einsatz der sfe/lc-ms -...

Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart

Einsatz der SFE – LC/MS zur Bestimmung von Rückständen in Lebensmitteln

Projekt Nr. 0165 E

Zwischenbericht

von Michelangelo Anastassiades

Lebensmittelchemiker

2 Einsatz der SFE – LC/MS in der Rückstandsanalytik von Pestiziden in Obst und Gemüse

Dank Herrn Dr. Rüdt, Leiter des Chemischen und Veterinäruntersuchungsamtes Stuttgart danke ich für sein Vertrauen und seine Unterstützung sowie für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes. Frau E. Scherbaum, Leiterin des Pestizid-Rückstandslaboratoriums am CVUA Stuttgart danke ich für die Aufnahme in ihren Arbeitsbereich und für die stetige Unterstützung während der gesamten Dauer dieser Arbeit. Herrn Dr. Köbler, Leiter der Messabteilung am CVUA Stuttgart danke ich für die gerätetechnische Unterstützung bei der LC/MS. Herrn Hubert Zipper danke ich für die Durchführung von Experimenten zur Derivatisierung von Organozinn-Pestiziden während seines Praktikums am CVUA Stuttgart. Frau M. Kaebel, Frau A. Krämer, Frau H. Lanzel und Frau M. Heinz danke ich für die Kooperation bei der gemeinsamen Nutzung von Messgeräten am CVUA Stuttgart. Dem Ministerium für den Ländlichen Raum Baden-Württemberg danke ich für die Finanzierung des Projektes.

CVUA Stuttgart M. Anastassiades

Einsatz der SFE – LC/MS in der Rückstandsanalytik von Pestiziden in Obst und Gemüse 3

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINFÜHRUNG ______________________________________________________ 1

1.1 Aufgabenstellung 3

2. SUPERCRITICAL FLUID EXTRACTION (SFE) _____________________________ 4

2.1 Der überkritische Zustand 4

2.2 Aufbau eines SFE-Extraktors 6

2.3 Ablauf einer Extraktion 7

2.4 Extraktionsparameter 8 2.4.1 Rolle der Temperatur 8 2.4.2 Rolle des Druckes 8 2.4.3 Rolle der Matrix 9 2.4.4 Rolle von Modifiern 9

3. METHODENENTWICKLUNG__________________________________________ 11

3.1 Allgemeine Überlegungen und Untersuchungen im Vorfeld 11 3.1.1 Optimierung der Messbedingungen 11 3.1.1.1 Flüssigkeitschromatographie 11 3.1.1.1.1 Prinzipien der API-ES und der APCI 12 3.1.1.1.1.1 API-ES 12 3.1.1.1.1.2 APCI 13 3.1.1.1.1.3 Fragmentierung der Ionen 14 3.1.1.1.2 Matrix-Einflüsse 15 3.1.1.1.2.1 Abhängigkeit von der Matrixkonzentration 15 3.1.1.1.2.2 Nicht-linearer Respons 17 3.1.1.1.2.3 Vergleich der Matrix-Einflüsse bei GC und LC 19 3.1.1.1.2.4 Mögliche Ursachen für Matrix-Einflüsse bei der API-ES 20 3.1.1.1.3 Berücksichtigung der „Matrixeinflüsse“ in der Praxis 20 3.1.1.1.3.1 Externe Matrix-Kalibrierungen 21 3.1.1.1.3.2 Interne Matrix-Kalibrierungen (Standardaddition) 21 3.1.2 Optimierung der Probenvorbereitung 23 3.1.3 Probenaufarbeitung 24 3.1.3.1 Entfernung bzw. Immobilisierung des Wassers 24 3.1.3.1.1 Wasserentfernung durch Gefriertrocknung 24 3.1.3.1.2 Physikalische Wasserbindung durch Adsorbentien 25 3.1.3.1.3 Chemische Wasserbindung durch Salze 25

3.2 Entwicklung von Bestimmungsmethoden 26 3.2.1 Einsatz der SFE in der Pestizid-Multirückstandsanalytik 26 3.2.1.1 Einfache Multimethode (Basismethode) 27



3.2.1.1.1 Wiederfindungsversuche 28 3.2.1.1.1.1 Vorgehensweise bei Dotierungen 28 3.2.1.2 Variationsmöglichkeiten der Multimethode zur Verbesserung der

Extrahierbarkeit spezieller Pestizide 29 3.2.1.2.1 Pestizide mit hoher Polarität 29 3.2.1.2.1.1 Zugabe von Salzen 30 3.2.1.2.2 Saure und basische Pestizide 33 3.2.1.2.3 Pestizide, die zu Adsorptionen neigen 35 3.2.1.2.3.1 Beteiligte Oberflächen 35 3.2.1.2.3.2 Beteiligte Lösungsmittel 36 3.2.1.2.3.3 Analyte 36 3.2.1.2.4 Zersetzungsanfällige Pestizide 40 3.2.1.2.4.1 Oxidationsanfällige Pestizide 42 3.2.1.2.4.2 Basenempfindliche Pestizide 46 3.2.1.2.4.3 Säureempfindliche Pestizide 51 3.2.1.2.4.4 Abbauvorgänge im Extraktor 54 3.2.1.2.4.5 Diskussion 55 3.2.1.3 Variationsmöglichkeiten der Multimethode im Überblick 56 3.2.2 Bestimmungsmethoden für spezielle Pestizidklassen 57 3.2.2.1 Basische Pestizide 59 3.2.2.1.1 Gemeinsame Bestimmung basischer Pestizide 60 3.2.2.1.1.1 Methodenentwicklung 60 3.2.2.1.1.2 Messung mittels GC/MSD 66 3.2.2.1.1.3 Messung mittels LC/MS 66 3.2.2.2 Saure Pestizide 68 3.2.2.2.1 Bestimmung von Phenoxyalkancarbonsäuren in Getreide 69 3.2.2.2.1.1 Aufarbeitung 69 3.2.2.2.1.2 Extraktion 69 3.2.2.2.1.3 Bestimmung mittels LC/MS 69 3.2.2.3 N-Methyl-Carbamate 71 3.2.2.3.1 Methodenentwicklung 74 3.2.2.3.1.1 Übersicht 74 3.2.2.3.1.2 Extraktion 75 3.2.2.3.1.3 Bestimmung mittels LC/MSD 76 3.2.2.3.1.6 Wiederfindungen 81 3.2.2.3.1.7 Abbau in der Extraktionshülse 82 3.2.2.3.1.8 Zusammenfassung 83 3.2.2.4 Harnstoff-Pestizide 84 3.2.2.4.1 Methodenentwicklung 87 3.2.2.4.1.1 Probenaufarbeitung und Extraktion 87 3.2.2.4.1.2 Bestimmung mittels GC/MS 87 3.2.2.4.1.3 Bestimmung mittels LC/MS 90 3.2.2.4.1.4 Wiederfindungsversuche 94 3.2.2.4.1.5 Sulfonyl-Harnstoff-Herbizide 96 3.2.2.5 Organozinn-Pestizide 99 3.2.2.5.1 Methodenentwicklung 102 3.2.2.5.1.1 Probenaufarbeitung und Extraktion 102 3.2.2.5.1.2 Bestimmung mittels LC/MSD (API-ES (pos.) Modus) 103



4. UNTERSUCHUNGEN VON PROBEN AUS DEM HANDEL _________________ 108

4.1 Untersuchungen auf Organozinn-Verbindungen in Obst und Gemüse 108 4.1.1 Fenbutatinoxid in Zitrusfrüchten 108 4.1.2 Lokalisierung der Rückstände von Fenbutatinoxid in Zitrusfrüchten 110

5. ZUSAMMENFASSUNG _____________________________________________ 111

6. LITERATUR ______________________________________________________ 114

7. VERÖFFENTLICHUNGEN VON TEILEN DER FORSCHUNGSARBEIT _______ 124

8. VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN__________________________________ 125

9. ANLAGEN________________________________________________________ 128



1. EINFÜHRUNG Die Landwirtschaft muss heute mehr denn je hohen Anforderungen in Bezug auf Pro-duktionsmenge und Qualität gerecht werden. Durch die Liberalisierung des Welthandels sind die Landwirte gezwungen wirtschaftlicher zu produzieren. Zur Steigerung der Ern-teerträge wird zunehmend ein intensiver Anbau in großflächigen Monokulturen und in Gewächshäusern betrieben. Die auf diese Weise kultivierten Pflanzen sind jedoch in besonderem Maße durch Schädlinge gefährdet [Chabousou 1987], so dass Landwirte heute stärker denn je auf den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln angewiesen sind. Weltweit sind mehr als 600 verschiedene chemische Pflanzenschutzmittel im Einsatz [Somasundaram et al. 1991, Ekström et al. 1990]. Sie werden entsprechend ihrer Wir-kung in verschiedene Gruppen eingeteilt (siehe Tab. 1-1). Zu den Pflanzenschutzmitteln werden im allgemeinem auch Wachstumsregulatoren und Keimhemmungsmittel gezählt. Tab. 1-1: Einteilung von Pflanzenschutzmitteln nach ihrer Wirkung [Hassall 1982, Perkow et al. 1999] Gruppe Wirkung Einige Vertreter

Herbizide gegen Unkräuter Phenoxyalkancarbonsäuren, Triazine,

Harnstoff-Derivate Fungizide gegen Pilze Dithiocarbamate, Benzimidazole, Triazole,

Fentin Insektizide gegen Insekten Carbamate, Organophosphorsäureester,

Organochlorverbindungen, Pyrethroide Synergisten potenzieren die Wirkung

von Insektiziden Piperonylbutoxid

Akarizide gegen Milben Carbamate, Pyrethroide, Organozinn-Verbindungen

Nematizide gegen Nematoden Organophosphorsäureester, Carbamate

Molluskizide gegen Schnecken Metaldehyd, Methiocarb

Rodentizide gegen Nagetiere

Kumarinderivate

Wachstums-regulatoren

Wachstumsregulierung, Verlängerung der Ernte-zeiten

Chlormequat, Phenoxyalkancarbonsäuren, Daminozid, Ethephon

Keimhemmungs-mittel

verhindern das Auskeimen z.B. bei Kartoffeln

Chlorpropham

Um die negativen Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf die Umwelt und den Menschen zu minimieren, bestehen zahlreiche nationale und internationale Regelungen bezüglich Zulassung, Anwendung und Rückstandsmengen. Die Zulassung von Pflanzenschutzmitteln in der Bundesrepublik Deutschland erfolgt durch die Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA). Mit der Zulas-sung wird u.a. die Anwendung und die einzuhaltenden Wartezeiten zwischen dem Aufbringen des Mittels und der Ernte geregelt [Beck, PflanzenschutzG.]. Trotz Einhaltung der festgelegten Wartezeiten verbleiben stets Restgehalte (Rück-stände) der Pflanzenschutzmittel sowie ihrer Abbauprodukte in den Erzeugnissen. Für viele dieser Rückstände werden in der Rückstands-Höchstmengen-Verordnung (RHmV)



die für Lebensmittel maximal zulässigen Gehalte festgesetzt [Beck, RHmV]. Diese Höchstmengen stellen jedoch überwiegend keine toxikologisch begründeten Grenzwerte dar, sondern Werte, die bei guter landwirtschaftlicher Praxis (GLP) eingehalten oder unterschritten werden können. Die Einhaltung dieser Höchstmengen wird sowohl von der amtlichen Lebensmittelüberwachung als auch von der Industrie durch die Untersu-chung zahlreicher Proben überwacht. Um die Gesamtbelastung der Bevölkerung mit Pestizidrückständen abzuschätzen und ggf. zeitliche Trends festzustellen, werden darüber hinaus in allen Ländern der Euro-päischen Union sogenannte Monitoring-Programme durchgeführt [Beck, LMBG § 46d, Richtlinie des Rates 90/642/EWG)]. Dabei werden gezielt und flächendeckend zahlrei-che Untersuchungen an verschiedenen Lebensmitteln durchgeführt und die somit ge-wonnenen Daten statistisch ausgewertet. Aus diesen Daten lassen sich mit Hilfe von Modellrechnungen, unter Berücksichtigung der mittleren Verzehrsmengen, die täglichen Aufnahmemengen an Pestiziden durch die verschiedenen Bevölkerungsgruppen abschätzen. Diese Werte werden dann mit den, von der WHO festgelegten, ADI-Werten (Acceptable Daily Intake) verglichen [BgVV 2000]. Zur Durchführung dieser Untersuchungen bedienen sich die meisten Laboratorien so-genannter Multimethoden [Luke et al. 1981, Specht et al. 1981 und 1995, DFG 1991, Liao et al. 1991, Lee et al. 1991, Andersson et al. 1991, Fillion et al. 1995, Inspectorate for Health Protection, Niederlande 1996, Anastassiades et al. 1997, BgVV 1999]. Dies sind Analysenverfahren mit denen eine große Anzahl von Wirkstoffen gleichzeitig (bei einer Aufarbeitung) erfasst wird. Die meisten Multimethoden sind nach einem ähnlichen Muster aufgebaut, das folgende Arbeitsschritte umfasst: Probenvorbereitung (Zerkleine-rung, Homogenisierung), Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Clean-up (z.B. Flüssig-Flüssig-Verteilungen und chromatographische Verfahren) und Messung (meist gaschromatographisch). Um ein möglichst breites Spektrum von Analyten zu erfassen, werden bei Multimetho-den die Extraktionsbedingungen meist nicht selektiv gewählt. Die gewonnenen Roh-Ex-trakte sind daher in der Regel stark mit Begleitstoffen belastet und können nicht ohne eine vorherige Reinigung zur Messung eingesetzt werden. Die erforderlichen Reini-gungsschritte sind jedoch oft sehr zeit-, arbeits-, material- und daher auch kosteninten-siv. Mit den meisten gängigen Multimethoden können große Bereiche des Pestizidspek-trums abgedeckt werden. Es gibt jedoch eine ganze Reihe von weiteren Verbindungen oder Verbindungsgruppen, die aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften (z.B. Polarität, Thermolablilität) nicht erfasst werden. Zur Bestimmung solcher Verbindungen stehen sog. Einzel- und Gruppenbestimmungsmethoden zur Verfügung [DFG 1991]. Solche Verfahren sind jedoch in der Regel ebenso aufwendig oder sogar aufwendiger als die oben beschriebenen Multimethoden und erfordern zudem teilweise spezielle Appara-turen, so dass sie in den meisten Laboratorien nur sehr begrenzt zum Einsatz kommen können. Gerade hier bestehen daher beträchtliche analytische Defizite. Dies hat zur Folge, dass für zahlreiche Verbindungen praktisch keine Daten über die allgemeine Rückstandssituation vorhanden sind. Die Pestizidrückstandslaboratorien stehen somit vor der Herausforderung, Wege zu fin-den, diese analytischen Defizite abzubauen. Um dies zu erreichen, ist eine insgesamt effizientere Analytik erforderlich. Es besteht daher ein großes Interesse an schnellen, kostengünstigen und automatisierten Analysenverfahren. Durch den Einsatz solcher Techniken erhoffen sich die Laboratorien unter anderem eine Entlastung im Bereich der



Probenaufarbeitung. Dadurch würde eine Verlagerung von Personalkapazitäten in den, durch die Einführung neuer Messverfahren, immer aufwendiger werdenden Bereich der Messung ermöglicht. In den letzten Jahren sind große Anstrengungen seitens der Industrie unternommen worden, Geräte herzustellen, die eine weitgehende Automatisierung der Extraktion und Probenaufarbeitung ermöglichen. Dazu zählen die beschleunigte Lösungsmittelextrak-tion (ASE oder PLE), die mikrowellenunterstützte Extraktion (MAE), die Extraktion mit überkritischem Fluiden (SFE) sowie Kombinationen dieser Techniken. Alle diese Verfahren ermöglichen eine serielle Abarbeitung von Proben und zeichnen sich durch kurze Extraktionszeiten und einen geringen Lösungsmittelverbrauch aus. Sie sind daher sowohl aus ökonomischer als auch aus ökologischer Sicht sehr attraktiv. Trotz der zahlreichen Vorteile, die diese Extraktionsverfahren gegenüber den herkömm-lichen bieten, werden sie bisher nur zögerlich in den Pestizidrückstandslaboratorien ein-geführt. Ein Grund hierfür sind sicherlich die hohen Kosten, die bei der Beschaffung neuer Extraktoren anfallen. Weitere Gründe sind das Fehlen geeigneter und validierter Arbeitsvorschriften, die aufgrund unselektiver Extraktionsbedingungen notwendige Rei-nigung der Extrakte im Fall der ASE, sowie die Tatsache, dass der Einfluss der Matrix auf die Extraktionsausbeuten im Fall der SFE oft überschätzt wird. Für zahlreiche Stoffe, die aufgrund ihrer Thermolabilität nicht gaschromatographisch bestimmt werden können, bieten sich prinzipiell schonendere flüssigkeits-chromatographische Verfahren an. In der Routineanalytik von Pestizidrückständen in Lebensmitteln wurden jedoch bisher flüssigkeitschromatographische Verfahren nur wenig eingesetzt. Hauptsächlich ist dies auf das Fehlen eines ausreichend empfindlichen universellen LC-Detektors zurückzuführen. Diese analytische Lücke kann mit Hilfe der LC/MS weitgehend geschlossen werden. Die Empfindlichkeit und Robustheit der LC/MS-Geräte konnte in den letzten Jahren bedeutend verbessert werden. Vorausgegangen waren entscheidende Fortschritte im Bereich der Interface-Techniken. 1.1 AUFGABENSTELLUNG

Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Einsatzmöglichkeiten eines der oben genannten Extraktionsverfahren, der SFE, in Kombination mit der LC/MS erkundet und schnelle Bestimmungsverfahren für solche Stoffe oder Stoffgruppen entwickelt werden, für die herkömmlich sehr aufwendige Einzelbestimmungsmethoden erforderlich sind. Dabei sollten die besonderen Anforderungen, die der routinemäßige Betrieb im Bereich der Pestizidrückstandsanalytik mit sich bringt, bei der Methodenentwicklung berück-sichtigt werden. Finanziert wurde diese Forschungsarbeit vom Ministerium für den Ländlichen Raum Baden-Württemberg.



2. Supercritical Fluid Extraction (SFE) Die SFE (Supercritical Fluid Extraction) ist ein Extraktionsverfahren, bei dem Substan-zen im überkritischen Zustand (überkritische Fluide) als Extraktionsmittel dienen. Extraktionen mit überkritischem Kohlendioxid werden großtechnisch schon seit längerer Zeit betrieben. Einige Beispiele hierfür sind die Entkoffeinierung von Kaffee, die scho-nende Extraktion von ätherischen Ölen, die Reinigung von Medikament-Präparaten, die Entölung von Lecithin, die Extraktion von Erdölprodukten und anderes mehr [Stahl et al. 1987, Frede 1993]. Milde und selektive Extraktionsbedingungen führen zu reineren und qualitativ höherwertigen Extrakten als bei vielen herkömmlichen Verfahren. Dies macht die SFE auch für den Einsatz im analytischen Bereich interessant. Seit einigen Jahren bieten verschiedene Hersteller SFE-Geräte an, die für analytische Zwecke geeignet sind. Diese Extraktoren ermöglichen eine Automatisierung vieler Ar-beitsschritte, deren Ablauf bei den herkömmlichen Verfahren sehr aufwendig ist. Dazu zählen z.B. die Extraktion, z.T. das Clean-up und der Lösungsmittelaustausch (d.h. das Einengen der Extrakte und ihre Aufnahme in das für die chromatographischen Prozesse geeignete Lösungsmittel). Dadurch ergeben sich erhebliche Raum-, Arbeitszeit- und Kostenersparnisse. Darüber hinaus kann mit Hilfe der SFE der hohe Verbrauch an Lö-sungsmitteln, der derzeit bei der Rückstandsanalytik anfällt, reduziert werden. Die Ex-position des Laborpersonals mit den oft gesundheitlich bedenklichen Lösungsmitteln wird dadurch weitgehend vermieden und die Kosten, die bei der umweltgerechten Lösungsmittel-Entsorgung und Rückgewinnung entstehen, minimiert [King et al. 1992, Sandra et al. 1995]. 2.1 DER ÜBERKRITISCHE ZUSTAND

Stoffe können in verschiedenen Aggregatszuständen vorliegen: gasförmig, flüssig, fest und überkritisch. Diese Zustände können durch Variation von Druck und Temperatur ineinander übergehen, vgl. Abbildung 2.1-1. Abb. 2.1-1: Phasendiagramm von Kohlendioxid

1

2

3

2= Sublimationskurve 3= Verdampfungskurve

Pc=73,7 bar

Tc=31,1°C Temperatur [T]

Druck [P]

gasförmig

fest

flüssig

überkritisches Fluid

kritischer Punkt

1= Schmelzkurve



Entlang der Verdampfungskurve (3) koexistieren der flüssige und der gasförmige Zu-stand. Bewegt man sich entlang dieser Kurve, beobachtet man für CO2 bei einem Druck von 73,7 bar (kritischer Druck) und einer Temperatur von 31,1°C (kritische Temperatur) das Verschwinden der Phasengrenze. Bei diesem Punkt erreichen die beiden Phasen „flüssig“ und „gasförmig“ die gleiche Dichte und vermischen sich. Dieser Punkt, der im P/T-Diagramm das Ende der Verdampfungskurve darstellt, wird als kritischer Punkt bezeichnet. Der kritische Druck und die kritische Temperatur sind charakteristische Stoffkonstanten. Zur Erreichung des überkritischen Zustandes müssen beide Größen überschritten werden. Temperatur- und Druckveränderungen überhalb der kritischen Daten führen lediglich zu Änderungen der Dichte und nicht zu einer Phasenumwand-lung. Substanzen im überkritischen Zustand zeigen interessante physikalische Eigenschaften (siehe Tab. 2.1-1). Da ihre Dichte größenordnungsmäßig vergleichbar mit der von flüs-sigen Lösungsmitteln ist, verfügen sie über ein hohes Lösungsvermögen. Im Unter-schied zu Flüssigkeiten zeigen sie jedoch auch ein gutes Kompressionsverhalten und sind in dieser Hinsicht den Gasen ähnlicher. Durch Änderungen des Druckes und der Temperatur kann die Dichte und das damit korrelierende Lösungsvermögen von über-kritischen Fluiden über weite Bereiche variiert werden. Darüber hinaus weisen überkriti-sche Fluide ähnlich wie Gase geringe Viskositäten auf und besitzen im Vergleich zu Flüssigkeiten deutlich höhere Diffusionskoeffizienten. Sie zeichnen sich daher durch ein gutes Penetrationsvermögen und eine hohe Mobilität aus und ermöglichen dadurch einen effizienten Massentransfer. Alle diese Eigenschaften machen überkritische Fluide als Extraktionsmittel außerordentlich interessant [Wenclawiak 1992, Luque de Castro et al. 1994, McHugh et al. 1986, Schneider 1978]. Tab. 2.1-1: Gegenüberstellung der physikalischen Eigenschaften von Gasen, über-

kritischen Fluiden und Flüssigkeiten [Wenclawiak 1992] Aggregatszustände

Dichte (g/ml) Diffusionskoeffizient (cm2/s) Viskosität (g/s cm)

Gase 10-4 - 10-3 ca. 10-1 ca. 10-4 überkritische Fluide 0,1 - 1 10-3 - 10-4 10-3 - 10-4

Flüssigkeiten 0,6 - 1,4 ca. 10-5 ca. 10-2 Verschiedene Substanzen wurden bereits für die SFE erprobt. Für den Routineeinsatz im Laboratorium hat sich jedoch nur das überkritische Kohlendioxid bewährt, da es ge-genüber anderen Substanzen einige Vorteile bietet (vgl. Tab. 2.1-2). Kohlendioxid ist leicht in den überkritischen Zustand überführbar, zeigt ein recht gutes Lösungsvermögen und wird in einem hohen Reinheitsgrad zu einem relativ günstigen Preis angeboten. Es ist ferner einfach in der Handhabung, ungiftig und umweltfreundlich und im Gegensatz zu Wasser oder Ammoniak chemisch praktisch inert.



Tab. 2.1-2: Kritische Daten verschiedener Stoffe [Hawthorne 1990] Fluid

kritische Temperatur Tc (°C) kritischer Druck Pc (bar)

Trifluoromethan (CHF3) 25,9 48,3 Chlortrifluoromethan (CClF3) 28,8 39,2 Kohlendioxid (CO2) 31,1 73,7 Distickstoffmonoxid (N2O) 36,4 72,4 Ammoniak (NH3) 132,2 112,7 n-Pentan (C5H12) 196,6 42,2 Methanol (CH3OH) 239,4 80,9 Wasser (H2O) 374,1 220,4 2.2 AUFBAU EINES SFE-EXTRAKTORS

Allen SFE-Geräten gemeinsam ist eine Pumpe zur Förderung und Verdichtung des Kohlendioxids, eine beheizbare Extraktionskammer, in der die Probe extrahiert wird, ein für die Expansion des Fluids zuständiger sog. Restriktor und eine Vorrichtung zur Sammlung der Extrakte (Falle) (siehe Abb. 2.2-1). Die wesentlichen Unterschiede zwischen Geräten verschiedener Anbieter liegen in der Art der Falle (fest oder flüssig), in der Art der Fluid-Expansion (Restriktor) nach der Ex-traktion und in der Höhe des maximal einsetzbaren Druckes. Abb. 2.2-1: Schematischer Aufbau eines SFE-Extraktors mit Festphasenfalle

CO2 Vial

Nozzle

Solvent- Pump

Trap

ThimbleCO2-Pump

Modifier- Pump

Modif.

Solv. 1

Solv. 2

Trap=Falle Nozzle=Restriktor Thimble=Extraktionshülse

Die Extraktionshülsen (thimbles) sind druckfeste Behälter, in welche die Proben ein-gefüllt werden. Sie bestehen aus einem Edelstahlrohr, das mit zwei speziellen Schraub-kappen verschlossen wird. Diese Kappen sind mit einem Ventil versehen durch das das überkritische Fluid in die Hülsen geleitet wird. Bei Geräten, bei denen in der Hülse und dem sie umgebenden Raum (Extraktionskammer) der gleiche Druck vorherrscht (z.B.



Extraktoren der Fa. ISCO) können wesentlich kostengünstigere Hülsen aus Kunststoff-material verwendet werden. Der Restriktor (nozzle) ist das Kernstück des Extraktors. Hierbei handelt es sich um eine Kapillare oder ein Ventil durch die/das das überkritische Fluid entweicht. Er ist be-heizbar, um die bei der Expansion des Kohlendioxids entstehende Kälte (Joule-Thomp-son-Effekt) zu kompensieren. Dadurch wird verhindert, dass Wasser und Fett konden-sieren oder gefrieren, was Verstopfungen oder Beschädigung des Restriktors zur Folge hätte. Es gibt statische und variable Restriktoren. Der Vorteil variabler Restriktoren besteht darin, dass der Gasfluss unabhängig vom eingesetzten Extraktionsdruck ge-regelt werden kann. Die Fallen (traps) verschiedener Geräte zeigen ebenfalls prinzipielle Unterschiede. Im allgemeinen unterscheidet man zwischen Flüssigkeitsfallen und Festphasenfallen. Bei Flüssigkeitsfallen werden die Substanzen direkt in ein Vorlagegefäß, das ein Lösungs-mittel enthält, eingeleitet und dort festgehalten. Bei den Festphasenfallen werden die Extrakte durch ein Adsorbens, das eine große Oberfläche oder besondere Affinität auf bestimmte Analyten aufweist (z.B. ODS), auf-gefangen. Nach beendeter Extraktion werden die Extrakte mit einem organischen Lö-sungsmittel in eine Vorlage eluiert. Der Vorteil dieser Fallen besteht darin, dass man durch gezielte Wahl des Festphasenmaterials und der Elutionsmittel eine Fraktionierung der Extrakte und somit einen zusätzlichen Reinigungseffekt erzielen kann. 2.3 ABLAUF EINER EXTRAKTION

Im folgenden wird der Ablauf einer Extraktion an einem HP 7680-T Extraktor beschrie-ben. Ein derartiges Extraktor-Modell wurde für die überwiegende Mehrzahl der im Verlauf dieser Arbeit durchgeführten Versuche verwendet. Das zu extrahierende Material wird zunächst in eine druckfeste Spezialhülse gebracht, die beidseitig mit Ventilen versehen ist. Dies ist notwendig, da bei der SFE unter hohen Drucken gearbeitet wird. Maximal acht befüllte Hülsen können in den Probengeber des Extraktors gegeben und nacheinander automatisch extrahiert werden. Zu Beginn der Extraktion wird die Hülse in eine beheizbare Kammer gebracht. Dort wird sie mit Hilfe einer Pumpe mit Kohlendioxid befüllt und die vordefinierten Bedingungen (Druck und Temperatur) werden eingestellt. Es erfolgt zunächst ein statischer Extrak-tionsschritt bei dem kein Fluss statt findet. Die Probenmatrix wird hierbei mit dem Fluid durchdrängt. Daraufhin folgt ein dynamischer Extraktionsschritt bei dem die Probe unter kontrollierten Bedingungen durchflossen und extrahiert wird. Das mit Extrakten aus der Probe beladene Fluid verlässt die Hülse und gelangt zum Restriktor, wo es schlagartig auf Atmosphärendruck entspannt wird und dabei seine Lösekraft verliert. Während die Extrakte in der nachgeschalteten gekühlten Falle aufgefangen werden, entweicht das Kohlendioxid gasförmig in die Umgebung. Nach der Extraktion werden die Extrakte mit einem Lösungsmittel (z.B. 1,5 ml) in eine Vorlage eluiert. Es folgt eine Nachreinigung des Restriktors und der Falle mit einer größeren Menge (z.B. 5 ml) an Lösungsmittel. Das Gerät ist dann für einen erneuten Extraktionsvorgang bereit. Bei dem Extraktor SFX 3560 der Fa. ISCO wird der Restriktor während der Extraktion direkt in die Lösungsmittelvorlage eingetaucht (Flüssigkeitsfalle). Zur Reinigung des Restriktors wird dieser nacheinander in drei Behälter mit Lösungsmittel eingetaucht.



2.4 EXTRAKTIONSPARAMETER

Das Lösungsvermögen von überkritischen Fluiden ist stark von ihrer Dichte abhängig. Diese kann durch Variation des Druckes und der Temperatur eingestellt werden. Bei höheren Dichten werden im allgemeinen die Extraktionseigenschaften verbessert. Je dichter ein überkritisches Fluid ist, desto effektiver kann es elektrostatische Wechsel-wirkungen zwischen Teilchen abschirmen und abschwächen. Dies erklärt die bessere Extrahierbarkeit von polaren Substanzen bei hohen Dichten [Zhou et al. 1997]. Kohlendioxid-Moleküle besitzen keine permanenten elektrischen Dipolmomente, so dass auftretende intermolekulare Interaktionen in erster Linie van der Waals’scher Natur sind. Selbst bei sehr hohen Dichten überschreitet die Dielektrizitätskonstante des überkriti-schen Kohlendioxids nicht den Wert von 1,8 [Schneider 1992]. Solvatisierungs-Effekte elektrostatischer Natur, wie sie bei polaren Lösungsmittel (z.B. Wasser, Methanol) auf-treten, spielen eine untergeordnete Rolle. Die Lösekraft von überkritischem Kohlendioxid ist daher relativ schwach und bewegt sich größenordnungsmäßig im Bereich der Kohlenwasserstoffe. [Schneider 1992, Wenclawiak 1992, McNally 1996]. Es wird ersichtlich, dass sich überkritisches Kohlendioxid gut für die Extraktion unpolarer Substanzen eignet. Induzierte Dipolmomente ermöglichen zudem die Extraktion von mittelpolare Verbindungen [Lira 1988]. Moleküle mit hoher Polarität wie Wasser, Frucht-säuren, Kohlenhydrate, Aminosäuren und Proteine lösen sich dagegen kaum und sind daher praktisch nicht extrahierbar. Wie bei jeder Extraktionsart spielt auch bei der SFE die Matrix/Analyt-Kombination eine wichtige Rolle. Das Extraktionsmedium muss die zu extrahierenden Substanzen nicht nur lösen, sondern auch die Wechselwirkungen zwischen der Matrix und den Analyten überwinden können. Im folgenden werden die Einflüsse einiger wichtiger Parameter auf die Extraktion näher erläutert.

2.4 .1 Rol le der Temperatur Die Extraktionskinetik wird im wesentlichen durch Diffusions- und Desorptionsprozesse limitiert. Bei höheren Temperaturen besitzen Moleküle eine höhere kinetische Energie (Mobilität), so dass intermolekulare Wechselwirkungen leichter überwunden werden können. Dadurch werden Desorptions- und Diffusionsprozesse erleichtert und die Ex-traktionszeiten verkürzt [Hawthorne et al. 1994]. Allerdings werden hier höhere Drucke benötigt, um die Dichte und damit die Lösungskraft hoch zu halten. Die einsetzbare Temperatur ist somit vom maximal einsetzbaren Druck des Extraktors abhängig. Meist sind aber die thermische Stabilität der zu extrahierenden Substanzen oder die Menge der mit extrahierbaren Begleitstoffe (Selektivitätsverlust) die Faktoren, die niedrigere Extraktionstemperaturen bedingen.

2.4 .2 Rol le des Druckes Bei gleichbleibender Temperatur führt eine Erhöhung des Druckes zu einer Dichteer-höhung und somit auch zu einer Verbesserung des Lösungsvermögens des Fluids. Bei niedrigen Dichten (0,2-0,45 g/L) zeigt Kohlendioxid eine mit Hexan vergleichbare Löse-kraft. Bei höheren Dichten steigt die Dielektrizitätskonstante, so dass die Löseeigen-schaften mit denen von Dichlormethan vergleichbar werden [McNally 1996]. Bei höheren Dichten wird das überkritische Kohlendioxid allerdings viskoser und verliert an Diffu-sionskraft, was sich ungünstig auf die Extraktionskinetik auswirkt.



Es wird ersichtlich, dass hier viele gegenläufige Faktoren eine Rolle spielen. Diese müssen für das jeweilige Problem richtig abgewogen werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

2.4 .3 Rol le der Matr ix Wechselwirkungen zwischen den Analyten und der Matrix erschweren die Extraktion und erfordern schärfere Extraktionsbedingungen wie z.B. höhere Temperaturen oder den Einsatz von sog. Modifiern (siehe Kap. 2.4.4). Die Teilchengröße und Oberflächenbeschaffenheit der zu extrahierenden Partikel spielt ebenfalls eine Rolle. In den Partikeln eingeschlossene, und dadurch schwer zugängliche Analyten erfordern längere Extraktionszeiten und eine starke Diffusionskraft des Fluids. Ein zu hoher Gehalt an mobilem Wasser in der Matrix bringt Schwierigkeiten (auch ge-rätetechnischer Art, siehe Kap. 2.2, Restriktor) mit sich. Das Wasser kann jedoch durch den Einsatz von Adsorbentien physikalisch gebunden werden, wodurch sich gleichzeitig die zu extrahierenden Analyte leicht zugänglich über eine große Oberfläche verteilen. Die Problematik der Wasserbindung wird in Kapitel 3.1.3.1 näher behandelt.

2.4 .4 Rol le von Modi f iern Als Modifier werden Substanzen bezeichnet, die überkritischen Fluiden zugemischt werden, um eine Veränderung ihrer Extraktionseigenschaften zu erzielen. Üblicherweise werden zu diesem Zweck organische Lösungsmittel wie Methanol, Acetonitril und Ace-ton eingesetzt. Die Zumischung der Modifier kann sowohl vor der Verdichtung als auch danach erfol-gen. Möglich ist auch die Zugabe des Modifiers direkt in die Extraktionshülse, in der sich die zu extrahierende Matrix befindet. Modifier, die auch als Co-Solventien bezeichnet werden [King 1992], vermischen sich mit dem überkritischen Kohlendioxid und beeinflussen (modifizieren) dadurch seine Lö-sungseigenschaften. Überkritisches Kohlendioxid, das mit Methanol modifiziert wurde, weist beispielsweise eine höhere Polarität auf als reines Kohlendioxid und ist dadurch in der Lage, polarere Substanzen besser zu solvatisieren [Valverde-Garcia et al. 1995, Taylor 1995, Luque de Castro et al. 1994]. Die Wirkung von Modifiern beschränkt sich aber nicht nur auf die Verbesserung der Löslichkeit von Verbindungen, sondern auch auf die Überwindung von Wechselwir-kungen zwischen Matrix und Analyten. Dies ist insbesondere im Bereich der Spuren-analytik interessant, da hier die Löslichkeit meist nicht der begrenzende Faktor ist. Mo-difier wie Methanol können aktive polare Zentren der Matrix, die mit polaren Molekülen wechselwirken, maskieren, wodurch die Extraktion dieser Stoffe erleichtert wird [King 1992, Gabriel et al. 1996]. Ein schon seit längerem bekanntes Beispiel für den Einsatz von Wasser zur Verbesserung der Extrahierbarkeit von Verbindungen im industriellen Maßstab ist die Entcoffeinierung von Kaffee [Zosel 1980]. Gerade bei wasserhaltigen Proben bewirkt ein Zusatz von organischen Modifiern oft keine wesentliche Verbesserung der Extraktionsausbeuten von Analyten. Wasser über-nimmt hier die Modifierfunktion, in dem es die Wechselwirkungen zwischen den Analyten und der Matrix schwächt und die Polarität des ÜK-CO2 erhöht [Fahmy et al. 1993, Aharonson et al. 1994, Lehotay et al. 1995b, Eller et al. 1997]. Die Löslichkeit von Wasser in ÜK-CO2 beträgt etwa 0,3 % [Kuk et al. 1983]. Der Zusatz von Modifiern kann auch Probleme mit sich bringen. Da durch Modifier die Lösekraft von überkritischem Kohlendioxid erhöht wird, nimmt die Extraktionsselektivität



ab, so dass in der Praxis Extrakte erhalten werden, die erheblich mehr störende Begleitstoffe aus der Matrix enthalten können [Lehotay et al. 1995b]. Bei Verwendung von Festphasenfallen kann es rasch zu einer Überladung der Falle kommen. Dabei können unter Umständen erhebliche Verluste auftreten. In der Regel wird in diesen Fällen die Festphasenfalle während der Extraktion auf einer hohen Tem-peratur gehalten, um den Modifier zu verdampfen [Mulcahey et al. 1992, Howard et al. 1993, Langenfeld et al. 1994].



