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Einfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die interbakterielle
Kommunikation von Pseudomonas aeruginosa
Vom Fachbereich für Biowissenschaften und Psychologie
der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina
zu Braunschweig
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
(Dr.rer.nat.)
genehmigte
D i s s e r t a t i o n
von Florian Bredenbruch
aus (Geburtsort) Langenhagen
1. Referent: Professor Dr. Jürgen Wehland
2. Referent: Professor Dr. Dieter Jahn
eingereicht am: 10.10.2005
mündliche Prüfung (Disputation) am: 12.01.2006
Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung des Fachbereichs für
Biowissenschaften und Psychologie, vertreten durch die Mentorin oder den Mentor/die
Betreuerin oder den Betreuer der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:
Publikationen
Bredenbruch,F., Nimtz,M., Wray,V., Morr,M., Muller,R., and Haussler,S. (2005)
Biosynthetic pathway of Pseudomonas aeruginosa 4-hydroxy-2-alkylquinolines J
Bacteriol 187: 3630-3635.
Wehmhoner,D., Haussler,S., Tummler,B., Jansch,L., Bredenbruch,F., Wehland,J.,
and Steinmetz,I. (2003) Inter- and intraclonal diversity of the Pseudomonas aeruginosa
proteome manifests within the secretome J.Bacteriol. 185: 5807-5814.
Tagungsbeiträge
Florian Bredenbruch, Robert Geffers, Manfred Nimtz, Jan Buer and Susanne
Häussler
The Pseudomonas quinolone signal is a powerful iron chelator: link between the iron- and
the quinolone signal-regulons in Pseudomonas aeruginosa (Poster) 2. DGHM-VAAM
Jahrestagung in Göttingen (2005)
Florian Bredenbruch, Manfred Nimtz, Susanne Häußler (2003) Biosynthetic Pathway
of extracellular metabolites (4-hydroxyquinoliens) of Pseudomonas aeruginosa (Poster)
55. DGHM Jahrestagung in Dresden (2003)
I. INHALTSVERZEICHNIS
I
I. Inhaltsverzeichnis
I. INHALTSVERZEICHNIS ...................................................................................................I
II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .......................................................................................... 1
III. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................... 3
IV. TABELLENVERZEICHNIS ........................................................................................... 6
1. EINLEITUNG .................................................................................................................. 7
1.1. Taxonomie von Pseudomonas aeruginosa............................................................ 7
1.2. Allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa ...................................................... 9
1.3. P. aeruginosa: ein bedeutsamer opportunistischer Krankheitserreger.................. 9
1.4. Pseudomonas aeruginosa Virulenz Faktoren...................................................... 12
1.5. Quorum Sensing .................................................................................................. 16
1.5.1. Überblick ..................................................................................................... 16
1.6. Pseudomonas Quinolon Signal (PQS)................................................................. 19
1.7. Zielsetzung .......................................................................................................... 21
2. MATERIAL UND METHODEN ....................................................................................... 22
2.1. Nährmedien ......................................................................................................... 22
2.1.1. Vogel-Bonner Minimalmedium .................................................................. 22
2.1.2. Luria Bertani Medium (LB) ........................................................................ 23
2.1.3. Brain Heart Infusion Medium (BHI)(BD-Diagnostic Systems).................. 23
2.1.4. Columbia-Blut-Agar (Becton Dickinson) ................................................... 23
2.2. Anzucht, Stammerhaltung und Entsorgung von Bakterien ................................. 24
2.3. DNA Arbeitstechniken ........................................................................................ 25
2.3.1. Isolierung chromosomaler DNA ................................................................. 25
2.3.2. Isolierung von Plasmid DNA ...................................................................... 25
2.3.3. Agarose-Gelelektrophorese ......................................................................... 25
2.3.4. Transposon Mutagenese .............................................................................. 26
2.3.5. Y-Linker Ligation........................................................................................ 27
2.4. RNA Arbeitstechniken und Techniken für Transkriptom Analysen ................... 30
2.4.1. Isolierung von bakterieller Gesamt-RNA.................................................... 30
I. INHALTSVERZEICHNIS
II
2.4.2. Reverse Transkription ................................................................................. 31
2.4.3. Realtime PCR .............................................................................................. 33
2.4.4. Affymetrix Micro-Array-Analyse ............................................................... 35
2.5. Sonstige Methoden .............................................................................................. 37
2.5.1. Das Screening nach HAQ-negativen Transposonmutanten ........................ 37
2.5.2. HAQ Extraktion........................................................................................... 37
2.5.3. Dünnschichtchromatographie...................................................................... 38
2.5.4. Fütterung von markierten Substraten .......................................................... 38
2.5.5. GC/MS......................................................................................................... 39
2.5.6. Elektrospray Ionisations MS (ESI).............................................................. 41
2.5.7. NMR ............................................................................................................ 41
2.5.8. Bestimmung von Eisenkonzentrationen ...................................................... 41
2.5.9. Bestimmung der RhlR Promotoraktivität mit Hilfe einer rhlR-lacZ Fusion
auf dem Plasmid pMAL.V [Latifi et al., 1996] ........................................................... 42
2.5.10. In vitro DNA-Fragmentierung durch PQS .................................................. 42
2.5.11. Live/Dead Färbung ...................................................................................... 43
2.5.12. Anfärbung extrazellulärer DNA .................................................................. 43
3. ERGEBNISSE ................................................................................................................ 44
3.1. Biosynthese von 4-Hydroxy-2-alkylquinolonen (HAQs) bei P. aeruginosa ...... 44
3.1.1. Transposonmutagenese und Screen nach HAQ-negativen Mutanten ......... 44
3.1.2. Fütterungsexperimente mit möglichen HAQ Vorstufen ............................. 47
3.1.3. Rhamnolipide und HAQs haben einen gemeinsamer Fettsäurepool ........... 50
3.2. Effekt von PQS auf P. aeruginosa: Transkriptionelle Analyse .......................... 52
3.2.1. Realtime-PCR von P. aeruginosa nach Zugabe von PQS ........................... 53
3.2.2. Arrays von PAO1 nach 5, 12 und 20 h unter Zugabe von 40 µM PQS ...... 54
3.2.2.1. PQS und Eisen regulierte Gene ........................................................... 55
3.2.2.2. Durch PQS und durch oxidativen Stress regulierte Gene.................... 57
3.2.2.3. PQS und MvfR regulierte Gene .......................................................... 60
3.2.2.4. Sonstige PQS-regulierte Gene............................................................. 62
I. INHALTSVERZEICHNIS
III
3.3. Vergleich der durch PQS-Zugabe regulierten Gene mit anderen P. aeruginosa
Transkriptionsstudien ...................................................................................................... 63
3.4. PQS Effekt auf die Eisenkonzentration............................................................... 64
3.5. PQS komplexiert Fe(III) in vitro ......................................................................... 66
3.6. Das Rhl-QS-System wird durch Eisenmangel induziert ..................................... 69
3.7. Die HAQ-Biosynthese wird eisenunabhängig durch PQS verstärkt ................... 70
3.8. Multiple Funktionen von PQS............................................................................. 70
3.8.1. Computermodell der Interaktion von PQS und DNA ................................. 71
3.8.2. PQS verstärkt die DNA Fragmentierung durch Fe(II) in vitro.................... 73
3.8.3. PQS fragmentiert in vivo DNA.................................................................... 74
3.9. PQS induziert einen bakteriellen Zelltod und die Bereitstellung von
extrazellulärer DNA ........................................................................................................ 75
3.10. PQS vermittelt morphologische Diversität in der späten Wachstumsphase.... 76
4. DISKUSSION ................................................................................................................. 78
4.1. HAQ Biosynthese................................................................................................ 79
4.2. Transkriptom Analyse unter Einfluss von PQS................................................... 81
4.2.1. PQS regulierte Gene: Eine Transkriptionsstudie......................................... 81
4.3. Molekulare Wirkmechanismen von PQS ............................................................ 84
4.4. Biofilme, Adaption und Überleben ..................................................................... 85
4.5. Ausblick............................................................................................................... 87
5. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................... 89
6. SUMMARY .................................................................................................................... 91
Anhang .............................................................................................................................. 105
Sequenzen der Transposonmutanten ............................................................................. 105
Ergebnisse des rhlR-lacZ Promotor Aktivitätstests....................................................... 111
Lebenslauf ......................................................................................................................... 115
II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
II. Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius µF Mikrofarad µg Mikrogramm µl Mikroliter µM Mikromolar AG Arbeitsgruppe bidest. zweimal destilliert Bp Basenpaar bzw. beziehungsweise cDNA komplementäre DNA CF Cystische Fibrose DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alteri (lat.) und andere Fe(II) zweifach positiv geladenes Eisen Fe(III) dreifach positiv geladenes Eisen g mittlere Erdbeschleunigung: 9,81 m/s2 ggf. gegebenenfalls h Stunde H2O Wasser HAQ 2-Alkyl-4-hydroxyquinolin HCl Salzsäure HHQ 2-Heptyl-4-hydroxyquinlin K2HPO4 Di-Kaliumhydrogenphosphat kV Kilovolt LB Luria-Bertani M Molar MBp Megabasenpaare MgSO4 Magnesiumsulfat min. Minute(n) ml Milliliter mM Millimolar mRNA Messenger Ribonukleinsäure ms Millisekunde N Normal NaCl Natriumchlorid NaNH5PO4 Natriumamoniumhydrogenphosphat NaOH Natriumhydroxid ng Nanogramm
II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
OD optische Dichte PBS Phosphat-gepufferte Natriumchlorid Lösung PQS Pseudomonas Quinolon Signal; 2-Heptyl-3-hydroxy-4-
quinolon ps Pikosekunde RNA Ribonukleinsäure rRNA ribosomale Ribonukleinsäure s Sekunde t Zeit TAE Tris-Acetat-EDTA Puffer Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U Einheit u.a. unter anderem u.s.w. und so weiter V Volt w/v Gewicht pro Volumen z.B. zum Beispiel Ω Ohm
III. ABBILDUNGSVERZEICHNIS
III. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1-1 Pseudomonas Arten in rRNA Gruppen aufgeteilt. (Abbildung aus [Bergey
et al., 1989]
7
Abbildung 1-2 Diversität von P. aeruginosa a: Mucoider Typ
b: SCV; c: „normaler Phänotyp“
11
Abbildung 1-3 Schema der Virulenzfaktor-Produktion von P. aeruginosa und deren
Lokalisation aus [van Delden und Iglewski, 1998]
16
Abbildung 1-4 QS-System von Vibrio fischeri aus [Miller und Bassler, 2001] 17
Abbildung 1-5 Schematische Darstellung der hierarchisch aufgebauten QS-Systeme von P.
aeruginosa (Las und Rhl) und der Interaktion mit PQS (Mitte) aus
[McKnight et al., 2000]
19
Abbildung 1-6 a: 2-Heptyl-3,4-dihydroxyquinolin (PQS) b: 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin
(HHQ) c: 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin-N-oxid
20
Abbildung 1-7 Postulierter Biosyntheseweg von HAQs und PQS in P. aeruginosa [Deziel
et al., 2004]
21
Abbildung 2-1 A: Y-Linker mit Linkerprimer. B: Der Linkerprimer kann erst nach dem
ersten Zyklus an die DNA Matrize binden, was unspezifischen PCR
Fragmenten vorbeugt
28
Abbildung 2-2 Beispiel von verschiedenen spezifischen Y-Linker PCR Produkten 29
Abbildung 2-3 Typisches Muster der isolierten und gereinigten RNA im RNA
BioAnalyzer. Das 16 S rRNA Signal sollte ca. die halbe Intensität des 23 S
rRNA Signals haben
31
Abbildung 2-4 Typische chromosomale DNA Kontroll PCR mit cDNA als DNA Matrize
(Spur 2, 4 und 6) und den zugehörigen Negativkontrollen ohne reverse
Transkriptase (Spur 3, 5 und 7) im cDNA Ansatz.
32
Abbildung 2-5 1: 50 Bp Leiter 2: cDNA 3: DNaseI fragmentierte cDNA 36
Abbildung 2-6 Typischer Versuchsaufbau der Array Versuche von der Kultivierung der
Bakterien unter verschiedenen Bedingungen (Oben und Unten) über die
RNA bis zur Hybridisierung der cDNA auf dem Chip
36
Abbildung 2-7 Typische SCV 20265 Kolonie mit HAQ-abhängigen Kristallstrukturen 37
Abbildung 2-8 HAQ-negative-Mutante mit Koloniemorphologie ohne Kristallstrukturen
(M1)
37
III. ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 2-9 oben: Typisches Gaschromatogramm eines trimethylsylisierten total-HAQ
Extraktes von P. aeruginosa 1: 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin (EI
Massenspektrum im unteren Bild) 2: 2-Heptyl-3,4-dihydroxyquinolin
(PQS) 3: 2-Nonyl-4-hydroxyquinolin 4: 2-Nonyl-3,4-dihydroxyquinolin 5:
2-Nonyl-2,4-dihydroxyquinolin 6: 2-Undecenyl-4-hydroxyquinolin; Unten:
EI Massenspektrum des trimethylsylilierten 2-Heptyl-4-hydroxyquinolins
mit typischem Fragmentierungsmuster
40
Abbildung 3-1 Ausschnitt aus dem Pyrimidin-Stoffwechselwegs 46
Abbildung 3-2 Dünnschitchromatographie von HAQ-Extrakten von Mutanten mit
Defekten im Pyrimidin oder Purin Stoffwechsel im Vergleich zur SCV
20265, die in LB, LB mit Uridine-5-Monophosphat, LB mit Inosine-5-
Monophosphat und LB mit Orotat angezogen wurden
47
Abbildung 3-3 A: Postulierter Biosyntheseweg von PQS: Kondensation von Anthranilat
und einer aktivierten β-keto Fettsäure zu PQS [Calfee et al., 2001]; B:
Mögliche Alternative der PQS Biosynthese in der Anthranilat und Orotat
als Vorstufen dienen.
48
Abbildung 3-4 A: Bei Fütterung mit markiertem Aspartat bleibt das MS
Fragmentionenmuster von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin unverändert mit
stärkstem Fragmention bei 231 m/z; B: Bei Fütterung mit markiertem
Anthranilat gibt es, entsprechend der Markierung, eine Verschiebung des
intensivsten Signals im Fragmentionenmuster von 2-Heptyl-4-
hydroxyquinolin um + 1 m/z auf 232 m/z
49
Abbildung 3-5 A: MS2 des 319 [m/z] Fragmentions von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin nach
Markierung mit [13C-1] Acetat; B: MS2 des 320 [m/z] Fragmentions von 2-
Heptyl-4-hydroxyquinolin nach Markierung mit [13C-2] Acetat
50
Abbildung 3-6 Vergleichende Dünnschichtchromatographie mit-HAQ Extrakten aus
verschiedenen Zeitpunkten von Kulturen der rhlG Mutante und dem PAO
Wildtyp
51
Abbildung 3-7 links: PAO1 Kultur in 10 ml BHI mit 40 µM PQS nach 12 h Wachstum mit
deutlicher Pyocyanin Grünfärbung verglichen zu der Kultur ohne PQS
(rechts)
52
Abbildung 3-8 Wachstumskurven von PAO1 mit unterschiedlichen PQS Konzentrationen 53
Abbildung 3-9 Relative Änderung der Transkription von rhlA und rhlR nach 5 h durch
PQS Zugabe
54
Abbildung 3-10 Schematische Abbildung der Fur abhängige Genregulation 55
III. ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 3-11 Eisenkonzentration im BHI Kulturen in Abhängigkeit von Zeit und
zugegebenen PQS oder 2,2-Bispyridyl
65
Abbildung 3-12 A: ESI des PQS/ Fe(III) Präzipitat B: MS2 des 831,50 m/z Signals [3 PQS-
2H+Fe]+; Das Fragmention zerfällt leicht unter Abspaltung eines PQS in
[2PQS-2H+Fe] C: MS2 des 572,32 [m / z] Signals [2PQS-2H+Fe]+. Vom
stabilen Komplex werden CH2 bzw. CH3 Gruppen der Heptyl Ketten der
PQS Moleküle abgespalten. Der Komplex mit Eisen bleibt dagegen stabil.
68
Abbildung 3-13 Relative rhlR Promotor Aktivität nach 4 h und 7 h von PAO1, PAO1 mit 40
µM PQS und PAO1 mit 500 µM 2,2-Bispyridyl; Die Regulation war nach 4
h bei den Kolben mit 2,2-Bispyridyl und nach 7 h bei den Kolben mit 40
µM PQS signifikant (T-Test p-value < 0,05)
69
Abbildung 3-14 PQS-DNA Interaktion im Computermodell 72
Abbildung 3-15 HHQ interagiert nicht mit der DNA 72
Abbildung 3-16 verstärkte DNA Fragmentierung durch Fe(II) und PQS 1:Smart Leiter 2
und 3: λ-DNA 4: λ-DNA mit PQS 5: λ-DNA mit HHQ 6: λ-DNA mit Fe(II)
7: λ-DNA mit Fe(II) und PQS 8: λ-DNA mit Fe(II) und HHQ
73
Abbildung 3-17 Vergleichende DNA Fragmentierungsmuster von PAO1 und pqsA Mutante
nach 4 und 5 Tagen 1:PAO1 4Tage; 2: pqsA Mutante 4 Tage; 3: PAO1 5
Tage; 4: pqsA Mutante 5 Tage
74
Abbildung 3-18 SCV 20265 TOTO-1 Färbung der extrazellulären DNA nach zwei Tagen 75
Abbildung 3-19 M1(pqsA negative Mutante) TOTO-1 Färbung der extrazellulären DNA
nach zwei Tagen
75
Abbildung 3-20 SCV live and dead Färbung nach einem Tag: rote Bakterien sind tot; grüne
Bakterien leben
76
Abbildung 3-21 M1 live and dead Färbung nach einem Tag: rote Bakterien sind tot; grüne
Bakterien leben
76
Abbildung 3-22 a: ursprünglicher Morphotyp, b: durchsichtiger Morphotyp, c: kleiner
Morphotyp (keine SCV)
77
Abbildung 4-1 Möglicher Komplex von PQS und Fe(III) 82
IV. TABELLENVERZEICHNIS
IV. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Die fünf rRNA Ähnlichkeitsgruppen von Pseudomonas mit den zugehörigen Arten 8
Tabelle 2 Primer Sequenzen für die Realtime PCR 34
Tabelle 3 Liste der gefundenen HAQ negativen Mutanten: PA Nummern und Gen Namen von
www.pseudomonas.com
45
Tabelle 4 PQS-regulierte Gene, die in mindestes einer von zwei Transkriptionsstudien als
eisenabhängig reguliert identifiziert wurden [Ochsner et al., 2002; Palma et al.,
2003]
56
Tabelle 5 PQS-regulierte Gene, die in mindestens einer von zwei Transkriptionsstudien als
durch oxidativen Stress reguliert identifiziert wurden [Palma et al., 2004; Salunkhe
et al., 2005]
58
Tabelle 6 Durch PQS regulierte Gene, die auch in der Transkriptionsstudie einer mvfR
negativen Mutante reguliert erschienen [Deziel et al., 2005]
60
Tabelle 7 PQS-regulierte Gene, die weder in Transkriptionsstudien unter Eisenmangel, H2O2
Stress noch in einer mvfR negativen Mutante als differentiell reguliert identifiziert
wurden
62
Tabelle 8 Vergleich von zuvor in verschiedener Transkriptomstudien als reguliert
identifizierten Genen, mit den Genen, die in dieser Studie als durch PQS reguliert
identifiziert wurden
64
1. EINLEITUNG
- 7 -
1. Einleitung
1.1. Taxonomie von Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonaden wurde erstmals 1894 von Migula als eine phylogenetisch sehr heterogene
Gruppe gram-negativer Stäbchen mit polarer Begeißlung beschrieben. Nachdem sich in
den 30er Jahren eine Einteilung der Bakterien in Europa nach morphologischen Kriterien
und eine physiologische Taxonomie in den USA durchgesetzt hatten, wurden 1960 bis zu
60 Arten in die Gattung Pseudomonas eingeordnet. Erst die Einführung von DNA-DNA
und rRNA-DNA
Hybridisierungen brachte
weitere Fortschritte. Durch
die Möglichkeit der
Sequenzierung von DNA
[Fox et al., 1980] und der
Verwendung der gesamten
Sequenz von 16S rRNA als
phylogenetischer Marker
[Woese et al., 1985] ist es
heute möglich,
Pseudomonas
verwandtschaftlich korrekt
zu typisieren. Es gibt fünf
rRNA Homologie Gruppen
(siehe Abbildung 1-1 und
Tabelle 1). Heute wird P.
aeruginosa in die große
phylogenetische Gruppe der Proteobacteria, genauer in die Subgruppe der γ-Proteobacteria
und da in die Ordnung Pseudomonadales und in die Familie der Pseudomonadaceae
Abbildung 1-1: Pseudomonas Arten in rRNA Gruppen aufgeteilt.
(Abbildung aus [Bergey et al., 1989]
1. EINLEITUNG
- 8 -
eingeordnet. Es gehören nur noch 17 Arten zur eigentlichen Gattung Pseudomonas (rRNA
Gruppe I). Darunter befinden sich die fluoreszierenden Pseudomonaden wie P. flourescens
und P. aeruginosa, sowie pflanzenpathogene Arten wie P. syringae (pv. tomato DC3000,
6,4 MBp), P. cichorii, P. putida (KT2440, 6,18 MBp) und die nicht fluoreszierenden Arten
P. stutzeri und P. mendocina. In der rRNA Gruppe II finden sich Pathogene wie
Burkholderia cepatia, B. pseudomallei und B. mallei.
Tabelle 1: Die fünf rRNA Ähnlichkeitsgruppen von Pseudomonas mit den zugehörigen Arten
RNA
Gruppe Arten
I
Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. chlororaphis, P.
syringae, P. stutzeri, P. mendocina, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes,
P. agarici, P. angulata, P. fragi, P. synxantha, P. taetrolens, P. mucidolens,
P. oleovorans, P. resinovorans
II
Burkholderia cepacia, B. gladioli, B. caryophylli, B. pseudomallei, B.
mallei, Ralstonia solanacearum, R. pickettii, B. pyrrocinia, B.
andropogonis
III
Delftia acidovorans, Comamonas testosteroni, P. saccharophila,
Acidovorax facilis, A. delafieldii, P. alboprecipitans, Hydrogenophaga
palleronii
IV Brevundimonas diminuta, B. vesicularis
V Stenotrophomonas spp. incl. S. maltophilia, P. geniculata, P. gardneri
1. EINLEITUNG
- 9 -
1.2. Allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa ist ein gram-negatives, stabförmiges Bakterium von 1,5 – 3,0
µm Länge und 0,5 – 0,8 µm Breite und mit einer polaren Geißel beweglich. Neben der
Fähigkeit, eine Vielzahl an Kohlenstoffquellen aerob zu verstoffwechseln, kann P.
aeruginosa anaerob wachsen, indem nicht fermentativ NO3 und NO2 anstelle von O2 als
teminale Elektronen Akzeptoren für die Atmung genutzt werden (Denitrifikation). Arginin
kann für die Aufrechterhaltung der biologischen Systeme und damit für das
Langzeitüberleben der Bakterien unter anaeroben Bedingungen über eine Pyruvat Gährung
verstoffwechselt werden [Eschbach et al., 2004]. P. aeruginosa ist sehr anpassungsfähig
und kommt ubiquitär in wässrigen Habitaten und im Boden vor [Spiers et al., 2000]. Die
Genomgröße des sequenzierten Stamms PAO1 beträgt 6,26 MBp und teilt sich in 5570
mögliche offene Leserahmen auf [Stover et al., 2000]. Damit befindet sich das Genom in
der Größenordnung von einzelligen Hefen. Über 9 % der möglichen Leserahmen von P.
aeruginosa codieren für beschriebene oder vorhergesagte transkriptionelle Regulatoren
oder 2-Komponenten Systeme [Stover et al., 2000]. Das könnte ein Hinweis auf die große
Anpassungsfähigkeit von P. aeruginosa an unterschiedlichste Umweltbedingungen sein.
