Aus dem Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und dem Institut für Tierernährung und Stoffwechselphysiologie der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
Verteilung des Flavonols Quercetin
in Organen und Geweben beim Schwein nach mehrwöchiger Verabreichung mit dem Futter
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Juliane Bieger
aus Preetz
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. J. Kamphues
Prof. Dr. S. Wolffram
1. Gutachter: Prof. Dr. J. Kamphues
Prof. Dr. S. Wolffram
2. Gutachter: Prof. Dr. W. Ternes
Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2007
I. Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung................................................................................1
2. Schrifttum ...............................................................................3
2.1 Struktur und Synthese von Flavonoiden ........................................3
2.2 Vorkommen und Aufgaben von Flavonoiden in Pflanzen ..............4
2.3 Aufnahme von Flavonoiden über pflanzliche Produkte ..................7
2.4 Wirkungen von Flavonoiden im menschlichen und tierischen
Organismus..................................................................................11
2.4.1 Antioxidative Eigenschaften.............................................11
2.4.2 Wirkung auf Enzyme, Signaltransduktion und
Genexpression.................................................................14
2.5 Bioverfügbarkeit von Flavonoiden................................................16
2.5.1 Intestinale Absorption ......................................................17
2.5.1.1 Einfluss des Glycosylierungsmusters: beteiligte
Enzyme und Transporter .....................................17
2.5.1.2 Die Rolle der intestinalen Mikroflora....................20
2.5.1.3 Einfluss der Nahrungszusammensetzung ...........21
2.5.2 Metabolisierung und Verteilung von Flavonoiden im
Organismus .....................................................................23
2.5.2.1 Konjugation .........................................................24
2.5.2.2 Intestinale und biliäre Sekretion ..........................27
2.5.2.3 Plasmatransport und Gewebeverteilung .............29
2.6 ß-Glucuronidase...........................................................................33
2.6.1 Subzelluläre Lokalisation .................................................33
2.6.2 Funktion ...........................................................................33
3. Material und Methoden.........................................................37
3.1 Fütterungsstudie ..........................................................................37
3.1.1 Versuchsaufbau und -durchführung.................................37
3.1.2 Flavonolanalytik ...............................................................39
3.1.2.1 Kalibrierung und Auswertung ..............................41
3.1.2.2 Korrektur Residualblut .........................................44
3.2 Bestimmung der Aktivität der ß-Glucuronidase............................45
3.2.1 Probenaufarbeitung und Testprinzip................................45
3.2.2 Proteinbestimmung und Auswertung...............................46
3.3 Statistische Auswertung...............................................................47
4. Ergebnisse ...........................................................................48
4.1 Gewebeverteilung von Quercetin und seiner methylierten
Metaboliten Isorhamnetin und Tamarixetin ..................................48
4.2 ß-Glucuronidaseaktivität verschiedener Gewebe.........................55
4.2.1 Eignung der Methode ......................................................55
4.2.2 ß-Glucuronidaseaktivität in einigen ausgewählten
Geweben des Schweins ..................................................56
5. Diskussion ............................................................................65
6. Zusammenfassung...............................................................78
7. Summary ..............................................................................80
8. Literaturverzeichnis ..............................................................82
II. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Grundstruktur und Numerierung von Flavonoiden..............................3 Abbildung 2: Flavonoidunterklassen........................................................................3 Abbildung 3: Molekulare Struktur von Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid).......................................5 Abbildung 4: Methylierung von Quercetin zu Tamarixetin (4'-Methylquercetin) und Isorhamnetin (3'-Methylquercetin) .............................................26 Abbildung 5: Kalibriergeraden zur quantitativen Bestimmung von Quercetin, Tamarixetin und Isorhamnetin in Plasma und Geweben ..................42 Abbildung 6: Chromatogramme eines Standards der Kalibriergeraden
sowie einer Plasmaprobe und einer Leberprobe vom Schwein nach vierwöchiger Verabreichung einer täglichen Dosis von 50 mg Quercetin pro kg Körpergewicht mit dem Futter.....................43
Abbildung 7: Gesamtkonzentration der Flavonole in Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon .................................52 Abbildung 8: Konzentrationen der Flavonolaglyca in Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon .................................53 Abbildung 9: Prozentuales Verhältnis von Quercetinaglyca und -konjugaten in den verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon ....................................................54 Abbildung 10: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenylglucuronid durch unter-
schiedliche Konzentrationen einer ß-Glucuronidase/Sulfatase-Mischung bei einem pH-Wert von 7,2...............................................55
Abbildung 11: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenylglucuronid durch unterschiedliche Konzentrationen einer ß-Glucuronidase/ Sulfatase-Mischung bei einem pH-Wert von 4,6 ..............................56 Abbildung 12: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenol durch die ß-Glucuroni- dase im Lungen-, Nieren- und Lebergewebe eines Schweins..........58 Abbildung 13: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenol durch die ß-Glucuroni- dase in Zwerchfell- und Rückenmuskulatur eines Schweins ............59 Abbildung 14: ß-Glucuronidaseaktivität in der Zwerchfell- und Rückenmusku- latur von drei Schweinen ..................................................................61
Abbildung 15: ß-Glucuronidaseaktivität in Lunge, Niere und Leber von drei Schweinen........................................................................................62 Abbildung 16: Spezifische ß-Glucuronidaseaktivität verschiedener Gewebe von drei Schweinen.................................................................................63 Abbildung 17: Darstellung der Beziehungen zwischen der ß-Glucuronidase- aktivität und dem Aglycongehalt in Leber, Zwerchfellmuskulatur und M. longissimus dorsi von drei Schweinen..................................64
III. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Gehalte verschiedener Flavonole (Angaben in mg/kg bzw. mg/l Frischsubstanz, Nachweis der Aglyca nach Hydrolyse der Glycoside ...............................................................................................10 Tabelle 2: Chemische Zusammensetzung der Versuchsration ..............................37 Tabelle 3: Gesamtkonzentration der Flavonole in verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon................50 Tabelle 4: Konzentration der Flavonolaglyca in verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon................51 Tabelle 5: ß-Glucuronidaseaktivität in Lunge, Niere, Leber, Zwerchfell- und Rückenmuskulatur von drei Schweinen.................................................60 Tabelle 6: Mittelwerte der ß-Glucuronidaseaktivität in verschiedenen Geweben von drei Schweinen ...............................................................................61
IV. Abkürzungsverzeichnis
ATP Adenosintriphosphat
BCRP1 Breast Cancer Resistance Protein 1
COMT Catechol-O-Methyltransferase
COX Cyclooxygenase
dpm disintegrations per minute
ε molarer Extinktionskoeffizient
HPLC High Performance Liquid Chromatography
Km Michaelis-Menten-Konstante
LDL Low Density Lipoprotein
LM Lebendmasse
LPH Laktasephlorizinhydrolase
MAPK mitogen-aktivierte Proteinkinasen
MRP1 bzw. 2 Multidrug Resistance Associated Protein 1 bzw. 2
NFκB Nuclear-Factor-Kappa-B
PCR Polymerase Chain Reaction
PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase
PKC Proteinkinase C
ppm parts per million
ROS Reaktive Sauerstoffspezies
Sc. Streptococcus
SGLT1 Sodium Dependend Glucose Transporter 1
UGT UDP-Glucuronosyltransferase
V. Bezugsquellenverzeichnis
Chemikalie Bezugsquelle Artikelnummer Reinheitsgrad [%]
Quercetin Dihydrat Rotichrom® HPLC
Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 7417.1 98 - 99
Isorhamnetin Rotichrom® HPLC
Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 2589.1 98 - 99
Tamarixetin Rotichrom® HPLC
Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 7425.1 98 - 99
Rhamnetin Rotichrom® HPLC
Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 7418.1 98 - 99
Quercetin Dihydrat Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 7138.1 ≥ 98,5
4-Nitrophenyl-β-D-glucuronid
Fluka/Sigma Aldrich Chemie
GmbH, Steinheim 73677 ≥ 99,0
Essigsäure Fluka/Sigma
Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
45730 99,5
ß-Glucuronidase/ Sulfatase
Sigma Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim G-0876
Aceton J. T. Baker, Holland 8142 99,7
Methanol HPLC Gradient Grade
J. T. Baker, Holland 8402 99,8
Salzsäure 32% Merck KGaA, Darmstadt 100319.1000 p. a.
Acetonitril HPLC Gradient Grade
J. T. Baker, Holland 9012 99,8
Aluminiumnitrat Nonhydrat Fluka/Sigma
Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
06275 ≥ 98,0
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich
Chemie GmbH, Steinheim
M-3148 ≥ 98,0
Albumin Fraktion V biotinfrei
Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 0163.2 ≥ 98,0
Bio-Rad Protein Assay, Dye Reagent Concentrate
Bio-Rad Laboratories
GmbH, München 500-0006 99,8
Natriumphosphat-Monohydrat
Calbiochem/Merck,Darmstadt 567549 99,8
Di-Natriumhydrogenphosphat
Merck KgaA, Darmstadt 106586.0500 99,0
1. Einleitung
1. Einleitung
Quercetin gehört zu den Flavonoiden, einer großen heterogenen Gruppe von sekun-
dären Pflanzeninhaltsstoffen mit polyphenolischer Struktur. Diese werden in nahezu
allen höheren Pflanzen in variierender Konzentration und Zusammensetzung synthe-
tisiert und übernehmen im pflanzlichen Stoffwechsel durch ihre Beteiligung an
Wachstums- und Differenzierungsvorgängen sowie Prozessen der Photosynthese
wichtige Funktionen. Ihre antioxidativen, antifungalen und bakteriziden Eigenschaften
machen sie zudem zu einem wichtigen Bestandteil des pflanzlichen Abwehrsystems.
Aufgrund ihrer weiten Verbreitung im Pflanzenreich werden Flavonoide dem mensch-
lichen und tierischen Organismus kontinuierlich mit der Nahrung zugeführt und sind
zahlreichen Studien zufolge auch hier in der Lage, den Zellstoffwechsel zu beeinflus-
sen. In den 30er Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts rückten diese polyphenoli-
schen Verbindungen erstmals durch ihre vitaminähnlichen Eigenschaften v. a. bei
Ernährungswissenschaftlern in den Mittelpunkt des Interesses. Der heutige Stand
der Forschung weist auf zahlreiche biologische Wirkungen verschiedener Flavonoide
im Säugerorganismus hin, die vor allem auf ihrem hohen antioxidativen Potential,
aber auch auf Interaktionen mit zahlreichen Enzymsystemen und dem Einfluss auf
zelluläre Signaltransduktionskaskaden und die Genexpression basieren. Eine protek-
tive Wirkung von Flavonoiden wird vor allem im Zusammenhang mit der Prävention
bestimmter Krankheitsformen, den sogenannten ’free radical diseases’, diskutiert, zu
denen Arteriosklerose, damit verbundene Herz-Kreislauf-Erkrankungen, bestimmte
kanzerogene Tumorformen und chronische Entzündungen gerechnet werden. Quer-
cetin, das zu den Flavonolen gehört und damit zu den häufigsten Flavonoiden in un-
serer Nahrung zählt, stellt eine der am intensivsten bearbeiteten Verbindungen aus
dieser Substanzgruppe dar. Seine Wirkungen wurden vielfach vor allem in entspre-
chenden in vitro-Studien nachgewiesen. In welchem Umfang diese Effekte auch un-
ter in vivo-Bedingungen gelten, bedarf noch weiterer Klärung. Eine Frage, die sich
stellt, ist unter anderem die nach der Verteilung von Flavonoiden im Organismus
nach einmaliger bzw. kontinuierlicher Aufnahme polyphenolreicher Nahrungsmittel.
Das Wissen über das Verhalten der Verbindungen nach ihrer Absorption, über ihre
1
1. Einleitung
Gewebeverteilung und Metabolisierung ist zum Verständnis ihrer Wirkungen im Kör-
per unerlässlich. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Verteilung von Quer-
cetin und einiger seiner Metaboliten im Organismus von Schweinen nach oraler Ap-
plikation zu untersuchen. Da aus zahlreichen Studien bekannt ist, dass nach oraler
Aufnahme von Quercetin praktisch ausschließlich Konjugate (Sulfate, Glucuronide)
von Quercetin und seinen methylierten Metaboliten in die Zirkulation gelangen, sollte
weiterhin untersucht werden, ob möglicherweise zwischen dem Auftreten hoher
Aglycagehalte in den Geweben und der gewebespezifischen Aktivität des Enzyms ß-
Glucuronidase eine Korrelation besteht.
2
2. Schrifttum
2. Schrifttum
2.1 Struktur und Synthese von Flavonoiden
Die typische Drei-Ring-Struktur des Flavonoidgrund-
moleküls, welches man als Flavan bezeichnet, wird
gebildet aus den aromatischen Ringen A und B, die
über drei C-Atome gekoppelt sind (Abb. 1). Letztere
bilden zusammen mit Sauerstoff den heterozyklischen
Ring C, wodurch das Molekül die Grundstruktur von
Diphenylpropan (C6-C3-C6) erhält (Formica & Regelson
1995, Manach et al. 2004, Bravo 1998).
Abb. 1: Grundstruktur und Numerierungvon Flavonoiden
Die Flavonoide lassen sich anhand des Oxidationsstatus’ und der
funktionellen Gruppen des C-Rings, sowie seiner Verbindung mit dem
B-Ring in die folgenden sechs Hauptunterklassen einteilen: Flavanole
(Catechine), Flavanone, Flavone, Flavonole, Anthocyanidine und Iso-
flavone (Abb. 2) (Beecher 2003, Ross & Kasum 2002). Flavonole
zeichnen sich beispielsweise durch eine Doppelbindung zwischen C-
Atom 2 und 3 sowie eine 4-Oxo-Gruppe und einer Hydroxylgruppe an
Position C-3 aus (Ader et al. 1999). Zusätzliche Hydroxylierungen an
den C-Atomen 3’ und 4’ sind am häufigsten (Rice-Evans et al. 1996).
Etwa 90 % der Flavonole besitzen außerdem eine Hydroxylgruppe an
Position C-5 und C-7 (Manach et al. 1996). Auch die meisten Antho-
cyanidine stimmen untereinander durch OH-Gruppen in diesen bei-
den Lokalisationen des A-Ringes überein und unterscheiden sich
voneinander durch das Substitutionsmuster im B-Ring (Böhm et al.
1998).
Isoflavon
Anthocyanidin
Flavonol
Flavon
Flavanon
Flavanol (Catechin)
Abb. 2: Flavonoid-unterklassen
Die Synthese der Flavonoide erfolgt über den Phenylpropanoidweg,
über den der Säugerorganismus nicht verfügt. Dabei stellt die aroma-
tische Aminosäure Phenylalanin die Hauptausgangssubstanz für den
Aufbau des B-Ringes und des heterozyklischen C-Ringes dar. Sie
3
2. Schrifttum
entsteht als Endprodukt des Shikiminsäureweges aus Erythrose-4-Phosphat und
Phosphoenolpyruvat, zwei Metaboliten des Kohlenhydratstoffwechsels. Aus der Ami-
nosäure wird durch enzymatische Katalyse über Zimtsäure 4-Cumarsäure gebildet
(Heller & Forkmann 1994). Die auf diese Weise entstandenen C9-Körper werden bei
Speicherung in den Pflanzen meist kovalent an Zellwandpolysaccharide - vor allem
durch Veresterung mit Arabinoseeinheiten der Hemicellulose - oder an das soge-
nannte Kernlignin gebunden (Bravo 1998). Der A-Ring wird unter Abgabe von drei
CO2-Molekülen aus drei Malonyl-CoA-Einheiten gebildet. Durch die anschließende
Kondensation dieser C6-Körper mit 4-Coumaroyl-CoA (C9), die durch die Chalkon-
synthase, das Schlüsselenzym der Flavonoidbiosynthese, katalysiert wird, sowie
nachfolgenden Ringschluss, entstehen letztendlich die Vorstufen der Flavonoidmole-
küle (Strack 1997). Die zahlreichen strukturellen Variationen innerhalb der Flavonoi-
dunterklassen resultieren des Weiteren aus diversen nachfolgenden Reaktionen wie
Hydratisierungen, Hydroxylierungen, Glycosylierungen, Methylierungen oder Sulfatie-
rungen (Duthie et al. 2003, Aisling Aherne & O’Brien 2002). Die Substituenten haben
einen signifikanten Einfluss auf das Molekulargewicht, ihre Wasserlöslichkeit und die
biologischen Eigenschaften der Moleküle.
2.2 Vorkommen und Aufgaben von Flavonoiden in Pflanzen
Flavonoide stellen eine große Fraktion der zahlreichen polyphenolischen Verbindun-
gen dar, die Pflanzen als sogenannte sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe synthetisieren.
Abgesehen von den Catechinen liegen Flavonoide in den Pflanzen fast ausschließ-
lich als Glycoside vor (Aisling Aherne & O’Brien 2002). Die meist ß-O-glycosidische
Bindung an einen Zuckerrest erhöht unter anderem die Polarität und damit die Was-
serlöslichkeit der Moleküle, was für ihre Speicherung im Zellsaft der Pflanzen not-
wendig ist (Aisling Aherne & O’Brien 2002). Die Glycosylierung am Flavonolmolekül
findet bevorzugt in der C-3-Position statt, weniger häufig auch am C-7-Atom und
eher selten an den Positionen 4’, 3’ und 5 (Hollman & Arts 2000). In der Regel erfolgt
dabei die Bindung über ein Sauerstoffatom, seltener kommen entsprechende Deriva-
tisierungen direkt an den Kohlenstoffatomen der Grundgerüste vor (Böhm et al.
4
2. Schrifttum
1998). Mehr als 80 verschiedene Zuckerreste sind in diesem Zusammenhang bereits
identifiziert worden.
Die unterschiedlichen Glycolysierungsmuster erklären die große Liste an Einzelver-
bindungen, die sich bei den Flavonoiden bereits auf über 6000 identifizierte Verbin-
dungen beläuft und kontinuierlich ergänzt wird. Für Quercetin allein wurden bereits
weit über 100 verschiedene Glycoside beschrieben, darunter das häufig vorkommen-
de Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid)
(Williams & Harborne 1994, 2000) (Abb. 3). Weit verbreitete Monosaccharide sind ne-
ben Glucose unter anderem Rhamnose, Galactose, Xylose oder Arabinose, die in
Form von Mono-, Di- und Oligosacchariden mit den Aglyca verknüpft sind. Seltener
findet die Substitution mit Glucuron- und Galacturonsäure statt. (Duthie et al. 2003,
Bravo 1998, Herrmann 1990).
O
OOH
OH
HO
OHOH
O - Glucose
O
OOH
OH
HO
OHOH
Isoquercitrin Rutin
O - Glucose - Rhamnose
Abb. 3: Molekulare Struktur von Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin- 3-O-Gluco-rhamnosid)
Die höchsten Flavonoidkonzentrationen sind im allgemeinen in unreifen Geweben, in
denen aktive Zellteilung vorkommt, sowie in den dem Licht zugewandten Anteilen
von Pflanzen, wie Blättern, Blüten und Früchten zu finden (Herrmann 1990). Eine
Anreicherung der Flavonoide findet daher bevorzugt in der Epidermis statt, wobei sie
entweder gelöst in den Vakuolen (v. a. Flavon- und Flavonolglycoside) oder auch in
den epikutikularen Bereichen (v. a. Methylester) anzutreffen sind. Die Akkumulierung
in peripheren Arealen lässt sich dadurch erklären, dass Flavonoide lichtabhängig in
Photosynthese betreibenden Zellen synthetisiert werden (Manach et al. 1996), in de-
nen sie während der Lichtphase Elektronentransportprozesse katalysieren (Das
5
2. Schrifttum
1994). Gleichzeitig verhindern sie Schädigungen des Pflanzengewebes durch ihre
Eigenschaft, als effektive UV-B-Filter wirken zu können (Harborne & Williams 2000).
Überdies sind sie als Radikalfänger in der Lage, reaktive Sauerstoffspezies (ROS),
die im Zuge der Photosynthese gebildet oder durch ultraviolette Strahlung freigesetzt
werden, zu neutralisieren (Shirley 1996). Daneben besitzen Flavonoide eine große
Anzahl weiterer Eigenschaften, die im Zusammenhang mit Wachstum und Fortpflan-
zung und der Abwehr von Pathogenen und Fressfeinden stehen. Bestimmte Flavo-
noide sind für die charakteristische Färbung von Laub-, Blütenblättern und Früchten
verantwortlich und dienen somit als Lockstoff für Insekten, Vögel und Säuger, die
Pollen und Samen weiter verbreiten können (Das 1994, Harborne & Williams 2000).
Die als Pigmente in Pflanzen am häufigsten auftretenden Flavonoide sind die
Anthocyanidine (z. B. Cyanidin, Delphinidin oder Malvidin), welche rote, violette und
blaue Farbtöne aufweisen, dicht gefolgt von den gelben Flavonolen und Flavonen
(Cheynier 2005). Auch ein Einfluss auf Wachstums- und Differenzierungsvorgänge
wird diesen Verbindungen zugeschrieben, da sie vermutlich den Spiegel bestimmter
Phytohormone, den Auxinen, kontrollieren, die für die Regulation dieser Prozesse
zuständig sind (Formica & Regelson 1995, Brown et al. 2001). Des Weiteren inter-
agieren Flavonoide auf verschiedene Art und Weise mit Pilzen, Bakterien und Viren.
So induzieren verschiedene aus den Wurzeln freigesetzte Flavonoide bei Legumino-
sen die Transkription von bakteriellen Nodulationsgenen, woraus letztendlich die
Knötchenbildung an den Pflanzenwurzeln resultiert (Treutter 2005, Rolfe 1988). Sol-
che Wechselbeziehungen wurden auch zwischen Mikroorganismen und Nicht-
Leguminosen beobachtet. In Weizenpflanzen beispielsweise wird durch einen ähnli-
chen Mechanismus die Ausbildung von Kollateralwurzeln stimuliert (Treutter 2005).
In anderen Fällen übernehmen Flavonoide dagegen durch antibakterielle, antifungale
und antivirale Wirkungen Schutzfunktionen gegenüber Pflanzenpathogenen, indem
sie im allgemeinen deren Wachstum und Vermehrung hemmen. Zu den Mechanis-
men zählen dabei unter anderem die Blockierung von Enzymen oder die Bildung von
kristallinen Strukturen als physikalische Barrieren (Treutter 2005). Durch bitteren Ge-
schmack oder unangenehme Gerüche verleihen sie vielen Pflanzen außerdem einen
6
2. Schrifttum
wirksamen Schutz gegenüber Herbivoren, verschiedenen Insektenarten und anderen
Parasiten.
Die Verbindungen werden während der normalen Entwicklung des Pflanzengewebes
synthetisiert, ihre Produktion kann jedoch auch als Antwort auf eine Infektion, eine
Verletzung oder umweltbedingten Stress wie Strahlung und extreme Witterungsver-
hältnisse (Dürre, Kälte) induziert werden (Treutter 2005, Harborne & Williams 2000).
