Stoffwechselhormone

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Universität Ulm WS 2004/2005

Inhaltsverzeichnis

1. Theoretischer Hintergrund.......................................4

1.1. Definition des Begriffs „Hormon“............................4

1.2. Einteilungsmöglichkeiten von Hormonen...............4

a) Einteilung nach der Wirkungsweise

b) Einteilung nach Bildungs – und Wirkungsort

c)Einteilung nach chemischer Struktur

1.3. Molekulare Wirkungsmechanismen........................5

a) Genaktivierungsprinzip

b) Second – messenger – Prinzip

1.4. Hormondrüsen des Menschen.................................9

a) Drüsen und ihre Hormone

b) Hierarchie der Hormondrüsen

1.5. Hormone der Insekten.............................................10

1.6. Regulation des Energiestoffwechsels...................

a) beim Menschen

b) bei Inesekten

Stoffwechselhormone

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1.7. Definition der „Lucusta-Einheit“............................

1.8. Aufgabenstellung des Versuchs............................

2. Material und Methoden............................................

2.1. Versuch 1: Dosis-Wirkungs-Kurve.......................

2.2. Versuch 2: Zeit-Wirkungs-Kurve............................

2.3. Präparation der Corpora cardiaca..........................

3. Ergebnisse................................................................

3.1. Versuch 1..................................................................

3.2. Versuch 2....................................................................

4. Diskussion.................................................................

4.1. Versuch 1...................................................................

4.2. Versuch 2...................................................................

4.3. Vergleich der Nullwerte...........................................

5. Quellenangaben........................................................

Stoffwechselhormone

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1. Theoretischer Hintergrund

1.1. Definition des Begriffs "Hormon"

Hormone sind chemische Botenstoffe, die die metabolische Aktivität von Zellen

Geweben oder Organen beeinflussen. Sie werden von speziellen Drüsen oder Zellen

in kleinen Mengen produziert und auf verschiedenen Wegen zu ihren Zielorganen

transportiert (Blutbahn, Hämolymphe, Luft). Dort lösen Hormone nach Bindung an

einen spezifischen Rezeptor eine bestimmte Reaktion aus.

1.2. Einteilungsmöglichkeiten von Hormonen

a) Einteilung nach der Wirkungsweise

� Kinetisch: Wirkung auf Pigmentwanderung (Melatonin), Muskelkontraktion

(Adrenalin) und Drüsensekretion (Releasing-Hormone)

� Metabolisch: Wirkung auf den Kohlenhydrat – und Proteinhaushalt (Thyroxin,

Insulin) und den Elektrolyt – und Wasserhaushalt (ADH, Aldosteron)

� Morphogenetisch: Wirkung auf Wachstum und Differenzierung, zum Beispiel

Allgemeinwachstum (Wachstumshormone), Metarmophose (Thyroxin),

Differenzierung der primären und sekundären Geschlechtsmerkmale

(Androgene, Östrogene)

� Verhalten: Wirkung durch Einfluss auf die Funktionsweise des

Nervensystems (Östrogene, Androgene, Progesteron)

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b) Einteilung nach Bildungs – und Wirkungsort

Unterscheidung nach ihrem Bildungsort:

� Neurohormone: werden von neurosekretorischen Zellen produziert und

freigesetzt (hypothalamische Hormone, Neurohypophysenhormone)

� Glanduläre Hormone: Bildung in speziellen Hormondrüsen, z.B. Schilddrüse,

Bauchspeicheldrüse, Nebennieren

� Aglanduläre Hormone: Produktion durch bestimmte Gewebe mit endokriner

Funktion, Wirkung auf direkt benachbartes oder nahe gelegenes Zielgewebe

(Prostaglandine, Histamin)

� Mediatoren: hormonähnliche Stoffe, die von verschiedenen Zellen produziert

werden, aber nur eine lokale Wirkung zeigen

Unterscheidung nach ihrem Wirkungsort:

� Autokrin: Hormone, die die sezernierende Zelle selbst beeinflussen

� Parakrin: Wirkung auf direkt benachbarte Zellen

� Endokrin: Botenmoleküle werden über die Blutbahn zu weiter entfernt

liegendem Gewebe transportiert

� Spezielfall: wenn die Hormone von Nervenzellen gebildet und in die Blutbahn

abgegeben werden, spricht man vom neuroendokrinen System

� Exokrin: werden aus dem Organismus heraustransportiert (Bsp.: Pheromone)

c) Einteilung nach chemischer Struktur

� Amine (Aminosäureabkömmlinge): lassen sich von Aminosäuren ableiten,

Bsp.: Adrenalin, Thyroxin

� Fettsäureabkömmlinge: cyclisch ungesättigte Fettsäuren, die meistens aus

Lipiden der Plasmamembran gebildet werden, Bsp.: Prostaglandin

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� Steroide: cyclische Kohlenwasserstoffderivate, die aus Cholesterin

synthetisiert werden, Bsp.: Östrogen, Testosteron, Cortison

� Proteo – und Peptidhormone: bestehen aus kurzen oder längeren Amino-

säureketten, Bsp.: Insulin, Glukagon, Releasing-Hormone

1.3. Molekulare Wirkungsmechanismen

a) Genaktivierungsprinzip

Die Genaktivierung kann nur mit Hilfe von lipophilen Hormonen stattfinden, die die

Zellmembran der Zielzelle passieren können. Im Cytoplasma bindet das Hormon an

seinen spezifischen Rezeptor nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip und bildet einen

Hormon–Rezeptor–Komplex. Dieser kann nach einer Konformationsänderung die

Kernmembran passieren und so über ein Akzeptormolekül an bestimmte Bereiche

der DNA binden. Dort wirkt der Komplex als Transriptionsfaktor und schaltet

spezifische Gene an oder aus.