1.3. P. aeruginosa: ein bedeutsamer opportunistischer
Krankheitserreger
P. aeruginosa ist ein opportunistisches Bakterium und verfügt über ein sehr breites
Wirtsspektrum, zu dem Pflanzen, Tiere und Menschen zählen [Chastre und Fagon, 2002;
Hutchison und Govan, 1999; Lyczak et al., 2000]. Besonders kritisch sind P. aeruginosa
Infektionen im Krankenhausbereich. Die Bakterien können durch direkten
Patientenkontakt oder über unzureichend sterilisierte Materialien und das Pflegepersonal
übertragen werden. Zur Ausbildung von schweren Krankheitsverläufen beim Menschen
kommt es nach einer Infektion bei Mukoviszidose (Cystische Fibrose; CF) Patienten und
1. EINLEITUNG
- 10 -
bei immunsuprimierten Menschen, wie z.B. Transplantationspatienten,
Verbrennungsopfern oder Personen mit AIDS.
16 % aller nosokomialen Pneumonien gehen auf P. aeruginosa Infektionen zurück [Wiblin
und Wenzel, 1996]. Ein besonderes Risiko für eine Infektion stellt eine Beatmung der
Patienten dar. Die Ansteckungsgefahr nimmt mit der Dauer des Krankenhausaufenthalts zu
und die Mortalitätsrate ist, bei durch P. aeruginosa hervorgerufenen Pneumonien,
besonders hoch. Neben Pneumonien sind Harnwegsinfekte bei katheterisierten Patienten,
Wundinfektionen (besonders bei Brandwunden) und Infektionen der verletzten Kornea
häufig und können Ausgangspunkt für eine Sepsis sein. Auch hier ist die Mortalitätsrate
besonders hoch: bei AIDS Patienten enden 50 % der P. aeruginosa Septikämien tödlich
[Mendelson et al., 1994] und bei P. aeruginosa Infektionen von Verbrennungsopfern steigt
die Mortalitätsrate auf 60 % [Richard et al., 1994].
Eine besondere Bedeutung hat die P. aeruginosa Infektion für CF Patienten. Die CF wird
durch einen autosomal rezessiv vererbten Gendefekt hervorgerufen, bei dem das Gen,
welches für den CFTR Rezeptor kodiert (cystic fibrosis transmenbrane conductance
regulator), eine Mutation trägt, die zu einer fehlerhaften Chloridsekretion der Epithelien
führt. Dadurch sekretieren alle exokrinen Drüsen ein sehr zähflüssiges und wasserarmes
Sekret. Während früher die gastrointestinale Beteiligung (z.B. Pankreasinsuffizienz) im
Vordergrund stand, ist die CF heute vornehmlich eine Lungenerkrankung. Durch die
Bildung des schleimigen Sekrets in der Lunge von CF Patienten können Krankheitserreger
nicht ausreichend abtransportiert werden. In frühen Lebensjahren werden die Lungen der
CF-Patienten mit Keimen wie Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae und
Streptococcus pneumoniae besiedelt, die zwar akute Infektionen auslösen, die aber mit
Hilfe der heutigen Antibiotikatherapien effektiv therapiert werden können. Im späteren
Verlauf dominieren P. aeruginosa und B. cepacia als Ursache von Pneumonien. P.
aeruginosa stellt insgesamt den häufigsten Erreger bei chronisch infizierten CF Patienten
dar und ist die Ursache von schweren Lungenentzündungen. Diese Infektionen sind sehr
schwerwiegend, können durch Antibiotika nicht erfolgreich behandelt werden, und führen
in über 90 % der Fälle zum Tod. Ein Hauptgrund für die Persistenz von P. aeruginosa ist -
1. EINLEITUNG
- 11 -
neben der Produktion einer Vielzahl von Virulenzfaktoren - die Fähigkeit, in der Lunge so
genannte Biofilme auszubilden [Singh et al., 2000; Yoon et al., 2002]. Innerhalb dieser
dreidimensionalen und hochgradig organisierten Strukturen sind die Bakterien eingebettet
in eine extrazelluläre Matrix aus Alginat und DNA [Whitchurch et al., 2002], die einen
wirkungsvollen Schutz vor Antibiotika [Hentzer et al., 2001; Mah et al., 2003; Mah und
O'Toole, 2001] und vor Angriffen der Zellen des Immunsystems bietet [Pier et al., 2001].
Bakterien, die in Biofilmen wachsen, zeigen eine um den Faktor 100 - 1000 höhere
Antibiotika Resistenz im Vergleich zu planktonisch wachsenden Erregern. Eine Therapie
mit Antibiotika führt daher bei chronisch infizierten CF Patienten in der Regel nur zu einer
Reduktion der Keimzahl und nicht zu einer vollständigen Eradizierung der Bakterien.
Deshalb ist heute die Nachfrage nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten von
chronischen Infektionen sehr hoch.
P. aeruginosa passt sich während des Infektionsverlaufs gut an heterogene Habitate an und
belegt verschiedene Nischen [Oliver et al., 2000]. Mit fortlaufender Infektionsdauer
können aus einer bronchoalveolären Lavage verschiedene Varianten eines Klons isoliert
werden [Romling et al., 1994], die sich unter anderem in Ihrer Koloniemorphologie
unterscheiden .
Neben dem normalen Typ
können insbesondere der
mucoide Typ, der
aufgrund vermehrter
Alginat-Produktion
schleimige Kolonien
ausbildet, und
Mikrokolonie-Bildner
(small colony variants;
SCV) isoliert werden
(Abbildung 1-2). Für
SCVs konnte gezeigt
Abbildung 1-2: Diversität von P. aeruginosa a: Mucoider Typ
b: SCV; c: „normaler Phänotyp“
1. EINLEITUNG
- 12 -
werden, dass das Auftreten im Patienten mit einem schlechterem Algemeinzustand und
schlechteren Lungenfunktionsparametern korreliert [Haussler et al., 1999]. Die
morphologische Varianz finden wir nicht nur typischerweise im Respirationstrakt von
chronisch infizierten CF Patienten, sondern auch in in vitro Biofilm Kulturen [Boles et al.,
2004]. Der Mechanismus der morphologischen Varianz wird kontrovers diskutiert. Eine
Phasenvariation ist als Ursache postuliert worden [Drenkard und Ausubel, 2002; Dybvig,
1993], aber auch Mutation und Selektion kommen als Auslöser für die phänotypische
Variation in Frage [McLean et al., 2004; Rainey, 1999; Rainey und Cooper, 2004; Spiers
et al., 2000]. Varianz kann durch Hypermutator Stämme beschleunigt werden [Macia et
al., 2005; Oliver et al., 2000]. Auch eine stressabhängige, fehlerbehaftete DNA
Doppelstrang Reparatur durch homologe Rekombination wurde in E. coli als möglicher
Motor der Evolution postuliert [Ponder et al., 2005].
1.4. Pseudomonas aeruginosa Virulenz Faktoren
Pathogene Bakterien zeichnen sich dadurch aus, dass sie in geeigneten Wirten in der Lage
sind, Krankheiten hervorzurufen. Ein Maß der Pathogenität ist die Virulenz eines
Bakteriums. Zu den Virulenzfaktoren zählen z.B. hydrolytische Proteine, Toxine und
Oberflächen Proteine, die das Anhaften der Bakterien an Oberflächen erlauben oder sie
schützen.
Pseudomonas aeruginosa verfügt über eine Vielzahl an Virulenzfaktoren, die vorwiegend
unter der Kontrolle der Quorum Sensing (QS) Systeme stehen (siehe dazu unter 1.5.) und
zum größten Teil über drei verschiedene Sekretionssysteme sekretiert werden.
Im Typ I Sektretionssystem von P. aeruginosa werden z.B. alkalische Proteasen (aprA)
über ABC-Transporter sekretiert. Diese spalten extrazellulär eine große Bandbreite an
Substraten, darunter Zytokine wie IL-1, IL-2, IFN-γ, TNF, Immunoglobuline und
Komplementsystem-Bestandteile [Suter, 1994]. Es handelt sich um ein Protein mit zwei
Domänen, die beide ca. 230 Aminosäuren lang sind. Der N-Terminale Teil ist die
1. EINLEITUNG
- 13 -
katalytische Domäne, und der C-Terminus wird als Transportsignal für das Typ I
Sekretionssystem gebraucht, der das Protein durch das Periplasma in den extrazellulären
Raum sezerniert [Baumann et al., 1993].
Das Typ II Sekretionssystem ist vom Sec Translokationsapparat abhängig. Exotoxin A
wird mittels Typ II Sekretion transportiert und inhibiert in der Wirtszelle die
Proteinbiosynthese, indem der Elongationsfaktor-2 durch eine ADP-Ribolysierung
inaktiviert wird [Armstrong et al., 2002; Wedekind et al., 2001; Yates und Merrill, 2001;
Yates und Merrill, 2004]. Dieser Mechanismus ist identisch mit dem des Corynebacterium
diphtheriae Toxins. LasA (lasA) [Kessler et al., 1993; Kessler et al., 1998] und LasB
(lasB) sind Elastasen, die ebenfalls über das Typ II System sekretiert werden und die beide
ähnliche proteolytische Eigenschaften haben. Sie spalten z.B. Elastin, Kollagen,
Transferrin, Immunglobuline, sowie einige Bestandteile des Komplementsystems und
verursachen damit Gewebeschäden.
Über das Typ III Sekretionssystem werden ein oder mehrere der P. aeruginosa
Effektormoleküle (ExoS, ExoT, ExoU und ExoY) bei Zellkontakt durch einen Kanal direkt
in die Wirtstelle injiziert. Exoenzym S (exoS) und Exoenzym T (exoT) sind in der Struktur
homolog [Garrity-Ryan et al., 2000; Garrity-Ryan et al., 2004; Geiser et al., 2001]. Sie
verhindern über die Aktivierung der GTPase Aktivität von Rho, Cdc42 und Rac die
Phagozytose der Bakterien durch Makrophagen [Goehring et al., 1999]. Neben dieser GAP
Aktivität (GTPase Activating Protein) werden zwei Adapter Proteine (Crk-1 und Crk-2),
die Src homologe 2-3 Domänen besitzen und an der Signaltransduktion für lokale
Anheftung und Phagozytose beteiligt sind, durch eine ADP-Ribosyltransferase Aktivität
inaktiviert [Ganesan et al., 1998; Ganesan et al., 1999; Riese et al., 2002]. Diese Aktivität
ist bei dem Exoenzym S vom wirtseigenen 14-3-3 Protein FAS abhängig [Coburn et al.,
1991; Fu et al., 1993]. Bei dem Exoenzym U (exoU) handelt es sich um eine
Phospholipase, die die Membranen der Wirtszellen schädigten. Exoenzym Y (exoY) wird
ebenfalls über das Typ III System sekretiert und beeinflusst über eine Adenylatzyklase-
Aktivität wahrscheinlich den intrazellulären Spiegel an cAMP in den Wirtszellen [Yahr et
al., 1998].
1. EINLEITUNG
- 14 -
P. aeruginosa produziert darüber hinaus eine Phospholipase C (PLC) (plcH), die auf der
Oberfläche der Alveolar-Zellen die Phospholipide degradiert. Die Phospholipide sind dafür
verantwortlich, dass die Oberflächenspannung herab gesetzt wird, so dass die Alveolen
nicht beim Atmen kollabieren [Songer, 1997; Terada et al., 1999]. Die Zugänglichkeit der
Phospholipide wird durch ein weiteres Exoprodukt von P. aeruginosa, den Rhamnolipiden,
erhöht. Diese tensidisch wirkenden Moleküle werden aus Thymidine-diphospho-L-
Rhamnose und Produkten der Fettsäure-Biosynthese gebildet und sind ein
Hauptvirulenzfaktor von P. aeruginosa.
Die Anheftung an Oberflächen stellt eine weitere und sehr wichtige Eigenschaft von P.
aeruginosa dar, die zur erhöhten Virulenz beiträgt. Flagellen sind dabei notwendig, um
einen Zielort durch Schwimmen zu erreichen. 30 Genprodukte sind an der Ausbildung und
Funktion von Flagellen beteiligt [Adamo et al., 2004; Feldman et al., 1998]. Typ IV Pili
sind für die Anheftung an Oberflächen (z.B. Wirtszell Epithelien) und für das Bewegen auf
ihnen verantwortlich. P. aeruginosa bildet außerdem zwei Lipopolysaccharid-Formen aus,
wobei die A-Form ein Homopolymer aus α verknüpften D-Rhamnose Molekülen ist,
während die B-Form des LPS ein Heteropolymer ist. LPS Moleküle scheinen an CFTR
Proteine zu binden [Lyczak et al., 2000; Schroeder et al., 2002].
Ein weiterer wichtiger Virulenzfaktor, und Bestandteil des Biofilms in der CF Lunge, ist
Alginat. Es ist ein Polymer aus β-D-Mannuronsäure und α-L-Guluronsäure, die β -1,4
glykosidisch verknüpft sind. Alginat schützt die Bakterien vor Phagozytose [Pier et al.,
2001].
Eisen ist ein unverzichtbarer Kofaktor für Cytochrome und Eisen-Schwefel-Proteine der
Bakterien und wird in mikromolaren Konzentrationen benötigt. In wässrigen und aeroben
Habitaten liegt die Konzentration von freiem Fe(III) nur bei ca. 10-9 M bei pH 7.0. Im Wirt
dagegen steht nur noch Fe(III) in der Konzentration 10-18 M ungebunden zur Verfügung. P.
aeruginosa verfügt über zwei Siderophore zur Eisenaufnahme. Pyochelin bindet Fe(III)
und ist eine Substanz mit verhältnismäßig niedriger Affinität zum Eisen (5 X 105 M-1). Es
ist ein Produkt aus Salicyl-Säure und zwei Cysteinyl-Resten. Pyochelin bindet Fe(III) in
einer Stoichometrie von 2:1. P. aeruginosa exprimiert den Rezeptor FptA, der für den
1. EINLEITUNG
- 15 -
Transport von Eisen gebundenem Pyochelin ins Periplasma gebraucht wird [Ankenbauer et
al., 1985; Ankenbauer et al., 1988; Ankenbauer und Quan, 1994; DeWitte et al., 2001]. Im
Unterschied zu E. coli werden die eisengebundenen Siderophore bei P. aeruginosa nicht
ins Zytoplasma transportiert [Poole und McKay, 2003]. Pyochelin vermag auch Mo(IV)
und Co(II) zu binden.
Pyoverdin hat eine höhere Affinität zu Fe(III), als Pyochelin. Es ist ein Di-
Hydroxyquinolon, an das mit einer nicht ribosomalen Peptid-Synthase Aminosäuren
angehängt werden. Die Sequenz dieses Restes kann variieren. Dieses Siderophor hat eine
für P. aeruginosa typische grün-gelbe Farbe. Es bindet Fe(III) in einer Stoichometrie von
1:1 und wird über den spezifischen Rezeptor FpvA erkannt und transportiert [Meyer et al.,
1996; Shen et al., 2002]. Der alternative Sigmafaktor PvdS wird über das Eisen reguliert
und steuert die Synthese und den Transport von Eisen in die Bakterien [Poole und McKay,
2003]. Beide beschriebenen Siderophore können Eisen von Transferrin lösen [Xiao und
Kisaalita, 1997].
Pyocyanin ist das Pigment von P. aeruginosa, welches den Kulturen die charakteristische
blau-grüne Farbe verleiht. Es handelt sich hierbei um einen modifizierten Phenanzin-Ring.
Pyocyanin ist Teil eines Redox-Systems. Es kann offensichtlich Elektronen aus der
Atmungskette aufnehmen und sie auf Sauerstoff oder auf Fe(III) übertragen. Wenn das
Pyocyanin Elektronen aus der Atmungskette aufgenommen hat, wird es farblos. Man
spricht dann von Leukopyocyanin. Auf diese Weise kann z.B. Fe(III) von Transferrin
abgelöst werden [Cox, 1986]. Bei der Reduktion entstehen reaktive Spezies wie
Wasserstoffperoxid und Superoxid, die negativen Einfluss auf den Wirt haben und kritisch
für die Aufrechterhaltung der Infektion durch P. aeruginosa, z.B. in Mäuselungen, ist [Lau
et al., 2004; Ran et al., 2003].
1. EINLEITUNG
- 16 -
1.5. Quorum Sensing
1.5.1. Überblick
Ein Hauptunterschied zwischen eukaryotischen und prokaryotischen Lebewesen ist, dass
nur eukaryotische Zellen multizelluläre Organismen, und damit höhere Lebensformen,
ausbilden können. Das erfordert ein streng reguliertes Wachstumsverhalten der beteiligten
Zellen und oft auch eine Spezialisierung und Aufgabeteilung. Dazu ist eine
Kommunikation zwischen den Zellen notwendig. Diese Kommunikation wird mit Hilfe
von niedermolekularen Signalmolekülen, Hormonen, geführt. Wenn diese Verbindung
zwischen den Zellen abreißt, kann es dazu kommen, dass sich diese Zellen ungehemmt
teilen und dem gesamten Organismus schaden oder sogar seinen Tod zur Folge haben.
Abbildung 1-3: Schema der Virulenzfaktor-Produktion von P. aeruginosa und deren Lokalisation
aus [van Delden und Iglewski, 1998]
1. EINLEITUNG
- 17 -
Seit ca. 30 Jahren wird bei immer mehr Bakterienarten ein koordiniertes Verhalten
beobachtet, welches seit 1994 Quorum Sensing genannt wird [Fuqua et al., 1994]. Dabei
produzieren und sezernieren die Bakterien Signalmoleküle (Autoinducer), die, wenn eine
kritische Konzentration erreicht ist, einen transkriptionellen Regulator aktivieren. Auf
diese Weise können innerhalb einer Population zelldichteabhängig Gene reguliert werden.
QS ist bei gram-positiven und gram-negativen Bakterien beschrieben worden. Bei gram-
positiven Spezies, wie beispielsweise Staphylococcus aureus, werden artspezifische,
modifizierte Oligopeptide als Signale für zwei Komponenten Systeme verwendet. Die
Peptide akkumulieren in der Umgebung und werden als Signal für die Populationsdichte
über eine membrangebundene Histidin-Kinase erkannt, welche das Signal an einen
traskriptionellen Regulator (Respose Regulator) weiterleitet [Kleerebezem et al., 1997;
Kleerebezem und Quadri, 2001]. Besser untersucht wurde QS bei gram-negativen
Bakterien. Bei den meisten gram-negativen Arten, die QS Systeme haben, werden Alkyl-
Homoserinlaktone (AHL) als Signalmoleküle sezerniert. Dabei variieren die Moleküle in
Alkylkettenlänge und Substituenten bei den unterschiedlichen Arten [Miller und Bassler,
2001]. Für den Autoinducer-2 wurde gezeigt, dass er sowohl von gram-positiven, als auch
von gram-negativen Spezies gebildet und erkannt wird. Es wird deshalb vermutet, dass es
sich hierbei um ein Signalmolekül für universelle bakterielle Kommunikation handelt, ein
„Esperanto der Bakterien“ [Winans, 2002].
Quorum Sensing wurde zuerst bei dem
marinen Bakterium Vibrio fischeri
entdeckt, welches in den Leuchtorganen
der Tintenfischart Euprymna scolopes
lebt. Die Autoinducer Synthase LuxI
produziert ein N-3-(oxohexanonyl)
Homoserinlakton. Wenn die bakterielle
Population, und damit die Autoinducer,
eine bestimmte Konzentration erreicht
haben, binden diese AHL Moleküle
Abbildung 1-4: QS-System von Vibrio fischeri aus
[Miller und Bassler, 2001]
1. EINLEITUNG
- 18 -
intrazellulär an das LuxR Protein und aktivieren die transkriptionelle Aktivität des lux
Operons. Ein Teil des Operons ist auch das luxI Gen, so dass eine Autoinduktion der AHL
Produktion stattfindet (Abbildung 1-4). Bei sehr vielen gram-negativen Bakterien sind
LuxI/R QS-Systeme beschrieben worden.
P. aeruginosa besitzt zwei LuxI/R homologe QS-Systeme, die hierarchisch angeordnet
sind (Abbildung 1-5). Das Las-System dominiert dabei über das Rhl-System. Wenn in der
logarithmischen Phase das Las System aktiviert wird, produziert LasI ein N-(3-
oxododecanoyl) Homoserinlakton (3-O12 HSL; PAI-1) [Pearson et al., 1994]. Wenn ein
bestimmter Schwellwert erreicht wird, bindet der PAI-1 an LasR und aktiviert damit die
Transkription des LasR-Regulons [Gambello und Iglewski, 1991; Passador et al., 1993;
Passador et al., 1996; Pearson et al., 1997; Toder et al., 1991]. Neben Elastase, Alginat
und Biofilmbildung wird auch die Synthese des Pseudomonas Quinolon Signals (PQS) und
RhlI induziert. RhlI produziert den Rhl-System spezifischen Autoinducer Butyryl
Homoserinlakton (C4-HSL; PAI-2) [Pearson et al., 1995].
Dieser wiederum aktiviert durch seine Bindung an den transkriptionellen Aktivator RhlR
das Rhl-QS-Regulon. Unter der Kontrolle des Rhl-Systems stehen z.B. Virulenzfaktoren
wie Rhamnolipide, Pyocyanin und alkalische Proteasen [Pearson et al., 1997].
Die Regulation der QS abhängigen Gene ist ein sehr filigranes System, wobei nicht nur die
aktivierten Regulatoren des jeweiligen Systems, sondern auch andere abiotische Faktoren,
eine Rolle spielen können (z.B. Eisen und Sauerstoffgehalt)[Bollinger et al., 2001; Pearson
et al., 1997]. Des Weiteren gibt es Virulenzfaktoren, die von beiden QS Systemen aktiviert
werden (z.B. LasB), wogegen andere nur unter der Kontrolle von einem speziellen
Regulator stehen.
1. EINLEITUNG
- 19 -
1.6. Pseudomonas Quinolon Signal (PQS)
Neben den beschriebenen und sehr gut charakterisierten Autoinducer-Molekülen der
beiden QS Systeme Las und Rhl, wurde 1999 von Pesci et al. ein drittes Signal-Molekül
identifiziert, welches mit den QS Systemen interagiert [Pesci et al., 1999]. Dieses Molekül
unterscheidet sich strukturell von den AHL. Es handelt sich um ein 2-Heptyl-3-hydroxy-4-
qiunolon [Pesci et al., 1999] und gehört zu der Gruppe der 4-Hydroxy-2-alkylquinolinen
(HAQs) (Abbildung 1-6) [Deziel et al., 2004].
Abbildung 1-5: Schematische Darstellung der hierarchisch aufgebauten QS-Systeme von P.
aeruginosa (Las und Rhl) und der Interaktion mit PQS (Mitte) aus [McKnight et al., 2000]
1. EINLEITUNG
- 20 -
Die Strukturen unterscheiden sich durch
Substituenten am heterozyklischen Ringsystem
oder in der Alkylkettenlänge.
PQS wird in der späten logarithmischen Phase
gebildet [McKnight et al., 2000]. Die
Biosynthese von HAQs - wie PQS und der
biologisch inaktiven Vorstufe 2-Heptyl-4-
hydroxyquinolin (HHQ) - wird durch das
LasIR-QS System reguliert [McKnight et al.,
2000]. Weiterhin konnte mit Promotor-lacZ-
Fusionsstudien gezeigt werden, dass PQS
positiv auf die Transkription von rhlI und in
geringerem Maße auf lasR und rhlR wirkt
[McKnight et al., 2000]. Andere HAQs (2-
Heptyl-4-quinolon-N-Oxid und 2-Hydroxy-3-
heptyl-4-qionolon) wiesen diese Aktivität nicht auf [Pesci et al., 1999].
Da PQS erst in späten Wachstumsphasen gebildet wird, wurde diskutiert, dass PQS nicht
direkt für die Wahrnehmung der Zelldichte verantwortlich ist, sondern vielmehr für die
Modulation des Rhl-QS-Systems in der stationären Phase [McKnight et al., 2000].
Offensichtlich sind die Enzyme des Operons PA0996 – PA1000 (pqsA-E) für die
Biosynthese des PQS Moleküls verantwortlich. Auch die Produkte der Genloci PA1001 –
PA1003 (phnAB und pqsR(mvfR)), sowie PA2587 (pqsH) sind an der Synthese und der
Aktivität beteiligt [Diggle et al., 2003; Gallagher et al., 2002]. Scheinbar werden 4-
Hydroxy-2-heptylquinolin Moleküle (HHQs) in Abhängigkeit von PqsA-D synthetisiert,
aber nur PQS induziert das Rhl-QS-System. Dabei scheint PqsH für die Konversion von
HHQs zu PQS verantwortlich zu sein (Abbildung 1-7) [Deziel et al., 2004].