2.3 Aufnahme von Flavonoiden über pflanzliche Produkte
In welchen Konzentrationen Flavonoide im Endeffekt mit der Nahrung aufgenommen
werden, hängt von verschiedenen Parametern ab. Unter den Lebensmitteln stellen
Obst und Getränke wie Rotwein und Tee die Hauptquellen für Polyphenole dar. Die
Polyphenolzusammensetzung und der Gehalt dieser Substanzen variiert jedoch ins-
gesamt hinsichtlich der Quantität und Qualität zwischen und innerhalb der Pflanzen-
spezies zum Teil erheblich; manche Verbindungen kommen ubiquitär vor, andere
sind auf bestimmte Familien oder Spezies beschränkt. Flavonole können beispiels-
weise in unterschiedlichen Konzentrationen in nahezu allen pflanzlichen Produkten
angetroffen werden. Die reichhaltigsten Quellen für Quercetin und Kaempferol, die
diese Flavonoidunterklasse dominieren, sind unter anderem Zwiebeln, Brokkoli,
Blaubeeren, Weintrauben und auch Ginkgo biloba (Manach et al. 2004, Williamson &
Manach 2005) (Tab. 1). In Zwiebeln ist Quercetin meist an ein oder zwei Glucosemo-
leküle gebunden (Quercetin-4’-glucosid und Quercetin-3,4’-diglucosid), in Äpfeln an
Galactose und in Beerenfrüchten an Arabinoseeinheiten (Erlund 2004). Flavanone
wie Hesperidin kommen v. a. in Zitrusfrüchten vor, Isoflavone (z. B. Genistein und
Daidzein) sind wiederum typisch für Sojabohnen und Sojaprodukte (Scalbert &
Williamson 2000). Variationen innerhalb einer Pflanzenart resultieren auch aus der
Züchtung verschiedener Sorten. Der Quercetingehalt in Cherrytomaten beträgt zum
Beispiel etwa das 6-fache der Menge in Tomaten normaler Größe, da sie im Verhält-
nis zum Volumen eine größere Oberfläche haben und Flavonole in den äußeren
Schichten synthetisiert und gespeichert werden (Duthie & Crozier 2000). Auch eine
unterschiedliche Sonnenlichtexposition während des Wachstums beeinflusst den
7
2. Schrifttum
Flavonoidgehalt der Früchte, und bei jeder einzelnen Frucht findet an der dem Licht
zugewandten Seite wiederum eine deutliche Akkumulation statt (Price et al. 1995).
Eine Ausnahme bildet die unterirdisch wachsende Zwiebel, in der Flavonoide insge-
samt relativ gleichmäßig verteilt sind (Price & Rhodes 1997).
Demnach spielt es eine Rolle, welche Teile der Pflanzen letztendlich konsumiert
werden und unter welchen Bedingungen diese kultiviert worden sind. Weitere nicht
zu unterschätzende Faktoren, die den Gehalt an Flavonoiden in Lebensmitteln
pflanzlicher Herkunft beeinflussen, sind der Erntezeitpunkt bzw. der Reifegrad, die
Lagerungsbedingungen und Verarbeitung (Cheynier 2005, Manach et al. 2004). Auf-
grund der Bearbeitung während der Lebensmittelherstellung ergibt sich i. d. R. ein
Verlust von Flavonoiden (Hollman & Arts 2000). Schon das einfache Entfernen der
Schale bzw. äußeren Schichten von Früchten und Gemüse führt zu einer Verringe-
rung des Flavonoidgehaltes. Auch Erhitzen (Kochen, Frittieren, Backen) oder längere
Lagerung bei Zimmertemperatur haben erhebliche Auswirkung auf die Flavonoidkon-
zentrationen. So verlieren Zwiebeln und Tomaten durch einen 15-minütigen Koch-
vorgang etwa 75 - 80 % ihres Quercetingehaltes, durch Erwärmung in der Mikrowelle
etwa 65 % und 30 % nach dem Frittieren (Crozier et al. 1997). Die Gehalte an Flavo-
nolen in Obst- und Gemüsekonserven betragen nur etwa die Hälfte des jeweiligen
Rohmaterials, wobei ein großer Teil des Verlustes eher der Auswaschung als dem
Substanzabbau zugeschrieben wird. Während Flavonole und Flavone als relativ sta-
bile Verbindungen gelten, sind Anthocyanidine eher labil, wofür das Verblassen ein-
geweckter Erdbeeren ein bekanntes Beispiel darstellt (Böhm et al. 1998).
Aus dem bisher Gesagten geht hervor, dass die tatsächliche tägliche Aufnahme von
Flavonoiden sehr schwer zu kalkulieren ist. Hinzu kommen regionale Unterschiede in
Vegetation und Essgewohnheiten, die ebenfalls zu Differenzen in Menge und Art der
aufgenommenen Flavonoide führen. Vor dreißig Jahren wurde die Aufnahme von
Flavonoiden in den Vereinigten Staaten auf etwa 1 g pro Tag geschätzt (Kühnau
1976). Nach aktuellem Stand der Forschung geht man jedoch von geringeren Men-
gen aus. Betrachtet man ausschließlich die Flavonole, liegt die Aufnahme in den
USA und Holland bei 20 - 25 mg, in Italien bei 5 - 125 mg täglich (Sampson et al.
2002, Hertog et al. 1993, Pietta et al. 1996). Das in der Nahrung dominierende Fla-
8
2. Schrifttum
vonol ist nach Hertog et al. (1995) Quercetin mit einer durchschnittlichen Aufnahme-
menge von etwa 16 mg pro Tag. In Bayern liegt die durchschnittliche Tagesaufnah-
me an Flavonoiden nach Linseisen et al. (1997) bei ca. 54 mg pro Tag. Die Flavo-
nolmenge liegt bei ca. 12 mg, von denen Quercetin mit 10,3 mg den Hauptteil aus-
macht.
Über die Flavonoidaufnahme von Tieren ist wenig bekannt, sie dürfte bei Herbivoren
unter Umständen jedoch ein Vielfaches über der Tagesmenge des Menschen liegen.
Auf dem Nutztier- bzw. Haustiersektor besteht durch gezielte Supplementierung von
Flavonoiden oder flavonoidhaltigen Pflanzenextrakten die Möglichkeit, den Tieren
bestimmte Mengen dieser Substanzen zuzuführen, um potenziell gesundheitsför-
dernde oder qualitätssteigernde Effekte zu erreichen (s. Kapitel 8).
9
2. Schrifttum
Tab. 1: Gehalte verschiedener Flavonole (Angaben in mg/kg bzw. mg/l Frisch-
substanz, Nachweis der Aglyca nach Hydrolyse der Glycoside)
Nahrungsmittel Flavonol Gehalt Zwiebel Quercetin 280-490 3)
Kaempferol <2 3)
Myricetin <1 3)
Brokkoli Quercetin 30-37 1)
Kaempferol 60-72 1)
Salat (grün) Quercetin 147 2)
Äpfel Quercetin 21-72 3)
Kaempferol <2 3)
Myricetin <1 3)
Trauben (rot) Quercetin 15-37 1)
Myricetin 4,5 1)
Johannisbeeren (schwarz) Quercetin 37 1)
Kaempferol 11)
Erdbeeren Quercetin 6-8,6 1)
Kaempferol 5-12 1)
Myricetin <1 3)
Tee (schwarz) Quercetin 14-17 1)
Kaempferol 14-16 1)
Myricetin 3 1)
Rotwein Quercetin 4-16 3)
Kaempferol <1 3)
Myricetin 7-9 3)
1) Hollman & Arts (2000), 2) Crozier et al. (1997), 3) Hertog & Katan (1998)
10
2. Schrifttum
2.4 Wirkungen von Flavonoiden im menschlichen und tieri-schen Organismus
Die biologische Aktivität von Polyphenolen wurde v. a. in in-vitro-Studien untersucht,
in denen meistens die Eigenschaften der Aglyca, jedoch weniger der Glycoside in
Zellkulturen oder isolierten Geweben im Mittelpunkt standen. Weit weniger ist be-
kannt über die Wirkungen der konjugierten Derivate, zu denen die Ausgangsverbin-
dungen im Organismus metabolisiert werden, da Daten über ihre Identität erst seit
einigen Jahren bekannt sind.
Im Folgenden werden die wichtigsten biologischen Effekte bzw. Wirkungsmechanis-
men beschrieben.
2.4.1 Antioxidative Eigenschaften
Zwischen der oxidativen Schädigung von Biopolymeren (Lipide, Nukleinsäuren, Pro-
teine) und der Entstehung chronischer Erkrankungen des Menschen wie Arterioskle-
rose, Krebs und Diabetes mellitus Typ 2 werden seit mehreren Jahren kausale Be-
ziehungen vermutet (Böhm et al. 1998). Daher besteht seitens der Präventivmedizin
großes Interesse, das Abwehrsystem des Körpers mittels exogener Antioxidantien
aktiv zu unterstützen. Die Annahme, dass Polyphenole in diesem Zusammenhang
eine entscheidende Funktion übernehmen könnten, basiert auf ihrer ausgeprägten
antioxidativen Kapazität, die allerdings v. a. in vitro nachgewiesen wurde (Manach et
al. 2005a). Viele Flavonoide sind in der Lage, eine große Zahl reaktiver Sauerstoff-
spezies (ROS) zu „neutralisieren“ und damit unschädlich zu machen (Halliwell et al.
2005). Unter der Bezeichnung ROS werden sowohl Radikale (Superoxid-, Hydroxyl-
radikale u. a.), Singulett-Sauerstoff als auch nicht-radikalische Sauerstoffverbindun-
gen wie Wasserstoffperoxid oder hypochlorige Säure zusammengefasst (Middleton
et al. 2000). Sie entstehen spontan an verschiedenen Stellen im oxidativen Stoff-
wechsel eukaryontischer Zellen, zeichnen sich durch ein hohes Reaktionspotential
aus und führen zur Schädigung wichtiger Zellstrukturen, sobald die zelleigenen
Schutzmechanismen überlastet sind. Zu diesen zählen zum einen Enzyme wie Kata-
11
2. Schrifttum
lase, Peroxidasen und Dismutasen, zum anderen nicht-enzymatische Faktoren wie
beispielsweise Ascorbat und α-Tocopherol (Pietta 2000, Middleton et al. 2000).
Kriterien für das Vorhandensein eines antioxidativen Potenzials sind vor allem die
Existenz bestimmter Strukturen und Substituenten, wie beispielsweise eine Doppel-
bindung zwischen dem C2- und C3-Atom in Verbindung mit einer 4-oxo-Gruppe im
heterozyklischen Ring, die eine Delokalisation von Elektronen ermöglicht, ohne dass
die Ringstruktur an Stabilität verliert. An der Abnahme der antioxidativen Wirkung
von 2,3-Dihydroquercetin (Taxifolin) gegenüber Quercetin von ca. 50 % lässt sich
außerdem schließen, dass ein insgesamt ungesättigter Charakter dieses Ringes, der
eine Elektronenwanderung ermöglicht, von ausschlaggebender Bedeutung ist (Böhm
et al. 1998). Des Weiteren sind eine ortho-Dihydroxystruktur im B-Ring und zusätzli-
che Hydroxylgruppen an Position 3 und 5 als aktivitätssteigernde Strukturmerkmale
zu nennen (Manach et al. 1996, van Acker et al. 1996, Bravo 1998, Pietta 2000, Ri-
ce-Evans et al. 1996, Bors et al. 1997). Eine Erklärung für die hohe antioxidative Ak-
tivität von Flavonolen scheint außerdem ihre planare Struktur und die Ausbildung von
intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen zu sein (van Acker et al. 1996).
Quercetin besitzt alle diese Merkmale in Kombination und ist daher eines der poten-
testen natürlich vorkommenden phenolischen Antioxidantien. Eine Rangfolge von
Flavonoiden gemäß ihrer antioxidativen Wirkung kann jedoch nicht allgemeingültig
aufgestellt werden, da die Reaktionen der Flavonoide auf verschiedene ROS sehr
unterschiedlich sein können (Böhm et al. 1998). Die Unterbrechung von Kettenreak-
tionen, die durch hochreaktive Radikale ausgelöst werden, erfolgt im allgemeinen bei
allen phenolischen Verbindungen durch die Übertragung eines Wasserstoffatoms
aus einer ihrer OH-Gruppen, wodurch sie den Radikalen ein Elektron zur Verfügung
stellen. Sie tragen zwar nun selber ein ungepaartes Elektron, sind jedoch im Gegen-
satz zu den ROS relativ reaktionsträge (Bravo 1998). Durch die Reaktion mit einem
zweiten Radikal können sie in eine stabile Chinonstruktur übergehen (Pietta 2000).
Neben ihrer Fähigkeit als Radikalfänger sind Flavonoide außerdem in der Lage durch
Komplexbildung mit prooxidativen Metallen wie Kupfer, Aluminium und Eisen indirekt
antioxidativ zu wirken. Eisen, welches aus seinen Komplexen mit den Transport-
proteinen (z. B. Ferritin, Transferritin) freigesetzt wird, kann unter anderem die Bil-
12
2. Schrifttum
dung von hochreaktiven Hydroxylradikalen initiieren, die durch die Reduktion von
Wasserstoffperoxid (Fenton-Reaktion) gebildet werden (Ferrali et al. 1997). Flavo-
noide mit zwei benachbarten Hydroxylgruppen an den Positionen 3’ und 4’ im B-Ring
sowie einer Carbonylstruktur im C-Ring können mit Metallen Chelate bilden und die-
se effektiv neutralisieren (Kühnau 1976).
Eine weitere indirekte antioxidative Wirkung der Flavonoide besteht in der Unterstüt-
zung und Regeneration anderer mit der Nahrung zugeführter bzw. endogener Fakto-
ren des antioxidativen Abwehrsystems, zu denen beispielsweise verschiedene Vita-
mine zählen. Durch ihre phenolischen Hydroxylgruppen, die für die antioxidative Ak-
tivität der Flavonoide verantwortlich sind, weisen sie deutliche strukturelle Ähnlichkei-
ten zu starken Antioxidantien wie α-Tocopherol auf, welches sie sogar an Wirksam-
keit übertreffen (van Acker et al. 2000). Dadurch sind sie in der Lage, andere antioxi-
dative Systeme zu regenerieren und das Level dieser Substanzen im Körper aufrecht
zu erhalten (Zhu et al. 2000, Pietta 2000). Chen et al. (2005) wiesen zudem einen
synergistischen Effekt von Flavonoiden und den Vitaminen C und E bei der Wider-
standsfähigkeit von LDL (low density lipoproteins) gegenüber Oxidation nach. Aus
einer Oxidation von LDL, die im Rahmen des Fettstoffwechsels Cholesterin aus der
Leber in periphere Gewebe transportieren, resultiert die Bildung von atheroskleroti-
schen Plaques an den Gefäßwänden (Fuhrman & Aviram 2001, Hertog et al. 1993,
Chopra & Thurnham 1999).
Der größte Teil dieser Erkenntnisse basieren auf Ergebnissen von in vitro-Studien, in
denen meistens Aglyca eingesetzt wurden. Untersuchungen mit Glycosiden und
Konjugaten, die bisher weitaus weniger häufig durchgeführt wurden, deuten darauf
hin, dass die antioxidative Kapazität der Quercetinmetaboliten im Vergleich zum
Aglycon erheblich reduziert sein kann (Manach et al. 1998, Morand et al. 1998, Day
et al. 2000a). Zudem muss berücksichtigt werden, dass das Redoxverhalten der ein-
gesetzten antioxidativ wirksamen Verbindungen stark abhängig von den gewählten
Versuchsbedingungen ist, wodurch eine Übertragbarkeit auf die tatsächliche in vivo-
Situation nur schwer gewährleistet werden kann. Neben der Art des Versuchs-
mediums (lipophil oder hydrophil) spielen zum Beispiel Parameter wie der pH-Wert,
sowie Konzentrationen und Redoxpotenziale der Reaktionspartner eine entschei-
13
2. Schrifttum
dende Rolle. Der Vollständigkeit halber soll an dieser Stelle erwähnt werden, dass
Flavonoide, wie alle Verbindungen mit antioxidativem Potenzial, unter bestimmten
Bedingungen prooxidative Aktivität entwickeln können und in jedem Fall immer auf
diese hin untersucht werden sollten (Fukumoto & Mazza 2000).
2.4.2 Wirkung auf Enzyme, Signaltransduktion und Genexpression
Durch Interaktionen mit zahlreichen Enzymsystemen, die an dieser Stelle anhand
einiger ausgewählter Beispiele dargestellt werden sollen, sind Flavonoide in der La-
ge, in Schlüsselreaktionen des Metabolismus einzugreifen. Eine umfangreiche Über-
sicht involvierter Enzyme wurde im Jahr 2000 von Middleton et al. veröffentlicht.
Viele der direkten antiinflammatorischen und kardiovaskulären Effekte von Flavonoi-
den lassen sich auf die Beeinflussung des Arachidonsäuremetabolismus zurückfüh-
ren. Die Produkte dieses Stoffwechselweges, die Eicosanoide, können als homöo-
statische Agentien verstanden werden, die die Integrität der renalen und kardio-
vaskulären Systeme bewahren und Entzündungsvorgänge steuern (Formica & Re-
gelson 1995). Der initiale Schritt der Eicosanoidsynthese, welcher die Freisetzung
von Arachidonsäure aus Phospholipiden beeinhaltet, wird durch die Phospholipase
A2 katalysiert. Anschließend erfolgt unter anderem die Bildung von Leukotrienen,
Thromboxanen und Prostaglandinen durch Lipoxy- und Cyclooxygenasen (Middleton
et al. 2000). Flavonoide können als Inhibitoren der genannten Enzyme die Produkti-
on dieser Entzündungsmediatoren unterdrücken. Flavonole wie Quercetin mit drei
oder mehr Hydroxylgruppen, darunter orthoständige im B-Ring, gelten als selektive
Lipoxygenasehemmer, während Verbindungen mit weniger OH-Gruppen selektiv die
COX hemmen. Die jeweiligen Aglyca sind dabei wirksamer als die Glycoside (Böhm
et al. 1998). Daher sind sie nicht nur aus ernährungswissenschaftlicher Sicht interes-
sant, sondern geben auch auf den Arzneimittelsektor ein exzellentes Modell für die
Entwicklung synthetischer Entzündungshemmer ab (Yoon & Beak 2005). Eine weite-
re ebenfalls besonders aus medizinischer Sicht hervorzuhebende Eigenschaft von
Flavonoiden ist ihre Interaktion mit Enzymen des Phase-I-Metabolismus, den Cyto-
chrom P450-Oxygenasen. Eine Hydroxylierung durch diese Enzymfamilie ist Voraus-
setzung für eine anschließende Konjugation und Ausscheidung einer Reihe endoge-
14
2. Schrifttum
ner aber auch exogener Verbindungen, so dass eine Hemmung oder Induktion der
Cytochrom P450-Enzyme durch Flavonoide eine direkte Auswirkung auf die Biover-
fügbarkeit von Xenobiotika hat. Dabei nehmen Flavonoide nicht nur Einfluss auf die
Enzymaktivität, sondern auch auf die Gentranskription. So konnte bezüglich be-
stimmter Cytochrom P450-Isoformen für Quercetin beispielsweise ein stimulierender
Effekt nachgewiesen werden, während Kaempferol hemmend auf die Transkription
der gleichen Isoformen wirkte (Ciolino et al. 1999). Der hemmende Einfluss ver-
schiedener Flavonoide bezieht sich auf eine Vielzahl von Cytochrom P450-
Oxidoreduktasen in Leber- und Dünndarmepithelzellen, wodurch Flavonoide auch in
der Krebsprävention weiter in den Mittelpunkt des Interesses rücken (Zhai et al.
1998). Durch einen spezifischen und stark inhibitorischen Einfluss auf Cytochrom
P450-1A1-Enzyme senken vor allem Flavonole (u. a. Quercetin, Myricetin) und Flavo-
ne z. B. die metabolische Aktivierung von heterozyklischen Aminen aus der Nahrung,
die im allgemeinen zur Entfaltung ihrer genotoxischen Wirkung führt (Kanazawa et al.
1997).
Der Eingriff in Signaltransduktion und Genexpression durch Modulation von Enzy-
men und Transkriptionsfaktoren zieht nachhaltige Veränderungen grundlegender
zellulärer Mechanismen wie Proliferation, Apoptosis, Zelldifferenzierung und Zellalte-
rung nach sich (Williams et al. 2004). Proteinkinasen, die zu Hunderten in eukaryon-
tischen Zellen vertreten sind, übernehmen bei der Steuerung nahezu aller Zellfunkti-
onen eine wichtige Rolle. Ein hemmender Effekt von Flavonoiden wurde unter ande-
rem für die Proteinkinase C (PKC) (Agullo et al. 1997, Ferriola et al. 1989), die Phos-
phatidylinositol-3-kinase (PI3K) (Agullo et al. 1997, Gamet-Payrastre et al. 1999) und
Protein-Tyrosinkinasen (Cunningham et al. 1992) beschrieben. Durch die Modifikati-
on spezifischer Zielproteine in Form von Phosphorylierungen sind Proteinkinasen
Bestandteil einer Vielzahl zellulärer Signalkaskaden, die u. a. an der Regulierung der
Genexpression beteiligt sind. Regulatorische Proteine, die am Ende solcher Signal-
transduktionswege stehen, binden nach Aktivierung an die Promotorregion von Ziel-
genen und leiten damit die Anbindung von Polymerasen und somit die Transkription
ein. Einige dieser Transkriptionsfaktoren und der an der Genexpression beteiligten
Proteinkinasen reagieren zum Teil sehr sensitiv auf Änderungen des Redoxstatus’
15
2. Schrifttum
der Zelle, da sie durch freie Radikale aktiviert werden können. Flavonoide, die mit
DNA-Sequenzen, welche genregulatorische Eigenschaften besitzen, selbst nicht zu
interagieren scheinen (Kuo 2002), sind durch ihr antioxidatives Potenzial daher in der
Lage, die Genexpression indirekt zu regulieren. So besitzt Quercetin beispielsweise
eine inhibitorische Wirkung auf den Nuclear-Factor-κ-B (NFκB) (Sen & Packer 1996)
und verschiedene mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) (Ishikawa & Kitamura
2000).
Die hier beschriebenen Effekte sind nur einige wenige aus einer großen Palette von
komplexen Wirkungsmechanismen, die zum Teil sogar gegensätzlich sind. Sie las-
sen erkennen, dass Flavonoide ein extrem hohes Potenzial zur Beeinflussung von
Stoffwechselvorgängen besitzen, das zum heutigen Zeitpunkt noch nicht überschau-
bar ist. Auch erscheint die Einschätzung dieser Wirkungen durch die unzulängliche
Übertragbarkeit von in vitro-Studien auf die tatsächliche in vivo-Situation fragwürdig.
2.5 Bioverfügbarkeit von Flavonoiden
Eine der ersten Untersuchungen zur Bestimmung der absoluten Bioverfügbarkeit von
Quercetin stellten Gugler et al. (1975) an, indem sie die Pharmakokinetik des Flavo-
nols nach oraler und intravenöser Applikation beim Menschen verglichen. Da die Au-
toren nach oraler Aufnahme weder im Plasma noch im Urin Quercetinmetaboliten
fanden, schätzten sie die Verfügbarkeit auf weniger als 1 % der zugeführten Menge.
Zahlreiche Folgestudien, die sich mit der Absorbierbarkeit von Quercetin beschäftig-
ten, deuten darauf hin, dass je nach eingesetzter Spezies und Ausgangssubstanz
(Aglycon, Glucosid, Rhamnosid) mehr oder minder starke Variationen in der systemi-
scher Verfügbarkeit von Quercetin aufzutreten scheinen. Bei ileostomierten Proban-
den wurde beispielsweise die Aufnahme einer Fraktion von 24 % einer zugeführten
Aglyconmenge, 17 % Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid) sowie 50 % der Quer-
cetinglycoside aus Zwiebeln nachgewiesen (Hollman et al. 1995). Die Aufnahme von
Quercetinmonoglucosiden wurde in einer vergleichbaren Studie auf 65 – 81 % ge-
schätzt (Walle et al. 2000). Aus der Applikation von Quercetin an Ratten resultierten
bisher recht unterschiedliche Ergebnisse. Während Ueno et al. (1983) nach einmali-
16
2. Schrifttum
ger Verabreichung einer Dosis radioaktiv markiertem Quercetin von 2,3 mg/kg Kör-
pergewicht eine Absorption von 20 % ermittelten, wurde in einer Studie nach der Ap-
plikation von 7,6 mg Quercetin-4’-O-Glucosid pro kg Körpergewicht lediglich 6 % in
der systemischen Zirkulation detektiert (Graf et al. 2005). Chen et al. (2005) ermittel-
ten sogar eine annähernd 50 %ige Bioverfügbarkeit von Quercetin bei der Ratte.
