partie iii : resultats a/ etude des reponses anticorps...
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PARTIE III : RESULTATS
A/ ETUDE DES REPONSES ANTICORPS LIEES
AUX CANDIDATS VACCINS (TESTS ELISA)
1) Prévalence des candidats vaccins : MSP1p19, MSP4p20, MSP5 et R23
L’objectif de cette thèse est d’étudier la fonctionnalité dans la réponse immunitaire des Ac
associées aux différents candidats vaccins. Cependant, au préalable, il est essentiel d’analyser
la prévalence et les caractéristiques de leurs réponses Ac associées. Ces analyses sont
réalisées pour les sérums de tous les villageois prélevés lors de la série en double transversale.
La répartition des Ac ayant pour cibles les candidats vaccins étudiés doit être analysée en
fonction des paramètres qui seront étudiés dans les tests de fonctionnalité. Il s’agit de
l’influence de la zone d’endémie, l’âge, la parasitémie circulante, l’hémoglobine mais
également la relation avec la protection clinique observée sur le terrain.
Tous les résultats présentés ici sont donc des compléments d’analyses sérologiques
approfondies.
1.1) Prévalence pour toute la population d’étude
La première des observations à faire concerne la validation des densités optiques (DO)
observées et donc des tests ELISA réalisés. Il est usuellement reconnu que pour tester les
réponses Ac contre les candidats vaccins en zone d’endémie, la dilution 1/200 est la plus
appropriée (Aribot, 1996) (Perraut, 2005 A). Cette dilution a donc été utilisée et les DO ainsi
obtenues sont comprises entre 0 et 1,962 pour MSP1p19, 0 et 2,378 pour MSP4p20, 0 et
1,696 pour MSP5 et 0 et 2,112 pour R23. Ces DO sont donc toutes inclues dans une même
gamme de réponse, gamme validant l’utilisation de cette dilution car étant suffisamment large
tout en n’atteignant pas le seuil maximal de détection de 3,5. Les 221 sérums issus des
habitants de Ndiop et les 186 issus de ceux de Dielmo ont été testés en duplicata à cette
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dilution pour ces quatre Ag. Ils ont été également testés contre la GST, les DO obtenues étant
à soustraire à celles de la protéine recombinante R23 afin d’analyser uniquement les réponses
inhérentes au fragment R23 de la construction vaccinale.
Les DO n’étant pas des données standardisées et pouvant fluctuer d’une plaque à l’autre et
d’une série de tests à l’autre, elles sont difficilement analysables en tant que telles. Aussi,
nous avons utilisé des unités basées sur des calculs d’unités arbitraires et de ratios de DO. Les
unités arbitraires permettent de travailler par rapport à une référence positive fixée
arbitrairement à 100 - contrôle positif SHI -. Les ratios de DO (rDO) permettent quant à eux
de standardiser les réponses par rapport à des contrôles négatifs. Cette dernière technique de
standardisation des résultats est largement utilisée sur le plan international et reconnue comme
fiable.
Les résultats globaux obtenus - minimum, maximum, médiane, moyenne - pour les DO, unités
et rDO sont présentés dans le tableau V, ainsi que la prévalence observée et l’analyse
statistique des différences entre les deux villages.
Les unités arbitraires utilisées permettent de pouvoir visualiser le niveau de réponse des
sérums et les classer selon ce critère. On peut constater que, pour chaque candidat vaccin
étudié, on trouve des sérums présentant des taux d’Ac plus élevés que le standard positif SHI.
Un maximum de 130,2 unités arbitraires est observé pour MSP1p19, 131,5 pour MSP4p20,
123,9 pour MSP5 et 166,3 pour R23. Ces unités ont été utilisées, entre autre, pour
sélectionner rapidement les sérums à dépléter : valeur supérieure à 80 et si possible à 100.
Cependant, elles présentent également des inconvénients. Le standard positif n’ayant pas
initialement la même valeur pour les différents candidats vaccins, les unités sont relatives et
ne sont pas comparables d’un Ag à l’autre. Ce phénomène est moins visible avec des ratios de
DO. De plus, l’utilisation d’un contrôle « positif » trop bas par rapport à l’Ag étudié - le SHI a
un taux relativement faible en Ac contre R23 et MSP5 - peut entraîner des résultats d’analyses
statistiques contradictoires avec ceux calculés en rDO. C’est le cas par exemple pour MSP5.
Les moyennes observées dans les 2 villages sont de 24,8 et 32,2 unités et les valeurs obtenues
en unités pour les 2 villages sont statistiquement différentes par le test de Mann Withney -
P <0,0001 -. A l’inverse, les rDO calculés ont une moyenne très proche - 4,31 et 4,30 -, avec
toutefois une médiane différente - 2,71 et 3,31 -. La différence de réponses entre les 2 villages
est finalement non significative - P = 0,07 -.
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Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo
médiane 0,805 0,545 1,113 1,196 0,163 0,316 0,053 0,049 0,111 0,133
moyenne 0,858 0,673 1,090 1,132 0,271 0,414 0,211 0,218 0,118 0,144
maximum 1,962 1,720 2,378 2,112 1,462 1,696 1,650 2,112 0,625 0,439
minimum 0,000 0,006 0,000 0,000 0,001 0,007 0,000 0,000 0,000 0,013
médiane 51,4 40,2 62,6 72,2 15,8 24,9 4,9 3,8
moyenne 54,6 47,5 61,7 69,3 24,8 32,2 19,3 17,1
maximum 126,6 130,2 131,3 131,5 123,1 123,9 151,7 166,3
minimum 2,2 0,8 3,0 2,1 1,0 1,3 0,0 0,0
médiane 8,69 5,31 6,76 8,64 2,71 3,31 1,00 1,00
moyenne 9,26 6,68 6,72 8,22 4,31 4,30 2,71 2,34
maximum 19,91 16,91 14,74 14,98 22,83 17,11 18,01 17,62
minimum 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
prévalence 86% 73% 78% 88% 66% 74% 30% 24%
P (Mann Withney)
NS<0,0001
MSP5 R23 GST
0,0005 NS
MSP4p20
DO
rDO
unités
MSP1p19
Tab
leau
VI :
Réc
apitu
latif
des
DO
, uni
tés
et r
DO
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vacc
ins
test
és s
ur
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oubl
e tr
ansv
ersa
le. (
NS
= n
on s
igni
ficat
if)
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Les unités arbitraires sont donc un outil d’aide à la visualisation des amplitudes de réponses
Ac mais ne permettent la réalisation d’études statistiques que si elles sont déterminées sur la
base d’un contrôle positif commun élevé - ce qui est le cas de MSP4 -.
C’est la raison pour laquelle toutes les analyses présentées dans la suite de cette partie auront
été effectuées à l’aide des rDO. En observant les résultats obtenus dans le tableau VI et leur
représentation en box-plot à la figure 19, il est très clair que tous les Ag candidats vaccins ne
sont pas reconnus de façon similaire par les Ac du système immunitaire de personnes vivant
en zone d’endémie.
Figure 19 : Distribution des valeurs de ratios de DO associés aux quatre candidats vaccins
dans les 2 sites d’étude
Pour ce qui est des MSP, les trois protéines recombinantes testées ont toutes les trois la
caractéristique d’être très bien reconnues par les populations vivant en zone d’endémie, que
ce soit méso- ou holo-endémie. En effet, les prévalences observées sont respectivement pour
Ndiop et Dielmo, de 86% et 73% pour MSP1p19, de 78% et 88% pour MSP4p20 et de 66% et
74% pour MSP5.
Pour deux de ces trois Ag, MSP4p20 et MSP5, le nombre de répondeurs est plus élevé en
zone d’holoendémie. Cette différence est observée de façon significative pour MSP4p20 - P =
0,0005 -. La situation inverse est observée pour MSP1p19, avec une meilleure réponse en
zone de mésoendémie - P < 0,0001 -.
Cependant, malgré ces fortes prévalences, les profils Ac sont différents pour ces trois
constructions vaccinales.
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MSP1p19, avec une moyenne de rDO de 9,26 à Ndiop, est l’Ag le mieux reconnu en terme
d’intensité de réponse. Cependant, une très nette différence entre Ndiop et Dielmo est
observée. A Dielmo, la moyenne des réponses n’est que de 6,68, valeur nettement plus faible
mais restant tout de même élevée. Cette différence de réponse entre les deux zones est très
significative - P <0,0001 - et évolue dans le même sens que le nombre de répondeurs. Aussi,
il apparaît paradoxalement que les habitants de zone de mésoendémie, dans cette étude,
répondent plus fortement que ceux résidant en zone d’holoendémie à MSP1p19 au même
moment.
Pour MSP4p20, nous observons la situation inverse. Avec une moyenne de 6,72 à Ndiop
contre 8,22 à Dielmo, ce sont les habitants des zones d’holoendémie qui sont les plus forts
répondeurs, ce qui coïncide également avec la prévalence observée. Cette différence de profil
est également très significative - P = 0,0005 -. L’intensité des réponses Ac contre cet Ag est
également très élevée, soulignant MSP4p20 comme un Ag majeur de P. falciparum, de
manière aussi importante que MSP1p19.
Concernant la réponse anti-MSP5, nous n’observons pas de différence de moyenne de
réponses et la répartition est très similaire dans les deux villages. Le test de Mann Withney
donne un résultat non significatif - P = 0,07 - lorsque l’on compare les réponses Ac mesurées
dans les deux zones. La prévalence reste cependant élevée, comme nous l’avons vu mais
l’intensité des réponses est plus faible que pour les deux autres MSP, avec une moyenne de
réponse à 4,3. C’est donc un Ag bien reconnu par les populations des zones d’endémie mais
induisant un niveau de réponse Ac plus modéré.
La réponse anti-R23 est très différente des réponses anti-MSP. En effet, 75% des réponses
sont nulles ou quasi nulles, avec une médiane égale à 1,0 pour les deux villages - ce qui
correspond à la valeur la plus faible possible - et une moyenne de 2,71 à Ndiop et 2,34 à
Dielmo. Ces moyennes sont excessivement faibles sachant que l’on considère un sérum
comme répondeur si son ratio de DO dépasse la valeur de 2. La prévalence observée y est
donc faible, à savoir 30% à Ndiop et 24% à Dielmo. Cependant, on observe un taux assez
important de sérums présentant une très forte réponse anti-R23, allant jusqu'à 18,1. Il
semblerait qu’avec cet Ag on observe deux grands profils de réponse : soit une absence de
production d’Ac anti-R23, correspondant à la très grande majorité des cas, soit au contraire
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Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo
rho 0,39 0,23 0,49 0,4 0,58 0,37
P <0,0001 0,002 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001
rho 0,23 - 0,5 0,44
P 0,0006 NS <0,0001 <0,0001
rho 0,3 0,24
P <0,0001 0,001
MSP1p19
MSP4p20
MSP5
R23 MSP4p20MSP5
une production en quantité importante. Il n’y a pas de différence significative - P = 0,11 -
observée entre les deux zones d’endémie.
Les analyses de colinéarité des réponses Ac associées à ces différents Ag ont été faites en
utilisant le test de corrélation de Spearman et sont résumées sur le tableau VII. Globalement,
les réponses anti-MSP sont liées, avec un pourcentage de corrélation compris entre 37% et
58% selon les Ag et les villages. Nous notons également que R23 induit une réponse Ac
colinéaire avec celles des MSP, sauf avec les IgG anti-MSP4p20 à Dielmo - P = 0,47 -,
Tableau VII: Colinéarités entre les réponses antigéniques liées aux différents
candidats vaccins étudiés
1.2) Impact des classes d’âge sur les réponses anticorps
Après l’analyse des réponses globales pour les deux zones d’endémie étudiées, les taux d’Ac
doivent être étudiés en fonction des caractéristiques des populations.
La première des analyses à réaliser est celle portant sur le lien avec l’âge ou plus précisément,
avec les classes d’âge prédéfinies comme correspondant à des stades d’acquisition de
l’immunité (McGregor, 1952) (Rogier, 1993) (Perraut, 2005 B).
� La classe 1 est celle des plus jeunes - moins de 15 ans à Ndiop et moins de 6 ans à
Dielmo -. L’immunité contre les cas graves de la maladie est en cours d’acquisition.
� La classe 2 correspond quant à elle à des individus plus âgés mais encore relativement
jeunes - 15 à 29 ans à Ndiop et 6 à 14 ans à Dielmo -. Ils ont déjà acquis cette immunité
contre les cas graves et une immunité contre les fortes parasitémies est en train de s’établir.
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Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo
médiane 3,98 2,86 3,81 8,14 2,34 4,15 1,00 1,00
moyenne 6,34 3,61 5,34 8,18 3,84 4,91 1,85 1,36
prévalence 82% 68% 66% 84% 58% 79% 17% 11%
médiane 11,98 2,04 8,86 10,12 2,61 2,81 1,00 1,00
moyenne 10,37 3,83 8,00 8,86 4,24 3,35 2,55 1,87
prévalence 88% 50% 83% 86% 63% 67% 36% 19%
médiane 13,43 7,30 8,05 8,37 3,05 3,58 1,31 1,00
moyenne 11,76 7,91 7,14 8,05 4,96 4,47 3,93 2,61
prévalence 90% 80% 87% 89% 78% 76% 42% 28%
<0,0001 <0,0001 0,0009 NS NS NS 0,0002 NS
MSP5 R23
classe 1
MSP1p19
classe 2
classe 3
p (Kruskal Wallis)
MSP4p20
� La classe 3 - plus de 30 ans à Ndiop et plus de 15 ans à Dielmo - correspond aux
adultes ayant acquis ces 2 types d’immunité.
Les réponses ELISA obtenues selon ces classes d’âge sont représentées par le tableau VIII et
la figure 20.
Tableau VIII : Réponses Ac (rDO) par village et par classe d’âge
Figure 20 : Répartition des réponses Ac (rDO) par village et par classe d’âge
Deux remarques saillantes peuvent être soulignées d’emblée au vu de ces résultats - ie sans
analyse statistique -.
� Globalement, pour les quatre constructions vaccinales, les plus fortes incidences de
répondeurs sont observées chez les adultes ayant acquis une prémunition (classe 3). Pour
Ndiop et Dielmo respectivement, on observe des taux de réponses positives de 90% et 80%
Dielmo Ndiop
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pour MSP1p19, 87% et 89% pour MSP4p20, 78% et 76% pour MSP5 et 42% et 28% pour
R23. Mais ils présentent également les plus hautes intensités de réponses, avec des moyennes
qui sont respectivement pour Ndiop et Dielmo de 11,76 et 7,91 pour MSP1p19, de 7,14 et
8,05 pour MSP4p20, de 4,96 et 4,47 pour MSP5 et de 3,93 et 2,61 pour R23. Cela est valable
dans les deux villages pour tous les Ag, à l’exception de MSP5 à Dielmo où les réponses des
classes 1 et 3 sont sensiblement les mêmes. Un avantage pour la classe 1 est même noté, celle-
ci présentant en effet un taux de répondeurs de 79% et une moyenne de 4,91.
� La réponse anti-MSP1p19 augmente très fortement avec l’âge, les classes 1 ayant des
réponses ne dépassant pas 9 et 4,5 dans 75% des cas à Ndiop et Dielmo respectivement, alors
que pour les classes 3 le troisième percentile atteint des valeurs de l’ordre de 17 et 12,5
respectivement.
En utilisant le test de Kruskal-Wallis pour déterminer statistiquement la dépendance de la
réponse par rapport à l’âge, on note que malgré les conclusions que l’on pouvait tirer en
première approche, la dépendance à l’âge observée n’est pas toujours significative.
En ce qui concerne la réponse Ac anti-MSP1p19, la dépendance à l’âge est bien
statistiquement significative - P < 0,0001 pour les 2 villages - et les médianes et moyennes
sont en augmentation notable au fur et à mesure que l’immunité s’acquiert. Mais au lieu de
trois groupes bien distincts, il y en aurait plutôt deux dans les deux villages et ceux-ci ne
seraient pas les mêmes. A Ndiop, la réponse évolue énormément entre la classe 1 et la classe 2
- médiane à 3,98 et 11,98 et moyenne à 6,34 et 10,37 respectivement -, et moins entre la
classe 2 et la classe 3 - médiane à 11,98 et 13,43 et moyenne à 10,37 et 11,76 respectivement -
. A Dielmo, les classes 1 et 2 ont des caractéristiques similaires - médiane à 2,86 et 2,04 et
moyenne à 3,61 et 3,83 respectivement -, mais une très nette différence est observée entre les
classes 2 et 3 - médiane à 2,04 et 7,3 et moyenne à 3,83 et 7,91 respectivement -. Cette
différence de profil est d’autant plus étonnante que si l’on considère l’âge « charnière », il est
le même dans les deux cas, à savoir 15 ans. Cela correspond bien à l’âge défini selon les
critères cliniques pour Ndiop mais pour Dielmo, celui-ci n’est que de 6 ans.
La réponse Ac contre MSP4p20 est quant à elle différente dans les deux villages. A Ndiop, la
dépendance à l’âge est significative - P = 0,0009 - et l’on observe une très nette augmentation
du nombre de répondeurs avec l’âge. Celui-ci passe de 66% pour la classe 1 à 83% pour la
classe 2 et 87% pour la classe 3. Cependant, au niveau des médianes et moyennes, c’est la
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classe 2 qui présente les intensités les plus élevées avec respectivement 8,86 et 8,00, contre
8,05 et 7,14 pour la classe 3. La classe 3, correspondant à l’acquisition de l’immunité anti-
parasite, semble donc correspondre au pic d’Ac anti-MSP4p20 en zone de mésoendémie. A
Dielmo, la dépendance à l’âge n’est plus considérée comme significative - P = 0,57 - et les
taux de répondeurs et leurs intensités de réponses sont sensiblement les mêmes avec
respectivement pour les trois classes : 84%, 86% et 89% de répondeurs et 8,18, 8,86 et 8,05
de moyenne. Cependant bien que non significatif, le profil observé à Ndiop est valable à
Dielmo avec une classe 2 présentant les plus fortes médianes et moyennes : 10,12 et 8,86,
contre 8,37 et 8,05 respectivement pour la classe 3.
S’agissant des Ac anti-MSP5, la dépendance à l’âge n’est pas significative dans les deux
villages en tenant compte de la correction de Bonferroni qui diminue la valeur seuil à 0,01 -
P = 0,045 à Ndiop et 0,24 à Dielmo -.
Enfin, la réponse anti-R23 présente un profil remarquable à Ndiop. Le taux de répondeurs
passe de 17% à 42% soit un nombre de répondeurs plus que doublé entre la classe 1 et la
classe 3. De plus cette dépendance avec l’âge est statistiquement significative - P = 0,0002 -.
La médiane n’est plus à sa valeur minimale pour la classe 3 - 1,31 - et la moyenne passe de
1,85 à 3,93. En zone de mésoendémie, l’acquisition d’Ac anti-R23 semble donc très nettement
dépendre de l’immunité anti-parasite et non pas de l’immunité anti-formes graves. Le même
profil est observable à Dielmo mais de façon non significative - P = 0,3 -, la médiane ne
décollant jamais de 1,0. Cependant le nombre de répondeurs passe de 11% à 28%, ce qui est
également plus que doublé, bien que restant très faible, et la moyenne de 1,36 pour la classe 1
à 2,61 pour la classe 3.
1.3) Impact de la parasitémie circulante sur les réponses anticorps (Dielmo)
Dans cette analyse, nous avons considéré uniquement les prélèvements des habitants de
Dielmo. Les individus sains ou avec une parasitémie circulante y sont en quantité quasi-
similaire - 54% et 46% respectivement -. A Ndiop, les personnes parasitées sont très
minoritaires - 17% - et les personnes avec une parasitémie relativement élevée quasiment
inexistantes - 2% -, minorant considérablement la représentativité de la variable « parasites
circulants » dans ce village.
Les résultats observés à Dielmo sont présentés sur le tableau IX et la figure 21.
75
MSP1p19 MSP4p20 MSP5 R23
médiane 8,03 8,76 3,99 1,00
moyenne 8,40 8,23 4,60 2,71
prévalence 82% 88% 76% 29%
médiane 4,00 8,37 2,86 1,00
moyenne 4,89 7,66 3,98 2,01
prévalence 67% 86% 75% 20%
médiane 2,47 11,03 2,66 1,00
moyenne 3,89 9,24 4,17 1,43
prévalence 59% 86% 64% 14%
<0,0001 NS NS NSP (Kruskal Wallis)
0
F1+F2
F3+F4+F5
Tableau IX : Réponses anticorps en fonction de l’importance de la parasitémie circulante
asymptomatique à Dielmo.
Figure 21 : Répartition des réponses Ac en fonction de l’importance de la parasitémie
circulante asymptomatique à Dielmo.
Globalement, nous observons une baisse du nombre de répondeurs au fur et à mesure que la
parasitémie circulante augmente. Pour MSP1p19, les personnes non parasitées répondent
avec une prévalence de 82%, contre 67% pour les faiblement parasitées et 59% seulement
pour les personnes avec une parasitémie conséquente. Pour MSP5, nous observons
respectivement une prévalence de 76%, 75% et 64%. Quant à R23, le taux de répondeurs est
respectivement de 29%, 20% et de seulement 14% pour les individus avec une parasitémie de
type F3 et plus. Cependant, ces différences entre les groupes ne sont significatives que pour
MSP1p19 - P < 0,0001 -, le test de Kruskal Wallis ne donnant pas de résultat concluant pour
MSP5 et R23 - P = 0,28 et 0,29 respectivement -. MSP4p20 présente quant à lui la
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Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo
médiane 8,73 5,69 6,91 8,82 2,71 3,31 1,00 1,00
moyenne 9,27 6,94 6,68 8,32 4,23 4,35 2,47 2,40
prévalence 86% 74% 78% 89% 64% 74% 27% 25%
médiane 8,67 3,34 6,69 8,88 2,66 3,27 2,18 1,00
moyenne 9,15 5,20 6,98 7,95 4,84 4,11 4,20 2,10
prévalence 90% 64% 77% 86% 73% 71% 53% 14%
NS NS NS NS NS NS 0,002 NS
MSP1p19 MSP4p20 MSP5 R23
Hb AA et AC
Hb AS
P (Mann Withney)
particularité d’avoir un taux de répondeurs qui ne varie pratiquement pas avec la parasitémie -
de 88% à 86% - et aucune dépendance significative avec celle-ci n’est trouvée - P = 0,27 -.
