pcd (2) 04.07.2016.ppt [kompatibilit tsmodus]) · 3 cytochrom c-freisetzung durch...
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Programmierter Zelltod (Programmed Cell Death, PCD)
„can‘t live with it,
can‘t live without it“
„programmed cell
death“ (PCD)
� Apoptose bei Tieren (phagocytotischer Zelltod)
� AutophagocytotischerZelltod (vorherrschend bei Pflanzen, selten bei Tieren)
� „Hypersensitiver Zelltod“ (HR) bei der pflanzlicher Abwehr
„unkontrollierter“
Zelltod
� nekrotischer Zelltod
Formen des Zelltods
Vorlesung E. Weis
� Kein festgelegte zelluläres oder genetisches Programm
� weder eigene noch fremde Lysosomen treten in Aktion
� Ausgelöst durch Hitze oder andere extreme abiotische Stress-
Einwirkungen.
� Zellmembranen werden undicht, die Zelle läuft aus!
(messbar durch „ion leakage“)
Nekrotischer Zelltod
Vorlesung E. Weis
Programmierter Zelltod (PCD)
� Zellulärer Suizid (bei allen Eukaryoten!)
kommt bereits bei Einzellern vor (z.B. Protozoen)
komplexere Formen bei Metazoen
� Energie-abhängig & genetisch programmiert
ausgelöst durch spez. intra- und extrazelluläre Signale
Vorlesung E. Weis
� Zell-Differenzierung (z.B. Xylem- und Aerenchym-Bildung)
� Organbildung - Beseitigung überschüssiger Zellen, z.B. Suspensor
(Embryonalentwicklung), Calyptra (Wurzelspitze), Trichome (Blatt)
� Beseitigung geschädigter Zellen
z.B. bei Mitose oder nach Stress
� Seneszenz
� Abwehr
Pflanzliche Prozesse, bei denen PCD eine
Rolle spielt
Vorlesung E. Weis, Abb. aus Buchanan ed. Biochem Mol. Biology of Plants
Externe vs. interne Induktion der Apoptose
Vereinfacht & verändert nach Ashkenazi A. (2002) Nat. Rev. Can. 2:420–430.
Caspase 3, 6, 7
Apoptosis
Pro-apoptotischer Ligand (tumor necrosis factors � Cytokine)
Caspase 9
Caspase 8, 10
p53
Mitochondria
Cytochrome c
DNA damage
FADD
DR5
DR4
Extrinsischer Weg
nach extrazellulärer
Liganden-Bindung
Pro-caspase 8, 10
Intrinsischer Weg
schließt p53 (Kern)
und Cytochrom c
(Mitochondrien) ein
(Death cell receptors)
MERKE: Beide Induktionswege münden in einer Caspase-Kaskade
Tnf-β
Nucleus
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Caspasen vermitteln beim apoptotischen Zelltod
Caspases: cysteine aspartate-specific proteases
� Konservierte Cystein-Protease-Familie
� Proteolytische Aktivierung aus inaktiven Vorläufern
(Pro-Caspasen)
� Caspase-Kaskade
� schneiden von Ziel-Proteinen an Asparaginsäure (Asp)-Resten
� dadurch werden Apoptose-relevante Proteine aktiviert
� „Caspase-like proteases“ auch in Pflanzen, Pilzen und Protozoen
http://www.biooncology.com/bioonc/images/apoptosis-image-lg.jpg
Drei Aktivierungsprinzipien:
1. Externe Aktivierung über
„cell-death receptors“
2. Interne Aktivierung durch
DNA-Schäden (vermittelt
durch p53 im Kern)
3. Aktivierung durch ROS
Vorlesung E. Weis
Apoptotischer Zelltod (in Tieren)
Rezeptor-abhängige Caspase-Aktivierung
Vorlesung E. Weis
Auf der cytosolischen Seite veranlassen
aktivierte “cell-death receptors”, dass
Pro-Caspase 8 und 10 in aktiveCaspasen umgewandelt werden.
Der mitochondriale Weg
Intrinsische Signale (p53) führen
zur Bildung von Poren in der
Mitochondrien-Hülle und
Freisetzung von Cytochrom c.
(aber auch extrinsiche Signalekönnen zur Freisetzung von
Cytochrom c führen).
Vorlesung E. Weis
Freigesetztes Cytochrom c aktiviert weitere Caspasen.
+ ATP
Aktivierung von Pro-Caspase 9:
� Cytochrom c bindet an Apaf-1 Proteine
� Apaf-1/Cyt. c- Komplexe bilden ein
„Apoptosom“, an welchem Pro-
Caspase 9 zu Caspase 9 aktiviert wird
(erfordert ATP!)
� Caspase 9 aktiviert weitere Caspasen
(3, 6 & 7) � Zelltod (Apoptose)
Der mitochondriale Weg
Vorlesung E. Weis
Merkmale der tierischen Apoptose
� Kern-Fragmentierung
� Ausbildung „apoptotischer Körper“ (→ Zelltod)
� Phagozytose durch Macrophagen (oder andere Zellen)
� Lysosomaler Verdau (hier: Fremdverdau!)
Vorlesung E. Weis;
Abb aus Lam E. (2004): Controlled cell death, plant survival and development. Mol. Cell Biology 5, 305-315.
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� Cytochrom c-Freisetzung
� Caspase-Aktivierung
� Aktivierung Apoptose-spezifischer Endonucleasen
Molekulare Merkmale der Apoptose
DNA-Leitern(im Agarose-Gel)
Vorlesung E. Weis
Nachweis von apoptotischem Zelltod
TUNEL-Nachweis
TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling
Durch apoptotische Endonukleasen enstehen
3´OH-Enden, die mithilfe der Terminal deoxy-
nucleotidyl-Transferase (TdT) markiert werden
können (Einbau von biotinylierten Nukleotiden).
