GENE UND TRANSKRIPTION Genstruktur (schematisch)

Gendefinition Gen ist DNA-Abschnitt, von dem eine biologische aktive RNA transkribiert werden kann. � zu Genen gehören neben transkribierten Bereich auch für Transkription notwenidige Bereiche:

� Promotor � Initiatorregion � Weitere „cis-regulatorische“ Elemente

„cis-regulatorische“ Elemente � auf gleichem DNA-Strang „trans-regulatorische“ Elemente � auf unterschiedlichen DNA-Strängen Pseudogene: � zeigen Sequenzen, die denen echter (funktioneller) Gene sehr ähnlich sind, aber ihnen fehlen Bereiche, die für die Genexpression benötigt werden (bspw. ein Promotor) Gen ist demnach durch seine RNA definiert

� Gene für mRNAs und damit für Polypeptide [1-3%] � Gene für tRNAs � Gene für rRNAs [~90%] � Gene für snRNAs usw.

Gene haben festgelegte Orientierung � immer von 5´-3´ Template strand wird abgelesen abgebildet wird der Nicht-Template-Strang (� entspricht dann der „sense“-RNA)

Chemische Unterschiede zwischen RNA und DNA Ribose in RNA Desoxyribose in DNA ↓ ↓ kann 2 Phosphordiesterbindungen ausbilden in 2-Stellung OH-Gruppe nötig um

Splicing durchführen zu können in RNA: Uracil statt Thymin (5-Methyl-Uracil) � Ausnahme: in tRNA kommt regelmäßig Thymin vor RNA ist in der Regel einzelsträngig, bildet aber fast immer durch Rückfaltung partiell Doppelhelices aus (� dient der Stabilisierung und schützt vor Abbau durch Enzyme) mRNA Matrize für Proteinbiosynthese rRNA struktureller und funktioneller Bestandteil der Ribosomen tRNA Adaptormolekül zwischen mRNA und Aminosäuren snRNA (small nuclear RNA) heterogene Klasse von kleinen RNA-Molekülen, die in

Assoziation mit Proteinen insbesondere an der Prozessierung der mRNA beteilgt sind

snoRNA (small nucleolar RNA) kleine RNA-Moleküle, die an der Prozessierung der rRNA im Nucleolus beteiligt sind

antisense RNA:

Transkripte, die komplementär zu mRNAs sind, können Translation verhindern und sind somit an Genregulation beteiligt.

RNA fungiert nicht nur als Matrize für Proteinsynthese, sie kann sich ähnlich wie Proteine auch selbst zu komplexen Strukturen falten, die enzymatische oder strukturelle Aufgaben übernehmen (� Riboenzyme) � Spicing-Reaktion (auch rRNA offenbar bei Biosynthese von Proteinen entscheidende katalytische Aufgaben) Biosynthese der RNA erfolgt von 5´-3´, der Template-Strang hat Orientierung 3´-5´. Für Synthese von RNA werden (Ribo-)Nucleosid-5´triphosphate benötigt. � ATP + GTP → Dinucleotid + Energie (PP) [ohne Triphosphate keine DNA] Für Bildung der Phosphordiesterbindung wird Energie benötigt, die durch die Abspaltung von Pyrophosphat aus Nukleosidtriphosphat gewonnen wird. Die RNA-Synthese ist Template-gesteuert! Template-DNA-Strang wird abgelesen von 3´-5´, Template-Strang entspricht „antisense“-Strang � Kettenverlängerung RNA 5´-3´-Richtung RNA-Polymerasen Während bei Prokaryoten eine einzige RNA-Pol alle Gene transkribiert, kommen bei Eukaryoten 3 verschiedene RNA-Pols vor, welche für verschiedene Klassen von RNA-Transkripten spezialisiert sind. RNA-Pol I Synthese der großen und

kleinen UE der rRNA

im Nucleolus lokalsiert, keine Hemmung durch α-Amanitin

RNA-Pol II Synthese der mRNA sowie snoRNA und einiger snRNAs

α-Amanitin sensitiv

RNA-Pol III

Synthese der tRNA, 5S-rRNA und vieler snRNAs

wird durch α-Amanitin nur schwach gehemmt

� RNA-Pol I ist α-Amanitin (Gift aus grünem Knollenblätterpilz) resistent � α-Amanitin hemmt RNA-Pol II bei geringen Konzentrationen bereits vollständig � RNA-Pol III wird nur durch hohe Konzentrationen gehemmt � tödliche Dosis 0,1 mg/kg Körpergewicht

Actinomycin D hemmt besonders stark RNA-Pol I, da Actinomycin D bevorzugt an GC-Basenpaare einlagert und rRNA-Gene sehr GC-reich sind. RNA-Polymerasen weist keinen effizienten Proofreading-Mechanismus auf, wie DNA-Polymerase. Hohe Kopiergenauigkeit, für DNA-Replikation nötig, ist für relativ kurzlebigen RNA-Transkripte nicht erforderlich, da Fehler nicht an nächste Generation weitergegeben werden. RNA-Polymerase-Holoenzym aus E.coli hat Molmasse von ca. 480 kDa und lässt sich funktionell in ein Core-Enzym (α2ββ´) und den Sigmafaktor (σ) untergliedern. Sigamfaktor ist entscheidend für Initiation der Transkription, d.h. dieses Polypeptid bstimmt die hohe Affinität zu den DNA-Sequenzen an der Initiationsstelle von Transkriptionseinheiten. Nach Initiation der RNA-Synthese dissoziiert der σ-Faktor, verbleibendes Core-Enzym enthält katalytisches Zentrum für Polymerisationsreaktion. Knüpfung der Phosphordiesterbindung findet an der β-UE statt. Eukaryotische RNA-Polymerasen sind große Proteinkomplexe mit Molmasse von mehr als 500 kDa. Jede der 3 Polymerasen besteht aus zwei sehr großen UE von ca. 160-220 und 128-150 kDa, die Ähnlichkeit zur β´-UE bzw zur β-UE des E.coli-Enzyms aufweisen. Im Gegensatz zur E.coli-RNA-Polymerase zeigen, eukaryotischen Polymerasen keine Aktivität, wenn sie isoliert sind, sind nur aktiv, wenn sie mit einem Komplex genereller TFs verbunden werden. Eigenschaften der 3 verschiedenen DNA-abhängigen RN A-Pol in Eukaryoten

Eigenschaft Pol I Pol II Pol III

Sensitivität gegen α- Amanitin

- hoch (10-9 M) niedrig (10-4 M)

transkribierte Gene

Gene großer RNAs (rRNA) proteincodierend Gene kleiner RNAs

(tRNA, 5S-rRNA)