Beim Schwein wiederum wurde nach Verabreichung von Quercetinaglycon über das
Futter in einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht eine orale Bioverfügbarkeit von 17
% nachgewiesen (Ader et al. 2000). Von Bedeutung - auch im Hinblick auf die mögli-
che Verteilung von Quercetin in bestimmte Zielgewebe - ist die Tatsache, dass sich
die Plasmaspiegel selbst bei extrem hohen Dosierungen im Bereich weniger µmol/l
bewegen.
2.5.1 Intestinale Absorption
Wie unter 2.2 bereits erwähnt, liegen Flavonoide mit Ausnahme der Flavanole in
pflanzlichen Nahrungsbestandteilen in glycosylierter Form vor und sind aus diesem
Grund relativ polar. Eine passive Diffusion durch biologische Membranen ist für Gly-
coside deswegen im allgemeinen weitgehend ausgeschlossen und erst nach Abspal-
tung der Zuckerreste erfolgt die Absorption in Form der lipophileren Aglyca (Crespy
et al. 2003, Scalbert & Williamson 2000). Dabei wurde zunächst angenommen, dass
eine Spaltung von Glycosiden v. a. im Dickdarm durch mikrobielle Enzyme stattfindet
(Kühnau 1976, Formica & Regelson 1995, Manach et al. 1997), da pankreatische
Enzyme nicht in der Lage sind, die ß-glycosidische Bindung aufzuspalten (Kühnau
1976, Arts et al. 2004). Später wurde jedoch anhand von Quercetinmonoglucosiden
gezeigt, dass diese schneller und effizienter als die Quercetinaglyca absorbiert wer-
den, was auf die Aufnahme im proximalen Darmtrakt zurück zu führen ist.
2.5.1.1 Einfluss des Glycosylierungsmusters: beteiligte Enzyme und Transporter
In situ-Versuche an Ratten weisen darauf hin, dass die Absorption einiger Flavonoid-
aglyca (Quercetin, Daidzein, Genistein) bereits aus dem Magen möglich ist, was je-
doch nicht für ihre Glycoside gilt (Crespy et al. 2002, Piskula et al. 1999). Diese sind
17
2. Schrifttum
im allgemeinen resistent gegen eine Hydrolyse im Magen, so dass sie das Duode-
num intakt erreichen (Hertog et al. 1992). Für Anthocyanidinmonoglycoside wurde
bei Ratten allerdings eine Absorptionsrate von ca. 25 % nachgewiesen (Talavéra et
al. 2003) und auch beim Menschen waren intakte glycosylierte Formen von Anthocy-
anidinen nur einige Minuten nach oraler Verabreichung im Blut nachweisbar (Cao et
al. 2001, Matsumoto et al. 2001). Ein Grund für diese Ausnahmestellung der Antho-
cyanidine ist, dass ihre Aglyca im pH-Bereich des Gastrointestinaltraktes sehr instabil
sind und abgebaut werden, bevor eine Absorption stattfinden kann (Erlund 2004).
Für Flavonoidglycoside, die im allgemeinen unversehrt in den Darmtrakt gelangen,
besteht abhängig von der Art ihres Zuckerrestes, die Möglichkeit, intakt oder nach
Abspaltung des Zuckers über die Enterozyten aufgenommen zu werden. Die Hydro-
lyse der Glycoside wird durch ß-Glucosidasen katalysiert, von denen drei in Säuge-
tieren ausführlich charakterisiert worden sind. Die lysosomale Glucocerebrosidase
(EC 3.2.1.62) und die intestinale Laktasephlorizinhydrolase (LPH) (EC 3.2.1.108)
sind membranständig und weisen substratspezifische Aktivitäten auf. Die dritte ß-
Glucosidase befindet sich hingegen frei im Cytosol vor allem in Leber- und Nieren-
und Dünndarmzellen und interagiert relativ unspezifisch mit verschiedenen Substra-
ten (Hays et al. 1996, Day et al. 1998). Bei der Bestimmung der Aktivität von ß-
Glucosidasen aus der Dünndarm-Bürstensaummembran von Menschen und Schafen
bezüglich einiger Flavonoid- und Isoflavonoidglycoside, darunter auch Quercetinmo-
no- und -diglucoside, wurden die meisten der eingesetzten Verbindungen mit ver-
schieden hoher Effizienz gespalten. Rutin (Quercetin-3-Glucorhamnosid) konnte je-
doch nicht hydrolysiert werden (Day et al. 1998, 2000b). Nach der oralen Aufnahme
von Rutin in Humanstudien zeigte sich, dass die Plasmawerte der Quercetinmetabo-
liten ihr Maximum erst 6 - 9 Stunden später erreichten, während dies bei Quercetin-
monoglucosiden wie dem Quercetin-4’-Glucosid schon innerhalb der ersten Stunde
der Fall ist (Hollman et al. 1997, 1999, Graefe et al. 2001, Cermak et al. 2003). Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, dass Rutin bzw. Polyphenole, die mit einem Rhamno-
serest verbunden sind, erst absorbiert werden können, wenn sie im hinteren Ileum
oder im Colon durch mikrobielle Enzyme hydrolysiert worden sind. Die Absorption im
distalen Darmtrakt bedeutet für diese Verbindungen nicht nur eine verzögerte Ver-
18
2. Schrifttum
fügbarkeit in der systemischen Zirkulation, sondern auch eine wesentlich ineffiziente-
re Aufnahme, da im Dickdarm die absorptionsfähige Oberfläche geringer ist als im
Dünndarm (Manach et al. 2004). Zudem unterliegen die freigesetzten Aglyca der Me-
tabolisierung durch die im distalen Gastrointestinaltrakt reichlich vorkommenden Mik-
roorganismen.
Die LPH befindet sich auf der apikalen Seite der Enterozyten, wodurch die Moleküle
nach Abspaltung der Zuckerreste als Aglyca ins Darmlumen freigesetzt werden und
danach passiv durch die Membranen diffundieren, wohingegen die cytosolische ß-
Glucosidase durch Carrier aktiv in die Zelle transportierte Glucoside hydrolysiert
(Németh et al. 2003, Petri et al. 2003). Das Quercetin-4’-glucosid beispielsweise
stellt ein potentielles Substrat für beide Enzyme dar, während das Quercetin-3-gluco-
sid erst nach Hydrolyse durch die LPH aufgenommen wird (Sesink et al. 2003, Day
et al. 2003). Der Umsatz der Substrate variiert allerdings inter-individuell, da sich die
Aktivitäten dieser Enzyme durch ausgeprägten Polymorphismus, also Genvariation
eines Allels innerhalb einer Population, unterscheiden. Németh et al. beobachteten in
ihren Untersuchungen mit zellfreien Extrakten humaner Dünndarmproben von zehn
verschiedenen Probanden eine etwa 87-fache Variation der Aktivität der im Dünn-
darm lokalisierten ß-Glucosidasen gegenüber dem Substrat Quercetin-4'-glucosid.
Die Lactasephlorizinhydrolase scheint der ausschlaggebende Faktor bei der Absorp-
tion von Quercetinmonoglucosiden zu sein. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass
durch die Inhibition des Enzyms die Aufnahme von Quercetin-3-glucosid bei Ratten
um 67 % sank, einhergehend mit einer 75 %igen Reduktion der Plasmakonzentration
(Sesink et al. 2003).
Für einfache Monoglucoside wird ein weiterer Aufnahmemechanismus in Betracht
gezogen, bei dem die Flavonoide in ihrer glycosilierten Form über den natriumab-
hängigen Glucosetransporter 1 (SGLT1) in die Enterozyten gelangen und anschlie-
ßend intrazellulär hydrolysiert werden (Hollman et al. 1999, Wolffram et al. 2002,
Walgren et al. 2000a). Die Wahrscheinlichkeit, dass dieser Glucosetransporter als
Transportmedium für Flavonoidglucoside dient, ist hoch, da er nachweislich ver-
schiedene glycosylierte Verbindungen zu transportieren vermag (Hirayama et al.
1994, Lostao et al. 1994). Versuche haben gezeigt, dass in Anwesenheit von Quer-
19
2. Schrifttum
cetin-3-glucosid (Isoquercitrin) und Quercetin-4’-glucosid (Spiraeosid) die intestinale
Aufnahme von Zuckermolekülen wie Glucose und Galactose kompetetiv gehemmt
wurde (Gee et al. 2000, Ader et al. 2001, Wolffram et al. 2002, Cermak et al. 2004).
Durch Untersuchungen zur Absorption von Flavonoiden an humanen Caco-2-Zellen
und SGLT1-transfizierten Hamsterovarzellen (G6D3) konnte sowohl mittels Fluores-
zenzmikroskopie als auch HPLC-Analysen die Aufnahme von Quercetin-4’-glucosid
in die Monolayer demonstriert werden, die sich im Beisein von Glucose und Phlorid-
zin, einem flavonoidähnlichen Polyphenolglucosid, verringerte. Die G6D3-Zellen wie-
sen zudem gegenüber parentalen Hamsterzellen eine gesteigerte Aufnahme auf
(Walgren et al. 2000a). In Experimenten mit der sogenannten „mucosal-uptake“-
Technik sowie Ussing-Kammer-Versuchen wurde die Annahme, dass eine Beteili-
gung des SGLT1 am Transport von Quercetinglucosiden sehr wahrscheinlich ist, er-
härtet. Dafür sprach eine Aufnahme von Isoquercitrin im Jejunum, in der der SGLT1
lokalisiert ist, nicht jedoch über die Colonschleimhaut, in der keine Exprimierung die-
ses Glucosetransporters stattfindet. Die Aufnahme von Quercetin-3-glucosid verrin-
gerte sich außerdem nach Zugabe von D-Glucose oder Phloridzin, sowie in Abwe-
senheit von Na+-Ionen, die für die Funktion des Carriers notwendig sind (Wolffram et
al. 2002). Weiterhin zeigten Cermak et al. (2004), dass der Na+-abhängige Glucose-
transport über den SGLT1 durch die genannten Quercetinmonoglucoside spezifisch
gehemmt wurde.
2.5.1.2 Die Rolle der intestinalen Mikroflora
Die enzymatische Aktivität der Mikroflora trägt einen nicht unerheblichen Teil dazu
bei, dass die Absorption und damit einhergehend auch die Bioverfügbarkeit von Fla-
vonoiden verringert wird, denn verstoffwechselt werden nicht nur die Flavonoidglyco-
side, die direkt mit der Ingesta den Dickdarm erreichen, sondern auch die Verbin-
dungen, die über die Galle ins Darmlumen resezerniert werden (Scalbert & William-
son 2000).
Die Abspaltung der Zuckerreste wird unter anderem durch ß-Glucosidasen und ß-
Rhamnosidasen katalysiert, die von einer Vielzahl verschiedener Bakterienspezies
stammen, darunter Streptokokkensubspezies (z. B. Sc. faecium VHG-1) (MacDonald
20
2. Schrifttum
et al. 1984), Escherichia coli-Stämme (Hur et al. 2000) und Bacteroides ssp.
(Bokkenheuser et al. 1987). Einige Bakterien metabolisieren ausschließlich den
Zuckerrest, während das Aglycon unverändert bleibt. So setzt beispielsweise Entero-
coccus cassiliflavus die Glucoseeinheit des Quercetin-3-O-glucosids zu Laktat, Ace-
tat und Formiat um (Schneider et al. 1999). Andere Mikroorganismenarten bauen
auch die Aglyca in großem Umfang weiter zu diversen aromatischen Verbindungen
ab (Kühnau 1976). Bestimmte strukturelle Merkmale scheinen jedoch Schutz vor
mikrobiellem Abbau zu bieten, wie z. B. die Abwesenheit von Hydroxylgruppen an
Position 5, 7 oder 4’ (Griffiths & Smith 1972). Zur Spaltung des Flavonoidgrundge-
rüstes sind u. a. Clostridium orbiscindens (Schoefer et al. 2003) und Eubacterium
ramulus befähigt (Blaut et al. 2003, Braune et al. 2001). Diese und andere Bakterien
spalten je nach chemischer Struktur den heterozyklischen Ring an verschiedenen
Stellen, wodurch aromatische Säuren entstehen. Flavonole werden dabei hauptsäch-
lich zu Hydroxyphenylessigsäuren umgesetzt, Flavone und Flavanone zu Hydro-
xyphenylpropionsäuren. Diese werden weiter zu Benzoesäurederivaten verstoff-
wechselt, welche letztendlich absorbiert und mit Glycin, Glucuronsäure oder Sulfaten
konjugiert werden oder weiter abgebaut werden. Im letzteren Fall entstehen kurzket-
tige Fettsäuren und Kohlenstoffdioxid (Hollman & Katan 1998). Walle et al. (2001)
konnten in ihrer Studie demonstrieren, dass radioaktiv markiertes Quercetin nach
oraler und intravenöser Applikation beim Menschen zu 24 – 81 % der zugeführten
Dosis in Form von CO2 abgeatmet wird. Ueno et al. (1983) hatten ebenfalls von der
Produktion radioaktiven Kohlenstoffdioxids kurz nach der oralen Verabreichung von
[14C] Quercetin an Ratten berichtet.
2.5.1.3 Einfluss der Nahrungszusammensetzung
Neben der chemischen Struktur der Verbindungen ist hinsichtlich der Bioverfügbar-
keit außerdem zu berücksichtigen, mit bzw. in Form welcher Nahrungsmittel sie auf-
genommen werden, da bei bestimmten diätetischen Komponenten die Möglichkeit
besteht, dass diese die Absorption von Flavonoiden beeinflussen. Diese Annahme
beruht auf Untersuchungen zur Aufnahme von Flavonoiden als Reinsubstanz in
Form der Aglyca oder von Glycosiden sowie als natürlicher Bestandteil einer Mahl-
21
2. Schrifttum
zeit bzw. in Verbindung mit bestimmten Nahrungskomponenten. Je nachdem, ob
Flavonoide in pflanzlicher Matrix eingeschlossen sind, aus der die Glycoside zu-
nächst während des Verdauungsvorganges durch mechanische, enzymatische und
chemische Prozesse freigesetzt werden müssen, oder ob sie mit bestimmten Lö-
sungsmitteln verabreicht werden, entstehen mehr oder weniger ausgeprägte Unter-
schiede in der Bioverfügbarkeit. Der Vergleich der Bioverfügbarkeit von Quercetin
nach einmaliger Aufnahme einer großen Menge Zwiebeln (225 µmol) bzw. Äpfel (325
µmol) ergab eine Differenz von 70 % (zugunsten der Zwiebeln), welche u. a. auf
Unterschiede in der Zellwandsstruktur, im Bindungsverhalten des Flavonols
gegenüber Zellbestandteilen und der Lokalisation der Glycoside in der Zelle
zurückgeführt wurde (Hollman et al. 1997). In einer weiteren Bioverfügbarkeitsstudie
wurde Probanden Zwiebelsupplement und Buchweizentee einerseits sowie isoliertes
Quercetin-4’-O-glucosid und Rutin andererseits verabreicht, um den Einfluss der
Pflanzenmatrix zu bestimmen. Ein Effekt konnte lediglich im Fall von Rutin
verzeichnet werden, wobei die Bioverfügbarkeit der Reinsubstanz nur rund zwei
Drittel derjenigen aus dem Teeextrakt betrug (Graefe et al. 2001). Neben der
Einwirkung der Struktur flavonoidhaltiger Nahrungsbestandteile wurde der Einfluss
bestimmter Nahrungskomponenten untersucht, darunter einige Fette und Alkohole.
Anhand verschiedener Experimente erhärtet sich die Annahme, dass Alkohole als
Extraktionsmittel für Polyphenole in der Lage ist, deren Aufnahme aus der Ingesta zu
steigern. Dazu wurden bereits mehrfach die Absorptionsprofile nach oraler
Administration von in Alkoholen (z. B. reines Ethanol oder Propylenglycol, Rot- und
Weißwein) und in nichtalkoholischen Getränken (Wasser, Fruchtsäfte) gelöstem
Quercetin verglichen (Goldberg et al. 2003, Piskula & Terao 1998, Dragoni et al.
2006, Azuma et al. 2002). Weinalkohol beispielsweise scheint den
Quercetinmetabolismus zudem in Richtung Isorhamnetin- und Tamarixetinbildung zu
lenken (Dragoni et al. 2006). Andere Studien deuten darauf hin, dass auch Fette und
emulsionsfördernde Agentien die Absorption von bestimmten Flavonoiden
verbessern können. In diesem Zusammenhang wurde die Wirkung von Fischöl,
Sojaöl, Rindertalg und Lecithin überprüft, welches in einer zwiebelhaltigen Diät in
einer Kurzzeitstudie an Ratten verfüttert wurde. Mehr als 4,6 % Sojaöl im Futter
führte zu einer deutlich gesteigerten Akkumulation von Quercetinmetaboliten im
22
2. Schrifttum
tinmetaboliten im Plasma. Ein Gehalt von 9,5 % Fischöl, Rindertalg oder Sojaöl in
der Diät hatte jeweils einen ähnlichen Effekt auf die Bioverfügbarkeit, während Leci-
thin noch effektiver wirkte, als die drei anderen Lipide. Eine gleichzeitige Verabrei-
chung von Emulgatoren mit dem Trinkwasser führte zu einer zusätzlichen Steigerung
der Bioverfügbarkeit der Quercetinglycoside aus der Diät (Azuma et al. 2003). In ei-
nem ähnlichen Experiment wurde Quercetin in der tendenziell lipophilen Aglyconform
und als hydrophiles 3-O-Glucosid in Testmahlzeiten mit unterschiedlichem Fettgehalt
(3, 17 oder 32 g Fett/100 g Futter) an wachsende Schweine verabreicht. Die Biover-
fügbarkeit des Glucosids war nach Aufnahme jeder Diät höher als die des Aglycons.
Ungeachtet der applizierten Verbindung wurde nach der 17 %igen im Vergleich zur 3
%igen Fettdiät eine Steigerung der Bioverfügbarkeit verzeichnet, eine Erhöhung des
Fettanteils erbrachte jedoch keinen weiteren Effekt. Mit Fett angereicherte Diäten
führten zudem zu einer deutliche Verzögerung der Elimination von Quercetin aus der
systemischen Zirkulation (Lesser et al. 2004).
2.5.2 Metabolisierung und Verteilung von Flavonoiden im Organismus
Dass Flavonoide schon im Lumen des Gastrointestinaltraktes und in der Darmmuco-
sa bereits vor dem Erreichen der Leber umfangreich metabolisiert werden und dem-
nach einem ausgeprägten intestinalen First-Pass-Effekt unterliegen, wurde durch
den Nachweis von entsprechenden Konjugaten im Kreislauf kurz nach oraler
Applikation in einigen in vivo-Studien dargelegt (Ader et al. 2000, Manach et al. 1998,
Morand et al. 1998). Einmal absorbiert, werden polyphenolische Verbindungen ver-
schiedenen Stoffwechselprozessen unterworfen, in die Phase-I- und Phase-II-En-
zyme involviert sind. Cytochrom P450-Monooxygenase-abhängige Hydroxylierungen
und Demethylierungen sind Beispiele für mögliche Aktivierungsreaktionen aus dem
Phase-I-Metabolismus, die jedoch im Flavonoidstoffwechsel eher eine untergeordne-
te Rolle zu spielen scheinen. Vielmehr wird angenommen, dass Flavonoide durch
ihre bereits vorhandenen Hydroxylgruppen in ihrer Ausgangsform sehr empfänglich
für Phase-II-Konjugationen sind (Day et al. 2004).
23
2. Schrifttum
2.5.2.1 Konjugation
Polyphenole sind hauptsächlich drei verschiedenen Konjugationstypen unterworfen:
Glucuronidierung, Sulfatierung und Methylierung. Es handelt sich dabei um allgemei-
ne Detoxifizierungsreaktionen, durch die u. a. toxische Effekte von Xenobiotika abge-
schwächt werden und deren Ausscheidung mit der Galle oder dem Harn durch die
Erhöhung ihrer Löslichkeit beschleunigt wird. Konjugation kann an einzelnen oder
mehreren Hydroxylgruppen des Polyphenolmoleküls stattfinden. Da bei Flavonoiden
die biologische Aktivität signifikant durch das Hydroxylierungsmuster bestimmt wird,
gehen aus dieser Art der Biotransformation, abhängig von der Position, an der eine
Konjugation stattfindet, Metaboliten mit veränderten Eigenschaften hervor (Boersma
et al. 2002).
Bei der Glucuronidierung wird die Übertragung von Glucuronsäuren auf Akzeptor-
moleküle wie Steroide, Gallensäuren, Polyphenole und viele Arzneimittel durch UDP-
Glucuronosyltransferasen (UGT) katalysiert, welche membranständig im endo-
plasmatischen Retikulum diverser Gewebe zu finden sind (Manach et al. 2004,
Taskinen et al. 2003). Im menschlichen Organismus gibt es verschiedene Isoformen
der UGT, von denen die meisten in der Leber lokalisiert sind. Einige Unterfamilien -
wie beispielsweise die UGT1A8 - kommen jedoch auch spezifisch im Gastrointesti-
naltrakt vor, andere in Niere oder Gehirn (King et al. 2000, Day et al. 2000a). Die in-
testinalen UGTs sind zu einem großen Teil am First-Pass-Metabolismus von Poly-
phenolen beteiligt. Ergebnisse mehrerer Studien am Modelltier Ratte zeigten, dass
Verbindungen dieser Substanzgruppe während der Absorption im Darm bereits ex-
tensiv glucuronidiert werden. In diesem Zusammenhang wurde z. B. die Metabolisie-
rung von Quercetin und Isoquercetrin während einer in situ-Perfusion des Jejunums
und Ileums untersucht, wonach sich ausschließlich konjugierte Formen im mesente-
rialen Blut anfanden (Crespy et al. 2001). Schon zuvor wurde die im Verhältnis zu
anderen Körpergeweben höchste UGT-Aktivität in Dünn- und Dickdarmpräparaten
von Ratten nach Messung von Epicatechinmetaboliten im Plasma registriert (Piskula
& Terao 1998), und auch durch Versuche am isolierten Rattendünndarm konnte eine
hohe Aktivität der UDP-Glucuronosyltransferase u. a. gegenüber einigen Flavonolen,
Flavonen und Flavanonen in den Enterozyten nachgewiesen werden (Spencer et al.
24
2. Schrifttum
1999). In einer Studie von Gee et al. (2000) zur Absorption von Quercetinaglyca und
-glucosiden durch die jejunale Mucosa von Ratten zeigte sich, dass Quercetin haupt-
sächlich in Form von Quercetin-7- und Quercetin-3-glucuroniden auf der serosalen
Seite des Darms erschien. Zudem konnte eine zusätzliche Konjugation an Position 4’
und 3’ durch UDP-Glucuronosyltransferasen aus menschlichen Dünndarmmikroso-
men demonstriert werden (Boersma et al. 2002).
Bei der Sulfatierung von Polyphenolen katalysieren Sulfotransferasen den Transfer
eines Sulfatrestes von der aktivierten Verbindung 3’-Phosphoadenosin-5’-phospho-
sulfat auf eine der Hydroxylgruppen (Piskula & Terao 1998, Falany 1997, Day et al.
