FilmwaageBiophysik-Praktikum

Literatur:• Albrecht et al., Polymorphism of Phospholipid Monolayers ,Journal de Physique 39

(1978) 301ff (siehe Anhang)

• Cevc, Gregor; Phospholipids handbook, Marcel Deccer Inc., New York, 1993, Möhwald,H.;“Phospholipid monolayers“ Seite 579 (siehe Anhang)

• Adam, G.; Läuger, P.; Stark, G.; Physikalische Chemie und Biophysik, 2. Aufl.,

Springer, Berlin, 1988

1. Zur Motivation

Amphiphile Moleküle wie Phospholipide oder Fettsäuren bilden an der Wasser-Luft-

Grenzfläche monomolekulare Schichten, wobei die hydrophile Kopfgruppe mit der Subphase,

die hydrophobe Schwanzgruppe mit der Atmosphäre in Verbindung steht. Ein wichtigesHilfsmittel zur Untersuchung der physikalischen Eigenschaften und zur Übertragung einer

oder mehrerer Schichten auf feste Substrate (z. B. einen Glasobjektträger, wie in Abschnitt 4beschrieben) ist die Filmwaage.

Phospholipide, aus denen die Plasmamembran von Zellen besteht, sind dabei von

besonderem Interesse. Abb. 1.1 zeigt, wie man sich diese Membran heute im Prinzip vorstellt:

Abb. 1: Schematische Darstellung einer Zellmembran

In einem fluiden Lipidbilayer, einem quasizweidimensionalen Gebilde aus zwei Monolayern,das viele verschiedene Lipidsorten enthält, "schwimmen" Proteine, die Funktionsträger der

Membran. Mit ihnen sind Erkennungsfunktionen (z. B. Hormonrezeptoren, Antikörper-

Antigen-Bindung) und selektive Transportmechanismen (z. B. die Na/K-Pumpe) der Zellerealisiert.

Dem Biophysiker sind nun die mit Hilfe der Filmwaage präparierten Monolayer

willkommene, natürlich stark vereinfachte Modellsysteme für die Zellmembran. Man versuchtz. B. Proteine in Monolayer einzubauen, um deren laterale Beweglichkeit in Abhängigkeit

vom Phasenzustand der Membran zu untersuchen oder eine Antigen-Antikörper-Bindungnachzuvollziehen.

Untersuchungen der thermodynamischen Eigenschaften von Lipidmonolayern

(Abschnitt 3 und Albrecht et al. 1978) geben Aufschluß über das Phasenverhaltenquasizweidimensionaler Systeme. Man kann z. B. Keimbildung und Kristallwachstum

untersuchen oder Umwandlungswärmen messen usw. Dabei zeigen sich Analogien zum

Dreidimensionalen, aber auch charakteristische Unterschiede.Lipidschichten können auf feste Substrate übertragen werden (Abschnitt 4), um ihre

Charakterisierung mit oberflächenspezifischen Meßmethoden zu vereinfachen, oder um siefür Untersuchungen in Biosensoranwendungen einzusetzen.

2. Aufbau und Funktion einer Filmwaage

2.1 Beschreibung der FilmwaageDas Funktionsprinzip einer Filmwaage sind in Abb. 2.1 dargestellt.

Abb. 2: Funktionsprinzip einer Filmwaage

Ein innen mit Teflon beschichteter, temperierbarer Trog enthält die Subphase, meist

hochreines Wasser oder evtl. auch Puffer. (Teflon ist hier das geeignetste Material, denn esgibt keine Lösungsmittel oder Ionen an die Subphase ab und ist im gereinigten Zustand

hydrophob.) Eine Chloroform/Methanol-(3:1)-Lösung des Lipids wird aus einer

Mikroliterspritze auf die Wasseroberfläche getropft ("gespreitet"). Das Lösungsmittelverdunstet rasch und es bildet sich eine Lipidmonoschicht. Durch die bewegliche Barriere

kann die dem Monolayer zur Verfügung stehende Oberfläche variiert werden; bei derKompression durchläuft der Monolayer zum Dreidimensionalen analoge Aggregatzustände

gasförmig ungeordnet, fluid, kristallin. Aufgrund der besonderen molekularen Struktur der

Lipide können aber auch wesentlich komplexere sogenannte flüssigkristalline Phasenauftreten. Der Lateraldruck p kann direkt aus der Kraft auf die Barriere berechnet werden.

Technisch einfacher ist die Bestimmung des Lateraldrucks aus der Reduktion der

Oberflächenspannung gemäß

p = m0 - m

als Differenz zwischen Oberflächenspannung des Wassers ohne (m0) bzw. mit (m) Lipidfilm

definiert. p wird über die an einem Filterpapierblättchen angreifenden Kräfte durch ein

Wilhelmy-Meßsystem gemessen.

