Vergleichende autoradiographische Untersuchungen
zur CEA-Expression in kolorektalen Karzinomen
sowie zur intratumoralen Verteilung
des anti-CEA Antikörpers BW 431/26 nach intravenöser Injektion
Andreas Kremer
Vergleichende autoradiographische Untersuchungen
zur CEA-Expression in kolorektalen Karzinomen
sowie zur intratumoralen Verteilung
des anti-CEA Antikörpers BW 431/26 nach intravenöser Injektion
Von der Medizinischen Fakultätder Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Gradeseines Doktors der Medizingenehmigte Dissertation
vorgelegt von
Andreas Kremeraus
Birkesdorf, jetzt Düren
Berichter: Herr ProfessorDr. med. R. Bares
Herr UniversitätsprofessorDr. rer. nat. Dr. med. habil. H. Korr
Herr UniversitätsprofessorDr. med. Ch. Mittermayer
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juni 1999
Inhaltsverzeichnis 1
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 3
1.1. Das kolorektale Karzinom 3
1.2. Carcinoembryonales Antigen und anti-CEA Antikörper 4
1.3. Anreicherung der Antikörper im Tumorgewebe 9
1.4. Radioimmunszintigraphie bei kolorektalen Karzinomen 16
1.5. Einsatz von Antikörper bei der Tumortherapie 19
1.6. Autoradiographie mikroskopischer Präparate 20
2. Zielsetzung 22
3. Materialien und Methoden 23
3.1. Antikörper 23
3.1.1. anti-CEA Antikörper BW 431/26 23
3.1.2. anti-Maus Antikörper 24
3.1.3. Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) 24
3.2. Untersuchte Gewebe 25
3.2.1. Herkunft und Histologie 25
3.2.2. Vorbereitung der Gewebeschnitte 26
3.3. Antikörperinkubation 27
3.4. Materialien für die Autoradiographie 28
3.4.1. Photoemulsion 28
3.4.2. Sonstige zur Autoradiographie benötigte Geräte 28
3.4.3. Zusammensetzung des Entwicklers 29
3.4.4. Zusammensetzung des Fixierers 29
3.4.5. Hämatoxlylin Färbung (nach Meyer) 30
3.4.6. Eindeckelung mit Entellan 30
3.5. Methode der Autoradiographie 31
3.6. Mikroskopie und photographische Dokumentation 32
Inhaltsverzeichnis 2
Fortsetzung Material und Methoden
3.7. Versuchsbeschreibung 33
3.7.1. Vorversuch 33
3.7.2. Ansatz für die autoradiographische Darstellung
des Antikörpers BW 431/26 33
3.7.3. Ansatz für die autoradiographische Darstellung
des Carcinoembryonalen Antigens 34
3.7.4. Kontrollanordnung 34
4. Ergebnisse 35
4.1. Auswertung der Markierungsintensität 35
4.2. Vorversuch 36
4.3. Autoradiographische Darstellung des Antikörpers BW 431/26 37
4.4. Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens 44
4.5. Kontrollanordnung 53
4.6. Auswertung der Ergebnisse 55
5. Diskussion 57
5.1. Autoradiographie 57
5.2. Versuchsanordnung 60
5.3. Ergebnisse 61
6. Zusammenfasssung 66
7. Literaturverzeichnis 68
8. Danksagung 84
9. Lebenslauf 85
Einleitung 3
1. Einleitung
1.1. Das kolorektale Karzinom
Das kolorektale Karzinom stellt in der Mortalitätsstatistik der Bundesrepublik
Deutschland nach den Bronchialneoplasien beim Mann und dem Mammakarzinom bei
der Frau die zweithäufigste Todesursache bei malignen Erkrankungen dar [139]. Die
jährliche Inzidenzrate beträgt 15-30/100.000 Einwohner. Die Tendenz ist zunehmend.
Hierbei hat die Prognose in den letzten Jahren trotz intensiver Forschung auf den Gebiet
der Diagnostik und Therapie keine wesentliche Verbesserung erfahren [42,107].
Die Fünfjahresüberlebensrate aller Tumorstadien beim kolorektalen Karzinom beträgt
etwa 50% [28,53]. Als prognostischer Parameter hat sich das Tumorstadium ent-
sprechend der TNM-Klassifikation bzw. der Dukes-Einteilung bewährt. Durch eine
Diagnose von Primärtumoren und Rezidiven in frühen Stadien ist daher am ehesten eine
Verbesserung der Prognose zu erwarten [107].
Nach radikalen Resektionen ist mit einem Tumorrezidiv in 40% d. F. zu rechnen [149].
Zum Zeitpunkt der chirurgischen Intervention hat bei einem Drittel der Patienten bereits
eine Metastasierung in die organdrainierenden regionären Lymphknoten statt-
gefunden [56]. Die hämatogene Metastasierung des kolorektalen Karzinoms erfolgt zu
75 % in die Leber und zu 20 % in die Lunge.
Diese Organmetastasen sind durch die üblichen Nachweisverfahren wie Ultraschall,
Endoskopie, Röntgen, Computertomographie und Magnetresonanztomographie gut
darzustellen. Bei der Identifikation der lokoregionalen, intraabdominalen und retro-
peritonealen Tumorprogression und der Abgrenzung zu chronisch-entzündlichen und
fibrotischen Veränderungen ist die konventionelle radiologische Diagnostik jedoch oft
unzureichend [56].
Einleitung 4
1.2. Carcinoembryonales Antigen und anti-CEA Antikörper
Die Erstbeschreibung des Carcinoembryonalen Antigens gelang 1965 Gold und Freed-
man in Extrakten von Adenokarzinomen des menschlichen Kolons und des fetalen
Verdauungstraktes [58]. 1968 lokalisierten die gleichen Autoren das CEA an der Ober-
fläche von Tumorzellen des digestiven Systems [59]. Später erfolgte die Isolation eines
chemisch und immunologisch identischen Moleküls aus der Lavage von gesundem
Kolongewebe [43]. Dadurch ging die initiale Hoffnung verloren, das CEA als
tumorspezifisches Antigen für die Diagnose des kolorektalen Karzinoms nutzen zu
können. CEA kommt sowohl im gesunden Gewebe als auch bei verschiedenen benignen
Erkrankungen ( entzündliche Prozesse des Verdauungstraktes, bei Erkrankungen der
Leber wie Zirrhose und Hepatitis, aber auch bei Gallengangsobstruktionen )
vor [43,144]. Das CEA hat sich in den letzten 30 Jahren zu dem am besten erforschten
tumorassoziierten Antigen entwickelt [95]. Es ist primär assoziiert mit Karzinomen des
entodermal entstandenen Verdauungstraktes [147]. In der Klinik ist die Bestimmung der
CEA-Serumkonzentration durch additive oder kompetitive Radio- bzw. Enzym-
immunoassyas als postoperative Verlaufskontrolle etabliert und dient zum Nachweis von
Tumorrezidiven nach Entfernung des Primärtumors [68].
Das Carcinoembryonale Antigen gilt als Prototyp des Tumormarkers, mit dem alle neu
entwickelten Tumormarker verglichen werden. Das CEA ist ein glykolisiertes Protein mit
einem Molekulargewicht von 180-200 kDa [147]. Es besteht aus einem Kohlenhydrat-
und einem Proteinanteil [124]. Durch die Variation der Kohlenhydratkomponente wird
es zu einem sehr heterogenen Molekül [144]. CEA wird konstant von Becherzellen des
Dünndarms, Saum- und Becherzellen des Kolons und Tumorzellen des kolorektalen
Adenokarzinoms synthetisiert [3]. Es wandert durch das Zytoplasma und ist mit der
Zellmembran assoziiert. Die Ausschüttung ins Gewebe erfolgt als lösliches Glykoprotein
mit Akkumulation im interstitiellen Raum [147]. Über die Lymphbahnen erfolgt der
Transport zum drainierenden Lymphknoten und später als Chylus ins Blut [12].
In den Lymphknoten wird das CEA zum Teil an der Oberfläche antigenpräsentierender
Zellen fixiert [45]. Zirkulierendes CEA wird in der Leber an Rezeptoren der Kupferzellen
gebunden. Nach Umwandlung gelangt es durch Exozytose wieder in die Sinusoide.
Einleitung 5
Mittels Endozytose wird das CEA nun von den Hepatozyten aufgenommen und
abgebaut [144]. Nur ein geringer Teil des CEA wird unverändert über die Galle aus-
geschieden. Bei einer Lebererkrankung kommt es zur Lockerung der Zellkontakte
zwischen den Hepatozyten. Dadurch gelangt ein größerer Anteil von CEA in die Gallen-
kapillaren und von hier über die Gallenkanälchen und den Ductus choledochus ins
Duodenum [144]. Die klinisch bekannten Serum-CEA Erhöhungen bei Leber-
erkrankungen lassen sich daher über die enterale Resorption oder durch Cholestase
erklären [12].
Präoperative CEA-Erhöhungen im Serum wurden bei 40-70 % der Patienten mit kolo-
rektalen Karzinomen beschrieben. Bei gut differenzierten Tumoren kommt es in fast
95 % zu einem erhöhten CEA-Wert, bei wenig differenzierten Tumoren nur in 35 % der
Fälle [116].
Im gesunden Dünndarm ist CEA hauptsächlich in der Mucosa an den Zellorganellen der
Proteinbiosynthese und apikal in den Mikrovilli der Becherzellen lokalisiert. Das Ver-
teilungsmuster im Kolon entspricht dem des Dünndarms, jedoch ist das CEA sowohl in
den Mikrovilli der differenzierten Becherzellen als auch der Saumzellen zu finden. Die
Sekretion erfolgt polarisiert hauptsächlich ins Darmlumen. Anschließend wird das CEA
mit dem Stuhl ausgeschieden [144].
Die CEA-Lokalisation bei den kolorektalen Karzinomen korreliert mit dem Grading [3].
Gut differenzierte Karzinome zeigen ein Verteilungsmuster vergleichbar mit normalem
Kolongewebe, während bei wenig differenzierten Karzinomen das CEA gleichmäßig mit
eher basolateraler Ausrichtung über die ganze Zelloberfläche verteilt ist [3]. Insgesamt ist
das CEA jedoch hauptsächlich in der Zellmembran lokalisiert [144]. Die Expresssion
erfolgt nicht polarisiert und ist ein Charakteristikum für neoplastische Zellen [3]. Im
Lumen erscheint das CEA oft in blinden Gängen, wo es gefangen zu sein scheint.
Vermutlich resultiert hieraus der höhere Wert an extrahierbarem CEA im Gewebe kolo-
rektaler Tumoren [144]. Diese Effekte sowie die unterschiedliche CEA-Produktionsrate
und die totale Tumormasse bedingen die Erhöhung von CEA im Serum von Patienten
mit kolorektalen Tumoren [123].
Die Entdeckung von Antikörper erfolgte zwar bereits 1890 ( damals als Antitoxine ),
aber erst Mitte der dreißiger Jahre dieses Jahrhunderts wurden sie durch die Einführung
Einleitung 6
der elektrophoretischen Technik zur Auftrennung von Serumproteinen als Gamma-
globuline eingeordnet. Schon Ende des 19. Jahrhunderts wurde die pathogene Bedeutung
des Diphtherie- und Tetanustoxins erkannt. Behring und Kitasato beschrieben die
neutralisierende Wirkung von passiv übertragbaren spezifischen Antitoxinen gegen das
Diphtherietoxin. Neben der Entwicklung von erregerspezifischen antitoxischen Immun-
sera war es seit den frühen Tagen der Immunologie immer ein Bestreben gewesen,
immunologische Kontrollmechanismen und Therapieformen gegen Tumorzellen zu
entwickeln [61].
Seit Anfang der sechziger Jahre ist die biochemische Analyse der Antikörper möglich. Es
folgten die Aufklärung der Antikörperstruktur, ihrer Primärsequenz und die Charak-
terisierung der verschiedenen Antikörperklassen.
Die Einführung der Hybridoma-Technik 1975 durch Köhler und Milstein ermöglichte die
Produktion von monoklonalen Antikörpern [93]. Dadurch existiert ein neues immuno-
logisches Werkzeug, das die Voraussetzung für einen breiten klinischen Einsatz von
Antikörpern geschaffen hat.
Die Untersuchung des Carcinoembryonalen Antigens durch monoklonale Antikörper
vermittelte wesentlich differenziertere Aussagen über seine Eigenschaften. Alle mono-
klonalen anti-CEA Antikörper reagieren mit Epithelstrukturen der kolorektalen
Adenokarzinome [151]. Durch immunohistologische Färbetechniken oder Autoradio-
graphien läßt sich die Antikörperbindung als ungleichmäßiges Markierungsmuster über
dem Tumor darstellen. Es kommt zu Markierungen der Drüsenlumina, der Zellmembran
und des Zytoplasmas der Tumorzellen, der intraluminalen Sekretion, im Extra-
zellulärraum und in nekrotischen Arealen. Nach Beatty läßt sich die CEA-Verteilung in
das Zytoplasma der Tumorzellen und apikale bzw. intraluminale Anteile der drüsigen
Karzinomverbände unterteilen [12].
Kommt es an der Zelloberfläche zu einem Kontakt zwischen dem membranassoziierten
Antigen und einem anti-CEA Antikörper, so wird der Antigen/Antikörper-Komplex
mittels Endozytose aufgenommen [128]. Diese CEA-Verminderung an der Tumor-
zelloberfläche wird nach der Endozytose innerhalb von 6 Stunden durch Reexpression
rekompensiert als Zeichen der genetischen stabil gehaltenen CEA-Expression [129].
Auffallend ist die fehlende Neutralisation des im Blut zirkulierenden CEA durch
applizierte Antikörper [62,63]. Bosslet zeigte an einem Modell die fehlende Bindung an
Einleitung 7
das zirkulierende Antigen [24]. Er beschreibt eine erhaltene Bindung eines anti-CEA
Antikörpers an das zellassoziierte Antigen, obwohl der Antikörper zuvor mit einem
20 molaren Überschuß an Serum-CEA inkubiert worden war. Dieses Phänomen kann
durch einen Unterschied in der Konformation zwischen zellgebundenem und
zirkulierendem CEA erklärt werden. Behr fand jedoch in einer klinischen Studie, daß
Patienten mit kolorektalen Karzinomen eine raschere Serum- und Ganzkörper-Clearance
für anti-CEA Antikörper haben [18]. Er sieht darin den Beweis für die Komplexreaktion
von anti-CEA Antikörpern mit zirkulierendem CEA.
In einer 1989 erschienenen Multizenter-Studie wurde das Bindungsverhalten von
52 gegen das CEA gerichteten Antikörpern beschrieben. Durch Untersuchung der Kon-
kordanz und Diskordanz der Inhibitionsmuster zwischen den monoklonalen Antikörpern
wurden 5 nicht interaktive Epitopgruppen klassifiziert [75]. Die Einteilung dieser Haupt-
gruppen erfolgt nach Gold 1 bis 5 [80]. Monoklonale Antikörper, die an den
Epitopgruppen Gold 1 bis 3 binden , hatten den höchsten Grad an CEA-Spezifität. Keine
Korrelation konnte zwischen der Antikörperspezifität und der Affinität gegenüber CEA
nachgewiesen werden [114].
