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Epstein-Barr-VirusTestsysteme zum Nachweis von
EBV-Infektionen
Hochspezifi sche, rekombinante Antigene
Vielfältige Automatisierungslösungen für ELISA, Blot und IIFT
Hohe Aussagekraft durch Multiplex-Tests und Aviditätsuntersuchung
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Epstein-Barr-Virus
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) gehört zur Gruppe der human-pathogenen Herpesviren. Es wird auch als Humanes Her-pesvirus-4 bezeichnet und zählt zu den doppelsträngigenDNA-Viren. Der Mensch ist der einzige Wirt für das EBV. DieInfektion erfolgt zunächst über Epithelzellen, später werdendann B-Lymphocyten befallen, in denen das Virus lebens-lang persistiert.
Der Hauptübertragungsweg der Viren ist die Tröpfchen-oder Kontaktinfektion durch Speichel. In aller Regel erfolgtdie Ansteckung bereits im Kindesalter. Für gewöhnlich tre-ten bei den Kindern keine Symptome auf. Tritt die Infektionerst bei Jugendlichen oder Erwachsenen auf, kommt es da-gegen in 30 - 60 % der Fälle zum Ausbruch einer infektiösen Mono nukleose, auch Pfeiffersches Drüsenfi eber genannt(siehe Infokasten). Durch die weite Verbreitung des EBV istdie Durchseuchungsrate in der Bevölkerung sehr hoch. Abdem 20. Lebensjahr sind etwa 90 % infi ziert, nach dem 50. Lebensjahr sogar 99 %.
Wie alle Herpesviren ist das EBV in der Lage, wiederkeh-rende Infektionen hervorzurufen. Bei Immungesundenverlaufen diese Reaktivierungen für gewöhnlich klinisch un-auffällig.
Wenn jedoch eine Immunsuppression vorliegt, z. B. bei einerHIV-Infektion oder nach einer Organtransplanta tion, kann essowohl unmittelbar nach der Erstinfektion als auch bei einerReaktivierung zu Komplikationen kommen. Das Virus ver-mehrt sich dann unkontrolliert, wodurch es zu Lymphkno-tenkrebs oder zur Entstehung von Posttransplantations-Lym-phoproliferativen Erkrankungen (PTLD) kommen kann. EineEBV-Infektion steht jedoch auch bei Immungesunden mitder Pathogenese verschiedener Tumor erkrankungen im Zu-sammenhang. Das Burkitt-Lymphom, das vor allem in Afrikaauftritt und das Nasopharynx-Kar zinom, das im südostasi-atischen Raum endemisch ist, sind mit einer EBV-Infektionassoziiert (siehe auch Seite 8).
Diagnostik
Eine EBV-Infektion zeigt meist relativ unspezifi scheSymptome, die sich mit denen anderer Erkrankungen über-schneiden. Differentialdiagnostisch sollte die EBV-Infektionvon folgenden Krankheiten abgegrenzt werden: Cytomega-lie, Toxoplasmose, Streptokokken-Infektion, Ringelrötelnund HIV-Infektion.
Primäres Ziel der Routinediagnostik ist die Unterscheidungzwischen den einzelnen Stadien einer EBV-Infektion, wieErstinfektion oder zurückliegende Infektion. Zur Bestätigungeiner EBV-Infektion wird in den meisten Fällen ein serologi-scher Nachweis von Antikörpern durchgeführt. Eine Virus-last-Bestimmung durch PCR ist bei immunsupprimiertenPatienten und bei chronisch-aktiven EBV-Infektionen sinn-voll. EUROIMMUN bietet ein breites Produkt spektrum ver-schiedener Testsysteme für eine umfassende serologischeEBV-Diagnostik. Für alle Testverfahren stehen verschiedeneAutomatisierungslösungen zur Verfügung.