Die Steuerung erlaubt die Kompression bzw. Expansion des Monolayers mitdefinierter Geschwindigkeit. Außerdem kann im "Konstant-Druck-Modus" der Lateraldruck

konstant gehalten werden, indem bei Druckänderung die Barriere nachgeführt wird. DieseBetriebsart ist erforderlich zur Aufnahme von Isobaren und bei der Beschichtung von festen

Substraten, wo der durch die Beschichtung verursachte Flächenverlust ausgeglichen werden

muß.

Abb. 3: Schema der Filmwaage für Präparationen nach der Langmuir-Blodgett-Methode.

2.2 Reinigung der Filmwaage

Bevor mit den eigentlichen in Abschnitt 3 und 4 beschriebenen Versuchen begonnenwerden kann, muß der Teflontrog sauber sein, denn Verunreinigungen sammeln sich

bevorzugt an der Wasser-Luft-Grenzfläche an, genau dort also, wo er am meisten stört.Zum Reinigen der Filmwaage (FW) wird mehrmals abgesaugt und mit Millipore-

Wasser (hochreines, entmineralisiertes Wasser) wieder aufgefüllt.

Achtung !!! Die FW soll niemals längere Zeit ohne Wasser stehen bleiben !!!

Daß der Trog sauber ist, sieht man daran, daß der Wasserfilm beim Absaugen schließlich

aufreißt und sich zusammenschnürt, ohne Tropfen zu hinterlassen. Sollte das auch nachmehrmaligem Wasserwechsel nicht der Fall sein, muß eine 1-2%ige HELLMANEX-Lösung

(Küvettenreiniger) eingefüllt werden, auf etwa 40 oC geheizt werden und danach etwa 20

Minuten stehen. Nach Absaugen und mehrmaligem Spülen sollte der Trog dann betriebsbereitsein.

Während der Messungen empfiehlt es sich, die Flowbox geschlossen zu halten, umVerunreinigungen zu vermeiden.

3. Thermodynamik von Lipidmonolayern

3.1 Ein wenig Theorie

Lipidmonolayer an Wasseroberflächen kann man durch „Spreiten“ erzeugen: man löst dasLipid in der gewünschten Konzentration in Chloroform (CHCl3)und bringt einen Tropfen

dieser Lösung mit definiertem Volumen auf die Wasseroberfläche auf. Da die

Oberflächenspannung des Wassers zu Luft wesentlich größer ist als die Summe derOberflächenspannungen von Chloroform zu Wasser und Chloroform zu Luft, werden die

Randwinkel der Tropfen zu Null und das Chloroform breitet sich völlig auf dem Wasser aus.Hier verdampft es und hinterlässt nur das Lipid auf der Oberfläche. Bei bekannter Einwaage

m und Molekulargewicht FM des Lipids ist somit seine molare Oberflächenkonzentration G

bekannt.

†

G =N

L ⋅ AS

N: Anzahl der Lipide, N=m/(FM*L)

AS: verfügbare Subphasenoberfläche

L: Avogadro konstante, N=6,022*1023 /mol

Unter der Bedingung, dass sich nur unmessbar wenig Lipide in der Subphase lösen (die

Versuche also rasch durchgeführt werden), gilt für den lateralen Druck der Lipide an derWasseroberfläche (Spreitungsdruck) folgende Beziehung (Adam, G 1988):

†

p (G) = R ⋅ T ⋅ G• ⋅ ln G•

G• -G

G• : Sättigungskonzentration des Lipids an der

OberflächeR: universelle Gaskonstante, R=8,314 J/(mol*K)

T: Temperatur

Ist die Oberflächenkonzentration G wesentlich kleiner als die Sättigungskonzentration G•,

wird π(G) annähernd:

†

p (G) = -R ⋅ T ⋅ G• ⋅ ln(1-G

G•

) ª R ⋅ T ⋅ G =R ⋅ T ⋅ N

L ⋅ AS

oder

†

p =k ⋅ T

A

A: molekulare Fläche, A=N/AS

K: Boltzmannkonstante, k= 1,381*10-23 J/K

Man sieht hieran, dass die Zustandsgleichung der Lipide in geringer Konzentration an derWasser/Luft-Grenzfläche wie die des idealen Gases nicht wechselwirkender Teilchen in drei