Das CEA entpuppte sich als ein sehr komplexes Antigen System [147]. 1992 gelang die
DNA-Entschlüsselung des Carcinoembryonalen Antigens [13,81]. CEA ist Mitglied der
Immunoglobulin-Gen-Superfamilie [151]. Es besitzt eine variable Domänen-ähnliche
Region mit 108 Aminosäuren und drei Sets konstanter Domänen-ähnlicher Regionen
durch die Kombination von jeweils 92 bzw. 86 Aminosäuresequenzen [80]. Durch die
genetische Aufschlüsselung, aber auch über die immunochemische Definition mittels
Antikörper sind inzwischen 13 Makromoleküle bekannt, die strukturell und
immunologisch dem CEA ähnlich sind [75]. Sie werden in drei Untergruppen
differenziert [151]. Die Gruppe 1 beinhaltet das CEA, das NCA (non crossreactive
antigen) und das BGP1 (biliäres Glycoprotein 1). Das NCA findet man in der normalen
Lunge, Milz und Granulozyten, während das BCP1 in Epithelzellen der Gallengänge und
in der normalen Leber lokalisiert ist [80]. Alle drei Moleküle sind Zelloberflächen-
Glykoproteine. Der Gruppe 2 wird das PSßG (pregnancy spezific ß glycoprotein) und
das FL/NCA (fetal liver/non crossreactiv antigen) zugeordnet. Die dritte Untergruppe
besteht aus Makromolekülen, die durch das Genom Clone hs CGM-2 repräsentiert
werden. Die CEA-Expression zeigte sich bei der Clonung von verschiedenen Tumor-
Einleitung 8
populationen in vitro als stabil. Daraus schließt man auf eine Kontrolle durch mehr als ein
einzelnes Gen [128]. Es gibt eine transkriptionale Kontrolle, wobei die Menge an
CEA-mRNA nicht mit der CEA Produktion korreliert [144]. Eine Erhöhung der
CEA-Expression konnte durch Interferone und Analoga des cyclischen AMP, aber auch
indirekt durch Theophyllin erreicht werden [70]. Bei der Steigerung der CEA-Expression
in vitro durch Interferon Typ 1 und Typ 2 sah man eine selektive Erhöhung der
CEA-Expression maligner Zellen [69].
Die Frage nach der physiologische Funktion des CEA ist heute noch weitgehend
unbeantwortet. Es ist als Bestandteil des Muzins charakterisiert. Die visköse Sekretion
von Muzin hat biologisch die Hauptaufgabe der Lubrifikation und Protektion. Bei der
Tumortransformation erfährt diese Aufgabe einen wichtigen Wechsel [89]. Durch
Kultivierung von menschlichen Kolonkarzinomzellen konnte in vitro die Funktion des
CEA als intrazelluläres Adhäsionsmolekül und Regulator der Aggregation definiert
werden. Die Rolle des CEA als Adhäsionsmolekül im fetalen Kolon und die Rolle im
kolorektalen Karzinom des Adulten ist jedoch unklar [144].
Einleitung 9
1.3. Anreicherung der Antikörper im Tumorgewebe
Über eine erste radioaktive Markierung von Antikörpern berichteten 1948 Pressman
et al. [121]. 1953 gelang ihnen der Nachweis von Osteosarkomen im Tierversuch mittels
radioaktiv markierter Antikörper [122]. Mach beschrieb 1980 die spezifische Bindung
eines anti-CEA Antikörpers in einem kolorektalen Tumor [104] und eine 2-4 fach
höhere Antikörperaufnahme im Tumor als im normalen Gewebe [105]. Colcher
veröffentlichte 1987, daß radioaktiv markierte monoklonale Antikörper für die
Diagnostik und potentiell auch für die Therapie von kolorektalen Karzinomen eingesetzt
werden können [38].
Nach parenteraler Applikation monoklonaler spezifischer Antikörper, die gegen das CEA
gerichtet sind und mit verschiedenen radioaktiven Isotopen markiert werden, läßt sich
szintigraphisch die Antikörperverteilung bei Patienten mit kolorektalem Karzinom dar-
stellen. Diese als Radioimmunszintigraphie beschriebene Methode beruht auf der
„spezifischen Bindung“ des radioaktiv markierten Antikörpers an seinem Zielantigen-
epitop.
Der Tumornachweis hängt von der absoluten Höhe der Radioaktivitätskonzentration im
Tumor bzw. dem Verhältnis zwischen Tumor und normalen Gewebe ab. Die An-
reicherung des Antikörpers im Tumor wird in der Literatur mit 0,001-0,01 % der
injizierten Antikörperdosis pro Gramm Tumor angegeben [27,66,131].
Neben der immunologischen Spezifität des eingesetzten Antikörpers für das Zielantigen
spielt der Transport bis zum Zielantigen eine wichtige Rolle. Das Verständnis über die
physiologischen Barrieren der Antikörperakkumulation im Tumor ist limitiert. Die Para-
meter, die die Aufnahme von radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpern in einen
Tumor beeinflussen, sind vielseitig und in der Tabelle 1 zusammengefaßt.
Einleitung 10
Tabelle 1:
Parameter, die die Aufnahme und Lokalisation monoklonaler radioaktiv markierter Anti-körper in einen Tumor beeinflussen ( nach Schlom [134] )
1. Anzahl der Antigenmoleküle an der Zelloberfläche
2. Anzahl der Zellen mit Expression des Antigens
3. Tumormasse
4. Verhalten des Antigen/Antikörper-Komplexes
a. Stabilität an der Zelloberflächeb. Aufnahmec. Cappingd. Shedding
5. Grad der Vaskularisation des Tumors
6. Nekroseausmaß des Tumors
7. Präsenz und Reaktivität des zirkulierenden Antigens im Blut
8. Dauer der Antikörperbindung an der Zelloberfläche
9. Isotyp des Immunglobulins (IgG Untergruppe oder IgM)
10. Art des Immunglobulins (murin, human, rekombiniert/chimeric)
11. Vollständiges Immunglobulin oder Fragmente (Fab, Fab’, F(ab’)2)
12. Clearance des Antikörpers aus dem Blut (Antikörper Metabolismus) durch
a. Ausscheidungb. Mononukleär-Phagozytäres Systemc. Gabe eines zweiten Antikörpers
13. Dosis des injizierten Antikörpers
14. Art der Antikörperapplikation (i.v., i.p., intralymphal, intraarteriell)
15. Entwicklung einer Immunantwort gegenüber dem Antikörper
16. Eignung des Antikörpers für eine Markierung mit einem Radionuklid
17. Spezifische Aktivität des markierten Antikörpers
18. Affinität des markierten Antikörpers
19. Tiefe des Tumors von der Körperoberfläche (für die Tumorlokalisation)
20. Zeitdauer bis zum Scanning (für die Tumorlokalisation)
21. Wahl des Radionuklides
22. Methode der Markierung des Antikörpers mit einem Radionuklid
a. Metabolismus des Antikörper-Radionuklid-Komplexesb. Katabolismus des Antikörper-Radionuklides
23. Dosis-Fraktionierung des applizierten Antikörpers
Einleitung 11
Parenteral applizierte Moleküle, die über die Gewebedurchblutung die Tumorzellen
erreichen sollen, nehmen den Weg über das Gefäßsystem, Transport durch die Gefäß-
wand und Transport durch den interstitiellen Raum. Dabei verhalten sich Antikörper
nicht anders als klassische Medikamente oder Hormone und unterliegen den gleichen
physiologischen Barrieren [132,136].
Die Penetration eines intakten Immunglobulins der Subklasse G mit einem Molekular-
gewicht von ungefähr 140 kDa verläuft jedoch langsamer als die eines Medikamentes
mit einem Molekulargewicht von einigen hundert Dalton oder eines Hormones von
einigen tausend Dalton [148]. Selbst Immunglobulinfragmente mit ungefähr 50 kDa
verhalten sich grundlegend anders [132].
Um die komplexen Vorgänge der intratumoralen Aufnahme und Verteilung von mono-
klonalen Antikörpern zu beurteilen, sind viele Modelle entwickelt worden [44]. Neben
rein theoretisch mathematischen Modellen gibt es Untersuchungen an multizellulären
Tumorsphäroiden und transplantierten menschlichen Tumorzellreihen bei athymischen
Mäusen [84].
So konnte Ahlström zeigten, daß sich ein anti-CEA Antikörper bei einem
Xenograft-Modell heterogen verteilt, obwohl die CEA-Expression der Tumorzellen
homogen war [2]. Als Erklärung führte er die nicht einheitliche Blutflußverteilung im
Tumor an.
Die Tumorvaskularisation unterscheidet sich vollständig von der Situation im Normal-
geweben. Neben Gefäßrekrutierungen aus dem präexistenten Gefäßnetz kommt es zur
Angioneogenese als Antwort auf die Tumorzellen [87]. Rein makroskopisch kann man
eine gut vaskularisierte periphere und eine zentrale Region mit schlechter Vaskularisation
differenzieren [85]. Mikroskopisch ist die Vaskularisierung des Tumors höchst heterogen
und nicht vergleichbar mit dem Standard der vaskulären Organisation. Die Hauptunter-
schiede liegen in einer sackförmigen gewundenen Dilatation der Blutgefäße. Das
Endothel der Gefäßwände kann Tumorzellen beinhalten. Es gibt keine fixierte Route
zwischen Arterien und Venen. Aufgrund dieser Eigentümlichkeiten variiert die
Organisation der Gefäße innerhalb des Tumors, aber auch zwischen Primärtumor und
Metastasen [85].
Der Blutfluß in nekrotischen und semi-nekrotischen Arealen des Tumors ist gering.
Durch das Tumorwachstum kommt es zur Zunahme der interkapillären Distanzen mit
Einleitung 12
Reduktion des transvaskulären Austausches von Molekülen. Dies führt trotz einer Ver-
längerung der Zeit für die Diffusion zusammen mit der Verringerung der durch-
schnittlichen Perfusion zur verminderten Antikörperaufnahme. Dieser Effekt verstärkt die
sehr heterogene räumliche Antikörperverteilung [85].
Für viele Autoren stellt die Permeabilität der Tumorgefäßwand eine signifikante Barriere
dar, die die Antikörper passieren müssen [132]. Die Extravasation geschieht über
Diffusion, Konvektion und Transzytose, einem spezifischen aktiven Transport-
mechanismus [85]. Die Diffusion ist dabei abhängig von der Gefäßoberfläche und dem
Konzentrationsgradienten zwischen Plasma und interstitiellem Raum. Die Konvektion
geschieht in Abhängigkeit von der Flußrate durch die Leckagen der Gefäßwand. Sie ist
proportional zu Gefäßoberfläche und der Differenz aus hydrostatischem Druck im Blut-
gefäß und intrazellulärem Raum minus der Differenz des onkotischen Druck zwischen
Gefäß und intrazellulärem Raum. Bei der Betrachtung der Ultrastrukturen der
Gefäßwände fallen weite Zellverbindungen im Endothel auf, eine große Anzahl von
Fensterungen, viele transendotheliale Kanäle und eine diskontinuierliche oder fehlende
Basalmembran. Trotz dieser hohen vaskulären Permeabiltät kommt es nur zur geringen
Extravasation [85].
Tumore haben einen signifikant höheren interstitiellen Druck als normales Gewebe [88].
Dies ist durch die Proliferation des Tumors in einem definierten Raum und durch die
Abwesenheit von funktionierenden Lymphgefäßen zu erklären [48]. Hieraus resultiert die
Abnahme der Extravasation von Makromolekülen. Der Anstieg des interstitiellen
Druckes korreliert mit der Reduktion des Tumorblutflusses und der Entwicklung von
Nekrosen in einem wachsenden Tumor [88]. Untersuchungen über den intratumoralen
Druckgradienten zeigen, daß der interstitielle Druck im Zentrum des Tumors am
höchsten ist und daß er in der Peripherie normale physiologische Werte erreicht [85].
Jeder maligne Tumor hat einen hohen Anteil an neoplastischen Zellen, die aktiv
proliferieren. Es entstehen dabei auch verschiedene Stadien der Zelldegeneration und
Zelluntergänge. Hieraus resultiert eine weitere Zunahme der Gefäßpermeabilität [46] und
eine unspezifische Antikörperaufnahme in nekrotischen Tumorarealen [49].
Jain geht in seinem mathematischen Modell für den Transport von Makromolekülen von
einer heterogenen Tumorperfusion, einer behinderten Diffusion in den intrazellulären
Raum, einer extravaskuläre Bindung von monoklonalen Antikörpern und einem erhöhten
Einleitung 13
interstitiellen Druck aus. Resultierend ergibt sich eine geringe Penetration von Anti-
körpern in den Tumor [86]. Van Osdol konnte in seinem Modell für die Antikörper-
verteilung bei einer Reduktion der Antikörperkonzentration eine Zunahme der Uni-
formität der Antikörperpenetration zeigen, gleichzeitig jedoch eine Verringerung der
durchschnittlichen Antikörperkonzentration im Tumor [145]. In einer Modellanalyse
konnten Fujimori und Weinstein eine Antigen/Antikörper-Bindung beschreiben, die eine
weitere Verteilung des Antikörpers im Tumor verzögerte. Durch eine zu hohe
Antikörperaffinität wurde die Antikörperpenetration erniedrigt. Mittels ansteigender
Antikörperdosen erzielten sie eine bessere Penetration und gleichmäßigere Verteilung.
Ihre Beobachtung fand als „binding site barrier“ Eingang in die Literatur. Sie wurde
definiert als Verzögerung des Antikörpertransportes im Tumor durch Bindung an ein
Oberflächenantigen in der Nähe des Austrittsortes aus dem zuführenden Blutgefäß [54].
Diese Vorstellungen bestätigten sie auch an einem Tumormodell [55]. Baxter und Jain
konnten die Hypothese der „binding site barrier“ an einem mikroskopischen Modell
erhärten [9]. Eine signifikante Abnahme der Anzahl frei diffundierender Moleküle, die
tiefer in den Tumor eindringen können, wurde als Folge der Bindung an peripher
lokalisierte Zellen beschrieben [96]. Auch Juweid kam zu diesem Ergebnis. Er folgerte
daraus, daß bei größerer Antigendichte, höherer Antikörperaffinität sowie geringerer
Antikörperinternalisation und Verstoffwechselung durch die Tumorzelle der Effekt der
„binding site barrier“ zunimmt [91]. Nach Baxter und Jain ist die optimale Antigen-
affinität die höchstmögliche, die zur geringsten Limitation des mikroskopischen
Transportes führt [10].
Bei der Analyse dieser Studien muß auch die Möglichkeit diskutiert werden, daß die un-
einheitliche Verteilung des Antikörpers nur die Antigenverteilung reflektiert, d.h. die
Antigenverteilung muß vergleichend mituntersucht werden. Die Rolle der physiolo-
gischen Barrieren für die Durchdringung eines Tumors kann durch vergleichende Studien
mit ähnlichen oder gleichen nichtbindenden, d.h. unspezifischen Antikörpern überprüft
werden. Dabei kann das Problem der immunhistochemischen Technik, daß nichtbindende
Antikörper dem Nachweis entgehen, durch den Gebrauch der Autoradiographie um-
gangen werden [91]. Carlsson konnte an einen Tumormodell zeigen, daß der
monoklonale anti-CEA Antikörper 38S1 homogen den Kugelzellhaufen HT-29 eines
menschlichen Kolonkarzinoms penetriert, aber aufgrund einer heterogenen
Einleitung 14
CEA-Antigenverteilung heterogen bindet [33]. Diese Studie steht in Widerspruch zu den
meisten anderen Studie, die eine Penetrations-Barriere als Erklärung für die heterogene
Antikörperverteilung postulieren. In einem Xenograft-Modell zeigte Moshakis, daß die
Antikörperverteilung in vivo nicht mit der Antigenexpression vergleichbar ist [110].
