molekulare neurogenetik ss 2007 - uni-muenster.de · westf lische wilhelms-universit t m nster...
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Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Allgemeine Zoologie und Genetik
Abteilung Molekularbiologie
Vorlesung
"Molekulare Neurogenetik" SS 2007 Dienstag und Donnerstag, 9 c.t.
© Klämbt, Püschel 2007
1
Terminplan und Themen
17.04. Grundlagen der Genetik (Klämbt)
19.04. Frühe Neurogenese bei Drosophila (Klämbt)
24.04. Neuronale Stammzellen (Klämbt)
26.04. Neuronale Induktion bei Vertebraten (Klämbt)
03.05. Polarität und Zelltypspezifizierung im Neuralrohr und
Neuralleistenzellen (Klämbt)
08.05. Gliogenese (Klämbt)
10.05. Neuron-Glia Interaktion (Klämbt)
15.05. Olfaktorische System (Hummel)
22.05. Entwicklung des Auges bei Drosophila (Klämbt)
24.05. Entwicklung des Auges bei Vertebraten (Klämbt)
05.06. Terminale Differenzierung imAuge (Klämbt)
12.06. Zellbiologie des Neurons I (Püschel)
14.06. Zellbiologie des Neurons II (Püschel)
19.06. Zellbiologie des Neurons III (Püschel)
21.06. Axonale Wegfindung I (Püschel)
26.06. Axonale Wegfindung II (Püschel)
28.06. Axonale Wegfindung III (Püschel)
03.07. Struktur und Funktion der Synapse I (Püschel)
05.07. Struktur und Funktion der Synapse II (Püschel)
10.07. Neurotrophine und Zelltod I (Püschel)
12.07. Neurotrophine und Zelltod II (Püschel)
© Püschel 2007
Vorlesung Molekulare Neurogenetik SS 2007
Zellbiologie des Neurons
© Püschel 2007
© Püschel 2007
Bildung von Axon und Dendriten
Navigation zum Zielgebiet
Synapsenbildung
Reifung synaptischer Verbindungen
"Geburt" des Neurons
Die Entwicklung des Nervensystems
© Püschel 2007
Neuronale Vorläuferzelle
postmitotisches Neuron
kortikale Platte
Ventrikularzone
Intermediärzone
+Proliferation
Zellwanderung
Differenzierung
© Püschel 2007
S
S
N
© Püschel 2007
Numb
Symmetrische Zellteilung Asymmetrische Zellteilung
PTB 593 ASMaus
Ventrikel
© Püschel 2007
Ventrikel
© Püschel 2007
Ventrikel
VZ
IZ
CP
Pia
Zwei Arten der Zellwanderung
E12-13 E15-16
Kern-Translokation (nuclear translocation) E12-14Zellmigration (locomotion) E15-18
© Püschel 2007
Radiale Wanderung
E11 E13
VZ
PPSP
MZ (I)CP (VI)
I
VI
V
CP: Rindenplatte
VZ: Ventrikular- oder Matrixzone (ventricular zone)SVZ: Subventrikularzone (subventricular zone)
MZ: Marginalzone
Cajal-Retzius Zelle (MZ)
IZSVZ
IZ
II
III
IV
Neuron (Pyramidenzelle) (Layer I -VI)
© Püschel 2007
Pia
CR
RG
CR: Cajal-Retzius Zellen
© Püschel 2007
Ventrikel
VZ
IZ
CP
PiaZellmigration
TangentialeWanderung
© Püschel 2007
VZ
SVZ
Neocortex
Ventrikel
Striatum
© Püschel 2007
Mutationen
Maus Reeler: Defekte in Entwicklung von Kortex, Hippocampus und Cerebellumkeine Spaltung der Preplate, umgekehrte Schichtung des Kortex
Mensch DCX: Doublecortex, X-chromosomale Lissencephalie LIS1: Lissencephalie, Miller-Dieker Syndrom (LIS1+/-)
Agyria, Pachygyria, Defekte in der Schichtungdes Kortex, etc.
RELN: Reelin, Lissencephaly und Hypoplasie des Cerebellum
© Püschel 2007E14
wt reeler
E11
VZ
PP
I
VI
V
II
VI
adult
wt reeler
V
IV
III
II
III
IV
I
© Püschel 2007
Extrazelluläres Glycoprotein > 400 kDa
Maus: ReelerMensch: Lissencephalie
EGF-Motiv
300-350 AS8x
Reelin
© Püschel 2007
Dab1: Adaptor-Protein, Disabled-Homolog Reelin induziert Phosphorylierung einey Tyrsoins in Dab1
VLDLR: NPxY-Motiv bindet PI-PTB-Domäne: Dab1
VLDLR ApoER2
Dab1
Fyn
PI/PTB
SH3/SH2 Kinase
PI/PTB
P
Reelin-Rezeptor
Phospho-Dab1
© Püschel 2007
E11
VZ
PP
E13
Lis1 Mutante
E14 adult
wt wt Lis
wt Lis
© Püschel 2007
DCX und LIS1 Mutationen haben einen ähnlichen Phenotyp, der auf Defekte in Zellwanderung zurückzuführen ist
DCX: Doublecortin, 361 AS, bindet und bündelt MicrotubuliLIS1: 419 AS bindet Microtubuli und Dynein
© Püschel 2007
Latrunculin Ainhibiert Polymerisation
Phalloidinstabilisiert F-Aktin
Rhodamine-Phalloidin: Färbung von F-Aktin
Cytochalasin Dinhibiert Polymerisation
© Püschel 2007
- +
pointed endspitzes Ende
barbed endstumpfes Ende
Wachstumsrichtung
Kd = 0,6 µM Kd = 0,1 µM
© Püschel 2007
