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Grundpraktikum Genetik WS 2005/2006, Kurs D/E/F 1

Genetisches Grundpraktikum WS 2005/2006

Kurs D/E/F


23114 d/e/f P/S Grundpraktikum Genetik WS 2005/2006 Kurs D Mi 900-1200 Uhr Kurs E Fr 900-1200 Uhr Kurs F Fr 1400-1700 Uhr

Internet: http://www.angenetik.fu-berlin.de Lehrveranstalter:

Prof. Dr. Reinhard Kunze Altbau Raum106 [email protected] 838-55802Prof. Dr. Wolfgang Schuster Neubau Raum 208 [email protected] 838-56797Dr. Alexander Heyl Neubau Raum 211 [email protected] 838-56550Dr. Christine Rausch Altbau Raum 2 (EG) [email protected] 838-55815Dr. Michael Riefler Neubau Raum 210 [email protected] 838-56796

Tutoren: Ben Krause ([email protected]),

Mona von Harder ([email protected]), Daniel Ibrahim ([email protected])

Im Rahmen des Praktikums findet ein Tutorium zur Vor- und Nachbereitung der

Kurstage/Klausur statt !!! Termin wird am ersten Kurstag bekanntgegeben. Kriterien für Scheinvergabe: 1. Regelmäßige Teilnahme am Kurs, 1 Fehltag erlaubt. 2. Für jedes Experiment wird ein Gruppenprotokoll (von je 2 Studenten) angefertigt. a) Aufbau des Protokolls:

b) Abgabe des Protokolls spätestens zwei Wochen nach Beendigung des Versuchs. Da sich einige Versuche über mehrere Wochen erstrecken sind Versuchsende und Kurstag jedoch nicht immer gleichzusetzen. Die Protokolle werden korrigiert und benotet. Protokolle werden nur bis zum 10.02.2006 angenommen. Ein nicht abgegebenes Protokoll wird danach als Fehltag gewertet.

3. Mikroskopische Auswertungen werden mit von jedem Studenten selbst angefertigten Zeichnungen dokumentiert. 4. Eine Klausur, in der Kursinhalte und Versuche abgefragt werden. (60% der Punkte = Note 4,0) Termine für die Klausur: 01./03.02.2006 5. Die Scheine werden benotet. Dabei geht die Klausurnote zu 80%, die Note für die Ausarbeitung der Protokolle zu 20% in die Bewertung ein.

Allgemeines: Wir legen das Hauptgewicht auf den praktischen Teil des Kurses, der nicht im Eigenstudium durchgeführt werden kann und wir gehen davon aus, dass Sie sich durch die Vorlesung Genetik sowie durch entsprechende Bücher theoretisch vorbereitet haben. Als Orientierung für den Stoffumfang sind die Stichworte zu den einzelnen Kurstagen angegeben. Über das zum Experiment notwendige hinaus werden wir sehr wenig erläutern. Die Seminarthemen sind zwar Kurstag bezogen, bieten aber nur kleine Ausschnitte und ersetzen nicht eine gründliche Vorbereitung. Das Mitbringen eines Taschenrechners ist an jedem Kurstag vorteilhaft und an manchen Kurstagen unerlässlich!!!

i. Einleitung ii. Material und Methodeniii. Ergebnisse iv. Diskussion


Kursplan Grundkurs Genetik: WS 2005/2006

Kursleiter: Heyl, Kunze, Rausch, Riefler, Schuster

Kursplan: Grundpraktikum Genetik Mi 900-1200, Fr 900-1200, Fr 1400-1700

Termin (Mi./Fr.)

Kurstag

Thema Experimente Stichworte

26./28.10. Michael Riefler

1 Cytogenetik Mitose Quetschpräparate aus Wurzelspitzen 1. Vicia faba,( Crepis capillaris) Fixierte Präparate, Färbung durch Studenten; einige Fertigpräparate Meiose und Chromosomenmutationen 2. Dauerpräparate Vicia faba, Paeonia tenuifolia

Kursbesprechung DNA-Struktur, Chromosomenaufbau, Mitose, genetische Kompartimente Rekombination, Meiose, Gametophyten, Spermatophyten, Generationswechsel, doppelte Befruchtung

02./04.11. Christine Rausch

2 Klassische Genetik I

Mendelsche Gesetze 3./4. Mono- u. dihybride Erbgänge, Signifikanz Lycopersicon esculentum, Antirrhinum majus

Mendelsche Regeln Statistik, chi-Quadrat, Homogenitätstest


3 Klassische Genetik II

Rekombination, Genkartierung 5. Kopplungsanalyse (Attraktion, Repulsion) Antirrhinum - Rückkreuzungs- u. Selbstungsnachkommen

Kopplung u. Genkartierung, Attraktion, Repulsion Crossing- over, Rekombinationsfrequenz, Morgan (cM-Definition),


4 Transformation Pflanzentransformation 6. Blattscheibentransformation bei Tabak 7. Reportergenanalyse (Fertigpräparate)

Pfl.-Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens, Antibiotikaresistenzen, Marker-/Reportergene,

23./25.11. Wolfgang Schuster

5 Klassische Genetik IV

Molekulare Genetik I

Verknüpfung Klass./Mol. Genetik 8. Segregation transgener Pflanzen (Antibiotikaresistenz) Theorie zur Molekularen Genetik 9. Ligation für Klonierung

Vektoren, Bakterien, Plasmide, Bakterientransformation, Multiple Cloning sites, Klonierung, Selektionsmarker, Ligase/Ligation, kompetente Zellen, α-, lacZ-Operon

30.11./ 02.12. Alexander Heyl

6 Molekulare Genetik II

10. Bakterientransformation 11. Komplementation ( Hefe) 12. PCR

Komplementation, siehe 5. KT


Termin (Mi./Fr.)

Kurstag

Thema Experimente Stichworte

07./09.12. Alexander Heyl

7 Molekulare Genetik III

→ Auswertung Bakt.-Transformation 13. Plasmid-DNA-Präparation → Auswertung Transformation (Tabak)

siehe 5. KT

14./16.12. Alexander Heyl

8 Molekulare Genetik III

→ Auswertung Bakt.-Transformation 14. Restriktionsanalyse 15. Gelelektrophorese → Auswertung Transformation (Tabak)

siehe 5. KT

04./06.01. Reinhard Kunze

9 Molekulare Genetik IV

16. Bioinformatik im Computerraum der Biochemie

Literaturrecherche, BLAST, Gendatenbanken, Sequenzanalysen, Restriktionsanalyse

11./13.01. Reinhard Kunze

10 Mutation und Supplementation

Mutation und Supplementation 17. UV-Mutagenese (E. coli) 18. Supplementation (Matthiola) 19. Transposons (Zea mays)

Transposonmutagenese (Ds/Ac-Elemente), Supplementation, Komplentation, Genwirkketten, Polygenie, t-Test, verschiedene Mutagene, Gen-/ Chromoso-men- und Genom-Mutationen

18./20.01. Michael Riefler

11 Klassische Genetik III

20. Multiple Allelie: Anagallis arvensis 21. Zygotische Letalfaktoren: Urtica urens

Abweichungen von den Mendelschen Regeln, Genwechselwirkungen, Geschlechtsgebundene Vererbung, Chromosomen- u. Genommutationen

25./27.01. Wolfgang Schuster

12 Populationsgenetik

22. Allogame Populationen am Beispiel von Trifolium spec. 23. Autogame Populationen am Beispiel von Hordeum vulgare

Populationsgenetik, Hardy-Weinberg-Regel, Fitness, Selektion

01./03.02. 13 Klausur Abschlussklausur und Abschlussbesprechung

Änderungen im Kursprogramm können sich durch das Pflanzenwachstum ergeben!


Einige Bücher zum Thema Brown, T. A.: Moderne Genetik, 2. Aufl. 1999, Spektrum Akadem. Verl.

Gottschalk W.: Allgemeine Genetik, 4. Aufl. 1994, Thieme Verl.

Griffith et al., Introduction in Genetics, 7. ed. 2000, Freeman Publ. (Man erhält zusätzlich eine CD mit Lehrfilmen und der Verlag hat ein paar Zugaben ins Internet gestellt.)

Hagemann R.: Allgemeine Genetik. 4. Aufl. 1999, UTB

Hartl, D. L. & Jones E. W.: Genetics Analysis of Genes and Genomes, 5. Aufl. 2001, Jones and

Bartlett Publ., Inc.

Henning W.: Genetik. 3. Aufl. 2002, Springer-Verlag.

Knippers R.: Molekulare Genetik. 8. Aufl. 2001, Thieme Verl.

Lewin B.: Gene, 2002, VCH.

Munk K.: Grundstudium Biologie Genetik, 2001, Spektrum Akadem. Verl.

Odenbach W. et al.: Biologische Grundlagen der Pflanzenzüchtung, 1. Aufl. 1997, Parey-Verlag.

(das ideale Buch für einige Teile des Grundkurses in der Angewandten Genetik, da viele Autoren aus dem Haus

kommen. Das Buch ist sehr stark an Pflanzen orientiert.) Passarge E.: Taschenatlas der Genetik, 1994 (2004)., Thieme Verl.

Passarge E.: Color Atlas of Genetics, 2001., Thieme Verl.

Seyffert W.: Lehrbuch der Genetik., 2. Aufl. 2003, G. Fischer Verl.

Snustad et al., Principles in Genetics, 2. Aufl. 2000, Wiley-Publ.

Strickberger M.W.: Genetik. 1. Aufl. 1988, C. Hanser Verl.

☺ Gonick L.: Genetik in Cartoons, 2001, Blackwell Wissenschafts-Verlag.

Links Nachschlagewerke im Internet (Dictionary bzw. Sammlung an Laborprotokollen)

http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/index.html

http://www.protocol-online.net/

http://www.botany.uwc.ac.za/mirrors/MIT-bio/bio/7001main.html http://www.biokurs.de/skripten/13/bs13.htm

Wichtige Seiten in der Genomforschung mit DNA/Protein-Datenbanken und vielen Bioinformatik-Tools

http://www.arabidopsis.org Datenbank des pflanzlichen Modellorganismus Arabidopsis thaliana

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Größte Online-Gendatenbank. Geeignet für Literaturrecherche über Pubmed.

http://www.ebi.ac.uk Europäische Gendatenbank.

http://www.expasy.ch/prosite Proteindatenbank. Erlaubt umfangreiche Untersuchungen der Proteinstruktur.

http://www.bioinformatics.vg/index.shtml Linkliste aller verfügbaren Bioinformatikprogramme zur Untersuchung der

Struktur von DNA und Proteinen.


1. Kurstag: Mitose und Meiose Stichworte: Mitose, Chromosomen (akrozentrisch, metazentrisch, telozentrisch), Chromatiden, Telomere, Centromere, Zellzyklus, G0-, G1-, G2-, S-Phase, Meiose, Homologie, Rekombination, synaptonemaler Komplex, crossing over, Chiasmata weitere Quellen: Wer etwas mehr als das Lehrbuchwissen nacharbeiten will, der soll mit den Stichworten in den Indices von z.B. Biologie in unserer Zeit oder Spektrum der Wissenschaften nachschlagen, z.B.: A.W. Murray & J.W. Szostak (1988): "Künstliche Chromosomen", Spektr. d.Wiss. Heft 1, 86-93 Versuch 1: Mitose Material Vicia faba (Acker-/Saubohne), Crepis capillaris (Grüner Pippau) Untersuchung von Wurzelspitzen von Crepis capillaris (n=3, diploid) und Vicia faba (n=6, diploid) Für die Untersuchung von Mitosen eignen sich meristematische Gewebe besonders gut (warum?). Sie sollen aus dem subapikalen meristematischen Gewebe der Wurzelspitze von Crepis capillaris und Vicia faba Quetschpräparate herstellen, um Mitosen zu untersuchen. Die Wurzelspitzen wurden zuvor fixiert, mit Colchizinlsg. behandelt und angefärbt (siehe Fixierung von Wurzelspitzen und Färbung im Anhang). Welche Wirkung hat Colchizin auf die Zelle bzw. Mitose? Quetsch-Präparation der Chromosomen Schneiden Sie die intensiv rot gefärbten Bereiche der Wurzelspitzen (0,5-0,75 cm) ab und legen Sie diese auf einen Objektträger (bei Crepis die Orcein-Färbelsg. entfernen) (A). Überschichten Sie die Wurzelspitze mit einem Tropfen verd. Karmin-Essigsäure (0,5 % (w/v) Karmin in 45 % (v/v) Essigsäure) und erhitzen* Sie diese, mit einer kleinen Flamme, leicht (kein Kochen) (B). Anschließend werden die Präparate mit einem Deckglas abgedeckt und zunächst mit einem kräftigen Daumendruck und dann mittels gefühlvollem Klopfen mit einer Präpariernadel gespreitet (C). Die Präparate können nun mit dem Mikroskop nach Mitosen abgesucht werden. Vor dem ersten Gebrauch sollten Sie das Mikroskop köhlern (siehe Anhang). Wenn Sie Mitosen finden, werden diese vorwiegend in der Metaphase sein (warum?). Zeichnen Sie mindestens zwei Mitosen für den Ergebnissteil des Protokolls. * kann evtl. entfallen, wenn Präparate schon länger eingelegt und sehr weich sind


Vorbereitung der Proben (wurde vorab durchgeführt): Fixierung von Wurzelspitzen Behandlung der Wurzelspitzen mit 2 mM 8-Hydroxychinolin,α-Monobromnaphtalinlösung (Crepis) oder 0,05 % Colchizinlösung (Vicia) für 3 - 4 h bei RT, anschließend 30 min bei 4 °C. Für sehr feine Wurzeln können die Zeiten u. U. noch stärker verkürzt werden (30 min). ⇒ Anreicherung von Metaphasen Das Material kurz trocken tupfen und sofort in frisch hergestellte Fixierungslösung (Ethanol: Eisessig [3:1]) geben. Die Fixierungslösung wird 3-5 mal nach jeweils 15-30 min gegen frische Lösung ausgetauscht. Die Wurzelspitzen werden mindestens 10 h bei RT fixiert und sollten danach bei 4 °C, für längere Zeit besser bei -20°C aufbewahrt werden. Färben Crepis: Wurzelspitzen werden über Nacht (oder mind. 3 h) in Orcein-Essigsäure (2 % (w/v) Orcein, 45 % (v/v) Essigsäure) gelegt. Vicia: Wurzelspitzen werden mind. 24-48 h in Eisenkarmin (100 ml 0,5%ige Karminessigsäure + 1-2 ml 10% Fe3Cl-Lsg.) gefärbt und dann in verdünnter Karminessigsäure (0,5 % (w/v) Karmin in 45 % (v/v) Essigsäure) aufbewahrt (mehrere Wochen möglich). Versuch 2: Meiose (Dauerpräparate) Präparate von Meiosen aus Vicia faba oder Paeonia tenuifolia (dünnblättrige Pfingstrose) Nehmen Sie sich ein Dauerpräparat aus der Objekträgermappe und suchen Sie mit Hilfe des Mikroskops nach Meiosestadien. Zeichnen Sie mind. zwei Stadien für das Protokoll. Achtung ! Vergessen Sie nicht, wenn Sie mit dem Mikroskopieren fertig sind, die Präparate vom Objekttisch zurück in die Objekträgermappe zu legen.