Anzahl UE

mindestens 3 mindestens 12 mindestens 14

zugehörige generelle

TFs

TF I, TAF I, TBP TF II, TAF II, TBP, SRB TF III, TAF III, TBP

ATP-Hydrolyse bei transkriptioneller

Initiation

- + -

RNA-Polymerasen benötigen für die geregelte und exakt positionierte Initiation der Transkription zusätzlich andere Proteine � Transkriptionsfaktoren (TF) Unter den Transkriptionsfaktoren unterscheidet man die generellen Transkriptionsfaktoren (GTF) von den regulatorischen Transkriptionsfaktoren (RTF). Des weiteren gibt es basale TFs (immer vorhanden und für jede Transkription notwendig) und spezifische TFs (gewebs-/zellspezifisch; hormoninduziert; entwicklungsspezifisch). Jede Genklasse hat eigene TFs. Gesamten Proteinkomplex aus den verschiedenen RNA-Pol-UE und GTF: � RNA-Polymerase-Holoenzym Basale Transkriptionsmaschinerie der durch RNA-Pol II transkribierten Gene ist Gebilde vieler Proteinkomponenten � Präinitiationskomplex der Transkription und enthält die als GTFs bezeichneten Einzelkomponenten:

� TF II A � TF II B � TF II D

� TBP (TATA-Box binding protein) � TAF (TBP assoziierter Faktor)

� TF II E � TF II F � TF II H � TF II J � SRB

� Gruppe von ca. 9 Proteinen, die direkt mit CTD (carboxyterminale Domäne) der größten UE der RNA-Pol II interagiert

Mit spezifischer Positionierung auf der DANN definiert der Präinitiationskomplex die Lage des Promotors und die exakte Initiationsstelle der Transkription, d.h. die Position +1 der RNA-Synthese. besondere Rolle von TF II D TF II D enthält als UE das TBP (TATA-box binding protein). Das TBP erkennt TATA-Box und bindet als 1. Protein an den Gen-Promotor. Erst dann folgt Bindung anderer TFs und schließlich zuletzt die der RNA-Pol II in Verbindung mit TF II F. TBP (TATA-Box binding protein)

� TBP bindet im Gegensatz zu meisten DNA-bindenden Proteinen in der „kleinen“ Furche der DNA

� krümmt DNA durch Bindung und verursacht so scharfen Knick � vermittelt Bindung weiterer TFs an Promotor � ist auch bei Genen ohne TATA-Box am Präinitiationskomplex beteiligt und zwar auch

bei Pol I- und Pol III-Genen

andere Transkriptionsfaktoren TF II A Interaktion mit TF II D, ist in der Lage, sowohl basale Transkription eines

Promotors zu stimulieren als auch die durch regulatorische Transkriptionsfaktoren stimulierte Transkription

TF II B offensichtlich Brückenprotein � Kontakt zwischen TBP-Komponente des TF II D und RNA-Pol II herstellt

TF II F Erhöhung der Elongationsrate TF II E verhilft der Rekrutierung des TF II H in Präinitiationskomplexes TF II H besitzt enzymatische Aktivität: ATPase, Helikase und Proteinkinase Reparatur von DNA-Schäden Präinitiation bei Pol I-Genen

� UBF Upstream binding factor � UCE Upstream control element � TBP TATA-Box binding protein � SL-1 Selectivity factor 1 � Core core promotor

Präinitiation bei Pol II-Genen

Zusammenfassung: Präinitiationskomplexe der verschi edenen Genklassen

DNA-bindende Proteine

� wichtigsten „Interpreter“ des genetischen DNA-Kommando-Codes � Vermittler zwischen ankommenden Signalen und Umsetzung durch Gene � „transaktive“ Steuerungselemente von Genen oder ganzen Gengruppen � globale oder lokale Modifikatoren der Chromatinstruktur und damit der Genaktivität

wichtigsten DNA-bindenden Proteine Helix-loop-Helix

� Dimer � besteht aus 2 α-Helix-Regionen, die über einen kurzen Proteinbereich miteinander

verbunden sind, der beide Helices gegeneinander dreht � eine der α-Helix-Regionen jedes Dimers kann in den ‚major groove’ der DNA

eingreifen, während der zweite α-Helix-Bereich mit dem des anderen Dimers in Kontakt steht

Zinkfinger

� Je ein Paar von Cysteinen und Histidinen bindet an ein Zinkion � zusätzlich erfolgt eine Faltung des Polypeptids in 9 fingerartige Domänen � diese greifen in den ‚major groove’ (große Grube) der DNA ein und bilden mit ihr

einen stabilen Komplex � daraufhin können TFs anlagern

Leucin Zipper

� kann nur als Dimer an die DNA binden � ein Teil (ca. 30 [basische] AS) binden sich an die saure DNA � ein anderer weist alle 7 AS ein Leucin auf, so dass sich beide Helices wie ein

Reißverschluss schraubenförmig um einander winden � die Aminosäuren der DNA-binde-Proteine interagieren über die große

Grube direkt mit den Basen der DNA über H-Brückenbindungen!!! Chromatin und Genaktivität Euchromatin ist aufgelockert und kann transkribiert werden (ist also aktiv), während Heterochromatin so kompakt ist, dass es nicht transkribiert werden kann (es ist inaktiv). � Acetylierung ‚öffnet’ das Chromatin!

TRANSKRIPTION UND GENREGULATION BEI PROKARYOTEN Typische Prokaryotengene

Shine-Dalgaro-Sequenz:

� AGGAGGU-Sequenz auf der mRNA der Prokaryoten und stellt eine Ribosomenbindungsstelle für die kleine 30S-Untereinheit dar; bindet an einen Bereich nahe des 3’-Endes der 16S-rRNA und initiiert so die Translation; die zur S.-D.-Sequenz komplementäre Sequenz auf der 16S-rRNA enthält stets die Nukleotide CCUCC!

polycistronische mRNA:

� RNA, die die Information für alle drei Proteine enthält, da die Gene des Operons in ein einziges mRNA-Molekül transkribiert werden

Transkriptionsaktivität vieler prokaryotischer Gene wird differentiell reguliert � bessere Anpassung der Organismen an unterschiedliche Umweltbedingungen oder speziellen Leistungen der Zellen für besondere Zwecke wie z.B. Konjugation, Reparatur von DNA-Schäden oder Integration von Bakteriophagen oder anderen Episomen (= Plasmide). Transkription der Prokaryotengene erfolgt in 3 Stuf en

� Initiation � Elongation � Termination

Transkription CTP, UTP, ATP und GTP stellen 4 Ribonucleotidtriphosphate dar. Basensequenz einer transkribierten RNA ist stets zu einem der beiden Stränge der DNA-Doppelhelix, dem Matrizenstrang oder kodogenen Strang (template strand) komplementär. � RNA selbe Sequenz wie nicht-kodogener Strang (nottemplate strand) Von DNA-Doppelhelix kann mal der eine, mal der andere Strang als Vorlage für Transkription verwendet werden. Transkription wird von DNA-abhängiger RNA-Pol katalysiert. Bei Prokaryoten werden alle Genklassen ausschließlich nur von 1 RNA-Pol transkribiert. Für Initiation ist neben der „Core“-RNA-Pol der „Sigma“-Faktor notwendig. Sigma-Faktor löst sich nach Synthese von ca. 10 Basen von RNA-Pol ab Erkennungs- und Startpunkt jeder RNA-Pol bildet Promotor, Sequenz von 20-200 bp. Der Promotor liegt entweder vor der zu transkribierten Region (E.coli RNA-Pol, Eukaryoten RNA-Pol I und RNA-Pol II) oder innerhalb des transkribierten Abschnitts (RNA-Pol III).

