Aus der Klinik für Innere Medizin B
der Universitätsmedizin
der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Vardenafil induzierter Schutz
vor Ischämie-Reperfusionsschäden
–
Untersuchung der Signalkaskade am isolierten
Rattenherzen
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin
(Dr.med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2012
vorgelegt von: Ole Christopher Maas
geb. am: 11. September 1982
in: Hamburg
Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Stephan B. Felix
2. Gutachter: Prof. Dr. Reiner Schulz
Ort, Raum: Greifswald, Besprechungsraum 334, Klinik für Anaesthesiologie und
Intensivmedizin, 3. OG, Fleischmannstr. 42-44
Tag der Disputation: 10.09.2012
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungslexikon……………………………………………………… IV-V
1. Einleitung……………………………………………………………… 1
1.1. Myokardinfarkt…………………………………………….. 1
1.1.1. Definition………………………………………… 1
1.1.2. Klinik…………………………………………….. 1
1.1.3. Therapie………………………………………….. 2
1.1.4. Epidemiologie……………………………………. 3
1.2. Ischämie……………………………………………………. 4
1.2.1. Definition………………………………………… 4
1.2.2. Anaerobe Energiegewinnung…………………….. 4
1.2.3. Nährstoffverlust………………………………….. 5
1.2.4. Prozesse während der Ischämie………………….. 5
1.2.5. Direkte Mechanismen der Zellschädigung………. 5
1.3. Ischämie-Reperfusionsschaden…………………………….. 6
1.3.1. Definition………………………………………… 6
1.3.2. Prozesse während der Reperfusion………………. 7
1.4. Konditionierung des Myokards……………………………..10
1.4.1. Präkonditionierung……………………………….. 10
1.4.2. Während der Ischämie…………………………… 12
1.4.3. Ischämische Postkonditionierung………………... 12
1.4.4. Pharmakologische Konditionierung………………13
1.5. Kardioprotektion durch Phosphodiesterase-5 Inhibitoren…. 13
1.5.1. Phosphodiesterasen………………………………. 13
1.5.2. PDE-5-Inhibitoren………………………………...14
2. Aufgabenstellung………………………………………………………. 15
3. Material und Methoden………………………………………………… 16
3.1. Material…………………………………………………….. 16
3.1.1. Chemikalien, Medikamente, Gase……………….. 16
3.1.2. Verbrauchsmaterial………………………………. 17
3.1.3. Geräte, Instrumente………………………………. 18
3.1.4. Computersoftware………………………………... 19
Inhaltsverzeichnis
II
3.1.5. Lösungen, Medien………………………………...20
3.1.6. Tiere……………………………………………… 20
3.2. Methoden…………………………………………………... 21
3.2.1. Rattenherzen-Isolation im Langendorffmodus…... 21
3.2.2. Infarktgrößenbestimmung………………………... 23
3.2.3. Biopsie-Entnahme………………………………... 27
3.2.4. cGMP-Level-Bestimmung……………………….. 28
3.3. HL-1-Zelllinie……………………………………………… 28
3.3.1. Zellkultivierung………………………………….. 28
3.3.2. Messungen der PKG-Aktivität mittels
Westernblotting….……………………………… 29
3.4. Statistik…………………………………………………….. 29
4. Ergebnisse……………………………………………………………… 30
4.1. Kontrolle der Indexischämie und ischämische Prä- und
Postkonditionierung………………………………………. 30
4.2. Präkonditionierung durch Vardenafil……………………… 33
4.3. Postkonditionierung durch Vardenafil……………………... 34
4.4. Enzyminhibitoren…………………………………………... 38
4.4.1. L-NAME…………………………………………. 38
4.4.2. ODQ……………………………………………… 39
4.4.3. KT5823…………………………………………... 41
4.4.4. Koronarfluss Enzyminhibitoren………………...... 42
4.5. Analogon 8-pCPT-cGMP………………………………….. 44
4.6. cGMP-Level………………………………………………... 47
4.7. HL-Zellen Vardenafil VASP-Blot…………………………. 48
5. Diskussion……………………………………………………………… 49
5.1. Dosisfindung……………………………………………….. 49
5.2. eNOS……………………………………………………….. 51
5.3. Guanylatcyclase & cGMP…………………………………..51
5.4. Proteinkinase G…………………………………………….. 52
5.5. Ischämische Postkonditionierung………………………….. 53
5.6. Klinischer Nutzen………………………………………….. 54
Zusammenfassung…………………………………………………………55
Quellenverzeichnis………………………………………………………... 56
Inhaltsverzeichnis
III
Eigene Veröffentlichungen……………………………………………...... 63
Eidesstattliche Erklärung…………………………………………………. 64
Lebenslauf………………………………………………………………… 65
Danksagung………………………………………………………………..67
Abkürzungsverzeichnis
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abb. -
ATP -
cAMP -
cGMP -
CK -
EDTA -
EGFR -
EKG -
ELISA -
eNOS -
GC -
GSK-3-beta -
HB-EGF -
5-HD -
HEPES -
IPC -
IPostC -
L-NAME -
Min. -
mitoKATP-Kanal -
mPTP -
NSTEMI -
ODQ -
8-pCPT-cGMP -
PI3-Kinase -
Abbildung
Adenosintriphosphat
zyklisches Adenosinmonophosphat
zyklisches Guanosinmonophosphat
Creatinin-Kinase
Ethylendiamintetraessigsäure
Endothelial Growth Factor Receptor (endothelialer
Wachstumshormonrezeptor)
Elektrokardiogramm
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (enzymatisches
Immunadsorptionsverfahren)
endotheliale Stickstoffmonoxid Synthase
Guanylatcyclase
Glykogen-Synthase-Kinase-3-beta
Heparin-binding epidermal growth factor
(heparinbindender, epidermaler Wachstumsfaktor)
5-Hydroxydecanoat
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl)-Ethansulfonsäure
Ischämische Präkonditionierung
Ischämische Postkonditionierung
N!-Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester-Hydrochlorid
Minute
mitochondrialer K-ATP-Kanal
mitochondrial permeability transition pore
(mitochondriale Permeabilitätsaustauscherpore)
Non ST-Elevation Myocardial Infarction (Nicht ST-
hebungs Myokardinfarkt)
1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one
8-(4-Chlorophenylthio)-Guanosin 3",5"-zyklisches
Monophosphat Salz
Phosphoinosid-3-Kinase
Abkürzungsverzeichnis
V
PCR -
PDE -
PKC -
SEM -
sGC -
STEMI -
SR -
ROS -
rpm -
UV-Licht -
VAR -
VASP -
WHO -
Polymerase Chain Reaction (Polymerase
Kettenreaktion)
Phosphodiesterase
Proteinkinase C
Standard Error of the Mean (Standardabweichung des
Mittelwertes)
soluble (lösliche) Guanylatcyclase
ST-Elevation Myocardial Infarction (ST-hebungs
Myokardinfarkt)
Sarkoplasmatisches Retikulum
Reaktive Oxygen Spezies (reaktive Sauerstoffradikale)
Rotationen pro Minute
Ultraviolettes Licht
Vardenafil
Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein
World Health Organisation
(Weltgesundheitsorganisation)
Einleitung
1
1. Einleitung
1. 1. Myokardinfarkt
1.1.1. Definition
Unter einem akuten Myokardinfarkt wird der plötzliche Verschluss einer Koronararterie, also eines
für die Myokardversorgung zuständigen Gefäßes, verstanden
(1). Der Myokardinfarkt kann sehr unterschiedlich verlaufen.
Auf der einen Seite ist der akute Myokardinfarkt eine der
häufigsten Todesursachen in den Industrienationen – in
Deutschland weist das Bundesamt für Statistik den akuten
Myokardinfarkt als zweithäufigste Todesursache aus (23;
19). Auf der anderen Seite verlaufen etwa 20% aller nicht
tödlichen Infarkte stumm, also vom Patienten unbemerkt.
Wie ein Infarkt sich klinisch verhält, hängt unter anderem
vom Ort des Verschlusses und damit von der Größe des
betroffenen Areals ab, sowie von den kardialen und nicht
kardialen Vorerkrankungen des Patienten. Wir unterscheiden
am menschlichen Herzen zwei große Herzkranzgefäße, die
linke und rechte Koronararterie. Die linke Arterie teilt sich
kurz nach ihrem Ursprung an der Aorta ascendens in den
Ramus circumflexus und Ramus interventricularis anterior.
Die Arterien teilen sich zur Peripherie hin weiter auf. Eine
wesentliche Kollateralbildung großer Gefäße, also ein
netzartiger Gefäßaufbau besteht am Herzen nicht (5). Das
heißt, dass im Falle des Verschlusses eines Gefäßes ein Areal
von der Versorgung mit Blut abgetrennt und damit mit
Nährstoffen und Sauerstoff unzureichend versorgt ist.
1.1.2. Klinik
Neben einer zum Teil typischen Klinik aus akutem
thorakalem Vernichtungsschmerz, Luftnot, Schwindel bis hin
zur Bewusstlosigkeit und Kaltschweißigkeit, ist das Elektrokardiogramm (EKG) eine der
wichtigsten diagnostischen Maßnahmen. Oft stellt sich der akute Infarkt im EKG mit einer ST-
Abb.1 Schematische Darstellung der Anatomie der Koronargefäße am Herzen: Die Gefäße verlaufen von der Basis der Klappen mit Ursprung in der Aorta auf der Außenseite des Herzen hinunter zur Herzspitze. Der Verschluss eines Koronargefäßes (schwarzer Balken) führt zu einer konsekutiven Ischämie des Areals unterhalb des Verschlusses (grau schattiert). Wesentliche Kollateralgefäße aus dem Stromgebiet anderer Gefäße bestehen nicht. Modifiziert nach A.Micheau, e-anatomy, imaios® (48)
Einleitung
2
Streckenhebung dar. Allerdings zeigt nur ein Teil der Patienten diese EKG-Veränderungen. Nach
der neuesten WHO-Definition des Herzinfarktes ist deshalb auch das wichtigste diagnostische
Werkzeug die Analyse einer Blutprobe auf Herzenzyme. Erst der Nachweis einer Myokardnekrose,
vorzugsweise mittels erhöhter Herzenzyme in Kombination mit typischen klinischen Symptomen,
passenden EKG-Veränderungen oder weiterer Bildgebung, erlaubt die Diagnose eines
Herzinfarktes (17). Die Erhöhung herzspezifischer Muskelproteine im peripheren Blut ist durch
einen Untergang von Herzmuskelzellen mit Freisetzung intrazellulärer Proteine in den Blutkreislauf
bedingt. Es steigen mit einer zeitlichen Latenz unter anderem die Enzyme Troponin I und Creatinin-
Kinase (CK) und andere Enzyme im peripheren
Blut an. (18)
Die Nomenklatur unterscheidet deshalb zwei
Typen des akuten Myokardinfarkts anhand des
Elektrokardiogramms: Während die einen
Patienten als Zeichen einer transmuralen,
ausgeprägten Ischämie des Herzmuskels eine
ST-Hebung im EKG zeigen (ST-Elevated
Myocardial Infarction – STEMI), fällt diese bei
anderen Patienten nicht auf (Non ST-Elevated Myocardial Infarction – NSTEMI).
90% aller Infarkte betreffen den linken Ventrikel. Man unterscheidet je nach betroffenem Areal
Hinter-, Vorder- oder Seitenwandinfarkte. Diese können auch noch wieder in Subkategorien
unterteilt werden.
Ein Patient mit akutem Myokardinfarkt kann unterschiedliche Symptome zeigen, weist aber oft die
oben erwähnten Symptome auf: starker Thoraxschmerz (sog. Vernichtungsschmerz) mit
Ausstrahlung in die linke Seite, Luftnot, Schwindel bis Bewusstlosigkeit sowie Kaltschweißigkeit.
Eine vitale Bedrohung des Betroffenen geht vor allem von Herzrhythmusstörungen und einem
Verlust der Pumpfunktion des Herzens in Folge des Myokardinfarkts aus (20).
1.1.3. Therapie
Die Therapie eines akuten Myokardinfarkts beinhaltet eine Schmerztherapie mit z.B. Opioiden,
Kreislaufstabilisation bzw. Komplikationsbeherrschung (kardiogener Schock, Rhythmusstörungen)
sowie eine Begrenzung der Infarktnarbe durch möglichst rasche Rekanalisation des betroffenen
Gefäßes (4).
Zwar gehen die meisten Todesfälle in der akuten Phase des Myokardinfarkts auf
Rhythmusstörungen mit Folge von drastischer Minderung der Pumpfunktion des Herzens zurück
Abb. 2 Darstellung der QRS-Komplexe: links der physiologische QRS-Komplex; rechts deutlich zu erkennen die ST-Streckenhebung als wichtiges Indiz einer transmuralen Ischämie
Einleitung
3
(1), aber schon vor 40 Jahren konnte gezeigt werden, dass für den weiteren Verlauf der Erkrankung
die Größe der Infarktnarbe im kontraktilen Gewebe des Herzens entscheidend ist (6). Ab einem
Verlust von 10% des Myokards ist mit einer Minderung der Ejektionsfraktion zu rechnen, ab 15%
nehmen enddiastolisches Volumen bzw. enddiastolischer Druck zu, ab 25 % zeigen die Patienten
klinisch die Symptome einer Herzinsuffizienz und ab 40% ist eine Gefährdung durch einen
kardiogenen Schock gegeben.
Der Verschluss einer Koronararterie erfolgt in der Regel auf dem Boden einer Arteriosklerose. Bei
kleinen Verschlüssen ist der Körper in der Lage, den Verschluss des Gefäßes selbst zu
rekanalisieren. Entscheidend beim Infarkt ist es, möglichst schnell eine Wiedereröffnung des
betroffenen Gefäßes herzustellen, um ein weiteres Absterben von Herzmuskelgewebe zu
verhindern. Hierzu kann der Arzt versuchen, den Verschluss mittels systemischer Lyse-Therapie
aufzulösen oder im Herzkatheterlabor das Gefäß gezielt mechanisch wiederzueröffnen.
Die Ballondilatation ist eine Behandlung, bei der mit einem Katheterdraht, an dessen Spitze sich ein
Ballon befindet, bis in das betroffene Gefäß vorgegangen wird. Der bis dato zusammengefaltete
Ballon wird im Bereich der Stenose mit physiologischer Kochsalzlösung entfaltet, um die Engstelle
mechanisch aufzudehnen. Zusätzlich kann, um das Gefäß längerfristig offen zu halten,
endovaskulär ein Stent implantiert werden. Ein Stent ist, vereinfacht gesagt, eine Röhre aus
Drahtgeflecht, die über Herzkatheter in der Engstelle der Gefäße implantiert werden kann und so
einen raschen Wiederverschluss des Gefäßes verhindert.
Zwar ist in der Akutbehandlung des Myokardinfarkts die Wiederherstellung der Perfusion im
Gewebe ein Hauptziel, dennoch ist die angestrebte Reperfusion nicht nur hilfreich. Die Größe der
Infarktnarbe bzw. der Zustand des betroffenen Myokards hängt zum einen entscheidend von der
Dauer der Ischämie ab, aber auch von der Zeit unmittelbar nach Wiedereröffnung – der so
genannten Reperfusionsphase.