Für Beatty erfolgt die größtmögliche Aufnahme von markiertem Antikörper, wenn der
Tumor einen hohen Gehalt an Antigen hat, das an der Zelloberfläche vorliegt und wenn
der Antikörper das Antigen gut erreicht. Dies ist möglich, wenn der Tumor klein ist und
eine günstiges Verhältnis zwischen der Vaskularisation und der Tumormasse vorliegt, die
Blutgefäße hochdurchlässig für den markierten Antikörper sind und der Blutfluß aus-
reichend schnell ist [11].
An unterschiedlich differenzierten multizellulären Tumorsphäroiden konnte Sutherland
die unterschiedliche Bindung von monoklonalen Antikörpern und deren Fragmenten in
Abhängigkeit von der differenten CEA-Expression darstellen. Diese war sehr heterogen
und oft assoziert mit differenzierten drüsigen Strukturen [142].
Für Pedley ist der Transfer des Antikörpers vom Blut über die Extravasation zur end-
gültigen Bindung eher von physiologischen Faktoren, die die Extravasation beeinflussen,
als von der Verteilung des Antigens im Gewebe abhängig [118]. Jain errechnete eine
Zeitdauer von ungefähr 10 Stunden für einen intakten monoklonalen Antikörper, um im
Tumorinterstitium die Strecke von 100 µm zu diffundieren [85]. Auch für Pervez liegt
das Hauptproblem monoklonaler Antikörper in der Erreichbarkeit des Antigens.
Naturgemäß sind Tumormodelle zwar geeignet, grundlegende Zusammenhänge
systematisch zu untersuchen. Sie weisen jedoch prinzipielle Schwachpunkte auf, die die
Übertragbarkeit der durch sie gewonnen Ergebnisse einschränken [16,17]. Die klinische
Realität sind keine homogenen Tumormassen, sondern multiple Tumorknoten mit jeweils
verschiedenen Anteilen an Nekrosen, Seminekrosen und vitalem Tumorgewebe mit
Übergangszonen [86]. Die Zellen in einem Tumor sind sehr heterogen in ihrer Funktion,
Differenzierung, Grad der Malignität und Antigenexpression [66].
Bei den Sphäroid-Modellen werden viele pharmakologische Reaktionen der Antikörper
ignoriert. Die Verteilung im intravasalen Raum bei parenteraler Applikation, die Rolle
der Plasmabindung, der Transport im Gefäßsystem zum Zielgewebe, der Effekt des inter-
stitiellen Flußes und das Potential des Metabolismus bleiben unberücksichtigt [21]. Auch
die Ergebnisse der Xenograft-Modelle sind kritisch zu werten. Sands sieht die Limitation
Einleitung 15
der Xenograft-Modelle darin, daß die Tumorwachstumsrate für die meisten Xenografts
größer ist als die klinische Tumorwachstumsrate [132]. Das Tumorgewebe wird dadurch
in Relation zum Wirtsorganismus (z.B. Maus) wesentlich größer als beim Menschen.
Dadurch entsteht bezogen auf das Körpergewicht eine 1000-fach größere Antikörpe-
aufnahme bei der Maus als beim Menschen [150]. Das Fehlen der Immunkompetenz der
athymischen Mäuse erzeugt neben dieser Wachstumszunahme auch eine Veränderung in
der Tumorphysiologie, die mit dem natürlich entstandenen primären Tumor oder einer
Metastase nicht vergleichbar ist [132].
Neben dieser Immunsuppression im Gasttier spielt die veränderte Vaskularisation auch
eine wichtige Rolle. Die Durchblutung des Xenograft wird durch eine murine
Vaskularisation aufrecht gehalten [131]. Ein weiterer Nachteil ist der immunologische
Unterschied durch die Anwendung eines murinen Antikörpers in einem
Maus-Xenograft-Modell und die wesentlich höhere applizierte Antikörperdosis im Ver-
gleich zum klinischen Einsatz [131].
Bei einer Studie von Lewis sah man, daß Subpopulation der Zellen eines primären
Tumors in Xenografts zum Teil weniger CEA produzierten als der primäre Tumor,
obgleich sie sich histologisch nicht unterschieden [102].
Trotz dieser Schwachpunkte kann man unter Extrapolation der Ergebnisse von Tumor-
modellen Rückschlüsse für den klinischen Einsatz ziehen [132]. Die Geschichte der
Xenograft-Modelle zeigt ihre Wichtigkeit für das Studium von Antikörpern gegen
tumorassoziierte Antigene [22].
Einleitung 16
1.4. Radioimmunszintigraphie bei kolorekaten Karzinomen
Das gewebeständige Carcinoembryonale Antigen benutzt man heute indirekt zur bild-
gebenden Diagnostik des kolorektalen Karzinoms. Dabei wird das CEA als Zielantigen
durch Bindung radioaktiv markierter Antikörper in vivo szintigraphisch lokalisiert.
Während der klinischen Erprobung wurde die Radioimmunszintigraphie sehr unter-
schiedlich beurteilt. So verzeichnet Abdel-Nabi „enttäuschende Ergebnisse“ durch die
Markierung von nicht tumorösem Gewebe in 10-13 % der Fälle [1]. Andere Autoren
berichten dagegen über eine Sensitivität von 70-90 % für die Diagnostik abdomineller
Rezidive von kolorektalen Karzinomen [8,57,78,97]. Die Empfehlungen über den
klinischen Einsatz der Radioimmunszintigraphie reichen von „Routineuntersuchung“ über
„Zusatzmethode bei negativer konventioneller Diagnostik“ bis hin zu „Spezial-
untersuchung bei besonderer Indikation“ [29,65,108].
In einer klinischen Multizenter-Studie zur Diagnostik vermuteter Lokalrezidive kolo-
rektaler Karzinome wurde die Radioimmunszintigraphie mit der konventionellen
Diagnostik verglichen [31]. Dabei wurde die Sensitivität der Radioimmunszintigraphie
mit 89% nur von der Magnetresonanztomographie mit 93% übertroffen.
Der im deutschsprachigen Raum am häufigsten eingesetzte Antikörper gegen das
Carcinoembryonale Antigen ist der Antikörper BW431/26 [14,15,20,103]. Dieser
Antikörper ist ein intakter muriner monoklonaler Antikörper der Subklasse IgG1 und
besitzt eine hohe Affinität für ein spezifisches Proteinepitop der Klasse III des Carcino-
embryonalen Antigens [14].
In der klinischen Anwendung konnte die Eignung des Präparates zur anti-CEA Radio-
immunszintigraphie für die Differentialdiagnostik von Lokalrezidiven bei Patienten mit
kolorektalen Karzinomen gezeigt werden. Die Sensitivität der Methode wird mit
70-100 % angegeben [14,53,72,99,120,140].
1995 wurde eine europäische Multizenterstudie veröffentlicht, die 730 Patienten ein-
schloß, die mit diesem Antikörper untersucht wurden [140]. Dabei wurden Rezidive
eines kolorektalen Karzinom mit einer Sensitivität von 90 % diagnostiziert. Auffallend
war die Tatsache, daß das histologische Grading keinen Einfluß auf das Resultat der
Radioimmunszintigraphie hatte, ebensowenig die Serum-CEA Konzentration. Dies
Einleitung 17
entspricht Ergebnissen früherer Untersuchungen über die Akkumulation von BW431/26
in Operationspräparaten kolorektaler Karzinome [5]. Hierbei fiel auch auf, daß in
Nekrosen unabhängig von der Anwesenheit des Zielantigens eine hohe Radioaktivitäts-
konzentration gemessen wurde, so daß eine spezifische Akkumulation im nekrotischen
Gewebe auszuschließen ist. Als Erklärung kann die passive Extravasation durch eine
erhöhte vaskuläre Permeabilität dienen. Unter Annahme einer gleichzeitig verzögerten
Antikörperdrainage im Nekrosegebiet resultiert eine Antikörperakkumulation ohne
spezifische Bindung.
Positive Ergebnisse erreicht die Radioimmunszintigraphie in der Rezidivdiagnostik mit
einer klinisch akzeptablen Sensitivität erst ab einer Tumorgröße von 2 cm [6]. Dies
dürfte vorwiegend auf meßtechnische Limitationen der Szintigraphie zurückzuführen
sein [5], da andererseits die Tumorantikörperaufnahme als Funktion der Tumormasse mit
inverser Korrelation beschrieben wurde. Bei kleineren Tumoren wäre daher eine
besonders hohe Speicherung zu erwarten [150].
Für einen erfolgreichen Tumornachweis müssen drei Voraussetzungen erfüllt sein [7]:
Erstens eine stabile Markierung des Antikörpers, um aus der Radioaktivitätsverteilung
auf die Verteilung des Antikörpers zu schließen. Zweitens muß der Antikörper selektiv
an sein Zielantigen binden, um aus der Anreicherung des Antikörpers im Gewebe auf die
Präsenz des Zielantigens schließen zu können. Drittens ist die Tumorspezifität des Ziel-
antigens erforderlich, um aus der Bindung des Antikörpers den gesuchten Tumor zu
diagnostizieren.
Satoh sieht das Hauptproblem der Radioimmunszintigraphie mit monoklonalen Anti-
körpern in der geringen Anreicherung des injizierten Antikörpers im Tumor [133].
Hieraus resultiert ein geringes Radioaktivitätsverhältnis zwischen Tumor und dem
gesunden Gewebe. Dieses Problem verhindere die Entdeckung kleiner Tumoren.
Dippold konnte zeigen, daß sich von 2 mg injizierter Antikörpermenge nur 0,01-0,03 %
in einem Gramm Tumorgewebe anreichern [42]. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von
anderen Arbeitsgruppen mitgeteilt [7].
Bezüglich des Beitrages zur Verbesserung der Radikalität bei der Resektion von kolo-
rektalen Karzinomen konnten durch eine intraoperativen Radioimmunszintimetrie
Lymphknotenmetastasen mit einer Sensitivität von 100 % und einer Spezifität von 57 %
nachgewiesen werden [50].
Einleitung 18
Trotz dieser klinischen Erfolge scheinen die Aussagen über Indikationen und
diagnostischen Gewinn der Radioimmunszintigraphie bisher uneinheitlich [7]. So sieht
Hach den hohen technischen und zeitlichen Aufwand einer Radioimmunszintigraphie nur
bei bestehendem Rezidivverdacht in der Tumornachsorge nach unergiebiger kon-
ventioneller Tumordiagnostik gerechtfertigt [72], während Goldenberg ein weites
Spektrum potentieller Indikationen vorschlägt (Tabelle 2).
Tabelle 2:
Potentielle Indikationen für die Radioimmunszintigraphie nach Goldenberg [66]
z Präoperatives Staging
z Postoperative Therapiekontrolle
z Bestätigung des Tumorverdachts bei konventioneller Diagnostik
z Rezidivdiagnostik bei ansteigendem Tumormarker im Blut
z Bestätigung der Antikörperbindung vor einer Immuntherapie
Einleitung 19
1.5. Einsatz von Antikörper bei der Tumortherapie
Neben dem diagnostischen Einsatz der monoklonalen Antikörper war es immer auch ein
Bestreben, die spezifische Bindung der Antikörper an ihrem Zielantigen für die Tumor-
therapie zu benutzen [61]. Dazu können monoklonale Antikörper in vielfältiger Form
und Zielsetzung eingesetzt werden.
Eine Wirkung unkonjugierter („nackter“) Antikörper ist über verschiedene Mechanismen
möglich. Durch direkte Aktivierung von Komponenten oder Effektorzellen des Immun-
systems können sie zytotoxisch wirken. Daneben spielen Antikörper gegen Rezeptoren
der Wachstumsfaktoren durch Beeinflussung der Zellproliferation und -differenzierung
eine Rolle [66].
Unter dem Schlagwort der Immunisierung eines Patienten gegen seinen Tumor versteht
man den versuchsweisen Einsatz von anti-Idiotyp Antikörpern, die an der antigenen
Determinate eines Antikörpers binden. Dadurch kommt es über ein Mimikry des
eigentlichen Zielantigens zur Immunisierung des Patienten, zum Beispiel gegen ein
tumorassoziiertes Antigen [66].
Auch der subtilere Einsatz von Chemotherapeutika bei der Tumortherapie mit Hilfe von
monoklonalen Antikörpern wird erforscht. Jedoch ist der Einsatz von Antikörpern, die
mit Chemotherapeutika oder Zytotoxinen konjugiert sind, limitiert. Nicht jede Tumor-
zelle wird erreicht und kann das Konjugat aufnehmen. Die zum Teil durch das Konjugat
bedingte noch stärker reduzierte Antikörperaufnahme, die fehlende Selektivität und die
Toxizität für die normalen Zellen schränken die Dosis der Therapeutika ein [74].
Eine weitere mögliche Form der Tumortherapie stellt die Radioimmuntherapie dar.
Hierbei werden monoklonale Antikörper mit Radionukliden konjugiert, so daß Tumor-
zellen über die radioaktive Strahlung zerstört werden [32]. Dieser Therapieansatz wird
durch die Heterogenität der Antikörperbindung, durch die physikalischen Eigenschaften
des Antikörpers und durch die histologischen Eigenschaften des Tumors unkalkulierbar
und stellt ein Risiko für das gesunde Gewebe dar [118].
Insgesamt finden diese neuen Formen der Tumortherapie ihre Limitation in einer zu
geringen Antikörperaufnahme im Tumor [74]. Neben der Spezifität des Antikörpers für
das Zielantigen spielen die Barrieren, die der Antiköper bei seinem Transport überwinden
muß, eine entscheidende Rolle [66].
Einleitung 20
1.6. Autoradiographie mikroskopischer Präparate
Bei einer Autoradiographie von mikroskopischen Objekten wird eine Photoemulsion
einige Zeit in unmittelbarer Nähe zu einem radioaktiven Präparat exponiert. Durch
energiereiche radioaktive Strahlung werden die in der Photoemulsion dicht gepackten
Silberbromidkristalle in einen entwickelbaren Zustand versetzt [73]. Nach der photo-
graphischen Entwicklung der Emulsion entsteht ein Schwärzungsbild, das sogenannte
Autoradiogramm [51]. Dabei korreliert die Anzahl der entstandenen Silberkörner mit
der Expositionszeit und stellt das Produkt aus Aktivität und Exposition dar. Die Auto-
radiographie ist eine photographische Methode zur Darstellung der räumlichen
Verteilung von Radioisotopen im Gewebe [73]. Besonders bei der Untersuchung von
Tumorantigenen und der Interaktionen eines Antikörpers mit dem Tumor und normalen
Gewebe ist die Methode der Autoradiographie hilfreich. Im Gegensatz zur
Immunhistochemie ist die spezifische Bindung sensibler darstellbar [39].
Für die erfolgreiche Anwendung der Autoradiographie müssen einige grundsätzliche
Voraussetzungen erfüllt sein [141]. Die Strahlungsreichweite des radioaktiven Isotopes
und der Typ der Photoemulsion müssen der erwarteten strukturellen Auflösung angepaßt
sein. Die zu untersuchende Präparation muß eine hohe spezifische Aktivität besitzen. Der
Antikörper muß mit dem Radioisotop chemisch stabil verbunden sein. Zum Zeitpunkt der
Applikation sollte der markierte Antikörper radiochemisch rein sein. Bei der Lokalisation
von diffusiblen Substanzen muß eine Translokation während der Herstellung des Auto-
radiogrammes vermieden werden. Es kann sowohl bei der Präparation des Gewebes als
auch der Autoradiogramme zur Translokation der radioaktiven Markierung kommen.