En ce qui concerne les moyennes des réponses obtenues, c’est surtout contre les constructions
vaccinales MSP1p19 et R23 que l’on note une diminution très nette, les moyennes passant de
8,4 et 2,71 respectivement pour les personnes non parasitées à 3,89 et 1,43 pour les individus
avec une parasitémie relativement élevée. Aucune diminution franche n’est observée
concernant la réponse anti-MSP5 - de 4,6 à 4,2 -. En ce qui concerne la réponse Ac anti-
MSP4p20, la moyenne des réponses varie d’un groupe à l’autre de façon non significative
donc ininterprétable.
1.4) Impact de l’hémoglobine AS sur les réponses anticorps
Nous avons vu précédemment (cf partie I § 3.1) que l’hémoglobine des individus
drépanocytaires hétérozygote AS induit une protection naturelle partielle contre l’infection
palustre. Cela est dû, entre autre, à la forme des GR qui lui est liée. Mais cela n’est pas le seul
facteur générateur de protection et tous les autres facteurs contribuant à la résistance observée
ne sont peut être pas encore connus. Il est donc intéressant de visualiser les résultats Ac selon
les profils d’hémoglobine afin de détecter une éventuelle différence de réponse.
Les résultats sont présentés dans le tableau X.
Tableau X : Les taux d’anticorps suivant le type d’hémoglobine :
drépanocytaire hétérozygote AS ou normale
77
Pour les réponses anti-MSP, nous n’observons au vu de ces résultats aucune tendance globale,
les prévalences et intensités de réponses oscillant dans les deux sens suivant les
caractéristiques observées et les villages. Mais surtout, aucune de ces variations n’est
significative.
Pour les réponses Ac anti-R23, les deux villages donnent des résultats contradictoires.
Cependant, une différence significative entre les réponses Ac anti-R23 des individus AS
versus celles des individus « sains » est obtenue pour Ndiop (cf figure 22).
Figure 22 : Répartition des taux d’IgG spécifiques suivant le type d’hémoglobine à Ndiop
Dans ce village, la réponse anti-R23 augmente très fortement, la prévalence passant de 27% à
53% pour les personnes drépanocytaires AS - P = 0,002 -, taux dépassant tous ceux observés
jusqu’à présent pour l’Ag R23. Comme le montre la figure 22, l’augmentation de la réponse
en Ac anti-R23 est très nette. Le profil inverse est observé à Dielmo - diminution de 9% de la
prévalence - mais il n’est pas significatif - P = 0,99 -. Cependant, les profils observés à Ndiop
du point de vue de l’influence du type d’hémoglobine sont plus représentatifs que ceux
observés à Dielmo. En effet, la population drépanocytaire AS étudiée est deux fois plus
importante à Ndiop qu’à Dielmo - 14% contre 7,5% -.
2) Relations avec la protection clinique
Grâce au suivi médical permanent qui avait lieu sur les sites d’étude, les relations entre les
réponses Ac naturelles associées aux candidats vaccins et la protection clinique observée ont
pu être étudiées. Pour ce faire, des régressions de Poisson ont été réalisées afin de déterminer
les risques relatifs de faire des accès palustres sur les 5,5 mois suivant le prélèvement sanguin.
78
Les réponses en rDO liées aux candidats vaccins, l’âge, le type d’hémoglobine, la parasitémie
et le sexe ont été testés et analysés comme cofacteurs dans les modèles de régressions
multiples.
Le cofacteur « type d’hémoglobine » n’a été trouvé comme améliorant le modèle d’étude du
risque relatif de faire des accès palustres que rarement, et uniquement pour les habitants de
Dielmo. Quant aux cofacteurs « parasitémie » et « sexe de l’individu », ils n’ont jamais été
trouvés comme déterminants dans les modèles de Poisson liés aux candidats vaccins.
Les réponses Ac ont été analysées soit comme variable continue, soit dichotomisée, selon des
seuils définis compte tenu de la distribution des données. Pour chaque Ag et chaque zone
d’endémie, le modèle le plus représentatif a été recherché selon les critères d’Akaïké (AIC).
Les corrélations ont été étudiées dans les deux villages.
Cependant, les relations obtenues pour le village de Ndiop sont les plus significatives pour
cette étude. En effet, le nombre d’accès palustres y est plus important et leur répartition plus
large permet une meilleure analyse statistique. A Ndiop, pour 203 personnes répondant aux
critères de suivi régulier, 199 accès palustres ont été recensés, soit une incidence totale
moyenne de 6,64 accès/1000pers/jour - l’incidence est le nombre d’accès palustres divisé par
le nombre de jours de suivi -. A Dielmo, seulement 51 accès palustres ont été répertoriés, pour
163 personnes. Cela représente une incidence de 1,99 accès/1000pers/jour, soit 3,3 fois plus
faible qu’à Ndiop.
2.1) Corrélations observées à Ndiop, zone de mésoendémie
Dans le village de Ndiop, le risque d’accès palustres par tranche d’âge pour les 5,5 mois
étudiés - de mi-juillet à fin décembre 2002 - est réparti comme suit. Les individus âgés de 15 à
29 ans ont un risque 2,75 fois plus important que ceux de plus de 30 ans de faire un accès
palustre - P = 0,004 -. Quant aux enfants de 2 à 14 ans, leur risque est 13,10 fois plus élevé
que pour les adultes de plus de 30 ans - P < 0,001 -.
Tenant compte de cet impact de l’âge, la réponse en Ac anti-MSP1p19 étudiée en continu ou
avec un seuil à 7 a été trouvée associée à la protection clinique (cf tableau XI). Selon les
critères d’AIC, le modèle le plus représentatif est celui dichotomisé à 7 avec, à âge égal, un
risque de faire un accès, si ce seuil d’Ac n’est pas présent, augmenté d’un facteur 1,587.
79
Tableau XI : Régressions de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres
en fonction de la réponse Ac anti-MSP1p19 à Ndiop
(RR : risque relatif, 95%CI : intervalle de confiance, P : significativité)
RR 95%CI P RR 95%CI P
MSP1p19
Continu 1,041 1,012-1,070 0,005
Dichotomisé
≥7 1
<7 1,587 1,168-2,157 0,003
Age (ans) <0,001 <0.001
≥30 1 1
15-29 2,567 1,293-5,097 0,007 2,598 1,309-5,154 0,006
2-14 10,704 5,868-19,527 <0,001 11,124 6,128-20,193 <0.001
Deviance 241,3 240,7
AIC 243,3 242,7
Modèle 1 Modèle 2
En représentant graphiquement la répartition des accès palustres par classe d’âge selon une
dichotomie des niveaux d’Ac anti-MSP1p19 à 7 (cf figure 23), on observe très clairement les
résultats présentés dans le modèle de Poisson. L’échelle des incidences est très nettement
diminuée au fur et à mesure que l’âge augmente. De plus, elle est toujours supérieure pour les
personnes présentant moins d’Ac anti-MSP1p19 - exception faite des deux premiers mois de
suivi dans la classe d’âge ≥ 30 ans -.
Figure 23 : Incidence des accès palustres par classe d’âge et importance de la réponse Ac anti-
MSP1p19 à Ndiop. En noir les réponses < 7 rDO, en gris ≥ 7.
80
En revanche, le modèle s’est révélé non significatif dans le cas d’une dichotomie
répondeur/non répondeur - P = 0,81 -. Il ne suffit donc pas d’avoir des Ac anti-MSP1p19 pour
avoir un risque réduit d’accès palustre. Il faut également en avoir en quantité importante.
Concernant la réponse anti-MSP4p20, aucun des quatre modèles étudiés - continu, seuil à 6, 4
et 2 - n’a permis d’obtenir une relation entre les Ac anti-MSP4p20 et la protection clinique à
5,5 mois. Tous les modèles ont renvoyé des résultats non significatifs.
Les Ac anti-MSP5 sont associés à la protection clinique lorsque le taux est étudié en variable
continue (cf tableau XII). Pour une perte de 5 unités de rDO, le risque de faire un accès
palustre est augmenté d’une valeur de 1,26, selon le calcul 1,047 puissance 5. Cette
corrélation entre la réponse Ac et la protection clinique est significative - P = 0,022 -.
Tableau XII : Régression de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres
en fonction de la réponse Ac anti-MSP5 à Ndiop
RR 95%CI P
MSP5
Continu 1,047 1,007-1,089 0,022
Age (ans) <0,001
≥30 1
15-29 2,649 1,336-5,254 0,005
2-14 12,613 7,010-22,692 <0,001
Deviance 243,8
AIC 245,8
En revanche, la stratification en répondeur/non répondeur, également testée, n’a pas donné de
résultat significatif - P = 0,74 -. Aussi, comme pour MSP1p19, il semblerait qu’il ne suffise
pas d’avoir des Ac anti-MSP5 pour être protégé, encore faudrait-il que ceux-ci soient en
quantité suffisante.
Du point de vue de la répartition des rDO, aucun autre seuil n’a pu être déterminé et donc
étudié, si ce n’est le seuil à 2 représentant les répondeurs/non répondeurs. Il n’était alors pas
possible de réaliser le même type de graphique que pour MSP1p19 afin de visualiser la
protection que confère les Ac anti-MSP5. Des droites moyennes ont donc été tracées, à partir
d’une représentation en nuage de points prenant en compte les rDO et incidences (cf figure
81
y = -0,0008x + 0,0207
y = -0,0001x + 0,0039
y = -4E-05x + 0,0015
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0,018
0,02
0 5 10 15 20 25
anti-MSP5 rDO
inci
denc
e ac
cès
palu
stre
s
Linéaire (IncidJASOND 2-14 ans)
Linéaire (IncidJASOND 15-29 ans)
Linéaire (IncidJASOND ≥30ans)
24). Ces 3 droites, calculées pour les 5,5 mois d’étude, sont toutes décroissantes. Cela
implique que, dans chaque classe d’âge, l’augmentation du taux d’Ac est associée à la baisse
du nombre d’accès palustres. Nous notons également que ceci est encore plus marqué pour la
classe d’âge 1 - 2-14 ans -, et beaucoup moins pour les deux autres classes d’âge.
Figure 24 : Incidence moyenne des accès palustres par classe d’âge et importance de la
réponse Ac anti-MSP5 à Ndiop
Aucune association n’a pu être mise en évidence dans ces modèles de protection clinique pour
les réponses Ac associées à R23, qu’elles soient étudiées en continu ou avec un seuil à 2.
En conclusion, pour le village de Ndiop, les taux d’Ac anti-MSP4p20 et anti-R23 ne sont pas
associés à la protection clinique à long terme en analyse prospective dans la série de 2002. En
revanche, des taux élevés d’Ac anti-MSP1p19 et anti-MSP5 sont associés significativement à
une baisse de la morbidité.
2.2) Corrélations observées à Dielmo, zone d’holoendémie
Concernant le village de Dielmo, le risque d’accès palustre par tranche d’âge pour les 5,5
mois étudiés - de mi-juillet à fin décembre 2002 - est réparti de façon très inégale. En effet,
les enfants de moins de 7 ans présentent 88 fois plus de risque de faire un accès palustre qu’un
individu de plus de 15 ans ! Pratiquement tous les accès palustres sont recensés dans cette
classe d’âge. Pour les 18 individus de cette tranche d’âge, on dénombre 38 accès palustres -
82
RR 95%CI P
MSP1p19
Dichotomisé
≥7 1
<7 5,179 1,194-22,466 0,028
Age (ans) <0.001
≥15 1
7-14 5,525 1,654-18,454 0,006
2-6 41,741 13,975-124,680 <0.001
Hb
AA 1
AS 0,897 0,339-2,375 0,826
scoretest Hb 0,026
Deviance 105,2
AIC 109,2
soit plus de 2 par enfant en moyenne -, contre 9 accès palustres pour les 7-14 ans qui sont au
nombre de 31 - moyenne de 0,29 accès palustre par jeune - et seulement 4 accès palustres
pour les individus de 15 ans ou plus, représentant la plus grande majorité de l’étude avec 114
sujets - moins de 0,04 accès palustre par adulte en moyenne -.
Les analyses de corrélation avec le nombre d’accès palustres obtenues pour Dielmo sont donc
à considérer avec précaution par rapport à celles obtenues pour Ndiop. Un seul adulte de plus
ou de moins faisant un accès répertorié peut éventuellement modifier complètement les
résultats. De plus, le faible nombre d’individus présentant des accès palustres réduit fortement
la puissance du test et donc sa fiabilité.
Concernant le taux d’Ac anti-MSP1p19 en tenant compte de l’âge, nous ne trouvons pas de
relation significative avec la protection clinique s’il est étudié en continu ou avec des seuils à
11, 9, 8, ou 2. Le seuil à 7, identique à celui applicable à l’étude à Ndiop, ne fournit pas non
plus avec l’âge de résultat significatif mais il se trouve à la limite de la signification - P = 0,06
-. Si l’on inclut le type d’hémoglobine dans ce modèle, celui-ci se trouve amélioré - Score test
Hb : P = 0,026 - et présente le meilleur critère d’AIC - 111,2 alors que les autres modèles sont
au minimum à 129,5 -. Une corrélation significative est alors obtenue entre la réponse Ac
anti-MSP1p19 et la protection clinique - P = 0,028 - (cf tableau XIII). Elle est d’ailleurs
relativement élevée car les individus ayant un taux d’Ac inférieur à 7 présentent 5,179 fois
plus de risque de faire un accès palustre que ceux ayant un rDO supérieur ou égal à ce seuil.
Tableau XIII : Régression de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres
en fonction de la réponse Ac anti-MSP1p19 à Dielmo
83
En représentant graphiquement, comme précédemment pour l’étude sur les habitants de
Ndiop, l’incidence des accès palustres en fonction de l’âge et de la réponse anti-MSP1p19
avec un seuil à 7, nous retrouvons le même type de courbes que précédemment (cf figure 25).
L’incidence diminue avec l’âge et avec les taux élevés d’Ac anti-MSP1p19.
Figure 25 : Incidence des accès palustres par classe d’âge et importance de la réponse Ac anti-
MSP1p19 à Dielmo. En noir les réponses < 7 rDO, en gris ≥ 7.
Le nombre d’individus composant les différentes catégories est remarquable :
� Pour les 2-6 ans, sur les 18 enfants, seuls 3 présentent un taux d’Ac supérieur à 7 en
rDO, et sur ces 3 enfants, 2 ont subi des crises de paludisme. 11 des 15 enfants ayant une rDO
inférieure à 7 ont également été malades ;
� Pour les 7-14 ans, 5 individus présentent un taux d’Ac supérieur à 7 et aucun n’a été
malade, alors que 26 individus ont un taux inférieur au seuil, dont 6 ont eu des crises de
paludisme ;
� Pour les personnes de plus de 15 ans, 62 individus présentent un taux d’Ac supérieur à
7, dont 1 ayant eu un accès palustre, contre seulement 52 personnes ayant une réponse
inférieure au seuil, avec 3 personnes ayant souffert du paludisme.
Aussi, passé l’âge « charnière » de 15 ans, plus de la majorité des individus présente un taux
d’Ac anti-MSP1p19 très élevé, résultat observé comme rare chez les jeunes enfants. Nous
notons donc une acquisition tardive de ces Ac.
Concernant la réponse anti-MSP4p20, aucun des quatre modèles étudiés - continu, seuil à 8, 5
et 2 - n’a permis d’obtenir une relation entre les Ac anti-MSP4p20 et la protection clinique à
84
5,5 mois. Cette absence de signification avait déjà été observée lors de l’étude de la protection
clinique à Ndiop.
Concernant la réponse anti-MSP5, en plus des rDO en continu, différents seuils ont été testés
avec des valeurs de 9, 5 et 2. Seul le seuil à 2, correspondant aux répondeurs/non répondeurs a
permis d’obtenir une corrélation significative entre la réponse Ac détectée et la protection
clinique observée - P = 0,031 -. Les individus non répondeurs en Ac anti-MSP5, à Dielmo,
présentent un risque de faire un accès palustre accru d’un facteur 1,905 (cf tableau XIV).
Tableau XIV : Régression de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres
en fonction de la réponse Ac anti-MSP5 à Dielmo
RR 95%CI P
MSP5
Dichotomisé
≥2 1
<2 1,905 1,061-3,419 0,031
Age (ans) <0,001
≥15 1
7-14 8,086 2,489-26,276 <0,001
2-6 89,854 32,058-251,848 <0,001
Deviance 124,9
AIC 126,9
Graphiquement, ces résultats fournissent les courbes d’incidences attendues, avec des
intensités moindres quand l’âge augmente et en présence d’Ac anti-MSP5 (cf figure 26).
Notons que les incidences quasi nulles observées pour les répondeurs ayant plus de 7 ans
peuvent être entièrement ramenées à zéro si l’on considère le seuil à 5. Ce seuil a été trouvé
comme non significatif car dans la classe 1, il ne fournit pas de résultat concluant, les courbes
s’entrecroisant. Cependant, dans les deux autres classes d’âge, plus aucun accès palustre n’est
à déplorer chez les 46 individus ayant atteint ce seuil critique.
85
Figure 26 : Incidence des accès palustres par classe d’âge et importance de la réponse Ac anti-
MSP5 à Dielmo. En noir les réponses < 2 rDO, en gris ≥ 2.
Enfin, concernant la réponse anti-R23, aucune relation n’a été obtenue entre le taux ou la
présence d’Ac et la protection clinique.
En conclusion, nous avons trouvé qu’à Dielmo, zone d’holoendémie, comme à Ndiop, zone
de mésoendémie, une corrélation existe entre la protection clinique et le taux d’Ac anti-
MSP1p19 avec une dichotomie à 7. Nous avons également mis en évidence dans les deux cas
une corrélation avec la réponse Ac anti-MSP5 et la protection clinique. Enfin, aucune
association avec la protection clinique à long terme n’a pu être trouvée concernant les
réponses Ac anti-MSP4p20 et anti-R23, et cela à Dielmo comme à Ndiop.
3) Prévalence des IgG : classe et sous classes
Bien que notre étude concerne les réponses Ac contre des candidats vaccins bien définis, il est
toujours important d’étudier les réponses Ac « globales », classes et sous classes. Les
réponses Ac contre les Ag totaux du mérozoïte ont donc été étudiées.
3.1) Les IgG totales
Il est utile de rappeler que ce travail est basé sur une évaluation d’un « titre ». Celui-ci est
déterminé à partir d’un calcul basé sur une courbe de régression logistique. Elle est obtenue à
partir de : i) sept dilutions du SHI et ii) un titre arbitraire fixé pour ce contrôle positif. Les
86
« unités-titres » ainsi obtenues pour les sérums étudiés sont donc ramenées à la valeur de ce
contrôle. Plus on s’éloigne de la courbe de régression de celui-ci - meilleurs répondeurs que le
standard - et plus les écart-types augmentent. Les moyennes ne sont donc pas exploitables car
influencées par les très grandes valeurs à grande incertitude. Il convient donc de travailler sur
les médianes pour avoir des résultats fiables. Les unités titres obtenues sont en réalité des
classements de hiérarchisation des titres et non pas l’obtention des valeurs réelles. Une très
faible unité titre n’implique donc pas forcément une absence d’IgG mais peut simplement
signifier que comparativement au titre du standart positif, le titre du sérum étudié est très
faible. Cependant, malgré ces précautions, cette hiérarchisation calculée en unité titre est très
profitable. En effet, nous ne travaillons pas sur des unités correspondant à une seule dilution
comme nous l’avons fait précédemment, mais réellement sur des unités prenant en compte le
titre du sérum. Cette stratégie d’analyse présente un avantage significatif car deux valeurs
identiques de DO à une dilution donnée peuvent être associées à des titres différents.
Cette stratégie découle de la standardisation des méthodes pour les essais cliniques au niveau
international, proposée à la suite des réunions de concertation internationale suscitées par
l’OMS (Dr MP Kieny et Z. Reed).
Concernant l’étude ELISA des IgG totales, il était impossible de travailler aux dilutions
habituellement utilisées pour les IgG spécifiques ou les sous-classes, les quantités d’IgG étant
incomparablement plus importantes. Travailler ne serait-ce qu’au 1/1000 revient à saturer la
plaque d’étude - DO à 3,5 - et les résultats demeurent par conséquent ininterprétables. C’est la
raison pour laquelle ce volet de l’étude a été réalisé aux dilutions 1/5000 et plus, afin de
pouvoir obtenir une courbe de régression pour le SHI, indispensable à l’établissement des
unités titres avec la méthode du Dr Remarque. Afin de marquer cette différence d’échelle du
niveau de la réponse, nous avons attribué à la valeur du SHI un titre arbitraire de 1000, en lieu
et place de la valeur de 100 habituellement utilisée.
Aux dilutions choisies, les DO des sérums étudiés en IgG totales varient de 0,198 à 3,159
avec une médiane des réponses à 2,841. La gamme de réponses est donc correcte pour réaliser
l’étude. En unités titres, cela revient à un minimum de 4 et un maximum de 6748, avec une
médiane à 273, et cela pour les 88 personnes de la sous cohorte des habitants de Ndiop non
parasités. Nous pouvons analyser les évolutions de ces résultats en fonction de l’âge, de
l’hémoglobine et étudier les relations avec les Ac des candidats vaccins.
