leukaemomycin-geblockte mutanten des streptomyces griseus und ihre pigmente

I Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie I 21 I 10 I 1981 I 751-760 I

(Akademie der Wissenschaften der DDR,

Zentralinstitut fur Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Forschungszentruin fur Molekularbiologie und Medizin,

Direktor: Prof. Dr. U. TAUBENECK)

Leukaemomycin-geblockte Mutanten des Streptomyces griseus und ihre Pigmente

CEIRISTINA WAGNER, CORNELIA STENGEL, INGF: ERITT, G. SCHUMANN und W. F. FLECK

(Eingega.ngen a m 1 9 . 2 . 1981)

In a continued search for leukaemomycin-blocked mutants of three leukaemomycin-producing strains IMET J A 3933, IMET J A 5142 and IMET J A 5570 of Streptomyces griseus, 32 mutants producing aerial mycelium and spores were detected. Furthermore, in all mutants cosynthetic capability has been observed. This report describes characterization of leukaemomycin-blocked mutants obtained by mutagenic treatment experiments using NTG and combined UV-/X-rays. According to the biosynthetic capability for anthracyclinones or other pigments the mutant,s could be- divided into six classes. The first class contains 14 leukaemomycin-blocked mutants unable to synthesize anthracyclinones. Besides two classes of mutants (12)synthesizing well-known anthracyclinones as epsilon-rhodomycinone, 7-deoxy-epsilon-rhodomycinone, 11 -deoxy-derivatives of daunomycinone, three new classes of mutants (6) synthesizing reddish-brown, brown and blue-violet pigments on solid media with structures not elucidated as yet, will be described.

Anthracyclin-Ant'ibiotica beanspruchen einen bevorzugten Platz linter den gegen- wartig verfugbaren Chemotherapeutica gegen Tumoren des Menschen. Besonders unifangreiche Erfahrungen liegen fur die klinisch eingesetzten Anthracycline Dauno- rubicin und Doxorubicin vor. Allerdings besitzen diese Antibiotica unerwiinschte Kebenwirkungen, wie Knochenmarksuppression, Herztoxizit.at und Mutagenitat. Dadurch wird die klinische Anwendung der Anthracyclin--4ntibiotica eingeschrankt., so daB weltweit neue Derivate mit gleicher oder verbesserter Antitumoraktivitat und gleichzeitig verringerter Toxizitat gesucht werden (ARCAMONE 1977, OKI 1977). Zur Herstellung von Anthracyclin-Derivaten sind bisher drei Wege beschri-tten worden. Total- bzw. Halbsynthese, enzyniatische Konversion nat urlich vorkoniniender und synthetischer Anthracycline mit Hilfe Antibiotica-geblockter Mutanten (Mutasyn- these) und Derivatbildung durch genetisch veranderte Anthracyclin-Bildner fuhrten zu zahlreichen Anthracl-clin-Derivaten, von denen ltubidazon auf chemisehem Wege (JOLLES 1974) und Doxorubicin aus Mutanten des Daunorubicin-Bildners gewonnen und klinisch erprobt worden sind. Durch Mutagen-Behandlung von Ant'hracyclin- Bildnern konnten sowohl Mutanten erhalten werden, die den Aglykon-Teil des Anthracyclin-Molekuls niodifizieren (z.B. Doxorubicin =1 14-Hydroxydaunomycin (ARCAMONE et al. lSCiYa), 13-Dihydrodaunomycin (ARCAMONE et al. l969b), 11- Desoxydaunomycin (ARCAMONE t;t al. 1980), 4-0-Desmethoxydaunomycin (CASSINELLI et al. 1978), 13-Desoxodaunornycin (YOSHIMOTO u. O m 1980), als auch Mutanten, die den Zirckeranteil des Anthracgclin-Molekiils cheniisch verandern kiinnen (UMEZAWA ct al. 1977).

Da neuc Anthracyclinon-Glpkoside mit Hilfe von Antibi.otica-geblockten Mutanten auf dem Wege der Halbsynthese bzw. Mutasynthese (YOSHIMOTO et a,Z. 1980) und interspezifischen Rekonibination erwartet' werden konnen (FLECK 1979, SCHLEGEL et nl. 1980, IHN et al. 1980), ist ein Suchprogramni fur Mutanten gestartet worden, die 43 Z. Mlg. Mikrobiol., Bd. 21, H. 10

7 5 2 CIIRTSTIKA WAGNER, COR~YELIA STENGEL, INGE ERITT, G. SCHUMANN und W. F. FLECK

in der Riosynt hese von Anthracyclinon-Glykosiden geblockt sind. In der vorliegeriden Arbeit wird eine vorlgufige phanotypische Charakterisierung und Klassifizierung von Mutantentypen vorgenoninien, die nach Mutagen-Rehandlung erhalten wurden. Daritber hinaus werden die von den Antibiotica-geblockten Mutanten synthetisierten Anthracyclinone nach dunnschichtchromatografischer Trennung eharakterisiert und z. T. identifiziert.

Naterial und Methoden

Eingesetzte Mikroorganismen : Alle verwendeten Mutanten sind abgeleitet von drei Wildstam- men des Leukaemomycin-Bildners, Xtreptomyces griseus, die aus verschiedenen Erdproben isoliert, in der 1MET-Stammsammlung unter den Sammlungs-Nr. IMET J A 3933, IMET J A 5570, IMET J A 5142 hinterlegt und in ihrer Bildungsleistung beziiglich Daunorubicin bereits charakterisiert wurden (FLECK u. STRAUSS 1975, STRSUSS u. FLECK 1975). Alle drei Wildstamme synt.heti- sieren Daunorubicin-Glykoside und verwandte Antibiotica. Eine Unterscheidung der drei Wild- stamme ist lediglich auf Grund der Quantitat der gebildeten Anthracyclin-Komponenten moglich.