Abb. 1: Genaktivierungsprinzip

Campbell, Biologie, S.1002, 2.Auflage

b) Second – messenger – Prinzip

Stoffwechselhormone

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Im Gegensatz zu den lipophilen Hormonen können hydrophile Hormone die

Cytoplasmamembran nicht passieren. Sie wirken über einen intrazellulären

Botenstoff, der die jeweiligen Reaktionen in der Zelle in Gang setzt.

cAMP

Das zyklische Adnosinmonophosphat (cAMP) ist ein Beispiel für ein chemisches

Botenmolekül.

Die Aktivierung wird nun am Beispiel von Adrenalin erklärt:

Das Hormon (first messenger) bindet spezifisch an seinen membranständigen

Rezeptor in der jeweiligen Zielzelle. Dadurch entsteht ein Hormon-Rezeptor-

Komplex, der wiederum an ein bestimmtes Membranprotein bindet, ein sogenanntes

G–Protein. G–Proteine sind molekulare Überträgerstoffe, die eine aktivierende oder

eine hemmende Wirkung ausüben können. Durch die Bindung des G–Proteins mit

GTP (Guanintriphosphat) wird ein weiteres Protein, nämlich das Enzym

Adenylatcyclase, aktiviert. Die Adenylatcyclase setzt nun ATP zu cAMP um, welches

den second messenger darstellt.

Im nächsten Schritt beeinflusst cAMP ein weiteres Enzym, die cAMP-abhängige

Proteinkinase oder kurz A-Kinase. A-Kinasen bestehen aus einer regulatorischen

und einer katabolischen Untereinheit. Sie werden aktiviert, indem cAMP die

regulatorische Untereinheit entfernt, woraufhin die katalytische Untereinheit frei wird

und anschließend eine Enzymkaskade in Gang setzt. Nun findet die

Depolymerisation von Glycogen zu Glucose statt.

Stoffwechselhormone

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Abb. 2: Sekond Messenger Prinzip

Campbell, Biologie, S.1003, 2.Auflage

Ca2+

Neben den chemischen Botenmolekülen können auch verschiedene andere

Substanzen, wie zum Beispiel Calciumionen, für eine Signaltransduktion

verantwortlich sein.

Wieder bindet das Hormon (first messenger) an seinen spezifischen

Membranrezeptor und der Hormon-Rezeptor-Komplex aktiviert ein G-Protein. Das G-

Protein aktiviert daraufhin das Enzym Phospholipase C, welches Phospholipide in

Diacylglycerin (DAG) und Inositoltriphosphat (IP3) spaltet. Beide Stoffe wirken als

second messenger. DAG aktiviert das Enzym Proteinkinase C, das durch

Phosphorylierung bestimmter Proteine in der Zellmembran seine Wirkung entfaltet.

IP3 hingegen bewirkt eine intrazelluläre Erhöhung der Ca2+ - Konzentration, entweder

durch Aufnahme aus dem extrazellulären Medium oder durch Freisetzung von

Calciumionen aus dem ER. Ca2+ wirkt dabei als third messenger. Die Calciumionen

üben ihre Wirkung auf die Zielzelle nun direkt aus oder durch Bindung an das Protein

Calmodulin.

Ein Beispiel für diesen Mechanismus ist das Hormon Insulin.

Stoffwechselhormone

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Abb. 3: Wirkung von Ca2+ als Third-messenger

Campbell, Biologie, S.2006, 2.Auflage

1.4. Hormondrüsen des Menschen

a) Drüsen und ihre Hormone

In der folgenden Tabelle sind einige menschliche Hormondrüsen, ihre Hormone und

deren Wirkungen aufgelistet.

Tabelle 1: menschliche Hormondrüsen

Drüse Hormone Wirkungen

Adenohypophyse Thyreotropes Hormon (TSH) fördern Bildung und Ausschüttung

Corticotropes Hormon (ACTH) der Hormone von Schilddrüse,

Luteinisierendes Hormon (LH) Nebennierenrinde, Ovar und Hoden

Follikelstimulierendes Hormon

(FSH)

Wachstumshormon (GH) stimuliert das Körperwachstum

Neurohypophyse Vasopressin fördert Wasserrentention der Niere

Oxytocin Wirkung auf Uterusmuskulatur

Stoffwechselhormone

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Schilddrüse Thyroxin Regulation des

Trijodthyronin Grundumsatzes

Pankreas Insulin Regulation des Glukose-

Glukagon spiegels im Blut

Nebennierenmark Adrenalin und Erhöhung der Leistungsbereitschaft

Noradrenalin

Nebennierenrinde Clucocorticoide beeinflussen den Kohlenhydratstoff-

wechsel und die Immunreaktion

Mineralocorticoide Regulation des Mineral- und

Wasserhaushaltes

Eierstock Östrogene Ausbildung der weibl. Geschlechts-

merkmale

Gestagene regeln Ovarialzyklus und

Schwangerschaft

Hoden Androgene

Ausbildung der männl.