87
3.1.1) Impact de l’âge sur les taux d’IgG
Dans cette sous cohorte d’étude, les 3 groupes d’âges sont représentés dans des proportions
similaires : 34 enfants de 2 à 14 ans - classe 1 -, 26 personnes de 15 à 29 ans - classe 2 - et 28
de plus de 30 ans - classe 3 -. Si l’on observe l’évolution de la médiane en fonction de ces
classes d’âges, on obtient une augmentation importante d’un groupe à l’autre (cf figure 27).
La médiane prend une valeur de 69 pour la classe 1, 372 pour la classe 2 et atteint 756 pour la
classe 3. Cette augmentation significative des réponses avec l’âge - P < 0,0001, test de
Kruskal Wallis -, est parfaitement logique car les classes d’âges ont été stratifiées selon le
statut immun dont dépend le taux d’IgG. Ce résultat valide l’utilisation du modèle des unités
titres.
Figure 27 : Augmentation de la réponse IgG visant le mérozoïte par classe d’âge
3.1.2) Impact de l’hémoglobine AS sur les taux d’IgG
Concernant l’impact de l’hémoglobine drépanocytaire hétérozygote AS sur la réponse IgG
totale, nous n’obtenons rien de concluant, la différence de réponse entre les personnes à profil
AS et les autres n’étant pas significative - P = 0,29, test de Mann Withney -.
3.1.3) Interrelation entre les réponses IgG liées aux candidats vaccins et les taux d’IgG
Le taux de corrélation le plus fort qui a été observé avec les IgG totales ciblant les Ag du
mérozoïte est celui lié aux Ac anti-MSP1p19 - 71% -. La réponse anti-MSP4p20 induit un
taux de corrélation de 65% avec le taux total d’IgG visant le mérozoïte. Pour les Ac anti-
MSP5, celui-ci est de 59%. Les Ac anti-R23, qui sont des Ac du GRp et non pas du
88
mérozoïte, présentent pourtant un taux de corrélation de 54% avec les IgG visant le
mérozoïte. Toutes ces corrélations sont hautement significatives - P ≤ 0,0002, test de
Spearman -.
La valeur élevée trouvée pour la corrélation entre des Ac spécifiques d’un Ag du GRp et le
taux d’IgG total visant les Ag du mérozoïte, montre bien que les réponses Ac dans le cas du
paludisme sont très variées mais également très liées. Les réponses IgG contre le mérozoïte et
contre le GRp ne sont donc pas clairement distinctes. Cela avait déjà été visualisé par l’étude
des colinéarités des réponses Ac dues aux différents Ag (cf § 1.1).
3.1.4) Corrélation entre le taux d’IgG et la protection clinique
Enfin, nous avons étudié à l’aide d’une régression de Poisson le taux d’IgG contre les Ag
totaux du mérozoïte en fonction du nombre d’accès palustres observés dans le village de
Ndiop. Cette étude a été réalisée afin de déterminer si ce taux peut à lui seul expliquer ou non
la protection clinique. Lorsque le test est réalisé en analyse univariée, nous trouvons une
corrélation entre le taux d’IgG et le nombre d’accès palustres - P < 0,001, RR = 1,0001 par
unité titre perdue -. Cependant, quand l’âge est injecté dans le modèle, le taux d’IgG n’est
plus significatif - P = 0,91 -. La protection clinique ne peut donc pas être expliquée
uniquement à partir de la quantité d’IgG visant les Ag du mérozoïte. Elle relève donc d’un
processus plus complexe.
3.2) Les IgG non cytophiles
Nous avons ensuite testé en ELISA les sérums du point de vue de leur réponse en IgG non
cytophiles, les IgG2 et IgG4. Tous les sérums de la sous cohorte d’étude « Ndiop non
parasités » ont donc été analysés en duplicata à la dilution 1/100. Nous avons alors obtenu des
réponses extrêmement faibles, voire bien souvent inexistantes.
Pour les IgG2, le maximum de DO observé au 1/100 est 1,341, avec une médiane à 0,065 et
une moyenne obtenue à 0,123. Ces résultats équivalent à seulement 3 sérums avec des IgG2
détectables à cette dilution, pourtant minimale.
89
En ce qui concerne les IgG4, nous avons trouvé des résultats similaires. Le maximum des
réponses est à 0,869, avec une médiane de 0,036 et une moyenne à 0,089. Seuls 4 sérums ont
des réponses différentes du bruit de fond.
Nous pouvons donc conclure au vu de ces résultats qu’il n’existe pas ou très peu d’IgG non
cytophiles détectables contre les protéines du mérozoïte dans cette étude.
3.3) Les IgG cytophiles
Les IgG cytophiles étant connus comme effecteurs de la réponse Ac protectrice (Garraud,
2003), cette réponse a été étudiée par la technique du Docteur Remarque, à partir de la
dilution 1/200 et avec le SHI fixé à 100 unités titres.
Concernant les IgG1, les réponses obtenues oscillent entre les valeurs de DO de 0,051 et
3,417, avec une médiane à 1,918 et une moyenne de 1,812. Les gammes de dilution sont donc
optimales par rapport à la gamme de DO observée. Les unités titres correspondantes sont
comprises entre 0 et 230, avec une médiane à 22. Quelques sérums contiennent donc plus
d’IgG1 que le SHI mais la grande majorité en présente beaucoup moins. Cependant, à part
quelques exceptions, tous les sérums induisent des DO nettement supérieures au bruit de fond.
Pour les IgG3, nous obtenons des résultats similaires, bien que légèrement plus faibles. Les
DO oscillent entre 0 et 3,313, avec une médiane à 0,631 et une moyenne à 0,954. Là encore, à
quelques exceptions près, tous les sérums induisent des DO nettement supérieures au bruit de
fond. Cependant, le taux d’IgG3 dans le SHI étant proportionnellement encore plus important
que pour les IgG1, les unités titres, variant de 0 à 206, ont une médiane de seulement 6.
Les IgG1 sont donc majoritaires mais les IgG3 sont également très présents dans la réponse
anti-P. falciparum. La très grande majorité des sérums de personnes immunes ou semi
immunes présentent des réponses d’intensité variées mais non négligeables pour ces deux
sous-classes.
90
3.3.1) Impact de l’âge sur les taux d’IgG1 et IgG3
En étudiant l’évolution de ces sous classes en fonction des classes d’âge et donc de
l’acquisition de l’immunité (cf tableau XV et figure 28), nous observons comme attendue une
augmentation importante avec l’âge, et cette dépendance est significative - P < 0,0001 pour
les deux sous classes, test de Kruskal Wallis -. La médiane des réponses augmente de 10 à 55
pour les IgG1 et de 1 à 28 pour les IgG3.
Tableau XV : Visualisation des unités titres des IgG1 et IgG3 visant le mérozoïte
en fonction des classes d’âge
2-14 ans 15-29 ans ≥ 30 ans 2-14 ans 15-29 ans ≥ 30 ans
médiane 10 36 55 1 16 28
maximum 121 215 230 42 206 180
minimum 0 1 1 0 0 0
P (Kruskal Wallis)
IgG1 IgG3
<0,0001 <0,0001
Il est intéressant de noter que dans tous les groupes nous observons des personnes avec de
faibles taux d’IgG1 ou IgG3. Les minimums sont de 0 ou 1 pour tous. Etre prémuni ne
correspondrait donc pas forcément à un fort taux d’IgG1 ou d’IgG3. En étudiant plus
précisément la classe d’âge 1, on note pour les IgG1 un maximum déjà élevé avec une valeur
de 121. En revanche, pour les IgG3, le maximum de la classe 1 n’est que de 42 unités titres.
L’augmentation du taux d’IgG3 semblerait donc mieux liée à l’acquisition de l’immunité que
le taux d’IgG1 mais il ne serait pas suffisant pour autant. Cela semblerait donc être une
combinaison des réponses IgG1 et IgG3 qui permettrait la mise en place d’une prémunition.
91
IgG1 IgG3
72% 71%
P < 0,0001 P < 0,0001
69% 55%
P < 0,0001 P < 0,0001
66% 60%
P < 0,0001 P < 0,0001
48% 48%
P < 0,0001 P < 0,0001
MSP1p19
MSP4p20
MSP5
R23
Figure 28 : Taux d’IgG1 (A) et IgG3 (B) dirigés contre le mérozoïte
selon les classes d’âge
3.3.2) Impact de l’hémoglobine AS sur les taux d’IgG1 et IgG3
Comme pour les IgG totales, nous ne trouvons aucune différence significative due au profil
drépanocytaire AS. Le test de Mann Withney donne des valeurs de P de 0,73 pour les IgG1 et
0,5 pour les IgG3.
3.3.3) Confrontation des réponses IgG contre les candidats vaccins avec les taux d’IgG1 et
IgG3
En étudiant les corrélations avec les candidats vaccins, nous trouvons la même hiérarchisation
que pour les IgG totales, et ce de façon significative - P < 0,0001 pour les différentes
corrélations, test de Spearman - (cf tableau XVI).
Tableau XVI : corrélation des IgG1 et IgG3 avec les candidats vaccins
A B
92
Il est intéressant de noter que les pourcentages de corrélation entre IgG1 et IgG3 n’évoluent
pas forcément dans un sens prévisible.
� MSP1p19, qui induit une réponse majoritairement IgG1, présente le même degré de
corrélation entre ses réponses Ac associées et les deux sous classes d’IgG cytophiles - 72% et
71% -.
� Concernant MSP4p20, qui induit une réponse IgG3 forte, sa réponse Ac associée est
trouvée mieux corrélée aux IgG1 - 69% - qu’aux IgG3 - 55% -. De plus son taux de
corrélation avec les IgG3 est plus faible que celui observé pour MSP1p19 ou MSP5 - 55% vs
71% et 60% respectivement -.
� La réponse anti-MSP5 et la réponse IgG1 sont également mieux reliées entre elles -
66% - que la réponse anti-MSP5 avec celle des IgG3 - 60% -.
� Quant aux Ac anti-R23, le taux de corrélation est le même dans les deux cas, à savoir
48%.
4) Vérification des déplétions
Les différentes analyses ELISA ayant été réalisées, il nous restait une dernière étude à mener :
valider les procédures de déplétions en Ac spécifiques et en quantifier l’efficacité. Cette
information est nécessaire pour l’analyse des réponses obtenues à partir de ces sérums
déplétés dans les tests fonctionnels.
Pour cela, nous avons tout d’abord réalisé des courbes de titration afin de vérifier leur
spécificité et efficacité.
Comme le montre l’exemple sur la figure 29 avec l’analyse en ELISA de la déplétion du SHI
en Ac anti-MSP4p20, les déplétions réalisées « en solution » avec passage sur résine TALON
sont très efficaces du point de vue de la chute du titre et en même temps, très spécifiques. En
effet, seule une légère différence est notée pour les courbes de titration des autres Ac présents
dans le sérum. Comparée à la chute du titre des Ac visée par la déplétion, elle est négligeable.
Nous avons ensuite, par la technique des unités titres du Dr Remarque, quantifié l’importance
de ces déplétions. Les sérums, initiaux et déplétés, ont donc été testés et leurs unités titres
respectives rapportées l’une à l’autre pour en obtenir un pourcentage de déplétion.
93
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800
dilution
DO
ELISA MSP4p20 SHI
ELISA MSP4p20 SHIdéplété anti-MSP4p20
ELISA MSP1p19 SHI
ELISA MSP1p19 SHIdéplété anti-MSP4p20
Figure 29 : Spécificité et efficacité de la déplétion
Détection en ELISA des Ac anti-MSP4p20 et anti-MSP1p19
avant et après déplétion du SHI en Ac anti-MSP4p20.
Les déplétions réalisées avec MSP1p19 - 20 sérums testés -, sont pratiquement totales, avec
un pourcentage moyen de 99,8%. La médiane des unités titres des sérums diminue d’une
valeur initiale de 511 pour les sérums originaux à 1 pour les sérums déplétés.
Concernant les 11 sérums traités avec MSP4p20, la déplétion est là aussi excellente, avec une
moyenne de déplétion obtenue de 99%. La médiane des unités titres des sérums initiaux
diminue après déplétion de 816 à 8.
En utilisant MSP5, le taux de déplétion est plus faible pour les huit sérums testés, bien que
toujours important, avec une valeur moyenne de 74%, correspondant à une diminution de la
médiane des unités titres de 351 à 90 unités.
94
Enfin, bien que n’ayant pas déplété les Ac anti-R23, ceux-ci ont été saturés par la même
méthode. Les résultats ELISA indiquent que cette saturation est restée efficace, même
plusieurs mois après sa réalisation. Trois mois après, les quatorze sérums testés présentent une
inactivité moyenne des Ac anti-R23 de presque 97%. La médiane des unités titres a diminué
d’une valeur de 395 unités à seulement 13.
Nous avons donc un outil et une procédure efficaces pour évaluer le rôle fonctionnel des
candidats vaccins dans la protection clinique via l’étude des sérums déplétés dans les tests
fonctionnels.
95
PARTIE III : RESULTATS
B/ ANALYSE DE LA PHAGOCYTOSE
DEPENDANTE DES ANTICORPS PAR
CHIMILUMINESCENCE
Le premier test fonctionnel étudié est le test de phagocytose dépendante des Ac par les
cellules PNN et détectée par chimiluminescence. Ce test mesure la poussée respiratoire
dépendante des Ac fonctionnels. Les termes « test de phagocytose » et « test de
chimiluminescence » sont généralement utilisés pour le qualifier.
Nous avons au préalable vérifié in vitro par microscopie l’existence de la phagocytose des
préparations mérozoïtaires par les PNN. Après 30 minutes d’incubation des PNN avec la
suspension mérozoïtaire préalablement opsonisée par les Ac du sérum contrôle positif SHI,
nous avons observé une ingestion importante de mérozoïtes et d’hémozoïne par les PNN (cf
figure 30). Ce résultat valide le déroulement de la phagocytose in vitro dans nos conditions
d’étude.
Figure 30 : Phagocytose par les PNN des préparations mérozoïtaires (coloration au Giemsa)
Pour réaliser notre étude, nous avons bénéficié d’un précédent travail. Il avait permis de
définir les quantités de sérums, de suspensions mérozoïtaires - établies comme pouvant être
congelées et poolées avant utilisation - et de PNN à utiliser (Corre, 2003).
L’objectif du travail de cette thèse sur ce test a alors été de s’appuyer sur ces résultats
préliminaires très encourageants pour les développer à un niveau méthodologique solide avec
une exploration systématique des différents paramètres - différents protocoles de préparation
96
des mérozoïtes et PNN ont été évalués -. Une fois les mises au point faites, nous avons
appliqué cette méthodologie à un nombre suffisant de sérums. Le but était d’analyser les
résultats d’un point de vue statistique en fonction de différents paramètres clinico-
épidémiologiques tels que la morbidité, mais également de tester l’importance relative des
différents candidats vaccins dans l’induction du phénomène de poussée respiratoire et de
phagocytose par les PNN.
1) Mises au point réalisées
1.1) Purification des mérozoïtes et validation du protocole
1.1.1) Qualité des mérozoïtes isolés par centrifugation
Le protocole utilisé pour les premières mises au point reposait sur une purification par
centrifugation longue et à vitesse élevée du surnageant de culture parasitaire (cf Matériel et
Méthodes, § 5.1). Cette centrifugation permet d’extraire les mérozoïtes qui n’ont pas encore
réenvahi des GR et « flottent » dans le milieu de culture. Cependant, des débris cellulaires et
de l’hémozoïne contaminent cette préparation.
Une étude réalisée en microscopie électronique a permis d’analyser le contenu de cette
préparation mérozoïtaire. Les deux entités recueillies majoritairement sont des mérozoïtes et
des fragments de globules rouges. Les mérozoïtes ont été visualisés comme étant en
relativement bon état malgré la centrifugation à vitesse élevée (cf figure 31).
Figure 31 : Visualisation d’un mérozoïte par microscopie électronique
Afin d’avoir une autre confirmation de l’intégrité relative des mérozoïtes recueillis, nous
avons effectué une culture parasitaire à partir de ces mérozoïtes et de GR sains - 0,2 mL par
97
puits de culture et 40µL de préparation mérozoïtaire -. Ces derniers sont restés deux jours en
contact avec les GR, dans un milieu propice à l’invasion - 1,2 mL de RPMI-Alb 0,5% - et en
quantité semblable à celle définie pour le test de phagocytose. Ensuite, le milieu de culture a
été renouvelé quotidiennement pour favoriser le développement du parasite - 2,3 mL de
RPMI-Alb 0,5% -. Au bout d’une semaine, pour les six puits testés, réalisés avec deux
préparations mérozoïtaires différentes, une parasitémie de l’ordre de 2% a été mise en
évidence. Elle confirme la viabilité et l’intégrité des mérozoïtes recueillis.
1.1.2) Rôle de l’hémozoïne et des débris cellulaires dans la chimiluminescence
Ayant validé la qualité des mérozoïtes obtenus, nous avons vérifié que l’hémozoïne présente
dans la suspension mérozoïtaire, bien qu’en quantité faible, ne soit pas responsable de la
chimiluminescence observée. Pour ce faire, nous avons au préalable centrifugé la moitié du
milieu de culture disponible, pendant 30 min à 50xg. Cette vitesse faible, ne permettant pas de
sédimenter les mérozoïtes, est suffisante pour la sédimentation des débris cellulaires et de
l’hémozoïne. Le milieu de culture semi-décanté a ensuite été traité de la même manière que le
reste du milieu de culture disponible le jour de l’expérience afin d’obtenir, dans les deux cas,
des préparations mérozoïtaires parfaitement semblables à l’exception de la présence
d’hémozoïne et de débris. Les trois culots ainsi préparés - i) hémozoïne et débris, ii)
mérozoïtes et iii) mérozoïtes avec hémozoïne - ont ensuite été testés simultanément dans le
test de phagocytose.
Une perte totale de spécificité de la réponse dans le cas des débris et de l’hémozoïne a été
observée, le sérum de l’individu naïf fournissant une réponse positive en chimiluminescence.
La présence d’hémozoïne et de débris dans la préparation mérozoïtaire, à cause de la non
spécificité qu’elle engendre, entraîne une légère baisse de la réponse spécifique aux
mérozoïtes. Cependant, celle-ci est parfaitement proportionnelle pour les différents sérums,
permettant l’obtention de ratios de réponses similaires pour les deux types de préparations
mérozoïtaires (cf figure 32).
La méthodologie de ce test préconise de ne pas travailler sur l’intensité de luminescence
détectée mais sur la valeur standardisée obtenue par calcul de ratio - l’ADPm -. Il n’est donc
pas nécessaire de pré purifier les préparations mérozoïtaires pour pouvoir les utiliser en
chimiluminescence.
98
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
hémozoïne mérozoïtes prépurifiés
mérozoïtes avechémozoïne
chim
ilum
ines
cenc
e (r
lu)
sans sérum
SHI (contrôle positif)
sérum naïf
Figure 32 : Comparaison de l’impact de l’hémozoïne et débris cellulaires avec celui des
mérozoïtes purifiés dans le test de phagocytose (profil type)
1.1.3) Purification des mérozoïtes par flottaison sur Percoll
Nous avons également testé une méthode plus « performante » pour la qualité des mérozoïtes.
Elle repose sur une purification par flottaison sur Percoll à 75% dans du PBS 10x.
La culture de parasites, traitée dans son intégralité, est déposée sur le Percoll - 7 mL de
culture sur 3 mL de Percoll 75% - et centrifugée 10 min à 700xg. L’utilisation du Percoll
permet l’extraction des mérozoïtes des rosaces et du milieu de culture. Une suspension
mérozoïtaire plus propre est ainsi obtenue. Celle-ci doit être lavée avec du PBS avant d’être
congelée. Le culot globulaire est lavé avec du RPMI 1640 avant d’être remis dans les
conditions de culture.
L’inconvénient majeur de cette méthode est son caractère agressif vis-à-vis de la culture
parasitaire. En effet, ce traitement par Percoll fragilise les GRp et provoque, s’il est répété
régulièrement, une lyse importante. Cette méthode doit donc être utilisée le moins souvent
possible - maximum 1 fois tous les 3 cycles -, sous peine de détruire totalement la culture
parasitaire.
De plus, les quantités de préparations mérozoïtaires recueillies sont nettement plus faibles que
lors d’une purification par centrifugation. Par conséquent, l’utilisation de cette méthode
99
implique un délai très long pour constituer des stocks de mérozoïtes pour les expériences de
chimiluminescence en série. Cependant cette méthode présente l’avantage de fournir des
intensités de luminescence très nettement amplifiées (cf figure 33), dues à une contamination
moindre des préparations mérozoïtaires.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0,0
6,5
12,9
19,4
25,8
32,3
38,7
45,2
51,6
58,1
temps (min)
chim
ilum
ines
cenc
e (r
lu)
mérozoïtes extraits parPercoll
mérozoïtes isolés parcentrifugation
Figure 33 : Différence d’intensité de luminescence suivant les méthodes
de préparation des mérozoïtes (profil type)
La technique s’étant révélée trop agressive et la collecte des mérozoïtes trop lente pour la
quantité de tests que nous souhaitions réaliser en un temps donné, nous avons écarté cette
méthode.
Cependant, lors des tests réalisés, le deuxième contrôle positif testé, issu d’un donneur de
sang sénégalais, a obtenu une valeur standardisée d’ADPm similaire avec les deux types de
préparation mérozoïtaire. En effet, bien que les rlu observées soient différentes - 173 et 69
unités -, une fois rapportées à celles du SHI - 487 et 190 - des valeurs d’ADPm de 363 et 355
unités sont obtenues. Cette remarque n’est cependant pas valable pour les sérums naïfs car les
rlu restant similaires et le bruit de fond inchangé, nous notons des valeurs d’ADPm
légèrement plus élevées avec les mérozoïtes issus de la centrifugation - 89 vs 47 -, l’éventail
de réponses étant plus restreint. Néanmoins, ces observations, bien que nécessitant d’être
analysées plus en détail sur un nombre conséquent d’échantillons, relativisent l’importance de
l’utilisation du Percoll.