Verwendete Medien: Zur Stammerhaltung und Anzucht der Mutanten diente ein Hafermehl- agar folgender Zusammenset,zimg (g/l) : Hafermehl 20, Agar-Agar 15 (pH 7,5). Als Vorkultur- medium eignete sich das Medium I I a (g/l) : Bacto-Pepton 6, Hefe-Extrakt 3. Ca-Hydrogennitrat 0,5 (pH 7 , 5 ) . Zur Prodaktion der Anthracyclinone bzw. Anthracycline ist das Medium I l I c eingesetzt worden (g/l) : Glucose 30, Sojabohnenmehl 10, NaCl3, CaCO, 3 (pH 6,s). Die Vorkeimung der Streptomyeeten-Sporen vor der Mut.agen-Behandlung wurde im Mediirm 79 vorgenommen. (Glucose 10, Bacto-Pepton 10, Hefe-Extrakt (DIFCO) 2, Casamino acids (DIBCO) 1 , NaCl6 (pH 7,5). Zur Aktivitatsbestimmung der Anthracyclinon-Glykoside ist das PSE-Medium herangezogen worden (g/l) : Pepton 5, Sojabohnen-Extrakt 150, Fleisch-Extrakt 1 (pH 7,O).

Mutagenbehandlungen: Als Mutagene sind liombinierte UV- und Ront.genst.rahlen sowie N- n~eth3rl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin (KTG) eingesetzt worden. Die Herstellung der zu mutageni- sierenden Sporensuspension erfolgte so, dal3 die Sporen einer 10-14 Tage alten Agarschragschicht- Kultur mit 3 ml isotonischer NaCI-Losung abgeschwemmt, anschlieDend zusammen mit Glas- kugeln (Durchmesser: 0,56 bis 1 mm) in &en Vibrationshomogenisator VHG 1 fur die Dauer von 5 min geschiittelt und nachfolgend durch Glasfilter G 3 (SCHOTT & GEN., Jena-DDR) filtriert, wurden. Bei Vorkeimung der Sporen vor der Mutagenbehandlung ist die Sporensuspension nach Zentrifugation, Resuspension in Medium 79 bei einer Temperatur von 28 "C fur die Zeit v011 30 min auf eineni Schiittelgerat (180 U/min) bebriit.et worden. Each der Vorkeimung wurden die Sporen zentrifugiert, in 5 ml isotonischer NaCI-Losung resuspensiert und in einer Petrischale einer UV-Strahlendosis von 1200 erg/mm2 ausgesetzt. Zusatzlich erhielten die vorgekeimten Sporen eine Rontgenstrahlen-Dosis von 16000 R im Verlaufe von 20 min.

Erfolgte eine Behandlung nichtvorgekeimter Sporen mit, dem Mutagen NTG, so wurden die von DELE et d. (1970) mitgeteilten Bedingungen eingehalten. Im Gegensatz dazu sind auch Suspen- sionen von 90 min vorgekeimten Sporen mit NTG behandelt worden, die anstatt 60 min bei 30 "C lediglich 30 min. dafiir aber bei 37 "C mit dem Mutagen inkubiert wurden. In allen Fallen wurde durch diese Behandliing eine fiberlebensrate von 0 , l bis 0.01% erreicht,.

Submersfermentation: Die chromatografische und mikrobiologisch-analptieche Priifung der Mutanten-Metabolite erfolgte in der Kulturbruhe naeh Submersfermentation. Letztere entstand nach 10- bis 14tagiger Anzucht der Selektanten auf Hafermehl-Agar, anschlieoender Ubertragung des Impfmaterials in eine 2t,agigs Vorzucht.kultur bei 28 "C (Schiittelfrequenz: 180 U/min) in Medium IIa and nachfolgender Ubertragung von 5% der Vorzuchtkultur in das Produktions- medium 11Ic. Die Prodiiktionskultur dauerte 4 Tage. Temperatiir und Sehiittelfrequenz ent- sprachen der der Vorznchtkultur.

Mikrobiologische Analyt.ik: Zur qaantitativen Bestimmunp der biologisrhtn Aktivitiit, in den Mutanten- und Wildstamm-Kulturen diente der Stamm ATCC 6633 von BnciZZzts subtilis anf PSE-Medium. Zar qualitativen Beurteilung dcr biologisch aktiven Stoffwechselprodukte sind die von FLECK (1974) beschriebenen Methoden herangezogen worden.

Cosynthesevcrhalt,en auf festem Medium: Alle iSnt.ibiotica-geblockten Miitanten, die mit Hilfe der oben beschriebencn nlutagene erzeugt und durch iibliche Selektionstechniken gewonnen wurden, sind auf Cosyntheseverhalten auf festem Medium (Hafermehl-Agar) gepruft worden. Die dazii eingesetzte Methode entsprach der von DELIC et d. (1969) bzw. der von SCHLEGEL u. FLECK .( 1950) mitgeteilt.en.

Dunnschichtchromatografisches Verhalten der Mutanten-Produkte: Aus 3 bis 4 Tage alten Submerskulturen der Antibiotica-geblockten Mutanten und Kontrollstamme (in Medium IIIc) murden nach Separation des Mycels methanolische Mycelextrakte hergestellt. Zur vergleichenden Bestimmuiig der Rf-Werte der als Gemisch im Methanolextrakt vorliegenden Aglykone (Anthra-

Leukaemomgcin-geblockte S. griseus-hlutanten 753

cyclinone) sind rnit 0,5 N Oxalsaure praparierte Silufol-Diinnschichtplatten (KAVALIER, CSSR) verwendet worden. Als Laufsystem dienten die Losungsmittel Chloroform undBceton im Gemisch nnd VerhBltnis 90: 10 hei Zimmertemperatur.