Geschlechts-

merkmale

b) Hierarchie der Hormondrüsen

Der Hypothalamus bildet die oberste Kontrollinstanz des Drüsensystems des

Körpers. Er empfängt Informationen aus allen Teilen des Körpers, vor allem aber von

anderen Gehirnregionen. Die hypothalamischen Hormone werden von zwei

verschiedenen Sorten von neurosekretorischen Zelle gebildet und dann zur

Hypophyse weitergeleitet.

Die Hypophyse (Hirnanhangsdrüse) ist die übergeordnete Hormondrüse, da sie

andere Hormondrüsen zur Hormonproduktion anregen kann, dabei aber selbst unter

hormoneller Kontrolle des Hypothalamus steht. Sie besteht aus zwei getrennten

Teilen, der Neurohypophyse und der Adenohypophyse.

Die Neurohypophyse ist ein Neurohämalorgan, d.h. die Axone der

neurosekretorischen Zellen des Hypothalamus sind so lang, dass sie bis in die

Neurohypophyse hineinreichen, wodurch die Hormone direkt übertragen werden

Stoffwechselhormone

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können. Sie dient zur Speicherung und Sekretion der Hormone Adiuretin (ADH) und

Oxytocin.

Die Adenohypophyse wird durch Releasing-(RH) oder Inhibiting-Hormone (IH)

beeinflusst. Diese werden von neurosekretorischen Zellen mit kurzen Axonen

produziert und über ein Pfortadersystem zur Adenohypophyse transportiert. Sie

regen zur Bildung eigener Hormone an, zum Beispiel die vier tropischen Hormone

Thyreotropin (TSH), Adrenocorticotropin (ACTH), Follikel stimulierendes Hormon

(FSH) und Luteinisierendes Hormon (LH), die andere Hormondrüsen zur

Hormonproduktion anregen, oder das Wachstumshormon.

1.5. Hormone der Insekten

Hier sind Hormone für Metamorphose und Häutungszyklen, Fortpflanzung und

Diapause zu ständig. Daneben aber auch sowohl zur Regulation des Gehalts an

Metaboliten in der Hämolymphe als auch zur Osmoregulation.

Die „Hormondrüsen“ (s.Abb.4) lassen sich im Grunde in zwei Gruppen aufteilen, die

neurosekretorischen Zellen im Gehirn und die Neurohämalorgane im weiteren

Kopfbereich.

Abb.4 : Lage der endokrinen Organe bei einem Insekt

De Deuterocerebrum; Pr Protocerebrum; Tr Tritocerebrum

(aus: Vergleichende Tierphysiologie, Heldmaier/Neuweiler, S. 407, Abb. 9.4)

Die neurosekretorischen Zellen sind Nervenzellen, die Hormon produzieren. Diese

liegen im Zentralen Nervensystem und sind wie normale Nervenzellen aufgebaut.

Zusätzlich besitzen sie aber noch sogenannte neurosekretorische Granula.

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Das namengebende Neurosekret wird im Zellkörper gebildet und innerhalb der

Axone transportiert. Deren verdickten Enden bilden keine Synapsen wie normale

Nervenzellen, sondern enden in unmittelbarer Nähe zu den Neurohämalorganen.

Die Aufgabe dieser Organe besteht in der Speicherung und Kontrolle der Abgabe

des Neurosekrets. Zum Teil kann das Neurosekret aber auch direkt ins

Kreislaufsystem (und damit in die Hämolymphe) abgegeben werden.

Zu den Neurohämalorganen gehören zum einen die paarig angeordneten Corpora

cardiaca. Diese erhalten Neurosekret aus verschiedenen Regionen des

Protocerebrums und Tritocerebrums. Zusätzlich enthalten sie Zellen, die selbst

endokrine Funktion besitzen und Neurone, die über Axone mit den Corpora allata

verbunden sind.

Die Corpora allata ist ein herkömmliches endokrines Organ, d.h. die Zellen sind

darauf spezialisiert Botenstoffe zu synthetisieren und direkt ins Blut zu sekretieren.

Bei diversen Insekten ist die C. allata nicht mehr paarig angeordnet, sondern zu

einem einzigen Organ verschmolzen (C. allatum).

Das andere wichtige Organ ist die ebenfalls paarige Prothorakaldrüse. Bei

stammesgeschichtlich frühen Insekten ist sie eine kompakte endokrine Drüse, die im

Bereich des Kopfes liegt. Bei späteren Insekten dagegen liegt sie mehr im Thorax

und ist verbreitert.

In der nachstehenden Tabelle sind die wichtigsten Hormone und ihre Wirkungen

aufgelistet.

Tab.2 : Hormone der Insekten

Bildungsort Hormon Chem.

Struktur

Wirkung

Neurosekretorische

Zellen im Gehirn,

Ausschüttung über

Corpora cardiaca

Prothorakotrophes

Hormon (PTTH)

Protein Stimuliert Ecdyson

Synthese, startet

dadurch die

Vorbereitung der

Häutung

Prothorax-Drüse Ecdyson Steroid Häutungshormon,

verändert Stoffwechsel

der Epidermiszellen

Stoffwechselhormone

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Corpora allata Juvenilhormon

(JH)

Terpenderivat Hoher JH-Gehalt erhält

Larvalstadien bei der

Häutung, niedriger Titer

verursacht

Imaginalhäutung

Neurosekretorische

Zellen im Gehirn,

Ausschüttung aus

den Corpora

cardiaca

Adipokinetisches

Hormon (AKH)

Protein Etwa 30 AKH´s bekannt,

mobilisieren

Speicherlipide,

Energieversorgung beim

Flug, gleichzeitig

Neurotransmitter,

stimuliert

lokomotorische Aktivität

Motoneurone Proctolin Protein Neuromodulator,

steigert Herzfrequenz,

Darmmotorik und

andere neuronal

ausgelöste

Muskelkontraktionen

Neurosekretische

Zellen im Gehirn

Bursicon Protein fördert

Cuticulaentwicklung,

Härten und Gerben der

Cuticula nach der

Häutung (vor allem nach

Imaginal-Häutung

2 Paar

neurosekretorische

Zellen im Gehirn

Eclosionshormon

(EH)

Protein Löst den eigentlichen

Schlüpfvorgang aus

1.6. Regulation des Energiestoffwechsels

Stoffwechselhormone

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Der Energiestoffwechsel wird neben anderen Faktoren auch hormonell geregelt.