100
1.1.4) Profils protéiques des préparations mérozoïtaires
Des gels d’acrylamide ont également été réalisés afin de comparer les profils protéiques des
différentes préparations mérozoïtaires. Les gels sont réalisés avec 10 µL de chaque
préparation mérozoïtaire par puits et migrent pendant 6H à 25mA. Un des gels de protéines
réalisé a ensuite été révélé au nitrate d’argent et les autres ont été transférés - 12V, toute la
nuit - sur membrane de cellulose. Ceux-ci ont ensuite été hybridés avec le SHI ou des Ac
spécifiques anti-MSP1p19. Au niveau des gels « western blot » ainsi obtenus, nous ne notons
pas de différence majeure entre les diverses préparations parasitaires (cf figure 34B). En
particulier, MSP1 est présent dans ses différentes formes - MSP1 (190kDa), MSP1p42
(42kDa), MSP1p19 (19kDa) - dans chacune de ces préparations (cf figure 34C).
En revanche, nous notons sur le gel révélé au nitrate d’argent une différence que nous n’avons
pu identifier. Les mérozoïtes recueillis par centrifugation présentent une bande protéique
importante à 50 kDa qui est remplacée dans les mérozoïtes recueillis sur Percoll par une
bande à 45 kDa (cf figure 34A).
Figure 34 : Comparaison des mérozoïtes purifiés par Percoll (lignes 1), par centrifugation sans
(lignes 2) ou avec (lignes 3) hémozoïne, visualisée par :
(A) gel révélé au nitrate d’argent,
(B) gel transféré sur membrane de cellulose et sondés avec SHI
(C) gel transféré sur membrane de cellulose et sondés avec des Ac anti-MSP1p19 spécifiques.
.
En conclusion, la méthode de purification des mérozoïtes par centrifugation unique 20 min à
1500xg que nous avons retenue est une méthode simple, non agressive et permettant d’obtenir
des mérozoïtes de qualité convenable et en quantité correcte.
A B C
101
1.1.5) Vérification des quantités prédéfinies à utiliser dans le test
L’optimisation de la méthode, du point de vue des cibles parasitaires, s’est terminée par la
confirmation du choix de la quantité de 40 µL de préparation mérozoïtaire à utiliser pour le
test de phagocytose.
Nous avons utilisé deux pools différents de mérozoïtes, opsonisés en quantités différentes
avec du SHI. Les courbes effet-dose obtenues (cf figure 35) divergent à leurs extrémités mais
un simili plateau est observable autour des valeurs de 30, 40 et 50 µL. Ces quantités donnent
des rlu d’ordre similaire - environ 200 - pour les deux lots de mérozoïtes.
0
100
200
300
400
500
600
10uL 20uL 30uL 40uL 50uL 60uL
quantité de mérozoïtes
inte
nsité
de
lum
ines
cenc
e (r
lu)
pool 2
pool 1
Figure 35 : Courbes effet dose de la quantité de mérozoïtes utilisée dans le test de
chimiluminescence
Les mérozoïtes ne peuvent pas être dénombrés, même dans un compteur de particules -
procédure essayée sans succès par le précédent expérimentateur -. Aussi, ce pallier observé
confirme le choix de 40 µL pour une meilleure reproductibilité des tests.
1.2) Purification des polynucléaires et conditions d’utilisation
La méthode de purification des mérozoïtes a été optimisée. La purification des effecteurs
cellulaires utilisés dans le test doit l’être de même.
102
1.2.1) Impact des monocytes en chimiluminescence
Les PNN sont par nature très fragiles en dehors du corps humain, avec un temps de demi-vie
très court. Des expériences de chimiluminescence ayant été rapportées avec des PBMC
(Khusmith, 1982), nous avons vérifié que l’usage des PNN était requis. Nous avons purifié,
en parallèle des PNN, les PBMC des donneurs de sang afin de pouvoir les tester
simultanément. Une même centrifugation sur ficoll 1077 permet de purifier ces deux types
d’effecteurs cellulaires (cf Materiel et Methodes, §5.2).
Pour les différents donneurs testés, les PBMC ont toujours fourni une réponse similaire ou
moindre à celle des PNN. Dans un cas, la réponse des PBMC a même été non détectable alors
que les PNN du même donneur fournissaient une réponse correcte.
Dans la majorité des cas testés, l’intensité de luminescence fournie par les PBMC est telle que
le rapport SHI/blanc ne dépasse pas 5, alors qu’il faut environ un ratio de 10 pour obtenir un
éventail de réponses suffisamment large pour permettre une précision suffisante. Il apparaît
donc que, bien que fournissant également une poussée respiratoire, cette dernière est
d’intensité insuffisante par rapport au seuil du bruit de fond de notre appareil. Les PBMC ne
peuvent donc pas être utilisés efficacement dans ce cas présent.
1.2.2) Chimiluminescence et sang total
Les PBMC ne fournissant pas une poussée respiratoire assez puissante, nous avons évalué une
alternative à l’utilisation des PNN isolés. Des articles rapportant des analyses de la poussée
respiratoire évaluée à partir de sang total (Perticarari, 1994), nous ont orienté vers cette voie.
Trois échantillons sanguins ont été étudiés à partir de restes de tests de « numération-formule
sanguine ». Ils ont été prélevés moins de 3H30 avant l’expérience - PNN toujours viables -.
Ils correspondent à : i) un individu à numération normale en PNN (6,49), ii) un individu avec
un taux anormalement élevé de PNN (9,26) et iii) un individu avec un défaut de PNN (1,69).
Ces trois prélèvements ont été testés en chimiluminescence, sous la forme de sang total
(100µL) ou de « sang concentré en globules blancs » (100µL). Ce dernier a été obtenu après
centrifugation du sang 10 min à 700xg et récupération de l’interface GR – sérum. Les
quantités de 100 µL ont été imposées par le volume des puits de la plaque de lecture.
103
Les résultats obtenus n’ont été concluants dans aucun des cas testés, surtout concernant le
sang total. Avec ce dernier, quel que soit le contrôle positif testé et la numération observée, la
luminescence ne sort jamais du bruit de fond. De même, les échantillons de globules blancs
concentrés des deux individus à numération élevée ou faible en PNN ne fournissent pas de
réponse supérieure à 20 rlu, valeur maximale du bruit de fond. En revanche, un début de
réponse est détectable avec les globules blancs concentrés de l’individu ayant un taux normal
de PNN. Le SHI fournit alors une luminescence de 35 rlu. La faible poussée respiratoire alors
observée est maximale au bout de 52 minutes, et non pas instantanément comme pour les
PNN isolés.
Il semble donc important de purifier les effecteurs cellulaires avant de les utiliser dans le test.
1.2.3) Utilisation de polynucléaires de lapin
Une autre solution envisagée pour permettre une homogénéité des effecteurs dans ce test a été
l’utilisation de PNN d’un modèle expérimental. A partir de sérums de lapins vaccinés, nous
avons testé l’utilisation des PNN de lapins. La purification de ceux-ci est identique à celle des
PNN humains (Roth, 1993) et ils génèrent également des radicaux oxygénés tels que le
superoxyde (Windle, 1983). Malgré ces éléments de similitude, pour les deux expériences
réalisées avec des PNN de lapins et des sérums de lapins vaccinés ou différents contrôles
positifs humains, nous n’avons jamais pu obtenir de résultats différents du bruit de fond.
1.2.4) Purification des polynucléaires par double ou simple gradient
N’ayant pas trouvé d’alternative correcte aux PNN humains, nous avons vérifié que la
technique de purification par ficoll hystopaque 1077 était la plus adaptée. Elle a été comparée
à la technique reposant sur un double ficoll 1119 - 5 mL - et 1077 - 5 mL -. Lors de cette
purification, réalisée à une vitesse de 700xg pendant 30 minutes, les PNN sont concentrés à
partir de l’interface des deux ficolls. L’étape de lyse est donc évitée, rendant la méthode
moins agressive. Cependant, des préparations ayant lieu en parallèle selon les deux méthodes
et pour les mêmes donneurs fournissent une quantité moindre de PNN avec la méthode du
double gradient. Cette procédure va à l’encontre de l’obtention d’un maximum de PNN afin
de tester simultanément le plus grand nombre possible de sérums. Avec la technique du
simple ficoll, 6 ou 7 tubes de sang contenant chacun 6 mL environ sont nécessaires - ces tubes
104
de sang pouvant être issus de différents donneurs - pour tester une quarantaine de sérums. Il
est difficile d’envisager une méthode moins productive.
Dans un test utilisant le même volume des deux préparations, nous avons observé une réponse
inférieure pour les PNN issus de la purification par double ficoll (cf figure 36). Cela signifie
que la concentration des PNN purifiés par simple gradient était correcte contrairement à celle
obtenue avec le double gradient malgré une procédure plus douce pour leur isolement. En
d’autre terme la qualité de la préparation ne compense pas son plus faible rendement.
0
50
100
150
200
250
300
350
0,0 4,8 9,5 14,3
19,0
23,8
28,5
33,3
38,0
42,8
47,5
temps (min)
inte
nsité
de
lum
ines
cenc
e (r
lu)
SHI et PNN extrait avec ficoll 1077
SHI et PNN extrait avec ficolls 1119et 1077
Figure 36 : Comparaison des deux méthodes de purification :
importance de la quantité sur la qualité
Il semblerait donc que la quantité des PNN additionnée soit réellement le facteur important et
qu’un minimum de 106 PNN par puits soit indispensable pour l’obtention d’une réponse avec
un seuil interprétable. La méthode d’isolement par double gradient n’a donc pas été retenue.
1.2.5) Optimisation de la réponse des polynucléaires
A partir de la méthode de purification des PNN par simple gradient, l’influence du type de
tube de prélèvement sur la capacité de réponse des PNN a été vérifiée. Nous avons utilisé
différents tubes d’analyses d’un même donneur : i) tube hépariné (LH), ii) tube traité à l’acide
citrique – dextrose (ACD) et iii) tube EDTA-K3. Nous avons constaté que les tubes de
prélèvement sanguin de type LH et ACD permettent d’obtenir la même capacité de
105
0
50
100
150
200
250
300
350
0,0
4,9
9,7
14,5
19,3
24,1
28,9
33,7
38,5
43,3
48,1
52,9
57,7
62,5
67,3
72,1
temps (min)
inte
nsi
té d
e lu
min
esce
nce
(rlu
)
PNN d'un Sénégalais A
PNN d'un Français
pool des PNN de 3 Sénégalais D, E, F
PNN d'un Sénégalais B
PNN d'un Sénégalais C
phagocytose des PNN. En revanche, les tubes de type EDTA-K3 permettent d’obtenir des
PNN induisant une poussée respiratoire plus intense et donc une meilleure intensité lumineuse
dans le test - réponse passant de 100 à 270 rlu -. Tous les prélèvements ont donc par la suite
été effectués avec des tubes EDTA-K3.
1.2.6) Utilisation de tous types de donneurs et de pools de polynucléaires
Pour terminer l’étude sur les PNN, nous avons vérifié deux points :
� les PNN peuvent fournir une poussée respiratoire dans ce test quelle que soit leur
origine ou l’état de santé du donneur;
� les PNN de différents donneurs peuvent être « poolés ».
Pour cela, nous avons étudié des PNN préparés à partir de certains dons volontaires : i) de
trois Sénégalais donneurs de sang à la Banque de sang de l’Hôpital Principal de Dakar - donc
à priori en bonne santé -, ii) d’un Français également en bonne santé et iii) de trois Sénégalais
venant faire un examen médical à l’Institut Pasteur de Dakar - les échantillons sanguins de ces
trois personnes ont été réunis -. Sur ces cinq lots de PNN, quatre ont fourni des réponses
significatives en chimiluminescence, comme on peut l’apprécier sur la figure 37. Un individu
(C) a quant à lui fourni une poussée respiratoire trop faible pour être étudiée.
Figure 37 : Test de chimiluminescence réalisé avec des donneurs d’origines différentes et un
pool de PNN. Profil type de réponse, réalisé avec le SHI.
106
Cet exemple illustre la variation de la poussée respiratoire obtenue. Celle-ci est liée au
donneur indépendamment de l’origine des individus. Elle n’a pas non plus de relation avec
l’état de santé du donneur car les individus faisant des examens médicaux peuvent représenter
de meilleurs donneurs qu’un individu à priori en bonne santé. Cette expérience confirme aussi
que un pool de PNN est utilisable dans ce test pour la mesure d’une réponse en
chimiluminescence.
Nous avons fait le choix par la suite de ne travailler qu’avec des pools de donneurs modulant
les effets de chaque donneur afin d’avoir une réponse moyenne. Ce résultat avait été montré
dans les essais préalables. Ainsi, nous dépendons moins des individus fournissant des
réponses trop faibles. Cependant, il est intéressant de noter que ces « non-réponses » en
chimiluminescence sont généralement observées lors de la saison des pluies. Elles seraient
donc plutôt dues à un phénomène biologique, cette saison correspondant à celle où l’on
recense le plus de maladies en général et de paludisme en particulier.
1.3) Standardisation des résultats
Ayant défini les méthodes à utiliser pour réaliser le test, il faut pouvoir s’assurer de sa
reproductibilité.
Selon les individus prélevés, les poussées respiratoires observées seront d’intensités
différentes. Cette variabilité inhérente aux donneurs de PNN est incontournable car nous
n’avons jamais le même lot de PNN fournissant la même intensité de chimiluminescence.
Cependant, pour tous les lots de PNN, nous observons une constante, à savoir un maximum
de chimiluminescence quasiment instantané : entre 0 et 10 min après le début du test.
Le test de chimiluminescence présente une très bonne reproductibilité intra-essai - coefficient
de variation (CV) ≤ 10% - mais il ne permet pas à partir des résultats bruts exprimés en unités
relatives de luminescence (rlu), d’obtenir une reproductibilité inter-essai suffisante. Il était
donc impératif de standardiser les réponses d’un jour à l’autre et permettre ainsi une
comparaison entre les différents résultats. Cet index a été appelé « ADPm » pour
« Phagocytose des merozoïtes Dépendante des Anticorps» (sigle en anglais). Il correspond à
une homogénéisation des résultats par rapport à un même contrôle positif (SHI) ramené à une
valeur arbitraire de 1000 pour chaque expérience. Cet index permet d’obtenir une très bonne
reproductibilité inter-essai - CV ≤ 20% -.
107
Fig
ure
38
: Diff
éren
ts p
rofil
s de
chi
milu
min
esce
nce
pou
vant
êtr
e ra
men
és à
une
val
eur
d’A
DP
m d
e 11
27 ±
5%
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 5 10 14 19 24 29 33 38 43 48 52 57
durée (min)
lum
ines
cenc
e (r
lu)
sans sérum
SHI : contrôle positif
serum naïf
serum immun
ADPm serum immun = 1126
Expérience du 18 janv 2006
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 5 9 14 18 23 27 32 37 41 46 50 55 60durée (min)
lum
ines
cenc
e (r
lu)
sans sérum
SHI : contrôle positif
serum naïf
serum immun
Expérience du 20 déc 2005
ADPm serum immun = 1183
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 5 10 16 21 27 34 39 44 51 57
durée (min)
lum
ines
cenc
e (r
lu)
sans sérum
SHI : contrôle positif
serum naïf
serum immun
ADPm serum immun = 1072
Expérience du 28 déc 2005
108
L’ADPm étant un index, il est considéré comme un ordre de grandeur de réponse. Aussi, une
très bonne reproductibilité des résultats est obtenue en tenant compte de la variabilité extrême
des paramètres dans les tests fonctionnels liés à P. falciparum.
L’exemple de la figure 38 montre bien cette variabilité de réponse des PNN qui peut être
contournée par le calcul normalisé de l’ADPm.
Nous avons donc au final un test fonctionnel reproductible. Il nous faut maintenant déterminer
le rôle des Ac dans ce test.
2) Les IgG, effecteurs moléculaires de la phagocytose immune
2.1) IgG et chimiluminescence
Afin de démontrer le rôle essentiel des IgG - hors Complément - dans le test de phagocytose
suivi par chimiluminescence, nous avons décomplémenté par chauffage - 20 min à 56°C - ou
déplété en IgG totales sur protéine G, sept sérums à fortes valeurs d’ADPm. Les IgG totales
ont également été purifiées. Ces sept sérums, sous leurs quatre formes d’étude, ont ensuite été
testés en chimiluminescence et la distribution des résultats est présentée sur la figure 39.
Figure 39 : Répartition des réponses ADPm pour 7 sérums testés sous leur forme :
(1) sérum, (2) sérum décomplémenté, (3) sérum déplété en IgG totales,
(4) IgG totales purifiées.
109
Plusieurs informations importantes concernant le test de chimiluminescence ont ainsi pu être
obtenues :
� la décomplémentation préalable des sérums n’est pas nécessaire, la réponse fournie par
un sérum avec ou sans la présence du Complément étant similaire - P = 0,46, test de
Wilcoxon -.
� les IgG purifiées sur protéine G fournissent la même réponse que le sérum dont elles
sont issues, aucune différence significative ne peut être notée - P = 0,4, test de Wilcoxon -.
� les sérums déplétés de leurs IgG fournissent une réponse négligeable comparée à la
réponse initiale du sérum.
Ces trois points prouvent donc que les IgG sont les effecteurs immuns de la réponse dans le
test de chimiluminescence tel qu’il a été développé.
Il est intéressant de mieux définir l’importance des IgG, ceci en utilisant les IgG caractérisées
par les tests ELISA réalisés sur la cohorte « Ndiop Non parasité ». Nous avons préalablement
stratifié la réponse ADPm observée selon cinq grands groupes de répondeurs définis au vu de
la distribution des réponses (cf figure 40A). Les distributions des réponses Ac obtenues en
ELISA sont représentées à la figure 40B en fonction des différentes classes de répondeurs en
ADPm.
Figure 40: A - Distribution de la réponse en ADPm à Ndiop. (n) représente le nombre
d’individus de chaque groupe;
B - Répartition des niveaux d’IgG totales contre les antigènes du mérozoïtes en fonction de la
distribution en ADPm.
Unités titres IgG totales
110
Les analyses ont alors montré qu’entre aucune réponse - groupe (0), ADPm < 100 - et une
mauvaise réponse - groupe (-), 100 ≤ ADPm < 200 -, aucune différence statistique de taux
d’IgG n’est observée - P = 0,39 -. En revanche, nous notons une élévation significative du
niveau d’Ac de mauvais à bons répondeurs - groupe (+), 200 ≤ ADPm < 400 - avec
P ≤ 0,0001, et de bons à très bons répondeurs - groupe (++), 400 ≤ ADPm < 600 -, P = 0,04.
Cependant, le niveau d’IgG reste constant entre les très bons et les forts répondeurs - groupe
(+++), ADPm ≥ 600 -, P = 0,88.
Les valeurs extrêmes d’ADPm, qu’elles soient positives ou négatives, ne sont donc pas
explicables uniquement sur la base des taux d’IgG. Cependant, ces taux permettent de
déterminer trois groupes de répondeurs en ADPm liés aux niveaux de réponses en IgG.
Cette étude a été complétée par des analyses en western blot, hybridés avec des sérums ayant
des valeurs d’ADPm très différentes (cf figure 41).
Figure 41 : Western-blots incluant le marqueur d’échelle (1), les protéines des mérozoïtes non
réduites (2) ou réduites par chauffage (3) et révélés avec : A - un sérum d’individu naïf,
B - le SHI, C à F - des sérums de Ndiop ayant des valeurs d’ADPm de 70 (C), 193 (D),
667 (E) et 1721 (F).
De cette expérience, il est apparu que les sérums présentant une réponse en ADPm nulle
(ADPm de 70, figure 41C), ont des IgG contre les Ag du mérozoïte, à la différence d’un
sérum naïf (figure 41A). Il est également apparu que les protéines de faible poids moléculaire
A B C D E F
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
0 +++ 0 - +++ +++
111
ne semblent pas être directement liées à la valeur de l’ADPm, les profils étant indifféremment
similaires ou différents quelles que soient les classes de répondeurs. En revanche, il semble y
avoir plus de protéines de haut poids moléculaire reconnues lorsque le sérum a un fort taux de
réponse en chimiluminescence.
Certaines de ces protéines de haut poids moléculaire seraient-elles particulièrement
importantes pour le système immunitaire et l’activation des PNN ?
2.2) Impact des sous classes d’IgG : IgG1 et IgG3
L’étape suivante a été d’étudier les niveaux de réponses en IgG cytophiles en fonction des
groupes de répondeurs ADPm. Nous avons trouvé des différences significatives entre le
groupe des faibles et bons répondeurs - IgG1 : P = 0,0005 ; IgG3 : P = 0,0002 - et entre les
groupes des bons et très bons répondeurs - IgG1 : P = 0,048 ; IgG3 : P = 0,0048 -. Nous
n’avons pas obtenu de différence significative expliquant les valeurs extrêmes d’ADPm -
IgG1 : P = 0,61 et 0,66 ; IgG3 : P = 0,27 et 0,59 - (cf figure 42).
Figure 42 : Distribution des taux d’IgG1 (A) et d’IgG3 (B)
suivant les groupes de répondeurs en ADPm
Les évolutions des taux d’IgG1 et IgG3 apparaissent donc comme très liées à la réponse en
chimiluminescence.
Unités titre IgG1
Unités titre IgG3
112
Il faut noter qu’il existe des individus isolés avec des taux importants d’IgG1 qui ne répondent
pas en chimiluminescence, ce qui n’existe pas avec les IgG3. Inversement, il existe des
individus isolés avec des taux relativement faibles d’IgG3 qui sont excellents répondeurs, ce
qui n’existe pas avec les IgG1.
Il semblerait donc que l’origine de la forte réponse en ADPm soit due à un rapport d’IgG1 et
d’IgG3, et non pas seulement un type d’IgG cytophiles.