Die dunnschichtehromatoprafische Charakterisierung der Glykoside (Anthracyrline) erfolgte rnit Hilfe der von C-4SSINELLI et nl. (1978) angegebenen Laufsysteme (Chloroform: Methanol = 90: 10 bzw. Chloroform :Met,hanol:Wasser = 78:20:2) und mit, 0,s N KaHCO, priiparierten oder neu- traleii Silufol-Platten. Alle Aglylrone der 3lutanten wurden mit einem Aglykon-Standard ver- glichen, der nach Saurehydrolyse der Glykoside des Ausgangs-Stammes J A 3933 erhalten nurde (0,l N HCl bei 80 "C, Einwirkungsdauer 1 Std.). Eine Ausnahme bildeten die Aglykone der Rlu- tante 826, die erst nach Trennung auf einer LH 20-Chromatografie-Saule unter Einsatz von Methanol als Elutionsmittel hinreichend unter den angegebenen diinnschichtchromatografiechen Bedingungen charakterisiert werden konnten.

Die Tdentitat der Hauptaglykone, gebildet von Vertretern der Rlutanten-Klasse V, rnit epsilon- Rhodomycinon bzw. 7-Desoxy-epsilon-Rhodomycinon wurde auf Griind der Massenspektren und lH-NMR-Spekt,ren vorgenommen. Die Massenspektren sind rnit einem hlassenspektrometer V-4RIAN XAT 311 sufgenommen worden (Bedingungen: 70 eV, Temperatur der Ionenquelle 200 "c, indirekter EinlaB bei 150 "C, Ioiiisierungsstrom 1000 mS). Die lH-NMR-Spektren (59.797 NHz) sind bei 25 "C mit einem JEOL FX-60 FT-NMR-Spektrometer gemessen worden. Als interner Standard diente Deuteriochloroform niit Tetramethylsilan.

Ergebnisse

Die Eehandlung der 3 Wildstamme des Leukaemomycin-Bildners, Streptoru yces griseus, IMET J A 3933, IMET J A 5570 und IMET JA 5142 niit dem Mutagen NTG und konibinierter UV-/Rontgen-Best.rahlung fiihrt.e zu insgesamt 32 Leukaemoniyein- geblockten Miit,anten. Alle erhaltenen Mutanten differenzieren Luftmycel und Sporen aus und sind zur Cosynthese in zweigliedriger Kultur befahigt.

Die Behandlung nichtvorgekeimter Sporen der Wildstamnie mit den1 Mutagen NTG und auch die kontbinierte UV-/Rontgen-Bestrahlung vorgekeimter Sporen fiihrten zu extreni niedrigen Mut'anten-Raten. In einigen Fallen konnten nach Bestrahlung partiell geblockte Mutanten selektiert werden, die neben den Glykosideri der Aus- gangsstaninie a.uch freies epsilon-Khodomycinon synthetisierten. Diese Mutanten sind nicht weiter untersiicht worden. Fur die nahere Charakterisierung sind lediglich die in der Leukaemomycin-Biosynthese vollstandig geblockten Mntanten herangezogen worden, die nach NTG-Behandlung und koiiibinierter I.:\'-/P,iintgen-Bestrah- lung niit einer Haufigkeit bis zu 1,1% entstanden (NTG, 90 rnin Vorkeiniung). Die uberlebensraten bei allen Rehandlungsarten lag zwischen 0,l und 0,010/,. Unter den 32 leukaeniomycin-geblockten Mutanten befinden sich 14 Mutanten (43,75%)), die uberhaupt keine Anthracyclinone bilden kijnnen. Die iibrigen 18 Mut'anten (56,25%) unterscheiden sich bezuglich der von ihnen synt,hctisierten Pigrnente und konnen niit Hilfe dunnschichtchromatografischer Methoden 5 unterschiedlichen Klassen von Pigaientbildnerri zugeordnet werden. Die Klassifizierung basiert auf der Tatsache, da8 diese Leuliaeinoruycin-geblockten Mutanten eine Reihe von Einzelkoniponenten bilden. Jede Einzelkomponente unterseheidet sich in ihrer Farbe im naturlichen und in1 UV-Licht sowie in ihreni dunnschichtchroniat,ografischen Verhaken (Kf-f;\'ert). In1 folgenden werden die Vertreter von 6 Mutankn-Klassen naher charakterisiert, :

I. K 1 a s s e 1, e u k a e in o ni p c i n-g e b 1 o clr t e r M u t a n t e n oh n e P igment , b i 1 d u ng s- vermogen

Es liegen 14 Mutanten vor, die in Submerskultur creniefarhenes bis gelbliches Mycel bilden, jedoch keine Pigmente in das Kultnrinedium ausscheiden. Der konzen- trierte rriethanolische Mycelextrakt ist' zwar gelblich bis gelbbraiin, lafit sich jedoch diinnschichtchromatografisch nicht in Einzelkoniponenten trennen. Die Miitanten entfalten gegen Bacil lus subtilis ATCC 6653 keine Henimwirkung. Das Cosynthese- verhalten der 14 Mutanten untereinander ist uneinheit,lich. 48 *

754 CHRISTINA WAGNER, CORNELIA STENGEL, IXGE ERITT, G. SCHUMANX und W. F. FLECK

~~

NTG 40 01P4 01P7 51/20 51/26 51/28 1 P4

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich wird, entstaninien die Mutanten der Klasse I allen 3 Ausgangsstamrnen. Vom Ausgangsstamm TMET J A 5570 sind Leukaemomycin- goblockte Mutanten ohne Bildungsverniogen fur Anthracyclinone nach Anwendung 3 verschiedener Mutagen-Rehandlungsmethoden erhalten worden.