In Promotoren prokayotischer Gene sind vor allem 2 Regionen besonders stark konserviert. Eine Region liegt etwa 35 bp oberhalb (in 5´-Richtung oder stromaufwärts, upstream) des Transkriptionsstart, da nach Übereinkunft die erste transkribierte Bse mit +1 nummeriert wird (es gibt keine Base 0 !), bezeichnet man diese Region als die -35-Region (TTGAC-Box). 2. konservierte Region, die -10-Region oder Pribnow-Box liegt 10 bp vor Transkriptionsstart. Initiation (Einleitung): Vor Beginn der Transkription prokaryotischer Gene, bewegt sich RNA-Pol entlang DNA „auf Suche“ nach Promotor. Wenn -35-Region und -10-Region erreicht hat, erfolgt Bindung an DNA. Anschließend wird DNA-Doppelhelix an -10-Region lokal entwunden, sodass kleines Stück (~20 bp) Einzelstrang freigelegt wird � kann nun transkribiert werden. Der σ-Faktor wird nun nicht mehr gebraucht und dissoziert vom Holoenzym ab. Im Gegensatz zur DNA-Pol kann RNA-Pol die Synthese ohne einen Primer initiieren. Elongation (Verlängerung): Zur Elongation der RNA werden Ribonucleotide durch Ausbildung einer Phosphordiesterbindung zwischen dem 3´-OH-Ende der wachsenden RNA und dem 5´-Phosphat eines neuen Ribonucleotidtriphosphats unter Abspaltung eines Diphosphats und Wasser angefügt. Synthese der RNA erfolgt stets von 5´� 3, sodass jedes 5´-Ende einer RNA ein Triphosphat trägt. Reihenfolge der Nucleotide in wachsender RNA ist durch Basensequenz des kodogenen DNA-Stranges festgelegt. Termination (Abbruch): Bei Prokaryoten gibt es 2 verschiedene Möglichkeiten zum Abbruch der Transkription. Häufigste ist: � direkte Termination, kontrolliert durch charakteristischen, etwa 40 bp langen

Terminationsabschnitt (Terminator). Besteht aus GC-reicher Region, gefolgt von mehreren A-Nucleotiden. Wenn Abschnitt transkribiert wird, können sich zwischen G´s und C´s der RNA intramolekulare WSBB ausbilden � kurzer Bereich doppelsträngiger RNA, die sog. Haarnadelschleife (hairpin-loop). An diese schließen sich mehrere U´s an, die komplementär zu den A´s des DNA-Strangs sind. Diese Struktur dient als Signal zur Freisetzung der RNA-Pol von DANN und somit zum Abbruch der Transkription .

� indirekt Termination bei Prokaryoten erfolgt mit Hilfe des Rho-Proteins � bindet an

eine Terminatorsequenz in RNA, welche von der oben genannten verschieden ist und auch kein poly(U) aufweist. Durch Bindung von Rho an RNA-Abschnitt erfolgt Loslösung der RNA-Pol und somit Beendigung der Transkrption.

Ganz typisch für regulatorische Gene bei Prokaryote n sind OPERONS

� Nach Operon-Operator-Hypothese von Jacob und Monod (NP 1965) sind Operons zusammengefasste, gemeinsam regulierte und gemeinsam an einem Stoffwechselprozess beteiligt sind und die damit zum gleichen Zeitpunkt in der Zelle benötigt werden

Verschiedene Regulationsmodelle

� negative Rückkopplung der Transkription � negative, aber induzierbare Regulation der Transkription � repremierbare Regulation der Transkription

Ein Operon prokaryotischer Gene enthält neben der proteinkodierenden Sequenz auch eine regulatorische Region (Operator), über die eine positive oder negative Regulation durch Bindung eines Repressors erfolgen kann. konstitutive Gene (Haushaltsgene) werden ständig, also unabhängig vom Milieu transkribiert, dagegen werden induzierbare Gene nur bei Bedarf, etwa in Gegenwart eines abzubauenden Substrats. Lac-Operon wichtigste Funktion:

(Neubildung eines Proteins oder Enzyms als Antwort auf äußeres Signal bezeichnet man als Induktion, das Agens, das die Reaktion ausgelöst, als Induktor) Nach Zugabe von Induktors (Lactose) produziert Zelle etwa 1000-mal so viel β-Galactosidase wie in Abwesenheit des Induktors (~3min). In meisten Experimenten verwendet man β-Galactosid-Isopropyl-β-D-Thyiogalaktosid (IPTG) � kann nicht von β-Galactosidase gespalten werden Gleichzeitig werden neben β-Galactosidase noch 2 weitere Enzyme gebildet:

� Galaktosidpermease � erleichtert Aufnahme von Galaktosiden aus Umgebung � Transacetylase � Funktion ?

� Enzyme werden von Genen Z, Y und A kodiert (liegen alle nebeneinander auf DNA) � polycistronische mRNA

1. Repressor 2. Sigma-Faktor 3. RNA-Pol 4. RNA-Pol nach der Transkription 5. polycistronische mRNA 6. Transacetylase

7. Permease 8. β-Galactosidase 9. Ribosomen

10. Induktor I: Repressor-Gen P: Promotor O: Operator Z: β-Galactosidase-Gen Y: Permease-Gen A: Transacetylase-Gen

Negative Regulation des lac-Operons Modell geht davon aus, dass Operon aus der Regulationssequenz dem Operator O und den enzymatischen Genen Z, Y und A besteht. Weiteres Gen I kodiert Protein � Repressor, der