Auswertung und Protokoll für Versuch 1 & 2: Der Ergebnissteil umfasst nicht nur vier gut beschriftete Zeichnungen, sondern auch eine Beschreibung dieser in Textform. Wenn Ihre Ergebnisse vom Erwarteten abweichen, sollten Sie dieses in der Diskussion darlegen und versuchen Gründe dafür anzuführen.


2. Kurstag: Klassische Genetik I Stichworte: 1. und 2. Mendelsche Regel, Uniformitätsregel, Unabhängigkeitsregel, rezessiv, dominant, codominant, intermediär, Gen (das nicht-molekularbiologische) als Rekombinationseinheit, Wildtyp, Mutante, Allel, heterozygot, homozygot, statistische Methoden. Versuch 3: Vererbung der Blattform bei Lycopersicon esculentum ( ____________ Erbgang ?)

Genotypen Phänotypen La+/La+ unpaarig gefiederte Blätter La+/La teilweise gelappte Blätter (ungefiedert) La/La verkümmerte Pflanzen La+ (Wildtyp), La (Mutation: lancelata = Längliche Blattform) Jede Gruppe untersucht zwei Pikierkisten mit jeweils 40 Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum, Familie Solanaceae). Jede Pflanze soll einem der folgenden Phänotypen zugeordnet werden (siehe auch Abb.): unpaarig gefiederte Blätter, teilweise gelappte Blätter oder verkümmerte Pflanzen. Tragen sie das Ergebnis für Ihre 80 Pflanzen (= eine Stichprobe) in die Tabelle (Spalte : Beobachtung) ein. Die Segregation der analysierten Pflanzen entspricht dem Verhältnis einer F2-Generation aus der Kreuzung reiner Linien [La+/La+] x [La/La]. Bei einem dominant/rezessiven Erbgang erwarten wir eine Aufspaltung von (?): ___zu___. Bei einem intermediären Erbgang erwarten wir eine Aufspaltung von(?): ___zu___zu___ . Um was für einen Erbgang handelt es sich hier (?):_____________________ Tragen sie die zu erwartenden Nach-kommenzahlen in die Tabelle (Spalte: Erwartung) ein. Warum ist es vermutlich keine F2-Generation aus der Kreuzung der reinen Linien [La+/La+] x [La/La]?


Tabelle zur Auswertung und Berechnung einer Einzelstichprobe (1 Stichprobe = 80 Pflanzen):

Beobachtung Erwartung χ2-Test unpaarig gefiederte

Blätter

teilweise gelappte Blätter (ungefiedert)

verkümmerte Pflanzen

Summe 80 80 Die Liste, in die alle Stichproben eingetragen werden, erhalten Sie am Kurstag. Erklärung und Beispiel: Sie wollen Ihre gesammelten Daten auf Signifikanz überprüfen. Das bedeutet, Sie wollen vergleichen, ob Ihre ausgezählten Werte den Erwartungswerten entsprechen. Die Werte müssen nicht absolut mit den Erwartungswerten übereinstimmen, um signifikant zu sein. Um zu entscheiden, ob eine Stichprobe nur eine zufällige Abweichung zeigt oder ob sie wirklich nicht mit dem Erwartungswert übereinstimmt hilft Ihnen der χ2-Test. Auswertung: Mit den Werten für Erwartung und Beobachtung soll ein einfacher χ2-Test (Chiquadrat-Test) durchgeführt werden. Das Ergebnis des χ2-Tests gibt Aufschluß darüber, ob die Nullhypothese angenommen oder abgelehnt wird. Zuvor müssen jedoch die Stichproben auf Homogenität getestet werden, um zu klären, ob alle Einzelergebnisse zusammengefasst werden dürfen. Erst dann kann mit den zusammengefassten Werten aller Einzelstichproben ein χ2-Test ausgeführt werden.


Formeln:

FG = k - 1

FG Homogenität = (k - 1) . (n - 1)

χα2 ≥ χ2

χ2 > χα2

Legende: ei = Erwartung für die Klasse i (z.B. Phänotyp) bi = Beobachtungswert für die Klasse i k = Anzahl unterschiedlicher Klassen n = Anzahl der verglichenen Experimente α = Irrtumswahrscheinlichkeit (in der Biologie normalerweise 5% ^ 0,05) χ2 = Chi-Quadrat-Wert FG = Freiheitsgrad (e)

k (bi – ei)2

χ2 = ∑i=1 ei

k (bi – ei)2

χ2 = ∑i=1 ei

n

χ2Homogenität = ∑ χi

2 - χ2gesamt

i=1

Die Unterschiede zwischen Beobachtung und Erwartung sind signifikant, die Nullhypothese wird abgelehnt.

Die Unterschiede zwischen Beobachtung und Erwartung sind zufällig, die Nullhypothese wird angenommen.


Versuch 4: Vererbung von _______ und _______ der Blätter bei Antirrhinum majus (Dihybrider Erbgang) In diesem Versuch sollen Sie einen dihybriden Erbgang bei Antirrhinum majus (Garten-Löwenmäulchen) untersuchen. Betrachtet werden die Gene virtelina und graminifolia, die in jeweils 2 Allelen vorliegen: dem Wildtyp (virtelina+ bzw. graminifolia+)*1 und einer Mutation (virtelina bzw. graminifolia)*2. Finden Sie eigenständig heraus, welche beiden phänotypischen Blattmerkmale von den beiden Genen beeinflusst werden könnten. Jedes Merkmal können Sie einem Gen und jede Ausprägung einem Allel zuordnen (Beispiel: Merkmal (Gen) = Blattbehaarung, Ausprägungen (Allele) = unbehaart/behaart). Pro Nase (nicht pro Gruppe) soll ein Topf mit ca. 90 jungen Löwenmäulchen ausgewertet werden. Ordnen Sie jeder Pflanze eine der vier möglichen Allelkombinationen zu.

Welches Gen dem jeweiligen Blattmerkmal zuzuordnen ist, erfahren Sie von den Tutoren/Kursleiter/in. Jeder Topf entspricht einer Stichprobe (1 Nachkommenschaft/F2). Die Stichproben des Kurses werden gesammelt (ca. 20 Stück) und in eine Liste eingetragen, die später fotokopiert wird. Zur Auswertung werden die Stichprobenwerte des gesamten Kurses benötigt !! *1 In der Genformel werden die Allele des Wildtyps (unter natürlichen Umweltbedingungen am häufigsten vor-kommender Phänotyp einer Art oder Rasse) mit einem hochgestellten Pluszeichen gekennzeichnet. *2 Gene werden häufig nach ihren „Defekt“-Mutationen benannt. Beispiel: Das Gen white bei Drosphila melanogaster wurde nach einer Mutation benannt, die phänotypisch eine weiße Augenfarbe hervorruft. Im Wildtyp (siehe unten) ist das Gen white jedoch für die Ausprägung der roten Augenfarbe verantwortlich. Also könnte man das Gen white auch „Gen für die rote Augenfarbe, wenn defekt weiße Augenfarbe“ nennen.

Gen Merkmal Allel Ausprägung

virtelina+ virtelina

virtelina

graminifolia+ graminifolia

graminifolia


1 Topf: Beobachtung Erwartung χ2-Test virtelina+/ graminifolia+

virtelina/ graminifolia+

virtelina+/ graminifolia

virtelina/ graminifolia

Summe

Auswertung:

Welche Merkmale zeichnen die Pflanzen aus und wie spalten diese auf? Welche Gene sind an dem Phänotyp beteiligt und mit welchem Erbgang nach Mendel kann die

Segregation erklärt werden? Welche theoretische Aufspaltung wäre zu erwarten? Welchen Phänotyp hat die Wildtyppflanze? Die Ergebnisse der Einzelgruppen (Stichproben) und die aufgestellte Hypothese sollen mit

Hilfe des χ2-Tests überprüft werden. Die unterschiedlichen Einzelergebnisse sollen auf der Basis des χ2-Tests auf Homogenität überprüft werden, um zu klären, ob alle Einzelergebnisse zusammengefasst werden dürfen. Ist dies der Fall, kann mit den zusammengefassten Werten ein χ2-Test durchgeführt werden. Die Auswertung erfolgt analog zur Auswertung von Versuch 4. Es ergeben sich hier jedoch andere Erwartungswerte und Freiheitsgrade. Welche ?


3. Kurstag: Klassische Genetik II Stichworte: 3. Mendelsche Regel, Abweichung von der 3. Mendelschen Regel, Rekombinationsarten, Kopplung, Kopplungsgruppen, cis- trans-Konfiguration (Attraktionsphase, Repulsionsphase), Genkartierung, Morgan-Einheit, Vierfelder-χ2-Test Versuch 5: Vererbung von Form der Blätter und Farbe der Blattunterseite bei Antirrhinum majus Die Selbstungsnachkommenschaft (F2) und die Rückkreuzungsnachkommenschaft (BC1) homozygoter Elternlinien von Antirrhinum majus (Garten-Löwenmäulchen) werden untersucht. Die relevanten Merkmale sind:

Bezeichnung Abkürzung/Symbol Phänotyp der homozygoten Linie incolorata inc grüne Blattunterseite

inc+ rote Blattunterseite graminifolia gram schmale Blätter

gram+ breite Blätter In Kreuzungsexperimenten mit zwei Genen können diese gekoppelt oder unabhängig voneinander vererbt werden. Entsprechend sind unterschiedliche Aufspaltungszahlen zu erwarten. Auswertung:

Mit welchen Hypothesen können die Segregationszahlen der Selbstung und der Rückkreuzung am besten erklärt werden?

Die jeweiligen Hypothesen sollen mit Hilfe des χ2-Tests geprüft werden. Für diese Analyse soll der Vierfelder-χ2-Test verwendet werden.

Welche Aufspaltungsverhältnisse erwartet man, wenn in den F1-Pflanzen die beiden

dominanten Allele auf einem Chromosom liegen (Attraktionsphase, cis-Konfiguration) und welche Verhältnisse erwartet man, wenn die beiden Allele sich in trans-Konfiguration (Repulsionsphase) befinden? Attraktionsphase

cis-Konfiguration Repulsionsphase trans-Konfiguration

F1 AB/ab Ab/aB Mögliche Gameten AB Ab aB ab AB Ab aB ab

Häufigkeit der Gameten 1/2 (1-x) 1/2 x 1/2 x 1/2 (1-x) 1/2 x 1/2 (1-x) 1/2 (1-x) 1/2 x

Die Variable x gibt den Anteil an Rekombination an und wird durch crossing over bei gekoppelt vererbten Genen bestimmt. Bei absoluter Kopplung ist x = 0, da die beiden Gene wie ein Genort vererbt werden, und bei unabhängiger Vererbung nach Mendel ist x = 0,5, da dann alle Gameten mit der gleichen Häufigkeit gebildet werden. Daraus lässt sich die Häufigkeit der erwarteten Phänotypen ableiten.

Welche Konfiguration lag in der F1 der analysierten F2-Nachkommenschaft vor? Wie groß ist x für die analysierte Nachkommenschaft?


4. Kurstag: Transformation Stichworte: Pflanzentransformation mittels Agrobacterium tumefaciens, T-DNA, Gewebekultur, Cytokinin, Auxin, Zellteilung/Differenzierung, Kallus, Tumor, Antibiotikaresistenz, Markergen, Reportergen, Promotor-GUS-Analyse, MS-Medium, Sterilbank Einleitung: Die Geschichte von Agrobacterium tumefaciens begann 1907, als man entdeckte, dass dieses Bodenbakterium in der Lage ist, Wurzelhalsgallen (Tumorgewebe) an verletzten zweikeimblättrigen Pflanzen auszulösen. In den siebziger Jahren fand man in virulenten, also Tumor auslösenden Stämmen von A. tumefaciens zusätzlich zur genomischen DNA sehr große Plasmide von 100 bis 800 kBp. Durch Transferexperimente auf plasmidfreie nicht-pathogene Stämme wurde gezeigt, dass der Besitz dieser Plasmide für die Tumorauslösung essentiell ist. Man nannte sie daher Tumor induzierende oder kurz Ti-Plasmide. Es handelt sich hier um eine natürliche Übertragung von Genmaterial von Pro- auf Eukaryoten. Der Mechanismus der Genübertragung, soweit man ihn bisher kennt, ist dem Konjugationstransfer zwischen Bakterien sehr ähnlich. Die T-DNA (= transferred DNA), ein ca. 20 - 25 kBp langes Stück DNA des mehr als 150 kBp großen Ti-Plamids wird als DNA-Einzelstrang in Agrobacterium erzeugt. Dabei spielen die an anderer Stelle im Plasmid lokalisierten vir- (Virulenz) Gene eine entscheidende Rolle. Sie werden durch Signalstoffe einer verwundeten Pflanze induziert. Die Genprodukte der vir-Gene wirken in trans auf die Enden der T-DNA und führen so zur Excision eines Einzelstrangs der T-DNA, zur Übertragung in die Pflanzenzelle, zum Einschleusen in den Zellkern und vermutlich dort auch zur Integration ins Pflanzengenom. Die Mobilisierung der T-DNA wird durch zwei flankierende DNA-Bereiche ermöglicht, die als Erkennungssequenz dienen und aus einer 25 Basenpaare langen, direkten Sequenzwiederholung bestehen. Sie werden als rechte und linke Grenze (engl. LB und RB für left border und right border) bezeichnet. Ein Teil der in Pflanzenzellen übertragenen DNA induziert die Bildung von Tumoren, die als Lebensraum für die Bakterien dienen. Gleichzeitig wird durch den DNA-Transfer die Bildung bestimmter Nährstoffe (Opine) in den Pflanzenzellen ermöglicht, die nur von den Bakterien selbst als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle genutzt werden können. Die bekanntesten Opine sind Nopalin und Octopin. Voraussetzung für die Übertragung der T-DNA in die Pflanze ist zunächst die Verletzung einer Pflanzenzelle. Hierbei spielen bestimmte phenolische Substanzen (z.B. Acetosyringon), die die Pflanze als Folge der Verwundung bildet, eine wichtige Rolle. Dieses Signal wird von den Agrobakterien erkannt und es erfolgt eine Anheftung an die Pflanzenzelle. Die Tumorentwicklung, die nach Infektion mit A. tumefaciens auftritt, beruht auf der Wirkung von zwei speziellen Phytohormonen und lässt sich anhand der Tumorgenese (Ausbildung so genannter Wurzelhalsgallen) an der Infektionsstelle erkennen. Die für die Synthese der Phytohormone notwendigen Enzyme werden hauptsächlich von Genen der in den Zellkern der Pflanze transferierten T-DNA codiert. Die Synthese der Auxine wird durch zwei Gene der T-DNA bewirkt, die tmsl und tms2 genannt werden. Aus einem Zwischenprodukt wird das Auxin Indolessigsäure hergestellt. Zusätzlich trägt die T-DNA noch das tmr-Gen, das für die Bildung von Cytokininvorstufen verantwortlich ist. Eine weitere Umsetzung führt zur Bildung der Cytokinine Transzeatin und Transribosylzeatin. Das gebildete Auxin führt zusammen mit den Cytokininen zum Tumorwachstum durch Förderung der Zellteilung.