- +
Wachstumsrichtung
ATPATPADP+P
ADP+P
ADPADPADP
ADP ATP
Pi
Kd = 0,6 µM Kd = 0,1 µM
ATP-Aktin Monomereassoziieren
ADP-Aktin Monomeredissoziieren
schnell wachsendes EndeDepolymerisation
Konzentration von Aktin-Monomeren ca. 100 µM
© Püschel 2007
- +
Wachstumsrichtung
ATPATPADP+P
ADP+P
ADPADPADP
ADP ATP
PiCofilin
Cofilin
ADP
ATP
Cofilin
Profilin
Profilin
© Püschel 2007
- +
Wachstumsrichtung
ATPATPADP+P
ADP+P
ADPADPADP
ADP ATP
Pi
Profilin
Thymosin-!4
ATP
ATP
Cofilin
Cofilin Profilin
© Püschel 2007
G-Aktin Nukleation Elongation Steady State
(-)Ende
(+)Ende
© Püschel 2007
RBD FH1 FH2
RBD: Rho GTPase BindungFH: Formin HomologieDAD
Nukleation
DAD
Rho•GTP
Diaphanous: Fromin
© Püschel 2007
Diaphanous-related Fromins
Arp2/3 Spire
© Püschel 2007
Subfamilien monomerer GTPasen
RasRhoRabArfRan
© Püschel 2007
Signale
GTPasen
Effektoren
Cytoskelett
© Püschel 2007
Rho
GTP
Rho
GDPGTP
GDP
Pi
H2O
GTPase Zyclus GEFGAP
Effektoren
Aktin Cytoskelett
Signale Signale
GAP: GTPase-activating proteinGEF: guanine nucleotide exchange factor
© Püschel 2007
RhoA (193 aa)
CAAX
Switch I Switch II
Effektor Domäne
CAAX: Signal für Farnesylierung oder Geranylgeraniolysierung
A: aliphatischX: M oder S
RhoV14, RhoN17monomere GTPasen
© Püschel 2007Cdc42/RhoGDI
GDI: Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitor
1) inhibiert GDP-Dissoziation
2) inhibiert GTP-Hydrolyse
3) löst GTPase aus Membran
© Püschel 2007
Rho
GTP
Rho
GDPGTP
GDP
Pi
H2O
GTPase Zyclus GEFGAP
Effektoren
Aktin Cytoskelett
Signale Signale
RhoV14RhoN19konstitutiv aktiv
dominant-negativ
© Püschel 2007
Rho: StressfasernZelladhesion
Rac: LamellipodienProtrusion
Cdc42: FilipodienZellpolarität(Position Lamellip.,Golgi)
© Püschel 2007
Signale
GTPasen
Effektoren
Cytoskelett
N-WASP/WAVEPAKROKetc.
© Püschel 2007
WASP/SCAR Familie
WASp
N-WASP
WASp/N-WASP Scar/WAVE
WAVE1
WAVE2
WAVE3
VCA
EVH1
GBD
EVH1
© Püschel 2007
Zeitne
ue F
ilam
ente
Aktin
Aktin + Arp2/3
Aktin + Arp2/3 + WASP
Aktin + Arp2/3 + WASP + F-Aktin
© Püschel 2007
EVH1 GBD WCA
Cdc42PIP2
Aktin Arp2/3
N-WASP(505 aa)
WASP: Wiskott-Aldrich Syndrome Protein
EVH1: poly Pro Bindung
PIP2: Phosphatidylinositol-4,5-bishphosphate
© Püschel 2007
PIP2
Aktin
Cdc42
Arp2/3
N-WASP
intrinsisch autoinhibiert
© Püschel 2007
PIR121
NAP1
Abi1
WAVE
Rac
WAVE interagiert indirect mit GTPasen
Arp2/3
© Püschel 2007
PAK
Kinase Domäne
GBD Kinase Inhibitor
Dimerisierung(545 aa)
p21 associated kinase (PAK)
© Püschel 2007
ROK
(1388 aa)Coiled-coil Region
PH-DomäneKinase Domäne
RBD
Rho-kinase (ROK/ROCK)
© Püschel 2007
MLC
MLC
MLCK
PAK
Myosin PPase
ROK
aktiv
inaktiv
MHC
MLC-P: erhöhte Motor-Aktivität von Myosin II Assemblierung von Filamenten
Verringerung der Kontraktilität
Erhöhung der Kontraktilität
© Püschel 2007
MLC
P-MLC
P P
ROCK
P P
P P
P P
P P
P P
P P
PP
PP
PP
PP
PP
PPAktinfilamentbündelung
Aktomyosin-vermittelte Kontraktion
Myosin IIMLCK
MLC
Phosphatse
© Püschel 2007
Rho
ROK
LIM-Kinase-1
Cofilin
Rac
PAK
Cdc42
N-WASP
Arp2/3
mDia
MLC MHC
F-Aktin
© Püschel 2007
Capping Proteine
SeveringCross-linking (Fascin)
Regulation der Dynamik von Aktinfilamenten
Profilin/Cofilin
- + - +
© Püschel 2007
Cofilin: bindet F-Aktin (ADP-Aktin) und fördert die Depolymerisation durch Destabilisierung von F-Aktin und seine Severing-Aktivität
Profilin: bindet ATP-Aktin und erleichtert die Polymerisation am Plus-Ende
Arp2/3: Bildung von Filament-Nuclei, Verzweigungen
Capping Proteine: binden Plus- oder Minus-Ende und stabilisieren dadurch Aktin-Filamente
Severing: Proteine (z.B. Gelsolin), die F-Aktin durchtrennen
Cross-linking: Proteine (z.B. Fascin), die Filamente bündeln
© Püschel 2007
+- GTP GDP
Untereinheit
"-Tubulin !-Tubulin
GTP GDP GTP GDP GTP GDP GTP GDP GTP GDP GTP GDPProtofilament
© Püschel 2007
- +Tubulin
GDP
GTP
GTP cap
stabilunstabil
[ ] [ ]
© Püschel 2007
Dynamic instability
Catastrophe
Rescue
Disassembly
Assembly
Time (min)
Mic
rotu
bule
leng
th (
µm
)
030 60 90
50
30
20
10
40
© Püschel 2007
MAP: Microtubule associated protein (Tau, MAP2, etc.)