Pour approfondir cette hypothèse, nous avons déterminé les ratios IgG3/IgG1. Ils ont ensuite
été stratifiés en 3 groupes : valeur < 0,5, entre 0,5 et 1, et ≥ 1. Ces groupes ont été comparés à
la valeur de l’ADPm en continue à l’aide d’un test de Spearman. Pour les IgG3/IgG1 < 0,5,
une corrélation significative a été observée - P = 0,0016, rho = 0,40 -. Aucune relation
significative n’a pu être obtenue pour les deux autres groupes - 0,5 ≤ IgG3/IgG1 < 1 :
P = 0,82 ; IgG3/IgG1 ≥ 1 : P = 0,49 -. Ce résultat laisserait supposer que les IgG1 doivent
être en quantité nettement supérieure aux IgG3 pour favoriser la chimiluminescence.
Cependant, cela n’est pas suffisant, la corrélation obtenue n’étant que de 40%.
3) Résultats obtenus avec la cohorte d’étude
3.1) Résultats globaux : comparaison des deux villages
La méthodologie du test de chimiluminescence validé, l’étape suivante a été l’analyse de ses
caractéristiques en tant que marqueur de l’immunité pour les deux zones d’endémie testées.
Nous avons trouvé pour celles-ci des niveaux de réponses statistiquement différents -
P = 0,0019 -. Le niveau de réponse est plus élevé à Dielmo, zone d’holoendémie - 119
individus testés -, qu’à Ndiop, zone de mésoendémie - 114 individus testés -. Le 25ème
percentile de l’un correspond à la médiane de l’autre, comme le montre la répartition des
résultats à la figure 43.
113
Figure 43 : Distribution de la réponse ADPm en fonction de la zone d’endémie
Il semblerait donc que plus le niveau d’immunité des populations est élevé et plus le niveau
d’ADPm obtenu est important.
3.1.1) Corrélation entre l’ADPm et l’âge
Le but de ce test est de pouvoir analyser in vitro le degré d’immunité acquise in vivo.
Les différentes classes d’âges étant définies comme liées à l’immunité clinique de manière
bien stratifiée, il est important de vérifier qu’une corrélation entre les classes d’âge et les
résultats du test de chimiluminescence existe.
Une analyse statistique menée avec le test de Kruskal Wallis a permis de montrer que pour les
deux villages, la valeur d’ADPm est hautement dépendante des strates d’âge - P < 0,0001 -.
Figure 44 : Moyennes d’ADPm observées par classes d’âge et par village
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Moy
. des
cel
lule
s
ADPm
Nd, 3
Nd, 2
Nd, 1
D, 3
D, 2
D, 1
Diag. en bâtonsEclaté par : Nd/D, stratAgesBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)
Dielmo Ndiop
2-6 7-14 ≥ 15 2-14 15-29 ≥ 30
ADPm
Age (ans)
* *
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Moy
. des
cel
lule
s
ADPm
Nd, 3
Nd, 2
Nd, 1
D, 3
D, 2
D, 1
Diag. en bâtonsEclaté par : Nd/D, stratAgesBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)
Dielmo Ndiop
2-6 7-14 ≥ 15 2-14 15-29 ≥ 30
ADPm
Age (ans)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Moy
. des
cel
lule
s
ADPm
Nd, 3
Nd, 2
Nd, 1
D, 3
D, 2
D, 1
Diag. en bâtonsEclaté par : Nd/D, stratAgesBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)
Dielmo Ndiop
2-6 7-14 ≥ 15 2-14 15-29 ≥ 30
ADPm
Age (ans)
* *
114
Les moyennes d’âge observées pour les différents groupes sont respectivement à Dielmo et à
Ndiop de 154 et 162 pour la classe 1, de 247 et 307 pour la classe 2 et de 380 et 394 pour la
classe 3 (cf figure 44). Les classes 1 et 3 ont donc globalement la même réponse pour les deux
zones d’endémie.
3.1.2) Corrélation entre l’ADPm et la parasitémie circulante
Si l’on évalue l’impact de la présence du portage asymptomatique sur la réponse en
chimiluminescence, on observe dans les deux villages une baisse de réponse en ADPm pour
les personnes parasitées (cf figure 45). Cependant cette baisse est non significative à Ndiop -
P = 0,9 - où 22% de la population d’étude est parasitée. Cette diminution est à l’inverse
hautement significative à Dielmo - P < 0,0001 - où 53% de la population était parasitée au
moment du prélèvement.
Figure 45 : Impact de la parasitémie circulante dans les deux zones d’étude
A Dielmo, la relation entre l’ADPm et la parasitémie est analysée en dichotomisant cette
dernière variable en faiblement parasitées - F1 et F2 - et fortement parasitées - F3 à F5 - (cf
figure 46). On observe une diminution significative de l’ADPm entre les non et faiblement
parasitées - P = 0,0009 -. Elle est en revanche non significative entre les faiblement et les
fortement parasitées - P = 0,2 -.
L’ADPm a donc une relation avec la présence de parasites mais le lien avec la charge
parasitaire mesurée dans le sang est moins évident.
Parasités
Dielmo Ndiop
ADPm
Parasités
Dielmo Ndiop
ADPm
115
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Moy
. des
cel
lule
s po
ur A
DP
m
D, 0 D, 1-2 D, 3-5
Diag. en bâtonsVariable(s) de groupe : Nd/D, stratParaBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Dielmo de double transversale .xls (importé)
ADPm
0 F1+F2 F3+F4+F5
*
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Moy
. des
cel
lule
s po
ur A
DP
m
D, 0 D, 1-2 D, 3-5
Diag. en bâtonsVariable(s) de groupe : Nd/D, stratParaBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Dielmo de double transversale .xls (importé)
ADPm
0 F1+F2 F3+F4+F5
*
Figure 46 : Stratification de la réponse en ADPm par rapport à l’intensité de la parasitémie
à Dielmo
Cette corrélation entre l’ADPm et le fait d’être ou non parasité laisse supposer que ce sont les
mêmes Ac qui jouent un rôle important dans la phagocytose immune par les PNN et le
« contrôle » de la parasitémie circulante.
3.1.3) Corrélation entre l’ADPm et l’hémoglobine AS
Pour les deux zones d’étude, aucune relation n’a été trouvée entre la réponse en
chimiluminescence et le fait d’être ou non drépanocytaire AS - P = 0,3 à Ndiop et 0,9 à
Dielmo -. Les Ac fonctionnels dans ce test n’ont pas de relation avec le type d’hémoglobine.
Ce résultat était prévisible, ce test étant basé sur les formes libres du parasite et non pas sur le
GR.
3.1.4) Corrélation entre l’ADPm et la protection clinique
Nous avons également réalisé des études prospectives de corrélation entre la protection
clinique et le taux d’ADPm grâce à la disponibilité d’un nombre suffisant de résultats
fonctionnels et de données cliniques précises. La variable individuelle d’ADPm a été testée en
continu ou avec différents seuils. Les critères d’Akaïké (AIC) ont permis de définir les
modèles les plus représentatifs.
A Ndiop, deux modèles de régression de Poisson ont été testés : l’un avec l’ADPm en variable
continue, l’autre en variable dichotomisée avec un seuil à 250 - valeur proche de la moyenne
observée dans le village -. Une corrélation a été trouvée en tenant compte de l’âge entre une
116
baisse du taux d’ADPm et l’augmentation du risque clinique (cf tableau XVII). Le meilleur de
ces deux modèles, du point de vue du critère d’AIC, est celui avec la dichotomie à 250. Une
personne dont l’ADPm a été trouvé en dessous de ce seuil aura une probabilité de faire 1,8
fois plus d’accès qu’un individu du même âge dont l’ADPm a été trouvé supérieur ou égal à
250. Autrement dit, si ce dernier individu fait 3 accès dans les 6 mois suivant le prélèvement,
celui du même âge n’ayant pas atteint ce seuil de réponse au test de phagocytose en fera 5 ou
6 pendant la même période.
Tableau XVII : Régressions de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres en fonction
de l’ADPm à Ndiop (l’ADPm en continu est sous sa forme dégressive)
RR 95%CI P RR 95%CI P
ADPm
Continu 1,002 1,001-1,003 0,049
Dichotomisé
≥250 1
<250 1,789 1,038-3,077 0,036
Age (ans) <0,001 <0,001
≥30 1 1
15-29 3,298 1,220-8,915 0,019 3,203 1,182-8,681 0,022
2-14 12,239 4,868-30,773 <0.001 12,627 5,036-31,660 <0,001
Deviance 118,6 118,4
AIC 120,6 120,4
Modèle 1 Modèle 2
Si l’on teste également la morbidité observée à Dielmo, nous obtenons des résultats similaires.
En effet, trois modèles de « variable ADPm » ont été retenus, un avec l’ADPm en continu et
deux avec l’ADPm dichotomisé avec un seuil à 300 - proche de la moyenne des réponses
observées pour le village - ou à 250 - seuil trouvé pour l’étude à Ndiop -. Ces trois modèles
fournissent une corrélation significative entre une baisse de la chimiluminescence et
l’augmentation du risque clinique (cf tableau XVIII).
Le meilleur modèle trouvé selon l’AIC est celui avec la même dichotomie qu’à Ndiop. Aussi,
à Dielmo, une personne dont l’ADPm a été trouvée en dessous du seuil à 250 aura une
probabilité de faire 17,5 fois plus d’accès qu’un individu du même âge dont l’ADPm a été
trouvée supérieure ou égale à 250. Soit, si ce dernier individu fait 1 accès dans les 6 mois
suivant le prélèvement, celui du même âge n’ayant pas atteint ce seuil de réponse au test de
phagocytose en ferait 17 ou 18 pendant la même période.
117
RR 95%CI P RR 95%CI P RR 95%CI P
ADPm
Continu 1,005 1,001-1,008 0,006
Dichotomisé
≥300 1
<300 12,150 1,653-89,302 0,014
≥250 1
<250 17,509 2,275-134,744 0,006
Age (ans) <0,001 <0,001 <0,001
≥15 1 1 1
7-14 4,233 1,133-15,823 0,032 3,827 1,027-14,256 0,046 2,876 0,759-10,904 0,120
2-6 31,944 9,189-111,052 <0,001 41,130 12,590-134,371 <0,001 17,637 5,042-61,690 <0,001
Hb
AA n'apporte rien au modèle n'apporte rien au modèle 1
AS 0,790 0,291-2,141 0,643
scoretest Hb NS NS 0,035
Deviance 111,8 106,6 86,7
AIC 113,8 108,6 90,7
Modèle 3Modèle 1 Modèle 2
Tableau XVIII : Régressions de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustre en fonction de
l’ADPm à Dielmo (l’ADPm en continu est sous sa forme dégressive)
Cependant, ce résultat, confirmant fortement celui trouvé à Ndiop, est à interpréter avec
précaution du point de vue des valeurs absolues. En effet, bien qu’étant significatif - P =
0,006 -, l’intervalle de confiance trouvé pour le risque relatif est large - de 2,3 à 134,7 -.
Celui-ci peut se justifier par la faible quantité et la distribution particulière des individus
faisant des accès palustres dans cette zone d’étude, rendant les analyses de morbidité et donc
protection clinique difficiles à réaliser avec précision (cf Partie IIIA §2).
4) Etude fonctionnelle des candidats vaccins
Après avoir étudier la fiabilité et l’importance de ce test comme outil de détection du degré
d’immunité acquise, nous l’avons ensuite évalué pour un deuxième axe important
d’utilisation : tester la fonctionnalité des Ac liés aux candidats vaccins.
Dans cette partie de l’étude, nous avons utilisé le test de chimiluminescence comme un outil
potentiel de « sélection » des candidats vaccins du point de vue de ce type de réponse
immunitaire. Cependant, les candidats ne répondant pas de façon positive au test ne sont pas à
proscrire, celui-ci ne modélisant in vitro qu’une forme de réponse immune. En revanche, pour
118
les candidats vaccins y répondant positivement, il peut fournir un argument supplémentaire en
faveur de leur développement et de leur suivi en essais cliniques.
4.1) Etude à partir des sérums déplétés
Tester en parallèle les sérums sous leur forme intacte et déplétée permet de juger par
comparaison l’impact éventuel des candidats vaccins dont les Ac ont été déplétés. Cette
solution est la plus adaptée pour deux raisons :
� la déplétion est efficace, facile et rapide à réaliser ;
� des essais à partir d’IgG spécifiques purifiées peuvent être réalisés.
Pour les IgG anti-MSP4p20 purifiées, aucune poussée respiratoire significative n’a pu être
observée. Cependant la déplétion en Ac anti-MSP4p20 a un impact mesurable en
chimiluminescence. Il est possible pour les IgG purifiées qu’un seul type d’Ac ne suffise pas à
créer une poussée respiratoire suffisamment conséquente. Une addition de plusieurs types
d’Ac semble donc nécessaire. Ainsi, l’utilisation d’Ac spécifiques purifiés peut sembler peu
concluante par rapport aux sérums déplétés.
Les différents résultats obtenus avec les sérums déplétés, détaillés ci-après, sont représentés
sur la figure 47.
21 sérums forts répondeurs contre MSP1p19 et en ADPm ont été testés, sous leur forme
native et déplétée par ce candidat vaccin. Une diminution du tiers de la réponse en
chimiluminescence a été observée pour les sérums déplétés, la moyenne des réponses
d’ADPm diminuant d’une valeur de 548 à 388. Cette diminution est significative - P = 0,002,
rangs de Wilcoxon -. Sur ces 21 sérums, seuls trois ne permettent pas d’observer une
diminution avec leur correspondant déplété.
Concernant l’étude de MSP4p20, 23 sérums forts répondeurs en ELISA et
chimiluminescence ont été déplétés. Une diminution de près de 50% de la réponse en
chimiluminescence en absence d’Ac anti-MSP4p20 a été observée - P < 0,0001 -. La
moyenne des réponses ADPm a diminué de 522 à 239. La déplétion en Ac anti-MSP4p20 fait
chuter la moyenne d’ADPm sous la barre des 250, seuil défini par les études de morbidité
119
pour l’augmentation significative du risque clinique. Sur les 23 sérums testés, seules deux
déplétions n’ont pas engendré de baisse de la chimiluminescence.
Figure 47 : Impact des déplétions des anticorps de différents candidats vaccins
sur la réponse en ADPm (I : sérums intacts, D: sérums déplétés ou saturés)
Concernant MSP5, les huit premiers sérums testés n’ayant pas fourni de résultats concluants,
la cohorte d’étude n’a pas été élargie. En effet, la très légère diminution globale observée -
l’ADPm moyen diminue de 302 à 277 - n’est pas significative - P = 0,78 -. Seuls 3 des 8
sérums testés sont responsables de cette diminution.
Nous avons également souhaité avoir, pour valider l’étude, un contrôle négatif. Pour cela,
nous avons testé les sérums saturés en R45. En effet, étant un Ag du GRp, il ne doit pas ou
peu agir dans la réponse contre le mérozoïte. Nous avons alors obtenu des résultats similaires
à ceux de MSP5, voire même avec un impact supérieur. Sur les dix sérums testés, six ont été
responsables d’une légère baisse de la réponse moyenne en ADPm - de 308 à 267 -, mais
celle-ci est non significative - P = 0,14 -.
Pour finir, il nous fallait également étudier l’impact des déplétions multiples. Nous avons
donc testé 11 sérums à la fois forts répondeurs en Ac anti -MSP1p19 et -MSP4p20 afin de
Etude MSP1p19 Etude MSP4p20 Etude MSP5
EtudeMSP1p19 + MSP4p20Etude R45
* *
*
I D I D I D
I D I D
Etude MSP1p19 Etude MSP4p20 Etude MSP5Etude MSP1p19 Etude MSP4p20 Etude MSP5
EtudeMSP1p19 + MSP4p20Etude R45
EtudeMSP1p19 + MSP4p20Etude R45
* *
*
I D I D I D
I D I D
120
déterminer l’effet conjugué des deux. Une perte de la réponse en ADPm de l’ordre des 2/3 est
alors observable, la moyenne diminuant de 652 à 198 - P = 0,005 -. Cette dernière valeur est
encore une fois inférieure au seuil défini par rapport à la clinique de 250.
Cependant, bien que cette méthode d’étude par déplétion des Ac liés aux candidats vaccins
soit correcte, les procédures avec des déplétions multiples le sont nettement moins, voire
impossibles pour trois déplétions ou plus. En effet, une déplétion excessive en Ac contre des
cibles différentes fait que nous n’observons plus aucune réponse en chimiluminescence.
4.2) Etude en chimiluminescence des mérozoïtes transgéniques D10-PcMEGF
Pour tester l’impact des Ac anti-MSP1p19, les mérozoïtes issus de la souche transgénique
D10-PcMEGF ont également été utilisés. Ces parasites, comme nous l’avons vu
précédemment (cf Partie I § 5.1.1), ont la particularité de ne pas être affectés par les Ac anti-
PfMSP1p19. Leur emploi nous permet donc, en les comparant avec la souche contrôle - D10-
PfM3’ -, de déterminer l’impact de ces Ac sur la chimiluminescence. Nous réalisons donc
ainsi une approche parallèle de l’expérience précédente utilisant les sérums déplétés. Sans
avoir à extraire les Ac du sérum, c’est l’Ag PfMSP1p19 qui est masqué.
22 sérums ayant une réponse en ELISA supérieure à 100 unités arbitraires du point de vue de
la réponse anti-MSP1p19 ont alors été étudiés. Ils ont quasiment tous induit une baisse
significative de leur réponse, comme nous pouvons le visualiser à la figure 48.
Globalement, cette diminution hautement significative de la poussée respiratoire - P < 0,0001
- correspond à une perte de 32% de la réponse. Nous retrouvons donc une réponse similaire à
celle des sérums déplétés. De plus, le contrôle négatif testé est quant à lui resté inchangé, bien
que n’étant pas noyé dans le bruit de fond.
121
Figure 48 : Comparaison des valeurs d’ADPm obtenues avec des sérums possédant un taux
important d’anticorps anti-MSP1p19 pour deux souches transgéniques de mérozoïtes,
exprimant (D10-PfM3’) ou non (D10-PcMEGF) l’antigène PfMSP1p19.
4.3) Effet de la surcharge des sérums en Ac anti-MSP4p20
Les IgG anti-MSP4p20 purifiées ne fournissant pas de réponse directe en chimiluminescence
mais étant impliquées significativement dans ce phénomène, nous avons testé l’effet de leur
addition dans divers types de sérums calibrés. Nous avons sélectionné des sérums d’individus
avec différents profils: i) ADPm nulle et pas d’Ac anti-MSP4p20, ii) ADPm moyenne mais
toujours sans Ac anti-MSP4p20, iii) ADPm nulle avec cette fois des Ac anti-MSP4p20 et iv)
ADPm bonne avec peu d’Ac anti-MSP4p20 - 2 individus différents pour chaque cas -.
Nous avons préalablement vérifié avec des sérums forts répondeurs que la quantité de sérum
pouvait être diminuée à 5 µL sans modification notable de la valeur d’ADPm.
Nous avons donc ensuite pu tester les sérums sélectionnés dans les conditions : i) contrôle : 5
µL de sérum + 5 µL de PBS 1x, ii) « vaccination » : 5 µL de sérum + 5 µL d’Ac spécifiques
anti-MSP4p20 issus d’habitants de Dielmo. Point important, ces Ac ont toujours été conservés
à +4°C afin de ne pas risquer une dénaturation possible des IgG en cas de décongélation au vu
de leur relativement faible concentration.
Cependant, cette supplémentation en Ac n’a eu aucun impact sur le taux d’ADPm dans les
différentes configurations.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
AD
Pm
1
D10-PfM3'
D10-PcMEGF
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
AD
Pm
1
D10-PfM3'
D10-PcMEGF
122
TOUS 2-14 ans 15-29 ans ≥ 30 ans TOUS 2-6 ans 7-14 ans ≥ 15 ans
MSP1p19 vs ADPmrho=0,68 P <0,0001
rho=0,53 P =0,0003
rho=0,67 P =0,0002
rho=0,62 P =0,0004
rho=0,71 P <0,0001
NSrho=0,57 P =0,002
rho=0,67 P <0,0001
MSP4p20 vs ADPmrho=0,53 P <0,0001
rho=0,39 P =0,007
rho=0,73 P <0,0001
NSrho=0,40 P <0,0001
rho=0,73 P =0,002
NSrho=0,42 P =0,0005
MSP5 vs ADPmrho=0,40 P <0,0001
NS NS NSrho=0,33 P =0,0003
NS NSrho=0,34 P =0,006
R23 vs ADPmrho=0,50 P <0,0001
rho=0,37 P =0,0112
NSrho=0,52 P =0,003
rho=0,30 P =0,0013
NS NS NS
NDIOP DIELMO
4.4) Corrélations entre les réponses obtenues en ELISA et celles en chimiluminescence
Nous avons, en dernière analyse, étudié les corrélations entre les résultats ELISA concernant
les réponses Ac contre les différents candidats vaccins - exprimés en ratio de densité optique -
et les réponses obtenues en chimiluminescence - analysées en ADPm -. En tenant compte des
corrections de Bonferroni pour cette étude, le seuil de signification est abaissé à 0,0125. Les
résultats obtenus, par village et par classe d’âge, sont présentés dans le tableau XIX.
Tableau XIX : corrélations de Spearman entre les réponses anticorps visant les candidats
vaccins et l’ADPm, en prenant compte des corrections de Bonferroni.
Si, dans un premier temps, nous ne tenons pas compte des groupes d’âge et observons la
relation globale, nous notons que tous les candidats vaccins étudiés, qu’ils soient ou non liés
au mérozoïtes, engendrent une réponse Ac reliée à la réponse en ADPm. Ces corrélations sont
toutes hautement significatives - P ≤ 0,0013 -.