Dimensionen aussieht.In höheren Konzentrationen, dass heisst wenn jedem Molekül weniger Platz zur Verfügung

steht, beginnt eine Wechselwirkung der Lipide miteinander und die Zustandsgleichung lässt

sich durch eine, der dreidimensionalen Van der Waals-Gleichung analogen Formel darstellen:

†

p + a( )A

Ê

Ë Á ˆ

¯ ⋅ A -b( ) = k ⋅ T

a und b sind dabei die „zweidimensionalen Van der Waals-Konstanten“. Die Abhängigkeit

des lateralen Drucks π von der molekularen Fläche A bei konstanter Temperatur an der

Wasser/Luft-Grenzfläche (das sog. Druck/Flächen-Diagramm oder auch π/A-Isotherme) lässt

sich dann in Analogie zum dreidimensionalen p/V-Diagramm darstellen. Dabei durchläuft der

Film mehrere Phasenzustände.

In diesem Abschnitt sollen anhand einiger Druck-Flächen-Diagramme (p-A-Diagramme) des

Phospholipids Dipalmitoyl-Phosphatidyl-Cholin (DPPC, siehe Abb 3.3) die Phasenzustände

dieses Monolayers untersucht werden, Analogien und Unterschiede zum Dreidimensionalendiskutiert und Umwandlungswärme für die Hauptumwandlung mit Hilfe des Gesetzes von

Clausius Clapeyron berechnet werden.Abb. 3.1 zeigt eine Klassifikation der möglichen Monolayerphasen; es wird

unterschieden zwischen isotroper Gas- bzw. fluider Phase, anisotroper fluider Phase und

verschiedenen kristallinen Phasen. Sie unterscheiden sich in Symmetrie und Ordnungsgrad.Biologische Relevanz hat das insofern, als die laterale Beweglichkeit von Membranproteinen

um mehrere Größenordnungen abnimmt, wenn die Membran vom fluiden in den kristallinenZustand übergeht. Diffusionskontrollierte Vorgänge, wie z. B. die Zusammenlagerung von

Membranproteinen zur Bildung eines Rezeptorkomplexes, laufen dann viel langsamer ab.

Auch kondensierte flüssige Phasen sind möglich und werden in biologischen Membranen als2D-Kompartimente für gelöste Membranproteine diskutiert.

Abb. 3.1 Klassifikation möglicher Monolayerphasen (aus Albrecht et al. 1978)

Abb. 3.2 zeigt p-A-Diagramme (= Isothermen) der Phosphatidsäure DMPA bei verschiedenen

Temperaturen. Der nahezu horizontal verlaufende Teil der Kurven entspricht der sogenannten

Hauptumwandlung des Lipides, dem Übergang vom fluiden in den kristallinen Zustand,

vergleichbar mit dem Koexistenzgebiet flüssig/fest im Dreidimensionalen. Es handelt sichdabei um einen Phasenübergang 1. Ordnung (für T < TC, TC = kritische Temperatur). Die

Umwandlungswärme pro Molekül DqM (M steht für "Main Transition") kann mit dem Gesetz

von Clausius Clapeyron

DqM = TM (dpM /dT)*(Af -Ac) (3.1)

berechnet werden. Weitere Details zur Thermodynamik und zur Interpretation von p-A-

Diagrammen dieser quasizweidimensionalen Systeme finden sich in (Albrecht et al. 1978).

Abb. 3.2 Strukturformel von Dimyristoyl-Phosphatidyl-Acid (DMPA) bei verschiedenenTemperaturen(aus Albrecht et al. 1978) und Druck-Flächen-Diagramm.

DPPC

TR-DHPEAbb. 3.3 Strukturformeln der Phospholipide Dipalmitoyl-Phosphatidyl-Cholin (DPPC,

FW=790g/mol und Texas Red® 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine,

triethylammonium salt (TR-DHPE, FW=1382 g/mol).

3.2 Eichung des Druckmeßsystems mit Arachidinsäure

Um Absolutwerte des Lateraldruckes p in einem Monolayer messen zu können, muss

das Druckmeßsystem entweder absolut z.B. mit Gewichten oder mit einer Eichsubstanz - hierArachidinsäure (Formel:CH3-(CH2)18-COOH) – geeicht werden. Arachidinsäure weist nahezu

temperaturunabhängig bei p = 25.6 mN/m einen Phasenübergang auf. Dabei richten

sich die vorher bezüglich der Normalen zur Oberfläche geneigten Kohlenwasserstoffketten

parallel zur Normalen auf. Für ein quantitatives p-A-Diagramm braucht man außerdem noch

die Fläche pro Molekül. Diese berechnet sich leicht aus der Oberfläche des Troges, derMenge des gespreiteten Lipids und dessen Molgewicht.