Adäquate Techniken für die Autoradiographie diffusibler Stoffe sind entwickelt und
entsprechende Standards aufgestellt worden [126,130].
Für die Autoradiographie von mikroskopischen Objekten gibt es mehrere
Methoden [51]. Dabei wird eine Schwärzung im Autoradiogramm dem Ausgangsort der
Strahlung im Präparat zugeordnet. Bei der Kontaktmethode (apposition-technique)
kommt es nach der gemeinsamen Exposition zur Trennung von Objekt und photo-
graphischer Schicht. Dieses Verfahren erschwert die erwünschte Zuordnung. Daneben
gibt es Techniken mit ständigem Kontakt des Präparates und der Filmschicht.
Einleitung 21
Beim Strippingfilm-Verfahren (mounting-technique) wird eine fertige Filmfolie in einem
Wasserbad auf das Präparat aufgebracht. Dieses Verfahren ist durch die Verarbeitung
und das Aufbringen der Filmschicht in Lichtabwesenheit sehr schwierig. Beim Gebrauch
von Photoemulsionen unterscheidet man die Coating-Technik von der Dipping-Technik.
Bei der ersteren wird eine schlecht definierbare und ungleichmäßige Filmschicht auf den
Präparaten durch Auftropfen und Verstreichen erreicht. Bei der Dipping-Technik werden
die Objektträger in die Photoemulsion getaucht und langsam herausgezogen.
Durch anschließende lotrechte Lagerung entsteht eine relativ homogene, gut haftende
dünne Photoschicht auf den Präparaten. Abhängig von der Verdünnung der Photo-
emulsion wird eine 1-2 µm Schichtdicke erreicht, die in ihrer Dicke und Qualität
reproduzierbar ist.
Die Auswahl der kommerziell angebotenen Photoemulsion für die Autoradiographie
richtet sich nach der Radioaktivität des Radionuklides, Energie der emittierten Teilchen
und der erforderlichen Auflösung [51,83].
Zielsetzung 22
2. Zielsetzung
In der vorgelegten Arbeit soll geprüft werden, ob die Verteilung eines applizierten Anti-
körpers der Verteilung des Zielantigens im Sinne einer spezifischen Bindung entspricht.
Den hier untersuchten Patienten mit einem kolorektalen Karzinom wurde präoperativ ein
anti-CEA Antikörper intravenös injiziert. Über die exakte Analyse der Operations-
präparate hinsichtlich der Verteilung des Carcinoembryonalen Antigens und des
Antikörpers sowie durch Vergleich beider Verteilungsmuster soll die Spezifität des
applizierten Antikörpers untersucht werden.
Daneben soll die Arbeit Aussagen über den Umfang unspezifischer Phänomene der Anti-
körperanreicherung liefern, aber auch Erkenntnisse über die Faktoren, die die
Antikörperverteilung im Tumor modulieren.
Anhand der Ergebnisse sollen Forschungsansätze zur Verbesserung der Antikörper-
aufnahme bei der klinischen Anwendung der Radioimmunszintigraphie und Radioimmun-
therapie entwickelt werden.
Materialien und Methoden 23
3. Materialien und Methoden
3.1. Antikörper
3.1.1. anti-CEA Antikörper BW 431/26
Der Antikörper BW431/26 ist durch Bosslet et al. entwickelt worden [23]. Der
ursprüngliche Vertrieb über die Behringwerke Marburg ist inzwischen von der Firma CIS
übernommen worden. Derzeit ist dieser Antikörper unter dem Handelsnamen
„Scintimun CEA“ kommerziell erhältlich.
Der Antikörper ist ein intakter muriner monoklonaler Antikörper der Subklasse IgG1 mit
einer Molekularmasse von 150.000 Dalton [75]. Er besitzt eine hohe Affinität
(Ka = 1010 l/mol) für ein spezifisches Proteinepitop der Klasse III des membranständigen
Carcinoembryonalen Antigens [14,146]. BW431/26 bindet nicht an periphere Blutzellen,
Knochenmarkszellen oder anderes menschliches Gewebe [14]. Ebensowenig wird die
Antikörper/Antigen Reaktion durch erhöhte Serum-CEA Werte gestört [24]. Die Blut-
clearance für den injizierten Antikörper BW431/26 wird mit einer Halbwertzeit von
38.2 Stunden angegeben [74]. Trotz der genauen Kenntnisse über das CEA incl. der
N-verbundenen Kohlenhydratkette und der N-terminalen Aminosäuresequenz durch
Sequenzaufschlüsselung der cDNA ist die genaue Struktur der Epitope, die durch den
monoklonale Antikörper definiert werden, unklar.
Wegen der kommerziellen Verfügbarkeit und seiner einfachen Markierung mit
Technetium 99-m ist der Antikörper BW431/26 im deutschsprachigen Raum der am
häufigsten zur Radioimmunszintigraphie verwendeter Antikörper [14]. Im Rahmen der
klinischen Forschung zur Radioimmunszintigraphie wurde der Antikörper BW431/26
auch in mehreren Studien an der RWTH Aachen untersucht [5,6,7,8,50,140].
Der zur anti-CEA Autoradiographie verwendete Antikörper wurde von der Arbeits-
gruppe Nuklearchemie und Radiopharmazie der Klinik für Nuklearmedizin an der Uni-
versitätsklinik Essen mit 125I mittels der Chloramine-T Technik markiert [51,82,106]. Die
Chloramine-T Technik ist eine Iodierungsmethode, bei der nur geringe bzw. nicht
Materialien und Methoden 24
nachweisbare Veränderungen im biologischen Verhalten der Immunglobulin-Moleküle
auftreten [27].
Die so hergestellte Lösung hatte eine Antikörperkonzentration von 40 µg/ml und eine
spezifische Radioaktivität von 53,8 KBq/µg. Für die Inkubation der Gewebeschnitte
wurde die Antikörperlösung mit Phosphatpuffer, der 1% BSA enthielt, auf eine Kon-
zentration von 20 µg/ml verdünnt.
3.1.2. anti-Maus Antikörper
Zum Nachweis des präoperativ injizierten murinen Antikörpers BW431/26 wurde ein
kommerziell erhältliches intaktes anti-Maus Immunglobulin vom Schaf, Code IM.131 der
Firma Amersham international verwendet. Die Markierung mit 125I war hier ebenfalls
nach der Chloramine-T Methode erfolgt, zusätzlich war eine Reinigung durch Gel-
filtration vorgenommen worden. Das Molekulargewicht des Antikörpers betrug
150.000 Dalton. Die spezifische Radioaktivität für den Versuchsansatz zur Ermittlung
der idealen Inkubationskonzentration betrug 590 KBq/µg bei einer Konzentration von
6.27 µg/ml [4]. Durch Verdünnung mit Phoshatpuffer und 1% BSA erhielten wir
5 verschiedene Konzentrationsansätze von 6.27 µg/ml in Zehnerpotenzen bis zu
627 pg/ml.
Zur definitiven Inkubation der Gewebeschnitte benutzten wir einen Antikörperansatz mit
der spezifischen Radioaktivität von 703 KBq/µg und einer Konzentration von
5,52 µg/ml. Durch weitere Verdünnung mit Phosphatpuffer und 1% BSA ergab sich eine
Antikörperkonzentration von 2,76 µg/ml, mit der wir die Präparate inkubierten.
3.1.3. Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)
Der Ansatz für die verwendete Phosphatgepufferte Salzlösung beinhaltete
8,0 g Natriumchlorid (NaCl), 1,15 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) und
0,2 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) mit Aqua destillata auf 1000 ml. Der
pH-Wert der Lösung lag bei 7,6. Durch Zusatz von 10 g Rinder-Serum-Albumin (BSA)
auf 1000 ml ergab sich eine Phosphatpuffer-Lösung mit 1% BSA Anteil.
Materialien und Methoden 25
3.2. Untersuchte Gewebe
3.2.1. Herkunft und Histologie
Für die Versuchsreihe wählten wir 15 Operationspräparate von kolorektalen Karzinomen
und ein Leberteilresektat mit zwei Metastasen eines Adenokarzinoms des Kolons.
Präoperativ, in einem Abstand von 3-5 Tagen, war den Patienten 2 mg des
Tc-99m markierten monoklonalen Antikörpers BW431/26 zur Radioimmunszintigraphie
intravenös verabreicht worden. Die pathologische Aufarbeitung aller Operationsresektate
erfolgte durch das Institut für Pathologie der RWTH Aachen. Die Kenndaten der Unter-
suchungspräparate sind in Tabelle 3 aufgeführt. Zur Negativkontrolle diente das
Operationspräparat eines mäßiggradig differenzierten Rektumkarzinoms (Präparat 15).
Diesem Patienten war präoperativ kein muriner Antikörper injiziert worden.
Tabelle 3:
Kenndaten der Untersuchungspräparate
Nr. Ident. Sex Alter Histologie Lokalisation Staging Grading
1 FA w 69 tubuläres Adenokarzinom Kolon pT3N0MX G1
2 GE w 50 tubuläres Adenokarzinom Rektum pT2N0Mx G1
3 BR w 66 tubuläres Adenokarzinom Kolon pT3N3Mx G2
4 MM m 66 muzinöses Adenokarzinom Kolon pT2N1MX G3
5 LF m 48 Adenokarzinom Rektum pT3N1MX G3
6 BA w 61 muzinöses Adenokarzinom Kolon pT2N1MX G2
7 KH m 63 Adenokarzinom Kolon pT2N0MX G3
8 GN m 56 Adenokarzinom Kolon pT3N0MX G2
9 MW m 58 tubuläres Adenokarzinom Rektum pT3N2MX G2
10 SM w 59 muzinöses Adenokarzinom Kolon pT3N2MX G3
11 SM w 54 tubuläres Adenokarzinom Rektum pT2N1MX G1
12 WE w 68 tubuläres Adenokarzinom Rektum pT3N1MX G2
13 BA w 66 Adenokarzinom Kolon pT3N2MX G2
14 DM w 79 Adenokarzinom Kolon pT3N1MX G2
15 FW m 66 Adenokarzinom Rektum pT3N0MX G2
16 JL w 57 Filiae, Adenokarzinom (Kolon) Leber G2
Materialien und Methoden 26
3.2.2. Vorbereitung der Gewebeschnitte
Die formalinfixierten Resektate wurden in Paraffin eingebettet und als 2µm Paraffin-
schnitte auf sogenannte K-Objektträger mit Aqua destillata aufgezogen. Das Glas dieser
speziellen Objektträger ist kaliumarm und wegen des geringen 40K-Gehaltes besser für
die Autoradiographie geeignet, da der Nulleffektes verringert wird. Zur Reinigung
stellten wir die Objektträger in eine Äther-Ethanol Lösung (1:4) und trockneten sie vor
Aufziehen der Schnitte mit einem Baumwolltuch. Nach einer Latenz zum Abklingen der
Radioaktivität des primär injizierten Antikörpers wurden die Paraffinschnitte angefertigt.
Nach Entparaffinierung in einer absteigenden Ethanolreihe wurden sie in einer
PBS-Lösung gespült. Die so vorbereiteten Gewebeschnitte transportierten wir in einer
feuchten Kammer zur weiteren Verarbeitung in das Isotopenlabor der Klinik für Nuklear-
medizin der RWTH Aachen.
Materialien und Methoden 27
3.3. Antikörperinkubation
Die entparaffinierten Gewebeschnitte wurden mittels einer Mikropipette mit jeweils
200 µl der Antikörperlösungen beträufelt, so daß die gesamte Gewebefläche benetzt war.
Zur Antikörperinkubation verweilten die Gewebeschnitte für 60 Minuten in einer
feuchten Kammer [77]. Anschließend erfolgte eine zweimalige Spülung für jeweils
5 Minuten in einer PBS-Lösung und anschließend jeweils 5 Minuten zweimal in Aqua
destillata. Zur Qualitätskontrolle wurde die Radioaktivität der Spülflüssigkeit mittels
eines Spektral-Geiger-Zählrohres gemessen, um eine ausreichende Spülung zu
gewährleisten. Durch die vier Spülvorgänge reduzierte sich die Aktivität um
durchschnittlich 90%. Zur weiteren Verarbeitung wurden die behandelten Gewebe-
schnitte in einer feuchten Kammer zum Autoradiographie-Labor des Lehr- und
Forschungsgebietes Anatomie und Zellbiologie der RWTH Aachen transportiert.
Materialien und Methoden 28
3.4. Materialien für die Autoradiographie
3.4.1. Photoemulsion
NUCLEAR RESEARCH EMULSION K2, in Gelform
Firma Ilford, England
Aus der Serie der Photoemulsionen der Firma Ilford besitzt die Emulsion Typ K mit dem
Sensitivitätsgrad 2 die besten Empfehlungen beim Einsatz des radioaktiven Isotop 125I
und einer lichtmikroskopischen Auswertung der Autoradiogramme. Mit einem Silber-
korndurchmesser von 0,20 µm liegt die Emulsion Typ K im mittleren Vergleichsbereich.
Die NUCLEAR RESEARCH EMULSION in Gelform enthält 0,162 g Silber und
0,042 g Gelatine pro Gramm Emulsion. Eine Flasche mit 50 ml enthält 65 g Emulsion.
Nach der Anlieferung lagerten wir die Emulsion in ihrer Außenverpackung bei 4 °C im
Kühlschrank, geschützt vor Licht und lokaler Radioaktivität maximal 2 Monate [83].
3.4.2. Sonstige zur Autoradiographie benötigte Geräte
Zur Lagerung der Objektträger während der Exposition dienten Kunststoffboxen. Dazu
benutzten wir Färbetröge POM der Firma Mohren, Deutschland mit Einsätzen zur Auf-
nahme der Objekträger.
Die weiteren Gerätschaften zur Herstellung der Autoradiogramme und deren Ent-
wicklung waren Eigenentwicklungen des Lehr- und Forschungsgebietes Anatomie und
Zellbiologie der RWTH Aachen (vgl.[94]).
Materialien und Methoden 29
3.4.3. Zusammensetzung des Entwicklers
Für die Entwicklung von 24 Objektträger, entsprechend dem Inhalt einer Kunststoffbox,
wurden 300 ml Entwicklungslösung wie folgt angesetzt.
1,35 g Amidol (4 Hydroxy-1,3 Phenylendiammoniumdichlorid)5,40 g Natriumsulfit (Na2SO3)2,40 g Kaliumbromid 10 % (KBr)gelöst in 300 ml Aqua bidestillata
Nach Lösung der Substanzen unter einer Abzugsanlage und persönlichem Kon-
taminationsschutz wurde die Lösung gefiltert und direkt zur Entwicklung benutzt.
Alle Chemikalien zum Ansatz des Entwicklers wurden von der Firma Merck,
Deutschland bezogen.
3.4.4. Zusammensetzung des Fixierers
Da die Fixierlösung in Kühlschrank bei 8 °C für 6 bis 8 Wochen lagerbar ist, wurde sie
für mehrere Entwicklungsprozeße nach folgender Rezeptur angesetzt.
