immunologie in der labormedizin - medizinstudium bern · 1 immunologie in der labormedizin...
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1
Immunologie
in der Labormedizin
Konteptvorlesung 2
Themenblock 8 Beda M. Stadler
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KV 8.2 2
KV2 im Überblick
• Was sind Immunassays?
• Was versteckt sich hinter
den Abkürzungen?
• Assay Beispiele um
immunologische
Prinzipien zu vertiefen
• Aussagekraft von
Labordaten
• Vertrauensgrenzen
Lernziele: Immunologie in der Labormedizin
3
Selbststudium:
de.wikipedia.org/wiki/Immunoassay
Allgemeine Grundlagen
• Analyt
• Detektionstechniken
• Feste Phase
• Quantifizierung
Assay-Prinzipien
• Kompetitiver Assay
• Nicht-kompetitiver Assay
• Direkter Assay
KV 8.2 5
KV 8.2 6
KV2 im Überblick
• Präzipitationsteste
• Agglutinations Teste
• Antigen-Antikörper Teste • Allgemein
• Allergie Diagnostik
• Flowzytometrie
• HLA Diagnostik
• Autoimmun Diagnostik
• Sensitivität und Spezifität von Labortesten
Immunologie in der Labormedizin
4
KV 8.2 7
Identität
1
A
4
2
3
6
5
Partielle Identität
1
A
4
2
3
6
5
Keine Identität
1
A
4
2
3
6
5
Immunodiffusion
(Ouchterlony Gel)
A
1
2
Antigen
Kontrollserum
Testserum
KV 8.2 8
Antigen
Präzipitinkurve
+ Anti-A
Anti-B
Anti-C
C B
A
Antikörper Immunkomplex
Imm
un
ko
mp
lex
Antigen
Prozone Postzone
Äquivalenz
5
KV 8.2 9
Radiale Immunodiffusion
Antigen Konzentration
Dia
mete
r2
Ag Ag Ag Ag
Antikörper im Gel
KV 8.2 10
Serum Elektrophorese
gamma
beta
alpha2
alpha1
Albumin
-
+
Globuline
Paraproteinämie-Patient
6
KV 8.2 11
Immun-Elektrophorese
IgA Albumin Transferrin IgG IgM
+
Normales Serum
Patienetenserum mit IgA Mangel
Antikörper gegen Serumproteine
-
Beispiel
KV 8.2 12
Direkter Coombs Test
7
KV 8.2 13
Der indirekte Coombs Test
Patienten
Serum
Erythrozyten
+ Step 1
+
Coombs Reagens
(Antiglobulin)
Step 2
z.B. anti-RhD Antikörper
KV 8.2 14
Passive Hämagglutination (Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper)
8
KV 8.2 15
Latex Agglutination
KV 8.2 16
Blutgruppenbestimmung: Geltechnik
Resultat:
Blutgruppe A RhD neg
monoklonaler Antikörper
gegen Blutgruppen A Antigen
in der oberen Gelmatrix
9
KV 8.2 17
z.B. Schwangerschaftstest
rapid determination of human chorionic gonadotropin (hCG)
in urine specimens
Primary antibodies (anti-hCG labelled or on solid phase)
Secondary antibodies (anti-Ig on solid phase)
KV 8.2 18
Allergieserologie: welcher Test?
Anti-b2-Glycoprotein 1 (IgG) ELISA
U/ml
<15
Cardiolipin-Antikörper (IgG) SYNELISA
GPL-U/ml
<12
ECP ("eosinophil cationic protein") FEIA
g/L
2.5-15
Tryptase FEIA
g/L
1-13.5
Methylhistamin RIA
µg/g Kreatinin
70-160
Total IgE FEIA
kIU/L
(altersabhängig)
Allergen-spezifisches IgE
(RAST)
FEIA
Rastklassen 0-6
0
Allergen-spezifisches IgG FEIA
mg/L
< 50 mg/L
Präzipitine Immundiffusion
qualitativ
negativ
Analyse Messprinzip Masseinheit Referenz-
bereich
10
KV 8.2 19
KV 8.2 20
Isotop Enzyme
Messung der Radioaktivität
oder Enzymaktivität
Immun Assay: RIA & ELISA
• Enzyme
• Linked
• Immuno
• Sorbent
• Assay Antikörper Antigen
markierter
Antikörper
• Radio
• Immuno
• Assay
11
KV 8.2 21
ELISA
Anti-A
Markierter Antikörper
A
Enzym
Substrat
Produkt
KV 8.2 22
Sandwich ELISA
Anti-A
Anti-Antikörper
A
Enzym
Substrat
Produkt
12
KV 8.2 23
Standardisierung
KV 8.2 24
Beispiel: Flowzytometrie
Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich
HLA-B27
Zytofluorometrie
qualitativ
positiv/negativ
Lymphozyten
Zytofluorometrie
Zellen/l
1200-2800
CD3 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
690-2540
55-84
CD4 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
410-1590
31-60
CD8 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
190-1140
13-41
NK-Zellen
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
90-590
5-27
B-Zellen
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
90-660
6-25
13
KV 8.2 25
sample
red fluorescence
sorted cells
sheet flow
nozzle
laser
forward scatter
right angle scatter
green fluorescence
prism
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorter
KV 8.2 26
Zellpopulationen
?