In der Reperfusion laufen in den Zellen des Myokards Prozesse ab, die ein Überleben der
jeweiligen Zelle entscheidend beeinflussen können. Die Einflussnahme auf diese Prozesse zur
Minimierung der Infarktnarbe im Myokard nennen wir Konditionierung (siehe Seite 10).
1.1.4. Epidemiologie
Die Inzidenz des Myokardinfarktes zeigt regionale Unterschiede. Während in Deutschland die
Inzidenz bei ca. 300 Infarkten auf 100.000 Einwohner pro Jahr liegt, werden in Japan unter 100
Infarkte auf 100.000 Einwohner/Jahr registriert (1). Andere Länder, z.B. England oder Finnland,
kommen auf über 500 Infarkte/100.000 Einwohner/Jahr. Diese großen regionalen Unterschiede
Einleitung
4
können unter anderem mit dem regional unterschiedlichen Profil der Risikofaktoren begründet
werden. Zu den wesentlichen Risikofaktoren gehören neben der nicht beeinflussbaren familiären
Disposition, Tabakrauchen, arterielle Hypertonie, ein bestehender Diabetes mellitus (21),
Dyslipoproteinämie und Ernährungsgewohnheiten. Diese Faktoren führen alle zu einer koronaren
Gefäßerkrankung im Sinne einer Arteriosklerose der Herzkranzgefäße - die Grundlage der meisten
Myokardinfarkte (22).
Im Vergleich der Verteilung auf die Geschlechter ist festzustellen, dass der Myokardinfarkt mit
dem Faktor 2 öfter Männer als Frauen trifft. Die Lebenszeitprävalenz liegt für deutsche Männer bei
etwa 30% und für Frauen bei ca. 15%. In der Todesursachenstatistik des Bundes wurden für 2002
64.218 tödliche Infarkte registriert (23).
1.2. Ischämie
1.2.1. Definition
Der Begriff Ischämie, in Übersetzung aus dem Altgriechischen „Blutleere“, bedeutet, dass ein
Organ oder Gewebe nicht mehr oder nur unzureichend durchblutet wird. Wenn nun durch den
Verschluss einer Koronararterie Teile des Herzmuskels nicht mehr mit Blut versorgt werden,
werden verschiedene Prozesse aktiviert, welche zu einem Gewebeschaden führen können.
1.2.2. Anaerobe Energiegewinnung
Mit Unterbrechen der Durchblutung wird auch die Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff
unterbunden. Der Sauerstoff ist für die Zellen für die Verstoffwechselung von Kohlenwasserstoffen
über die Glykolyse und die Atemkette der Mitochondrien nötig, um so die Ausbeute an
Adenosintriphosphat (ATP) pro Kohlenstoffverbindung zu maximieren. Steht kein Sauerstoff mehr
zur Verfügung, wird die ATP-Gewinnung von der aeroben auf die anaerobe Zellatmung umgestellt
(7). Bei der anaeroben Zellatmung fällt zum einen Laktat als Endprodukt der Glykolyse an, zum
anderen akkumuliert CO2 im Gewebe, da es nicht abtransportiert werden kann.
Beide Metabolite sorgen für eine Verschiebung des pH-Wertes des Gewebes ins saure Milieu. Mit
zunehmender Dauer der Ischämie kommt auch die anaerobe Glykolyse zum Erliegen. Die
akkumulierten Endprodukte der anaeroben Glykolyse verschieben die Reaktionsgleichgewichte und
hemmen so eine weitere Verstoffwechselung.
Einleitung
5
1.2.3. Nährstoffverlust
Mit Unterbrechung der Blutzufuhr fällt auch die Versorgung des Gewebes mit Nährstoffen wie
Eiweiß, Fett und Glukose aus. Die Myokardzellen verfügen zwar über einen gewissen Spiegel an
Glukose im Zytosol, dieser ist jedoch schnell verbraucht. Weitere schnelle mobilisierbare Energie
ist in Form von Glykogen und Lipiden gespeichert. Da die Verstoffwechselung dieser Reserven
aber unter anaeroben Bedingungen erfolgt, ist die Ausbeute an ATP, Energieäquivalent für die
Umsetzung Energie fordernder Prozesse der Zelle, geringer.
1.2.4. Prozesse während der Ischämie
Auch wenn unter der Ischämie die aktive Kontraktion der Myokardzelle bald zum Erliegen kommt,
wird dadurch der Energiebedarf der Zelle nur reduziert, nicht aber beseitigt. Die Zelle benötigt zur
Aufrechterhaltung des gesonderten, in Bezug auf Molarität und pH-Wert stabilen, Milieus im
Zytosol Energie (11). Um die Milieudifferenzen zwischen Intra- und Extrazellulärraum zu erhalten,
verfügt die Zelle über ein spezielles System verschiedener Ionenpumpen und Ionenkanäle. Einige
dieser Membranproteine, unter anderem die Na-K-ATPase, sind primär aktive, das heißt direkt ATP
verbrauchende „Pumpen“. Die Na-K-ATPase transportiert Natriumionen im Austausch gegen
Kaliumionen aus dem Inneren der Zelle heraus und baut so einen Natriumgradienten über der
Plasmamembran auf. Andere, die so genannten sekundär aktiven Transporter, benutzen nun diesen
Natriumgradienten, um wieder weitere Ionen über die Zellmembran zu transportieren und so ein
konstantes Milieu im Inneren der Zelle aufzubauen. Reguliert wird die Na-K-ATPase über die
Menge des intrazellulären Natriums.
Der Ausfall der Na-K-ATPase in der Ischämie hat nun zwei Folgen: Als erstes steigt der
intrazelluläre Natriumspiegel an, was einen vermehrten Antrieb der Pumpe und damit einen
weiteren Anstieg des ATP-Bedarfs zur Folge hat. Zum anderen bricht der Natriumgradient über der
Plasmamembran zusammen. Die sekundär aktiven Ionentransporter fallen so ebenfalls aus. In der
Folge ist die Zelle nicht in der Lage, ihr besonderes intrazelluläres Milieu zu erhalten (25).
1.2.5. Direkte Mechanismen der Zellschädigung
Die in den vorangegangenen Absätzen beschriebenen Prozesse führen zu einer Schädigung der
Zelle. Im Wesentlichen sind zwei Mechanismen verantwortlich.
Einleitung
6
Zum einen führt der vermehrte Einstrom von
Ionen, beziehungsweise der Verlust einer
kompensierenden Pumpleistung von Ionen
aus der Zelle heraus, zu einem Anstieg der
Osmolarität des Zytosols. Konsekutiv
strömen Wassermoleküle ins Zellinnere.
Diese Zunahme von intrazellulärer
Flüssigkeit geht mit einer Volumenzunahme
der Zelle einher. Die Schwellung kann die
Plasmamembran der Zelle nur bedingt
ausgleichen, ehe es zu Schäden der Zellwand
führt (11).
Neben diesem passiven Schädigungsmuster
werden aktive Prozesse der Zelle initiiert.
Unter physiologischen Bedingungen ist der
Calciumspiegel des Zytosols gering und nur
einigen Schwankungen zur Aktivierung
einer Myokardkontraktion unterlegen. In der
ischämischen Zelle steigt durch den Ausfall
der plasmalemmalen Transporter auch der
intrazelluläre Calciumspiegel an. Ein großer Teil des in der Ischämie einströmenden Calciums
kommt jedoch aus den intrazellulären Speichern der Zelle. Ein stark erhöhter intrazellulärer
Calciumspiegel führt zur Aktivierung von Caspasen und anderen Enzymen, die die Apoptose der
Zelle einleiten (45).
1.3. Ischämie-Reperfusionsschaden
1.3.1. Definition
Unter dem Ischämieschaden wird der Defekt verstanden, der direkt durch die Mangelversorgung
des Gewebes verursacht wird und im Abschnitt „Ischämie“ geschildert wird.
Der Reperfusionsschaden bezeichnet den Gewebeschaden, der durch Prozesse in der Reperfusion,
also erst im Anschluss an die Ischämie, verursacht wird.
Abb.3 Vereinfachte Darstellung der Prozesse während der Ischämie, die zur Schädigung des Gewebes führen: Ein Mangel von Nährstoffen und Sauerstoff führt zum Mangel an ATP. Dadurch kann die Na-K-ATPase das Membranpotential nicht mehr aufrechterhalten. Calcium und Wasser strömen ins Zellinnere. Der erhöhte Calciumspiegel aktiviert die Caspasen, welche eine Apoptose einleiten.
Einleitung
7
Nach der Ischämie am Beginn der Reperfusion
unterteilt man die Zellen im betroffenen Areal in drei
Gruppen. Die erste Gruppe ist durch die Ischämie
irreversibel geschädigt und ist zu Grunde gegangen
oder wird während der Reperfusionsphase mit
Sicherheit absterben. Die zweite Gruppe umfasst
Zellen, die die Ischämie überlebt haben und auch ohne
weitere Beeinflussung die Reperfusionsphase
überstehen werden. Die dritte Gruppe ist letztlich die,
mit der sich diese Arbeit auseinander setzt. Diese
Zellen sind durch die Ischämie soweit geschädigt, dass
sie durch die Reperfusion absterben würden. Dennoch
lassen sich diese Zellen durch Beeinflussung der
Prozesse in der Reperfusion bzw. durch Aktivierung
protektiver Signalkaskaden retten (31; 8).
Es wird angenommen, dass der Reperfusionsschaden
im wesentlichen durch oxidativen Stress und die damit
verbundenen reaktiven Sauerstoffradikale, durch eine
Veränderung der Calciumionenhomöostase sowie
durch exzessive Zellkontraktionen verursacht wird. Diese Stressoren haben ihren Ursprung in der
Normalisierung des Energiehaushalts und Gewebsosmolarität der Zelle sowie in Verschiebungen
des pH-Wertes im Gewebe.
1.3.2. Prozesse während der Reperfusion
1.3.2.1. Normalisierung des Energiehaushalts
Wenn das Gewebe nach einer ischämischen Phase wieder mit Sauerstoff versorgt wird, kommt es
zum so genannten „Sauerstoff-Paradoxon“ (10). Darunter versteht man eine ernsthafte Schädigung
des Gewebes durch die erneute Zufuhr des lebenswichtigen Sauerstoffs. Während der
Reoxygenierung kommt es zu einer myofibrillären Hyperkontraktur und einer sarkolemmalen
Disruptur, die in der Reperfusion zu Schäden am Gewebe führen (46; 47).
Der Sauerstoff ermöglicht es der Zelle, über die Mitochondrien den während der Ischämie
ausgeschöpften ATP-Vorrat wieder aufzufüllen.
Abb.4 Beitrag zur Sterblichkeit der Myokardzellen, aufgegliedert nach Schaden durch die Ischämie, Reperfusion bzw. der erzielbare Effekt der Myokardprotektion Modifiziert nach Yellon et. al.(8)
Einleitung
8
Das neu synthetisierte ATP wird von der Zelle in der Reperfusion für diverse Prozesse benötigt. Da
sich während der Ischämie die Ionengleichgewichte über der Zellmembran verschoben haben, ist
die Zelle mittels der Ionentransporter bestrebt, dieses Gleichgewicht wieder herzustellen. Eine
wichtige Rolle kommt hier der Na-K-ATPase zu, die das während der Ischämie gestiegene
intrazelluläre Natrium im Austausch gegen Kalium wieder nach extrazellulär pumpt. Da ein
Natriumeinstrom bei vielen sekundär aktiven Transportern der treibende Gradient ist, ist eine
Normalisierung des Natriumgleichgewichts über der Zellmembran essentiell.
Unter anderem werden in der gesunden Zelle Calciumionen im Austausch gegen Natriumionen
nach extrazellulär gepumpt und so ein niedriger intrazellulärer Calciumspiegel gesichert.
In der gesunden Zelle steigt zur Initiation einer Kontraktion das intrazelluläre Calcium. Ein
schneller Abfall des Calciumspiegels verhindert eine dauerhafte, pathologische Kontraktur des
Gewebes (11). Für den Abfall des Calciumspiegels ist am sarkoplasmatischen Retikulum eine direkt
ATP-abhängige Calciumpumpe zuständig (63). An der Zellmembran wird das Calcium in einem
sekundär aktiven Transport im Austausch gegen Natrium nach extrazellulär gepumpt und so ein
Absinken des Calciumspiegels gesichert.
Während der Ischämie ist der Calciumspiegel intrazellulär angestiegen. Der hohe Calciumspiegel
führt nun, wie in der gesunden Zelle, zur Aktivierung verschiedener zellulärer Enzyme. Dazu
gehören die für die Kontraktion der Zelle zuständigen Myofibrillen sowie sarkolemmale
Calciumpumpen.
Zu Beginn der Reperfusion liegt nun ein sehr hoher intrazellulärer Calciumspiegel zusammen mit
ATP vor. Dadurch wird eine Kontraktion initiiert und Calcium ins sarkoplasmatische Retikulum
(SR) gepumpt. Doch kann im Gegensatz zur physiologischen Myokardkontraktion nicht Calcium an
der Zellmembran gegen Natrium ausgetauscht werden, da der intrazelluläre Natriumspiegel nach
der Ischämie erst wieder normalisiert werden muss. Zwar kann der ATP-abhängige Transport von
Calcium in das SR arbeiten, jedoch ist die Calciumkapazität des SR begrenzt. Bei Überbeladung
des SR mit Calcium wird dieses wieder freigesetzt und damit eine Oszillation des Calciumspiegels
und eine Kontraktur der Zelle ausgelöst. Diese Oszillation kann nur durch ein Einsetzen des
plasmalemmalen Calciumtransports beendet werden (27; 28).
Ob der Natriumspiegel normalisiert werden kann und damit ein Absinken des intrazellulären
Calciums möglich ist, hängt vom Ausmaß der ischämischen Schädigung der Na-K-ATPase ab.
Einleitung
9
1.3.2.2. Normalisierung der Gewebsosmolarität
Durch den Funktionsverlust der plasmalemmalen Pumpen wie der Na-K-ATPase während der
Ischämie kann das Gleichgewicht der Ionen zwischen Intra- und Extrazellulärraum nicht
aufrechterhalten werden. Insbesondere Natriumionen sammeln sich im Inneren der Zelle.
In der ischämischen Phase stellen die Zellen ihren Stoffwechsel zunächst auf eine anaerobe
Energiegewinnung um. Dabei entstehen Stoffwechselprodukte wie Laktat, die in der Zelle
akkumulieren.
Die Natriumionen und die Stoffwechselprodukte sind osmotisch aktive Substanzen. Durch ihre
übermäßige Ansammlung in den Zellen ist das osmotische Gleichgewicht gestört, sie ziehen Wasser
ins Innere der Zellen.
In der Reperfusion werden die in der ischämischen Phase akkumulierten Stoffe nun ausgewaschen.
Das Wasser kann die Zelle aber nicht so schnell wieder verlassen. Zurück bleibt eine mit Wasser
überladene Zelle, welche angeschwollen ist (29).
