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Klinische Chemie und LaboratoriumsdiagnostikVorlesung: Immunologische Labormethoden
Dr. rer. nat. Manfred Fobker Centrum für Laboratoriumsmedizin
– Zentrallaboratorium –Universitätsklinikum MünsterAlbert-Schweitzer-Campus 1
D-48149 MünsterTel.: 0251 83-48701Fax: 0251 83-47225
Sommersemester 2014 - 1 -
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Immunglobulin-Antigenbindung
Antigen
Fab
Fc
COOH COOH
S-S S-SS-SS-S
VH
CH1
VL
CL
Schwere Kette
CH2
CH3CH3
CH2
CH1
VH
CL
VL
Flexible Übergangsregion
NH2NH2
NH2
NH2Antigen Bindung sregion
AntigenEpitop
Paratop Leichte Kette
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Spezifität von Antikörpern
Antigen: Stoffe (z.B. Proteine), die „Antikörper-generierend“ sind
Analytische Spezifität: Fähigkeit nur den gesuchten Analytennachzuweisen
Kreuzreaktivität: Antikörper erkennt ähnliche Antigene
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Was möchte ich messen? Beispiel: PSA-Fraktionen
PSAPSA PSA
Freies PSA PSA-ACT PSA- 2M
10-15% 85-90% nicht detektierbar
ACT= 1-antichymotrypsin 2M= 2-Makroglobulin- 4 -
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Stimulanzien
Verbotene Dopingsubstanzen
Narkotika
Anabolika
Diuretika
Peptidhormone
- 5 -
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• Bildung von Antigen-Antikörper-Netzwerken (Präzipitate)• bivalent•Vernetzungsgrad von ihren relativen Mengen abhängig
Antikörper-Reaktionen
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Quantitative immunchemische Verfahren:Nephelo- und Turbidimetrie
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PSA
Antigen Antikörper Markierung
• radioaktive Isotope
• fluorogene Moleküle
• Enzym
• luminogene Moleküle
• polyklonal• monoklonal
Spezifität:
Herkunft:• Mensch/Tier
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Immunoassay-Testformen (heterogen)
Konzentration
A. Kompetitive Testform
Sign
al
Ag
AgAgAg
AgAg
- 9 -
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Immunoassay-Testformen (heterogen)
B. Sandwich-Typ (immunometrischer Test)
Mes
ssig
nal
Ag
Ag
Ag
Ag
Konzentration
Waschen
Ag
Ag
Ag
- 10 -
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Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA)
Antigen markierter AK
Ag
„ Sandwich-Prinzip “
AP
MUP
MU
O O
CH3
R
+P
4-Methylumbelliferyl-Phosphat- 11 -
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TeststreifenGLORIA-Technik (Gold Labelled Optical-read Rapid Immuno Assay)
FilterMischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier
PSA
PSA
PSA
POSITIV
FilterMischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier
NEGATIV- 12 -
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+ +AgAg
a) EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)
AgAgAg
Substrat
Produkt
Substrat
ProduktProduktAg
E
AgAgAg
E
Ag
E
AgAgAgAg
E
hohe Ag-Konzentration
niedrige Ag-Konzentration
hohe Ag-Konzentration
niedrige Ag-Konzentration
Homogene Immunoassays („Eintopfverfahren“)
- 13 -
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Test-Spezifikationen
Probenmaterial: SerumHaltbarkeit: wenige Stunden- mehrere Wochen
(Peptide !)
Probenvolumen: 10-50 µl
Kalibratoren: WHO-Standard (methodenabhängige Werte)
Inkubationszeit: 10 min-60 min
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Immunoassays-Anwendungen-
• Hormonbestimmungen (Schilddrüsen- und Fertilitätshormone, Insulin)
• Tumormarker (z.B. CEA, PSA, CA 15-3)• Medikamentenspiegel (z.B. Digoxin, Antibiotika)• Herzmarker (z.B. Troponin I)• Virusdiagnostik (z.B. HBsAg)
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PSA_Kalibration
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60
Konzentration ng/ml
Sign
alst
ärke
Wie sensitiv ist mein Verfahren?