aus: Biochemistry and molecular biology of plants. Buchanan et al., 2001 Praktische Anwendung von Agrobakterien in der Gentechnik: Der molekulare Mechanismus der Agrobacterium vermittelten Transformation wird zur Übertragung fremden Genmaterials ausgenutzt. Essentiell für den T -DNA- Transfer und die Integration ins Pflanzengenom sind nur die kurzen repetitiven Enden der T-DNA (ca. 25 bp; LB und RB). Das gesamte dazwischen liegende Genmaterial (Gene für die Opinsynthese, Pflanzenwuchsstoffe usw.) kann deletiert werden, ohne dass der eigentliche Transfer-Mechanismus, der über die trans-aktiven vir-Gene wirkt, beeinträchtigt wird. Anstelle der deletierten Regionen können beliebige Gene eingebaut werden, die dann anstatt der „natürlichen“ T-DNA in die Pflanzenzellen transferiert werden. Allerdings bleibt bei solchen Transformationen aufgrund des Fehlens der Hormongene (für die Auxin- und Cytokinin-Synthese) die Tumorgenese aus und die Transformation der Zellen kann nicht erkannt werden. Durch gleichzeitige Übertragung anderer selektierbarer Markergene (z.B. Antibiotikaresistenzgene) als Teil künstlicher T-DNA Konstrukte kann jedoch eine Identifizierung der transformierten Zellen sichergestellt werden. Für diese Art der Transformation haben sich Methoden bewährt, die von Gewebestücken (Blatt bei Tabak, Wurzel bei Arabidopsis) ausgehen, die dann durch geeignete Agrobakterien-Stämme mit manipulierten T-DNA-Konstrukten infiziert und schließlich auf antibiotikahaltigen Selektionsmedien kultiviert werden. Darauf können nur transformierte Zellen überleben, die dann proliferieren und unter geeigneten Bedingungen (Hormonzusammensetzung des Mediums) zu transgenen Pflanzen regenerieren. Transgene Pflanzen enthalten in allen Zellen das ursprünglich über Agrobakterium-Transformation eingeführte Genmaterial, dessen Ausprägung untersucht werden kann. Eine Regeneration von Pflanzen aus Tumorgewebe ist in der Regel nicht möglich, da die Gene der natürlichen T-DNA eine zu starke Veränderung der Hormonspiegel erzeugen. Lediglich bei Verwendung von Agrobakterium rhizogenes (pRi = root-inducing plasmid) zur Transformation kann anschließend aus dem proliferierenden wurzelartigen Gewebe die Regenerierung von Pflanzen eingeleitet werden.


Versuch 6: In vitro Vermehrung und Blattscheibentransformation von Tabak (Nicotiana tabacum) Durchführung: Unter sterilen Bedingungen sollen Blattscheiben von transformierten und nicht transformierten Tabakpflanzen auf Medien mit unterschiedlichen Hormonkonzentrationen (Auxin: NAA= Naphtyl-Essigsäure, Cytokinin: BAP= Benzylaminopurin) ausgelegt und kultiviert werden. Die Transformation erfolgt mit einem Agrobacterium tumefaciens – Wildstamm (B6S3 Octopin). Die keimfreien (sterilen) Bedingungen werden mit Hilfe einer Sterilbank (Cleanbench) gewährleistet. Diese saugt Raumluft an, bläst sie durch einen Feinstfilter wodurch auch kleinste Partikel aufgehalten werden. Die Gläser und Medien, mit denen gearbeitet wird, wurden vorab autoklaviert, d.h. in heißem Wasserdampf unter hohem Druck gereinigt. Die Werkzeuge (Spatel, Pinzette, Korkbohrer usw.) müssen vor jeder Benutzung immer in Alkohol getaucht, unter dem Bunsenbrenner abgeflammt, und danach kurz abgekühlt werden. Vor Benutzung der Sterilbank wird die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol abgewischt und die Hände mit Handdesinfektionsmittel gesäubert.

1. Von steril angezogenen Tabakpflanzen werden frische Blätter abgeschnitten und in sterile Petrischalen gelegt. Danach stanzt man mit dem Korkbohrer Blattscheiben aus und legt diese auf das MS1-Medium (0,5 mg/l BAP), bzw. das MS2-Medium (2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP). Die Blattunterseite muss auf das Medium leicht aufgedrückt werden, so dass optimaler Kontakt zwischen Blatt und Medium gewährleistet ist. Danach werden die Petrischalen mit Parafilm abgedichtet und beschriftet.

2. Blätter von steril angezogenem Tabak werden unter der Sterilbank in ca. 1 cm große

Stücke geschnitten (3 pro Gruppe in eine Petrischale). Die Stücke werden schwimmend mit der Blattunterseite nach unten auf die Agrobakteriensuspension aufgelegt (nicht eintunken!!) und dort 5 min bei RT inkubiert. Danach wird die überschüssige Suspension an den Blattscheiben kurz auf sterilem Filterpapier abgetupft und die Blattscheiben anschließend auf MS3-Medium ausgelegt (Blattunterseite nach unten) und bei 26°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen werden die Blattstücke auf MS3-Medium (ohne Hormon) mit Cefotaxim ausgelegt und im Normallicht bei 25°C kultiviert. Kontrollansatz: Blätter ohne Bakterienkultur auf MS3-Medium auslegen. Nach wenigen Tagen kann man möglicherweise die erste Kallusbildung beobachten, nach einigen Wochen die ersten transgenen, über Organogenese entstandenen Sprosse.

3. Die Sprosse der Tabakpflanzen werden abgeschnitten und in vorbereitete Weckgläser mit

hormonfreiem MS-Medium (MS3) gesteckt, um die Pflanzen weiter zu vermehren. Dabei ist darauf zu achten, dass die Schnittstelle im Medium ist. Auch die Weckgläser werden abgedichtet.

→ Die Agrobakteriumsuspensionen und alle Glasgeräte und Gefäße, die mit den Bakterien in Kontakt gekommen sind müssen vor der Entsorgung bzw. Reinigung autoklaviert werden.


Auswertung : Nach 3-4 Wochen werden die Gewebe- und Sprosskulturen auf etwaig entstandene Phänotypen

hin untersucht. Wie unterscheiden sich die untransformierten Blattscheiben auf den verschiedenen

Hormonmedien bzw. Kontrolle bezüglich ihrer Kallusbildung und Organogenese? Bestimmen Sie die Regenerationsrate.

Welche Aussagen können über die transformierten Blattscheiben im Vergleich zu den untransformierten Blattscheiben gemacht werden? Anzucht von Agrobacterium tumefaciens (nicht im Praktikum durchgeführt) Die Anzucht der Agrobacterium tumefaciens-Stämme erfolgte in YEB-Medium (oder auch LB-Medium) bzw. auf YEB-Agarplatten bei 28°C (mind. 2 Tage). YEB (1 Liter): 5 g Rinderextrakt (DIFCO), 1 g Hefeextrakt (DIFCO), 1 g Bactopeptone (DIFCO), 5 g Saccharose, 2 mM Magnesiumchlorid, 15 g Agar (DUCHEFA) für Agarplatten Leaf disk-Transformation von Nicotiana tabacum L. Kulturmedien: MS-Medium plus Cefotaxim (500 mg/l). Durchführung: 1. YEB-Medium wird mit einer Agrobakterien-Glycerinkultur (Wildstamm B6S3) angeimpft und über Nacht bei 28°C geschüttelt. 2. Die dicht gewachsene Bakterienkultur wird in der Kühlzentrifuge sedimentiert (5000g, 15 min) und nach Dekantieren des Überstands mit MS-Flüssigmedium resuspendiert und auf die OD546 von 1 eingestellt (oder 1:10 Verd. in MS-Medium).

Versuch 7: Reportergenaktivität – Histologische Analyse Durchführung: Cytokinine sind eine Klasse von Pflanzenhormonen, die eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellzyklus, der Entwicklung von Chloroplasten und der Regulation des Wachstums von Sproß und Wurzel spielen. Der Abbau der Cytokinine wird von Cytokininoxidasen katalysiert. In Arabidopsis thaliana kodiert eine Genfamilie für sieben verschiedene Cytokininoxidasen (AtCKX Gene). Um zu untersuchen, ob die Mitglieder der Genfamilie unterschiedlich reguliert werden, wurden je ca. 2000 Basenpaare der Promotoren der AtCKX2, AtCKX4, AtCKX5 und AtCKX6 Gene mit dem ß-Glucuronidase Gen (GUS) fusioniert. Im Praktikum werden transgene 10 Tage alte Pflanzen, die diese Fusionsgene enthalten, charakterisiert. Es sollen die unterschiedlichen Expressionsdomänen der AtCKX Gene miteinander verglichen werden. Die Pflänzchen wurden wie folgt gefärbt: Um das Gewebe für die Färbelösung aufzuschließen wurden die Pflanzen 1h in 90% Aceton eingelegt. Nach zwei Waschschritten in Natriumphosphatpuffer (0,1mM, pH7) wurden die Pflanzen in einer Färbelösung über Nacht bei 37° C im Dunkeln inkubiert. Die Färbelösung enthält 1 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide), 10 mM K-Ferricyanid, 10 mM K-Ferrocyanid, Triton-X-100 und Natriumphospatpuffer. Um die endogenen Pigmente (z.B. Chlorophyll, Anthocyane...) zu bleichen wurden die Pflanzen mit 70 % Ethanol behandelt. Aufgabe: Im Kurs sollen nun die entfärbten Pflanzen unter dem Stereomikroskop oder Mikroskop beobachtet und die GUS-Färbungen der Pflanzen mit den verschiedenen AtCKX-Konstrukten dokumentiert (Skizze oder Beschreibung) werden.

Diskutieren Sie die Ergebnisse.


5. Kurstag: Klassische Genetik IV / Molekulare Genetik I

Versuch 8: Analyse der Segregation dominanter Markergene (Antibiotikaresistenzen) bei transgenen Tabakpflanzen (Demonstration) Durchführung: In dem hier vorgestellten Versuch werden transgene Pflanzen untersucht die ein T-DNA-Konstrukt (Kanamycinresistenz) enthalten. In einem ersten Schritt wurden in vitro die Blattgewebe von Tabak mit Agrobacterien transformiert, deren T-DNA eine Antibiotikaresistenz enthielt. Die daraus regenerierten Pflanzen wurden auf Erde ausgebracht und die geernteten Samen auf Selektionsmedium ausgelegt. Nur Pflanzen mit durch die Transformation erworbener Antibiotikaresistenz können weiterwachsen. Die nun vorliegende Generation wurde vier Wochen vor Beginn des Praktikums auf Medium mit entweder …

• 100 mg/l Kanamycin • keinem Antibiotikum ausgelegt.

Antibiotikasensitive Pflanzen wachsen auf antibiotikahaltigem Medium nach der Keimung nicht mehr weiter. Sie haben daher nur zwei Keimblätter, die z.T. ausbleichen, während resistente Pflanzen zum Untersuchungszeitpunkt bereits mehrere Folgebätter aufweisen. Aufgabe:

Bei der Transformation kann es vorkommen, dass nicht nur eine T-DNA in das Genom einer transformierten Pflanzenzelle aufgenommen wird, sondern mehrere. Um dies herauszufinden, stellen Sie das Segregationsverhältnis zwischen sensitiven und resistenten Pflanzen in der Nachkommenschaft je einer transformierten Pflanze (entspricht zwei Petrischalen) fest.

Wie viele Integrationsloci sind für die T-DNA aufgrund dieses Ergebnisses im Genom der jeweiligen Elternpflanze zu erwarten?


Versuch 9: Ligation - Einbau eines DNA-Fragments in einen Plasmidvektor Da die Vorbereitung der DNA-Proben (Restriktion des Vektors und der zu klonierenden genomischen DNA*) zeitlich im Rahmen dieses Kurstages nicht durchführbar ist, wird dieser Versuchsteil nur theoretisch besprochen. Die weiteren Versuchsabschnitte (Ligationsansatz und Transformation) werden eigenständig durchgeführt. Ligationsansatz: Der Ligationsansatz soll ein Endvolumen von 20 µl haben und die einzelnen Komponenten wie folgt enthalten:

• 50 ng Vektor • 150 ng * genom. DNA (= Insert) (Verhältnis Vektor:Insert soll 1:3 sein) • 5 units Ligase • Lig.-Puffer in einfacher Konzentration → auffüllen mit bidest. H2O

Komponenten, die Ihnen zur Verfügung stehen:

• DNA (?* ng/µl), die kloniert werden soll • Plasmidvektor* (10 ng/µl) • T4-DNA-Ligase (4 units/µl) • 10 x Puffer (d.h.10fach konzentriert) • bidest. H2O

Die Plasmid-DNA* (pBluescript-Vektor) und die Insert-DNA (*Konz. wird im Kurs angesagt) wird Ihnen zur Verfügung gestellt.

das Pipettierschema mit den Konzentrationsangaben gehört ins Protokoll!! Alle Komponenten werden gut gemischt (+ einmal kurz zentrifugiert), und die Ligationsreaktion erfolgt dann 1 h bei Raumtemperatur (oder alternativ 1 Woche bei 4°C). Auswertung:

Welche Voraussetzungen müssen das zu klonierende DNA-Fragment und der Vektor für eine Ligation erfüllen?

Welche Produkte können im Ligationsansatz entstehen?