14
KV 8.2 27
CD-Antikörper
CD
Antigen Funktion Vorkommen
CD 2 Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer
Aktivierungsweg von T-Lymphozyten unreife und reife T-lymphozyten
CD 3 T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten,
Signaltransduktion reife T-Lymphozyten
CD 4 assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an
MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen
CD 8 Bindung an MHC-Klasse I Moleküle zytotoxische T-Lymphozyten
CD 14 Rezeptor für bakterielles Endotoxin
(LPS=Lipopolysacharid) Monozyten, Makrophagen
CD 16 Fc-gamma Rezeptor III NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen,
Makrophagen
CD 23 niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgE B-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC)
CD 25 Interleukin-2-Rezeptor aktivierte T-Lymphozyten
IgM Antigenrezeptor unreife + reife B-Lymphos
IgD Antigenrezeptor reife B-Lymphos
HLA-DR MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von
Antigenpeptiden
AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen,
Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos
KV 8.2 28
Eine Immunantwort verfolgen
15
KV 8.2 29
CD-Marker bei der Diagnose von
lymphohämopoietischen Erkrankungen
Stammzelle Prä-B. frühe B. mittlere B. reife B. plasmozytoide B. Plasmazelle
ALL PLL, Burkitt
Lymphom
CLL,
foll. L.
Haarzell-
L.
Waldenström Myelom
CD19
CD 20
CD 34
CD 52
CD138
KV 8.2 30
Beispiel: HLA Typisierung
Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich
HLA-B27
Zelllyse
qualitativ
positiv/negativ
HLA-Typ I (A, B, C) (serologisch) Zelllyse
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ I (A, B)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DR)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DQ)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DP)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ Organempfänger
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
T-Zell Cross-match
Zelllyse
qualitativ
negativ
B-Zell Cross-match
Zelllyse
qualitativ
negativ
Leukozytenantikörper
Zelllyse
qualitativ
negativ
16
KV 8.2 31
HLA Typisierung einst...
KV 8.2 32
Überlebensrate Nierentransplantate
Number of HLA mismatches
A & B DQ & DR
0 0
A & B DQ & DR
3 or 4 1 or 2
20
KV 8.2 39
HIV: Western Blot
1. Lane 1, HIV+ serum
(positive control)
2. Lane 2, HIV- serum
(negative control)
3. Lane A, Patient A
4. Lane B, Patient B
5. Lane C, Patient C
KV 8.2 40
Beispiel: Autoimmunserologie
Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich
Rheumafaktor
Nephelometrie
IU/ml
< 20
Zellkerne (ANA)
IIF
Titer
< 1:80
Thyreoidea Thyroglobulin
Agglutination
Titer
< 1:400
C1-Esteraseinhibitor
(funktionell)
Fotometrie
% des
Normwertes
70-130%
C1q-tragende Immunkomplexe
ELISA
g/ml
< 35
Hautbiopsie
DIF
qualitativ
negativ
Schleimhautbiopsie
DIF
qualitativ
negativ
21
KV 8.2 41
Nephelometry
KV 8.2 42
Immunfluoreszenz
Antinukleäre Antikörper (ANA)
Ag
Fluorochrom
markierter AK
Gewebe
23
KV 8.2 45
FISH Beispiel
Fluorescent in situ
hybridisation of a
small intestinal biopsy
in a case of Whipple's
disease (confocal laser
scanning microscopy).
Tropheryma whipplei
rRNA is blue, nuclei of
human cells are green
and the intracellular
cytoskeletal protein
vimentin is red.
Magnification
approximately 200 x.
KV 8.2 46
Immunhistochemie
Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink)
in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody
against cytokeratin (green)
24
KV 8.2 47
Sensitivität und Spezifität
• Sensitivität (epidemiologisch)
• Sensitivität (analytisch)
• niedriger Titer
• Serokonversion
• Verdünnung
KV 8.2 48
oder...
• Sensitivität = Wahrscheinlichkeit,
dass Test bei kranken Personen
positiv ausfällt
• Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass
Test bei gesunden Personen negativ
ausfällt
25
KV 8.2 49
Genauigkeit der Labordiagnostik
X 100%
Anzahl richtig positiver
(Anzahl richtig positiver + Anzahl falsch negativer)
Sensitivität =
X 100% Spezifität =
Anzahl richtig negativer
Anzahl richtig negativer + Anzahl falsch positiver
Beispiel
Tatsächlicher Sachverhalt
positiv
(krank)
negativ
(gesund) Gesamt
Testergebnis
positiv
(krank)
richtig positiv
95
falsch positiv
30
125
negativ
(gesund)
falsch negativ
5
richtig negativ
270
275
Gesamt 100 300 400
KV 8.2 50
Sensitivität: 95 %
Spezifität: 90 %
26
KV 8.2 51
Aussagekraft der Labordiagnostik
echt Positive + falsch Positive
echt Positive X 100%
positiver
prädiktiver Wert =
echt Negative + falsch Negative
echt Negative X 100%
negativer
prädiktiver Wert =
HIV Testung bei der
Gesamtbevölkerung (82Mio)
HIV positiv HIV negativ
HIV-Test
positiv 66 933 82 000 148 933
HIV-Test
negativ 67
ca. 82
Mio
Summe 82 Mio
KV 8.2 52
Falls Sensitivität und Spezifität = 99.9%
positive Vorhersagewert beträgt nur 45 %!
27
KV 8.2 53
KV2 im Rückblick
Immunologie in der Labormedizin
• Traditionelle Serologie
• Moderne
immunologische Teste
• Molekularbiologische
Methoden
• Outlook: Point-of-care
testing ?
Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004
„Ein Einblick in die Labormedizin“
http://www.immunology.unibe.ch/wiki/?p=teaching/medical_students/practicle&l=de