an Operator bindet und Transkription von Z, Y und A verhindert. Nach Zugabe des Induktors (Lactose bzw. Allolactose) bindet dieser an Repressor, wodurch dieser vom Operator entfernt wird � Promotor zugänglich für RNA-Pol Man sagt lac-Operon unterliegt negativer Kontrolle, da unter normalen, nicht-induzierten Bedingung der Repressor die Transkription blockiert � Transkription erfordert Inaktivierung des Repressors. 3 Gene Z, Y und A liegen hintereinander und ihre gemeinsame Transkription in eine polycistronische mRNA garantiert, dass ihre Genprodukte zur gleichen Zeit und in gleichen Mengen zur Verfügung stehen. Unter normalen Bedingungen wird Synthese polycistronischer mRNA durch Aktivität des Repressors verhindert, der an Operator in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstarts bindet � Repressor ist Genprodukt von Gen I. Repressor hat nicht nur Eigenschaft an Operator binden zu können, sondern ist auch befähigt, an Induktor zu binden. Bindet Induktor an Repressor so löst sich dieser von Operator, wodurch Promotor zugänglich für RNA-Pol wird � Transkription erfolgt. Positive Regulation des lac-Operons Induktion der Transkription der Gene des lac-Operons ist Beispiel für negative Kontrolle, da Repressor inaktiviert werden muss um Transkription zu straten. Signal (Induktor) inaktiviert Repressor. Andere Gene bzw. Operons unterliegen positiver Kontrolle. Hierbei führt Signal zur Aktivierung eines Faktors (Aktivator), der Transkription ermöglicht. In Abwesenheit des Induktors ist Faktor inaktiv. Wird Zelle sowohl Lactose als auch Glucose angeboten, so wird, obwohl Induktor (Lactose) vorhanden ist, nur sehr wenig RNA von lac-Operon transkribiert. Erst unter Hungerbedingungen � Abnahme des Glucosespielgels, wird Induktor Lactose wirksam � wird durch cAMP reguliert. cAMP wird bei niedrigen Glucosekonzentrationen synthetisiert. Bei Bakterien stellt Erhöhung der cAMP-Konzentration ein „Warnsignal“ dar, um niedrige Glucosekonzentration zu melden. Folge ist Aktivierung der β-Galactosidase, aber auch von Enzymen, die für Abbau anderer Zucker nötig sind. cAMP bindet an Protein CAP (katabolisches Aktivatorprotein). cAMP-CAP-Komplex bindet an spezifische Sequenz in lac-Kontrollregion, erst wenn dieser Komplex gebunden hat, kann RNA-Pol effektiv an Promotor binden. Gleichzeitig Bindung von cAMP-CAP und RNA-Pol führt zu Interaktion zwischen beiden Proteinen wodurch ihre jeweilige Bindng an DNA erhöht und somit Transkription aktiviert wird. � cAMP-CAP aktiviert Transkription (positive Regulation) � lac-Repressor verhindert Transkription (negative Regulation)

Mutationen im lac-Operon Mutationen wurden charakterisiert � Oc genannt, die dazu führen, dass Zellen β-Galactosidase auch ohne Zugabe des Induktors in erhöhter Menge produziert. Wildtypzellen (O+) können nur in Anwesenheit des Induktors β-Galactosidase synthetisieren, während Oc-Zellen dies gleichermaßen in An- und Abwesenheit des Induktors tun. � in Oc-Mutanten werden alle Gene des lac-Operons synthetisiert In Zellen von Genotyp O+/Oc (ein Operon liegt auf einem F-Plasmid in der Zelle) ist Enzymproduktion weiterhin konstitutiv (grundlegend) � Oc ist dominant über O+ Kombiniert man Operon mit intaktem Operator und defektem Z-Gen (O+ Z- Y+) mit 2. Operon auf F-Plasmid mit konstitutiven Operator und intaktem Z-Gen (F´Oc Z+ Y-) so wird β-Galactosidase konstitutiv expremiert, während Permease nur nach Induktion gebildet wird. � Operator kontrolliert nur proteinkodierenden Gene mit denen er auch strukturell verbunden ist � Oc-Mutationen sind in cis wirksam, da sie nur Expression von denjenigen beeinflussen, die auf demselben DNA-Molekül liegen wie Operator selbst. Mutation I kontrolliert Induzierbarkeit der 3 Gene � verhält sich beim Vorliegen von 2 verschiedenen Allelen völlig anders als Oc-Mutation So sind etwa I+/ I--Zellen wieder induzierbar, d.h. I+ dominant über I-. Ferner zeigt I+ „Fernwirkung“, indem es auch Gene kontrolliert, mit denen es nicht strukturell verbunden ist � es wirkt trans Weitere Mutation im I-Gen: Is � führt zum Verlust der Induzierbarkeit Auch bei Anwesenheit des Induktors werden Z, Y und A nicht abgelesen, selbst dann nicht wenn Wildtyp-Kopie I+ vorliegt � Is ist dominat über I+ In Bakterien mit mutanten Is-Gen ist Bindung des Induktors an Repressor nicht mehr möglich: 3 Gene werden nicht abgelesen selbst bei Anwesenheit des Induktors. Auf diese Weise mutierter Repressor kann, nachdem er einmal an Operator-DNA gebunden hat nicht mehr abgelöst werden, selbst Wildtyp-Repressor kann nichts ausrichten, da alle Operatorsequenzen blockiert sind.

Tryptophan-Operon Trp-Operon ist Beispiel für reprimierbares System � kodiert Enzyme für Synthese von Aminosäure Tryptophan 5 Gene trpE, trpD, trpC, trpB und trpA werden bei hohen intrazellulären trp-Konzentration abgeschaltet. Anders als lac-Repressor, der nur dann an Operator bindet, wenn er nicht an Lactose gebunden ist, bindet trp-Repressor nur dann, wenn er mit Tryptophan assoziiert ist. Neben der Regulation durch trp-Reprssor gibt es am trp-Operon noch weitere Regulationsmöglich-keit � Attenuation (Abschwächung) Attenuation kontrolliert Fortsetzung der Transkription: Im trp-Operon liegt zwischen Promotor und 1. Codon von trpE Sequenz von etwa 160 bp � Leader-Sequenz Bei geringen Tryptophankonzentrationen wird etwa 7 kb großes durchgehendes Transskript, beginnend mit Leader-Sequenz und gefolgt von polycistronische RNA der trp-Gene hergestellt. Ist Konzenztration von trp hoch, so reduziert sich Menge von Transkripten auf etwa 10%, da trp-Repressor aktiv ist. Diese 10% stellen jedoch nur kurze Transkripte aus ersten 141 Nucleotiden der Leader-Sequenz dar � Anwesenheit von trp führt zu einer vorzeitigen Termination. Deletion der ersten 30 Nucleotide aus Leader-Sequenz führt zum Verlust der Regulation: Selbst in Gegenwart von trp werden große Mengen des langen Transkripts gebildet. � 30 bp langer Abschnitt = Attenuator, da seine Anwesenheit zur Verminderung der Menge des kompletten Transkripts führt, stellt also eine interne Terminationsstelle im Anfangsbereich des Transkripts dar. Unter Attenuation versteht man Regulation der Genexpression durch vorzeitigen Abbruch der Transkription, weshalb durch sie Feinregulation der Transkription erfolgen kann.

Translation der Leader-RNA beginnt am 5´-Ende kurz nach Beginn der Transkription, die währenddessen fortgesetzt wird. Bei hohen trp-Konzentrationen führt Ausbildung einer Haarnadelschleife zwischen Region 3 und 4 und Serie von Uridinresten zur Rho-unabhängigen Termination der Transkription. Bei niedrigen trp-Konzentrationen und damit verbundenen Mangel an beladener tRNATrp ist Translation verzögert und es kommt zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur zwischen Region 2 und 3, weshalb für Termination nötige Haarnadelschleife zwischen Region 3 und 4 nicht gebildet wird. Transkription wird in kodierende Region fortgesetzt, die polycistronische mRNA des trp-Operons wird transkribiert. Wird leader-Peptid nicht translatiert, bildet sich Haarnadelschleife zwischen Region 1 und 2, sobald entsprechende Abschnitte transkribiert worden sind. Ausbildung dieser Struktur verhindert Bildung der Haarnadelschleife zwischen Region 2 und 3, dies ermöglicht Faltung der Haarnadelschleife zwischen Region 3 und 4, was wiederum zur Termination der Transkription führt.