6. Kurstag: Molekulare Genetik II Bakterientransformation, Komplementation Stichworte: Klonierung, Bakterientransformation, Kompetenz, Plasmide, Ligase, Multiple Cloning Site, Restriktionsenzyme, Markergene/ lacZ-Operon, Antibiotikaresistenzen, Komplementation, auxotrophe Mutanten, PCR, Taq Polymerase Einleitung: Mit der Einführung der Bakterien und Phagen als Untersuchungsobjekte machte die Genetik einen gewaltigen Sprung in Bezug auf die experimentellen Möglichkeiten. In den vierziger und fünfziger Jahren dieses Jahrhunderts wurden damit die Grundlagen der molekularen Genetik und wenig später der Gentechnologie gelegt. Bereits in den zwanziger Jahren gelang mit Bakterien bereits der Nachweis, dass DNA die Erbsubstanz ist (Griffith 1928), aber erst die Wiederholung dieses Experimentes (Avery 1944) wurde allgemein als Beweis akzeptiert. Bakterien lassen sich in extrem großer Zahl auf sehr kleinem Raum kultivieren. Man kann leicht aus einem Stamm allein durch die Wahl des Mediums eine gewaltige Zahl an Mutanten isolieren. Sie besitzen ein Genom, das im Vergleich zu Tieren und Pflanzen sehr viel kleiner ist und das nur aus einem ringförmigen DNA-Molekül besteht. Daher entspricht auch der Genotyp dem Phänotyp. Auch wenn sie es nicht den Regeln Mendels entsprechend tun, tauschen Bakterien "trotzdem" Erbinformationen aus und zeigen Rekombination (Konjugation über F-Pili), was die Erstellung von genetischen Karten ermöglichte. Phagen transduzieren Bakteriengene, was ebenfalls für genetische Karten genutzt werden konnte. Zusätzliche extrachromosomale DNA-Moleküle (Plasmide) werden von Bakterien ebenfalls, selbst artübergreifend, ausgetauscht und zudem recht leicht aus dem Medium heraus aufgenommen (Transformation), was diese Moleküle prädestinierte, zu Werkzeugen der Gentechnologie zu werden. Plasmide, die ein Gen für Antibiotikaresistenz tragen und von einem Antibiotika-sensitiven Bakterium aufgenommen werden, führen zu dem neuen Phänotyp der "Antibiotikumresistenz". Nahezu alle Plasmide, die von Molekulargenetikern verwendet werden, tragen Antibiotikaresistenzgene, und transformierte Bakterien werden über die Antibiotikaresistenz selektiert, indem sie auf Antibiotika-haltigen Medien kultiviert werden. Entsprechend können Plasmide, die ein Gen für ein wichtiges Enzym tragen, einen Stamm, bei dem dieses Gen mutiert ist, komplementieren. Folgerichtig kann ein Bakterium durch Aufnahme eines Plasmids auch partiell "diploid" werden. Um unbekannte DNA-Sequenzen zu analysieren ist es sinnvoll, diese in Vektoren (z. B. Plasmide) zu klonieren. Dazu werden Vekor und DNA-Fragment mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und mit Hilfe der DNA-Ligase verknüpft. DNA-Ligasen sind Enzyme, die in einem DNA-Doppelstrang eine Phosphodiesterbindung zwischen dem 5'-Phosphatende eines Nukleotids und dem 3'-OH-Ende des benachbarten Nukleotids herstellen. Um diese "rekombinanten Plasmide" zu vermehren und genauer untersuchen zu können, müssen sie in Bakterienzellen eingeschleust, d.h. transformiert werden. Unter Transformation versteht man die Aufnahme von freier DNA (z.B. Plasmide) in eine Bakterienzelle, d.h. die Übertragung genetischer Information mittels reiner DNA. Aus den wachsenden Bakterien können diese Plasmide dann isoliert werden und die eingebaute DNA, das Insert, genauer untersucht werden (z.B. durch Restriktionsanalysen und Gelelektrophorese (siehe 9./10. Kurstag), Sequenzierung der DNA o.a.). Die Experimente an diesem und am folgenden Kurstag sollen einen Einblick in die Bakteriengenetik geben. Sie werden einen bestimmten E. coli-Bakterienstamm (DH5α) mit einem Plasmid, in das zuvor ein spezifisches DNA-Fragment (Insert) eingebaut/ligiert wurde, transformieren.


Kloniert werden sollen in diesem Versuch verschieden große Fragmente genomischer DNA der Modelpflanze Arabidopsis thaliana, die nach dem Verdau genomischer DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI entstehen (vgl. genomische DNA-Bibliotheken). Es werden hierbei zwei Selektionsmechanismen angewendet (Antibiotikaresistenz, lacZ-Expression), erstens eine Selektion der transformierten Bakterienzellen (Bakterien, die das gewünschte Plasmid enthalten) und zweitens eine Selektion rekombinanter Klone (Bakterienklone mit Plasmiden, die ein Insert enthalten). Anschließend sollen Sie mittels einer PCR und Restriktionsanalyse parallel überprüfen/bestimmen, welche Größe die klonierten DNA-Fragmente haben. Versuch 10: Bakterientransformation (Einschleusen eines Plasmids in E. coli) Für die Transformation wird der zuvor angesetzte Ligationsansatz (s.o.) verwendet. Außerdem werden für die Transformation kompetente Zellen des E. coli-Stamms DH5α verwendet. Diejenigen Zellen, die bei der Transformation ein Plasmid erhalten haben, werden über eine Antibiotikaresistenz (Ampicillinresistenzgen im Plasmidvektor) und die Expression eines Markergens (lacZ-Expression ⇒ Blau/Weiß-Selektion, siehe unten) selektiert. Hierzu werden die transformierten Bakterien auf Platten mit LB-Medium ausgestrichen, das Ampicillin und X-Gal enthält. Mit Hilfe der Lebendzellzahl der verwendeten E. coli-Zellen (Wachstum der kompetenten Zellen auf LB-Medium ohne Antibiotikum) kann dann die Transformationsrate ermittelt werden. Die Transformationsrate ist von verschiedenen Faktoren (z. B. Kompetenzgrad der Zellen, Größe des Plasmids) abhängig. Unter Kompetenz versteht man einen bestimmten Zustand der Zellen, in dem sie die Fähigkeit besitzen Fremd-DNA aufzunehmen. Kompetenz ist ein physiologischer Zustand (Abschnitt des Lebenszyklus bei einigen Gram-positiven Bakterien), in dem sich die Bakterienzelle vorübergehend befindet. Diese Kompetenz kann durch eine Inkubation in CaCl2 bei 0°C oder durch Elektroporation hergestellt werden. Der Kompetenzzustand äußert sich u. a. in einer veränderten Zellwandstruktur. Als ein Selektionsfaktor wird in diesem Versuch die Ampicillinresistenz eingesetzt, d.h. es können hier grundsätzlich nur Bakterien wachsen, die das Vektorplasmid mit seinem Ampicillinresistenzgen besitzen. Bakterien die nicht transformiert wurden, d.h. kein Plasmid aufgenommen haben, können nicht wachsen. Die Blau- oder Weißfärbung der gewachsenen Bakterienkolonien wird hier zur weiteren Selektion verwendet. Weiße Kolonien enthalten Plasmide, die ein Insert eingebaut haben, blaue Kolonien enthalten dagegen Plasmide, die mit sich selbst ligiert sind und kein Insert enthalten. Die Insertionsstelle im Plasmid liegt inmitten des lacZα-Gens, welches das erste von den drei Genen des lac-Operons ist und die ersten 146 Aminosäuren der ß-Galaktosidase codiert. Wird dieses Gen durch Insertion eines DNA-Fragments (Insert) inaktiviert, kann keine funktionstüchtige ß-Galaktosidase synthetisiert werden und das im Medium vorhandene X-Gal wird nicht abgebaut. Die Kolonien bleiben weiß. X-Gal [(5-Brom-4-chlor-3-indolyl)-ß-D-galactosid] ist eine farblose Verbindung. Nur wenn das X-Gal durch das Enzym ß-Galaktosidase gespalten wird, entsteht das tiefblaue 5-Brom-4-chlor-indigo.

Manche Bakterienstämme, z.B. JM109, exprimieren einen sog. lac-Repressor (lacIq), welcher die Transkription des lacZ-Gens verhindert, indem sich das gebildete Repressorprotein an die Operatorsequenz vor dem lacZ-Gen anlagert und den Zugang der RNA-Polymerase zum Promotor verhindert. Das Produkt des lacZ-Gens ist die ß-Galaktosidase. Ein Induktor wie z.B. IPTG heftet


sich an den Repressor, der dadurch seine Bindungseigenschaften ändert, so dass die DNA frei für die Transkription ist. Soll also die Expression des lacZ-Gens als Selektionskriterium verwendet werden, dann müssen die Platten IPTG enthalten (nur bei Verwendung von Stämmen wie JM109). Durchführung: Für die Transformation werden 50 µl kompetente E. coli-Zellen (DH5α) auf Eis aufgetaut und dann mit 10 µl des Ligationsansatzes vorsichtig auf Eis gemischt. Nach 20 minütiger Inkubation auf Eis folgt eine 90 Sekunden (Zeit einhalten!) lange Inkubation bei genau 42 °C im Wasserbad (→ Heat Shock). Danach werden die Ansätze sofort wieder auf Eis gestellt und dort weitere 2-5 min inkubiert. Während des Hitzeschocks können die Plasmide durch die Zellwand in die Bakterienzelle gelangen. Anschließend werden 450 µl SOC-Medium (oder evtl. auch LB-Medium) zugegeben und mit den Bakterien gemischt und 30 min bis 1 h bei 37° C auf einem Schüttler kultiviert. Anschließend werden je 200 µl dieser Bakteriensuspension auf LB-Platten mit Ampicillin, X-Gal ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert und dann bis zur Auswertung am folgenden Kurstag bei 4°C gelagert.

Sie bekommen LB-Platten zur Verfügung gestellt. Auf diesen Platten muss vor dem Ausplattieren der transformierten Bakterien das X-Gal frisch ausgestrichen werden!! LB-Platten mit Ampicillin / X-Gal: 40 µl einer X-Gal-Stammlösung. (20 mg/ml) werden gleichmäßig über die Oberfläche der LB-Platten mit Ampicillin verteilt und zum Trocknen stehen gelassen (ca. 20 min). Bestimmung der Transformationsrate: Für die Bestimmung der Lebendzellzahl werden je 100 µl der 10-4, 10-5 und 10-6 Verdünnung der kompetenten Zellen (siehe unten) auf einer LB-Plattte ohne Ampicillin ausplattiert. Verdünnungsreihe:

990 µl LB-Medium + 10 µl kompetente Zellen 10-2-Verdünnung 990 µl LB + 10 µl der 10-2 –Verdünnung 10-4-Verdünnung 900 µl LB + 100 µl der 10-4 – Verdünnung 10-5-Verdünnung 900 µl LB + 100 µl der 10-5 – Verdünnung 10-6-Verdünnung

Zur Berechnung der Lebendzellzahl kann später unter Berücksichtigung der Verdünnungs-

faktoren ein Mittelwert errechnet werden. Auswertung:

Konnte eine Blau-/Weiß-Selektion beobachtet werden? Wenn ja, wie hoch ist der Anteil von transformierten Zellen, die ein Plasmid mit bzw. ohne Insert enthalten?

Berechnung der Transformationseffizienz: Die Transformationsrate wird durch das Verhältnis der transformierten Bakterienzellen zur Lebendzellzahl der kompetenten Zellen beschrieben. Die Anzahl von transformierten Bakterienzellen wird durch Auszählen der Bakterienkolonien auf den Ampicillinplatten bestimmt. Die Lebendzellzahl wird durch Auszählen der Bakterienkolonien auf den LB-Platten ohne Ampicillin ermittelt. (Achtung: Dabei müssen die jeweiligen Verdünnungsfaktoren und die Mengen der ausplattierten Bakterien berücksichtigt werden!!)


Material: Die kompetenten Zellen (DH5α), die Plasmid-DNA (pBlueScript), die Insert-DNA und das Bakterienmedium (LB-Platten) werden zur Verfügung gestellt SOC-Medium (100 ml enthalten): 2,0 g Bacto-Tryptone, 0,5 g Bacto-Yeast-Extract, 1 ml 1M NaCl, 0,25 ml 1M KCl, 1 ml 2M Mg2+-Stammlsg.(1M MgCl2 x 6H2O/1M MgSO4 x 7H2O, sterilfiltriert), 1 ml 2M Glucose, sterilfiltriert LB-Medium (1 Liter):10 g Bacto-Tryptone, 5 g Bacto-Yeast-Extract, 5 g NaCl (mit NaOH auf pH 7,0 einstellen) LB-Platten mit Ampicillin (1 Liter): Zugabe von 15 g Bacto-Agar zu 1 Liter LB-Medium. Nach dem Autoklavieren wurde das Medium auf 55 °C abgekühlt und dann Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 µg/ml hinzugefügt (2ml einer Ampicillin-Stammlösung mit 50 mg/ml). Der flüssige Agar (ca. 30 ml / Platte) wurde dann in Plastikpetrischalen (∅ 9cm) gegossen. Die Aufbewahrung der Platten erfolgte bei 4 °C.

Versuch 11: Komplementation - Hefegenetik Saccharomyces cerevisae ist ein verbreitetes Modellsystem. Im Gegensatz zu E. coli handelt es sich um einen Eukaryonten. Die Genomstruktur und Genzusammensetzung ist somit der von höheren Organismen ähnlicher. So hat Hefe z.B. lineare Chromosomen, und die Funktion essentieller Stoffwechselgene ist z.T. zwischen Hefe und höheren Organismen vergleichbar, was durch Komplementationsexperimente in Hefe gezeigt werden konnte. In diesem Versuch sollen (wildtypische) Mangelmutanten, denen ein essentielles Uracilsynthesegen fehlt, mit Mangelmutanten verglichen werden, denen durch Transformation dieses Gen wieder zugefügt wurde. Die Saccharomyces cereviseae Mutante ura3- kann nur auf Vollmedium wachsen oder auf Minimalmedium, dem Uracil zugesetzt wurde. Wird das intakte URA3 Gen in ein Plasmid kloniert und die Mutante damit transformiert, können die transformierten Zellen auch auf Mangelmedium wachsen. Komplementation von Mutanten durch Transformation: Aus zwei am Vortag mit den entsprechenden Hefestämmen (Ura3-/ Ura3- mit Plasmid) angeimpften Röhrchen mit Vollmedien (YPD), die über Nacht bei 30°C inkubiert wurden, werden jeweils mit einer Impföse Hefezellen auf Minimalmedium plus Uracil (SD+Ura) und auf Minimalmedium ohne Uracil (SD) ausgestrichen. Dazu wird die Impföse ausgeglüht, dann kurz in den ersten der beiden Hefestämme getaucht (Kontrollstamm) und danach in Zick-Zack-Linien über jeweils die eine Hälfte der Petrischalen mit dem Minimalmedium plus Uracil, Minimalmedium ohne Uracil und Vollmedium gestrichen. Danach wird die Impföse erneut ausgeglüht, dann kurz in das zweite Vollmediumröhrchen (Stamm mit transformiertem Plasmid) getaucht und wiederum in Zick-Zack-Linien über jeweils die andere Hälfte der Petrischalen mit dem Minimalmedium plus Uracil, Minimalmedium ohne Uracil und Vollmedium gestrichen. Die Platten werden danach mit Parafilm verschlossen und bei 30°C für zwei bis drei Tage inkubiert. Anschließend werden die Platten bis zur Auswertung bei 4°C gelagert. Auswertung:

Welcher der beiden Hefestämme I und II ist der transformierte Stamm, begründen Sie diese Zuordnung.