Abbildung 1-6: a: 2-Heptyl-3,4-
dihydroxyquinolin (PQS) b: 2-Heptyl-4-
hydroxyquinolin (HHQ) c: 2-Heptyl-4-
hydroxyquinolin-N-oxid
1. EINLEITUNG
- 21 -
1.7. Zielsetzung
Das Ziel dieser Arbeit war es, den Biosyntheseweg des neuen und sehr interessanten P.
aeruginosa Signal Moleküls PQS aufzuklären, und den molekularen Mechanismus der
Wirkung von PQS auf P. aeruginosa zu untersuchen.
Abbildung 1-7: Postulierter Biosyntheseweg von HAQs und PQS in P. aeruginosa [Deziel et al., 2004; Firoved und Deretic, 2003; Frisk et al., 2004]
2. MATERIAL UND METHODEN
- 22 -
10 x Puffer
10,5 g Citrat x H2O
29,3 g NaNH5PO4 x 4 H2O
42,2 g K2HPO4 x 3 H2O
ad 500 ml Wasser bidest., pH 7,2
2. Material und Methoden
2.1. Nährmedien
Die Anzucht der Stämme von P. aeruginosa fand entweder in Minimal oder in
Vollmedium statt. Zur Herstellung fester Nährmedien wurde vor dem Autoklavieren, Agar
in Konzentrationen von 0,3 – 1,5 % (w/v) zugegeben. Antibiotika wurden in der benötigten
Menge zum erkalteten Medium bzw. zum 45 °C warmen Festmedium gegeben und gut
gemischt.
2.1.1. Vogel-Bonner Minimalmedium
Als Minimalmedium wurde modifiziertes Vogel-Bonner Medium verwendet [Vogel und
Bonner, 1956]. Das Medium wurde aus konzentrierten Stammlösungen frisch vor dem
Gebrauch angesetzt.
Die Pufferstammlösung und die Gluconat-Lösung wurden sterilfiltriert. Gebrauchsfertiges
Vogel-Bonner Minimalmedium wurde durch Vermischung der Stammlösungen
entsprechend ihrer Konzentrationen angesetzt, mit Wasser bidest. aufgefüllt und bei 4 °C
aufbewahrt. Für die Durchführung von Markierungsexperimenten wurde das Gluconat als
Kohlenstoffquelle teilweise durch das jeweilige markierte Substrat ersetzt.
50 x Magnesiumsulfat
4,1 g MgSO4 x 7 H2O
ad 100 ml H2O bidest., steril filtriert
5 x Gluconat-Lösung
62,5 g Kalium- D- Gluconat
ad 250 ml H2O bidest., steril filtriert
2. MATERIAL UND METHODEN
- 23 -
2.1.2. Luria Bertani Medium (LB)
Das LB Medium wurde als Standardmedium für die Anzucht von P. aeruginosa und E.
coli verwendet.
2.1.3. Brain Heart Infusion Medium (BHI)(BD-Diagnostic Systems)
Das BHI Medium wurde für die Array-Versuche benutzt, weil die PQS induzierte
Pyocyanin Produktion hier besonders deutlich zu sehen war.
2.1.4. Columbia-Blut-Agar (Becton Dickinson)
Die Columbia-Blut-Agarplatten wurden zur Anzucht von P. aeruginosa als Alternative
zum LB-Agar verwendet. Auf Columbia-Blut-Agar kann besonders gut der für P.
aeruginosa typische, metallische Glanz und die Hämolyse beobachtet werden.
LB-Medium
10 g Bacto Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
2. MATERIAL UND METHODEN
- 24 -
2.2. Anzucht, Stammerhaltung und Entsorgung von Bakterien
Die in dieser Arbeit verwendeten Stämme wurden, wenn nicht anders beschrieben, auf 1,5
% LB-Agarplatten kultiviert. Bei Bedarf wurde der LB-Agar mit entsprechenden
Antibiotika Konzentrationen versetzt. Oft verwendete Stämme wurden auf Agarplatten bis
zu zwei Wochen bei 4°C aufbewahrt. Häufiges Passagieren eines Stamms über mehrere
Agarplatten wurde vermieden. Von den Agarplatten konnten Vorkulturen in
Flüssigmedium angeimpft werden. Von diesen Übernachtkulturen wurden Hauptkulturen
mit einer OD600 von 0,05 angeimpft. Für die dauerhafte Lagerung von Bakterienstämmen
wurden Glycerin-Dauerkulturen in sterilen 1,5 ml Schraubdeckelgefäßen angelegt. Dazu
wurden fünf ml LB-Medium in einem sterilen Röhrchen mit einer vereinzelten Kolonie
inokuliert und über Nacht bei 37°C und 180 upm inkubiert. Bei Bedarf wurde dem
Medium Antibiotikum zugefügt. 500 µl Kultur wurden mit 500 µl sterilem Glycerin in den
Schraubdeckelgefäßen gemischt und sofort in flüssigen Stickstoff gegeben. Die Lagerung
erfolgte bei –70 °C. Dauerkulturen wurden aufgetaut, indem 10 µl der Kulturen auf
geeigneten Agarplatten ausplattiert und bei 37 °C inkubiert wurden.
Nicht mehr benötigte beimpfte Medien, Agarplatten und Dauerkulturen wurden bei 121 °C
für 30 Minuten autoklaviert und entsorgt.
2. MATERIAL UND METHODEN
- 25 -
2.3. DNA Arbeitstechniken
2.3.1. Isolierung chromosomaler DNA
Chromosomale DNA wurde aus Bakterien, mit Hilfe des DNA Tissue Kit von Qiagen,
nach Herstellerangaben isoliert. Dazu wurde 1 ml aus einer 5 ml Übernachtkultur 5
Minuten bei 5000 upm zentrifugiert und das Pellet dreimal mit 1 ml H2O gewaschen.
Zwischen den Waschschritten, wurde jeweils 1 Minute bei 13000 upm zentrifugiert. Durch
das Waschen sollte möglichst viel extrazelluläre Matrix entfernt werden, die bei der
Aufreinigung der DNA stören könnte. Die Bakterien wurden mit einem Lysis-Puffer
aufgeschlossen und die DNA durch Zentrifugation auf einer Affinitätssäule gebunden.
Durch Waschen mit ethanolhaltigen Waschlösungen wurde die Reinheit der DNA auf der
Säule erhöht. Die Säule wurde kurz getrocknet und die DNA mit H2O eluiert. Die Qualität
der DNA wurde auf einem 1 % Agarosegel überprüft.
2.3.2. Isolierung von Plasmid DNA
Plasmid DNA wurde mit Hilfe des Plasmid Minipräparation oder Maxipräparation Kits
von Qiagen nach den Angaben des Herstellers isoliert. Die richtige Größe und Reinheit der
Plasmide wurde in Agarosegelen getestet, wobei die Plasmide zuvor mit einem geeigneten
Restriktionsenzym linearisiert wurden. Die Größe wurde anhand eines DNA
Längenstandards ermittelt.
2.3.3. Agarose-Gelelektrophorese
Agarose-Gelelektrophoresen wurde nach Sambrook et al. durchgeführt [Sambrook et al.,
1989]. Je nach aufzutrennender DNA Fragmentgrößen wurde eine Agarosekonzentration
im TAE Puffer von 1-2 % gewählt.
Als Längenstandards wurden die SmartLadder von Eurogentec und die GeneRuler 50 Bp
Leiter von MBI Fermentas verwendet.
2. MATERIAL UND METHODEN
- 26 -
2.3.4. Transposon Mutagenese
Elektrokompetente P. aeruginosa: Für die Herrstellung von elektrokompetenten P.
aeruginosa SCV 20265 wurden zwei LB-Agarplatten von einer frischen SCV 20265 Platte
beimpft. Eine Platte wurde bei 37 °C, und die zweite bei 42 °C, über Nacht inkubiert. Die
Bakterien wurden in einem 1,5 ml Gefäß in 1 ml H2O vereinigt und gut gemischt. 500 µl
der Bakteriensuspension wurden in ein neues 1,5 ml Gefäß überführt und mehrfach durch
Zentrifugation, Abnehmen des Überstandes und erneutes Zugeben von 500 µl H2O von
extrazellulärer Matrix getrennt. Das Pellet wurde in 20 µl H2O resuspendiert und ergab ein
Endvolumen von ca. 40µl.
Transposon Präparation: In das Transposon aus dem pMOD-3 Plasposons (Epicentre)
wurde eine Gentamycin-Resistenzkassette kloniert. Für die Mutagenese wurde das
Transposon aus einer Plasmidpräparation des pMOD-3 Plasposons mit dem
Restriktionsenzym PvuII 2 h bei 37 °C ausgeschnitten und über ein präparatives
Agarosegel aufgereinigt. Die Fragmentgröße betrug 1.276 Bp. Die DNA wurde in der
Speedvac auf eine Konzentration von ca. 160 ng/µl eingeengt.
Vorbereitung der Transposon DNA: 0,25 μl gelöste Transposon-DNA (ca. 160 ng/µl),
0,5 μl Transposase (1 U/µl) und 0,25 μl 100%iges Glyzerin wurden zusammen in ein 0,5
ml Mikroreagiergefäß vorsichtig gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
TAE
0,4 M Tris
0,01 M EDTA Na-Salz
0,2 M Acetat
2. MATERIAL UND METHODEN
- 27 -
Elektroporation: Die vorbereitete Transposon DNA wurde mit den kompetenten
Bakterien in einer neuen Elektroporationsküvette vorsichtig gemischt und 5 min auf Eis
inkubiert. Als Negativkontrolle wurde, anstelle des Transposonansatzes, H2O pipettiert.
Die Elektroporation erfolgte bei 2,5 kV und 200 Ω und 25 µF. Die Elektroporationsdauer
betrug ca. 5 ms.
Direkt nach der Elektroporation wurden die Bakterien in der Küvette mit 1 ml eiskaltem
LB-Medium resuspendiert und in ein 1,5 ml Gefäß überführt. Dieses wurde 1 h, bei 37 °C
und 180 upm, geschüttelt. Danach wurden 50 oder 100 µl der Bakteriensuspension auf LB-
Agar-Selektionsmedium (40 µg/ml Gentamycin) ausplattiert und bei 37 °C inkubiert.
2.3.5. Y-Linker Ligation
Um die Transposon-flankierende DNA-Sequenz effizient amplifizieren und sequenzieren
zu können, wurde die genomische DNA der Transposonmutante mit HAQ-negativem
Phenotyp mit dem Restriktionsenzym NlaIII geschnitten, wobei an den Schnittstellen
jeweils 4 Basenpaare lange, überhängende Enden entstanden. Der Restriktionsansatz von
50 μl wurde eine Stunde bei 37 °C inkubiert und anschließend 20 Minuten, bei 65 °C,
inaktiviert.
Zur Herstellung des Y-Linkers [Kwon und Ricke, 2000] wurden 9 μl Linker 1 (350 ng/μl)
und 9 μl Linker 2 (350 ng/μl) mit 11 μl H2O für 4 Minuten, bei 95 °C, erhitzt und
anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
Der Y-Linker dient als bekannte Sequenz, die neben der Transposon Sequenz als 2.
flankierende Bindestelle für PCR Primer die Grundlage für eine Amplifikation und damit
Sequenzierung der DNA Region darstellt, in die das Transposon inseriert ist. Dazu hat der
Y-Linker einen 4 Basen Überhang - komplementär zu NlaIII Schnittstellen - und kann an
jede NlaIII Schnittstelle ligiert werden. Der Linker 2 hat am 5´ Ende eine
Phosphorylierung. Am 5´ Ende des Y-Linkers befindet sich eine 19 Basen Sequenz, die
nicht doppelsträngig ist. Da der Linker PCR Primer nicht direkt an den Y-Linker binden
2. MATERIAL UND METHODEN
- 28 -
kann, sondern erst nach dem ersten PCR Zyklus eine passende DNA Grundlage geschaffen
wird, ist es die Amplifikation, trotz eines hohen Y-Linker Überschusses an sehr vielen
DNA Fragmenten, spezifisch für das Primer Paar Linker Primer/ Transposon Primer
(Abbildung 2-1).
Die Ligation wurde mit 5 µl verdauter, chromosomaler DNA und mit 5 µl Y-Linker in 20
µl Endvolumen über Nacht mit 40 U T4-Ligase bei Raumtemperatur durchgeführt. Der
Reaktionsansatz wurde auf 200 µl mit H2O aufgefüllt und bei –20 °C gelagert.
Die PCR Reaktion zur Amplifikation der unbekannten Sequenz, in die das Transposon
inserierte, wurde nach einem Standard PCR Protokoll durchgeführt. Dabei konnte der Y-
Abbildung 2-1: A: Y-Linker mit Linkerprimer. B: Der Linkerprimer kann erst nach dem ersten
Zyklus an die DNA Matrize binden, was unspezifischen PCR Fragmenten vorbeugt
2. MATERIAL UND METHODEN
- 29 -
Linker Primer in zwei Kombinationen mit unterschiedlichen Sequenzierprimern SqFP1
und SqRP1 eingesetzt werden.
Das PCR Produkt wurde mit Hilfe eines PCR
Aufreinigungs Kits von Nukleotiden und
anderen PCR Bestandteilen getrennt und im
Agarosegel auf Reinheit kontrolliert (Abbildung
2-2). Wenn die PCR eine definierte Bande
ergab, wurde das gereinigte Produkt zur
Sequenzierung an GATC-Biotech (Konstanz)
geschickt. Als Sequenzierprimer wurden die
gleichen Primer verwendet, die auch auf der
Transposonseite für die PCR eingesetzt wurden (SqFP1/SqRP1).
Die erhaltenen Sequenzen wurden auf die NlaIII Schnittstelle überprüft. Diese durfte nur
einmal pro Sequenz auftreten und sich 5´ von der Y-Linker Sequenz befinden. Mit der
Sequenz vor dieser Schnittstellensequenz konnte in der Pseudomonas aeruginosa
Datenbank nach Sequenzhomologien gesucht werden. Dazu wurden BLAST-N und
BLAST-X Suchalgorithmen verwendet.
Abbildung 2-2: Beispiel von verschiedenen
spezifischen Y-Linker PCR Produkten
Mastermix:
34,8 µl H2O
3 µl dNTP Mix (je 2 µM)
5 µl 10 x Puffer
1 µl Y-Primer (10 µM/µl)
1 µl SqFP1/SqRP1 (10 µM/µl)
5 µl Ligationsansatz
0,2 µl Taq Polymerase (5 U/µl)
PCR Programm :
3 min 95 °C Initiale Denaturierung
30 Zyklen:
1 min 95 °C Denaturierung
1 min 58 °C Annealing
1 min 72 °C Elongation
5 min 72 °C Finale Elongation
2. MATERIAL UND METHODEN
- 30 -
2.4. RNA Arbeitstechniken und Techniken für Transkriptom
Analysen
Für Transkriptomanalysen ist es essentiell, dass eine reproduzierbar qualitativ gute RNA
den Versuchen zu Grunde liegt. Die Materialien dürfen nicht mit RNase kontaminiert sein,
und das Arbeiten hat generell auf Eis und sehr zügig zu erfolgen, damit die RNA nicht
durch Degradation unbrauchbar wird oder die Ergebnisse verfälscht. Deshalb wurden,
wenn möglich, Einweg-Artikel verwendet und in Lösungen sowie auf Glaswaren RNasen
mit DEPC inhibiert.
2.4.1. Isolierung von bakterieller Gesamt-RNA
Die RNA Isolierung aus P. aeruginosa wurde mit einem modifizierten Qiagen Protokoll
durchgeführt. Dabei wurden die RNA der Bakterien aus der jeweiligen Wachstumsphase,
mit Hilfe von RNA Protect, stabilisiert und Aliquots (109 Bakterien/ Lysis-Ansatz) in
flüssigen Stickstoff eingefroren. Der Lysozym Aufschluss erfolgte nach Protokoll des
Herstellers. Um die Konzentration der RNA zu erhöhen, wurden zwei bis drei Lysisansätze
über eine RNeasy Säule (Qiagen) vereinigt und aufgereinigt. Die Elution erfolgt im
Maximal-Volumen von zwei mal 50 µl RNase freiem H2O. Im Gesamtvolumen von 200 µl
wurde 30 min die chromosomale DNA mit DNaseI verdaut. Die RNA wurde erneut über
RNeasy Säulen aufgereinigt und in zweimal mit 30 µl H2O eluiert. Die Konzentration der
RNA wurde im Eppendorf Photometer bestimmt. Qualität und mögliche Degradation
wurde im Agarosegel und im 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies) überprüft
(Abbildung 2-3). Um Degradation zu verhindern, wurde die reverse Transkriptionsreaktion
in cDNA sofort im Anschluss durchgeführt.
2. MATERIAL UND METHODEN
- 31 -
2.4.2. Reverse Transkription
Es wurden standardmäßig 10 µg RNA in einer cDNA Synthese Reaktion eingesetzt, die
maximal in einem Volumen von 20 µl gelöst sein durften. Dazu wurden 2 µl Random
Primer Hexamere (300 ng/ µl) gegeben und im Thermocycler vorinkubiert:
Abbildung 2-3: Typisches Muster der isolierten und gereinigten
RNA im RNA BioAnalyzer. Das 16 S rRNA Signal sollte ca. die
halbe Intensität des 23 S rRNA Signals haben
Programm:
10 min 70 °C
10 min 25 °C
2. MATERIAL UND METHODEN
- 32 -
Die Proben wurden anschließend sofort auf Eis gestellt, vorsichtig mit 28 µl Mastermix
gemischt und weiter im Thermocycler mit folgendem Programm inkubiert. Ein Ansatz
ohne Reverse Transkriptase diente als Kontrolle auf chromosomale Verunreinigung
(Abbildung 2-4).
Nach Ende des cDNA Synthese Programms wurden die Proben mit 10 µl H2O auf ein
Endvolumen von 60 µl aufgefüllt. Durch Zugabe von 20 µl NaOH (1N) und 30 min bei 65
°C wurde die RNA denaturiert. Mit 20 µl HCl
(1N) wurde die Probe neutralisiert und danach
über eine PCR Aufreinigungssäule (Qiagen)
nach Herstellerangaben aufgearbeitet. Bei der
cDNA Synthese für Micro-Array-Experimente
wurden bis zu 3 cDNA Synthesen parallel
durchgeführt und zur Konzentrierung über
eine Säule aufgereinigt. Die Konzentration der
cDNA wurde photometrisch bei 260 nm
bestimmt. Für Realtime-PCR-Analysen
genügten 10 – 100 ng cDNA. Die
Gesamtmenge an cDNA für einen Affymetrix
DNA Chip sollte zwischen 3 und 7 µg liegen.
Programm:
10 min 25 °C
60 min 37 °C
60 min 42 °C
15 min 70 °C
Mastermix:
10 µl 5 x First Strand Buffer
5 µl DTT (100 mM)
3 µl dNTP (jedes 10 mM)
5 µl H2O
5 µl Superscript II
Abbildung 2-4: Typische chromosomale DNA
Kontroll PCR mit cDNA als DNA Matrize
(Spur 2, 4 und 6) und den zugehörigen
Negativkontrollen ohne reverse Transkriptase
(Spur 3, 5 und 7) im cDNA Ansatz.
2. MATERIAL UND METHODEN
- 33 -
2.4.3. Realtime PCR
Die Realtime PCR stellt eine Methode dar, die es ermöglicht, transkriptionelle Regulation
in ausgewählten Genen zu analysieren. Zur Normalisierung der Daten wurde ein nicht
reguliertes Gen, ein so genanntes housekeeping Gen, verwendet. Die Realtime PCR hat
den Vorteil, dass für etablierte Primerpaare von potentiell regulierten Genen
vergleichsweise schnell eine Regulation in cDNA Proben festgestellt werden kann. Für
häufig wechselnde Zielgene ist dagegen die Etablierung der Primer ein sehr hoher
Aufwand, weil für jedes neue Primerpaar zuerst eine Primermatrix erstellt werden muss,
um die optimalen Primerkonzentrationen zu ermitteln.
Generell wird bei jedem Realtime-PCR-Lauf im 96-Well-Format nach jedem PCR-Zyklus
die Leuchtintensität des SybrGreen Farbstoffes in jedem Reaktionsgefäß gemessen. Es gibt
eine lineare Beziehung zwischen zunehmender Leuchtintensität und Zunahme der
doppelsträngigen DNA. Je früher dabei das Signal aus dem Hintergrundrauschen oder
einem bestimmten Schwellenwert heraustritt, desto höher war die anfängliche
Konzentration einer bestimmten mRNA Spezies in der Bakterien-Population. Der
Zeitpunkt wird in Ct angegeben (Zyklus). Um verschiedenen cDNA Proben innerhalb eines
Laufs vergleichen zu können, wurden die Verdünnungen eines Gemischs von allen
gemessenen cDNAs für die Erstellung von Messgeraden für die verschiedenen Primerpaare
verwendet. Die Ct Werte wurden mit dem nicht regulierten housekeeping Gen in
Beziehung gesetzt. Eine Änderung von zweifach wurde als Regulation gewertet.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Realtime-PCR dazu verwendet, cDNA Proben darauf
zu überprüfen, ob das Rhl-QS System unterschiedlich reguliert wurde. Dazu wurden
Primerpaare etabliert, die homolog zu den rhlR (PA3477) und rhlA (PA3479) Genen von
P. aeruginosa sind. Als nicht reguliertes housekeeping Gen wurde PA1580 verwendet,
welches für die Citratsynthase kodiert. Die Anlagerungstemperatur der Primer wurde so
gewählt, dass alle drei PCR Reaktionen bei 60 °C, und damit in einem Lauf, stattfinden
konnten. Auch die Fragmentlänge, die bei der PCR generiert wird, wurde auf ca. 200 Bp
2. MATERIAL UND METHODEN
- 34 -
angepasst, damit die Bedingungen für die verschiedenen PCR Reaktionen vergleichbar
waren.
Primer für die Realtime PCR:
Tabelle 2: Primer Sequenzen für die Realtime PCR
Primer Sequenz Gen PA1580FP1RT TCC AAG GGC GAG CCG ATG ATG TA gltA (PA1580) PA1580RP1RT AGG CGA TGC AGG CGA ACG GAT TG gltA (PA1580) RhlAFP2RT TGG CGC TCA ACG ATC GGG GCT ACT rhlA (PA3479) RhlARP2RT GGG CGT CCT CGG CGG TGG TGT rhlA (PA3479) RhlRFP2RT CGG CGC CTG GGC TTC GAT TAC TAC rhlR (PA3477) RhlRRP2RT GAG GAG CGC AGG CCG TTG AGG AT rhlR (PA3477)
Primer Matrix: Bei der Erstellung einer Primer Matrix kommt es darauf an, dass die
Primer eines Primerpaars in verschiedenen Konzentrationen zueinander eingesetzt werden.
Als Template für die PCR wurde chromosomale DNA eingesetzt. Als zugehörige
Negativkontrolle wurde, anstelle von DNA, H2O verwendet. Alle Proben wurden als
Doppelbestimmung pipettiert. Bei der Auswertung wurde darauf geachtet, welche
Primerkonzentrationen das beste Verhältnis von Proben mit DNA, gegenüber Proben ohne
DNA, hatte. Am Ende der PCR wurde eine Dissoziationskurve aufgenommen, bei welcher
das entstandene Produkt langsam von 60 °C ansteigend aufgeschmolzen wird. Bei dieser
Aufschmelzung der doppelsträngigen DNA sollte ein definiertes Signal zu sehen sein, das
einer dem Fragment und der Sequenz entsprechenden Temperatur zuzuordnen ist.
2. MATERIAL UND METHODEN
- 35 -
2.4.4. Affymetrix Micro-Array-Analyse
Die gereinigte cDNA, die aus RNA von Bakterien aus unterschiedlichen Kulturen revers
transkribiert wurde, musste für die Hybridisierung mit den Affymetrix DNA Chips weiter
aufgearbeitet werden. Dieses erfolgte nach den Vorgaben aus den Affymetrix Protokollen
für P. aeruginosa DNA Chips. Dazu wurde die cDNA mit DNase I fragmentiert und die
Fragmentgröße im Agarosegel überprüft. Sie sollte zwischen 50 und 200 Bp liegen
(Abbildung 2-5). Die Fragmente wurden terminal mit Biotin-dUTP markiert. Die
Markierungseffizienz wurde im Agarosegel überprüft, indem StreptAvidin mit der
markierten cDNA vorinkubiert wurden, so dass sich durch die Bindung von StreptAvidin
an Biotin das Laufverhalten änderte. Die Markierungseffizienz ist sehr wichtig für eine
gute Auswertbarkeit der Chips, weil zu viele nicht markierte Fragmente die Oligomere auf
dem Chip blockieren, was zu einer falsch negativen Aussage über das Vorhandensein von
Genen führen kann. Die Hybridisierung und Waschschritte erfolgten nach
Herstellerangaben in der Arrayfacility der GBF Braunschweig (Dr. Robert Geffers, AG
Prof. Dr. Jan Buer). Die Auswertung erfolgte über MAS 5.0 Software (Microarray
Software) von Affymetrix.