3. Methodenentwicklung 3.1 ALLGEMEINE ÜBERLEGUNGEN UND UNTERSUCHUNGEN IM VORFELD

Entscheidend für eine effiziente und erfolgreiche Methodenentwicklung sind Kenntnisse über die Eigenschaften und Besonderheiten der Analyten sowie der Proben aus denen die Rückstände extrahiert werden sollen (Matrices). Hierzu wurden umfangreiche Voruntersuchungen im Bereich der Messung (GC/MS, LC/MS) durchgeführt. Die Messung nimmt bei jeder Methodenentwicklung eine Schlüs-selstellung ein, da nur anhand zuverlässiger Messergebnisse die Optimierung vorausge-hender analytischen Teilschritte effektiv erfolgen kann. Untersucht wurde hierbei, wie sich die verschiedenen Analyte während der Chromatographie verhalten und durch welche Faktoren die Messergebnisse verfälscht werden. Im Bereich der Probenaufarbeitung (Vorbereitung für die Extraktion) wurde der Einfluss verschiedener Parameter auf die Extraktionsausbeuten von Analyten untersucht. Dieses Thema wird jedoch erst in Kapitel 3.2.1.2 vorgestellt. In diesem Abschnitt wird aus dem Bereich der Probenaufarbeitung lediglich die Problematik der Wasserbindung behandelt.

3.1 .1 Opt imierung der Messbedingungen In der Praxis der Pestizid-Rückstandsanalytik zeigt sich immer wieder, dass die am stärksten ins Gewicht fallenden Fehler im Bereich der Messung auftreten. Dennoch wird dieser Bereich sowohl bei der Methodenentwicklung als auch bei der Rückstandsanaly-tik oft stark vernachlässigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Messung eine beson-dere Bedeutung beigemessen und es wurden vertiefte Untersuchungen durchgeführt, um die möglichen Fehlerquellen aufzuspüren und die komplexen Vorgänge und Zusam-menhänge besser zu verstehen.

3.1.1 .1 F lüss igkei tschromatographie

Im der Literatur werden zahlreiche Schwierigkeiten, die bei der Gaschromatographie bestimmter Stoffe auftreten können, erläutert [Anastassiades 1997 und 1998, Andersson et al. 1996, de Kroon et al. 1996]. Für solche Stoffe bieten sich prinzipiell schonendere flüssigkeitschromatographische Verfahren an. In der Routineanalytik von Pestizidrückständen in Lebensmitteln wurden jedoch bisher flüssigkeitschromato-graphische Verfahren nur wenig eingesetzt. Hauptsächlich ist dies auf das Fehlen eines ausreichend empfindlichen universellen LC-Detektors zurückzuführen. Der am meisten verbreitete LC-Detektor, der DAD, ist zwar prinzipiell in der Lage, zahl-reiche Pestizide zu erfassen, hat aber den Nachteil, dass er nicht ausreichend emp-findlich ist und eine zu geringe Selektivität aufweist. Applikationen, die eine Bestim-mung mittels LC/DAD vorsehen sind meist aufwendig, da in der Regel eine intensive Reinigung der Extrakte vor der Messung notwendig ist. Einige herkömmliche Detektor-typen (z.B. Fluoreszenzdetektoren) können zwar eine hohe Empfindlichkeit erreichen, sie sind aber nur für spezielle Applikationen einsetzbar. In den meisten Laboratorien gehören aus diesen Gründen zahlreiche gaschromatographisch nicht erfassbare Pes-tizide, bisher nicht zum routinemäßigen Untersuchungsspektrum.



Diese analytische Lücke kann mit Hilfe der LC/MS weitgehend geschlossen werden. Die Empfindlichkeit und Robustheit der LC/MS-Geräte konnte in den letzten Jahren bedeutend verbessert werden. Vorausgegangen waren entscheidende Fortschritte im Bereich der Interface-Techniken. Das Interface spielt bei der LC/MS eine Schlüssel-rolle. Es hat die Aufgabe, die im Fließmittel gelösten Analyten als freie Ionen in die Gasphase zu überführen. Seit Einführung der LC/MS wurden zahlreiche Interface-Konzepte eingesetzt und ge-testet [Niessen 1998 , Watson 1995, Hau 1994]. Viele davon wurden nicht weiter ver-folgt, da sie zu viele Probleme bereiteten. In den letzten Jahren konnten sich jedoch die API-ES (Athmosperic Pressure Ionisation, Electrospray) und APCI (Athmosperic Pressure Chemical Ionisation) Techniken immer mehr durchzusetzen. Bei beiden Techniken erfolgt die Ionisation unter Atmosphärendruck. Die Funktionsweise beider Techniken wird in Kapitel 3.1.1.1.1 näher erläutert. Für die vorliegende Arbeit stand ein LC/MS Gerät des Typs HP LC/MSD series 1100 zur Verfügung. Dieses Gerät bietet die Möglichkeit sowohl im API-ES als auch im APCI-Modus Messungen durchzuführen. Erfasst werden können in beiden Modi so-wohl positiv als auch negativ geladenen Teilchen. Die Umstellung von dem einen in den anderen Modus erfordert nur wenige Handgriffe und erfolgt schnell. Ein sehr be-deutender Vorteil dieses Gerätes ist die Positionierung des Fließmittelzerstäubers senkrecht zum Ionenstrom (siehe Abb. 3.1.1-1 und Abb. 3.1.1-2). Auf diese Weise wird die Kontamination der Ionenoptik stark reduziert, so dass das Gerät sehr wartungsarm ist. Ferner wird dadurch eine stabile und empfindliche Messung ermöglicht.

3.1.1.1.1 Prinzipien der API-ES und der APCI

3.1.1.1.1.1 API-ES API-ES (auch AP-EI genannt) steht für Atmospheric Pressure Ionisation / Electrospray. In Abbildung 3.1.1-1 ist der Aufbau einer API-ES Ionenquelle schematisch dargestellt. Zur Erklärung des Mechanismus der „Ionenbildung“ beim Elektrospray-Verfahren wur-den seither mehrere Theorien entwickelt, die im wesentlichen sehr ähnlich sind [Iribarne et al. 1976, Thompson et al. 1979, Fenn 1993, Kebarle et al. 1993, Gaskell 1997]. Im allgemeinen beruht das Verfahren auf drei Prozessen: 1. Erzeugung von Tröpfchen (Aerosol), 2. Verdampfung des Elutionsmittels (Tröpfchenschrumpfung) und 3. Überfüh-rung der Ionen in die Gasphase. Die Erzeugung des Aerosols erfolgt, indem das LC-Eluat durch eine Zerstäuber-Kapil-lare geleitet wird. Zwischen der Kapillare und dem Eingang in die Ionenoptik wird eine hohe Spannung angelegt. Wird das Elektrospray im positiven Modus betrieben, bildet die Kapillare den positiven Pol. Bedingt durch das angelegte Spannungsfeld kommt es zu einer Anreicherung von positiv geladenen Ionen am Ausgang der Kapillare, da diese dazu neigen sich in Richtung des Gegenpols zu bewegen. Infolge dessen bekommt die Oberfläche des Fliesmittels eine charakteristische konische Form (sog. Taylor-Konus). Durch die Überwindung der Oberflächenspannung werden kontinuierlich feine überwie-gend positiv geladene Tröpfchen erzeugt, die ihrerseits in Richtung des Gegenpols be-schleunigt werden. Die Zerstäubung wird zudem durch einen Stickstoffstrom an der Ka-pillare unterstützt. Die Verdampfung des Fließmittels und die Freisetzung der Ionen in die Gasphase erfol-gen parallel. Die Entfernung des Lösungsmittels erfolgt mit Hilfe eines heißen Stickstoff-Gegenstromes. Dadurch konzentrieren sich die erzeugten Tröpfchen immer mehr auf. Mit zunehmender Ladungsdichte zerfallen die Tröpfchen durch aufeinanderfolgende



Coulomb-Explosionen zu immer kleineren Einheiten. Diese treten auf, sobald durch die abstoßenden elektrostatischen Kräfte innerhalb der Tröpfchen die Oberflächenspannung überwunden wird (Rayleigh limit [Lord Rayleigh 1882]). Durch weitere Coulomb-Explosionen sowie der Einwirkung des elektrischen Feldes kommt es letztendlich zu Freisetzung von Ionen in die Gasphase. Diese Ionen werden dann zum Analysator (Quadrupol) gelenkt. Im allgemeinen gilt die API-ES als eine sehr schonende Ionisationstechnik. Besonders gut geeignet ist sie für Verbindungen, die im Fließmittel z.T. in ionischer Form vorliegen (z.B. durch Protonierung [M+H]+ oder Deprotonierung [M-H]-). Dazu zählen insbeson-dere Verbindungen mit Säuregruppen und Amino-Gruppen. Aber auch zahlreiche wei-tere Verbindungsgruppen wie Alkohole, Carbonyle, Phosphate, Amide usw. lassen sich hiermit gut detektieren. Interessant ist auch die Entstehung von Cluster-Ionen durch die Anlagerung von Salzionen aus dem Fließmittel wie [M+Na]+ (M+23), [M+K]+ (M+39), [M+ NH4]+ (M+18), [M+Cl]- (M+35). Die Ausbildung solcher Addukte ist erfahrungsgemäß stark von der Fließmittel-Zusammensetzung abhängig. Abb. 3.1.1-1: Schematischer Aufbau der API-ES (Ionenquelle und Analysator, HP series 1100) [HP 1998]

3.1.1.1.1.2 APCI Die APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) ist im Vergleich zur API-ES eine härtere Ionisationstechnik. Auch hier wird das LC-Eluat mit Hilfe eines Gasstroms zer-stäubt. Im Gegensatz zur API-ES herrschen jedoch hier in der Ionisationskammer er-höhte Temperaturen (250-400 °C), wodurch der Sprühnebel rasch verdampft. In der Io-nisationskammer befindet sich eine sog. Corona-Nadel an der durch Entladungen die Lösungsmittelmoleküle ionisiert werden. Die ionisierten Lösungsmittelmoleküle fungieren somit als CI-Reaktandgas und reagieren ihrerseits mit den Analyten, wodurch diese



ionisiert werden (Ladungstransfer). Dabei entstehen überwiegend protonierte [M+H]+ und deprotonierte [M-H]- Molekülionen. Die ionisierten Analyte werden dann in Richtung des Massenanalysators gelenkt (Abb. 3.1.1-2). Die APCI ergänzt die API-ES und er-möglicht die Detektion von Molekülen die keine ionisierbaren funktionellen Gruppen verfügen. Abb. 3.1.1-2: Schematischer Aufbau der Ionisationskammer beim APCI

(HP series 1100) [HP 1998]

3.1.1.1.1.3 Fragmentierung der Ionen Sowohl bei der APCI als auch bei der API-ES passieren die Ionen zunächst eine sog. dielektrische Kapillare, anschließend zwei konische Blenden (Skimmer) und einen Oc-topol bevor sie in den Quadrupol gelangen. In ihrem Flug von der Ionenquelle (~1 bar) zum Quadrupol (~10-6 bar) durchlaufen die Ionen einen Druckgradienten (siehe Abb. 3.1.1-1). Am Ausgang der dielektrische Kapillare beträgt der Druck noch ca. 2 bar. Zwischen dem Ausgang der Kapillare und dem ersten Skimmer ist ein elektrisches Spannungsfeld angelegt. Dadurch werden die Ionen beschleunigt, was zu einer Zu-nahme der Kollisionen mit den vorhandenen Stickstoff-Molekülen führt. Infolge dieser Kollisionen erfolgt in diesem Bereich, der als „Fragmentierungszone“ bezeichnet wird (siehe Abb. 3.1.1-1), eine vermehrte Zersetzung der Ionen in kleinere Bruchstücke. Dieser Vorgang wird als „Collision Induced Dissociation” (CID) bezeichnet. Dem Analytiker bietet sich die Möglichkeit die angelegte Spannung, die als „Fragmen-torspannung“ bezeichnet wird, zu variieren. Dadurch ist es möglich die Fragmentierung der Ionen zu beeinflussen. Bei höheren Fragmentorspannungen erfolgt eine stärkere Fragmentierung, wodurch Bruchstücke entstehen die zur Identifizierung herangezogen werden können. Durch die Variation der Fragmentorspannung lässt sich auf diese Weise die Sensitivität und Selektivität auf das jeweilige analytische Problem abstimmen. Wie auch die GC/MS bietet die LC/MS die Möglichkeit sowohl im SCAN- als auch im SIM-Modus zu arbeiten.



3.1.1.1.2 Matrix-Einflüsse

Nicht nur bei der Gaschromatographie, sondern auch bei der LC/MS bereiten Begleit-stoffe aus der Matrix messtechnische Schwierigkeiten. Um einen Einblick in die Ursa-chen dieser Effekte zu bekommen, wurden auch hier verschiedene Versuche durchge-führt. Die Untersuchungen beschränkten sich jedoch nur auf den Bereich der API-ES, da fast alle Bestimmungen mit dieser Technik durchgeführt wurden. 3.1.1.1.2.1 Abhängigkeit von der Matrixkonzentration Schon im Verlauf der ersten Wiederfindungsversuche mit dem LC/MS im API-ES Modus wurde festgestellt, dass im Fall einer Ko-elution von Matrixbestandteilen eine Suppres-sion der Signale von Analyten erfolgte. Es wurde beispielsweise beobachtet, dass die Verbindung Triphenylphosphat (TPP, als interner Standard verwendet), in Zitrus-Ex-trakten deutlich erniedrigte Signale aufwies. Ein im SCAN-Modus aufgenommenes Chromatogramm zeigte, dass erhebliche Mengen an Matrixbestandteilen mit Triphenyl-phosphat ko-eluieren. Diese Problematik wurde im folgenden Versuch näher untersucht. Hierzu wurden die Extrakte von mehreren Extraktionen einer Zitronen-Matrix vereint. Um den Einfluss der Matrix-Konzentration auf die Suppression sichtbar zu machen, wurde eine Verdün-nungsreihe dieser Extrakte vorgenommen. Jeder Verdünnungsstufe wurden unter-schiedliche Konzentrationen der Substanz TPP zugesetzt, so dass gleichzeitig auch die Änderung der Matrix-Einflüsse in Abhängigkeit von der Analyt-Konzentration verfolgt werden konnte. Die ermittelten Signale wurden mit den entsprechenden Signalen gleichkonzentrierter Standardlösungen in reinem Lösungsmittel verglichen. Wie in Ab-bildung 3.1.1-3 ersichtlich, hat die Konzentration der Matrix einen sehr starken Einfluss auf die Ausprägung der Suppressionen.



Abb. 3.1.1-3: Einfluss der Zitronen-Matrix-Konzentration auf die Signalsuppression von Triphenylphosphat (LC/MS im API-ES (pos.) Modus, Inj. vol. 5 µl)

2,5 1,25 0,625 0,3120,156 0,078

0,039

2 g/ml

1 g/ml0,5 g/ml

0,25 g/ml0,125 g/ml

ohne M atrix

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

TPP Konzentration [µg/ml]

Flächen normiert

Matrix-konzentration

Die beschriebenen Effekte haben beträchtliche Konsequenzen für die Bestimmung. Eine Signalsuppression am internen Standard, wie im obigen Beispiel beschrieben, führt zwangsläufig zu überhöhten Ergebnissen. Erfolgt dagegen eine Suppression am Analyten, werden zu niedrige Werte ermittelt. In der Praxis ist es sehr schwer zu erkennen, wann und in welchem Ausmaß eine Sig-nalsuppression infolge von Matrix-Einflüssen stattfindet. Dies stellt ein großes Problem dar, da die Unsicherheit bei der Messung entsprechend groß wird. Es wird ersichtlich, dass bei LC/MS-Messungen stets große Sorgfalt erforderlich ist. Hilfreich ist hierbei das Arbeiten mit zwei oder mehreren internen Standards, so dass eine Signalsuppression an einem der internen Standards als solche erkannt wird. Eine weitere Möglichkeit, Matrix-Einflüsse zu erkennen, ergibt sich aus der Tatsache, dass die Signalsuppression mit abnehmender Konzentration an ko-eluierenden Matrix-bestandteilen stark reduziert wird. Dies wird in Abbildung 3.1.1-4 verdeutlicht. Um dieses zu erreichen, kann entweder eine Verdünnung der Probelösungen vorgenommen werden oder es können entsprechend kleinere Volumina injiziert werden. Vergleicht man die Ergebnisse, lässt sich einfach feststellen, ob im betreffenden Fall signifikante Matrix-Einflüsse vorlagen. Eine weitere wichtige Erkenntnis aus diesem Experiment war, dass unabhängig von der Matrixkonzentration eine quasi lineare Beziehung zwischen TPP-Konzentration und MSD-Signal bestand. Die Matrix hatte also lediglich einen Einfluss auf die Steigung je-doch nicht auf die Linearität (siehe Abb. 3.1.1-4). Dies ist von großer Bedeutung, da Linearität eine wichtige Voraussetzung für die Durchführung von Kalibrierungen nach dem Standardadditionsverfahren ist (vgl. Kap. 3.1.1.1.3). Wie auch bei der GC/MS haben sich bei der LC/MS Kalibrierungen auf Matrix als sehr hilfreich zur Kompensation von Matrix-Einflüssen erwiesen.



Abb. 3.1.1-4: Linearität der Beziehung Analyt-Konzentration/Detektorsignal bei unterschiedlichen Matrixkonzentrationen (LC/MS API-ES (pos.) Modus, Injektionsvolumen 5 µl)

0

50

100

150

200

250

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

2 g/ml

1 g/ml

0,5 g/ml

0,25 g/ml

0,125 g/ml

ohne Matrix

TPP Konzentration [µg/ml]

Fläche

Matrix

3.1.1.1.2.2 Nicht-linearer Respons Die eben beschriebene quasi-lineare Detektion erstreckt sich lediglich über einen be-grenzten Konzentrationsbereich. Betrachtet man jedoch größere Konzentrationsberei-che, so ist in der Regel eine deutliche Krümmung der Respons-Kurven festzustellen. Dies wird in den Abbildungen 3.1.1-5 und 6 anhand verschiedener Beispiele gezeigt. Zur Erklärung dieser Erscheinung kann angenommen werden, dass in diesem Fall der Analyt selbst die Rolle der Matrix übernimmt und auf ähnliche Weise eine Signal-Sup-pression bewirkt. Man könnte hier demnach von einer Art „Autosuppression“ sprechen. Zwischen den Analyten bestehen in dieser Hinsicht erhebliche Unterschiede. Während TPP, Carbaryl und Linuron über weite Strecken einen linearen Detektionsbereich zei-gen, ist bei Imazalil und den Organozinn-Verbindungen Fenbutatinoxid (FBO), Fentin und Cyhexatin eine starke Krümmung bereits bei niedrigen Konzentrationen erkennbar. Hierbei ist jedoch zu erwähnen, dass bei der Messung der Organozinn-Verbindungen eine mobile Phase eingesetzt wurde, die 3 % Essigsäure enthielt. Diese hohe Konzent-ration an Essigsäure wurde gewählt, um die chromatographischen Eigenschaften der Organozinn-Verbindungen zu verbessern. Es wurde jedoch beobachtet, dass mit steigender Konzentration an Essigsäure eine stärkere Krümmung der Kalibrierkurven einherging. Auf diese Problematik wird in Kapitel 3.2.2.5.1.2 näher eingegangen. Bei allen anderen Messungen enthielt die mobile Phase lediglich 5 mmol Ammonium-acetat pro Liter.



Abb. 3.1.1-5: Detektionsverhalten verschiedener Pestizide im Bereich von 0,05 µg/ml bis 2 µg/ml, (LC/MS API-ES (pos.) Modus, Inj. vol. 5 µl)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2

Konzentration [µg/ml]

Respons normiert

HilfslinieLinuronCarbarylMethamidophosFentinImazalilCyhexatinFBO

Hilfslinie (linear)

Abb. 3.1.1-6: Detektionsverhalten verschiedener Verbindungen im Bereich von 0,05 µg/ml bis 15 µg/ml, (LC/MS API-ES (pos.) Modus, Inj. vol. 5 µl)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2 4 6 8 10 12 14 16


Respons normiert

HilfslinieLinuronCarbarylMethamidophosFentinImazalilCyhexatinFBO

Hilfslinie (linear)



Die Durchführung von internen Kalibrierungen nach dem Standardadditionsverfahren ist im Fall der Organozinn-Verbindungen unter diesen Bedingungen etwas problematisch, da hierfür ein annähernd linearer Respons Voraussetzung ist. Wenn das nicht zutrifft, ergeben sich zwangsläufig Fehler bei der Extrapolation. Daher sollten hier - wenn über-haupt - möglichst kleine Standardadditionen vorgenommen werden. Soll dagegen extern kalibriert werden, so ist auf jeden Fall eine Mehrpunkt-Kalibrationskurve zu erstellen. 3.1.1.1.2.3 Vergleich der Matrix-Einflüsse bei GC und LC Im folgenden wird eine Übersicht über die prinzipiellen Unterschiede zwischen den bei der GC/MSD und LC/MS (API-ES) auftretenden Matrix-Einflüssen gezeigt (Tabelle 3.1.1-1). Tab. 3.1.1-1: Haupt-Unterschiede zwischen den Matrix-Einflüssen bei der GC/MSD und der LC/MS (API-ES)

GC/MSD LC/MS (API-ES) Injektorbereich

Detektorbereich

Matrixbestandteile bewirken in der Regel eine Signalerhöhung

Matrixbestandteile bewirken in der Regel eine Signalsuppression

starke Unterschiede in der Ausprägung der Effekte von Analyt zu Analyt (vgl. Kap. 3.1.1.1.1.3 und Tab. 3.1.1-2)

ebenfalls starke Unterschiede in der Aus-prägung der Effekte von Analyt zu Analyt (vgl. Abb. 3.1.1-21)

Abhängigkeit von der Matrixart und der Matrixkonzentration

starke Abhängigkeit von der Matrixart und der Matrixkonzentration

unabhängig von der chromatographischen Trennung

starke Abhängigkeit von der chromato-graphischen Trennung bei ausreichender Trennung des Analyten von Matrixkomponenten tritt keine Suppression auf

Effekte zeitlich nicht konstant stark vom Zustand der Kontaktoberflächen im System (hauptsächlich Injektorbereich) abhängig

Effekte meist zeitlich konstant und reproduzier-bar (bei gleichen chromatographischen Be-dingungen)

Massenspektren konstant

Massenspektren verändern sich z.B. bei unterschiedlicher Fließmittelzusammensetzung (pH-Wert), Ko-elutionen von Matrixbestandteilen oder Ionen Ausbildung von Addukten z.B. mit H+, Na+, K+, NH4

+ und Verzerrung des Massen-spektrums)

Es wird ersichtlich, dass sich die bei der LC/MS (API-ES) auftretenden Matrixeffekte deutlich, sowohl in ihren Ursachen als auch in ihren Auswirkungen, von denen bei der Gaschromatographie unterscheiden.



3.1.1.1.2.4 Mögliche Ursachen für Matrix-Einflüsse bei der API-ES Die Erzeugung von Ionen bei der LC/MS-API-ES hängt vor allem von physikalischen und chemischen Prozessen innerhalb der gebildeten Tröpfchen ab. Will man die Ursa-chen für die hier vorkommenden Matrix-Effekte erkunden, muss daher ein Blick auf diese Prozesse geworfen werden. Im folgenden werden einige Überlegungen zu den möglichen Ursachen der Matrixeffekte bei der API-ES vorgestellt. Engpässe bei der Freisetzung von Ionen aus den Tröpfchen Es ist denkbar, dass es ab einer gewissen Konzentration zu einer Sättigung der Ober-fläche der Tröpfchen mit einem oder verschiedenen Ionen kommt, so dass es bei der Freisetzung zwangsweise zu Diskriminierungen kommt. Das Auftreten eines Sätti-gungseffektes („Autosuppression“) deutet in diese Richtung. Bildung von Addukt-Ionen Innerhalb der Tröpfchen können die Analyten mit verschiedenen Ionen in Wechselwir-kung treten, wodurch geladene Konjugate gebildet werden. Mehrfach beobachtet wurde die Ausbildung von Addukten mit Ionen aus der mobilen Phase z.B. H+, Na+, NH4

+, K+. Unterschiede in der Konzentration dieser Ionen (Kontaminationen mit Salzen, Fließmit-tel-Zusammensetzung, pH) können zu einer Verzerrung des Spektrums des gebildeten Ionen führen. Bildung von Ionen-Paaren Da in den Tröpfchen eine hohe Ladungsdichte herrscht, ist es weiterhin denkbar, dass im Inneren der Tröpfchen zwischen Kationen und Anionen Ionenpaare gebildet werden. Die auf diese Weise neutralisierten Analyte würden dann nicht mehr für die Detektion zur Verfügung stehen. Dieser Effekt könnte im Fall der Organozinn-Verbindungen und bei Imazalil eine Rolle spielen, da diese Verbindungen eine besondere Neigung haben in Wechselwirkungen zu treten. Änderung der Oberflächenspannung Beim Zerfall der Tröpfchen in kleinere Einheiten, sowie bei der Desorption von Ionen in die Gasphase spielt die Oberflächen-Spannung eine wesentliche Rolle (siehe Kap. 3.1.1.1.1.1). Es ist daher zu erwarten, dass alle Faktoren, die diesem Parameter verän-dern können auch die Freisetzungsrate von Ionen beeinflussen (z.B. Lösungsmittelzu-sammensetzung, Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen in der Matrix).

3.1.1.1.3 Berücksichtigung der „Matrixeinflüsse“ in der Praxis

Wie aus dem vorangegangenen Kapitel ersichtlich wird, können bei der flüssigkeitschromatographischen Bestimmung erhebliche Fehler auftreten. Es ist deshalb wichtig, darauf zu achten, dass sowohl die Probelösung als auch die Kalibrier-lösungen unter möglichst gleichen Bedingungen gemessen werden. Dies gilt sowohl für die Art und Konzentration der Begleitstoffe in der Matrix als auch für den Zustand des Messgerätes. Um ersteres zu erreichen, ist die Verwendung von matrixhaltigen Kali-brierlösungen unumgänglich. Letzteres kann durch die Durchführung der Messungen in kurzem zeitlichen Abstand annähernd gewährleistet werden.



3.1.1.1.3.1 Externe Matrix-Kalibrierungen Als eine Möglichkeit zum Ausgleich der Matrix-Einflüsse bieten sich externe Matrix-Ka-librierungen an. In diesem Fall werden die Kalibrierungsstandards durch Dotierung von Extrakten pestizidfreier Proben der gleichen Art hergestellt. Um die „Matrixeinflüsse“ weitgehend auszugleichen, muss darauf geachtet werden, dass Kalibrierlösungen und Probenextrakt in etwa die gleiche Konzentration an Matrix aufweisen. Von Nachteil bei diesem Verfahren ist jedoch, dass eine zusätzliche Aufarbeitung von pestizidfreien Pro-ben erfolgen muss. Solche Proben sind aber nicht nur schwer zu beschaffen, sie unter-scheiden sich zudem oft von den zu untersuchenden Proben (z.B. hinsichtlich der Sorte, des Reifegrades sowie des Schalen- u/o Kernanteils). 3.1.1.1.3.2 Interne Matrix-Kalibrierungen (Standardaddition) Eine praktikablere Möglichkeit sind interne Matrix-Kalibrierungen nach dem Standard-additionsverfahren. Hierzu wird der Probenextrakt in mehrere Aliquote geteilt, die dann mit den entsprechenden Analyten in unterschiedlichen Mengen aufgestockt werden (parallele Standardaddition, vgl. Abb. 3.1.1-7). In diesem Fall entfällt die gesonderte Aufarbeitung einer pestizidfreien Probe. In Abbildung 3.1.1-8 wird das Prinzip einer solchen Kalibrierung schematisch gezeigt. Abb. 3.1.1-7: Prinzip der internen Matrix-Kalibrierung nach einer Aliquotierung („parallele“ Standardaddition)

Probenextrakt (mit internem Standard)

Aliquotierung

Aliquot

1 Aliquot

2 Aliquot

3 Aliquot

4 Standardaddition 1 Standardaddition 2 Standardaddition 3

Volumenausgleich Volumenausgleich Volumenausgleich Volumenausgleich Messlösung

1 Messlösung

2 Messlösung

3 Messlösung

4

Messung Messung Messung Messung

Kalibrierung



Abb. 3.1.1-8: Interne Kalibrierung nach dem Standardadditionsverfahren, schematisch

|x|

Flächenverhältnis Analyt/ISTD

zugegebene Menge an Analyt (Aufstockung)

|x|: absolute Menge an Analyt im Probenextrakt vor der Dotierung (y=0)

y-Achsenabschnitt = ׀x׀

Steigung der Geraden

In Anbetracht der geringen Probenmenge, die bei der SFE extrahiert wird, ist diese Art der internen Kalibrierung, bei der Aliquotierungen vorgenommen werden, häufig nicht praktikabel. „Interne Kalibrierungen“ nach dem Standardadditionsverfahren können aber auch ohne eine Aliquotierung erstellt werden, in dem die gleiche Probelösung mehrfach mit Standard aufgestockt und gemessen wird. Die Tatsache, dass die Matrix-Einflüsse nach jeder Standardzugabe aufgrund der Verdünnung etwas verringert werden (Matrix-konzentration nimmt ab) bleibt hier allerdings unberücksichtigt. Um diese Fehler gering zu halten, ist es demnach wichtig kleine Volumina zu dotieren (vgl. Abb. 3.1.1-9). Abb. 3.1.1-9: Prinzip der „internen Kalibrierung“ ohne Aliquotierung des Extraktes (Standardadditionsverfahren)

Probelösung (mit ISTD)

Messung

Standardaddition

Messung Erstellung einer Kalibrierung

Standardaddition

Messung



3.1 .2 Opt imierung der Probenvorbere i tung Da bei der SFE relativ kleine Probemengen pro Ansatz verwendet werden (z.B. bis zu ca. 3 g bei Verwendung des HP 7680-T Extraktors), muss sicher gestellt werden, dass die eingesetzten Obst- und Gemüseproben gut homogenisiert und für die Gesamtprobe repräsentativ sind. Eine intensive Zerkleinerung ist daher erforderlich. Abbauvorgänge müssen hierbei jedoch so weit wie möglich unterdrückt werden. Bei zahlreichen Matrices wie Salaten, Kernobst und Beerenobst kann bei Verwendung eines hochtourigen Mixers ohne große Probleme ein guter Homogenitätsgrad erreicht werden [vgl. Di Muccio 1996]. Andere Probenarten wie Trauben, Paprika, Mango, Zitrus-früchte bereiten jedoch größere Schwierigkeiten. Insbesondere die Schalen, auf denen sich die Pestizidrückstände oft größtenteils lokalisieren, werden nicht ohne weiteres in dem gewünschten Grad zerkleinert. Dies führt zwangsläufig zu einer erhöhten statistischen Streuung bei Gehaltsbestimmungen. In diesen schwierigen Fällen konnte ein ausreichend guter Homogenitätsgrad nur durch eine Zerkleinerung im gefrorenem Zustand erreicht werden. Hierzu wurden die Proben zunächst mit einem Messer grob zerkleinert, dann tiefgefroren und in gefrorenem Zu-stand mit einem hochtourigen Mixer feinzerkleinert. Wenn sich die Probe im gefrorenem Zustand befindet, wird die Zerkleinerung durch die Eiskristalle in den Zellen unterstützt, so dass in der Regel ein ausreichender Homo-genitätsgrad erreicht wird. Das Material befindet sich nach der Feinzerkleinerung meist noch in gefrorenem Zustand, so dass, im Gegensatz zu Zerkleinerungen im frischen Zustand, keine Separierung der wässrigen (Saft) von der festen Phase (Zellwände) er-folgt. Die zerkleinerten Proben lassen sich zudem schnell wieder tiefgefrieren [Anastassiades 1998]. Die Zerkleinerung in gefrorenem Zustand bietet auch einen weiteren Vorteil. Bei der Zerkleinerung der Proben in frischem Zustand können unter Umständen erhebliche Wirkstoffverluste auftreten. Durch die Feinzerkleinerung der pflanzlichen Proben wird die Kompartimentierung der Zellen aufgehoben, wodurch Enzyme, die für Abbauvorgänge mitverantwortlich sind, freigesetzt werden. Pestizide, die sich auf der Schale lokalisierten kommen in Kontakt mit den Fruchtsäften. Darüber hinaus wird Luft in die Matrix eingeschlagen. Verschiedene enzymatische und chemische Reaktionen werden dadurch ermöglicht oder begünstigt. Zudem kann die beim Zerkleinerungsprozess frei-gesetzte Wärme zu einer Beschleunigung von Abbauprozessen führen. Durch die Einhaltung niedriger Temperaturen während der Zerkleinerung können solche zu Wirk-stoffverlusten führenden Prozesse bedeutend verlangsamt werden. Eine effektive Kühlung von Proben während des Zerkleinerungsvorgangs kann auch durch Zumischung von Trockeneis in die Zerkleinerungsapparatur erreicht werden [vgl. Lehotay 1995, Allmendinger 1999]. Neben dem eintretenden Kühleffekt hat diese Vor-gehensweise auch einen weiteren Vorteil. Durch die Verdrängung der Luft aus der Probe werden gleichzeitig Oxidationsprozesse zurückgedrängt. Dieser Sachverhalt wurde jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht.



3.1 .3 Probenaufarbei tung Unter Probenaufarbeitung sind hier alle Arbeitsschritte zwischen der Probenvorbereitung und der Extraktion zu verstehen. Durch die Probenaufarbeitung soll erreicht werden, dass die Proben bei einem angemessenen Arbeits- und Materialaufwand durch verschiedene Zusätze in eine handliche und leicht extrahierbare Form gebracht werden. Die Extraktion der Pestizide aus der aufgearbeiteten Matrix soll bei einem angemes-senen Zeitaufwand möglichst quantitativ erfolgen können. Da sich sowohl die verschiedenen Pestizide als auch die Matrix in ihren Eigenschaften z.T. erheblich unterscheiden können, ist in einigen Fällen eine individuelle Probenauf-arbeitung erforderlich. Diese Problematik wird in Kapitel 3.2.1.2 dargestellt. Eine zentrale Bedeutung bei der Probenaufarbeitung von Obst- und Gemüseproben kommt der Immobilisierung von Wasser zu, da dieses zu einer Beschädigung des SFE-Extraktors (Restriktor) führen kann (vgl. Kap. 2.2).

3.1.3 .1 Ent fernung bzw. Immobi l i s ierung des Wassers

Aufgrund der Schwierigkeiten, die Wasser bei SFE-Extraktionen bereitet, setzten an-fänglich viele Anwender die SFE lediglich für Proben mit geringen Wassergehalten ein, wie Erde und Getreide [Seidel et al. 1993, King et al. 1993). In der Literatur werden mittlerweile verschiedene Vorgehensweisen beschrieben, um die Probleme, die Wasser bereitet, in den Griff zu bekommen, z.B. Gefriertrocknung [Wigfield et al. 1993, Jiménez et al. 1994], Verwendung von chemischen Trockenmitteln wie Magnesiumsulfat und Natriumsulfat [Burford et al. 1993, Valverde-Garcia et al. 1995, Stefani et al. 1996] und Zusatz von wasseradsorbierenden Materialien, die eine große Oberfläche besitzen und dadurch in der Lage sind, große Mengen an Wasser physikalisch zu binden.

3.1.3.1.1 Wasserentfernung durch Gefriertrocknung

Die Gefriertrocknung ist eine relativ schonende Methode um einer Probe Wasser zu ent-ziehen. Dennoch besitzt sie auch gewisse Nachteile. Insbesondere bei Proben, die re-lativ viel Zucker enthalten, bilden sich im Verlauf der Trocknung karamelartige, pasteuse Massen, die den Trocknungsvorgang verzögern und ggf. Rückstände einschließen. Zu-dem nehmen die getrockneten, hygroskopischen Proben schnell wieder Luftfeuchtigkeit auf, so dass ihre Handhabung Sorgfalt verlangt. Ein weiterer Nachteil der sich aus der Gefriertrocknung ergibt ist die schlechtere Extrahierbarkeit verschiedener Pestizide bei Abwesenheit von Wasser. Die Gegenwart von Wasser ist von großer Bedeutung, da es die Wechselwirkungen zwischen Analyten mit polaren Zentren und der Matrix ab-schwächt (siehe Kap. 2.4.4). Des weiteren ist anzunehmen, dass es unter den Bedin-gungen der Gefriertrocknung zu einer Verflüchtigung von Wirkstoffen kommen kann. Nach eigener Erfahrung ist die Gefriertrocknung mit einem relativ großen Arbeits- und Zeitaufwand verbunden. Der Trocknungsvorgang dauert sehr lange und bringt keine entscheidenden Vorteile.