- Bindung entlang der gesamten Länge der MT
+TIPs: plus-end-tracking proteins
MCAKs: mitotic centromere-associated kinesins
- Bindung spezifisch an das Ende von MT
© Püschel 2007
Colchicininhibiert Polymerisation
Taxolinhibiert Depolymerisation
Nocodazol induziert Depolymerisation
© Püschel 2007
Kinesin IPlus Ende-gerichteter Motor
Motordomäne
KHC (120 kD)
KLC (64 kD)
ATPase
Dimere von: 380 kD
80 nm
MT
MT-Bindung
Cargo-Bindung
© Püschel 2007
Konventionelle Kinesine: N-terminale Motor Domäne
anterograder Transport von Membran-Organellen
im Axon
Motor-Domäne in der Mitte
wichtig für Extension von Neuriten
C-terminale Motor Domäne
Minus-Ende-gerichteter Motor
Unkonventionelle Kinesine:
© Püschel 2007
DyneinMinus Ende-gerichteter Motor
2 schwere Ketten (530 kD)
3 intermediäre Ketten (74 kD)
4 leichte Ketten (55 - 60 kD)
1,2 MD
(4644 AS)
41 nm
Dynactin: 10 Untereinheiten, verbindet Dynein mit Cargo
© Püschel 2007
Dynactin-Komplex Cargo
Rhodopsin
leichte Dynein Kette TcTex-1 verbindet Dynein mit Rhodopsin
© Püschel 2007
Kinesine: Diversität durch verschiedene Gene
Dyneine: Diversität durch assoziierte Proteine
Molekulare Motoren
Transport über grosse Distanzen: Kinesin, Dynein
Transport über kurze Distanzen: Myosin
© Püschel 2007
© Püschel 2007
Focal adhesions
focal complexesfocal adhesions
© Püschel 2007
" !
FibronectinLaminin
Integrine vermitteln den Kontakt des Cytoskelettsmit der Extrazellulären Matrix
Integrine sind aus je einer " und ! Untereinheit aufgebaut
Integrine
© Püschel 2007
!""! "!
© Püschel 2007
kortikale Platte
Ventrikularzone
Intermediärzone
Polarität:
Welcher Fortsatz wird Axon,
welcher Dendrit?
Was bestimmt die
Morphologie der Dendriten?
Wie orientieren sich
Axon und Dendriten?
Offene Fragen:
© Püschel 2007
overlayTau-1MAP2GFP
Axon: Tau-1
"minor neurites": MAP2
differenzieren zu Dendriten
© Püschel 2007
Neuronale Polarität
2) Ein und nur ein Neurit wird zum Axon
1) Es werden mehrere Fortsätze (Neuriten) gebildet, die zunächst gleichwertig sind
3) Die anderen Neuriten werden Dendriten
Was bestimmt die axonale Identität?Warum wird nur ein Neurit zum Axon??
© Püschel 2007
© Püschel 2007
PI 3-Kinase
PI(4,5)P2 PI(3,4,5)P3PTEN
Akt/
PKBP
P-Akt
Neuronale Polarität
PI(4,5)P2: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphatePI(3,4,5)P2: Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate
Phosphoinositide 3-Kinase
© Püschel 2007
Stadium 1 St. 3 Frühes St. 2 Spätes St. 2
Rap1
Par3
© Püschel 2007MT
kinesin-2 (KIF3A/3B)
Par-3
Par-6aPKC
© Püschel 2007
Cdc42GTP
GEF
Neuronale Polarität
Par-3
Par-6aPKC
RacGTP
GSK3!
'Rap1GTP
© Püschel 2007
Hippocampale Neuronen
Rap1B
Cdc42
Extrinsische/instrinsische Signale
Par3/Par6
aPKC
PI3K
RhoRac
STEF
Axonales Wachstum
aktives Rho
inaktives Rho
Rap1B
MikrotubuliAktin Transsportvesikel
GSK3!
© Püschel 2007
Mikrotubuli
F-Aktin
Die Rolle von GTPasen
Antagonistische Regulation der Neuritenextension
Extension: Rac, N-WASP
Retraktion: Rho, ROK
GTPasen koordinieren Wachstum von Mikrotubuli, F-Aktin
und Transport von Vesikeln
© Püschel 2007
- +MT
Axon:
- tau-positiv
- Plus-Ende MT distal
Dendriten:
- MAP2-positiv
- proximale Dendriten: gemischte Polarität
- distale Dendriten: uniforme Polarität
- Translationsapparat
- ++ -
+ -
© Püschel 2007
Dendriten
SomaAxon
Axonhügel (axon hillock)
Anfangssegment des Axons
(axon initial segement)
© Püschel 2007
anterograd
retrograd
- Transport Vesikel
(z.B.: Vorläufern von synaptischen Vesikeln)
- Mitochondrien
- Endosomen
- Mitochondrien
© Püschel 2007
Axonaler Transport
schnelle Komponente (200 - 400 mm/Tag):
Organellen und Vesikel (antero- und retrograd)
Motorproteine
langsame Komponente (1-10 mm/Tag):
MT, NF, Aktin, cytosolische Proteine (anterograd)
Antriebskraft unbekannt
© Püschel 2007
© Püschel 2007
© Püschel 2007
Vorlesung Molekulare Neurogenetik SS 2007
Axonale Wegfindung
© Püschel 2007
© Püschel 2007
mN
spG
psN
nsN
msN
nsN: noci-/thermoceptives sensorisches NeuronmsN: mechanoceptives sNpsN: proprioceptives sN
mN: Motorneuron
Mus musculus
© Püschel 2007
vz
mz
vIN
k IN
a IN
gp
d
va
p
m l
Mus musculus
kIN: kommissurales InterneuronaIN: assoziatives InterneuronvIN: lokales Interneuron
gp: Grundplattemz: Mantelzonevz: Ventrikulärzone
© Püschel 2007
a
p
d v
ipsilateral contralateral
d
v
Mus musculus
kommissurale Axone
© Püschel 2007
a
p
d v
ipsilateral contralateral
d
v
1 2
4
1: Wachstum in Richtung FP2: Wachstum durch FP3: contralateral: Änderung der Wachstumsrichtung4: rostrales Wachstum
3
© Püschel 2007
a
p
d v
ipsilateral contralateral
AC
PC
MausFliege
© Püschel 2007
instruktive
permissive
kontakt-abhängigdiffusible
attraktive
repulsive
Signale der axonalen Wegfindung
© Püschel 2007
Chemotrope Signale und Gradienten
chemotrope Signale vermitteln Richtungsinformation
chemotrophe Signale unterstützen das axonale Wachstum
Entfernung
Kon
zent
rati
on
12
3
1 Attraktion2 keine Reaktion3 Repulsion
© Püschel 2007
Wie können Signalmoleküle gefunden werden,
die die axonale Wegfindung steuern ?