Um zwei verschiedene Zustände miteinander zu vergleichen, wurden folgende
Versuchsparameter festgelegt:
• Es wurden drei Kulturen eines Zustandes parallel inkubiert und vor der RNA-
Isolierung vereinigt, um wachstumsabhängige Varianzen in der Genexpression zu
minimieren (Abbildung 2-6).
• Um ausreichende RNA und cDNA Konzentrationen zu erhalten, wurden bis zu drei
parallele Reaktionsansätze mit identischem Material vereinigt, die bei der
Aufreinigung über Affinitätschromatographiesäulen ankonzentriert wurden (2.5.1.
und 2.5.2.)
• Pro Zustand wurden zwei unabhängige Arrays durchgeführt
2. MATERIAL UND METHODEN
- 36 -
Ein Gen wurde als reguliert angesehen, wenn:
i) es in allen vier Paarvergleichen von der Software als reguliert bezeichnet wurde
ii) die Signalintensität nicht in allen Fällen als „abwesend“ bewertet wurde
iii) es einen Signal-Log-Ratio von durchschnittlich mindestens > 1 oder < -1 hat
(zweifache Regulation)
Durch diese Versuchsparameter war es möglich, die falsch-positiven Aussagen der Array
Versuche auf ein Minimum zu reduzieren und mit den allgemeinen Vorgaben von
MIAME (minimum informations about a microarray experiment) konforme Versuche
durchzuführen.
Abbildung 2-6: Typischer
Versuchsaufbau der Array Versuche
von der Kultivierung der Bakterien
unter verschiedenen Bedingungen (Oben
und Unten) über die RNA bis zur
Hybridisierung der cDNA auf dem Chip
Abbildung 2-5: 1: 50
Bp Leiter 2: cDNA 3:
DNaseI fragmentierte
cDNA
2. MATERIAL UND METHODEN
- 37 -
2.5. Sonstige Methoden
2.5.1. Das Screening nach HAQ-negativen Transposonmutanten
Das Screening nach HAQ-negativen Transposonmutanten erfolgte nach drei Tagen direkt
auf den Selektionsagarplatten, indem unter dem Mikroskop (10 – 100 fache Vergrößerung)
in den Kolonien nach Abwesendheit von typischen HAQ-abhängigen Kristallstrukturen
gesucht wurde (Abbildung 2-7 und 2-8). Diese Kolonien wurden vereinzelnd angezogen
und für weitere Untersuchungen in Glycerin-Dauerkulturen bei –70 °C gelagert. Die
Überprüfung der Mutanten erfolgte in der Dünnschichtchromatographie.
2.5.2. HAQ Extraktion
Für die Analyse von Transposonmutanten, sowie die Durchführung von
Fütterungsexperimenten mit stabil markierten Vorstufen von HAQ in P. aeruginosa, war
es notwendig, eine Methode zu etablieren, mit der verschiedenen HAQ Spezies aus P.
aeruginosa Kulturen isoliert werden konnten. Die sehr hydrophoben HAQ wurden mit
Hilfe von Methanol- oder Dichlormethan-Extraktionen vom Medium getrennt. Dabei
wurden 1 Volumen Lösungsmittel zur Kultur oder der Agarplatte gegeben und nach 5-
Abbildung 2-7 Typische SCV 20265
Kolonie mit HAQ-abhängigen
Kristallstrukturen
Abbildung 2-8 HAQ-negative-Mutante mit
Koloniemorphologie ohne Kristall-
strukturen (M1)
2. MATERIAL UND METHODEN
- 38 -
minütiger Inkubation und guter Durchmischung zentrifugiert. Das Methanol musste
abgedampft werden und konnte nur in der Extraktion von Festmedien verwendet werden.
Das Dichlormethan bildet dagegen mit wässrigen Medien zwei Phasen und kann leicht
nach der Zentrifugation abgenommen werden, bevor es abgedampft wird. Die Proben
wurden dann in einem definierten Volumen Methanol aufgenommen und für weitere
Analysen verwendet.
2.5.3. Dünnschichtchromatographie
Die HAQ Extrakte wurden für quantitative Aussagen und Qualitätsbestimmung
dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Als Laufmittel wurde ein 10 Teile Methyl-
tertiär-butyl-ether : 1 Teil n-Hexan Gemisch verwendet. Die mit Kiselgel beschichteten
Glasplatten wurden unter UV Licht ausgewertet. Als Standard Substanzen wurden
synthetisiertes 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin und PQS verwendet. Die Substanzen wurden
von Dr. Michael Morr an der GBF Braunschweig synthetisch hergestellt. 2-Heptyl-4-
hydroxyquinolin-N-Oxid wurde von Sigma Aldrich verwendet.
2.5.4. Fütterung von markierten Substraten
Um den Biosyntheseweg von HAQs in P. aeruginosa aufzuklären, wurden verschiedenen
stabil-markierte Substrate zu den Bakterien gegeben, um danach die HAQ zu extrahieren
und den eventuellen Einbau zu überprüfen. Dazu wurden je 5 mg des zu testenden
Substrats in 7 ml Vogel-Bonner Medium mit 0,2 % Agarose gegeben. Die Bakterien
wurden mit einer Impföse auf die Mitte einer kleinen Kulturplatte (50 mm Durchmesser)
gegeben und drei Tage wachsen gelassen. Der bewachsene Nährboden wurde komplett für
die HAQ Extraktion eingesetzt.
2. MATERIAL UND METHODEN
- 39 -
2.5.5. GC/MS
Die für diese Arbeit notwendeigen ESI, GC/MS und MS/MS Analysen wurden in der
Strukturbiologischen Abteilung der GBF Braunschweig von Dr. Manfred Nimtz
durchgeführt.
Im Prinzip wurden die abgedampften HAQ Extrakte eine Stunde mit 50/50 Pyridin +
(BSTFA (N,O-bis-(Trimethylsilyl)trifluoroacetamide) + 1% TMC (Trichlormethan)) bei
70 °C derivatisiert. Dabei wurden alle funktionellen Gruppen mit einer
Trimethylsilylgruppe substituiert. Dadurch wird die Polarität erniedrigt und somit eine
bessere Auftrennung. Die Molekular-Ionen-Masse wurde damit um 72 Da pro
Trimethylsilylgruppe erhöht.
Die Auftrennung erfolgte auf einem Thermo-Finnigan GCQ Gaschromatographie-
Ionenfallenmassenspektrometer (Finnigan MAT corp., San Jose, CA) welches im positiven
EI (electron impact) Modus betrieben wurde. Die trimethylsilylierten HAQ-Derivate
wurden, mittels Vergleich mit synthetischen Standardsubstanzen und anhand ihres
charakteristischen Fragmentierungsmusters, identifiziert (Abbildung 2-9).
Für die MS/MS-Analyse wurden Eltern Ionen von Interesse selektiert und durch collision
induced dissociation (CID) in der Ionenfalle in Tochterionen fragmentiert
(Kollisionsenergie ca. 0.7 eV). Auf diese Weise war es möglich, die Einbauorientierung
von unterschiedlich markierten Acetat-Molekülen anhand des Fragmentierungsmusters der
Molekularionen in MS/MS zu bestimmen (3.1.2.).
2. MATERIAL UND METHODEN
- 40 -
Abbildung 2-9 oben: Typisches Gaschromatogramm eines trimethylsylisierten total-HAQ
Extraktes von P. aeruginosa 1: 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin (EI Massenspektrum im unteren
Bild) 2: 2-Heptyl-3,4-dihydroxyquinolin (PQS) 3: 2-Nonyl-4-hydroxyquinolin 4: 2-Nonyl-3,4-
dihydroxyquinolin 5: 2-Nonyl-2,4-dihydroxyquinolin 6: 2-Undecenyl-4-hydroxyquinolin;
Unten: EI Massenspektrum des trimethylsylilierten 2-Heptyl-4-hydroxyquinolins mit
typischem Fragmentierungsmuster.
2. MATERIAL UND METHODEN
- 41 -
2.5.6. Elektrospray Ionisations MS (ESI)
Für die Bestimmung des Fe(III)/PQS Komplexes wurden 3 µl einer 2:1 Methanol: H2O
Lösung, mit einer Endkonzentration von ca. 10-100 pmol/µl, auf eine Nanospray Gold
beschichtete Glaskapillare gegeben, die orthogonal zur Eingangsöffnung eines QTOF-II
Gerätes (Micromass, Manchester, U.K.) platziert wurde. Durch Anlegung einer Spannung
von ca. 1000 V an die Kapillare wurde ein Spray erzeugt, die darin enthaltenen Ionen ins
Gerät geleitet, und über ein „time-of-flight“ (TOF, Flugzeitmassenspektrometer)
aufgetrennt. Für das anschließende MS/MS wurden Eltern Ionen von Interesse durch einen
vorgeschalteten Quadropol-Massenfilter ausgewählt und danach durch „collision induced
dissociation“ (CID) in Tochterionen fragmentiert. Diese wurden dann im
Flugzeitmassenspektrometer aufgetrennt.
2.5.7. NMR
13C Nuclear Magnetic Resonace (NMR) wurde als ergänzende Methode zur GC/MS
Analyse verwendet, um den Einbaur der markierten Acetate zu untersuchen. Die Analysen
wurden unter der Aufsicht von Dr. Victor Wray an der GBF Braunschweig durchgeführt.
2.5.8. Bestimmung von Eisenkonzentrationen
Zur Bestimmung von Eisenkonzentrationen in Lösungen wurde das Spectroquant® Fe
Bestimmungskit von der Firma Merck benutzt.
2. MATERIAL UND METHODEN
- 42 -
2.5.9. Bestimmung der RhlR Promotoraktivität mit Hilfe einer rhlR-lacZ
Fusion auf dem Plasmid pMAL.V [Latifi et al., 1996]
Die Aktivität des Rhl-QS-Systems wurde mit Hilfe des Plasmids pMAL.V bestimmt,
welches in PAO1 transformiert wurde. Das Plasmid enthält eine transkriptionelle Fusion
des rhlR Promotors mit einem lacZ-Gen, so dass die Promotoraktivität anhand eines β-
Galactosidase Tests nach Miller 1972 photometrisch bestimmt werden konnte. Dazu
wurden 50 - 200 µl der Bakteriensuspension mit 800 - 950 µl Z-Puffer [Miller, 1972] auf
ein Gesamtvolumen von 1 ml aufgefüllt und gut gemischt. 5 µl 0,1 % SDS und 10 µl
Chloroform wurden für die Lyse der Bakterien zugesetzt, und das Gemisch wurde 15 min
bei 30 °C inkubiert. Durch Zugabe von 200 µl einer 4 mg/ml ONPG Lösung (in PBS) als
Substrat wurde die Reaktion gestartet. Eine Gelbfärbung wurde photometrisch bei OD420
nm bestimmt. Eventuelle Zellkontaminationen wurden bei OD550 gemessen. Zusammen
mit der OD600 der eingesetzten Bakteriensuspension, des eingesetzten Volumens [v] und
der Inkubationszeit des Tests bis zum Farbumschlag [t], konnten die Miller Einheiten [U]
berechnet werden, die ein Maß der Promotoraktivität sind.
2.5.10. In vitro DNA-Fragmentierung durch PQS
Um zu überprüfen, ob PQS in vitro einen Einfluss auf die DNA hat, wurden 500 ng λ-
DNA mit PQS vorinkubiert und dann mit 100 nMol Fe2SO4 in 10 µl Endvolumen versetzt.
Es wurde keine PQS-Methanol-Lösung verwendet, weil das Methanol die Interaktion von
Eisen und DNA inhibiert. Nach 15 min, bei 37 °C, wurde die Probe mit DNA Ladepuffer
versetzt und in einem Agarosegel aufgetrennt. Als Negativkontrolle wurden Fe2SO4 und
die nicht aktive Substanz 2-Heptyl-4-quinolon verwendet.
U= 1000*[(OD420)-(1.75*OD550)] t * v * OD600
2. MATERIAL UND METHODEN
- 43 -
2.5.11. Live/Dead Färbung
Für die differentielle Anfärbung von lebendigen und toten Bakterien wurde das
LIVE/DEAD BacLight Kit von Molecular Probes nach Herstellerangaben verwendet. Dazu
wurden Bakterien aus einer Kolonie auf einem Objektträger verteilt und mit den
Fluoreszenzfarbstoffen SYTO-9 (grün; Anregung bei 480 nm/ Emission 500 nm) und
Propidiumiodid (rot; Anregung bei 490 nm/ Emission 635 nm) inkubiert. Dabei färbt
SYTO-9 Nukleinsäuren aller Bakterien an. Propidiumiodid durchdringt nur defekte
Membranen und färbt die DNA von toten Bakterien an. Dadurch wird gleichzeitig die
Fluoreszenz von SYTO-9 reduziert. Die Auswertung erfolgte am Fluoreszenzmikroskop.
2.5.12. Anfärbung extrazellulärer DNA
Extrazelluläre DNA wurde mit einem TOTO-1 „dimeric cyanine“ Nukleinsäure
Fluoreszenzfarbstoff von Molecular Probes nach Herstellerangaben angefärbt. Dazu
wurden Bakterien einer Kolonie auf einem Objektträger verteilt und mit dem Farbstoff
inkubiert. Die extrazelluläre DNA wurde spezifisch angefärbt und konnte bei einer
Anregungsenergie von 512 nm und einer Emission von 533 nm im Fluoreszenzmikroskop
dargestellt werden.
3. ERGEBNISSE
- 44 -
3. Ergebnisse
3.1. Biosynthese von 4-Hydroxy-2-alkylquinolonen (HAQs) bei
P. aeruginosa
3.1.1. Transposonmutagenese und Screen nach HAQ-negativen Mutanten
Die Aufklärung der Biosynthese von HAQ-Molekülen in P. aeruginosa ist ein erster und
wichtiger Schritt zum besseren Verständnis dieser neu entdeckten Signalmoleküle. Um
Hinweise auf Gene zu bekommen, deren Produkte an der Biosynthese von HAQs beteiligt
sind, wurde eine Transposonmutagenese mit dem klinischen Isolat P. aeruginosa SCV
20265 durchgeführt. Die SCV 20265 produziert große Mengen an HAQ abhängigen
kristallinen Strukturen (Abbildung 2-7) und ist deshalb besonders gut für einen Screen
nach HAQ-negativen Mutanten geeignet. Ca. 15000 Mutanten wurden vereinzelt und mit
Hilfe eines Mikroskops auf HAQ abhängige, kristalline Strukturen untersucht (siehe 2.5.1.
Abbildung 2-7 und 2-8). 26 Mutanten, die keine kristallinen Strukturen in ihren Kolonien
aufwiesen, wurden isoliert und für weitere Untersuchungen in Dauerkulturen gelagert.
Um zu überprüfen, ob auch in der Dünnschichtchromatographie keine oder deutlich
weniger HAQs zu sehen waren, wurden die 26 Mutanten drei Tage auf LB-Weichagar
inkubiert. Die HAQs wurden mit Methanol extrahiert. Alle Mutanten zeigten, verglichen
zum Wildtyp SCV 20265, eine deutlich geringere HAQ-Produktion in der
Dünnschichtchromatographie. Die chromosomale DNA der 26 Mutanten wurde mit NlaIII
verdaut, und mit Hilfe der Y-Linker Ligations Methode wurde der Übergang vom
Transposon zu chromosomaler DNA, mittels PCR, amplifiziert und sequenziert (siehe
2.3.5.). Die Sequenzen befinden sich im Anhang.
Diese Sequenzen wurden auf der Internet-Seite des Pseudomonas-Genom-Projekts
(www.pseudomonas.com) mit den Genom-DNA-Sequenzen von P. aeruginosa verglichen.
Dazu wurden BLAST-X (Nucleotidsequenz wird im Programm translatiert und mit
3. ERGEBNISSE
- 45 -
Proteinsequenzen des Projekts verglichen) und BLAST-N (Nucleotidsequenz wird mit
Nucleotidsequenzen verglichen) Homologie-Suchalgorithmen verwendet.
In der Tabelle 3 sind die identifizierten Mutanten aufgelistet, die durch die
Transposoninsertion eine beeinträchtigte HAQ Produktion hatten.
Neben Genen, die dem PQS-Operon angehören (M1, M6 und M16 mit Defekten in pqsA
und PA1003) wurden fünf Mutanten gefunden, die eine Insertion im carB Gen haben (M 8,
M18, M20, M23 und M26). Zwei unabhängige Mutanten hatten eine Transposoninsertion
im pyrB (M9 und M25) und eine im pyrD (M21) Gen. Vier mal inserierte das Transposon
in purL (M4, M5, M10 und M11).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein intakter Pyrimidin-Stoffwechsel essentiell für
die Synthese von HAQs ist. Obwohl über das gesamte Genom verteilt, wurden die Gene
carB, pyrB, pyrD und pyrE jeweils mindestens einmal getroffen. Wie Abbildung 3-1 zeigt,
Tabelle 3: Liste der gefundenen HAQ negativen Mutanten: PA-Nummern und Gen-Namen von
www.pseudomonas.com
Mutante PA Nummer Gen Mutante PA Nummer GenM8 PA4756 carB M5 PA3763 purLM18 PA4756 carB M11 PA3763 purLM20 PA4756 carB M10 PA3763 purLM23 PA4756 carB M13 PA0447 gcdHM26 PA4756 carB M14 PA0447 gcdHM9 PA0402 pyrB M7 PA1417M25 PA0402 pyrB M3 PA1421 speB2M21 PA3050 pyrD M22 PA1583M17 PA5331 pyrE M12 PA0794M6 PA0996 pqsA M2 keine ÜbereinstimmungM1 PA0996 pqsA M19 keine ÜbereinstimmungM16 PA1003 mvfR M24 keine ÜbereinstimmungM4 PA3763 purL
3. ERGEBNISSE
- 46 -
sind die Produkte an der Synthese von Orotat als wichtige Vorstufe im Pyrimidin-
Stoffwechsel beteiligt.
Deshalb wurde versucht, in einer Flüssigkultur die Mutanten mit Defekten in den carB,
pyrB, pyrD und pyrE Genen mit externer Orotat-Zugabe so zu komplementieren, dass sie
wieder HAQs produzieren können. Mit diesem Versuch sollte untersucht werden, ob das
Produkt des Biosynthesewegs oder die Proteine selbst wichtig für die Bildung der HAQs
ist.
Das Wachstum in Flüssigkultur verdeutlichte zweierlei:
• Orotat Zugabe führte zur Komplementation der HAQ-Biosynthese in den
Pyrimidin-Stoffwechselmutanten carB, pyrB und pyrD. Die pyrE Mutante konnte
nur bedingt komplementiert werden.
• Die Kulturen ohne Orotat erreichten nur eine OD600 von 0,6, wogegen die
komplementierten (außer die pyrE Mutante) deutlich höher als OD600 2,0 wuchsen
und nun wieder dem Wachstum der SCV 20265 glichen.
Weiterhin wurde Uridine-5-Monophosphat (UMP) - als Vorstufe von Pyrimidin - und
Inosin-5-Monophosphat (IMP) - als Vorstufe von Purin - exogen zu LB-Flüssigkulturen
der Mutanten gegeben. Mit Uridine-5-Monophosphat in der Kultur konnten alle Pyrimidin-
Stoffwechselmutanten wieder HAQs produzieren. Die purL Mutante dagegen nicht. Bei
Zugabe von Inosin-5-Monophosphat war es nur die purL Mutante, die mehr HAQ
Abbildung 3-1: Ausschnitt aus dem Pyrimidin-Stoffwechselwegs
3. ERGEBNISSE
- 47 -
synthetisierte, als die anderen Mutanten, aber nicht so viel, wie die SCV 20265 (Abbildung
3-2).
Da sich die HAQ-Produktion der Mutanten mit Defekten in Genen der Pyrimidin- und
Purin-Stoffwechselwege durch exogene Zugabe von Vorstufen dieser Stoffwechselwege
komplementieren ließ, scheint offenbar ein Wachstumseffekt der Grund dafür zu sein, dass
diese Mutanten keine HAQs produzierten.
3.1.2. Fütterungsexperimente mit möglichen HAQ Vorstufen
Unter Berücksichtigung der in diese Studie gefundenen HAQ-negativen Mutanten, mit
Defekten in der Pyrimidin-Biosynthese, wurden Experimente durchgeführt, die zeigen
sollten, dass es sich bei der fehlenden HAQ-Biosynthese tatsächlich um einen
Wachstumseffekt handelte und dass nicht Vorstufen der Uridine-5-Monophosphat (UMP)
Biosynthese direkt an der HAQ-Bildung beteiligt sind. Ein alternativer Weg zur zuvor
propagierten Biosynthese [Calfee et al., 2001], in der Anthranilat und eine ß-Keto-
Fettsäure als Vorstufen von PQS dienen (Abbildung 3-3 A), wäre nämlich, dass
Anthranilat und Orotat als Vorstufen der HAQ-Biosynthese zu einer kynurenischen Säure
Abbildung 3-2: Dünnschitchromatographie von HAQ-Extrakten von Mutanten mit Defekten im
Pyrimidin oder Purin Stoffwechsel im Vergleich zur SCV 20265, die in LB, LB mit Uridine-5-
Monophosphat, LB mit Inosine-5-Monophosphat und LB mit Orotat angezogen wurden
3. ERGEBNISSE
- 48 -
reagieren und an diese nachträglich ein aliphatischer Rest angehängt wird (Abbildung 3-3
B).
Zur Überprüfung beider möglicher Biosynthesewege wurden folgende
Markierungsexperimente durchgeführt:
Stabile Isotope von möglichen Vorstufen der PQS Biosynthese (Anthranilate, Acetat,
Aspartate) wurden zu den auf Vogel-Bonner Weichagar wachsenden SCV 20265 Bakterien
gegeben. Nach drei Tagen wurden die HAQs mit Ethyl-Acetat oder Dichlormethan
extrahiert und mit GC/MS und NMR analysiert.
Es wurde versucht, durch Fütterung von nicht markierten Vorstufen (Orotat, Acetat, ß-
Dekan-Fettsäure, kynurenische Säure) der möglichen Biosynthesewege, die Markierung
anderer, markierter Vorstufen abzuschwächen.
Dabei konnte eindeutig gezeigt werden, dass markierte Bestandteile von Anthranilat
(Abbildung 3-4 B) und vom Acetat (als Vorstufe der Fettsäure) (Abbildung 3-5 A und B)
in HAQ eingebaut werden [Bredenbruch et al., 2005]. Es war dagegen nicht möglich, zu
zeigen, dass markiertes Aspartat als Vorstufe von Orotat zur Synthese von HAQs
Abbildung 3-3 A: Postulierter Biosyntheseweg von PQS: Kondensation von Anthranilat und einer
aktivierten β-keto Fettsäure zu PQS [Calfee et al., 2001; Juhas et al., 2004; Juhas et al., 2005]; B: Mögliche
Alternative der PQS Biosynthese in der Anthranilat und Orotat als Vorstufen dienen.
3. ERGEBNISSE
- 49 -
verwendet wird (Abbildung 3-4 A). Des Weiteren wurde der Einbau von markierten
Atomen von Acetat und Anthranilat, weder durch gleichzeitige Fütterung von nicht
markiertem Orotat, noch durch kynurenische Säure abgeschwächt. Nicht markierte
Fettsäure konnte dagegen die Markierung durch Acetat deutlich verringern.
Der Biosyntheseweg von HAQ verläuft damit über eine Kondensation von Anthranilat und
einer ß-Dekan-Fettsäure unter Abspaltung von CO2.
Durch NMR Analysen von HAQ Isolaten aus SCV 20265, die mit verschieden markierten
Acetaten gefüttert wurden ([13C-1] Acetat; [13C-2] Acetat), konnte weitergehend gezeigt
werden, dass es sich bei dieser Reaktion um eine „head to head“ Kondensation handelt.