Infektiöse Mononukleose Die infektiöse Mononukleose (Pfeiffersches Drüsen-fi eber) beginnt in aller Regel mit Grippe-ähnlichen Symptomen wie Fieber, Gliederschmerzen, starkerMüdigkeit und schmerzhaften, dick geschwollenenLymphknoten, vor allem am Hals. Die Infektion gehtaußerdem mit einer auffälligen Erhöhung der Lympho-cytenzahl im Blut einher. Im Blutbild lassen sich zahl-reiche lymphomono cytoide Zellen nachweisen. Beietwa 50 % der Patienten tritt zudem eine Milzvergröße-rung auf. Normalerweise verläuft die Infektion selbst-limitierend und dauert selten länger als drei Wochen.Postinfektiös sind jedoch länger anhaltende Erschöp-fungszustände möglich, was auch als chronisches Mü-digkeitssyndrom bezeichnet wird. Die Krankheit trittbesonders ausgeprägt bei Jugendlichen und jungenErwachsenen auf.
Hüllmembran mit Glykoprotein-Spikes
Capsid
EBV
INFO
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EBV-Antikörper
Die serologischen Tests messen Antikörper, die sich gegen verschiedene Antigene des EBV richten. Zielantigene sind primär:
Im Verlauf einer EBV-Infektion treten die Antikörper zeitlichversetzt auf. In der Frühphase der Erkrankung sind IgM- undIgG-Antikörper gegen CA nachweisbar. Ein positiver Anti-EBV-CA (IgM)-Nachweis ist der klassische Marker einer aku-ten Infektion. IgG-Antikörper gegen EA treten etwas späterin der akuten Phase auf und fallen nach 3-6 Monaten auf nicht mehr detektierbare Konzentrationen ab.
Der CA-IgG-Antikörperspiegel persistiert dagegen lebens-lang. Etwa sechs bis acht Wochen nach einer Infektionkommt es zur Ausbildung von Antikörpern gegen EBNA. IhrAuftreten zeigt also eine bereits abgelaufene Infektion an.
Interpretationsschema Antikörper-Profi l
Antikörperprofi lDiagnose Infektionsstadium
EA (IgG) CA (IgM) CA (IgG) EBNA-1 (IgG)
– – – – Keine Infektion
– – + + Zurückliegende Infektion
+ / – + + – Akute Infektion (frühe Phase)
+ / – + + +Unklare serologische Konstellation,weiterführende Diagnostik erforderlich
Titer der verschiedenen Antikörper im zeitlichen Verlauf
Virales Capsidantigen (CA): Strukturprotein des Virus-capsids
Early Antigen (EA): Frühes Protein der Virusreplikation
Epstein-Barr-Nukleäres Antigen (EBNA): Immortali-sierungsprotein, wird erst spät dem Immunsystem desWirtes präsentiert. Die Antikörper-Bildung erfolgt des-halb erst nach der Infektion.
0 2 4A
nti
kö
rpert
iter
CA (IgG)
EBNA-1 (IgG)
EA (IgG)
CA (IgM)
6 12
Infektion
Krankheitsverlauf (Wochen) (Monate)
Symptome
Antikörper gegenVerfügbare Testsysteme
IIFT ELISA EUROLINE Westernblot
EBV-Capsid-Antigen (EBV-CA) EBV-CA, Aviditätstest EBV-CA p19 EBV-CA p22 EBV-CA gp125 EBV-Early-Antigen (EBV-EA) EBV-Nukleäres Antigen (EBNA)
Überblick Testsysteme
EUROIMMUN bietet eine Reihe von Testsystemen zum Anti-EBV-Nachweis an. An Testmethoden stehen ELISA, IIFTund Blot-Techniken zur Auswahl. Je nach Laborsituation kann das passende System gewählt werden.
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Indirekter Immunfl uoreszenztest (IIFT)
Der Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene EBV-Antigene kann mit der bewährten Methode der indirekten Immun-fl uoreszenz durchgeführt werden, die in der Literatur vielfach als Goldstandard beschrieben wird. Mit Hilfe der EUROIMMUN BIOCHIPs können parallel Antikörper gegen EBV-CA, EBV-EA und EBNA detektiert werden. Serologisch unklare Konstellatio-nen können durch einen modifi zierten IIFT zur Bestimmung der Antikörper-Avidität geklärt werden.