Analytische Sensitivität (Nachweisgrenze)
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Immunologische Messmethoden sind die sensitivsten Verfahren zum Nachweis von Substanzen in menschlichen Körperflüssigkeiten.
mg (10g-3)
ng (10g-9)
g (10g-6)
pg (10g-12)
fg (10g-15)
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Die Nachweisgrenze AaseeFläche: 40 HektarTiefe: 2 m= 8 x 108 Liter
Immunologischer Test: z.B. PSANachweisgrenze 0,01 ng/ml = 10-8 g/lZuckerwürfel 2 g:
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Nachweisgrenzen
Analytisch: „0-Kalibrator“ 20 Messungen + 2-3 SD
Biologisch: „Analyt-freies“ Serum 20 Messungen + 2-3 SD
Funktionell: „Analyt-freies“ Serum Konzentration, bei der VK > 20%oder aufgehobene Verdünnungslinearität
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Untere Nachweisgrenze - ErgebnisseUntere Nachweisgrenze - Ergebnisse
Analytische untere Nachweisgrenze
Biologische untere Nachweisgrenze (Männer nach Zystoprostatektomie)
Biologische untere Nachweisgrenze (Frauen ohne Grunderkrankung)
0.5
0
0.0
9
0.0
5
0.0
4
0.0
1 0.0
7
0.4
0
0.5
8 0.6
3
0.3
8
0.2
9
0.2
9
0.5
0
0.3
0
0.2
1 0.2
7
0.1
0
0.0
3
0.6
9
0.0
5
0.5
0
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
1 2 3 4Assay
5 6 7
PS
A (
ng
/ml 0.5
0
0.0
9
0.0
5
0.0
4
0.0
1 0.0
7
0.4
0
0.5
8 0.6
3
0.3
8
0.2
9
0.2
9
0.5
0
0.3
0
0.2
1 0.2
7
0.1
0
0.0
3
0.6
9
0.0
5
0.5
0
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
1 2 3 4Assay
5 6 7
PS
A (
ng
/ml
(Junker R et al.: Measurement of prostate-specific antigen: No advantage to ultrasensitive assays? J Natl Cancer Inst 1996;88:1594)
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PSA_Kalibration
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60
Konzentration ng/ml
Sign
alst
ärke
Kalibration (Standardkurve)
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„High-dose-hook-Effekt“
• Sandwich-Typ (immunometrischer Test) Mes
ssig
nal
Ag
Ag
Ag
Ag
PSA-Konzentration
Waschen
Ag
Ag
AgAg
AgAg
Ag
AgAg
Ag
Ag
Ag
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Messgrenze bzw. Linearitätsgrenze
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Schwanger?
Kontrolle
Testfeld
1. Positiv
2. Negativ
3. Schwach schwanger
Auch schwache Signale sind positiv!
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Entscheidungsgrenzen im Serum/Urin
20 postmenopausal
20
Serum Urin
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OK!
Vorsicht !!!
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Störfaktoren
Serumproteine (z.B. Rheuma-faktoren, Bindungsproteine)
heterophile Antikörper
Anti-Tier-Antikörper
Medikamente
Hämolyse, Lipämie,Hyperbilirubinämie
kreuzreagierende Substanzen
Störungen bei Immunoassays
Niereninsuffizienz, nephrotisches Syndrom, Schwangerschaft, Transfusionen
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PSA falsch hohes Ergebnis
HAMAEpitop
PSA falsch niedriges Ergebnis
Human-Anti-Maus-Antikörper (HAMA)
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T-PSA-AssaysAbbott PSA AxSymAbbott PSA IMxBaxter/Dade Stratus-PSABayer Technicon Immuno 1Behring Berilux PSABehring N Latex PSABehring Opus PSABiochem Immunosystems
MAIAcloneBiochem Immunosystems
SR1 PSABiomar PSA ELISABiomar psaQuick stickBioMedTech BioSign PSAbioMerieux Vidas PSABoehringer Elecsys PSA
Boehringer Enzymun PSAByk-Sangtec IRMA-matByk-Sangtec LiaisonByk-Sangtec LIA-matCanAg Equi-molar EIAChembio PSA Membrane T.Chimica PSA ELISAChiron ACS2 PSACIS ELSA2 PSACIS Kryptor PSACIS RIACT PSADiag. Systems Active PSADiag. Systems Active Ultrasens PSADianova PSA DIA 0301 EDianova PSA ELISA TM 10DiaSorin ETI-PSAKDiaSorin PSACTKDPC Biermann Coat-A-CountDPC Biermann Immulite 3. Gen.