Die Zellschwellung erhöht in Kombination mit ischämischen Hyperkontrakturen des Zytoskeletts,
dem Mangel an Energie und anderen Stressfaktoren das Risiko einer Zellschädigung.
1.3.2.3. Normalisierung des pH-Werts
Wird ein Gewebe durch eine Ischämie gezwungen auf anaeroben Stoffwechsel umzustellen, fällt
dabei Laktat an. Da dieses in der Ischämie nicht abtransportiert oder weiter verstoffwechselt wird,
sammelt es sich an. Laktat senkt während der Ischämie den pH-Wert in den Zellen sowie im
Extrazellulärraum.
Da ein saures Milieu hemmend auf den kontraktilen Apparat der Myozyten wirkt, hat es während
der Ischämie durchaus protektive Effekte auf die Zelle. Es senkt den Stress durch die
Hyperkontraktilität der Myofibrillen auf die Zellmembran (52).
Wird das Gewebe in der Reperfusion wieder durchblutet, werden die Wasserstoffprotonen im
Extrazellulärraum zwischen den Zellen rasch ausgeschwemmt. Durch die in den Zellen
verbleibenden Protonen entsteht ein Gradient über der Zellmembran. Entlang des
Konzentrationsgefälles zieht es die Wasserstoffionen aus den Zellen heraus in den alkalischeren
Extrazellulärraum. Dabei nutzen die Wasserstoffionen unter anderem einen Na-H-Antiporter, der
Natriumionen im Austausch mit Wasserstoffionen in die Zelle transportiert (53).
Ein weiterer Mechanismus, um die Differenz des pH-Wertes von Intra- und Extrazellulärraum
auszugleichen, ist die Aktivierung des Na-Bicarbonat-Symports. Dieser bringt HCO3- mit Natrium
in die Zelle hinein. Beide Transporter gleichen zwar den pH-Wert von intra- und extrazellulär an,
bringen jedoch Natriumionen in die Zelle hinein.
Einleitung
10
In der Folge kommt es zu einer Überladung der Zelle mit Natriumionen. Diese Überladung aktiviert
den Na-Ca-Antiport in „verkehrter Richtung“. Bei der physiologischen Muskelarbeit bringt dieser
Transporter die Calciumionen, deren Einstrom die Kontraktion initiiert hatte, im Tausch gegen
Natriumionen wieder aus der Zelle heraus. Die Überladung des Zytoplasmas mit Natrium lässt
diesen Na-Ca-Antiport nun Calcium in die Zellen hinein transportieren, um Natrium entlang des
herrschenden Gradienten aus der Zelle herauszufördern (11).
Dieser Einstrom von Calcium in die Zellen verstärkt die oben beschriebene Hyperkontraktilität der
Myofibrillen und erhöht so den Stress für die Myozyten (26).
1.4. Konditionierung des Myokards
1.4.1. Präkonditionierung
Unter Konditionierung wird die Aktivierung von Schutzmechanismen des Myokards gegen die
beschriebenen Ischämie-Reperfusionsschäden verstanden. Entdeckt wurde dieses Phänomen 1986
durch Murry et al. (3).
Ihnen gelang es, den Schaden, der durch eine lange andauernde Ischämie, der so genannten
Indexischämie, am Myokard verursacht wird durch alternierende, kurze Phasen von Ischämie und
Perfusion vor der Indexischämie zu
verringern.
Abbildung 5 zeigt die
schematische Erläuterung des
Versuchsprotokolls aus Murrys
Publikation. An aus Hunden
isolierten Herzen wurden 5 Min.
Ischämie mit 5 Min. Reperfusion
in 4 Zyklen abgewechselt, bevor
die Versorgung des Myokards für
40 Min. unterbunden wurde.
Dieses Vorgehen reduzierte die
Infarktgröße im Vergleich zu 40
Min. Indexischämie ohne weitere
Behandlung signifikant (3).
Abb.5 Aus der Publikation von Murry et al.: Graphische Darstellung des Versuchprotokolls: Repetitive Ischämien verringerten die Infarktgröße.
Einleitung
11
Auch wenn das Phänomen der ischämischen Präkonditionierung mittlerweile über 20 Jahre bekannt
ist, sind noch nicht alle Schritte der Signalvermittlung in der Myokardzelle verstanden.
Verschiedene Signaltransduktionswege sind untersucht worden. Mehrere protektive Signalkaskaden
konnten identifiziert werden (8).
Als Zielstruktur zum Schutz der Myokardzelle wird vielfach die mitochondriale Membranpore
mPTP (mitochondrial permeability transition pore) angenommen. In der vitalen Myokardzelle liegt
die mPTP in der mitochondrialen Membran in dissoziiertem Zustand vor. Auch während der
Ischämie ist die mPTP noch geschlossen (9). Finden sich die Bestandteile der Pore jedoch
zusammen, bildet sich ein Kanal in der Membran, der einen Zusammenbruch des
Membranpotentials am Mitochondrium zur Folge hat. Die Mitochondrien sind nicht weiter in der
Lage ATP zu produzieren. Sie gehen zugrunde. Diese Formation der mPTP gilt es zum Schutz des
Myokards zu verhindern.
Derzeit sind mehrere Wege bekannt, die einen hemmenden Einfluss auf die Formation der mPTP
ausüben. Eine zentrale Rolle scheint die Aktivierung der Proteinkinase C zu spielen. Die PKC wird
bei der Präkonditionierung vor Beginn der Ischämie aktiviert und bildet das „Gedächtnis“ der
Konditionierung. Das heißt, die PKC wird vor der Ischämie aktiviert, aber ihr Effekt kommt erst
nach der Zeit der Ischämie zum Tragen (54).
Es gibt mehrere bekannte Wege, um die PKC zu aktivieren. Alle diese Signalkaskaden beginnen an
der Zellmembran mit der Aktivierung von Gi-Protein gekoppelten Rezeptoren, u.a. Rezeptoren für
Adenosin, Bradykinin oder Opioide (55; 56).
Bradykinin und die Opioide vermitteln ihr Signal über die PI3-Kinase, welche direkt (Bradykinin-
Rezeptor) oder indirekt aktiviert wird. Die PI3-Kinase stimuliert unter anderem die Kinase Akt. Die
aktive Akt stimuliert die endotheliale NO-Synthase (eNOS), welche Stickstoffmonoxid (NO) als
Botenstoff produziert.
NO stimuliert die lösliche Guanylatcyclase (soluble guanyl cyclase - sGC). Die sGC spaltet cGMP
aus GTP ab. Das so entstandene cGMP ist in der Lage, verschiedene Prozesse in der Zelle zu
aktivieren. Unter anderem wird die cGMP-abhängige Proteinkinase G aktiviert.
Die PKG scheint ein entscheidender Schritt zu sein, um das protektive Signal vom Zytosol auf die
Mitochondrien zu übertragen. Nach Aktivierung der PKG kommt es zur Öffnung von Kanälen in
der mitochondrialen Membran. Es handelt sich hier um einen Adenosintriphosphat-abhängigen
Kaliumkanal (mitoKATP-Kanal). Eine Öffnung des mitoKATP-Kanals hat einen Einstrom von
Kaliumionen ins Innere der Mitochondrien und konsekutiv einen Aufbau eines osmotischen
Gradienten über die mitochondriale Membran zur Folge. Dem Gradienten folgende
Einleitung
12
Wassermoleküle bewirken eine Schwellung der Mitochondrien. Dieses Anschwellen der
Mitochondrien stimuliert die Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (reaktive oxygen species
– ROS) an der Mitochondrienmembran. Dieses ist ein entscheidender Schritt, denn ein chemisches
Abfangen der ROS hemmt eine Aktivierung dieses Signalweges. Die ROS scheinen die PKC zu
aktivieren, welche dann wieder den Beginn der gemeinsamen Signalkaskade darstellt (44).
1.4.2. Während der Ischämie
Eine Aktivierung der Proteinkinase C vor der Ischämie bedingt, dass während der ischämischen
Phase der Adenosin A2b Rezeptor durch die PKC aktiviert wird (58). Der A2b Rezeptor aktiviert
mehrere protektive Kinasen, was letztlich zu einer Phosphorylierung der Glykogen-Synthase-
Kinase-3-beta (GSK-3-beta) führt (57; 59).
Im normalen, physiologischen Zustand der Myozyten liegt die GSK-3-beta dephosphoryliert und
somit konstitutiv aktiv vor. Durch Phosphorylierung wird sie inaktiviert. Eine Inaktivierung der
GSK-3-beta verhindert die Bildung der mPTP, welches einen Schutz gegen Ischämie-
Reperfusionsschäden bietet (59).
1.4.3. Ischämische Postkonditionierung
Zwar wurde die ischämische Präkonditionierung zuerst entdeckt und ist auch noch weiterhin
Gegenstand der Forschung, dennoch ist die Postkonditionierung aus einfachen klinischen Gründen
relevanter. Da es bis auf wenige Situationen, zum Beispiel einer Herzoperation, wenig Situationen
gibt, in denen dem Arzt bekannt ist, dass das Herz des Patienten in Kürze einer Ischämie ausgesetzt
sein wird, ist die Postkonditionierung interessanter. Die Patienten erreichen den Arzt nachdem der
Infarkt eingetreten ist und während der ischämischen Phase. Der Arzt könnte nun während der
Wiedereröffnung des Verschlusses in den Herzkranzgefäßen Maßnahmen ergreifen, die eine
Postkonditionierung des Myokards initiieren und eventuell das Outcome des Patienten verbessern.
In vielen wesentlichen Schritten entspricht die Signalkaskade, die eine Postkonditionierung bewirkt,
der der Präkonditionierung. Ein wesentlicher Unterschied ist aber nötig, wenn man die grobe
Unterteilung der Präkonditionierung in Initialisierung, Memory-Phase und Effektor-Phase
berücksichtigt. Bei der Postkonditionierung ist keine Memory-Phase nötig, da Initialisierung und
Effekt zeitlich nicht durch eine Ischämiephase getrennt werden.
Wie bei der Präkonditionierung wird der Schutz des Myokards auch bei der Postkonditionierung
durch eine Beeinflussung der mPTP vermittelt (60).
Einleitung
13
1.4.4. Pharmakologische Konditionierung
Die oben beschriebenen Phänomene der Prä- bzw. Postkonditionierung haben die kurzen repetitiven
ischämischen Episoden als Auslöser des kardioprotektiven Signals. Neben diesen als ischämische
Prä- und Postkonditionierung bekannten Verfahren sind auch pharmakologische Auslöser bekannt.
Es ist möglich, auf verschiedenen Stufen der involvierten Signalkaskade durch exogene Gabe der
Botenstoffe oder ihrer Analoga und Mimetika die protektive Signalkaskade zu stimulieren und so
einen Schutz im Myokard hervorzurufen.
Beispiele sind die Gabe von Opioiden oder Adenosin, welche schon auf der Ebene der
Zellmembranrezeptoren die Signalkaskade aktivieren, oder andere Pharmaka, wie die
Phosphodiesterase-5 Inhibitoren.
Applikationsdauer und -zeitpunkt variieren je nach Substanz. Generell unterscheidet man auch bei
der pharmakologischen Konditionierung eine Prä- und Postkonditionierung.
1.5. Kardioprotektion durch Phosphodiesterase-5 Inhibitoren
1.5.1. Phosphodiesterasen
Die zyklischen Nukleotide cAMP oder cGMP sind in viele Reaktionen in Zellen involviert und
stellen eine wichtige Gruppe von Botenstoffen dar. Synthetisiert werden sie aus ihren
entsprechenden Triphosphaten, ATP oder GTP. Die zyklischen Nukleotide werden von
Phosphodiesterasen (PDE) abgebaut. Diese hydrolysieren die zyklischen Nukleotide (38).
Es sind unterschiedliche Phosphodiesterasen bekannt. Sie werden in drei Klassen unterteilt, wobei
alle in Wirbeltieren exprimierten Phosphodiesterasen der Klasse 1 angehören. Die im menschlichen
Organismus vorkommenden Phosphodiesterasen werden wiederum in zwölf Familien unterteilt und
durchnummeriert. Innerhalb dieser Familien gibt es noch einige Splicevarianten. Zum einen
unterscheiden sich die PDEs in Affinität und Aktivität, Regulation und im bevorzugten Substrat.
Zum anderen werden sie in den Geweben des Körpers unterschiedlich exprimiert (61). Da sich
diese Arbeit mit einem Hemmstoff der Phosphodiesterase-5 beschäftigt, wird im Folgenden nur
genauer auf die Phosphodiesterase-5 eingegangen.
Die PDE-5 gehört wie die PDEs 6 und 9 zu den cGMP spezifischen Phosphodiesterasen. Sie wird in
den glatten Muskelzellen, im Corpus cavernosum des Penis und in den Zellen des Myokards
exprimiert. Die PDE-5 ist im Zytosol lokalisiert; in Myozyten konnte eine Lokalisation in den Z-
Banden nachgewiesen werden (15).
Einleitung
14
1.5.2. PDE-5-Inhibitoren
Bekannt wurden die PDE-5-Inhibitoren durch die Indikation der erektilen Dysfunktion (12). Eine
weitere Indikation ist der pulmonale Hochdruck (42).
Durch eine Hemmung der PDE-5 wird der Abbau des cGMP gebremst und somit der intrazelluläre
cGMP-Spiegel erhöht. Durch diesen Effekt verstärken die PDE-5-Inhibitoren die Wirkung des
cGMP im Organismus. Im Penis bedeutet dies, dass eine verstärkte und verlängerte cGMP-
Konzentrationserhöhung die Arteriolen des Schwellkörpers weiter und länger dilatieren und den
Einstrom des Blutes in den Schwellkörper fördert (39). Dadurch wird eine Erektion bei Patienten
mit erektiler Dysfunktion unterstützt. Unter dieser Indikation sind die PDE-5-Inhibitoren zu einer
etablierten, in den Massenmedien vielfach diskutierten Therapie geworden.
Der erste auf dem Markt verfügbare PDE-5-Inhibitor war Sildenafil (Viagra®, Pfizer AG).
Mittlerweile sind zwei weitere Substanzen erhältlich: Taldalafil (Cialis®, Lilly Pharma) und
Vardenafil (Levitra®, Bayer Healthcare). Die Substanzen sind nach einer Arbeit von Carson et al.
(13) auch bei Patienten mit kardiologischen Vorerkrankungen einsetzbar.
Die pharmakodynamischen Eigenschaften der genannten PDE-5-Inhibitoren sind bezüglich der
Rezeptorselektivität und Rezeptoraffinität unterschiedlich. Vardenafil zeigt die beste Selektivität
und grösste pharmakologische Potenz.