BIOCHIP-Sequenz EBVPatientenseren verschiedener internationaler Referenz-zentren (INSTAND / Deutschland, NEQAS / Großbritannien und Labquality / Finnland) wurden mit der EUROIMMUN BIOCHIP-Sequenz EBV untersucht. Anhand des vorgegebe-nen Erwartungswerts wurden folgende Sensitivitäten undSpezifi täten ermittelt:
Substrat n Spezifi tät Sensitivität
EBV-CA (IgG) 61 100 % 100 %
EBV-CA (IgM) 84 100 % 100 %
EBV-EA (IgG) 48 100 % 100 %
EBNA 80 95 % 100 %
Substrat Referenz Spezifi tät Sensitivität
gp125 und /oder p19 (IgG)
Anti-EBV-CA-IgG-IIFT(n = 320)
98 % 100 %
gp125 und /oder p19 (IgM)
Anti-EBV-CA-IgM-IIFT(n = 322)
98 % 99 %
Bestellnummer
BIOCHIP-Sequenz EBV FI 2799 -####-1 X
EUROPLUS BIOCHIP®-Sequenz EBV FI 2799 -####-21 X
Anti-EBV-CA-IIFT (IgA, IgG, IgM) FI 2791 -#### A, G oder M
Anti-EBNA-IIFT FI 2793 -#### G
Anti-EBV-EA-IIFT (IgA, IgG) FI 2795 -#### A oder G
Auch für serologisch schwierige Konstellationen geeignet durch Aviditäts-Messung
Optional auch zum Nachweis von IgA-Antikörpern er-hältlich, zum Screening bei Verdacht auf Nasopharynx-Karzinom
Vereinfachte Auswertung unspezifi scher EBV-CA-IgG- Reaktionen durch Einsatz von EBV-Capsid-Antigenengp125 und p19
Kombination aus exprimierenden Zellen und defi nierten Einzelantigenen auf einem Objektträger
Patient 1: EBV-CA (IgG) EBV-CA (IgG): Harnstoff-behandelt EBV-CA (IgM) EBV-EA (IgG) EBNA (IgG)
Patient 2: EBV-CA (IgG) EBV-CA (IgG): Harnstoff-behandelt EBV-CA (IgM) EBV-EA (IgG) EBNA (IgG)
EUROPLUS BIOCHIP-Sequenz EBVFür eine hochdifferenzierte EBV-Diagnostik kann die BIOCHIP-Sequenz EBV mit den monospezifi schen Anti-gensubstraten gp125 und p19 erweitert werden. Die In-terpretation unspezifi scher EBV-CA-IgG-Reaktionen im IIFT kann so wesentlich vereinfacht werden. Bei unkla-ren EBV-CA-IgM-Reaktionen ermöglicht der EUROPLUS-BIOCHIP zudem eine zuverlässige Differenzierung zwischenspezifi schen und unspezifi schen Reaktionen.
Obere Reihe: frische Infektion, untere Reihe: abgelaufene Infektion
6 VCA gp125 7 VCA p19 8 Antigen-freier BIOCHIP (IgG)
9 VCA gp125 10 VCA p19 11 Antigen-freier BIOCHIP (IgM)
BE
ST
ELL
UN
G1 2 3 4 5
5432 1
8
7
6
8
7
6
11
10
9
11
10
9
EBV CA (IgG) EEBV CA (IgG) EEBV CA (I G) EEBV CA (I G) EBV CA (IgG) +HarnstoBV CA (IgG) +HarnstoV CA (I G) H tV CA (I G) H t f EBV CA (IgM)ff EBV CA (IgM)f EBV CA (I M)f EBV CA (I M)f EBV EA (IgG)EBV EA (IgG)EBV EA (I G)EBV EA (I G) EBNA (IgG)EBNA (IgG)EBNA (I G)EBNA (I G)
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ELISA
Die EUROIMMUN Anti-EBV-ELISA sind hochsensitive Tests zum Nachweis von EBV-Antikörpern verschiedener Immun-globulinklassen (IgA, IgG, IgM). Die Untersuchung der zeitlich versetzt auftretenden Antikörper ermöglicht eine unkompli-zierte Bestimmung des Infektionsstadiums. Durch die automatisierte Abarbeitung sind die ELISA zur Untersuchung größe-rer Patientenkollektive geeignet.