Tabelle 1 I. Klasse Leukaemomycin-geblockter Mutanten ohne Pigmentbildungsvermogen, abgeleitet aus 3 Ausgangsstiimmen des Leukaemomycin-Bildners, Streptomyces griseus, nach KTG-Behandlung

bzw. UV-/Rontgen-Bestrahlung

~ - ~ _ _

1 1 1 1 1 1 1

~~ ~ ~ _ _ _ Ausgangs-

Stamme ~

IMET J A 3933 IMET J A 5142 IMET J A 5142

IMET J A 5142 IMET J A 5142 IMET J A 5570 IMET J A 5570

IMET J A 5142

IMET J A 5570 G74

IMET J A 5570 G58 IMET J A 5570 1 G22

2 2 2

IMET J A 5570 95612 3 IMET J A 5570 1 S3/2 1

Mutanten- Produkte

Gelblicher Mycel- extrakt mit Hilfe der Diinnschicht-Chroma- tografie nicht in Einzelkomponenten trennbar. Keine Wluoreszenz im CV-Licht

1 = NTG-Behandlung nichtvorgekeimter Sporen (siehe DELIC et al. 1970) 2 = NTG-Behandlung 30 min bei 37 OC nach 90 min Vorkeimung der Sporen 3 = Kombinierte UV-/Rontgen-Bestrahlung 30 min vorgekeimter Sporen

11. K1 a s se L e u k a em o my c i n-g e b 1 o c k t e r Mu t a n t en r n i t g e 1 b e r P ig n i en t - b i ldung

Behandlung des Ausgangsstannnes IMET J A 3933 fuhrte zur Entdeckung von 4 Mutanten, die durch ihre intensive Gelbfarbiing auffielen. Die Pigmente der Mutan- ten IMET JA 3933/G 42 und IMET JA 3933/G 44 unterdrucken das Wachstmi von Bacillus subtilts ATCC W33 sehr stark, wahrend die Produkte der Mutanten IMET JA 3933/G 4 und IMET JA 3933/NTG 59 nnr niiiisige Wachstiinishemmung bewirken. Die naher iintersuchte Mutante NTG 58 bildet 3 gelbe Hauptaglycone (Rf-Werte : 0,8 ; 0,3 und 0,1) sowie 5 gelhe Minorkomponenten. Letztere konnten nicht genauer charakterisiert werden. Die beiden Komponenten niit den1 gro fiten Rf-M-ert fluoreszieren gelb, die mit deni geringeren Rf -%Vat orangerot. Alle 3 Koniponenten sind nicht identisch niit Aklavinon oder dessen Dehydrierungsprodukten 7-Desoxy- Aklavinon. Ein direkter dnnnschichtchroniatografischer Vergleich der 3 Haupt- komponenten aus der Mutante N'I'C: 59 (Klasse 11) des Xtreptomyces griseiifi rnit aiithentischen Probcn der gelben Pigniente X, X I und XI1 (JIZIIA et al . 1980) aus der Pigmentmiitante 24-47 des Streptomyces coeruleorubidus (BLURMJEROVB et al. 1978) ergab identisches DC-Verhalten.

I1 J. K la s se 1, e u k a em oni y c in-g e b 1 o c k t e r M u t a n t e n mi t r o t e r P i g in e n t- b i l d un g

Einziger Vertreter dieser Mutantenklasse ist die Mutante IMET J A 3933/h'TG 61' Die Mutante ist nach KTG-Beharidlung des Ausgangsstanirnes IMET JA 3933 erhalten worden und bildet unter den angefnhrten Bedingringen lediglicli Spuren eines

Leukaemomycin-geblockte S. griseus-Mutanten 755

roten Pigments, das nach entsprechender Anreicherung dunnschichtcliromatografisch in 6 Einzelkoniponenten getrennt werden kann. Alle Koniponenten sind biologisch inaktiv. Neben 2 rotvioletten Koniponenten mit roter Fluoreszenz im UV-Licht (Rf-Werte: 0,7 und 0,4) werden 4 orangerote Pigmente (Rf-Werte: 0,3; 0,15; 0,09 und 0 , O l ) gebildet. Alle 4 Pigmente lassen sich bezuglich ihrer Fluoreszenz im UV- Licht unterscheiden. Im Dunnschichtchromatogramni fluoreszieren die 4 Komponen- ten von oben nach unten gelborange, orangerot, orangerot und intensiv gelb. Eine Identitat der Pignient,e mit Daunomycinon, 13-Dihydro-Daunomycinon oder Carmino- mycinon liegt nicht vor.

I V . K las se Leukaemom ycin-geblockter M u t a n t e n ini t b r a u n e r P igment . b i l d u n g

Einziger Vertreter der Klasse ist die Mutante IMET JA 5570/826. Sie bildet weinrot'es bis kaffeebraunes Mycel, in den1 Pignient'e enthalten sind, die einen charakteri- stischen Farbunischlag von weinrot nach gelb zeigen, wenn alkalisches niit saurem Milieu wechselt. Die I'igniente sind gut in polaren 1,iisungsniitteln \vie Wasser oder Methanol loslich und lassen sich daher nur schwer aus der wassrigen Phase des Knltur- filt,rates ext,rahieren. Auffallend und charakt,eristisch fiir die Mutante IMET JA 5570/ 826 ist die Yrazipitierbarkeit groaer Mengen organischen Materials dorch Aceton und Chloroform aus dem methanolischen Mycelextrakt. Dieses Phanomen konnte Fisher bei keiner anderen Mut'ante beobachtet werden. Eine Trennung der Mutanten-Pro- dukte ist. diinnsrhicht,chromatografisch erst, erreicht, worden, wenn eine saulenchronia- tografische Vortrennung des Mycelextrakts iiber LH 20 (Methanol) vorgeschaltet' wurde. 14:s treten 4 gelhe Einzelkomponenten auf (Rf-Werte: 0,8; 0,C;B; 0,55 und 0,27), die in unterschiedlichen Gelbtonen fluoreszieren. Die Mutante IMET JA 5570/826 unt'erscheidet sich von den Mutanten der Klasse I1 . Cosynthese zwischen Vertretern der Klasse II und IV wurde beobachtet.