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DPC Biermann Immulite PSADPC Biermann IRMA-countDPC Biermann Milenia PSADRG Instruments PSA EIAEiken PSAEurogen./Tosoh AIA-Pack PAFF Diagnost. PSA OncoquantFF Diagnost. PSA OncoscreenHybritech Tandem-EHybritech Tandem-RImmunocorp PSA IRMAImmunotech Liana PSAInt. Immunodiagn. PSA IEMAJant Pharmacal Accustrip PSAMedpro PSA EIAMedpro PSA Membrane T.Melotec SA Melotest PSAMerck PSA-US MagiaMitsui Pharm. High-Sens-MPMitsui Pharm. PSA-MP Quartus
Nichols PSA CELIANobis Nobi-Well TMBOrtho-Clin.-Diag. Vitros PSAPrinceton BioSign PSARoche Cobas Core PSASeratec PSA ELISA 270 Seratec PSA SemiquantSerono PSA MAIAcloneSerono SR1 PSASorin/Yang Pros-CheckSyntron QuikPac 2Syntron QuikStrip 1United Biotech Ubi MagwelVeda Lab PSA EIAVeda Lab PSA Membrane T.Wallac Delfia PSA EQMWallac Dual Label
= 70 Assays- 33 -
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Analytische Beurteilung und Wertigkeit einer Bestimmungsmethode
•Präzision
•Richtigkeit
•Stabilität (Drift)
•Verschleppung
•Robustheit
•Analytische Sensitivität und Spezifität
•Diagnostische Sensitivität und Spezifität
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Diagnostische Sensitivität:
Wahrscheinlichkeit mit der Kranke richtig erkannt werden (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle Kranken)
Diagnostische Spezifität:
Wahrscheinlichkeit mit der Nicht-Kranke richtig erkannt werden (alle richtig negativen Ergebnisse/ alle Gesunden)
Positiver prädiktiver Wert:
Wahrscheinlichkeit bei positivem Testergebnis, das der Patient krank ist (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle positiven Ergebnisse) abhängig von der Prävalenz
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- 37 -
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Krankheit “Y” ist asymptomatisch (Inzidenz: 1 / 1000)
Krankheit “Y” ist im Serum nachweisbar
Sensitivität: “Y”-Assay = 99 % (1 von 100 Kranken wird übersehen)
Spezifität “Y”-Assay = 98 % ( 2 von 100 Gesunden fälschlich im Verdacht
Screeninguntersuchung
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Screeninguntersuchung
•Assay “Y” ergibt ein positivesTestergebnis in Ihrer Probe
•Wie hoch schätzen Sie Ihr Risikoein, an Krankheit “Y” zu leiden ?