1) Genetische Ansätze:C. elegans: unc (uncoordinated) MutantenDrosophila: Mutanten mit veränderten Projektionen Maus: Gene-trap, chemische Mutagenese
2) Biochemische AnsätzeWirbeltiere: Kombination von Bioassays undproteinchemischer Reinigung
© Püschel 2007
Signalmoleküle
der axonalen Wegfindung
und ihre Rezeptoren
Netrine DCC/Unc5HSlit RoboSemaphorine Neuropiline/Plexine
© Püschel 2007
In vitro Assay
20.000 Gehirne von Hühnerembryonen
Biochemische Reinigung
Peptidsequenzen
cDNA-Klonierung
Netrin
gp
© Püschel 2007
Netrin
Maus: Netrin-1 Netrin-3
Huhn: Netrin-1 Netrin-2
Dros.: Netrin-A Netrin-B
Nem.: UNC-6
VI
V
unc-6C. elegans
Netrin-1G. gallus
612 AS 606 AS
© Püschel 2007
d
v
Netrin-1
?
© Püschel 2007
unc-40 unc-5unc-6
unc: uncoordinated Mutantenunc-6
unc-40
unc-5
DCC: deleted in colorectal cancer
© Püschel 2007
unc-40 unc-5
FNIII
Ig
TM TM
IgTSP
C. elegans
Maus DCC
Neogenin
Unc5H1Unc5H2Unc5H3
Drosophila Frazzled Unc5
© Püschel 2007
+
Attraktion
© Püschel 2007
+
Repulsion
UNC-5H/DCC Rezeptor vermittelt Repulsion
© Püschel 2007
Repulsion(long-range)
AttraktionRepulsion
(short-range)
Rezeptorzusammensetzung bestimmt den Effekt von Netrin
© Püschel 2007
a
p
d v
ipsilateral contralateral
AC
PC
MausFliege
© Püschel 2007
Slit
"leucine-rich repeats"
EGF repeats
EGF repeatsG-Domäne
cysteine knot
Maus: Slit-1 Slit-2 Slit-3
Dros.: Slit
Nem.: SLT-1
© Püschel 2007
FNIII
Ig
TM
C. elegans
Drosophila
Maus
Sax-3
RoboRobo2Robo3
Robo1Robo2Robo3
© Püschel 2007
Slit
+
+-
-
Netrin+
+-
-
DCC DCC + Robo
DCC/Netrin Attraktion
Robo/Slit
Repulsion
DCC/Netrin
Zusammenwirken von DCC und Robo
© Püschel 2007
DCC
Attraction Silencing Repulsion
Netrin Slit
Robo
© Püschel 2007
a
p
d v
ipsilateral contralateral
d
v
Netrin-1Shh
Slit-1
+
-
+
+
+
-
-
-+
+
+
BMP7/GDF7
Bmp7/GDF7
Netrin-1Shh
Slit-1
-
-
-
-
© Püschel 2007In vitro Assay
MembranextrakteRinderhirn
Biochemische Reinigung
Peptidsequenzen
cDNA-Klonierung
Slit
© Püschel 2007
In vitro Assay
20.000 Gehirne von Hühnerembryonen
Biochemische Reinigung
Peptidsequenzen
cDNA-Klonierung
A B
© Püschel 2007
Semaphorin-Domäne
Ig-Homologie
Semaphorine (Klasse 3)
Maus: 6 Klasse 3
Dros.: 2 Klasse 2
Nem.: 1 Klasse 2
Basischer C-Terminus
772 AS
PSI-Domäne
Sema3A
© Püschel 2007
© Püschel 2007
cont ro l Sema3A
293 s g
Semaphorine wirken als repulsive Signale
© Püschel 2007
Expressions-Bank
Transfektion in COS-Zellen
Ligandenbindung
Isolation der cDNA für den Rezeptor
© Püschel 2007
a1
a2
b1
b2
c
CUB
MAM
coagulationfactor
TM
Maus Neuropilin-1Neuropilin-2
Drosophila -
-C. elegans
© Püschel 2007
Semaphorin-Domäne
GAP-Homologie
TM
PSI-Domänen
Plexin
Maus 9 Plexine
Drosophila Plexin-APlexin-B
plx-1plx-2
C. elegans
IPT-Repeats
© Püschel 2007
© Püschel 2007
Kollaps/Repulsion
Rho/Rac
LIMK1
Cofilin
F-actin
?
Integrin
?