Dabei ist es wichtig, dass die Höhe des Hormonspiegels überwacht und reguliert

werden kann. Im einfachsten Falle hemmt oder fördert die Substratkonzentration

selbst die Hormonbildung. Weitere Möglichkeiten wurden schon im Abschnitt 1.4.

erläutert.

a) beim Menschen

Chemische Energie kann auf verschiedene Weisen gewonnen werden, aerob oder

anaerob, und zwar wird dabei immer aus Nährstoffen ATP produziert.

Gärung als Abbau von Zuckermolekülen ohne Sauerstoff wird nur in

Ausnahmezuständen genutzt. Dazu zählt die Milchsäuregärung im Muskel, die zu

Muskelkater und Muskelerschöpfung führen kann. Dabei wird Pyruvat vom NADH

direkt zu Lactat reduziert. Dieses wird später vom Blut zur Leber befördert und in den

Zellen wieder zu Pyruvat umgesetzt. Die Milchsäuregärung ist aber auch

dahingehend negativ zu bewerten, dass hier nur zwei ATP Moleküle (der universelle

Energieüberträger der Zelle) entstehen.

Die normale Energiegewinnung ist die unter Sauerstoffverbrauch. Die dabei

ablaufenden Prozesse werden Glykolyse, Citratcyclus und Atmungskette genannt

und laufen im Mitochondrium ab.

Die Glykolyse entspricht der Milchsäuregärung, d. h. auch hier wird Glucose zu

Pyruvat oxidiert. Dieses wird dann allerdings im Citratcyclus weiter oxidiert, wodurch

die Energie die noch im Pyruvat steckt auch noch für den Körper nutzbar wird.

Bei der anschließenden Atmungskette (wozu auch die oxidative Phosphorilierung

gehört) wird nun der größte Teil der Energie gewonnen. Denn dabei oxidiert NADH

durch Luftsauerstoff und freiwerdende Energie wird zur ATP Synthese eingesetzt.

Dabei werden insgesamt pro Molekül Glucose immerhin 36 ATP Moleküle frei

(s.Abb.5).

Stoffwechselhormone

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Abb.5: Eine Zusammenfassung der Zellatmung (aus: N.A.Campbell; Biologie, S.190, Abb. 9.15)

Als Beispiel für die Regulation des Energiestoffwechsels seien hier die

antagonistischen Hormone Insulin und Glucagon erwähnt, die von den

Langerhansschen Zellen ausgeschüttet werden. Um den Stoffwechsel im

Gleichgewicht zu halten, sollte der Blutglucosespiegel bei ungefähr 0,9 mg/ml liegen.

Insulin wird ausgeschüttet, sobald der Blutzuckergehalt über diesen Wert steigt.

Neben anderen Auswirkungen werden dadurch fast alle Körperzellen, ausgenommen

die Gehirnzellen, angeregt Glucose aus dem Blut aufzunehmen. Falls aber der Wert

unter diesen Punkt sinkt, wird Glucagon ausgeschüttet und z.B. die Leber angeregt

eingelagertes Glycogen abzubauen und als Glucose wieder ins Blut abzugeben.

Zur Energiespeicherung wird Glucose nicht nur in der Leber sondern auch in den

Muskeln in Form von Glycogen eingelagert, während das Fettgewebe es zu Fett

umbaut.

b) bei Insekten

Die Flugmuskeln der Insekten gewinnen ihre Energie stets aerob. Da die

Flugmuskeln selber keine großen Energiereserven speichern können, müssen

energiereiche Moleküle von der Hämolymphe geliefert werden.

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Hierbei kann man zwischen Aminosäuren-, Kohlenhydrat- und Fettfliegern

unterscheiden. Das Gewebe mit Speicherkapazität und der entsprechenden

Stoffwechselaktivität ist der Fettkörper der Insekten.

Nur wenige Arten wie die Tsetse-Fliege Glossina morsitans oder der Kartoffelkäfer

Leptinotarsa decemlineata nutzen Aminosäuren (genauer Prolin) als Energielieferant

im Flugstoffwechsel. Das Prolin entsteht im Fettkörper durch den Abbau von

Fettsäuren bzw. aus Acetyl-CoA, im Citratcyclus unter Beteiligung von Alanin.

Danach wird das Prolin über die Hämolymphe in den Flugmuskel transportiert und

hier oxidativ abgebaut. Dabei entsteht wieder Alanin, das über die Hämolymphe

zurück in den Fettkörper gelangt und damit zur erneuten Synthese von Prolin zur

Verfügung gestellt wird.