Das die PDE-5-Inhibitoren auch zur Konditionierung von Myokardzellen geeignet sind, konnte
Ockailis Gruppe (14; 15) erstmals nachweisen. Es wird davon ausgegangen, dass die erhöhten
cGMP-Spiegel in den Zellen eine Aktivierung der Proteinkinase G zur Folge haben (37). Diese
initiiert dann die weiteren Signale der oben beschriebenen Kaskade und sollte so einen Schutz des
Myokards gegen Ischämie-Reperfusionsschäden verursachen. Salloum et al. konnten diesen
protektiven Effekt für die Reperfusion nachweisen. Weiterhin gelang es ihnen, diese
Postkonditionierung durch 5-Hydroxydecanoat (5-HD), einen mitoKATP-Kanal-Blocker, zu
hemmen. Dies legt nahe, dass der mitoKATP-Kanal an der Signalvermittlung durch PDE-5-
Inhibitoren beteiligt ist (66).
Zuvor wurde gezeigt, dass die Öffnung des mitoKATP-Kanals durch die PKG vermittelt wird (16).
Zusammengefasst kann man davon ausgehen, dass der Effekt des Vardenafil über eine cGMP-
Erhöhung mit konsekutiver Aktivierung der PKG und dadurch bedingter Öffnung des mitoKATP-
Kanals vermittelt wird.
Aufgabenstellung
15
2. Aufgabenstellung
Mit dieser Studie wollten wir die Wirkungsweise der PDE-5-Inhibitoren präzisieren.
Zum einen galt es, eine maximale Wirkdosis für isolierte Rattenherzen zu finden. Bisher waren in
der Literatur nur Dosisangaben zur Anwendung von Vardenafil in der Prä- oder
Postkonditionierung im in-vivo-Modell des Rattenherzens zu finden. Dabei handelt es sich um
Bolusgaben oder kontinuierliche intravenöse Infusion in eine periphere Vene des Versuchstiers.
Das heißt, Informationen über die letztliche Zieldosis an der Effektorzelle sind nicht bekannt.
Zum anderen haben wir die Wirkungsweise von Vardenafil durch den Einsatz verschiedener
Enzyminhibitoren untersucht. Die Arbeitsgruppen um Yellon und Salloum haben die Applikation
von Vardenafil mit verschiedenen Enzyminhibitoren kombiniert und so Teile der Signalkaskade,
über die die PDE-5-Inhibitoren ihre schützende Wirkung entfalten, identifiziert. So ist bekannt, dass
die PDE-5-Inhibitoren ihre Wirkung über den mitochondrialen ATP-abhängigen Kaliumkanal
mitoKATP-Kanal entfalten. Die genauen Schritte zur Aktivierung des mitoKATP-Kanal waren noch
zu beweisen.
Da cGMP-Analoga einen protektiven Effekt bezüglich Ischämie-Reperfusionsschäden auf das
Myokard haben, ist unsere Hypothese, dass Vardenafil seine schützende Wirkung durch die
Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels vermittelt.
Es gibt oft Situationen des Stoffwechsels, in denen eine cGMP-Erhöhung mit einer cAMP-
Erniedrigung einhergeht. Es ist ungeklärt, ob der cAMP/PKA-Signalweg zur Vermittlung des
schützenden Signals benötigt wird oder die cGMP-Level alleine für das schützende Signal
verantwortlich sind.
Material & Methoden
16
3. Material und Methoden
3.1. Materialien
3.1.1. Chemikalien, Medikamente, Gase
Stoff Firma, Sitz
Heparin-Natrium (25 000 I.E./5ml) B Braun Melsungen AG, Melsungen,
Deutschland
Thiopental-Natrium (Trapanal®, 0,5g/20ml
Durchstechflasche)
Altana Pharma Deutschland GmbH,
Konstanz, Deutschland
Aqua ad injectabile, 10ml B Braun Melsungen AG, Melsungen,
Deutschland
Natrium-Chlorid (NaCl) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,
Deutschland
Claycomb-Medium SAFC Bioscience; Lenaxa, USA
Glucose Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,
Deutschland
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl)-
Ethansulfonsäure (HEPES)
Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,
Deutschland
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,
Deutschland
Magnesiumsulfat (MgSO4) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Deutschland
Calciumchlorid (CaCl2) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,
Deutschland
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,
Deutschland
Kaliumchlorid (KCl) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,
Deutschland
Vardenafil-Chlorid (Levitra®) Bayer Health Care, Leverkusen,
Deutschland
1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Deutschland
Material & Methoden
17
N!-Nitro-L-Arginin Methyl Ester Hydrochlorid (L-
NAME)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Deutschland
KT5823 Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Deutschland
8-(4-Chlorophenylthio)-Guanosin 3",5"-zyklisches
Monophosphat Salz (8-pCPT-cGMP)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Deutschland
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (Tetrazolium) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Deutschland
Flourescent Polymer Microspheres (Diam. 3-8#m), 1g Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA,
USA
Carbogen (5%O2, 95%CO2) Air Liquide Deutschland GmbH,
Düsseldorf, Deutschland
Ethanol (96%, MEK-vergällt) Universitätsapotheke Greifswald
Formaldehyd, 70% Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Deutschland
3.1.2. Verbrauchsmaterial
Chirurgische Naht, Greenfil, PET-Faden,
geflochten, unbeschichtet 2/0 USP, DRT18, 70cm
Catgut GMBH, Markneukirchen,
Deutschland
Chirurgischer Faden, Greenfil PET-Faden,
geflochten, unbeschichtet 3/0 USP 50cm
Catgut GMBH, Markneukirchen,
Deutschland
Aluminium-Folie Toppits Melitta GmbH, Minden,
Deutschland
Druckerfolie, Lumocolor Ink Jet Transparent Film Staedtler, Nürnberg, Deutschland
Falcons 50ml Becton Dickinson Labware Europe, Le
Pont De Claix, Frankreich
Einmalspritze 5ml B Braun Melsungen AG, Melsungen,
Deutschland
Einmalspritze 20ml B Braun Melsungen AG, Melsungen,
Deutschland
Klebepflaster von der Rolle Leukosilk
Pipettenspitzen Becton Dickinson Labware Europe, Le
Pont De Claix, Frankreich
Material & Methoden
18
3.1.3. Geräte, Instrumente
3.1.3.1. Langendorffanlage
Die Langendorffanlage dient der
Simulation eines Kreislaufs für ein
isoliertes Versuchstierherz. Die
Anlage muss die notwendigsten
Bedingungen des Kreislaufs
ersetzen, die das Herz benötigt. Das
heißt, es müssen Nährstoffzufuhr,
also die Perfusion der
Koronargefäße, und eine
Organtemperatur von 37°C, der
Körpertemperatur entsprechend,
sichergestellt werden. Außerdem
muss ein physiologischer pH-Wert
im Gewebe erhalten werden.
Nach der nachfolgend
Abb.6 Schematische Darstellung der Langendorffanlage A-C: Reservoirgefäße mit Pufferlösung D: Zufuhr für die Begasung der Puffer mit Carbogen E: Heizspirale F: 3-Wege-Hahn G: Gefäß mit isoliertem Herzen H: Auslass des Puffers dunkles Grau: Wasser in der Doppelwand der Analge, in Zirkulation durch eine Wärmepumpe (aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht mit dargestellt) helles Grau: Pufferlösung zur Perfusion des Herzens
Material & Methoden
19
beschriebenen Operation zur raschen Isolation des Herzens aus der Ratte wird das Herz in eine
Langendorffanlage, wie in Abbildung 6 schematisch dargestellt, eingespannt. Die Anlage besteht
aus drei Reservoirgefäßen (A bis C) die mit Pufferlösung befüllt werden. Die Gefäße haben eine
Doppelwand. Das Lumen der Wand ist an einen zirkulierenden Fluss einer Wärmepumpe (Haake
DC10-P5 open Bath Circulator Thermo Scientific, Waltham, USA) angeschlossen, so dass die
Pufferlösung temperiert werden kann. In jedem Puffergefäß ist ein Glaslöffel (D) mit einer porösen
Fläche platziert, über den Carbogen-Gas in feinen Blasen in die Pufferlösung geleitet werden kann.
Die Begasung mit Carbogen dient in Kombination mit dem im Puffer enthaltenen Puffersystem aus
Bicarbonat der Konstanz des pH-Wertes. Über ein Schlauchsystem sind alle drei Reservoire mit
einer Heizspirale (E) verbunden. Durch Abklemmen der Schläuche wird die Zufuhr aus den
verschiedenen Reservoiren geregelt. In der Heizspirale durchläuft der Puffer eine Glasspirale, die
wiederum von dem temperierten Wasser des Kreislaufs der Wärmepumpe umspült wird. Unterhalb
der Heizspirale befindet sich ein 3-Wege-Hahn (F). Dieser dient der Entnahme von Puffer zu
Analysezwecken. Beim Befüllen der Anlage ist es wichtig, keine Luftblasen im Schlauchsystem
zuzulassen. Luftblasen können während des Versuchs in das Herz geschwemmt werden und dort
eine unkontrollierte Ischämie induzieren. Das Herz, unterhalb des 3-Wege-Hahns befestigt, befindet
sich ebenfalls in einem beheizten doppelwandigen Behältnis mit Deckel, um die Organtemperatur
zu sichern. Das Behältnis ist mobil, so dass zur Montage des Herzens oder Biopsieentnahme ein
Zugang zum Herz geschaffen werden kann. Die Höhe der Reservoirgefäße von ca. 90cm oberhalb
des Herzens sorgt für den Perfusionsdruck.
Wurden lichtempfindliche Substanzen in den Versuchen eingesetzt, wurden die gläsernen
Reservoirgefäße, die Heizspindel und Schlauchsysteme mit Alu-Folie umwickelt.
Herstellung der Glasbehälter: Medizinisch-Glastechnische-Werkstätte, Berlin
3.1.4. Computersoftware
SigmaStat SPSS inc., Chicago USA
SigmaPlot SPSS inc., Chicago USA
MicrosoftExcel Microsoft Deutschland GmbH; Unterschleissheim,
Deutschland
ImageTool University of Texas Health Science Center, San
Antonio, TX, USA
Material & Methoden
20
3.1.5. Lösungen, Medien
Krebs-Henseleit-Puffer
modifiziert für Rattenherzen
- 117 mM Natriumchlorid (NaCl)
- 2,6 mM Kaliumchlorid (KCl)
- 1,2 mM Magnesiumsulfat (MgSO4)
- 1,2 mM Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4-)
- 25 mM HEPES
- 11mM Glukose
TBS (10x) - 80g Natriumchlorid (NaCl)
- 2 g Kaliumchlorid (KCl)
- 30g Tris-Base
- ad 1 l Aqua dest.
- einstellen auf pH 7,6
TBST - 100 ml TBS (10x)
- 1 ml Tween 20
- ad 1 l Aqua dest.
Mircospheren gelöst 125mg fluoreszierende polymere Microspheren in 50ml
physiologischer Kochsalzlösung
Physiologische Kochsalzlösung
(NaCl 0,9%)
- 9g Natriumchlorid (NaCl)
- ad 1 l Aqua dest.
PBS phosphate buffered saline, PAA, Pasching, Österreich
Fixierer Tetanal, Norderstedt
Blotentwickler Tetanal, Norderstedt
3.1.6. Tiere
Für die Studien wurden Ratten der Firma Harlan Laboratories Inc., Indianapolis, Indiana, USA,
verwendet. Die Tiere waren vom Stamm Wistar, weiblich und zum Zeitpunkt des Versuchs 3-4
Monate alt. Sie hatten ein Körpergewicht von 180 bis 200g.
Material & Methoden
21
3.2. Methoden
3.2.1. Rattenherzen-Isolation im Langendorffmodus
3.2.1.1. Vorbereitung der Langendorffanlage und des Operationsfeldes
Bevor das Herz aus der Ratte heraus isoliert werden kann, muss die Langendorffanlage vorbereitet
werden.
Modifizierter Krebs-Henseleit-Puffer (24) wird in den Reservebehältern der Anlage erwärmt und
mit Carbogen-Gas für 30 Min. begast. Dies dient der Anreicherung des Puffers mit Sauerstoff sowie
der pH-Regulation über die CO2-Zufuhr zu dem Natriumbicarbonat-haltigen Puffer. Nach 30 Min.
werden die Schläuche der Anlage mit Puffer gefüllt. Besondere Achtung gilt hier den Luftblasen in
den Schläuchen der Anlage. Diese müssen unbedingt herausgespült werden, um die Gefahr einer
Luftembolie im isolierten Herzen zu minimieren. Klemmen an den Schläuchen der Anlage
verschließen die Zufuhr des Puffers vorerst.
Eine Flasche mit 300ml physiologischer Kochsalzlösung wird im Tiefkühlschrank abgekühlt und
unmittelbar vor Beginn der Operation in die zwei Petrischälchen gefüllt.
3.2.1.2. Betäubung
Die Ratten wurden mit einer intraperitonealen Thiopental-Injektion betäubt (60mg/kg). Der
Thiopental-Injektion wurden 1000 Einheiten Heparin zugesetzt.
3.2.1.3. Operation
Zur Operation wurde die betäubte Ratte auf dem Rücken liegend an beiden Vorderläufen fixiert.
Der Thorax wurde mit Ethanol befeuchtet. Dies machte die Schnitte durch das Fell leichter und
besser steuerbar.
Das Fell wurde beginnend vom Processus xiphoideus beidseits bis in die Fossae axillares
eingeschnitten. Über dem Thorax wurde das Fell bis zum Halsansatz stumpf gelöst. Der nun frei
liegende Thorax und das Epigastrium wurden ebenfalls von kaudal her eröffnet. Zuerst wurde der
Bauchraum zwischen den beiden Rippenbögen geöffnet. Durch Erweitern der Öffnung nach lateral
durch die unteren Rippen und den Rippenbogen, wurde auch das Diaphragma pelvis lateral
beidseitig eingeschnitten. Die beiden lateralen Einschnitte im Diaphragma pelvis wurden nun
entlang des Ansatzes des Diaphragmas an der vorderen Brustwand verbunden.
Die Rippen wurden in der Axillarlinie durchtrennt. Der Thorax ließ sich nun durch Umschlagen der
ventralen Thoraxwand nach kranial leicht öffnen.
Das freiliegende Herz wurde mit zwei Fingern angehoben. Starker Druck auf das Herz war dabei zu
vermeiden. In zwei groben Schnitten durch das obere Mediastinum wurde das Herz mitsamt
Material & Methoden
22
Thymus und angrenzenden Lungenteilen aus dem Thorax herausgeschnitten und in bereitstehende
Petrischälchen mit eisgekühlter physiologischer Kochsalzlösung gegeben.
Die Reste der Lunge wurden entfernt. Dann wurde mit den zwei anatomischen Pinzetten je ein
Lappen des großen, juvenilen Thymus gegriffen und vorsichtig durch Zug entfernt.
Unter dem Thymus lag nun der Aortenbogen mit den großen Gefäßabgängen von Truncus
brachiocephalicus, A. carotis communis sinistra und A. cephalica frei. Unmittelbar proximal des
Abgangs des Truncus brachiocephalicus wurde die Aorta etwa im 90° Winkel zur Gefäßwand mit
der Schere durchtrennt.