TRANSKRIPTION UND GENREGULATION BEI EUKARYOTEN

Prokaryoten Eukaryoten keine Introns (i. d. Regel) Exon-Intron-Struktur (i. d. Regel)

Gene in Operons keine Operons mRNA polycistronisch mRNA monocistronisch

nur eine RNA-Pol 3 RNA-Pol Shine-Dalgarno-Sequenz Capping keine Polyadenylierung Polyadenylierung (i. d. Regel)

Transkription + Translation simultan Transkription + Translation zeitlich und räumlich getrennt

kein Chromatin Gene in Chromatin

Promotor Pribnow-Box

Promotor verschiedene für I, II, III-Gene I: spezies-spezifischer Promotor

II: oft TATA-Box III: interner Promotor mit A- und B-Box

erste Aminosäure in einem Polypeptid: n-Formyl-Methionin

erste Aminosäure in einem Polypeptid: Methionin

Ribosomale UE: 30S und 50S (insg. 70S) Ribosomale UE: 40S und 60S (insg. 80S) Genstruktur der Eukaryoten 1. RNA-Pol I: Gene für 18S-, 5,8S-, 28S-rRNA [über ~95% in Zelle] 2. RNA-Pol II: Gene für alle mRNAs 3. RNA-Pol III: Gene für tRNAs, 5S-rRNA, einige snRNAs (4. RNA-Pol VI: (bei Pflanzen) Funktion ?) RNA-Polymerase I Gene

� Promotor 5´stromaufwärts � Primärskript enthält 18S, 5,8S und 28S-rRNA, sowie „spacer“-RNA � Gene immer repetitiv vorhanden � Gene in Gruppen („cluster) tandemartig angeordnet (i.d.R. „head-to-tail“) � Nur bei manchen Organismen : „Amplifikation“

� selektive Vervielfachung von Genen, für die temporär ein erhöhter Bedarf besteht rDNA-Amplifikation durch „rolling circle“-Replikation rDNA-Gene tandemartig im Chromosom angeordnet, einzige rRNA-Einheit wird herausgetrennt und diese erzeugt ringförmige extrachromosomale, replikationskompetente Struktur � rolling circle � Synthese während Oogenese ist für Bildung großer Mengen Ribosomen nötig, die in

Eizelle gespeichert werden. RNA-Pol II Gene

� 5´stromaufwärts Promotor (oft TATA-Box bei -25) � Intron-Exon-Struktur � Primärskript (hnRNA) enthält 5´UTR (untranslatierte Region), alle Exons und Introns

und 3´UTR � Transkriptionsstart +1 = Cap-Site � an Intron/Exongrenzen „consensus splice sites (Exon/GT…Intron…AG/Exon) � Polyadenylierungssignal

� Termination oft ungenau definiert � Regulation durch Enhancer

� gehören nicht zum Core-Promotor, sind nicht im Promotor-Bereich RNA-Pol II Promotorelemente Aufbau des Promotors eukaryotischer Gene ist wenig stark konserviert. Startnucleotid vieler Pol-II-Promotoren (+1) ist sehr häufug ein A und liegt meistens in Region, in der gehäuft Pyrimidine vorkommen � Initiator (-3 bis +5) Vergleichbar zu Promotoren von Prokaryoten findet man in allermeisten Pol-II-Promotoren AT-reiche Region � TATA-Box (-25), jedoch sind noch weitere Elemente wichtig � promotorproximale Elemente Bsp. bei -70 ist Sequenz vorhanden CCAAT und wird daher CAAT-Box genannt � Pol-Bindung via CBP (TF) Zusätzlich meist noch GC-reiche Region (-1 bis -167) stromaufwärts � definiert RNA-Pol Bindungsstelle Bei vielen Pol-II-Promotoren findet man eine Pribnow-Box ähnliche A=T-reiche Region � TATA-Box. Dazu kommt noch weniger gut definierte Initiationsregion kurz vor Transkriptionsstart (INR) sowie oft ein Down-stream-Promotor-Element (DPE). Diese 3 Bereiche nicht immer vorhanden, wenn z.B. TATA-Box fehlt ist oft Initiationsregion stärker ausgeprägt. Mit eukaryotischen Promotoren ist i.d.R. auch weiter stromaufwärts liegende aktive Sequenz verbunden � upstream-activating-sequenz (UAS) oder Enhancer genannt. Enhancer Regulatorische cis-Elemente, die in größeren Distanzen von basalen Promotoren entfernt positioniert sind, werden als distale Regulationselemente oder auch als Enhancer bezeichnet. Man findet Enhancer teilweise viele tausend bp vom Promotor entfernt (sowohl up- als auch downstream), wobei sogar relative Orientierung zum Promotor unwesentlich ist. Nicht selten findet man Enhancer auch in Introns eines Genes. An distalen Regulationselementen binden ebenfalls spezifische regulatorische TFs. ↔ Silencer Wirkungsweise wie negativer Enhancer � setzt Genaktivität herab Im Gegensatz zu Enhancer/Silencer müssen Promotor dagegen immer in 5´-3´-Richtung liegen um ihre Aktivität richtig auszuführen Prinzip molekularen Mechanismus d Regulation RNA-Sy nthese durch Steroidhormone Steroidhormonkomplex � Oligomer, das sequenzspezifisch an ein DNA-Element bindet Steroidhormone passieren die Cytoplasmamembran & binden an einen Rezeptor im Zellinneren. Der Hormon-Rezeptor-Komplex bewirkt die Transkription einer Reihe von Genen, indem er sich an Enhancer-Elemente bindet. Hormonrezeptoren weisen i.d. Regel drei unterschiedliche Domänen auf:

� DNA-Binde-Domäne � Liganden-Binde-Domäne � Transaktivierende Domäne

Chromatin und Genaktivität Da für Transkription RNA-Pol Zugang zur DNA haben muss, diese aber mit diversen Proteinen verpackt ist kommt Struktur und Zusammensetzung des Chromatins wichtige Kontrollfunktion zu. In Mitose ist gesamtes Chromatin stark kondensiert, weshalb in dieser Zeit DNA nicht abgelesen werden kann � somit ist Transkription auf Interphase beschränkt in der das Chromatin stark entspiralisiert ist. � meisten aktiven Gene liegen im Euchromatin vor Im Euchromatin ist DNA aufgelockert, sodass DNA für Protein der Transkription zugänglich ist. Im Heterochromatin hingegen ist DNA unzugänglich für RNA-Pol � keine Ablesung. Jedoch nicht alle im Euchromatin gelegenen Gene werden transkribiert. Unterscheidung zwischen aktivem und nicht-aktivem Euchromatin � Zustand des aktivem bzw. inaktivem Euchromatins sehr stabil und kann auf Tochterzelle übertragen werden (gleiches Muster) Zusammensetzung der Chromatinproteine oder ihre chemische Modifikation können Übergang vom „offenen“ transkribtionsaktivem Chromatin in kondensiertes, transkriptionsinaktives Chromatin bewirken. Acetylierung oder Methylierung an aminoterminalen Bereichen der Histone, die reich an Lysin-Resten sind, erschweren Abbaufähigkeit � katalysiert durch Histon-Acetyltransferase Dadurch werden positive Ladungen der Histone neutralisiert, was in weniger starken Bindung an negativ geladene Phosphatreste der DNA resultiert, auch Phosphorylierung von Serin oder Threonin kann zur Änderung der Chromatinstruktur führen. Schließlich tragen auch Veränderungen der DNA selbst zur Regulation der Transkription bei, wobei vor allem Methylierung von Cytosin von Bedeutung ist. Methylierung findet nur in GC-Dinucleotiden statt und führt zur Änderung der Zusammensetzung der an DNA gebundenen Proteine. Etwa 70% aller GC-Dinucleotide der menschlichen DNA sind methyliert. Polymerase III Gene