Stufendiagnostik bei Immungesunden
Sensitivität und Spezifi tät
Die Untersuchung klinisch und serologisch vorcharakte-risierter Proben verschiedenen Ursprungs (INSTAND /Deutschland, NEQAS / Großbritannien, Labquality / Finn-land) mit den ELISA-Systemen ergaben eine hohe Sensi-tivität bei gleichzeitig sehr guter Spezifi tät (grenzwertige Seren ausgenommen).
Antigen n Spezifi tät Sensitivität
EBV-CA (IgG) 111 100 % 100 %
EBV-CA (IgM) 160 99 % 100 %
EBV-EA-D (IgG) 26 100 % 100 %
EBNA-1 (IgG) 109 100 % 100 %
ELISA-Produkte Bestellnummer
Anti-EBV-CA-ELISA (IgA, IgG) EI 2791-9601 A / G
Anti-EBV-CA-ELISA (IgG) (Aviditätsbestimmung) EI 2791-9601-1 G
Anti-EBV-CA-ELISA (IgM) EI 2791-9601 M
Anti-EBV-EA-D-ELISA (IgA, IgG, IgM) EI 2795-9601 A / G / M
Anti-EBNA-1-ELISA (IgG) EI 2793-9601 G BE
ST
ELL
UN
G
1Es gibt Patienten, die keine
EBV-CA-IgM-Antikörper bilden.
In diesem Fall kann mit den
Routinetests nicht zuverläs-
sig zwischen einer akuten und
einer abgelaufenen Reaktion
unterschieden werden. Hier
kann zusätzlich ein Aviditätstest
durchgeführt werden, um eine
akute von einer abgelaufenen
Infektion zu unterscheiden.
EBV-CA IgG / IgM EBNA IgG
ein Test positiv 1
EBNA IgG
negativ positivIgG und IgM
negativ
Patientenprobe
*vgl. Tabelle S. 3
Seronegativ Interpretation * Zurückliegende
Infektion
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EUROLINE EBV-Profi l 2 (IgG / IgM)Einfache Testdurchführung, vollautomatische Abarbei-tung möglich
Native, affi nitätschromatographisch aufgereinigte Anti-gene und rekombinante EBV-Antigene für höchste Sen-sitivität und Spezifi tät
Wahrscheinlichkeit einer akuten EBV-Infektion wird in derEUROLineScan Software berechnet
Inklusive Spätphasenmarker p22; hilfreich bei serolo-gisch unklaren Befunden wie sekundärem Verlust vonAnti-EBNA-1
Anti-EBV-Westernblot (IgG / IgM)
Spezifi scher Test zum Nachweis von Antikörpern gegen EBVVollantigenextrakt mit allen relevanten AntigenenOptimale Trennung der Antigenbanden
Klinische Daten
60 klinisch und serologisch vorcharakterisierte Seren wurden im Rahmen eines INSTANDRingversuchs mit dem EUROIMMUN EUROLINE EBV-Profi l 2 (IgG, IgM) untersucht. Die mit dem EUROLINE erzielten Ergebnisse zum Infektionsstatus stimmten in allen Fällen mit demVorgaben des Ringversuchsinstituts überein.
BLOT-Produkte Bestellnummer
EUROLINE EBV-Profi l 2 (IgG, IgM) DN 2790 -####-2 G / M
Anti-EBV-Westernblot (IgG, IgM) DY 2790 -#### G / M
BESTELLUNG
Immunblot
Als Nachweisverfahren zur Diagnostik einer EBV-Erkrankung stehen neben den Methoden IIFT und ELISA auch Immunblotszur Verfügung (EUROLINE und Westernblot). Beide Blotverfahren bieten eine Multiparameteranalyse verschiedener Anti-körper. Für die automatische Blot-Abarbeitung steht mit dem EUROBlotOne ein System zur Verfügung, das von der Proben-verdünnung bis zur Bilderfassung sämtliche Arbeitsschritte vollautomatisch durchführt.