Die so aufpräparierte Aorta ascendens wurde mit den beiden anatomischen Pinzetten gegriffen und
aus dem Eiswasser heraus über den Konus der Langendorffanlage gezogen. Zu beachten war, dass
die Aorta nur wenige Millimeter über den Konus gezogen werden durfte, um nicht die
Aortenklappen mit dem Konus zu verletzen. Eine intakte, funktionsfähige Aortenklappe war
zwingend nötig, damit bei retrograder Perfusion der Aorta der Druck der Wassersäule der
Langendorffanlage nicht durch die defekte Aortenklappe entweichen konnte, sondern den Puffer in
den Abgang der Koronargefäße gedrückt hat.
Mit einer Pinzette wurden die Aorta und das Herz in Position gehalten, um dann mit der Bulldog-
Clamp die Aorta am Konus passager festzuklemmen. Der chirurgische Faden (3-0) wurde
genommen, um dann die Aorta um den Konus zu fixieren. Nun wurde die Klemme, die den
Schlauch der Reservoirgefäße verschloss, geöffnet. Schon nach wenigen Augenblicken Perfusion
mit Krebs-Henseleit-Puffer begann das Herz wieder zu schlagen. Stimulierende Maßnahmen waren
nicht nötig.
3.2.1.4. Handhabung an der Langendorffanlage
Während des Versuchs wurden die Umgebungsbedingungen für den Versuch regelmäßig
kontrolliert. Dazu gehörten Temperaturmessung am Herzen, pH-Wert-Kontrollen im Puffer und
Füllstand der Reservoirgefäße.
Je nach Protokoll wurde der Fluss in den Koronararterien gemessen. Da durch die retrograde
Versorgung des Herzens der gesamte Puffer, der den Abfluss der Anlage passierte, durch die
Koronarien geflossen sein musste, konnte man den Koronararterienfluss unterhalb der Anlage
messen. Dazu wurde ein Messzylinder (25ml) verwendet und so der Fluss in ml/Min. bestimmt.
Material & Methoden
23
3.2.1.5. Simulation der Ischämie
3.2.1.5.1. Global
Zur Simulation einer globalen Ischämie wurde der Zufluss zum isolierten Herzen komplett für 30
Min. verschlossen.
3.2.1.5.2. Regional
Mit der chirurgischen Naht (2-0) wurde ein Koronargefäß umstochen. Da am isolierten Herzen die
mit farblosem Puffer gefüllten Koronargefäße nicht sichtbar waren, habe ich mich beim Umstechen
am Auricula cordis sinistra orientiert. So wurde versucht, eine möglichst hohe Vergleichbarkeit
beim Umstechen zu erreichen. Da aber je nach Herz unterschiedlich große Areale von der
regionalen Ischämie betroffen waren, wurde dies auch bei der Auswertung berücksichtigt. Der
Faden wurde dann 3-4cm oberhalb der Ein- bzw. Ausstichstelle abgeschnitten.
Zum Verschluss des Koronargefäßes wurden beide Enden des Fadens durch einen ca. 5mm langen
Polyethylenschlauch gefädelt. Dieser Schlauch wurde dann mit leichtem Druck auf das Myokard
gezogen und mit einem Nadelhalter festgeklemmt.
Eine erste Kontrolle, ob ein Koronargefäß erfolgreich verschlossen wurde, war die Veränderung des
Koronarflusses. Dieser wurde
immer vor und nach Beginn der
Ischämie gemessen und sollte
deutlich abfallen.
Durch Lösen des Nadelhalters
konnte die regionale Ischämie
leicht wieder aufgehoben
werden.
Nach der 30minütigen
Indexischämie wurden die
Herzen für 120 Min. an der Anlage reperfundiert. In dieser Zeit konnte sich der
Reperfusionsschaden ausprägen. Nach 120 Min. wurden die Herzen ausgewertet.
3.2.2. Infarktgrößenbestimmung
3.2.2.1. Regional
Am Ende des Versuchs wurde die Koronararterie mittels Polyethylenschlauch erneut verschlossen.
Dazu wurde zur Simulation der Ischämie wie oben beschrieben vorgegangen. 2,5ml der
Micropheres-Lösung wurden auf eine 5ml Einmalspritze gezogen. Die Spritze wurde an den 3-
Wege-Hahn über dem Konus der Langendorffanlage angesetzt und dort dann auf 5ml mit Puffer aus
Abb.7 Schematische Darstellung des Grundprotokolls der Infarktgrößenbestimmung an der Langendorffanlage. Nach einer 30minütigen Einschlagphase schließt sich die 30 Min. Indexischämie an, gefolgt von 120 Min. Reperfusion.
Material & Methoden
24
der Anlage aufgezogen. Die Zufuhr von Krebs-Henseleit-Puffer wurde unmittelbar über der
Wärmespirale der Anlage abgeklemmt und die Microspheres in das Herz gespritzt. Sie verteilten
sich nun in dem Gewebe, welches der regionalen Ischämie nicht ausgesetzt war (32).
Das Herz wurde nun abgenommen, und mit handelsüblicher Aluminium-Folie eingewickelt, und für
30-45 Min. bei -20°C gefroren.
Mit einer Rasierklinge wurde das Herz in ca. 1mm dicke Scheiben geschnitten. Die Herzscheiben
wurden in einer Lösung aus 125mg Tetrazolium in 25ml PBS in einem Erlenmeyerkolben für 8
Min. im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Da Tetrazolium von vitalem Gewebe reduziert wird, färbte
sich das vitale Gewebe dabei tief rot. Infarziertes Gewebe war nicht in der Lage, das Tetrazolium zu
reduzieren und stellte sich daher nach der
Färbung weiß bis beige dar (30).
Zur Fixierung der Färbung wurden die
Herzscheiben in 70%igem Formaldehyd
für mindestens 1 Stunde inkubiert.
Zur exakten Auswertung wurden die
Herzscheiben zwischen zwei
Glasscheiben fixiert. Dabei wurden die
Scheiben so angeordnet, dass jeweils die
dem Apex abgewandte Seite nach oben
zeigte.
Um eine Auswertung von Gesamtgröße
des Herzen, Größe des Risikoareals, und
Größe des letztlich an der Ischämie zu
Grunde gegangenen Areals zu bestimmen, wurde auf die Glasscheibe eine transparente Folie gelegt,
auf die mit verschiedenen Farben die genannten Areale übertragen wurden. Das Risikoareal wurde
unter UV-Licht angezeichnet. Im UV-Licht fluoreszierten die am Ende des Versuches in den Nicht-
Risikoteil eingespritzten polymeren Microspheres. Das Risikoareal stellte sich also als der nicht
fluoreszierende Teil der Herzscheiben dar.
Die Herzscheiben und die Folie mit den übertragenden Arealen wurden mit einem Referenzmaßstab
mittels eines Scanners digitalisiert und mit dem Programm ImageTool® quantitativ ausgewertet.
Die Zielgröße des Infarkts wurde in Prozent am Risikoareal angegeben, um so Unterschiede in der
Größe des Risikoareals gegenüber einer Angabe in Quadratzentimetern auszugleichen. Für diese
Auswertung wurde eine mit MicrosoftExcel entwickelte Auswertevorlage verwendet.
Abb.8 Oben vor blauem Grund: eingescannte Herzschnitte; unten die dazu gehörige Folie mit den zur Auswertung übertragenden Arealen. Zur Skalierung ist ein mit eingescanntes Zentimetermaß abgebildet. Das linke Bild zeigt ein ischämisch konditioniertes Myokard, das rechte einen Infarkt ohne Konditionierung.
Material & Methoden
25
3.2.2.2. Global
Die Auswertung erfolgte wie die der regionalen Ischämie, nur war eine Bestimmung und
Berücksichtigung des Risikoareals natürlich nicht nötig. D.h. das Einspritzen von Microspheres am
Ende des Versuchs entfiel. Der Infarkt wurde in Prozent am linken Ventrikel angegeben.
3.2.2.3. Durchgeführte Protokolle
Infarktgrößenbestimmung bei regional induzierter Ischämie wurde mit folgenden Protokollen
durchgeführt.
Zum einen wurden Herzen, wie oben geschildert, nach einer Einschlagphase von 30 Min. und einer
Indexischämie ohne weitere Intervention nach 120 Min. Reperfusionsphase analysiert
(schematische Darstellung in Abbildung 9).
Abb.9
Neben dieser Kontrollgruppe wurde Vardenafil in verschiedenen Dosierungen vor und nach der
Ischämie infundiert. Präischämische Behandlung erfolgte für 20 Min. unmittelbar vor der Ischämie,
postischämische Gabe wurde 5 Min. vor Ende der Indexischämie begonnen und für die Dauer der
Reperfusion fortgesetzt. Eingesetzt wurden in Prä- und Postkonditionierung die Dosierungen 1, 10,
100nM sowie 1µM (schematische Darstellung in Abbildung 10).
Material & Methoden
26
Abb.10
Diese Gabe von Vardenafil in der Dosierung 10nM wurde durch verschiedene Enzyminhibitoren
ergänzt: N!-Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester-Hydrochlorid (L-NAME), ein Inhibitor der eNOS in
200#M (49), 1H-(1,2,4)oxadiazolo(4,3-a)quinoxalin-1-one (ODQ), einen Guanylatcyclase-Blocker
in 10µM (50) sowie KT5823 in 1µM einen Inhibitor der PKG (51). Die Infusion des Blockers
wurde 5 Min. vor Beginn der Vardenafil-Gabe, also 10 Min. vor Ende der Indexischämie begonnen.
Die Inhibitoren wurden alle auch ohne gleichzeitige Vardenafil-Gabe analysiert (schematische
Darstellung in Abbildung 11).
Abb.11
Material & Methoden
27
Das cGMP-Analogon 8-pCPT-cGMP wurde in einer Konzentration von 10µM und 100µM für die
ersten 20 Min. der Reperfusion, begin nend 10 Min. vor Ende der Indexischämie eingesetzt. Die
Konzentration von 10µM wurde mit einer Gabe von 1µM Vardenafil für die Dauer der Reperfusion
ergänzt (schematische Darstellung in Abbildung 12).
Abb.12
3.2.3. Biopsie-Entnahme
Die Entnahme von Biopsien aus dem isolierten Rattenherzen erweitert die Möglichkeiten zur
Analyse der untersuchten Phänomene erheblich. Wir haben die entnommenen Biopsien zur cGMP-
Level Bestimmung verwendet. Die Entnahme der Biopsien erfolgte dabei immer mit der gleichen
Technik. Zum einen ist es mit unserer Methode möglich, in einem Herzen zu zwei
unterschiedlichen Zeitpunkten eine Probe zu entnehmen, zum anderen ist es möglich mehrere
Herzen nach unterschiedlichen Protokollen zu einem definierten Zeitpunkt zu vergleichen.
Die Isolationsoperation unterschied sich nicht von der oben beschriebenen Technik zur
Infarktgrößenbestimmung. Da aber am isolierten Herzen bei regional induzierter Ischämie nicht
während des laufenden Versuches das Risikoareal markiert werden konnte, war nur eine global
induzierte Ischämie sinnvoll. Proben konnten vor, während oder nach der Ischämie entnommen
werden.
Zur Entnahme haben wir einen modifizierten Zahnarztbohrer verwendet. Der Bohrkopf wurde
durch einen angeschliffenen Hohlzylinder mit 3mm Durchmesser ersetzt. Im Inneren des
Bohrzylinders konnte durch über eine angeschlossene elektrische Pumpe ein Über- bzw.
Unterdruck erzeugt werden. Dies diente der Entnahme bzw. Abgabe der Probe.
Material & Methoden
28
Wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten Biopsien entnommen, so war die erste Biopsie nahe dem
Apex zu entnehmen. Da die Herzkranzgefäße aus der Aorta in der Ebene der Herzklappen
entspringen und von dort aus bis zur Herzspitze herunterziehen, war mit einer Entnahme der ersten
Biopsie am Apex des Herzens eine Versorgungsstörung des Areals der zweiten, später entnommen
Probe minimiert.
Die Biopsien wurden unmittelbar nach Entnahme in flüssigem Stickstoff gefroren und je nach
Fragestellung weiter aufgearbeitet.
Für diese Arbeit haben wir nach 30 Min. Einschlagphase und 30 Min. Ischämie bei Minute 20 der
Reperfusion die Biopsien entnommen. Dabei wurde zum einen ein Protokoll ohne weitere
Pharmakazugabe verwendet, zum anderen haben wir den cGMP-Level bei einer Zugabe von 10nM
und 1µM Vardenafil analysiert.
3.2.4. cGMP-Level Bestimmung
Die Proben für die cGMP-Level Bestimmung hat in freundlicher Zusammenarbeit das Labor von
Bayer Healthcare, Wuppertal analysiert. Wir haben die Proben entnommen und auf Trockeneis
gekühlt per Expresskurier verschickt.
3.3. HL-1-Zelllinie
3.3.1. Zellkultivierung
Die Kultivierung der HL-1-Zellen (41) wurde mit Claycomb-Medium durchgeführt, welches mit
10% (v/v) FCS, 100#g/ml Streptomycin, 100u/ml Penicillin und 1nM L-Glutamin angereichert
wurde. Zur Kultivierung wurden 75cm3 große Kulturflaschen verwendet, wobei die 20ml Medium
pro Flasche täglich gewechselt wurden. Die Kulturflaschen wurden in einem Brutschrank bei 37°C
und Begasung mit 95% O2 und 5% CO2 bebrütet.
Das Splitten der Zellkultur haben wir durchgeführt, sobald der Boden der Flasche mikroskopisch
dicht mit Zellen bewachsen war, also circa alle vier bis fünf Tage. Zum Splitten einer Kulturflasche
wurde nach Entfernung des Kulturmediums im nächsten Schritt mehrfach mit 10ml D-PBS
gewaschen. Um die Zellen trennen zu können, wurden sie mit Trypsin vom Flaschenboden gelöst.
Dazu wurden 5ml Trypsin-EDTA bei 37°C für 10 bis 15 Min. appliziert. Durch gründliches
Resuspensieren wurde die Zellablösung mechanisch unterstützt. Je 0,5ml der Suspension aus Zellen
und Trypsin wurden dann in eine frische Kulturflasche, in der 20ml angereichertes Kulturmedium
vorgelegt waren, übertragen. Das Medium stoppte die Aktivität des Trypsins und verhinderte so
Zellschäden durch zu lange Einwirkdauer des Trypsins.
Material & Methoden
29
3.3.2. Messungen der PKG-Aktivität mittels Westernblotting
Zur Durchführung der Westernblot-Analysen wurden die HL-1 Zellen in 6-Well-Platten ausgesät
und über 24 Stunden dort angewachsen. Zuvor sind die Zellen wie zum Splitten der
ausgewaschenen Zellkulturflaschen mittels Trypsin-EDTA vom Flaschenboden gelöst worden.
Wirkstoffe konnten direkt mit dem Medium auf die Zellen gegeben werden. In dieser Arbeit
wurden neben einer Kontrollgruppe ohne Wirkstoffzugabe, Gruppen nach Zugabe von je Vardenafil
oder KT5823 alleine sowie Vardenafil in Kombination mit KT5823 untersucht.