Als Kohlenhydrat-Flieger gelten zum Beispiel die Schmetterlinge. Denn sie haben

meist nur kurze Flüge von Blüte zu Blüte zu bewältigen und nehmen dabei

zuckerhaltigen Nektar auf. Dieser wird zum Disaccharid Trehalose umgebaut, da dies

der Transportzucker in der Hämolymphe ist. In den Flugmuskeln angekommen wird

die Trehalose vom Enzym Trehalase zu Glucose abgebaut, so dass in den Muskeln

die Glykolyse ablaufen kann.

Der von uns betrachtete Fettflieger ist die Wanderheuschrecke Locusta migratoria,

die zu den Langstreckenfliegern zählt. Um die Energie dafür aufbringen zu können,

wird in den ersten Flugminuten auf schneller verfügbare Energie aus Kohlenhydraten

(Trehalose) zurückgegriffen.

Der anfängliche Kohlenhydratstoffwechsel wird durch das Aminhormon Octopamin

gesteuert und entspricht damit dem blutzuckersteigernden Hormon Adrenalin der

Wirbeltiere. Nach 10-20 Minuten übernehmen, zum Ende der ersten Flugphase,

Peptidhormone die Regulation des Stoffwechsels und der Energiebereitstellung.

Diese werden in der Corpora cardiaca synthetisiert und im hinteren Hirnbereich

gespeichert. Über die Verbindung mit dem Nervi Corporis zum Gehirn wird die

Exozytose des AKH induziert. Durch die Hämolymphe gelangt es zum Fettkörper und

bindet dort an seine Rezeptoren. Wie in Abb. ersichtlich, löst dieser Vorgang in der

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Zelle, über die second- Messenger cAMP und Ca2+, die Aktivierung der Lipase aus,

welche die gespeicherten Triacylglyceride in Diacylglyceride spaltet. Diese

Diglyceride werden an der Membranoberfläche des Fettkörpers mit dem (in der

Hämolymphe vorhandenen) Transportprotein HDLp und dem Apoprotein ApoLp-III

zu einem Transportkomplex zusammengelagert. Dieser ganze Komplex wird als

LDLp bezeichnet und übernimmt die Beförderung der Diglyceride zu den

Muskelzellen.

Dort bindet der Transportkomplex an das membranständige Enzym Lipophorin-

Lipase, welche den Abbau katalysiert und dabei die Fettsäuren von Glycerin spaltet.

Die Fettsäuren wiederum werden in die Muskelzelle aufgenommen und oxidiert,

während die restlichen Bestandteile des Komplexes in der Hämolymphe

zurückbleiben und somit wieder der Komplexbildung zur Verfügung stehen. Der

Verlauf des Fettstoffwechsels ist in Abb. 6 dargestellt.

Abb.6: Die physiologische Steuerung des Fettstoffwechsels

AKH Adipokinetisches Hormon; ApoLp-III ApollpophorinIII; CC Corpora cardiaca; DG

Diacylglyceride; FFa freie Fettsäuren; HDLp High-Density-Lipophorin; LDLp Low-Density-

Lipophorin; TG Triacylglyceride

(aus: Skript zum Tierphysiologischen Anfängerpraktikum)

Die Regulation dieses Stoffwechselprozesses gelingt nur über die Zusammenarbeit

aller beteiligten Proteine. So inhibiert freies ApoLp-III in der Hämolymphe zusätzlich

die Lipophorin- Lipase, was einen Mindestgehalt an Fett in der Hämolymphe sichert.

Der Umstand, dass Fette osmotisch inaktiv speicherbar sind, und beim oxidativen

Abbau der Fettsäuren metabolisches Wasser entsteht, führt zu einem geringen

Wasserbedarf der Tiere. Außerdem besitzen Fette ein hohes ATP-Äquivalent von

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0,65 mol ATP pro g Fett. Diese Fakten sind für Langstreckenflieger von besonderer

Bedeutung und Nutzen.

1.7. Definition der „Lucusta-Einheit“

Unter der Lucusta-Einheit versteht man die Menge an AKH, die benötigt wird, um die

halbe Fettkonzentration in der Hämolymphe zu erreichen. Diese AKH Menge

mobilisiert eine bestimmte Menge Fett in Form von Diglyceriden.

1.8. Aufgabenstellung des Versuchs

In diesem Versuch wird untersucht, in wieweit sich das Hormon AKH auf den

Fettmetabolismus der Wanderheuschrecke Locusta migratoria auswirkt. Dies wird

anhand der Abhängigkeit von der Zeit und der Dosis auf die Fettkonzentration der

Hämolymphe analysiert. Außerdem werden am Ende aus sieben

Wanderheuschrecken die Corpora cardiaca´s herauspräpariert, damit ein Corpora

cardiaca Aliquot für die nächste Gruppe bereit steht.

2. Material und Methoden

2.1. Versuch 1: Dosis-Wirkungs-Kurve

Vor Versuchsbeginn wurde vier Wanderheuschrecken (Locusta migratoria) je 5µl

einer unterschiedlich hoch konzentrierten Lösung eines Corpora cardiaca Extraktes,

welches das adipokinetische Hormon (AKH) enthält, von der Betreuerin injiziert.

Dafür wurden sieben Corpora cardiaca aus dem Versuch der vorherigen Woche

verwendet und mit Wasser verdünnt, damit man die Mengen von 0,009, 0,0175,

0,035 und 0,07 als Anteile der extrahierten Hormondüsen bekommt. Außerdem wird

einem Tier als Blindwert 5µl bidestilliertes H20 injiziert.