2004). Durch die Konjugation mit Sulfaten wird die Wasserlöslichkeit stark erhöht und
damit die Exkretion mit dem Harn gesteigert (Weinshilboum & Otterness 1994). Es
liegt im allgemeinen eine hohe Affinität zur Sulfatierung vor, jedoch sind die Kapazi-
täten dieses Stoffwechselweges verglichen mit der Glucuronidierung relativ schnell
ausgeschöpft, so dass bei einer Erhöhung der Substratdosis eine Verschiebung zur
Konjugation mit Glucuronsäure vorliegt. Da aber normalerweise eine große Menge
an Konjugaten im Kreislauf auftauchen, die sowohl glucuronidiert als auch sulfatiert
sind, scheint eine Glucuronidierung kein Hindernis für eine nachfolgende Sulfatierung
darzustellen (Koster et al. 1981, Day et al. 2004). Cytosolische und membranständi-
ge Sulfotransferasen sind in Körpergeweben von Mensch und Tier weit verbreitet
und weisen überlappende Substratspezifitäten auf (Falany 1997). Vor allem in der
Leber scheinen Polyphenole umfangreich zu Sulfokonjugaten umgesetzt zu werden
(Piskula & Terao 1998). Die Methylierung ist eine weitere biologische Transformati-
on, die im Flavonoidmetabolismus eine Rolle spielt. Dabei katalysiert die Catechol-O-
Methyltransferase (COMT) die Übertragung eines Methylrestes von S-Adenosyl-L-
methionin auf Polyphenole, die eine Catecholgruppe im Molekül enthalten wie bei-
spielsweise Quercetin, Catechin oder Luteolin (Manach et al. 2004). Auch die Methy-
lierung von Cyanidin zu Peonidin im Menschen wurde nachgewiesen (Wu et al.
2002). Die COMT ist ubiquitär präsent im Körper, wobei Leber und Nieren relativ ho-
he Aktivitäten aufweisen (Piskula & Terao 1998). Zudem deuten einige Studien dar-
auf hin, dass die Methylierung von Flavonoiden bereits in den Enterozyten des
Dünndarms stattfindet. Dies demonstrierten neben Spencer et al. (1999) auch
25
2. Schrifttum
26
Kuhnle et al. (2000), die den Metabolismus von Catechin und Epicatechin im jejuna-
len Abschnitt des Rattendünndarms untersuchten und neben ca. 45 % Glucuroniden
etwa 20 % Metaboliten mit sowohl Glucuronyl- als auch Methylresten identifizierten,
sowie ca. 30 % Konjugate, die ausschließlich in Position 3’ und 4’ methyliert waren.
In diesen Lokalisationen werden Methylgruppen vorrangig gebunden, was auch an-
hand hoher Tamarixetin- und Isorhamnetinkonzentrationen (= 4’- und 3’-
Methylquercetin (Abb.4)) im Plasma, Urin und Gallenflüssigkeit von Ratten, denen
hohe Dosen an Quercetin mit dem Futter verabreicht worden waren, gezeigt werden
konnte (Manach et al. 1996b). Auch beim Schwein erscheinen beide Metaboliten
schon kurz nach oraler Aufnahme von Quercetin im Plasma, was für eine umfangrei-
che Methylierung in den Enterozyten spricht (Ader et al. 2000).
Tamarixetin
Quercetin
Isorhamnetin
Abb. 4: Methylierung von Quercetin zu Tamarixetin (4'-Methylquercetin) und Isorhamnetin (3'-Methylquercetin)
Das Konjugationsmuster der Metaboliten kann zwischen Individuen verschiedener
Spezies stark variieren, da es durch bestimmte Faktoren beeinflusst wird. Beispiels-
weise werden bei der Ratte im allgemeinen hohe Gehalte an methylierten Verbin-
dungen gefunden (Manach et al. 1996b), während dieser Stoffwechselprozess beim
Menschen eine untergeordnete Rolle zu spielen scheint und nach Applikation von
Quercetin nur ca. 20 – 30 % an methylierten Konjugaten im Blut auftreten. (Manach
et al. 1998, Day et al. 2000a). Auch die Sulfokonjugation überwiegt bei den Ratten im
Vergleich zum Menschen, bei dem die Glucuronidierung als Hauptkonjugationsme-
chanismus angegeben wird (Wittig et al. 2001, Crespy et al. 1999, Manach et al.
2. Schrifttum
1995). Letzteres gilt auch für das Schwein, in dessen Organismus Sulfatierung nicht
statt zu finden scheint (Caldwell 1982). Neben speziesspezifischen Unterschieden im
Metabolismus von Flavonoiden, sind auch geschlechtsabhängige Variationen beob-
achtet worden, wie z. B. geschlechtsspezifischer Dimorphismus bei Nagern bezüg-
lich der Sulfotransferaseaktivität (Piskula 2000, Klaassen et al. 1998). Ungeachtet
dieser interindividuellen Unterschiede hinsichtlich der Enzymkapazitäten ist die Ten-
denz zur Konjugation von Flavonoiden im Organismus von Säugern sehr hoch. Ab-
gesehen von Epigallocatechingallaten (Lee et al. 2002), sind daher sind bei der Auf-
nahme von nahrungsphysiologischen Dosen im allgemeinen nur sehr geringe Kon-
zentrationen der Aglyca im Plasma zu erwarten (Manach et al. 2004).
2.5.2.2 Intestinale und biliäre Sekretion
Flavonoide erreichen über die systemische Zirkulation nur zu einem bestimmten Pro-
zentsatz der zugeführten Menge die peripheren Gewebe. Dies liegt zum einen daran,
dass die intestinale Absorption nicht komplett zu sein scheint und zum anderen be-
stimmte Fraktionen in konjugierter Form über die Hepatozyten und Enterozyten ins
Darmlumen resezerniert werden. In welchem Ausmaß diese Vorgänge stattfinden,
hängt vor allem von den strukturellen Merkmalen der einzelnen Flavonoide ab
(Crespy et al. 2003).
Nach der intrazellulären Bildung von Flavonoidkonjugaten können diese Konjugate -
wie übrigens auch intakte Quercetinmonoglucoside - über die Bürstensaummembran
ins Darmlumen resezerniert werden. Anhand von Studien am Dünndarm von Ratten,
bei dem jejunale und ileale Segmente mit flavonoidangereicherter Lösung perfundiert
wurden, erhielten Crespy et al. (1999, 2003) Informationen über Absorption und Sek-
retion über den Darmtrakt, sowie die Verteilung von Quercetin und weiteren Flavo-
noiden. Zwei Drittel des zugeführten Quercetins wurden absorbiert, 52 % der Ge-
samtmenge wurden durch die Darmzellen ins Lumen resezerniert, und nur etwa 15
% konnten im mesenterialen Blut registriert werden. Zwei Fünftel dieses Anteils un-
terlagen der Sekretion über die Galle, so dass im Endeffekt lediglich 9 % der einge-
setzten Quercetinmenge in der Peripherie verfügbar waren. Ein mehr oder weniger
großer Anteil der absorbierten und in Darm und Leber konjugierten Flavonoide unter-
27
2. Schrifttum
liegt also dem enterohepatischen Kreislauf. Die resezernierten konjugierten Verbin-
dungen erreichen den Zwölffingerdarm, werden jedoch während ihrer Passage durch
den Dünndarm nicht reabsorbiert. Erst durch die enzymatische Aktivität der Mikroflo-
ra im distalen Darmtrakt (s. 2.5.1.2) findet eine Dekonjugation statt. Die freigesetzten
Aglyca werden entweder erneut absorbiert oder weiter abgebaut (Manach et al.
2004).
Ein Efflux von Flavonoiden aus den Zellen wird vermittelt durch sogenannte
ABC(ATP-binding cassette)-Transporter wie dem MRP1 bzw. MRP2 (multidrug
resistance associated protein 1 und 2), dem P-Glykoprotein und dem BCRP1 (breast
cancer resistance protein), die sich vor allem in Organen befinden, die an der Elimi-
nation von Xenobiotika beteiligt sind, also unter anderem auch in der Bürstensaum-
membran der Enterozyten und der kanalikulären Membran der Hepatozyten (Ofer et
al. 2005, Sesink et al. 2005, O’Leary et al. 2002). Es handelt sich hierbei um primär
aktive Mechanismen, die durch Energie aus der Hydrolyse von ATP ihre Substrate
aus der Zelle „bergauf“ transportieren können (Litman et al. 2001).
MRP1 und 2 akzeptieren im allgemeinen ein ähnliches Spektrum von organischen
Anionen, darunter Konjugate von lipophilen Verbindungen wie Glutathion-, Glucuro-
nid- und Sulfokonjugate (König et al. 1999, Borst & Elferink 2002). Es wurde jedoch
auch gezeigt, dass MRPs auch den Efflux nichtanionischer Verbindungen, wie zum
Beispiel von Quercetin-4’-glucosid, vermitteln können (Walgren et al. 2000b). MRP1
ist zwar in Körpergeweben weit verbreitet, kommt aber im Gegensatz zu MRP2 in
Leber- und Darmzellen nur limitiert vor, und trotz ähnlicher Molekülstruktur und Sub-
stratspektra weisen MRP1 bzw. MRP2 unterschiedliche Affinitäten zu verschiedenen
Flavonoiden auf. Diese Eigenschaft beobachteten unter anderem van Zanden et al.
(2005) bei ihren Untersuchungen zur inhibitorischen Wirkung von insgesamt 29 Fla-
vonoiden aus der Subklasse der Flavone und Flavonone auf MRP1 und 2.
BCRP1, ein weiteres Mitglied der ABC-Transporter-Familie, wurde initial in humanen
Brustkrebszellen entdeckt (Doyle et al. 1998). In vitro-Studien haben gezeigt, dass
Flavonoide auch potenzielle Substrate für BCRP1 darstellen (Zhang et al. 2004, Imai
et al. 2004). Neben der direkten inhibitorischen Wirkung auf den Transporter sind
28
2. Schrifttum
zumindest einige Flavonoide in der Lage, die ATPase-Aktivität zu modulieren
(Cooray et al. 2004). BCRP1 scheint am apikalen Efflux von in Enterozyten gebilde-
ten Quercetinglucuroniden beteiligt zu sein, da nach Einsatz von FTC (Fumitremorgin
C), einem spezifischen Inhibitor dieses Effluxtransporters, bei Ratten ein mehr als
zweifacher Anstieg des Plasmaquercetinspiegels verzeichnet werden konnte (Sesink
et al. 2005). Auch in der Leber ist dieser Transporter nachweisbar, was die Beteili-
gung an der effizienten Exkretion von Quercetinkonjugaten über die Galle sehr wahr-
scheinlich macht (Arts et al. 2004).
Das P-Gykoprotein, welches eine ähnliche Gewebeverteilung wie das BCRP1 auf-
weist, spielt eine Rolle beim Transport von amphipatischen oder positiv geladenen
lipophilen Molekülen, vorrangig in Grenzgeweben wie der Blut-Hirn- oder der Blut-
Hoden-Schranke, der Plazenta oder dem Colon. Auch in Tumoren kann es in gro-
ßem Umfang exprimiert werden (Cooray et al. 2004). Durch seine Lokalisation an
zellulären Barrieren übernimmt dieser Transporter eine Schutzfunktion bei der Ver-
teidigung von Zellen gegenüber toxischen Substanzen, im Fall der Behandlung von
malignen Tumoren kann er jedoch das Eindringen von therapeutisch eingesetzten
Medikamenten wie Zytostatika stark behindern (Ofer et al. 2005). Für Flavonoide be-
stehen derzeit gegensätzliche Aussagen über ihre Wirkung auf das P-Glykoprotein.
Im allgemeinen sind sie in der Lage, durch kompetetive Hemmung die Akkumulation
anderer Substrate des P-Glykoproteins zu fördern, ihre Effekte auf die ATPase-
Aktivität des Transporters scheinen jedoch unterschiedlich zu sein. So beobachteten
Wang et al. (2005) in einem entsprechenden Experiment mit Flavonoiden aus Ginkgo
biloba eine Hemmung der ATPase-Aktivität des Proteins durch Quercetin und
Kaempferol, jedoch einen stimulierenden Effekt durch Isorhamnetin.
2.5.2.3 Plasmatransport und Gewebeverteilung
Polyphenole bzw. ihre Metaboliten zirkulieren nicht in freier Form im Blutkreislauf,
sondern gehen zum größten Teil eine Bindung mit Plasmaproteinen ein. Die Interak-
tionen von Quercetin mit diesen Transportproteinen ist eingehend untersucht worden
(Boulton et al. 1998, Zsila et al. 2003, Sengupta & Sengupta 2002). Dabei stellte sich
heraus, dass das Quercetinaglycon in vitro umfangreich (~99 %) an menschliches
29
2. Schrifttum
Serumalbumin gebunden wird, eine Kopplung an andere Proteine und LDLs dagegen
eine untergeordnete Rolle spielt. Von größerer Bedeutsamkeit ist jedoch die Unter-
suchung des Bindungsverhaltens der Konjugate, die nach Aufnahme polyphenolhal-
tiger Nahrung im Organismus entstehen. Ihre Affinität zum Albumin bestimmt letzt-
endlich, in welchem Maße sie als biologisch aktive Verbindungen in periphere Ge-
webe aufgenommen, verteilt und weiter verstoffwechselt werden. Nach Untersuchun-
gen von Dufour & Dangels (2005) zur Bindungsaffinität von Quercetinkonjugaten ist
davon auszugehen, dass auch diese im Kreislauf zum größten Teil als Komplex mit
Albumin zirkulieren, obwohl ihre Affinität zu dem Plasmaprotein, verglichen mit dem
Aglycon, abgeschwächt ist. Eine in vitro-Studie deutet außerdem darauf hin, dass
menschliche Erythrozyten durch die Bindung von Quercetin an Hämoglobin eine Rol-
le in der Bioverfügbarkeit von Flavonoiden spielen könnten (Fiorani et al. 2003).
Die Gewebeverteilung von Flavonoiden - insbesondere von Quercetin - wurde schon
von einigen Autoren behandelt, wobei es zwischen Kurz- und Langzeitstudien zu dif-
ferenzieren gilt. Ein relativ häufig verwendeter Versuchsansatz stellt beispielsweise
die Untersuchung der Verteilung der Radioaktivität nach einmaliger oraler Applikation
von radioaktiv markiertem Quercetin bei der Ratte dar. Als Ergebnis einer solchen
Studie wurde sechs Stunden nach Gabe einer Einzeldosis von [14C]-Quercetin-
aglycon die mit Abstand höchste Konzentration der zugeführten Radioaktivität im
Gastrointestinaltrakt und nur etwa 0,2 % in Leber und Nieren gefunden. Alle weiteren
untersuchten Organe (Lunge, Skelettmuskulatur, Herz) enthielten eine um ein Viel-
faches geringere Menge an radioaktiven Molekülen (Ueno et al. 1983). Mullen et al.
(2002) und Graf et al. (2005) widmeten sich in zwei inhaltlich zusammenhängenden
Studien der Verteilung und Metabolisierung von Quercetin-4’-glucosid. Sie wiesen
eine Absorption in einem Bereich von ca. 6 % der eingesetzten Dosis (7,6 mg/kg
[14C]-Quercetin-4’-glucosid = 58,5 x 106 dpm) sowie bezüglich der Organverteilung
ebenfalls vorrangig eine Anreicherung in Leber und Niere (je ~1 % der absorbierten
Radioaktivität) nach. Über 95 % der absorbierten Substanz wurde in Form von mehr
als 20 verschiedenen methylierten, glucuronidierten und/oder sulfatierten Quercetin-
konjugaten wiedergefunden. In Darm, Leber und Niere handelte es sich fünf Stunden
nach oraler Aufnahme hauptsächlich um Diglucuronide, im Plasma um glucuronidier-
30
2. Schrifttum
te Sulfate von methylierten Quercetinderivaten. Freies Quercetin konnte lediglich in
sehr geringen Mengen in Leber und Nieren detektiert werden (Graf et al. 2005). Ähn-
liche Ergebnisse ergaben sich aus einer Studie zur Bioverfügbarkeit von Quercetin
und Catechin bei Ratten, in der die Tiere über einen Zeitraum von zwei Wochen eine
mit Quercetin bzw. Catechin angereicherte Diät (je 0,25 %) erhielten (Manach et al.
1999).
Daneben scheint eine längerfristige Verabreichung von Quercetin außerdem eine
gewisse Retention der Verbindung in bestimmten Geweben nach sich zu ziehen. De
Boer et al. (2005) erweiterten und optimierten den Versuchsrahmen, indem sie in
ihrer Studie den Fütterungszeitraum ausdehnten und zwölf verschiedene Organe in
ihre Analysen einbezogen. Zusätzlich zu den Ratten untersuchten sie verschiedene
Gewebe vom Schwein, einer dem Menschen hinsichtlich der Anatomie und Physio-
logie des Gastrointestinaltraktes weitaus ähnlicheren Spezies. Die Ratten erhielten
über elf Wochen eine 0,1 bzw. 1 % Quercetin enthaltende Diät, was einer täglichen
Dosis von ~50 bzw. 500 mg pro Kilogramm Körpergewicht entsprach. Die höchsten
Konzentrationen von Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin wurden - abgesehen
vom Plasma - in Lunge, extrem niedrige Gehalte in Gehirn, Milz und weißem Fett
nachgewiesen. Die an der Elimination beteiligten Organe Leber und Niere enthielten
mittlere Konzentrationen. Die Gewebeverteilung wies bei beiden Diäten ein ähnliches
Muster auf, wobei eine zehnfache Erhöhung der Quercetindosis eine etwa vierfache
Konzentrationssteigerung in den Geweben bedingte. In den meisten Geweben beider
Gruppen betrug der Quercetinanteil ca. 30 % der Gesamtflavonolkonzentration; in
der Knochensubstanz, der Muskulatur, braunem Fett und Thymus überwogen wie-
derum deutlich die Gehalte an Methylquercetin, was auf unterschiedliche Methylie-
rungsraten der Gewebe und/oder verschiedene Aufnahmekapazitäten für methylierte
Metaboliten hindeutet. Tamarixetin stellte in allen Proben die kleinste Fraktion dar, im
Plasma (beider Tierarten) konnte es in keinem Fall detektiert werden. Einige Gewebe
wie die Lunge, die Leber und die Nieren, wiesen einen beachtlich hohen Gehalt an
freiem Quercetin auf (12 – 40 %), die meisten anderen Organe enthielten dagegen
niedrige oder nicht detektierbare Mengen. Im Plasma betrug der Aglyconanteil nur
0,4 - 0,8 %. Hinsichtlich der für das Auftreten von Aglyca in den Geweben verant-
31
2. Schrifttum
wortlichen Mechanismen konnte eine Aktivierung von Glucuronidasen während der
Aufarbeitung der Gewebeproben nicht ausgeschlossen werden.
In den Geweben von zwei Schweinen, denen über drei Tage lang hochdosiert Quer-
cetin mit dem Futter (500 mg/kg Lebendmasse pro Tag) verabreicht worden war, tra-
ten im Vergleich zu den Ratten die höchsten Quercetinkonzentrationen nicht im
Plasma (1,1 µmol/L) auf, sondern in der Leber (3,8 nmol/g Gewebe) und Niere (1,8
nmol/g Gewebe). Gehirn, Herzmuskulatur und Milz enthielten nur sehr geringe Men-
gen an Quercetin. Tamarixetin und Isorhamnetin konnten in den letztgenannten Ge-
weben nicht detektiert werden.
32
2. Schrifttum
2.6 ß-Glucuronidase
Die Dekonjugation von Flavonoidglucuroniden wird durch eine ß-Glucuronidase (EC
3.2.1.31) katalysiert, welche zu den sauren Hydrolasen zählt und im Säugerorganis-
mus in einer Vielzahl von Geweben exprimiert wird (Paigen 1989, Brunelle & Ver-
beeck 1993).
2.6.1 Subzelluläre Lokalisation
Bei der aktiven Form des Enzyms handelt es sich um ein Tetramer, das sich aus vier
identischen Untereinheiten zusammensetzt und in erster Linie in den Lysosomen lo-
kalisiert ist (Tomino & Paigen 1975). In höheren Eukaryonten durchläuft das Enzym
auf seinem Weg zu den Lysosomen über das Endoplasmatische Retikulum (ER) und
den Golgi-Apparat eine Reihe von posttranslationalen Modifikationen, zu denen bei-
spielsweise Glycosylierungen und die Bildung von Disulfidbrücken zählen (Shipley et
al. 1993, Rosenfeld et al. 1982). Untersuchungen an kleinen Nagern haben gezeigt,
dass in einigen Geweben, wie der Leber, der Lunge und der Niere, ein Teil des En-
zyms im Lumen des ER durch die Komplexierung mit dem membrangebundenen
Glycoprotein Egasyn verbleibt (Lusis et al. 1976, Lusis & Paigen 1977, Ganschow &
Paigen 1967) und anteilig etwa ein Drittel des intrazellulär vorhandenen Enzyms
ausmachen kann (Swank et al. 1986). Die microsomale und die lysosomale Form
stammen von demselben Gen ab, unterscheiden sich jedoch in ihrem Glycosylie-
rungsgrad (O’Leary et al. 2001).
2.6.2 Funktion
Die physiologische Rolle der ß-Glucuronidase besteht im schrittweisen Abbau von
Proteoglykanen in den Lysosomen durch die Abspaltung von Glucuronosylresten
(Tomino & Paigen 1975). Schwere Aktivitätsstörungen der ß-Glucuronidase führen
zur Mucopolysaccharidosis Typ VII, einer Speicherkrankheit, bei der es durch An-
schoppung von Glycosaminoglycanen in den Lysosomen zu Funktionsstörungen der
Zellen kommt (Birkenmeier et al. 1989, Glaser & Sly 1973). Diese Krankheit, die zu-
33
2. Schrifttum
nächst für den Menschen (Sly et al. 1973), später auch für Hunde (Haskins et al.
1984) und Mäuse (Birkenmeier et al. 1989) beschrieben wurde, ist gekennzeichnet
durch Zwergwuchs mit deutlicher Verkürzung von Gliedmaßen und Rumpf, schwerer
Skelettdeformation an Thorax und Wirbelsäule, Hepato- und Splenomegalie, geisti-
gem Zerfall und massiver Ausscheidung von Mucopolysacchariden mit dem Harn
(Glaser & Sly 1973). Milde Formen der ß-Glucuronidasedefizienz können bei der
Maus auch gänzlich symptomlos verlaufen (Birkenmeier et al. 1989).
Die Tatsache, dass dieses Enzym Glucuronide spaltet, macht es auch zu einem
Schlüsselenzym im Stoffwechsel von Xenobiotika. Eine Vielzahl von Studien belegt,
dass es bei chronischer Anwendung von Medikamenten zu einer Akkumulierung von
Glucuroniden kommen kann, die teilweise eine direkte, von der Muttersubstanz
abweichende oder verminderte pharmakologische Wirkung aufweisen. Eine
Abspaltung der Glucuronosylreste durch die ß-Glucuronidase würde demnach eine
Freisetzung der ursprünglichen Substanz bewirken und zudem ihr Verteilungsmuster
im Organismus modifizieren (Sperker et al. 1996). ß-Glucuronidase scheint in
Tumorgeweben nicht nur vermehrt exprimiert zu werden (Connors & Whisson 1966,
Mürdter et al. 1997, Sperker et al. 2000), sondern sie gelangt auch durch
nekrotischen Zelluntergang in den extrazellulären Raum (Bosslet et al. 1995),
wodurch eine Dekonjugation der im allgemeinen hydrophilen Glucuronide außerhalb
der Zellen stattfinden kann. Ähnliches gilt für entzündliche Gewebebereiche, in
denen Zellen wie beispielsweise neutrophile Granulozyten durch chemotaktische
Stimuli eine gesteigerte Freisetzung der ß-Glucuronidase aufweisen (Shimoi &
Nakayama 2005). Wie auch Lysozym wirkt das Enzym durch Schädigung von
Bakterienzellwänden mikrobizid (Krumholz et al. 2000).