V. K l a s s e Leukaemomyc in -geb lock te r M u t a n t e n mi t e p s i 1 o n-R hod o my c i n o n-R i 1 d u n g s ve r m og e n

i lus den 3 Ausgangsstaninien wurden insgesanit 8 Mutanten isoliert, deren Haupt- koniponenten in allen Fallen epsiion-Khodonlycinon und 7-l)esox~-epsilon-Rhodo- mycinon darstellen. Daneben werden 4 Minorkomponenten von den Mutanten synthetisiert. Die aufgefnndenen Mutanten sind unabhangig von der Art der Mutagenbe- handlnng entstanden (Tab. 2). Die Identitat der Anthrac) clinone mit epsilon-Rhodo- mycinon hzw. 7-Desoxy-epsilon-rhodoni) cinon \\ urde r n i t Hilfe der Massenspektro- metrie und lH-KMR-Spektronietrie bestininit. Alle Mutanten sind zur Cosynthese niit anderen Mutanten befahigt.

V I. K 1 a s s e I, e u k a e ni o ni y c i n-g e b 1 o c k t e r M 11 t a n t e n n1 i t b l auv io le t t e r P i g m e n t h i ldung

4 Mutanten wurden naeh Behandlung riichtvorgekeiniter Sporen der Ansgangs- stamnie IMET ,JA 5570 und lMET ,JA 5142 mit NTG bzw. kombinierter U\'-/Rontgen- Strahlen erhalten, die durch Rildung intensiv hlanvioletter Pigmente, untypisch fiir Selektanten des Streptom yces griseus, auffielen. Auf Grund der taxononiischen Merk- male nnd des Cosyntheseverhaltens handelt cs sich hei diesem in der Titeratur bisher noch nicht beschriebtnen Mntantentyp Anthracyclin-bildender Streptoniyceten eindeutig mi Leukaenioniycin-geblockte Mutanten des Streptomyces griseus. Die von den Mutanten gebildeten tintenfarbenen Pigniente sind gut niit organischen Tikungs- mitteln aus den1 Mycel bzw. den1 Kulturfiltrat zu extrahieren. Die dunnschichtchro-

756 CIIRISTINA WAGNER, CORNELIA STEXGEL, INCE ERITT, G. SCHUBIAXN und W. F. FLECK

Tabelle 2 nbersicht fiber Leukaemomycin-geblocktc Mutanten von Strepton? yces griseus und ihrc Pigmente

l ) Siehe Legende von Tabelle 1 2, Vergleiche Abbildung 1 3, Sind mit den von JIZBA et al. (1980) beschriebenen 1 I-Desoxydaunomycinon-Derivaten X,

XI und XI1 der Mutante 24-47 (Typ E) des Daunorubicin-Bildners Streptomyces coeruleorubidus dunnschichtchromatografisch identifiziert worden

4, Die Aglykone sind nicht identisch mit Daunomycinon, 13-Dihydrodaunomycinon oder Car- minomycinon

j) Die Identitat des epsilon-Rhodomycinons und seines 7-Desoxy-Derivates ist durch massenspektrometrische und 'H-NMR-spektrometrische Untersuchungen im Institut fur Mikrobiologie der CSAV in Prag bestatigt worden

6, Auf Hafermehl-Agar

matografische Untersuchung des methanolischen Mycelextraktes ergab 7 Einzel- komponenten, die im natiirlichen Licht sehr unterschiedliche Farben, irn UV-Licht dagegen his auf 2 Ausnahmen keine Plrroreszenz zeigten (Abb. 1). Die Strukturaaf- klarung einer rotvioletten Hauptkomponente mit weinroter Fluoreszenz (Rf-W7ert : 0,78) ist noch nicht abgeschlossen. Eine gelhe Koniponente mit ahnlicheni Rf-W'ert wird von der rot>violetten Hauptkoniponente iiberdeckt. Sie ist nach saulenchroniatografischer Trennung (LH20, Methanol) als Einzellroniponente zu isolieren. Eine Minorkonrponente von lilablauer Parbe (Rf-Wert : O,B8) sowie 2 unterschiedlich rote Koniponenten (It€-Wert : 0,55 und 0,4) konnen in1 Z)iinnschicht'chromatogranlrn getrennt werden. Diese 4 I'igmente werden erganzt durch eine blaue Hauptkornponente (Rf-Wert : 0,34), die eine weinrote Koniponente (Kf -Wert :0,4) iiberlagert. AuBerdeni wird eine blaue Minorkornponent,e niit eineni Rf-Wert von 0,13 sichtbar (Tab. 2 ) .

Leukaemomycin-geblockte AS'. griseus-Mutanten 757

5 - Wert Standard

a b

CMN

oh ' I 'I @/@

@/g

Abb. 1. Vergltich der Kf-Werte von Referenz-Anthraryclinonen (a) und Aglykonen des Leukae- momycin-Bildners (Wildstamm) nach Siurehydrolysc (b) mit denen charakteristischer Aglykone,

die von Vertretern der Mutantenklassen I1 bis VI gebildet werden Jedes Pigment ist auI3er durch seinen Rf-Wert noch durch seine Farbe im naturlichen Licht

2, Das DC-Verhalten der Aglykone des Vertreters der Mutantenklasse IV andert sich nach

3, Verwendete Zeichen: DMN = Daunomycinon; DDNK = 13-Dihydrodaunomycinon; CMN =

(vor dem Trennstrich) und im UV-Licht (nach dem Trennstrich) charakterisiert.

Anwendung des GISrkosid-Lsufsystems in der im Text beschriebenen Weise.