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60 Minuten nach der Injektion wird dem Tier Hämolymphe entnommen, um den darin

vorhandenen Fettgehalt zu bestimmen. Hierfür wird das Tier auf den Rücken gelegt,

festgehalten und der Kopf mit einer Pipettenspitze nach hinten gehalten. An der

Übergansregion von Caput und Thorax, an der der Chitinpanzer sehr dünn ist, wird

die Wanderheuschrecke mit einem Skalpell perforiert. Durch Ausübung von Druck

auf den Thorax bildet sich an der angeschnittenen Stelle eine Tropfen Hämolymphe,

der dann abpipettiert werden kann. Hierbei werden jedem Tier zur

Doppelbestimmung zweimal 10µl Hämolymphe entnommen, wobei darauf

aufgepasst werden muss, dass keine Fettzellen aus dem nahe liegende Fettkörper

mit aufgenommen werden.

Die entnommene Hämolymphe wird zu je 1ml Isopropanol gegeben und sofort mit

Hilfe eines Rüttlers gemischt. Ebenfalls werden ein Triglycerid-Standard (Triolein,

3mg/ml), ein Diglycerid- Standard (Dipalmitin, 3mg/ml) und reines Wasser als

Leerwert mit je 1ml Isopropanol vermischt (Pipettierschema siehe Tabelle 3).

Tabelle 3: Pipettierschema zur Dosis-Wirkungs-Kurve

Isopropanol Hämolymphe Standard H20

Probe 1ml 10µl

Standard 1ml 10µl

Leerwert 1ml 10µl

Zu jeder Probe werden nun 200µl Kalilauge (KOH) gegeben, mit dem Rüttler

vermischt und in einem Wasserbad 5 Minuten bei 60°C inkubiert. Hierbei reagieren

die Di- und Triglyceride mit dem KOH zu Glycerin und Fettsäuren. Um die Reaktion

zu stoppen, werden die Reagenzien in Eis abgekühlt.

Anschließend wird zu jeder Probe 200µl Natriumperjodad hinzugefügt, geschüttelt

und 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dabei wird das Glycerin durch

Natriumperjodad in Formaldehyd gespalten.

Zuletzt pipettiert man die Farbreagenz (NH4+ und Acetylaceton) in jedes

Reagenzglas, vermischt den Inhalt im Rüttler, setzt Glaskugel auf die Reagenzgläser

und inkubiert sie eine halbe Stunde bei 60°C. Dadurch reagiert das Formaldehyd zu

Diacetyldihydrolutidin, wodurch eine Farbveränderung (gelb) auftritt.

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Die entstandenen Lösungen werden nun in Küvetten umgeschüttet und bei 410nm

photometriert, wobei die Extinktion gemessen wird.

2.2. Versuch 2: Zeit-Wirkungs-Kurve

Fünf Wanderheuschrecken wurden vor dem Versuch eine Menge von 0,07

Rohextrakt der Corpora cardiaca von der Betreuerin injiziert. Nach unterschiedlichen

Zeiten (10min, 30min, 60min, 90min und 120min) wird dann Hämolymphe

entnommen und der jeweilige Fettgehalt, wie in Versuch 1 beschrieben, bestimmt.

Außerdem wird der Fettgehalt der Hämolymphe eines Ruhetiers, welchem nichts

injiziert wurde, untersucht.

2.3. Präparation der Corpora cardiaca

Die Corpora cardiaca wird aus den Köpfen von 7 Wanderheuschrecken unter dem

Stereobinocular präpariert, welche davor vom restlichen Körper abgetrennt wurden.

Die Hormondrüse ist halbmonförmig und liegt dorsal hinter dem Gehirn, hinter den

Mundwerkzeugen und Oberschlundganglion.

Die sieben Drüsen werden in reinem Wasser homogenisiert, so dass das Gewebe

aufgeschlossen wird und in Eppendorfgefäße gegeben. Dann wird nochmals

homogenisiert, wobei als Lösungsmittel Methanol verwendet wird und wieder in

Eppendorfgefäße umgefüllt. Diese werden dann in einer Biofuge 5min bei 13000U

zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und über Nacht eingeengt, so dass

das für Insekten schädliche Methanol verdampfen kann. Das gewonnene Rohextrakt

der Corpora cardiaca kann dann von dem nächsten Kurs verwendet werden.

3. Ergebnisse

3.1. Versuch 1

Um die Konzentration der Lösungen berechnen zu können, wird zuerst der

Absorptionskoeffizient ε mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetztes berechnet, das

wie folgt lautet:

∆E=c*d*ε � c*d

E∆=ε

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Dieses Gesetz besagt, dass die Extinktion E∆ der Konzentration c des

absorbierenden Stoffes und der Schichtdicke d der Lösung proportional ist.

Der Absorptionskoeffizient ist ε, er ist abhängig von der Art der Substanz und der

Wellenlänge.

Da die Konzentration der Standardlösungen bekannt ist, kann man somit ε, wie in

Tabelle 4 gezeigt ist, berechnen.

Tabelle 4: Berechnung von ε aus den Standards

Extinktion 1

∆E1

Extinktion 2

∆E2

Mittelwert

∆E

Konzen-

tration c

ε in [ml*

cm-1*mg-1]

Standard 1

Dipalmitin

0,198 0,175 0,1865 3mg/ml 0,0622

Standard 2

Triolein

0,117 0,202 *1 0,117 3mg/ml 0,039

*1 Da dieser Wert zu hoch ist, wurde er in unseren Berechnungen nicht berücksichtigt.