Dem Umsatz von Flavonoidglucuroniden durch Enzyme wie die ß-Glucuronidase
wurde bisher noch relativ wenig Beachtung geschenkt. Shimoi et al. (2001) verwen-
deten Luteolin als Modellverbindung in einem ex vivo-Versuchsansatz mit stimulier-
ten humanen neutrophilen Granulozyten, um zu ermitteln, ob aus dem Luteolinmo-
noglucuronid möglicherweise während eines Entzündungsprozesses das im allge-
meinen biologisch aktivere Aglycon freigesetzt werden kann. Nach der Behandlung
von Versuchsratten mit LPS (Lipopolysaccharide) konnte ein deutlicher Anstieg der
34
2. Schrifttum
ß-Glucuronidaseaktivität und ein Absinken des Luteolinmonoglucuronidspiegels im
Vergleich zu nicht-behandelten Kontrolltieren gezeigt werden. Dieses Ergebnis deu-
tet darauf hin, dass im Zuge von Entzündungsreaktionen, wie sie beispielsweise in
der Pathogenese von Arteriosklerose, Krebs, rheumatoider Arthritis oder diabetischer
Nephropathie vorkommen, vermehrt glucuronidierte Konjugate der mit der Nahrung
zugeführten Flavonoide hydrolysiert werden. Die lipophilen Aglyca könnten demnach
in den umgebenden Zellen ihre biologische Wirkung entfalten. O’Leary et al. (2001)
untersuchten, ob eine mögliche Verfügbarkeit der Flavonoidaglyca in bestimmten
Körpergeweben auf die Substratspezifität der dekonjugierenden ß-Glucuronidase
zurückzuführen ist. Die Bestimmung der Affinität des aus Lebergewebe, Dünndarm
und neutrophilen Granulozyten gewonnenen Enzyms zu Quercetin-3-, 3’, 4’ und 7-
Glucuroniden ergab jedoch keine wesentlichen Unterschiede. Die Möglichkeit, dass
Quercetinglucuronide auch in vivo Substrate für die ß-Glucuronidase darstellen, setzt
voraus, dass sie in Geweben das zelluläre Kompartiment erreichen, in dem das En-
zym aktiv ist. Aus diesem Grund untersuchten O’Leary et al. (2003) in einer weiter-
führenden Studie an HepG2-Zellen den Metabolismus von Quercetin-7- und Querce-
tin-3-Glucuroniden nach Erreichen der Leber. Ihren Resultaten zufolge können die
Flavonolglucuronide zwei verschiedene Stoffwechselwege einschlagen: 1. die Methy-
lierung der Catecholgruppe (44 % der Quercetin-7-Glucuronide und 32 % der Quer-
cetin-3-Glucuronide), 2. die Hydrolyse der Glucuronide durch die endogene ß-
Glucuronidase (7 % der Quercetin-7-Glucuronide und 10 % der Quercetin-3-Glu-
curonide), gefolgt von einer Sulfatierung zu Quercetin-3’-Sulfat. Diese Metabolisie-
rung der Glucuronide zu Monosulfaten zeigt, dass sie von den Zellen aufgenommen
und intrazellulär von der ß-Glucuronidase dekonjugiert worden sein müssen. Dies
wiederum würde einen vorübergehenden Kontakt des Aglycons mit dem Intrazellular-
raum bedeuten. Über den Absorptionsmechanismus, durch den die Glucuronide in
die Leberzellen gelangen, besteht noch Unklarheit. Es wurde die Beteiligung eines
bisher noch unidentifizierten Influx-Transporters, der Ähnlichkeiten zur OATP-
Familie, insbesondere zu OATP2 (organic anion-transporting polypeptide 2) aufweist,
vermutet (O’Leary et al. 2003). Dieser Transporter spielt unter anderem bei der Auf-
nahme von Bilirubinglucuroniden in die Leber eine Rolle (Cui et al. 2000). Obwohl
35
2. Schrifttum
das Protein in den HepG2-Zellen nicht direkt nachgewiesen werden konnte, zeigte
sich, dass Quercetin-7-Glucuronide in Anwesenheit eines OATP2-Inhibitors nicht me-
tabolisiert wurde.
Bei den Überlegungen, ob die ß-Glucuronidase die Bioaktivität und Verteilung von
Flavonoiden im Organismus nachhaltig verändern kann, dürfen Faktoren, die das
Enzym selbst beeinflussen, nicht außer acht gelassen werden. Dazu zählen zu-
nächst gewebespezifische Unterschiede sowie eine große interindividuelle Variation
in der Expression der ß-Glucuronidase. Sperker et al. (1997) beschrieben solche Un-
terschiede anhand von Untersuchungen von 30 Leber- und 18 Nierenproben vom
Menschen. Die gemessenen Enzymaktivitäten der Leberproben rangierten von 0,32
bis 1,85, die der Nieren von 0,07 bis 1,0 µmol/mg Protein/h. Die Aktivität bzw. das
Vorkommen der ß-Glucuronidase im Organismus kann zudem nicht nur durch die
bereits genannten pathologischen Vorgänge im Körper moduliert werden, sondern
auch durch den gewöhnlichen Alterungsprozess. Sowohl in der Leber als auch in den
Nieren scheint die Aktivität mit dem Alter zuzunehmen, wobei eine gesteigerte Fragi-
lität der Lysosomenmembranen als Grund angenommen wird (Cristofalo & Kabakiji-
an 1975).
Eine weitere Möglichkeit, wie das Enzym in seiner Aktivität beeinflusst werden kann,
scheint in der Aufnahme bestimmter Nahrungskomponenten zu bestehen. In Ratten
verminderte beispielsweise die Verabreichung von Futter mit supplementiertem Cal-
ciumglucarat die ß-Glucuronidaseaktivität in Lebermicrosomen und Serum (Dwivedi
et al. 1990). Lampe et al. (2002) stellten eine inverse Korrelation zwischen der En-
zymaktivität im menschlichem Serum und der gesteigerten Aufnahme einer vorwie-
gend pflanzlich ausgerichteten Diät fest.
36
3. Material und Methoden
3. Material und Methoden
3.1 Fütterungsstudie
3.1.1 Versuchsaufbau und -durchführung
Bei den im Versuch verwendeten Tieren handelte es sich um sieben männliche kast-
rierte Hybridschweine (DL x DE) mit einem Anfangsgewicht von 33 - 37 kg aus dem
Mastbetrieb des Versuchsgutes Hohenschulen der Agrar- und Ernährungswissen-
schaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Zur Fütterung wurde
ein kommerzielles Alleinfutter für Mastschweine eingesetzt (J. Aug. Plambeck, 24582
Brügge), das vorwiegend aus Weizen- und Gerstenschrot, Gerstenfuttermehl, Rog-
genkleie, Sojaextraktionsschrot, Rapsextraktionsschrot und Zuckerrohrmelasse be-
stand. Inhalts- und Zusatzstoffe sind der Tabelle 2 zu entnehmen. Aufgrund des
Energiebedarfs von wachsenden Schweinen wurde die tägliche Futtermenge be-
rechnet (Kirchgeßner) und auf 80 % der ad libitum-Aufnahme festgelegt. Diese re-
striktive Fütterungsweise sollte die vollständige und zügige Aufnahme der Versuchs-
ration gewährleisten. Die Tiere hatten jederzeit über Nippeltränken Zugang zu Frisch-
wasser. In der letzten Versuchswoche wogen die Tiere 48,5 - 56,5 kg.
Tab. 2: Chemische Zusammensetzung der Versuchsration (in % der Ursprungssubstanz)
Rohprotein 16,50 Rohfaser 5,25 Rohfett 2,10 Rohasche 5,25 Calcium 0,70 Phosphor 0,50 Natrium 0,15 Lysin 0,90
Zusatzstoffe: 10.000 I. E. Vitamin A, 1.200 I. E. Vitamin D3, 80 mg α−Tocopherolacetat, 15 mg Kupfer, 500 FTU-3-Phytase; Umsetzbare Energie: 12,6 MJ ME/kg
Die Haltung der Tiere erfolgte einzeln in Stoffwechselkäfigen auf Kunststoffgittern
ohne Einstreu bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 – 70 %. Die Raumtempera-
37
3. Material und Methoden
tur wurde im Laufe des Versuches von 24°C auf 22°C reduziert. Die erste Woche
nach Einstallung diente der Adaptation der Tiere an die neuen Haltungsbedingungen.
Während dieser Phase wurde der Diät kein Quercetin zugesetzt. Um endogenen Pa-
rasitenbefall auszuschließen, wurden die Schweine am 5. Tag mit einem Antiparasi-
tikum (Flubenol 5 %) behandelt. Die tägliche Futterration wurde in zwei Mahlzeiten
pro Tag verabreicht. Nach der Adaptationszeit erhielten die Tiere über einen Zeit-
raum von vier Wochen eine Tagesdosis von 50 mg Quercetin (Quercetin-Dihydrat,
Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe) pro kg Lebendmasse (LM), von der jeweils die
Hälfte (25 mg/kg LM) mit der Morgen- bzw. Abendmahlzeit verabreicht wurde. Dazu
wurde wöchentlich das Gewicht der Versuchstiere bestimmt, die Quercetinmenge
individuell berechnet und alle zwei Tage auf Basis der Tageszunahmen aus der vo-
rausgegangenen Woche erhöht. Die jeweilige Quercetindosis wurde den mit Wasser
angefeuchteten Mahlzeiten (feucht-krümelige Konsistenz) vor jeder Fütterung manu-
ell zugemischt und von den Schweinen innerhalb von ca. 10 min aufgenommen. Die
letzte Quercetinapplikation erfolgte jeweils 60 - 90 Minuten vor der Tötung der Ver-
suchstiere.
Vor der Supplementierung mit Quercetin wurde einmalig eine Blutabnahme durchge-
führt und durch sofortige Zentrifugation (Zentrifuge: 3K12, Sigma) des Blutes über 10
Minuten bei 2000 x g und 4°C Plasma gewonnen. Zur Tötung wurden die Schweine
mit einer Ketamin/Azaperon-Narkose (Präparate: Ursotamin® /Stresnil®) abgelegt und
entblutet. Pro Tier wurden etwa 100 ml Blut aufgefangen und in heparinisierte Röhr-
chen (Sarstedt) überführt. 80 ml wurden anschließend unter den beschriebenen Be-
dingungen zur Plasmagewinnung zentrifugiert. Im folgenden wurden die Gewebe-
proben von jeweils mindestens 10 g als Doppelprobe entnommen. Dazu zählten je-
weils beide Gehirnhälften, ein Teil der Lunge, ein Abschnitt des mittleren Jejunums
und des proximalen Colons (komplett, ohne Inhalt), Anteile von Leber und Nieren,
Gekrösefett aus dem großen Netz des Magens und Rückenspeck sowie Teile des
M. longissimus dorsi und der Zwerchfellmuskulatur. Alle Gewebeproben wurden zu-
nächst auf Trockeneis durchgefroren und anschließend bis zur weiteren Aufbereitung
zusammen mit Plasma und Vollblut bei einer Temperatur von -70°C gelagert. Nach
Gewichtsbestimmung der Organproben wurden diese über einen Zeitraum von 72
38
3. Material und Methoden
Stunden lyophilisiert und danach erneut gewogen. Die weitere Verarbeitung bestand
in der pulverförmigen Zerkleinerung der Proben, die je nach Beschaffenheit der Ge-
webe in einem Kryomörser oder einer wassergekühlten Analysenmühle (A10 Jahnke
& Kunkel) vorgenommen wurde. Alle Proben wurden vor der Zerkleinerung in flüssi-
gem Stickstoff durchgefroren. Die Lagerung bis zur Analyse erfolgte bei -70°C unter
Luftabschluss in kältebeständigen Kunststoffröhrchen (Sarstedt), um die Aufnahme
von Fremdwasser zu verhindern.
3.1.2 Flavonolanalytik
Zur Extraktion der Plasmaproben wurden jeweils 980 µl Plasma verwendet. Von den
Geweben wurden zu diesem Zweck jeweils 100 mg in 980 µl physiologischer Natri-
umchlorid-Lösung suspendiert. Zu jedem Ansatz erfolgte die Zugabe von 20 µl einer
methanolischen Rhamnetinlösung (1 mg pro 20 ml Methanol; Rotichrom® HPLC, Carl
Roth GmbH, Karlsruhe) als interner Standard. Anschließend wurde der pH-Wert mit
jeweils eine zuvor ermittelte Menge an Essigsäure (0,583 mol/l) auf 4,5 – 6, dem pH-
Optimum der ß-Glucuronidase/Sulfatase (Crude solution aus Helix pomatia, Sigma-
Aldrich AG) eingestellt. Diese Enzymmischung dient dazu, Quercetin und seine Me-
taboliten aus den entsprechenden Konjugaten freizusetzen, da diese mit der ver-
wendeten Methode nicht eindeutig darstellbar sind. Zu diesem Zweck wurden die
angesäuerten Proben mit je 75 µl der Enzymmischung über eine Dauer von 60 min
bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Bei parallel durchgeführten Bestimmungen
wurde keine enzymatische Behandlung durchgeführt, um den ursprünglichen Agly-
congehalt der Gewebe bestimmen zu können. Der folgende Schritt bestand in der
Versetzung der Proben mit 4 ml Aceton zur Fällung der Proteine. Nach 20-minütiger
gründlicher Durchmischung auf einem Horizontalschüttler erfolgte die Abtrennung
des flavonoidhaltigen Extraktes durch eine 45-minütige Zentrifugation bei 4000 U/min
und einer Temperatur von 4°C (Varifuge 20RS, Heraeus, Hanau). Die Überstände
wurden abgenommen und bei 45°C und unter einem partiellen Vakuum bis zur Tro-
ckene eingedampft (SPD 2010 SpeedVac® System). Die Rückstände wurden in 200
µl Methanol aufgenommen und 15 min bis zur vollständigen Lösung in ein Ultra-
schallbad verbracht. Danach wurden zur Optimierung der chromatographischen
39
3. Material und Methoden
Trennung 77,5 µl aqua bidest und 22,5 µl Salzsäure (10 mol/l) hinzu pipettiert, ge-
mischt und die Ansätze ein weiteres Mal zentrifugiert (14000 U/min, Centrifuge
5415C, Eppendorf). Der Überstand wurde im Anschluss für die Analyse mittels HPLC
(High Perfomance Liquid Chromatography) verwendet. Zur Trennung und Darstel-
lung des in den Probenextrakten enthaltenen Quercetins und seiner methylierten Me-
taboliten Isorhamnetin und Tamarixetin (Abb. 4) wurde eine leicht modifizierte HPLC-
Methode nach Hollman et al. (1996b) verwendet. Die Injektion von 30 µl der aufgear-
beiteten Proben erfolgte über einen Autosampler (950-AS, Firma Jasco, Gross Um-
stadt) in das HPLC-System. Die stationäre Phase bestand in einer „Reversed Pha-
se“-Trennsäule (C-18 Kromasil 100, 250 x 4 mm, Partikelgröße: 5 µm, Jasco), der
zum Schutz der Trennmatrix vor Verunreinigungen eine Vorsäule (C-18 Inertsil ODS-
2, 10 x 4 mm Partikelgröße: 5 µm, Jasco) vorgeschaltet war. Als mobile Phase wurde
ein Fließmittel aus 135 Teilen Phosphatpuffer (0,025 M Natriumdihydrogenphosphat-
Monohydrat), 56 Teilen Acetonitril und 9 Teilen Methanol mit einem pH-Wert von
2,96 verwendet und die Flussrate auf 1 ml/min eingestellt. Um die aufgetrennten
Substanzen bestimmen zu können, wird bei dieser Analysemethode durch die soge-
nannte Nachsäulenderivatisierung die Fähigkeit der Flavonole genutzt, mit dreiwerti-
gen Aluminiumionen (Al3+) Komplexe zu bilden. Dazu wurde das Derivatisierungs-
reagenz, eine methanolische Aluminiumnitratlösung (1 mol/l), über ein „low-dead-
volume“-Mischstück dem Fließmittel mit einer Flussrate von 0,4 ml/min zugeführt. Die
Komplexbildung erfolgte anschließend in einem Kapillarreaktor (Teflonkapillare,
Innendurchmesser 0,5 mm, Länge 3 m), der zusammen mit der Trennsäule in einem
Säulenofen (30°C) untergebracht war. Mit dieser Methode werden nur Flavonole er-
fasst, die über eine freie Hydroxylgruppe in Position 3 verfügen und zusammen mit
der 4-Oxo-Gruppe an dieser Stelle einen Komplex mit Al3+ bilden können (Hollman et
al.1996b). Zur Detektion der komplexierten Einzelsubstanzen bei einer Anregungs-
wellenlänge von 422 nm und einer Emissionswellenlänge von 485 nm wurde ein Flu-
oreszenzdetektor (920-FP, Jasco) verwendet. Die Identifikation der enthaltenen Ver-
bindungen erfolgte durch den Vergleich der Retentionszeiten mit denen der Reinsub-
stanzen.
40
3. Material und Methoden
3.1.2.1 Kalibrierung und Auswertung
Zur Herstellung von Kalibrationsreihen für Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin
(Rotichrom® HPLC, Carl Roth GmbH, Karlsruhe) wurde eine methanolische Stan-
dardlösung angesetzt, die die genannten Flavonole in einer Konzentration von 125
mg/ml enthielt und schrittweise verdünnt wurde. Insgesamt wurde ein Konzentrati-
onsbereich von 125 bis 0,03 mg/ml abgedeckt. Um vergleichbare Bedingungen wie
im Versuchsansatz zu schaffen, wurden 20 µl dieser Lösungen sowie 20 µl Rhamne-
tin als interner Standard zu 960 µl einer physiologischen Kochsalzlösung mit 7 %
Albuminfraktion gegeben. Die Aufarbeitung erfolgte wie unter 3.1.2 bereits beschrie-
ben. Die Konzentrationen wurden anhand der relativen Peakflächen berechnet, wo-
bei mit der Fläche des Quercetin- und Isorhamnetinstandards und der Fläche des
internen Standards jeweils der Quotient gebildet wurde, um eventuelle Substanzver-
luste während der Aufarbeitung und der Messung zu berücksichtigen. Insgesamt
wurden drei Kalibrationsreihen erstellt und die Mittelwerte der Eichgeradensteigun-
gen zur Berechnung der Flavonolkonzentrationen im Plasma und in den Geweben
verwendet. Für jede der drei Verbindungen konnte regelmäßig ein linearer Konzen-
trationsverlauf dargestellt werden (Abb. 5).
Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde entsprechenden Geweben vom Schwein
eine definierte Menge der Testsubstanzen als methanolische Lösung zugesetzt und
die Ansätze auf die gleiche Weise wie die Proben aufgearbeitet. Die ermittelten
Peakflächen wurden mit einer entsprechenden methanolischen Probe ins Verhältnis
gesetzt. Geprüft wurde die Wiederfindung in Leber und Muskelgewebe und lag für
Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin zwischen 85 und 94 %. Verluste traten vor
allem während dem Eindampfen der Proben auf. Eine Korrektur der Daten war je-
doch nicht notwendig, da die Aufarbeitung der Proben und Standards (Eichgeraden)
identisch war und damit die Verluste während der Probenaufarbeitung berücksichtigt
wurden. Die Wiederfindung der Testsubstanzen im Plasma mit der in dieser Studie
verwendeten Analysemethode wurde bereits ermittelt (Ader et al. 2000) und betrugen
für Quercetin 83 bzw. 101 %, für Isorhamnetin 87 % und für Tamarixetin 83 %. Die
Nachweisgrenze für Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin lag bei ca. 1 ng/g Ge-
41
3. Material und Methoden
webe. Nur diejenigen Peaks, die mindestens fünfmal so hoch wie das “Basisrau-
schen“ waren, wurden ausgewertet.
0 100 200 300 400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 100 200 300 400
0
1.0×106
2.0×106
3.0×106
4.0×106
5.0×106
0 100 200 300 400
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5Konzentration [ng /ml]
Rel
ativ
e Pe
akflä
che
I/R
Tamarixetin y = 12682x R2 = 0,9988
Isorhamnetin y = 0,0034x R2 = 0,9973
T [µ
V]
Konzentration [ng /ml]
Rel
ativ
e Pe
akflä
che
Q/R
Quercetin y = 0,0014x R2 = 0,9979
Abb. 5:
Kalibriergeraden zur quantitativen Bestimmung von Quercetin, Tamarixetin und Isorhamnetin inPlasma und Geweben. Mittelwerte mit SEM von drei Bestimmungen (SEM teilweise im Symbol ent-halten). (R2 = Bestimmtheitsmaß; Q/R = Peakfläche Quercetin/Peakfläche Rhamnetin; I/R =Peakfläche Isorhamnetin/Peakfläche Rhamnetin; T = Peakfläche Tamarixetin)
Konzentration [ng /ml]
42
3. Material und Methoden
0 10 20 30 40 50
2.5×104
7.5×104
1.3×105
1.8×105
2.3×105
[µV]
t [min]
0 10 20 30 40 50
0
5.0×104
1.0×105
1.5×105
[µV]
t [min]
0 10 20 30 40 50
0
5.0×10 4
1.0×10 5
1.5×10 5
2.0×10 5
2.5×10 5
3.0×10 5
[µV]
t [min]
A
B
C
4
4
4
3
3
3
2
2
2
1
1
1
Abb. 6:Chromatogramme eines Standards der Kalibriergeraden (A), sowie einer Plasmaprobe (B) undeiner Leberprobe (C) vom Schwein nach vierwöchiger Verabreichung einer täglichen Dosis von50 mg Quercetin pro kg Körpergewicht mit dem Futter; 1 = Quercetin, 2 = Isorhamnetin, 3 = Ta-marixetin, 4 = Rhamnetin (interner Standard)
43
3. Material und Methoden
3.1.2.2 Korrektur Residualblut
Tierisches Gewebe enthält nach dem Entbluten einen Restblutanteil. Die im Blut ent-
haltene Menge der Testsubstanz und deren Metaboliten muss von der in der Gewe-
beprobe bestimmten Gesamtmenge subtrahiert werden, um die tatsächlich im Ge-
webe enthaltene Menge der Testsubstanz zu ermitteln. Zu diesem Zweck wurde der
Hämoglobingehalt der lyophilisierten Gewebe mit dem Hämoglobingehalt von lyophi-
lisiertem Vollblut verglichen. Die Bestimmung erfolgte in Anlehnung an eine spektro-
photometrische Methode nach de Boer et al. (2005). Dazu wurden jeweils Doppel-
proben der Gewebe bzw. der Vollblutproben jedes Tieres von 0,1 g verwendet, die in
10 ml Tris-HCl (pH 7,4; mit 50 mmol/L EDTA (Titriplex III)) suspendiert wurden. Nach
zehnminütiger Zentrifugation bei 14000 x g und 10°C wurden 500 µl des Überstan-
des abgenommen und in einer Verdünnung von 1:1 mit Tris-HCl zur photometrischen
Messung eingesetzt. Das in der Literatur etablierte Peakmaximum von Hämoglobin
bei einer Wellenlänge von 540 nm wurde durch die Messung des Spektrums einer
Vollblutprobe im Wellenlängenbereich von 220 - 750 nm nachvollzogen. Um die Ge-
webekonzentrationen um den Flavonolanteil im Restblut zu korrigieren, wurden
durch Quotientenbildung aus den ermittelten Peakmaxima des Hämoglobins in Ge-
webe und Vollblut (Hbtissue/Hbbl) für jede Probe die Residualblutfraktion (fbl) berech-
net. Das Produkt aus diesem Faktor und der Gesamtplasmakonzentration wurde im
Anschluss von der totalen Gewebekonzentration subtrahiert (Ccorr = Ctot - fbl * Cpl).