Excepté pour les Ac anti-MSP1p19 qui sont reliés plus fortement avec l’ADPm à Dielmo -
71% contre 68% à Ndiop -, les trois autres constructions vaccinales induisent des Ac mieux
reliés à la chimiluminescence à Ndiop qu’à Dielmo, avec respectivement : 53% et 40% pour
les Ac anti-MSP4p20, 40% et 33% pour les anti-MSP5, 50% et 30% pour les anti-R23.
Notons que :
� la réponse anti-MSP1p19 apparaît comme mieux reliée à l’ADPm que la réponse anti-
MSP4p20, résultat allant en sens inverse de celui obtenu à partir de l’étude avec les sérums
déplétés ;
� la réponse anti-R23 apparaît de façon globale comme mieux associée au résultat
d’ADPm que MSP5, qui est pourtant un Ag du mérozoïte. Ce résultat tend à confirmer la non
123
dépendance de la chimiluminescence aux Ac anti-MSP5, résultat trouvé avec l’analyse des
sérums déplétés.
Afin de s’affranchir de l’impact de l’âge sur le statut immun et donc sur l’importance de la
poussée respiratoire, les corrélations sont analysées par groupe d’âge. Nous obtenons alors
des corrélations avec des significations généralement plus faibles, voire même inexistantes.
Les absences de relation liées à MSP4p20 dans les deux villages ou à MSP5 à Ndiop le sont
en prenant compte des corrections de Bonferroni - 0,04 ≤ P ≤ 0,0127. Il pourrait donc suffire
de peu d’individus supplémentaires pour éventuellement observer des relations significatives.
Ces résultats sont donc à interpréter avec prudence. Cependant, concernant la relation non
significative observée pour la classe d’âge 1 à Dielmo avec les Ac anti-MSP1p19 ou celles
liées à MSP5 à Dielmo ou à R23 dans les deux villages, celles-ci sont relativement plus fortes,
donc plus fiables.
124
PARTIE III : RESULTATS
C/ ANALYSE DE L’INHIBITION DE
CULTURE DEPENDANTE DES ANTICORPS
Nous souhaitions comparer les résultats obtenus pour deux types de fonctionnalités différentes
des Ac : avec coopération ou directe. Il fallait donc étudier un autre test en plus de celui de
chimiluminescence précédemment développé.
Dans le test d’inhibition de culture, qui est devenu une référence internationale en terme
d’étude de fonctionnalité des Ac, ceux-ci jouent un rôle direct bloquant. Nous avons donc
souhaité approfondir l’étude de ce test également.
Des analyses précédentes réalisées au laboratoire avaient défini l’hématocrite et le
pourcentage de sérum à utiliser pour la réalisation de ce type de test en macro méthode
(Diouf, 2002). Des études en cytofluorométrie avaient déjà été initiées dans ces conditions
(Diatta, 2004). Nous les avons donc reprises afin de pouvoir les adapter en micro méthode
automatisable.
1) Lecture par cytométrie en flux
La cytofluorométrie en flux est une technique permettant d’analyser, en moins d’une minute,
plusieurs milliers de GR - généralement entre 50 000 et 100 000 -. Une bonne estimation de la
parasitémie est ainsi obtenue, en un temps très court. De plus, l’Institut Pasteur de Dakar
possède un FACScalibur équipé d’un système HTS, permettant une analyse automatisée en
micro méthode. La cytométrie en flux nous a donc semblé la technique la plus adaptée à la
lecture des tests d’inhibition de culture. Aussi, nous avons repris les études d’inhibition
précédemment réalisées. L’hématocrite et le pourcentage de sérum prédéfinis ont été
conservés tout en étant ramenés au volume adéquat pour une étude en plaque de 96 puits - 2
µL de GRp et 20 µL de sérum suffisent -.
125
A B
1.1) Le choix du marqueur de fluorescence : HE à la place de TO
Les études réalisées en cytofluorométrie au laboratoire l’étaient jusqu’à présent avec détection
par thiazole orange (TO). Or, ce fluorochrome présente l’inconvénient de ne pas distinguer les
formes parasitaires jeunes des GR sains. Seules les formes âgées sont clairement identifiées,
comme le montrent les analyses de la figure 49 (M2 et R2).
Figure 49 : Détection par thiazole orange avec analyse en histogramme (A) et dot plot (B).
M1 et R1 correspondent à des érythrocytes parasités par des formes trophozoïtes,
M2 et R2 par des formes schizontes.
Cette figure représente deux des différents types d’analyse possibles : l’analyse par
histogramme (49A) et celle par dot plot (49B). Ce sont les deux types d’analyse les plus
fréquemment utilisés.
Le dot plot permet de distinguer les GR en quantité moindre, moins aisément détectables avec
un histogramme. De plus la qualité du réglage - voltages utilisés et compensations réalisées -
est plus aisée à vérifier par dot plot que par histogramme, car nous avons des « taches » de
réponses et non pas des pics plus ou moins larges.
Dans un premier temps, pour résoudre le problème de détection partielle, nous avons souhaité
tester un autre fluorochrome. L’utilisation de l’hydroéthidine (HE) en lieu et place du TO a
alors été étudiée. Ce marqueur est décrit comme permettant la détection de toutes les formes
parasitaires, quel que soit leur âge (Jouin, 2004). De plus, c’est un marqueur de viabilité :
seuls les parasites toujours vivants sont détectés. La figure 50 représente exactement la même
population parasitaire que la figure 49, mais avec une détection par HE. Nous notons alors
que, même sous la forme histogramme, les formes trophozoïtes peuvent clairement être
observées. La résolution est donc augmentée et la parasitémie a été trouvée grandement
126
B A
diminuée, de 10% à 7% environ, ce qui s’explique en grande partie par la meilleure séparation
d’avec les GR non parasités.
Figure 50 : Détection par hydroéthidine. M1 et R1 correspondent à des érythrocytes parasités
par des formes trophozoïtes, M2 et R2 par des formes schizontes.
Souhaitant également tester l’impact de l’HE sur les formes parasitaires jeunes, nous avons
marqué une autre culture composée au moment de l’étude de formes anneaux et trophozoïtes.
Bien que ces deux populations ne soient pas distinguables des formes saines en TO (figure
51A), elles sont bien distinctes en HE (figure 51B).
Figure 51 : Détection d’une culture parasitaire composée d’anneaux et trophozoïtes
par TO (A) ou HE (B).
Enfin, si nous comparons le bruit de fond inhérent à chaque type de marquage, l’usage de
l’HE apparaît encore comme préférable. Le bruit de fond obtenu avec ce dernier marqueur
correspondant aux faux positifs obtenus, c’est-à-dire à un pourcentage de parasitémie pour
une étude de GR sains, est de 0,13% alors qu’avec le TO nous obtenons 0,4%. Le bruit de
fond est donc diminué de plus de moitié en utilisant l’HE. C’est un résultat non négligeable,
d’autant plus qu’il n’est pas déductible des pourcentages obtenus, la règle de base en
cytofluorométrie étant de ne jamais rien soustraire.
B A
127
Il est ainsi plus intéressant d’utiliser l’HE au détriment du TO. L’HE permet d’identifier
clairement les différentes populations parasitaires, de les isoler en fonction de leur âge et donc
d’obtenir une meilleure précision de lecture.
1.2) Des problèmes de reproductibilité
Nous n’avons pas pu continuer l’étude en testant l’inhibition due à nos différents sérums
immuns à cause de nombreux problèmes lors des réglages et lectures automatisées des
plaques par HTS.
1.2.1) Des doubles marquages impossibles
La première incohérence notée a été le décalage des populations saines d’un marqueur à
l’autre. Normalement, les populations saines doivent être positionnées par réglages des
voltages afin d’être comprises dans le carré de fluorescence négative - valeurs inférieures à
101 dans les différents canaux -. Une fois ce réglage défini, il ne doit plus être modifié selon
les marqueurs, et seules des compensations de fluorescence doivent être réalisées. Ainsi, des
marquages multiples peuvent être effectués afin de mieux définir la population étudiée. Ceci
a pu être réalisé sur le FACScalibur de l’Institut Pasteur de Paris. Or, réaliser des doubles
marquages TO/HE s’est révélé impossible sur l’appareil de l’Institut Pasteur de Dakar, les
populations saines étant complètement décalées lorsque le marqueur est modifié. Si les
réglages du négatif sont définis à partir du TO (figure 52A), lors du passage à un marquage à
l’HE, les formes saines se retrouvent en lieu et place des formes parasitées (figure 52B). Si
l’on effectue à l’inverse le réglage du négatif à partir d’un marquage des formes saines à l’HE
(figure 52C), lorsque l’on se trouve en présence d’un marquage par TO, les formes saines
« disparaissent » (figure 52D).
128
Figure 52 : Visualisation de globules rouges sains marqués par TO (A-D) et HE (B-C), en
fonction que les réglages aient été réalisés à partir de la solution contenant TO (A) ou HE (C).
Ces déplacements de populations neutres en fonction des marquages ne devraient pas exister
et nous ont amené à nous poser les premières questions sur le FACScalibur utilisé. Des billes
CaliBRITE et le logiciel FACScomp ont donc été utilisés afin de recalibrer l’appareil si
besoin. Mais bien qu’ayant eu un rapport FACScomp tout a fait normal, le problème a
subsisté. L’alignement des lasers a également été vérifié et celui-ci s’est également révélé
normal. Nous avons donc repris nos études en considérant que tout double marquage se
révélait impossible pour une raison inconnue et avons fixé nos réglages à partir de l’HE pour
une analyse par HE.
1.2.2) Une autofluorescence qui n’en est pas une
Nous avons commencé des tests de reproductibilité de lecture avec l’HE par le système HTS.
La lecture par HTS repose sur des réglages préalables de l’appareil. Ceux-ci sont
obligatoirement réalisés en tube et sauvegardés avant d’être paramétrés dans le programme
Plate Manager qui gère la lecture par HTS. Par la suite, la lecture se fait donc de façon
entièrement automatisée et aucune ingérence de l’expérimentateur n’est tolérée par l’appareil.
Nous avons alors constaté un deuxième problème ressemblant à un phénomène
d’ « autofluorescence », à savoir une fluorescence non compensable n’ayant pas de raison
d’être. Celui-ci est visible à l’intersection des canaux FL1-FL2 et FL2-FL3. Une véritable
autofluorescence devant être visible sur tous les canaux, nous avons testé le canal FL4 dans
lequel nous n’avons observé aucune fluorescence. Cette hypothèse s’est par conséquent
révélée infondée.
Ce phénomène aurait pu être dû à une « fuite » du marqueur sur plusieurs canaux, phénomène
observable avec certains fluorochromes comme l’iodure de propidium qui fluoresce en FL2 et
A B
C D
129
FL3. Cette supposition était confortée par le fait que les compensations sont inutiles. Mais
dans ce cas comment expliquer qu’elle n’apparaisse pas systématiquement et ne soit pas
visible lors des tests en tubes réalisés sur l’appareil de l’Institut Pasteur de Paris ?
Pour un même sérum testé dans différents puits, ce phénomène est plus ou moins marqué
comme le montre la figure 53.
Figure 53 : « Fuite » de fluorescence plus ou moins importante sur la diagonale visualisée
pour une expérience en triplicata (sérum de personne immunisée)
Dans le cas représenté ici, nous notons clairement trois profils différents alors qu’il s’agit d’un
triplicata, et cela à cause de cette « fuite » le long de la diagonale. Si nous considérons comme
pourcentage de parasitémie tout ce qui fluoresce (R1), nous avons alors des pourcentages très
variés - 0,09%, 0,30% et 0,17% dans le cas présent -. Néanmoins, en faisant abstraction des
populations sur la diagonale (R2), nous obtenons une meilleure reproductibilité - 0,03%,
0,04% et 0,09 % -. Cependant l’apparition aléatoire de ce phénomène n’est pas « normale » et
ne devrait pas être observée.
1.2.3) Un écrasement qui ne correspond pourtant pas à une mort cellulaire
Nous avons également rencontré un troisième problème : la survenue d’un écrasement de la
réponse. Celui-ci se produit également de façon aléatoire, et non pas dans les derniers puits
d’étude. Dans l’exemple choisi à la figure 54, il a été observé au puits D09 alors qu’en E09
nous avons retrouvé un profil des cellules neutres relativement correct. Il ne s’agit donc pas
130
d’un phénomène de mort cellulaire car la composition des puits étant identique, il devrait
s’intensifier au fur et à mesure de l’étude, les puits étant lus ligne par ligne.
Figure 54 : Tassement de la réponse en FL2 (sérum humain passé en triplicata)
Le gros problème de ce phénomène est que les populations neutres « disparaissant »
partiellement du cadre de lecture, les populations parasitées se retrouvent en grande partie en
lieu et place des populations saines. Elles ne sont donc plus comptabilisées comme parasitées.
Ceci entraîne un gros problème du point de vue de la reproductibilité. L’étude étant
entièrement automatisée, ce phénomène n’est absolument pas contrôlable.
1.2.4) Remarques générales sur ces difficultés
Ces différentes difficultés ont été rencontrées essentiellement lors de l’utilisation du passeur
de plaque. Elles sont parfois observables lors de l’analyse en tube mais de façon généralement
atténuée et uniquement en travaillant sur le même appareil. Il semblerait que ces phénomènes
soient dus à des problèmes de pression. Ceux-ci sont bien entendu amplifiés lorsque les
quantités prélevées sont moindres.
Des microfuites et microfissures observables sur le système de pompage du FACScalibur
pourraient être à l’origine de ces problèmes.
L’appareil n’ayant pas été réparé sur ce point durant la période de cette thèse et l’Institut
Pasteur de Paris n’étant pas équipé d’un système HTS, nous n’avons pas pu continuer à
explorer cette voie, pourtant prometteuse.
131
0
,05
,1
,15
,2
,25
,3
Moy
. des
cel
lule
s
'2%
san
s bl
anc
'1%
san
s bl
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'0,5
% s
ans
blan
c
Col
onne
4
Plaq F
Maxisorp
Culture
Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Concentré de GIA plaque.xls ( importé)
0
,05
,1
,15
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,25
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Moy
. des
cel
lule
s
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san
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'1%
san
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'0,5
% s
ans
blan
c
'0,2
5% s
ans
blan
c
Plaq F
Maxisorp
Culture
Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : dilué de GIA plaque 060609.xl s (importé).svd
**
*
2% 1% 0,5% 0,25% 2% 1% 0,5% 0,25%Dépôt des GRp concentré Dépôt des GRp dilué
*Plaque culture
Plaque Maxisorp
Plaque ELISA F
0,3
0,2
0,1
0
0,3
0,2
0,1
00
,05
,1
,15
,2
,25
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Moy
. des
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lule
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Col
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4
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Plaq F
Maxisorp
Culture
Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : dilué de GIA plaque 060609.xl s (importé).svd
**
*
2% 1% 0,5% 0,25% 2% 1% 0,5% 0,25%Dépôt des GRp concentré Dépôt des GRp dilué
*Plaque culture
Plaque Maxisorp
Plaque ELISA F
0,3
0,2
0,1
0
0,3
0,2
0,1
0
0,3
0,2
0,1
0
0,3
0,2
0,1
0
2) Lecture par absorbance : détection de la pLDH
En raison des dysfonctionnements réitérés du cytofluoromètre, nous avons continué l’étude
avec une autre technique pour tenter d’obtenir des résultats plus reproductibles. Nous avons
alors testé les conditions standardisées par le NIH reposant sur une détection de la pLDH
(Zhou, 2005).
2.1) Domaine de définition du test et conditions de réalisation
En étudiant le protocole SOP décrivant cette méthode, nous nous sommes rendus compte
qu’elle avait été standardisée dans des conditions de travail et avec du matériel différent des
nôtres. Les cultures parasitaires sont réalisées dans des conditions gazées avec un milieu
composé de sérum humain, et la lecture du test est réalisée sur plaques Polysorp - plaques
particulières fixant les résidus hydrophobiques -. A l’Institut Pasteur de Dakar, nous utilisons
des plaques Immulon 4HBX, qui sont un équivalent des Polysorp. Cependant, cette étude a
été commencée à l’Institut Pasteur de Paris où nous n’avions que trois types de plaques à
notre disposition : des plaques de culture cellulaire, des plaques ELISA Nunc F - dont nous ne
connaissons pas le caractère hydrophile/hydrophobe - et des plaques Maxisorp qui fixent les
domaines hydrophobes et hydrophiles. Nous avons donc, dans un premier temps, souhaité
mesurer l’impact que pouvait avoir la plaque sur la révélation. Nous avons alors constaté que
selon le type de dépôt des GRp - en condition concentrée ou diluée -, l’utilisation d’une
plaque fixant ou non les résidus hydrophobiques pouvait avoir une influence.
� En condition de dépôt dilué, le type de plaque ne semble jouer qu’un rôle très mineur
� En condition de dépôt concentré, son rôle est beaucoup plus significatif et une plaque
Maxisorp semble souhaitable pour obtenir une plus grande échelle de réponse (cf figure 55).
Figure 55 : Impact du type de plaque et de dépôt sur les résultats du dosage de la pLDH
132
Nous avons donc par la suite préféré utiliser des plaques Maxisorp ou Immulon 4HBX, selon
nos possibilités.
Dans la standardisation des résultats, une limite supérieure de parasitémie de 4% est stipulée
pour la validité du test. Mais aucune limite inférieure n’est mentionnée. Or si l’on étudie les
ratios de parasitémie observés pour les plaques Maxisorp, on se rend compte qu’ils sont
globalement valables pour la dilution de 2% à 1% - 0,6 en dépôt concentré, 0,4 en dépôt dilué
- et entre 1% et 0,5% - 0,5 et 0,4 respectivement -. Cependant, le ratio n’est plus du tout
correct si l’on diminue à moins de 0,5% de parasitémie - entre 0,5% et 0,25%, ratios de 0,08
et 0,7 -.
Cette impossibilité de détecter de manière fiable des parasitémies de moins de 0,5% a été
retrouvée une fois à Dakar avec l’étude sur plaque Immulon 4HBX. L’étude a cette fois pris
en compte des parasitémies de 3%, 1,5%, 0,75% et 0,375%. En utilisant une quantité de GRp
de 1 µL comme définie dans les conditions standardisées et avec un dépôt en solution, nous
avons trouvé des ratios de dilution respectifs de 0,5 , 0,4 et seulement 0,2 pour la dernière
dilution. En revanche, si nous utilisons 2 µL de GRp, comme nous le faisions précédemment
pour le test en cytofluorométrie, nous obtenons un ratio correct pour les trois dilutions - 0,4,
0,5 et 0,4 respectivement -. Augmenter la quantité de GRp pourrait donc éventuellement
permettre une augmentation de la résolution du test.
2.2) Impact du Complément
Ayant développé précédemment un test ne dépendant pas du Complément, nous avons
également étudié l’impact de celui-ci sur ce test d’inhibition. Ce dernier est connu comme
nécessitant des sérums sans Complément.
Les sérums étudiés ont été décomplémentés par chauffage à 56°C et les inhibitions obtenues
avec ou sans la présence du Complément ont été comparées. Nous avons alors observé un rôle
majeur pour ce dernier, tous les sérums testés perdant globalement leur effet inhibiteur en
absence de Complément (cf figure 56).
133
-400
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
Moy
. des
cel
lule
s
SH
I
SH
I déc
ompl
'346
63
'346
63 d
écom
pl.
'346
60
'346
60 d
écom
pl.
'346
61
'346
61 d
écom
pl.
'346
59
'346
59 d
écom
pl.
Diag. en bâtonsBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)
C D C D C D C D C D
Sérums 1 2 3 4 5
-400
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
Moy
. des
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I
SH
I déc
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'346
63
'346
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pl.
'346
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pl.
'346
61
'346
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pl.
'346
59
'346
59 d
écom
pl.
Diag. en bâtonsBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)
C D C D C D C D C D
Sérums 1 2 3 4 5
C D C D C D C D C D
Sérums 1 2 3 4 5
Figure 56 : pourcentages d’inhibition de culture parasitaire suivant que
les sérums soient intactes (C) ou décomplémentés (D)
Cependant, nous n’avons pas obtenu de reproductibilité dans les pourcentages d’inhibitions
d’une ligne à l’autre des plaques d’étude. Nous avons en effet observé cette diminution de
l’effet inhibiteur de façon systématique mais avec une variation de valeur très importante.
Pour exemple, le sérum 1 a varié de 24% à 109% d’inhibition en présence du Complément, et
de 16% à -46% en absence de ce dernier. Ces résultats sont donc à prendre avec précaution,
n’ayant pas pu observer de reproductibilité suffisante.
2.3) Des conditions standardisées non applicables dans nos conditions de croissance
parasitaire
L’origine du problème que nous avons rencontré avec ce test est due en grande partie aux
conditions de croissance parasitaire différentes entre la standardisation et la réalisation. En
effet, avec 1 µL de GRp à 0,3%, après un cycle et dans les conditions utilisées pour la
standardisation, la parasitémie finale obtenue est de 2-3%. En albumax et candle-jar, la
parasitémie augmente bien plus lentement quand les GR sont en faible quantité. Nous
n’atteignons généralement qu’une parasitémie de l’ordre de 0,5% après un cycle, or nous
avons vu que ce résultat est trop faible pour la détection par pLDH.
De plus, tous les puits d’étude ne sont pas réenvahis au même moment, un décalage a en effet
pu être visible par microscopie selon les sérums. Certains puits contenaient des parasites sous
forme anneaux exclusivement alors que pour d’autres, les parasites étaient toujours en
rosaces. Nous avions donc des puits ayant subi deux invasions alors que les autres n’en
avaient eu qu’une seule et cela pour une même durée de test. Cela rend l’étude très difficile,
134
voir impossible. Cette différence a été visible pour un test lancé 27H après la synchronisation
et un temps de GIA de 40H - analyse de 3D7 -. Il semblerait qu’un temps intermédiaire de
24H soit souhaitable, la durée standardisée de 23H ayant été à l’inverse trouvée trop courte.