Nun kann man ebenfalls mit dem Lambert-Beerschen-Gesetz die Konzentrationen

der einzelnen Lösungen berechnen:

ε

∆=

*d

Ec

Hierfür wird für die Fettkonzentration cA der Absorptionskoeffizient ε1 des Dipalmitin-

Standards verwendet und für die Fettkonzentration cB der des Tripalmitin-Standards

(ε2). Die berechneten Werte werden in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5: Ergebnisse des Dosis-Wirkungs-Versuches

Injizierte

Dosis

Extinktion 1

∆E1

Extinktion 2

∆E2

Mittelwert

∆E

Fettkonzen-

tration cA

Fettkonzen-

tration cB

Bidest. H20 0,439 0,465 0,452 7,271 11,589

0,009 0,787 0,492 *1 0,787 12,659 20,180

0,0175 0,975 0,845 0,91 14,638 23,333

0,035 0,927 1,073 1 16,086 25,641

0,07 0,675 0,706 0,6905 11,107 17,705

Die Fettkonzentration cA in mg/ml gegen die Dosis, die dem Tier injiziert wurde,

aufgetragen ergibt die Kurve in Graphik 1. Es wurde hierfür nur die Fettkonzentration

cA verwendet, also nur die Werte, die mit Hilfe des Dipalmitin-Standards berechnet

Stoffwechselhormone

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wurden. Da die Fettkonzentration cB denselben Kurvenverlauf, nur etwas verzerrt

ergeben würde. (Weitere Begründung siehe Diskussion.)

Graphik 1: Dosis-Wirkungs-Kurve

3.2. Versuch 2

Es wird, analog zu Versuch 1 die Konzentrationen der einzelnen Lösungen nach

Lambert-Beer berechnet. Dies ergibt die Tabelle 6:

Tabelle 6: Ergebnisse des Zeit-Wirkungs-Versuches

Zeit Extinktion 1

∆E1

Extinktion 2

∆E2

Mittelwert

∆E

Fettkonzen-

tration cA

Fettkonzen-

tration cB

Ruhetier 0,370 0,466 0,418 6,724 10,718

10 min 0,697 0,665 0,681 10,954 17,462

30 min 0,880 0,991 0,9355 15,048 23, 987

60 min *1 *1 *1 *1 *1

90 min 1,120 0,787 0,9535 15,338 24,449

120 min 1,181 1,336 1,2585 20,244 32,269

*1 Da aus diesem Versuchstier keine Hämolymphe gewonnen werden konnte, konnten diese Werte

nicht berechnet werden.

Stoffwechselhormone

- 22 -

Die Fettkonzentration cA gegen die Zeit aufgetragen, ergibt die Graphik 2:

Graphik 2: Zeit-Wirkungs-Kurve

4. Diskussion

Bei beiden Versuchen wurden die Ergebnisse mit dem Absorptionskoeffizienten des

Dipalmitin-Standards berechnet, da in den Wanderheuschrecken Diglyceride und

nicht Triglyceride zur eigentlichen Energiegewinnung gespalten werden. Da Triolein

der gängigere Standard ist und deshalb Verwechslungsgefahr besteht, wurde er in

unseren Versuch miteinbezogen. Die höheren Fettkonzentrationen bei Triolein als

Standard lassen sich dadurch erklären, dass bei selber Menge verhältnismäßig

weniger Glycerinmoleküle enthalten sind, was bewirkt, dass weniger Farbstoff

gebildet wird, also die Extinktion geringer ist. Dies hat zur Folge, dass der

Extinktionskoeffizient ε2 niedriger ist als ε1, und somit bei der Berechnung der

Fettkonzentrationen höhere Werte für cB als für cA zustande kommen.

Stoffwechselhormone

- 23 -

4.1. Versuch 1

Bei dem Dosis-Wirkungsversuch wäre eine Sättigungskurve, die sich asymptotisch

einem Grenzwert nähert zu erwarten. Wenn weniger ADH - Hormone als

Rezeptoren am Fettkörper vorhanden sind, steigt die Fettkonzentration durch

Erhöhung der Hormonkonzentration an. Sind alle Rezeptoren mit Hormonen besetzt,

kann trotz Erhöhung der ADH Konzentration nicht mehr Hormon gebunden werden.

Es können also nicht mehr Triglyceride in Diglyceride gespalten werden und dadurch

hat auch die Menge an Glycerin in der Hämolymphe auf einem konstant hohen

Niveau erreicht.

Die Messwerte für Bidest. Wasser und für die Corpora cardiaca Äquivalente von

0,009, 0,0175 sowie 0,035 entsprechen diesen Erwartungen. Der Messwert für das

Corpora cardiaca Äquivalent von 0,07 ist deutlich zu niedrig, dadurch sinkt die Kurve

stark ab, anstatt ein Plateau bei konstantem Wert zu bilden.

Gründe für die zu niedrige Fettkonzentration könnten sein:

� Beim Pipettieren der Hämolymphe sind versehentlich Luftblasen entstanden,

so dass nur eine verringerte Menge an Hämolymphe untersucht werden

konnte.

� Es können Variationen bei der Hormonkonzentration auftreten, da kein reines

AKH verwendet wurde, sondern nur das Äquivalent aus der Corpora cardiaca.