Versuch 12: PCR (Polymerasekettenreaktion) Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine der wichtigsten molekularbiologischen Methoden, mit der es möglich ist, einen bestimmten DNA-Abschnitt in kurzer Zeit millionenfach zu vermehren. Dies geschieht mit Hilfe der hitzestabilen Taq-Polymerase, einem Enzym, welches aus in heißen Quellen lebenden Bakterien (Thermus aquaticus) isoliert wurde. Der vervielfältigte DNA-Abschnitt kann dann durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden oder für weitere Experimente, wie z.B. Klonierungsversuche weiter verwendet werden. Der zu vervielfältigende Bereich wird durch zwei Primer eingegrenzt. Primer sind kurze (i.d.R. 20-30bp lange) DNA-Stücke, die komplementär zur Ziel-DNA sind und durch Binden an diese als Startpunkte für die Taq-Polymerase dienen, so dass nur der zwischen diesen beiden Primern liegende DNA-Abschnitt durch wiederholtes Trennen des Doppelstranges und anschließender Ergänzung zu zwei neuen Doppelsträngen vervielfältigt wird. Eine detaillierte Beschreibung der Reaktionsabläufe ist in jedem molekularbiologischen Lehrbuch (z. T. auch in Genetikbüchern) zu finden. Ihre Aufgabe ist es, mit Hilfe zweier Primer (T3, T7) den DNA-Abschnitt (Insert), den Sie am vorherigen Kurstag in einen Plasmidvektor kloniert haben, mittels PCR zu amplifizieren (=vervielfältigen). Hierzu werden zwei Primer verwendet, die jeweils rechts und links von der Multiple Cloning Site (MCS) im Plasmidvektor binden, so dass das dazwischen liegende Insert vervielfältigt wird. Durchführung: Jede PCR-Reaktion (20 µl) setzt sich wie im Folgenden beschrieben zusammen: 2 µl DNA 2 µl bidest. H2O 2 µl PCR-Puffer (10fach konz.) 4,0µl MgCl2 (10 mM) 4,0 µl dNTP-Mix (1 mM, enthält alle 4 Desoxynukleosidtriphosphate) 2,5 µl Primer1 (5 pmol/µl) 2,5 µl Primer2 (5 pmol/µl) 1 µl Taq-Polymerase (1 Unit/µl) ---------------------------------------- 20 µl

Setzen Sie einen Mastermix für 4 PCR-Ansätze (alle Komponenten mit Ausnahme der DNA!) an und entnehmen Sie daraus je 18 µl für:

- zwei PCR-Reaktionen → Zugabe von je 2 µl DNA von Klon I bzw. II - einen Ansatz mit 2 µl bidest. H2O statt DNA (Blindprobe/Negativkontrolle)

(den Rest des Mastermixes können Sie verwerfen)

Alle Komponenten sollten gut (und luftblasenfrei) gemischt werden. Die PCR erfolgt im Thermocycler unter Einstellung folgender Parameter: 1 min 95°C, 40 Zyklen mit 15 sec 94°C + 15 sec 55°C + 45 sec 72°C, 4°C bis zur Entnahme aus Gerät.


7. Kurstag: Molekulare Genetik II Stichworte: Plasmide, Vektoren, Bakterientransformation, Restriktionsenzyme, Multiple Cloning Site (MCS), Gelelektrophorese, Versuch 13: Plasmid-DNA-Präparation Sie erhalten jeder eine Bakteriensuspension, die am Tag zuvor mit je einer unterschiedlichen weißen Bakterienkolonie (Klon I, II) ihrer Transformation vom vorherigen Kurstag angeimpft wurde und über Nacht gewachsen ist (in LB-Medium + Ampicillin bei 37°C auf Schüttler). Sie sollen nach der folgenden Methode (Prinzip der alkalischen Lyse) die Plasmid-DNA aus diesen Bakterien isolieren. Hierbei werden die Bakterienzellwände so behandelt, dass Poren entstehen, die nur die Plasmid-DNA nicht aber die genomische bakterielle DNA aus der Zelle austreten lassen. Durchführung: Plasmid-DNA-Mini-Präparation • 2 ml Bakteriensuspension in ein Eppi (2 ml Eppi) überführen • Bakterienzellen bei 13.000 rpm 5 min abzentrifugieren • Überstand verwerfen und nochmals 2 ml Bakteriensuspension pelletieren. • Pellet in 150 µl Puffer P1 (enhält RNAse, deshalb kühl lagern) resuspendieren, dann 500 µl

Puffer P2 (RT) zugeben, mischen und bei RT inkubieren bis Lösung klar wird (Max. 5 min). • 350 µl Puffer P3 zugeben und sofort mischen, auf Eis stellen bis zur Zentrifugation • 5 min bei 13.000 rpm zentrifugieren, dann 850µl Überstand in ein neues 2 ml Eppi

abpipettieren (auf jeden Fall ausgefällenes Protein beim pipettieren vermeiden) • Überstand mit 850 µl Isoamylalkohol durch invertieren mischen und 10 min bei RT inkubieren • 15 min bei 13.000 rpm / 4°C zentrifugieren • Überstand vorsichtig abpipettieren und verwerfen • Pellet 1 x mit 200 µl 70%igem Ethanol waschen, • 5 min bei 13.000rpm zentrifugieren, Überstand verwerfen • Pellet trocknen (ggf. Heizblock 40 °C) und in 30 µl 10mM Tris/HCl pH 8,0 lösen RT = Raumtemperatur rpm = Umdrehungen pro Minute


8. Kurstag: Molekulare Genetik III Stichworte: Plasmide, Vektoren, Gelelektrophorese, Restriktionsenzyme, Multiple Cloning Site (MCS), PCR, Taq-Polymerase Versuch 14: Restriktionsanalyse Um parallel zur PCR zu kontrollieren, welche Größe das klonierte DNA-Fragment hat wird eine Restriktionsanalyse durchgeführt, d.h. das zuvor klonierte Fragment wird mittels entsprechender Restriktionsenzyme wieder aus dem Vektor herausgeschnitten und seine Größe über eine Gelelektrophorese bestimmt Sie verwenden hierfür ebenfalls die zuvor präparierte Plasmid-DNA der Klone I und II.. Die Restriktionsenzyme (SacI + KpnI) müssen hierbei flankierend zur Insertionsstelle in der MCS schneiden. Wurde bei der zuvor durchgeführten Klonierung ein Restriktionsenzym verwendet, das ausschließlich in der MCS des Vektors schneidet, kann auch dieses Enzym zum Herausschneiden des Inserts verwendet werden. Restriktionsendonukleasen (Klasse II) erkennen spezifische 4-8 Basenpaare umfassende und meist palindromische Sequenzabschnitte doppelsträngiger DNA. Die Phosphodiesterbindung innerhalb des Sequenzbereiches wird hydrolysiert, so dass DNA-Fragmente mit überstehenden (sticky) 3'- oder 5'-Enden oder mit glatten (blunt) Enden entstehen. Die verschiedenen Restriktionsendonukleasen werden in Verbindung mit den von den Herstellern angegebenen Puffern verwendet. Um unspezifische Aktivitäten des Enzyms auszuschließen, wird der Enzymanteil im Restriktionsansatz auf maximal 10% (v/v) beschränkt. Pro Reaktion werden zwischen 5 und 10 U (= Units) eingesetzt. Die Reaktionsdauer beträgt normalerweise 1 h bei der jeweils enzymspezifischen optimalen Temperatur (meistens 37°C). Die entstandenen Fragmente können dann mit Hilfe eines Agarosegels aufgetrennt werden. Restriktionsansatz: 3µl Plasmid-DNA , 2µl Puffer, je 1µl Enzym (= 10 units), 13µl bidest. H2O (Gesamtvolumen 20µl) mind. 60 min bei 37°C inkubieren. Ansätze:

1. Plasmid-DNA (Klon I) geschnitten mit Restriktionsenzym SacI + KpnI 2. Plasmid-DNA (Klon II) geschnitten mit Restriktionsenzym SacI + KpnI

Versuch 15: Gelelektrophorese DNA-Moleküle sind negativ geladen (Säuren sind Protonenspender!). Bringt man DNA in ein elektrisches Feld, wandert diese zum Pluspol. In einem Agarosegel wandern verschieden lange Fragmente mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Kurze Fragmente gelangen leichter durch die feinmaschige Gelmatrix als lange Fragmente. Diese zwei Phenomene (Ladung und Gelmatrix) macht man sich zunutze, um ein Gemisch aus verschieden langen DNA-Molekülen aufzutrennen und so Fragmente bestimmter Länge zu isolieren. Trägt man zusätzlich zu den zu untersuchenden Proben DNA-Fragmente definierter Länge und definierter Menge (= Marker) auf, kann anhand vergleichender Analyse eine quantitative und qualitative Bestimmung vorgenommen werden. Die Agarosekonzentrationen variieren je nach Größe der untersuchten DNA-Fragmente. Für große Fragmente (z.B. genomische DNA) werden niederprozentige Gele (0,7–1,2 %) verwendet. Zur Untersuchung kleiner Fragmente (z.B. wenige hundert Basenpaare) hochprozentige Gele (2–6 %) verwendet.


Durchführung: Die DNA-Proben werden vor der Elektrophorese mit 10 x DNA-Probenpuffer (2µl für 20 µl Ansatz*) versetzt. Die DNA wird in Agarosegelen mit 1,2 % Agarose und 0,5 mg/ml Ethidiumbromid sowie l x TBE (45 mM Tris-Borat, 1mM EDTA, pH 8) als Laufpuffer aufgetrennt. Die Laufzeit beträgt ca. 60 min bei etwa 60 V, 30 mA. Die DNA-Banden werden an einem Transilluminator bei einer Wellenlänge von 302 nm (UV-Licht) sichtbar, da sich das fluoreszierende Ethidiumbromid in die „große Furche“ der DNA-Helix einlagert (= interkaliert). Nach Beendigung des Gellaufs können die Gele fotografiert werden. Probenauftrag im Gel: 1. Marker 1 (DNA-Längenstandard) 2. PCR-Fragment Klon I (10 µl vom PCR-Ansatz) 3. PCR-Fragment Klon II (10 µl vom PCR-Ansatz) 4. Blindprobe (10 µl vom PCR-Ansatz mit H2O) 5. Plasmid-DNA (Klon I) geschnitten mit SacI + KpnI (20µl Restriktionsansatz) 6. Plasmid-DNA (Klon II) geschnitten mit SacI + KpnI (20µl Restriktionsansatz) 7. Plasmid-DNA (Klon I) ungeschnitten (10 µl vom Plasmid-Präp.) 8. Plasmid-DNA (Klon II) ungeschnitten (10 µl vom Plasmid-Präp.) ⇒ *es ist sinnvoll alle Proben aufs gleiche Endvolumen (z.B. 20 µl) mit bidest. H2O aufzufüllen und dann mit Probenpuffer zu versetzen (s.o.). Achtung!! Sowohl bei Ethidiumbromid als auch bei UV-Licht ist große Vorsicht geboten. Ethidiumbromid ist ein giftiges Mutagen! UV-Licht zerstört im Extremfall bei Bestrahlung der Augen die Netzhaut! also: Handschuhe und Brille und Kittel! Auswertung:

Die Laufstrecke der einzelnen Fragmente wird auf dem Foto des Gels vermessen und mit Hilfe der Marker in Basenpaare umgerechnet. Der Logarithmus der Basenpaaranzahl ist über weite Bereiche direkt proportional zur Laufstrecke im Gel. Dementsprechend sollen die Fragmentmuster beider Marker in einer Graphik zu einer Eichgerade umgewandelt werden. Mit Hilfe beider Eichgeraden soll dann die Fragmentgröße der DNA-Banden bestimmt werden.

Beschreiben bzw. erläutern Sie die erhaltenen Ergebnisse (Gelfoto) der Gelelektrophorese (welche Bande entspricht welchem der folgenden zu erwartenden DNA-Moleküle – circulärer Vektor+Insert, linearer Vektor-Insert, Insert)?

Diskutieren Sie, ob die Klonierung erfolgreich war und welche Größe die klonierten DNA-Fragmente (Klon I und II) haben. Stimmen die Ergebnisse (Fragmentgrößen) der PCR mit denen der Restriktionsanalyse überein?


9. Kurstag: Molekulare Genetik IV - Bioinformatik (Literaturrecherche und computergestützte Sequenzanalyse) Stichpunkte: Alignment, BLAST, Sequenzdatenbanken (DNA, Protein), Sequenzanalyse-programme (z.B. Restriktionsanalysetool), Literatursuche im Internet → Bitte findet Euch um 9:00 im Chemiebau in der Takustr. 6 im Computerraum (Raum 21, 1. Stock rechts) ein und bringt ein Speichermedium (d.h. Diskette, CD oder Zip-Disk) mit, um die erhaltenen Daten für das Protokoll abzuspeichern. Alternativ könnt ihr Euch die Daten auch per e-mail zuschicken (wenn ihr einen Web-based Account habt!) Im Rahmen dieses Kurstages wird der Zugang zu wissenschaftlicher Literatur besprochen und die Organisation wichtiger Datenbanken im Internet gezeigt. Aufgabe wird es sein Sequenzen in diesen Datenbanken zu finden und diese verschiedenen Sequenzanalysen zu unterziehen (insbesondere Homologiesuche (BLAST) und Restriktionsanalyse). Im Appendix sind noch weitere spezifischere Sequenzanalysen angefügt, die, wenn noch Zeit übrig ist, untersucht werden können (z.B. Umwandlung einer DNA-Sequenz in eine Proteinsequenz und DNA- und Proteinstrukturanalysen).

Fürs Protokoll ist es sinnvoll, die BLAST-Ergebnisse und andere Angaben zu kopieren und z.B. in einem Word-Dokument abzuspeichern und dann ins Protokoll zu integrieren.