Carminomycinon ; RMN = epsilon-Rhodomycinon v = rotviolett, g = gelb; o = orange; r = rot; b = blau; - = ohne UV-Fluoreszenz

Inzwischen ist nach saulenchroniatografischer Trennung des Pigmentgeniisches cine gelbe Komponente init intensiv gruner Fluorrszenz (1Zf-Wert : zwischen 0,6S und 0,55) angereichert worden. Die Zusaniinensetzung der Pignientgemische in Mycel und Kulturfiltrat stimrnt iiberein, jedoch kann in1 Kulturfiltrat noch eine weitere blaue Koniponente (Rf-U'ert : zwischen 0,55 nnd 0,4) beohachtet werden.

Dainit ist gezeigt, daB bei Anwendung untcrschiedlicher Mutagen-Behandlungs- techniken und unter Verwendung verschiedener Ausgangsstamme ein Spektruni von Daunomycin-geblockten Mutanten erhalten werden kann, dessen Mutanten sich durch Qualitat und Quantitat der gebildeten Pigmente unterscheiden und daher in unter- schiedlichem Ma Cle f u r die Prodilktion von Anthracj-clinonen, fiir Mutasynthese oder Kiokonversionen bzw. als Kreuzungspartner fur intra- und/oder interspezifische Kekonibinationen geeignet sind.

Ergebnime, die Auskiinft geben uber die den 6 Mutantenklassen zugeordneten Leukaenioriigcin-geblockten Mutanten, iiber deren Hervorgehen ails unterschiedlichen Mutagenbehandlungen und uber deren Sekundarstoffwechsel-Produkte sind in den Tabellen 1 und 2 zusamniengestellt. Daraus geht hervor, daS von 18 Leukaemomycin- geblockten Mutanten mindestens 26 verschiedene Pigmente gebildet werden konnen, unter denen sich die gelben Pigmente aus der Mutantenklasse I1 durch ihre biolo- gische Aktivitat hervorheben und darauf schliefien lassen, daB es sich um Glykoside voni Anthracyclinon-Typ (eventuell 11-Desoxy-daunomycinon-Deriva te) handelt.

758 CHRISTINA WAGNER, CORNELIA STENGEL, INGE ERITT, G. SCHUMANN und W. F. FLECK

Gewinnung von Anthracyc l inon-geblockten M u t a n t e n u n d R e v e r t a n t e n a u s P o p u l a t i o n e n Leukaemomycin-geblockter M u t a n t e n n a c h e r n e u t e r

Ausgewahlte Mutanten der Klasse V bzw. VI (NTG 95615 bzw. 1P) sind erneut der Einwirkung des Mutagens NTG ausgesetzt worden. Dabei sind sowohl auxotrophe Pigmentinutanten als auch solche Mutanten gewonnen worden, die das Biosynthese- vermogen fur Pigmente verloren haben. So konnten von der Mutante NTG 95615, die ursprunglich epsilon-Rhodoniycinon synthetisierte, 7-pigmentlose Mutanten erhalten werden, von denen wiederuni 4 Mutanten weder Sporen noch Luftmycel ausdifferenzieren.

Von der zur Klasse VI gehorigen Mutante 1P sind ebenfalls pignientlose Mutanten erhalten worden. Zusatzlich zu den Anthracyclinon-geblockten Mutanten sind echte Revertanten des Sekundarstoffwechsels selektiert worden. Kevertanten aus der Leukaemomycin-geblockten Mutante 1P lienen sich nach Mutagenbehandlung mit KTG bei einer Haufigkeit von bis lo-' isolieren. Uberraschenderweise bilden diese Kevertanten nicht nur die biologisch aktiven Glykoside des Ausgangsstammes IMET JA 5570, sondern gleichzeitig die fur die Mutante 1P typischen blauen Pig- niente. Uber detaillierte Untersuchungsergebnisse, die mit dieser Mutante gewonnen wurden, wird gesondert berichtet.

Mutagenese

Diskussion

Bhnlich wie bei anderen Antibiotica-Bildnern (MCCORMICK 1968, QUEENER et al. 1978) konnen durch Mutagen-Behandlung des Leukaemomycin-Bildners. Xtreptomyces griseus, Antibiotica-geblockte Mutanten gewonnen werden (STENGEL et al. 1979). Mutanten dieser Art sind geeigiiet zur Gewinnung neuer Antibiotica-Derivate (SEBEK 1976), zur Optimierung fernientativer Prozesse durch Ausbeute-Erhbhung oder Eli- minierung unerwunschter Begleitkomponenten bzw. erwunschte Verschiebung im Metaboliten-Spektrum (VEZINA 1976). Antibiotica-gebloekte Mutanten werden mit Vorteil zuni Studiuni der Biogenese von Sekundar-Metaboliten sowie der Genetik industrieller Mikroorganisnien eingesetzt (HOPWOOD et al. 1973, HOPWOOD and MER- RICK 1977, MACDONALD et al. 1972, FLECK 1979). Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daB die Behandlung vorgekeimter Sporen des Leukaernomycin-Bildners mit NTG bei einer Uberlebensrate von 0,l bis O,Ol% zu einer Mutantenhaufigkeit von mehr als 1% fuhrt und damit der kombinierten UV-/Rontgenbestrahlung oder XTG-Behandlung nichtvorgekeimter Sporen uberlegen ist. Die 32 isolierten und naher charakterisierten Leukaemoinycin-geblockten Mutanten differenzieren alle Luftniycel und Sporen aus, sind zur Cosynthese untereinander befahigt und unterscheiden sich beziiglich der von ihnen gebildeten Pigmente voneinander, so daB sie auf Grund diinnschichtchromato- grafischer Vergleichsuntersuchungen ti verschiedenen Mutanten-Klassen zugeordnet werden konnen.