90 g Natriumthiosulfat-Pentahydrat reinst (Na2S2O3 x 5H2O)gelöst in 300 ml Aqua bidestillata
Die Chemikalien zum Ansatz des Fixierers wurden von der Firma Merck, Deutschland
bezogen.
Materialien und Methoden 30
3.4.5. Hämatoxylin Färbung (nach P. Mayer)
Die Lösung zur Hämatoxylin-Färbung ist mehrere Monate lang haltbar und wurde einmal
angesetzt.
1,0 g Hämatoxylingelöst in 1000 ml Aqua destillata
In dieser Stammlösung wurden folgende Substanzen gelöst.
0,2 g Natriumiodad (NaIO3)50 g Kaliumalaun, chemisch rein ( Aluminiumkaliumsulfat)50 g Chloralhydrat1,0 g kristalline Zitronensäure
Alle Chemikalien für die Hämatoxylin-Färbung wurden von der Firma Merck,
Deutschland bezogen.
3.4.6. Eindeckelung mit Entellan
Zur Eindeckelung der fertigen Autoradigramme wurde Entellan der Firma Merck,
Deutschland benutzt.
Materialien und Methoden 31
3.5. Methode der Autoradiographie
Für die Herstellung der Autoradiogramme orientierten wir uns an der „Arbeitsanweisung
zur Herstellung von Autoradiogrammen“ von Professor Dr. Dr. H. Korr, Lehr- und
Forschungsgebiet Anatomie und Zellbiologie der RWTH Aachen (vgl. [94]). Zur
Herstellung der Autoradiogramme wurden die Gewebeschnitte zunächst in die
Dunkelkammer gebracht. Eine diskrete Dunkelkammerbeleuchtung erfolgte durch eine
15 Watt Lampe mit einem Ilford 904 Lichtfilter [83]. Durch eine Klimaanlage mit
Schleusensystem erhielt die Dunkelkammer eine Raumtemperatur von 20 °C mit einer
konstanten Luftfeuchtigkeit von 60 %. Die Staubreduktion erfolgte durch das Filter-
system der Klimaanlage. In der Vorbereitungsphase wurden bei Dunkelkammer-
beleuchtung (siehe oben) 15 g der Photoemulsion abgewogen und mit 10 ml Aqua
destillata in einem auf 42 °C temperierten Wasserbad vollständig gelöst. Bei allen
Arbeiten wurde auf eine umsichtige Arbeitsweise und Arbeitsmaterialen zur Vermeidung
von elektrostatischer Aufladung und hieraus resultierender Entladungen geachten, da
hierdurch der Nulleffekt erhöht würde. Zunächst wurde die gelöste Emulsion durch eine
Mullage gefiltert. Anschließend wurde nach Aneinanderlegen von jeweils zwei
Objektträgerrückseiten und Eintauchen in die Photoemulsion eine gleichmäßige dünne
Schicht auf den Gewebeschnitten an der Oberseite der Objektträger erzielt. Zum
Trocknen wurden die Objektträger dann einzeln in einer fast senkrechten Position in ein
Trockengestell verbracht. Nach ca. 3 Stunden Trocknungszeit in absoluter Dunkelheit
sortierten wir die emulsionsbeschichteten Objektträger in lichtdichte Kunststoffboxen ein,
die durch einen Einsatz für die Aufnahme der Objektträger vorbereitet waren. Unter
Zusatz von Calciumsulfat (CaSO4) zur Absorption von Feuchtigkeit wurden die Boxen
luftdicht verschlossen und für die Expositionszeit im Kühlschrank bei 4 °C strahlungsarm
gelagert. Als strahlungsarm ist ein allseitig gemauerter Raum zur Reduktion der
kosmischen Strahlungseinflüsse und Abwesenheit von lokaler Radioaktivität zu
verstehen. Nach Beendigung der autoradiographischen Exposition wurden die noch ver-
schlossenen Kunststoffboxen mit den Präparaten zunächst für eine Stunden bei
Raumtemperatur gelagert, um eine Kondensation von Wasser auf den Schnitten und dem
Film beim Öffnen der Präparatekästen zu vermeiden. Nach Ansatz der Entwickler-
Materialien und Methoden 32
und Fixierlösung wurde die Entwicklerlösung in einem Wasserbad auf 18 °C gekühlt. Zur
photographischen Entwicklung der emulsionsbeschichteten Objektträger überführten wir
die Einsätze aus den Kunststoffboxen unter Lichtausschluß mit den Präparaten in die
gekühlte Entwicklerflüssigkeit. Eine Schüttelapparatur garantierte eine gleichmäßige
Konzentration der Entwicklungsflüssigkeit. Nach genau vier Minuten erfolgt eine
Zwischenwässerung für eine Minute in Aqua destillata. Danach wurden die Präparate für
10 Minuten in der Fixierlösung ebenfalls durch eine Schüttelapparatur bewegt. Erst nach
der Fixierung waren die Autoradiogramme unempfindlich für Licht. Abschließend
erfolgte eine Wässerung in fließendem kalten Wasser für 20 Minuten. Nach kurzer
Überführung in Aqua destillata wurden die Schnitte in einem Wärmeschrank bei 37 °C
über 2 bis 3 Tage getrocknet. Zur histologischen Färbung wurden die Schnitte für
30 Sekunden in eine Hämatoxylinlösung getaucht. Anschließend wurden sie für
20 Minuten in Leitungswasser gebläut, dann für 2 Minuten in Aqua destillata überführt,
bevor sie wiederum im Wärmeschrank bei 37 °C über 2 bis 3 Tage getrocknet wurden.
Nach Eindeckelung mit Entellan unter einer Absauganlage und dessen Aushärtung waren
die Autoradiogramme für die mikroskopische Auswertung bereit.
3.6. Mikroskopie und photographische Dokumentation
Für die Lichtmikroskopie und Mikrophotographie verwendeten wir den Mikroskop-Typ
BH-2 und den Kameraaufsatz C-35AD-4 der Firma OLYMPUS, Deutschland. Die Be-
lichtung wurde über die automatische Belichtungs Kontroll Box PM-CBAD, ebenfalls
Firma OLYMPUS, gesteuert. Die Auswertung der Autoradiogramme erfolgte bei einer
10 x 40 fachen Vergrößerung. Zur photographischen Dokumentation benutzten wird den
Schwarzweiß-Film ILFORD PAN F 50 DX 135, der Firma ILFORD, England. Die Ent-
wicklung und Vergrößerungen der Bilder ließen wir in einem kommerziellen Photolabor
durchführen.
Materialien und Methoden 33
3.7. Versuchsbeschreibung
3.7.1. Vorversuch
Für den autoradiographischen Nachweis des präoperativ injizierten intakten murinen
monoklonalen Antikörpers BW431/26 durch einen 125I-markierten anti-Maus Antikörper
fehlten Erfahrungswerte. Somit führten wir eine Vorversuchreihe mit dem Ziel durch,
eine adäquate anti-Maus Antikörperkonzentation für die Inkubation und die optimale Ex-
positionszeit zu finden. Dazu wählten wir drei Operationspräparate und eine
Negativkontrolle aus. Zur Findung der geeigneten Antikörperkonzentration wurden
korrespondierende Schnitte mit fünf verschiedenen Antikörperkonzentrationen inkubiert.
Dieser Ansatz wurde in dreifacher Ausführung angelegt und auf verschiedene Kunst-
stoffboxen verteilt. Nach der gemeinsamen autoradiographische Verarbeitung aller drei
Ansätze erfolgte die Exposition. Zur Ermittlung der optimalen Expositionszeit
entwickelten wir jeweils einen Ansatz nach 7 Tagen, 15 Tagen und 63 Tagen.
3.7.2. Ansatz für die autoradiographische Darstellung
des Antikörpers BW431/26
Zum Nachweis und zur autoradiographischen Darstellung des in vivo applizierten
murinen Antikörpers BW 431/26 inkubierten wir aufgrund der Ergebnisse des Vor-
versuches alle Gewebeschnitte mit dem 125I-markierten anti-Maus Antikörper in einer
Konzentation von 2,63 µg/ml bei einer spezifischen Aktivität von 703 KBq/µg. Dieser
Ansatz wurde zweifach angelegt. Nach 36 Tagen Expositionszeit erfolgte die photo-
graphische Entwicklung des ersten Ansatzes. Die Begutachtung der autoradio-
graphischen Qualität veranlaßte auch die Entwicklung des zweiten Ansatzes am 36. Tag
der Exposition.
Materialien und Methoden 34
3.7.3. Ansatz für die autoradiographische Darstellung
des Carcinoembryonalen Antigens
Für den Nachweis und die autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen
Antigens beim kolorektalem Karzinom inkubierten wir alle Gewebeschnitte mit dem125I-markierten Antikörper BW431/26 in einer Konzentation von 40 µg/ml und einer
spezifischen Aktivität von 53,8 KBq/µl. Der dreifach angelegte Ansatz wurde nach
42 Tagen bzw. nach 49 Tagen photographisch entwickelt.
3.7.4. Kontrollanordnung
Jeder Ansatz führte einen Gewebeschnitt mit, der vom Prozeß der Antikörperinkubation
ausgeschlossen war. Bei der Herstellung der Autoradiogramme wurde jeder Ansatz von
zwei leeren Objektträgern begleitet. Dabei verteilten wir diese Leerproben so, daß jeder
Ansatz von einem leeren Objektträger angeführt bzw. beendet wurde.
Diese Kontrollanordnung diente der Qualitätssicherung der Autoradiographie, um den
Nulleffekt und die Chemographie der Autoradiogramme abschätzen zu können.
Ergebnisse 35
4. Ergebnisse
4.1. Auswertung der Markierungsintensität
Zur Auswertung wurden die Autoradiogramme nach ihrem Markierungsmuster und dem
Grad ihrer Markierung, d.h. der Ansammlung von Silberkörnern, mikroskopisch
ausgewertet. Dabei differenzierten wir Markierungen über den Lumina der Krypten, den
Epithelzellen und den bindegewebigen Schichten des angrenzenden normalen
Darmgewebes. Die tumorösen Gewebeareale wurden hinsichtlich der Ansammlung von
Silberkörnern über den Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände, über den
Tumorzellen und dem umgebenem Bindegewebe untersucht. Die Intensität der
Markierung in den einzelnen Gewebearealen teilten wir semi-quantitativ in fünf
Kategorien ein (Tabelle 4).
Tabelle 4:
Kategorien der Markierungsintensität
„ negativ „ ( - )
„ diskret positiv „ ( + )
„ schwach positiv „ ( ++ )
„ deutlich positiv „ ( +++ )
„ stark positiv „ ( ++++ )
Ergebnisse 36
4.2. Vorversuch
Diese Anordnung war als Versuchsreihe zur Definition der erforderlichen Antikörper-
konzentration und der optimalen Expositionszeit konzipiert worden. Wir entwickelten
den ersten Ansatz nach 7 Tagen und den zweiten Ansatz nach 15 Tagen Expositionszeit.
Die Autoradiogramme wurden hinsichtlich der mikroskopisch sichtbaren Ansammlung
von Silberkörnern untersucht. Die Präparate, die mit 0,627 ng/ml, 6,27 ng/ml und
62,7 ng/ml Antikörperlösung inkubiert worden waren, zeigten kaum eine Markierung.
Die Schnitte, die mit 0,627 µg/ml Antikörperkonzentration inkubiert worden waren,
zeigten im Autoradiogramm eine diskrete Markierung über den drüsigen
Karzinomverbänden. Dabei lagen Silberkörner über Tumorzellen, in deren Drüsenlumina
und auch im Tumorstroma. Im angrenzenden gesunden Gewebe war keine Markierung
erkennbar. Bei der Auswertung der Präparate, die mit der höchsten Konzentration
inkubiert worden waren, zeigte sich nur eine diskrete Zunahme an Silberkörner. Bei der
Auswertung der Autoradiogramme, die 63 Tage exponiert waren, wiesen die Präparate,
die mit den Antikörperkonzentrationen 0,627 ng/ml bis 62,7 ng/ml inkubiert worden
waren, eine äquivalentes Markierungsmuster mit steter Zunahme über die
Verdünnungsstufen auf. Zwischen den Ergebnisse der Antikörperkonzentrationen
0,627 µg/ml und 6,27 µg/ml war nur noch eine geringe Zunahme bei der Ansammlung
von Silberkörnern zu beobachten.
Somit definierten wir die optimale Antikörperkonzentration mit einen Wert, der zwischen
0,627 µg/ml und 6,27µg/ml liegen sollte. Als optimale Expositionszeit betrachteten wir
einen Zeitraum innerhalb der ersten Halbwertzeit von 60 Tagen für das Isotop 125I.
Ergebnisse 37
4.3. Autoradiographische Darstellung des Antikörpers BW431/26
Bei der autoradiographischen Darstellung des anti-CEA Antikörpers im Gewebe durch
einen 125I-markierten anti-Maus Antikörper beobachteten wir ein homogenes
Markierungsmuster über den angrenzenden gesunden Arealen des Dickdarms. Über den
Lichtungen der Kolonkrypten zeigte sich keine einheitliche Ansammlung von
Silberkörnern. Die Becher- und Saumzellen des drüsenbildenden Epithels hatten nur
teilweise eine Markierung im basalen Bereich, während das umgebende bindegewebige
Stroma durch eine diskrete Anzahl von Silberkörnern markiert war (Abbildung 1). Über
den Blutgefäßen war keine Markierung erkennbar. Auch zeigten die perivaskulären
Areale in ihrem Markierungsverhalten keine Zunahme in der Anzahl der Silberkörner
verglichen mit dem bindegewebigem Stroma.
Abbildung 1
Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers im angrenzenden gesundenGewebe eines kolorektalen Karzinoms (Präparat 2):Lumen der Krypten ohne Markierung (-), basale Markierung der Epithelzellen (+) undAnsammlung von Silberkörnern über dem umgebenen bindegewebigem Stroma (++).
Ergebnisse 38
Die Intensität der Markierung in den Autoradiogrammen für die tumorösen Präparat-
anteile zeigten eine Heterogenität in Abhängigkeit von der Differenzierung des Tumors.
Deshalb wurden die Ergebnisse gesondert nach ihrer histologischen Differenzierung
aufgeführt. Die Betrachtung der Blutgefäße und perivaskulären Areale im Tumorgewebe
erbrachte auch hier keine ausgeprägten Markierungen.
Die gut differenzierten Abschnitte der kolorektalen Adenokarzinome zeigten nur eine
sehr geringe Anzahl von Silberkörnern über den Lichtungen der drüsigen Karzinom-
verbände. Hauptsächlich lag die Markierung homogen über den Tumorzellen und dem
umgebenem Bindegewebe (Abbildung 2). Dieses Markierungsmuster war einheitlich
auch im Vergleich mit Präparaten gleicher Differenzierung.
Abbildung 2
Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einem gut differenziertenAdenokarzinom des Kolons (Präparat 1):Markierungsmuster kaum in den Lichtungen (+), hauptsächlich über den Tumorzellen (++)und dem umgebenen Bindegewebe (++).
Ergebnisse 39
Die Intensität im Markierungsmuster der mittelgradig bis gering differenzierten Adeno-
karzinome war unterschiedlich. Während die unregelmäßigen Lumina der drüsigen
Karzinomverbände ebenfalls kaum eine Markierung zeigten, lag die Ansammlung von
Silberkörnern über den Tumorzellen in einem stark variablen Ausmaß vor
(Abbildungen 3-5).