3.1.3.1.2 Physikalische Wasserbindung durch Adsorbentien

Verschiedene Adsorbentien auf Basis von Diatomeenerde, die natürlicherweise eine sehr große Oberfläche aufweisen (z.B. Hydromatrix (Varian), Kieselgur, Celite) können zur Immobilisierung von Wasser eingesetzt werden [Hopper et al. 1991, Lehotay et al. 1995a+b]. Die vorzerkleinerte und homogenisierte Obst- oder Gemüseprobe wird hierbei in einem bestimmten Verhältnis (z.B. 2,5:2) mit einem Adsorbens vermengt. Aliquote des homogenen Gemisches werden in Extraktionshülsen gefüllt und extrahiert. Diese Art der Probenvorbereitung ist einfach durchzuführen, erfordert wenige Arbeits-schritte und ermöglicht eine effiziente Extraktion von Rückständen, da die Probe durch die Vermengung mit dem Adsorbens über eine große Oberfläche verteilt wird. Möglich ist auch der Einsatz von Adsorbentien auf Zellulose-Basis, die ebenfalls größere Men-gen an Wasser zu immobilisieren vermögen [Burford et al. 1993]. Die gute Wasseraufnahmefähigkeit der oben beschriebenen Materialien beruht auf der hohen Anzahl freier Hydroxygruppen auf deren Oberfläche. Dadurch wird eine ausge-zeichnete Benetzung dieser Materialien durch Wasser ermöglicht. Nachteilig in diesem Zusammenhang ist jedoch die Tatsache, dass zahlreiche Pestizide, insbesondere sol-che, mit basischen Eigenschaften, dazu neigen, mit derartig aktiven Oberflächen in Wechselwirkung zu treten (vgl. Kap. 3.2.1.2.3). Diese Problematik wurde bereits von Oostdyk et al. [1993] und Burford et al. [1993] angeschnitten. 3.1.3.1.3 Chemische Wasserbindung durch Salze

Neben der rein physikalischen Wasserbindung durch die oben beschriebenen Adsor-bentien besteht die Möglichkeit einer chemischen Wasserbindung. Trocknungs-Salze wie Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat, die in der Lage sind größere Mengen an Was-ser zu binden (Kristallwasser), können hier eingesetzt werden. Leider kommt es jedoch in der Praxis bei einer Vermengung von wasserhaltigen Proben mit diesen Salzen zur Ausbildung von harten Klumpen, was sich ungünstig auf die Extraktion auswirkt. Aus diesem Grund ist es angebracht, stets zusätzlich zum Salz eine gewisse Menge an ei-nem Adsorbens wie Hydromatrix beizumengen, um die Handhabung der Proben zu er-leichtern. Durch die chemische Bindung des Wassers steht dieses nicht mehr zur Verfügung. Das Volumen der wässrigen Phase in der Probe verringert sich dadurch erheblich, so dass die Extraktion von polaren Pestiziden, die eine hohe Wasserlöslichkeit besitzen be-günstigt wird (siehe hierzu Kap. 3.2.1.2.1). In diesem Zusammenhang ist auch der Aus-salzeffekt zu nennen, der hier zum Tragen kommt (siehe hierzu Kap. 3.2.1.2.1.1). Einige praktischen Nachteile, die sich bei der Verwendung von Salzen ergeben, werden im folgenden Kapitel (3.2) geschildert.



3.2 ENTWICKLUNG VON BESTIMMUNGSMETHODEN

Im vorangegangenen Abschnitt wurden Experimente zur Optimierung der Proben-vorbereitung sowie der Messung vorgestellt. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse waren für die Entwicklung der in diesem Kapitel vorgestellten Bestimmungsverfahren sehr hilfreich. Im Bereich der Extraktion (apparative Bedingungen) wurde dagegen nur wenig optimiert, da zum einen auf Angaben aus der Literatur zurückgegriffen werden konnte [Schulenberg-Schell, pers. Mitt. 1996, Lehotay et al. 1995a+b und 1997, Stefani et al. 1997] und zum anderen nach eigenen Untersuchungen [Anastassiades 1998] eine Va-riation der apparativen Parameter (Extraktions-Druck, -Temperatur, -Flussrate) innerhalb sinnvoller Bereiche in den meisten Fällen keine signifikanten Auswirkungen auf die Extraktionsausbeuten hatte. Ferner wurde festgestellt, dass selbst bei relativ drastischen Bedingungen die Extrakte eine ausreichend hohe Reinheit aufwiesen, so dass auch in dieser Hinsicht keine Limitation bestand. Aus diesem Grund wurden mit wenigen Ausnahmen (Organozinn-Verbindungen (siehe Kap. 3.2.2.5) und z.T. basische Pestizide (siehe Kap. 3.2.2.1)), für alle hier vorgestellten Extraktionen die gleichen Bedingungen gewählt (siehe Tab. 3.2.1-1). Im folgenden werden verschiedene Einsatzmöglichkeiten der SFE im Bereich der Multi-rückstandsanalytik von Pestiziden präsentiert. Dabei werden Bestimmungsverfahren für verschiedene Verbindungsklassen, die herkömmlich große analytische Schwierigkeiten bereiten (saure und basische Pestizide, N-Methyl-Carbamate, Harnstoff-Derivate, Organozinn-Pestizide), vorgestellt.

3.2 .1 E insatz der SFE in der Pest iz id-Mul t i rückstandsanalyt ik Eine optimale Extraktion des gesamten Pestizidspektrums ist mit einer einzigen Me-thode praktisch nicht möglich. Das Erfassungsspektrum einer Multimethode ist u.a. durch die Extraktionsbedingungen und die eingesetzten Messmethoden limitiert. Limitie-rend wirken auch die aus der Matrix stammenden Bestandteile, die ggf. bei der Messung interferieren. Zur Beseitigung dieser Störungen sind oft aufwendige Reinigungsschritte erforderlich. Multimethoden sind daher in der Regel nur ein Kompromiss. Verluste von Substanzen müssen oft in Kauf genommen werden, um ein möglichst gutes Gesamt-ergebnis bei einem angemessenen Aufwand zu erzielen. Durch die weitgehende Automatisierung und die hohe Extraktionsselektivität kann die SFE für die Multirückstandsanalytik von Pestiziden erfolgreich eingesetzt werden [Anastassiades 1998]. Im folgenden wird das Prinzip der einfachen SFE-Multimethode kurz aufgezeigt, mit der bereits Wiederfindungen für mehr als 120 verschiedene Pestizide aus Obst und Gemüse durchgeführt wurden (Basismethode) [Anastassiades 1998]. Anschließend werden verschiedene Möglichkeiten zu Verbesserung der Extraktionsausbeuten verschiedener Pestizide aufgezeigt. Hierbei wird der Bereich der Probenaufarbeitung, der im vorangegangenen Kapitel nur angeschnitten wurde, weiter vertieft.



3.2.1 .1 E in fache Mul t imethode (Bas ismethode)

In Abbildung 3.2.1-1 sind die einzelnen Arbeitsschritte der ausgearbeiteten SFE-Multi-methode schematisch aufgeführt. Eine detaillierte Analysenvorschrift findet sich in Anlage 1. Die Extraktionsbedingungen für beide verwendeten Extraktoren sind in Tabelle 3.2.1-1 aufgeführt. Sehr hilfreich für die Ausarbeitung dieser Methode waren neben den wertvollen Erkenntnissen aus den Vorversuchen (Kap 3.1) die Arbeiten von Lehotay et al. [1995]. Abb. 3.2.1-1: Durchführungsschema der Multimethode (siehe auch Anlage 1)

Probenvorbereitung (Feinzerkleinerung in gefrorenem Zustand)

Einwaage

Probe mit Hydromatrix vermischen

(Verhältnis: z.B. 2,5 g Probe und 2 g Hydromatrix)

Aliquot in die Extraktionshülse füllen (z.B. 4,5 g)

Supercritical Fluid Extraction (SFE) mit CO2

ggf. Derivatisierung

LC/MS

Analyse GC/MSD

Analyse Tab. 3.2.1-1: Extraktionsbedingungen

SFE-Parameter für HP 7680T:

o Extraktionsdruck: 329 bar, o Temperatur: 55 °C o Dichte: 0,89 g/ml o statische Extraktion: 2 min o dynamische Extraktion: 25 min o CO2-Fluss: 1,8 ml/min o Fallenmaterial: ODS, 10 °C während der Extraktion o Elutions-Lösungsmittel: Acetonitril

SFE-Parameter für ISCO SFX 3560:

o Extraktionsdruck: 330 bar, T o Temperatur: 55 °C o Dichte: 0,89 g/ml o statische Extraktion: 2 min o dynamische Extraktion: 25 min o CO2-Fluss: 1,8 ml/min o Lösungsmittel in der Vorlage: 10 ml Aceton:Acetonitril (4:1) o Temperatur der Vorlage: 0 °C



Dank der SFE hat diese Methode im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren erhebliche praktische Vorteile. Sowohl die Extraktion als auch die Aufnahme der Extrakte in das für die chromatographischen Prozesse (GC und HPLC) geeignete Lösungsmittel (Aceto-nitril) erfolgt automatisch. Der Aufwand an manuellen Arbeiten beschränkt sich daher nur auf Probenzerkleinerung, Einwaage, Vermengung mit Adsorbens und Befüllen der Extraktionshülsen und ist erheblich geringer als bei den herkömmlichen Multimethoden. Infolge der selektiven Extraktionsbedingungen ist ein aufwendiges Clean-up hier nicht notwendig.

3.2.1.1.1 Wiederfindungsversuche

Wiederfindungsversuche werden durchgeführt um festzustellen, ob das Extraktions-verfahren prinzipiell geeignet ist Wirkstoffe aus Proben zu extrahieren. Hierbei besteht jedoch ein prinzipielles Problem, da es kaum möglich ist durch Dotierungen im Labora-torium den Zustand gewachsener Rückstände zu erreichen. Um diesem Zustand mög-lichst nahe zu kommen, müssen daher bei der Dotierung von Proben einige Punkte be-achtet werden. Um eine möglichst homogene Verteilung der Pestizide in das Probenmaterial zu errei-chen, sollte das Lösungsmittel in dem der zu dotierende Standard gelöst ist möglichst gut mit Wasser mischbar sein. Dies ist insbesondere dann notwendig, wenn anschlie-ßend eine Aliquotierung der aufgearbeiteten Probe vorgenommen wird. Des weiteren wird dadurch vermieden, dass es zu einer Phasen-Separation kommt was u.U. zu Ver-lusten führen kann (Lösungsmittel kriecht die Gefäßwand hoch und verdunstet). Das Lösungsmittel sollte ferner einen hohen Dampfdruck besitzen, so dass es bis zur Abfüllung der Proben in die Extraktionshülsen möglichst vollständig verdampft ist. Wäre dies nicht der Fall könnte dies zu einer Verfälschung der Wiederfindungsraten führen (Modifier-Wirkung von Lösungsmittel vgl. Kap. 2.4.4). 3.2.1.1.1.1 Vorgehensweise bei Dotierungen Für die Wiederfindungsversuche erfolgte die Dotierung auf rückstandsfreies und ggf. feinzerkleinertes Probenmaterial. Bei Proben mit einer flüssigen Beschaffenheit wie Säften, zerkleinertem Beerenobst wurden größere Probenmengen dotiert, die dotierten Pestizide durch Schwenken homogen verteilt und der Ansatz mit Hydromatrix im entsprechenden Verhältnis vermischt. In die Extraktionshülsen wurden dann Aliquote dieser Mischung eingewogen. Bei Proben, die einen hohen Anteil an festen Bestandteilen aufweisen z.B. Zitrusfrüchte, Kohlgemüse, Apfelmus war es trotz der Verwendung von Aceton als Dotierungs-Lö-sungsmittel nicht möglich eine ausreichend homogene Verteilung der Pestizide in der Matrix zu erzielen, so dass größere Schwankungen bei den Ergebnissen für die einzel-nen Aliquote resultierten. In diesen Fällen wurde daher eine Aliquotierung vermieden. Die Dotierungen erfolgten portionsweise auf Probenmengen, die einem Extraktionsan-satz entsprechen (z.B. 2,5 g Probe wurden dotiert und mit 2 g Hydromatrix vermengt, das entspricht der Füllung einer Extraktionshülse). Die Konzentration der Standardlösungen wurde so gewählt, dass möglichst geringe Volumina der Lösung zugegeben werden mussten (z.B. 100 µl acetonische Lösung). Um das Lösungsmittel zu verdampfen, wurde der Ansatz für einige Minuten stehen ge-lassen und erst dann in die Extraktionshülse überführt.



Zur Herstellung der Matrix-Extrakte für Kalibrierungs-Standards auf Matrix wurde auf ähnliche Art und Weise vorgegangen. Statt der Standardlösung wurde jedoch hier die gleiche Menge reinen Acetons zugegeben und wie beschrieben weiter verfahren. Die hier vorgestellte Vorgehensweise wurde bei allen hier vorgestellten Wiederfindungs-versuchen angewandt.

3.2.1 .2 Var iat ionsmögl ichkei ten der Mul t imethode zur

Verbesserung der Ext rahierbarkei t spez ie l ler Pest iz ide

Wie bereits ausgeführt, können für viele Pestizide durch eine einfache Vermengung der Proben mit Hydromatrix sehr gute Wiederfindungen erzielt werden [Anastassiades 1998]. Es gibt jedoch auch weitere Analyte, bei denen die Extraktion aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften (hohe Polarität, Affinität zu Oberflächen, Labilität) größere Schwierigkeiten bereitet. In diesen Fällen ist es notwendig die Bedingungen bei der Probenaufarbeitung und der Extraktion zu variieren.

3.2.1.2.1 Pestizide mit hoher Polarität

Überkritisches Kohlendioxid ist ein recht unpolares Lösungsmittel und daher prinzipiell gut zur Extraktion von Analyten mit geringer Polarität geeignet. Durch die Aufnahme von Wasser (Sättigungskonzentration: 3 mg/g) [Kuk et al. 1983] wird seine Polarität deutlich erhöht, so dass die Extraktion von Verbindungen, die eine höhere Polarität aufweisen ebenfalls ermöglicht wird (Wasser fungiert hier als Modifier). Da durch die Vermengung mit einem Adsorbens die Wasserphase über eine sehr große Oberfläche verteilt ist, ist bei Obst- und Gemüseproben mit einer raschen Absättigung des Kohlendioxids mit Wasser zu rechnen. Die Extraktion von Analyten mit sehr hoher Polarität bereitet jedoch, wie auch bei her-kömmlichen Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, größere Schwierigkeiten, da der Übergang solcher Verbindungen von der wässrigen Phase, in der sie sehr gut löslich sind, in das lipophile überkritische CO2 ungünstig ist. Mit zunehmender Polarität der Analyten wird in der Regel ihre Extrahierbarkeit schlech-ter. So ist z.B. Dimethoat deutlich besser extrahierbar als Omethoat, Methomyl besser als Oxamyl und Aldicarb besser als Aldicarb Sulfon. Dies geht aus Abbildung 3.2.1-2 hervor. Hier sind die erzielten Wiederfindungen von verschiedenen Pestiziden dargestellt. Als Maß für die Polarität werden zusätzlich die Wasserlöslichkeiten (S) sowie die Verteilungskoeffizienten zwischen n-Octanol und Wasser (Kow) aufgeführt. Um die Darstellung zu erleichtern wurden diese Werte logarithmiert. Es wird deutlich, dass zwischen den erzielten Wiederfindungen und den Octa-nol/Wasser-Verteilungskoeffizienten eine sehr gute Korrelation besteht. Daher scheint diese Größe zur Abschätzung der Extrahierbarkeit mit ÜK-CO2 gut geeignet zu sein. Die Wasserlöslichkeiten korrelieren dagegen deutlich schlechter mit den hier erzielten Wie-derfindungen.



Abb. 3.2.1-2: Korrelation zwischen Wasserlöslichkeit, Verteilungskoeffizient und

Extraktionsausbeute, Matrix: Traubensaft, Dotierungslevel 5 µg/Ansatz, (Analysenmethode siehe Anlage 1)

M e t ha m ido ph o s( 7 %)

A ld ic a rb S u lf o n( 6 1 %)

A ld ic a rb ( 9 5 %) M e t h o m yl

( 9 0 %) D im e t h o a t ( 8 6 %)

O xa m yl ( 3 4 %)

A c e p ha t ( 6 %)

O m e t ho a t ( 2 1 %)

0

20

40

60

80

100

Wiederfindung in %

%

A ld ic a rbM e t h o m yl

D im e t ho a t

O xa m yl

A c e p ha t

A ld ic a rb S u lf o n

M e t ha m ido p ho sO m e t ho a t

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

log Kow

A c e ph a t ( S = 7 9 0 g / L )

M e t h a m id o p ho s ( S = 2 0 0 0 / L )

O m e t h o a t ( S = 4 0 0 g / L )O xa m yl

( S = 2 8 2 g / L )

D im e t ho a t ( S = 2 3 ,8 g / L )

M e t ho m yl ( S = 5 5 g / L )

A ld ic a rb ( S = 4 ,9 g / L )

A ld ic a rb S u lf o n( S = 1 0 g / L )

0

1

2

3

4

log S

3.2.1.2.1.1 Zugabe von Salzen Es ist bekannt, dass durch den Zusatz von Salzen die Extrahierbarkeit von polaren Ver-bindungen aus einer wässrigen Phase in ein organisches Lösungsmittel erheblich ver-bessert werden kann (Aussalzeffekt). Die Übertragbarkeit dieses Prinzips auf die SFE konnte anhand zahlreicher Versuche demonstriert werden. Wie aus Abbildung 3.2.1-3 ersichtlich, konnte dadurch eine deutliche Verbesserung der Extrahierbarkeit vieler dieser Verbindungen erzielt werden. Lediglich bei Acephat und Methamidophos, die eine sehr hohe Polarität aufweisen, konnten auf die Weise keine ausreichend guten Wieder-findungen erzielt werden.



Abb. 3.2.1-3: Verbesserung der Extraktionsausbeuten von polaren Verbindungen

durch Zugabe unterschiedlicher Mengen an Ammoniumchlorid, Dotierungslevel 1 µg/Ansatz, Matrix Traubensaft

Met

ham

idop

hos

Ace

phat

Om

etho

at

Oxa

myl

Ald

icar

bsul

fon

Dim

etho

at

Met

hom

yl

Ald

icar

b

1 g N H 4C l0,5 g N H 4C l

o hne Z usatz0

20

40

60

80

100

Wf. [%]Jeweils:

2 g Probe +1,5 g Hydromatrix

+angegebene Salzmenge

Um auch für Methamidophos und Acephat hohe Wiederfindungen erzielen zu können, ist der Zusatz von „Trocknungsalzen“ erforderlich (vgl. [Valverde-Garcia et al. 1995, Eller et al. 1997]. Solche Salze z.B. Natriumsulfat, Magnesiumsulfat sind in der Lage der Probe größere Mengen Wasser zu entziehen. Die Menge des verfügbaren Wassers wird dadurch reduziert, so dass der Übergang polarer Verbindungen in die überkritische Phase noch günstiger wird. Dies wird in den Abbildungen 3.2.1-4 und 3.2.1-5 demonstriert.



Abb. 3.2.1-4: Auswirkung des Zusatzes von verschiedenen Salzen auf die Extrahierbarkeit von Methamidophos, Acephat und Oxamyl, Dotierungslevel 1 µg/Ansatz, Matrix Gurke

OxamylAcephat

Methamidophos0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100Wf. [%]

MgSO4

2 gNa2 SO4

2 gNaCl2 g

ohneSalz

Jeweils:2 g Gurke

+ 1,5 g Hydromatrix + angegebene Salzmenge

Abb. 3.2.1-5: Auswirkung des Zusatzes verschiedener Salze auf die Extrahierbarkeit von Methamidophos, Dotierungslevel 1 µg/Ansatz, Matrix Gurke

00,2 g0,5 g1 g2 g

MagnesiumsulfatNatriumsulfat

Kalimchlorid0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Wf. [%]

Jeweils :2 g Gurke

+ 1,5 g Hydromatrix + angegebene Salzmenge

Es wird ersichtlich, dass durch Zusatz von MgSO4 (hier als Monohydrat) für beide Ver-bindungen (Methamidophos und Acephat) sehr hohe Wiederfindungen erzielt werden können. Die Wiederfindungen bei Verwendung von Na2SO4 (wasserfrei) waren dagegen deutlich niedriger. Bei Zusatz von Natriumsulfat zu feuchten Proben kommt es rasch zu einer Verfestigung des Ansatzes oder zur Ausbildung von Krusten. Dies wirkt sich nachteilig, sowohl auf die Handhabung der Proben als auch auf die Extraktion aus. Natriumsulfat ist daher für diesen Zweck schlechter geeignet als Magnesiumsulfat. In diesem Zusam-menhang ist zu auch erwähnen, dass hydratisiertes Natriumsulfat (Dekahydrat) schon



bei 32,4 °C zu schmelzen beginnt [Weast 1972]. Da die Extraktionstemperatur bei 55 °C liegt, dürfte dies ein weiterer Grund für die schlechteren Wiederfindungen sein. Wie der Abbildung 3.2.1-4 ebenfalls zu entnehmen ist, zeigt Methamidophos insgesamt geringere Wiederfindungsraten als Acephat und Oxamyl. Dies ist in erster Linie auf seine höhere Polarität (siehe Wasserlöslichkeit in Abb. 3.2.1-2) zurückzuführen. Ein Rolle könnte in diesem Zusammenhang auch die Tatsache spielen, dass Methamido-phos eine basische Amino-Funktion aufweist, die potentiell mit der Hydromatrix oder der Probenmatrix wechselwirken kann. Praktische Schwierigkeiten bei der Verwendung von Salzen: Die Verwendung von Salzen als Trocknungsmittel ist nicht unproblematisch. So werden im Verlauf der Extraktion stets gewisse Mengen kleiner Salzpartikel mitgerissen, die zu Verstopfungen des Systems und im schlimmsten Fall zu einer Beschädigung des Restriktors führen können. Die Verwendung von CaCl2 bereitete Probleme, sowohl bei der Aufarbeitung (starke Erwärmung und flüssige Konsistenz nach Aufnahme von Wasser) als auch bei der Ex-traktion (Verstopfungen) und wurde daher nicht weiter verfolgt. Während der Vermengung der wasserhaltigen Obst- und Gemüseproben mit Magne-siumsulfat kommt es darüber hinaus zu einer starken Wärmeentwicklung, die zu einer Zersetzung empfindlicher Verbindungen führen kann. Um dies zu verhindern sind hier die Proben in gefrorenem Zustand einzusetzen. Bei Messungen mit LC/MS wurde zudem festgestellt, dass Salze, die in die Vorlage (GC-Gläschen) gelangen, eine Verzerrung der erzeugten Massenspektren von polaren Verbindungen wie Methamidophos, Acephat, Aldicarb Sulfon und Oxamyl bewirken kön-nen. In einigen Fällen war eine vermehrte Bildung von Natrium-(M+23) bzw. Kalium- (M+39) Addukten erkennbar, während die Intensität der erwünschten protonierten Mole-küle zurückging.

3.2.1.2.2 Saure und basische Pestizide

Pestizide, die eine ausgeprägte Basizität oder Acidität aufweisen bereiten sowohl bei der herkömmlichen Analytik als auch bei der SFE stets Schwierigkeiten. Sie erfordern daher meist eine gesonderte Aufarbeitung. Einige Vertreter basischer und saurer Pestizide werden in Tabelle 3.2.1-2 dargestellt.



Tab. 3.2.1-2: Einige Beispiele basischer und saurer Pestizide

Verbindung

N

N

H

N

S

N

N

H

NHC

O

O CH3

NN CH2 CH

OCH2 CH CH2

ClCl

Cl

Cl

OCH2COOH

O CH3

COOH

Cl

Cl

Strukturformel Wirkungsweise pKb-Wert pKs-Wert

Thiabendazol

Fungizid

9,3 und 11,5

4,7 und 2,5

(Korresp. Säure)

Carbendazim

Fungizid

9,52

4,48

(Korresp. Säure)

Imazalil Fungizid

6,53

7,47

(Korresp. Säure)

2,4-D

Herbizid

2,73

Dicamba

Herbizid

1,91

PKs-Werte aus [Roberts et al 1999]

Bedingt durch die Lage des Säure-Base-Gleichgewichtes liegen saure Pestizide bei ho-hen pH-Werten (pH > pKs) und basische Pestizide bei niedrigeren pH-Werten (pH< 14-pKb) größtenteils in ionischer Form vor. Die jeweiligen korrespondierenden Säuren und Basen entziehen sich auf Grund ihrer hohen Polarität weitgehend der Extraktion. Daraus wird ersichtlich, dass der vorherr-schende pH-Wert einen großen Einfluss auf die Extrahierbarkeit basischer und saurer Pestizide hat. Homogenate pflanzlicher Proben weisen oft recht niedrige pH-Werte auf: z.B. Zitronen pH∼2,5, Grapefruit und Orangen pH 3-3,5, Trauben, Steinobst und Kernobst pH 3 bis 4. Um sicherzustellen, dass die Verbindungen bei der Extraktion überwiegend in der leicht extrahierbaren nicht ionischer Form vorliegen, muss bei sauren Pestiziden der pH-Wert deutlich unterhalb des pKs-Wertes und bei basischen Pestiziden deutlich oberhalb des 14 - pKb-Wertes eingestellt werden. Je deutlicher man diese Werte über- bzw. unter-schreitet desto günstiger ist die Gleichgewichtslage und umso schneller erfolgt die Ex-traktion. In Abbildung 3.2.1-6 wird die Auswirkung des pH-Wertes auf die Extraktionsausbeuten am Beispiel 2,4-D (pKs 2,73) und Carbendazim (pKb 9,52) verdeutlicht.



Abb. 3.2.1-6: Einfluss des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit von 2,4-D und Carbendazim

0

20

40

60

80

100

Carbendaz im 2,4-D

Rec

over

ies

(%) pH 2.5

pH 4pH 7pH 9.5

Die Neigung basischer Pestizide, mit Oberflächen in Wechselwirkung zu treten, wird im kommenden Kapitel diskutiert.

3.2.1.2.3 Pestizide, die zu Adsorptionen neigen

Adsorptionen von Pestiziden an Oberflächen (z.B. über elektrostatische Wechselwir-kungen oder über Wasserstoffbrücken-Bindungen) sind oft die Ursache für schlechte Extrahierbarkeit, für Verluste bei der Aufarbeitung und für Schwierigkeiten bei der Chromatographie. Daher sind Kenntnisse über die möglichen Ursachen und Mechanis-men dieser Erscheinungen bei der Entwicklung von analytischen Methoden unentbehr-lich. Dabei müssen sowohl die Analyten selbst als auch die jeweils beteiligten Phasen (Oberflächen, Lösungsmittel) betrachtet werden. 3.2.1.2.3.1 Beteiligte Oberflächen Im Verlauf der Pestizidrückstandsanalytik kommen die Pestizide zwangsläufig mit ver-schiedenen Oberflächen in Kontakt. Dabei kommt es aus unterschiedlichen Ursachen zu Wechselwirkungen und Adsorptionen, die z.T. gewollt meist aber ungewollt sind. Im folgenden werden beispielhaft einige Oberflächen aufgeführt, die in verschiedenen Stufen der Analytik potentiell in Kontakt mit Pestiziden kommen und dabei unerwünschte Adsorptionen verursachen:

1. bei der Probenaufarbeitung und der Extraktion Bestandteile der Probe (Wachse, Cutin, Öle, Polysaccharide, Proteine) Glasoberflächen (Glasgeräte, Glasfaserpapier) Adsorbentien (Hydromatrix, Kieselgel) Matrix-Ablagerungen innerhalb der Leitungen des SFE-Systems

2. bei der Gaschromatographie Glasoberflächen (GC-Injektions-Liner) Matrix-Ablagerungen auf der Oberfläche von GC-Injektions-Liner und Vorsäule

3. bei der RP-Flüssigkeitschromatographie Trennungsmaterialien (freie Silanolgruppen) Matrix-Ablagerungen in der Säule und Vorsäule.



Die Adsorptionskraft bestimmter Oberflächen kann erheblich variieren. Bei Polysilikaten wie Diatomeen-Erden, Kieselgel spielt z.B. der Wassergehalt (Aktivitätsstufe) eine er-hebliche Rolle, da Wasser die Oberfläche benetzen und maskieren kann (Wasser als Modifier vgl. Kap 2.4.4). Bei Adsorbentien auf Polysilikatbasis kann durch Silanisierung freier Silanolgruppen eine entscheidende Abschwächung der Aktivität erreicht werden. Hierfür gibt es ver-schiedene Beispiele: silanisierte Glasgeräte, GC-Glasliner, RP-Phasen bei der HPLC. Die Restmenge an freien Silanolgruppen bestimmt den Aktivitätsgrad der Oberfläche. 3.2.1.2.3.2 Beteiligte Lösungsmittel Eine wichtige Rolle bei Adsorptionsprozessen spielen auch die beteiligten mobilen Pha-sen (flüssig, überkritisch). Lösungsmittel treten sowohl mit den Analyten als auch mit aktiven Stellen der Oberfläche der festen Phase in Wechselwirkung und können damit die Affinität der Analyten zu der Oberfläche schwächen. Zum Beispiel wird die Adsorption von Verbindungen an ein hydrophilen Adsorbens (wie Kieselgel) erheblich abgeschwächt, wenn die aktiven Stellen an seiner Oberfläche durch Lösungsmittelmoleküle wie Wasser oder Methanol „besetzt“ (deaktiviert) werden (vgl. Kap. 2.4.4). Unpolare Lösungsmittel (z.B. ÜK-CO2 und Hexan) konkurrieren dagegen kaum um solche aktive Stellen und können derartige Adsorptionsprozesse nur wenig beeinflussen. Im allgemeinen sind Wechselwirkungen elektrostatischer Art zwischen dem Analyt und der Oberfläche des Adsorbens um so schwächer ausgeprägt, je höher die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels ist. Andererseits ist die Adsorption unpolarer Analyten an lipophilen Oberflächen (z.B. Wachsoberflächen) dann begünstigt, wenn die beteiligte flüssige Phase polar (z.B. was-serhaltig) ist (siehe hierzu auch Kap. 3.2.1.2.3.3). 3.2.1.2.3.3 Analyte Zahlreiche Pestizide besitzen in ihrem Molekül geeignete funktionelle Gruppen, um mit ihrer Umgebung in Wechselwirkung zu treten. Diese Interaktionen unterscheiden sich sowohl in ihren Ursachen als auch in ihrer Intensität beträchtlich. Um das Verhalten solcher Pestizide besser zu verstehen und ggf. Vorhersagen treffen zu können, soll ein Blick auf die molekularen Hindergründe geworfen werden. Im folgenden werden einige Merkmale aufgelistet, die für solche Adsorptionserscheinungen verantwortlich sein kön-nen. 1. Basizität oder Acidität:

z.B. bei Pestiziden die basische Stickstofffunktionen aufweisen und bei Pestiziden mit Alkohol- oder Säuregruppen. Die Wechselwirkung solcher Verbindungen mit Oberflächen erfolgen meist über Wasserstoffbrücken-Bindungen.

2. Elektrische Ladungen:

z.B. bei Verbindungen mit ionischem Charakter. Diese können mit anderen Verbindungen oder Oberflächen, die entgegengesetzte Ladungen aufweisen, in elektrostatische Wechselwirkung treten (z.B. dissoziierte Säuren, protonierte Basen, Organozinn-Pestizide, Paraquat, siehe unter Kap. 3.2.2.5).

3. Lipophilie:

Verbindungen mit einer ausgeprägten Lipophilie wie Organochlorpestizide und Pyrethroide neigen zur Adsorption an hydrophobe Oberflächen wie Wachse, Öle,



Cutin. Prinzipiell haben die meisten Pestizide diese Neigung, da sie meist lipophile Bereiche aufweisen. Im allgemeinen sind diese Adsorptionen umso günstiger je polarer die beteiligte flüssige Phase ist. Im Gegensatz zu den ersten zwei Fällen spielen hier intermolekulare Kräfte (z.B. van-der-Waals-Kräfte) eine untergeordnete Rolle. Ursächlich für diesen Effekt ist primär die Neigung solcher Verbindungen sich der polaren Phase zu entziehen (geringe Löslichkeit), was energetisch bevorzugt ist (Entropiegewinn) (vgl. hierzu Kap. 3.2.1.2.3.3).

Im folgenden wird auf Adsorptionserscheinungen basischer Pestizide näher eingegan-gen, da diese im Bereich der Pestizidrückstandsanalytik eine sehr wichtige Rolle spie-len. 3.2.1.2.3.3.1 Adsorptionserscheinungen basischer Pestizide Mehr als andere Pestizide bereiten solche mit basischen Eigenschaften analytische Schwierigkeiten. Begründen lässt sich dies durch ihre ausgeprägte Neigung mit ver-schiedenen Oberflächen in Wechselwirkung zu treten. Solche ungewollten Interaktionen können bei verschiedenen Stufen der Analytik auftreten. Besonders bemerkbar machen sich diese Erscheinungen bei der Gas- und Flüssigkeitschromatographie durch das Auftreten von Peaks, die ein deutliches Tailing aufweisen. Bei der Flüssigkeits-chromatographie an RP-Phasen erfolgen die Wechselwirkungen mit den freien Silanolgruppen der stationären Phase. Daher ist es sinnvoll Säulenmaterialien zu verwenden, die einen hohen Absättigungsgrad und/oder eine gut Abschirmung der Silanolgruppen aufweisen. Neuere Trennphasen (Zorbax®, Luna®) besitzen solche Eigenschaften und ermöglichen daher eine relativ gute Chromatographie solcher Pesti-zide (vgl. Abb. 3.2.2-6). Die Trennleistung lässt jedoch bei längerem Gebrauch stark nach, was sowohl auf die Entstehung freier Silanolgruppen als auch auf die Ablagerung von Verunreinigungen innerhalb der Säule zurückzuführen ist. Auch während der SFE bereiten basische Pestizide analytische Schwierigkeiten. In Ka-pitel 3.2.1.2.2 wurde bereits die Rolle des pH-Wertes zur Verschiebung des Säure-Base-Gleichgewichtes und zur Verbesserung der Extrahierbarkeit besprochen. Schwie-rigkeiten bereitet aber auch die Neigung basischer Verbindungen mit den Materialien, die zur Wasseradsorption eingesetzten werden (z.B. Hydromatrix oder Kieselgur), in Wechselwirkung zu treten. Dadurch wird die Extraktion erschwert. Aber nicht nur in der Extraktionshülse werden basische Verbindungen retardiert, son-dern auch innerhalb der Leitungen, die sich zwischen der Extraktionshülse und dem Restriktor befinden. Verantwortlich hierfür sind Ablagerungen, die sich auf der Ober-fläche dieser Leitungen nach und nach ausbilden. Dieser Effekt macht sich insbeson-dere bei Thiabendazol u.a. durch verringerte Ausbeuten bei Wiederfindungsversuchen bemerkbar. Problematischer in diesem Zusammenhang ist die Tatsache, dass bei dar-auffolgenden Extraktionen von thiabendazolfreien Proben stets noch signifikante Men-gen an Thiabendazol gefunden werden (Verschleppungen). In Kapitel 3.2.2.1.1 wird die-ser Sachverhalt näher beschrieben. Unerwünschte Retentionen basischer Pestizide treten auch an der Festphasenfalle auf. Bei Verwendung von ODS als Fallenmaterial wurde festgestellt, dass sich die Verbin-dungen Thiabendazol, Imazalil, Fenpropimorph sowie Prochloraz nur sehr schleppend von der Falle in das Vorlagegläschen eluieren ließen. Auch dieser Sachverhalt wird in Kapitel 3.2.2.1.1 näher erläutert. Wesentlich unproblematischer verlief die Extraktion die-



ser Verbindungen mit dem Extraktor der Firma ISCO bei dem der Restriktor direkt in die Lösungsmittelvorlage eingetaucht wird. In Tab. 3.2.1-3 werden einige basische Pestizide aufgelistet, die zu Adsorptionen nei-gen. Tab. 3.2.1-3: Einige Fungizide die zu Adsorptionen neigen

Wirkstoff N

N

H

N

S

N

N

H

NHC

O

O CH3

NN CH2 CH

OCH2 CH CH2

ClCl

NN C

O

N CH2CH2O

Cl

Cl

ClCH3CH2CH2

N

O

CH3

CH3

Ein Maß für die Basizität dieser Verbindungen (d.h. für ihre Neigung, mit Elektrophilen in Wechselwirkungen zu treten) ist sicherlich der pKb-Wert. Dieser Wert geht jedoch aus dem Säure-Base-Gleichgewicht in wässrigen Lösungen hervor, bei dem Protonen als elektrophile Reaktionspartner fungieren. Die beschriebenen Adsorptionserscheinungen beruhen jedoch auf Wechselwirkungen mit größeren Molekülen. Da nur frei zugängliche Stickstoffatome in Wechselwirkung mit sperrigen Molekülen treten können, spielen hier die sterischen Verhältnisse eine entscheidende Rolle. Zudem ist bei der Pestizidrück-standsanalytik nach der Extraktion Wasser i.d.R. abwesend. Aus diesen Gründen kann der pKb-Wert nicht isoliert als Maß für die beschriebenen Effekte herangezogen werden.