44
3. Material und Methoden
3.2 Bestimmung der Aktivität der ß-Glucuronidase
3.2.1 Probenaufarbeitung und Testprinzip
Die Messung der Enzymaktivität erfolgte mit einer leicht modifizierten Methode von
O’Leary et al. (2001).
Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte über die kontinuierliche Messung von p-
Nitrophenol, welches durch enzymatische Spaltung aus dem eingesetzten Modell-
substrat p-Nitrophenylglucuronid gebildet wird. Das in der Literatur etablierte Absorp-
tionsmaximum des Reaktionsproduktes von 400 nm wurde über die Messung des
Absorptionspektrums im Bereich von 200 bis 500 nm bestätigt und diese Wellenlän-
ge anschließend zur kinetischen Messung verwendet.
Zur Validierung des Versuchsansatzes und insbesondere, um den Bereich des linea-
ren Konzentrationsanstieges festzustellen, wurde anstelle der Gewebeproben zu-
nächst eine aufgereinigte Enzymmischung eingesetzt (ß-Glucuronidase/Sulfatase,
crude solution, Sigma-Aldrich AG, 111480 U/ml (1 Unit setzt 1,0 µl Phenolphthalein
aus Phenolphthaleinglucuronid bei pH 5 und 37°C frei)). Dazu wurde in vier Küvetten
Natriumphosphatpuffer (20 mmol/l, pH 7,2) in unterschiedlichen Volumina (800 - 875
µl) vorgelegt und mit der mit Puffer im Verhältnis 1:100 verdünnten Enzymlösung in
den Mengenanteilen 25 µl, 50 µl, 100 µl und 200 µl auf 900 µl ergänzt. Als Lösungs-
mittel für das entstehende farbige Produkt diente 2-Mercaptoethanol, das dem An-
satz in einer Konzentration von 10 mmol/l zugesetzt wurde. Die Reaktion wurde
durch die Zugabe von 100 µl einer Substratlösung (p-Nitrophenylglucuronid in Phos-
phatpuffer, 100 mmol/l, pH 7,2) gestartet. Die photometrische Messung wurde nach
Durchmischung der Komponenten über 60 Minuten (13 Intervalle à 5 Minuten) UV-
Spektrophotometer (UV-1602, Shimadzu, Europa GmbH Photometer) vorgenommen.
Zur Bestimmung der Enzymaktivität in den bereits lyophilisierten und zerkleinerten
Gewebeproben von Lunge, Leber, Nieren, M. longissimus dorsi und Zwerchfellmus-
kulatur dreier Schweine wurden aus 0,1 bzw. 0,2 g des Frischgewichtes durch Ho-
mogenisierung in eisgekühltem Natriumphosphatpuffer (20 mmol/l, pH 7,2) mit 2-
Mercaptoethanol (10 mmol/l) und anschließender halbstündiger Zentrifugation bei
45
3. Material und Methoden
14000 x g und 4°C zellfreie Extrakte hergestellt. Zur Messung wurden jeweils 100 µl
des Extraktes eingesetzt.
3.2.2 Proteinbestimmung und Auswertung
Zur Berechnung der spezifischen Aktivitäten der ß-Glucuronidase wurde der Protein-
gehalt der jeweiligen Extrakte bestimmt. Die Proteinbestimmung erfolgte mittels des
Bio-Rad-Protein Assays (Bio-Rad-Laboratories GmbH, München). Aus der Bindung
von Coomassie Brilliant Blau an die im Ansatz enthaltenen Proteine resultiert eine
Farbänderung, die zur Verschiebung des Absorptionsmaximums führt und sich pro-
portional zur Proteinkonzentration verhält. Die Farbänderung wurde photometrisch
bei einer Wellenlänge von 578 nm bestimmt (UV Spectrophotometer 1602, Shimad-
zu, Europa GmbH Photometer). Als Standard zur Erstellung einer Kalibrationsreihe
wurde bovines Serum-Albumin (Roth) eingesetzt.
Die spezifische Enzymaktivität wurde als Einheiten pro mg Protein berechnet. Eine
Einheit wurde definiert als Enzymmenge, die 1 nmol Produkt pro Minute bei 37°C
und einem pH-Wert von 7,2 freisetzt. Die Berechnung der Zunahme der Produktkon-
zentration im linearen Bereich erfolgte mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten
von p-Nitrophenol (ε = 18,3 mol/l /cm).
c =
c = Ko
ε = mo
A = A
b = Sc
A
(ε ⋅ b)nzentration [mol/l]
larer Extinktionskoeffizient [mol/l/cm]
bsorption
hichtdicke = 1 cm
46
3. Material und Methoden
3.3 Statistische Auswertung
Die Werte in den Abb. 7, 8, 14, 15 und 16 sind Mittelwerte ± SEM (Standardfehler),
die mit dem Programm Graph Pad Prism berechnet wurden. In Abb. 7 und 8 sind die
jeweiligen Konzentrationen der Aglyca bzw. die Konzentrationen nach enzymatischer
Behandlung der Proben (vorhandene Aglyca und Konjugate) angegeben. Alle Daten
sind Mittelwerte aus den Einzelwerten der Gewebe (n = 7) und sind bezogen auf das
Gewebefrischgewicht. Der Hämoglobingehalt in den Geweben wurde zweifach be-
stimmt und der Mittelwert zur Berechnung der Residualblutfraktion verwendet. Die
errechneten Flavonolkonzentrationen im Residualblutvolumen wurden anschließend
von den Gewebekonzentrationen subtrahiert.
Die ß-Glucuronidaseaktivitäten in den Muskelgeweben, der Lunge, Niere und Leber
von drei Schweinen (Abb. 14 und 15) stellen Mittelwerte aus jeweils drei Wiederho-
lungsmessungen dar. Die gewebespezifischen Aktivitäten der ß-Glucuronidase in
Abb. 16 sind Mittelwerte aus allen Messungen (n = 18).
Die Regressionsgeraden bei der Bestimmung der Standardkurven (Abb. 5) und zur
Berechnung der Enzymaktivitäten (Tab. 5) wurden in Microsoft Excel erstellt.
47
4. Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Gewebeverteilung von Quercetin und seiner methylierten Metaboliten Isorhamnetin und Tamarixetin
Nach dietätischer Applikation von Quercetin über vier Wochen in einer Dosierung
von 50 mg/kg Körpergewicht und Tag sowie einer Aufnahme von 25 mg/kg Körper-
gewicht 60 - 90 min vor der Schlachtung trat die mit Abstand höchste Quercetinkon-
zentration (inkl. Methylquercetin) im Colon (15,49 nmol/g Gewebe) auf, gefolgt von
Nieren (8,46 nmol/g Gewebe) und Dünndarm (7,21 nmol/g Gewebe), wobei zwischen
den Darmabschnitten verschiedener Versuchstiere relativ große interindividuelle
Konzentrationsunterschiede verzeichnet werden konnten (Colon: 2 - 34 nmol/g Ge-
webe; Jejunum: 1 - 13 nmol/g Gewebe). Die Leber enthielt mit 4,24 nmol/g Gewebe
etwa 50 % der in den Nieren registrierten Konzentrationen. Alle übrigen untersuchten
Gewebe und das Plasma wiesen, mit Ausnahme der mesenterialen Lymphknoten
(2,4 nmol/g Gewebe), Flavonolgehalte von unter 1 nmol/g auf. Die Werte von Plasma
(0,79 nmol/ml), Gekröse (0,7 nmol/g Gewebe) und Lunge (0,49 nmol/g Gewebe)
rangierten im Mittelfeld, die niedrigsten Konzentrationen wurde in der untersuchten
quergestreiften Muskulatur (Zwerchfellmuskulatur: 0,14 nmol/g Gewebe; Rücken-
muskulatur: 0,10 nmol/g Gewebe) und dem Gehirn (0,03 nmol/g Gewebe) detektiert.
In allen Geweben war Quercetin mit meist über 80 % (67 – 98 %) an der Gesamt-
konzentration der Metaboliten das vorherrschende Flavonol. Die vorrangig an der
Metabolisierung und Ausscheidung beteiligten Organe enthielten erwartungsgemäß
prozentual hohe Gehalte der methylierten Quercetinderivate Isorhamnetin und
Tamarixetin (Niere: 12 % bzw. 13 %, Leber: 22 % bzw. 11 %, Dünndarm: 17 % bzw.
7 %). Die im Verhältnis höchsten Isorhamnetinkonzentrationen wurden im Jejunum
gefunden (1,19 ± 0,46 nmol/g Gewebe), die höchsten Tamarixetinkonzentrationen in
der Niere (1,11 ± 0,16 nmol/g Gewebe).
In allen Gewebeextrakten konnte auch ohne enzymatische Hydrolyse während der
Extraktion ein mehr oder weniger großer Anteil an freiem Quercetin nachgewiesen
werden. Im Mittel lag Quercetin in Gehirn-, Lungen- und Dickdarmgewebe sowie im
Gekröse des Magens nahezu 100 % dekonjugiert vor. Ähnlich hohe Gehalte zeigten
48
4. Ergebnisse
die Zwerchfellmuskulatur (97 %), die Leber (93 %) und das Jejunum (89 %). Rü-
ckenspeck, Lymphknoten und die Rückenmuskulatur wiesen mit 60 %, 46 % und 40
% mittlere Aclyconkonzentrationen auf. Die Konzentration im Nierengewebe betrug
dagegen nur knapp ein Drittel der Gesamtkonzentration. Im Plasma war der Anteil
der unkonjugierten Flavonole, wie zu erwarten, verschwindend gering (6 %). In den
Tabellen 3 und 4, sowie den Abbildungen 6 und 7 sind die ermittelten Gesamtkon-
zentrationen bzw. die Konzentrationen der Aglyca (keine enzymatische Behandlung
während der Analyse) zusammengefasst. Abbildung 9 zeigt das prozentuale Vorlie-
gen der Aglyca und Konjugate in den untersuchten Geweben.
49
55
Tab. 3: Gesamtkonzentration der Flavonole in verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon
∑ Quercetin, Isorhamnetin, Tamarixetin
Quercetin Isorhamnetin Tamarixetin
[nmol/g Gewebe]
nmol/g Gewebe % der Summe nmol/g
Gewebe % der Summe nmol/g Gewebe % der Summe
Colon 14,21 13,92 ± 4,16 98 0,14 ± 0,08 1 0,14 ± 0,05 1
Niere 8,46 6,31 ± 1,14 75 1,04 ± 0,11 12 1,11 ± 0,16 13 Jejunum 7,21 5,51 ± 1,87 76 1,19 ± 0,46 17 0,51 ± 0,20 7
Leber 4,24 2,83 ± 0,54 67 0,92 ± 0,19 22 0,49 ± 0,12 11
Lymphknoten 2,40 2,23 ± 0,16 93 0,11 ± 0,02 4 0,06 ± 0,01 3
Plasma 0,79 0,67 ± 0,11 85 0,05 ± 0,01 7 0,06 ± 0,01 8
Gekröse 0,68 0,57 ± 0,20 83 0,05 ± 0,02 8 0,06 ± 0,04 9
Lunge 0,34 0,28 ± 0,07 83 0,03 ± 0,01 9 0,02 ± 0,03 8
Rückenspeck 0,21 0,17 ± 0,03 82 0,01 ± 0,003 7 0,02 ± 0,01 11
Zwerchfellmuskulatur 0,14 0,12 ± 0,02 81 0,02 ± 0,003 14 0,006 ± 0,001 5
M. longissimus dorsi 0,10 0,09 ± 0,007 86 0,01 ± 0,002 10 0,004 ± 0,003 4
Gehirn 0,03 0,02 ± 0,01 95 0,001± 0,001 5 *
4. Ergebnisse
50
Angegeben sind die jeweiligen Konzentrationen nach enzymatischer Behandlung der Proben (vorhandene Aglyca und Konjugate). Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM aus Einzelwerten von sieben Tieren und bezogen auf das Gewebefrischgewicht. Die Flavonolkonzentrationen im Residualblutvolumen wurden subtra-hiert; * Wert unter dem Detektionslimit
Tab. 4: Konzentration der Flavonolaglyca in verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon
∑ Quercetin, Isorhamnetin, Tamarixetin
Quercetin
Isorhamnetin
Tamarixetin
[nmol/g Gewebe]
nmol/g Gewebe % der Summe nmol/g
Gewebe % der Summe nmol/g Gewebe % der Summe
___________________________________________________________________________________________________________
Colon 15,49 15,21 ± 3,28 98 0,14 ± 0,02 1 0,14 ± 0,04 1
Niere 3,07 1,81 ± 0,38 60 0,58 ± 0,07 19 0,67 ± 0,11 22 Jejunum 6,39 4,89 ± 1,61 76 1,10 ± 0,48 17 0,40 ± 0,15 6
Leber 3,89 2,64 ± 0,50 68 0,79 ± 0,11 20 0,46 ± 0,12 12
Lymphknoten 1,19 1,02 ± 0,25 86 0,10 ± 0,02 8 0,07 ± 0,01 6
Plasma 0,01 0,005 ± 0,002 36 0,004 ± 0,001 29 0,004 ± 0,001 35
Gekröse 0,70 0,63 ± 0,38 90 0,05 ± 0,03 7 0,02 ± 0,02 3
Lunge 0,49 0,43 ± 0,17 87 0,03 ± 0,01 6 0,03 ± 0,005 7
Rückenspeck 0,11 0,10 ± 0,02 91 0,005 ± 0,003 5 0,004 ± 0,004 4
Zwerchfellmuskulatur 0,13 0,12 ± 0,05 86 0,01 ± 0,004 14 0,006 ± 0,002 5
M. longissimus dorsi 0,04 0,04 ± 0,004 89 0,003 ± 0,002 10 0,003 ± 0,0003 1
Gehirn 0,03 0,03 ± 0,006 100 * *
4. Ergebnisse
51
56
__________________________________________________________________________________________________________Angegeben sind die Konzentrationen der in Geweben und Plasma enthaltenen Aglyca. Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM aus Einzelwerten von sieben Tieren und bezogen auf das Gewebefrischgewicht. Die Flavonolkonzentrationen im Residualblutvolumen wurden subtrahiert. *Wert unter dem Detektionslimit
57
Co Ni Je Le Ly Pl Gk Lu Rü Zw Ml Ge
Co Ni Je Le Ly Pl Gk Lu Rü Zw Ml Ge
Co Ni Je Le Ly Pl Gk Lu Rü Zw Ml Ge
-
Abb. 7: Gesamtkonzentration der Flavonole in Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon (n = 7; Mittelwerte ± SEM) Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin in Geweben und Plasma; Nachweis der Aglyca nach enzymatischer Hydrolyse der Konjugate (Co = Co-lon; Ni = Niere; Je = Jejunum; Le = Leber; Ly = Lymphknoten; Pl = Plasma; Gk = Gekröse; Lu = Lunge; Rü = Rückenspeck; Zw = Zwerchfellmuskulatur; Ml = M. longissimus dorsi; Ge =Gehirn)
0
Quercetin
Isorhamnetin
Tamarixetin
nmol
/g G
eweb
e bz
w.
nmol
/ml P
lasm
a nm
ol/g
Gew
ebe
bzw
. nm
ol/m
l Pla
sma
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00
20
15
10
5
nmol
/g G
eweb
e bz
w. n
mol
/ml P
lasm
a
4. Ergebnisse
52
15
20m
l Pla
sma
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
nmol
/g G
eweb
e bz
w.
nmol
/ml P
lasm
a
Isorhamnetin
58
0
5
10
nmol
/g G
eweb
e bz
w. n
mol
/ Quercetin 0.00
0.00.10.20.30.40.50.60.70.8
Co Ni Je Le Ly Pl Gk Lu Rü Zw Ml Ge
Co Ni Je Le Ly Pl Gk Lu Rü Zw Ml Ge nm
ol/g
Gew
ebe
bzw
. nm
ol/m
l Pla
sma
Tamarixetin
Abb. 8: Konzentrationen der Flavonolaglyca in Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon (n = 7; Mittelwerte ± SEM) (Co = Colon; Ni = Niere; Je = Jejunum; Le = Leber; Ly = Lymphknoten; Pl = Plasma; Gk = Gekröse; Lu = Lunge; Rü = Rückenspeck; Zw = Zwerchfellmuskulatur; Ml = M. longissimus dorsi; Ge =Gehirn)
Co Ni Je Le Ly Pl Gk Lu Rü Zw Ml Ge
4. Ergebnisse
53
59
Co Ge Lu Gk Zw Le Je Rü Ly Ml Ni Pl0
102030405060708090
100AglycaKonjugate
%
Abb. 8: Prozentuales Verhältnis von Quercetinaglyca und -konjugaten in den verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon (Co = Colon; Ni = Niere; Je = Jejunum; Le = Leber; Ly = Lymphknoten; Pl = Plasma; Gk = Gekröse; Lu = Lunge; Rü = Rückenspeck; Zw = Zwerchfellmuskulatur; Ml = M. longissimus dorsi; Ge =Gehirn)
4. Ergebnisse
54
4. Ergebnisse
4.2 ß-Glucuronidaseaktivität verschiedener Gewebe
4.2.1 Eignung der Methode
Die grundsätzliche Eignung der gewählten Methode zur Bestimmung der ß-Glucuro-
nidase-Aktivität wurde anhand einer aufgereinigten Enzymmischung (Glucuronidase/
Sulfatase crude solution, Sigma-Aldrich AG) bei einem pH-Wert von 7,2 demonst-
riert. Die Verdoppelung der eingesetzten Enzymmenge resultierte in einem etwa
zweifachen Anstieg der gemessenen Umsatzrate unter Berücksichtigung des linea-
ren Abschnittes des Zeitverlaufs (s. Inset Abb. 10). Bezüglich des eingesetzten Sub-
strates ergaben sich für den Konzentrationsanstieg des Reaktionsproduktes (p-Nitro-
phenol) pro Minute folgende Werte: 246 nmol/ml, 519 nmol/ml, 1131 nmol/ml und
2349 nmol/ml.
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
2,79 U*
11,15 U*22,3 U*
5,57 U*
t[min]
Extin
ktio
n
10 15 20 25
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
t[min]
Extin
ktio
n
Abb. 10: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenylglucuronid durch unterschiedliche Konzentrati-onen einer ß-Glucuronidase/Sulfatase-Mischung bei einem pH-Wert von 7,2. Darstellung des Zeitfensters des linearen Konzentzrationsanstiegs von p-Nitrophenol (Inset) * nach Herstellerangaben; 1 Unit setzt 1,0 µl Phenolphthalein aus Phenolphthaleinglucuronid pro
Stunde bei pH 5 und 37°C frei
pH 7,2
55
4. Ergebnisse
Das in der Literatur genannte pH-Optimum des Enzyms von pH 4,5 - 6 konnte aller-
dings nicht bestätigt werden (Abb. 11). Im Vergleich zu den bei pH 7,2 erhaltenen
Werten, konnten bei pH 4,6 unter ansonsten identischen Bedingungen nur wesent-
lich geringere Umsatzraten pro min gemessen werden (65,6 nmol/ml, 98,3 nmol/ml,
191,3 nmol/ml, 229,5 nmol/ml). Des Weiteren ergab sich im Unterschied zu pH 7,2
ein schlechterer linearer Bezug zwischen Enzymkonzentration und Umsatzrate.
Selbst O’Leary et al. (2001), deren Methode zur Messung der ß-Glucuronidase-
aktivität in dieser Arbeit angewandt wurde, geben diesen pH-Bereich als Optimum
an, verwenden jedoch in ihrem Assay den fast neutralen pH-Wert von 7,2.
10
0.0
0.1
0.2
0.32,79 U*
Extin
ktio
n
6
Abb. 11: Zeitverlauf der Hynen einer ß-Glucuronidase* nach Herstellerangaben;
Stunde bei pH 5 und 37°C
4.2.2 ß-GlucuronidSchweins
Nach einer Lag-Phase
25 min gemessen. Zu
trophenol pro Minute w
pH 4,
15 20 25
5,57 U*11,15 U*22,3 U*
t[min]drolyse von p-Nitrophenylglucuronid durch unterschiedliche Konzentratio-
/Sulfatase-Mischung bei einem pH-Wert von 4,6. 1 Unit setzt 1,0 µl Phenolphthalein aus Phenolphthaleinglucuronid pro frei
aseaktivität in einigen ausgewählten Geweben des
von 5 min wurde die Extinktion in 5-Minuten-Intervallen über
r Berechnung der mittleren Konzentrationsänderung von p-Ni-
urden Regressionsgeraden erstellt.
56
4. Ergebnisse
Die Abbildungen 12 und 13 zeigen exemplarisch den Zeitverlauf der Freisetzung von
p-Nitrophenol für ein Versuchstier bei Dreifachbestimmung. Auf ß-Glucuronidase-
aktivität getestet wurden Lunge und Leber, in denen hohe Gehalte an freiem Querce-
tin (bis zu 100 %) nachgewiesen werden konnten, außerdem die Niere als Exkreti-
onsorgan mit verhältnismäßig niedrigen Aglyconkonzentrationen (29 %) sowie zwei
verschiedenen Muskelproben mit verschiedenen Aglyconanteilen (40 % und 93 %).
Bei den Messungen fiel auf, dass unabhängig von der eingesetzten Gewebemenge
oft nur ein geringer oder gar kein Umsatz gemessen werden konnte. Des Weiteren
lag nicht immer ein linearer Konzentrationsanstieg von p-Nitrophenol vor. Die be-
rechneten Aktivitäten wiesen nicht nur zwischen den Tieren erhebliche Schwankun-
gen auf, sondern auch die Wiederholungsmessungen der Gewebe ein und dessel-
ben Tieres differierten zum Teil deutlich (Tab. 5).