Aufier den bereits bei anderen I>aunomycin-bildenden Streptomyceten-Arten bekannten Mutanten-Typen niit Bildungsvermogen fur epsilon-Khodoniyoinon (BLU- MAUEROVP; et al. 1978, MCGUIRE et al. 1979), 11-Desoxy-Daunomycinon-Derivaten ( JIZBA et al. 1980, ARCAMONE et al. 1980) und 13-Desoxo-Daunomycinon-Derivaten (YOSWIMOTO et al. 1980) sind beim Leukaemoniycin-Bildner, Stieptomyces griseus, 3 weitere Mutanten-Klassen aufgef unden worden. Die Mutanten dieser 3 neuen Mutanten-Klassen bilden Pigmente, die mit organischen Losungsmitteln extrahierbaz sind und biologisch inaktive Sekundarstoffwechsel-Produkte von rotlich-braunem (Mutantenklasse 111), braunem (Mutanten-Klasse IV) und blauviolettein Aussehen (Mutanten-Klasse VI) darstellen.

Leukaemomycin-geblockte S. griseus-Mutanten 759

Diese Pigment-Mutanten bilden auf Crund ihres genetischen Blocks in der Leu- kaemomycin-Biosynthese solche Sekundarstoffwechselprodukte, die nicht mit den bekannten Aglykonen der Aklavinon-, Pyrromycinon- oder Rhodornycinon-Serien identisch sind und sich dariiber hinaus dunnschichtchromat'ografisch voni Daunomy- cinon und dessen Derivaten unterscheiden.

Die vorgelegten Ergehnisse zeigen, dafi die von <JIZBA et al. (1980) beschriebenen gelben 11-Desoxg-Derivate des Daunomycinons a m einer Streptomyces coeruleoru,bidus- Mutante auch von Mutanten des Leukaemomycin-Bildners Streptomyces griseus synthetisiert werden konnen (Mutaritenklasse IT).

Im Gegensatz zii der gelben M1itant.e (24-47) des Streptomyces coeruleorubidus, die als Hauptaglycon 7-Desoxy-Aklavinon und die ebenfalls gelben 11-Desoxy-Derivate des Daunoniycinons (X, XI, XTI) als Minorkomponenten sgnthet'isiert', bildet die Leukaemomycin-geblockte Mutante NTG 59 kein Aklavinon oder dessen Dehydrie- rungsprodukte, sondern die 11-Desoxy-Derivate des Daunomycinons als Haupt- komponenten.

Uber das Cosynthese-Verhalten der Leukaemomycin-geblockten Mutanten sowie iiber die strukt'urelle Zuordnung der neiien Mutanten-Yrodukte wird gesondert init- get eilt .

U7ir danken den Doktoren LV. IHN, K. ECKHARDT, D. STRAUSS sowie Herrn DC W. KOCH fur die Uberhsung von Referenzsubst.anzen und Hinweise zur Dunnschichtchromatografie derAnthracyc- linone. Besonderen Dank mochten wir Frau Dr. MARGITA BLUMAUEROVA aussprechen fur die Moglichkeit, im Rahmen eines Studienaufenthaltes von C. 1%'. Vergleichsuntersuchungen im Prager Institiit' fur hlikrobiologie der CSAV durchfuhren zu konnen, sowie Ing. J. V. JIZBA fur die Uberlassung authentischer Proben der 11 -Desoxy-Daunomycinone und die experimentelle Unterstutzung bei der DC-Vergleichsuntersuchung. Aus dem gleichen Institut verdanken wir den Herren Dr. SEDBIERA und Dr. VOKOUN 'H-?u'hlR-spekt.rometrische und massenspektrometrische Untersuchungen einiger Komponenten.

L i t e r a t 11 r

ARCABIOXE. F., 1977. Xew antitumor ant.hracyclines. Lloydia, 40, 45-66. ARCAMONE, F., CASSINELLI, G.. FANTINI, G., GREIN, A., OREZZI, P., POL, C. and SPALLA, C., 1969a.

Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S . peucetius cer. caesius. Biotechnol. Bioengin., 11, 1101-1110.

ARCAMONE, F., CASSINELLI, G., PENCO, S. und TOGNOLI, L., 1969b. Antibiotische Substanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung. BRD 0s 1923 885 (29. 1. 1970, appl. 9. 5. 1969).

ARCAMOKE, F., CASSINELLI, G., DIMATTEO, F. and FOREXZA, S., 1980. Structures of novel anthracycline antitumor antibiotics from ilficromonospora peucetica. J. Amer. Chem. Soc., 102. 4.

BLUIIAUEROV~, $I., STAJNER, K., POKORNY, V., HOSTALEK, Z. and VANEK, Z., 1978. Nutants of Streptomyees coeruleorubidus impaired in the biosynthesis of daunomycinone glycosides and related metabolites. Folia rnicrobiol., 23, 255-260.

CASAZZA, A. AT. , PRATESI, G. and S o ~ a ~ z o , C., 1978. Preparation and biological evaluation of 4-0-demet.hyldaunorubicin {Carminomycin 1 ) and of it.s 13-dehydroderivative. J. Antib., 31, 178-184.

DELIC, V., PIGAC, J. and SERMONTI, G., 1969. Detection and study of cosynthesis to tetracycline antibiotics by an agar method. J. gen. Microbial., 55, 103-108.

DELIC, V., HOPWOOD, D. ,4. and FRIEND, E. J., 1970. Mnt,agenesis by B-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine (NTC) in Streptonzyces eoelicolor. Mutat. Res., 9, 167-182.

FLECK, W., 1974. Development of microbiological screening methods for detection of new ant,i- biotics. Post. Hig. I Med. Dosw., 28, 479-498.

FLECK, W. F., 1979. Genetic approaches to new streptomycete products. In : SEBEK, 0. K. and LASKIR, A. I . (Editors), Genetics of Industrial Microorganisms. 1978. Am. SOC. Microb., Washing- ton, D.C.: 117-122.