Frische
Infektion
Abgelaufene
Infektion
Anti-VCA (IgM) - + -
Anti-VCA (IgG) - + +
Anti-EBNA-1 (IgG) - - +
Anti-p22 (IgG) - - +
Anti-EA-D (IgG) - - -
n = 60
Ergebnisse EUROLINE IgG und IgM
Primärinfektion zurückliegendeInfektion negativ
Status der EBV-
Infektion nach
INSTAND
Primärinfektion 5 0 0
zurückliegendeInfektion 0 43 0
negativ 0 0 12
Kontrollbande
VCA p22
IgAIgGIgM
VCA p33
EA p43, VCA p42
EA p45
EBNA-1 p79
VCA p40, 41
VCA p125
EA p93
VCA p65
p27
Kontrolle
IgGIgM
EA-D
p22
VCA gp125
VCA p19
EBNA-1
EUROLINE Westernblot
Konjugat-kontrolle
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Avidität
Über die Avidität der IgG-Antikörper kann abgeschätzt wer-den, in welcher Phase sich eine EBV-Infektion befi ndet. Die Stärke einer einzelnen Bindung zwischen Antikörper undAntigen wird als Affi nität bezeichnet. Unter Avidität versteht man die Summe aller Affi nitäten eines Antikörpers. Zu Be-ginn einer Infektion ist die Bindungskraft schwach, weil dasImmunsystem noch keine genau passenden Antikörper bil-den kann. Mit fortschreitender Dauer der Infektion werdendie Antikörper dann immer exakter dem entsprechendenAntigen angepasst.
IgG-Antikörper während einer akuten Infektion weiseneine niedrige Avidität auf
IgG-Antikörper nach einer durchgemachten Infektionweisen eine hohe Avidität auf
Zur Feststellung der Bindungsfähigkeit werden IgG-Testsmit bzw. ohne bindungshemmende Substanzen wie z. B.hochmolarer Harnstoff durchgeführt. Im Gegensatz zuhoch-aviden Antikörpern sind niedrig-avide Antikörper nachZugabe von Harnstoff nicht in der Lage, stabile Bindungeneinzugehen. Durch die Aviditätstestung lassen sich serolo-gisch schwierige Konstellationen klären wie z. B. das Auftre-ten persistierender Anti-EBV-CA-IgM-Antikörper oder dasFehlen spezifi scher Anti-EBV-CA-IgM-Antikörper bei akuten Infektionen.
Aviditätsmessung ELISA
Zur serologischen Diagnose einer akuten EBV-Infektion kannder EBV-CA-ELISA genutzt werden. Dazu werden zwei Pa-tientenproben parallel angesetzt (konventionell bzw. mitHarnstoff-Behandlung). Niedrig-avide Antikörper liegen vor,wenn die im ELISA gemessene Extinktion durch die Harn-stoff-Behandlung wesentlich verringert wird. Zur Objektivie-rung und Quantifi zierung wird aus den Messwerten mit und ohne Harnstoff-Behandlung der relative Aviditäts index (RAI)berechnet.
Eine Aviditätsbestimmung ist auch bei den indirekten Im-munfl uoreszenztests möglich.
Tests zur Aviditätsmessung Bestellnummer
BIOCHIP-Sequenz EBV FI 2799 -####-1 X
EUROPLUS® BIOCHIP-Sequenz EBV FI 2799 -####-21 X
EBV-CA-ELISA (IgG) EI 2791-9601-1 G
BESTELLUNG
Tag der Blutentnahme
0 50 100 150 200
Rela
tiver
Avid
itäts
ind
ex (
%)
0
20
40
60
80
100
2568
Hinweis auf niedrig-avide Antikörper
Hinweis auf hoch-avide Antikörper
Grenzwertbereich
Bei Inkubation mit Harnstoff-Lösung lösen sich niedrig avide Anti-körper von ihrem Antigen (a), während bei hoch-aviden Antikörperndie Bindung stabil bleibt (b).