Versuch 16 a: Auffinden einer Sequenz in einer Gendatenbank Die am häufigsten verwendeten Datenbanken finden Sie unter den folgenden Adressen im Web: National Center for Biotechnology Information (enthält weltweit die umfangreichste Anzahl an DNA/Proteinsequenzen)- Um sich zurechtzufinden ist es sinnvoll die help-Seite aufzurufen. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/

European Bioinformatics Institute: (wichtigste europäische Datenbank) http://srs.ebi.ac.uk/

TAIR – The Arabidopsis Information Resource (wichtigste Seite des Arabidopsis Genome Projekts mit vielen hilfreichen Analysetools) www.arabidopsis.org

BCM Baylor College of Medicine Search Launcher http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/

The Institute for genomic research http://www.tigr.org/

Von diesen Startseiten gelangt man über Querverweise zu einer Vielzahl anderer Seiten im Netz, die spezielle Analyseprogramme anbieten. Einige Adressen sind im Appendix aufgelistet.


In den Datenbanken können mittels verschiedener Parameter nach Sequenzen gesucht werden, z.B. Name des Gens, Publikation, Autoren etc. Die Daten können anschließend zur Weiterverarbeitung kopiert werden.

Aufgabe 1: Stellen Sie sich vor, Sie arbeiten in einem Projekt mit dem Organismus Arabidopsis thaliana, der Modellpflanze der molekularen Pflanzengenetik. Es ist Ihnen gelungen eine kurze DNA-Sequenz zu isolieren und zu sequenzieren. Die Sequenzfolge lautet:

ccaacactagcgagtacggt Sie haben keine weiteren Angaben, wollen aber nun herausfinden, ob dieser Sequenzabschnitt einem Gen mit einer bekannten Funktion entspricht. Führen Sie mit der DNA-Sequenz eine BLASTN-Suche (standard nucleotide-nucleotide BLAST) in der Datenbank „nr (non redundant)“ durch. Dazu rufen Sie die Datenbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ auf. (Sollte die Suche zu lange dauern kann alternativ auch die Arabidopsis-Datenbank (TAIR) untersucht werden: http://www.arabidopsis.org/Blast/ w).

BLAST auswählen

Auf der BLAST-Seite ist BLASTN als Standardprogramm eingesetzt;

Sequenz in den Kasten mittels copy&paste einkopieren, auf BLAST! klicken und das

Ergebnis mit FORMAT! abfragen (Dauer ca. 2-5 min)

Als Suchergebnis erhält man 1. eine Übersicht mit graphischer Darstellung 2. eine Liste mit der Suchsequenz (bester Treffer) und ähnliche Sequenzen mit Angaben zu

welchen Bereichen Homologien gefunden wurden. Über die Liste der Treffer kann man direkt über Links die entsprechenden Sequenzabschnitte aufrufen.

Sie erhalten ein Datenblatt, das neben der DNA-Sequenz eine Vielzahl weiterer Informationen enthält, die z.T. über neue Links verfügen. Man erhält z. B. die entsprechenden mRNA Sequenzen, Aminosäuresequenzen, Literaturhinweise (Verknüpfungen) u. a. .

Finden Sie folgendes heraus:

- Kann die Sequenz einem bereits identifizierten Arabidopsis-Gen zugeordnet werden? - Wenn ja, um welches Gen handelt es sich hierbei? - Wie lang ist die entsprechende genomische DNA bzw. mRNA in Basenpaaren? - Gibt es ein oder mehrere Introns in diesem Gen und wie lang ist/sind diese? - Suchen Sie mit Hilfe der PubMed/NCBI-Literaturdatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) nach aktueller Literatur zum entsprechenden Gen (wie viele Artikel gibt es?) und finden Sie heraus, welche der Journals über die FU als Volltext zugänglich sind (Darwin, Elektronische Zeitschriften http://darwin.inf.fu-berlin.de/work/JournalSearch/).

Weitere Anmerkungen zur BLAST-Recherche und zur Literatursuche finden Sie weiter unten.


Versuch 16 b: Restriktionsanalyse Um ein unbekanntes Gen genauer zu untersuchen, ist es notwendig dieses zu klonieren. Bei der Klonierung werden mit Hilfe von Restriktionsenzymen sowohl der Vektor als auch die zu klonierende DNA spezifisch geschnitten. Mittels sogenannter Restriktionsanalyse-Programme können geeignete Schnittstellen identifiziert werden. Ein solches Programm findet man z.B. auf der Seite http://www.arabidopsis.org unter „Tools“ – „more“ – „Restriction analysis“. In der Eingabemaske „Choose restriction enzymes“ können die Restriktionsenzyme, nach denen gesucht werden soll, eingeschränkt werden (z.B. Enzyme die gar nicht, einmal oder zweimal schneiden, oder Enzyme, die mit oder ohne Überhang schneiden). Nach Eingabe der Sequenz erhält man eine Grafik, die die Restriktionsorte angibt. Die Grafik ist interaktiv, d.h. durch klicken auf einzelne Restriktionsenzyme erhält man die genaue Position der Schnittstellen und die Fragmente nach Größe sortiert (entspricht dem Bandenmuster auf einem Gel). Zudem werden die Enzyme angegeben, die diese Sequenz nicht schneiden.

Aufgabe 2: Suchen Sie Restriktionsenzyme, die innerhalb der Sequenz des zuvor identifizierten Gens RTM1 keine Restriktionsorte haben, sowie diejenigen, welche die Sequenz einmal bzw. zweimal schneiden. - Nennen Sie ein Enzym, das einmal schneidet und zwei gut unterscheidbare, d.h. im Agarosegel auftrennbare DNA-Fragmente liefert. - Welche einmal schneidenden Enzyme liefern zwei etwa gleich große DNA-Fragmente, die auf einem Agarosegel nur schwer auftrennbar wären?

Versuch 16 c: Sequenzvergleich auf Proteinebene (Alignment) Um zwei oder mehrere Sequenzen miteinander zu vergleichen, können folgende Internetseiten verwendet werden:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html blastp auswählen! http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/Options/clustalw.html Vor der Suche nach Sequenzhomologien auf Proteinebene oder strukturellen Analysen muss die cDNA-Sequenz in die Aminosäuresequenz übersetzt werden. Dies wurde von NCBI oder TIGR schon vorab ausgeführt. Die oben genannten Datenbanken bieten auch alle ein Translation-TOOL an mit dem cDNA Sequenzen in Aminosäuresequenzen übersetzt werden können, z.B. http://www2.ebi.ac.uk/translate/. Solche Alignments sind insbesondere dann von Interesse, wenn es gilt Sequenzähnlichkeiten von Genen innerhalb einer Genfamilie, oder Gene mit ähnlicher oder gleicher Funktion in anderen Organismen untereinander zu vergleichen. Dabei müssen die DNA-Sequenzen bzw. Proteinsequenzen im FASTA Format eingegeben werden. Die Datenblätter der NCBI-Datenbank enthalten hierfür eine spezielle Anzeigefunktion für dieses Format:


Hierzu muss unter DISPLAY das FASTA-Format eingestellt und angeklickt werden. Man erhält dann die DNA-bzw. Protein-Sequenz im FASTA-Format, welches dann kopiert und im Alignment eingefügt werden kann.

>Name der 1. Sequenz Proteinsequenz >Name der 2. Sequenz Proteinsequenz usw.

Mit diesem Programm (BOXSHADE) kann das Alignment farblich dargestellt werden: http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/tools/JAV/JAViewer.cgi (Geben sie dazu das Ergebnis von ClustalW im Fasta-Format durch Copy and Paste in das Eingabefenster ein.) Parameter: Output format : RTF_new, Fraction of Sequence that must agree : 0.9, Input Sequence format: ALN

Aufgabe 3 : Ihre Aufgabe ist es, zwei Arabidopsis-Gene einer bekannten Genfamilie mittels eines Protein-Alignments zu vergleichen und die Homologien dieser zwei Gene herauszufinden. a) Vergleichen Sie die Proteinsequenzen der beiden Gene CKX2 (Accession: AAG30905) und CKX4 (Accession AAG30907). b) Vergleichen Sie die Proteinsequenzen der beiden Gene RTM1 (Accession: AAF14583) und RTM2 (Accession AAF61902). - Wie groß ist der Anteil homologer Aminosäuren (AS) in diesen zwei Genen? - Wie groß ist der Anteil homologer und funktionell-ähnlicher AS?

Versuch 16 d: Nutzung spezialisierter Internetseiten Eine Vielzahl technischer Fortschritte in der Molekularbiologie ermöglicht heutzutage die

Sequenzierung ganzer Genome. Mittlerweile gibt es weltweit viele Institute, die sich auf Genome

einzelner Organismen spezialisiert haben und ihre Erkenntnisse der Öffentlichkeit im Internet zur

Verfügung stellen. Hier sollen nun exemplarisch am Arabidopsis-Genomprojekt (AGI) die

Nutzungsmöglichkeiten einer solchen Internetseite (http://www.arabidopsis.org/home.html) erlernt

werden. Suchen Sie hierfür folgende Informationen.

Aufgaben: Verschaffen Sie sich einen Überblick über z. B. - Genomgröße (Chromosomenzahl und Nukleotidanzahl) - geographische Verbreitung der Pflanze - Gene und Marker und deren Positionen im Genom - Möglichkeiten der Genomanalyse u.s.w.


Literaturrecherche Pubmed-Seite des NCBI (National Center for Biotechnology Information) Erlaubt Stichwortsuche nach wissenschaftlichen Veröffentlichungen.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/

Unibibliothek FU-Berlin

http://www.fu-berlin.de/bibliothek/ http://darwin.inf.fu-berlin.de/work/JournalSearch/

Die Zugänglichkeit von einzelnen Online-Journalen (von Rechnern der FU Berlin) wird direkt durch Symbole angegeben.

MPI für Molekulare Genetik (Ihnestr. 74)

http://www.molgen.mpg.de/ http://www.molgen.mpg.de/lib/

Die Homepage gibt Einblick in den Bestand der Präsenzbibliothek und der per Online erreichbaren elektronischen wissenschaftlichen Journalen. (Um jedoch Artikel auszudrucken oder abzuspeichern muss man in die Bibliothek gehen und vor Ort am Computer arbeiten).

BLAST-Recherche Eine typische Sequenzanalyse ist zunächst ein DNA-Sequenzvergleich. Das Standardprogramm hierfür ist BLAST (Altschul et al., 1990; BLAST: Basic local alignment search tool), ein Programm zur Suche nach Sequenzhomologien von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen. Die BLAST-Programme haben verschiedene Zusatzbuchstaben, je nach Typ der Dateneingabe und des Datenoutputs. BLASTN: Eingabe Nukleotidsequenz, suche nach ähnlichen Nukleotidsequenzen

BLASTP: Eingabe einer Proteinsequenz, suche nach Proteinsequenz

BLASTX: Eingabe als Nukleotidsequenz, suche nach Proteinsequenzen

(Übersetzung in allen sechs Leserastern)

TBLASTX: Eingabe als Nukleotidsequenz, suche in Nukleotidsequenzen,

(sowohl Query-Sequenz, als auch alle Nucleotidsequenzen werden in alle sechs

Leseraster übersetzt!! D.h. eine Suche umfasst 6x6 =36 Sequenzvergleiche)

TBLASTN: Eingabe als Proteinsequenz, suche in Nucleotidsequenzen

(Übersetzung in allen sechs Leserastern)

Desweiteren muss noch vor einer BLAST-Suche die Datenbank ausgewählt werden, in der gesucht werden soll. Es gibt verschiedene Organisationen, die solche Datenbanken zusammengestellt haben, z.B. NCBI, TIGR, Kazusa, Genbank und AGI. Die Datenbanken können CDS (= Coding Sequences) -, DNA- und Protein-Daten enthalten. Außerdem können die Datenbanken noch Sequenzen von BACs (= Bacterial Artificial Chromosomes), Contigs oder ESTs (= Expressed


Sequence Tags) enthalten. BAC-Sequenzen und Contigs sind für Klonierungen von besonderem Interesse, da sie DNA-Sequenzen, die vor und nach dem Gen liegen, beinhalten. ESTs sind für das Auffinden neuer Gene wichtig, da mit ihrer Hilfe ein Nachweis für die Expression dieser Sequenz in vivo erbracht werden kann. Weitere hilfreiche Programme und Websites für die Analyse von DNA- oder Proteinsequenzen sind beispielsweise: PROSITE (Bairoch und Bucher, 1994) Dieses Programm wurde zur Suche nach Übereinstimmungen einer Aminosäuresequenz mit Proteinmustern verwendet. Einstiegsseite des Network Protein Sequence Analysis: http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_prosite.html Programme für die Untersuchung der Sekundärstruktur): TMHMM (v. 2.0), PHDhtm, PHDtopology TMHMM (v. 2.0): (Transmembrandomänen) http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ PHDhtm, PHDtopology: (Resultat per Email) http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html. PSORT http://psort.nibb.ac.jp Analyse von Signalsequenzen: TargetP, SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/ Anschauen von Alignments mit Java interaktiv viewer http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/tools/JAV/JAViewer.cgi Erstellung des Reversen Komplements einer DNA-Sequenz: http://bioinformatics.org/sms/rev_comp.html Primerdesign http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi. Auf diesen Homepages sind eine große Anzahl nützlicher Links zu Analysetools und Datenbanken zusammengefasst. http://www.geocities.com/biosci2000a/biotools.htm http://www.beri.co.jp/Pedro/research_tools.html


Abb. 1: Thymindimer

10. Kurstag: Mutation und Supplementation Stichworte: Mutationsarten, Mutagene, DNA-Reparaturmechanismen, physiologische Strahlenschäden, C-Wert, C-Wert-Paradox, Blütenfarben, Anthocyane, Flavonoide, Biosynthesekette, Transposon, Transposase, IR-Elemente, Ac/Ds und En/Spm, Reversion Versuch 17: UV-Mutagenese einer Plasmid DNA Theorie: Genetische Veränderungen (Mutationen) sind einerseits die treibende Kraft der Evolution, andererseits ist die Mehrzahl aller Mutationen für ein Individuum eher schädlich als nützlich. In den Genomen aller Organismen ereignen sich ständig neue Mutationen, wobei die meisten davon natürlichen Ursprungs sind. Diese "spontanen" Mutationen entstehen z.B. durch Replikationsfehler, chemische Umlagerungen in der DNA oder Transposons (s. Versuch 19). Mutationen können aber auch durch äußere Einflüsse (Mutagene) induziert werden. Die wichtigsten Mutagene sind UV- und ionisierende Strahlung sowie bestimmte DNA-verändernde Chemikalien.