Nach 80 Min. Einwirkdauer wurde das (mit Wirkstoff versehene) Medium entfernt und durch 200#l
eiskalten Lysispuffer ersetzt. Der Lysispuffer wurde zuvor mit 1mM PMSF versetzt. Die Wells
wurden mit einem Zellschaber geerntet. Zum Abtrennen der zytosolischen Proteine wurde die
geerntete Suspension in Eppendorfgefäßen 15 Min. bei 13000rpm unter 4°C zentrifugiert. Der
Überstand, der die zytosolischen Proteine enthielt, wurde dann in ein weiteres Eppendorfgefäß
übertragen.
Mittels eines BCA-Protein-Analyse-Kits wurde im Vergleich zu einer Eichreihe der Proteingehalt
der Proben gemessen. Auf dieser Grundlage wurde jede Probe zum Westernblotting auf 50#g
standardisiert, um einen quantitativen Vergleich in der Auswertung zu ermöglichen. Durch
Gelelektrophorese im SDS-PAGE Gel wurden die Proteine nach ihrer molekularen Masse
aufgetrennt. Durch Anlegen eines elektrischen Gradienten wurden die aufgetrennten Proteine auf
die Nitrozellulosemembran übertragen und so immobilisiert.
Auf den Nitrozellulosemembranen konnten nun durch den Einsatz spezifischer Antikörper Proteine
detektiert werden. Durch den Einsatz eines sekundären Fluoreszenz-Antikörpers gegen das Fc-
Fragment des primären Antikörpers konnten nun durch Chemilumineszenz die Banden des Proteins,
gegen das sich der primäre Antikörper richtete, detektiert werden. Die Fluoreszenz war direkt
proportional zur Menge des Proteins in der Probe. Bei identischer Gesamtproteinmenge in jeder
Gel-Tasche war auch eine direkte Relation zum Anteil am zytosolischen Protein der Zellkultur
gegeben.
Wir haben Antikörper gegen das Vasodilatator-stimulierte Phosphoprotein verwendet. Dieses
Protein wird durch die PKG phosphoryliert (64).
3.4. Statistik
Die statistische Auswertung wurde mittels SPSS SigmaStat durchgeführt. Zum Vergleich der
Versuchsgruppen wurden ein One-Way-ANOVA mit Fisher`s LSD post hoc angewendet. Als
statistisch signifikant wurde ein P < 0,05 angesehen. Die Mittelwerte der Gruppen sind jeweils mit
dem Standardfehler (Standard Error of the Mean, SEM) angegeben.
Ergebnisse
30
4. Ergebnisse
4.1. Kontrolle der Indexischämie und ischämische Prä- und
Postkonditionierung
4.1.1. Infarktgrößenbestimmung
Zur Etablierung des Modells in der Ratte wurde eine Serie von Herzen nur der Indexischämie von
30 Min. ausgesetzt und keiner schützenden Behandlung zugeführt. Diese Gruppe diente dem
Nachweis der Wirksamkeit der Indexischämie in dem Modell der isolierten Rattenherzen an der
Langendorffanlage. Die alleinige Indexischämie hatte eine Infarktgröße von 45,76 +/- 2,03% am
Risikoareal zur Folge.
Wurden die Herzen mit einer ischämischen Präkonditionierung (IPC) durch 5 Zyklen von 30 Sek.
globaler Ischämie und 30 Sek. Perfusion vorbehandelt, so konnte die mittlere Infarktgröße im
Risikoareal auf 14,85 +/- 1,88% gesenkt werden, was einer statistisch signifikanten Reduktion
entsprach (P <0,001).
Ein Protokoll, um eine ischämische Postkonditionierung auszulösen, wurde mit einer repetitiven
Ischämie von 12 x 30 Sek. nach der Indexischämie durchgeführt. Allerdings konnte die
Infarktgröße durch dieses Protokoll nicht gesenkt werden und lag bei 42,16 +/- 3,60% am
Risikoareal.
Graphische Darstellung in Abbildung 13; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 1.
Kontrolle Ischämische
Präkonditionierung
Ischämische
Postkonditionierung
49,2 15,8 43,5
36,7 18,4 32,0
54,7 13,8 41,8
43,8 22,1 31,7
52,6 9,1 54,9
45,3 11,9 53,1
41,1 12,5 38,1
49,0 14,2
39,5 5,3 Infa
rktg
röße
in
% a
m R
isik
oare
al
25,4
Durchschnitt
+/- SEM
45,76
+/- 2,03
14,85
+/- 1,88
42,16
+/- 3,60
Tabelle 1
Ergebnisse
31
4.1.2. Koronarfluss
Durch die ischämische Präkonditionierung wurde der koronare Fluss zu Beginn der Ischämie
gegenüber den anderen Gruppen angehoben. Unmittelbar nach Beendigung der Ischämie zeigten
die konditionierten Herzen einen gesteigerten Koronarfluss. Es ergab sich zu den jeweiligen
Messzeitpunkten keine statistisch signifikante Differenz, lediglich ein Trend war erkennbar. Im
weiteren Verlauf glichen sich die Flussraten an.
Graphische Darstellung in Abbildung 14; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 2.
Abb.13 Dargestellt sind die Einzelwerte und der jeweilige Gruppendurchschnitt mit Standardfehler der unbehandelten Kontrollgruppe und der Gruppen der ischämischen Prä- (IPC) und Postkonditionierung (IPostC).
= Einzelwert eines Versuchs = Gruppendurchschnitt mit Standardfehler
= Signifikante Reduktion gegenüber der Kontrollgruppe Eine ischämische Präkonditionierung verringert die Infarktgröße signifikant zur Kontrollgruppe, die durchgeführten Postkonditionierung nicht.
Ergebnisse
32
Zeitpunkt
Protokoll
Beg
inn
Ein
schl
agen
End
e
Ein
schl
agen
Beg
inn
Isch
ämie
End
e
Isch
ämie
Rep
erfu
sion
5’
Rep
erfu
sion
60’
Rep
erfu
sion
120’
Kontrolle 12,3 ± 0,7 8,4 ± 1,4 4,9 ± 0,7 4,6 ± 0,7 8,6 ± 0,7 6,3 ± 1,0 5,5 ± 0,8
IPC 11,5 ± 0,5 8,2 ± 0,5 7,6 ± 0,9 5,6 ± 0,9 10,9 ± 0,6 6,5 ± 0,6 0,58 ± 0,6
IPostC 10,8 ± 2,1 6,3 ± 1,7 4,2 ± 1,4 4,0 ± 1,3 9,7 ± 1,7 6,0 ± 1,8 4,6 ± 1,7
Tabelle 2
Abb.14 Darstellung der Veränderungen des durchschnittlichen Koronarflusses unter ischämischer Prä- und Postkonditionierung. Statistisch signifikante Unterschiede bestanden nicht.
regionale
Ischämie
Ergebnisse
33
4.2. Präkonditionierung durch Vardenafil
4.2.1. Infarktgrößenbestimmung
Es wurden verschiedene Konzentrationen von Vardenafil für 20 Min. unmittelbar vor der
Indexischämie gegeben. Beginnend mit 1nM wurden 10nM, 100nM und 1!M appliziert. Es konnte
gezeigt werden, dass man mit der Gabe von 10nM Vardenafil für 20 Min. vor der ischämischen
Phase einen sicheren Schutz für das Myokard erzeugen kann. Wurde die Konzentration von
Vardenafil verringert oder erhöht, so verringerte sich die protektive Wirkung des Vardenafils.
Allerdings waren gegenüber der alleinigen Ischämie die Reduktionen der Infarktgröße in allen
Gruppen statistisch signifikant. Ein signifikanter Unterschied war auch zwischen der Gabe von
10nM Vardenafil und der Gabe von 100nM oder 1µM Vardenafil gegeben.
Graphische Darstellung in Abbildung 15; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 3.
Vardenafil 20’ vor regionaler Indexischämie Globale
Ischämie
1nM 10nM 100nM 1µM 10nM
25,7 19,9 37,4 31,5 30,0
13,0 24,6 22,7 25,2 24,0
29,6 24,7 19,1 41,7 23,6
38,4 16,5 32,5 35,5 15,2
38,4 17,9 32,2 42,2
25,7 24,5
Infa
rktg
röße
in
% a
m
Ris
ikoa
real
25,0
Durchschnitt
+/- SEM
28,47
+/- 3,89
21,87
+/- 1,39
30,98
+/- 3,11
33,47
+/- 3,47
27,00
+/- 4,47
Tabelle 3
Ergebnisse
34
4.3. Postkonditionierung durch Vardenafil
4.3.1. Infarktgrößenbestimmung
Wurde Vardenafil für die Zeit der Reperfusion nach der Indexischämie appliziert, zeigte sich eine
ähnliche Dosis-Wirkungskurve wie bei Gabe vor der Indexischämie. Ein Maximum an protektiver
Wirkung konnte wieder für 10nM Vardenafil in der Pufferlösung gezeigt werden, welche als
einzige Dosis eine signifikante Reduktion der Infarktgröße zur Kontrolle zeigte (P<0,001).
Abb.15 Dargestellt sind die Einzelwerte und der jeweilige Gruppendurchschnitt mit Standardfehler der unbehandelten Kontrollgruppe, der Gruppe der ischämischen Präkonditionierung sowie der Gruppen der unterschiedlichen Vardenafildosis bei regional induzierter Ischämie. Ganz rechts dargestellt ist die Gruppe mit 10nM Vardenafil bei global induzierter Ischämie.
= Einzelwert eines Versuchs = Gruppendurchschnitt mit Standardfehler
= Signifikante Reduktion gegenüber der Kontrollgruppe
Ergebnisse
35
Erhöhung bzw. Verminderung der Konzentration führte ebenfalls zu einer signifikanten Zunahme
der durchschnittlichen Infarktgröße in Prozent am Risikoareal.
Graphische Darstellung in Abbildung 16; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 4.
Vardenafil Kontrolle
1nM 10nM 100nM 1µM
49,2 34,9 33,8 51,1 45,0
36,7 46,7 28,8 40,0 56,6
54,7 29,3 33,3 26,3 43,0
43,8 33,3 18,0 44,8 52,3
52,6 34,9 22,2 35,1 35,5
45,3 51,8 21,0 33,7 30,9
41,1
49,0
Infa
rktg
röße
in
% a
m R
isik
oare
al
39,5
Durchschnitt
+/- SEM
45,76
+/- 2,03
38,48
+/- 3,57
26,18
+/- 2,74
38,50
+/- 3,58
43,88
+/- 3,97
Tabelle 4
Ergebnisse
36
4.3.2. Koronarfluss
Die Analyse der durchschnittlichen Flüsse in den Koronargefäßen zeigte, dass die schützende Dosis
Vardenafil (10nM) den Koronarfluss leicht gesteigert hat. Bei weiterer Dosiserhöhung konnte ein
weiterer Anstieg des Koronarflusses beobachtet werden. Gegenüber der Kontrollgruppe ergab sich
ein statistisch signifikanter Unterschied für die Gruppe mit 1!M Vardenafil zum Ende der
Ischämiephase (p=0,007), Minute 5 der Reperfusion (p=0,008) und Minute 60 der Reperfusion
(p<0,001). Gegenüber 10nM Vardenafil war die Gruppe mit 1!M Vardenafil zu Minute 5 der
Reperfusion (p=0,047) signifikant different.
Graphische Darstellung in Abbildung 17; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 5.
Abb.16 Darstellung der Infarktgrößen gegenüber der nicht konditionierten Kontrollgruppe. Vardenafil erreicht die durchschnittlich kleinsten Infarktgrößen bei einer Dosis von 10nM. Höhere oder niedrigere Dosen reduzieren die Infarktgröße nicht signifikant.
= Einzelwert eines Versuchs = Gruppendurchschnitt mit Standardfehler
= Signifikante Reduktion gegenüber der Kontrollgruppe = Signifikante Differenz zur Gruppe mit 10nM Vardenafil
Ergebnisse
37
Zeitpunkt
Protokoll
Beg
inn
Ein
schl
agen
End
e
Ein
schl
agen
Beg
inn
Isch
ämie
End
e
Isch
ämie
Rep
erfu
sion
5’
Rep
erfu
sion
60’
Rep
erfu
sion
120’
Vardenafil 1nM 13,3 +/- 0,3
9,6 +/- 1,7 6,2 +/- 0,5 5,8 +/- 0,8 10,6 +/- 2,2
7,6 +/- 1,2 5,6 +/- 0,8
Vardenafil 10nM 12,0 +/- 0,5
7,6 +/- 0,9 6,0 +/- 1,9 5,8 +/- 1,9 9,2 +/- 1,6 8,3 +/-1,7 6,6 +/- 2,0
Vardenafil 100nM 12,8 +/- 0,6
9,1 +/- 1,0 5,5 +/- 0,5 6,7 +/- 0,9 11,1 +/- 1,5
9,3 +/- 1,1 8,2 +/- 1,3
Vardenafil 1µM 12,5 +/- 0,9
8,8 +/- 1,1 4,8 +/- 0,4 9,1 +/- 0,8 13,9 +/- 1,1
12,2 +/- 1,4
10,3 +/- 1,7
Tabelle 5
Abb.17 Darstellung des durchschnittlichen Koronarflusses unter der Gabe von Vardenafil in unterschiedlichen Dosen. Vardenafil erhöht den Fluss im Vergleich zur Kontrollgruppe.
regionale Ischämie
Ergebnisse
38
4.4. Enzyminhibitoren
4.4.1. L-NAME
Durch Blockade der endothelialen NO-Synthase durch Gabe von L-NAME war es nicht möglich,
ein durch Vardenafil ausgelöstes protektives Signal zu blockieren. Die Gabe von 200!M L-NAME
während der Reperfusion mit 10nM Vardenafil führte weiterhin zu einer signifikant kleineren
Infarktgröße (35,33%) im Vergleich zu der Gabe von Vardenafil allein.
Die alleinige Infusion von 200!M L-NAME in der Reperfusion beeinflusste die Infarktgröße nicht
(43,57%).
Graphische Darstellung in Abbildung 18; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 6.
L-NAME VAR + L-NAME
39,2 36,4
40,6 26,4
50,9 42,4
31,8
30,2
Infa
rktg
röße
in
% a
m
Ris
ikoa
real
44,8
Durchschnitt +/- SEM
43,57 +/- 3,69
35,33 +/- 2,94
Tabelle 6
Ergebnisse
39
4.4.2. ODQ
Die Applikation von ODQ in der Reperfusion zur Inhibition der NO-sensitiven Guanylatcyclase hat
den Schutz durch Vardenafil blockiert. Im Vergleich zur alleinigen Gabe von Vardenafil war die
durchschnittliche Infarktgröße mit 43,97 +/- 1,78% signifikant (P<0,001) erhöht. Die alleinige Gabe
von ODQ in der Reperfusion (39,92 +/- 3,93%) hat die Infarktgröße nicht beeinflusst.
Graphische Darstellung in Abbildung 19; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 7.
Abb.18 Darstellung der Infarktgrößen nach Gabe von L-NAME. Vardenafil 10nM zeigt in Kombination mit L-NAME einen signifikanten unterschied zur Gabe von Vardenafil 10nM alleine. Die Gabe von L-NAME alleine beeinflusst die Infarktgröße nicht.