Gruppenzugehörigkeit pKb-Wert Thiabendazol:

Benzimidazolderivat

9,3 und 11,5

Carbendazim:

Benzimidazolderivat

9,52

Imazalil:

Imidazolderivat

6,53

Prochloraz: Imidazolderivat

10,2

Fenpropimorph:

Morpholinderivat

9,4

Betrachtet man in Tabelle 3.2.1-3 die basischen Pestizide, die im Verlauf dieser Arbeit analytische Schwierigkeiten bereitet haben, fällt auf, dass bei allen diesen Verbindun-gen, die für die ausgeprägte Basizität verantwortlichen Stickstoffatome an aromatischen Systemen beteiligt und frei zugänglich sind. Eine Ausnahme ist Fenpropimorph dessen basischer Stickstoff an einer nicht aromatischen aber dennoch relativ starren Morpholin-Struktur beteiligt und daher ebenfalls leicht zugänglich ist. 3.2.1.2.3.3.2 Adsorptionserscheinungen stark lipophiler Pestizide Aufgrund des unpolaren Charakters von überkritischem Kohlendioxid wäre eine prob-lemlose Extraktion von Pestiziden, die eine sehr geringe Polarität aufweisen, wie Orga-nochlorverbindungen und Pyrethroide, zu erwarten. In der Praxis aber ist die Extraktion solcher Verbindungen nicht unproblematisch. Wie in Abbildung 3.2.1-7 dargestellt zeigt sich für solche Verbindungen bei zunehmendem Proben / Hydromatrix-Verhältnis eine starke Abnahme der Wiederfindungen. Gerade bei Pyrethroiden, die eine sehr geringe Wasserlöslichkeit aufweisen (Löslichkeit in Wasser S = 1 - 500 µg/L [Wauchope et al. 1992, Roberts et al. 1999]), ist dieser Effekt besonders stark ausgeprägt. Bei Verbin-



dungen mit höherer Polarität, z.B. Lindan (S = 7 mg/L) wurde dagegen dieser Effekt nicht beobachtet. Abb. 3.2.1-7: Einfluss des Wassergehaltes auf die Extrahierbarkeit unpolarer Pestizide

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Bip

hent

hrin

Del

tam

ethr

in

Cyh

alot

hrin

Per

met

hrin

Cyf

luth

rin

Cyp

erm

ethr

in

Fenp

ropa

thrin

Fenv

aler

at DD

E

Hep

tach

lor

Die

ldrin

Lind

an

0

20

40

60

80

100

Recoveries %

Sample/HymxRatio

Man könnte die Ursache für diesen Effekt darin vermuten, dass mit steigendem Was-sergehalt in der Probe die Menge des Wassers, die sich in dem überkritischen Kohlen-dioxid löst, ebenfalls zunimmt, was zu einer Steigerung der Polarität des Extraktions-mittels führen würde („modifier“-Wirkung von Wasser). Die Löslichkeit von Wasser in überkritischem Kohlendioxid ist jedoch sehr gering (Sätti-gungskonzentration etwa 3 mg/g [Kuk et al. 1983]). Zudem weist das auf der Oberfläche des Adsorbens verteilte Wasser eine sehr große Oberfläche auf, so dass eine rasche Gleichgewichtseinstellung (Sättigung) zu erwarten ist. Die Absättigung des überkriti-schen Kohlendioxids mit Wasser dürfte demnach kurz nach dem ersten Kontakt mit der wasserhaltigen Probe erfolgen und praktisch unabhängig von der absoluten Wasser-menge in der Extraktionshülse sein. Ein unterschiedlicher Absättigungsgrad und Pola-ritätsgrad des Fluids kommt demnach als Ursache für den oben genannten Befund eher nicht in Frage. Die ziemlich unpolaren und daher kaum in Wasser löslichen Substanzen neigen dazu, sich an unpolare Oberflächen wie Wachs-, Cutin- und Ölschichten zu adsorbieren. Es ist daher zu erwarten, dass beim Verreiben der Probe mit Hydromatrix solche lipophilen Bestandteile teilweise an der unregelmäßigen Oberfläche der Hydromatrix haften blei-ben und dort mehr oder weniger von einem Wasserfilm überzogen und abgeschirmt werden. Die darin/darüber liegenden Wirkstoffe wären in diesem Fall für das lipophile Extraktionsfluid nur schwer zugänglich, da sich dieses nicht mit dem Wasser vermischen kann. Die Wasserschicht stellt somit eine Barriere dar, da eine Diffusion dieser Verbindungen durch diese Schicht bis hin zur Grenzschicht mit dem überkritischen Kohlendioxid ungünstig ist. Im Gegensatz dazu lösen sich Verbindungen, die eine grö-ßere Polarität aufweisen besser in Wasser und neigen eher dazu durch die Wasser-schicht zu diffundieren. Die Extraktion verläuft daher in diesen Fällen wesentlich ein-facher und schneller.



Dieses Extraktionsmodell würde auch erklären, weshalb SFE-Extrakte im Vergleich zu den Extrakten herkömmlicher Verfahren eine höhere Reinheit aufweisen, da bei der SFE von wasserhaltigen Proben die Extraktion lipophiler Stoffe durch ihr Diffusionsvermögen innerhalb der wässrigen Schicht limitiert wird. Für diesen Effekt spricht auch die Tatsache, dass bei Zusatz von Salz in die dotierten Proben die Wiederfindungen lipophiler Pestizide noch weiter verschlechtert werden. Dies wird in Abbildung 3.2.1-8 am Beispiel der Pyrethroide Permethrin und Deltamethrin demonstriert. Abb. 3.2.1-8: Verschlechterung der Extraktionsausbeuten von Pyrethroiden bei zunehmenden Salzgehalt (Ammoniumchlorid), Matrix Traubensaft, Dotierungslevel 1 µg/Ansatz

0 0 0,2 g 0,5 g 1 g

Deltamethrin

Permethrin

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Wf. [%]2 g Probe

+ 1,5 g Hydromatrix+ angegebene Menge

Ammoniumchlorid2 g

Probe & 2 g

Hymx

Hymx = Hydromatrix

Erklären lässt sich dieser Effekt durch die auf Grund des Salzzusatzes noch verstärkte Neigung der lipophilen Pestizide sich der Wasserphase zu entziehen. Ihre Diffusion durch die Wasserschicht wird auf diese Weise noch weiter erschwert. Eine Verbesserung der Extraktionsausbeuten lipophiler Pestizide wurde nicht nur bei dotierten sondern auch bei Proben mit gewachsenen Rückständen festgestellt (Daten hier nicht gezeigt). Darüber hinaus trat dieser Effekt in abgeschwächter Form auch bei dotiertem Wasser auf. Da hier keine lipophilen Teilchen beteiligt sind, ist anzunehmen, dass die Pyrethroide auf Grund ihrer geringen Löslichkeit in Wasser (<0,01 µg/ml) auf der Adsorbens-Oberfläche präzipitieren und dort durch Wasser abgeschirmt werden. In Kapitel 3.2.2.4.1 werden einige Harnstoff-Pestizide vorgestellt, die sich ähnlich wie die Pyrethroide verhalten.

3.2.1.2.4 Zersetzungsanfäll ige Pestizide

Kenntnisse über das Abbauverhalten von Pestiziden im Verlauf der Analytik sind für den Rückstandsanalytiker von großer Bedeutung. Die Zersetzungsproblematik im Bereich der Gaschromatographie wurde bereits behandelt [Anastassiades 1998]. In Kapitel 3.1.2



wurden ferner Maßnahmen zur Minimierung der Pestizidverluste während der Proben-vorbereitung vorgestellt. Zersetzungen können aber auch in anderen analytischen Teilschritten auftreten, wie z.B. bei der Probenaufarbeitung, bei der niedrige Temperaturen nicht immer eingehalten werden können, oder während der Extraktion, bei der erhöhte Temperaturen erforderlich sind. Bei herkömmlichen nasschemischen Analysenmethoden werden die Proben meist un-mittelbar nach ihrer Wägung mit Lösungsmittel versetzt und extrahiert. Die Analyten werden dadurch geschont. Im Gegensatz dazu verläuft die Probenaufarbeitung bei SFE-Applikationen nicht so schonend. Hier werden die Proben zunächst mit einem Ad-sorbens vermengt, in Extraktionshülsen gefüllt und anschließend in den Probengeber des Extraktionsgerätes gestellt, wo sie bei Raumtemperatur bis zu ihrer Extraktion verweilen. Während dieser Zeitspanne, die mehrere Stunden dauern kann, ist mit einem erheblichen Abbau empfindlicher Pestizide zu rechnen. Um einen ersten Einblick über das Ausmaß dieser Zersetzungen zu bekommen, wurde zunächst folgender Vorversuch durchgeführt. Pestizidfreie Salat- und Traubenproben wurden mit einer Mischung von Pestiziden, die bei Wiederfindungsversuchen wegen ihrer Zersetzungsanfälligkeit aufgefallen waren, dotiert. Die dotierten Proben wurden, wie in Anlage 1 beschrieben, mit Hydromatrix vermengt und in Extraktionshülsen gefüllt. Diese Hülsen wurden bei Raumtemperatur gelagert und in bestimmten zeitlichen Ab-ständen nacheinander extrahiert. Die Pestizidkonzentrationen in den gewonnenen Ex-trakten wurden gaschromatographisch bestimmt und somit der Abbau der Verbindungen zeitlich verfolgt. Für die Kalibrierung wurden undotierte Proben extrahiert und deren Extrakte mit derselben Pestizidmischung versetzt. Die Ergebnisse dieses Versuches werden in Abbildung 3.2.1-9 dargestellt.



Abb. 3.2.1-9: Abbau von Pestiziden während der Lagerung in den Extraktionshülsen bei Raumtemperatur, Matrices Salat und Traube, Dotierungslevel 2 µg/Ansatz

1: Diazinon 2: Dioxacarb

3: Disulfoton 4: Ethiofencarb

7: Dichlofluanid8: Folpet

5: Tolylfluanid6: Chlozolinate

04

820

1 2 3 4 5 6 7 8

0

20

40

60

80

100

04

820

5 1 7 6 8 3 4 2

0

20

40

60

80

100

Lage rze it [h]

T rauben pH~3,5Salat pH~6

Lage rze it [h]

Wf. [%]Wf. [%]

Bei diesen Orientierungsversuchen zeigte sich, dass die Art der Matrix einen großen Einfluss auf das Abbauverhalten der Pestizide hat. Während die Verbindungen Folpet, Dichlofluanid und Tolylfluanid in der Salatmatrix (pH~6) einen wesentlich schnelleren Abbau zeigten als in der Traubenmatrix (pH~3,5), zeigte das Carbamat Dioxacarb ein umgekehrtes Verhalten. Offen blieb jedoch die Frage, ob diese Zersetzungen in erster Linie auf den vorherrschenden pH-Wert zurückzuführen waren, oder ob auch enzyma-tisch katalysierte Reaktionen eine Rolle gespielt haben. Auf diesem Versuch aufbauend wurden nach dem gleichen Schema zahlreiche weitere Abbauversuche mit verschiedenen Matrices sowie mit reinem Wasser durchgeführt. Dabei wurden neben den oben genannten auch andere zersetzungsanfällige Pestizide eingesetzt. Ziel dieser Versuche war es, zum einen die Unterschiede beim Abbauver-halten der Pestizide in den verschiedenen Matrices festzustellen und zum anderen Möglichkeiten zu finden, wie die Pestizide effektiv vor einem Abbau geschützt werden können. Im folgenden werden die Ergebnisse dieser Untersuchungen vorgestellt. Zum Zweck der Übersichtlichkeit wurden die Pestizide entsprechend ihrem Abbauverhalten in folgende Gruppen eingeteilt: 1) oxidationsanfällige Pestizide, 2) basenempfindliche Pestizide, 3) säureempfindliche Pestizide. 3.2.1.2.4.1 Oxidationsanfällige Pestizide Zu den am stärksten durch Oxidationen gefährdeten Pestiziden zählen solche, die in ihrem Molekül eine Thioether-Gruppe aufweisen. In pflanzlichen Proben erfolgen die Oxidationen meist enzymatisch, wobei die entsprechenden Sulfoxide und Sulfone ent-stehen. Im allgemeinen verlaufen die Oxidationen zu den Sulfoxiden wesentlich schnel-ler ab als die weiteren Umsetzungen zu den Sulfonen [Miles 1991]. Für die Abbauversuche wurden die Carbamat-Pestizide Ethiofencarb, Methiocarb und Aldicarb herangezogen. Hierbei wurde nicht nur die Abnahme der Muttersubstanzen verfolgt, sondern teilweise auch die Entstehung ihrer Abbauprodukte. Bei Methomyl und



Oxamyl, die ebenfalls eine Thioether-Gruppe aufweisen (siehe Tab. 3.2.1-4) war bei Vorversuchen kein merklicher Abbau festzustellen, so dass hier keine weiteren Unter-suchungen angestellt wurden. In Tabelle 3.2.1-4 werden die hier untersuchten oxidati-onsempfindlichen Verbindungen vorgestellt. Tab. 3.2.1-4: Oxidationsanfällige Pestizide

Pestizid Typ Hauptabbauprodukte Bemerkungen

Ethiofencarb

Carbamat

Ethiofencarb Sulfoxid

Ethiofencarb Sulfon

Methiocarb

Carbamat

Methiocarb Sulfoxid

Methiocarb Sulfon

Aldicarb

Carbamat

Aldicarb Sulfoxid

Aldicarb Sulfon

(Aldoxycarb)

In Pflanzen verlaufen

Oxidationen in erster Linie enzymatisch unter

Beteiligung von Monooxygenasen

[Hassall 1982]

Oxidationen zum Sulfoxid erfolgen rasch, Oxidationen

der Sulfoxide zu den Sulfonen dagegen deutlich

langsamer [Miles 1991]

Bei Ethiofencarb auch Abbau in den Extrakten beobachtet, der wahrscheinlich auf einen Photoabbau zurückzuführen ist (vgl. [Kopf 1992, Kopf et

al. 1995])

Bei Aldicarb erfolgt eine rasche Hydrolyse der

Oxidationsprodukte [Miles 1991, Roberts et al. 1999]

O C

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3

O

O C

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3 O C

O

NHCH3

CH2 S

O

O

CH2CH3

O C

O

NHCH3

SOO C

O

NHCH3

SO C

O

NHCH3

SO

O

CC

HNS

NHCH3

O

COH3C

O

CC

HNS

NHCH3

O

CO

H3C

CC

HNS

NHCH3

O

CO

H3C O

O

In Abbildung 3.2.1-10 wird das Abbauverhalten von Ethiofencarb in verschiedenen Mat-rices dargestellt. Es wird ersichtlich, dass die Zersetzungsgeschwindigkeiten sich von Matrix zu Matrix stark unterscheiden. Besonders interessant ist das unterschiedliche Abbauverhalten von Ethiofencarb bei den Matrices, die als Traube „alt“ und Traube „frisch“ bezeichnet sind. Die Traube „frisch“ wurde unmittelbar nach der Zerkleinerung zur Dotierung verwendet, die Traube „alt“ war bereits mehrfach aufgetaut und wieder eingefroren worden. Da die Matrix für längere Zeit dem Luftsauerstoff ausgesetzt war, ist



davon auszugehen, dass zum Zeitpunkt der Dotierung natürliche Antioxidantien bereits verbraucht waren. Abb. 3.2.1-10: Abbau von Ethiofencarb in den Extraktionshülsen während der Lagerung bei Raumtemperatur in verschiedenen Matrices, Dotierungslevel 5 µg/Ansatz

0 1 2 4 6 8 16

Traube "alt"

Tomate

Traube "frisch"Aprikose

Wasser

0102030405060708090

100

Wf. [%]

Lagerzeit [h]

Methiocarb und Aldicarb zeigten sich wesentlich weniger oxidationsanfällig als Ethio-fencarb. Im Fall des Methiocarb ist das Schwefelatom direkt an den Aromaten gebunden und durch zwei Methyl-Gruppen, jeweils in ortho-Position, sterisch gut abgeschirmt. Bei Aldicarb ist das Schwefelatom an einem sperrigen, tertiär substituierten Kohlenstoff gebunden. Das Abbauverhalten von Methiocarb, Aldicarb und Ethiofencarb in Traubensaft zeigt Abbildung 3.2.1-11. Bei diesem Versuch wurde der Traubensaft durch Zugabe von Pufferlösungen auf verschiedene pH-Werte eingestellt, dotiert und dann extrahiert. Die Bestimmung erfolgte mittels LC/MS. Es wird erkennbar, dass der Zerfall der drei Verbindungen mit steigendem pH-Wert ra-scher erfolgt. Theoretisch könnte dies auf eine gesteigerte Hydrolysegeschwindigkeit der Carbamate bei höheren pH-Werten zurückzuführen sein. Dagegen spricht jedoch der Befund, dass Ethiofencarb bei einer Dotierung auf Wasser (keine Matrix), einen ver-gleichsweise geringeren Abbau zeigte. Dies deckt sich auch mit den in der Literatur an-gegebenen Halbwertzeiten in wässrigen Lösungen (DT50: Ethiofencarb 19 d bei pH 7, Methiocarb 35 d bei pH 7, Aldicarb 75 d bei pH 9) [Roberts et al. 1999]. Möglich ist, dass der zunehmende Zerfall auf einer gesteigerten Aktivität der für die Oxidation zu-ständigen Enzyme (Monooxygenasen) beruht.



Abb. 3.2.1-11: Abbauverhalten von Methiocarb, Aldicarb und Ethiofencarb in den Extraktionshülsen während der Lagerung bei Raumtemperatur in Abhängigkeit vom pH-Wert, Matrix Traubensaft, Dotierung 5 µg/Ansatz

Methiocarb (Mercaptodimethur)

Aldicarb

Ethiofencarb

03610

2030pH 4

pH 5

pH 6

0

20

40

60

80

100

Lagerzeit in h

Wf. %

036

1020

30pH 4

pH 5

pH 6

0

20

40

60

80

100

Lagerzeit in h

Wf. %

036

1020

30pH 4

pH 5

pH 6

0

20

40

60

80

100

Lagerzeit in h

Wf. %



Um die Verbindungen vor der Oxidation zu schützen, wurde den Proben Ascorbinsäure zugesetzt. Gegenüber anderen Antioxidantien hat Ascorbinsäure den Vorteil, dass sie gut wasserlöslich und daher durch ÜK-CO2 praktisch nicht extrahierbar ist. Wie in Abbil-dung 3.2.1-12 ersichtlich konnte durch den Ascorbinsäurezusatz die Oxidation von Ethiofencarb effektiv verhindert werden. Abb. 3.2.1-12: Schutz von Ethiofencarb vor Oxidation durch Zusatz von Ascorbinsäure Zusatzmenge 100 mg in 2,5 g Probe

0 20 40 60 80

0 h

4 h

4 hLagerzeit

Wiederfindung [%]

ohne Zusatz

mit Ascorbinsäure

100

Unerwünschte Nebeneffekte bei Zusatz von Ascorbinsäure Die Verwendung von Ascorbinsäure ist jedoch nicht ganz unproblematisch: So wurde z.B. eine leichte Abnahme der Wiederfindung von Aldicarb festgestellt, was auf einer Hydrolyse zum Aldehyd [vgl. Roberts et al. 1999] und anschließende Reduktion zum Alkohol beruhen könnte. Ein weiterer unerwünschter Nebeneffekt nach Zugabe von Ascorbinsäure war die Zer-setzung der Verbindungen Dioxacarb und Propiconazol. Beide Verbindungen weisen eine Acetalgruppe auf, die insbesondere unter sauren Bedingungen zu dem entspre-chenden Aldehyd hydrolysiert wird (vgl. Kap. 3.2.1.2.4.3), der seinerseits durch die As-corbinsäure reduziert werden kann. 3.2.1.2.4.2 Basenempfindliche Pestizide Als bei höheren pH-Werten besonders hydrolyseempfindlich haben sich die Pestizide Folpet, Captan, Dichlofluanid und Tolylfluanid erwiesen. Sie weisen als gemeinsa-mes Strukturmerkmal eine N-Trihalomethylthio-Einheit auf (siehe Tab. 3.2.1-5), die be-sonders anfällig für Angriffe durch Nucleophile, insbesondere Hydroxid-Ionen ist [Ro-berts et al. 1999, Hassall 1982]. Aus der Gruppe der Phosphorsäureester zeigte Dichlorvos bei höheren pH-Werten einen deutlichen Abbau. Aus der Gruppe der Dicarboximide ist Chlozolinat als beson-ders labil aufgefallen. Tabelle 3.2.1-5 gibt eine Übersicht über die hinsichtlich ihres Abbauverhaltens unter-suchten basenempfindlichen Verbindungen.



Tab. 3.2.1-5: Pestizide, die bei höheren pH-Werten während der Lagerung

in Extraktionshülsen bei Raumtemperatur einen signifikanten Abbau gezeigt haben


Folpet

N-Trihalomethylthio-

derivat

Phthalimid

Hydrolyse insbesondere bei höheren pH-Werten

Halbwertzeiten DT50 [Roberts et al. 1999 S. 1363]

pH 3: 10,5 h pH 7: 1,1 h

Captan


derivat

Tetrahydrophthalimid

Hydrolyse insbesondere bei höheren pH-Werten

Halbwertzeiten DT50 [Roberts et al. 1999 S. 1351]

pH 4: 32 h pH 7: 10 h

Dichlofluanid


derivat

Hydrolyse insbesondere bei

höheren pH-Werten Halbwertzeiten DT50

[Roberts et al. 1999 S. 1359]pH 4: 12 d pH 7: 29 h

Tolylfluanid N-Trihalomethylthio-

derivat



[Roberts et al. 1999 S. 1368]pH 4:>15 d pH 7: 18 h

Dichlorvos

Organophosphor-

säureester

Dimethylphosphat

Dichloracetaldehyd

Rasche Hydrolyse bei

höheren pH-Werten auch im Sauren relativ instabil

[Roberts et al. 1999 S. 264]

Chlozolinat

Dicarboximid

Entstehung über verschiedene

Zwischenstufen [Cabras et al. 1987]



[Roberts et al. 1999 S. 1155]pH 6,8:>6 h

pH 8,3: 16 min

NH

O

O

N

O

O

S CCl3

N

O

O

S CCl3 NH

O

O

NS

O

O

NH

NS

O

O

NS CCl2F

NS

O

O

NH

NS

O

O

NS CCl2F

P

O

H3CO

OCH3

OH

P

O

H3CO

OCH3

OCH C

Cl

Cl

CHCl2CO

H

Cl

Cl

N

O

HOH

CH3

H

Cl

Cl

N O

O

O

CH3

COOCH2CH3



Das Abbauverhalten der Verbindungen Folpet, Dichlofluanid, Tolylfluanid bei verschie-denen pH-Werten (natürlicher pH-Wert der Frucht und bei pH 7) in verschiedenen Matrices wird in den Abbildung 3.2.1-13 dargestellt. Captan wurde bei diesem Versuch nicht mit einbezogen. Es zeigte jedoch bei verschiedenen Vorversuchen ein ähnliches Verhalten wie die eben genannten Verbindungen. Sowohl bei der Trauben- als auch bei der Aprikosen-Matrix zeigten alle drei Verbindun-gen einen deutlichen Abbau bei pH 7. Bei natürlichen pH-Werten fiel dieser Abbau deutlich geringer aus. Bei einer Lagerung der Hülsen für 24 Stunden im Tiefkühlfach (24 TK) war weder im Sauren noch bei pH 7 ein merklicher Abbau festzustellen. Abb. 3.2.1-13: Abbauverhalten von Folpet, Dichlofluanid und Tolylfluanid in verschiedenen Matrices und bei verschiedenen pH-Werten, Dotierungslevel 5 µg/Ansatz

natürlicher pH-Wert pH 7

Traube

Aprikose

Wf

24TK

0 1 2 4 6 8 16

Folpet

TolylfluanidDichlofluanid

0102030405060708090

100Wf [%]

Lagerzeit in Stunden

24TK

0 1 2 4 6 8 16

Folpet

TolylfluanidDichlofluanid

0102030405060708090

100 [%]


24TK

0 1 2 4 6 8 16

Folpet

Dichlo fluanidTolylfluanid

0102030405060708090

100Wf [%]


24TK

0 1 2 4 6 8 16

Folpet

Dichlo fluanidTolylfluanid

0102030405060708090

100

Wf [%]


Der Abbau von Dichlorvos und Chlozolinat in verschiedenen Matrices wird in den Abbil-dungen 3.2.1-14 und 3.2.1-15 dargestellt. Auch hier wurde eine erhöhte Abbaurate bei pH 7 festgestellt. Bei einer eintägigen Lagerung im Tiefkühlfach (in den Abbildungen als 24 TK bezeichnet) war auch hier praktisch kein Abbau festzustellen.



Abb. 3.2.1-14: Abbauverhalten von Dichlorvos in den Extraktionshülsen während der Lagerung bei Raumtemperatur in verschiedenen Matrices, Dotierungslevel 5 µg/Ansatz

natürlicher pH-Wert

pH 7

Abb. 3.2.1-15: Abbauverhalten von Chlozolinat in den Extraktionshülsen während der Lagerung bei Raumtemperatur in verschiedenen Matrices, Dotierungslevel 5 µg/Ansatz

Natürlicher pH-Wert

pH 7

Trau

beA

prik

ose

Gur

keTo

mat

e

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Wf. [%]


2 4T K0

12

46

81 6Tr

aube

Apr

ikos

e

Tom

ate

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0Wf. [%]


Apr

ikos

eTr

aube

Gur

keTo

mat

e

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Wf. [%]


2 4T K0

12

46

81 6Tr

aube

Apr

ikos

e

Tom

ate

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0Wf. [%]


Die vorangegangenen Versuche haben gezeigt, dass Folpet, Dichlofluanid, Tolylfluanid, Chlozolinat und Dichlorvos unter neutralen Bedingungen (pH 7) einen erheblich stärke-ren Abbau zeigen als im Sauren. Folglich sollte gegebenenfalls bei der Probenaufar-beitung eine pH-Wert-Einstellung vorgenommen werden. Dies wäre z. B. bei Salaten und verschiedenen Gemüsesorten angebracht. Um ein genaueres Bild über das Zersetzungsverhalten dieser Pestizide in Abhängigkeit vom vorherrschenden pH-Wert zu erhalten, wurden beispielhaft für Folpet, Tolylfluanid und Chlozolinat weitere Untersuchungen bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Dazu wurde Traubensaft durch Zugabe von Pufferlösungen auf pH 4, 5 und 6 einge-stellt, mit den Pestiziden dotiert und wie in Anlage 1 beschrieben weiter aufgearbeitet.



Die Extraktionen wurden auch hier nach festgelegten zeitlichen Intervallen durchgeführt (siehe Abb. 3.2.1-16). Abb. 3.2.1-16: Abbau von Folpet, Chlozolinat und Tolylfluanid in den Extraktionshülsen während der Lagerung bei Raumtemperatur und bei verschiedenen pH-Werten, Matrix Traubensaft, Dotierung 5 µg/Ansatz

0361020

30pH 4

pH 5pH 6

0

20

40

60

80

100

Lagerzeit in h

Wf. %

0361020

30pH 4

pH 5pH 6

0

20

40

60

80

100

Lagerzeit in h

Wf. %

0361020

30pH 4

pH 5pH 6

0

20

40

60

80

100

Lagerzeit in h

Wf. %

Folpet

Chlozolinat

Tolylfluanid



Wie in Abbildung 3.2.1-16 gezeigt wird, zeigten die Wirkstoffe bei allen pH-Werten (4, 5 und 6) einen Abbau. Am labilsten waren die Verbindungen bei pH 6 und am stabilsten bei pH 4. Nach 6 h lag der Abbau bei pH 4 in einem noch akzeptablen Bereich. Dem-nach sollten Proben die einen höheren pH aufweisen für diese Stoffe auf einen pH-Wert von höchstens 4 eingestellt werden (vgl. hierzu Kap. 3.2.1.2.4.5). 3.2.1.2.4.3 Säureempfindliche Pestizide Als besonders unbeständig in sauren Proben haben sich die insektiziden Carbamate Dioxacarb, Benfuracarb und Carbosulfan gezeigt. Tabelle 3.2.1-6 gibt eine Übersicht über die hier untersuchten säureempfindlichen Pesti-zide. Furathiocarb wird ebenfalls hier aufgeführt, obwohl diese Verbindung eher zu den basenempfindlichen Pestiziden gehört. Wie auch Benfuracarb und Carbosulfan hydroly-siert Furathiocarb zu Carbofuran. Tab. 3.2.1-6: Einige insektizide Carbamate, die während der Lagerung in den

Extraktionshülsen bei Raumtemperatur einen signifikanten Abbau gezeigt haben


Dioxacarb

Carbamat

Hydrolyse des cyclischen Ketals, säurekatalysiert

Benfuracarb

Carbamat

Hydrolyse insbesondere bei niedrigen pH Werten

[Roberts et al. 1999, S. 10]

Carbosulfan

Carbamat

Hydrolyse insbesondere bei niedrigen pH-Werten Halbwertzeiten DT50

[Roberts et al. 1999, S. 34] pH 4: 1 h

pH 6: 22 h pH 7: 7,6 d

Furathiocarb

Carbamat

Carbofuran

Hydrolyse im Sauren rel.

langsam, bei höheren pH-Werten stärker

Halbwertzeiten DT50 [Perkow et al. 1999]

pH 5: 200 d pH 7: 144 d

OC

O

NHCH3O

O

OC

O

NHCH3

C

O

H

NHCH3

O

CO

O

N

O

CO

SN OCH2CH3

O

O

N

O

CO

SN

C4H9

C4H9

O

N

O

CO

O

SN

C

O

O C4H9



Das N-Methyl-Carbamat Dioxacarb weist eine cyclische Acetalgruppe (Dioxolan-Ring) auf, die bevorzugt unter sauren Bedingungen unter Abspaltung von Ethylenglykol zu dem entsprechenden Aldehyd hydrolysiert wird. In Abbildung 3.2.1-17 wird das Abbauverhalten Dioxacarb bei verschiedenen pH-Werten dargestellt. Während bei pH 6 die Verbindung praktisch stabil ist, zeigt sie schon bei pH 4 einen deutlichen Abbau. Abb. 3.2.1-17: Abbau von Dioxacarb in den Extraktionshülsen während der Lagerung bei Raumtemperatur und bei verschiedenen pH-Werten, Matrix Traubensaft, Dotierungslevel 5 µg/Ansatz

03

610

2030

pH 4

pH 5

pH 6

0

20

40

60

80

100

DioxacarbLagerzeit in h

Wf. %

Die Pro-Pestizide Carbosulfan, Benfuracarb und Furathiocarb bauen während der Lagerung bei Raumtemperatur ebenfalls ab. Dabei entsteht als Hauptabbauprodukt Carbofuran. Die Abhängigkeit der Umwandlungsraten dieser Verbindungen vom pH-Wert wird in Ab-bildung 3.2.1-18 demonstriert. Dargestellt sind jeweils die Wiederfindungen der Mutter-substanzen (dunkle Säule) sowie des Abbauproduktes Carbofuran (helle Säule dar-über). Für die Berechnungen wurden folgende Umwandlungsfaktoren herangezogen: Furathiocarb (FC) / Carbofuran F=1,73 Carbosulfan (CS) / Carbofuran F=1,72 und Benfuracarb (BC) / Carbofuran F=1,86. Während Carbosulfan und Benfuracarb stärker bei niedrigen pH-Werten zu Carbofuran umgewandelt werden, ist bei Furathiocarb die Umwandlung bei höheren pH-Werten günstiger.



Abb. 3.2.1-18: Umwandlung von Carbosulfan, Benfuracarb und Furathiocarb zu Carbofuran bei verschiedenen pH-Werten, Matrix Traubensaft

Carbosulfan

Benfuracarb

Furathiocarb


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7

Carbofuran berechnet als FCFurathiocarb (FC)

Wf. % 8 h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7

Carbofuran berechnet als CSCarbosulfan (CS)

Wf. % 0 h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7


Wf. % 4 h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7


Wf. % 8 h

010

20

3040

5060

70

8090

100

pH 4 pH 5 pH 6

Carbofuran berechnet als BCBenfuracarb (BC)

Wf. % 0 h

0

10

2030

40

50

6070

80

90100

pH 4 pH 5 pH 6


Wf. % 3 h

0

10

20

30

40

50

6070

80

90

100

pH 4 pH 5 pH 6


Wf. % 6 h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7


Wf. % 0 h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7


Wf. % 4 h


3.2.1.2.4.4 Abbauvorgänge im Extraktor Ein Abbau von Pestiziden findet nicht nur während der Lagerung der Extraktionshülsen sondern auch im Extraktor statt. In Abbildung 3.2.1-19 ist der zeitliche Ablauf der Arbeitsschritte eines Extraktors vom Typ HP 7680-T schematisch dargestellt. Abb. 3.2.1-19: Zeitlicher Ablauf der Arbeitsschritte des Extraktionsgerätes (HP 7680-T) bis zum Beginn der dynamischen Extraktion Zeitachse

0 min ► ► ► ► ca. 4 min Temperatur der Probe

RT RT►55°C 55°C

Extraktions-hülse

Hülse fährt in die Extraktions-kammer

Kammer wird beheizt bis die Solltemperatur von z.B. 55 °C erreicht ist

Solltemperatur erreicht

Falle

Falle kurz beheizt

Falle wird mit technischem CO2 gekühlt z.B. auf 10 °C


Hochreines CO2

CO2 wird durch das System geblasen

System wird mit flüssigem CO2 befüllt Druck: ca. 55 bar

Aufbau des Solldruckes (z.B. 329 bar) „Wait for pressure“

Pumpen- Kühlung

Pumpenkopf wird mit technischem Kohlendioxid auf 4 °C gekühlt „wait for temperature“


Statische Extraktion z.B. 1,5 min kein CO2-Fluss

Betrachtet man das Zeitschema, so wird deutlich, dass die in den Extraktionshülsen ent-haltenen Proben für eine relativ lange Zeit hohen Temperaturen ausgesetzt sind, bevor die dynamische Extraktion (im Anschluss an die statische Extraktion) beginnt. Limitie-rend ist insbesondere der Vorgang der Kühlung des Pumpenkopfes, da erst nach Errei-chen der notwendigen Temperatur die CO2-Pumpe in Betrieb geht („wait for tempera-ture“). Dieser Vorgang dauert unterschiedlich lange und ist z.B. abhängig von dem Füll-stand der Kühlgasflasche sowie von der Ausgangstemperatur der Pumpe. Aus diesem Grund dauert der Kühlvorgang bei den jeweils ersten Proben einer Extraktionssequenz meist deutlich länger als bei den nachfolgenden. In der Tat sind die Extrakte solcher Proben des öfteren durch eine höhere Abbaurate bestimmter empfindlicher Pestizide aufgefallen. Um ein Bild über das Ausmaß der Abbauvorgänge während der Anlaufphase des Ex-traktors bis zur Extraktion zu bekommen, wurden beispielhaft für Ethiofencarb die bei-den Zeitintervalle „wait for temperature“ und „statische Extraktion“ variiert. Die Ergeb-nisse dieses Versuches werden in Tabelle 3.2.1-7 dargestellt. Tab. 3.2.1-7: Abbau von Ethiofencarb während der Anlaufphase des Extraktions- gerätes bis zur Extraktion bei unterschiedlichen Bedingungen, Matrix Apfelmus, Dotierungslevel 5 µg/Ansatz

Temperatur der Hülse vor der

Extraktion

„wait for temperature“ [s]

statische Extraktion [s]

Wf. [%]

RT 80 120 85 -18 °C 80 120 93

RT 180 120 71 -18 °C 180 120 86

RT 80 0 86 RT 80 120 85 RT 80 240 80 RT 80 360 81

Es wird deutlich, dass Ethiofencarb während der Vorbereitungszeit des Extraktors auf die Extraktion, aufgrund der erhöhten Temperaturen, zersetzt wird.



Interessanterweise war bei der statischen Extraktion nur ein sehr geringer Abbau fest-zustellen. Dies könnte darauf hindeuten, dass der Abbau unterdrückt wird, sobald die Extraktionshülse mit ÜK-CO2 befüllt wird (Verdrängung der Luft). Wurden die Extraktionshülsen in tiefgekühltem Zustand zur Extraktion eingesetzt, fiel der Abbau von Ethiofencarb wesentlich geringer aus. 3.2.1.2.4.5 Diskussion Anhand zahlreicher Beispiele wurde gezeigt, dass sich die verschiedenen Pestizide hin-sichtlich ihrer Stabilität sehr unterschiedlich verhalten. Um die Abbauvorgänge während der Probenaufarbeitung, Lagerung und Extraktion zu minimieren, müssen verschiedene Maßnahmen getroffen werden. Eine sehr effektive Methode die Abbauvorgänge zu minimieren, ist die Einhaltung tiefer Temperaturen. Leider ist dies in der Praxis nur schwer zu realisieren, da hierfür eine ständige Betreuung des Gerätes erforderlich ist und damit die Vorteile der seriellen Probenabarbeitung (stand alone) verloren gehen. Um die Vorzüge der Probengeber (Autosampler) effektiv nutzen zu können, sollten Ex-traktoren zukünftig unbedingt kühlfähig sein. Ein sehr wichtiger Parameter in Zusammenhang mit dem Abbauverhalten von Pestizi-den ist der pH-Wert. Während einige Verbindungen wie Folpet, Captan, Dichlofluanid unter neutralen Bedingungen einen starken Abbau zeigen, zeigen sich andere Verbin-dungen wie Carbosulfan, Benfuracarb und Dioxacarb wesentlich anfälliger unter sauren Bedingungen. Da in der Routineanalytik bevorzugt Multimethoden eingesetzt werden, wird ersichtlich, dass hinsichtlich des pH-Wertes ein Kompromiss gefunden werden muss. Tabelle 3.2.1-8 gibt eine Übersicht über das Abbauverhalten der oben aufge-führten Pestizide bei verschiedenen pH-Werten. Tab. 3.2.1-8: Übersicht zum Abbauverhalten verschiedener Pestizide in Abhängigkeit vom pH-Wert

Verbindung pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7

Dioxacarb ▼▼▼ ▼▼ ▼ ● ● Carbosulfan ▼▼▼ ▼▼ ▼ ● ● Benfuracarb ▼▼▼ ▼▼ ▼ ● ● Folpet ● ● ▼▼ ▼▼ ▼▼▼ Tolylfluanid ● ● ▼ ▼▼ ▼▼▼ Chlozolinat ● ● ▼ ▼▼ ▼▼▼

Legende ●

relativ stabil

▼ leichter Abbau

▼▼ deutlicher

Abbau

▼▼▼ starker Abbau

Die Einstellung des pH-Wertes vor der Extraktion auf pH 5 wäre, diesen Ergebnissen zufolge, ein sinnvoller Kompromiss. Berücksichtigt man jedoch die Tatsache, dass die fungiziden Verbindungen Folpet, Captan, Dichlofluanid und Tolylfluanid zu den am häu-figsten gefundenen Pestiziden zählen und die Verbindungen Dioxacarb, Carbosulfan und Benfuracarb eher selten anzutreffen sind, wäre für Routineuntersuchungen eine Einstellung des pH-Wertes im Bereich von 4 angebrachter. Dies wäre beispielsweise bei den meisten Gemüsesorten erforderlich. Die Einstellung des pH-Wertes kann z.B. durch die Zugabe eines Phosphat-Zitronen-säure-Puffers (vgl. Anlage 1) erfolgen. Da hierdurch auch der Salzgehalt in den Proben



erhöht wird, wirkt sich diese Maßname auch positiv auf die Extrahierbarkeit von polaren Verbindungen aus. Anmerkung: In diesem Abschnitt wurden Verbindungen vorgestellt, die einen deutlichen Abbau zeigen. Es muss jedoch erwähnt werden, dass die Mehrzahl der Pestizide eine erheblich höhere Stabilität zeigte.