Detektion im Gewebe mittels Fluoreszenz-Mikroskopie
http://www.nature.com/ki/journal/v65/n6/images/4494517f8.gif
Vorlesung E. Weis
DNA laddering
Durch apoptotische Endonukleasen entstehen Oligo-
nukeotid-Fragmente (oder Vielfache davon), die bei
Gelelektrophorese charakteristische Leitern erzeugen
(Regelmäßigkeit durch Besetzung mit Histonen).
Autophagozytotischer Zelltod in Pflanzen durch
Selbstverdau
� Verdau zellulärer Bestandteile/Organellen durch das zelleigene
System, lytische Vakuolen in Pflanzen (Lysosomen in Tieren)
� vakuoläre Cystein-Proteasen (Teil der „vacuole processing enzymes“, VPEs) mit Caspase-ähnlicher Wirkung („caspase-like proteases“), aber
unterschiedlicher Kompartimentierung („echte“ Caspasen im Cytosol).
� 3 Unterformen: „Mikro“-, „Makro“- und „Mega“-Autophagozytose
Vorlesung E. Weis; Abb. aus Lam E. (2004): Controlled cell death, plant survival and development. Mol. Cell Biology 5, 305-315.
„Mikro“-Autophagozytose
� Verdau kleiner Bestandteile des Cytosols
� Kommt bei Pflanzen und Tieren vor (Schutz vor Verhungern)
� Noch reversibel!
Lebende Zelle Zelltod
Zellkern Vakuole (Lysosom)Mitochondrium
ER
Golgi
Abb. aus: Doorn, van W. et al. (2005): Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in plant science 3, 117-122.
Bei Tieren kommt zwar auch Mikro-Autophagozytose vor, aber es wird keinAutophagozytotischerZelltod beobachtet!
„Makro“-Autophagozytose
� Verdau ganzer Organellen
� Einschluss der Organellen in Autophagosomen (mit Doppelmembran!)
� Fusion mit Vakuole(n)
� Irreversibel (→ Zelltod)
Lebende Zelle Zelltod
Autophagosom
Vakuole
Vorlesung E. Weis; Abb. aus: Doorn, van W. et al. (2005): Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in plant science 3, 117-122.
„Mega“-Autophagozytose
� Einschluss und Verdau des gesamten Cytoplasmas in der Vakuole
(Kollaps des Protoplasten)
� Typisch bei Entwicklung und Organdifferenzierungen
� Irreversibel (→ Zelltod)
Lebende Zelle Zelltod
Vorlesung E. Weis; Abb. aus: Doorn, van W. et al. (2005): Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in plant science 3, 117-122.
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Beispiele für autophagozytotischen Zelltod
in Pflanzen
Roberts and McCann, 2001Gunawardena et al., 2004
„leaf shaping“ Xylogenese � Differenzierung in männliche &
weibliche Blütenorgane
� Seneszenz
� Wurzelhaube (Verschleimen)
� ...
http://agritech.tnau.ac.in/seed/seedconcepts.html
http://virtualplant.ru.ac.za/Main/ANATOMY/onionrt.jpghttp://www.angenetik.fu-berlin.de/agkunze3/AGK3_research.html
Beispiele für autophagozytotischen Zelltod
in Pflanzen
Vorlesung E. Weis; Abb. aus: E. Lam 2004 Mol. Cell Biology (Nature Reviews) 5 (Controlled Cell death, Plant survival and Developement)
Hypersensitiver Zelltod in Pflanzen
� Noch einige apoptotische Merkmale, wie z.B.
- DNA-Spaltung in regelmäßige Fragmente (� laddering)
- Chromatin-Kondensation
- Cytochrom c-Freisetzung (aus Mitochondrien)
- Aktivierung von „Caspase-like“-Proteasen
� Schrumpfen von Vakuole und Protopast (aber keine apoptotischen Körper!)
� schnell (Minuten bis wenige Stunden)!
Vorkommen: z.B. bei der pflanzlichen Abwehr als „Hypersensitive Reaktion“ = HR
Nachweis mittels Propidium-Jodid ⇒ violett (rote Fluoreszenz: Chlorophyll).
3 hpi 6 hpi 9 hpi 12 hpicontrol
� Propidium-Jodid ist (wie Ethidium-Bromid) ein DNA-Farbstoff
� Über die desintegrierten Membranen gelangt es nur in tote Zellen
� Dort interkaliert der Farbstoff zwischen gestapelte Basen(paare)
Vorlesung E. Weis
Entwicklung des Hypersensitiven Zelltods (HR)
nach Infektion eines Tabakblattes
In den sterbenden Zellen ist das Schrumpfen des Cytosols zu erkennen (weißer Pfeil)(hpi : hours post infection)
„Cross talk“ bei Induktion von PCD in Pflanzen
„schnell“ versus „langsam“
ROS, SAROS, SAParasiten,
Infektion
Parasiten,
Infektion
z.B. Verwundung,
Entwicklung
(Seneszenz)
z.B. Verwundung,
Entwicklung
(Seneszenz)
EthylenEthylen
ROS, JAROS, JAAutophagozytotischer Zelltod
⇒ langsam!
Autophagozytotischer Zelltod
⇒ langsam!
Hypersensitiver Zelltod (HR)
⇒ schnell!Hypersensitiver Zelltod (HR)
⇒ schnell!
� Vergl. auch Vorlesung zur „Abwehr“
Apoptose-„like“
„Selbstverdau“