La croissance parasitaire étant variable, la présence de formes trophozoïtes âgés est préférable
à une nouvelle réinvasion.
Le problème majeur dont nous n’avons pas pu nous affranchir est l’observation, dans nos
conditions, d’effets de croissance pour les sérums immuns supérieurs aux contrôles négatifs.
Cela s’explique par la richesse des sérums qui l’emporte sur l’action des Ac, la quantité des
parasites étant trop faible. Cela a été vérifié pour deux souches parasitaires : PA FCR3 et 3D7.
La méthode GIA, bien que standardisée, est valable pour des conditions de culture qui ne sont
pas les nôtres et la standardisation réalisée n’est pas utilisable dans notre cas. D’autres mises
au point sont nécessaires.
135
PARTIE IV : DISCUSSION
La problématique de base de ce travail était axée sur la validation d’un test fonctionnel. Celui-
ci devait être un reflet, éventuellement plus révélateur que d’autres, de l’immunité. Il devait
pouvoir servir de référence dans l’analyse des candidats vaccins. Le test de
chimiluminescence a répondu à ces exigences.
Cependant, nous ne pouvions étudier les candidats vaccins dans un test fonctionnel sans les
avoir au préalable analysés selon des méthodes plus « classiques » : réponses immunologiques
associées - tests ELISA - et relations avec différents facteurs épidémiologiques tels que l’âge
ou la protection clinique.
Il est important de souligner que le terme « protection » recouvre en réalité différents critères
d’étude. Les études de relation à la protection analysent généralement de façon prospective le
taux d’Ac vis-à-vis de la survenue d’évènements ultérieurs sur une durée plus ou moins
longue. Ces évènements étudiés peuvent être une protection contre la mort, contre les cas
graves, contre la survenue d’accès cliniques, contre l’apparition d’une parasitémie
circulante,… Aussi, lorsque différentes études de protection clinique sont comparées, il est
important de savoir si elles correspondent à l’analyse des mêmes facteurs sur une même
durée. Dans ce travail, nous avons étudié la survenue d’accès cliniques pendant 5,5 mois
suivant les prélèvements sanguins.
Le même type de question se pose lors de l’analyse des corrélations avec l’âge. Les cohortes
étudiées correspondent-elles à un même éventail d’âge et donc étudie-t-on réellement la
même chose? Nous avons travaillé sur une population dont l’âge est distribué entre 3 et 80
ans, en est-il de même pour les autres analyses de corrélation à l’âge avec lesquels nous
pourrions comparer nos résultats ?
Les divers points de cette étude sont discutés dans la suite de ce document : i) les réponses
immuno-épidémiologiques associés aux candidats vaccins étudiés à savoir MSP1p19,
MSP4p20, MSP5 et R23, ii) les tests fonctionnels et l’importance du test de
chimiluminescence développé, et iii) l’impact des Ac liés à certains candidats vaccins dans le
test de chimiluminescence.
136
1) Les taux d’anticorps contre certains candidats vaccins et leur corrélation avec la
protection
1.1) MSP1p19 : confirmation de son caractère majeur
Concernant la construction vaccinale MSP1p19 exprimée par le Baculovirus dans les cellules
d’insectes (BvMSP1p19), une réponse Ac supérieure à un ratio de DO de 7 est apparue
comme extrêmement importante d’un point de vue clinique. En effet, nous avons observé
dans les deux zones d’endémie étudiées, une protection clinique significativement plus élevée
chez les individus ayant atteint ou dépassé ce taux et ce, quelque soit l’âge. Nous avons
également remarqué que ce seuil de 7 est difficilement atteint chez les jeunes enfants. Le
challenge vaccinal pourrait donc être de permettre, dès le plus jeune âge, l’acquisition d’une
réponse Ac contre MSP1p19 suffisamment forte pour permettre une bonne protection
clinique.
Cette valeur de seuil est remarquablement constante. Elle a déjà été trouvé à plusieurs reprises
dans des études menées de manière totalement indépendantes, sur des séries de prélèvements
différents et par des manipulateurs distincts.
� A Ndiop, pour la saison de transmission de l’année 2000, un rDO inférieur à 7
entraînait un risque relatif de faire un accès clinique de 1,30 - P = 0,047, régression de
Poisson -. L’étude avait été réalisée à partir de sérums prélevés en juillet 2000 sur 205
volontaires de tout âge suivis cliniquement pendant cinq mois. Une moyenne de réponse Ac
de 8,1 rDO avait été obtenue (Perraut, 2005 A), résultat inférieur mais globalement similaire
à celui de notre étude pour le même village (9,3).
� En 1997, une étude de repositivation menée à Ndiop sur 110 volontaires a également
mis en relief ce seuil à 7 - moyenne de rDO de 8 -. Une relation significative a pu être établie
avec la durée comprise entre le traitement curatif par antipaludéen et la réapparition d’une
parasitémie - P < 0,01 -. Cependant, cette relation disparaissait quand l’âge était pris en
compte dans le modèle (Perraut, 2003). Ce phénomène peut être expliqué par un effectif
réduit de villageois analysés, fournissant moins de puissance aux tests statistiques.
L’association d’une réponse Ac anti-MSP1p19 supérieure ou égale à 7 rDO avec la
protection clinique est donc particulièrement pertinente, car ayant été retrouvée sur plusieurs
années et pour deux zones d’endémie différentes.
137
La qualité de cette réponse protectrice a pu être montrée par des tests immunologiques
(Garraud, 2002). BvMSP1p19 conduit in vitro, en présence de PBMC, à la production
essentiellement d’IgG1, accompagnées ou non d’IgG3. Ces deux sous-classes cytophiles sont
connues pour leurs effets protecteurs dans le cas du paludisme (Garraud, 2003). A l’inverse,
les IgG non cytophiles, IgG2 et IgG4, sont neutres ou bloquantes et donc potentiellement
impliquées dans les cas de paludisme aggravé (Soe, 2004). Or celles-ci ne sont jamais
retrouvées contre BvMSP1p19 in vivo dans les plasmas. In vitro, l’étude a montré la
production dans quelques rares cas d’IgG2 mais jamais d’IgG4.
Il est cependant important de bien considérer tous ces résultats dans le contexte de la
construction particulière de BvMSP1p19, à savoir l’expression de la construction vaccinale
par le Baculovirus dans les cellules d’insectes. En effet, l’analyse des résultats immuno-
épidémiologiques obtenus à partir de la construction MSP1p19 exprimée dans E. coli
(EcMSP1p19) donne des résultats différents.
� Lors d’une étude menée au Kenya, avant la saison des pluies 2004, sur 72 volontaires,
aucune relation entre l’âge et le niveau de réponse Ac anti-MSP1p19 n’a pu être établie
(Dorfman, 2005).
� De même, une étude menée sur 112 individus au Vietnam, prélevés en juin 1994 et
suivis cliniquement pendant six mois n’a pas permis d’établir une relation entre la protection
clinique ou le délai avant repositivation et la réponse Ac anti-EcMSP1p19 chez les 47
personnes de l’étude considérées comme non prémunies (Wang, 2001).
Plusieurs facteurs semblent pouvoir expliquer ces différences.
� Le premier porte sur l’effectif des sujets participant à ces études. Dans les deux cas
précédents, les cohortes sont plus réduites en nombre d’individus que celles impliquées dans
les études avec la construction BvMSP1p19. Elles sont donc moins significatives du point de
vue de la validité des conclusions.
� Le deuxième facteur porte sur les différences d’étude de corrélation à l’âge ou à la
protection clinique, dont nous avons commencé à discuter dans l’introduction de cette partie.
* Concernant l’étude menée par Dorfman et al., la relation entre le taux d’Ac et l’âge est
biaisée : sur les 72 volontaires, 57 ont entre 5 et 9 ans. La population étudiée est donc très
spécifique d’une classe d’âge pour laquelle l’immunité est en cours d’acquisition. Elle n’est
donc pas le reflet de toute une population comme a pu l’être notre étude. De plus, ils précisent
que néanmoins, ils ont observé une différence significative pour la reconnaissance de
138
EcMSP1p19 : 54% des adultes testés, contre 23% des enfants de la cohorte, sont positifs
contre EcMSP1p19 - P = 0,036 - (Dorfman, 2005). Si la population d’étude avait une
distribution en âge mieux répartie, une relation entre le taux d’Ac anti-EcMSP1p19 et l’âge
serait donc envisageable.
* De même, pour l’étude menée par Wang et al., les 112 personnes ont un âge compris entre 9
et 55 ans. Il n’y a donc pas de jeunes enfants naïfs. De plus, une sélection est réalisée et
l’étude de protection n’est menée en réalité que sur 47 personnes susceptibles de faire un
accès palustre (Wang, 2001). Ils ne spécifient pas la distribution en âge de cette sous cohorte
mais il s’agit à priori d’une sous population plus jeune. Ils cherchent donc à montrer une
éventuelle corrélation avec la protection clinique chez une population qui a été sélectionnée
pour son absence de prémunition. Il ne s’agit donc pas du même type d’étude que la nôtre qui
prenait en compte toute une population, quelque soit son statut immun.
� Le troisième facteur concerne la construction vaccinale en elle-même. Il a été montré
que les structures secondaire et tertiaire de l’Ag sont essentielles pour le caractère protecteur
vis-à-vis de l’infection. Or, le repliement et la formation des ponts disulfures sont plus
délicats à réaliser avec un vecteur tel qu’E. coli (Planson, 2003), comparativement à un
vecteur de type Baculovirus (Pizarro, 2003). Ces résultats pourraient donc suggérer que la
construction BvMSP1p19 présente une meilleure antigénicité qu’EcMSP1p19, car mieux
conformée par rapport à l’Ag natif.
* Cette dernière suggestion est appuyée par une étude comparative multicentrique menée par
l’OMS - programme EuroMalVac - utilisant des lapins vaccinés avec différentes constructions
MSP1 candidat vaccin pour le terrain. Les sérums de lapins ont été testés en aveugle en GIA,
en ELISA, et avec les parasites transgéniques D10-PcMEGF. Les résultats obtenus à partir
d’une vaccination avec BvMSP1p19 ont été meilleurs que ceux dus à EcMSP1p19. Cela a été
vérifié pour les différentes études réalisées (article en préparation). Le caractère plus
immunogène de BvMSP1p19 semblerait donc être plus qu’une supposition.
1.2) MSP4p20 : des études à approfondir
Concernant MSP4p20, les résultats sont moins tranchés et nécessitent d’autres études
complémentaires.
Nous n’avons pas obtenu dans cette étude de relation entre la réponse Ac anti-MSP4p20 et la
protection clinique, et cela aussi bien en zone de méso- que d’holo-endémie. Cependant, une
139
corrélation entre la réponse anti-MSP4p20 et la protection clinique avait été trouvée lors du
suivi clinique sur cinq mois des 205 individus de tout âge prélevés en juillet 2000 à Ndiop.
Pour cette étude, une médiane de ratio de DO de 17,3 avait été obtenue. Une dichotomie basée
sur cette valeur entraînait un risque relatif de 1,33 pour les personnes ayant une réponse en
ELISA inférieure, et cela indépendamment de l’âge - P = 0,018, régression de Poisson -
(Perraut, 2004). Ce seuil n’a pas pu être testé dans nos études, les rDO maximales obtenues
contre BvMSP4p20 pour juillet 2002 étant de 14,7 et 15, respectivement pour Ndiop et
Dielmo. Comment expliquer de telles variations d’amplitude ? Correspondent-elles à des
titres similaires ou bien sont-elles le reflet d’une véritable différence de réponses entre ces
deux années ? Ce type de résultats permet de souligner l’intérêt de l’étude des candidats
vaccins en ELISA par la méthode du Dr Remarque qui permet de définir un « titre ».
Cependant cette méthode est lourde car elle nécessite de tester au moins 3 dilutions de chaque
sérum et d’inclure une gamme complète de titration du standard positif par plaque. Nous
aurions dû multiplier par 4 à 6 le nombre de plaques ELISA dans nos études.
Une autre étude basée sur le suivi clinique pendant six mois de 112 Vietnamiens prélevés en
juin 1994 et menée sur EcMSP4 ou ScMSP4 (MSP4 exprimé par Saccharomyces cerevisiae)
n’a pas donné de résultat concluant. Aucune relation avec l’âge ou la protection clinique n’a
pu être observée, et cela quelque soit le vecteur d’expression utilisé et pour les 47 personnes
considérées « à risque » (Wang, 2001).
Cependant, bien qu’étudiant dans cette étude et dans notre travail les réponses liées à l’Ag
MSP4 d’un point de vue immuno-épidémiologique, de nombreuses restrictions sont à faire
concernant la comparaison de ces deux travaux.
� Comme nous l’avons vu précédemment (cf §1.1), cette étude n’a été réalisée que sur
une sous population sélectionnée pour son risque de faire un accès palustre. Il ne s’agit donc
pas du même type de relation à l’âge ou à la protection clinique que dans notre étude. De plus
l’échantillon est nettement plus réduit, aussi bien en nombre qu’en différence de statut
immun, limitant la puissance des analyses statistiques.
� Outre le fait que MSP4 soit exprimé dans des vecteurs différents, l’étude implique la
protéine entière et non uniquement son fragment terminal MSP4p20.
� Enfin, comme pour MSP1p19, la protéine comporte des ponts disulfures. Des
structures secondaires et tertiaires similaires à celles de la protéine native semblent
indispensables à une fonctionnalité (Wang, 1999). Les constructions issues de différents
vecteurs peuvent donc également présenter des différences d’antigénicité.
140
Il semble donc important de pouvoir de nouveau analyser les réponses Ac anti-PfMSP4 de
cette transversale 2002, en particulier en y incluant les divers fragments de MSP4, pour
exploiter l’ensemble des données
1.3) MSP5 : un « nouveau » candidat vaccin prometteur
Concernant la construction vaccinale BvMSP5, nous avons trouvé une corrélation entre la
réponse Ac qui lui est liée et la protection clinique pour les deux zones d’endémie testées. Ces
résultats positifs viennent conforter un précédent résultat, obtenu à partir de la cohorte de
Ndiop de juillet 2000 et étudiée de façon similaire. Les études ELISA avaient fait ressortir
une médiane de réponses de 2,4 rDO. Celle-ci, prise comme seuil pour la dichotomie des
réponses Ac, engendrait une relation avec la protection clinique. Le risque relatif de faire un
accès palustre pour les individus ayant une réponse ELISA moindre, et ce quelque soit l’âge, a
été trouvé égal à 1,45 - P = 0,003, régression de Poisson - (Polson, 2005 A). Ce seuil est
similaire à celui trouvé par l’analyse menée à Dielmo pour l’année 2002. Concernant
l’analyse menée à Ndiop en 2002, aucun seuil n’avait été défini, les rDO devant être étudiés
en continu. Trois analyses, portant sur des années et des villages différents, ont donc permis
d’établir pour ce candidat vaccin une relation avec la protection clinique (article en
préparation). Ces résultats soulignent l’intérêt de cette construction pour un développement
vaccinale ultérieur, d’autant qu’elle ne présente pas de variabilité en fonction des souches
parasitaires (Polson, 2005 A) (Polson, 2005 B).
La construction BvMSP5 présente une particularité atypique : elle est doublement myristilée,
par la présence de deux acides gras à 14 carbones sur la construction vaccinale. Cette
particularité a été mise en évidence suite à une analyse par spectrométrie de masse puis
confirmée via l’injection dans les cultures d’acide myristilé marqué au tritium (Longacre et
al., données non publiées).
Une étude complémentaire substantielle devra être menée afin de déterminer le rôle éventuel
des acides gras comme cofacteur d’expression de MSP5, et cela à différents niveaux.
� Validité des mesures des réponses Ac obtenues en ELISA ?
� In vivo, quel est le rôle des groupements myristiles dans la protection clinique ?
� Possibilité de produire le candidat vaccin avec les groupements myristiles ?
141
Ces questions sont importantes dans la mesure où nos connaissances actuelles sur l’Ag natif
ne nous permettent pas de savoir si il est ou non myristilé à un moment ou un autre du
processus d’invasion.
La présence de ces groupements myristiles apporte un doute sur la validité des réponses
ELISA obtenues avec cette construction.
� Les analyses contrôlant l’efficacité des déplétions pourraient laisser supposer
qu’environ 25% de la réponse Ac détectée contre BvMSP5 seraient non spécifiques. En effet,
pourquoi ces déplétions seraient-elles quasi-totales pour BvMSP1p19 et BvMSP4p20 et de
seulement 74% pour BvMSP5 ? Une reconnaissance Ac des groupements myristiles pourrait
être à l’origine du phénomène.
� Inversement, on pourrait émettre l’hypothèse que les groupements myristiles masquent
partiellement MSP5. La conséquence en serait une moins bonne reconnaissance de la
construction vaccinale par les Ac. Cela expliquerait le pourcentage plus faible de répondeurs
obtenu par rapport aux autres MSP testées.
Concernant l’effet éventuel des groupements myristiles dans la protection clinique, nous
pouvons citer une étude menée par Kumaratilake et al. (Kumaratilake, 1997). Elle a montré
qu’in vitro les acides gras influencent l’activité des PNN - qu’en est il in vivo ? -. Suivant le
nombre de carbones (C) constituant les acides gras utilisés, on observe une augmentation (de
20 à 22 C), une diminution (> 28 C) ou un effet neutre (18 C) par rapport à l’activité
antiparasitaire des PNN. Nous n’avons pas trouvé d’étude portant sur l’impact des acides gras
à 14 C. Toutes les hypothèses doivent donc être envisageables.
Les groupements myristiles présents sur MSP5 représentent-ils pour le candidat vaccin une
force, un désavantage, ou bien n’ont-ils aucun impact ?
1.4) R23 : des variabilités importantes
Concernant les études immuno-épidémiologiques de R23, nous avons, comme pour
BvMSP4p20, des résultats différents d’une année à l’autre.
� Dans notre étude, concernant les deux zones d’endémie, nous n’avons trouvé aucune
corrélation entre la réponse Ac anti-R23 et la protection clinique.
142
� Pour l’étude de repositivation de 1997 menée sur 110 habitants de Ndiop, une telle
corrélation ajustée sur l’âge avait pu être déterminée. Le facteur risque trouvé était de 1,25
pour les individus n’étant pas répondeurs en Ac anti-R23 - P = 0,04, régression de Poisson -.
Cependant, lors de cette même étude, il n’y avait pas de relation entre les réponses Ac anti-
R23 et la durée de repositivation, le temps de portage asymptomatique ou le moment
d’apparition du 1er épisode clinique (Perraut, 2003). Aucune relation avec ces trois facteurs
n’ayant été obtenue, comment expliquer le lien avec le nombre d’accès palustres? Quel est le
rôle de ces Ac ?
� Lors d’une étude menée à Ndiop et Dielmo en mars et décembre 1996, aucune relation
entre les Ac anti-R23 et la protection clinique n’a pu être détectée. Néanmoins, des niveaux
d’Ac significativement plus faibles ont été relevés en décembre, soit en fin de saison de
transmission intense (Perraut, 2000). Ce dernier résultat suggère que, lors des accès palustres,
ces Ac ont été consommés et que cette consommation n’a pas été compensée par une
production suffisante.
Afin de mieux comprendre la réponse Ac liée à R23, une étude visant à déterminer la qualité
de la réponse protectrice a été menée (Garraud, 2002). In vitro, la construction vaccinale R23,
en présence de PBMC, induit la formation des quatre sous-classes d’IgG possibles. Les sous-
classes d’IgG les plus fréquemment retrouvées ont été les IgG1 et IgG2. Des IgG2 et IgG4 ont
parfois été décelées comme seuls Ac spécifiques formés, réponses allant habituellement à
l’encontre d’une protection anti-palustre (Schreiber, 2006). Cette non spécificité de réponse
pourrait être à l’origine des différences de protection retrouvées selon les études. Elles
pourraient dépendre de la sous-classe d’IgG majoritairement présente au moment de l’étude.
Mais comment expliquer une telle différence de réponse Ac selon les individus ou les
périodes ? Quel(s) facteur(s) influence (nt) le type d’isotype des Ac se liant à R23 ?
R23 induit une réponse majoritairement IgG1 et IgG2, deux types d’Immunoglobulines
généralement considérées comme très différentes, l’une étant cytophile et l’autre non.
Néanmoins, une étude a montré que dans certains cas de polymorphisme, les IgG2 pouvaient
être considérées par les récepteurs Fc comme des IgG1 cytophiles (Chappel, 1993). Ce
polymorphisme spécifique serait-il plus fréquemment présent pour les IgG2 visant R23 et
cette caractéristique expliquerait-elle alors les résultats trouvés par Garraut et al. ?
Cela n’est pas la seule interrogation que suscite cette construction vaccinale. Des analyses par
microscopie de fluorescence ont montré que l’Ag natif correspondant à R23 n’est pas toujours
143
présenté à la surface du GRp. Ce phénomène de présentation ou non de l’Ag a été étudié par
Mercereau-Puijalon et al.. Ils ont montré que l’Ag est systématiquement surestimé en
condition de stress (O. Mercereau-Puijalon - communication personnelle).
Cette présentation non systématique de l’Ag pourrait intervenir dans l’intensité des réponses
Ac détectées et les différences de corrélation observées entre les réponses Ac et la protection
clinique. Il serait intéressant d’étudier ce phénomène en le rapprochant des résultats issus de
ce travail pour les personnes à profil drépanocytaire hétérozygote AS. Leurs réponses Ac sont
significativement plus élevées en ELISA vis à vis de la construction R23. Cela est-il
simplement dû à la forme des GR de type AS, qui permettrait une meilleure présentation de
l’Ag ? Ou bien à une présentation plus systématique de celui-ci à la surface du GR qui serait
due au « stress » des parasites lié à un manque d’oxygène dans les GR de type AS ou bien à
un métabolisme intracellulaire légèrement différent à l’intérieur de ceux-ci ?