Plexin-A1
Adhesion
© Püschel 2007
Chemotrophe Signale: Änderung der Wachstumsrichtung
1
2
3
1 Attraktion2 keine Reaktion3 Repulsion "Turning-Assay" (Mu-ming Poo et al.)
© Püschel 2007
© Püschel 2007
Verringerung der intrazellulären cAMP-Konzentrationmacht Netrin-1 zu einem repulsiven Signal
Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentrationmacht Sema3A zu einem attraktiven Signal
1.Hypothese: Zwei Gruppen von Signalen
1: Modulation über cAMP (z.B. Netrin)2: Modulation über cGMP (z.B. Sema3A)
2.Hypothese: [cAMP]/[cGMP] ist entscheidend
[cAMP]>[cGMP] -> Attraktion [cAMP]<[cGMP] -> Repulsion bei: Netrin
© Püschel 2007
Die Reaktion von Wachstumskegeln auf Signale kann vonIhrer Geschichte abhängen
Kontakt mit intermediären Zielen kann die Reaktion auf einSignal beeinflussen
© Püschel 2007
[Ca2+] # Rac #
Cytoskelett
?
Desensitisierung
MAPK
Translation
Adaptation
DCC
© Püschel 2007
ap
d
v
d
v
d
v
© Püschel 2007
d
v
d
v
Net
rin1
-/-
Shh
+ Cyclopamine
d
v
© Püschel 2007
Shh N C
NShh-N
Shh-Np N
© Püschel 2007
a
p
d v
ipsilateral contralateral
d
v
Netrin-1Shh
slit-1
+
-
Sema3B ?
+
+
+
-
-
-+
+
+
BMP7/GDF7
Bmp7/GDF7
Netrin-1Shh
slit-1
Sema3B ?
-
-
-
-
Wnt
© Püschel 2007
D
V
N T
D: dorsalV: ventral
N: nasalT: temporal
A P
D
V
Retina Tectumoptischer Nerv
Visuelles System des Huhns
topographische Projektion
© Püschel 2007
Chemoaffinitätshypothese (Sperry 1963)
biochemische Affinität zwischen Axonen und Zielregiondurch Markierungsmoleküle in Projektion und Zielgebiete die jeweils Gradienten bilden
Roger W. SperryNobelpreis 1981
© Püschel 2007
D
V
N T A P
D
V
Streifen-Assay
© Püschel 2007
T
N
AP
+ PI-PLC
© Püschel 2007
Rezeptor repulsives Signal
attraktives Signal
N T A P
© Püschel 2007
Rezeptor repulsives Signal 1
repulsives Signal 2
N T A P
© Püschel 2007
N T A P
Terminationszone
"Overshooting"
Kollaterale
© Püschel 2007
Tectum (Hühnerembryonen)
Menbranpräparation anteriores, posteriores Tectum
+/- PI-PLC Behandlung, Überstand
2D-Gel
Reinigung differentiell exprimierten Proteins
RAGS = Ephrin-A5
(retinal axon guidance signal)
© Püschel 2007
Ephrine
Klonierung RAGS
Liganden für Eph-RTKs
Maus: 14 Eph, 8 Ephrine
C. elegans: 1 Eph, 4 Ephrin-A
Drosophila: 1 Eph, 1 Ephrin
© Püschel 2007
EphA1
EphA2
EphA3
EphA5
EphA5
EphA7
EphA8
EphA4
EphB1
EphB2
EphB3
EphB4
EphB5
EphB6
Rez
epto
r-T
yros
inki
nase
n
ephrin-A1
ephrin-A2
ephrin-A3
ephrin-A4
ephrin-A5
ephrin-B1
ephrin-B2
ephrin-B3
Eph
rine
© Püschel 2007
Bidiredtionelle Signaltransduktion
P
Repulsion oder Adhesion
© Püschel 2007
EphA3
EphA4, EphA5
Ephrin-A2
Ephrin-A5
Ephrin-A6
N T A P
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Retina
superiorer Colliculus (SC)laterales Gencilatum (LGN)
visueller Cortex
© Püschel 2007
ipsilateral
ipsilateral
contralateral
contralateral
Primärer visueller Cortex
Layer 4
laterales Geniculatum
(LGN)
optisches Chiasma
optischer Nerv
occular dominanz columns
© Püschel 2007
DiI: 3H-Indolium, 2-[3-(1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-octadecyl- 2H-indol-2-ylidene)-1-propenyl]-3,3-dimethyl-
1-octadecyl-,perchlorate
DiO: Benzoxazolium, 3-octadecyl-2-[3-(3-octadecyl-2(3H)-benzoxazolylidene) -1-propenyl]-, perchlorate
DiO
DiI
© Püschel 2007Retina Superior colliculus
T
N
T
NT
N
wt
ephrin-A2-/-
ephrin-A5-/-
T
N
ephrin-A2-/-
ephrin-A5-/-
Genetische Analyse in "Knockout" Mäusen
A P
© Püschel 2007
EphA5
EphA4
Ephrin-A2
Ephrin-A5
Ephrin-A6
Mus musculaus
N T A P
Ephrin-A2
Ephrin-A5
Ephrin-A6
© Püschel 2007
+ PI-PLC
N T
EphA
Ephrin
N T
EphA*
EphA
EphA*
© Püschel 2007
N T A P
D
V
M
LEphB
Ephrin-B
EphB
Ephrin-B
dorsale Axone: reverse signalingventrale Axone: forward signaling
© Püschel 2007
Festlegung der Position im Ziegebiet durch
- Konzentration sensitiver EphA-Rezeptoren- Konzentration Ephrin-A Liganden- Kompetition zwischen Axonen um synaptische Ziele