Normalerweise werden von Lipiden und Fettsäuren 1 mg/ml-Lösungen in

Chloroform/Methanol (3:1) hergestellt. Mit einer Mikroliterspritze wird eine definierte Menge

davon Tropfen für Tropfen knapp über der Oberfläche abgegeben. Man sieht dabei, wie sichder Tropfen augenblicklich über die Oberfläche verteilt ("spreitet") - es entsteht eine

Monoschicht des Lipids.

40

30

20

10

0

later

aler D

ruck

[mN/

m]

0.280.240.200.16molekulare Fläche [nm 2

]

Cadmium-Arachidat

Arachidinsäure

Abb. 3.10: p,A-Diagramme von Arachidinsäure und Cadmium-Arachidat. Durch die

Zugabe von Cadmiumionen (5x10-4 molar) zur Subphase kann der Phasenübergangsdruck

der Arachidinsäure von 25,4!mN/m auf 0!mN/m gesenkt werden.

Berechnet die zu spreitende Menge aus einem angenommenen Flächenbedarfvon 40 Å/Molekül für Arachidinsäure in der "Gasphase".

Achtung: Vor und nach jedem Spreiten die Mikroliterspritze mit der dafürvorgesehenen Chloroform/Methanollösung spülen!

F: Bestimmt den Flächenbedarf/Molekül an den beiden Knickpunkten des p-A-Diagrammes!

3.3 Druck-Flächen-Diagramme von DPPCDas Phospholipid DPPC wurde für diesen Versuch gewählt, weil die verschiedenen

Phasen im p -A-Diagramm sehr gut sichtbar werden. Für die Bestimmung der

Umwandlungswärme pro Molekül DqM beim Hauptübergang von DPPC müssen p-A-

Diagramme bei T ª 20 oC, 25 oC und 30 oC aufgenommen werden. Die Temperatur wird am

Thermostat reguliert, die tatsächlichen Werte jedoch mit dem IR-Thermometer direkt überdem Trog ermittelt.

F: Welche Größen müssen gemessen werden, um DqM bestimmen zu können? (Glg. 3.1)

Vor Beginn sollten ausserdem folgende Fragen geklärt werden:

F: Wie ist der Zusammenhang zwischen Filmwaagenoberfläche, Barrierenstellung und

Zählerstand?F: Welche Menge DPPC ist zu spreiten (aus einer 1 mg/ml-Lösung), wenn der Flächenbedarf

pro Molekül in der Gasphase etwa 80 Å2 beträgt?

F: Wie schnell darf komprimiert werden (= darf sich die Barriere bewegen), damit da/dt £ 5

Å2/min bleibt? Was passiert wohl, wenn man zu schnell komprimiert oder expandiert? (Mandenke daran, was im Dreidimensionalen geschieht!)

Wenn die Filmwaage sauber und die Temperatur eingestellt ist, wird die berechneteMenge DPPC gespreitet (Druck beobachten !!) und komprimiert. Auf dem Bildschirm sieht

man, wie der Monolayer die verschiedenen Phasen durchläuft. Bereiche zuordnen! Bei einemDruck von etwa 30 mN/m solltet Ihr einen leichten Knick im p-A-Diagramm sehen. Stoppt

dann die Kompression.

Zur Kontrolle, ob die Barriere dicht schließt, daß also kein Lipid verloren geht bzw.

der Monolayer stabil ist, kann die Steuerung auf den "Konstant-Druck-Modus" umgeschaltetwerden. Wenn kein Lipid verloren geht, sollte die Barriere stehen, andernfalls wird sie

nachgeführt und die berechneten Flächen wären nicht korrekt.Für die beiden anderen p-A-Diagramme kann man entweder den Monolayer absaugen

und neu spreiten oder einen einzigen Monolayer für alle drei Versuche verwenden, d. h.

mehrmals expandieren und komprimieren.

F: Vor- und Nachteile der beiden Verfahren? Welches Verfahren ist vorzuziehen? Was ist

jeweils dabei besonders zu beachten, damit die p-A-Diagramme vergleichbar sind?

Diskussion der p-A-Diagramme:

F: Warum verläuft die Isotherme im Bereich des Koexistenzgebietes fluid/kristallin nicht

exakt horizontal? Unterschied 3-dimensional und 2-dimensional? Welche Rolle spielt dieKompressionsgeschwindigkeit? Welche Rolle spielen Verunreinigungen?

F : Man berechne DqM, die Umwandlungswärme pro Molekül und D Q M, die

Umwandlungswärme pro Mol DPPC, für alle p-A-Diagramme (mit Fehlerabschätzung)! Ist

das viel oder wenig, verglichen mit typischen Schmelzwärmen im Dreidimensionalen?