2) Les tests fonctionnels : des références à définir
La plupart des études immuno-épidémiologiques ont été menées à partir de résultats ELISA.
Or, ce test quantifie tous les Ac sans lien avec leur fonctionnalité réelle dans la protection.
C’est la raison pour laquelle des tests fonctionnels de référence doivent également être définis
et normalisés (Miller, 1997).
2.1) Le test d’inhibition de culture : un test de référence difficile à adapter
Parmi les tests fonctionnels existants, un a déjà acquis ce statut de test de référence. Il s’agit
de l’inhibition de culture, réalisé avec une lecture par dosage de la pLDH. Un protocole de
type « Standard Operating Procedure » a été validé par une commission de standardisation des
bio-essais de l’OMS (Zhou, 2005).
Plusieurs articles sont parus à ce sujet au cours de ces deux dernières années. Ils avaient
comme objectif une optimisation des tests d’inhibition de culture et la définition du meilleur
protocole de lecture (Persson, 2006) (Bergmann-Leitner, 2006) (Miura, 2007).
Les deux méthodes qui apparaissent comme les plus fiables sont les lectures par dosage de la
pLDH ou par cytofluorométrie. Persson et al. arrivent à la conclusion que la cytofluorométrie
est la méthode la plus précise, résultat qui nous semble probant dans le cadre de nos essais
144
partiels. En effet, si le fluorochrome est bien choisi et l’appareil en parfait état, toutes les
formes parasitaires peuvent être détectées et quantifiées. Le dosage de la pLDH quant à lui
nécessite des trophozoïtes âgés ou des schizontes. Ceci peut engendrer une moins bonne
précision. Pourtant Bergmann-Leitner et al. ont jugé cette méthode comme la plus
satisfaisante.
Bien que standardisé, ce test nous a posé de nombreuses difficultés. Nos conditions de travail
ne nous ont pas permis d’obtenir les résultats escomptés. Des difficultés dues à des problèmes
d’appareillage ou à des conditions induisant une croissance parasitaire insuffisante nous ont
finalement bloqués.
Les tests d’inhibition de culture avaient pu être réalisés à l’Institut Pasteur de Dakar avec des
cultures en albumax de la souche FUP via une lecture par hypoxanthine tritiée, après de
nombreuses mises au point (Diouf, 2002). Ces mises au point ne sont plus applicables dès
qu’un facteur est modifié, de même que les conditions standardisées réalisées aux Etats-Unis
ne sont pas directement applicables pour un laboratoire du Sud, les conditions étant
différentes. Toute technique doit donc être validée et restandardisée au Sud avant de pouvoir y
être utilisée.
2.2) L’ADCI : un test difficile à reproduire ne pouvant pas encore devenir une référence
L’ADCI est un autre test fonctionnel basé sur la réponse Ac. Il a été très utilisé par l’équipe de
P. Druilhe et très largement décrit (Bouharoun-Tayoun, 1990) (Bouharoun-Tayoun, 1995)
(Druilhe, 1997) (Jafarshad, 2007). Ce test a permis l’identification d’un nouveau candidat
vaccin prometteur, l’Ag MSP3 (Oeuvray, 1994).
Cependant, bien que présentant un réel intérêt, ce test fonctionnel a été très peu utilisé par des
laboratoires extérieurs. Peu d’équipes ont publié sur ce sujet (Shi, 1999) (Tebo, 2001) ou sur
l’utilisation de ce test (Zhou, 2006). L’explication tient dans la difficulté qu’il représente en
terme de variables à maîtriser et de reproductibilité. Un travail fait état de l’impossibilité de
reproduire les résultats précédemment établis, malgré tous les efforts fournis pour y arriver.
Sur 17 sérums de personnes vivant en zone d’hyperendémie, aucune ADCI n’a pu être
détectée (Rzepczyk, 1988).
145
Il est clair que les tests fonctionnels de destruction parasitaire par des cellules et dépendant
des Ac sont complexes car impliquant un système multifactoriel variable avec les cellules
« naturelles » humaines. Dans le cadre de l’ADCI, cette difficulté a été décrite dans le détail et
de manière quantitative récemment (Zhou, 2006). L’ADCI y permet une évaluation de
l’efficacité d’un candidat vaccin, le FALVAC-1A. Pour cela, des IgG de lapins vaccinés ont
été testés avec des monocytes humains. Les résultats sont présentés comme positifs : des
résultats similaires auraient été obtenus avec les sérums de lapins vaccinés et les personnes
immunisées. Cependant, si l’on analyse plus précisément les données rapportées, on note des
problèmes de reproductibilité majeurs. En effet, toutes les expériences réalisées ne sont pas
prises en compte dans les résultats finaux. Plus de 30% des essais n’ont pas été retenus dans
l’analyse, les contrôles positifs donnant des résultats inférieurs à 10% d’inhibition. Si on
examine la figure résumant les données des expériences retenues, on note que pour un même
sérum les pourcentages d’inhibitions oscillent de plus de 50% entre les différentes
expériences - lapin R3123 oscillant de 0 à 53% d’ADCI, contrôle positif humain oscillant de
12% à 68% d’ADCI, pour ne citer que deux exemples -. Le problème de reproductibilité a été
contourné dans l’étude en travaillant non pas directement sur les résultats mais sur les
moyennes des réponses valides obtenues. Cela n’est pas acceptable pour un test standardisé de
référence. C’est donc la raison pour laquelle, à l’heure actuelle, il nous semble difficile de
classer ce test comme un test de référence pour l’évaluation des candidats vaccins.
2.3) La phagocytose des mérozoïtes en chimiluminescence : une variante simplifiée de
l’ADCI ?
L’ADCI est donc difficile à mettre en œuvre de façon réellement reproductible. De plus, son
mécanisme n’est à l’heure actuelle toujours pas élucidé. L’intermédiaire fonctionnel dans la
destruction parasitaire n’a pas été clairement identifié (Druilhe, 1997). Cependant, comme
nous l’avons décrit de façon approfondie dans la discussion de l’article portant sur le
développement du test de chimiluminescence (cf annexe), nous faisons l’hypothèse que les
deux tests reposent sur le même processus. En effet, les expériences réalisées par l’équipe de
P. Druilhe pour invalider le rôle des ROS (Lunel, 1989) (Bouharoun-Tayoun, 1995) ne
semblent pas totalement concluantes. La durée de vie des PNN ne permet pas d’étudier leur
action pendant 24h et leur technique de purification est très agressive et longue - ficoll,
sédimentation, lyse et lavages -. De même, le choix de l’utilisation de la superoxyde
dismutase et de la catalase comme seuls inhibiteurs de ROS est discutable et n’est pas
146
exhaustif pour tester l’hypothèse d’action des ROS car elles n’ont pas d’effet sur le singulet
de l’oxygène. Quant au TNFα, médiateur associé à l’ADCI, il est connu pour être un
activateur de la poussée respiratoire.
A ces arguments développés dans l’article (cf annexe), nous pouvons en ajouter d’autres
portant sur des similitudes observées. Concernant les Ac, il a été montré qu’en ADCI un fort
taux d’IgG1 ne suffit pas. Il est nécessaire qu’il y ait un équilibre entre les taux d’IgG1 et
d’IgG3 comportant un excès d’IgG1 (Shi, 1999). Ce résultat a également été trouvé pour
l’analyse de la chimiluminescence. De plus, cette même étude a montré que le récepteur des
IgG des monocytes important pour ce test est FcγRIIA - comme pour la chimiluminescence -,
et que les mérozoïtes jouent un rôle crucial dans le déclenchement de la coopération
monocyte/Ac. Enfin, il a également été montré que les IgG non cytophiles gênaient le
phénomène d’ADCI et impliquaient une baisse de réponse (Druilhe, 1997) (Bouharoun-
Tayoun, 1995), phénomène également vrai pour la phagocytose immune (Groux, 1990).
Concernant la chimiluminescence, des résultats similaires ont été obtenus lors d’une étude
portant sur les personnes atteintes de neuropaludisme. Lorsque la gravité de la maladie
augmente, le taux d’IgG4 augmente - P < 0,001 -. Or, les personnes décédant des suites de la
maladie ont présenté des réponses en chimiluminescence significativement plus faibles que
les personnes ayant eu une issue favorable - P = 0,003 - (Mbengue, 2007).
Beaucoup de similitudes peuvent donc être notées entre ces deux tests. Reposent-ils en réalité
sur le même phénomène de poussée respiratoire ? Dans ce cas, notre test présenterait des
avantages majeurs sur l’ADCI. Il est reproductible et moins long dans sa réalisation car ne
s’intéressant qu’à l’étape du test impliquant les mérozoïtes. Il est également plus facilement
maîtrisable, le nombre de paramètres et variables étant réduits.
Le test de chimiluminescence nous semble être un test pouvant servir de référence afin de
compléter les tests d’inhibition de culture pour évaluer l’antigénicité des candidats vaccins.
Nous allons maintenant discuter du test en lui-même et des avantages qu’il présente.
147
3) La chimiluminescence, un test fonctionnel reflet de l’immunité naturelle
3.1) Un test ne dépendant pas exclusivement de la quantité d’anticorps
Le test de phagocytose via détection de la poussée respiratoire par chimiluminescence est un
test dépendant des Ac, ou plus exactement de leur capacité fonctionnelle. En effet, ce n’est
pas la seule présence des Ac qui permet de détecter une réponse positive en ADPm. Il
semblerait qu’un certain équilibre IgG1/IgG3 doive être respecté à l’avantage des IgG1. Mais
il ne permet pas à lui seul d’expliquer la totalité de la réponse.
De plus, il est important de noter que le taux d’IgG totales dirigées contre les Ag du mérozoïte
n’est pas lié à la protection clinique si l’on tient compte de l’âge - cohorte Ndiop Non Parasité
-. Ce résultat avait déjà été trouvé avec l’étude sur 5 mois des sérums prélevés en 2000 à
Ndiop - P = 0,97 - (Perraut, 2005 A).
Aussi, le test de chimiluminescence étant quant à lui associé à la protection clinique, il ne peut
pas être expliqué par une action due à la seule quantité d’IgG anti-mérozoïtes. Leur spécificité
et leur cytophilie sont cruciales.
Nous pouvons également souligner que la présence ou non du Complément n’est pas critique.
Ce résultat avait déjà été montré (Kumaratilake, 1992).
3.2) Amélioration de la méthode par utilisation de cytokines ?
Le test de suivi de la poussée respiratoire par chimiluminescence a été étudié dans ce travail
de façon la plus exhaustive possible. Cependant, il manque à cette étude l’analyse de
l’utilisation des cytokines comme facteur d’activation. Leur usage est une perspective qui
permettrait éventuellement d’améliorer la méthode.
L’activation préalable des PNN par des cytokines issues de cellules Th1, comme le TNF,
l’IFN γ, etc., permet d’augmenter la capacité de poussée respiratoire des PNN (Kumaratilake,
1994) et donc d’intensifier le signal de chimiluminescence observé (Kumaratilake, 1992).
Nous pouvons supposer qu’une réponse trop faible des PNN pour être analysable pourrait être
contournée par l’activation préalable. Si cette hypothèse venait à être confirmée, cela
résoudrait une des deux difficultés liées à cette méthode, la deuxième étant l’absence de
lignée cellulaire cultivable in vitro.
148
Cependant, les études de corrélation de l’ADPm avec la protection clinique seraient à
reprendre intégralement. Cette activation a été montrée comme variable selon les individus et
comme faisant perdre de la spécificité dans la réponse dépendante des Ac (Ferrante, 1988)
(Kumaratilake, 1994). Il faudra étudier si cette perte de spécificité est similaire pour chaque
sérum, n’entraînant qu’une hausse du bruit de fond compensée par une augmentation plus
importante de la réponse spécifique. Ou inversement, si cette activation venait à entraîner une
perte complète du caractère spécifique de ce test.
Cette activation, en plus de rendre le test beaucoup plus onéreux, permettrait-elle réellement
d’améliorer la méthode ou au contraire lui ferait-elle perdre toute spécificité ? La corrélation
obtenue de l’ADPm avec la protection clinique serait elle toujours vérifiée? La question reste
largement ouverte.
3.3) Un test fonctionnel associé à la protection clinique
De nombreux rapports et articles font état de l’absence de tests fonctionnels standardisés
permettant d’appuyer les tests précliniques et cliniques. Ceux-ci sont vivement attendus par la
communauté scientifique car ils permettraient de réduire les coûts des essais cliniques et
d’augmenter l’efficacité de leur pouvoir prédictif (OMS, 1997) (Giersing, 2006). Jusqu'à
présent, aucun test n’avait permis d’avoir une corrélation satisfaisante entre ses résultats et la
protection clinique (Snounou, 2007).
La problématique de ce travail était d’atteindre cet objectif : définir un ou plusieurs tests de
référence pour l’évaluation des candidats vaccins. La chimiluminescence est apparue comme
remplissant les critères requis.
Ce test présente plusieurs avantages par rapport au test d’inhibition de culture. En effet, bien
qu’étant un test de référence, les pourcentages d’inhibition de culture observés ne sont pas liés
à l’âge et aucune différence de réponse n’est observée lors des accès cliniques (Perraut, 2005
B), à la différence de la chimiluminescence. De plus, les résultats du test d’inhibition de
culture n’ont jamais pu être associés à la protection clinique (Mahanty, 2003), y compris lors
d’une étude menée dans le village de Ndiop (Perraut, 2005 A). Cependant, ce test fonctionnel
est déjà utilisé pour le suivi d’essai clinique d’AMA-1. (Malkin, 2005). Des études
précliniques menées chez la souris, le lapin et le singe ont montré que le taux d’Ac était lié à
149
l’inhibition de la croissance parasitaire. Partant de ces conclusions, il a été supposé que ce test
permettait de juger l’impact de la vaccination in vivo. Cependant, il peut conduire à des
conclusions qui se révéleraient par la suite infondées. L’utilisation d’un test, dont la réponse
est statistiquement associée à la protection chez l’homme comme l’est la chimiluminescence,
représente un atout supplémentaire pour une meilleure analyse des effets des candidats
vaccins.
En effet, la chimiluminescence est associée à la protection clinique comme le montre cette
étude. Cela a été vérifié pour les deux zones d’endémie testées malgré des conditions
totalement différentes en terme de population immunes et d’effectifs à risque d’épisodes
fébriles. On obtient une même dichotomie à une valeur d’ADPm de 250 pour l’étude du
nombre d’accès palustres, et cela malgré des réponses statistiquement différentes dans les
deux villages. En zone d’holoendémie, sa réponse prise en analyse continue a également été
trouvée comme étant reliée à la protection clinique. Ces résultats fournissent un argument
important pour la validité et l’originalité de ce test.
Cette relation avec la prémunition avait déjà été soupçonnée par l’équipe de P. Druilhe dans
les années 1990. Son équipe étudiait la chimiluminescence obtenue avec des mérozoïtes
purifiés par simple centrifugation. Ils avaient observé que les réponses étaient statistiquement
plus élevées pour les sérums immuns que non immuns. De même, en zone d’endémie, les
adultes répondaient mieux que les enfants. Ils avaient donc suggéré que le test était prédictif
du statut de protection des individus (Lunel, 1990).
Il est important de noter que les relations avec la protection clinique sont généralement
étudiées sur des animaux, dans des conditions expérimentales ne reflétant pas la réalité. Les
différences avec les réponses in vivo sont dues à l’utilisation de souches adaptées, à la
purification d’IgG dénaturant leurs effets, à la complexité des tests entraînant des sources de
variabilité, ou encore à la non considération de la cascade complexe d’évènements
physiologiques qui provoquent la destruction parasitaire chez l’homme. Les résultats ainsi
obtenus n’ont qu’une fiabilité relative pour juger une éventuelle représentativité chez
l’homme (Mahanty, 2003) (Perraut, 2005 B). Or la relation observée dans notre étude repose
sur une analyse statistique basée sur un suivi clinique objectif et précis des populations. La
corrélation obtenue entre l’ADPm et la protection observée in vivo chez l’homme est donc
particulièrement intéressante. Elle est très différente des études positives ou négatives menées
150
chez les modèles animaux - y compris les primates - car potentiellement bien plus
représentative.
4) Application directe de la chimiluminescence pour la sélection de candidats vaccins
Une application directe de la chimiluminescence en vaccinologie a pu être réalisée grâce à
l’étude des mérozoïtes transgéniques ou des sérums déplétés. Ces deux méthodes nous ont
permis de réaliser des études portant spécifiquement sur le déclenchement de la poussée
respiratoire. Nous avons noté un impact important des Ac réagissant avec BvMSP1p19 et
BvMSP4p20 dans ce phénomène. Leur implication dans le test ayant été mise en évidence,
nous savons qu’au moins une de leur fonctionnalité réside dans l’activation de ce phénomène.
Enfin, concernant les Ac anti-MSP1p19, l’étude à partir des mérozoïtes transgéniques D10-
PcMEGF a mis en relief la diversité de leur fonctionnalité. Nous avons vu qu’ils étaient
impliqués dans une coopération avec les effecteurs cellulaires. Environ 30% de la réponse en
ADPm peut leur être attribuée - 32% de diminution obtenue avec D10-PcMEGF, 29% avec
les sérums déplétés -. De plus, ils ont également une action directe. En inhibition de culture,
25% de l’inhibition est perdue lors de l’utilisation des parasites transgéniques (O'Donnell,
2001). Ces résultats issus de tests fonctionnels confirment ainsi l’importance de ce candidat
vaccin. Les Ac qui lui sont associés semblent agir de diverses façons du point de vue du
système immunitaire.
151
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Dans ce travail de thèse, nous avons eu l’occasion d’évaluer in vitro l’efficacité de différents
candidats vaccins via des analyses immuno-épidémiologiques ou via le test fonctionnel de
chimiluminescence. Nous avons également étudié le test fonctionnel d’inhibition de culture,
avec différents modes de lecture. Ces résultats, assortis de la confrontation avec les données
de la littérature, nous ont permis de répondre à notre problématique. Celle-ci revenait à
déterminer et standardiser un test fonctionnel reflet de l’immunité.
Nous avons pu aboutir à la conclusion que le test de chimiluminescence est un test
reproductible qui est surtout associé à la protection clinique en zone d’endémie. Nous avons
donc, après de nombreuses mises au point, abouti à la standardisation d’un test fonctionnel,
reflet d’un type de l’immunité palustre. Cette dernière étant multiple, un seul test ne peut pas
en être un reflet complet.
Concernant les candidats vaccins testés, nos conclusions et perspectives sont multiples.
� Concernant BvMSP1p19, nos résultats ont tous conforté l’impact majeur de ce
candidat vaccin dans la protection clinique. Nous l’avons de nouveau retrouvé relié à la
protection clinique, et cela pour les deux villages étudiés et avec le même seuil à 7 rDO. Les
Ac qui lui sont associés sont donc protecteurs, mais un taux élevé est nécessaire pour ce faire.
Ils sont de plus très efficaces d’un point de vu fonctionnel comme cela avait été montré en
inhibition de culture et comme nous l’avons observé dans le test de phagocytose. Il semblerait
donc que ce candidat vaccin ait sa place en essais cliniques. � Concernant BvMSP4p20, les résultats sont controversés. Les Ac qui lui sont associés
n’ont pas été trouvés comme reliés à la protection clinique. Cependant, ils sont fonctionnels
dans le test de phagocytose. Il est donc nécessaire d’approfondir les études sur ce candidat
vaccin, sachant que dans le passé, son caractère protecteur avait été montré. � S’agissant de BvMSP5, bien que non fonctionnel en chimiluminescence, les Ac qui lui
sont liés ont été retrouvés pour la deuxième fois comme associés à la protection clinique. Sa
fonctionnalité ne serait pas reliée au déclenchement de la poussée respiratoire comme
MSP1p19 ou MSP4p20 mais serait bien réelle. Il faudrait l’étudier dans un autre type de test,
comme par exemple les inhibitions de culture, afin de déterminer quel type de fonctionnalité
lui est associé. Il est également primordial d’étudier l’effet des deux groupements myristiles
qui lui sont liés, afin de connaître leur éventuel impact sur la protection - positif ou négatif -.
152
� EcR23 n’a pas fourni de résultats concluants dans cette étude. Seul son impact chez les
personnes drépanocytaires hétérozygotes AS pourrait ouvrir de nouveaux champs
d’investigation afin de mieux comprendre son mode de présentation et donc son rôle.
Concernant les tests fonctionnels, nous n’avons pas pu, pour diverses raisons, réaliser le test
d’inhibition de culture. Il nécessiterait un travail plus approfondi que nous n’avons pas pu
réaliser dans cette étude.
Cependant, le test de chimiluminescence a pu être développé, optimisé et standardisé. Son
mode de fonctionnement nous a semblé élucider des incompréhensions sur celui de l’ADCI :
les ROS seraient des effecteurs majeurs dans les deux tests. Nous avons également pu, via le
calcul d’ADPm, permettre la standardisation des résultats et leur conférer une bonne
reproductibilité. Les résultats obtenus nous ont permis de montrer l’impact des Ac anti-
MSP4p20 et anti-MSP1p19 dans le déclenchement de la poussée respiratoire, via l’utilisation
de sérums déplétés et/ou de mérozoïtes transgéniques. Cependant cela n’a pas pu être obtenu
pour MSP5, montrant ainsi la spécificité du test dans la validation de candidats vaccins. Des
corrélations entre l’ADPm et la protection clinique en zone de méso- et d’holo-endémie ont
également pu être définies, avec le même seuil de réponses dans les deux cas. Il semble donc
important, au vu de tous ces résultats concluants, que ce test soit repris par d’autres équipes.
Si, en utilisant la méthodologie développée dans ce travail, des résultats similaires sont
retrouvés, alors ce test pourrait devenir un test de référence. Il pourrait être utilisé non
seulement pour les tests précliniques, mais également pour les essais cliniques en phase I, but
ultime de ce travail.
153
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