FLECK, W. and STRAUSS, D., 1975. Leukaemomycin, an antibiotic with antitumor activity. I. Screening, fermentation and biological activity. Z. Allg. Mikrobiol., 15, 495-503.

HOPWOOD, D. A., CHATER, K. F., DOWDING, J. E. and VIVIAN, A,, 1973. Advances in Streptomyces coelicolor genetics. Bacteriol. Rev., Si, 371 -405.

CASSINELLI, G., GREIN, A., MASI, P., SlJAR-4T0, 8., BERKARDI, L., ARCAMONE, F., DIMARCO, A.,

49 Z. All& Nikrobiol., Bd. 21, H. 10

760 CHRISTINA WAGNER, CORNELIA STENGEL, INGE ERITT, G . SCHUMANN und W. F. FLECK

HOPWOOD, D. A. and MERRICK, M. J., 1977. Genetics of antibiotic production. Bacteriol. Rev., 41, 595-635.

IHN, W., SCHLEGEL, BRIGITTE, FLECK, W. F. and SEDMERA, P., 1980. New anthracycline antibiotics produced by interspecific recombinants of streptomycetes. 111. Isolation and structure of iremycin. J. Antibiotics (Tokyo), 33, 1457.

JIZBA, J. V., SEDMERA, P., VOKOUN, J., BLUMAUEROVA, M. and VANEK, Z., 1980. Naphthacene- auinone derivatives from a mutant strain of Strevtomvces coeruleorubidus. Coll. Czech. ChPm. - .. _.. . - Y

dlommun., 45, 764-771. JOLLES. G.. 1974. Daunorubicin hvdrazones. BRD 0s 2 327 211 (12.12.1974. aoo1.28.5. 1973). MACDONALD, K. D., HOLT, G. and"DITCHBURN, P., 1972. In: 4th Int. Ferment. gymp. Fermeni:

Technol. Today (Editor: C. TERUI), pp. 251 -257. Osaka: SOC. Ferment. Technol. MCCORMICK, J. R. D., 1968. Point-blocked mutants and the biogenesis of tetracyclines. I n : G.

SERMONTI and M. ALACEVIC, 1969, Proceedings of the International Symposium held in Dnbrov- nik 31. 5. -2. 6. 1968. Yugoslav. Academy of Sciences and Arts, Zagreb, 163-176.

MCGUIRE, J. C., HAMILTON, B. K. and WHITE, R. J., 1979. Approaches to development of the daunorubicin fermentation. Process Biochemistry, 14, 12, 2, 4-5.

MCGUIRE, J. C., THOMAS, M. C., STROSHANE, R. M., HAMILTON, B. K. and WHITE, R. J., 1980. Biosynthesis of daunorubicin glycosides: role of c-rhodomycinone. Antimicrob. Ag. Chemother., 18, 454-464.

OKI, T., 1977. New anthracycline antibiotics. Jap. J. Antibiotics, 30, Supplement, 70-84. QUEENER, S. W., SEBEK, I. K. and VEZINA. C., 1978. Mutants blocked in antibiotic synthesis.

Ann. Rev. Microbiol., 32, 593-636. SCHLEGEL, BRIGITTE and FLECK, W. F., 1980. New anthracycline antibiotics produced by inter-

specific recombinants of streptomycetes. I. Selection of Streptomyces violaceus subsp. iremyceticus, an iremycin-producing subspecies. Z. Allg. Mikrobiol., 20, 527-530.

SCHLEGEL, B., IHN, W. and FLECK, W. F., 1980. New anthracycline antibiotics produced by interspecific recombinants of streptomycetes. 11. Production of iremycin. Z. AlIg. Mikrobiol., 20, 533-536.

SEREK, 0. K., 1976. Use of mutants for the synthesis of new antibiotics. In: Microbiology 1976 (Edit.or: D. SCHLESSINGER), pp. 522-525. Washington, D.C. : Am. SOC. Microbiol.

STENGEL, CORNELIA, WAGNER, CHRISTINA and FLECK, W. F., 1979. Antibiotic-blocked m1itant.s of Streptomyces griseus producing different secondary metabolites in pine and two-membered cultures. Internat. Symp. Antibiotics, 14-18 May, Weimar-DDR, Abstracts NO.

STRAUSS. D. and FLECK, W., 1975. Leukaemomycin, an antibiotic with antitumor activity. 11. Isolation and identification. Z. Allg. Mikrobiol., 15. 615-623.

UMEZAWA. H., TAKEICHI, T., HAMADA, M., ISHIZUBA, M., XAGANAWA, H., OKI, T. und INNI, T., 1977. Anthracvclin~lvcoside. Verfahrcn zu ihrer Herstellung und Arneimittel. B E D OX 27 24 441 (22. 12. 1977, ;ppl."3!. 5. 1977).

VEZINA, C., 1976. In: Microbiology 1976 (Editor: D. SCHLESSINGER). pp. 525-530. Washington DC: Am. SOC. Microbiol.

YOSHIMOTO. A. and OKI. T.. 1980. Microbial conversion of anthracyclinones to daunomrcin bv

"

blocked mutants of Streptomyces coeruleorubidus. J. Antih., 10, 1158-1166.

to 1-hydroxy-13-dihydrodaunomycin and their bioactivities. J. Antibiot., 10, 1150-1157. YOSHIMOTO, A,, MATSUZAWA, Y. and OKI, T., 1980. Microbial conversion of epsilon-rhodomycinone

Anschrift: Dr. habil. W. F. FLECK Zentralinstitut far Mikrobiologie iind experimentelle Therapie der AdW DDR 6900 Jena. Beutenbergstr. 11

leukaemomycin-geblockte mutanten des streptomyces griseus und ihre pigmente

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