In der Negativkontrolle sahen wir nur eine sehr schwache Markierung über dem
Bindegewebe der tumorösen Gewebeabschnitte (Präparat 15).
Abbildung 3
Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einem wenig differenziertenAdenokarzinom des Rektums (Präparat 5):Diskrete Markierung der Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände (+), während überden Tumorzellen (++/+++) und dem umgebenden Bindegewebe (++/+++) schwach bisdeutlich Silberkörner zu sehen sind.
Ergebnisse 40
Abbildungen 4 und 5
Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einem mäßiggradigdifferenzierten Kolonkarzinom (Präparat 14): Unterschiedliches Markierungsmusterinnerhalb eines Präparates:Die Markierung der Tumorzellen und des umgebenden Bindegewebes reicht von diskretbis deutlich (+/+++).
Ergebnisse 41
Die Tumorzellen der schleimbildenden muzinösen Adenokarzinome waren geringgradig
differenziert. Ihre Markierungsmuster zeigte sich heterogen innerhalb des Präparates und
der Vergleichspräparate. Über den Tumorzellen konnten wir eine geringe Markierung
sehen. Das Gewebe um die Tumorzellen und der Schleim hatten kaum eine Markierung
(Abbildung 6). Über den bindegewebigen Septen lag nur eine geringe Anzahl an
Silberkörnern.
Das Verteilungsmuster über den Metastasen eines mittelgradig differenzierten Adeno-
karzinoms in der Leber zeigte das gleiche Markierungmuster wie der Primärtumor
(Abbildung 7). Die Sinusoide und Hepatozyten hatten eine homogene diskrete An-
sammlung von Silberkörnern (Abbildung 8).
Abbildung 6
Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einem muzinösenAdenokarzinom des Kolons (Präparat 6):Schwaches Markierungsmuster über den Tumorzellen (++).
Ergebnisse 42
Abbildung 7 und 8
Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einer Metastase einesmäßiggradig differenzierten Adenokarzinoms und im umgebenden Lebergewebe(Präparat 16).
Ergebnisse 43
Tabelle 5:
Markierungsintensität des 125I-markierten anti-Maus Antikörpers
zur Darstellung des Antikörpers BW 431/26
angrenzendes gesundes Gewebe tumoröse Gewebeareale
Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe
1 - - ++ + ++ ++2 - + ++ - + +11 - - ++ + ++ ++
Markierungsintensität der gut differenzierten Adenokarzinome
angrenzendes gesundes Gewebe tumoröse Gewebeareale
Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe
3 - - + + +/++ +5 + ++/+++ ++/+++7 - + ++ - +/++ ++8 - + ++9 - +/++ +/++12 - + ++ + ++/+++ ++13 - - + - + +14 - + ++ - +/+++ +/+++15 - - - - - +16 Sinusoide + Hepatozyten + + +/++ ++
Markierungsintensität der mäßiggradig und gering differenzierten Adenokarzinome
Präparat 15: Negativkontrolle (ohne in vivo Antikörper)
angrenzendes gesundes Gewebe tumoröse Gewebeareale
Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe
4 - - + + + ++6 - + ++ - ++ +10 - + ++ + +/++ +/++
Markierungsintensität der muzinösen Adenokarzinome
Anmerkung: Die Gewebeschnitte 5, 8 und 9 enthielten kein gesundes Gewebe.
Ergebnisse 44
4.4. Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens
Bei der Auswertung der Autoradiogramme, die nach Inkubation der interessierenden
Schnitte mit dem 125I-markierten anti-CEA Antikörper BW 431/26 hergestellt worden
waren, sahen wir das typische Markierungsmuster für das CEA im gesundem
Kolongewebe und bei kolorektalen Adenokarzinomen. In allen Gewebeschnitten zeigten
sich nur geringe Ansammlungen von Silberkörnern über den Lichtungen der
angrenzenden gesunden Darmkrypten. Im Epithel sah man eine diskrete Markierung über
den Zellmembranen der Becher- und Saumzellen mit teilweiser apikaler Präsenz
(Abbildung 9). Diese Intensität und das Markierungsmuster war bei allen Präparaten
gleich. Die umgebenden bindegewebigen Schichten des Dickdarms zeigten eine eher
heterogene Überlagerung mit Silberkörnern. Neben sehr diskreten Markierungen sahen
wir in einigen Präparaten auch Areale mit einer zunehmenden Anzahl von Silberkörnern,
besonders über den Zellmembranen der Epithelzellen und dem bindegewebigen Stroma in
tumornahen Arealen (Abbildung 10 und 11).
Abbildung 9
Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einem an-grenzenden gesunden Gewebe eines kolorektalen Karzinoms (Präparat 1):Kolonkrypte (+), Epithelzellen (+/++), Bindewebe (+/++).
Ergebnisse 45
Abbildung 10 und 11
Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einemangrenzenden gesunden Gewebe eines gut differenzierten Adenokarzinoms. Zunahme derMarkierung in Abhängigkeit von der Tumornähe (Präparat 2):Kolonkrypten (+/++), Epithelzellen (+/+++), Bindegewebe (++/++++).
Ergebnisse 46
Die Markierungen der tumorösen Präparatanteile zeigten in den Autoradiogrammen eine
Heterogenität in Abhängigkeit von der Differenzierung des Tumors. Deshalb werden die
Ergebnisse gesondert nach der histologischen Differenzierung aufgeführt.
Die Präparate mit gut differenzierten drüsenbildenden Adenokarzinomen des Kolons
zeigten einheitlich eine starke Schwärzung in den Lichtungen der drüsigen Karzinom-
verbände. Diese Markierung differierte gering in ihrer Ausprägung innerhalb eines
Präparates (Abbildung 12 und 13), aber auch beim Vergleich mit anderen Adeno-
karzinomen mit gleicher Differenzierung. In allen Vergleichs-Autoradiogrammen blieb
dieses Markierungmuster jedoch dominant. Über den Tumorzellen der drüsigen
Karzinomverbände zeigte sich eine Ansammlung von Silberkörnern, aber mit geringerer
Ausprägung und apikaler Ausrichtung. Das umgebende Bindegewebe zeigte nur eine
mäßige Markierung. Dieser Befund war in allen Schnitten gleichermaßen erkennbar.
Die Adenokarzinome mit mittelgradiger bis geringer Differenzierung zeigten eine sehr
unterschiedliche Intensität im autoradiographischen Markierungsverhalten. Sofern
Lichtungen im drüsigen Karzinomverband vorkamen, waren diese sehr unregelmäßig
konformiert. Die Ansammlung von Silberkörnern in diesen Lichtungen variierte sehr
stark, war aber im Vergleich zur Markierung anderer Strukturen dominant (Abbildung 14
und 15). Über den Tumorzellen zeigte sich eine mäßige Markierung ohne eine
Ausrichtungsprävalenz. Das bindegewebige Stroma um die Tumorzellverbände war
unterschiedlich gering markiert.
Das Präparat 15 (Negativkontrolle ohne in vivo applizierten Antikörper) hatte ein
Markierungsmuster und eine Markierungsintensität, die vergleichbar war mit einen
Adenokarzinomen geringer Differenzierung.
Ergebnisse 47
Abbildung 12 und 13
Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einem gutdifferenzierten Adenokarzinom des Kolons mit typischem Markierungsmuster (Präparat 1):Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände (+++/++++), Tumorzellen (++/+++),umgebende Bindegewebe (++).
Ergebnisse 48
Abbildung 14 und 15
Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einem wenigdifferenzierten Adenokarzinom des Rektums. Unterschiedliches Markierungsmusterinnerhalb des Tumors (Präparat 5):Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände (++/+++), Tumorzellen (+), umgebendeBindegewebe (+/++).
Ergebnisse 49
Als dritte Gruppe hob sich die Markierungsintensität von schleimbildenden muzinösen
Adenokarzinomen mit geringgradiger Differenzierung ab. Die Tumorzellen zeigten eine
Ansammlung von Silberkörnern über ihrem Zytoplasma und teilweiser Ausrichtung auf
die Zellmembran (Abbildung 16). Das die Tumorzellen umgebene Stroma und der
Schleim war unregelmäßig markiert. Innerhalb dieser Gruppe zeigt sich sowohl in dem
einzelnen Schnitt als auch im Vergleich mit anderen Schnitten eine heterogene
Markierung mit Silberkörnern. Über den bindegewebigen Septen konnte man eine
homogene diskrete Markierung erkennen.
Abbildung 16
Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einem muzinösenAdenokarzinom des Kolons (Präparat 4):Tumorzellen (++/+++).
Ergebnisse 50
Die Lebermetastasen des mäßiggradig differenzierten Adenokarzinoms
(Abbildung 17) zeigten das gleiche Markierungsmuster wie der Primärtumor. Das
umgebende Lebergewebe war durch eine starke Ansammlung von Silberkörnern
über Randbereichen der Sinusoide und über den Hepatozyten homogen markiert
(Abbildung 18).
Abbildung 17
Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einer Metastaseeines mäßiggradig differenzierten Adenokarzinoms (Präparat 16).
Ergebnisse 51
Abbildung 18
Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens im umgebenenLebergewebe einer Adenokarzinommetastase (Präparat 16).
Ergebnisse 52
Tabelle 6:
Markierungsintensität des 125I-markierten Antikörpers BW 431/26zur Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens
angrenzendes gesundes Gewebe tumoröse Gewebeareale
Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe1 + +/++ +/++ +++/++++ ++/+++ ++2 +/++ +/+++ ++/++++ +++ +/++ ++11 + + ++ +++ ++ ++
Markierungsintensität der gut differenzierten Adenokarzinome
angrenzendes gesundes Gewebe tumoröse Gewebeareale
Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe3 + + +/++ +++ ++ +/++5 ++/+++ + +/++7 + ++ +/++ ++ + +8 ++/++++ +/+++ ++9 ++/+++ +/++ +/++12 +/++ +/++ +++ ++/+++ ++ ++13 +/++ ++ ++ +++ ++ +/++14 + ++ ++ ++/+++ ++ +/++15 + +/++ +/++ +/+++ ++ +/++16 Sinusoide ++ Hepatozyten ++ +/++ + ++
Markierungsintensität der mäßiggradig und gering differenzierten Adenokarzinome
Präparat 15: Negativkontrolle (ohne in vivo Antikörper)
angrenzendes gesundes Gewebe tumoröse Gewebeareale
Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe4 +/++ +/++ ++ +/++ ++/+++ ++6 - + ++ + ++/+++ +/++10 +/++ ++ +/++
Markierungsintensität der muzinösen Adenokarzinome
Anmerkung: Die Gewebeschnitte 5, 8 und 9 enthielten kein gesundes Gewebe.
Ergebnisse 53
4.5. Kontrollanordnung
Die Autoradiogramme der Kontrollanordnung, d.h. Präparate, die an der Antikörper-
inkubation nicht teilgenommen hatten, zeigten keine Silberkörner über den
Gewebeschnitten (Abbildung 19 und 20). Dies läßt den Schluß zu, daß die Präparate
keine eigene Radioaktivität mehr enthielten. Eine Verschleppung von Antikörpern durch
die Waschvorgänge wird dadurch ebenfalls ausgeschlossen. Diese Ergebnisse zeigten
auch, daß die Autoradiogramme keiner relevanten positiven Chemographie unterlagen.
Über den Objektträgern ohne Gewebeschnitte, die zur Qualitätskontrolle der Herstellung
der Autoradiogramme angefertigt worden waren, sah man eine sehr schwache
Background-Markierung, die innerhalb der Ansätze konstant war. Eine Verschleppung
von Radioaktivität während der Herstellung der Autoradiogramme wird somit aus-
geschlossen. Dies bestätigt auch, daß keine Effekte durch positive Chemographie
entstanden sind. Der Nulleffekt der Autoradiographie war so gering, daß er keinen
Einfluß auf die übrigen Ergebnisse hatte.
Ergebnisse 54
Abbildung 19 und 20
Kontrollautoradiogramme, ohne Antikörperinkubation, bei einem muzinösen Adeno-karzinom (Präparat 6) und tumornahe gesunde Darmkrypten (Präparat 1).
Ergebnisse 55
4.6. Auswertung der Ergebnisse
Zur Beurteilung der intratumoralen Verteilung des in vivo applizierten Antikörpers
BW 431/26 wurde das Markierungsmuster und die Markierungsintensität des anti-Maus
Antikörpers mit der CEA-Expression in den Operationspräparaten verglichen.
In den angrenzenden gesunden Gewebearealen der Adenokarzinome lag der Antikörper
BW 431/26 im Bindegewebe in einem vergleichbaren Ausmaß wie die CEA-Expression
vor. Während die Markierung in den Epithelzellen nur in geringem Umfang der
CEA-Expression folgte, wurde in den Kolonkrypten das vorhandene Carcinoembryonale
Antigen überhaupt nicht durch den Antikörper BW 431/26 dargestellt.
Der Markierung der CEA-Expression in den tumorösen Anteilen der Präparate war
uneinheitlich. In dem Bindegewebe, das die Tumorareale umgibt, lag der Antikörper
BW 431/26 ebenfalls in einem vergleichbaren Ausmaß wie die CEA-Expression vor. Die
Tumorzellen selber waren in der gleichen Intensität und Variabilität markiert, in der auch
das Carcinoembryonale Antigen vorlag. Die Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände,
die sehr viel Carcinoembryonales Antigen enthielten, wurden durch den Antikörper
BW 431/26 nur sehr diskret markiert. Insgesamt war das Markierungsmuster und die
Markierungsintensität sowohl für den Nachweis des anti-CEA Antikörpers als auch für
das Carcinoembryonale Antigen abhängig von der Differenzierung des Adenokarzinoms.
Das Leberpräparat mit Metastasen eines Kolonadenokarzinoms verhielt sich im
tumorösen Anteil entsprechend dem Primärtumor. Im umgebenen Lebergewebe zeigte
die Markierung des Antikörpers BW 431/26 ein unspezifisches Markierungsmuster beim
Vergleich mit der CEA-Expression. Das intensive Markierungsmuster für CEA an den
Rändern der Sinusoide spiegelt den CEA-Metabolismus der Leber wider. Das
Markierungsmuster des anti-CEA Antikörpers korrelierte nicht mit dieser
CEA-Prävalenz.
Bei den Präparaten der Negativkontrolle, die keinen in vivo applizierten Antikörper
enthielten, kam es nur über dem Bindegewebe, das die Tumorareale umgab, zu einer sehr
schwachen Markierung. Es kann somit von einer sehr geringen unspezifischen Reaktion
des anti-Maus Antikörpers ausgegangen werden. Diese unspezifische Markierung war
Ergebnisse 56
jedoch so minimal, daß sie die übrigen Ergebnisse nicht verfälschte. Die Markierung des
Carcinoembryonalen Antigens in diesen Kontrollpräparaten hingegen lag in dem gleichen
Ausmaß vor wie in den Versuchspräparaten gleicher Differenzierung.
Unsere Ergebnisse zeigten, daß der murine monoklonale Antikörper BW 431/26, der
in vivo zur Radioimmunszintigraphie eingesetzt wurde, nicht alle CEA-positiven
Gewebeformationen erreichte. Er markierte zwar spezifisch die CEA-Expression, jedoch
nicht in allen Präparatarealen. Seine hauptsächliche Akkumulation lag im bindegewebigen
Stroma, das die Tumorzellen und das angrenzende gesunde Drüsengewebe umgab, und
an den Tumorzellen. An den Stellen mit der größten Prävalenz des Carcinoembryonalen
Antigens, den Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände, kam er nur in sehr geringer
Konzentration vor. Ebenso wurde das CEA der gesunden Epithelzellen und der
Kolonkrypten nicht adäquat markiert.