A/P-Achse: EphA/Ephrin-A, RepulsionD/V-Achse: EphB/Ephrin-B, Attraktion
© Püschel 2007
Vorlesung Molekulare Neurogenetik SS 2007
Struktur und Funktion
der Synapse
© Püschel 2007
© Püschel 2007
MikrotubuliF-Aktin
Synapse
Dendrit
© Püschel 2007
Andere Adhesionsmoleküle
Ig-Superfamilie
Cadherine (Ca2+-abhängig)
klassische
EC1
EC2
EC3EC4
EC5
Protocadherine
EC1
EC2
EC3EC4
EC5
EC6
!-Catanin
"-Catanin
p120
© Püschel 2007
ca. 300 nm
postsynaptische Dichte
Endosom
präsynaptische
Cytomatrix
Vesikel-Docking
© Püschel 2007
!-Catenin
"-Catenin
F-Aktin
Monomer
(schwach adhesiv)
cis-Dimer
(stark adhesiv)
Cadherin: Ca2+-abhängige
Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle
Cadherin-Repeat
© Püschel 2007
Vesikel
Aktive Zone
Postsynaptische Dichte
prä
syn
ap
tisc
hp
ost
yn
ap
tisc
h
Chemische Synapsen
synaptischer Spalt
Spine Aparatus
Polyribosomen
http://synapses.mcg.edu
© Püschel 2007
Glia
1: Aktionspotential
2: Depolarisation
3: Ca2+ Einstrom(Spannungs-abhängige Ca2+ Kanäle)
5: Exocytose Neurotransmitter
6: Aktivierung postsynaptischer
Rezeptoren
7: Depolarisation
4: Fusion synaptischer Vesikel
mit Membran
1
2
3
Chemische Synapsen
© Püschel 2007
Glia
8: Re-uptake Neurotransmitter
8
8 8
9: Recycling synaptischer
Vesikel9
© Püschel 2007
kann bi-
directional
sein
Signal-
übertragung
NeinTransmission
Delay
IonenflussTransmitter
Gap-junctionBestandteile
3,5 nmMembran-
abstand
Electrische
Synapse
unidirectional
Ja
(ca. 1-5 msec)
Chemischer Transmitter
Neurotransmitter-Vesikel
postsynaptische Rezeptoren
20-40 nm
Chemische
Synapse
© Püschel 2007
0 mV
Hyperpolarisation
Depolarisation
Repolarisation
Schwellenwert
Ruhe-Potential
-70 mVMem
bran
Pot
enti
al (
mV
)
K+
Na+
-
+
© Püschel 2007
0 mV
Depolarisation
Schwellenwert
-70 mVMem
bran
Pot
enti
al (
mV
)
K+
© Püschel 2007
0 mV
Schwellenwert
-70 mVMem
bran
Pot
enti
al (
mV
)
K+
Hyperpolarisation
© Püschel 2007
Excitatorypostsynapticpotential (EPSP)
Inhibitorypostsynapticpotential (IPSP)
© Püschel 2007
Synapsentypen
Gray Typ 1: Asymmetrische Synapsen
Gray Typ 2: Symmetrische Synapsen
dendritic spines and shafts
dendrite shafts and neuronal cell bodies
excitatorisch
inhibitorisch
http://synapses.mcg.edu
© Püschel 2007
Neurotransmitter
Klassische Neurotransmitter
Catecholamine: Dopamin, Adrenalin, NoradrenalinSerotoninGlycinGABA ($-aminobutyric acid)GlutamatAcetylcholine
Nicht-Klassische Neurotransmitter
Peptide
© Püschel 2007
Neurotransmitter-Rezeptoren
Ionotrope Rezeptoren
Metabotrope Rezeptoren
Liganden-aktivierte Ionenkanäle
mehrere Untereinheiten
Reaktion im Submilllisekunden-Bereich
schnell desensitisierend
G-Protein gekoppelte Rezeptoren
langsame Reaktion, aber länger andauernd
(Sekunden bis Stunden)
© Püschel 2007
Ionotrope Rezeptoren
2 Familien
1) nAChR, 5-HT3, GABAA, GlyR
excitatorisch: nAChR, 5-HT3
inhibitorisch: GABAA, GlyR
2) Glutamat-Rezeptoren
excitatorisch: AMPA, NMDA, Kainat
© Püschel 2007
Ionotrope Rezeptoren
1) nAChR, 5-HT3, GABAA, GlyR
nAChR: nicotinische Acetylcholin-Rezeptor
muskelspzifische und neuronale Form
5-HT3 (5-Hydroxytryptamine): Serotonin
GABAA : GABA
GlyR: Glycin
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Pentamer, Liganden-Bindugsstelle zwischen den Untereinheiten
N
C
1 2 3 4
2
34
1
2
2
22
nAChR:
Muskel: 2" ! $ %
neuronal: 2" 2 !
GlyR" : GlyR! = 3:2
GABAA Rezeptoren:
2" : 2! : 1$
Cl- Kanälepermeabel für
Na+, K+, Ca2+
5-HT3 (Serotonin)
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ionotrope Glutamat-Rezeptoren
AMPA ("-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol Proprionat)KainatNMDA (N-Methyl-D-Aspartat)
NR1
NR2A
NR2B
NR2C
NR2D
NR3A
NR3B
GluR1
GluR2
GluR3
GluR4
NMDA AMPA Kainat
GluR5
GluR6
GluR7
KA-1
KA-2
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NMDA-Rezeptoren: Liganden- und Spannungs-abhängig
Co-Agonist: Glycin oder D-Serin
Mg2+-Block
Ca2+-permeabel
Mg2+
Na+, Ca2+
K+
Depol.