Das konnte auch in GC/MS-MS Analysen bestätigt werden, wo unter Fragmentierung der
Fragmentionen 319 [m/z], bei [13C-1] Acetat gefütterten Proben, und 320 [m/z], bei [13C-2]
Acetat gefütterten Proben von 2-heptyl-4-hydroxyquinolin, die Orientierung der Acetate
anhand der Massen der abgespaltenen CH2 Gruppen festgestellt werden konnte. Der
Abbildung 3-4 B: Bei Fütterung mit
markiertem Anthranilat gibt es entsprechend
der Markierung eine Verschiebung des
intensivsten Signals im Fragmentionenmuster
von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin um + 1 m/z
auf 232 m/z
Abbildung 3-4 A: Bei Fütterung mit markiertem
Aspartat bleibt das MS Fragmentionenmuster von
2-Heptyl-4-hydroxyquinolin unverändert mit
stärkstem Fragmention bei 231 m/z
3. ERGEBNISSE
- 50 -
postulierte Biosyntheseweg A (Abbildung 3-3 A) konnte mit diesen Methoden bewiesen
und die Ergebnisse von Ritter 1971 nachvollzogen werden [Ritter und Luckner, 1971a].
Es konnte weiter gezeigt werden, dass nicht nur die 4-Hydroxy Variante, sondern auch
PQS, sowie die längerkettigen Nonyl-Derivate die Markierung enthielten. Das weist auf
eine gemeinsame Biosynthese vieler HAQ Spezies in P. aeruginosa hin und entspricht der
Veröffentlichung von Deziel et al. [Deziel et al., 2004].
3.1.3. Rhamnolipide und HAQs haben einen gemeinsamer Fettsäurepool
Bei der Auswertung der GC/MS Daten für die Aufklärung der Biosynthese von HAQs in
P. aeruginosa wurde festgestellt, dass mit verlängerter Inkubationszeit der Kulturen, die
Länge der aliphatischen Kette der HAQ-Moleküle prozentual zunimmt. Dabei wurde auch
bemerkt, dass die Fettsäure-Kettenlänge bei Rhamnolipiden im gleichen Maße zunimmt.
Diese Beobachtungen legten nahe, dass bei den Biosynthesen von HAQs und
Rhamnolipiden auf den gleichen Fettsäurepool zurückgegriffen wird.
Um diese Theorie zu prüfen, wurden Versuche mit eine rhlG Mutante durchgeführt, die
verglichen zum Wildtyp, nur noch 1-10% der Menge an Rhamnolipiden produziert
230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]
Rel
ativ
e A
bund
ance
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 275
260
246
289232 304
[13C-1] acetate
MS2 of 319
N
OSi(CH
3)
3
230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]
Rel
ativ
e A
bund
ance
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 275
260
246
289232 304
[13C-1] acetate
MS2 of 319
N
OSi(CH
3)
3
Rel
ativ
e A
bund
ance
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 275
260
246
289232 304
[13C-1] acetate
MS2 of 319
N
OSi(CH
3)
3
Abbildung 3-5 A: MS2 des 319 [m/z] Fragmentions
von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin nach Markierung
mit [13C-1] Acetat
275
230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
261
246
290233 304
[13C-2] acetate
MS2 of 320
N
OSi(CH
3)
3
275
230 240 250 260 270 280 290 300 [ m / z ]
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
261
246
290233 304
[13C-2] acetate
MS2 of 320
N
OSi(CH
3)
3
Abbildung 3-5 B: MS2 des 320 [m/z]
Fragmentions von 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin
nach Markierung mit [13C-2] Acetat
3. ERGEBNISSE
- 51 -
[Campos-Garcia et al., 1998]. Die Mutante wurde aus der Arbeitsguppe von Dr. Gloria
Soberon-Chavez zur Verfügung gestellt. Der Defekt dieser Mutante befindet sich in einem
Stoffwechselweg, der für die Bereitstellung von Fettsäuren für die Rhamnolipid
Biosynthese essentiell ist [Campos-Garcia et al., 1998].
Die HAQ- und Rhamnolipid-Produktion der rhlG Mutante wurde mit der Produktion des
Wildtyps verglichen. Die differentielle Rhamnolipid-Produktion war mit GC/MS Analyse
indirekt gezeigt worden, indem die Rhamnolipidextrakte mit methanolischer HCl
hydrolysiert und danach die Rhamnose und die Lipidreste getrennt voneinander gemessen
und verglichen wurden. Die Messungen ergaben im Einklang mit der Literatur, dass die
Rhamnolipid-Produktion in der rhlG Mutante deutlich reduziert ist. In der
Dünnschichtchromatographie (Abbildung 3-6) war auch bei der HAQ-Produktion eine
Reduktion bei der rhlG Mutante zu erkennen. Die Produktion war auf ca. 60% reduziert,
was dafür spricht, dass die HAQ-Produktion, im Gegensatz zur Rhamnolipid-Produktion,
nur teilweise von RhlG abhängt [Bredenbruch et al., 2005].
Abbildung 3-6: Vergleichende Dünnschichtchromatographie mit-HAQ Extrakten aus verschiedenen
Zeitpunkten von Kulturen der rhlG Mutante und dem PAO Wildtyp
3. ERGEBNISSE
- 52 -
Abbildung 3-7 links: PAO1 Kultur in 10 ml BHI
mit 40 µM PQS nach 12 h Wachstum mit
deutlicher Pyocyanin Grünfärbung verglichen
zu der Kultur ohne PQS (rechts)
3.2. Effekt von PQS auf P. aeruginosa: Transkriptionelle
Analyse
PQS ist als ein Signalmolekül beschrieben worden, das es bei exogener Zugabe einen
positiven Effekt auf das Rhl-QS-System hat [McKnight et al., 2000]. Um einen Einblick in
die regulatorische Wirkung von PQS auf P. aeruginosa zu bekommen, wurde PQS in der
Konzentration 40 µM zu Beginn einer PAO1-Kultur gegeben und die transkriptionelle
Änderung im Vergleich zu Kulturen ohne PQS-Zugabe an verschiedenen Zeitpunkten
gemessen. Dazu wurden Realtime-PCR und Microarray-Experimente kombiniert
durchgeführt. Pyocyanin wurde mit Chloroform ausgeschüttelt und eine differentielle
Produktion wurde als ein Marker für eine gesteigerte Aktivität des Rhl-QS-Systems
betrachtet. Diese war bei 40 µM PQS,
verglichen mit der Kultur ohne PQS, nach
12 h zu sehen (Abbildung 3-7).
Eine weitere generelle Beobachtung war,
dass Kulturen mit 40 µM PQS nicht ganz
die gleiche OD600 erreichten, wie die
Kultur ohne exogene PQS Zugabe
(Abbildung 3-8).
Außerdem bildete sich bereits nach 2 h in
den Kulturen mit 40 µM ein roter
Niederschlag und ein Biofilm an der
Kolbenwand nach 4 h.
3. ERGEBNISSE
- 53 -
3.2.1. Realtime-PCR von P. aeruginosa nach Zugabe von PQS
Mit Realtime-PCR wurde überprüft, ob auf transkriptioneller Ebene eine Regulation von
rhlR und rhlA (Rhamnolipid Synthase A) im Vergleich zum housekeeping Gen PA1580 zu
sehen ist, wenn PQS zu der Kultur gegeben wird. Dazu wurden Kulturen ohne, mit 4 und
mit 40 µM PQS angesetzt und RNA von P. aeruginosa in diversen Wachstumsphasen
isoliert. Eine differentielle Regulation bei den getesteten Genen konnte bereits nach 5 h
gezeigt werden, wobei nur mit 40 µM PQS eine deutliche Induktion der Gene um den
Faktor 2-3,5 zu sehen war (Abbildung 3-9).
0,01
0,1
1
10
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Zeit [min]
OD
600 0 PQS
4 µM PQS40 µM PQS
Abbildung 3-8: Wachstumskurven von PAO1 mit unterschiedlichen PQS Konzentrationen
3. ERGEBNISSE
- 54 -
3.2.2. Arrays von PAO1 nach 5, 12 und 20 h unter Zugabe von 40 µM PQS
Die Microarray-Analysen sollten einen Überblick darüber geben, welche Gene in P.
aeruginosa, durch PQS Zugabe, transkriptionell reguliert werden. Dazu wurden 40 µM
PQS zu Beginn der Kultur zugesetzt. Um die globale Transktiption unter homogenen
Kulturbedingungen testen und vergleichen zu können, wurden alle Experimente in 50 ml
Kolben mit 10 ml BHI Medium durchgeführt. Der Kolben ohne PQS wurde mit der
gleichen Menge Methanol versetzt, um einen Effekt durch das Methanol auszuschließen.
Die RNA wurde nach 5, 12 und 20 h isoliert und revers transkribiert. Die cDNA wurde
fragmentiert, markiert und mit den Oligonukleotiden auf den Affymetrix Chip hybridisiert.
0
50
100
150
200
250
300
ohne PQS 4 µM PQS 40 µM PQS
Rel
ativ
e Tr
ansk
ript
ion
(%)
PA1580RhlARhlR
Abbildung 3-9: Relative Änderung der Transkription von rhlA und rhlR nach 5 h
durch PQS Zugabe
3. ERGEBNISSE
- 55 -
Abbildung 3-10: Schematische Abbildung der Fur
abhängige Genregulation
Die als reguliert gefundenen Gene (siehe 2.4.4.) aller drei Experimente sind in den
folgenden Tabellen zusammengefasst.
Insgesamt wurden 93 Gene durch PQS-Zugabe als reguliert gefunden. Das sind 1,6 % des
P. aeruginosa Genoms. Davon wurden 66 Gene induziert und 27 geringer transkribiert.
KatA ist als einziges Gen nicht eindeutig einer Regulationsrichtung zuzuordnen, weil es
nach 5 h und nach 11 h gegensätzlich reguliert erschien.
3.2.2.1. PQS und Eisen regulierte Gene
31 der 93 PQS regulierten Gene wurden zuvor in zwei Transkriptionsstudien als
eisenreguliert beschrieben [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003]. Sie sind in der
Tabelle 4 aufgeführt.
Sehr deutlich war, dass die Gene der beiden Eisenaufnahme-Systeme von P. aruginosa,
Pyoverdin (pvdA, D und J) und Pyochelin (pchA-G, fptA), in allen Versuchen vermehrt
abgelesen wurden. Von bfrB
(Bacterioferritin) war dagegen bereits
nach 5 h 50-fach weniger Transkript
vorhanden. Bacterioferritine binden
intrazellulär Fe(II) und sind ein
Marker für den Eisengehalt in den
Bakterien. Unter Eisenmangel-
Bedingungen werden Bacterioferritine
weniger exprimiert. Darüber hinaus
wurden weitere Gene, die zuvor in
anderen Transkriptionstudien als
eisenreguliert beschrieben wurden,
auch unter PQS Einfluss differentiell
reguliert. Alkalische Proteasen (aprF
3. ERGEBNISSE
- 56 -
und aprA) und das sodM (sodA) (manganabhängige Superoxid Dismutase) - fumC1 Operon
wurden durch PQS induziert.
Der Eisengehalt der Bakterien wird über Fur (Ferric Uptake Regulator) reguliert.
Zusammen mit Fe(II) als Korepressor bindet und inhibiert Fur die Transkription von
verschiedenen Genen, die wichtig für die Eisenaufnahme sind (Abbildung 3-10). Fur
reguliert aber nicht nur die Gene, deren Produkte für die Eisenaufnahme wichtig sind,
sondern auch eisenabhängige Faktoren, wie z.B. SodB.
Auch wenn bfrB direkt keine Fur-Box in der Promotor-Region besitzt, wird dennoch
diskutiert, dass es über PA4570, welches eine Fur-Box aufweist, indirekt durch Fur
reguliert wird.
Tabelle 4: PQS-regulierte Gene, die in mindestes einer von zwei Transkriptionsstudien als
eisenabhängig reguliert identifiziert wurden [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003]
PA- Nummer Gen 5 h 11 h 20 h Bezeichnung nach www.pseudomonas.com
PA0848 +76,11 probable alkyl hydroperoxide reductase
PA1245 +4,86 +16,22 hypothetical protein PA1248 aprF +2,31 Alkaline protease secretion outer membrane
protein AprF precursor PA1249 aprA +7,26 +3,20 alkaline metalloproteinase precursor PA2384 +2,89 hypothetical protein PA2386 pvdA +4,44 +2,58 L-ornithine N5-oxygenase PA2399 pvdD +2,57 pyoverdine synthetase D PA2400 pvdJ +9,32 PvdJ PA2402 +3,89 probable non-ribosomal peptide synthetase PA2405 +9,38 hypothetical protein PA2412 +3,53 +2,99 conserved hypothetical protein PA2427 +5,68 hypothetical protein PA3531 bfrB -50,40 bacterioferritin PA4218 +10,13 +8,00 probable transporter PA4220 +18,38 +18,77 hypothetical protein PA4221 fptA +10,22 +4,17 +4,56 Fe(III)-pyochelin outer membrane receptor
precursor PA4222 +14,32 +4,23 probable ATP-binding component of ABC
transporter
3. ERGEBNISSE
- 57 -
PA4223 +6,41 +3,78 probable ATP-binding component of ABC transporter
PA4224 pchG +9,08 +8,51 +9,85 pyochelin biosynthetic protein PchG PA4225 pchF +20,51 +39,67 +17,15 pyochelin synthetase PA4226 pchE +10,34 +16,22 dihydroaeruginoic acid synthetase PA4228 pchD +24,22 +5,24 +3,97 pyochelin biosynthesis protein PchD PA4229 pchC +18,67 +7,26 +3,36 pyochelin biosynthetic protein PchC PA4230 pchB +9,91 +7,89 +12,47 salicylate biosynthesis protein PchB PA4231 pchA +18,88 +7,89 +5,98 salicylate biosynthesis isochorismate synthase PA4467 +5,66 hypothetical protein PA4468 sodM +5,98 +9,85 superoxide dismutase PA4469 +5,58 +5,54 hypothetical protein PA4470 fumC1 +5,24 +3,14 fumarate hydratase PA4471 +7,11 +22,94 hypothetical protein PA4570 +5,46 hypothetical protein
Fettschrift: Diese Gene wurden gleichzeitig auch in Transkriptomstudien unter H2O2 Stress als
reguliert gefunden [Palma et al., 2004; Salunkhe et al., 2005] Kursiv: Diese Gene wurden gleichzeitig
auch in Transkriptomstudie mit MvfR Mutante als reguliert gefunden [Deziel et al., 2005]
3.2.2.2. Durch PQS und durch oxidativen Stress regulierte Gene
Da der Eisenhaushalt von Bakterien immer ein Balanceakt zwischen Eisenmangel und
Radikalbildung durch zu viel Eisen ist, ist es nicht verwunderlich, dass viele Gene, die
eisenabhängig reguliert werden, auch durch oxidativen Stress transkriptionell reguliert
werden [Palma et al., 2004; Salunkhe et al., 2005]. Umgekehrt werden durch oxidativen
Stress auch viele Gene reguliert, die für die Eisenaufnahme wichtig sind. Das spricht für
eine sehr enge Koregulation von Genen unter Eisenmangel und unter oxidativem Stress. In
der Tabelle 5 sind Gene aufgelistet, die sowohl PQS-abhängig als auch unter oxidativem
Stress durch H2O2 differentiell transkribiert wurden [Palma et al., 2004; Salunkhe et al.,
2005].
3. ERGEBNISSE
- 58 -
Tabelle 5: PQS-regulierte Gene, die in mindestens einer von zwei Transkriptionsstudien als durch
oxidativen Stress reguliert identifiziert wurden [Palma et al., 2004; Salunkhe et al., 2005]
PA- Nummer Gen 5 h 11 h 20 h Bezeichnung nach www.pseudomonas.com
PA0139 ahpC +9,19 +4,20 alkyl hydroperoxide reductase subunit C PA0140 ahpF +17,03 alkyl hydroperoxide reductase subunit F PA0201 +9,85 hypothetical protein PA0250 +13,36 conserved hypothetical protein PA0449 +6,92 hypothetical protein PA0848 +76,11 probable alkyl hydroperoxide reductase PA0849 trxB2 +5,06 thioredoxin reductase 2 PA1174 napA -3,27 -2,62 periplasmic nitrate reductase protein NapA PA1245 +4,86 +16,22 hypothetical protein
PA1248 aprF +2,31 Alkaline protease secretion outer membrane protein AprF precursor
PA1249 aprA +7,26 +3,20 alkaline metalloproteinase precursor PA1902 +3,43 phenazine biosynthesis protein PhzD PA1999 -2,99 probable CoA transferase subunit A PA2008 fahA -9,13 fumarylacetoacetase PA2009 hmgA -2,46 homogentisate 1,2-dioxygenase PA2330 +2,33 hypothetical protein PA2384 +2,89 hypothetical protein PA2386 pvdA +4,44 +2,58 L-ornithine N5-oxygenase PA2405 +9,38 hypothetical protein PA2412 +3,53 +2,99 conserved hypothetical protein PA3032 +2,93 cytochrome c Snr1 PA3237 +34,06 +25,63 hypothetical protein PA3287 +18,9 +2,99 conserved hypothetical protein PA3363 amiR -2,08 aliphatic amidase regulator PA3531 bfrB -50,40 bacterioferritin PA3822 -9,08 conserved hypothetical protein PA4131 -3,01 probable iron-sulfur protein PA4218 +10,13 +8,00 probable transporter PA4220 +18,38 +18,77 hypothetical protein
PA4221 fptA +10,22 +4,17 +4,56 Fe(III)-pyochelin outer membrane receptor precursor
PA4222 +14,32 +4,23 probable ATP-binding component of ABC transporter
PA4223 +6,41 +3,78 probable ATP-binding component of ABC transporter
3. ERGEBNISSE
- 59 -
PA4224 pchG +9,08 +8,51 +9,85 pyochelin biosynthetic protein PchG PA4225 pchF +20,51 +39,67 +17,15 pyochelin synthetase PA4226 pchE +10,34 +16,22 dihydroaeruginoic acid synthetase PA4228 pchE +24,22 +5,24 +3,97 pyochelin biosynthesis protein PchD PA4229 pchC +18,67 +7,26 +3,36 pyochelin biosynthetic protein PchC PA4230 pchB +9,91 +7,89 +12,47 salicylate biosynthesis protein PchB PA4231 pchA +18,88 +7,89 +5,98 salicylate biosynthesis isochorismate synthase PA4236 katA -4,21 +2,41 catalase PA4377 -3,63 hypothetical protein PA4468 sodM +5,98 +9,85 superoxide dismutase PA4469 +5,58 +5,54 hypothetical protein PA4470 fumC1 +5,24 +3,14 fumarate hydratase PA4471 +7,11 +22,94 hypothetical protein PA4613 katB +3,39 catalase PA4655 hemH +12,64 ferrochelatase
PA4811 fdnH -6,50 nitrate-inducible formate dehydrogenase, beta subunit
PA4812 fdnG -2,83 formate dehydrogenase-O, major subunit PA4881 +4,92 +2,62 hypothetical protein PA5460 +4,20 hypothetical protein
Fettschrift: Diese Gene wurden gleichzeitig auch in Transkriptomstudien unter Eisenmangel als
reguliert gefunden [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003] Kursiv: Diese Gene wurden gleichzeitig
auch in der Transkriptomstudie der MvfR Mutante als reguliert gefunden [Deziel et al., 2005]
3. ERGEBNISSE
- 60 -
3.2.2.3. PQS und MvfR regulierte Gene
Der “multiple virulence factor regulator” MvfR (PqsR) wurde als wichtiger Faktor in der
Regulation der QS-Systeme und der Virulenzfaktor-Produktion bei P. aeruginosa
beschrieben [Deziel et al., 2005] und ist gleichzeitig für die Kontrolle der PQS-
Biosynthese verantwortlich, wobei PQS als Koinduktor diskutiert wurde [Wade et al.,
2005]. Da MvfR der transkriptionelle Regulator des PQS-Biosynthese-Operons ist, würde
man erwarten, dass sowohl in einer Transkriptionsstudie von einer mvfR negativen
Mutante, als auch in einer Studie, in der exogen PQS zu PAO1 Kulturen dazugegeben
wurde, PQS abhängige Gene als reguliert gefunden werden.
Wir haben 20 Gene gefunden, die sowohl durch PQS Zugabe differentiell transkribiert
wurden und die auch in der Transkriptionsstudie mit der mvfR negativen Mutante als
reguliert erschienen (siehe Tabelle 6) [Deziel et al., 2005]. Darunter fallen neben 8
hypothetischen Proteinen auch mexG und mexH Gene, die von Aendekerk et al.
[Aendekerk et al., 2005] als wichtige Faktoren beschrieben wurden, um Wachstum und
Antibiotika Sensitivität zu regulieren. Des Weiteren wurde rsmA als reguliert gefunden,
wobei es sich im einen post-transkriptionalen negativen Regulator von
Sekundärmetaboliten handelt und der ein Gegenspieler von GacA ist. PhzS, welches für ein
Enzym kodiert, das an der Pyocyanin-Biosynthese aus Phenazin-1-carboxyl Säure beteiligt
ist, wurde genauso durch PQS und MvfR reguliert, wie vier mögliche Hitzeschockproteine
(clpB, ibpA, hslU und hslV). Auch bfrB und das mögliche Bakterioferritin PA4880 wurden
sowohl in der mvfR negativen Mutante, als auch unter exogener Zugabe von PQS
differentiell reguliert.
Tabelle 6: Durch PQS regulierte Gene, die auch in der Transkriptionsstudie einer mvfR negativen
Mutante reguliert erschienen [Deziel et al., 2005]
PA- Nummer Gen 5 h 11 h 20 h Bezeichnung nach www.pseudomonas.com
PA0200 +6,96 hypothetical protein PA0284 +8,51 hypothetical protein PA0905 rsmA +2,60 RsmA, regulator of secondary metabolites PA0997 pqsB -2,38
3. ERGEBNISSE
- 61 -
PA2126 +2,35 conserved hypothetical protein PA2274 +3,03 hypothetical protein PA2331 +2,39 hypothetical protein PA3126 ibpA +4,76 heat-shock protein IbpA PA3520 +2,85 hypothetical protein PA3531 bfrB -50,40 Bacterioferritin PA4141 +7,30 +4,14 +5,17 hypothetical protein PA4205 +11,39 hypothetical protein
PA4206 mexH +8,22 probable Resistance-Nodulation-Cell Division (RND) efflux membrane fusion protein precursor
PA4217 phzS +3,66 flavin-containing monooxygenase PA4542 clpB +4,99 ClpB protein
PA4587 ccpR -2,23 -3,18 cytochrome c551 peroxidase precursor
PA4880 -2,55 probable bacterioferritin PA5053 hslV +2,95 heat shock protein HslV PA5054 hslU +2,48 heat shock protein HslU PA5170 arcD +2,31 arginine/ornithine antiporter
Fettschrift: Diese Gene wurden gleichzeitig auch in Transkriptomstudien mit Eisenmangel als
reguliert identifiziert [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003] Kursiv: Diese Gene wurden gleichzeitig
auch in Transkriptomstudien unter oxidativem Stress als reguliert gefunden [Palma et al., 2004;
Salunkhe et al., 2005]
3. ERGEBNISSE
- 62 -
3.2.2.4. Sonstige PQS-regulierte Gene
In diesem Abschnitt sind die Gene zusammengefasst, die durch PQS transkriptionell
reguliert wurden, aber in keiner der anderen oben genannten Transkriptionsstudien als
reguliert gefunden wurden [Deziel et al., 2005; Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003;
Palma et al., 2004; Salunkhe et al., 2005]. Aber auch in der Tabelle 7 sind Gene
differentiell exprimiert, die wahrscheinlich für eisenabhängige Faktoren kodieren, wie
SodB (eisenabhängige Superoxid Dismutase), PA4430 (mögliches Cytochrom b) und
PA4431 (mögliches Eisen Sulfat Protein). Ebenso sind Gene hoch reguliert, deren
Produkte für die Anpassung gegenüber Stress wichtig sind. Darunter fallen dnaK (DnaK
Protein) und grpE (Hitzeschock-Protein) sowie das mögliche DNA-Binde-Stress Protein
PA0962.