Da unsere Ergebnisse keine nennenswerte unspezifische Markierung durch den anti-CEA
Antikörper BW 431/26 zeigten, kann man das intratumorale Verteilungsverhalten des in
vivo applizierten Antikörpers als spezifisch bezeichnen. Die Tatsache, daß der Anti-
körper nicht in allen Präparatanteilen das Carcinoembryonale Antigen markiert, läßt auf
einen ungleichmäßigen Antikörpertransport im Tumor schließen.
Diskussion 57
5. Diskussion
5.1. Autoradiographie
Der Nachweis eines gewebeständigen Antigens nach Inkubation mit einem Antikörper ist
ein Standardverfahren. Meist wird hierzu die immunhistochemische Technik ange-
wandt [26,77,105,122]. Bei der direkten Anfärbung des spezifischen Antikörpers,
z.B. durch eine Peroxidase-Reaktion, ist das Farbsignal jedoch zu gering, um auch kleine
Antigenmengen mit einer ausreichenden Sensitivität zu erfassen. Deshalb werden
indirekte Markierungsmethoden eingesetzt, bei denen durch Bindung verschiedener
Antikörper an den spezifischen Primär-Antikörper und besondere Markierungssysteme,
wie z.B. die Avidin-Biotin-Methode, ein stärkeres Farbsignal und damit eine erhöhte
Empfindlichkeit erreicht wird. Es erhöht sich aber auch der Anteil unspezifischer
Bindungen und somit falsch positiver Ergebnisse [143].
Als methodische Alternative wurde 1988 von Del Vecchio die Inkubation mit einem
radioaktiv markierten Antikörper vorgeschlagen [39]. Dabei wird der gebundene
spezifische Antikörper direkt durch die von ihm emittierte Strahlung als Autoradiogramm
nachgewiesen. Dadurch, daß bei der Autoradiographie die Nachweisempfindlichkeit
durch eine Verlängerung der Belichtungszeit vergrößerbar ist, ergibt sich mit dieser
Methodik insgesamt eine höhere Sensitivität als bei einer immunhistologischen Reaktion.
Unspezifische Antikörperbindungen sind prinzipiell möglich, werden aber in einem
wesentlich geringen Ausmaß beobachtet als bei der indirekten Immunhistochemie [141].
Dies wird durch Kontrollansätze zum Erkennen von unspezifischen Bindungen und
Maßnahmen zur Verhinderung bzw. Kontrollen der positiven oder negativen
Chemographie erreicht [141].
Das Phänomen der Entstehung von Silberkörnern ohne Anwesenheit eines Radioisotops
wird als positive Chemographie bezeichnet. Bei der negativen Chemographie wird das
Bild, das durch die Radioaktivität entsteht, teilweise oder ganz entfernt. Ursächlich
kommen gewebeständige Enzyme, mechanischer Druck, die Gewebefixation, hohe
Konzentrationen von Formaldehyd und Färbungen in Frage, die zu chemischen
Diskussion 58
Interaktionen zwischen Gewebekomponenten und der Photoemulsion führen. Auch eine
Verschleppung oder Lösung der radioaktiv markierten Substanzen ist denkbar. Durch
Kontrollansätze mit der gleichen Verarbeitung, jedoch ohne Radioaktivität, und
belichtete Kontrollansätze werden diese Phänome erkennbar.
Die Ergebnisse unserer Kontrollanordnung zeigten, daß bei der Herstellung der Auto-
radiogramme keine Chemographie nachweisbar war.
Als weitere Fehlerquelle wird der Nulleffekt angesehen [141]. Er beschreibt die Summe
aller Silberkörner, die unspezifisch entstanden sind. Als Ursachen gelten die kosmische
Höhenstrahlung, unbeabsichtigte Lichteinwirkung sowie Herstellungs- und Ver-
arbeitungseffekte beim Umgang mit dem photographischen Material. Auch hier zeigten
die Ergebnisse unserer Kontrollanordnung, daß der Nulleffekt unserer Autoradiographie
so gering war, daß er keinen Einfluß auf die Ergebnisse hatte.
Der Einsatz von 125I als Radioisotop in der Autoradiographie erwies sich als günstig.
Der hauptsächliche Zerfall über Auger-Elektronen mit einer Energie von 30 KeV
ermöglichte kurze Expositionszeiten in Rahmen der ersten Halbwertzeit von
60 Tagen [73]. Gleichzeitig konnte die erforderliche Aktivität reduziert werden. Dadurch
erhält man einen niedrigen Backgroundeffekt bei Maximierung der Auflösung [41].
Resultierend verringerte sich auch die Strahlenbelastung für den Untersucher bei der
Herstellung der Autoradiogramme [51].
Bei der Verwendung von 125I als Radioisotop zur Autoradiographie ist die Photoemulsion
K-2 der Firma Ilford wegen ihres geringen Backgroundeffektes bei hoher Sensibilität gut
geeignet [51]. Generell wird für die mikroskopische Autoradiographie die K-Serie der
Ilford-Photoemulsionen am häufigsten gebraucht [83].
Auch die eingesetzte Dipping-Technik [25,34,111,119,136], der Gebrauch von
Formalin-fixierten Gewebeschnitten, die Paraffineinbettung und Entparaffinierung mit
Xylol wurde vielfältig beschrieben [2,34,41,47,100]. Die genannten Methoden zählen zu
den Standardverfahren im Rahmen der Autoradiographie.
In der Literatur gibt es jedoch auch Kontroversen zu diesem Thema. So beschreibt
Moshakins einen 50-60 % Verlust an radioaktiv markiertem anti-CEA durch die
Fixierung in Formalin und Einbettung in Paraffin [111]. Ahnen und Zoubir zeigten in
ihren Studien mit gleicher Verarbeitungstechnik eine selektive Reduktion der Immun-
reaktivität von CEA in normalem Gewebe [3,151]. Ob dies durch quantitative oder
Diskussion 59
strukturelle Unterschiede zwischen CEA im normalen Gewebe und Tumorgewebe
bedingt war, bleibt zu klären. Der vergleichende Einsatz von Gefrierschnitten zeigte in
Arbeiten von Bosslet wie auch Harwood keinen Unterschied in der Intensität oder Ver-
teilung des Markierungsmusters [23,77]. Die Erkennung der Epitope war gleich, so daß
auf eine Stabilität der Antigendeterminate bei der Fixierung mit Formalin und Einbettung
in Paraffin geschlossen werden kann.
Eine histologische Färbung mit Hämatoxylin ohne positiven Chemographieeffekt der
Autoradiogramme und ohne Anfärbung der Gelatinebasis der Photoemulsion wurde
mehrfach veröffentlicht [34,47,98,100].
Die von uns angewandte Methode der Autoradiographie ist ein gängiges Verfahren, das
sich gegenüber anderen Techniken besonders durch seine hohe Sensitivität auszeichnet.
Durch Maßnahmen zur Verhinderung von unspezifischen Antikörperbindungen und der
methodenspezifischen Chemographie ließ sich eine hohe Spezifität erreichen.
Diskussion 60
5.2. Versuchsanordnung
Zunächst wurde untersucht, ob die Zeitspanne zwischen der Antikörperinjektion und der
Operation des Patienten ( gleichbedeutend mit dem Zeitpunkt der Fixierung des Prä-
parates ) einen Einfluß auf das Ergebnis haben könnte. Der Antikörper BW431/26 hat
eine Blutclearance von 38,1 Stunden. Haisma beschreibt bei einem Xenograft-Modell
einen gleichbleibenden Uptake im Tumorgewebe zwischen 8 und 120 Stunden [74].
Somit müßte zum Zeitpunkt der Gewebefixierung ( 3-5 Tage nach der Applikation ) der
Antikörper in einer optimaler Konzentration im Tumorgewebe vorliegen. Falls es eine
langsamere Clearance von 58,8 Stunden für Tumorgewebe geben sollte [74], würde das
Uptake-Verhältnis zwischen Tumor und gesundem Gewebe ebenfalls noch in einem
günstigen Bereich liegen
In unserer Untersuchung war den Patienten präoperativ ein Tc-99m markierter Anti-
körper intravenös injiziert worden. Mit einer Halbwertzeit von 6 Stunden zerfällt das
Radionuklid zu schnell, um es für eine direkte Autoradiographie nutzen zu können.
Deshalb haben wir den murinen Antikörper BW431/26 indirekt über einen radioaktiv
markierten anti-Maus Antikörper im Gewebe dargestellt [4]. Der Möglichkeit der un-
spezifischen Bindung des murinen Antikörpers wurde Rechnung getragen. Da das
Ergebnis unserer Versuche eine spezifische Bindung des Antikörpers BW431/26 durch
den Vergleich mit der CEA-Expression belegt, ist im Umkehrschluß das Ausmaß einer
unspezifischen Bindung des murinen Antikörpers als vernachlässigbar gering anzusehen.
Beide Antikörper wurden nach einer Modifikation der von Harwood [77] bzw.
Zoubir [151] beschriebenen Methode inkubiert.
Die untersuchten 15 Präparate stellen nur eine Auswahl dar. Für eine statistische Aus-
wertung reichte die Präparateanzahl nicht aus. Durch die Vorversuchsanordnung, die
parallelen Ansätze innerhalb der Anordnungen und die Kontrollansätze wurden für diese
Arbeit 150 Autoradiogramme angefertigt und untersucht.
Die beschreibende Auswertung der Autoradiogramme stellt kein quantitatives Verfahren
dar. Die subjektive Beschreibung der Autoradiogramme, der Markierungsmuster und der
Markierungsintensitäten erfährt durch die photographische Dokumentation jedoch einen
objektiven Charakter.
Diskussion 61
5.3. Ergebnisse
Die Expression des Carcinoembryonalen Antigens bei kolorektalen Karzinomen wird als
sehr heterogen beschrieben [64,117]. Das Muster der Antikörperbindung ist vor allem
von Histologie und CEA-Gehalt der Tumoren abhängig [151]. Eine Heterogenität in der
CEA-Struktur, die von dem Tumortyp abhängt, wird vermutet [19]. Im gesunden Kolon-
gewebe ist das Markierungsmuster homogen. Es kommt zur Markierung der apikalen
Zellmembran der Drüsenzellen, der Innenoberfläche der Drüsenzellen und der Drüsen-
krypten mit Präferenz der Kryptenausgänge [151].
Lewis beschreibt nach Immunperoxidase-Darstellung eines anti-CEA Antikörpers
differente heterogene Markierungsmuster bei verschieden Typen von kolorektalen
Karzinomen [102].
Ein muzinöses Adenokarzinom mit zentraler Nekrose und einem inhomogenem Zellbild
inklusive gut differenzierter Becherzellen, kleinen Saumzellen und Siegelringzellen zeigte
ein Markierungsmuster über fast allen Zellen. Dabei waren viele Zellgruppen sowohl an
der Zelloberfläche als auch im Zytoplasma gefärbt. Die Siegelringzellen hatten eine
Färbung des peripheren Zytoplasmaringes, aber nicht des intrazellulären Muzins. Das
extrazelluläre Muzin war ebenfalls negativ. Die feinen granulären Zelltrümmer der
nekrotischen Zellen hingegen zeigten eine intensive Anfärbung.
Das Markierungsmuster bei einem gut differenzierten muzinösen Adenokarzinom mit
hohen Saumzellen in drüsenähnlicher Anordnung mit muzinösen Lumen zeigte eine
Positivität über allen Tumorzellen mit intensiver Färbung der apikalen Zelloberfläche.
Zelltrümmer, nekrotische Zellen ohne neoplastische Drüsenlumina und extrazelluläres
Muzin erschienen positiv, oftmals sogar extrem stark gefärbt.
Ein weiterer Tumortyp war ein mäßig differenziertes Adenokarzinom mit hohen Saum-
zellen, die große drüsenähnliche Strukturen formten. Die Zellen zeigten einen mäßigen
nukleären Pleomorphismus. Es gab muzinöse Areale und lokale Nekrosen. Das Muster
der Immunperoxidase-Färbung war ähnlich dem des vorbeschrieben Tumortyps, ebenso
das Färbemuster eines gut differenzierten Adenokarzinoms, das ausgeprägte Areale mit
drüsenähnlichen Räumen aus Saumzellen ausbildete.
Ein Adenokarzinom mit geringer Differenzierung zeigte eine geringe spezifische Färbung
Diskussion 62
des vitalen Tumors. Die meisten Zellen waren negativ. Eine positive Markierung war nur
vereinzelt im Zytoplasma undifferenzierter Zellen und an der Zelloberfläche bei drüsigen
Strukturen zu sehen. Nekrotische Zelltrümmer waren immer stark positiv markiert. Bei
allen Tumortypen wurden sehr kleine Areale mit positiver Färbung im fibrösen Stroma
gesehen.
Diese unterschiedlichen Markierungsmuster sahen auch wir in unseren Autoradio-
grammen verschiedener kolorektaler Adenokarzinome.
Die gut differenzierten Adenokarzinome hatten eine einheitlich starke Schwärzung in den
Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände. Die Tumorzellen waren durch eine
geringere Ansammlung von Silberkörnern mit apikaler Ausrichtung markiert.
Die weniger differenzierten Adenokarzinome zeigten ein sehr unterschiedliches
Markierungsmuster im Autoradiogramm. Die Ansammlung von Silberkörner in den
unregelmäßigen Lichtungen im drüsigen Karzinomverband variierte sehr stark. Über den
Tumorzellen lag eine mäßige Markierung ohne eine erkennbare Ausrichtungsprävalenz
vor.
Die untersuchten Präparate enthielten kaum nekrotische Gewebeanteile, so daß wir keine
sicheren Aussagen zum Markierungsverhalten von Nekrosen machen konnten.
Bei der autoradiographischen Darstellung des CEA im angrenzenden gesunden Gewebe
von gut differenzierten Adenokarzinomen beobachten wir eine Zunahme der
CEA-Markierung in Abhängigkeit von der Tumornähe. Zoubir beschrieb dieses
Phänomen in ähnlicher Weise [151]. Diese Auffälligkeit wirft die Frage nach der bisher
ungeklärten Funktion des Carcinoembryonalen Antigens auf. Obwohl das CEA zu den
am besten erforschten tumorassoziierten Antigenen gehört, bestehen auf diesem Gebiet
noch keine gesicherten Erkenntnisse.
Bei der Analyse der intratumoralen Verteilung des in vivo applizierten Antikörpers
BW 431/26 sahen wir eine heterogen Aufnahme in das Tumorgewebe. Die unter-
schiedliche autoradiographische Darstellung variierte in Abhängigkeit von der Dif-
ferenzierung der Adenokarzinome.
Da die Expression des Carcinoembryonalen Antigens in gleicher Weise von der histo-
logischen Differenzierung abhängt und unspezifische Markierungsreaktionen durch den
Antikörper BW 431/26 fehlten, kann die intratumorale Verteilung als spezifische
Bindung an das Carcinoembryonale Antigen angesehen werden.
Diskussion 63
Der Detailvergleich der autoradiographischen Lokalisation des anti-CEA Antikörpers mit
der CEA-Expression zeigte jedoch, daß der systemisch applizierte Antikörper nicht alle
möglichen Antigenlokalisationen im Gewebe erreicht hatte. Die stärkste Akkumulation
fand sich im bindegewebigen Stroma, das die Tumorzellen umgibt und in dem die Blut-
gefäße lokalisiert sind, und an den Tumorzellen. Die Lichtungen der drüsigen Karzinom-
verbände, die die intensivste Expression des Carcinoembryonalen Antigens aufwiesen,
zeigten jedoch keine entsprechende Antikörperanreicherung.
Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit Arbeiten über die Antikörperverteilung bei
Xenograft-Modellen. DePalatis beschreibt in einer Arbeit, daß die Gewebeverteilung
eines spezifischen Antikörpers mit dem Zielantigen (TAG-72) kaum übereinstimmt [41].
Über ein ähnliches Ergebnis berichtete Jones bei Verwendung von zwei anti-CEA
Antikörpern [90]. Das Muster der Antikörperverteilung bei Xenografts korrelierte nicht
mit der entsprechenden CEA-Expression. Auch bei Lewis stimmte die Akkumulation von
anti-CEA Antikörpern nicht mit der CEA-Verteilung überein [101]. In einer weiteren
Arbeit fand er mehr Antikörper im Extrazellulärraum als im CEA-positiven
Tumorgewebe [74]. Lewis schloß daraus, daß das extrazelluläre Carcinoembryonale
Antigen für den spezifischen Antikörper besser zu erreichen ist als das Antigen an der
Zelloberfläche. Ein entsprechendes Verteilungsverhalten beschrieb auch Moshakis [111].
Beatty sah überwiegend eine Bindung des anti-CEA Antikörpers an Antigen im
Extrazellulärraum und nur im geringen Maße an der Zellmembran oder im Zyto-
plasma [12].
1992 führte Boxer direkte autoradiographische Untersuchung zur Lokalisation eines
monoklonalen anti-CEA Antikörpers (Mab A5B7) an Präparaten von Patienten mit kolo-
rektalen Karzinomen durch [26]. Er fand eine vorwiegende Lokalisation des Antikörpers
an den Tumorzellen. Er deutete die heterogene Verteilung als multifaktoriell, wobei
neben der CEA-Expression die limitierte Penetration des Antikörpers im Gewebe eine
Rolle spielte. In einer weiteren Studie konnte Boxer nachweisen, daß der untersuchte
Antikörper sein Zielantigen nicht erreichte, wenn dieses an der luminalen Oberfläche
exprimiert wird. Epitope an basalen oder basolateralen glandulären Strukturen seien für
Antikörper besser über Diffusion zugänglich [25]. Auch Colcher beschriebt eine
Abhängigkeit der Verteilung des Antikörpers von der Erreichbarkeit des Epitops an der
Zelloberfläche [36]. Diese Erkenntnisse stehen im Einklang mit den zahlreichen in der
Diskussion 64
Einleitung beschriebenen Faktoren, die Aufnahme und Verteilung eines Antikörpers im
Tumor beeinflußen. Unsere Ergebnisse über die Verteilung des Antikörpers BW431/26
sind vergleichbar und ebenfalls durch die pathophysiologischen Besonderheiten des
Tumorgewebes zu erklären. In welchem Umfang die Vaskularisation, Transportbarrieren
oder die „binding site barrier“ für die intratumorale Verteilung entscheidend sind, läßt
sich durch diese Studie nicht klären. Die genannten Faktoren spielen aber eine elementare
Rolle bei der Erörterung der Frage, warum der Antikörper das Zielantigen zwar
spezifisch erkennt, aber nicht alle Tumorabschnitte erreicht.
Das unspezifische Markierungsverhalten des Antikörpers BW 431/26 im Lebergewebe
bei spezifischer Markierung des Carcinoembryonalen Antigen in Lebermetastasen eines
Adenokarzinoms läßt sich durch die physiologische Bindung der Immunglobuline und
deren Metabolismus in der Leber erklären [148]. Hieraus resultiert auch die bekannte
limitierte Sensitivität der Radioimmunszintigraphie für Lebermetastasen der kolorektalen
Adenokarzinome [8,72].
Die genannten Besonderheiten der intratumoralen Antikörperverteilung widersprechen
der spezifischen Bindung des Antikörpers nicht. Sie deuten aber grundsätzliche
methodische Probleme der Radioimmunszintigraphie und der Tumortherapie mit Anti-
körpern an, die vor allem in einem nur geringen Kontrast zwischen Antikörper-
anreicherung im Tumor und im gesunden Gewebe bestehen.
Die derzeitigen Forschungsansätze konzentrieren sich auf eine Verbesserung der Anti-
körperaufnahme in den Tumor, um die Sensitivität der Radioimmunszintigraphie noch
weiter zu verbessern und eine „selektive Tumortherapie“ zu verwirklichen.
Dabei geht man von verschiedenen methodischen Ansätzen aus. Modulationen der Anti-
körper stellen eine Möglichkeit dar. So kommen Antikörperfragmente, Kombinationen
aus humanen und murinen Antikörpern und chemisch modifizierte Antikörper zum
Einsatz [30,35,40,60,71,109,115,125,137]. Daneben versucht man, die Antikörper-
aufnahme des Tumors über eine Zunahme der Tumorvaskularisation und Permeabilität zu
erhöhen, zum Beispiel durch vasoaktive Medikamente, externe Bestrahlung oder
Hyperthermie [66]. Fooli konnte zeigen, daß durch Injektion von Tumornekrose-
faktor (TNF) die Permeabilität der Tumorgefäße zunimmt und die Antikörperaufnahme
verbessert wird [52].
Diskussion 65
Ein andere Forschungsrichtung beschäftigt sich mit der Modulation des Tumorantigens.
Durch Interferone kann selektiv die Antigenexpression im Tumor gesteigert werden [69].
Auf diese Weise wird auch die Antikörperaufnahme erhöht [135]. Dies wird jedoch
durch das Ergebnis der vorliegenden Arbeit in Frage gestellt. Wenn die Aufnahme des
Antikörpers durch die Antikörperkinetik limitiert wird, dürfte eine erhöhte Antigen-
präsenz allenfalls einen geringen Einfluß auf die Gesamtaufnahme haben. Dies wird von
dem Befund unterstrichen, daß der Antikörper kaum die Stellen erreicht, die in unseren
Autoradiogrammen die höchste CEA-Konzentration aufwiesen.
Als weitere Alternative zur Optimierung der Antikörperaufnahme wurden in den letzten
Jahren sogenannte Zwei-Schritt-Systeme entwickelt. Dabei wird zunächst ein
spezifischer Antikörper appliziert. Nach Bindung am spezifischen Antigen und
Elimination des zirkulierenden Antikörpers aus dem Blut wird in einem weiteren Schritt
ein Radionuklid oder ein zytotoxisches Agens appliziert, das rasch an den Antikörper
bindet [92,113,118,138]. Zwar läßt sich durch Einsatz eines Zwei-Schritt-Systems die
absolute Antikörperaufnahme in den Tumor nicht erhöhen, durch Reduktion
unspezifischer Bindungen kann jedoch der Tumorkontrast erhöht und im Fall einer
Radioimmuntherapie die Bestrahlung von Normalgewebe reduziert werden [127].
Das Ergebnis dieser Arbeit zeigt, daß die Antikörperaufnahme wesentlich von den patho-
physiologischen Eigenschaften des Tumorgewebes abhängt, die die Antikörperkinetik
determinieren. Da diese Faktoren einzeln nur schwer beeinflußbar sind, bietet der
Therapieansatz zur Reduktion unspezifischer Bindungen prinzipiell Vorteile. Die
Therapieerfolge bei Tumoren mit kleinen Volumina und Mikrometastasen sind ver-
ständlich, da die Antikörperaufnahme mit der Tumorgröße invers korreliert [150].
Abschließend sei angemerkt, daß nach David M. Goldenberg die größte Bedeutung in
der Entwicklung, Erforschung und im Gebrauch monoklonaler Antikörper vielleicht in
der Möglichkeit der Tumortherapie liege, wobei aber momentan die Perfektion der
tumorspezifischen Therapie durch die Komplexität der menschlichen Karzinome
frustriert werde [61,67].
Zusammenfassung 66
6. Zusammenfassung
Die Radioimmunszintigraphie beruht auf dem Grundprinzip, daß ein Zielantigen durch
Bindung eines radioaktiv markierten Antikörpers in vivo lokalisiert wird. Dabei ist der
Erfolg von der Intensität der Akkumulation des radioaktiv markierten Antikörpers bzw.
vom Tumor/Background Verhältnis abhängig. Ebenso ist die spezifische Bindung des
Antikörpers an sein Zielantigen Voraussetzung dieser Methode. Trotz methodischer
Verbesserungen wird die Sensitivität der anti-CEA Radioimmunszintigraphie für die
Differentialdiagnostik eines Lokalrezidiv bei kolorektalen Karzinomen mit einer weiten
Spanne von 70-100 % angegeben. Als Ursache wird die sehr geringe Anreicherung des
Antikörpers im Tumorgewebe angeführt. Der aufgenommene Anteil der Radioaktivität
pro Gramm Tumor liegt in der Größenordnung 0,001-0,03 % der injizierten Radio-
aktivität.
Neue Formen der Tumorbehandlung durch radioaktive Antikörper oder Konjugation des
Antikörpers mit Chemotherapeutika oder Zytotoxinen finden ebenfalls ihre Limitationen
in der zu geringen Antikörperanreicherung im Tumor und der zu geringen Spezifität des
Antikörpers für das Zielantigen.
In der vorgelegten Arbeit wurde analysiert, ob die Verteilung eines applizierten Anti-
körpers der Verteilung des Zielantigens im Sinne einer spezifischen Bindung entspricht.
Dazu wurden Operationspräparate kolorektaler Karzinome von 15 Patienten untersucht.
Präoperativ war jeweils der murine monoklonale anti-CEA Antikörper BW431/26 intra-
venös injiziert worden. Die CEA-Expression und die intratumorale Antikörperverteilung
wurden an Gewebeschnitten der Operationspräparate miteinander verglichen.
Zur Darstellung des Antikörpers wurden die Gewebeschnitte mit einem anti-Maus Anti-
körper, markiert mit 125I, inkubiert. Korrespondierende Gewebeschnitte inkubierten wir
mit einem anti-CEA Antikörper. Dazu benutzten wir erneut den Antikörper BW431/26
mit einer 125I-Markierung.
Durch eine anschließende autoradiographische Aufarbeitung erhielten wir eine Dar-
stellung der histologischen Mikroverteilung des in vivo applizierten murinen Antikörpers
und der CEA-Expression in vergleichbaren Gewebeschnitten.
Zusammenfassung 67
Die Autoradiographie zeigte ein typisches Markierungsmuster für das Carcino-
embryonale Antigen im gesunden Kolongewebe und beim kolorektalen Adenokarzinom.
Die Radioaktivität war deutlich in den Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände und
über den Tumorzellen zu sehen. Hierbei war das Ausmaß der Markierung abhängig von
der Differenzierung des Tumors. Die Verteilung des in vivo applizierten anti-CEA Anti-
körpers BW 431/26 ergab ein ähnlich differentes Markierungsmuster. An den Tumor-
zellen und im umgebenden Bindegewebe entsprachen sich Antikörperverteilung und
Antigenexpression. In den Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände, die sehr viel
CEA enthielten, lies sich der Antikörper jedoch nur in diskreter Menge nachweisen.
Hieraus läßt sich einerseits die spezifische Bindung des anti-CEA Antikörpers an das
Carcinoembryonale Antigen ableiten. Andererseits deuten diese Ergebnisse an, daß sich
der Antikörper im Tumor nicht gleichmäßig verteilt hat und demzufolge nicht alle
Antigen-positiven Tumoranteile erreichen konnte. Dies dürfte durch Besonderheiten der
Tumorpathophysiologie, insbesondere der Vaskularisation und den gestörten Substrat-
transport, bedingt sein. Eine quantitative Einschätzung der Einflüsse der genannten
Faktoren konnte im Rahmen dieser Studie nicht erreicht werden.
Die erhobenen Befunde widersprechen nicht der spezifischen Bindung des Antikörpers.
Sie unterstreichen aber die Bedeutung von Forschungsansätzen zur Verbesserung der
Radioimmunszintigraphie und Radioimmuntherapie, bei denen eine vermehrte intra-
tumorale Antikörperaufnahme zur Erhöhung des Uptake-Verhältnis zwischen Tumor und
gesundem Gewebe angestrebt wird.
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Danksagung 84
8. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mir ermöglicht haben, diese
Studie durchzuführen:
Herrn Professor Dr. med. R. Bares, Direktor der Abteilung und Lehrstuhl für Nuklear-
medizin des Universitätsklinikums Tübingen, für die freundliche Überlassung des
Themas, die Betreuung der Arbeit und die vielen wertvollen Anregungen.
Herrn Professor Dr. rer. nat. Dr. med. H. Korr, Lehr- und Forschungsgebiet Anatomie
und Zellbiologie der RWTH Aachen, für die freundliche Anleitung zur Methode der
Autoradiographie, die Möglichkeit, die Autoradiogramme in seiner Abteilung herzustellen,
und die vielen Anregungen.
Herrn Professor Dr. med. C. Mittermayer, Direktor des Institutes für Pathologie der
RWTH Aachen, für die Überlassung der histologischen Präparate.
Herrn Professor Dr. med. U. Büll, Direktor der Klinik für Nuklearmedizin der
RWTH Aachen, für die Möglichkeit, die Inkubationsexperimente in seiner Abteilung
durchzuführen.
Herrn Professor Dr. med. S. Hauptmann, Institut für Pathologie der Charité Berlin,
für die Anleitung zur Auswertung der histologischen Präparate und seine Anregungen.
Herrn Professor Dr. med. G. Konrad, Chefarzt der Klinik für Urologie, Kinder-
urologie und urologische Onkologie, Kliniken Maria Hilf in Mönchengladbach, für die
Möglichkeit, die mikroskopische Dokumentation in seiner Abteilung durchzuführen.
Lebenslauf 85
9. Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Kremer
Vorname: Andreas
Geburtsdaten: 9. Juni 1967 in Birkesdorf, jetzt Düren
Familienstand: ledig
Konfession: römisch-katholisch
Eltern: Konrad Kremer, Bankangestellter
Theresia Kremer (=), Bankangestellte
Schulausbildung:
Grundschule: 1973-1977 Städtische Grundschule Nord, Düren
Gymnasium: 1977-1987 Stiftisches Gymnasium, Düren
Berufsausbildung:
Studium der Humanmedizin: 1987-1994 RWTH Aachen
Praktisches Jahr: 1994 Kreiskrankenhaus Marienhöhe in Würselen,
Wahlfach Anästhesie
Ärztliche Prüfung: 1994 RWTH Aachen
Approbation als Arzt: 1995 Bezirksregierung Köln
Berufstätigkeit als Arzt:
• 1994-1995 Maria Hilf Krankenhaus in Bergheim/Rheinland (AiP)
Abteilung für Anästhesie und operative Intensivmedizin
Chefärztin Frau Dr. med. E. Doepke
• seit 1996 Kliniken Maria Hilf in Mönchengladbach
Klinik für Anästhesie und operative Intensivmedizin
Chefarzt Herr Dr. med. G. Zentgraf
• 1996 Fachkunde Rettungsdienst
• 1997 Ausbildung zum Arzt im Zivilschutz
• 1998 Fachkunde Strahlenschutz
• 1998 Facharzt für Anästhesiologie
• 1998 Ausbildung zum Leitenden Notarzt
• 1999 Zusatzbezeichnung Sportmedizin