Heterooligomere aus NR1 und NR2A-D
NR1 bindet Glycin
NR2 binden Glutamat
NR1 NR2
© Püschel 2007
Kainat
1 2 3 4
N
C
S1S2
GluR2
"re-entrant loop"
Glutamat-Rezeptoren
Tetramere
Liganden-Bindungsstelle: Ectodomäne
© Püschel 2007
GABAB: hetrooligomere 7TM Rezeptoren
Metabotrope Rezeptoren
Serotonin, Adrenalin, Dopamin
Glutamat
muscarinischer AChR
© Püschel 2007
SH3 PRD PRD
cortactin
GK
AP
SH3 GuK
PH
C2
GA
P
mGlur
NRAMPA-R
PSD-95
Shank
Homer
PICK1GRIP
© Püschel 2007
PDZ-Bindemotive
Klasse I X-S/T-X-V/L PSD-95
Klasse II X-F/Y-X-V/I
X - & - X - &
Shank/ProSAP
GRIP, PICK-1
Klasse III X-D-X-V nNOS
© Püschel 2007
N
C
GlyR !-Untereinheit
Mikrotubuli
CollybistinCdc42
N
C
Gephyrin
© Püschel 2007
Vorläufer Synapticher Vesikel
Dense-core Vesikel mit Vorläufer der aktiven Zone
aktive Zone
Vesikel mit AMPA-RezeptorVesikel mit NMDA-Rezeptor
0 Min 20 Min 60 Min
PSD
© Püschel 2007
aktive Synapsestumme Synapse
© Püschel 2007
NRAMPA-R
AMPA Rezeptor: Depolarisierung, Turnover von synaptischer Aktiviät abhängigNMDA Rezeptor: synaptische Plastizität, in der Synapse stabil in Membran
ERStargazin
PDZ Proteine
© Püschel 2007
Basallamina
terminale Schwann-Zelle
Muskelfaser
synaptische Vesikel
AChR
Mitochondrien
Neuromuskuläre Endplatte
Aktive Zone
Subsynaptische
Einfaltungen
© Püschel 2007
1. Clusterbildung AChR
2. transkriptionelle Aktivierung
Achr-Gen
3. Repression extrasynaptischer
Achr-Transkription
synaptisch:
>10.000 AChR/µm2
extrasynaptisch:
10 AChR/µm2
© Püschel 2007
1. Clusterbildung AChR
2. transkriptionelle Aktivierung
Achr-Gen
3. Repression extrasynaptischer
Achr-Transkription
synaptisch:
>10.000 AChR/µm2
extrasynaptisch:
10 AChR/µm2
Agrin
Neuregulin
Acetylcholin
MuSK
ErbB RTKs
AChR
© Püschel 2007
Elimination von Synapsen
polyneuronale Innervation
© Püschel 2007
Muskel-intrinsisches AChR-Clustering
in der Endplatten-Zone:
unabhängig von Agrin
abhängig von MuSK
Stabilisierung und Wachstum der
AChR-Cluster:
abhängig von MuSK und Agrin
Dispersion aneural Cluster:
abhängig vom Nerv
© Püschel 2007
Expression in sybsynaptsichen
Kernen
Muskel-intrinsische
Expression von AChR-mRNA
in der Endplatten-Zone
© Püschel 2007
Vorlesung Molekulare Neurogenetik SS 2007
Neurotrophine und Zelltod
© Püschel 2007
© Püschel 2007
Zielgebiete sezernieren begrenzte Mengen (NGF: 1ng/g Gewebe)von Überlebensfaktoren (Neurotrophinen), um die Neurone kompetierenErgebnis:Anpassung von Grösse des Zielgebiets und Zahl Neuronen
Rita Levi-MontalciniVictor HamburgerStan Cohen
Neurotrophin Hypothese - NGF + NGF
© Püschel 2007
C1
LRR1-3
C2
Ig1
Ig2
Tyrosin-Kinase
CR1
CR2
CR3
CR4
p75 TrkA, B, C
NGF
© Püschel 2007
TrkA TrkB TrkBTrkC
NGF BDNF NT-3 NT-4
ca. 250 AS Proproteinca. 120 AS Protein
© Püschel 2007
proNGF
NGF
TrkA: Kd = 10-10
p75: Kd = 10-9
ÜberlebenZelltod
TrkA
p75
Überleben
Kd = 10-11
p75: low affinity neurotrophin recptor
Sortilin
© Püschel 2007
Inhibition axonales Wachtum
NogoMAGOMgp
NogoMAG: myelin associated glycoproteinOMgp: myelin oligodendrocyte glycoprotein
Rho-GDI"
RhoA
NgR
p75
Lingo-1
© Püschel 2007
NGF
Stimulation axonales WachstumInhibition axonales Wachtum
NogoMAGOMgp NgR p75
© Püschel 2007proprioceptiv (TrkC)
mechanoceptiv (TrkB oder TrkC) nociceptiv (TrkA)
sensorische Neurone
Motorneuron
Afferenzen: sensorischer InputEfferenzen: motorischer Output
© Püschel 2007
Zielgebiet
retrograder Transport
autocrin
paracrin
© Püschel 2007
GDNF
Neurotrophin fürdopaminerge NeuroneMotorneuroneeinige sensorische u.sympthische Neurone
Glial-derived neurotrophic factor
TGF Superfamilie
© Püschel 2007
Ret
GFR"1 GFR"2 GFR"3 GFR"4
GDNF NRTN ARTN PSPN
GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factorNRTN: neuturinARTN: arteminPSPN: persephin
GFR: GDNF family receptor
© Püschel 2007
Ret
GFR"1
GDNF
Src
GFR"1
© Püschel 2007
LIF: Leukimia inhibitory factor
CNTF: Ciliaray neurotrophic factor
CT1: Cardiotropin 1
OsM: Oncostatin M
Neurotrophe Cytokine
IL-6: Interleukin 6
© Püschel 2007
gp130
LIFR!
LIF CNTF CT1 OsM
CNTFR"gp130
LIFR!gp130LIFR!