� tRNAs, 5S-rRNA, snRNAs � wesentlichen Elemente der Pol III-Promtoren liegen stromabwärts des

Transkritionsstarts werden also mittranskribiert � interne Promotoren � bei tRNAs gibt es eine A- und B-Box, die durch spezielle TFs erkannt werden

hnRNA reift im Zellkern zur mRNA Reifung oder Prozessierung eukaryotischer Primärskripte zur fertigen, translatierbaren mRNA schließt folgende Schritte ein:

� Hinzufügen einer Kappe am 5´-Ende (capping) � Polyadenylierung am 3´-Ende � Entfenung der Introns � Splicing

Capping Sobald ersten 25 Nucleotide der mRNA transkribiert sind, wird 5´-Ende (meist A oder G) modifiziert. Es wird ein modifiziertes Guanosin, das 7-Methylguanosin hinzugefügt � katalysiert durch Enzym Guanyltransferase. Dabei wird zunächst einer der 3 Phosphatreste am 5´-Ende der RNA entfernt, anschließend wird 7-Methylguanosin über 5´-5´-Verknüpfung (entgegensetzte Orientierung angefügt � Abspaltung von Diphosphat � modifiziertes 5´-Ende der mRNA wird als m7Gppp-Kappe bezeichnet. In vielen Fällen wird auch erstes und zweites Nucleotid der RNA durch Methylierung am C2´-Atom der Ribose modifiziert

Funktion der Cap-Struktur: � erhöht Stabilität der mRNA � induziert Splicing � fördert Export aus Nucleus � vermittelt Bindung der Ribosomen an mRNA und macht Translation möglich

� Prokaryoten haben kein Capping!!! 3´-Polyadenylierung Fast alle eukaryotischen mRNA-Moleküle (Ausnahme: meisten Histon-mRNAs) polyadenyliert. Die ca. 100-200 Nucleotide lange Polyadenylsäure am 3´-Ende der eukaryotischen mRNA-Moleküle ist nicht in DNA codiert. Polyadenylierung eines Primärskripts erfolgt in 2 Schritten:

� es kommt zur Erkennung einer konservierten Sequenz der mRNA (AAUAAA) durch mehrere Proteine darunter auch RNA-spaltende Enzyme (Endonucleasen). Diese schneiden Primärskript 10-35 Nucleotide stromabwärts (in 3´-Richtung) dieser Sequenz

� an so gebildeten 3´-Enden (=poly(A)-Stelle) katalysiert Poly(A)-Polymerase mit Hilfe weiterer Faktoren die Polymerisation der A´s wobei keine DNA als Matrize benötigt wird

In einem Primärskript kann es mehrere poly(A)-Stellen geben, sodass verschiedene Transkripte unterschiedlicher Länge gebildet werden können. Der poly(A)-Schwanz, der sowohl im Kern als auch im Cytoplasma mit dem poly(A)-bindenden Protein (PABP) assoziiert ist, übt entscheidenden Einfluss auf Stabilität der mRNA und Regulation der Translation aus. Splicing Eukaryotengene = Mosaikgene, die Intron-Exon-Struktur aufweisen Beim Spleißen werden Intronbereiche aus Primärskript herausgeschnitten und Exons miteinander verbunden � nur Exonsequenzen finden sich in reifer mRNA Spleißen kann auf 2 verschiedene Weisen erfolgen:

� autokatalytisches Spleißen („Selbst-Spleißen“) Das Primärskript erlangt durch seine Faltung enzymatische Aktivität � Riboenzyme Diese Aktivität erlaubt es der RNA ihre eigenen Introns zu entfernen

� in meisten Fällen jedoch erfolgt Spleißen in nucleären RNA-Protein-Partikeln � Spleißosomen Diese Ribonucleoproteine erkennen Consensus-Sequenz der Intron-Exon-Übergange, spalten hier Phosphordiesterbindungen und verknüpfen Exonenden miteinander.Consensus-Sequenz m 5´-Ende der Introns lautet AGGURAGU, wobei R für G oder A steht. Nahezu invariant sind dabei ersten beiden Basen des Introns GU, gleiche gilt für letzten beiden Basen des Introns, die nahezu immer AG sind.

1. Schritt Spleißvorgang: Phosphordiesterbindung an Exon-Intron-Grenze gespalten. 2´-OH-Gruppe eines Adenylatrestes greift aus Inneren des Introns 5´-terminalen Phosphatrest des Intronanfangs nucleophil an. � 2´-5´-Phosphordiesterbindung wird geknüpft. Durch diesen nun mit 3 Nucleotiden verknüpften Adenylatrest entsteht Schlaufe � Lassostruktur (lariat)

2. Schritt Spleißvorgang: Freigesetzte 3´-OH-Ende des 5´-Exon greift nun seinerseits Phosphordiesterbindung zwischen 3´-Ende des Introns und stromabwärts liegenden Exon an. � Intron wird in Lassoform freigesetzt und beide Exons miteinander verknüpft. Spleißosom großer Ribonucleotideproteinkomplex bestehend aus 50 Proteine und 5 kleine Kern-RNAs (snRNA) � U1 U2 U3 U4 U5 U6 Komplexe zwischen snRNAs und dazugehörigen Proteinen bezeichnet man auch als snRNPs („snurps“).