Zusammengenommen ergab sich die höchste Aktivität aus den Mittelwerten der un-
tersuchten Nierenproben (144,1 ± 31,18 Units), gefolgt von Lungen- und Lebergewe-
be (125,1 ± 21,26 und 96,92 ± 11,66 Units). In den Muskelproben wurden dagegen
wesentlich geringere Aktivitäten nachgewiesen (Zwerchfellmuskulatur: 38,6 ± 7,25,
M. longissimus dorsi: 33,93 ± 4,59 Units) (Abb. 16).
57
4. Ergebnisse
Lunge A B
Leber A B
Niere A B
0 10 20 30 40
0.3
0.4
0.5
0.6
0.71. Messung2. Messung3. Messung
t [min]
AB
S
0 10 20 30 40
0.7
0.8
0.9
1.0
1.11. Messung2. Messung3. Messung
t [min]
AB
S
0 10 20 30 40
0.3
0.4
0.5
0.6
0.71. Messung2. Messung3. Messung
t [min]
AB
S
0 10 20 30 40
0.00
0.25
0.50
0.75
1.001. Messung2. Messung3. Messung
t [min]
AB
S
0 5 10 15 20 25 30 35
0.5
0.6
0.7
0.81. Messung2. Messung3. Messung
t [min]
AB
S
0 5 10 15 20 25 30 35
0.85
0.95
1.05
1.15
1.25
2. Messung1. Messung
3. Messung
t [min]
AB
S
Abb. 12: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenol durch die ß-Glucuronidase im Lungen-, Nieren- und Lebergewebe eines Schweins (Tier 1) A: 100 µl Gewebeextrakt aus 0,1 g Frischgewebe (drei Messungen) B: 100 µl Gewebeextrakt aus 0,2 g Frischgewebe (drei Messungen)
58
4. Ergebnisse
Zwerchfellmuskulatur A B
0 10 20 30 40
0.2
0.3
0.4
0.51. Messung2. Messung3. Messung
t[min]
AB
S
M. longissimus dorsi A B
0 10 20 30 40
0.5
0.6
0.71. Messung2. Messung3. Messung
t [min]
AB
S
0 10 20 30 40
0.20
0.25
0.30
0.351. Messung2. Messung3. Messung
t [min]0 10 20 30 40
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.51. Messung2. Messung3. Messung
t [min]
AB
S
AB
S
Abb. 13: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenol durch die ß-Glucuronidase in Zwerchfell- und Rückenmuskulatur eines Schweins (Tier 1) A: 100 µl Gewebeextrakt aus 0,1 g Frischgewebe (drei Messungen) B: 100 µl Gewebeextrakt aus 0,2 g Frischgewebe (drei Messungen)
59
4. Ergebnisse
Tab. 5: ß-Glucuronidaseaktivität in Lunge, Niere, Leber, Zwerchfell- und Rücken-
muskulatur von drei Schweinen
Tier 1 Tier 2 Tier 3 Lunge
A 59,03 84,86 54,55 84,33 93,14 136,37 118,06 91,07 401,3
B 59,03 69,34 81,80
54,82 155,24 236,7 57,35 181,12 232,8
Niere A 576,42 415,71 95,58
235,18 58,76 31,85 293,59 120,45 65,10
B 109,9 105,03 92,12
92,00 142,49 268,03 36,89 157,18 70,65
Leber A 67,04 187,64 0
233,23 140,45 40,95 61,91 160,85 141,62
B 49,53 74,62 18,77
68,62 98,75 58,01 81,52 168,98 92,99
Zwerchfellmuskulatur A 27,58 100,44 54,75
39,19 34,05 73,70 98,36 45,96 63,17
B 0 11,92 21,06
5,81 22,98 17,90 0 19,58 55,81
M. longissimus dorsi A 29,24 39,76 46,11
16,71 33,31 26,52 49,30 62,33 92,23
B 11,70 30,63 17,87
14,62 11,82 13,84 24,74 53,19 36,89
Angaben in Units (nmol mg-1 Protein min-1); A: 100 µl Gewebeextrakt aus ursprünglich 0,1 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen) B: 100 µl Gewebeextrakt aus ursprünglich 0,2 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen)
60
4. Ergebnisse
Tab. 6: Mittelwerte der ß-Glucuronidaseaktivität in verschiedenen Geweben von drei Schweinen
Gewebe
Tier 1 Mittelwerte ± SEM
Tier 2 Mittelwerte ± SEM
Tier 3 Mittelwerte ± SEM
Lunge 72,1 ± 10,2 112,5 ± 18,25 190,6 ± 52,15
Niere 224,2 ± 80,48 166,6 ± 51,73 103,9 ± 34,13
Leber 93,48 ± 28,07 138,5 ± 17,8 58,72 ± 21,14
Zwerchfellmuskel 28,49 ± 15,42 39,16 ± 13,18 47,73 ± 9,36
M. long. dorsi 24,39 ± 5,66 38,51 ± 7,27 38,91 ± 11,72
Angabe der Mittelwerte ± SEM von jeweils 6 Messungen
B
Zwerchfell
0
25
50
75
100Tier 1Tier 2Tier 3
Uni
ts
0
25
50
75
A
Uni
ts
Abb. 14:. ß-GlucuronidaA: 100 µl GewebeextrakB: 100 µl Gewebeextrak
A B A B A
M. lonissimus dorsi
Tier 1Tier 2Tier 2
M. longissimus dorsi
B A B A B
seaktivität in der Zwerchfell- und Rückenmuskulatur von drei Schweinen t aus ursprünglich 0,1 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen) t aus ursprünglich 0,2 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen)
61
4. Ergebnisse
62
Lunge
0
100
200
300
400Tier 1Tier 2Tier 3
Niere
0
100
200
300
400
500Tier 1Tier 2Tier 3
Leber
0
50
100
150
200Tier 1Tier 2Tier 3
A B A B A B
A B A B A B
A B A B A B
Uni
ts
Uni
ts
Uni
ts
Abb. 15: ß-Glucuronidaseaktivität in Lunge, Nieren und Leber von drei Schweinen (n = 3) A: 100 µl Gewebeextrakt aus ursprünglich 0,1 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen) B: 100 µl Gewebeextrakt aus ursprünglich 0,2 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen)
4. Ergebnisse
0
100
200
300
Uni
ts
Ni Lu Le Zw Ml
Abb. 16: Spezifische ß-Glucuronidaseaktivität verschiedener Gewebe von drei Schweinen (n = 18; Mittelwerte ± SEM); Ni = Niere; Lu = Lunge; Le = Leber; Zw = Zwerchfellmuskulatur; Ml = M. longissimus dorsi
Um einen möglichen Zusammenhang zwischen einer hohen Aktivität der ß-Glucuro-
nidase und einer hohen Aglyconkonzentration zu klären, wurden diese beiden Para-
meter zueinander ins Verhältnis gesetzt. Zu diesem Zweck wurde jeweils der Mittel-
wert der Aktivitäten aus den Wiederholungsmessungen gebildet. Wie der Abbildung
17 zu entnehmen ist, konnte jedoch in keinem Fall ein Hinweis auf eine positive Kor-
relation zwischen den beiden Parametern gefunden werden. Aus diesem Grund wur-
de auf die Bestimmung der Enzymaktivitäten in den Geweben der übrigen Tiere ver-
zichtet.
63
4. Ergebnisse
Lunge
0.0 0.5 1.0 1.50
50
100
150
200
Aglyconkonz. [nmol/g Gewebe]
Enzy
mak
tivitä
t [U
]
Niere
0 1 2 3 490
140
190
240
Aglyconkonz. [nmol/g Gewebe]
Enzy
mak
tivitä
t [U
]
Leber
0 1 2 3 450
75
100
125
150
Aglyconkonz. [nmol/g Gewebe]
Enzy
mak
tivitä
t [U
]
Zwerchfellmuskel
0.0 0.1 0.2 0.3 0.425
30
35
40
45
50
55
Aglyconkonz. [nmol/g Gewebe]
Enzy
mak
tivitä
t [U
]
M. longissimus dorsi
0.030 0.035 0.040 0.04520
25
30
35
40
45
Aglyconkonz. [nmol/g Gewebe]
Enzy
mak
tivitä
t [U
]
Abb. 17: Darstellung der Beziehungenzwischen der ß-Glucuronidaseaktivitätund der Aglyconkonzentration verschie-dener Gewebe von drei Schweinen
64
5. Diskussion
5. Diskussion
Flavonoide werden von Menschen und pflanzenfressenden Tieren fast täglich mit der
Nahrung aufgenommen, da sie in nahezu allen höheren Pflanzen als natürliche In-
haltsstoffe vorkommen. Aufgrund der Hinweise, dass Flavonoide über vielseitige Me-
chanismen gesundheitsfördernde Effekte haben können, ist es von großer Bedeu-
tung, Informationen über das Verteilungs- und Akkumulierungsverhalten der Sub-
stanzen zu erhalten, um beispielsweise mögliche Zielgewebe zu identifizieren. Zu
diesem Zweck wurden Schweine, deren Gastrointestinaltrakt und Herz-Kreislauf-
System dem des Menschen anatomisch und physiologisch ähnlich ist, über vier Wo-
chen mit einer quercetinhaltigen Diät versorgt und anschließend in verschiedenen
Geweben die Konzentrationen von Quercetin und seinen methylierten Metaboliten
Isorhamnetin und Tamarixetin bestimmt. Um die Flavonolverbindungen im Tierkörper
sicher nachweisen zu können, wurde mit 50 mg/kg Lebendmasse und Tag eine rela-
tiv hohe Dosierung verwendet. Mit Einmischung der Testsubstanz in die Ration wur-
den mögliche Interaktionen mit anderen Nahrungsbestandteilen berücksichtigt. Des
Weiteren erfolgte exemplarisch an Muskel-, Leber-, Nieren- und Lungengewebe von
drei Tieren die Bestimmung der Aktivität der ß-Glucuronidase, einem Enzym, das die
Hydrolyse von Flavonolglucuroniden katalysiert und damit zur Freisetzung der Aglyca
im Körper führen kann. Das Enzym könnte demnach als Modulator der intrazellulären
biologischen Aktivität von Flavonoiden fungieren und durch eine gesteigerte Aktivität
möglicherweise den Quercetinaglycongehalt in bestimmten Körpergeweben erhöhen.
Flavonolgehalte in Plasma und untersuchten Geweben
Die Bestimmung von Flavonoiden im Plasma war bereits Gegenstand zahlreicher
Studien. Sehr sicher ist nach aktuellem Stand der Forschung, dass vom serosalen
Pol der Enterozyten nur Flavonolkonjugate die Zellen in Richtung systemische Zirku-
lation verlassen (Murota & Terao 2003). Auch in dieser Arbeit konnte erneut gezeigt
werden, dass der Anteil der konjugierten Derivate von Quercetin, Isorhamnetin und
Tamarixetin im Blut annähernd 100 % betrug. Hinsichtlich der in der vorliegenden
Studie verwendeten Versuchstiere dürfte es sich bei den Konjugaten überwiegend
65
5. Diskussion
um Glucuronide handeln, da Sulfatierungen im Phase-II-Metabolismus von Schwei-
nen nicht aufzutreten scheinen (Caldwell 1982). Insgesamt handelte es sich im
Plasma bei 85 % der bestimmten Metaboliten um Quercetinkonjugate. Tamarixetin
und Isorhamnetin waren zu 8 % und 7 % enthalten. Dass die beiden Methylether un-
gefähr zu gleichen Teilen im Plasma von Schweinen auftreten, ist bereits in voraus-
gegangenen Studien gezeigt worden (Ader et al. 2000, Cermak et al. 2003). In ande-
ren Spezies können im Blut aufgrund unterschiedlicher Metabolisierung abweichende
Metabolitenmuster auftreten. So wurde in humanen Plasmaproben beispielweise
bisher kein Tamarixetin nachgewiesen (Graefe et al. 2001, de Vries et al. 2001). Bei
Ratten wird wesentlich mehr Isorhamnetin als beim Schwein gebildet, so dass bei
der Ratte die Plasmakonzentration dieses Metaboliten mehr als Doppelte des Quer-
cetinspiegels betragen kann (de Boer et al. 2005; Morand et al. 2000). Eine Erklä-
rung für die im Vergleich zur Ratte wesentlich niedrigeren Konzentration an Methyl-
derivaten beim Schwein könnte eine vergleichsweise geringe Aktivität der Catechol-
O-Methyltransferase (COMT) sein.
Nicht nur das Metabolitenmuster, sondern v. a. auch die Gesamtflavonolkonzentra-
tion im Plasma variiert zwischen Schweinen und Ratten erheblich (s. u.). Der Plas-
maspiegel von Quercetin in der vorliegenden Studie mit einem Wert von ca. 0,8
µmol/l waren fast 30 mal niedriger als derjenige bei Ratten (ca. 23 µmol/l), die unter
ähnlichen Versuchsbedingungen gehalten wurden (de Boer et al. 2005), obwohl die
Schweine die letzte quercetinhaltige Mahlzeit ca. 60 - 90 min vor der Schlachtung
aufgenommen hatten. Eine mögliche Erklärung für die niedrigen Plasmakonzentrati-
onen beim Schwein im Vergleich zur Ratte könnte eine extrem schnelle Elimination
bzw. eine rasche Verteilung in die Gewebe sein. Hätte man die Tiere vor der Tötung
genüchtert, wäre eine deutlich geringere Plasmakonzentration zu erwarten gewesen,
da diese im allgemeinen bei der gewählten Dosierung nach ca. 8 Stunden weniger
als die Hälfte der maximalen Konzentration beträgt (Ader et al. 2000).
Die höchsten Gewebekonzentrationen von Quercetin wurden im Dickdarm detektiert.
Dies deutet darauf hin, dass trotz gründlicher Spülung mit physiologischer NaCl-
Lösung quercetinhaltige Ingestapartikel an der Darmschleimhaut zurückgeblieben
sind. Dies wäre auch eine Erklärung für die großen Schwankungen der Quercetin-
66
5. Diskussion
konzentrationen, die zwischen den Tieren festgestellt wurden. Die Flavonolkonzen-
trationen im Dickdarmlumen dürften allgemein sehr hoch gewesen sein, da Flavonoi-
de nur beschränkt aus dem Dünndarm absorbiert und außerdem zum Teil über Galle
und Enterozyten resezerniert werden (Manach et al. 1996b, Crespy et al. 1999, Ueno
et al. 1983). Dass ein großer Teil des zugeführten Quercetins den Weg bis zum Co-
lon unverändert passiert, würde auch den extrem hohen Aglycongehalt in diesen
Gewebeextrakten erklären.
Die Entfernung der Ingesta aus dem Dünndarmabschnitt stellte sich weniger auf-
wändig dar als beim Colon, jedoch wurden auch hier extrem hohe Aglycongehalte
nachgewiesen. Neben Quercetin enthielten die Proben außerdem einen verhältnis-
mäßig hohen prozentualen Anteil an Isorhamnetin und Tamarixetin (17 % + 7 %), die
jeweils nahezu vollständig in freier Form vorlagen. Dieses spricht für eine rasche Me-
thylierung von Quercetin in den Enterozyten, die bevorzugt an Position 3’ stattzufin-
den scheint (Bildung von Isorhamnetin). Wie erwartet sind auch in Leber und Niere,
die besonders stark am Stoffwechsel beteiligt sind, aufgrund der hohen enzymati-
schen Aktivität die prozentualen Anteile der beiden methylierten Quercetinkonjugate
an der Gesamtkonzentration relativ hoch (Leber: 22 % Isorhamnetin + 11 % Tamari-
xetin, Niere: 12 % Isorhamnetin + 13 % Tamarixetin). Dass Flavonoide bereits kurz-
fristig nach ihrer Absorption umfangreich verstoffwechselt werden (First-Pass-Effekt),
wurde durch Identifikation der Metaboliten im Kreislauf in mehreren Studien gezeigt
(Morand et al. 1998, Manach et al. 1998, Ader et al. 2000). Das Verhältnis von freien
Molekülen und Konjugaten in den Enterozyten unterliegt verschiedenen zeitgleich
ablaufenden Stoffwechselvorgängen. Es wird von der Absorptions- und Sezernie-
rungsrate sowie der Konjugation und Dekonjugation beeinflusst. Besonders komplex
wird dieser Zusammenhang durch die Tatsache, dass Flavonoidmoleküle mehrfach
und wiederholt mit Methylgruppen, Sulfaten und Glucuroniden konjugiert werden
können, die durch die in diesem Versuch angewendete Analysemethode weder in Art
noch Menge unterschieden werden konnten.
Eine vergleichsweise hohe Gesamtkonzentration an Flavonolkonjugaten enthielten
die mesenterialen Lymphknoten (Quercetin: 2,23 ± 0,16, Isorhamnetin: 0,11 ± 0,02,
Tamarixetin: 0,06 ± 0,01 nmol/g Gewebe), insgesamt mehr als die Hälfte des Flavo-
67
5. Diskussion
nolgehaltes in der Leber. Diese Daten sprechen dafür, dass Flavonoide neben dem
Blutweg auch über die Lymphe transportiert werden können. Untersuchungen dazu
wurden erstmals 2005 von Murota & Terao angestellt, die den thorakalen Lymph-
gang (ductus thoracicus) von Ratten kannulierten. Die Lymphe enthält lipophile Ver-
bindungen, die aus dem Dünndarm absorbiert und nach Metabolisierung in den Ente-
rozyten via Chylomikronen ins Interstitium sezerniert werden. Bei Ratten konnte 30
min nach Applikation einer Dosis von 10 mg Quercetin pro kg Körpergewicht das in-
takte Quercetinaglycon in einer Konzentration zwischen 0,04 und 0,11 µmol/l in der
Lymphe detektiert werden. Nach der enzymatischen Hydrolyse der Konjugate mit
Glucuronidase/Sulfatase wurde eine maximale Konzentration von 2,54 ± 0,43 µmol/l
nachgewiesen. Während die Quercetinkonjugate innerhalb der Zeitspanne von 7
Stunden nach Quercetingabe eine deutliche Akkumulierung in der Lymphe zeigten,
blieben die Gehalte des Aglycons und von Isorhamnetin nach den ersten 45 Minuten
relativ konstant.
Bei dem untersuchten Anteil des Gekröses handelte es sich um das Omentum ma-
jus, das an der großen Kurvatur des Magens befestigt ist. Es bestand bei diesen re-
striktiv gefütterten Tieren zum größten Teil aus Bindegewebe und war nur wenig von
Fett durchsetzt. Die Gesamtflavonolkonzentration war trotz Korrektur des residualen
Blutgehaltes im Schnitt fast so hoch wie im Plasma. Auffällig ist, dass Quercetin im
Gegensatz zum Plasma zum größten Teil in dekonjugierter Form vorlag. Da den Tie-
ren kein Glycosid sondern das Aglycon zugeführt wurde, besteht die Möglichkeit
einer Absorption über die Magenschleimhaut. Die Rolle des Magens als Stoffwech-
selorgan neben anderen extrahepatischen Organen, wie den Nieren oder dem Darm,
wird im allgemeinen immer noch als relativ unbedeutend eingestuft. Bezüglich der
Quercetinaglyca wurde am Rattenmodell jedoch schon mehrfach bewiesen, dass
diese Verbindungen über den Magen schnell und effizient aufgenommen werden
können. Crespy et al. (2002) zeigten, dass 38 % einer zugeführten Menge von freiem
Quercetin bei einer 30-minütigen Verweildauer im Magen von Ratten mit einer Ab-
sorptionsrate von 1,11 ± 0,08 nmol/min über die Magenwand aufgenommen wurden
und die Metaboliten etwa 20 Minuten später in der Gallenflüssigkeit auftauchten.
Übereinstimmend mit diesem Ergebnis konnte bereits in einer vorausgegangenen
68
5. Diskussion
Studie die äußerst schnelle Absorption der Isoflavone Genistein und Daidzein auf
Magenebene demonstriert werden. Isoflavonmetaboliten konnten in diesem Fall
schon drei Minuten nach Applikation im Plasma nachgewiesen werden (Piskula et al.
1999).
Die Lunge scheint beim Schwein bei der Umverteilung von Quercetin und seiner Me-
tabolite eine wesentlich geringere Rolle zu spielen als bei der Ratte. Dass Quercetin,
wie von de Boer et al. (2005) am Rattenmodell gezeigt, sich nach mehrwöchiger Ex-
position in der Lunge anreichert, konnte in diesem Versuch nicht bestätigt werden
(s. u.). Unter den in dieser Studie untersuchten Geweben befand sich die Lunge mit
einer Gesamtflavonolkonzentration von ca. 0,4 nmol/g Gewebe bei den Geweben mit
niedrigem Gehalt.
Die mit Abstand niedrigsten Konzentrationen wurden im Unterhautfettgewebe, in der
untersuchten Skelettmuskulatur und im Gehirn gefunden. Das Gehirn nimmt zwi-
schen den untersuchten Geweben eine Sonderstellung ein, da Substanzen durch die
Blut-Liquor-Schranke nur beschränkt oder mit großer Verzögerung ins Zentral-
nervensystem übertreten können. Durch den morphologischen Aufbau des Gefäß-
systems können nur sehr kleine Moleküle (Wasser, Harnstoff, Kohlendioxid, Sauer-
stoff) ungehindert passieren. Für alle größeren polaren Verbindungen, also auch die
wasserlöslichen Flavonolkonjugate, ist die Blut-Hirn-Schranke nicht permeabel, eini-
ge wenige kleine Hirnareale (z. B. Hypo- und Epiphyse) ausgenommen. Eine nen-
nenswerte Diffusion ist somit nur im Falle von lipophilen Substanzen möglich. Für
körpereigene Stoffe (Glucose, Aminosäuren, Transmitter) und auch Xenobiotika be-
steht die Möglichkeit eines Carrier-vermittelten Transports. Bei körperfremden Stof-
fen kann der Auswärtstransport jedoch oft eine höhere Kapazität als der Einwärts-
transport haben, wodurch der Aufbau wirksamer Konzentrationen verhindert wird
(Frey 2000). In einigen vorausgegangenen Studien ist jedoch vom Übertritt einiger
Flavonoide nach oraler oder intravenöser Applikation ins Gehirn berichtet worden
(Peng et al. 1998, Prasain et al. 2004, Datla et al. 2001).
Auch die Konzentration der Flavonole im Rückenspeck war sehr niedrig (0,21 nmol/g
Gewebe). In Fett werden nur lipidlösliche Verbindungen angereichert, die Ergebnisse
lassen jedoch nicht erkennen, dass in den Proben fast ausschließlich das hydropho-
69
5. Diskussion
bere Aglycon enthalten war, dessen prozentualer Anteil an der Gesamtflavonolmen-
ge bei 60 % lag.
In der Rückenmuskulatur war die Gesamtflavonolkonzentration (0,1 nmol/g Gewebe)
extrem niedrig. Bei solch geringen Konzentrationen ist zu beachten, dass sich ein
Restfehler bei der Residualblutkorrektur vergleichsweise stark auswirkt. Insgesamt
gesehen ist der Anteil an Quercetin, der sich in der Muskulatur befindet selbst nach
dieser hohen Dosierung sehr klein, auch wenn man berücksichtigt, dass die Musku-
latur insgesamt einen großen prozentualen Anteil des Körpers einnimmt. Kritisch an-
zumerken ist, dass die Ergebnisse für Lunge, Rückenspeck, Skelettmuskulatur und
Gehirn aufgrund der niedrigen Konzentrationen mit Vorsicht zu betrachten sind. Je
niedriger die Gehalte sind, desto eher besteht vor allem im Fall von Tamarixetin und
Isorhamnetin die Möglichkeit, dass die Konzentrationen im Bereich der Nachweis-
grenze liegen. Eine relativ kleine Versuchstiergruppe birgt zudem die Gefahr, dass
Durchschnittswerte von „Ausreißern“ stark beeinflusst werden. Zudem ist es nicht
auszuschließen, dass sich die Testsubstanz in Gefäßwänden anreichert und der Fla-
vonolgehalt in gut durchbluteten Geweben dadurch erhöht sein kann.
