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Erwin R. SchmidtInstitut für Molekulargenetik
2. VL28. 04. 2009
Thema Gentechnologie
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In der Gentechnologieist die Neukombinationunterschiedlicher DNA-Moleküle wichtig.
Das Verknüpfen von DNA-Molekülen erledigt das Enzym „DNA-Ligase“
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Komplementäreüberhängende Enden („Sticky ends“)erleichtern das Wiederverknüpfen von DNA-Molekülen
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Die DNA-Ligase verknüpft zwei DNA-Moleküle
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Die DNA-Ligasen sind in der Lage, Phospho-diesterbindungen zu knüpfen. Sie brauchen dafüEnergie, die entweder durch ATP oder NAD+geliefert wird
T4-DNA-Ligase
E. coli DNA-Ligase
Ligase AMP
Ligase
AMP
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Oder verbindet „glatte“ Enden miteinander
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In der Gentechnologieist die Neukombinationunterschiedlicher DNA-Moleküle wichtig.
Das Verknüpfen von DNA-Molekülen erledigt das Enzym „DNA-Ligase“
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Für die Selektionder gewünschtenrekombinantenKlone braucht mandie Vektor-DNA
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Asymmetrische Restriktion von Vektor und Integrat-DNA
AATTGGCC
CCGGAATT
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Funktionen der Vektor DNA
• Sorgt für Replikation in der Wirtszelle• Stellt selektierbare Markergene bereit• Hat Vielzweck-Klonierungsstelle• Trägt Signalsequenzen für Genexpression• Verschiedenste Modifikationen für
spezielle Anwendungen (z. B. „Shuttle“zwischen Pro- und Eukaryoten; Elemente für künstl. Chromosomen)
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Typische Vektoren besitzen einen Replikationsorigin,selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle
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Typische Vektoren besitzen einen Replikationsorigin,selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle
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Inzwischen gibt es die verschiedensten Farbvariationen als Marker oder Reportergene
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Plasmide als Vektoren
Plasmide sind extrachromosomale, autonom replizierende,meist zirkuläre DNA-Moleküle,die natürlicherweise in vielen Bakterien vorkommen
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Plasmid-DNA
E. coli DNA
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Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Plasmids in der Zustandsform
„supercoiled“(rechts) bzw. „relaxed circle“ (links)
http://www.gen.cam.ac.uk/Images/summers/plasmids.jpg
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aus Weaver/Hedrick
z.B. Resistenzplasmide
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Plasmide als Vektoren
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Vektor zur Klonierung von PCR-Produkten
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Eigenschaften einiger PCR-Polymerasen
Table 1. Comparison of PCR Product Properties for Some Thermostable DNA
Polymerases.
Taq/ VentR®/ DeepCharacteristic AmpliTaq® Tfl Tth (Tli) VentR® Pfu Pwo
>95% >95% Resulting DNA ends 3´ A 3´ A 3´ A Blunt Blunt Blunt
5´®3´ exonucleaseActivity Yes Yes Yes No No No No
3´®5´ exonucleaseactivity No No No Yes Yes Yes Yes
N.A.: not available
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Für die Expression fremder Gene gibt es spezielle Expressionsvektoren mit Signalsequenzen für die korrekte Transkription und Translation in Bakterien
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Plasmidvektoren, zur Expression von Fremdgenen
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Expression von Fusionsproteinen mit sog. „His-tag“
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„Gateway“-Klonierungssystem
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„Gateway“-Klonierungssystem
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„Gateway“-Klonierungssystem
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„Gateway“-Klonierungssystem
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Replikation M13-Bakteriophage
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United States Patent 6803230 Inventors:
Bowdish, Katherine S. (Del Mar, CA) Fredrickson, Shana (Solana Beach, CA)
Wild, Martha (Solana Beach, CA)
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Substitutionsvektoren
Linker Arm „Stuffer“ Rechter Arm
IntegratLigation
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Sal Bam Eco Eco Bam Sal
Verdau mit Sal I + Eco
Sal Bam Eco Eco Bam Sal
Sal
Sal
Eco
Eco
Sal
Sal
Fällen mit Isopropanol
Eco
Eco
Sal
Sal
Integrat
Linker Arm Rechter Arm„Stuffer“
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Lambda Zap:Moderne Vektoren Mit Phagen und Plasmid-eigenschaften
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P-Elemente sind Transposons bei D. melanogaster, die eine Keimbahn-spezifisch aktive Transposase exprimieren
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PiggyBac-Transposon aus Trichoplusia ni (Schmetterling) funktioniert in einer großen Bandbreite von Organismen inklusive der Maus
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