= Einzelwert eines Versuchs = Gruppendurchschnitt mit Standardfehler
= Signifikante Differenz gegenüber 10nM Vardenafil
Ergebnisse
40
Vardenafil 10nM + ODQ ODQ
50,6 31,6
40,9 36,5
47,0 50,0
42,7 41,6
38,4
Infa
rktg
röße
in
% a
m
Ris
ikoa
real
44,2
Durchschnitt
+/- SEM 43,97
+/- 1,78 39,92
+/- 3,93
Tabelle 7
Abb.19 Darstellung der Versuchsgruppen unter Gabe von ODQ. Die Kombination von Vardenafil 10nM mit ODQ zeigte einen signifikanten Unterschied zur Gabe von Vardenafil 10nM alleine.
= Einzelwert eines Versuchs = Gruppendurchschnitt mit Standardfehler
= Signifikante Differenz gegenüber 10nM Vardenafil
Ergebnisse
41
4.4.3. KT5823
Die Inhibition der PKG durch Gabe von KT5823 in der Reperfusion hat den durch Vardenafil-
Applikation induzierten Schutz blockiert. Die durchschnittliche Infarktgröße am Risikoareal war
mit 42,53 +/- 1,85% signifikant verändert zur Gabe von Vardenafil alleine, aber nicht verändert zur
Kontrollgruppe. Die isolierte KT5823 Gabe während der Reperfusion hat die Infarktgröße nicht
signifikant beeinflusst (45,33 +/- 1,34%).
Graphische Darstellung in Abbildung 20; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 8.
KT5823 Vardenafil + KT5823
48,9 35,4
44,6 42,3
42,5 41,5
44,7 49,3
41,9
Infa
rktg
röße
in
% a
m
Ris
ikoa
real
44,7
Durchschnitt +/-
SEM 45,33
+/- 1,34
42,53 +/- 1,85
Tabelle 8
Ergebnisse
42
4.4.4. Koronarfluss Enzyminhibitoren
Die Zugabe der Enzyminhibitoren in Kombination mit Vardenafil (10nM) oder alleine veränderte
die Flussrate der Pufferlösung in den Koronarien nicht signifikant gegenüber der Gruppe Vardenafil
(10nM) oder der unbehandelten Kontrollgruppe.
Graphische Darstellung in Abbildung 21; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 9.
Abb.20 Darstellung der Versuche mit der Kombination von Vardenafil 10nM und KT5823. Signifikant größere Infarkte waren durch die Kombination von KT5823 mit Vardenafil 10nM im Vergleich zu Vardenafil 10nM alleine zu beobachten.
= Einzelwert eines Versuchs = Gruppendurchschnitt mit Standardfehler
= Signifikante Differenz gegenüber 10nM Vardenafil
Ergebnisse
43
Zeitpunkt
Protokoll
Beg
inn
Ein
schl
agen
End
e
Ein
schl
agen
Beg
inn
Isch
ämie
End
e
Isch
ämie
Rep
erfu
sion
5’
Rep
erfu
sion
60’
Rep
erfu
sion
120’
L-NAME 13,7 +/- 0,7
8,8 +/- 1,4 5,7 +/- 1,2 5,2 +/- 1,2 7,7 +/- 1,5 5,7 +/- 1,3 4,5 +/- 0,9
L-NAME + VAR 13,0 +/- 0,7
6,9 +/- 0,3 4,0 +/- 0,3 3,6 +/- 0,1 7,4 +/- 0,3 5,7 +/- 0,3 4,7 +/- 0,4
ODQ 10,8+/- 2,2
7,5 +/- 3,5 5,0 +/- 3,0 2,5 +/- 0,6 5,5 +/- 1,0 5,0 +/- 0,6 3,8 +/- 0,2
ODQ + VAR 11,3 +/- 1,0
5,8 +/- 0,6 3,9 +/- 0,5 3,8 +/- 0,4 7,2 +/- 0,6 5,4 +/- 0,5 4,3 +/- 0,2
KT5823 11,6 +/- 1,5
5,4 +/- 0,5 3,8 +/- 0,4 3,3 +/- 0,2 6,5 +/- 0,5 3,1 +/- 0,3 2,3 +/- 0,2
KT5823 + VAR 12,0 +/- 0,9
8,2 +/- 1,7 4,8 +/- 0,9 3,9 +/- 0,5 7,5 +/- 0,5 3,6 +/- 0,3 2,5 +/- 0,1
Tabelle 9
Abb.21 Darstellung der Entwicklung des Koronarflusses unter Gabe der Enzymblocker alleine und in Kombination mit Vardenafil 10nM.
regionale Ischämie
Ergebnisse
44
4.5. Analogon 8-pCPT-cGMP
Die Gabe von 10!M 8-pCPT-cGMP für 20 Min. nach der Indexischämie senkte die Infarktgröße im
Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant (26,45 +/- 4,15%). Eine Erhöhung der Dosis auf 100!M
zeigte eine Reduktion dieses Effektes (34,82 +/- 3,16). Die Kombination von Vardenafil 1!M mit
10!M 8-pCPT-cGMP hatte keine Reduktion der Infarktgröße zur Folge (42,53 +/- 3,75).
Bezüglich des Koronarflusses ergab sich eine statistisch signifikante Differenz im Vergleich zur
unbehandelten Kontrollgruppe für die mit 100!M 8-pCPT-cGMP behandelten Herzen zum Ende
der Ischämiephase (p=0,011), zu Minute 5 der Reperfusion (p= 0,002) und zu Minute 60 der
Reperfusion, sowie für die Gruppe der Kombination aus Vardenafil 1!M und 8-pCPT-cGMP 10!M
zum Ende der Ischämiephase (p=0,009) und Minute 5 der Reperfusionsphase (p=0,011). Statistisch
signifikant unterschiedlich im Vergleich zur Gruppe mit 10nM Vardenafil war lediglich die Gruppe
mit 100!M 8-pCPT-cGMP zu Minute 5 der Reperfusion (p=0,014).
Graphische Darstellung in Abbildung 22 & 23; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 10 &
11.
8-pCPT-cGMP 10µM 8-pCPT-cGMP
100µM
8-pCPT-cGMP 10µM
+ VAR1µM
22,3 43,0 55,5
30,6 28,8 39,3
36,4 45,2
31,1 39,3
Infa
rktg
röße
in
%
am R
isik
oare
al
33,3
Durchschnitt +/- SEM 26,45 +/- 4,15
34,82 +/- 3,16
42,53 +/- 3,75
Tabelle 10
Ergebnisse
45
Zeitpunkt
Protokoll
Beg
inn
Ein
schl
agen
End
e
Ein
schl
agen
Beg
inn
Isch
ämie
End
e
Isch
ämie
Rep
erfu
sion
5’
Rep
erfu
sion
60’
Rep
erfu
sion
120’
8pCPT-cGMP 10µM 13,0 +/- 1,0
6,3 +/- 1,2
4,0 +/- 0,5
5,3 +/- 0,7
11,5 +/- 1,0
6,8 +/- 0,7
4,3 +/- 0,2
8pCPT-cGMP 100µM 12,4 +/- 1,1
6,6 +/- 0,2
4,8 +/- 0,2
9,6 +/- 0,6
15,4 +/- 0,9
6,6 +/- 0,2
4,5 +/- 0,3
Vardenafil 1µM +
8pCPT-cGMP 10µM
12,8 +/- 0,9
7,6 +/- 0,7
4,5 +/- 0,2
9,3 +/- 1,1
13,9 +/- 1,1
7,1 +/- 0,2
5,3 +/- 0,3
Tabelle 11
Abb.22 Darstellung der Versuchsgruppen mit dem cGMP-Analogon 8-pCPT-cGMP.
= Einzelwert eines Versuchs = Gruppendurchschnitt mit Standardfehler
= Signifikante Differenz gegenüber 10nM Vardenafil
Ergebnisse
46
Abb.23 Entwicklung des Koronarflusses der Versuchsserien mit dem cGMP-Analogon 8-pCPT-cGMP.
regionale Ischämie
Ergebnisse
47
4.6. cGMP-Level
Die Analyse der Biopsien der Ventrikel mittels eines ELISAs in den Laboren der Bayer Health Care
AG Wuppertal ergab, dass der intrazelluläre cGMP-Level im Vergleich zur Kontrolle bei Gabe von
1µM Vardenafil signifikant ansteigt (p<0,001). Die in der Infarktgrößenanalyse protektive Dosis
von 10nM verursachte keinen signifikanten Anstieg des intrazellulären cGMPs.
Graphische Darstellung in Abbildung 24.
Kontrolle Vardenafil 10nM Vardenafil 1!M
Abb.24 Durchschnittliche intrazelluläre cGMP-Level: ganz links die Kontrollgruppe ( ) ohne
Vardenafilzugabe im Puffer. In der Mitte unter Zugabe vom 10nM Vardenafil ( ) und rechts unter Applikation von 1!M Vardenafil ( ).
= statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe.
Ergebnisse
48
4.7. HL-1 Zellen Vardenafil VASP-Blot
Die Behandlung von HL-1 Myozyten mit Vardenafil führte zu einem signifikanten Anstieg der
Phosphorylierung von VASP an Ser239 am Gesamt-VASP im Vergleich zur Kontrollgruppe
(p=0,03).
Die gleichzeitige Gabe von KT5823, einem PKG-Inhibitor, verhinderte einen Anstieg der
VASP-Phosphorylierung als Zeichen der PKG-Aktivität.
Applikation von KT5823 alleine verursachte keine Veränderungen zur Kontrollgruppe ohne
Behandlung.
Graphische Darstellung in Abbildung 25.
Abb.25 Signifikanter Anstieg des Anteils von phosphoryliertem VASP unter Applikation von Vardenafil. Die Gabe von KT5823 in Kombination mit Vardenafil und die Gabe von KT5823 allein zeigten keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollmessung.
Diskussion
49
5. Diskussion
5.1. Dosisfindung
Vardenafil hat einen schützenden Effekt auf das Myokard gegenüber einem Ischämie-
Reperfusionsschaden. Dass die Klasse der PDE-5-Inhibitoren protektiv wirkt, wurde erstmals 2002
von Ockailis Gruppe am Wirkstoff Sildenafil gezeigt (14; 65). In der Literatur sind mit Vardenafil
bisher nur in vivo Versuche am Rattenherzen durchgeführt worden (66). Eine Ermittlung der an der
Myokardzelle protektiv wirkenden Dosis in einem isolierten Herzmodell fehlte. Die Dosis-
Wirkungsbeziehung zeigte kein einfach proportionales Verhältnis. Es konnte ein maximaler Effekt
für die Dosis von 10nM Vardenafil demonstriert werden. Eine Reduktion der Dosis auf 1nM bzw.
eine Erhöhung auf 1!M zeigte keinen protektiven Effekt mehr. Diese Dosis-Wirkungsbeziehung
unterstreicht, dass die Konditionierung des Myokards ein sehr sensitiver Prozess ist. Ein möglicher
Zusammenhang kann hier mit der koronaren Flussrate gesehen werden. Unsere Messungen zeigten,
dass eine weitere Erhöhung der Vardenafil-Dosis über die maximal protektive Dosis von 10nM
hinaus zu einer weiteren Steigerung des Koronarflusses führt. Möglicherweise wird durch zu hohe
Flussraten in der Reperfusion eine zu schnelle Normalisierung der Homöostase des Gewebes
hervorgerufen. Diese könnte, unter Berücksichtigung der in der Einführung dargelegten Prozesse,
während der Reperfusion einen Zellschaden begünstigen.
Zur Verwendung der PDE-5-Inhibitoren im Bereich der Myokardprotektion gegen Ischämie-
Reperfusionsschäden kam es, da gezeigt wurde, dass die Gabe von cGMP-Analoga die Infarktgröße
signifikant reduzieren kann (62).
Die Inhibitoren der PDE-5 sind eine Medikamentenklasse, die mittlerweile über eine breite
klinische Erprobung verfügt. Unter der Indikation der erektilen Dysfunktion werden diese
Medikamente nun seit einigen Jahren weit verbreitet eingesetzt und konnten in diesem Bereich
einen therapeutischen Erfolg erzielen. Durch die breite Anwendung von Sildenafil und seinen
Analoga in der Praxis kann man nun davon ausgehen, dass dies ein klinisch sicher anzuwendender
Wirkstoff ist. Auch wenn die medikamentöse Myokardprotektion noch lange nicht in der Klinik
angekommen ist, schien es Erfolg versprechend, gerade diese klinisch sicheren Medikamente auf
myokardprotektive Effekte zu untersuchen.
Einige vorausgehende Arbeiten zeigten, dass die Expression der PDE-5 im Myokard erfolgt. Dies
wurde an Myokardzellen der Ventrikel von Mäuse- und Kaninchenherzen gezeigt (38; 69; 70). Die
Phosphodiesterasen sind Enzyme, die in vielen Geweben des Körpers in unterschiedlichen
Isoformen exprimiert werden. Sie alle hydrolysieren zyklische Triphosphate, welche an diversen
intrazellulären Signalwegen beteiligt sind, um diese abzubauen. Die PDE-5 besitzt eine relativ hohe
Diskussion
50
Spezifität für zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Eine Hemmung der PDE-5 hat daher
eine Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels zur Folge.
In Kombination mit der Tatsache, dass die Gabe von zellmembranpermeablen cGMP-Analoga
einen Schutz vor Ischämie-Reperfusionsschäden induziert und dem Nachweis der PDE-5 im
Herzmuskelgewebe schien es logische Konsequenz, dass die PDE-5-Hemmer protektiv wirken
könnten. Dieser Nachweis erfolgte dann durch Ockaili et al. mit Sildenafil als Vertreter der PDE-5-
Inhibitoren.
Nachdem 2002 erstmals der protektive Effekt der PDE-5-Inhibitoren gezeigt wurde, wurden weitere
Studien angeschlossen. Für andere Wirkstoffe der PDE-5-Hemmer, unter anderem Vardenafil,
konnte der myokardprotektive Effekt nachgewiesen werden. Die PDE-5-Inhibitoren wurden in
diesen Studien aber vor Induktion einer Ischämie, also als Präkonditionierung, gegeben.
Nun ist aus schon in der Einleitung dieser Arbeit dargelegten Gründen die Postkonditionierung
interessanter als die Präkonditionierung. 2007 konnten Salloum et al. nachweisen, dass die Gabe der
PDE-5-Inhibitoren auch bei Applikation in der Reperfusion wirkt.