3.2.1 .3 Var iat ionsmögl ichkei ten der Mul t imethode im Überbl ick

Im vorangegangenen Abschnitt (Kap 3.2.1.2) wurden verschiedene Möglichkeiten auf-gezeigt um die Extraktionsausbeuten von „schwierigen Pestiziden“ zu verbessern. Ab-bildung 3.2.1-20 gibt eine schematische Überblick über diese Variationsmöglichkeiten der in Kapitel 3.2.1.1 vorgestellten Multimethode (Basismethode). Abb. 3.2.1-20: Variationsmöglichkeiten der Basismethode im Überblick

Probenzerkleinerung

Einwaage

pH-Wert-Einstellungen o Minimierung v. Zersetzungen o Verbesserung der Extrahier-

barkeit von sauren oder basischen Verbindungen

Zugabe von Salzen für polare Pestizide o Erhöhung des Salzaktivität o Wasserbindung

Zugabe von Ascorbat* Schutz vor Oxidationen

Vermengung mit Hydromatrix

Erhöhung des Hydromatrix-Anteils bei stark lipophilen

Verbindungen

Tiefgefrieren der Extraktionshülsen

Extraktion

2 ter Extraktionsschritt z.B. bei Verbindungen die o zu Adsorptionen neigen o ungünstige Verteilungs-

koeffizenten besitzen

Auffangen der Extrakte auf ODS-Falle

Verwendung von inertem Fallenmaterial z.B. Stahlkugeln

bei Verbindungen die zu Adsorptionen neigen

Modif. des Elutionsmittels z.B. Zugabe von 0,1 %

Ammoniak zur besseren Elution basischer Verbindungen

Elution der Extrakte aus der Falle mit

Acetonitril

* Bei Zugabe von Ascorbat wurde eine Abnahme der Wiederfindungen bestimmter Verbindungen

(Aldicarb, Dioxacarb, Propiconazol) beobachtet



3.2 .2 Best immungsmethoden für spez ie l le Pest iz idk lassen Bereits in der Einführung wurde auf die bestehenden Defizite im Bereich der Pestizid-rückstandsanalytik hingewiesen. Hierbei sind insbesondere solche Pestizide betroffen, die mit den herkömmlich eingesetzten Multimethoden nicht erfasst werden. Vorhandene Einzel- und Gruppenbestimmungsmethoden werden auf Grund mangelnder technischer und personeller Kapazitäten in den Laboratorien kaum durchgeführt. Um diese analyti-schen Lücken füllen zu können, besteht daher ein großes Interesse an schnelleren Analysenmethoden die in der Routine eingesetzt werden können. Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war es, gerade für derartige Verbindungen mit Hilfe der SFE in Kombination mit der LC/MS schnelle und einfach durchzuführende Be-stimmungsmethoden zu entwickeln. Um den Abbau dieser analytischen Defizite ist auch das Bundesministerium für Gesund-heit bemüht. In diesem Zusammenhang wurde eine Prioritätenliste erstellt, in der ca. 100 Pestizide aufgeführt sind, für die derzeit noch analytische Defizite bestehen [BMG 1999]. Die Prioritätsreihenfolge richtet sich nach einem Punkteschema, das sich an toxi-kologischen Daten sowie an Daten über die EU-weite Anwendung der einzelnen Pesti-zide richtet. Ziel dieser Liste ist es, den Laboratorien analytische Schwerpunkte aufzu-zeigen. Es wird angestrebt, für Pestizide, denen eine hohe Priorität beigemessen wird, vorrangig Bestimmungsmethoden zu entwickeln und in der Praxis einzusetzen. Für die Erstellung dieser Liste wurden deutschlandweit Daten über das routinemäßig und potentiell erfassbare Pestizidspektrum in den einzelnen Laboratorien gesammelt. Da in den meisten Laboratorien fast ausschließlich die Multimethoden DFG S 19 und S 8 [DFG 1991, BgVV 1999] eingesetzt werden, sind in der Prioritätenliste hauptsächlich Pestizide aufgeführt, die mit diesen Multimethoden nicht erfasst werden. Wie im fol-genden gezeigt wird kann dies verschiedene Gründe haben. Ein wichtiger Grund ist die Tatsache, dass bei den meisten Multimethoden lediglich eine gaschromatographische Bestimmung vorgesehen ist. Dadurch werden z.B. thermolabile Verbindungen wie N-Methyl-Carbamate und Harnstoff-Derivate nicht erfasst, obwohl sie, ihren physikalischen Eigenschaften zufolge, bei der Extraktion größtenteils keine Schwierigkeiten bereiten dürften. Für solche Verbindungen bietet sich prinzipiell die Flüssigkeitschromatographie an. Die Detektion bereitete jedoch seither stets Probleme, da mit dem DAD kein universeller Detektor mit ausreichendender Empfindlichkeit zur Verfügung stand. Im Fall der N-Methyl-Carbamate und der Phenyl-Harnstoff-Pestizide bietet sich zwar die Möglichkeit einer empfindlichen Bestimmung mittels Fluoreszenz-detektion nach einer Nachsäulen-Derivatisierung an, jedoch ist bei diesem Verfahren eine spezielle Apparatur notwendig [Luchtefeld 1987, de Kok et al. 1987]. Diese Situation hat sich in den letzten Jahren durch die rasanten Fortschritte im Bereich der LC/MS geändert. Mittlerweile werden für den Routineeinsatz konzipierte Geräte zu erschwinglichen Preisen angeboten. Durch die hohe Empfindlichkeit und Selektivität dieser Messgeräte eröffnet sich auch für herkömmliche Multimethoden die Möglichkeit, das erfassbare Pestizidspektrum stark zu erweitern. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass durch die Einführung der GC/MSD in den letzten Jahren viele Laboratorien ihr routinemäßig erfassbares Spektrum bereits bedeutend erweitern konnten. Durch die GC/MS wird nämlich eine empfindliche und sichere Detektion zahlreicher Pestizide, die mit den herkömmlichen GC-Detektoren (ECD, NPD) nur sehr unempfindlich erfasst werden, ermöglicht. Auch basische und saure Pestizide werden mit den gängigen Multimethoden nur unvoll-ständig erfasst, da der pH-Wert während der Flüssig-Flüssig-Verteilung meist nicht be-



rücksichtigt wird. Hinzu kommt, dass basische Pestizide bei Clean-up-Schritten wie der Mini-Kieselgelsäulenreinigung und der GPC [DFG 1991, BgVV 1999] aufgrund ihrer Neigung zu Adsorptionen oft große Verluste erleiden, sowie die Tatsache, dass sowohl saure als auch basische Pestizide oft einer Derivatisierung bedürfen. Eine prinzipielle Limitation von Multimethoden besteht in der unvollständigen Erfassung von Pestiziden mit hoher Polarität, wobei hier z.T. große Unterschiede bestehen. So werden beispielsweise mit der DFG S 19 Multimethode, bei der die wässrige Phase im Verteilungsschritt mit Salz gesättigt wird, polare Pestizide besser erfasst als mit der DFG S 8. Dafür sind aber die Extrakte der letzteren in der Regel weniger mit störenden Begleitstoffen aus der Matrix belastet. In Tabelle 3.2.2-1 werden die oben aufgeführten Gründe, die eine Erfassung verschiedener Pestizide mittels der gängigen Multimethoden erschweren, nochmals zusammengefasst und einige Beispiele genannt. Tab. 3.2.2-1: Pestizide, die mit den gängigen Multimethoden schlecht erfasst werden

Eigenschaft der Pestizide Beispiele Anmerkungen

Hohe Polarität

Methamidophos, Acephat, Oxamyl, Glyphosat, Ethephon, Chlormequat

- schwer in die organische Phase zu überführen

- oft Probleme bei der GC Thermolabilität

N-Methyl-Carbamate, Harnstoff-Derivate, Organozinn-Verbindungen

- Zersetzung während der GC

Basizität

Thiabendazol, Carbendazim Imazalil, Fenpropimorph, Prochloraz

- pH-Einstellung bei der Flüssig-Flüssig-Verteilung notwendig

- Verluste durch Adsorptionserscheinungen z.B. bei GPC, Kieselgel-Säulenreinigung

- für die GC z.T. Derivatisierung erforderlich Acidität

Phenoxyalkancarbonsäuren

- pH-Einstellung bei der Flüssig-Flüssig-Verteilung notwendig

- Derivatisierung vor der Gaschromato-graphie erforderlich

Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Hilfe der SFE für folgende Pestizidgruppen Bestim-mungsverfahren entwickelt und im folgenden vorgestellt:

Basische Pestizide (Kap. 3.2.2.1) Saure Pestizide (Kap. 3.2.2.2) N-Methyl-Carbamate (Kap. 3.2.2.3) Harnstoff-Derivate (Kap. 3.2.2.4) Organozinn-Verbindungen (Kap. 3.2.2.5).

In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass einige dieser Verbindungen (die Mehr-zahl der N-Methyl-Carbamate und der Harnstoff-Derivate) sich auch gut mit der eben vorgestellten Multimethode erfassen lassen. Sie werden hier dennoch gesondert be-handelt, da sie zu den Pestiziden zählen, für die derzeit in der Lebensmittelüberwa-chung noch erhebliche analytische Defizite bestehen.



3.2.2 .1 Bas ische Pest iz ide

Die Analytik von Pestiziden mit basischen Eigenschaften ist sehr anspruchsvoll. In vor-angegangenen Kapiteln wurde bereits auf die zahlreichen Schwierigkeiten, die solche Verbindungen während der Analytik bereiten, eingegangen.

pH-Wert-Abhängigkeit der Extraktion (Kap. 3.2.1.2.2) Neigung zu Adsorptionen (Kap. 3.2.1.2.3.3.1) Schwierigkeiten bei der Gaschromatographie [Anastassiades 1998].

Um die Verluste der basischen Pestizide während der Analytik möglichst gering zu halten, ist daher stets große Sorgfalt geboten. Einige wichtige Vertreter sind in Abbildung 3.2.2-1 dargestellt. Bei allen diesen Verbindungen handelt es sich um systemische Fungizide mit protektiver und kurativer Wirkung. Sie finden einen verbreiteten Einsatz zur Bekämpfung zahlreicher Pilzarten sowohl im Obst- als auch im Gemüse- und Getreideanbau. Darüber hinaus werden sie bei Zitrusfrüchten und Kernobst auch nach der Ernte zum Schutz vor Lagerschä-den durch Pilzbefall eingesetzt. Die fungizide Wirkung der Imidazolderivate Prochloraz und Imazalil sowie des Mor-pholinderivates Fenpropimorph beruht auf der Hemmung der Ergosterol-Biosynthese. Die Benzimidazolderivate Thiabendazol und Carbendazim dagegen hemmen die Zellteilungen durch Beeinträchtigung der Mitose [Roberts et al. 1999].



Abb. 3.2.2-1: Strukturformeln einiger Pestizide mit basischen Eigenschaften

NN C

O

N CH2CH2O

Cl

Cl

ClCH3CH2CH2

Imazalil

NN CH2 CH

OCH2 CH CH2

ClCl

Thiabendazol Prochloraz

Fenpropimorph

N

N

H

N

S

N

N

H

NHC

O

OCH3

Carbendazim

N

O

CH3

CH3

3.2.2.1.1 Gemeinsame Bestimmung basischer Pestizide

3.2.2.1.1.1 Methodenentwicklung Prinzipiell lassen sich durch Erhöhung des pH-Wertes (pH 8-9) (wie bei der Bestimmung von Carbendazim beschrieben [Anastassiades 1998]) auch andere Pestizide mit basischen Eigenschaften gut extrahieren. Dies wurde mit folgendem Experiment demonstriert: Je 3 g einer Zitronenmatrix (pH-Wert 2,5) sowie einer durch Zugabe von 50 %iger K2CO3-Lösung auf pH 9 eingestellten Zitronenmatrix wurden mit einer Mischung von basischen Pestiziden dotiert. Nach Vermengung mit je 2,5 g Hydromatrix und Überfüh-rung des Gemisches in die Extraktionshülsen wurde die Extraktion am Extraktor der Fa. ISCO durchgeführt (Extraktionsbedingungen siehe Tab. 3.2.1-1). Bei diesem Gerät werden die Extrakte direkt in eine Lösungsmittelvorlage geleitet. Die erzielten Wieder-findungen werden in Tabelle 3.2.2-2 dargestellt.



Tab. 3.2.2-7: Wiederfindungen verschiedener basischer Pestizide aus dotierter Zitro-nenmatrix bei unterschiedlichen pH-Werten (ISCO Extraktor) (n=3)

Thiabendazol Carbendazim* Imazalil

Bedingungen

Prochloraz

Wf. [%]

Var. Koeff. [%]

Wf. [%]

Var. Koeff. [%]

Wf. [%]

Var. Koeff. [%]

Wf. [%]

Var. Koeff. [%]

pH∼2,5 natürlicher Wert 11,1 7,1 9,1 15 12 34 92 3,7

pH 9 62 5,8 94 3,3 91 5,1 95 3,3

pH 9, 2. Extr. 16 13,1 - 3 8,8 -

* nach Derivatisierung mit Pentafluorbenzylbromid (siehe Anlage 2) Extraktionsbedingungen siehe Tab. 3.2.2-1 Dotierte Matrix: Zitrone, dotierte Menge 5 µg je Pestizid pro Ansatz Es wird ersichtlich, dass durch die Erhöhung des pH-Wertes eine deutlich verbesserte Extrahierbarkeit der basischen Pestizide erreicht wird. Überraschend war die Wieder-findung von Imazalil mit 34 % bei pH 2,5. Mit einem pK von 7,47 liegt Imazalil schon bei einem pH-Wert unterhalb von 6,53 überwiegend in der protonierten Form vor. Bei einem pH von 2,5 liegen nur vernachlässigbar kleine Mengen in der extrahierbaren unproto-nierten Form vor (vgl. Kap. 3.2.1.2.2). Die Tatsache, dass dennoch eine so hohe Wie-derfindung erzielt werden konnte, spricht für die Effektivität mit der die Analyten, mit Hilfe von ÜK-CO2, aus der auf der Hydromatrixoberfläche verteilten Wasserschicht, extrahiert werden. Wesentlich schlechter extrahierbar waren die Benzimidazole Car-bendazim (Pkb=9,52) und Thiabendazol (Pkb=9,3), obwohl sie deutlich schwächere Ba-sen sind als Imazalil. Dies könnte auf eine stärkere Neigung dieser Verbindungen, z.B. mit der Hydromatrix in Wechselwirkungen zu treten, hindeuten. Eine starke Neigung der Benzimidazole zur Adsorption an Böden unter sauren Bedingungen wurde bereits von Aharonson et al. beschrieben [1975a, 1975b]. Hierbei wurde gezeigt, dass diese Wech-selwirkungen sowohl elektrostatischer Natur (Bildung von Ionen-Paaren zwischen den protonierten Verbindungen und der Bodenoberfläche) als rein chemischer Natur sein können.

b

Vergleicht man die beiden Imidazolderivate Imazalil und Prochloraz fällt auf, dass sich Prochloraz bei pH 2,5 praktisch quantitativ extrahieren lässt. Dies ist darauf zurück-zuführen, dass durch den –M-Effekt der Carbonylgruppe die Elektronendichte im Ring abnimmt (siehe Abb. 3.2.2-2). Dies spiegelt sich in der deutlich geringeren Basizität von Prochloraz wieder (pKb=10,2).



Abb. 3.2.2-11: Konjugation des Imidazolsystems mit der Carbonylgruppe bei Prochloraz

CH2CH2 O

Cl

Cl

ClR1 R2 CH2CH2CH3

δ-

δ+N

N CO

N R2

R1

NN C

O

N R2

R1

NN C

O

N R2

R1

Darüber hinaus fällt auf, dass sich Thiabendazol selbst unter alkalischen Bedingungen nur sehr zögerlich extrahieren lässt. Dies deutet ebenfalls darauf hin, dass diese Verbin-dung eine besonders ausgeprägte Neigung hat, Wechselwirkungen einzugehen. Eine Retention durch die Hydromatrix sowie durch Bestandteile der Zitronenmatrix ist hier denkbar. Bei Verwendung des Extraktors der Firma HP, bei dem die Extrakte an einer mit ODS befüllten Falle aufgefangen werden, traten zusätzliche Schwierigkeiten auf. Hier wurden zunächst insbesondere für Thiabendazol und in geringerem Ausmaß auch für die ande-ren Verbindungen zu geringe Wiederfindungen erzielt. Zurückzuführen war dies auf die schleppende Elution dieser Verbindungen von der Falle in die Vorlagegläschen. Da angenommen wurde, dass diese Retention hauptsächlich auf Wechselwirkungen der basischen Verbindungen mit Verunreinigungen am Eingangsbereich der Falle beruhte, wurde das alte ODS-Material durch ein unbenutztes ausgetauscht. Höhere Wiederfin-dungen und ein vermindertes „Schleichen“ waren die Folge. Jedoch waren insbesondere für Thiabendazol die Wiederfindungen weiterhin niedriger als erwartet, was auf Wech-selwirkungen mit dem ODS-Adsorptionsmaterial hindeuten könnte. Eine Verbesserung der Situation wurde durch Verwendung von Acetonitril mit 0,1 % Ammoniak als Eluti-onsmittel erreicht. Praktisch ausschalten ließ sich der Effekt jedoch erst durch die Verwendung von inertem Stahldraht oder kleinen Stahlkugeln (stainless steel balls) als Fallenmaterial. In Abbildung 3.2.2-3 wird diese Tatsache demonstriert. Bei diesem Versuch wurde Gurkenmatrix mit Thiabendazol (5 µg pro Ansatz) dotiert, auf pH~8 gebracht und extrahiert. Jede Probe wurde 3 mal hintereinander extrahiert (E1, E2 und E3 in Abb. 3.2.2-3). Dabei wurde die jeweilige Festphasenfalle bei der ersten Extraktion 8 mal und bei den beiden anderen je 3 mal mit je 1,5 ml Acetonitril eluiert (1r bis 8r in Abb. 3.2.2-3). Die Eluate wurden jeweils in getrennte Gefäße gesammelt und der Gehalt an Thiabendazol mittels LC/MSD bestimmt. Es wurden drei verschiedene Festphasenfallen-Materialien benutzt: 1. Feingeschnittener Stahldraht, 2. ODS-Material (wenig benutzt), 3. ODS-Material (etwa 3 Monate lang im Routinebetrieb). Wie aus Abbildung 3.2.3-3 ersichtlich, wird die Elution von Thiabendazol bei Verwendung von ODS als Fallenmaterial verzögert. Ein noch schlechteres Elutions-verhalten zeigte Thiabendazol aus dem gebrauchten ODS-Material was darauf



hindeutet, dass die Probenbestandteile die sich stets am Eingangsbereich der ODS ablagern, eine zusätzliche Retention bewirken. Abb. 3.2.2-3: Elutionsverhalten von Thiabendazol aus verschiedenen Festphasen- fallen bei der SFE, Elutionsmittel: Acetonitril, Dotierung: 5µg/Ansatz

0 1E1r

1E2r

1E3r

1E4r

1E5r

1E6r

1E7r

1E8r

2E1r

2E2r

2E3r

3E1r

3E2r

3E3r

Alte

ODS

Neue

ODS

Stah

ldra

ht

0

20

40

60

80

100Wf. in %

E = Extraktion r = rinse (Eluat von der Falle)

Thiabendazol bereitete jedoch auch weitere Schwierigkeiten. Wechselwirkungen machten sich nicht nur im Bereich der Falle, sondern auch innerhalb der Leitungen des SFE Gerätes bemerkbar. In den Leitungen zwischen der Extraktionshülse und dem Restriktor lagern sich offenbar nach und nach Bestandteile aus den Proben an. Beson-ders betroffen ist der Bereich nahe am Ausgang der Extraktionshülse, was dafür spricht, dass diese Bestandteile im überkritischem Kohlendioxid sehr schlecht löslich sind und daher sehr schleppend aus den Leitungen heraus befördert werden. Möglich ist, dass es sich hierbei um Probenbestandteile handelt, die nicht echt extrahiert werden, sondern lediglich durch den CO2-Fluß nach und nach mitgerissen werden und sich in den Lei-tungen ablagern. Diese Verunreinigung bewirken nicht nur eine Verschlechterung der Wiederfindungen sondern auch eine Verschleppung von Thiabendazol in die nachfolgenden Extrakte. So traten z.B. nach einer längeren Extraktionsserie von thiabendazolhaltigen Zitrusfrucht-proben erhebliche Verschleppungen von Thiabendazol bei nachfolgenden Extraktionen auf. Es wird ersichtlich, dass dieses Verhalten nicht unproblematisch ist, da die niedrigsten gesetzlichen Höchstmengen von Thiabendazol im Bereich von 0,01 mg/kg liegen und somit leicht falsch positive Befunde erzielt werden. Es wurden verschiedene Versuche unternommen eine Reinigung dieser Leitungen, mit den durch das Gerät gebotenen Möglichkeiten, zu erzielen. Dabei wurden sowohl reines Kohlendioxid als auch modifiziertes Kohlendioxid verwendet (Vermischung mit Aceto-nitril, Aceton, Aceton:Wasser 4:1, Acetonitril mit 0,1 % Ammoniak, jeweils 10 Vol%). Jedoch war es bei keinem dieser Versuche gelungen diese Erscheinung vollständig zu beseitigen. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass die effektivste Methode zur Beseitigung der Thiabendazol retardierenden Beläge eine Reinigung der Leitungen mit Wasser ist.



Hierzu wurden die Leitungen herausmontiert, in einem Behälter mit warmen Wasser eingetaucht und für wenige Minuten im Ultraschallbad behandelt. Da das demontieren der Leitungen nur wenige Handgriffe erfordert, bereitet diese Maßnahme keine größeren Probleme. Nach dem Reinigen der Leitungen erhöhten sich die Thiabendazol Wieder-findungen deutlich. Verschleppungen waren auch nach mehreren Extraktionen thiaben-dazolhaltiger Proben nicht mehr feststellbar. In Abbildung 3.2.2-4 werden die addierten Wiederfindungsraten der verschiedenen basi-schen Pestizide aus einer mit 1 mg/kg dotierten und auf pH~8 eingestellten Salatprobe dargestellt. Es wurden 2 aufeinanderfolgende Extraktionen à 25 min durchgeführt und jeweils die ersten 1,5 ml Eluat (1. Eluat) zur Bestimmung eingesetzt. Als Fallenmaterial wurden Stahlkugeln und zur Elution Acetonitril mit 0,1 % Ammoniak verwendet. Es wird deutlich, dass mit Ausnahme von Thiabendazol bereits eine Extraktion gute Wiederfindungsraten erbringt. Bei Thiabendazol ist jedoch die Durchführung einer zweiten Extraktion erforderlich. Abb. 3.2.2-4: Wiederfindungsraten basischer Pestizide aus Salatmatrix (pH~8) bei 2 Extraktionen (Festphasenfalle: Stahlkugeln)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Imazalil

Thiabendazol

Fenpropimorph

Prochloraz

Carbendazim

1. Extraktion 1. Eluat 2. Extraktion 1. Eluat

Wf. in %

In Abbildung 3.2.2-5 werden die mittleren Wiederfindungen (n=5) der basischen Pesti-zide aus Orangenmatrix dargestellt. Hierbei wurden je 2,5 g Orange auf pH~8 gebracht und mit 1 mg/kg der Verbindungen dotiert. Auch hier wurden 2 Extraktionen durchge-führt. Die Eluate beider Extraktionen (je 0,7 ml) wurden in diesem Fall in einem Gefäß aufgefangen. Als Fallenmaterial wurden hier ebenfalls Stahlkugeln verwendet. Hierbei konnten für alle Verbindungen sehr gute Wiederfindungsraten bei geringen Schwankungen erzielt werden. Die Variatioskoeffizienten (n=5) lagen bei Carbendazim 3,2%, Fenpropimorph 5,7%, Imazalil 3,3%, Prochloraz 3,1% und Thiabendazol 6,1%.



Abb. 3.2.2-5: Mittlere Wiederfindungsraten basischer Pestizide aus Orangenmatrix (n=5) (pH~8) bei 2 Extraktionen (Festphasenfalle: Stahlkugeln)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10

Carbendazim

Thiabendazol

Fenpropimorph

Prochloraz

Imazalil

Wf. in %0

In den vorangegangenen Kapiteln wurde gezeigt, dass durch eine Erhöhung des pH-Wertes auf über 8 eine gute Extrahierbarkeit der basischen Verbindungen erreicht wer-den kann. Wie in Kapitel 3.2.1.2.4.2 jedoch dargestellt wurde, können derart hohe pH-Werte zu erheblichen Verlusten bestimmter Verbindungen führen. Daher wurde über-prüft inwieweit auch bei geringeren pH-Werten eine quantitative Extraktion der basi-schen Verbindungen erreicht werden kann. Dies würde die Eingliederung einiger basi-schen Pestizide in die Multimethode ermöglichen. Hierzu wurde Wiederfindungsversuche der basischen Pestizide aus Traubenmatrix, die auf unterschiedliche pH-Werte eingestellt wurde, durchgeführt. Es wurden je 2,5 g Matrix mit 1 µg/kg der Wirkstoffe dotiert. Die Extraktionen wurden unter den Be-dingungen der Multimethode (siehe Tab. 3.2.1-1) durchgeführt. Abweichend wurden hier statt ODS Stahlkugeln als Festphasenfallenmaterial verwendet um eine gute Elution des Thiabendazol, Imazalil und Fenpropimorph sicher zu stellen (Bem.: Carbendazim und Prochloraz lassen sich auch aus ODS-Material gut eluieren) Die erzielten Wiederfindungen bei pH 5, 6 und 8 werden in Tabelle 3.2.2-3 dargestellt. Es wurden je 2 Extraktionen von 25 min durchgeführt. Dargestellt sind die Summen der mittleren Wiederfindungen der ersten und zweiten Extraktion. Es wird deutlich, dass sich alle untersuchten basischen Pestizide auch bei pH 5 noch gut extrahieren lassen. Damit können zumindest Carbendazim und Prochloraz bei entsprechender pH-Wert-Einstel-lung auch mit der Multimethode erfasst werden (Anlage 1).



Tab. 3.2.2-3: Mittlere Wiederfindungen basischer Pestizide bei verschiedenen pH- Werten, Matrix Traube, Dotierungslevel 1 µg/kg, Summe aus 2 Extraktionen von 25 min, Festphasenfalle: Stahlkugeln

pH 5 pH 6 pH 8 Verbindungen Wiederfindungen in %

1. Extr.

2. Extr.

Summe

1. Extr.

2. Extr.

Summe

1. Extr.

2. Extr.

Summe

Thiabendazol 63 28 91 64 25 89 65 28 93 Carbendazim 81 3 84 92 2 94 94 2 96 Fenpropimorph 77 5 82 81 4 85 80 4 84 Prochloraz 86 3 89 86 2 88 88 2 90 Imazalil 77 8 85 75 5 80 90 2 92

3.2.2.1.1.2 Messung mittels GC/MSD Mit Ausnahme von Carbendazim, das vor einer gaschromatographischen Bestimmung derivatisiert werden muss, lassen sich die untersuchten Verbindungen bei Berücksich-tigung der Matrix-Einflüsse gut mittels GC/MSD bestimmen [Anastassiades 1998]. Die Derivatisierung von Carbendazim erfolgt mit Pentafluorbenzylbromid. Dabei wird auch Thiabendazol umgesetzt. Das Thiabendazol-Derivat zeigt ein erheblich besseres chromatographisches Verhalten als Thiabendazol und lässt sich daher wesentlich empfindlicher bestimmen. In Tabelle 3.2.2-4 werden die im SIM-Modus verwendeten Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen dargestellt. Tab. 3.2.2-4: Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen basischer Verbindungen bei

der GC/MSD Verbindung Quantifizierungsmasse

(m/z) Identifizierungsmassen

(m/z) Thiabendazol 201 174,202,175 Imazalil 215 173,175,217 Fenpropimorph 128 303 Prochloraz 310 308,180,266,268 Thiabendazol-PFB-Derivat 381 383,262 Carbendazim-Bis-PFB-Derivat 551 492,292 GC/MSD Bedingungen: siehe Anlage 1

3.2.2.1.1.3 Messung mittels LC/MS Bequemer und in der Regel problemloser verläuft die Bestimmung dieser Verbindungen mittels HPLC/MS. Eine Derivatisierung ist hierbei nicht erforderlich. Eine sehr hohe Empfindlichkeit wird im API-ES (pos.) Modus erreicht. In Tabelle 3.2.2-5 werden die verwendeten Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen und die jeweils optimalen Einstellungen der Fragmentorspannung dargestellt.



Tab. 3.2.2-5: Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen basischer Verbindungen bei der LC/MSD, API-ES (pos.) Modus

Verbindung Quantifizierungsmassen m/z (Fragmentorspannung [V])

Identifizierungsmassen m/z (Fragmentorspannung [V])

Thiabendazol 202 (100) 131 (180), 175 (150) Carbendazim 160 (130) 192 (50), 105 (170) Imazalil 297 (80) 298 (80), 299 (80) Fenpropimorph 304 (105) 305 (105), 147 (165), 130 (165) Prochloraz 378 (40) 308 (80), 310 (80), 376 (40)

LC/MSD Bedingungen: siehe Anlage 4

In Abbildung 3.2.2-6 wird ein LC/MSD-Chromatogramm einer Mischung dieser Verbind-ungen gezeigt. Die chromatographischen Bedingungen sind in Anlage 4 dargestellt. Im allgemeinen lassen sich basische Pestizide bei der RP-Flüssigkeitschromatographie bei höheren pH-Werte besser chromatographieren. Dennoch wurde hier dasselbe Fließ-mittelgemisch benutzt (5 mmol wässrige Ammoniumacetat-Lösung pH 5,8, Acetonitril) wie auch im Fall der N-Methyl-Carbamate und der Harnstoff-Derivate. Unter diesen Bedingungen zeigten die Pestizide ein gutes chromatographisches Verhalten. Auch Imazalil (pKb 6,58), das bei einem pH von 5,8 auf jeden Fall überwiegend protoniert vorliegen sollte, zeigte hier eine sehr scharfe Peakform. Etwas breitere Peakformen zeigten dagegen die Benzimidazole Thiabendazol und Carbendazim. Abb. 3.2.2-6: LC/MSD-Chromatogramme einiger basischen Pestizide im API-ES (pos.)Modus, Konzentration 0,2 µg/ml, Inj. vol. 3 µl (0,6 ng)

min2 4 6 8 10 12 14

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

3.0

38 3.5

40

9.4

56

9.8

23

13.

206

Im a z a lil m/z 2 9 7

P r o c h lo r a z m/z 3 7 6

C a r b e n d a z imm/z 1 9 2

T h ia b e n d a z o lm/z 2 0 2

Fe n p r o p im o r p hm/z 3 0 4

T a rg e t-Io n s

min2 4 6 8 10 12 14

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

3.0

40

3.5

44

9.4

57

9.8

24

13.

203



C a r b e n d a z imm/z 1 6 0 T h ia b e n d a z o l

m/z 1 7 5

Fe n p r o p im o r p hm/z 1 4 7Q u a lifie r-Io n s

min2 4 6 8 10 12 14

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

3.0

33

13.

201

3.5

40

13.

201

9.4

57

9.8

21

13.

206



C a r b e n d a z imm/z 1 0 5

T h ia b e n d a z o lm/z 1 3 1

Fe n p r o p im o r p hm/z 3 0 5

Q u a lifie r-Io n s



3.2.2 .2 Saure Pest iz ide

Zu den Pestiziden mit sauren Eigenschaften zählen in erster Linie die herbizid und/oder wachstumsregulatorisch wirksamen Phenoxyalkancarbonsäuren. Die ersten Vertreter dieser Verbindungsklasse wurden bereits in den 40ger Jahren ge-zielt als Analoga zu der auxin-wirksamen 3-Indolylessigsäure synthetisiert. In ihrer Wir-kung gleichen sie Pflanzenhormonen und können Stoffwechselstörungen und ein ab-normes Wachstum verursachen, das schließlich zum Tod der Pflanzen führt. Bezüglich ihrer Wirkung zeigen die Phenoxyalkancarbonsäure-Herbizide eine relativ starke Selektivität und werden hauptsächlich zur Bekämpfung von dikotylen Unkräutern im Getreideanbau eingesetzt. Diese Selektivität wird im allgemeinen auf die stärkere Aufnahme dieser Verbindungen durch Dikotyledonen zurückgeführt. Die Verbindungen 2,4-D, MCPA und MCPP (Formeln in Tab. 3.2.2-6) gehören weltweit zu den mengenmäßig am häufigsten verwendeten Pestiziden [Ekström et al. 1990]. In ihrer Eigenschaft als Wachstumsregulatoren werden einige Phenoxyalkancarbon-säuren (2,4-D, 4-CPA, MCPA, Naphthoxyessigsäure) z.B. im Zitrus-, Tomaten- , Erdbeer- und Kernobstanbau eingesetzt. Die Einsatzmengen sind jedoch in diesem Fall gering. Pestizide mit Säuregruppen sind in der Regel gut wasserlöslich und daher systemisch wirksam, d.h. sie dringen z.B. über die Wurzeln in die Pflanzen ein und verteilen sich innerhalb der Assimilatenbahnen über das ganze Pflanzensystem. Um auch eine Auf-nahme über die Blätter, zu ermöglichen werden Phenoxyalkancarbonsäuren oft als Es-ter (z.B. Isopropyl-, Butoxyethyl-) eingesetzt. Diese werden jedoch sehr rasch sowohl innerhalb der Pflanze als auch im Boden zu den freien Säuren hydrolysiert [Roberts et al. 1999]. Zu den wichtigsten Metabolisierungswegen der Phenoxyalkancarbonsäuren zählen die Abspaltung der Seitenketten unter Freisetzung der entsprechenden Phenole sowie Ringhydroxylierungen [Roberts et al. 1999]. Wie in zahlreichen Studien gezeigt wurde, bilden sowohl die Phenoxyalkancarbonsäuren als auch ihre phenolischen Metaboliten innerhalb der Pflanzen Konjugate mit ver-schiedenen Pflanzeninhaltsstoffen, wie Kohlenhydraten, Aminosäuren und Peptiden („gebundene Rückstände“) [Roberts et al. 1999]. Bei Getreide ist darüber hinaus auch mit sog. „eingeschlossenen“ Rückständen zu rechnen. Darunter versteht man Rückstände, die z.B. innerhalb der Stärke-Makromole-küle eingebettet und daher nur schwer zugänglich sind [Gilsbach et al. 1982]. Zur Erfassung gebundener oder eingeschlossener Rückständen sind Aufschlüsse erfor-derlich, durchgeführt als alkalische Hydrolyse (vgl. [Specht et al. 1981] oder als enzy-matische Behandlung mit Amylase und Papain [Gilsbach et al. 1982]. Analytisch bereiten Pestizide mit Säuregruppen einige Schwierigkeiten, da sie beson-dere Extraktionsbedingungen erfordern und gaschromatographisch nicht ohne vor-herige Derivatisierung bestimmt werden können. Sie werden daher mit den gängigen Multimethoden nicht erfasst. Da die bestehenden Einzelbestimmungs-Methoden ar-beitsaufwendig sind, werden die Vertreter dieser Verbindungsklasse in den Untersuchungsanstalten routinemäßig kaum untersucht. Die Entwicklung einer einfachen Methode zur Bestimmung solcher Pestizide ist daher erforderlich. Eine Bestimmungsmethode für 2,4-D-Rückstände in Zitrusfrüchten wurde bereits vorgestellt [Anastassiades 1998] vorgestellt.



In Getreide werden in der Regel nur geringe Gehalte an Phenoxyalkancarbonsäuren gefunden, da die Anwendungen bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Anbaus erfolgen. Die Extraktion diverser Phenoxyalkancarbonsäuren aus Getreideproben und ihre Bestimmung mittels LC/MSD wird im folgenden vorgestellt.

3.2.2.2.1 Bestimmung von Phenoxyalkancarbonsäuren in Getreide

Um die Anwendbarkeit der für Zitrusfrüchte validierten Methode [Anastassiades 1998] auf Getreide-Proben zu überprüfen, wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt. Hierzu wurden drei verschiedene pestizidfreie Getreideproben (Haferflocken, Weizen-mehl Typ E 405, feinzerkleinerte Maiskörner aus der Dose) mit einer Mischung von mehreren Phenoxyalkancarbonsäuren sowie Dicamba (einem weiteren Carbonsäure-Herbizid) dotiert. 3.2.2.2.1.1 Aufarbeitung Die Aufarbeitung der Maisproben erfolgte wie bei den Zitrusproben (siehe Anlage 3, ohne alkalische Hydrolyse). Die Haferflocken und das Mehl wurden wie folgt aufgearbeitet: 5 g Probe wurden in ei-nem 100 ml Becherglas mit der 100 µl der Pestizid-Standardmischung (10 µg/ml Ace-ton) dotiert. Nach dem das Aceton sich verflüchtigt hatte, wurde der Ansatz mit 10 g Wasser und 200 µl 20 %ige Schwefelsäure versetzt und verrührt. Durch Zugabe von Hydromatrix wurde das Gewicht auf 25 g gebracht und intensiv verrührt. 6,5 g dieser Mischung entsprechend 1,3 g Probe wurden in eine Extraktionshülse eingefüllt. 3.2.2.2.1.2 Extraktion Die Extraktion wurde wie in Tabelle 3.2.1-1 beschrieben durchgeführt.