� U1-snRNP enthält eine der 5´-Spleißstelle komplementäre Sequenz � U2-snRNP sind zur Verzweigungstelle und Polypyrimidinbereich am 3´-Ende des

Introns komplementäre Sequenzen vorhanden � 3´-Spleißstelle selbst wird von U5-snRNP erkannt � U4-snRNP und U6-snRNP spielen Rolle bei Zusammensetzung aus Spleißosom � U6 ersetzt zudem während des Spleißvorgangs U1 an 5´-Spleißstelle

Obwohl Spleißreaktion selbst keine Energie aus ATP-Hydrolyse benötigt, wird ATP dennoch benutzt um Spleißkomplex aufzubauen � katalytische Reaktionen des Spleißosoms werden größtenteils durch RNA-Anteile direkt bewirkt alternatives Spleißen Durch Kombination unterschiedlicher Exons können aus Primärskript verschiedene mRNAs gebildet werden � differentielles oder alternatives Spleißen � ein Gen kann für mehrere mRNAs und somit ggf. auch für mehrere Proteine kodieren. Differentielles Spleißen ist Möglichkeit der Regulation der Genexpression und spielt bei verschiedenen Entwicklungsprozessen wichtige Rolle � Bsp. Geschlechtsdetermination bei Drosophila Je nach Splicemechanismus werden 4 verschied. Grupp en von Introns unterschieden:

� tRNA Introns � autokatalytische Introns Gruppe I

externes GMP bindet sich an das 5’-Ende des Introns, freies 3’-OH-Ende von Exon 1 bindet sich an das 5’-PO4-Ende von Exon 2, während sich das Intron unter Bildung einer Schleife (Lariat) selbst herauslöst, hierbei muss keine Energie aufgewendet werden, da die Phosphordiesterbindung, zwischen dem Intron und den beiden Exons auf die beiden Exons übertragen wird

� autokatalytische Introns Gruppe II ähnlich wie bei Gruppe I, nur das hier statt des externen GMPs die ans Ende von Exon 2 eingebaute Base Adenosin mit ihrer 2’-OH-Gruppe mit der ersten 5’-PO4-Gruppe des 1. Nukleotids des Introns reagiert, auch hier bildet sich ein Lariat

� hn/mRNA Introns nicht autokatalytisch!!! i.d. Regel bei Eukaryoten meist unter Beteiligung von Enzymen, die die autokatalytische Funktion der RNA ersetzen, es werden Spliceosome gebildet, die das Intron an bestimmten Sequenzen (‚Consensuns Splice Site’) herausschneiden

GENTECHNOLOGIE Warum ist Gentechnologie möglich?

� alle Organismen speichern Erbinformation in DNA � genetischer Code ist fast bei allen Organismen identisch � genetische Eigenschaften lassen sich mit reiner DNA zwischen verschiedenen

Organismen übertragen Voraussetzung für Gentechnologie

� Spender-DNA (z.B. ein Gen) � Vektor-DNA � Restriktionsenzyme � DNA-Ligase � DNA-Transfermethode � Wirtsorganismus

Basenpaarspezifische Endonucleasen: Restriktionsenz yme Endonucleasen, die DNA sequenzspezifisch schneiden � Restriktionsendonucleasen Restriktionsenzyme erkennen und hydrolisieren fremde DNA an einer Tetra-bis Oktanucleotidfolge, die in Bakterien-DNA durch Methylierung von Einzelbasen modifiziert sein kann. Methylierung der Adenine und Cytosine (m6A bzw. m5C) verleiht Bakterien-DNA spezifisches Erkennungsmuster, das unter anderem Schutz gegen eigene Restriktionsenzyme dient

� Typ1-Restriktionsenzyme erkennen definierte Sequenzen, aber schneiden DNA an entfernt gelegenen zufälligen Stellen. (Methyltransferaseaktivität gekoppelt & benötigt ATP)

� Typ2-Restriktionsenzyme spalten an der Erkennunsstelle oder in enger Nachbarschaft (Methyltransferaseaktivität nicht gekoppelt & kein ATP)

� Typ3-Restriktionsenzyme spalten DNA in Abstand von 20-25 bp von Erkennungsstelle (Methyltransferaseaktivität gekoppelt & brauchen ATP als Cofaktor)

Restriktionsenzyme vom Typ2 (wichtigster Typ für Gentechnologie) erkennen und schneiden DNA an palindromischen Sequenzen z.B. 5´-GGAATTCC-3´. Restriktionsenzyme können glatte oder überhängende Enden produzieren: � Alu 1, Eco R5 � Eco R1 , Bam H1, Hind 3

� Hha 1, Pst 1

Nomenklatur Restriktionsenzyme

� Eco R1 � E: Gattunsname: Escherichia � co: Artname: coli � R: Stamm/Serotyp: Stamm R � 1: Reihenfolge der Entdeckung: 1. Enzym

DNA-Ligase DNA-Ligasen schließen Phosphordiesterbindungen zwischen 5´-Phosphatgruppe an einem DNA-Ende und 3´-OH-Gruppe an anderem DNA-Ende. Bakterien besitzen eine, Eukaryoten mehrere verschiedene DNA-Ligasen. Unterschied:

� Bakterienenzym braucht NAD, � Eukaryotenenzym braucht ATP als Cofaktor

In beiden Fällen verläuft jedoch Reaktion über ähnliche Einzelschritte

� Bildung Enzym-Nucleotid-Intermediats durch Transfer des AMP-Anteils von NAD oder ATP auf Aminogruppe einer Lysinkette des Enzyms

� Übertragung des AMP-Restes auf 5´-Phosphat-Ende der DNA � Bildung der Phosphordiesterbindung über Angriff der 3´-OH-Gruppe auf aktivierte 5´-

Phosphat mit Freisetzung des AMP-Restes und des Enzyms. Vektor-DNA

� Trägermoleküle (wie Plasmide), die es erlauben, ein kleines Stück einer beliebigen DNA-Sequenz in eine Bakterienzelle einzuführen und dort zu vermehren

� sorgt für Replikation in der Wirtszelle � stellt selektierbare Markergene bereit � hat Vielzweck-Klonierungsstelle � besitzt einen Replikationsorigin � trägt Signalsequenzen für Genexpression � verschiedenste Modifikationen für spezielle Anwendungen (z.B. Shuttle zwischen

Pro- und Eukaryoten; Elemente für künstliche Chromosomen) � für die Expression fremder Gene gibt es spezielle Expressionsvektoren

Plasmide: Ringförmige, sich autonom replizierende DNAs, können in vielen Kopien/Zellen vorliegen Bakteriophagen: Viren, die Bakterien infizieren. Bei Verwendung von Phagen als Klonierungsvektoren werden einzige Bereiche der Phagen-DNA durch Fremd-DNA ersetzt. Bereiche, die für Vermehrung der Phagen nötig sind, bleiben erhalten. Cosmide: Sind Hybridmoleküle zwischen Plasmiden und Bakteriophagen, wobei sie von Plasmiden Replikationsstart und Resistenzgen, von Bakteriophagen sog. Cos-Stellen, die kohäsiven Enden, enthalten. DNA ist ringförmig und vermehrt sich wie Plasmid-DNA autonom in Bakterien, wobei sie in mehreren Kopien/Zelle vorliegen. Bei Klonierung Cosmid-DNA in vitro in Phagenköpfe verpackt, und in dieser Form kann sie durch Infektion in Baktierien gebracht werden. Allerdings fehlen der Cosmid-DNA Sequenzen zur Synthese neuer Phagenpartikel, so dass sie sich nur wie Plasmid-DNA in Bakterienzelle vermehren kann.