Tabelle 7: PQS-regulierte Gene, die weder in Transkriptionsstudien unter Eisenmangel, H2O2 Stress
noch in einer mvfR negativen Mutante als differentiell reguliert identifiziert wurden
PA -Nummer Gen 5 h 11 h 20 h Bezeichnung nach www.Pseudomonas.com
PA0359 -2,03 hypothetical protein PA0721 -2,83 hypothetical protein of bacteriophage Pf1 PA0753 -3,11 hypothetical protein PA0962 +3,10 probable dna-binding stress protein PA1582 sdhD -12,38 succinate dehydrogenase (D subunit) PA2674 -5,47 probable type II secretion
system protein PA2868 +10,34 hypothetical protein PA3524 gloA1 -2,34 lactoylglutathione lyase PA3815 +3,63 conserved hypothetical protein PA4263 rplC -2,58 50S ribosomal protein L3 PA4366 sodB -4,03 -3,01 -4,38 superoxide dismutase PA4430 -7,73 probable cytochrome b PA4431 -3,01 -3,53 probable iron-sulfur protein PA4761 dnaK +2,48 DnaK protein PA4762 grpE +3,14 heat shock protein GrpE PA5100 hutU -4,61 Urocanase
3. ERGEBNISSE
- 63 -
Zusammenfassend konnte in unserer Transkriptionsstudie festgestellt werden, dass die
Gene, die unter Zugabe von 40 µM PQS reguliert wurden in großen Teilen dem Fur
Regulon entsprachen. Ebenso gab es viele Gene, die sowohl durch PQS als auch unter
H2O2 Stress reguliert wurden. Allerdings ist auch deutlich geworden, dass es PQS
regulierte Gene zu geben scheint, die nicht mit Eisenmangel in Verbindung gebracht
werden können. Zu diesen Genen zählen rsmA, pqsB und mexGH. Sie zeigten sich sowohl
in dieser Studie als PQS abhängig reguliert, als auch in der Transkriptionsstudie mit der
mvfR negativen Mutante als differentiell transkribiert und unterliegen damit offensichtlich
einer PQS spezifischen Regulation.
3.3. Vergleich der durch PQS-Zugabe regulierten Gene mit
anderen P. aeruginosa Transkriptionsstudien
Im Anschluss an die Transkriptionsstudie wurden die durch PQS-Zugabe als differentiell
reguliert gefunden Gene mit den Genen, die in anderen P. aeruginosa
Transkriptionsstudien als reguliert beschrieben wurden, verglichen. Die Anzahl der Gene,
die in jeweils zwei Transkriptionsstudien als reguliert erschienen, wurden in der Tabelle 8
zusammengefasst, um einen Überblick über die bisher veröffentlichten P. aeruginosa
Transkriptionsstudien zu bekommen.
3. ERGEBNISSE
- 64 -
3.4. PQS Effekt auf die Eisenkonzentration
Da nach der externen PQS-Zugabe, die Gene in den transkriptionellen Analysen so
reguliert waren, als würde ein Eisenmangel vorliegen, wurde untersucht, ob PQS direkt
einen Eisenmangel in der Kultur hervorruft. Dazu wurde in P. aeruginosa Kulturen mit
und ohne PQS der Eisengehalt gemessen, und mit dem Gehalt in Kulturen verglichen,
denen 2,2-Bispyridyl als Eisenchelator in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt wurde.
Die Untersuchungen der Eisenkonzentration im Verlauf der Kultivierungen ergaben, dass
bei den Kulturen mit 40 µM PQS die Eisenkonzentration im Medium viel schneller sank,
[H t t l 2003 Whit l t l 2001 W lf t l 2004]
Tabelle 8: Vergleich von zuvor in verschiedener Transkriptomstudien als reguliert identifizierten
Genen mit den Genen, die in dieser Studie als durch PQS reguliert identifiziert wurden
3. ERGEBNISSE
- 65 -
als in den Kulturen ohne PQS. Nach 1 h waren in den Kontrollkulturen noch 0,47 mg/l
Eisen vorhanden, wogegen in den Kulturen mit PQS nur noch 0,25 mg/l und damit gut die
Hälfte des Eisens messbar war. Im Vergleich dazu sank der messbare Eisengehalt in den
Kulturen ohne PQS nach 5 h nur auf 0,36 mg/l (Abbildung 3-11).
Die Vergleichswerte mit 2,2-Bispyridyl zeigten einen konzentrationsabhängigen Effekt auf
die Konzentration von freiem Eisen im Medium. Die Eisenkonzentration sank in dem
Kolben mit PQS schneller als in den Kolben mit 2,2-Bispyridyl, so dass in der PQS-
haltigen Kultur der Eisengehalt nach einer Stunde mit 0,25 mg/l der Konzentration
entsprach, welche die 200 µM 2,2-Bispyridyl Kultur nach einer Stunde zeigte. Nach 2 h
war der Wert aber bereits vergleichbar mit der 500 µM 2,2-Bispyridyl Kultur. Das setzte
sich fort, so dass nach 5 h, wo nur noch 0,07 mg/l messbares Eisen in der PQS Kultur war,
die Eisenkonzentrationen nahezu mit der Konzentration der 1 mM 2,2-Bispyridyl Kultur
übereinstimmte (0,05 mg/l).
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50
1,0 2,5 4,0 5,0Zeit (h)
Eis
en K
onze
ntra
tion
(mg/
l) PAO1 Kontrolle
PAO1 + 40 µM PQS
PAO1 + 100 µM 2,2-Bispyridyl
PAO1 + 200 µM 2,2-Bispyridyl
PAO1 + 500 µM 2,2-Bispyridyl
PAO1 + 1000 µM 2,2-Bispyridyl
Abbildung 3-11: Eisenkonzentration im BHI Kulturen in Abhängigkeit von Zeit und zugegebenen
PQS oder 2,2-Bispyridyl
3. ERGEBNISSE
- 66 -
3.5. PQS komplexiert Fe(III) in vitro
Um Hinweise darauf zu bekommen, auf welche Weise PQS zum Eisenmangel führt, wurde
versucht, ob PQS dem BHI Medium auch im bakterienfreien System Eisen entziehen kann,
oder ob P. aeruginosa dafür nötig ist. Neben einem direkten PQS Effekt könnte eine
Überproduktion an Siderophoren eine Erklärung für die schnell sinkende
Eisenkonzentration sein.
Schüttelkolben wurden mit BHI Medium und PQS versetzt und ohne Bakterien bei 37 °C
geschüttelt. Als Kontrolle wurde der Eisengehalt in BHI Medium bestimmt. In den Kolben,
die zusätzlich PQS enthielten, war nach 1 h Schüttelinkubation bei 37 °C ein roter
Niederschlag abzuzentrifugieren. Das war weder bei den Kontrollkolben der Fall, noch
direkt nach der PQS-Zugabe möglich. Das Prezipitat wurde mit Dichlormethan extrahiert
und mit DC auf PQS untersucht. Als Vergleich wurde aus dem gleichen Kolben der
Überstand extrahiert und ebenfalls aufgetragen. PQS war eindeutig in dem roten
Niederschlag nachweisbar.
Nach der Inkubation bei 37 °C wurde die Eisenkonzentration im Medium bestimmt. Die
Konzentration an freiem Eisen sank im Medium mit PQS deutlich. Die Ergebnisse waren
vergleichbar mit den P. aeruginosa Schüttelkulturen mit PQS.
Dieser Versuch zeigte, dass PQS alleine in der Lage ist, das Eisen aus dem Medium zu
binden. Bakterien bzw. andere Metaboliten waren nicht erforderlich. Bemerkenswert dabei
war, dass die Bindung ein Schütteln des Mediums erforderte, um den roten Niederschlag
zu bilden. Der Versuch, das Eisen aus dem BHI Medium in einem geschlossenen 2 ml
Reaktionsgefäß mit PQS zu entziehen, gelang nicht. Ein Sauerstoffeintrag schien für die
Reaktion unerlässlich zu sein.
Um einen weiteren Einblick in die Bindereaktion von PQS und Eisen zu bekommen, wurde
PQS mit Fe2SO4 und mit Fe3SO4 gemischt. Dabei wurde das Eisensulfat mit 250 mM im
deutlichen Überschuss zu PQS (2 mM) eingesetzt und im 2 ml Reaktionsgefäß gemischt.
Beim Fe3SO4 wurde das Gemisch sofort rötlich und es ließ sich ein roter Niederschlag
zentrifugieren. Das Fe2SO4 musste dagegen offen mehrere Minuten gemischt werden,
3. ERGEBNISSE
- 67 -
damit ebenfalls ein roter Niederschlag entstand, der nicht so stark war, aber sich dennoch
zentrifugieren ließ. Die als biologisch inaktiv beschriebene Vorstufe von PQS 2-Heptyl-4-
hydroxyquinolin (HHQ) bildete weder mit Fe2SO4 noch mit Fe3SO4 einen zentrifugierbaren
Niederschlag. Alle vier Proben wurden in ESI analysiert.
Bei der Fe3SO4/ PQS Probe stellte sich heraus, dass zwei PQS Moleküle mit einem Fe(III)
Atom einen Komplex ausbilden, der so stabil war, dass bei einer anschließenden MS2
Analyse die kovalenten Bindungen der Alkyl-Seitenketten des PQS nacheinander
abgespalten wurden (Abbildung 3-12). Der Komplex zwischen PQS und Eisen blieb stabil.
Von anderen gefundenen Komplexen, wie z.B. zwei PQS Moleküle oder drei PQS und ein
Fe(III) ließ sich dagegen mit sehr wenig Energie ein PQS abspalten, so dass einzelne PQS
Moleküle oder ein stabiler Komplex aus zwei PQS und einem Fe(III) entstanden.
Bei eingesetztem Fe2SO4/ PQS wurde ebenfalls ein stabiler Komplex aus zwei PQS und
einem Fe(III) nachgewiesen. Fe(II) haltige PQS Komplexe wurden dagegen nicht
gefunden. Für die Oxidation des Fe(II) zu Fe(III) war der Sauerstoffeintrag durch das
mischen unerlässlich. Deshalb war es auch nicht möglich, ohne gute Durchmischung und
Sauerstoffeintrag PQS/ Eisen Komplexe aus BHI Medium zu erhalten.
Mit 2-Heptyl-4-hydroxyquinolin konnte weder mit Fe(II) noch mit Fe(III) Komplexe
nachgewiesen werden. Das zeigt, dass nur die als aktiv beschrieben HAQ Substanz PQS
[McKnight et al., 2000; Pesci et al., 1999] Eisen komplexieren kann und die als inaktiv
beschriebenen HHQs [McKnight et al., 2000; Pesci et al., 1999] als Vorstufe von PQS
keine Komplexe mit Eisen bilden können.
3. ERGEBNISSE
- 68 -
Abbildung 3-12 A: ESI des PQS/ Fe(III) Präzipitat B: MS2 des 831,50 m/z Signals [3
PQS-2H+Fe]+; Das Fragmention zerfällt leicht unter Abspaltung eines PQS in [2PQS-
2H+Fe] C: MS2 des 572,32 [m / z] Signals [2PQS-2H+Fe]+. Vom stabilen Komplex werden
CH2 bzw. CH3 Gruppen der Heptyl Ketten der PQS Moleküle abgespalten. Der Kompex
mit Eisen bleibt dagegen stabil.
3. ERGEBNISSE
- 69 -
3.6. Das Rhl-QS-System wird durch Eisenmangel induziert
Es wurde beschrieben, dass exogene PQS Zugabe zu einer Hochregulation des Rhl-QS
Systems führt [McKnight et al., 2000]. Nachdem gezeigt werden konnte, dass exogene
PQS-Zugabe sehr schnell zu Eisenmangel im Medium führt, stellte sich die Frage, ob die
Regulation des Rhl-Systems auf PQS oder auf Eisenmangel zurückzuführen ist. Dazu
wurde die Aktivität des rhlR Promotors in Kulturen mit PQS und mit 2,2-Bispyridyl,
mittels einer lacZ Fusion, die auf dem pMAL.V Plasmid lokalisiert ist [Latifi et al., 1996],
verglichen. Durch die LacZ Aktivität konnten Rückschlüsse auf die Promotor-Aktivität
während der Kultivierung gezogen werden.
In den Versuchen wurde gezeigt, dass sich die rhlR Promotoraktivität eindeutig sowohl
durch PQS Zugabe, als auch durch Eisenentzug mit Hilfe von 500 µM 2,2-Bispyridyl
signifikant steigern ließ. Dabei erreichte die Aktivierung mit 2,2-Bispyridyl bereits nach 4
Abbildung 3-13: Relative rhlR Promotor Aktivität nach 4 h und 7 h von PAO1,
PAO1 mit 40 µM PQS und PAO1 mit 500 µM 2,2-Bispyridyl; Die Regulation
war nach 4 h bei den Kolben mit 2,2-Bispyridyl und nach 7 h bei den Kolben
mit 40 µM PQS signifikant (T-Test p-value < 0,05)
0
50
100
150
200
250
300
350
4 7Zeit (h)
rela
tive
rhlR
Akt
ivitä
t (%
)
PAO1 Kontrolle
PAO1 + 40 µM PQS
PAO1 + 500 µM 2,2-Bispyridyl
3. ERGEBNISSE
- 70 -
h ihr Maximum. PQS zeigte nach dieser Zeit noch keine Wirkung auf das Rhl-QS-System.
Diese war erst nach 7 h deutlich zu erkennen (Abbildung 3-13), die Aktivität des rhlR
Promotors in der Kultur mit 2,2-Bispyridyl, im Vergleich zur Kontrolle, dagegen schon
wieder sank.
3.7. Die HAQ-Biosynthese wird eisenunabhängig durch PQS
verstärkt
Ganz offensichtlich ließ sich eine rhlR Promotor Aktivierung auch durch Eisenmangel
ohne PQS Zugabe erreichen. Es ist allerdings denkbar, dass die PQS Produktion durch
Eisenmangel verstärkt wird und dass eine erhöhte PQS Konzentration zur Induktion des
Rhl-QS Systems führt und nicht der Eisenmangel als direktes Signal. Um dies zu
überprüfen, wurden gesamt HAQ Extrakte aus Kulturen mit und ohne 500µM 2,2-
Bispyridyl gewonnen und mit GC/MS analysiert.
Bei den vergleichenden Untersuchungen von PAO1 Kontrollkulturen, mit 40 µM PQS
versetzen Kulturen und Kulturen mit 500 µM 2,2-Bispyridyl wurde festgestellt, dass nur
bei den PQS Kulturen auch die HAQ Produktion verstärkt war. Bei den 2,2-Bispyridyl
Kulturen konnte dagegen, im Vergleich zu den Kontrollen, kein Unterschied in der HAQ
Produktion festgestellt werden.
Das bedeutet zusammenfassend, dass es bei exogener PQS Zugabe zu einer Autoinduktion
des PQS Biosynthese Operons kommt und dass dieser PQS Effekt unabhängig vom
Eisengehalt des Mediums ist.
3.8. Multiple Funktionen von PQS
Die Ergebnisse, die belegen, dass PQS ein eisenbindender Sekundärmetabolit von P.
aeruginosa ist, welches, wenn extern zu einer Kultur gegeben wird, zu Eisenmangel in der
3. ERGEBNISSE
- 71 -
Kultur und zu einer transkriptionellen Regulation der Gene führt, die für die
Aufrechterhaltung des Eisenhaushalts wichtig sind, sind sehr interessant und bieten einen
neuen Ansatzpunkt für die Erklärung des bisher beschriebenen Wirkmechanismus von
PQS. Dennoch lassen sich nicht alle PQS Effekte auf Eisenmangel reduzieren. Einige
Gene, wie z.B. das PQS Operon selbst, werden durch PQS und nicht durch Eisenmangel
reguliert.
Die Frage, die sich nun stellte, war, in welcher Weise PQS noch auf die P. aeruginosa
Kultur Einfluss nehmen kann.
3.8.1. Computermodell der Interaktion von PQS und DNA
Auf Grund der Struktur von PQS wurde vermutet, dass PQS mit DNA interagieren könnte,
und es wurde eine Interaktion zwischen PQS und einem 141 Bp langen DNA Fragment im
Computermodell simuliert. Die Simulation wurde von Dr. Joachim Reichelt an der GBF
Braunschweig mit Hilfe des Programms BRAGI durchgeführt [Reichelt et al., 2005]. Da
die Rechnungen sehr viel Zeit in Anspruch nehmen (ca. 1 Monat CPU Rechenzeit für 500
ps) und bei Raumtemperatur die Reaktionen zu langsam ablaufen, wurden die Rechnungen
bei 510 °K durchgeführt.
Im Modell lagerte sich das PQS in der großen Furche an die DNA so an, dass sich einzelne
Basen aus der Doppelhelix heraus zum PQS drehen (siehe Abbildung 3-14). Durch diese
Interaktion wurde die DNA teilweise einzelsträngig. Strangbrüche wurden im Modell
durch das PQS nicht herbeigeführt.
Die gleiche Rechnung wurde auch mit dem inaktiven HHQ [Pesci et al., 1999]
durchgeführt. Im Modell hatte das HHQ nicht den gleichen Effekt auf die DNA, wie das
PQS. Es gab zwar Wechselwirkungen, die aber nicht zur Entwindung der Doppelhelix und
auch nicht zur Generation von Einzelsträngen führte (siehe Abbildung 3-15).
3. ERGEBNISSE
- 72 -
Abbildung 3-14: PQS-DNA Interaktion im Computermodell
Abbildung 3-15: HHQ interagiert nicht mit der DNA
3. ERGEBNISSE
- 73 -
3.8.2. PQS verstärkt die DNA Fragmentierung durch Fe(II) in vitro
Anhand des Computermodells wurde gezeigt, dass PQS mit DNA interagiert. Deshalb
wurde in vitro λ-DNA mit PQS und HHQ inkubiert. Es war keine Veränderung im
Laufverhalten der DNA im Agarosegel zu sehen (Abbildung 3-16) Spur 2 und 3 λ-DNA;
Spur 4: λ-DNA mit PQS und Spur 5: λ-DNA mit HHQ). Wenn PQS nur eine strukturelle
Veränderung der DNA bewirkt, ist dies auch nicht zu erwarten gewesen. Wir haben daher
im nächsten Schritt getestet, ob eine strukturelle Veränderung zu einer größeren
Empfindlichkeit der DNA gegenüber
oxidativem Stress führt. Daher wurde die λ-
DNA mit Fe(II) (Spur 6) und PQS (Spur 7)
bzw. HHQ (Spur 8) inkubiert. Wir konnten
zeigen, dass offensichtlich die DNA Struktur
durch PQS so verändert wird, dass die DNA
deutlich stärker fragmentiert. Die HHQ
Zugabe zeigte dagegen keinen Effekt. Es sind
also keine weiteren lytischen Enzyme wie z.B.
DNasen für eine PQS induzierte
Fragmentierung der DNA notwendig.
Abbildung 3-16: verstärkte DNA
Fragmentierung durch Fe(II) und PQS
1:Smart Leiter 2 und 3: λ-DNA 4: λ-DNA mit
PQS 5: λ-DNA mit HHQ 6: λ-DNA mit Fe(II)
7: λ-DNA mit Fe(II) und PQS 8: λ-DNA mit
Fe(II) und HHQ
3. ERGEBNISSE
- 74 -
3.8.3. PQS fragmentiert in vivo DNA
Um die Art der Wechselwirkung von
PQS und DNA in vivo besser zu
verstehen, wurde chromosomale
DNA von PAO1 und einer pqsA
negativen Mutante - die kein PQS
mehr produziert, weil das erste Gen
des pqs Operon defekt ist - nach 4
und 5 Tagen Wachstum in
biofilmähnlichen Bedingungen auf
Weichagarplatten isoliert und das
Laufverhalten im Agarosegel
verglichen.
Die Laufmuster unterschieden sich
deutlich (Abbildung 3-17). Die pqsA
negative Mutante zeigte kaum eine
DNA Fragmentierung nach 4 und 5 Tagen (Abbildung 3-17; Spuren 2 und 4) verglichen
mit dem PQS produzierenden PAO1, dessen DNA mit zunehmender Inkubationszeit
deutlich mehr fragmentiert ist (Abbildung 3-17; Spuren 1 und 3).
Es konnte damit auch in vivo gezeigt werden, dass PQS an der DNA Fragmentierung
beteiligt ist.
Abbildung 3-17: Vergleichende DNA Fragmnetierungs-
muster von PAO1 und pqsA Mutante nach 4 und 5 Tagen
1:PAO1 4Tage; 2: pqsA Mutante 4 Tage; 3: PAO1 5 Tage;
4: pqsA Mutante 5 Tage
3. ERGEBNISSE
- 75 -
3.9. PQS induziert einen bakteriellen Zelltod und die
Bereitstellung von extrazellulärer DNA
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PQS in vitro und in vivo an einer DNA
Fragmentierung beteiligt ist. Als Konsequenz daraus findet sich deutlich mehr
extrazelluläre DNA in einer Kultur der PQS produzierenden SCV 20265 (Abbildung 3-18)
im Vergleich zu einer PQS-negativen Mutante M1 mit einer Transposoninsertion im PQS
Biosynthese-Operon (Abbildung 3-19). Die extrazelluläre DNA wurde spezifisch mit dem
TOTO-1 Farbstoff aus zwei Tage alten Kolonien auf Columbia-Blut-Agar angefärbt.
Als nächstes wurde mit Hilfe von einer „life and dead“ Färbung überprüft, welchen
Einfluss die PQS Produktion auf die Überlebensrate der Bakterien in einer Kolonie hat.
Dazu wurden die Bakterien aus SCV 20265- und M1 (pqsA negativen Mutante)-Kolonien
nach einem Tag gefärbt und im Fluoreszenz Mikroskop analysiert. Es ist eindeutig zu
sehen, dass nach einem Tag fast 90 % der Bakterien in der SCV 20265 Kolonie tot sind
(Abbildung 3-20), wogegen deutlich mehr Bakterien in der Kolonie der pqsA negativen
Mutante noch leben (Abbildung 3-21).
Abbildung 3-19: M1 (pqsA negative Mutante)
TOTO-1 Färbung der extrazellulären DNA nach
zwei Tagen
Abbildung 3-18: SCV 20265 TOTO-1 Färbung
der extrazellulären DNA nach zwei Tagen
3. ERGEBNISSE
- 76 -
Es gibt bei P. aeruginosa folglich einen Zusammenhang zwischen PQS Produktion, DNA
Fragmentierung, Lyse der Bakterien und Bereitstellung von extrazellulärer DNA.
3.10. PQS vermittelt morphologische Diversität in der späten
Wachstumsphase
Typischerweise bildet P. aeruginosa im Biofilm in der späten stationären Phase
verschiedene Koloniemorphotypen aus [Boles et al., 2004]. Die Ausbildung dieser
morphologischen Diversität ist auch als „insurance effect“ bezeichnet worden, da eine
heterogene Population größere Chancen hat, verschiedene Stressbedingungen zu
überleben, als eine homogene Kultur. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass diese
Diversität RecA abhängig ist [Boles et al., 2004].
Wir haben den PAO1 Wildtyp, eine recA Mutante und eine pqsA negative Mutante 4 und 5
Tage auf Weichagar inkubiert und die Koloniemorphotypen auf Columbia-Blut Agar
überprüft. Der PAO1 Wildstamm zeigte mindestens drei verschiedenen Kolonie
Morphotypen (Abbildung 3-22), die in gleicher Verteilung auftraten, wogegen weder die
Abbildung 3-20: SCV live and dead Färbung
nach einem Tag: rote Bakterien sind tot; grüne
Bakterien leben
Abbildung 3-21: M1 live and dead Färbung nach
einem Tag: rote Bakterien sind tot; grüne
Bakterien leben
3. ERGEBNISSE
- 77 -
recA noch die pqsA Mutante deutlich von der ursprünglichen Kolonieform abweichende
Kolonien ausbildeten.
Abbildung 3-22 a: ursprünglicher Morphotyp, b: durchsichtiger Morphotyp, c:
kleiner Morphotyp (keine SCV)
4. DISKUSSION
- 78 -
4. Diskussion
P. aeruginosa ist ein fakultativ pathogener Keim, der eine wichtige Rolle als Erreger bei
nosokomialen Infektion und bei Patienten mit CF spielt. Maßgeblich für die Pathogenität
von P. aeruginosa ist ein Arsenal von Virulenzfaktoren, welche zum großen Teil durch
Quorum Sensing reguliert werden. Die interbakterielle Kommunikation wird durch
Signalmoleküle (Autoinducer) vermittelt, deren Konzentration mit steigender Zelldichte
der Bakterien Population zunimmt. Haben die Autoinducer einen gewissen Schwellenwert
überschritten, dann binden sie intrazellulär an den transkriptionellen Regulator und
aktivieren diesen und damit eine Gruppe von Genen, welche unter der Kontrolle des
Regulatorproteins steht. Dieses System ermöglicht es in Abhängigkeit von der Zelldichte,
Gene koordiniert zu regulieren. P. aeruginosa verfügt über zwei QS Systeme, die in einer
Hierarchie angeordnet sind. Das Las-QS-System dominiert dabei über das Rhl-QS-System.