Meint ihr hiermit Schwankungen innerhalb der Probe, weil die Lösung nicht

homogen war? Schwankungen zwischen den einzelnen Konzentrationen

(0,07, 0,035 usw.) können nicht auftreten, da es sich immer um eine 1:2

Verdünnung handelte. Es könnten also nur Fehler auftreten, wenn ich die

Probe vor der Weiterverdünnung nicht richtig vermischt habe. Die

Verwendung von reinem AKH würde an dieser Fehlerquelle aber auch nichts

ändern.

� Das Versuchstier könnte aufgrund der Haltung in einer kleinen Box nervös

geworden sein und versucht haben zu fliehen, was einen deutlich höheren

Fettumsatz zur Folge hat. Somit wäre nur noch eine geringe Menge an

Glycerin im Körper vorhanden und damit nachweisbar.

Stoffwechselhormone

- 24 -

4.2. Versuch 2

Bei dem Dosis-Zeit-Versuch wäre für die Fettkonzentration in Abhängigkeit von der

Zeit eine Glockenkurve zu erwarten, was bedeutet, dass die Kurve relativ steil

ansteigt, dann einen Höhepunkt erreicht und anschließend wieder abfällt. Der

Hochpunkt wäre ungefähr bei der Zeit 60min zu erwarten.

Die injizierte Menge an Corpora cardiaca bzw. ADH war bei allen Versuchstieren

gleich hoch bei 0,07. Somit kann also eine maximale Sättigung wie im Versuch

vorher gezeigt, erreicht werden. Die am Anfang sehr niedrige Fettkonzentration, die

dann ansteigt, bedeutet, dass es eine gewisse Zeit dauert, bis das Hormon seinem

Wirkungsort erreicht und bis die Fette gespalten sind, so dass Glycerin

nachgewiesen werden kann. Nach ca. 60 min ist das Optimum der Fettkonzentration

erreicht, das bedeutet, dass eine maximale Anzahl von ADH-Molekülen den

Fettkörper erreicht haben. Dies bewirkt, dass sich ein Gleichgewicht zwischen den

Molekülen, die den Fettkörper erreichen und dann wieder in diesem abgebaut

werden, einstellt. Da das ADH nach einer gewissen Zeit enzymatische abgebaut

wird, sinkt die Fettkonzentration folglich.

Die Messwerte der Fettkonzentration beim Ruhetier und bei den Tieren, bei denen

die Hämolymphe-Abnahme nach 10min, 30min und 90min erfolgte entsprechen

unseren gerade genannten Vermutungen. Da dem 60 min Tier keine Hämolymphe

entnommen werden konnte, ist in unserer Kurve kein Optimum vorhanden. Wir

vermuten, dass nach 60min die Fettkonzentration bei ca. 19-20mg/ml liegt. Die nach

120min gemessene Fettkonzentration ist viel zu hoch, da die Kurve zu diesem

Zeitpunkt nicht wie bei uns steigen, sondern schon abfallen sollte.

Die Gründe für den zu hohen Messwert können folgende sein:

� Bei der Entnahme von Hämolymphe könnte der Fettkörper mit angestochen

worden sein, so dass daraus zusätzlich Fett in unsere Probe gelangen konnte.

� Wahrscheinlicher hingegen ist, dass das Versuchstier kurz vor der

Hämolymphe-Entnahme unter Stress gelitten hat und so selbst eine hohe

Konzentration an AKH ausgeschüttet hat, wodurch zusätzlich Diglyceride

entstanden und gespalten wurden.

Stoffwechselhormone

- 25 -

� Es wäre auch möglich, dass unser Versuchstier lethargisch war und sich

überhaupt nicht bewegt hat, so dass kein Fett bis zur Entnahme verbraucht

wurde.

Allgemein sind die gemessenen Werte nicht unbedingt zuverlässig und repräsentativ,

da wir jeweils nur einem Tier Hämolymphe entnommen haben und da jede Messung

nur zweifach durchgeführt wurde. Um eine repräsentative Statistik zu bekommen,

müsste man die Versuche viel häufiger durchführen, wodurch exaktere Mittelwerte

entstehen würden und somit abweichende Werte sicherer als Ausreißer erkannt

werden können.

4.3. Vergleich der Nullwerte

Zum Abgleichen wurde einmal ein Ruhetier verwendet, das andere Mal ein Tier, dem

bidest. Wasser injiziert wurde. Dieses Tier steht unter demselben Stress durch die

Injektion, wie die anderen Versuchstiere. Das Ruhetier war diesem Stress nicht

ausgesetzt, ist also in dieser Hinsicht nicht ganz so repräsentativ. Da aber durch die

Wasserinjektion die Hämolymphe verdünnt wurde, wodurch der Fettgehalt in der

entnommenen Hämolymphe erniedrigt wird. Allgemein ist es schwer die beiden Tiere

zu vergleichen, da sie unter unterschiedlichen Bedingungen leben mussten und

jedes Tier sich anders auf Stress reagiert.

5.Quellenangaben

1. Versuchsskript „Kurs Stoffwechselhormone“, Anfängerpraktikum

Tierphysiologie, WS 2004/5

2. Zoologie Wehner Gering, Thieme Verlag, 23.Auflage, 1995

3. Biologie, Campbell, Spektrum Akademischer Verlag, 2.Auflage, 2000

4. Tierphysiologie, Eckert, Thieme Verlag, 4.Auflage, 2002

5. Penzlin H.; Lehrbuch der Tierphysiologie, 4. Auflage, 1989

6. Heldmaier/Neuweiler; Vergleichende Tierphysiologie, 2004