In diesem Versuchsteil wird die mutagene Wirkung von UV-Licht demonstriert. UV-Licht induziert in DNA die Bildung verschiedener Photoprodukte. Am häufigsten werden zwei benachbarte Thyminbasen über einen Cyclobutanring zu einem Dimer verknüpft, das keine normalen Basenpaarungen mehr eingehen kann und daher bei der Replikation zum Einbau falscher Basen führt. Die UV-Induktion von Pyrimidindimeren ist ein sehr häufiges Ereignis und dementsprechend haben alle Zellen DNA-Reparatursysteme zur Korrektur solcher und anderer Läsionen. Die Kapazität und Präzision der Reparatursysteme ist jedoch limitiert.

In diesem Versuch soll der Zusammenhang zwischen der Bestrahlungsdauer (UV-Dosis) und der Inaktivierung eines Ampicillinresistenzgenes auf einem Plasmid untersucht werden. Vorbereitung (Tutoren): In Wasser gelöste Plasmid-DNA wird fünf unterschiedlichen UV-Dosen (254 nm Wellenlänge) ausgesetzt. Die DNA wird anschließend in recA E. coli Zellen transformiert und auf Ampicillin-, -X-Gal und IPTG-haltiges Medium ausplattiert (s. Versuch 10). • 6 mal 5 µl 'pBluescript II' Plasmid-DNA (20ng/µl) auf je ein gekühltes Stück Parafilm pipettieren • Parafilm in einem Abstand von ca. 15 cm unter der UV-Lichtquelle (Stratalinker) platzieren und mit einer Energie

von 0 (Kontrolle), 25, 75, 150, 300 bzw. 400 J/cm2 bestrahlen • 2 µl der bestrahlten DNA in ein 1,5 ml Reaktionsgefäss überführen und auf Eis stellen • 40 µl kompetente E. coli 'XL1-Blue' Zellen (ca. 2,0 x108 Zellen) dazupipettieren und kurz mischen • 20 min auf Eis inkubieren • 45 sec bei 42°C im Wasserbad inkubieren • 2 min auf Eis inkubieren • 800 µl SOC-Medium (s. Versuch 10) zugeben • 50 min bei 37°C inkubieren, dabei alle 5 min mischen • nach nochmaligem Mischen von jedem Ansatz je 300 µl auf zwei LB-Amp-IPTG-XGal Platten (s. Versuch 10)

ausplattieren • zusätzlich von der Kontrolle und dem letzten Zeitwert je 100 µl auf LB-Platten ausstreichen • Platten über Nacht bei 37°C inkubieren


Abb. 2: pBluescript II

Auswertung: Mit den im Verlauf der Bestrahlung zunehmenden DNA-Schäden wird die Zahl der Plasmide, die noch repliziert werden können und ein intaktes AmpR Gen tragen, abnehmen. Dementsprechend sollte die Zahl der Kolonien auf den Platten etwa gemäß folgender Funktion abnehmen: N(t) = N0 • e–kt bzw. lnN(t) = lnN0 – kt

N0 = Zahl der Kolonien zum Zeitpunkt 0 t = Zeit in Sekunden k = Anteil der Kolonien bzw. der intakten Plasmid DNA-Moleküle der pro Sekunde abnimmt (durch lineare Regression zu ermitteln)

Das LacZ Gen ist dagegen für Replikation und Ampicillinresistenz unerheblich, lacZ-Nullmutationen sind daran zu erkennen, daß sie weiss sind. Sie sollen überprüfen, ob die Frequenz der durch UV-Licht ausgelösten Mutationen in einem DNA-Molekül bzw. Gen von der Größe (in Basenpaaren) abhängt. (a) Wirkung der Bestrahlung auf das AmpR Gen und den pUC origin:

• Zählen Sie die Kolonien (blauen und weisse) auf den Platten

• Tragen Sie den Logarithmus der Zahl aller Kolonien gegen die Bestrahlungsdauer auf • Bestimmen Sie k

(b) Wirkung der Bestrahlung auf das LacZ alpha-Fragment Gen:

• Tragen Sie den Logarithmus des Anteils der weissen Kolonien an allen Kolonien gegen die Bestrahlungsdauer auf

• Bestimmen Sie k'


Malonyl-CoA + p-Cumaroyl-CoA Chalkon Flavanon

DihydroflavanolFlavan-3,4-diolAnthocyanidin

Anthocyan

f+

e+

g+

Abb.:13.1Anthocyan-Biosynthese

Malonyl-CoA + p-Cumaroyl-CoA Chalkon Flavanon

DihydroflavanolFlavan-3,4-diolAnthocyanidin

Anthocyan

f+

e+

g+

Abb.:13.1Anthocyan-Biosynthese

Versuch 18: Supplementation bei Matthiola incana Einleitung: Die Biosynthese der Blütenfarbstoffe ist in der Regel durch viele Enzyme bestimmt, und entsprechend sind auch mehrere Gene daran beteiligt. Daher ist die Vererbung der Blütenfarben, wenn man allein den Phänotyp betrachten kann, auch komplex. Rätselhafte Spaltungsergebnisse können aber aufgelöst werden, wenn man die Biochemie analysiert und sich über die Biosynthese der Farbstoffe Gedanken macht. Analoge Beispiele in der Humangenetik wären Phenylketonurie (PKU) oder Galaktosämie, allerdings werden hier als Therapie die nicht umsetzbaren Substrate durch Diät vermieden. Als Supplementation kann man auch Hormontherapie bei Schilddrüsenunterfunktion bzw. Fehlen der Schilddrüse begreifen, allerdings wird dann ein kompletter Syntheseweg überbrückt. Durchführung: Durch Zugabe von Chemikalien können Zwischenprodukte oder Endprodukte der Blütenfarbstoffsynthese teilweise ersetzt werden. Blüten von drei weiß-blühenden Linien (Nr. 17, Nr. 18, Nr. 19) von Matthiola incana (Garten-Levkoje, Familie Brassicaceae) werden für 8-12 h in wässrige Lösungen von Dihydroquercitin gestellt. Dihydroquercitin steht im Gleichgewicht mit Dihydroflavanol.

Blütenfarbe plus Dihydroquercitin Genotyp Matthiola incana Nr. 17 Matthiola incana Nr. 18 Matthiola incana Nr. 19 Auswertung:

Aus der Veränderung der Blütenfarbe dieser Linien und der Kenntnis der Farbstoffsynthese soll die Genetik der Linien abgeleitet werden.

Welche Funktion hat das Dihydroquercitin? Was kann man aus der Kenntnis der Biosynthesewege der Blütenfarbstoffe über die Genetik

der drei Linien ableiten?


Abbildung 1: Retrotransposition

Abbildung 2: Transposition

Abbildung 3: DNA-Transposon

Versuch 19: Transposonmutagenese beim Mais Mit der Entdeckung von Transposons vor bald 60 Jahren wurde die bis dahin geltende Lehrmeinung, daß Gene unverrückbar an ihren Positionen auf den Chromosomen verankert sind, widerlegt. Bereits 1917 untersuchte Rollins Emerson die Genetik von Maiskörnern mit unregelmäßig großen roten Streifen oder farbigen Flecken, die von den Indianern Mittelamerikas als Zierpflanzen gezogen wurden, und prägte für diesen Phänotyp die Bezeichnung "instabile Mutation". Seine Schülerin Barbara McClintock studierte in den Folgejahren die Cytologie und Genetik solcher Mutationen im Detail und veröffentlichte 1947 ihre revolutionäre Schlußfolgerung, daß instabile Mutationen durch Insertion und Exzision von "springenden Genen" (Transposons) verursacht wurde. Es dauerte noch viele Jahre bis die Existenz von Transposons von den Genetikern allgemein akzeptiert wurde. Im Jahr 1983 erhielt Barbara McClintock den Nobelpreis für ihre bahnbrechenden Arbeiten.

Heute wissen wir, daß Transposons ubiquitär in allen Organismen vorkommen. Mittlerweile sind rund 1000 verschiedene Transposons bekannt, viele davon sind erst in den letzten Jahren im Zuge der bioinformatischen Analyse von vollständig sequenzierten Genomen entdeckt worden. Es gibt zwei Klassen von Transposons: Klasse I-Transposons verwenden ein RNA-Intermediat bei der Transposition und werden daher als Retrotransposons bezeichnet. Zu dieser Klasse gehören auch die Retroviren. Retrotransposons gibt es in allen Eukaryonten einschließlich den Menschen, aber nicht in Bakterien. Diese Klasse I-Elemente vervielfältigen sich durch Transposition und erzeugen neue Mutationen bei der Insertion, die aber stabil sind weil ein einmal inseriertes Retrotransposon nie wieder ausgeschnitten wird (Abbildung 1). Klasse II-Transposons (DNA-Transposons, transposable elements, TEs) schneiden sich selbst als DNA aus ihrer Umgebung aus und reinserieren an anderer Stelle. Diese Klasse von Transponierbaren Elementen findet man in Prokaryonten, Archae und in fast allen Eukaryonten. Auch sie erzeugen bei der Insertion in ein Gen eine neue

Mutation, daneben kann aber bei der Exzision gelegentlich ein Gen wieder reaktiviert werden (Reversion; Abbildung 2). Reversionsereignisse sind charakteristisch für TEs und verantwortlich für die oben erwähnten instabilen Mutationen, die Sie in diesem Kursteil analysieren werden. Viele TEs sind sehr einfach aufgebaut. Sie bestehen aus zwei kurzen terminalen invertierten Sequenzwiederholungen (terminal inverted repeats, TIRs) die ein Gen für das Protein Transposase flankieren (Abbildung 3). Die Transposase bindet an die TIRs und schneidet an deren Enden das Transposon aus der Wirts-DNA heraus. In einer häufig zeitlich und räumlich gekoppelten Reaktion erzeugt die Transposase um einige Basen versetzte Schnitte an anderer Stelle in der Wirts-DNA und katalysiert die Insertion des TEs.

Seit der Entdeckung der TEs ist umstritten, ob sie lediglich als 'molekulare Parasiten' oder eher als 'molekulare Symbionten' zu verstehen sind. Einerseits sind sie für die Ontogenie und den Stoffwechsel des Wirtsindividuums ganz klar entbehrlich. Ausserdem sind alle TEs im Genom unter normalen Wachstums- und Fortpflanzungsbedingungen (fast immer) in einem inaktiven Zustand, d.h. sie springen nicht und verhalten sich wie 'normale' Gene. Andererseits werden viele TEs aktiv, wenn der Wirtsorganismus Stressbedingungen ausgesetzt wird, die eine Schädigung der genomischen DNA mit sich bringen (z.B. ionisierende Strahlung, chemische Mutagene, genetisch induzierte Chromosomenbrüche). So wurden die von McClintock zuerst entdeckten Ac/Ds Elemente erst durch genetisch induzierte Chromosomenbrüche und die von Peter Peterson wenige Jahre später entdeckten Maistransposons En/Spm in Folge von radioaktiver Bestrahlung von Maiskörnern nach atmosphärischen Atombombenversuchen aktiviert und damit 'sichtbar'. Dies unterstützt die Hypothese, daß TEs wichtige "Players in Evolution" sind, die einer Art unter veränderten Umweltbedingungen eine schnellere genetische Adaption durch eine erhöhte Mutationsrate ermöglicht.


Abbildung 4: Aufbau eines Maiskorns

Bereits wenige Jahre nach dem Beginn der Entwicklung von gentechnischen Methoden und insbesondere der Möglichkeit Pflanzen zu transformieren wurde das Potential von TEs als gentechnische Werkzeuge entdeckt. Nach der Klonierung und Sequenzaufklärung eines TEs kann dieses auf seinem 'Weg durch das Genom' als mobiler molekularer Marker verfolgt werden. Wenn beispielsweise in Mais eine neue instabile Mutante entdeckt wird, so ist sie höchstwahrscheinlich auf die Insertion eines TEs zurückzuführen. Mittels molekularbiologischer Techniken (u.a. Southern Blotting, PCR, Klonierung) ist es möglich, ein neu inseriertes TE im Genom aufzuspüren und die flankierenden DNA-Abschnitte zu isolieren. Diese gehören zu dem Gen, das für den beobachteten Phänotyp verantwortlich ist.

Transposons haben aber auch zum Verständnis entwicklungsbiologischer Vorgänge beigetragen. Die durch TE-Exzision verursachten Variegationsmuster in einem Organ lassen manchmal Rückschlüsse auf die Entwicklung des betroffenen Gewebes und die Gewebespezifität der Expression eines getroffenen Gens schließen. In diesem Kursteil sollen Sie durch Insertion/Exzision von TEs in Maiskörnern verursachte instabile Mutationen analysieren und interpretieren. Den Aufbau und die Zellarchitektur eines Maiskorns zeigt Abbildung 4. Die für die Interpretation der beobachteten Phänotypen relevanten Fakten werden in der Vorbesprechung erörtert.

Aufgabe:

Sie erhalten Maiskolben bzw. einzelne Körner, die Transposoninsertionen in Genen für die Stärkebiosynthese (Waxy), die Flavoniodbiosynthese (P) und/oder die Anthocyanbiosynthese (Bz) tragen. Die Insertion im Waxy Gen bewirkt den Ausfall der Amylosesynthese und eine dadurch bedingte Transparenz des sonst eher milchig-trüben Endosperms. TE Insertionen in eines der Pigmentbiosynthesegene lassen die Maiskörner farblos werden.

Um die Stärkezusammensetzung im Inneren der Körner zu bestimmen, werden sie angefeilt und die Schnittstellen mit Iod-Iodkaliumlösung (Lugol Lösung: 1,3 g Iod + 2 g Kaliumiodid in 100 ml Wasser) gefärbt. Iod (in Form von KI5) bindet an die helikale Amylose, aber kaum an Amylopektin.

Beschreiben Sie die Phänotypen der Körner.

Analysieren Sie die Stärkezusammensetzung im Inneren der Körner durch Anfeilen und interpretieren Sie das Ergebnis.

Leiten Sie aus den Phänotypen ab, in welchen Geweben die Waxy, P und Bz Gene exprimiert werden.

Schließen Sie aus den Reversionsmustern auf den Entwicklungszeitraum in dem das Transposon aktiv war.