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Screeninguntersuchung
Bei einem positiven Testergebnis im Assay “Y” würde ich schätzen, daß ich mit dieser Wahrscheinlichkeit tatsächlich an Krankheit “Y” leide:
~ 99 % ~ 98 % ~ 95 % ~ 50 % ~ 5 % ~ 1 %
- 41 -
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Screeninguntersuchung
Bei einem positiven Testergebnis im Assay “Y” würde ich schätzen, daß ich mit dieser Wahrscheinlichkeit tatsächlich an Krankheit “Y” leide:
~ 99 % ~ 98 % ~ 95 % ~ 50 % ~ 5 % ~ 1 %X
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Screeninguntersuchung100.100 getestet100 Kranke, 100 000 Gesunde99 der 100 Kranken erkannt, 1 übersehen98.000 der Gesunden als gesund erkannt2.000 der Gesunden falsch-positives Testergebnis99 + 2000 haben positives Testergebnis
Wahrscheinlichkeit, daß Sie bei positivem Testergebnis an Krankheit “Y” leiden: richtig positiv / alle positiven Ergebnisse
99 / 2099 = 0,047 x 100 = 4,7 %- 43 -
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Screeninguntersuchung100.100 getestet100 Kranke, 100 000 Gesunde99 der 100 Kranken erkannt, 1 übersehen98.000 der Gesunden als gesund erkannt2.000 der Gesunden falsch-positives Testergebnis99 + 2000 haben positives Testergebnis
Wahrscheinlichkeit, daß Sie bei negativem Testergebnis nicht an Krankheit “Y” leiden: richtig negativ / alle negativen Ergebnisse
98000 / 98001 = 0,99 x 100 = 99,9999 %- 44 -
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Ausgangspunkt
TSH – Alter Bereich: 0.35 – 4.5 mIU/LTSH – Neuer Bereich: 0.55 – 4.78 mIU/L
Patient: Ergebnis zwischen 4.5 und 4.78Frage: War er krank und ist jetzt gesund?
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Referenzbereich
MW‐2s +2s
Die Wahrschein‐lichkeit in einer gesunden Population, einen Wert, außerhalb des Referenzbereiches zu finden, beträgt 5% (1 in 20)
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ReferenzbereichReferenzpopulation
Stichprobe(gesunde Probanden)
(Probenteilung)
Bestimmung vonReferenzwerten
Bestimmung derDistribution
Normalisierung
Bereinigung vonAusreißer
• mindestens 120 Probanden• optimal 200 Probanden• bei der Verteilung, die von normaler sehr abweicht, bis 700 Probanden
Berechnung desReferenzbereiches
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Bestimmung von ReferenzwertenBeispiel: Natrium
Charakteristika der Methode
• Homogenität des Analyts gut• Matrixeffekte niedrig• Präzision gut• Standardisierung gut•IntraindividuelleVariabilität niedrig
• InterindividuelleVariabilität niedrig
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Intraassay-Präzision – NatriumCentrum für Laboratoriumsdiagnostik – Monatliche QK
Ermitellte Präzision
0.9 %
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Bestimmung des ReferenzbereichsBeispiel: Natrium
Konzentration des Analyts im Plasma
135 – 145 mEq/L
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Bestimmung von ReferenzwertenBeispiel: TSH
Charakteristika der Methode
• Homogenität des Analyts schlecht• Matrixeffekte mittel• Präzision mittel• Standardisierung mittel•IntraindividuelleVariabilität hoch
• InterindividuelleVariabilität hoch
Beispiel: MEIA
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TSH - Intraassay-Präzision Centrum für Laboratoriumsdiagnostik – QK
Ermittelte Präzision
8.1 %
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TSH Interindividuelle Variabilität
TSH (mIU/L)
Prob
and
12 Probanden16 Messungen1 x pro Woche
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Bestimmung des ReferenzbereichsBeispiel: TSH
Konzentration des Analyts im Plasma
Natrium
TSH
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TSHMethodenabhängige Referenzbereiche
Assay Erwartungswerte(µIU/L)
Zahl derProbanden
Referenz-population
SIEMENSAdvia Centaur
0.35 – 5.50 174 EuthyroidePatienten
ABBOTT Architect 0.35 – 4.94 549 Normale Individuen
SIEMENS Immulite 0.4 – 4.00 NA NA
ROCHE Cobas 0.27 – 4.20 516 Gesunde Probanden
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Referenzbereichvs.
Medizinische Entscheidungsgrenze
Konzentration von TSH im Plasma
Gesund SymptomatischeHypothyreose
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