gelelektrophoreseam isas
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Gelelektrophoreseam Isas. SDS-Page 2D. SDS-PAGE. Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese Kontinuierliche PAGE Diskontinuierliche PAGE Durch SDS Proteine entfaltet, 1 Nettoladung proportional zur Molekülgröße. 2D -PAGE. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Gelelektrophorese am Isas
SDS-Page 2D
SDS-PAGE
• Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese
• Kontinuierliche PAGE• Diskontinuierliche PAGE• Durch SDS Proteine entfaltet, 1 Nettoladung
proportional zur Molekülgröße
2D -PAGE
• Separation der Proteine nach 2 physikalischen Parametern
• Auch orthogonale Seperation• 1. Dim.: Separation durch isoelektrischen
Punkt• 2. Dim.: Separation nach elektrophoretischen
Trennverfahren
NachweißgrenzeM
olek
ülm
asse
Trennungskapazität
Cells
Proteine
Peptide
Aminosäuren
Arbeitsschema für 2D-PAGE
IPG-strip
1. Dimension
‚Probenbehälter‘
pH 3.0 pH 10.0
Proteine wandern im elektrischen Feld zu ihren isoelektrischen Punkt
+ -
1. Dimension
IPG-Strips:• Im Handel erhältliche
Gel-Streifen mit unmobilen und eingestellten pH-gradient (pH 3-10 )
• Vorbereitung da Streifen im Schiff transportiert wurden sind diese dehydratisiert (längere Lagerung)
• Rehydratisierung ist nötig• Für 24 cm Streifen sind 450 µL
nötig • Mischung aus – 8M Harnstoff– 2M Thioharnstoff– 2% CHAPS– 0.002% Bromphenol blau– 2% IPG-Puffer
Isoelektrische Fokusierung
• Assembly of IEF-System– Streifen in Vorrichtung (Streifenhalter)– Elektroden an das Gel anschließen– Proben aufs Gel/Streifen geben – Streifen mit Öl abdecken – Ungefähre Laufzeit 20h !!!!
Vorbereitung für 2 Dimension
• Re-puffering von IPG-Streifen• Reduktion and Alkylierung Schritt• Streifen auf 2 Gel packen und laden• Gel mit Agarose Lösung auffüllen, so dass
Streifen gut aufliegt
2. Dimension
• Ungefähre Laufzeit 4h
Färbung
• Colloidal Coomassie (G-250)– 34% Methanol– 2% Phosphorsäure– 17% Ammoniumsulfat– 0,066% Coomassie
• Silber Färbung