3.2.2.2.1.3 Bestimmung mittels LC/MS Die Bestimmung der Phenoxyalkancarbonsäuren mittels LC/MS kann direkt nach der Extraktion erfolgen. Eine Nachreinigung der SFE-Extrakte ist nicht erforderlich, da die Extrakte eine ausreichende Reinheit besitzen. Die Messung erfolgt im API-ES (neg.) Modus. Die dabei erzielten Wiederfindungen sowie die verwendeten Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen werden in Tabelle 3.2.2-6 aufgeführt.



Tab. 3.2.2-18: Verwendete Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen der Phenoxyalkancarbonsäuren bei der LC/MSD im API-ES (neg.) Modus sowie Wiederfindungsraten aus Weizenmehl, Dotierungslevel 2 mg/kg

Verbindung M Quantifizierungs- Massen (m/z)

(Fragmentorspannung [V])

Identifizierungs- Massen (m/z)

(Fragmentorspannung [V])

Wf. in % n=4

Var. Koeff.

[%] 4-CPA

186 127 (100)

129 (100) 185/187 (60)

99 1,9

2,4-D

220 161 (100)

163/(100) 219/221 (60)

97 1,6

2,4-DB

248 161 (90)

163 (90) 247/249 (80)

96 2,0

2,4-DP

234 233 (50)

235 (50) 161/163 (105)

98 1,9

2,4,5-T

254 195 (115)

197/199 (110) 253/255 (60)

95 2,1

2,4,5-TP

268 267 (40)

269/271 (40) 195/197 (110)

94 2,2

MCPA

200 199 (65)

201 (60-70) 141/143 (105)

99 1,9

MCPB

228 227 (35)

229 (40) 141/143 (80)

100 2,3

MCPP

214 213 (50)

215 (50) 141/143 (105)

96 2,4

Dicamba

220 219 (50) 221 (30) 175/177 (50)

98 1,8

Anmerkung: M = Masse des Moleküls, für die Berechnung wurden folgende Isotope herangezogen: 12C, 35Cl, 1H, 16O

O

CH

CH

O

Cl

O

OH

O

Cl

O

OH

Cl

O

Cl

OH

OCl

O

Cl

OH

CH3

O

Cl

O

OH

Cl

Cl

O

O

OH

3

Cl

Cl

Cl

O

Cl

O

OH

3

Cl

O

Cl

OH

OCH3

O

Cl

O

OH

CH3

CH3

O

OH

OCH3

Cl

Cl



3.2.2 .3 N-Methyl-Carbamate

N-Methyl-Carbamate werden seit Mitte der 50ger Jahre in der Landwirtschaft eingesetzt. Die meisten Vertreter sind Insektizide, einige Verbindungen zeigen jedoch auch akari-zide, nematizide oder molluskizide Wirkung [Perkow et al. 1996, Hassall 1982, Roberts et al. 1999]. Als gemeinsames Strukturmerkmal weisen die Verbindungen dieser Pestizidklasse eine N-Methyl-Carbamat-Gruppe auf:

O

C

O

NHCH3R

Nach der Art des Restes R- werden sie im allgemeinen in zwei Grundtypen unterteilt: o Aryl-Carbamate o Oxim-Carbamate.

Im Vergleich zu den Aryl-Carbamaten weisen die Oxim-Carbamate eine deutlich hö-here Polarität und Wasserlöslichkeit auf. In Abbildung 3.2.2-7 werden die Strukturfor-meln, die Wasserlöslichkeiten sowie die Wirkungsweisen einiger N-Methyl-Carbamate aufgeführt [Wauchope et al. 1992, Perkow et al. 1999, Roberts et al. 1999]. Wegen ihrer vergleichsweise geringen Persistenz in der Umwelt und dem schwachen Bioakkumulationspotential konnten die N-Methyl-Carbamate, zusammen mit den Orga-nophosphorsäureestern, die Organochlorinsektizide, die in den 40iger und 50iger Jah-ren weit verbreitet waren, verdrängen. Eingesetzt werden die N-Methyl-Carbamate so-wohl im Obst- als auch im Gemüse-Anbau. Wegen ihrer vergleichsweise geringen Toxizität und Selektivität und der geringen Ausbildung von Resistenzen werden sie, nach modernen Maßstäben, meist in hohen Dosen appliziert. Wie bei Organophosphorsäureestern basiert die Wirkung der Carbamate auf der Hem-mung von Chlolinesterasen. In ihrer Toxizität für Warmblüter unterscheiden sich die ver-schiedenen Carbamate stark [Roberts et al. 1999, Hassall 1982]. So wurde beispiels-weise die Verbindung Carbaryl (LD50=700 mg/kg KG bei Ratten) früher sogar in Sham-poos verwendet. Andere Vertreter sind toxikologisch bedenklicher, z.B. Carbofuran (LD50=11 mg/kg KG bei Ratten) und die Oxim-Carbamate Aldicarb (LD50=1 mg/kg KG bei Ratten) und Oxamyl (LD50=5 mg/kg KG bei Ratten). Sowohl die Oxim- als auch die Aryl-Carbamate wirken systemisch, d.h. sie weisen eine hohe Mobilität innerhalb des Pflanzensystems auf. Zu den wichtigsten Metabolisierungsreaktionen der N-Methyl-Carbamate in Pflanzen zählen:

die Hydrolyse der Carbamat-Gruppe unter Bildung von Methylamin, Kohlendioxid und des korrespondierenden Phenols bzw. Oxims [Wegler 1970, Roberts et al. 1999], Hydroxylierungen am aromatischen Rest (bei Aryl-Carbamaten) Oxidationen von Thioethergruppen unter Bildung von Sulfoxiden und Sulfonen.

Während in Säugetieren die Carbamat-Gruppe relativ rasch hydrolysiert wird, zeigt sie sich in Pflanzen überraschend beständig. Die Metabolisierung der Aryl-Carbamate in Pflanzen verläuft daher primär über eine Hydroxylierung am Ring und einer anschlie-



ßenden Bildung von Konjugaten [Thier et al. 1986, Roberts et al. 1999]. Einen photo-chemischen Abbau zeigen z.B. die Verbindungen Ethiofencarb [Kopf et al. 1995, Kopf, 1992], Propoxur [Schwack et al. 1992] und Carbaryl [Pramauro 1997]. Dioxacarb nimmt eine Sonderstellung ein, da es über eine hydrolytische Spaltung des cyclischen Acetals, unter Freisetzung Ethylenglykol zu einem Benzaldehyd-Derivat abgebaut wird (siehe auch Kap. 3.2.1.2.4.3). Oxim-Carbamate werden in Pflanzen hauptsächlich durch eine hydrolytische Spaltung der Carbamat-Gruppe unter Freisetzung der korrespondierenden Oxime metabolisiert [Roberts et al. 1999]. Abb. 3.2.2-7: Strukturformeln einiger N-Methyl-Carbamate [Perkow et al. 1999]

CARBOFURAN (0,32g/l)Insektizid und Nemadizid

OC

O

NHCH3

O

ETHIOFENCARB (1,8g/l)Insektizid

OC

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3

NHCH3

O

CO

PROMECARB (0,091g/l)Insektizid

NHCH3

O

CO

N

AMINOCARB (0,92mg/l)Insektizid und Akarizid

NHCH3

O

CO

O

PROPOXUR (1,9g/l)Insektizid

CH3S NHCH3

O

CO

METHIOCARB (0,027g/l)Insektizid und Molluskizid

OC

O

NHCH3

O O

BENDIOCARB (0,26g/l)Insektizid

DIOXACARB (6g/l)Insektizid

OC

O

NHCH3

OO

OXIM-CARBAMATE

ARYL-CARBAMATE

Anmerkung: In Klammern ist die Löslichkeit der Substanzen in Wasser bei 20°C aufgeführt.

CARBARYL (0,12g/l)Insektizid und Nemadizid

NHCH3

O

CO

OXAMYL (280g/l)Insektizid und Nematizid

CS

CN

O

N

CH3

OC

O

NHCH3

METHOMYL (58g/l)Insektizid und Akarizid

CS

H3CN

CH3

OC

O

NHCH3

ALDICARB (9g/l)Insektizid, Nematizid und Akarizid

C NH

H3CS

OC

O

NHCH3



Zu den N-Methyl-Carbamaten werden im weitesten Sinne auch die Verbindungen Fu-rathiocarb, Benfuracarb und Carbosulfan gezählt. Diese drei Verbindungen sind Pro-Pestizide und werden sowohl in der Pflanze, als auch während der Analytik zu dem insektizid wirksamen Carbofuran umgewandelt (siehe Abb. 3.2.2-8). Untersuchungen zur Zersetzung dieser Verbindungen im Verlauf der Analytik wurden bereits in Kapitel 3.2.1.2.4.3 vorgestellt. Ein ähnliches Verhalten zeigt die Verbindung Thiodicarb, die hydrolytisch zu Methomyl umgesetzt wird (siehe Abb. 3.2.2-9) [Roberts et al. 1999]. Abb. 3.2.2-8: Entstehung von Carbofuran aus Benfuracarb, Carbosulfan und Furathiocarb

CARBOFURAN

OC

O

NH

CH3O

BENFURACARB

NSCH

C2H4 COC2H5

O

CH3

CH3

CH3

N

O

CO

O

CARBOSULFAN

FURATHIOCARB

CH3

N

O

CO

CH3

C4H9O

O

CNS

O

CH3

N

O

CO NS

C4H9

C4H9

O

Abb. 3.2.2-9: Entstehung von Methomyl aus Thiodicarb

H3CC

SH3CN

OC

O

N

CH3

SN

CH3

C

O

ON C

CH3

S CH3

H3CC

SH3CN

OC

O

N

CH3

H2 x

THIODICARB METHOMYL

Rechtliche Situation In der Rückstandshöchstmengen-Verordnung finden sich für N-Methyl-Carbamate so-wohl Höchstmengen, die sich nur auf die intakten Wirkstoffe beziehen als auch soge-nannte Summenhöchstmengen, bei denen neben den Muttersubstanzen (Carbamaten) auch einige toxikologisch relevante Umwandlungsprodukte mit berücksichtigt werden. So sind bei Aldicarb, Ethiofencarb und Methiocarb auch deren Oxidationsprodukte, die Sulfoxide und Sulfone, zu berücksichtigen. Bei Carbofuran ist das Metabolisierungs-produkt 3-Hydroxy-Carbofuran und bei Bendiocarb das korrespondierende Phenol, das durch hydrolytische Abspaltung der Carbamat-Gruppe entsteht, zu berücksichtigen. Das Pro-Pestizid Thiodicarb und sein pestizidaktives Hydrolyseprodukt Methomyl besit-zen eine gemeinsame Höchstmenge, die als Methomyl berechnet wird. Im Fall der Pro-Pestizide Furathiocarb, Benfuracarb und Carbosulfan, die sich zu Car-bofuran zersetzen, sieht die Situation anders aus: hier besteht für jede dieser Verbin-



dungen eine individuelle Höchstmenge. Da aber diese Verbindungen leicht zersetzt werden (vgl. Kap. 3.2.1.2.4.3), ist bei der Analytik eine besondere Sorgfalt geboten. Analytik Analytisch bereiteten N-Methyl-Carbamate seither gewisse Schwierigkeiten. Aufgrund der Thermolabilität der Carbamat-Gruppe und der hohen Polarität einiger Vertreter, ist ein GC-Bestimmung nicht ohne weiteres möglich. Da die gängigen Multimethoden eine Bestimmung mittels Gaschromatographie vorsehen, zählen diese Verbindungen in den meisten Laboratorien nicht zu den routinemäßig erfassbaren Stoffen. Vor einer gaschromatographischen Bestimmung müssen N-Methyl-Carbamate zu ther-mostabilen Derivaten umgesetzt werden. In der Literatur werden verschiedene Mög-lichkeiten hierzu beschrieben. Holden [1973] sowie Brauckhoff et al. [1987] beschreiben die Umsetzung der Aryl-Carbamate mit Dinitrofluorbenzol zu den 2,4-Dinitrophenyl-Ether Derivaten der korrespondierenden Phenole. Stan et al. [1991b] beschreiben eine Umsetzung mit Essigsäureanhydrid. Hierbei werden die Carbamate teilweise zu den Acetyl-derivaten der korrespondierenden Phenole umgesetzt und teilweise durch Substitution des Wasserstoffs am Carbamat-Stickstoff unter Erhaltung des Grundgerüstes derivatisiert. Ballesteros et al. [1993] beschreiben eine Umsetzung mit Heptafluorpropionsäureanhydrid. Die meisten in der Literatur beschriebenen Methoden zur Bestimmung der N-Methyl-Carbamate basieren jedoch auf einer flüssigkeitschromatographischen Auftrennung mit Nachsäulen-Derivatisierung und Fluoreszenzdetektion [McGarvey 1993]. Zur Deriva-tisierung werden die N-Methyl-Carbamate mit Lauge hydrolysiert und das dabei ent-stehende Methylamin mit o-Phthalsäure-Anhydrid in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol (OPA/2-Me) zu einem fluoreszierenden Isoindol-Derivat umgesetzt. Dieses wird fluori-metrisch mit hoher Empfindlichkeit detektiert [Blaß et al. 1992, de Kok et al. 1987 und 1990, Moye et al. 1977, Krause 1986]. In der Liste der Stoffe mit analytischen Defiziten des BMG sind neben Landrin (Tri-methacarb) die Oxidationsprodukte von Ethiofencarb, Methiocarb und Aldicarb aufge-führt (Strukturformeln siehe Tab. 3.2.2-7) [BMG 1999].

3.2.2.3.1 Methodenentwicklung

3.2.2.3.1.1 Übersicht In diesem Abschnitt wird die Extraktion der N-Methyl-Carbamate aus Obst- und Gemüseproben und ihre Bestimmung mittels LC/MSD im API-Elektrospray-Modus vorgestellt. Die direkte Bestimmung mittels GC/MSD bei Verwendung eines Kaltaufgabesystems und die Bestimmung mittels GC/MSD nach Derivatisierung mit PFB-Br wurden bereits vorgestellt [Anastassiades 1998]. Abbildung 3.2.2-10 zeigt den Analysengang zur Bestimmung der N-Methyl-Carbamate auf. Eine detaillierte Analysenvorschrift findet sich in Anlage 5.



Abb. 3.2.2-10: SFE-Methode zur Bestimmung der N-Methyl-Carbamate

Feinzerkleinerung der Probe

2,5 Teile der Probe werden intensiv mit 2 Teilen Hydromatrix vermengt

ggf. Zusatz von Phosphatpuffergemisch (pH 6)

ggf. Zusatz von Natrium-Ascorbat als Antioxidants ggf. Zusatz von Salz für Oxamyl

4,5 g des Probe/Hydromatrix-Gemisches (2,5 g Probe) wird

in eine Extraktionshülse eingewogen

Supercritical Fluid Extraction (SFE) Derivatisierung mit

PFB-Br/K2CO3 Bestimmung mittels LC/MS

Bestimmung mittels GC/MSD

3.2.2.3.1.2 Extraktion In ihrer Polarität strecken sich die Vertreter den N-Methyl-Carbamate über einen sehr weiten Bereich. Auf der einen Seite stehen die Aryl-Carbamate mit Wasserlöslichkeiten zwischen 0,03 g/L (Methiocarb) und 6 g/L (Dioxacarb) und auf der anderen die Oxim-Carbamate mit Wasserlöslichkeiten von 9 g/L (Aldicarb), 58 g/L (Methomyl) und 280 g/L (Oxamyl). Sämtliche N-Methyl-O-Aryl-Carbamate sowie Aldicarb befinden sich damit in einem für die SFE günstigen Polaritätsbereich. Die Extraktion dieser Verbindungen aus stark was-serhaltigen Proben wie Obst und Gemüse bereitet demnach prinzipiell keine Probleme. Selbst Methomyl, das unter den Bedingungen herkömmlicher Multimethoden nur unvoll-ständig extrahiert wird, ist mittels SFE auch ohne den Zusatz von Salzen ausreichend gut extrahierbar (vgl. Kap. 3.2.1.2.1). Problematischer ist dagegen die Extraktion von Oxamyl (siehe Kap. 3.2.1.2.1.1). Probleme bereiteten zudem die hydrolyse- und oxidati-onsempfindlichen Vertreter wie Dioxacarb, Benfuracarb, Furathiocarb, Carbosulfan und Ethiofencarb, da sie bei verschiedenen Stufen der Analytik (Aufarbeitung, Lagerung und Extraktion) vor einer Zersetzung geschützt werden müssen. Hierzu ist ggf. eine Puffe-rung oder der Zusatz von Ascorbat notwendig. Ein effektiver Schutz ist auch durch die Einhaltung tiefer Temperaturen möglich. Diese Aspekte wurden bereits in Kapitel 3.2.1.2.4 behandelt. Prinzipiell kann zur Extraktion der Mehrzahl der Carbamat-Pestizide die in Kapitel 3.2.1.1 vorgestellte Multimethode eingesetzt werden. Durch den Zusatz eines Phos-phatpuffers (z.B. pH 6) werden die säureempfindlichen Pestizide Benfuracarb, Furathio-carb und Dioxacarb weitgehend geschützt. Zudem verbessert sich durch die höhere Salzaktivität die Extrahierbarkeit der polaren Verbindungen Methomyl und Oxamyl. Es ist aber stets darauf zu achten, dass durch eine Pufferung die oxidationsempfindlichen Pestizide, insbesondere Ethiofencarb, nicht geschützt werden können. In diesen Fällen wäre der Zusatz von Natrium-Ascorbat angebracht.



3.2.2.3.1.3 Bestimmung mittels LC/MSD Unter den schonenden Bedingungen der Flüssigkeitschromatographie findet kein Ab-bau der N-Methyl-Carbamate statt. Durch den Einsatz der LC/MSD konnte eine sehr empfindliche und selektive Bestimmung dieser Verbindungen erzielt werden. Die Mes-sungen wurden an einem HP 1100 series LC/MSD im API-ES (pos.) Modus durchge-führt (siehe auch Anlage 5). LC/MSD-Einstellungen: LC-Parameter: • Säule: 2,1x 30 mm, 3,5 µ, ZORBAX XDB C-18, • mobile Phasen: A: 5 mM CH3COONH4 in Wasser, B: Methanol/Acetonitril 1:1, • Gradient: 10 %B → 90 % B in 5 min, • Fluss 0,3 ml/min, • Temperatur: 50 °C, • Injektionsvolumen: 0,5-2 µl MSD-Parameter: • API-Elektrospray, • Fragmentorspannung [V] variabel, siehe Tab. 3.2.2-22, • drying gas: Stickstoff 10 L/min, 300 °C Das Fragmentierungsmuster der N-Methyl-Carbamate ist im Vergleich zur GC/MS meist sehr einfach. Als Hauptmasse tritt das protonierte Molekül („Quasi-Molekülion“) auf. Bei höheren Fragmentorspannungen tritt eine vermehrte Bildung der protonierten korres-pondierende Phenole auf. Vereinzelt treten bei einigen Vertretern auch weitere nen-nenswerte Fragmente auf. So entsteht beispielsweise bei Propoxur durch Abspaltung von Propen ein [M-41]+ Fragmention und bei Ethiofencarb durch Spaltung der Thi-oethergruppe ein [M-61]+ Fragment (vgl. Abb. 3.2.2-11).



Abb. 3.2.2-11: Fragmentierung von Ethiofencarb (Vorschlag)

CH3CH2SH

CH2 SCH2CH3

OC

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3

OC

O

N

H

CH3

H

H

H3C N C OM+1

M-61

Ethiofencarb

NHC

OO

CH3CH2

OC

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3

HO

M-56

In Tabelle 3.2.2-7 werden die wichtigsten beobachteten Massen (m/z) der N-Methyl-Carbamate im API-ES (pos.)-Modus aufgeführt. Die zur Quantifizierung und Identifizie-rung verwendeten Massen werden fett aufgeführt. Angegeben sind auch die Frag-mentorspannungen bei denen die jeweiligen Ionen die höchsten Signalintensitäten ge-zeigt haben. Tab. 3.2.2-7: Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen (m/z) der N-Methyl-

Carbamate bei der LC/MS im API-ES (pos.)-Modus

N-Methyl-Carbamat M+1

(Fragmentor-spannung [V])

M-56 (Fragmentor-spannung [V])

M+18 NH4-Addukt (Fragmentor-spannung [V])

M+23 Na-Addukt


weitere Ionen


Aldicarb

191 (30)

-

208 (20)

116 (50)

Aldicarb Sulfon (Aldoxycarb)

223 (65)

166 (100)

240 (30)

245 (100)

CC

HNS

NHCH3

O

CO

H3C O

O

CC

HNS

NHCH3

O

CO

H3C







M+23 Na-Addukt


weitere Ionen


Aldicarb Sulfoxid 207 (40)

-

224 (20)

229 (75)

132 (65)

166 (100)

Aminocarb 209

152

Bendiocarb 224 (50)

167 (90)

241 (15)

109 (90)

Carbanolat

214/216

(50)

157/159

(90)

Carbaryl 202 (50)

145 (90)

219 (70)

224

Carbofuran 222 (50)

165 (90)

123 (140)

Dioxacarb 224 (30)

167 (65)

123 (90)

Ethiofencarb 226 (30)

169 (55)

243 (10)

164 (70) 107 (90)

Ethiofencarb Sulfon -

201 (50)

218 (30) 223 (60) 107 (80)

Ethiofencarb Sulfoxid -

185 (30)

207 (50) 107 (65)

O

Cl

O C

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3

O

CC

HNS

NHCH3

O

COH3C

O

O

N

C

O

NHCH3

O

O

OC

O

NHCH3

OC

O

NHCH3

O

NHCH3

O

CO

OC

O

NHCH3O

O

OC

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3

O C

O

NHCH3

CH2 S

O

O

CH2CH3

OC

NHCH3







M+23 Na-Addukt


weitere Ionen


Fenobucarb 208 (50)

152 (90)

225 (15)

Isoprocarb 194 (60)

137 (80)

152 (90)

Landrin (2,4,5-Trimethacarb)

194 (50)

137 (100)

211 (20)

Methiocarb 226 (50)

169 (90)

121 (110) 107 (110)

Methiocarb Sulfon 258 (70)

201 (100)

218 (25)

122 (100) 107 (110)

Methiocarb Sulfoxid 242 (90)

185 (115)

170 (140) 122 (140) 106 (10)

Methomyl

163 (40)

106 (80)

185 (80)

Metolcarb

166 (50)

109 (100)

183 (10)

Oxamyl

220 (40)

-

237 (10)

242 (80)

Promecarb 208 (50)

151 (100)

225 (10)

109 (100)

OC

O

NHCH3

OC

O

NHCH3

OC

O

NHCH3

OC

O

NHCH3

OC

O

N HCH3

S

O C

O

NHCH3

SO

O

O C

O

NHCH3

SO

OC

O

NHCH3NC

SCH3

H3C

OC

O

NHCH3

OC

O

NHCH3NC

SCH3

C

O

NH3C

CH3







M+23 Na-Addukt


weitere Ionen


Propoxur 210 (25)

153 (70)

227 (10)

168 (70)

111 (100)

Pro-Pestizide Thiodicarb

355 (30)

-

193 (60) 149 (70) 108 (90)

Benfuracarb 411 (50)

-

433 (130)

190 (90)

195 (130)

Furathiocarb

-

405 (150)

252 (110) 195 (130)

Carbosulfan 381 (80)

-

419 (90) K-Addukt

160 (120) 118 (130) 195 (130)

Anmerkung: M = Masse des Moleküls, für die Berechnung wurden folgende Isotope herangezogen: 12C, 35Cl, 1H, 14N, 16O, 32S

OC

O

NHCH3

O

H3CC

SH3CN

OC

O

N

CH3

SN

CH3

C

O

ON C

CH3

S CH3

N

O

CO

SN OCH2CH3

O

O

N

O

CO

O

SN

C

O

O C4H9

N

O

CO

SN

C4H9

C4H9

O

Empfindlichkeit des Verfahrens Durch die API (Atmospheric Pressure Ionisation) Elektrospray-Technik können ohne vorherige Derivatisierung für die N-Methyl-Carbamate Nachweisgrenzen erreicht wer-den, die im Bereich der GC/MSD-Bestimmung liegen. Eine Bestimmung im Bereich von 0,01 ppm ist in der Regel gut möglich. Vorteile der LC/MSD Die Vorteile der LC/MSD-Methode gegenüber den anderen Bestimmungsmethoden las-sen sich wie folgt zusammenfassen: • hohe Selektivität und Empfindlichkeit, • keine Derivatisierung erforderlich, • Erfassung aller N-Methyl-Carbamate (Oxim- und Aryl-), • Erfassung der Pro-Pestizide Benfuracarb, Furathiocarb, Carbosulfan, Thiodicarb, • gleichzeitige Bestimmung der Abbauprodukte möglich (z.B. Sulfoxide und Sulfone) • Schnelligkeit.



3.2.2.3.1.6 Wiederfindungen Es wurden mehrere Wiederfindungsversuche mit verschiedenen Matrizes (Apfel, Oran-gensaft, Traube, Karotte, Blumenkohl) durchgeführt und mit den drei beschriebenen Bestimmungsmethoden untersucht. Die dabei erzielten Wiederfindungsraten lagen unabhängig von der gewählten Bestimmungsmethode in der gleichen Größenordnung. In Abbildung 3.2.2-12 sind die mittels SFE und LC/MSD erzielten Wiederfindungsraten für eine mit 0,167 mg/kg dotierte Traubenmatrix aufgeführt. Im Gegensatz zu den beiden gaschromatographischen Verfahren werden auf diese Weise nicht nur die Aryl- sondern auch die Oxim-Carbamate sowie Benfuracarb, Furathiocarb und Carbosulfan erfasst. Im Vergleich mit den gaschromatographischen Verfahren wiesen die mittels LC/MSD erzielten Ergebnisse von Wiederholbestimmungen die kleinsten Schwankungen auf (Variationskoeffizienten zwischen 1,3 % und 4,8 %, meist im Bereich von 2 %). Die Wiederfindungen für Benfuracarb, Furathiocarb und Carbosulfan sowie das Abbau-verhalten der drei Verbindungen in Abhängigkeit vom pH-Wert wurden bereits in Kapitel 3.2.1.2.4.3 dargestellt. Abb. 3.2.2-12: Wiederfindungen verschiedener Carbamate (LC/MSD API-ES (pos.) Modus), dotierte Matrix Traube, Dotierungslevel 0,167 mg/kg

0 20 40 60 80 100

Carbosulfan

Thiodicarb

Benfuracarb

Furathiocarb

Oxamyl

Aldoxycarb

Methiocarb Sulfoxid

Dioxacarb

Methomyl

Methiocarb Sulfon

Ethiofencarb

Carbanolat

Propoxur

Promecarb

Carbofuran

Metolcarb

Methiocarb

Fenobucarb

Aldicarb

Isoprocarb

Bendiocarb

Aminocarb

Landrin

Carbaryl

Wf. in %



3.2.2.3.1.7 Abbau in der Extraktionshülse Im Gegensatz zu den herkömmlichen Analysenverfahren, bei denen die Proben unmit-telbar nach der Einwaage extrahiert werden, werden bei der SFE die Proben bis zur Extraktion manchmal über mehrere Stunden im Autosampler des SFE-Gerätes bei Raumtemperatur gelagert. Dabei kann es zu einem signifikanten Abbau empfindlicher Verbindungen kommen (vgl. Kap. 3.2.1.2.4). Abbau von Dioxacarb: Dioxacarb weist eine cyclische Acetalgruppe auf (Dioxolanring), die insbesondere säu-rekatalysiert leicht hydrolysierbar ist. Wie in Kapitel 3.2.1.2.4.3 demonstriert wurde, kann diese Verbindung durch eine Erhöhung des pH-Wertes effektiv geschützt werden. Umwandlung zu Carbofuran: Carbosulfan, Benfuracarb und Furathiocarb werden leicht zu Carbofuran abgebaut. Die-ser Abbau erfolgt sowohl in der behandelten Pflanze als auch während der Analyse. Diese Problematik wurde ebenfalls in Kapitel 3.2.1.2.4.3 beschrieben. Dabei stellte sich heraus, dass Carbosulfan und Benfuracarb erst ab einem pH > 6 ausreichend gut ge-schützt werden. Im Gegensatz dazu zeigte Furathiocarb über weite pH-Bereiche eine gute Stabilität. Lediglich bei pH 7 war eine deutliche Zersetzung zu Carbosulfan festzu-stellen (siehe Kap. 3.2.1.2.4.3, Abb. 3.2.1-18) Thiodicarb: Thiodicarb und Methomyl besitzen eine gemeinsame Höchstmenge berechnet als Me-thomyl. Eine Zersetzung von Thiodicarb während der Aufarbeitung ist daher nicht prob-lematisch, solange die Umwandlung zu Methomyl praktisch quantitativ verläuft. In Abbildung 3.2.2-13 wird der Abbau von Thiodicarb zu Methomyl in Traubensaft wäh-rend der Lagerung in Extraktionshülsen bei verschiedenen pH-Werten dargestellt (Dotie-rungslevel 2 mg/kg, Thiodicarb-Lösung frisch hergestellt, Methomyl nicht nachweisbar). Neben den Wiederfindungen von Thiodicarb (dunkle Säule) werden auch die bestimm-ten Gehalte an Methomyl (helle Säulen darüber) berechnet als Thiodicarb dargestellt. Zur Berechnung wurde der Umwandlungsfaktor 1,093 herangezogen.



Abb. 3.2.2-13: Wiederfindung von Thiodicarb in Abhängigkeit von pH-Wert und der Lagerzeit in der Extraktionshülse, Matrix Traubensaft, Dotierungslevel 2 mg/kg

Thiodicarb als Summe Thiodicarb und Methomyl

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7

Methomyl ber. als ThiodicarbThiodicarb

Wf. % 4 h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7


Wf. % 8 h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ph3 ph4 ph5 ph6 ph7


Wf. % 0 h

Betrachtet man die Ergebnisse in Abbildung 3.2.2-13, so ist für Thiodicarb bei allen pH-Werten ein deutlicher Abbau festzustellen. Die höchsten Zersetzungsraten wurden bei pH 7 und pH 3 beobachtet. Am stabilsten zeigte sich Thiodicarb im pH-Bereich 4 bis 5. Dieser Befund deckt sich relativ gut mit Angaben aus der Literatur [Roberts et al. 1999]. Dort wird für Thiodicarb eine hohe Hydrolyse-Empfindlichkeit bei tiefen und hohen pH-Werten und eine höhere Stabilität im pH-Bereich 5 bis 6 angegeben. Betrachtet man die erzielten summarischen Wiederfindungsraten (Methomyl plus Thio-dicarb), so ist bei pH 3 eine sehr starke Abnahme erkennbar. Dies spricht dafür, dass unter sauren Bedingungen die Umwandlungsrate von Thiodicarb zu Methomyl sehr schlecht ist. Dieser Effekt kann nicht auf eine Zersetzung von Methomyl zurückgeführt werden. Nach eigenen Untersuchungsergebnissen, die sich mit Angaben aus der Lite-ratur [Roberts et al. 1999] decken, zeigt Methomyl unter diesen Bedingungen eine sehr gute Stabilität. 3.2.2.3.1.8 Zusammenfassung Mit Hilfe der SFE können N-Methyl-O-Aryl-Carbamate mit sehr guten Ausbeuten extra-hiert werden. Durch Zugabe von Salzen lassen sich auch die höher polaren Vertreter wie Oxamyl und Aldoxycarb sehr gut extrahieren. Zum Schutz von Carbosulfan, Fura-thiocarb, Benfuracarb und Dioxacarb vor hydrolytischer Zersetzung ist bei sauren Pro-ben eine pH-Einstellung erforderlich. Eine Oxidation von Ethiofencarb kann durch Zusatz von Ascorbinsäure unterdrückt werden. Ein ausreichend guter Schutz aller dieser Verbindungen konnte auch durch die Einhaltung niedriger Temperaturen erzielt werden. Die LC/MS bietet zahlreiche Vorteile und ermöglicht eine direkte, schnelle und einfache Bestimmung aller N-Methyl-Carbamate und ihrer Abbauprodukte mit hoher Empfindlichkeit.



3.2.2 .4 Harnstof f -Pest iz ide

Nach den Phosphorsäureestern sind die Harnstoff-Derivate die zahlenmäßig umfang-reichste Pestizidklasse. Sie umfasst Herbizide, Wachstumsregulatoren, Insektizide so-wie ein Fungizid.

Nach der Art der Substituenten an der Harnstoff-Gruppe, lassen sich die meisten Ver-treter in folgende drei Gruppen einteilen (Abb. 3.2.2-36):

den Benzoyl-Harnstoffen (Insektizide), die an einem Stickstoff mit einem Aryl-Rest und am anderen mit einem Benzoyl-Rest substituiert sind, den Phenyl-Harnstoffen (Herbizide), die an einem Stickstoff mit einem Aryl-Rest

und am anderen meist mit zwei Methyl-Gruppen oder mit einer Methyl- und einer Methoxygruppe substituiert sind und den Sulfonyl-Harnstoffen (Herbizide), die am einen Stickstoff mit einem Triazi-

nyl- oder einem Pyrimidinyl-Rest und am anderen mit einem Arylsulfonyl-Rest substituiert sind.