4. Übertragung von Monolayern auf feste Substrate (Langmuir Blodgett-Technik)

4.1 Vorbemerkung und Prinzip

In diesem Abschnitt soll eine wichtige Präparationstechnik für den an

Lipidmembranen interessierten Biophysiker kennengelernt werden: die Übertragungmonomolekularer Lipidschichten von der Filmwaagenoberfläche auf feste Substrate - in

unserem Versuch auf einen gereinigten Glasobjektträger.Anwendungen für diese Technik sind denkbar, z. B. in der Biosensorik, wo man

derartige Monolayer als Matrix für darin eingebaute biologische Rezeptoren verwenden will.

Mischt man dem Lipid einen kleinen Prozentsatz (1-2 mol%) fluoreszenzmarkiertenLipids bei (in unserem Versuch: TR-DHPE, siehe Abb 3.3), so kann man die Struktur des

Monolayers im Fluoreszenzmikroskop (Abb. 4.1) direkt untersuchen. Das mit Farbstoff

markierte Lipid hat nämlich die Tendenz, sich bevorzugt in der fluiden Phase des Monolayerszu lösen - diese Bereiche erscheinen daher im Mikroskop hell, die kristallinen dagegen

dunkel. Es konnte gezeigt werden, daß die Struktur des übertragenen Monolayers tatsächlichidentisch ist mit der des Monolayers auf der Filmwaage.

Abb.:4 Schema der Fluoreszenzfilmwaage. Mit einem in xyz-Richtung beweglichen Schlitten

lässt sich der Mikroskopaufbau über dem Monolayer positionieren.

4.2 MethodeAbb. 4.2 zeigt den Beschichtungsvorgang bei hydrophilem bzw. hydrophobem

Substrat. Man beachte die unterschiedliche Art der Anlagerung der Lipidmoleküle und die

Form des Miniskus. Der als Substrat verwendete Glasobjektträger ist hydrophil, wenn erfrisch gereinigt und im Plasmacleaner mit Argon-Ionen "gesputtert" wurde. Wasser benetzt

dieses Substrat also vollständig. Ein bei der Beschichtung ablesbares Kriterium für dieSauberkeit des Substrates liefert der Miniskus der Wasseroberfläche: ist es sauber, so verläuft

er exakt horizontal und gleitet kontinuierlich über die Substratoberfläche.

Abb. 3.7: Schematische Darstellung der Langmuir-Blodgett-Methode. Die

Übertragungsrate liegt typischerweise bei 100 µm/s. (A) Beim Eintauchen eines hydrophilen

Substrates wird kein Film übertragen. (B) Beim Herausziehen desselben Substrates

beschichtet sich das Substrat mit einer Monoschicht. (C) Übertrag einer Monoschicht auf ein

hydrophobes Substrat durch Eintauchen. (D) Beim Herausziehen desselben Substrates wird

eine zweite Monoschicht übertragen.

Zunächst wird der Monolayer mit der gewünschten Zusammensetzung gespreitet und

durch Zusammenfahren der Barriere der gewünschte Lateraldruck eingestellt. Im "Druck-Konstant-Modus" hält ihn die Steuerung dann während des Beschichtungsvorgangs konstant,

indem sie durch Nachführen der Barriere den Flächenverlust ausgleicht. Dieses Nachführen

kann als Maß für die beschichtete Fläche benutzt werden, natürlich nur dann, wenn vor demEinfahren des Substrates konrolliert wurde, ob der Monolayer stabil und die Filmwaage dicht

ist, d. h. die Barriere steht.

4.3 Monolayer aus DPPC mit TR-DHPE bei 25 oC

In diesem Versuch soll die Struktur, d. h. die Art und Form der kristallinen und fluidenBereiche eines Monolayers aus DPPC mit TR-DHPE bei T ª 25 oC im Koexistenzgebiet

untersucht werden.

Dazu werden von einem Monolayer nacheinander mehrere (mindestens drei) Substratebeschichtet.

F: Stimmen Flächenverlust des Monolayers und beschichtete Oberfläche des Substratesüberein?

F : Was ist für das Verhältnis heller und dunkler Flächen für die verschiedenenKompressionsstadien des Monolayers zu erwarten?

F: Man diskutiere Zahl, Form und Größe der kristallinen Bereiche! Wodurch könnte man

diese Parameter beeinflussen? (Viel Information zu diesem Thema findet sich in derDissertation von W. Heckl, 1988).

Viel Spaß!