CTR ?gp130
OSMR
© Püschel 2007
Weitere Funktionen von Neurotrophinen
- Axonales Wachstum (Stimulation)- Entwicklung und Struktur von Dendriten und Dendritic Spines- Synapsenzahl- synaptische Transmission- neuronale Plastizität
Funktionen von neurotrophen Cytokinen
Neurotransmitterphenotyp
© Püschel 2007
Programmierter Zelltod
- Apoptose- Necrose- andere Formen
© Püschel 2007
Apoptose
- normaler physiologischer Prozess in Entwicklung und bei Krankheitsprozessen
- eine Form des programmierten Zelltodes
© Püschel 2007
- Membran-"Blebbing"
- Fragmentierung DNA
Apoptose
- Schrumpfen des Cytoplasma
- Chromatin-Kondensierung
- Phagocytose durch benachbarte Zellen
© Püschel 2007
pathologische Antwort auf Verletzung der Zelleführt zur Zell-Lyse und Entzündung
Nekrose
Freisetzung des Zellinhalts
© Püschel 2007
1) Spaltung von Caspase-Substraten
Nachweis von Apoptose
2) TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling)
3) Kernmorphologie (Fragmentierung)
(terminal deoxynucleotidyl transferase)
© Püschel 2007
EGL-1 CED-9
CED-4
CED-3
Bcl-2
Apaf-1
Caspase-9
Bax/Bik
Apoptosis Apoptosis
ced: cell death abnormal
© Püschel 2007
Prodomäne
grosse Untereinheit
kleine Untereinheit
Procaspase-9
Procaspase-8
Procaspase-3
CARD (caspase recruitment domain)DED (death effector domain)
Heterotetramer
DEVDXX
inaktives Monomer
© Püschel 2007
Signal
Initiator-Caspase
Effektor-Caspase
Sub strate
Zelltod
© Püschel 2007
Procaspase-9
Procaspase-8
Procaspase-3, 6, 7
Initiator-Caspasen
Effektor-Caspasen
CARD (caspase recruitment domain)DED (death effector domain)
© Püschel 2007
Intrinsische Weg Extrinsische Weg
Rezeptor-vermitteltEntzug trophischer FaktorenDNA-Schäden
© Püschel 2007
Aktivierung von Caspasen
1) Proteolytische Spaltung durch andere Caspasen (Effektor-Caspasen)
2) "Induced proximity" (autokatalytisch) (Initiator-Caspasen)
3) Komplexbildung mit Apaf-1 (als regulatorische Untereinheit)
© Püschel 2007
Extrinsischer Weg
Procaspase-8
DD (death domain)
DISC (death-inducingsignaling complex)
TNF
FADD
Caspase-8
TNF-Rezeptor
TRADD
FADD: Fas-associated DD
TRADD: TNFR-associated DD
© Püschel 2007
Cytochrom c Freisetzung
Bindung Cyt c an Apaf-1
Bindung von ATP/dATP
Apoptosom-Assemblierung durchOlligomerisation
Bindung Pro-Caspase-9
Aktivierung Caspase-9
Aktivierung Effektor-Caspasen
Intrinsischer Weg
© Püschel 2007
Trimerisierung TNF-R
Assemblierung DISC
Aktivierung Caspase-8Typ 1
Aktivierung Effektor-Caspasen
Extrinsischer Weg
Typ 2
Spaltung von Bid
Translokation Bid zu Mitochondrien
Induziert Cytochrom c Freisetzung
Cyt. c bindet Apaf-1
Apoptosom- AssemblierungCaspase-9 Aktivierung
© Püschel 2007
BIR1 BIR2 BIR3
Caspase-9 (kleine Untereinheit)
Caspase-3 und -7 (katalytisches Zentrum)
AVPY----XIAP
© Püschel 2007
AVIP
Import-Signal
Smac/DIABOLO
AVIP
239 As
AV
IP
AVIP
AVIPAVIP
© Püschel 2007
Gruppe I
Gruppe II
Gruppe III
Bcl-2
Bax
Bid
Bik
BH4 BH3 BH1 BH2 TM
BH3-only
antiapoptotisch
proapoptotisch
multi-domain
Bcl-2 Familie
Bad
© Püschel 2007
BaxBak
proapoptotische BH3-only: Bad
Oligomerisierung von Bax oder Bak
in der Mitochondrien-Membran
Bax, Bak bilden Poren
anti-apoptotische Bcl2: Bcl-2, Bcl-xL
proapoptotische BH3-only: Bim, Bid
Cytochrom c Freisetzung
© Püschel 2007
BimBidBad
BaxBak
Bcl-2Bcl-xL
Signale
BH3-only: Sensoren für Zellschäden, Liganden für Multi-Domain
Multi-Domain: regulieren Integrität der Mitochondrien-Membran
Cytochrom c
Apaf-1
Caspase-9
© Püschel 2007
Bad
Caspase-8
BidBim
Bax, Bak
Bcl-xL
PMT
t-Bid
Dynein
DLC
© Püschel 2007
pro-apoptotische Signale
Cytochrom cEndoGAIFSmac/DIABOLO
Apaf-1
Caspase-9
DNA-Fragmentierung
IAPs
Bax/BakBcl-2/Bcl-xL
anti-apoptotische Signale
DNA-Fragmentierung?
© Püschel 2007
IAP-Proteine (IAP: inhibitor of apoptosis)
497604
142
XIAPcIAP1
Survivin
BIR CARD RING
BIR (baculovirus IAP repeat): 70 Aminosäure Domäne bindet Zn2+
inhibieren Caspasen direkt
© Püschel 2007
BadBax, Bak
Bcl-xL
P
TrkA
© Püschel 2007
PI(3)Kinase PIP3
AKT
PDK
Bcl-xL Bad-PBad
Transkription
TrkA
© Püschel 2007
DCC, Unc5H: Netrin-1
Neogenin: RGM (Repulsive Guidance Molecule)
DCC, Neogenin als "Dependence"-Rezeptoren
Caspase-9
Caspase-3
Netrin-Bindungverhindert Apoptose
Caspase-3