Relativer Aviditätsindex der IgG-Antikörper im Verlauf einer akutenEBV-Infektion
niedrig-avidesIgG
+ Harnstoff
Bindung zerstört Virus Antigen
a
hoch-avidesIgG
+ Harnstoff
Bindungstabil
b
Extinktion der Probe mit Harnstoffbehandlung x 100
Extinktion der Probe ohne Harnstoffbehandlung= RAI (%)
Nasopharynx-Karzinom
Das Nasopharynx-Karzinom (NPC) ist ein monoklonaler Tu-mor des Nasen-Rachen-Raums, der mit einer EBV-Infektionassoziiert ist. Das NPC tritt vor allem in Südostasien, Nordaf-rika, Alaska und Grönland auf. Im südlichen China ist dasNPC unter den bösartigen Tumoren die dritthäufi gste Tu-morart. In Europa und Nordamerika ist die Erkrankung sel-ten. Die Inzidenz liegt hier im Bereich von 0,5 bis 1 auf 100.000 Personen. Bei der Entstehung des NPC sind nebender Infektion mit dem EBV noch andere Faktoren am Tumor-wachstum beteiligt. Als Kofaktoren werden genetischeGründe angenommen, aber auch Umweltfaktoren wie spezi-fi sche Ernährungsgewohnheiten scheinen eine Rolle zu spielen. In der Diskussion stehen seit einiger Zeit auchverschiedene Virusstämme des EBV.
Für die frühzeitige Identifi zierung des Nasopharynx-Karzi-noms spielt neben dem Direktnachweis durch Polymera-se-Kettenreaktion (PCR) die Serologie eine große Rolle. DasNasopharynx-Karzinom stimuliert die Bildung von IgA-Antikörpern gegen Capsid-Antigene und Early Anti gene des Epstein-Barr-Virus.
Prävalenz von IgA-Antikörpern
In einer Studie wurden 96 chinesische Patienten mit kli-nisch charakterisiertem NPC und ein Kontrollkollektiv aus 80gesunden chinesischen Blutspendern untersucht. Die Prä-valenz der IgA-Antikörper gegen EBV-CA und EBV-EAwurde mithilfe von ELISA-Testsystemen bzw. durch indi-rekte Immunfl uoreszenztests ermittelt. Bei Einhaltung des empfohl enen Cut-off konnten Antikörper der Klasse IgAgegen EBV-CA in 98 % (IIFT) bzw. 95 % (ELISA) der NPC-Patientenseren nachgewiesen werden. Die ermittelte Präva-lenz von Anti-EBV-EA (IgA) lag im Patientenkollektiv bei 85 % (IIFT) bzw. 56 % (ELISA).
Tests für die Diagnose des NPC Bestellnummer
Anti-EBV-CA-ELISA (IgA) EI 2791-9601 A
Anti-EBV-EA-ELISA (IgA) EI 2795-9601 A
BIOCHIP-Mosaik EBV-CA/EBV-EA (IgA) FI 2791-####-2 A
BESTELLUNG
EI_2791_I_DE_A03, 07/ 2018
IIFT-Titer Anti-EBV-CA-IIFT (IgA) Anti-EBV-EA-IIFT (IgA)
Cut-off Sensitivität Spezifi tät Sensitivität Spezifi tät
1:10* 98 % 85 % 85 % 97 %
1:100 95 % 91% 66 % 99 %
1:1000 69 % 99 % 28% 100 %
1:10000 22 % 100 % 7 % 100 %
Ratio Anti-EBV-CA-ELISA (IgA) Anti-EBV-EA-ELISA (IgA)
Cut-off Sensitivität Spezifi tät Sensitivität Spezifi tät
Ratio 0,8* 95 % 85 % 56 % 99 %
Ratio 1,1 85 % 92% 47 % 99 %
Ratio 1,6 77 % 95 % 40% 99 %
Ratio 2,1 70 % 100 % 38 % 100 %
*Empfohlener Cut-off
Für den serologischen Nachweis von EBV-IgA-Antikörpernbietet EUROIMMUN sowohl ELISA- als auch indirekte Im-munfl uoreszenz-Testsysteme an.
Immunfl uoreszenz-Aufnahme Anti-EBV-CA-positiv (links) und
Anti- EBV-EA-positiv (rechts)
Nasopharynx
Nasenhöhle
EUROIMMUN AG · Seekamp 31 · 23560 Lübeck · Tel 0 451/ 58 55-0 · Fax 58 55-591 · [email protected] · www.euroimmun.de