Bisher waren alle Studien mit Vardenafil in in-situ Modellen durchgeführt worden. Das heißt, eine
Dosis für Vardenafil im Herzen an der Langendorffanlage war bisher nicht bekannt. Unsere
Ergebnisse zur Dosisfindung zeigen einen maximalen schützenden Effekt bei der Gabe von 10nM
Vardenafil. Erstaunlicherweise wurde durch Steigerung der Dosis nicht der Anteil der überlebenden
Myozyten erhöht, sondern verringert. Wie der Verlust dieses schützenden Effekts zu erklären ist, ist
strittig. DuToit und Mitarbeiter erzielten mit der Gabe von 50nM Sildenafil einen schützenden
Effekt an Myozyten (67). Schon durch Verdoppelung der Dosis wurde aber ebenfalls ein Verlust
der schützenden Wirkung beobachtet. Durch die gefäßrelaxierende Wirkung der PDE-5-Hemmer
am ganzen Kreislauf war die Frage, ob der Verlust eines schützenden Effekts der PDE-5-Hemmer
nicht durch einen zu starken Abfall des systemischen Blutdruckes und einer damit resultierenden
verminderten Koronardurchblutung zu erklären ist. Im isolierten Herzen an der Langendorffanlage
konnten wir aber einen gegenteiligen Effekt feststellen. Zum einen ist am isolierten Herzen der
Perfusionsdruck in den Koronarien innerhalb eines kleinen Rahmens konstant. Zum anderen haben
wir durch Messung des Koronarflusses zeigen können, dass eine höhere Dosis an Vardenafil den
Koronarfluss erhöht, aber keinen schützenden Effekt mehr ausübt. Ob eine zu hohe Dosis
Vardenafil alleine eine Zelle schädigt, ist unklar. Vorstellbar wäre, dass der unter Vardenafil stark
erhöhte Koronarfluss in der Reperfusion schädigt. Wir konnten zeigen, dass eine Steigerung der
schützenden Dosis des cGMP-Analogons 8-pCPT-cGMP auch mit einem Wirkungsverlust
einhergeht. Die Zugabe der Überdosis Vardenafil (1µM) zu einer schützenden Dosis von 8-pCPT-
cGMP zeigt keine Reduktion der Infarktgröße. Ein erhöhter Koronarfluss könnte ein beschleunigtes
Diskussion
51
Auswaschen der in der Ischämie gebildeten Metabolite verursachen und so einen gesteigerten
Gradienten verschiedener Elektrolyte und des pH-Wertes zwischen intra- und extrazellulärem
Raum bedingen. Dieser würde den Stress für die Myozyten verstärken, was durch eine
Myokardkonditionierung nicht ausgeglichen werden kann. Um diese Theorie zu beweisen, wären
weitere Untersuchungen nötig.
5.2. eNOS
Es ist bekannt, dass die endotheliale NO-Synthase (eNOS) in die Signalwege der Konditionierung
des Myokards gegen Ischämie-Reperfusionsschäden eingebunden ist. Sie wird durch die Kinase
Akt aktiviert (68) und produziert dann Stickstoffmonoxid NO, welches in der Zelle verschiedene
Effekte hat. Unter anderem konnte nachgewiesen werden, dass NO die Guanylatcyclase aktiviert.
Eine aktive Guanylatcyclase und damit stattfindende Produktion von cGMP könnte als
Vorausetzung für eine Wirkung eines PDE-5-Inhibitors zur Konditionierung nötig sein. Unter
Einsatz des spezifischen eNOS-Inhibitors L-NAME reduzierte sich der schützende Effekt des
Vardenafil signifikant. Mit der bisher veröffentlichten Literatur ist dieses Ergebnis zum Teil
widersprüchlich. Nakano et al. konnten ex vivo keine Blockade eines mittels eines NO-Donator
ausgelösten Schutzes erzielen (36). Aus Untersuchungen im Rahmen einer pharmakologischen
Konditionierung mit Bradykinin ist aber bekannt, dass die eNOS-Blockade mit L-NAME eine
Infarktgrößenreduktion verhindern kann (33; 35). In Versuchen an isolierten HL-1 Zellen konnte
meine Kollegin U. Donat im Rahmen ihrer Diplomarbeit ebenfalls zeigen, dass ein durch
Vardenafil induzierter Schutz durch L-NAME induzierte eNOS Blockade gehemmt wird.
5.3. Guanylatcyclase & cGMP
Die Guanylatcyclase produziert das cGMP, deren Abbau durch Vardenafil gehemmt wird. Das
bedeutet, dass Vardenafil auf die Aktivität der Guanylatcyclase angewiesen ist, um einen Schutz in
der Zelle hervorzurufen. Sollte kein cGMP produziert werden, könnte auch eine Hemmung des
Abbaus nicht zu einem erhöhten cGMP-Spiegel führen.
In dieser Arbeit wurde die Guanylatcyclase mittels ODQ direkt gehemmt. Die Applikation von
ODQ unterdrückte das schützende Signal von Vardenafil im isolierten Rattenherzen bei einer
Konzentration von 10µM. Dies lässt zwei Schlussfolgerungen zu: Zum einen ist Vardenafil zur
Vermittlung seines protektiven Effektes auf eine aktive Guanylatcyclase angewiesen. Denn nur im
Falle einer aktiven cGMP-Produktion kann durch eine Hemmung des Abbaus von cGMP der
cGMP-Spiegel erhöht werden. Zum anderen scheint Vardenafil sein schützendes Signal nicht auf
anderem Wege als durch die Erhöhung des cGMP-Levels vermitteln zu können. Es wäre sonst
denkbar, dass Vardenafil keine absolute Spezifität für die PDE-5 besitzt und so z.B. auch den
Diskussion
52
cAMP-Spiegel anheben könnte und so einen weiteren Angriffspunkt zur Vermittlung eines
schützenden Signals hätte. Sollte dies der Fall sein, würde dieser Signalweg entweder im weiteren
Verlauf der Kaskade ebenfalls über die Guanylatcyclase vermittelt werden, oder er existiert nicht.
Die Ergebnisse der intrazellulären cGMP-Spiegelmessungen, welche einen signifikanten Anstieg
erst bei Zugabe nicht mehr protektiver Dosen zeigen, erscheinen zunächst widersprüchlich.
Entscheidend ist, in welchem Zellkompartiment der cGMP-Level sein schützendes Signal
vermittelt. Castro et al. konnten zeigen, dass die PDE-5, das Ziel des Vardenafils, vornehmlich die
löslichen, zellmembrannahen Anteile des cGMP beeinflusst (40). Eine mögliche Hypothese, welche
den Verlust des schützenden Signals durch hohe Gaben von Vardenafil erklären könnte, wäre, dass
eine exzessive Gabe, wie die Dosis von 1!M, die Selektivität des Vardenafils beeinträchtigt.
Dadurch würde der cGMP-Level in weiteren Zellkompartimenten angehoben und in Folge ein nicht
schützendes, bzw. schädigendes Signal vermittelt.
5.4. Proteinkinase G
Es gibt Studien, die zeigen konnten, dass ein durch Gabe von cGMP-Analoga induzierter
Myokardschutz gegen Ischämie-Reperfusionsschäden durch die Proteinkinase G (PKG) vermittelt
wird (62). Durch einige Versuche mit 8-pCPT-cGMP, einem zellpermeablen cGMP-Analogon
konnte gezeigt werden, dass unser Modell am isolierten Rattenherzen diese Ergebnisse bestätigt.
In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die PKG ihr Signal wiederum auf den
mitochondrialen ATP-abhängigen Kaliumkanal (KATP) direkt überträgt (43). Der mitoKATP-Kanal
ist für die Vermittlung des schützenden Signals in der Myokardzelle essentiell und inhibiert die
Öffnung der mPTP. Durch die Verwendung des selektiven PKG-Blockers KT5823 konnten wir das
durch Vardenafil induzierte Signal aufheben.
Des Weiteren konnten wir in HL-1 Zelllinien zeigen, dass die Gabe von Vardenafil die Aktivität der
PKG direkt stimuliert. Eine Phosphorylierung des VASP an der Stelle Ser239 gilt als
hochspezifischer Marker für eine Aktivität der PKG. Wir konnten in Westernblots mit Antikörpern
gegen das SER239 des VASP zeigen, dass eine Gabe von Vardenafil zu einer Erhöhung des
phospho-VASP-Anteils am gesamten VASP im Vergleich zu einer Kontrollgruppe ohne Vardenafil
im Medium führt.
Diese Ergebnisse mit Vardenafil und KT5823 im isolierten Rattenherzen und in der HL-1 Zelllinie
beweisen, dass Vardenafil bei der Vermittlung der Konditionierung auf die PKG angewiesen ist. So
kann ein Zusammenhang zwischen Vardenafil-Gabe und vielen weiteren untersuchten
Zusammenhängen der Signaltransduktion im Rahmen der Post- und Präkonditionierung hergestellt
werden.
Diskussion
53
5.5. Ischämische Postkonditionierung
Es liegt nahe, dass die Postkonditionierung aus klinischer Sicht das größere Interesse hervorruft, da
sie die Möglichkeit bietet, bei erfolgtem Koronarverschluss in der Akutbehandlung therapeutisch
tätig zu werden.
Auf Ebene der intrazellulären Signalkaskaden ergeben sich nur geringe Unterschiede. Die Zeit nach
der Indexischämie bis zur Konditionierung scheint essentiell zu sein. Während im Falle einer
Präkonditionierung entsprechende Signalkaskaden schon aktiviert wurden, müssen nun die
Signalkaskaden aktiviert werden, um einen irreversiblen myokardialen Schaden zu verhindern.
Während die pharmakologische Postkonditionierung mittels Vardenafil in der gleichen Dosis wie in
der pharmakologischen Präkonditionierung möglich war, ist es mir nicht gelungen, an isolierten
Rattenherzen einen durch repetitive Ischämien nach der Indexischämie induzierten Myokardschutz
zu erzeugen. Verschiedene Protokolle, variiert in der Anzahl der nach der Indexischämie erfolgten
Ischämieintervalle und in der jeweiligen Dauer der Intervalle, konnten keinen stabilen Schutz
induzieren. Dies deckt sich jedoch mit anderen Studien (57). Die Stärke des Stimulus sowie die Zeit
nach Indexischämie und die Intervallraten spielen eine entscheidende Rolle und sind je nach
Spezies unterschiedlich zu wählen (60).
Abschließend kann zusammengefasst werden, dass
Vardenafil ein potenter Wirkstoff der
pharmakologischen Konditionierung ist, seinen Effekt
aber nur in bestimmter Konzentration entfalten kann.
Die durch diese Arbeit unterstützte hypothetische
Signalkaskade stellt Abbildung 26 dar. Diese
Signalkaskade wird auch durch Ergebnisse im
Zellmodell meiner Kollegin U. Donat gestützt (34).
Das durch Vardenafil induzierte Signal wird durch
eine cGMP-Level-Erhöhung vermittelt. cGMP
wiederum stimuliert die Proteinkinase G. Diese ist bei
der Übermittlung des Signals auf die Zielstruktur
mPTP essentiell.
Abb.26 Vardenafil erhöht die intrazelluläre cGMP-Konzentration und induziert so ein Signal an die PKG.
Diskussion
54
5.6. Klinischer Nutzen
Die Übertragung der Ergebnisse dieser und anderer Laborarbeiten zum Thema der Ischämie-
Reperfusionsschäden in die klinische Praxis hat schon begonnen (60). Keine der bisher
veröffentlichten klinischen Studien nutzt einen PDE-5-Inhibitor.
Vorteile des Einsatzes der PDE-5-Inhibitoren wären die breite klinische Erprobung und Erfahrung
die mit dieser Stoffklasse unter der Indikation der erektilen Dysfunktion und des
pulmonalarteriellen Hochdrucks gesammelt wurde. Des Weiteren ist davon auszugehen, dass die
Substanzklasse in naher Zukunft kostengünstig zur Verfügung stehen wird. Der Patentschutz für
Sildenafil läuft 2012 aus und Generikapräparate sind zu erwarten (71).
Eine Schwierigkeit im klinischen Einsatz ergibt sich aus der U-förmigen Konzentrations-Wirkungs-
Kurve. Eine exakte, protektive Dosis im Patienten zu erzielen ist bei dieser engen therapeutischen
Breite schwierig. Selbst bei einer körpergrößenadaptierten Gabe ist durch interindividuelle
Stoffwechselunterschiede eine Schwankungsbreite der Dosis an der Zielzelle zu erwarten.
Zwar sind die PDE-5-Inhibitoren als sicheres Medikament anzusehen, aber eine Gabe in
Kombination mit NO-Donatoren ist kontraindiziert. NO-Donatoren spielen im Management von
Herz-Kreislauf-Erkrankungen zur Blutdrucksenkung eine wichtige Rolle. Viele Patienten werden
durch den Bedarf eines NO-Donators von einer PDE-5-Inhibitor-Gabe im Akutfall eines
Herzkreislaufereignisses ausgeschlossen.
Dennoch ist, auch nach der Einschätzung von Garcia-Dorado, der cGMP-Weg ein „wertvolles Ziel“
und „Schlüsselelement“ in der protektiven Konditionierung des Myokards (2).
Zusammenfassung
55
Zusammenfassung
Der Myokardinfarkt ist eine der wesentlichen Mortalitätsursachen in den westlichen
Industrieländern. Für das Outcome der Patienten nach Myokardinfarkt ist die Größe der
Infarktnarbe von prognostischer Bedeutung. Nach therapeutischer Rekanalisation des
betroffenen Herzkranzgefäßes entsteht durch einen aktiven Prozess eine Myokardnarbe.
Durch Perfusionsmanöver oder verschiedene Pharmaka vor und auch nach einem Infarkt lässt
sich die Ausprägung der Narbe beeinflussen und die Größe der Narbe reduzieren.
Zu diesen Pharmaka gehören die PDE-5-Inhibitoren, unter anderem Vardenafil. Die
Signalkaskade, welche das protektive Signal vermittelt, ist nur zu Teilen erforscht.
Diese Arbeit etablierte ein Modell in isolierten Rattenherzen, zeichnete eine
Dosisfindungskurve des protektiven Effektes von Vardenafil und konnte unter Einsatz
verschiedener Enzymblocker nachweisen, dass Vardenafil sein Signal über eine intrazelluläre
NO-Erhöhung und eine Aktivierung der Proteinkinase G vermittelt. Ferner konnte dargestellt
werden, dass der aus einer PDE-5-Inhibitoren-Gabe resultierende cGMP-Level-Anstieg
intrazellulär ein sensibler Faktor ist und ein überschießender Anstieg eine Myokardprotektion
verhindert.
Quellenverzeichnis
56
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Eidesstattliche Erklärung
64
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und
keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen
wissenschaftlichen Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und
dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Datum
Unterschrift
Danksagung
67
Danksagung
PD Dr.med Thomas Krieg danke ich ganz besonders für die Einführung in wissenschaftliches
Arbeiten, die Betreuung dieser Arbeit und Geduld. Meinen Arbeitskollegen, Ulrike Donat, Heike
Richter, Karina Förster, Stefanie Franke und Thomas Rütz gilt ein großer Dank für die produktive,
tolle Zusammenarbeit und gegenseitige Motivation.
Professor Tetsuji Miura, Medical School der University Sapporo, Japan, möchte ich an dieser Stelle
für seine ansteckende Begeisterung für die Wissenschaft danken.
Ermöglicht haben diese Arbeit meine Eltern, die das zusätzliche Forschungssemester getragen
haben. Vielen Dank.
Besonderer Dank gilt meiner Frau Marlene.