11. Kurstag: Klassische Genetik III Einleitung: Sehr bald nach der Wiederentdeckung der Mendelschen Regeln fand man Kreuzungsergebnisse, die im Spaltungsverhältnis der F2 von diesen deutlich abwichen. Darüber machten sich die alten Genetiker Gedanken und fanden verschiedene Erklärungsansätze, die zu einer Modifizierung der allgemeingültigen Formulierungen der Mendelschen Regeln führte. Als Abweichungen wurden sie zunächst in die Lehrbücher aufgenommen, weil die klassische Genetik immer nur den Phänotyp untersuchen konnte und von diesem Rückschlüsse auf den Genotyp ziehen musste. Stichworte: Letalfaktoren (gonische, zygotische), Abweichung von den Mendelschen Regeln, Phänotyp, Genotyp, Multiple Allelie, Blutgruppen, Dominanzreihe Versuch 20: Blütenfarben von Anagallis arvensis Aufgrund der F2-Spaltung folgender drei Kreuzungen der Art Anagallis arvensis (dt. Ackergauchheil, Familie Primulaceae) soll geklärt werden, ob die folgenden Phänotypen der Blütenfarbe (rot, rosa, blau) durch drei oder weniger Allele bedingt sind.

Bezeichnung Abkürzung/Symbol Phänotyp der homozygoten Linie phoenicia phoe rote Blütenfarbe

carnea car rosa Blütenfarbe coerolea coe blaue Blütenfarbe

hypothetische Genotypen

N Verh.

Kreuzung: Phänotypen phoenica x carnea

?

F1: Genotyp ? Phänotyp ?

F2: rotblühende rosablühende blaublühende

Kreuzung: Phänotypen phoenica x coerolea

?



Kreuzung: Phänotypen coerolea x carnea

?



Auswertung:

Die entsprechenden Hypothesen sollen mit Hilfe des χ2-Tests überprüft werden. Zwischen den Allelen eines Gens sollen die Dominanzverhältnisse bestimmt werden.


Versuch 21: Letalfaktoren: Blattfarben von Urtica urens Durchführung: Jede Gruppe untersucht mindestens einen Topf mit ca. 100 Pflanzen von Urtica urens (Kleine Brennessel, Familie Urticaceae). Die Segregation der analysierten Pflanzen entspricht dem Verhältnis einer F2-Generation aus der Kreuzung reiner Linien mit den Blattfarben dunkelgrün und weißlich.

Phänotyp Anzahl Genotyp dunkelgrüne Blattfarbe

hellgrüne Blattfarbe

weißliche Blattfarbe

Auswertung:

Welche Gene sind an dem Phänotyp beteiligt und mit welchem Erbgang nach Mendel kann die Segregation erklärt werden?

Welche theoretische Aufspaltung wäre zu erwarten. Welche Generation könnte die untersuchte Generation sein, wenn es nicht eine F2-Generation

ist? Warum ist es vermutlich keine F2-Generation aus der Kreuzung der genannten reinen Linien.

Die Antworten auf diese Fragen sollen statistisch gesichert werden:

Die Ergebnisse der Einzelgruppen und die Erwartungswerte sollen mit Hilfe des χ2-Tests überprüft werden.

Wer möchte soll den G-Test durchführen und das Ergebnis mit dem einfachen χ2-Test vergleichen.

Die Summe der Ergebnisse aus allen Gruppen soll entsprechend analysiert werden. Die unterschiedlichen Einzelergebnisse sollen auf der Basis des χ2-Tests auf Homogenität

überprüft werden, um zu klären, ob alle Einzelergebnisse zusammengefasst werden dürfen.


12. Kurstag: Populationsgenetik Allogame (Weißklee, Trifolium repens) und autogame Populationen (Gerste, Hordeum vulgare) Stichworte: Autogame und allogame Population, ideale Population, Hardy-Weinberg-Prinzip, Allelfrequenz, Abnahme der Heterozygotenfrequenz Die Populationsgenetik erforscht Vererbungsgesetzmäßigkeiten innerhalb von realen Fortpflanzungsgemeinschaften (Mendel-Populationen). Populationen sind abgegrenzt zu der theoretischen Fortpflanzungsgemeinschaft einer Art (Gesamtheit aller Erbanlagen einer Art) durch einen homogeneren Genpool. Eine Population ist für diese Betrachtung gekennzeichnet durch:

Genpool: Gesamtheit aller Erbanlagen in einer Population Genhäufigkeit: Die Anteile der verschiedenen Allele eines Gens in einer Population (eigentlich also: "Allelhäufigkeit").

Das HARDY WEINBERG Prinzip (1908) beschreibt die Verteilung von Allelen bzw. Genotypen in Populationen (diploider Organismen) in einer mathematischen Form. Es gilt im strengen Sinne allerdings nur für ideale Populationen. Diese Bedingungen sind für viele Gene in Populationen mit über 1000 Individuen mit hinreichender Genauigkeit gegeben, so dass eine mathematische Betrachtung möglich wird und dieselbe ein Instrument zur Analyse von Mutationsraten, Selektion, Gendrift, Isolation usw. wird. Unter den Bedingungen freier Partnerwahl (Panmixie) hängen in einer großen Population (>1000) diploider und sich sexuell vermehrender Organismen, bei der alle Genotypen gleich lebensfähig sind (keine Selektion) und keine Genotypen von außen (Isolation) oder durch Mutation (keine Neu- oder Rückmutation) hinzukommen, die Genotyphäufigkeiten einer bestimmten Generation von den Häufigkeiten der Allele in der vorausgehenden Generation ab und nicht von den Häufigkeiten der Genotypen. Die Häufigkeiten unterschiedlicher Genotypen, die durch freie Partnerwahl entstehen, hängen nur von den Genhäufigkeiten ab. Die Summe der Häufigkeiten der Allele für einen Genort ist immer 1 (100%): pA + qa = 1. Die Häufigkeit eines Allels für ein Gen mit zwei Allelen ist gleich der Häufigkeit der Homozygoten + 1/2 (Häufigkeit der Heterozygoten). Bei diploiden Organismen ergibt sich daraus, dass die Häufigkeit der Homozygoten p2 bzw q2 und der Heterozygoten 2pq sein muß (analog für mehr Allele): p2 + 2pq + q2 = 1 (für zwei Allele) p2 + 2pq + 2pr +2qr + q2 + r2 = 1 (für drei Allele) Auf der Basis des HARDY-WEINBERG-Prinzips lässt sich auch die Wirkung von Evolutionsfaktoren auf den Genpool einer Population betrachten. Mit dem Begriff Fitness (W) als Maß für den relativen Fortpflanzungserfolg in einer bestimmten Umwelt und einer bestimmten Population und dem Selektionskoeffizienten (s) für ein Allel, der den selektiven Nachteil eines Genotypen angibt, erhält man folgende Formeln: s = 1 - W (mit W=1 ist s=0 und es besteht kein selektiver Nachteil, mit W=0 ist s=1, die Merkmalsträger sind steril oder sterben früh). Berechnung von ∆q für ein Allel a, das unter homozygoten Bedingungen schädlich, aber nicht letal ist (0 < s < 1).


qnq0

01 +

Genotyp AA Aa Aa

ursprüngliche Häufigkeit p2 2pq q2

Anpassungswert (Fitness) 1 1 1-s Häufigkeit nach Selektion p2 2pq q2 (1-s)

Aus dem HWG abgeleitet, erweitert um die Faktoren Selektion (s), Mutation mit µ als Mutationsfrequenz und ν als Rückmutationsfrequenz, ergibt sich: spq2 ∆q = - ------------ + µ(1 - q) - νq

1 - sq2 Die folgende Formel wird oft im Zusammenhang mit negativer Eugenik zitiert, sie lässt sich aber auch umgekehrt für eine Vergrößerung von Allelfrequenzen durch therapeutische Maßnahmen verwenden. Für homozygot rezessive Genotypen (mit s=1, autosomale Gene) lässt sich die Anzahl der Generationen für eine bestimmte Veränderung von q entsprechend errechnen. qn = ⇒ n = n ist die Anzahl Generationen, die benötigt wird, um q zu reduzieren (∆q = qo -qn) Solche Berechnungen mögen spielerisch wirken, ergeben aber dann Sinn, wenn man über negative Eugenik nachdenkt. Sie erlauben auch Korrelationen aufzustellen, wie in den folgenden Beispielen. Es gibt in Malariagebieten einen Heterozygotenvorteil für Sichelzellenanämie, da hier die Allelehäufigkeit deutlich erhöht ist (siehe Tab.). Ebenso deuten die unterschiedlichen Verteilungen innerhalb der verschiedenen Populationen auf Gleichgewichte zwischen Häufigkeiten von genetischen Krankheiten mit anderen unbekannten genetischen Faktoren, wie es für PKU (Phenylketonuria) und cystischer Fibrose vermutet wird. Cystische Fibrose: Anreicherung von abnormen Glykoproteinen und entsprechend abnorme Sekrete; Absorptionsschwierigkeiten für Fette und Proteine, Leberzirrhose, erhöhte Infektionsanfälligkeit der Atemwege) tritt in Mitteleuropa einmal unter 2000 Neugeborenen auf (Heterozygote: 2 % ), während in China ein einziger Fall bisher zweifelsfrei diagnostiziert wurde. PKU: Enzym (Phenylalaninhydroxylase) zum Katabolismus von Phenylalanin ist defekt und führt zu Vergiftungserscheinungen. Unter anderem zu Hirndefekten, weshalb schon bei Neugeborenen u.U. eine Phenylalanin-Diät eingesetzt werden muss.

q qq q

n

n

0

0

−


Genotypenhäufigkeiten einiger rezessiver Erbkrankheiten beim Menschen (aus Strickberger 1988 und Stengel 1980) Erbkrankheit Population Häufigkeit

von Homo-zyg.

Allelhäu-figkeit (q)

Häufigkeit von Hetero-zyg. (2pq)

relative Fitness

Mutationsrate (geschätzt) (x10-6)

Sichelzellenanämie Afrika (Malariagebiet)

1:25 0,2 1:3 0,16 (Homozyg.) 1,14 (Heterozyg.)

Sichelzellenanämie USA (Schwarze) 1:625 0,04 1:13 Albinismus Panama (San Blas-

Indianer) 1:132 0,09 1:6

Albinismus Norwegen 1:10.000 0,01 1:50 cystische Fibrose USA (Weiße) 1:1000 0,032 1:16 Phenylketonurie USA 1:25.000 0,0063 1:80 25 Diabetes melitus Mitteleuropa 1:100 0,1 1:10 Mucoviszidose Mitteleuropa 1:3000 0,014 1:70 Bluterkrankheit Hämophilie A (X-Chr.)

Mitteleuropa 1:8000 (Männer)

0,2 (Hemizyg.)

30-60

Genotypenhäufigkeiten einiger dominanter Erbkrankheiten beim Menschen Erbkrankheit Population Häufigkeit

von Homo-zygoten

Allelhäu-figkeit (q)

Häufigkeit von Hetero-zygoten (2pq)

relative Fitness

Mutationsrate (geschätzt) (x10-6)

Brachydaktylie Mitteleuropa 1:170.000 0,002 1:420 Chondrodystrophie, Achondroplasie

Mitteleuropa 1:10.000 0,01 1:100 0,29 (Heterozyg.)

13

Huntington Chorea, Veit-stanz

Mitteleuropa 1:20.000 0,007 1:150 0,74 (Heterozyg.)

5

erbliche Taubstummheit Mitteleuropa 1:3000 0,018 1:55 Auf diese humangenetischen Aspekte gehen wir im Kurs leider nicht ein.

Versuch 22: Weißklee (Trifolium repens) Eine Population von allogamem Weißklee (Trifolium repens, Familie Fabaceae) wird in Bezug auf das Merkmal V-förmige Blattzeichnung (Genort V) der Blattsegmente untersucht. Das Gen liegt in mehreren codominanten Allelen vor. Nur das Allel v ist rezessiv gegenüber allen anderen Allelen. Die übrigen Allele wirken sich auch auf den Phänotyp der Heterozygoten aus, sofern die Blattzeichnungen jeweils an unterschiedlichen Stellen lokalisiert sind. Einige Allele maskieren aber die Ausprägung anderer Allele (z.B. Vf in der Heterozygoten VfVl).

Bezeichnung Symbol Phänotyp Schemazeichnung low Vl Winkelzeichnung (V-Form) der Blattsegmente

in der unteren Hälfte der Blättchen [low V-mark in lower half of the leaflet, size and position variable]

broken Vb Randzeichnung der Blattsegmente, der Scheitelpunkt der V-Blattzeichnung fehlt [broken, point of V is absent]


( )0 5 1, G− N

high Vh high V-mark extending into upper half of the leaflet

filled Vf filled in area within V is marked basal Vba basal, narrower, longer and fainter than Vt broken yellow Vby broken yellow, point of V is yellow, arms are

white

v Abwesenheit von Blattzeichnungen (rezessiv gegenüber allen anderen Allelen)

Da die unterschiedlichen Phänotypen, insbesondere die Heterozygoten nicht gut unterscheidbar sind, betrachten wir im Kurs nur die Allele Vl und v. Die heterozygoten Vl/v Pflanzen weisen eine wesentlich schwächere und dünnere Blattzeichnung auf, als die homozygoten Vl/Vl Pflanzen. Auswertung:

Aus den Häufigkeiten der homozygoten Pflanzen soll die Allelfrequenz (i.d.R. als Genfrequenz bezeichnet) berechnet werden und anhand der HARDY-WEINBERG-Regel geklärt werden, ob diese Population einer idealen Population entspricht und sich im Gleichgewicht befindet.

Inwieweit die Abweichungen allein auf zufällige Schwankungen zurückzuführen sind, soll mit Hilfe des χ2 Tests geklärt werden. Versuch 23: Gerste (Hordeum vulgare) Die Nachkommenschaft einer Ursprungskreuzung von zweizeiliger (Sorte Union) und vierzeiliger (Sorte Asse) Gerste (Hordeum vulgare) soll untersucht werden. Aus der Kenntnis des folgenden Schemas sowie dem Wissen, dass Gerste sich autogam fortpflanzt und ein Genlocus betrachtet wird, ist die Verteilung der folgenden Generationen abzuleiten.

Parental AA x aa Heterozygotenanteil F1 Aa 100 % F2 AA (1) Aa (2) aa (1) ? F3 AA AA (1) Aa (2) aa (1) aa ? F4 F5 F6 Allgemein gelten die Formeln: Anteil (Heterozyg.) = Anteil (Homozyg.) = G = Generation nach der Kreuzung (F1 = 1) N = Anzahl der Genloci Aufgabe/Auswertung: Auf dem Feld stehen fünf aufeinander folgende Filialgenerationen die ausgezählt werden sollen (im WS werden die Pflanzen in getrockneter Form ausgewertet). Anhand der Aufspaltungs-verhältnisse sollen Hypothesen über die Generation (Fx-Fy) aufgestellt werden und diese mittels eines geeigneten statistischen Tests überprüft werden (sprich χ2 Test).

( )1 0 5 1− −, G N

genetisches grundpraktikum ws 2005/2006 kurs … genetik ws 2005/2006, kurs d/e/f 3 kursplan...

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