Beide Systeme bestehen aus einer Autoinducer-Synthase (LasI, RhlI) und einem
transkriptionellen Regulatorprotein (LasR, RhlR), welches durch die Bindung des
spezifischen Autoinducers aktiviert wird. Bei den Autoinducern handelt es sich um n-Acyl-
Homoserinlaktone.
1999 wurde bei P. aeruginosa 2-Heptyl-3-hydroxy-4-quinolon (PQS) als drittes
Signalmolekül beschrieben, welches sich von den zwei Autoinducern strukturell
unterscheidet [Pesci et al., 1999]. Das PQS interagiert mit den zwei QS Systemen von P.
aeruginosa und ist an der Induktion des Rhl-QS-Systems maßgeblich beteiligt. Zahlreiche
Untersuchungen haben ein sehr komplexes regulatorisches Netzwerk um die beiden QS-
Systeme gezeigt, wobei PQS eine zentrale Rolle einnimmt: • PQS wird in der einsetzenden stationären Phase gebildet [Diggle et al., 2003] und
steht unter der Kontrolle des Las QS-Systems [McKnight et al., 2000; Pesci et al.,
1999].
• Ohne PQS Produktion und ohne PqsE, welches als PQS Effektor Molekül
beschrieben wurde [Gallagher et al., 2002], produziert P. aeruginosa nur geringe
4. DISKUSSION
- 79 -
Mengen an Rhl-QS-System abhängigen Exoprodukten wie Pyocyanin, PA-IL
Lectin, obwohl das Rhl-QS-System aktiv ist [Diggle et al., 2003].
• MvfR (PqsR) ist ein Las-QS-System abhängiger transkriptioneller Regulator des
pqsA-E Operons, der phnAB Gene und von sich selbst [Deziel et al., 2005].
• Exogene PQS Zugabe führt zur Aktivierung des Rhl QS Systems und bedingt zur
Aktivierung des Las QS Systems. Verstärkte LasB, Pyocyanin, PA-IL Lectin und
RpoS Produktion sind die Folgen [Diggle et al., 2003; Gallagher et al., 2002;
McKnight et al., 2000]
Allerdings bleibt der molekulare Mechanismus der Wirkung von PQS auf die QS Systeme
von P. aeruginosa unbekannt.
4.1. HAQ Biosynthese
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Biosyntheseweg von PQS untersucht. Calfee et al.
zeigten 2001, dass Anthranilat für die PQS Biosynthese unerlässlich ist und postulierten
einen Biosyntheseweg von PQS über die Kondensation von Anthranilat und β-
Ketofettsäuren [Calfee et al., 2001]. In einer Arbeit von Deziel et al. [Deziel et al., 2004]
konnte gezeigt werden, dass erst eine Vorstufe von PQS - die HHQs – in großen Mengen
synthetisiert werden, aus denen durch die Monoxigenase PqsH PQS gebildet wird [Deziel
et al., 2004]. Auf der Suche nach weiteren Genen, deren Produkte an der Biosynthese von
HAQ beteiligt sind, wurde in dieser Arbeit eine Transposonmutagenese mit dem klinischen
Isolat SCV 20265 [Haussler et al., 1999] durchgeführt und nach HAQ defizienten
Mutanten gescreent. Dieses Isolat produziert HAQ abhängige kristalline Strukturen in
großer Menge und eignete sich deshalb besonders gut für den Screen. Unter den 26
gefundenen HAQ negativen Mutanten hatten über die Hälfte einen Defekt in einem der 4
Gene (carB, pyrB, pyrD, pyrE) des Pyrimidin-Stoffwechselwegs, der an der Bildung von
Orotat beteiligt ist. Die Ergebnisse führten neben dem von Calfee et al. postulierten HAQ
4. DISKUSSION
- 80 -
Biosyntheseweg [Calfee et al., 2001], zu einer alternativen Theorie: die Synthese könnte
auch über eine Reaktion von Anthranilat und Orotat unter der Bildung der Vorstufe
Kynurat verlaufen, an die nachträglich ein Alkyl Rest angehängt wird. Es stellte sich
heraus, dass die Pyrimidin Mutanten unter Zugabe von Substraten, die den
Stoffwechselweg komplementierten, wieder HAQ produzierten und dass eine deutlich
höhere OD600 erreicht wurde, als ohne Substrate. Des Weiteren wurde mit Hilfe von
GC/MS und NMR Analysen von nicht radioaktiv markierten HAQ Extrakten gezeigt, dass
die Synthese der HAQ über eine Kondensation von Anthranilat und eine β-Ketofettsäure
verläuft. Dabei wird die Fettsäurekette über eine „head to head“ Kondensation an das
Anthranilat gebunden. Diese Ergebnisse bestätigten die Arbeit von Ritter und Luckner, die
mit radioaktiv markierten Substraten arbeiteten [Ritter und Luckner, 1971b].
Bei den GC/MS Analysen der markierten HAQ Extrakte konnten wir außerdem zeigen,
dass die Markierung nicht nur im PQS sondern auch in anderen HAQ Derivaten
nachgewiesen werden konnte. Das beweist, dass es einen Biosyntheseweg für die HAQs
von P. aeruginosa gibt und bestätigt die Arbeiten von Lepine und Deziel [Deziel et al.,
2004; Lepine et al., 2004; Lepine et al., 2003].
Bei den Analysen fiel zudem auf, dass die Fettsäurenkettenlänge der HAQ mit
zunehmender Kultivierungsdauer zunahm. Dies war auch der Fall in den Lipidresten von
Rhamnolipiden, die ein bedeutender Virulenzfaktor von P. aeruginosa sind. Die
Vermutung lag nahe, dass P. aeruginosa einen gemeinsamen Fettsäurepool für die
Synthesen von HAQ und Rhamnolipiden verwendet. Wir untersuchten daraufhin eine rhlG
Mutante auf HAQ Produktion. Für diese Mutante konnte gezeigt werden, dass sie durch
einen Defekt in der Fettsäure Bereitstellung nur 10 % der Rhamnolipide produziert
[Campos-Garcia et al., 1998]. Wir konnten zeigen, dass die rhlG Mutante 40 % weniger
HAQs produziert als der Wildtyp. Das bedeutet, dass ein Teil der Fettsäuren für HAQ und
Rhamnolipid Biosynthesen aus dem gleichen Pool bereitgestellt werden. Für die HAQ
Biosynthese scheint es noch andere Bezugsquellen für die Fettsäuren zu geben, die noch
nicht bekannt sind.
4. DISKUSSION
- 81 -
4.2. Transkriptom Analyse unter Einfluss von PQS
PQS wurde als Signalmolekül beschrieben, welches einen Einfluss auf die QS-Systeme
von P. aeruginosa hat [Pesci et al., 1999]. Der positive regulatorische Effekt von exogen
zu den Bakterien gegebenen PQS, wurde mit Hilfe von lacZ Fusionen, hauptsächlich für
rhlI und lasB und in geringerem Maß für rhlR und lasR gezeigt [McKnight et al., 2000].
Wir waren an der transkriptionellen Regulation durch exogenes PQS interessiert. In dieser
Arbeit wurde 40 µM synthetisches PQS zu P. aeruginosa PAO1 Kulturen gegeben. Zuerst
wurde mit Realtime PCR die differentielle Transkription von rhlR und rhlA eruiert. Die
Ergebnisse zeigten, dass es eine Regulation auf transkriptioneller Ebene bereits nach 5 h
gab. Diese war sehr gering, obwohl deutliche PQS abhängige Effekte auf das Rhl-QS-
System in den Kulturen zu sehen waren:
i Pyocyanin wurde in den Kolben mit PQS deutlich verstärkt produziert
ii rhlR-lacZ Promotorfusion zeigte, dass durch PQS Zugabe die Promotoraktivität
signifikant stieg
Darauf folgten Array Experimente nach 5, 11 und 20 h. Dabei wurden insgesamt 93 Gene
als reguliert gefunden.
4.2.1. PQS regulierte Gene: Eine Transkriptionsstudie
Das offensichtlichste Ergebnis der Transkriptionsanalyse war, dass durch PQS Gene
reguliert wurden, die bereits in anderen Transkriptionsstudien unter Eisenmangel als
reguliert gefunden wurden [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003]. 31 der 93 gesamt
durch PQS reguliert gefundenen Gene waren zuvor als eisenreguliert beschrieben worden.
Z.B. wurde eine erhöhte Expression der Pyoverdin und Pyochelin Eisenaufnahme Systeme
und eine starke Repression der Eisenspeicher Proteine (Bakterioferritin) gefunden, was
dafür spricht, dass in den Kulturen mit PQS ein Eisenmangel herrscht. Die Analyse des
Eisengehalts in den Kulturen zeigte, dass PQS die Konzentration an freiem Eisen deutlich
reduzierte. Wir waren an dem Mechanismus des PQS induzierten Eisenmangels
4. DISKUSSION
- 82 -
interessiert. Deshalb untersuchten wir, ob PQS das auch im zellfreien System Eisen
entziehen konnte und fanden mit ESI Analysen heraus, dass PQS in vitro stabile Komplexe
mit Fe(III) bildet (Abbildung 4-1).
HHQs bildeten dagegen keinen Eisenkomplex
aus. Interessanterweise wurde das PQS, welches
von uns als eisenbindende HAQ Komponente von
P. aeruginosa identifiziert wurde, als die aktive
Substanz in Bezug auf Regulation der QS
Systeme beschrieben [Pesci et al., 1999], die nicht
eisenbindenden HHQs zeigten dagegen keine
Aktivierung des Rhl Systems [Pesci et al., 1999].
Royt et al. [Royt et al., 2001] haben zuvor aus P.
aeruginosa Membranen 4-Hydroxy-2-nonylquinolin isoliert und diese als eine
eisenbindende Substanz beschrieben, obwohl sie – wie in dieser Arbeit - für die
synthetisch hergestellten HHQs keine Eisenbindung zeigen konnten.
Da PQS das freie Eisen im Medium komplexiert und einen Eisenmangel hervorruft, haben
wir mit Hilfe einer lacZ Fusion untersucht, ob rhlR auch durch Eisenmangel an sich
induziert werden kann. Die Ergebnisse zeigten, dass rhlR eindeutig durch Eisenmangel
induziert wird.
Neben den PQS regulierten Genen, die zuvor in anderen Transktiptionsstudien auch als
eisenreguliert gefunden wurden, gab es eine Reihe von Genen, die durch PQS und
oxidativen Stress reguliert wurden [Chang et al., 2005; Palma et al., 2004; Salunkhe et al.,
2005]. Ganz offensichtlich stehen der Eisenhaushalt der Bakterien und oxidativer Stress
durch H2O2 in einer engen Beziehung zueinander. Bei Eisenmangel werden neben den
Eisenaufnahme-Systemen auch Proteine, die in der Abwehr von oxidativen Stress
involviert sind, induziert. Das könnte dadurch erklärt werden, dass bei der Eisenaufnahme
vermehrt freies Eisen im Zytoplasma vorkommt, welches an der Bildung von Radikalen
beteiligt sein kann. Umgekehrt werden auch Eisenaufnahme-Systeme unter oxidativem
Stress mit H2O2 stärker exprimiert [Chang et al., 2005; Palma et al., 2004; Salunkhe et al.,
Abbildung 4-1: Möglicher Komplex
von PQS und Fe(III)
4. DISKUSSION
- 83 -
2005]. Das wurde damit begründet, dass das H2O2 kurzzeitig Fe(II) aus den aktiven
Zentren von Eisen Schwefel Proteinen löst und evtl. Fur inaktiviert und damit, trotz
genügend hoher intrazellulärer Eisenkonzentration, die Eisenaufnahme induziert [Palma et
al., 2004]. Dagegen wurde in einer anderen Arbeit beschrieben, dass unter H2O2 Zugabe
die Gene der Eisenaufnahme Systeme weniger stark exprimiert wurden [Chang et al.,
2005]. Das zeigt die Komplexität des Eisenhaushalts von P. aeruginosa, der offensichtlich
in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren reguliert wird.
Weiterhin hatten wir eine Gruppe von Genen identifiziert, die auch schon in
Transkriptomstudien mit mvfR negativen Mutanten als differentiell reguliert gefunden
wurden. MvfR wurde als transkriptioneller Regulator beschrieben, der als Teil des Las-QS-
Systems von P. aeruginosa reguliert wird. MvfR wirkt positiv transkriptionell auf die
phnAB Gene, das pqsA-E Operons und sich selbst, ohne dass das Las- oder das Rhl-QS-
System modelliert wird [Deziel et al., 2005]. Interessanterweise scheint die MvfR Aktivität
von einem intakten pqsA-E Operon abzuhängen. Von Wade et al. wurde postuliert, dass
PQS selbst ein Koinduktor von MvfR sei [Wade et al., 2005].
MvfR wurde in zwei Transkriptionsstudien unter Eisenmangel Bedingungen als reguliert
gefunden [Ochsner et al., 2002; Palma et al., 2003]. Nachdem wir mit GC/MS Analysen
zeigen konnten, dass die HAQ Produktion unter PQS Zugabe induziert wird, waren wir
daran interessiert, ob ein Eisenmangel die Produktion von HAQs über eine Regulation von
mvfR genauso induzieren kann, wie PQS. Da dies nicht möglich war, kann der Effekt von
PQS auf P. aeruginosa nicht auf den eisenkomplexierenden Effekt reduziert werden.
Diejenigen Gene, die Übereinstimmungen mit den in der mvfR negativen Mutante
regulierten Genen haben, nicht aber in den Transkriptomstudien unter Eisenmandel oder
oxidativem Stress vorkommen, sind Kandidaten für Produkte, die durch PQS, nicht aber
durch den von PQS verursachten Eisenmangel, reguliert werden. Dazu zählen das pqsA-E
Operon, mexGHI-ompD und rsmA.
4. DISKUSSION
- 84 -
4.3. Molekulare Wirkmechanismen von PQS
Die Ergebnisse der Transkriptionsstudien und der Eisenkomplexierungs Versuche zeigten,
dass PQS nach externer Zugabe zum Medium das Eisen komplexiert und damit einen
Eisenmangel Zustand mit entsprechenden transkriptionellen Regulationen zur Folge hat.
Dieser Effekt von PQS wurde bisher noch nicht beschrieben und wirft ein neues Licht auf
die molekularen Wirkmechanismen von PQS. Die Wirkung von PQS auf das Rhl-QS-
System scheint indirekt zu sein, weil auch ein Eisenmangel, der durch 2,2-Bispyridyl
hervorgerufen wurde, rhlR induzierte (siehe 3.4.). Dennoch gibt es ganz offensichtlich
PQS spezifische Effekte, die nicht mit einem Eisenmangel durch 2,2-Bispyridyl zu
simulieren sind. Dazu scheinen die Autoinduktion der HAQ Biosynthese und die
Regulation der MexGHI-OmpD Pumpe, die in engem Zusammenhang mit der Produktion
und der Wirkung von PQS gebracht wird [Aendekerk et al., 2005], zu zählen.
Aufgrund der Struktur des PQS Moleküls wurde eine Interaktion mit DNA postuliert. Eine
Computersimulation der Interaktion von PQS und DNA zeigte, dass sich das PQS Molekül
an die große Furche der DNA anlagert. Durch die PQS-DNA Interaktion wird die DNA an
dieser Stelle einzelsträngig. Interessanterweise wurde in der gleichen Simulation mit der
als biologisch inaktiv beschriebenen Substanz HHQ keine solche Wechselwirkung
beobachtet. Aufgrund dieser Simulation wurde in vitro PQS und HHQ mit DNA inkubiert
und nach verändertem Laufverhalten im Agarosegel geschaut. Es war kein Unterschied zu
sehen. Wenn jedoch Fe(II) als Reaktionspartner hinzugefügt wurde, zeigte nur die PQS
haltige Probe eine deutlich stärkere Fragmentierung der DNA. Dafür sind zwei mögliche
Ursachen denkbar: i) Das PQS verändert die strukturelle Integrität der DNA α-Helix und
macht sie angreifbar für Radikale. ii) Das PQS bindet Fe(III) und katalysiert damit die
Oxidation des Fe(II) und die Bildung von OH• Radikalen. Da HHQs weder eine
Eisenbindung aufweisen, noch im Computermodell die DNA Struktur veränderten, wird
die in vitro Fragmentierung der DNA auch nicht verstärkt.
4. DISKUSSION
- 85 -
Diese PQS abhängig DNA Fragmentierung konnten wir auch in vivo zeigen. Nach vier
Tagen in biofilmähnlichen Bedingungen zeigte der PQS produzierende PAO1 eine
deutliche Fragmentierung der chromosomalen DNA wogegen die PQS negative Mutante
kaum eine Fragmentierung der DNA aufwies. Eine spezifische Anfärbung der
extrazellulären DNA in zwei Tage alten Kolonien zeigte, dass auch deutlich mehr
extrazelluläre DNA in den Kolonien von PQS produzierenden Bakterien ist. Bereits nach
einem Tag konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der PQS produzierenden Bakterien in
einer Kolonie tot waren, wogegen die Bakterien, die kein PQS bildeten, zum großen Teil
noch lebten.
Doch welchen Vorteil hat P. aruginosa davon, eine Substanz zu produzieren, die
offensichtlich in relativ kurzer Zeit zum Sterben eines großen Teils der Population führt?
4.4. Biofilme, Adaption und Überleben
Die Anpassung an wechselnde Umgebungen und verschiedene Arten von Stress ist einer
der größten Herausforderungen, die an Lebewesen gestellt wird. P. aeruginosa hält eine
große Palette an Sensoren und Regulatoren für solche Situationen bereit [Stover et al.,
2000], um auf ein großes Spektrum an wechselnde Umweltbedingungen mit geeigneter
Genregulation reagieren zu können. Da das genetische Repertoire jedoch nicht für
sämtliche Umwelteinflüsse ausgelegt sein kann, ist ein sehr wichtiger Mechanismus, der
das Überleben sichert, Mutation und Selektion [Rainey, 1999]. Des Weiteren ist die
Ausbildung von Heterogenität innerhalb einer Population, insbesondere bei seltenen aber
unregelmäßigen Veränderungen sehr wichtig [Kussell und Leibler, 2005]. Monokultur
Wälder sind z.B. anfälliger gegenüber Insektenbefall als Mischwälder [McCann, 2000].
Dieser Effekt wird als „insurance effect“ bezeichnet [McCann, 2000]. Genauso sind auch
homogene Bakterien Populationen anfälliger gegenüber wechselnden
Umweltbedingungen. In P. aeruginosa konnte gezeigt werden, dass in Biofilmen eine
selbst generierte genetische Diversität ebenfalls zu einem „insurance effect“ führt [Boles et
4. DISKUSSION
- 86 -
al., 2004; Boles et al., 2005]. Dabei wurde gezeigt, dass es hauptsächlich zur Ausbildung
von drei unterschiedlichen Morphotypen kommt und dass dieser Mechanismus RecA
abhängig ist [Boles et al., 2004].
Eine genetische Diversität die auf Mutationen in Stress Situationen zurückzuführen ist,
wird auch stationäre Phase - oder adaptive Mutation genannt. Der Mechanismus wurde
sehr genau in E. coli untersucht, und es wurde gezeigt, dass die Anzahl der adaptiven
Mutationen, die zu der Reversion einer +1 Frameshift Punktmutation eines auf einem
Episom gelegenen lacI führen, maßgeblich von folgenden Faktoren abhängen [Foster,
2004]: i) von RpoS und damit von stationärer Phase und Stress ii) von den DNA-
Doppelstrangbruch-Reparaturproteinen RecABCD und RuvABC und iii) DNA Polymerase
IV der SOS Antwort. Dabei nimmt die durch dinB codierte DNA Polymerase IV eine
zentrale Rolle ein. Diese Polymerase lässt Fehler bei der DNA Replikation zu und führt
vermehrt zu Mutationen [Layton und Foster, 2003; Ponder et al., 2005], die sich von
„normalen“ Mutationen unterscheiden [Foster, 2004]. Bakterien mit „hypermutator“
Eigenschaften wird bei der Ausbildung von adaptiven Mutationen dagegen nur eine
untergeordnete Rolle eingeräumt [Foster, 2004]. Auch bei P. putida wurde gezeigt, dass
DNA Polymerase IV in der stationären Phase an adaptiven Mutationen beteiligt ist
[Tegova et al., 2004].
PQS ist offensichtlich ein Molekül welches mittels Membran Vesikeln zu Nachbarzellen
gelangen kann [Mashburn und Whiteley, 2005; Vlamakis und Kolter, 2005; Winans, 2005]
und dort zur Freisetzung von DNA führt. Der Zelltod von großen Teilen der Population
unter Stressbedingungen könnte für das Überleben der Gesamtpopulation von
entscheidender Bedeutung sein, weil i) DNA eine wichtige extrazelluläre Matrix für
Biofilme darstellt [Whitchurch et al., 2002], ii) die DNA den überlebenden Bakterien als
Nährstoff dienen könnte [Dell'Anno und Danovaro, 2005; Finkel und Kolter, 2001] und iii)
die extrazelluläre DNA als Reparatur Material der beschädigten DNA dienen und so zur
Ausbildung der typischen morphologischen Diversität führen könnte. Wir konnten für P.
aeruginosa klar zeigen, dass die Ausbildung der morphologischen Diversität nicht nur –
4. DISKUSSION
- 87 -
wie bereits beschrieben [Boles et al., 2004] - von RecA sondern auch von der PQS
Produktion abhängt.
Ein PQS gesteuerter Zelltod eines großen Teils der Population könnte entscheidend für das
Überleben von einigen wenigen sichert. Ganz ähnlich zu der beschriebenen Autolyse und
dem programmierten Zelltod von Bakterien als Reaktion auf unterschiedliche Stress
Signale (z.B. Antibiotika) [Lewis, 2000]. Dabei profitieren die Überlebenden [Brooun et
al., 2000; Lewis, 2000; Spoering und Lewis, 2001] von dem altruistischen Verhalten
anderer in der Gemeinschaft. Damit eine Population nicht von „cheatern“ – Individuen, die
vom Altruismus profitieren, aber nichts zum Gemeinwohl beisteuern – übernommen wird,
gibt es Mechanismen, die das altruistische Verhalten direkt an den Vorteil koppeln [Foster
et al., 2004; Travisano und Velicer, 2004; Velicer, 2003]. So wäre denkbar, dass die PQS
Produktion von P. aeruginosa direkt an die Fähigkeit der natürlichen Kompetenz und
damit die Möglichkeit zur Rekombination gebunden ist. In vorläufigen Untersuchungen
weist die pqsA-negative Mutante selbst in einer Kokultivierung mit dem PAO1 Wildtyp
deutlich weniger Varianz auf, obwohl die extrazelluläre DNA nun vorhanden ist. Dieser
pleiotrope Effekt [Foster et al., 2004] ist zu schwerwiegend, als dass sich eine Population
von PQS negativen Mutanten durchsetzen könnte. Besonders die Lunge von CF Patienten
stellt ein sehr heterogenes Habitat mit unregelmäßig wechselnden Bedingungen dar, an die
sich P. aeruginosa wahrscheinlich ständig anpassen muss.
4.5. Ausblick
Obwohl die heutige Diagnostik und Behandlungsstrategien gegen akute Infektionen sehr
gute Ergebnisse erzielen, gibt es noch immer keine wirkungsvolle Methode gegen
chronische P. aeruginosa Infektionen. Das Ausbilden von Biofilmen und die Entwicklung
von resistenten Mutanten macht es nahezu unmöglich, P. aeruginosa mit einer
herkömmlichen Antibiotika Behandlung zu eradizieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt,
dass PQS ein zentrales Molekül bei der Entstehung von genetischen Varianten ist, was der
4. DISKUSSION
- 88 -
Population einen elementaren Vorteil verschafft. Dabei profitieren persistierende Bakterien
im Biofilm davon, dass durch direkte PQS Wirkung ein Großteil der Population lysiert und
damit Nährstoffe und DNA als extrazelluläre Matrix und als genetisches Material für
homologe Rekombination zur Verfügung steht. Das nähere Verständnis dieses
Mechanismus könnte die Grundlage für alternative Behandlungsmethoden sein, die auf der
Unterbindung von interbakterieller Kommunikation und der Verhinderung von
Biofilmbildung, Persistenz und Adaption von P. aeruginosa beruht.