YACs (künstliche Hefechromosomen): Es handelt sich um Vektoren, die Teile eines Hefechromosoms besitzen und zwar Replikationsstart, Zentromer und Telomer, zusätzlich enthalten sie Selektionsmarker. Kommen wie alle natürlichen Chromosomen in zwei Kopien/Zelle vor. Bei Teilung der Hefezellen verhalten sie sich wie jedes andere Chromosom und ihre „Chromatiden“ werden gleichmäßig auf beide Tochterzellen verteilt. BACs (künstliche Bakterienchromosomen): Hierbei handelt es sich um F-Plasmide, die so verändert wurden, dass in ihnen große DNA-Fragmente aufgenommen werden können. PACs (Phage P1-based artificial chromosomes): Sind Derivate des Phagen P1 � zur genetischen Transduktion fähig. PAC-DNA liegt als Plasmid in Zelle vor und repliziert sich autonom.

Vektor Wirtszelle Größe des klonierten DNA-Fragments

Plasmid Bakterien bis ca. 15 kb Bakteriophagen λ Bakterien 10 – 15 kb

Cosmid Bakterien ca. 45 kb YAC Hefe bis ca. 1000 kb BAC Bakterien bis ca. 300 kb PAC Bakterien bis ca. 300 kb

typischer Plasmidvektor weist folgende Eigenschaften auf:

� Replikon Wichtigste Eigenschaft, die Plasmid aufweist ist eigener Replikationsursprung, hierdurch ist Plasmid befähigt, in der Bakterienzelle unabhängig vom Bakterienchromosom zu replizieren. Fremd-DNA die in Plasmidmolekül integriet ist, wird mitrepliziert und auf diese Art und Weise vermehrt und auf Tochterzellen weitergegeben.

� Markergene (Selektion, Doppelselektion)

Ein typischer Plasmidvektor enthält ein oder mehrere Markergene, anhand derer man erkennen kann, ob Bakterienzelle das Plasmid enthält oder nicht (Selektion). Manche Plasmidvektoren weisen jedoch nicht nur ein einziges Markergen aus, das reine Anwesenheit des Plasmids in Bakterienzelle verdeutlicht, sondern ermöglichen sog. Doppelselektion, durch die Untersuchung von rekombinanten und nicht rekombinanten Plasmiden ermöglicht wird. Markergen, das in sehr vielen Vektoren für Doppelselektion vorhanden ist, ist lacZ´-Gen.

� MCS („multiple cloning site“)

Viele moderne Klonierungsvektoren bieten Möglichkeit, DNA-Molekül mit den unterschiedlichen Enden zu klonieren. Hierfür findet sich an bestimmten Stelle des Plasmids eine „multiple cloning site“ (MCS) oder multiple Klonierungsstelle, an der viele unterschiedliche Restriktionsenzyme schneiden.

� Signalsequenzen

Soll Klonierungsexperiment nicht nur der Vermehrung der klonierten DNA dienen, sondern darüber hinaus das von Fremd-DNA kodierte Genprodukt isoliert werden, so müssen alle für Expression notwendigen Siganlsequenzen von der Vektor-DNA bereitgestellt werden. (Promotor/Operator, Ribosomenbindungsstelle,Terminator)

Versuche mit pUC-Plasmiden (Praktikum) Die Vektoren pUC 18/19 (geringe Größe von 2,7 kb) erfüllen alle Anforderungen, die typische, moderne Plasmidvektoren benötigen: Sie besitzen den oriV (Ring-zu-Ring-Replikation) und zusätzlich ein Markergen (ampR-Gen), was für das Enzym β-Lactamase kodiert, das Ampicillin-Resistenz vermittelt. Des weiteren besitzen sie eine zur Aufnahme von Fremd-DNA besonders eingefügten DNA-Abschnitt mit vielen Restriktionsschnittstellen (MCS). Diese MCS-Sequenz liegt innerhalb eines 5´-Abschnitts des lacZ-Gens. Dieser Abschnitt kodiert aminoterminalen Teil der β-Galactosidase. Um Selektionssymstem gut ausnutzen zu können, müssen passende Bakterienstämme verwendet werden, die auf ihrem Genom den 3´-Abschnitt des lacZ-Gens besitzen und deswegen des carboxyterminalen Teil der β-Galactosidase kodieren. Bakterien mit pUC 18/19 sind ampicillinresistent und besitzen überdies funktionsfähige β-Galactosidase, die sich aus dem plasmidkodierten Anteil und genomkodierten Anteil zusammensetzt. Diese Bakterien bilden in Gegenwart des Farbstoffes X-Gal blaue Kolonien. Einbau der Fremd-DNA in MCS zerstört Leseraster des lacZ-Gens. Betreffenden Bakterienkolonien bleiben in Gegenwart von X-Gal farblos. Kolonien auf Ampicillin-Agar mit X-Gal � blau, wenn sie pUC 18/19 enthalten Kolonien auf Ampicillin-Agar mit X-Gal � weiß, wenn sie pUC 18/19 und Fremd-DNA haben Wichtiges Kriterium, das guten Plasmidvektor auszeichnet ist geringes Molekuargewicht, da kleine Moleküle durch Transformation wesentlich besser von Bakterienzellen aufgenommen werden als große. Aus diesem Grund ist nicht das komplette lacZ-Gen in Vektoren pUC 18/19 vorhanden, sondern nur bestimmter Teil � lacZ´-Fragment (ersten 59 AS) Genom der E.coli-Zellen, die an Klonierungsexperiment mit Vektoren pUC 18/19 eingesetzt werden, tragen Deletion ∆M15. Dieser deletierte Bereich kodiert für AS 11 bis 41 der β-Galactosidase. Auf Polypeptidebene lagern sich vom Bakteriengenom und Plasmid kodierten Fragmente der β-Galactosidase zusammen und bilden funktionsfähiges Enzym. � α-Komplementation

Gentechnologie an höheren Organismen:

� komplizierter wegen Vielzelligkeit � muss im einzelligen Stadium (Zygote!!!) angewendet werden, da sich die genetische

Veränderung sonst nicht auf alle Zellen verteilen würde... transgen Bezeichnung für einen Organismus, der ein künstlich eingeführtes (fremdes) Gen in allen Zellen seines Körpers trägt und dadurch neue Eigenschaften erhält. Das Gen wird in die Keimzellen oder die befruchtete Eizelle eingeführt und dann durch Zellteilung an sämtliche Körperzellen weitergegeben, so dass aus der Eizelle ein transgenes Tier heranwächst. Pflanzengentechnologie:

� Pflanzen haben keine Keimbahn, deswegen kann man direkt Soma-Zellen

entnehmen, diese verändern und neue Pflanzen daraus züchten � Ti-Plasmid � eine ringförmige DNA, die in dem Bodenbakterium Agrobacterium

tumefaciens vorkommt, das vor allem Pflanzen infiziert. Das Plasmid enthält mehrere Gene, von denen ein Abschnitt, der als T-DNA bezeichnet wird, sich in die chromosomale DNA der Pflanzenzelle einbaut. Die Eigenschaften des Plasmids und der T-DNA ermöglichen es Gentechnikern, diese DNA zu verwenden, um fremde Gene in Zellen zu schleusen

� Ti-Plasmid kann leicht in Pflanzen gelangen, sich in das Pflanzengenom integrieren und sich leicht selbst replizieren

(Genkanone: wird bei den Pflanzen angewendet, die nicht mit dem Ti Plasmid von A. tumefaciens infiziert werden können)