Vergleich mit Befunden bei der Ratte
Die Ratten in der vorausgegangenen Studie von de Boer et al. (2005), welche eine
0,1 %ige Quercetindiät (~50 mg/kg) bekamen, lassen sich bedingt zu einem Ver-
gleich mit den in der vorliegenden Studie verwendeten Tieren heranziehen, da in
beiden Versuchen über einige Wochen Quercetin gefüttert wurde und die Tiere vor
der Tötung nicht genüchtert wurden. Wie schon erwähnt, fällt besonders der extreme
Unterschied in der Plasmakonzentration auf, der bei den Schweinen ca. 30 mal nied-
riger war. Bei den Schweinen traten 10-fach höhere Flavonolkonzentrationen in der
Niere (8,46 nmol/g Gewebe) und 5-fach höhere Flavonolkonzentrationen in der Leber
(4,24 nmol/g Gewebe) im Vergleich zum Plasma (0,79 µmol/l) auf. Dagegen betrug
der Plasmaspiegel der Ratten mit 23,4 µmol/l etwa das 8-fache des Gehaltes der
Niere (2,85 nmol/g Gewebe) und das 13-fache des Flavonolspiegels der Leber (1,79
nmol/g Gewebe). Auch unter anderen Versuchsbedingungen (Kurzzeitexposition,
10-fache Dosis, 8-stündige Nüchterung vor der Gewebeentnahme) wurden beim
70
5. Diskussion
Schwein hohe Leber- und Nierenwerte festgestellt, wobei das Verhältnis der Gehalte
umgekehrt war, also im Lebergewebe doppelt soviel Testsubstanz gefunden wurde
wie in der Niere (de Boer et al. 2005). Aus den speziesspezifischen Unterschieden
im Stoffwechsel, insbesondere der verschiedenen Konjugationsmechanismen für
Xenobiotika resultieren stark variierende Eliminationsgeschwindigkeiten. Bei Schwei-
nen scheint die Verweildauer im Plasma im Vergleich zur Ratte kürzer zu sein. Dass
einige Gewebe beim Schwein eine erheblich höhere Konzentration aufweisen als das
Plasma 60 - 90 min nach der Quercetinapplikation spricht dafür, dass in den Gewe-
ben nach Langzeitapplikation eine gewisse Retention der Testsubstanz stattgefun-
den zu haben scheint. Auch eine effektivere Aufnahme durch die Gewebe beim
Schwein wäre denkbar, wobei es in der Literatur bisher grundsätzlich an Informatio-
nen über den Aufnahmemechanismus von Flavonoiden in Zellen fehlt.
Ein weiterer Unterschied besteht in den Flavonolkonzentrationen, die in der Lunge
der beiden Spezies gefunden wurden und bei der Ratte ca. das 10-fache der Kon-
zentration beim Schwein betrug. Vereinbar mit den Ergebnissen von de Boer et al.
(2005) ist die Tatsache, dass auch in den Lungenextrakten der Schweine der über-
wiegende Teil der enthaltenen Flavonole in freier Form vorlag. Der Grund für die
niedrigeren Gehalte beim Schwein könnte zum einen die kürzere Versuchsdauer
sein, zum anderen aber vor allem auch der bereits angesprochene Unterschied im
Stoffwechsel der beiden Tierspezies. Im Falle der Ratten scheint es sich jedenfalls
um einen Langzeiteffekt zu handeln, denn in Studien, in denen die Tiere einer einma-
ligen Quercetindosis ausgesetzt waren, traten nur geringe Konzentrationen in den
Lungen auf (Mullen et al. 2002, Ueno et al. 1983).
Korrelationen ß-Glucuronidaseaktivität und Aglycongehalt
Der unterschiedlich große Anteil des Quercetinaglycons in den untersuchten Gewe-
ben deutet grundsätzlich auf enzymatische Dekonjugation durch die ß-Glucuronidase
hin. So ergab sich für die Enzymaktivität die Reihenfolge Niere > Lunge > Leber >
Zwerchfellmuskulatur > M. longissimus dorsi und für die jeweiligen Aglycagehalte
Lunge > Zwerchfell > Leber > M. longissimus dorsi > Niere. Insgesamt wurden kei-
nerlei Hinweise auf positive Korrelationen zwischen der gemessenen spezifischen
71
5. Diskussion
Aktivität der ß-Glucuronidase und dem Aglycagehalt in den verschiedenen Geweben
festgestellt.
Die höchste ß-Glucuronidaseaktivität der fünf Gewebeproben wurde in der Niere
(144,1 ± 31,18 Units, Aglycongehalt: 29 %) festgestellt. Dieses Ergebnis scheint im
Widerspruch zur eigentlichen Funktion der Niere zu stehen, nämlich der Ausschei-
dung der glucuronidierten Verbindungen mit dem Harn. Im Endeffekt würde dies be-
deuten, dass eine hohe ß-Glucuronidaseaktivität in der Niere die Elimination von
Quercetin und seiner methylierten Metabolite vermindert. Denkbar wäre auch eine
partielle Dekonjugation mehrfach glucuronidierter Moleküle und erneute Konjugation
oder nachfolgende Einschleusung der freigesetzten Glucuronsäure in andere Stoff-
wechselwege.
Leber und Lunge wiesen hohe ß-Glucuronidaseaktivitäten bei sehr hohen Aglycon-
gehalten (93 und 100 %) auf. Die Leber ist maßgeblich an der Metabolisierung von
Flavonoiden beteiligt. Ihr werden die nach Absorption in den Darmzellen entstande-
nen Flavonoidglucuronide über das Pfortaderblut zugeführt und in den Hepatozyten
weiter verstoffwechselt. Im HepG2-Zellmodell unterlagen das Quercetin-3- und -7-
Glucuronid zwei unterschiedlichen Stoffwechselwegen: Methylierung oder Deglucu-
ronierung durch die ß-Glucuronidase mit anschließender Sulfatierung, was für eine
Rolle der Leber beim Umsatz von Glucuroniden spricht (O’Leary et al. 2003).
Die Enzymaktivität der beiden Muskelproben (Zwerchfellmuskulatur und M. longissi-
mus dorsi) war ähnlich gering. Im M. longissimus dorsi aller Tiere lag weit mehr als
die Hälfte des enthaltenen Quercetins in Form von Glucuroniden vor, in der Zwerch-
fellmuskulatur immerhin bei vier von sieben Tieren.
Generell muss die Bewertung des Gehaltes an freiem Quercetin in den Organen kri-
tisch beurteilt werden, da die Möglichkeit einer nachträglichen Freisetzung von Quer-
cetin aus seinen Konjugaten besteht, die während der Aufarbeitung und insbesonde-
re der Extraktion stattfinden kann (de Boer et al. 2005). Einige Proben zeigten zudem
ohne vorausgegangene enzymatische Hydrolyse höhere Aglyconkonzentrationen als
dasselbe Ausgangsmaterial nach Behandlung mit ß-Glucuronidase/Sulfatase. Dafür
können Materialverluste oder Abbau während der Aufarbeitung und Messung ver-
antwortlich sein. Insgesamt scheint ist es wenig wahrscheinlich, dass das Aglycon in
72
5. Diskussion
Organen mit hoher metabolischer Aktivität (Darm, Leber, Niere) über längere Zeit
unverändert bleibt. Bei nebeneinander ablaufenden entgegengesetzten Reaktionen
wie der Glucuronidierung durch die UGT und der Dekonjugation durch die ß-Glucu-
ronidase bestimmt letztendlich die Kinetik, welches der beiden Produkte in der höhe-
ren Konzentration vorliegt. In diesem Zusammenhang ermittelten Day et al. (2000a)
für die Aktivität der UGT gegenüber Flavonoidaglyca einen 5 - 10-fach niedrigeren
Km-Wert als für die ß-Glucuronidase bezüglich der Flavonoidglucuronide. Das bedeu-
tet, dass die Bildung von Glucuroniden gegenüber der Hydrolyse von Konjugaten zu
überwiegen scheint.
Denkbar ist außerdem, dass es nach der Aufnahme von Quercetinkonjugaten in be-
stimmte Gewebe nach der Deglucuronidierung zur erneuten Konjugation und/oder
anschließender Abgabe aus dem Gewebe kommt, was die Darstellung einer Korrela-
tion zwischen Aglycagehalten und ß-Glucuronidaseaktivität erschwert.
Auch die Aussagekraft der Bestimmung der Enzymaktivität unter den beschriebenen
Versuchsbedingungen ist kritisch zu bewerten. Der Einsatz der aufgereinigten En-
zymmischung in definierter Menge (Abb. 10) zeigt, dass die Methode an sich funktio-
niert. Für die Messung der Aktivität des Enzyms aus Gewebeextrakten scheint dies
jedoch nur eingeschränkt zu gelten. Die mangelnde Reproduzierbarkeit der Daten
spricht dafür, dass die Methode nicht sensitiv genug ist und die Messung durch einen
oder mehrere unbekannte Faktoren beeinflusst wird. Die Auswahl des Modellsubstra-
tes könnte ebenfalls eine gewisse Rolle spielen, da das Enzym zu verschiedenen
Verbindungen unterschiedliche Affinitäten aufweisen kann. O’Leary et al. (2001) un-
tersuchten die Substratspezifität von rekombinanter menschlicher ß-Glucuronidase
zum Modellsubstrat p-Nitrophenylglucuronid einerseits und verschiedenen Flavonol-
und Isoflavonglucuroniden andererseits. Für das künstliche Substrat p-Nitrophenol
ergab sich ein weitaus höherer Km-Wert als für die Flavonoidglucuronide, was auf
eine viel geringere Affinität des Enzyms zu diesem Substrat hindeutet. Gleichzeitig
konnte anhand verschiedener Quercetinglucuronide festgestellt werden, dass die
Position der Konjugation keinen nennenswerten Einfluss auf die Enzymaktivität hat.
Eine weitere Erklärung für die niedrigen und wenig reproduzierbaren Enzymaktivitä-
ten in den untersuchten Geweben könnten die verwendeten Gewebeextrakte sein,
73
5. Diskussion
die nach Homogenisierung durch einfache Zentrifugation bei 14000 x g gewonnen
wurden. Lysosomen stellen eine sehr heterogene Fraktion dar, so dass sich generell
eine Isolation dieser Zellorganellen durch Unterschiede in Dichte und Sedimentati-
onskoeffizienten als extrem schwierig erweist (Arai et al. 1991). Um zu erreichen,
dass sich wirklich die komplette Lysosomenfraktion nach dem Zentrifugationsschritt
im Überstand befindet, werden spezielle Verfahren wie die Dichtegradientenzentrifu-
gation angewendet. Eine derartige Aufreinigung bzw. Aufkonzentration der Lysoso-
menfraktion könnte zu einer erheblichen Steigerung der Enzymaktivität im Extrakt
führen. Allerdings ist eine Präparation der Lysosomen nicht aus jedem Gewebe mög-
lich.
Eine weitere Möglichkeit zur Untersuchung des Vorkommens der ß-Glucuronidase in
Körpergeweben wäre eine Analyse auf Ebene der Genexpression mittels PCR (Po-
lymerase Chain Reaction). Das Ergebnis der mRNA-Quantifizierung spiegelt jedoch
nicht zwingend den Proteingehalt oder gar die Enzymaktivität wieder. Eine direkte
Bestimmung des Proteins wäre stattdessen mittels Western Blot zu realisieren. Da-
bei ist aber zu bedenken, dass die gebildeten Proteine posttranskriptional auch inak-
tiv vorliegen können und sie beispielsweise durch fehlende Brückenbindungen noch
nicht zur Ausbildung der Tertiär- oder Quartärstruktur befähigt sind. Viele Enzyme
benötigen zur Aktivierung zudem bestimmte Co-Faktoren.
Generell muss in diese Überlegungen die Möglichkeit einbezogen werden, dass Fla-
vonoide als „multifunctional inducers“ in der Lage sein können, Phase-II-Enzyme zu
induzieren, zu denen auch Glucuronosyltransferasen zählen (Liska 1998, Moon et al.
2005, Walle & Walle 2002).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie dargestellten Daten
über die Verteilung und Konzentrationen von Quercetin in den untersuchten Gewe-
ben letztendlich sehr stark von den gewählten Versuchsbedingungen abhängen. Aus
Bioverfügbarkeitsstudien ist bekannt, dass maximale Quercetinkonzentrationen im
Plasma nach 60 - 120 min erreicht werden und nach 12 Stunden bereits nur noch
Spuren detektierbar sind. Das bedeutet, dass bei der Applikation hoher Dosen in nur
zwei Mahlzeiten am Tag erhebliche Schwankungen der Flavonolspiegel im Plasma
und mit großer Wahrscheinlichkeit auch entsprechende Fluktuationen in den Gewe-
74
5. Diskussion
ben zu erwarten sind. Die Flavonolgehalte der Gewebe, v. a. der Darmabschnitte,
der Mesenteriallymphknoten sowie von Leber, Niere und Gekröse, wurden mit großer
Wahrscheinlichkeit deutlich von der zuletzt vorgenommenen Quercetinapplikation
ungefähr 60 min vor der Tötung beeinflusst. Die erhobenen Daten sollten daher als
eine Art Momentaufnahme betrachtet werden, vor allem weil es bezüglich der Kinetik
von Quercetin in Körpergeweben noch an Informationen fehlt. Bisher noch uner-
forschte Metabolisierungswege von Flavonoiden und ihren Konjugaten sowie damit
verbundene Umverteilungen der Flavonolmoleküle im Organismus können auch ein
Grund für die in der vorliegenden Studie fehlende Korrelation zwischen Aglyconge-
halt und ß-Glucuronidaseaktivität in den verschiedenen Geweben sein. Dennoch lie-
fert die Studie insgesamt wertvolle Erkenntnisse über das Verhalten von Quercetin
im Organismus vom Schwein, gibt deutliche Hinweise auf Zielgewebe des Flavonols
und zeigt im direkten Vergleich mit anderen Spezies die Auswirkungen von Unter-
schieden im Stoffwechsel auf die Verteilung der Metaboliten in den Körpergeweben
auf.
75
5. Diskussion
Bedeutung für die Tiermedizin
Bisherige Untersuchungen zur Wirkung von Flavonoiden auf den Stoffwechsel von
Nutztieren befassen sich vor allem mit Inhaltsstoffen aus Sojaerzeugnissen. Soja,
das natürlicherweise einen hohen Gehalt an Isoflavonen aufweist, wird vielen Futter-
mitteln als Proteinquelle beigemischt. Sojabohnen und auch Klee enthalten Konzen-
trationen von 100 bis 5000 ppm (Wang & Murphy 1994), wobei die dominierenden
Isoflavone in Sojaerzeugnissen Daidzein und Genistein sind (Greiner et al. 2001).
Neben den bereits in 2.4 angesprochenen Wirkungen zeichnen sich Isoflavone vor
allem durch eine strukturelle und funktionale Ähnlichkeit mit nativen Östrogenen aus
und werden daher zu den Phytoöstrogenen gerechnet. Obwohl sie eine weniger
ausgeprägte Affinität zu Östrogenrezeptoren aufweisen als natürliche Östrogene,
besteht eine gewisse Konkurrenz um die Rezeptorbindungsstellen (Kelly et al. 1993).
Aufgrund dieser hormonähnlichen Eigenschaften können Isoflavone eine potentielle
Rolle bei der Beeinflussung von Wachstums- und Reproduktionsvorgängen spielen.
Dieser Aspekt gewinnt besonders heutzutage bei Tieren, die zur Fleischgewinnung
dienen, an Bedeutung, da sich der Trend immer noch dahin bewegt, die Muskelmas-
se bei gleichzeitiger Reduktion des Fettansatzes zu steigern (Payne et al. 2001). Um
einen Zusammenhang zwischen der Aufnahme von Soja und Änderungen in Wachs-
tum und Körperzusammensetzung herzustellen, wurden in Studien nach Verabrei-
chung von isoflavonreichen und -armen Diäten Masttiere und deren Schlachtkörper
verglichen. Ergebnisse von Payne et al. (2001) bestätigen die Verminderung des
Fettansatzes beim Schwein durch Sojafütterung, die sich jedoch nicht über Erhöhung
des gängigen Isoflavongehaltes im Futter steigern ließ. In einem Fütterungsversuch
von Kuhn et al. (2004) konnten zwischen Schweinen zweier Fütterungsgruppen mit
mehr als 6-fachem Konzentrationsunterschied in der Isoflavonzufuhr keine signifikan-
ten Unterschiede in der Körperzusammensetzung (Gewebeanteile, Protein/Fett-
Verhältnis) und Wachstum festgestellt werden. Andererseits konnte gezeigt werden,
dass das prä- und postnatale Wachstum von männlichen Ferkeln, deren Muttersauen
während der Trächtigkeit vermehrt Daidzein über das Futter erhalten hatten, verbes-
sert werden konnte (Liu et al. 1999). Zurückgeführt wurde dies auf eine durch das
76
5. Diskussion
Isoflavon induzierte Erhöhung der Expression von IGF-1R (insulin-like growth factor
receptor type 1) im Skelettmuskel der Ferkel. IGF-I und -II spielen bedeutende Rollen
im Muskelwachstum und führen über den IGF-1R zu wachstumsfördernden Effekten
(Ren et al. 2001).
Von Interesse in der Nutztierhaltung sind außerdem die immunmodulierenden und
antipathogenen Wirkungen, die Flavonoiden zugeschrieben werden und durch die
Verluste während der Aufzucht und Haltung vermindert werden könnten.
Der Einsatz von Flavonoiden als Futterzusatz findet aufgrund ihrer potenziell gesund-
heitsfördernden Effekte dieser Pflanzeninhaltsstoffe seit einiger Zeit auch bei der
Haltung von "Liebhabertieren" Beachtung. Kleintiere wie Hunde und Katzen errei-
chen in der Obhut des Menschen im Durchschnitt ein relativ hohes Alter, das wie
beim Menschen auch von Herz- und Gefäßerkrankungen, Krebs, Diabetes mellitus
Typ 2 oder ähnlichen Leiden begleitet sein kann. Aus diesem Grund wird nicht nur in
der Humanernährung (functional food), sondern auch in der Futtermittelindustrie da-
zu übergegangen, Pflanzenextrakte oder daraus isolierte Verbindungen wie Querce-
tin Tiernahrungsmitteln zuzusetzen.
77
6. Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Juliane Bieger (2007):
Verteilung des Flavonols Quercetin
in Organen und Geweben beim Schwein
nach mehrwöchiger Verabreichung mit dem Futter
Die im Rahmen dieser Arbeit vorgenommenen Untersuchungen hatten zum Ziel, die
Kenntnisse über die Verteilung des Flavonols Quercetin sowie seiner Metaboliten
Isorhamnetin und Tamarixetin im Säugetierorganismus zu vertiefen. Informationen
über das Verhalten der allgemein als gesundheitsförndernd geltenden Flavonoide,
die dem Körper kontinuierlich mit pflanzlicher Nahrung zugeführt werden, sind zum
Verständnis ihrer Wirkungsweise von größter Bedeutung. Studien, die bisher vor-
zugsweise an Ratten durchgeführt worden sind, geben Hinweise auf eine weite Ver-
teilung von Flavonoiden in verschiedenen Körpergeweben. Erste Untersuchungen an
Schweinen (de Boer et al. 2005) deuten ferner darauf hin, dass es bei dieser Spezies
im Vergleich zur Ratte zu erheblichen Differenzen im Verteilungs- und Metaboliten-
muster kommt.
In der vorliegenden Studie erfolgte die Verabreichung von Quercetin in einer hohen
Dosierung (50 mg/kg Körpergewicht) über einen Zeitraum von vier Wochen an
Schweine. Die Ergebnisse demonstrieren, dass nach einer Langzeitapplikation von
Quercetin in allen untersuchten Geweben Quercetin und dessen Metaboliten nach-
gewiesen werden konnten. Anhand der relativ hohen Konzentrationen in Darmwand,
Leber und Niere wird jedoch deutlich, dass das zugeführte Flavonoid umfangreich
metabolisiert und eliminiert wird. Die wesentlich niedrigeren Konzentrationen in Fett,
Muskulatur, Lunge und Gehirn der Schweine lassen vermuten, dass eine nennens-
werte Anreicherung von Quercetin in diesen Organen auch nach langer oraler Expo-
sition nicht auftritt. Bei den Metaboliten handelte es sich in allen untersuchten Gewe-
ben überwiegend um Quercetinkonjugate (67 – 98 %). In den Geweben konnten im
Gegensatz zum Plasma regelmäßig Gehalte von dekonjugiertem Quercetin nachge-
wiesen werden, die ca. 30 – 100 % der Gesamtkonzentration ausmachten. Ein direk-
ter Zusammenhang zwischen der Konzentration an Aglyca und der spezifischen Ak-
78
6. Zusammenfassung
tivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Geweben ließ sich allerdings nicht
zeigen. Grundsätzlich ist anzumerken, dass die in dieser Arbeit ermittelten Gewebs-
konzentrationen von Flavonolen eine „Momentaufnahme“ darstellen und Effekte ei-
ner langfristigen Applikation von Quercetin und der akuten Zufuhr des Flavonols mit
der letzten Mahlzeit 60 - 90 min vor der Gewebeentnahme widerspiegeln.
79
7. Summary
7. Summary
Juliane Bieger (2007):
Tissue distribution of the flavonol quercetin
in the pig after long-term feeding of a quercetin-containing diet
The aim of this study was to improve our knowledge about the distribution of the
flavonol quercetin as well as its methylated metabolites isorhamnetin and tamarixetin
in mammals. Information about the post-absorptive fate of the health-promoting
flavonoids which are continuously ingested with plant-derived food, is of crucial
importance for the understanding of their mode of action. Few studies carried out in
rats indicate a distribution of flavonoids in different body tissues. Furthermore,
preliminary data obtained in pigs (de Boer et al. 2005) indicate, that remarkable
differences between rats and pigs concerning the distribution and metabolite
transformation of flavonols do exist.
In the present study pigs were fed a high quercetin diet (50 mg per kg body weight
daily) for a period of four weeks. The results demonstrate that a long-term application
of quercetin leads to a broad distribution of the test substance and its methylated
metabolites within the organism. The high concentrations in the intestinal wall, liver
and kidneys, however, indicate that the flavonoid is extensively metabolized and
eliminated by these organs. The considerably lower concentrations found in adipose
tissue, skeletal muscle, lungs and brain suggest that even after long-term oral
application of quercetin a significant accumulation within these organs is unlikely. In
most tissues the majority of flavonols (67 - 98 %) were present as conjugates of
quercetin. Unlike in plasma the other tissues investigated contained a variable
amount of deconjugated quercetin in the range of 30 - 100 % of the total
concentration. A correlation, however, between aglyca concentration and the specific
activity of the enzyme ß-glucuronidase of the respective tissue could not be
demonstrated.
With respect to the tissues distribution of quercetin and its metabolites, the present
results are some kind of a “snap-shot” reflecting effects of the long-term quercetin
80
7. Summary
application and the acute intake with the last meal consumed about 60 min prior to
slaughtering.
81
8. Literaturverzeichnis
8. Literaturverzeichnis
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Danksagung
Danksagung Ich danke ganz herzlich:
Herrn Professor Dr. S. Wolffram für die Überlassung des Themas, für die vielen hilf-
reichen Verbesserungsvorschläge und seine Unterstützung bei der Anfertigung der
Arbeit.
Herrn Professor Dr. J. Kamphues dafür, dass er sich dazu bereit erklärt hat, mich als
externe Doktorandin zu betreuen und es mir dadurch ermöglicht hat, an der Tierärzt-
lichen Hochschule Hannover promoviert zu werden.
Herrn Professor Dr. R. Cermak für die Einarbeitung in das Thema meiner Arbeit so-
wie für die Mithilfe bei der Durchführung der Fütterungsstudie.
Petra Schulz für die Einweisung an der HPLC und ihre tatkräftige Unterstützung bei
der Aufarbeitung meiner Proben.
Maike Jürgensen, die mir nicht nur bei der Arbeit am Photometer mit Rat und Tat zur
Seite stand.
Clemens Benthin und allen fleißigen Hiwis, die für mich im Stall eingesprungen sind.
Sabine, Miriam und Birga, die immer ein offenes Ohr für mich hatten und oft sehr zu
meiner Motivation beigetragen haben, sowie allen Kollegen aus dem Institut für Tier-
ernährung und Stoffwechselphysiologie und dem Institut für Humanernährung und
Lebensmittelkunde, die für eine nette Atmosphäre und ein gutes Arbeitsklima gesorgt
haben.
Martin für alle aufmunternden Worte, den Rückhalt und die Hilfe, die er mir während
der Zeit gewährt hat.
Meinen Eltern, die es mir ermöglicht haben, in Hannover Tiermedizin zu studieren.
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