Eine Sonderstellung unter den Harnstoffen nimmt die Verbindung Pencycuron ein. Diese Verbindung ist ein nicht systemisches Fungizid mit protektiver Wirkung. Abb. 3.2.2-14: Einige Vertreter der Harnstoff-Pestizide [Roberts et al. 1999]

Phenyl-Harnstoffe (Herbizide) Heteroaryl-Harnstoffe (Herbizide)

LinuronDiuron

N

S

CH3

HN

H

C

O

N

Benzthiazuron

N

O

C

H

N

Cl

ClCH3

CH3

N

O

C

H

N

Cl

ClCH3

OCH3

N

S

N

CH3

HN

CH3

C

O

NC

CH3

CH3

H3C

Tebuthiuron

Hexaflumuron

Benzoyl-Harnstoffe (Insektizide)

Diflubenzuron Teflubenzuron

F

F

O

CN

O

C

H

N

Cl

H

F

F

O

CN

O

C

H

N

F

Cl

F

Cl

H

F

F

O

CN

O

C

H

NH

O

CF2CHF2

N

O

C

H

NN

N N

O

OS

Cl

OCH3

H3C

HN

O

C

H

NN

N

O

OS

CH2

OCH3

H3CO

H

O COCH3

Chlorsulfuron (Triazinyl-Sulfuron) Bensulfuron-methyl (Pyrimidinyl-Sulfuron)

Sulfonyl-Harnstoffe (Herbizide) Pencycuron (Fungizid)

N

O

C

H

N

Cl

Die insektizide Wirkung der Benzoyl-Harnstoffe wurde in den 70ger Jahren zufällig ent-deckt. Sie basiert auf der Inhibierung der Chitinbiosynthese. Daher sind diese Verbin-dungen besonders im Wachstumsstadium der Insekten wirksam. Eingesetzt werden die Benzoyl-Harnstoffe sowohl im Obst- und Gemüse- als auch im Pilzanbau. Die Benzoyl-Harnstoffe sind hydrolytisch ziemlich stabil und werden in Pflanzen nur langsam metabolisiert. Sie zeigen eine geringe Polarität und sind nicht-systemisch, d.h.



sie haben eine geringe Mobilität innerhalb der Leitungsbahnen der Pflanze [Roberts et al. 1999]. Die herbizide Wirkung der Phenyl-Harnstoffe basiert auf der Verhinderung des Elekt-ronentransfers bei der Photosynthese [Roberts et al. 1999]. Sie werden zur Bekämpfung von verschiedenen einjährigen Unkräutern eingesetzt. In höheren Dosen wirken sie auch gegen mehrjährige Unkräuter. Phenyl-Harnstoffe sind systemisch wirksam und verteilen sich rasch über das gesamte Pflanzensystem. Unter modernen Gesichts-punkten werden diese Verbindungen aufgrund ihrer schwachen Wirksamkeit in relativ hohen Dosen eingesetzt (z.B. Diuron bis zu 4 kg/ha). Sie zählen zu den Pestiziden mit den weltweit höchsten Einsatzmengen [Ekström et al. 1990]. Die wachstumsregulatorische und herbizide Wirkung der Sulfonyl-Harnstoffe ist seit Mitte der 70iger Jahre bekannt. Die herbizide Wirkung beruht auf der Inhibierung der Biosynthese der verzweigten Aminosäuren Leucin, Isoleucin und Valin. Eingesetzt werden sie hauptsächlich im Getreideanbau aber auch im Kartoffel- und Tomatenanbau. Ein wichtiger Vorteil dieser Verbindungsklasse ist die hohe Wirkungs-Effizienz und –Spezifität der einzelnen Vertreter gegen bestimmte Unkräuter. Dies ermöglicht Einsatz geringer Dosen (3 bis 100 g/ha). Die Verbindungen gelten daher, sowohl für die Umwelt als auch für Anwender und Verbraucher, als wenig problematisch [Roberts et al. 1999], da mit Rückständen kaum zu rechnen ist. Analytik Die Analytik der Harnstoff-Derivate bereitete herkömmlich zahlreiche Schwierigkeiten. Dies ist in erster Linie darauf zurückzuführen, dass diese Verbindungen, ähnlich wie die N-Methyl-Carbamate, bei der Gaschromatographie zersetzt werden. In der Literatur sind zahlreiche Bestimmungsmethoden beschrieben, die sich einer Deri-vatisierung zur Erzeugung GC-gängiger Produkte bedienen. Man kann hier zwischen zwei Vorgehensweisen unterscheiden: Es besteht die Möglichkeit, die Harnstoffe zunächst hydrolytisch zu spalten, um an-schließend die Zersetzungsprodukte zu derivatisieren. Zwei auf diesem Prinzip beruhende Verfahren zur Bestimmung von Phenyl-Harnstoffen werden in [DFG S6 und DFG S6A 1991] beschrieben. In beiden Fällen werden die Phenyl-Harnstoff-Pestizide zunächst zu den entsprechenden Anilinen zersetzt. Um eine gaschromatographische Bestimmung zu ermöglichen, werden im ersten Fall die Aniline acetyliert und im zweiten Fall zunächst diazotiert und anschließend iodiert. Auch für Benzoyl-Harnstoffe wird ein ähnliches Verfahren beschrieben [DeMilo et al 1978] hier wurde das Trifluoracetyl-Derivat des gebildeten Anilins erzeugt. Problematisch bei diesen Verfahren ist die Tatsache, dass einige Harnstoff-Derivate zu identischen Derivatisierungsprodukten umgesetzt werden. Diese Verfahren sind daher eher für Screening-Zwecke geeignet. Bei anderen spezifischeren Verfahren bleibt das Grundgerüst der Harnstoffderivate erhalten. Stan et al [1991a] beschreiben die Umsetzung der Phenyl-Harnstoffe mit Heptafluorbuttersäureanhydrid. Hierbei erfolgt eine Substitution des Wasserstoffs am Stickstoff der Harnstoff-Einheit. Klaffenbach et al. [1993] beschreibt die Methylierung von Sulfonyl-Harnstoffen mit Diazomethan. Bei einer Bestimmung der Harnstoff-Derivate mittels flüssigkeitschromatographischer Verfahren bleiben die Wirkstoffe intakt. Bei Verwendung eines UV-Detektors ist jedoch hier eine aufwendige Reinigung der Extrakte erforderlich, da die Empfindlichkeit der



Detektion gering ist und die Harnstoff-Pestizide in der Regel wenig charakteristische Adsorptionsspektren zeigen. Sannino [1998] und Miliadis [1990] beschreiben die Bestimmung von Phenyluronen aus pflanzlichen Proben mittels LC-UV nach Clean-up mit einer Florisil-Säule. Gamón et al. [1998], Hiemstra et al. [1999] und Tsiropoulos et al. [1999] beschreiben die Bestimmung von Benzoyl-Harnstoffen mittels LC/UV nach Aufreinigung der Extrakte an einer Aminopropylphase. Zur Bestimmung der Phenyl-Harnstoffe bietet sich zudem die Möglichkeit einer Bestim-mung mittel HPLC, Nachsäulen-Derivatisierung und Fluoreszenzdetektion [Luchtefeld 1987]. Die oben beschriebenen Verfahren werden wegen ihrer Umständlichkeit kaum in der Routine eingesetzt, so dass die Harnstoff-Derivate zu den Pestiziden mit analytischen Defiziten zählen. In der Prioritätsliste des BMG befinden sich daher insgesamt 11 Ver-treter der Benzoyl- und Phenyl-Harnstoffe sowie 8 Sulfonyl-Harnstoffe [BMG 1999]:

Benzoyl- und Phenyl-Harnstoffe

Benzthiazuron Diflubenzuron Pencycuron Buturon Isoproturon Tribenuron-Methyl Cycluron Metoxuron Triflumuron Difenoxuron Monuron

Sulfonyl-Harnstoffe

Amidosulfuron Primisulfuron Triasulfuron Chlorsulfuron Rimsulfuron Trisulfuron-Methyl Metsulfuron-Methyl Thifensulfuron-Methyl Im Vergleich zu den systemischen Phenyl-Harnstoff-Herbiziden, die Wasserlöslichkeiten zwischen 30-800 mg/L besitzen und damit in einem für die SFE optimalen Polaritätsbe-reich liegen, sind die Benzoyl-Harnstoff-Insektizide wesentlich lipophiler. Sie zeigen Wasserlöslichkeiten zwischen 0,01 und 0,08 mg/L und liegen somit größenordnungs-mäßig im gleichen Polaritätsbereich wie die Pyrethroide. Es ist daher mit einem ähnlichen Einfluss des Wassergehaltes auf die Wiederfindungen zu rechnen (vgl. Kap. 3.2.1.2.3.3). Da die Sulfurone schwache Säuren sind (pKs-Werte zwischen 3,3 und 5,2), hängen ihre Wasserlöslichkeiten stark vom vorliegenden pH-Wert ab. Im folgenden werden Methoden zu Bestimmung der Benzoyl- und Phenyl-Harnstoffe in Obst- und Gemüseproben vorgestellt. Nach einer Extraktion mittels überkritischem Kohlendioxid erfolgt eine direkte Bestimmung mittels LC/MS. Die Möglichkeiten des Einsatzes der GC/MSD für Screening-Zwecke werden ebenfalls dargestellt. Die Sulfonyl-Harnstoff-Herbizide spielen im Obst und Gemüseanbau eine unbedeutende Rolle und wurden daher im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht. Für diese Verbindungen wurden lediglich einige Wiederfindungsversuche durchgeführt, um deren Extrahierbarkeit mittels SFE aufzuzeigen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wer-den am Ende dieses Abschnittes vorgestellt.




3.2.2.4.1.1 Probenaufarbeitung und Extraktion Die Probenaufarbeitung und Extraktion erfolgte auf die gleiche Art und Weise wie bei der in Kapitel 3.2.1.1 vorgestellten Multimethode (Basismethode vgl. Tab. 3.2.1-1). 3.2.2.4.1.2 Bestimmung mittels GC/MS Wie bereits erwähnt, bereiten die Harnstoff-Derivate bei der Gaschromatographie Schwierigkeiten. Ähnlich wie im Fall der N-Methyl-Carbamate erfolgt eine Zersetzung im Injektorbereich. Da dabei zahlreiche Produkte in unterschiedlicher Zusammensetzung entstehen, ist eine genaue Bestimmung der Gehalte der Muttersubstanzen selbst bei Verwendung von Matrixkalibrierungen sehr schwierig. Im Fall der Benzoyl-Harnstoffe wurden als Abbauprodukte Benzoesäureamide, Phenyl-isocyanate, Aniline sowie Benzoesäurenitrile detektiert. Bei der Zersetzung der Phenyl-Harnstoffe wurden dagegen nur Aryl-Isocyanate und Aniline festgestellt. Dieser Sach-verhalt wird in Abbildung 3.2.2-15 veranschaulicht. Abb. 3.2.2-15: Zersetzung der Harnstoff-Derivate während der Gaschromatographie

O

CN

O

C

H

NAr1

HAr2

Ar1 N C O

Ar1 NH2 Ar2C

O

NH2

Benzoyl-Harnstoff

Aryl-Isocyanat-Derivat

Anilin-Derivat

Phenyl-Harnstoff

N

O

C

H

NR2

R1

ArAr NH2 Ar N C O

Ar2 C NBenzoesäurenitril -Derivat

Benzoesäureamid -Derivat

Anilin-Derivat Aryl-Isocyanat-Derivat

Die entstehenden Zersetzungsprodukte können zu Screening-Zwecken genutzt werden und sind zu einem großen Teil charakteristisch für die Muttersubstanzen. Aufgrund der geringen Molekülgröße bereitet die Identifizierung einiger dieser Zersetzungsprodukte jedoch Probleme, da sie zu einem frühen Zeitpunkt eluieren und oft durch zahlreiche Interferenzen gestört werden. In Tabelle 3.2.2-8 werden die MSD-Massen von zahlreichen Harnstoff-Derivaten und de-ren Zersetzungsprodukte dargestellt. Tab. 3.2.2-8: GC/MSD-Daten der Harnstoff-Derivate und ihrer Zersetzungsprodukte



Harnstoff-Pestizid m/z Amide m/z Amine m/z Isocyanate m/z

Phenyl-Harnstoffe (Herbizide)

N,N-Dimethyl-

Chloroxuron

nb

-

-

nb

245 247 182

Chlortoluron

nb

-

-

nb

167 169 166

Difenoxuron

nb

-

-

nb

241 226 170

Dimefuron

nb

-

-

267 269 140 142 105

293 249 166 168 131

Diuron

nb

-

-

nb

187 189 159 161

Fenuron

164 119 72

-

-

nb

119 91 64

Isoproturon

206 191 146

-

-

nb

161 146 128

Metoxuron

nb

-

-

nb

183 185 168 170

Monuron

198 200 72

-

-

nb

153 155 125 90

N-Methyl-N-methoxy-

Chlorbromuron

294 292 204 206

-

-

nb

233 231 235 205

Linuron

248 250 160 162

-

-

nb

187 189 159 161

Metobromuron

258 260 170 172

-

-

nb

197 199 169 171

Monolinuron

214 216 153 126

-

-

nb

153 155 125 90

andere Substituenten

Buturon

236 238 221

-

-

nb

153 155 125 90

Neburon

nb

-

-

nb

187 189 159 161

Cl O NH C

O

NCH3

CH3

Cl O NH2 Cl O NCO

Cl

Cl

NH2NH C

O

NCH3

CH3

Cl

Cl

O NH C

O

NCH3

CH3

OH3C

Cl NCO

Cl

Cl NH2

Cl

NH C

O

NCH3

CH2CH2CH2CH3

Cl

Cl

Cl NCOCl NH2NH C

O

NCH3

CH C CHCH3

Cl

Cl NCOCl NH2NH C

O

NCH3

O CH3

Cl

Br NCOBr NH2NH C

O

NCH3

O CH3

Br

NH C

O

NCH3

O CH3

Cl

Cl

Cl NH2

Cl

Cl NCO

Cl

Br

C l

N C OBr

C l

NH2NH C

O

NCH3

O CH3

Br

Cl

Cl NCOCl NH2NH C

O

NCH3

CH3

Cl

NH C

O

NCH3

CH3

Cl

OCH3

Cl

OCH3 NH2

Cl

OCH3 NCO

CHCH3

CH3

NCOCHCH3

CH3

NH2NH C

O

NCH3

CH3

CHCH3

CH3

NCO

Cl

Cl

NCOCl

Cl

NH2

NH2NH C

O

NCH3

CH3

NH C

O

NCH3

CH3

Cl

Cl

O NH2OH3C O NCOOH3C

N N

O O

C l NH C

O

NC H3

C H3

N N

O O

Cl NH2

N N

O O

Cl NCO

Cl

Cl

NCO



Harnstoff-Pestizid m/z Amide m/z Amine m/z Isocyanate m/z

Pencycuron (Fungizid)

nb

209 209 211 211 180 180 182 182

119 119 91 91 64 64

Siduron

232 120 93 77

-

-

nb

119 91 64

Thidiazuron

(Wachstumsregulator)

nb

-

93 66

nb

119 91 64

nb

Heteroaryl-Harnstoffe (Herbizide)

Benzthiazuron

nb

150 123 96

nb

Ethidimuron

nb

-

-

207 142 115 74

-

-

Methabenzthiazuron

nb

-

-

164 163 136 135

-

-

Tebuthiuron

nb

-

-

171 156 88

-

-

Thiazafluron

nb

-

-

183 164 113

-

-

Cycluron (Herbizid)

Cycluron

198 127 89 72

152 125 110 97


Chlorfluazuron

nb

157 141 113

321 323 347 354

247 249 383 363

Diflubenzuron

nb

157 141 113

153 155 125 90

Fluazuron

nb

157 141 113

287 289 270

313 315

Flufenoxuron

nb

157 141 113

305 307 126 286

331 333 268 227

Hexaflumuron

nb

157 141 113

277 279 176 178

303 305 202 204

ClN C

O

NHCl

N

H

F

F

C NH C NH

O OO

N

Cl

CF3Cl

F

F

C NH2

O

H2N O

N

Cl

CF3Cl

OCN O

N

Cl

CF3Cl

C

O

NH C

O

NH

F

F

O

F Cl

CF3H2N O

F Cl

CF3 OCN O

F Cl

CF3

C

O

NH C

O

NH

F

F

OCF2CHF2

Cl

Cl

OCF2CHF2

Cl

Cl

H2N

F

F

C NH2

O

F

F

C NH2

OOCF2CHF2

Cl

Cl

OCN

C

O

NH C

O

NH

F

F

O CF3

ClCl

ClC

O

F

F

NH2H2N O CF3

ClCl

Cl

OCN O CF3

ClCl

Cl

F

F

C

O

NH C

O

NH Cl

F

F

C

O

NH2ClOCNClH2N

N C ONH2

NH C

O

NCH3

CH3

N N

SF3C NHCH3

N N

SF3C N C

CH3

O

NH CH3

NN

SN

CH3

C

O

NH CH3

NN

SN HCH3

N

SNHCH3

N

SN C NH CH3

CH3

O

NN

SNHS

O

CH3CH2

O

CH3

NN

SN

CH3

C

O

NH CH3S

O

CH3CH2

O

N

SNCO

N

SNH2

N

SNH C

O

NH CH3

NCO

OCNN

NS

NCO

H2NN

NS

NH2NH C

O

NHN

NS

Cl NH2Cl NH C

O

NH

H3C

NCO



Harnstoff- m/z Amide m/z Amine Pestizid m/z Isocyanate m/z

Lufenuron

nb

157 141 113

357

327 -

Teflubenzuron

nb

157 141 113

197 199 201 135

223 225 195 160

Triflumuron

-

155 157 139 141

-

-

Anmerkung: für die Berechnung wurden folgende Isotope herangezogen: 79Br, 12C, 35Cl, 19F, 1H, 14N, 16O, 32S,

C

O

NH C

O

NH

F

F

OCF2CF2CF3

Cl

Cl

H2N OCF2CF2CF3

Cl

Cl

OCN OCF2CF2CF3

Cl

Cl

C

O

NH C

O

NH

F Cl

ClF

F

F

F

F

C NH2

O

F

F

C NH2

OOCN

F

F

Cl

Cl

H2N

F

F

Cl

Cl

C

O

NH C

O

NH

Cl

OCF3C

OCl

NH2 H2N OCF3 OCN OCF3

3.2.2.4.1.3 Bestimmung mittels LC/MS Sowohl die Benzoyl-Harnstoffe als auch die Phenyl-Harnstoffe lassen sich gut mittels LC/MS bestimmen. Auf Grund der hohen Selektivität der Messung ist ein Clean-up der SFE-Extrakte nicht erforderlich. Die Phenyl-Harnstoffe lassen sich im Gegensatz zu den Benzoyl-Harnstoffen sehr emp-findlich im API-ES (pos.) Modus detektieren. Eine wesentlich bessere Empfindlichkeit für die Benzoyl-Harnstoffe wurde im APCI (neg.) Modus erreicht. In Tabelle 3.2.2-9 werden die wichtigsten LC/MS Massen (m/z) der Harnstoff-Derivate im API-ES (pos.) Modus aufgeführt. Tab. 3.2.2-9: Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen (m/z) für Harnstoff- Pestizide bei der LC/MS im API-ES (pos.) Modus

Harnstoff-Pestizid

M Target (m/z) (Fragmentorspannung [V])

Qualifier (m/z) (Fragmentorspannung [V])

Bemerkung

Phenyl-Harnstoffe (Herbizide)

N,N-Dimethyl-

Chloroxuron

290 291 (85)

293 (85) 72 (140)

Chlortoluron

212 213 (70) 215 (70) 72 (120)

Difenoxuron

286 287 (90) 309 (110) 123 (140) 72 (150)

Na-Addukt

Dimefuron

338 339 (110) 341 (110) 167 (150) 72 (150)

Diuron

232 233 (75) 235 (75) 72 (130)

Fenuron

164 165 (60) 72 (120) NH C

O

NC H3

C H3

Cl O NH C

O

NCH3

CH3

NH C

O

NCH3

CH3

Cl

Cl

O NH C

O

NCH3

CH3

OH3C

N N

O O

C l NH C

O

NC H3

C H3

NH C

O

NCH3

CH3

Cl

Cl



Harnstoff-Pestizid



Bemerkung

Fluometuron

232 233 (80) 72 (120)

Isoproturon

206 207 (80) 165 (130) 72 (130)

Metoxuron

228 229 (70) 231 (70) 72 (120)

Monuron

198 199 (60) 201 (60) 72 (110)

N-Methyl-N-methoxy-

Chlorbromuron

292 293 (80) 295/297 (80) 206/208 (130)

Linuron

248 249 (70) 251 (70) 160 (120)

Metobromuron

258 259 (65) 261 (65) 171 (120) 172 (120)

Monolinuron

214 215 (50) 217 (50) 126 (100)

andere Substituenten am Stickstoff

Buturon

236 237 (75) 239 (75) 84 (120)

Neburon

274 275 (80) 277 (80) 88 (140)

Pencycuron

328 125 (150) 329 (110) 331 (110)

Siduron

232 233 (100) 137 (160) 94 (160)

Thidiazuron

220 221 (60) 102 (100) 243 (80)

Na-Addukt

Heteroaryl-Harnstoffe (Herbizide)

Benzthiazuron

207 151 (120) 208 (60)

Ethidimuron

264 265 (60) 208 (110)

Methabenzthiazuron

221 165 (110) 222 (65)

Tebuthiuron

228 229 (80) 172 (120) 251

Na-Addukt

NN

SN

CH3

C

O

NH CH3

NH C

O

NCH3

CH3

F3C

NH C

O

NCH3

CH3

CHCH3

CH3

NH C

O

NCH3

CH3

Cl

OCH3

NH C

O

NCH3

CH3

Cl

NH C

O

NCH3

O CH3

Br

Cl

NH C

O

NCH3

O CH3

Cl

Cl

NH C

O

NCH3

O CH3

Br

NH C

O

NCH3

O CH3

Cl

NH C

O

NCH3

CH C CHCH3

Cl

NH C

O

NCH3

CH2CH2CH2CH3

Cl

Cl

ClN C

O

NH

Cl NH C

O

NH

H3C

NH C

O

NHN

NS

N

SNH C

O

NH CH3

NN

SN

CH3

C

O

NH CH3S

O

CH3CH2

O

N

SN C NH CH3

CH3

O



Harnstoff-Pestizid



Bemerkung

Thiazafluron

240 184 (110) 241 (50) 74 (160)

Cycluron (Herbizid)

Cycluron

198 199 (90) 89 (120) 397 (50) 221 (60)

Anmerkung: M = Masse des Moleküls, für die Berechnung wurden folgende Isotope herangezogen: 79Br, 12C, 35Cl, 19F, 1H, 14N, 16O, 32S

N N

SF3C N C

CH3

O

NH CH3

NH C

O

NCH3

CH3

Die Massenspektren der Harnstoff-Derivate zeigen nur wenige brauchbare Ionen. Die protonierten Moleküle ([M+H]+) wiesen in der Regel die höchste Intensität auf. Zur Iden-tifizierung konnten in vielen Fällen die entsprechenden 37Cl-Isotop-Ionen sowie ver-schiedene Fragment-Ionen, die bei höheren Fragmentorspannungen entstehen, heran-gezogen werden. In Abbildung 3.2.2-16 werden LC/MS-API-ES-Chromatogramme einer Mischung von einigen Vertretern dieser Verbindungsklasse dargestellt. Die Massenspuren der Quantifizierungs- und Identifizierungs-Ionen (Target- und Qualifier-Ions) werden separat dargestellt. In jeder Darstellung sind die entsprechenden Massenspuren der einzelnen Verbindungen übereinander gelegt.



Abb. 3.2.2-16: LC/MS-Chromatogramme einiger Harnstoff-Pestizide, API-ES (pos.) Modus, 0,2 µg/ml-Lösung, Injektionsvolumen 5 µl

min5 6 7 8 9 10

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

Ne bur onm/z 275

M e toxur onm/z 229

Chloroxur onm/z 291

L inur onm/z 249

Is o -p ro tur on

m/z 207

Butur onm/z 237

Te buth iu ronm/z 229

M e tabe nz th iazuronm/z 165

T arge t Ions

min5 6 7 8 9 10

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000Ne bur onm/z 277

M e toxur onm/z 231

Chlor oxuronm/z 293

L inur onm/z 251

Is opr otu ronm/z 165

Butur onm/z 239

Te buth iu ronm/z 172

M e tabe nz -th iazur on

m/z 222

Q ualifie r Ions

Die im APCI (neg.) Modus aufgenommenen Spektren der Benzoyl-Harnstoffe wiesen eine Vielzahl von Massen mit hohen relativen Intensitäten auf. Dadurch wird eine hohe Selektivität bei der Messung gewährleistet. Die durch Deprotonierung der Moleküle ent-standenen Anionen [M-H]- waren in der Regel am stärksten vertreten. Ebenfalls stark vertreten waren die aus diesen Anionen durch Abspaltung von Flusssäure entstandenen Ionen [M-H-HF]- und [M-H-HF-HF]-. Daneben traten durch Anlagerung von Chlorid auch die [M+35]—Massen auf. Diese wurden jedoch aufgrund schwankender relativer Intensitäten nicht für Berechnungen herangezogen. Die Massen der Benzoyl-Harnstoffe sind in Tabelle 3.2.2-10 dargestellt.



Tab. 3.2.2-10: Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen (m/z) für Harnstoff- Pestizide bei der LC/MS im APCI (neg.) Modus

Harnstoff-Pestizid

M Target (Fragmentorspannung [V])

Qualifier (Fragmentorspannung [V])

Bemerkung


Diflubenzuron

310 309 311 (80) 345 / 347 (45)

289 / 291 (100) 156 (110)

[M-H]- [M+Cl]-

Fluazuron

505 504 (80) 506 (80) 540 / 542 (40)

305 / 307 (110) 156 (120)

484 / 486 (120)

[M-H]- [M+Cl]-

[M-H-HF]-

Flufenoxuron

488 487 (100) 489 (100) 467 / 469 (100) 523 / 525 (40)

447 / 449 (130)

[M-H]- [M-H-HF]-

[M+Cl]- [M-H-HF-HF]-

Hexaflumuron

460 439 (100) 441 (100) 459 / 461 (80) 495 / 497 (40)

156 (110)

[M-H-HF]- [M-H]- [M+Cl]-

Lufenuron

510 509 511 489 / 491 339 / 341

[M-H]- [M-H-HF]-

Teflubenzuron

380 379 (80)

381 (80) 339 / 341 (100) 359 / 361 (80)

196 / 198 (120) 156 (110)

415 / 417 (40)

[M-H]- [M-H-HF-HF]-

[M-H-HF]-

[M+Cl]-

Triflumuron

358 357 (70) 359 (70) 393 / 395 (30) 154 /156 (110)

176 (120)

[M-H]- [M+Cl]-

Anmerkung: M = Masse des Moleküls, für die Berechnung wurden folgende Isotope herangezogen: 12C, 35Cl, 19F, 1H, 14N, 16O, 32S,

C

O

NH C

O

NH

F

F

OCF2CF2CF3

Cl

Cl

C

O

NH C

O

NH

F

F

O

F Cl

CF3

F

F

C

O

NH C

O

NH Cl

C

O

NH C

O

NH

F

F

OCF2CHF2

Cl

Cl

F

F

C NH C NH

O OO

N

Cl

CF3Cl

C

O

NH C

O

NH

F Cl

ClF

F

F

C

O

NH C

O

NH

Cl

OCF3

3.2.2.4.1.4 Wiederfindungsversuche Phenyl-Harnstoffe und sonstige Harnstoffe: Für die Wiederfindungsversuche wurden drei Standard-Mischungen der Harnstoff-Deri-vate verwendet (Konzentration je 10 µg/ml in Aceton). Zur Dotierung wurde Apfelmatrix sowie Traubensaft verwendet. Je 2,5 g Probenmatrix wurden mit 100 µl einer der Stan-dard-Mischungen dotiert. Die erzielten Wiederfindungsraten lagen bei beiden Matrices in der gleichen Größenordnung. Die relativen Standardabweichungen lagen bei n=5 sehr niedrig im Bereich 1,5-2,6 %, was für die gute Reproduzierbarkeit sowohl des Ex-traktionsschrittes als auch der Messung spricht. In Abbildung 3.2.2-17 und 3.2.2-18 werden die erzielten Wiederfindungsraten aus dotiertem Apfel dargestellt.



Abb. 3.2.2-17: Mittlere Wiederfindungsraten für Phenyl-Harnstoffe aus dotierter Apfelmatrix, Dotierungslevel 1 µg/Ansatz (entsprechend 0,4 mg/kg)

98

95

99

99

100

96

100

93

99

98

99

100

100

100

92

101

0 20 40 60 80 100

Buturon

Chlorbromuron

Chloroxuron

Chlortoluron

Difenoxuron

Dimefuron

Diuron

Fluometuron

Isoproturon

Linuron

Metobromuron

Metoxuron

Monolinuron

Monuron

Neburon

Siduron

Wf. %

Abb. 3.2.2-18: Mittlere Wiederfindungsraten für sonstige Harnstoffe aus dotierter Apfelmatrix, Dotierungslevel 1 µg/Ansatz (entsprechend 0,4 mg/kg)

93

101

23

99

91

99

101

0 20 40 60 80 100

Benzthiazuron

Cycluron

Ethidimuron

Methabenzthiazuron

Pencycuron

Tebuthiuron

Thiazafluron

Wf. %

Mit Ausnahme von Ethidimuron konnten alle Verbindungen praktisch quantitativ extra-hiert werden. Ähnlich wie im Fall der basischen Pestizide (vgl. Kap.3.2.2.1.1) konnten die Wiederfindungen durch eine verlängerte Extraktionszeit (Zweifachextraktion) und die



Verwendung von Edelstahlkugeln als Fallenmaterial auf 59 % verbessert werden. Ethi-dimuron, das in seiner Molekülstruktur einen Thiadiazol-Ring besitzt, scheint eine aus-geprägte Neigung zu haben, mit Oberflächen in Wechselwirkungen zu treten. Benzoyl-Harnstoffe: Die Ergebnisse der Wiederfindungsversuche für die Benzoyl-Harnstoffe werden in Abbildung 3.2.2-41 dargestellt. Untersucht wurden auch die Auswirkungen des Probe/ Hydromatrix-Mischungsverhältnisses auf die Wiederfindungsraten. Dabei sollten Paralle-len zu den ebenfalls schwerlöslichen Pyrethroiden festgestellt werden (vgl. Kap. 3.2.1.2.3.3). Die bei diesem Versuch erzielten Wiederfindungen werden in Abbildung 3.2.2-19 dargestellt. Es wird deutlich, dass auch bei den Benzoyl-Harnstoffen die Extraktionsausbeute in Ab-hängigkeit vom Gehalt an freiem Wasser variiert. Wie bei den Pyrethroiden ist die Ex-traktionsausbeute bei einem höheren Hydromatrix-Anteil besser. Allerdings ist dieser Effekt nur bei Lufenuron und Flufenoxuron ausgeprägt. Abb. 3.2.2-19: Mittlere Wiederfindungsraten für Benzoyl-Harnstoffe aus dotierter Apfelmatrix, Dotierungslevel 1 µg/Ansatz (entsprechend 0,4 mg/kg)

1,75 2 2,5 3

Lufe

nuro

n

Fluf

enox

uron

Hexa

flum

uron

Teflu

benz

uron

Diflu

benu

ron

Trifl

umur

on

0

20

40

60

80

100

Wf. %

Alle Proben wurden mit je 2g Hydromatrix vermengt

Probenmenge [g]

3.2.2.4.1.5 Sulfonyl-Harnstoff-Herbizide Auch für die Sulfonyl-Harnstoffe Amidosulfuron, Chlorsulfuron, Metsulfuron-Methyl, Pri-misulfuron Rimsulfuron, Thifensulfuron-Methyl, Triasulfuron und Triflusulfuron-Methyl wurden vom BMG [1999] analytische Defizite festgestellt. Für sechs, der in der BMG-Defizitliste aufgeführten Stoffe dieser Gruppe wurden Wiederfindungsversuche durch-geführt. Die Verbindungen Rimsulfuron und Triflusulfuron-Methyl konnten bis zur Durchführung der hier vorgestellten Untersuchungen noch nicht käuflich erworben werden.



Analytik: Aufarbeitung und Extraktion erfolgten auch bei den Sulfonyl-Harnstoffen nach den in Kapitel 3.2.1.1 vorgestellten Bedingungen. Die Bestimmung erfolgte mittels LC/MS im API-ES (pos.)-Modus. In Tabelle 3.2.2-11 sind die verwendeten Identifizierungs- und Quantifizierungsmassen (m/z) sowie die je-weils günstigsten Fragmentorspannungen dargestellt. Tab.: 3.2.2-11: Identifizierungs- und Quantifizierungsmassen (m/z) für einige Sulfonyl-Harnstoffe bei der LC/MS im API-ES (pos.) Modus

Harnstoff-Pestizid M Target (m/z)

(Fragmentorspannung [V])Qualifier (m/z)

(Fragmentorspannung [V]) BemerkungAmidosulfuron

369 370 (70) 261 (110) 218 (130) 392 (110)

Na-Addukt

Bensulfuron-Methyl

410 411 (90) 182 (130) 149 (130) 433 (120)

Na-Addukt

Chlorsulfuron

357 358 (80) 360 (80) 167 (130) 141 (120)

380/382 (120)

Na-Addukt

Metsulfuron-Methyl

381 382 (80) 167 (120) 404 (120)

Na-Addukt

Primisulfuron

468 469 (90) 254 (130) 264 (130) 491 (110)

Na-Addukt

Prosulfuron

419 420 (90) 167 (130) 144 (130) 442 (120)

Na-Addukt

Thifensulfuron-Methyl

387 388 (70) 167 (110) 410 (120)

Na-Addukt

NH

NH

NH

NH

N

N

OCH3

OCH3

C

O

NHS

O

O

C

O

OCH3

CH3

H3C

O

O

S

O

ONS

NH

O

C

OCH3

OCH3

N

N

NHN

NN

CH3

OCH3

C

O

NHS

O

O

Cl

NN

N

CH3

OCH3

C

O

NHS

O

O

C O

OCH3

NHN

N

OCHF2

OCHF2

C

O

NHS

O

O

C O

OCH3

NN

N

CH3

OCH3

C

O

NHS

O

O

CF3

NHN

NN

CH3

OCH3

C

O

NHS

O

O

SC O

OCH3



Harnstoff-Pestizid M Target (m/z) (Fragmentorspannung [V])

Qualifier (m/z) (Fragmentorspannung [V]) Bemerkung

Triasulfuron

401 402 (90) 404 (90) 167 (120) 141 (130)

424/426 (120)

Na-Addukt

Anmerkung: M = Masse des Moleküls, für die Berechnung wurden folgende Isotope herangezogen: 12C, 35Cl, 19F, 1H, 14N, 16O, 32S,

NHN

NN

CH3

OCH3

C

O

NHS

O

O

O

CH2Cl

Wiederfindungsversuche: Es wurde lediglich drei Wiederfindungsversuche auf Kiwi-Matrix durchgeführt. Hierzu wurden je 2,5 g Kiwi mit 100 µl einer Standard-Mischung (10 µg/ml Aceton) versetzt und wie in Kapitel 3.2.1.1 beschrieben weiter verfahren. Die ermittelten Wiederfindungsraten sind in Abbildung 3.2.2-20 dargestellt. Mit Ausnahme von Primisulfuron und Amidosulfuron wurden für alle Verbindungen mitt-lere Wiederfindungsraten von über 70 % ermittelt. Die relativen Standardabweichungen der Wiederfindungsraten waren für alle Verbindungen außer Primisulfuron gering. Bei einem Lagerungsversuch der Extraktionshülsen bei Raumtemperatur war selbst nach 8 Stunden kein signifikanter Abbau dieser Verbindungen festzustellen. Abb. 3.2.2-20: Wiederfindungsraten für einige Sulfonyl-Harnstoffe aus Kiwi-Matrix Dotierungslevel 0,4 mg/kg

46

64

74

79

84

88

89

97

0 20 40 60 80 100

Primisulfuron

Amidosulfuron

Bensulfuron-Methyl

Prosulfuron

Metsulfuron-Methyl

Chlorsulfuron

Thifensulfuron-Methyl

Triasulfuron

Wf. %



3.2.2 .5 Organozinn-Pest iz ide

Die toxische Wirkung von Organozinn-Verbindungen gegen verschiedene Organismen ist lange bekannt [Bock 1981]. Einen Durchbruch, was die praktische Anwendung von Organozinn-Verbindungen anbelangt, brachten die Arbeiten von van der Kerk et al. [1954], der die fungizide Wirkung dieser Verbindungen in Abhängigkeit von der Anzahl und Art der Zinn-Liganden systematisch untersuchte. Trotz der hohen Wirksamkeit ge-gen Schimmelpilze schien jedoch ein landwirtschaftlicher Einsatz dieser Verbindungen anfänglich nicht praktikabel, da Organozinn-Verbindungen eine hohe Phytotoxizität aufwiesen. Diese Schwierigkeit wurde mit der Entwicklung von Triphenylzinn-Acetat (Handelsname „Brestan“), das eine hohe fungizide Wirkung mit einer geringen Phyto-toxizität kombiniert, beseitigt [Bock 1981]. Es folgten mit der Entwicklung von Cyhexatin und Fenbutatinoxid zwei akarizid wirksame Verbindungen. In Abbildung 3.2.2-21 werden die Strukturformeln der wichtigsten Organozinn-Pestizide aufgeführt. Abb. 3.2.2-21: Strukturformeln der Organozinn-Pestizide Fentin ist ein nicht-systemisches Fungizid mit protektiver und kurativer Wirkung. Zu den wichtigsten Einsatzgebieten zählt der Kartoffelanbau. Hier wird es sowohl im Frühling als auch im Herbst gegen die von Alternaria- und Phytophthora-Arten verursachten Mykosen, oft in Kombination mit Dithiocarbamaten, eingesetzt.

Sn

OH

Cyhexatin Azocyclotin

Sn

NN

NFentinhydroxid (X=-OH)Fentinchlorid (X= -Cl) Fentinacetat (X= -OCOCH3)

Sn

X

Fenbutatinoxid

CH2

Sn

CH2

O

CH2

Sn

CH2

CH2 CH2

Einige weitere Einsatzgebiete in Europa sind der Zuckerrüben-, Sellerie-, Karotten-, Zwiebel- sowie der Hopfenanbau. In tropischen Ländern wird Fentin verbreitet im Kaf-fee-, Kakao-, Bananen- und Reisanbau verwendet.