5. ZUSAMMENFASSUNG
- 89 -
5. Zusammenfassung
Florian Bredenbruch
„Einfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die interbakterielle Kommunikation
von Pseudomonas. aeruginosa“
Die Produktion der meisten Virulenzfaktoren und die Ausbildung von Biofilmen werden
von P. aeruginosa über zwei hierarchisch organisierten Quorum Sensing (QS) Systeme
durch Alkyl-Homoserinlakton-Signalmoleküle reguliert. Kürzlich wurde ein drittes
bakterielles Signalmolekül – das Pseudomonas Quinolon Signal (PQS) – identifiziert,
welches einen Teil der durch QS regulierten Gene positiv beeinflusst.
In dieser Arbeit wurde der Biosyntheseweg von 4-Hydroxy-2-alkylquinolinen (HAQs) mit
Hilfe von Fütterung stabil-markierter Vorstufen und anschließender Analyse der HAQ
Extrakte mit GC/MS und NMR aufgeklärt. Außerdem wurde der Einfluss von PQS auf
PAO1 mit Hilfe von Transkriptionsanalysen untersucht. Das durch die exogene Zugabe
von PQS hervorgerufenen Transkriptionsprofil zeigte eine deutliche Induktion von Genen,
die zu den Gruppen der eisenregulierten Gene und den Genen, die durch oxidativen Stress
reguliert werden, gehören. Bemerkenswerterweise konnten nicht nur die meisten der
regulierten Gene, sondern auch die Induktion einer transkriptionellen lacZ-Fusion mit der
Promotorregion von rhlR auf einen starken eisenbindenden Effekt von PQS zurückgeführt
werden. Nichtsdestotrotz gibt es PQS spezifische Effekte, die unabhängig von dem PQS
Effekt auf den P. aeruginosa Eisenhaushalt sind. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass
PQS scheinbar die benachbarten P. aeruginosa Zellen angreift, indem es direkt auf die
bakterielle DNA wirkt. Als Konsequenz daraus reichern sich große Mengen extrazellulärer
DNA in Biofimkulturen an und stellen offensichtlich einen genetischen Pool für einen
horizontalen Gentransfer dar. Auf diese Weise führt die Opferung eines Teils der
Population zu einer genetische Variabilität der überlebenden Bakterien und zu einem
evolutionären Vorteil unter den sich ändernden Umweltbedingungen. Der horizontale
Gentransfer könnte die genetischen Veränderungen, die mit sexueller Reproduktion der
normalerweise klonalen Lebensweise der Bakterien nicht erreicht werden, kompensieren.
5. ZUSAMMENFASSUNG
- 90 -
Von einem evolutionären Standpunkt aus betrachtet offenbaren diese Ergebnisse eine
außergewöhnliche Bedeutung der natürlichen Transformierbarkeit und macht das
Phänomen zu einem biologisch und medizinisch relevanten Thema.
6. SUMMARY
- 91 -
6. Summary
Florian Bredenbruch „The influence of Pseudomonas Quinolon Signal to interbacterial communication of
Pseudomonas. aeruginosa”
Virulence factor production and the development of biofilms in Pseudomonas aeruginosa
have been shown to be regulated by two hierarchically organised quorum sensing (QS)
systems via small acyl-homoserine lactone (AHL) signal molecules. Recently, a third
bacterial signal molecule, the Pseudomonas quinolone signal (PQS), has been identified,
which positively regulates a subset of genes dependent on the QS systems.
In this study we have unraveled the biosynthetic pathway of HAQs by analysing extracted
HAQs by GC/MS and NMR spectroscopy in feeding experiments with isotope labeled
precursors. Moreover, we evaluated the impact of PQS on the QS circuitry using
transcriptome analysis of PAO1 cultures supplemented with PQS. The global
transcriptional profile in response to PQS revealed a marked up-regulation of genes
belonging to the tightly interdependent functional groups of iron acquisition and oxidative
stress response. Remarkably, not only most of the differentially regulated genes but also
the induction of a lacZ transcriptional fusion of rhlR could be traced back to a powerful
iron chelating effect of PQS. Nevertheless, although iron deficiency per se induced rhlR,
there are PQS specific effects that are independent of the PQS effect on P. aeruginosa iron
homeostasis. Moreover we could show that PQS seems to be capable of attacking
neighbouring P. aeruginosa cells by directly targeting bacterial DNA. As a result large
amounts of extracellular DNA accumulate in biofilm cultures and obviously serve as a
genetic pool for horizontal gene transfer. This way the self-sacrificing of parts of the
population promotes genetic variability of survivors providing the bacterial population
with an evolutionary advantage under changing environmental conditions and
compensating for the otherwise clonal mode of prokaryotic life where genetic innovation
cannot be archived by sexual reproduction. From an evolutionary perspective this finding
6. SUMMARY
- 92 -
adds a new dimension to natural genetic transformation and makes this phenomenon a
biological and medical significant event.
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ANHANG
- 105 -
Anhang
Sequenzen der Transposonmutanten
M1:
CTTTGGCGCCGATGAGCCTGCGTGCGGCCGCCGGACGCCCTTTGCTCGACGAT
TTCTCGCTGGACGCGCTGGTCGGTCCTGCGGACCTCGATTGGAGTGCCTTCCAT
CGCCAGGACCCGGCGGCAGCCTGTTTCCTGCAATACACCTCGGGTTCCACCGG
GGCGCCCAAGGGGGTGATGCACAGCCTGCGCAACACGCTCGGTTTCTGCCGGG
CGTTCGCTACGGAGTTGCTGGCATTGCAGGCGGGAGACCGGCTGTATTCGATT
CCCAAGATGTTCTTCGGCTATGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGA
ATTTCGAGCAGAAAGTNNNATAGAGC
M2:
ATGAGCTTCAGGTTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGCGTAAGTCTGGGCCATG
TGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAAGTTGGCTAGTGCG
ATANTCGTGTGACAGNNNNNGNNN
M3:
TCTGAATTCCCGCAGATGATTTCCATCGCCTGGATGGTGGTCAGGCCGCCGATT
TCCGGGGTGCCGGTGCCGGGCGCCCAGGCCGGGTCGATGCCGTCGATGTCGAA
GCTCAGGTAGACGGGGCCGCCGCCGACCTTCTCGCGGACCTCGGCCATCAGCG
GCTCCAGCGACTTGTGCCAGCACTCCTCGGCCTGCACCACGCGGAAGCCCTGC
TTGCGGCTCCAGTTGAAGTCCTCGGCGGTGTAGCCCTGGGCGCGCAGGCCGAT
CTGCACAACACGGTCGCAATCCAGCAGGTCTTCTTCCACCGCGCGGCGGAAGG
TGGTGCCGTGGGCGATCTTCTCGCCGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAC
TTGAATTCC
ANHANG
- 106 -
M4:
AAGAGCTTCAGGTTGAGATGGTATAAGACACAGGTTCCGCGCCGTGCAGAATT
CCTGGCGTCCGGACGACTGGCAGGAAGACGGCGGCTGGCTGCGCATGTGTCCC
CGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAAGCNGNNNCGN
M5:
GTATAATACACAGGACTGGCCTGGGCGAACATCATCAGCTCGACGTCGTGCGG
GTTGCGCCCCAGTTCACCGAAGCTCTTCAGCAGGTAGTCGATCTCGTCCTCGGC
CAGGGCCAGGCCCAACTCGACGTTGGCCTTCTCCAGCGCGGCGCGACCGCCGC
CAAGCACGTCGACGGCGGTGAGCGGGCGGGGCTGCGCATGTGTCCCCGTACAT
CGTTAGAAGTNNNATTTCGAGCANNNN
M6:
ACGAGCTTCGTGATTGAGATGCGTATAAGAGACAGGCTCAACAGCTCCCTGGC
CTGCGGACGCAGCGAGGCATAGATGGCCGGCACCCCAAACAGGACCCGGGGG
CGGAAGGCGACCAGGTTCTCCAGAACCCGCTCCGGGCTCGGCCAGGTATCGTC
GAGCAGCGCCGAGGCTCCGCTGAACCAGGGAAAGAACAGGCTGTTGCCCATG
TGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGANAATTCGAGCAGANANNNNNNNN
M7:
AAGAGCTTAGGATTGAGATGTGTATAAGAGACAGGAGCTCTACGGTATGCACG
CCGGGGATGCCGAAGACGGTCTCGACGCCCCAGGCTTCGAGTTGCTTGACGAG
GAATTCGCCGCAGGTGGTCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAATTC
GAGCAGANNNNGNNNNNGNGN
M8:
GTATAAGAGACAGCCACCGAGGGCCGGCAGTCCATCGCTGACTCCTACTCCAT
TCGTCGAAACGCCCTGCAGCACAAGATCTGCTGCACCACCACCATTGCGGGTG
GGCAGGCGATCTGTGAGGCGCTCAAGTTCGGTCCCGAGAAGACCGTTCGGCGT
CTGCAGGATCTCCACGCAGGAATCAAGGCATGTGTCCCCGTA
ANHANG
- 107 -
M9:
CCACTTCATCTCGCTCGAGGGATTGCCCCGCGAGCTGCTCACCGAAATCCTCG
ATACCGCCGACTCCTTCCTGGAAGTCGGCGCCCGCGCGGTGAAAAAGGTCCCG
CTGCTGCGCGGCAAGACCGTCTGCAACGTGTTCTTCGAGAACTCCACGCGCAC
CCGCACCACCTTCGAGCTGGCCGCCCAGCGGCTGTCGGCCGACGTGATCAGCC
TGAACGTATCCACCTCTTCCACCAGCAAGGGCGAGACGCTCACCGACACCCTG
CGCAACCTGGAGGCGATGGCCGCCGACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGC
TTGAATTCCGAGCANN
M10:
ATACTTCGGATTGAGATGTGTATAAGAGACAGGTCCAACGCCCTGCCGTGAAC
TGATCAACGACGGCGGCCGCGGCAGTCGCTTCGAGCTGCGCGCGGTGCCCAAC
GACGAGCCGGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTCGAATTCGAGCAGA
AAGTTGGCTAGTGCGTAGTCGTTGACAAANNNNNNNCNNGN
M11:
CTAGCTTCGGTTTGAGAGTGTATAGAGACAGGTGCTGAGCAGCCGCGACGGCC
GGGTCACCATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAA
AGTTGGCTAGTGCGTAGTCGTTGGCAANNNNNNN
M12:
NACGAGCTTCAGGATTGAGATGCGTATAAGAGACAGGGTCTACATCCCGATGT
TCGACATCACCCACGGCGTAGCGCGAGAAGGTCGACCCGCTCTACGCCTGGCG
CCCGACGAGCACTTACATCCGCCGCCCGCCGTACTGGGAAGGCGCCCTCGCCG
GCGAACGCACCCTGCGCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATT
CGAGCAGAAAGNTGGNTAGTGCGTANNTCGTTGGAAAN
ANHANG
- 108 -
M13:
ATGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGCTTCCAGGTTGACCAGGT
GGCGGGCGATGCCGAATTCGTCGGAGATGCCGTTGCCGCCCAGCATGTGTCCC
CGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGANNNNNNNNTNNN
M14:
NTGAGCTTCCGGTTCGAGCTGCGTATAAGAGACAGAGCTTGTCCTGGGCGACT
GCTGGGCGCTGTCGCGCACCATGTAGTCCCCGTACATCGTTAGCAGCTTGAATT
CGAGCAGAAAGTTGGCTAGTGCGATACTCTTTGAGCAANNNNN
M15:
M16:
AGAGCTTCCAGCTGAATATGTTAAGACACAGCCTCCCTGCACAGATCGCGAGC
CTGGCCAATTACCGGCAGATCAGCCTCGGCAGCCGCTCCGGGCAGCATTCGAA
CCTGCTGCGGCCGGTCAGCGACAAGGTGCTCTTCGTGGAAAACTTCGACGACA
TGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTCGAGCAGAANNNN
M17:
CGAGCTTCCGCTTGAATAGGTTATAGACACGTTCATGCCCTTGTACGCCGGGCC
GAACAGGACGTCTAAGTCGATTCCGCTGTCGATCACCGCCTCGGCGTAGAAGC
GTCCCAGGCGGGCCAGCGCCAGGCCGCTGTCGAACAGGCCGGCATTGAAGAA
ATAGGGGCTGGTGCGCCCGGACTTGAGGGTGAACTCACCGAAGCGCAGAACC
CCGCGCTCGATGGCGAAACGAATGAAATCGCGCTGATACGCCTGCATGTGTCC
CCGTACATCGTTAGAAGCTGNNATTTCGAGCAGAANNNNNNNNNNN
M18:
CGAGCTCGAGTTGAATGTGTATAGAGACCGTCAGACGACAGCGGCGCAGATCT
CTTCGAACTCTTCACGGTTGTAGGCGATACCGCCGCCGGTGCCGCCCATGTGTC
ANHANG
- 109 -
CCCGTACATCGTTAGAGCTTGNAATTCGAGCAGAANNNNNNNNNNNNNNNNG
NNNNNNGNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNGNNNNNNGNN
NNAGNNNNGNGNNNNNGNNGNGNNGGNNGNGGNNGAANGGGGGNNGGNNG
NNNNNNNGGGNNGNNNNNNNGGGGGGNNGGGGGNGGNGGNNGGNGGNGNG
G
M19:
CGACTCCGCTTGTGATGGTATAGAGATGCGATGTCGATTCGATGTCTGCCAGTC
TCGCGCTCATGTGTGCCGTACATCGTTAGAGCTTGAATTCGAGCAGAAANNNN
NNNNNNNNNNNNN
M20:
CGGATCTGATGGCAGTACCGGACTGGTGCCGATGATCGGCACGCCGGCCTCTT
CGAGGGCGCGGCAGAGCTTCAGCGGGGTCTGGCCGCCGTACTGGACGATCAC
GCCCTTGGGCTGCTCGACGCGGACGATCTCAAGGACGTCCTCGAGGGTCACCG
GCTCGAAGTACAGGCGGTCGGAGGTGTCATAGTCGGTGGAGACGGTTTCCGGG
TTGCAGTTGACCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTTCGAGCAG
NNNNNNNN
M21:
CTGACCTTCCGTTTGAATAGGTATAAGACACAGTGCCTGGACAAGGTGCTACG
CCGACGCCAGCTACGTCATCCGTCAACGTCAGCTCGCCGAACACGCCCGGCCT
GCGCAGCCTGCAGTTCGGCGATTCGCTCAAGCAACTGCTGGAGGCACTGCGCC
AGCGCCAGGAAGCGCTGGCGCTGCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGC
TGAAATTCGAGCAGAANN
M22:
AAGACTTCGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGATGCCGAAGGGCGCAGAGG
AAGGCATCATCAAGGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGACTTTGAATTCGAG
CAGAACCCAAGGTCC
ANHANG
- 110 -
M23:
CCATAGAACCTTCATCCATGCGGATCAGCTCGAACACTTCCTCGACGCTCTTGC
CGGCGCGGAAGGCGTCGGCGACGTACCAGACACGCTCGGCGCTGGGCACGGT
CAGCTCGCGCTTGAGGATGCTGTCGGCCTCCGGGTCGTTCAGGTCGAGCTTCG
GATCGAAGCCGGTGGCGCCGACTTCCAGGCCGCGCAAGGCTTTCTGCACCGAC
TCCTGGAAGGTCCGGCCGATGGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACTGAA
NNNTCCGAGCANNNNN
M24:
M25:
GAAGTTGCAACAGACAGGCTGATCACGTCGGCCGACAGCCGCTGGGCGGCCA
GCTCGAAGGTGGTGCGGGTGCGCGTGGAGTTCTCGAAGAACACGTTGCAGACG
GTCTTGCCGCGCAGCAGCGGGACCTTTTTCACCGCGCGGGCGCCGACTTCCAG
GAAGGAGTCGGCGGTATCGAGGATTTCGGTGAGCAGCTCGCGGGGCAATCCGT
CGAGCGAGATGAAGTGGCGCAGCTGGCCCTGGTCGTTGAGCTGCAGCGGGCGC
TTGGCGTCTGTCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTTCGAGC
AGNNNNNNNN
M26:
AAGAGCTTCGGGTTGAGATGGTATAAGAGAAGTCGGCGCCCAGGGCTGCAAG
GCCCTGCGCGAGGAGGGCTACCGCGTCATCCTGGTGAACTCCAACCCCGCGAC
CATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAATTCGAGCAGAANNNNNNN
NNNNN
ANHANG
- 111 -
Ergebnisse des rhlR-lacZ Promotor Aktivitätstests
Versuch 1
Zeit MPAO -PQS MPAO + PQS MPAO 500µM 2,2- Bispyridyl
h (1/100 min) OD600 OD600 OD600 4,00 0,68 0,65 0,636 7,17 1,47 1,21 1,24 24,25 4,88 3,82 4,3
MPAO -PQS
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,00 4 0,538 0,015 940,717 0,556 0,016 970,5887,17 1 0,421 0,017 2661,565 0,430 0,021 2675,17024,25 0,5 0,602 0,034 4446,721 0,633 0,037 4657,787 MPAO + 40 µM PQS
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,00 4 0,466 0,018 835,577 0,472 0,018 847,1157,17 1 0,403 0,017 3084,711 0,420 0,024 3123,96724,25 0,5 0,632 0,034 5994,764 0,679 0,047 6248,691 MPAO + 500 µM 2,2-BISPYRIDYL
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,00 4 0,662 0,016 1246,069 0,689 0,017 1295,6967,17 1 0,385 0,023 2780,242 0,402 0,022 2931,45224,25 0,5 0,481 0,036 3888,372 0,525 0,043 4183,721
ANHANG
- 112 -
Versuch 2:
Zeit MPAO -PQS MPAO + PQS MPAO 500µM 2,2- Bispyridyl
h (1/100 min) OD600 OD600 OD600 4,08 0,672 0,638 0,638 7,08 1,3 1,24 1,19 24,25 4,06 3,08 4,16
MPAO -PQS
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,08 4 0,477 0,013 844,959 0,506 0,014 895,6477,08 1,5 0,472 0,010 2330,769 0,497 0,015 2414,103
24,25 0,666 0,510 0,018 3539,254 0,521 0,015 3659,448 MPAO + 40 µM PQS
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,08 4 0,455 0,017 833,170 0,475 0,016 875,7847,08 1,5 0,491 0,010 2545,699 0,477 0,014 2432,796
24,25 0,666 0,566 0,017 5228,443 0,578 0,017 5345,443 MPAO + 500 µM 2,2-BISPYRIDYL
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,08 4 0,698 0,017 1309,267 0,722 0,017 1356,2897,08 1,5 0,483 0,012 2588,235 0,500 0,026 2546,218
24,25 0,666 0,465 0,020 3104,066 0,487 0,021 3250,245
ANHANG
- 113 -
Versuch 3 Zeit MPAO -PQS MPAO + PQS MPAO 500µM 2,2- Bispyridyl
h (1/100 min) OD600 OD600 OD600 4,00 0,64 0,612 0,616 7,00 1,32 1,21 1,27 24,25 4,74 3,5 4,28
MPAO -PQS
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,08 4 0,477 0,013 844,959 0,506 0,014 895,6477,08 1,5 0,472 0,010 2330,769 0,497 0,015 2414,103
24,25 0,666 0,510 0,018 3539,254 0,521 0,015 3659,448 MPAO + 40 µM PQS
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,08 4 0,455 0,017 833,170 0,475 0,016 875,7847,08 1,5 0,491 0,010 2545,699 0,477 0,014 2432,796
24,25 0,666 0,566 0,017 5228,443 0,578 0,017 5345,443 MPAO + 500 µM 2,2-BISPYRIDYL
h (1/100 min)
min Inkubation
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
pMALV OD420
pMALV OD550
ResultatU
4,08 4 0,698 0,017 1309,267 0,722 0,017 1356,2897,08 1,5 0,483 0,012 2588,235 0,500 0,026 2546,218
24,25 0,666 0,465 0,020 3104,066 0,487 0,021 3250,245
DANKSAGUNG
- 114 -
Ich möchte mich besonders bei Prof. Dr. D. Bitter-Suermann für die Überlassung des interessanten Themas und die Aufnahme an seinem Institut bedanken. Mein besonderer Dank gilt auch meinem Mentor Prof. Dr. J. Wehland, der es uns ermöglichte, mit der Pseudomonas Arbeitsgruppe in die Zellbiologie der GBF zu wechseln, der das Referat für dieser Dissertation übernahm und mir mit gutem Rat zur Seite stand. Ich möchte mich herzlichst bei meiner Betreuerin Dr. Susanne Häußler bedanken, die immer für mich da war, mich immer zur rechten Zeit zu motivieren verstand und die, im Gegensatz zu mir, nie den Überblick verlor. Vielen Dank für alles! Ich möchte mich weiter bei all den guten Seelen des A-Gebäudes bedanken, die einem das Arbeiten so unendlich viel leichter machen: vielen Dank Brigitte, Hildegard, Marlies, Petra und Frau Thiem, stellvertretend für alle, die ich aus Platzgründen nicht einzeln nennen kann. Vielen Dank an Amanda für ihre unverwechselbare Art und die nie endende Hilfsbereitschaft. Des Weiteren möchte ich allen Mitarbeitern von ZIB danken, die das Arbeiten so angenehm machten. Natürlich möchte ich mich auch ganz herzlich bei meiner Arbeitsgruppe bedanken: vielen Dank Susanne, Caroline, Tanja, Vanessa, Yusuf und Andree für die wunderschöne Zeit im Labor. Eine bessere Arbeitsgruppe gibt es nicht. Dagmar und Verena danke ich für die schöne Zeit in Hannover. Ich danke Dr. Manfred Nimtz für die nicht endende Hilfe in Sachen GC/MS und ESI, Dr. Jan Buer, Dr. Robert Geffers und Tanja Töpfer für die Hilfe bei den Micro-Arrays, Dr. Michael Morr für die Synthese von PQS und HHQ, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre, Dr. Victor Wray für die NMR-Unterstützung und Dr. Joachim Reichelt für das Computermodell. Ich danke meiner Familie und vor allen meinen geliebten Eltern Anita und Ernst Bredenbruch, die mich immer zu 100% unterstützt haben und immer für mich da sind. Vielen Dank. Diese Arbeit ist für Euch. Und ich danke Bianca für ihre Liebe, die Unterstützung und das grenzenlose Verständnis für den „schusseligen Professor“. Vielen Dank für alles!
- 115 -
Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name Ernst Florian Bredenbruch
Adresse Friedrich-Ebert-Platz 18, 31226 Peine Geburtstag/-ort 06.07.1976 in Langenhagen
Familenstand ledig
Schulabschluss
06/1995 Allgemeine Hochschulreife, Integrierte Gesamtschule Langenhagen
Wehrdienst
10/1995-07/1996 4./Panzerbataillion 33, Wilhelmstein-Kaserne Neustadt, (Panzerfahrer)
Hochschulausbildung
10/1996-04/2002 Studium der Biologie (Diplom), Universität Hannover
Diplomarbeit „Untersuchungen zur Deacetylierung von Chitin und Chito-Oligomeren durch Gram-positive Bakterien der Gattungen Streptomyces und Promikromonospora“
07/2002-11/2002 Dissertation „Einfluss des Pseudomonas Quinolon Signals auf die interbakterielle Kommunikation von Pseudomonas aeruginosa“ bei Prof. Dr. D. Bitter-Suermann, Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene in der Medizinische Hochschule, Hannover
seit 11/2002 Fortsetzung der Arbeit bei PD Dr. S. Häußler, Nachwuchsforschergruppe „Chronische Pseudomonas Infektionen“, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig
- 116 -
Vorveröffentlichungen
Pubikationen
Bredenbruch,F., Nimtz,M., Wray,V., Morr,M., Muller,R., and Haussler,S. (2005)
Biosynthetic pathway of Pseudomonas aeruginosa 4-hydroxy-2-alkylquinolines J
Bacteriol 187: 3630-3635.
Wehmhoner,D., Haussler,S., Tummler,B., Jansch,L., Bredenbruch,F., Wehland,J.,
and Steinmetz,I. (2003) Inter- and intraclonal diversity of the Pseudomonas aeruginosa
proteome manifests within the secretome J.Bacteriol. 185: 5807-5814.
Tagungsbeiträge
Florian Bredenbruch, Robert Geffers, Manfred Nimtz, Jan Buer and Susanne
Häussler
The Pseudomonas quinolone signal is a powerful iron chelator: link between the iron- and
the quinolone signal-regulons in Pseudomonas aeruginosa (Poster) 2. DGHM-VAAM
Jahrestagung in Göttingen (2005)
Florian Bredenbruch, Manfred Nimtz, Susanne Häußler (2003) Biosynthetic Pathway
of extracellular metabolites (4-hydroxyquinoliens) of Pseudomonas aeruginosa (Poster)
55. DGHM Jahrestagung in Dresden (2003).