Neben dem Hauptanwendungsgebiet als Fungizid wird Fentin als Antifraßmittel gegen blattfressende Larven im Kartoffel-, Rüben- und Sellerieanbau, sowie zur Bekämpfung von Schnecken und Algen im Reisanbau und in Sellerie-Wasserkulturen benutzt. Dar-über hinaus besitzt Fentin auch eine akarizide Wirkung, jedoch wird es zumindest in Europa auf diesem Gebiet nicht eingesetzt [Bock 1981]. In der Landwirtschaft wird Fentin in drei verschiedenen Anwendungsformen eingesetzt, als Fentinacetat, Fentinhydroxid und Fentinchlorid, wobei die beiden erstgenannten Formen die größte Bedeutung haben. Die Bindung des zentralen Zinnatoms zum Hydroxid und Acetat hat einen überwiegend ionischen Charakter, was auf der guten Stabilisierung der positiven Ladung am Zinn durch die drei Phenylreste beruht. In wässrigen Lösungen erfolgt daher eine Dissozia-tion der Fentinsalze zu dem Fentin-Kation und dem jeweiligen Gegenion [vgl. Jansen et al. 1962]. Die in der Rückstands-Höchstmengenverordnung aufgeführte Höchstmenge für Fentin bezieht sich daher auf das Fentin-Kation [Beck, RHmV]. In Böden sowie in Pflanzen wird Fentin unter sukzessiver Abspaltung von Benzen zu Diphenyl-Zinn (Ph2Sn2+) und Monophenyl-Zinn (PhSn3+) metabolisiert. Durch An-lagerung von Hydroxid-Ionen und Wasserabspaltung entstehen daraus Diphenyl-zinnoxid (Ph2SnO) sowie Phenylzinnsäure (PhSnOOH) [Roberts et al. 1999, Bock 1981] Da Organozinn-Verbindungen dazu neigen, mit nucleophilen Liganden in Wechselwir-kung zu treten, werden sie durch verschiedene organische Liganden komplexiert. So bindet Fentin an Huminstoffe in Böden und Gewässern. Die Trialkyl-Zinn-Verbindungen Azocyclotin, Cyhexatin und Fenbutatinoxid werden als nicht systemische Akarizide mit Kontaktwirkung, sowohl im Obst- als auch im Gemüse-anbau, eingesetzt. Ihre Wirkung erstreckt sich gegen alle beweglichen Entwicklungs-stadien der Spinnmilben [Roberts et al. 1999, Perkow et al. 1999]. Cyhexatin (Tricyclohexylzinn-hydroxid) wurde 1968 zum ersten Mal unter dem Handels-namen Plictran auf den Markt gebracht und wird v.a. im Obstanbau (u.a. im Beeren- Stein- und Kernobst) eingesetzt. Im Gegensatz zu Fentinhydroxid besitzt die Bindung vom Zinnatom zum Sauerstoff bei Cyhexatin einen stark kovalenten Charakter. Die Metabolisierung des Cyhexatin in Pflanzen erfolgt relativ langsam unter Bildung von Dicyclohexylzinnoxid. Wie auch Fen-tin zeigt Cyhexatin eine Neigung zu Adsorptionen an Sedimente [Roberts et al. 1999]. Azocyclotin hydrolysiert in wässrigen Lösungen und auf Pflanzen unter Abspaltung von 1,2,4-Triazol schnell zu Cyhexatin [Roberts et al. 1999]. Der Gesetzgeber sieht daher für diese beiden Verbindungen eine gemeinsame Höchstmenge vor, die als Cyhexatin angegeben wird. In Lebensmitteln ist aufgrund der hohen Hydrolyseanfälligkeit von Azocyclotin nicht mit intakten Rückständen dieser Verbindung zu rechnen. Fenbutatinoxid wird häufig zur Bekämpfung der Roten Spinnmilbe u.a. beim Zitrus-, Kernobst-, Bananen- und Erdbeeranbau eingesetzt. Es ist recht stabil gegen Hydrolyse und wird sowohl in Pflanzen als auch im Tieren nur sehr langsam metabolisiert. In Böden zeigt Fenbutatinoxid eine starke Tendenz sich an kationische Oberflächen und organische Bestandteile zu adsorbieren [Roberts et al. 1999, Gray et al. 1995]. Auch in anderen Bereichen finden verschiedene Organozinn-Verbindungen eine breite Verwendung. So werden z.B. die Verbindungen Mono-, Di- und Tributylzinn in der



Kunststoffindustrie als Hitzestabilisatoren bei der Synthese von PVC bis zu 5 % einge-setzt. Ein weiterer Einsatzbereich von Organozinn-Verbindungen, der zu Kontaminationen von Lebensmitteln und der Umwelt führt, ist die Schifffahrt. Hier werden die Schiffsrümpfe zur Eindämmung des Algenbewuchses mit sog. „Antifouling-Farben“ gestrichen, in de-nen Tributylzinn (bis zu 20 %) sowie in kleineren Mengen Fentin enthalten sind [Bock 1981, Römpp 1995, Stäb et al. 1996]. Besonders in der Nähe von Jachthäfen findet sich daher eine hohe Belastung der Sedimente mit diesen Verbindungen und deren Metabo-liten. Problematisch in diesem Zusammenhang ist die Tatsache, dass die Organozinn-Verbindungen zu Rückständen in Speisefischen führen und auch in sehr geringen Kon-zentrationen eine starke Schädigung des maritimen Gleichgewichtes bewirken. Im Herbst 1999 entfachte sich, sowohl in den Medien als auch in wissenschaftlichen Kreisen, eine rege Diskussion über die Risiken, die von Organozinn-Verbindungen aus-gehen [BgVV 2000]. Die öffentliche Besorgnis beruhte auf Befürchtungen, dass Orga-nozinn-Verbindungen beim Menschen eine hormonelle oder krebserregende Wirkung haben. Auslöser der Diskussion waren Befunde an Mono-, Di- und Tributylzinn in Fischen und Bekleidungsgegenständen. Vorausgegangen war eine Resolution des Europarats, die die Verwendung von Organozinn-Verbindungen bei Schiffsanstrichen bis zum Jahr 2004 verbietet. Im Zuge dieser Entwicklung und aus Gründen des vorbeugenden Verbraucherschutzes wird im Bundesministerium für Umwelt die Aussetzung der Zulassung aller Organozinn-Pestizide diskutiert. Analytik Organozinn-Pestizide wurden seither in Deutschland im Rahmen der Lebensmittelüber-wachung nicht routinemäßig untersucht. Dies ist in erster Linie darauf zurückzuführen, dass die bestehenden Analysenverfahren eine aufwendige Aufarbeitung erfordern. Infolge dessen befinden sich in der Prioritätenliste des BMG für Pestizide mit analyti-schen Defiziten, die Organozinn-Pestizide Fentinacetat, Fentinhydroxid und Azocyclotin unter den ersten sechs und Fenbutatinoxid, Cyhexatin und Fentinchlorid unter den �r’s-ten 25 Stoffen mit größter Priorität [BMG 1999]. Für die Spurenanalytik zinnhaltiger Pestizide sind in der Literatur verschiedene Analy-senverfahren beschrieben. Sie lassen sich in zwei Gruppen einteilen. Bei den indirekten Bestimmungsverfahren werden die Organozinn-Verbindungen zu-nächst extrahiert, durch einen Aufschluss zerstört und das freigesetzte Zinn z.B. photometrisch [Corbin 1970], polarographisch [Méndez et al. 1982, Metrohm (Applikation)], über AAS [Leuenberger et al. 1994, Verwaal et al. 1996] oder ICP/MS [Anderson 1998] bestimmt. Da auf diese Weise keine qualitativen Aussagen über die Herkunft des Zinns möglich sind, werden diese Verfahren ausschließlich zu Screening-Zwecken eingesetzt.

Eine direkte gaschromatographische Bestimmung ist nicht möglich. Um die Stabilität der Moleküle zu erhöhen, ist daher eine Derivatisierung erforderlich. Hierzu werden in der Literatur verschiedene Derivatisierungsmöglichkeiten beschrieben. Bei den meisten handelt es sich um Alkylierungen mit Grignard Reagenzien [Müller 1987, Van den Broek

Für die differenzierte Bestimmung der einzelnen Komponenten werden in der Literatur u.a. gas-, flüssigkeits- und dünnschichtchromatographische [Leuenberger et al. 1994] Verfahren beschrieben.



et al. 1988, DFG 1991, Forsyth et al. 1992, Liu et al. 1994, Stäb et al. 1996, Verwaal et al. 1996] sowie mit Natriumtetraethylborat [Carlier-Pinasseau 1997]. Beschrieben sind auch Hydrierungen mit Natriumborhydrid [Sullivan 1988]. Zur Detektion stehen ebenfalls mehrere Möglichkeiten zur Verfügung, wie FPD [Müller 1987], AAS [Forsyth et al. 1992], AED [Liu et al. 1994] und MSD [Stäb et al. 1996]. Für eine Bestimmung mittels HPLC ist bei Verwendung eines lichtsensitiven Detektors ebenfalls eine Derivatisierung notwendig, da nicht alle zinnhaltigen Pestizide ein Chromophor enthalten. So ist z.B. eine Derivatisierung mit Flavonen zur Erzeugung flu-oreszierender Derivate beschrieben [Stäb et al. 1992]. Empfindlicher erfolgt die Detek-tion mittels ICP-MS [Kumar et al. 1993].


3.2.2.5.1.1 Probenaufarbeitung und Extraktion Organozinn-Pestizide weisen eine geringe Wasserlöslichkeit sowie hohe Oktanol / Wasser-Verteilungskoeffizienten (K ) auf (z.B. Fentin log K 3,43, Fenbutatinoxid log K 5,2, Azocyclotin log K 5,38) [Roberts et al. 1999]. Überkritisches Kohlendioxid bietet sich daher als Extraktionsmittel an.

o/w o/w

o/w o/w

Wie in Tabelle 3.2.2-12 dargestellt, waren die Wiederfindungsraten für alle Organozinn-Pestizide zufriedenstellend, solange die Dotierungen auf Wasser erfolgten. Bei Gegen-wart von Matrix (Obst- oder Gemüse) gingen jedoch insbesondere die Wiederfindungen von Cyhexatin und Fenbutatinoxid stark zurück. Diese Verbindungen scheinen starke Wechselwirkungen mit Matrixbestandteilen einzugehen. Um die Extrahierbarkeit zu verbessern, wurden verschiedene Zusätze erprobt. Zunächst wurde versucht, das Zinn zu komplexieren und dadurch eine bessere Extrahierbarkeit zu erreichen. Hierzu wurde das in der Literatur oft bei Extraktionen von Organozinn-Verbindungen beschriebene Tropolon eingesetzt. Tropolon brachte jedoch keine Verbesserung, im Gegenteil, die Wiederfindungen von Fentin gingen sogar zurück. Auch die Verwendung von Ionenpaar-Reagenzien wie Natrium-Dodecylsulfat und Natrium-Pentylsulfonat führte nicht zum Erfolg.

Denoch gestaltete sich die Extraktion der Organozinn-Verbindungen problematischer als erwartet. Insbesondere Cyhexatin und Fenbutatinoxid zeigten eine starke Neigung zu Adsorptionen, so dass unter den Bedingungen der in Kapitel 3.2.1.1 aufgeführten Multi-methode (Basismethode) lediglich geringe und schwankende Wiederfindungsraten er-zielt wurden. Sehr auffällig war die schleppende Elution aus der ODS-Festphasenfalle und die Verschleppung von z.B. Cyhexatin in nachfolgende Extrakte. Ein ebenfalls schlechtes Elutionsverhalten zeigten insbesondere Fenbutatinoxid und Cyhexatin bei der RP-HPLC. Da dies auf Wechselwirkungen mit dem ODS-Material hindeutete, wurde, wie im Fall der basischen Pestizide, das ODS-Fallenmaterial durch feinzerkleinerte Stahlwolle ausgetauscht. Die daraufhin erzielten Wiederfindungen werden in Tabelle 3.2.2-12 vorgestellt. Verschleppungen wurden zunächst nicht mehr registriert. Nach ei-nigen Extraktionen war jedoch eine stetige Abnahme der Wiederfindungsraten sowie das erneute Auftreten von Verschleppungen zu beobachten. Für diese Effekte wurden, wie im Fall der basischen Verbindungen (Kap. 3.2.2.1.1), Wechselwirkungen mit abge-setzten Matrixbestandteilen innerhalb der Leitungen verantwortlich gemacht. Nach einer Reinigung der Leitungen mit Wasser (siehe Kap. 3.2.2.1.1) konnte die Extrahierbarkeit wieder erhöht werden. Verschleppungen wurden für längere Zeit nicht mehr beobachtet.



Erst durch Zusatz von Essigsäure vor der Extraktion konnten die Wiederfindungsraten für Cyhexatin und Fenbutatinoxid deutlich gesteigert werden (Tab. 3.2.2-12). Vermutlich maskieren die Protonen der Essigsäure nucleophile Zentren und Acetat kann als Gegenion zum Zinn fungieren und dadurch die Extraktion erleichtern. Eine reine Protonenwirkung wurde durch einen Zusatz von Schwefelsäure überprüft. Es wurde hierbei eine Verbesserung der Extrahierbarkeit erreicht, die Wirkung von Essig-säure war jedoch deutlich besser. Wie im Fall der basischen Pestizide ist auch hier die Durchführung einer zweiten Ex-traktion zur Erhöhung der Wiederfindungen von Cyhexatin und Fenbutatinoxid ange-bracht. Tab. 3.2.2-12: Wiederfindungsraten für Organozinn-Pestizide bei verschiedenen Aufarbeitungen und Extraktionsbedingungen

Cyhexatin Fenbutatin-oxid

Fentin

Wiederfindung in %

Matrix

Zusätze

Fallen-

Zustand

des Gerätes 1. Ex. 2. Ex. 1. Ex. 2. Ex. 1. Ex

2. Ex

Be-

merkung

Wasser keine ODS ver-schmutzt

17 30 56

Wasser keine Stahldraht sauber 38 82 64 Wasser 200 µl

H2SO4 * Stahldraht sauber 52 81 80

Wasser 50 µl HAc** Stahldraht sauber 76 80 87 Wasser 100 µl HAc Stahldraht sauber 88 91 96

Traube keine Stahldraht sauber 14 25 54 15 min ExTraube keine Stahldraht sauber 20 30 58 25 min ExTraube 100 µl HAc Stahldraht sauber 54 9 52 9 95 4 Traube 200 µl HAc Stahldraht sauber 74 10 76 11 95 5

* Schwefelsäure 20 %ig v/v ** HAc = Essigsäure 96 %ig

Material

3.2.2.5.1.2 Bestimmung mittels LC/MSD (API-ES (pos.) Modus) Für die Bestimmung der Organozinn-Pestizide mittels LC/MSD ist keine Derivatisierung erforderlich. Die Messungen wurden mit einem HP 1100 series MSD-Gerät im ES (pos.) Modus durchgeführt. Bei ersten Versuchen wurde festgestellt, dass die Organozinn-Pestizide unter den Elutionsbedingungen, die für die N-Methyl-Carbamate und die Phenyl-Harnstoff-Pestizide eingesetzt werden (mobilen Phase: Acetonitril/Methanol, 5 mmol wäss. Ammoniumacetat-Lösung, RP18-Phase), ein sehr schlechtes Elutionsverhalten zeigen. Insbesondere Cyhexatin und Fentin eluierten nur sehr schleppend und zeigten ein starkes Tailing. Bei Verwendung einer neuen ODS-Phase verbesserte sich die Situation, jedoch zeigten die Verbindungen weiterhin ein schlechtes Elutionsverhalten. Daraufhin wurde eine essigsäurehaltige mobile Phase eingesetzt. Das Elutionsverhalten der Verbindungen verbesserte sich mit steigender Essigsäure-Konzentration (0,5 bis 3 %) erheblich (Abb. 3.2.2-22). Die Verbesserung des Elutionsverhaltens durch die Essigsäure-Zugabe ist wahrscheinlich auf zwei Faktoren zurückzuführen. Zum einen ist Acetat in der Lage kationische Anteile der Organozinn-Pestizide zu maskieren, zum anderen werden nucleophile Funktionen auf der stationären Phase durch Protonen abgeschirmt [vgl.



Abalos et al. 1997]. Ein ähnliches Verhalten wurde auch bei der Extraktion festgestellt (siehe Kap. 3.2.2.5.1.1). Abb. 3.2.2-22: LC-Elutionsverhalten der Organozinn-Pestizide mit und ohne Essigsäure-Zusatz zur mobilen Phase

min2 4 6 8 10 12

0

50000

100000

150000

200000

250000

7.0

04

10.

795

9.1

99

Cyhexatinm/z 369

Fenbutatinoxidm/z 519

Fentinm/z 351

min3 4 5 6 7 8 9 10 11

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

6.2

50 10.

597

10.

196

Cyhexatinm/z 369


Fentinm/z 351

ohne Essigsäure

3 % Essigsäure

Essigsäure hat in diesen Konzentrationen allerdings den Nachteil, das sie den Respons der Organozinn-Pestizide beeinflusst. Je höher die Konzentration an Essigsäure ist, desto flacher werden die Kalibrierkurven der Verbindungen (vgl. auch Kap. 3.1.1.1.2.2). Der Verlauf der Kalibrierkurven mit und ohne Essigsäure wird in Abbildung 3.2.2-23 dargestellt.



Abb. 3.2.2-23: Auswirkungen der Essigsäure auf das Detektionsverhalten von Organo- zinn-Pestiziden bei der LC/MS API-ES (pos.) Modus

Kalibrierkurven - mobile Phase mit 2 % Essigsäure

02468

10121416182022

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


Resp

ons

norm

iert Fentin

FBO

Cyhexatin

Hilfslinie

Kalibrierkurven - mobile Phase ohne Essigsäure

02468

10121416182022

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22


Resp

ons

norm

iert

Fentin

FBO

Cyhexatin

Hilfslinie



Im folgenden werden die für die Wiederfindungsversuche verwendeten LC/MS-Bedingungen aufgeführt. • LC-Bedingungen Säulen: Luna C18 (2), 50 x 2 mm 3 µ oder Zorbax XDB C-18 50 x 2,1 mm, 2 µ Injektionsvolumen: z.B. 8 µl mobile Phase: A: Wasser : Acetonitril : Essigsäure 90:7:3 B: Wasser : Acetonitril : Essigsäure 7:90:3 Gradient: 40 % B in 5 Minuten auf 100 % B, Stop time 10 min, Post time 8 min Fluss: 0,3 ml/min • MS-Bedingungen API-ES positiv Spray Chamber Parameter: Drying gas: 350 °C, 10 L/min Nebulizer Pressure: 30 psig Vcap: 4000 V In Tabelle 3.2.2-13 werden die Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen (m/z) bei der LC/MS im API-ES (pos.) Modus aufgeführt. Als Hauptmassen treten im Massen-spektrum die Triphenyl-/Trialkyl-Zinn-Kationen auf. Bei hohen Fragmentorspannungen kommt es zu einer Freisetzung von Sn(I)-Kationen. Durch die große Anzahl an Zinn-Iso-topen bietet sich eine Fülle von Massen zur Identifizierung und Absicherung der Verbin-dungen. Tab. 3.2.2-13: Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen (m/z) für Organozinn-Pestizide bei der LC/MS im API-ES (pos.) Modus

m/z Fragmentorspannung [V] rel. Intensität Formel

Fentinhydroxid, Fentinacetat 351 349 347

135

100 74 45

120 118 116

250

78 58 35

197 195 193

190

56 41 25

Cyhexatin, Azocyclotin 369 367 365

70

100 74 45

205 203 201

105

67 50 30

Sn

3

Sn

Sn

Sn

3

SnH

H



m/z Fragmentorspannung [V] rel. Intensität Formel

287 285 283

135

44 33 20

Fenbutatinoxid 519 517 515

135

100 74 45

197 195 193

120

33 24 15

120 118 116

250

31 23 14

2

SnH

Sn

3

Sn

Sn

In Abbildung 3.2.2-24 werden LC-API-ES-Chromatogramme einer Mischung der Orga-nozinn-Pestizide dargestellt. Die Massenspuren der Quantifizierungs- und Identifizie-rungs-Ionen (Target- und Qualifier-Ions) werden separat dargestellt. In jeder Darstellung sind die entsprechenden Massenspuren der einzelnen Verbindungen übereinander gelegt. Es wird deutlich, dass auf diese Weise eine sehr empfindliche Bestimmung die-ser Verbindungen möglich ist. Abb. 3.2.2-24: LC/MS-Chromatogramme API-ES (pos.) der Organozinn-Pestizide, 0,2 µg/ml, Injektionsvolumen 5 µl

min3 4 5 6 7 8 9 10 11

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

6.2

50 10.

597

10.

196

Target Ions

Cyhexatinm/z 369


Fentinm/z 351

min3 4 5 6 7 8 9 10 11

0

10000

20000

30000

40000

50000

6.2

53 10.

592

10.

194

Qualifier Ions

Cyhexatinm/z 367


Fentinm/z 349



4. Untersuchungen von Proben aus dem Handel

4.1 UNTERSUCHUNGEN AUF ORGANOZINN-VERBINDUNGEN IN OBST UND GEMÜSE

Insgesamt wurden im ersten Halbjahr 2000 279 Proben Obst und Gemüse auf Rückstände an Fentin, Azocyclotin, Cyhexatin und Fenbutatinoxid untersucht. Die Nachweisgrenze lag bei 0,01 mg/kg. In Tab. 4-1 sind die Ergebnisse zusammengestellt. Positive Befunde traten nur vereinzelt auf, lediglich Zitrusfrüchte fielen auf. Diese Ergebnisse werden deshalb in Kap. 4.1.1 dargestellt. Tab. 4-1: Auf Organozinn-Pestizide im Jahr ersten Halbjahr 2000 untersuchte Proben

Untersuchte Lebensmittel Anzahl Positive Befunde Zitrusfrüchte 59 in 37 Proben Fenbutatinoxid positiv Erdbeere 47 Kernobst 21 Apfel: 1 x Fenbutatinoxid 0,11 ppm Steinobst 19 Nektarine: 1 x Cyhexatin 0,03 ppm Salatarten 17 Tomate 16 1 x Fenbutatinoxid 0,03 ppm Kartoffel 15 Paprika 15 Traube 15 exotische Früchte 12 Tamarillo: 1 x Fentin 0,03 ppm Spargel 10 Hülsengemüse 6 Aubergine 5 1 x Fenbutatinoxid 0,02 ppm Staudensellerie 5 Sonstiges 17

4.1 .1 Fenbutat inoxid in Z i t rusfrüchten Beim Anbau von Zitrusfrüchten wird zur Bekämpfung der roten Spinnmilbe neben anderen Akarizide (z.B. Dicofol, Brompropylat, xx) auch die Substanz Fenbutatinoxid eingesetzt. Höchstmenge für Fenbutatinoxid in Zitrusfrüchten liegt in Deutschland bei 0,05 ppm und ist somit die niedrigste unter den EU-Ländern (Spanien 2 ppm). Es wurden insgesamt 59 Proben Zitrusfrüchte auf Fenbutatinoxid untersucht. In 37 (63 %) waren Rückstände an Fenbutatinoxid im Bereich zwischen <0,01-0,50 ppm nach-weisbar. In 10 Fällen (17 % der Proben) lagen die Gehalte gesichert über der Höchst-menge von 0,05 ppm. In weiteren 8 Proben wurden Gehalte gefunden die zwar über der Höchstmenge lagen, jedoch unter Berücksichtigung einer analytischen Schwan-kungsbreite von 60% nicht als gesichert betrachtet wurden. Die Untersuchungs-ergebnisse bei Zitrusfrüchten sind in der folgenden Tab. 4-2 zusammengestellt.



Tab. 4-2: Rückstände von Organozinn-Pestiziden in Zitrusfrüchten

Gehalte in mg/kg Fruchtart

Herkunft Fentin Cyhexatin

Azocyclotin Fenbutatinoxid

Bewertung

Clementine unbekannt n.n. n.n. n.n. Clementine Spanien n.n. n.n. 0,06 >HM, nicht gesichert Clementine Spanien n.n. n.n. <0,01 Clementine Spanien n.n. n.n. 0,32 >HM Grapefruit Türkei n.n. n.n. n.n. Grapefruit Türkei n.n. n.n. n.n. Grapefruit Türkei n.n. n.n. n.n. Grapefruit Spanien n.n. n.n. n.n. Grapefruit unbekannt n.n. n.n. n.n. Grapefruit Türkei n.n. n.n. 0,16 >HM Grapefruit Türkei n.n. n.n. 0,065 >HM, nicht gesichert Grapefruit Türkei n.n. n.n. 0,1 >HM, nicht gesichert Grapefruit Türkei n.n. n.n. <0,01 Limette Brasilien n.n. n.n. n.n. Limette Mexiko n.n. n.n. n.n. Limone Brasilien n.n. n.n. 0,01 Mandarine Spanien n.n. n.n. 0,01 Mandarine Spanien n.n. n.n. 0,04 Mandarine Spanien n.n. n.n. <0,01 Mandarine Türkei n.n. n.n. 0,13 >HM Minneola Türkei n.n. n.n. n.n. Minneola Türkei n.n. n.n. n.n. Minneola Türkei n.n. n.n. n.n. Minneola unbekannt n.n. n.n. n.n. Minneola Türkei n.n. n.n. 0,04 Orange Italien n.n. n.n. n.n. Orange Spanien n.n. n.n. n.n. Orange Türkei n.n. n.n. n.n. Orange unbekannt n.n. n.n. n.n. Orange Italien n.n. n.n. n.n. Orange unbekannt n.n. n.n. 0,01 Orange unbekannt n.n. n.n. n.n. Orange Spanien n.n. n.n. <0,01 Orange Spanien n.n. n.n. 0,01 Orange Spanien n.n. n.n. 0,06 >HM, nicht gesichert Orange unbekannt n.n. n.n. <0,01 Orange Italien n.n. n.n. n.n. Orange Italien n.n. n.n. n.n. Orange unbekannt n.n. n.n. n.n. Orange Spanien n.n. n.n. <0,01 Orange Italien n.n. n.n. n.n.



Gehalte in mg/kg Fruchtart

Herkunft Fentin Cyhexatin

Azocyclotin Fenbutatinoxid

Bewertung

Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,5 >HM Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,2 >HM Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,075 >HM, nicht gesichert Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,01 Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,2 >HM Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,07 >HM, nicht gesichert Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,04 Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,07 >HM, nicht gesichert Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,01 Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,17 >HM Zitrone Spanien n.n. n.n. <0,01 Zitrone unbekannt n.n. n.n. 0,02 Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,15 >HM Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,01 Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,12 >HM, nicht gesichert Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,05 Zitrone Spanien n.n. n.n. 0,28 >HM

4.1 .2 Lokal is ierung der Rückstände von Fenbutat inoxid in Z i t rusfrüchten

Um festzustellen welcher Anteil der Fenbutatinoxid-Rückstände auf der Schale von Zitrusfrüchten lokalisiert ist, wurde bei einer Probe Grapefruit türkischer Herkunft Schale und Fruchtfleisch getrennt analysiert. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in Tab. 4-3 dargestellt.

Tab. 4-3: Verteilung der Fenbutatinoxid-Rückstände in einer Probe Grapefruit

Fruchtteil Gewichtsprozente Gehalt in mg/kg

Anteil an Fenbutatinoxid-

Rückständen Fruchtfleisch ca. 75 0,011 ca. 4% Schale ca. 25 0,93 ca. 96% Es wird deutlich, dass Fenbutatinoxid hauptsächlich in der Schale zu finden ist, die in den meisten Fällen nicht mitverzehrt wird.



5. Zusammenfassung Problemstellung Die Pestizidrückstandsanalytik in der amtlichen Lebensmittelüberwachung steht ständig vor neuen Herausforderungen (neue Wirkstoffe und Kontaminanten, Monitoring-Pro-gramme). Um analytische Defizite zu beseitigen und eine lückenlose Überwachung gewährleisten zu können, besteht bei den Untersuchungseinrichtungen zunehmend Bedarf an schnellen, kostengünstigen und automatisierten Analysenverfahren. Ziele Eine neue, erst in den letzten Jahren für analytische Zwecke eingeführte Extraktions-methode, die SFE, sollte auf ihre Eignung hin geprüft und zur Beseitigung dringender analytischer Defizite eingesetzt werden. Die Möglichkeiten und Grenzen dieses Extraktionsverfahrens im Bereich der Pestizidanalytik galt es zu prüfen und Methoden zu entwickeln, die im Vergleich zu den herkömmlichen schneller sind, weniger manuelle Arbeitsschritte benötigen und insgesamt wirtschaftlicher sind. Als Bestimmungs-verfahren sollte die LC/MS eingesetzt werden. Vorgehensweise Zunächst wurden Versuche zur Optimierung der Probenaufbereitung durchgeführt. Um auf eine aufwendige Reinigung der Extrakte verzichten zu können, wurden selektive Messverfahren (LC/MS) eingesetzt. Dabei wurde ein besonders großes Augenmerk auf die Optimierung der Messbedingungen gelegt. Ergebnisse 1. Für diverse Wirkstoffe/Wirkstoffgruppen, für die bisher analytische Defizite bestehen,

wurden einfache, routinetaugliche Analysenverfahren entwickelt: - Phenoxyalkancarbonsäuren - basische Fungizide (wie Carbendazim, Thiabendazol, Imazalil, Prochloraz) - Organozinn-Pestizide - herbizide, insektizide und fungizide Harnstoffderivate - Oxim-Carbamate (Aldicarb, Oxamyl, Methomyl) - N-Methyl-Carbamate und deren Oxidationsprodukte.

2. Neben den Einstellungen des Extraktionsgerätes wurde auch der Einfluss weiterer

analytischer Parameter auf die Extrahierbarkeit verschiedener Analyten am Beispiel ausgesuchter Pestizide untersucht.

Polarität der Analyten: Da überkritisches Kohlendioxid ein recht unpolares Lö-

sungsmittel ist, ist es gut zur Extraktion von unpolaren bis mittelpolaren Pestizi-den geeignet. Polarere Pestizide werden dagegen nur unvollständig extrahiert. Ihre Extrahierbarkeit kann durch Zugabe von Salzen verbessert werden (z.B. bei Oxamyl, Aldoxycarb, Methamidophos, Acephat)

Feuchtigkeitsgehalt: Bei unpolaren Pestiziden spielt der Feuchtigkeitsgehalt der

Probe eine wichtige Rolle. Mit zunehmendem Wasseranteil werden für diese Substanzen schlechtere Wiederfindungen erzielt. Durch Zugabe von größeren Mengen Adsorbens können solche Substanzen wesentlich besser extrahiert wer-den (z.B. Pyrethroide, einige Benzoyl-Harnstoffe und chlororganische Pestizide), da sie nicht mehr von einer Wasserschicht abgeschirmt werden.



pH-Wert: Bei Verbindungen mit sauren oder basischen Eigenschaften kann die

Extrahierbarkeit bedeutend verbessert werden, wenn der pH-Wert der zu extra-hierenden Proben entsprechend erhöht oder erniedrigt wird (z.B. Carbendazim und 2,4-D).

Abbau: Es wurde festgestellt, dass einige Pestizide einen signifikanten Abbau zei-

gen, während die Extraktionshülsen bei Raumtemperatur im Autosampler ge-lagert werden. Kein nennenswerter Abbau war festzustellen, wenn die Lagerung bei –18 °C erfolgte. Um den Abbau zu minimieren, sollten Proben, die emp-findlichen Stoffe enthalten, bis zur Extraktion im Gefrierschrank aufbewahrt und erst kurz vor der Extraktion in den Probengeber eingestellt werden. Alternativ be-steht die Möglichkeit den pH-Wert einzustellen, um säure- und basenempfindliche Pestizide zu schützen. Im Fall von oxidationsempfindlichen Pestiziden wird die Möglichkeit der Zugabe von Ascorbat als Antioxidants aufgezeigt.

3. Für zahlreiche Verbindungen wurden LC/MS-Bestimmungsmethoden entwickelt (N-

Methyl-Carbamate, Carbendazim, Thiabendazol, Organozinn-Verbindungen, Harnstoff-Pestizide, Phenoxyalkancarbonsäuren). Umfassende Untersuchungen im Bereich der Messung zeigten, dass für viele Substanzen eine Kalibrierung nach dem Standardadditionsverfahren notwendig ist. Anderenfalls resultieren infolge von Matrixeinflüssen größere Fehler.

4. Neben den zweifelsohne zahlreichen Vorteilen (Selektivität, Schnelligkeit, Auto-matisierung, Wirtschaftlichkeit) besitzt die SFE auch einige Limitationen, die zum Teil gerätebedingt, zum Teil prinzipieller Natur sind. Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurde z.B. festgestellt, dass bestimmte Ver-bindungen, die zu Adsorptionen neigen wie Thiabendazol oder Organozinn-Pestizide nicht nur Schwierigkeiten bei der Extraktion bereiten (längere Extraktionszeiten sind erforderlich), sondern auch innerhalb der Leitungen des Systems angereichert wer-den. Dadurch ergeben sich Verschleppungen in nachfolgende Extrakte. Durch regelmäßiges Reinigen der Leitungen des SFE-Extraktors mit Wasser im Ultraschallbad können Verschleppungen weitgehend vermieden werden.

5. Die LC/MS hat sich als hervorragende Ergänzung zur GC/MS erwiesen. Da bei diesem Bestimmungsverfahren hohe Temperaturen vermieden werden, ist es möglich eine große Anzahl von thermolabilen Stoffen in bestehende Multimethoden zu integrieren. Des weiteren können polare Stoffe leicht und ohne vorherige Derivatisierung bestimmt werden. Das Verfahren ist in den meisten Fällen ausreichend empfindlich und für den Einsatz in der Routine der Lebensmittel-überwachung geeignet.

6. Das zur Verfügung stehende LC/MS-Gerät HP series 1100 ist robust und gut für große Serien geeignet. Limitierend ist jedoch die Tatsache, dass nur für 10 Massen definierte Fragmentorspannungen eingestellt werden können. Sollen für jeden Stoff mindestens 3 Massen aufgenommen werden (Nachweissicherheit), können nur 3 Stoffe pro Lauf überprüft werden.



Bedeutung für die Praxis Die erarbeiteten Methoden wurden z.T. noch während der Forschungsarbeiten in der Praxis der amtlichen Lebensmittelüberwachung erprobt und eingesetzt. Verschiedene Pestizide, die bisher routinemäßig nicht erfasst wurden, konnten neuerdings als Rückstände in Lebensmitteln festgestellt werden. So wurden im ersten Halbjahr 2000 zahlreiche Proben auf ihren Gehalt an Organozinn-Pestiziden überprüft. Damit wurde ein wichtiger Beitrag zur Beschreibung der Rückstandssituation dieser Stoffe geleistet. Die erarbeiteten Methoden erfordern einen geringen Arbeitsaufwand und ermöglichen einen hohen Probendurchsatz. Daher bietet sich die Möglichkeit die SFE – LC/MS für routinemäßige Pestizidrückstandsuntersuchungen einzusetzen.



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7. Veröffentlichungen von Teilen der Forschungsarbeit

Poster Präsentationen:

Titel: „Analysis of Pesticide Residues in Fruits and Vegetables by SFE

and GC-MSD/LC-MSD“

Titel: „Analysis of Residues of Urea Pesticides in Fruits and Vegetables Using SFE and LC-MS”

vorgestellt bei: Int. Symp. Pesticides in Food in Medit. Countries in Cagliari, April 1999 XIVth Int. Plant Protection Congress (IPPC), Jerusalem, Israel, Juli

1999 Titel: „Analysis of Organotin-Pesticide Residues in Fruits and

Vegetables“

vorgestellt bei: Int. Symp. Pesticides in Food in Medit. Countries in Cagliari, April 1999 XIVth Int. Plant Protection Congress (IPPC), Jerusalem, Israel, Juli

1999 4th International SFE-(X)SE-SPME-Congress in Siegen, Oktober 1999

vorgestellt bei: 3rd European Pesticide Residue Workshop, York, U.K. Juli 2000 Vorträge Thema: „Bestimmung von N-Methyl-Carbamaten aus pflanzlichen Proben

nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid“

vorgestellt bei: 57. Arbeitstagung des Regionalverbandes Südwest der Lebensmittel--chemischen Gesellschaft in Hohenheim, März 1999

Kurzfassung in Lebensmittelchemie 53 (1999) 113-114



8. Verzeichnis der Abkürzungen

2,4-D : 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-essigsäure

2,4-DP : 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure

2,4,5-TP : 2-(2,4,5-Trichlorphenoxy)-propionsäure

APCI : Atmospheric Pressure Chemical Ionisation API : Atmospheric Pressure Ionisation

BBA : Biologische Bundesanstalt

CO Kohlendioxid

FBO : Fenbutatinoxid

h : Stunde(n)

2,4-DB : 4-(2,4-Dichlorphenoxy)-buttersäure

2,4,5-T : 2-(2,4,5-Trichlorphenoxy)-essigsäure

4-CPA : 4-Chlorphenoxyessigsäure aw : Wasseraktivität AAS : Atom-Adsorptions-Spektroskopie AED : Atomic Emission Detector ADI : Acceptable Daily Intake, maximal duldbare tägliche Aufnahme-

menge

ASE : Accelerated Solvent Extraction

BG : Bestimmungsgrenze BgVV : Bundesinstitut für den gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin BMG : Bundesministerium für Gesundheit CI : Chemical Ionisation CID : Collision Induced Dissociation

2 : CVUA : Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt d : Tag DAD : Dioden-Array-Detektor DDE : 1,1-Dichlor-2,2-bis(4-chlorphenyl)ethylen DFG : Deutsche Forschungsgemeinschaft DT50 : Halbwertszeit ECD : Electron Captive Detector, Elektroneneinfangdetektor EPC : Electronic Pressure Control, electronische Druck-Kontrolle ES : Electrospray

FPD : Flame Photometric Detector, flammenphotometrischer Detektor GC : Gaschromatographie GLP : Gute Landwirtschaftliche Praxis GPC : Gel Permeation Chromatography, Gelpermeationschromatographie



HM : Höchstmenge HP : Hewlett-Packard HPLC : High Pressure Liquid Chromatography, Hochdruckflüssigkeits—

chromatographie HWZ : Halbwertszeit

Kow : Verteilungskoeffizient n-Octanol/Wasser

M : Molekulargewicht

MCPA : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy)-essigsäure

MCPP : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy)-propionsäure

ODS : Octadecylsilan

P kritischer Druck PFB- : Pentafluorbenzyl-

Po/w : Verteilungskoeffizient n-Octanol/Wasser

RHmV : Rückstands-Höchstmengenverordnung

RT : Raumtemperatur

Hymx : Hydromatrix ICP : Inductively Coupled Plasma, induktiv gekoppeltes Plasma ISTD : interner Standard IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry KAS : Kaltaufgabesystem

LC : Liquid Chromatography (Flüssigkeitschromatographie) LD50 : mittlere tödliche Dosis für 50 % der Versuchstiere LMBG : Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz

MAE : Microwave Assisted Extraction, Mikrowellenunterstützte Extraktion

MCPB : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy)-buttersäure

MS : Mass Spectrometry, Massenspektrometrie MSD : Mass Selective Detector, massenselektiver Detektor m/z : Masse/Ladung n.d. : nicht durchgeführt NG : Nachweisgrenze NMC : N-Methyl-Carbamate NPD : Nitrogen Phosphorus Detector, Stickstoff-Phosphor-Detektor

P : Druck c :

PFB-Br : Pentafluorbenzylbromid

pKb : Basenkonstante pKs : Säurekonstante PLE : Pressurized Liquid Extraction ppm : parts per million

RP : Reversed Phase, Umkehrphase



SCAN : scanning modus, Aufzeichnung aller Massen S : Solubility, Löslichkeit einer Verbindung in Wasser s : Sekunde Sdp. : Siedepunkt SFC : Supercritical Fluid Chromatography SFE : Supercritical Fluid Extraction SIM : Selected Ion Monitoring, Aufzeichnung ausgewählter Massen T : Temperatur t0,5 : Halbwertszeit Tc : kritische Temperatur TPP : Triphenylphosphat TIC : Total Ion Chromatogram, Totalionenstrom-Chromatogramm ÜK-CO2 : überkritisches Kohlendioxid UV : Ultraviolett VO : Verordnung Wf. : Wiederfindung WHO : World Health Organisation, Weltgesundheitsorganisation XSE : Accelerated Solvent Extraction



9. Anlagen Anlagenverzeichnis:

Anlage 1 Multimethode zur Bestimmung von Pestizidrückständen in Obst und Gemüse nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE) Anlage 2 Summarische Bestimmung von Carbendazim/Benomyl/Thiophanat-Methyl in Obst und Gemüse nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE)

Anlage 3 Verfahren zur Bestimmung von 2,4-D in Zitrusfrüchten nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE) Anlage 4 Verfahren zur Bestimmung von Rückständen der basischen Fungizide Carbendazim, Fenpropimorph, Imazalil, Prochloraz und Thiabendazol in Obst und Gemüse nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE) Anlage 5 Verfahren zur Bestimmung von N-Methyl-Carbamat-Rückständen in Obst und Gemüse nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE) Anlage 6 Verfahren zur Bestimmung von Rückständen an Benzoyl- und Phenyl-Harnstoffen in Obst und Gemüse nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE) Anlage 7 Verfahren zur Bestimmung von Rückständen an Organozinn-Pestiziden in Obst und Gemüse nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE)


einsatz der sfe/lc-ms -...

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