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Screening Screening nachnach neuenneuenWirkstoffenWirkstoffen –– was was kannkann

man von computerman von computer--basiertenbasierten MethodenMethoden

erwartenerwarten??

Prof. Dr. Wolfgang SipplInstitut für Pharmazie

Martin-Luther-UniversitätHalle-Wittenberg

WirkstofforschungWirkstofforschung heuteheute

2

Hoher Aufwand Hoher Aufwand –– Steigende KostenSteigende Kosten

Jahre

Phase I

> 100.000 neue

Verbindungen

Klinische PhasenPhase II

Phase III

Zulassung

PräklinischeForschung 20

10

1

1000 Mio $ArzneimittelEntwicklungsphasen

0 2 4 6 8 10 12

22

55

Wie Wirkstoffe effizient finden?Wie Wirkstoffe effizient finden?

Wirkstoffforschung ist…

Die Suche nach der Nadel im Heuhaufen

3

Eine LEine Löösung?sung?• Computer-Aided Drug Design

1970-1980 Erste Computer-Grafik Systeme(Tektronix, Silico Graphics, …)

• Computer-Aided Drug Design

1970-1980 Erste Computer-Grafik Systeme(Tektronix, Silico Graphics, …)

Eine LEine Löösung?sung?

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Eine LEine Löösung?sung?• Computer-Aided Drug Design

Time

Expe

ctat

ion

Neuer Neuer HypeHype in den 80ern: CADD in den 80ern: CADD

5

Time

Fortune 1981: Fortune 1981: „„NextNext industrialindustrial revolutionrevolution““

Einsatz CADD heuteEinsatz CADD heute

6

GlivecGlivec®®

Blockiert die Blockiert die TyrosinTyrosin KinaseKinase BCRBCR--ABL ABL –– die in die in -- 90% aller chronischen 90% aller chronischen myeloidenmyeloiden LeukLeukäämie Fmie Fäälle lle üüberaktiv ist (beraktiv ist (GendefektGendefekt, Philadelphia Chromosom), Philadelphia Chromosom)

NH

N

N NH

N

NR N NH

N

NNH

R

O

N

NH

O

NN N

HN

N

N

Hit PKC Optimierter Hit - Leitstruktur AmideATP Mimic

Imatinib (Glivec®)BCR-ABL Tyrosin Kinase Inhibitor (u.a. PDGFR, c-KIT, ...)

ProteinProtein--Ligand KristallstrukturLigand Kristallstruktur

Die frühzeitige Aufklärung der 3D Struktur der cABLKinase lieferte Hinweise für die Optimierung des Wirkstoffes

7

ImatinibImatinib

Imatinib

Wie lassen sich effizient neue Wirkstoffe mit Wie lassen sich effizient neue Wirkstoffe mit computercomputer--basiertenbasierten Methoden finden?Methoden finden?

8

Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening

Substanzdatenbanken Protein 3D Struktur

Sortierung

BiologischeTestung

• Verwaltung großer Datenbanken mit verfügbaren Verbindungen

• Filterung Arzneistoff-ähnlicher Verb.• Suche nach chemisch ähnlichen Verb. mit

hoher Chance auf biol. Aktivität• Suche nach Verb. mit Hilfe eines

Pharmakophormodells• Docking von Verb. in 3D Strukturen

von Targetproteinen• Auswahl von Verb. für biol. Testung

Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening

9

Suchmethoden fSuchmethoden füür Molekr Moleküülele

Form

MolekulareFelder

AD

DAr

3D Pharmakophore

3-PunktPharmakophore

Fragmente

2D- Fingerprints

2D- Fingerprints

N

NH

NH3+

Atom Pfade

Graphen

PharmakophorPharmakophor ModelleModelle

Chemische Features die für die Auslösung des biol. Effekts relevantsind

Ligand-basierte Pharmakophormodelle: Vergleich mehrerer MoleküleStruktur-basierte Pharmakophormodelle

10

StrukurStrukur--basierterbasierter PharmakophorPharmakophor

Anordnung von chemischen Features, die für die biol. Wirkungrelevan sind

Chemische Features: - Electrostatische WW- H-Brücken- Hydrophobe WW

LigandScout, Inteligand

ProteinProtein--Ligand Docking/Ligand Docking/ScoringScoring

Bindungsstärke?

Ligand Docking und Ligand Docking und ScoringScoring

Sampling Problem Scoring Problem

Score

11

0

60

120

180

240

300

360

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 und größer

bis RMSD

Num

bers

,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

120,00%

Cum

lativ

e %

< 2.5 Å RMSD: GOLD/ Goldscore 78%ParaDocks 79%GOLD/ Chemscore 69%

~800 Protein-Ligand Komplexe

Reproduktion der experimentell bestimmten Ligand-Struktur

Genauigkeit DockingGenauigkeit Docking

RMSD - Maß für Genauigkeit

Vorhersage der BindungsstVorhersage der Bindungsstäärkerke

Score

12

VirtuellesVirtuelles Screening Screening alsals effizienteeffizienteMethodeMethode zurzur AuffindungAuffindung erstererster

biologischbiologisch aktiveraktiver VerbindungenVerbindungen

BeispielBeispiel: Histon: Histon--ArgininArgininMethyltransferaseMethyltransferase PRMT1PRMT1

HistonHiston--MethyltransferasenMethyltransferasen

•• Arg/Arg/LysLys Methylierung reguliert die Interaktion Methylierung reguliert die Interaktion der Histone mit der DNA und steuert die der Histone mit der DNA und steuert die epigenetischeepigenetische RegulationRegulation

•• Histone Arginine Methyltransferases (PRMT)Histone Arginine Methyltransferases (PRMT)•• PRMTs sind SAM abhPRMTs sind SAM abhäängige Enzymengige Enzyme•• Methylieren Histone und Methylieren Histone und NichtNicht--HistonproteineHistonproteine

N

N N

N

NH2

O

OH OH

S+

NH3+

COO

CH3

N

N N

N

NH2

O

OH OH

S NH3+

COO

PRMTsPRMTs

SAM + Arg---Histone SAH + N-Methyl-Arg---HistoneSo, CW et al. Nat. Cell. Biol. 10, 1208, 2007

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hPRMT1 mit hPRMT1 mit KofaktorKofaktor SAM und ArgSAM und Arg

rat PRMT3 rat PRMT1

Histon SubstratBindungstasche

Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening

Substanzdatenbanken Protein 3D Struktur

Sortierung

BiologischeTestung

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Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening

• Verwendete Datenbanken• NCI Diversity Datenbank ~2 000 Verbindungen• Chembridge Datenbank ~400 000 Verbindungen

• Verwendung von 3D Strukturen• Stereoisomere, Tautomere, Protonierung, Konformationen

• Arzneistoff-Filter • Drug-likeness, ADME Filter

• Ligand Docking• 3D Struktur der Substratbindungstasche PRMT1• Visuelle Auswertung Bindungsmodus

• Auswahl von 36 Verbindungen • In vitro Testung humane PRMT1• 7 Inhibitoren mit IC50 1.7 – 76 µm

Spannhoff A, et al., J Med Chem 50, 2319, 2007

PRMT1 InhibitorenPRMT1 Inhibitoren

NH

N

O O

O

ONH

S

NH2

O

O

(1)

NH

NH2

NH

NH2

(2)(2) 1.7 µM IC50 hPRMT1 (3) 55 µM

NSC35605

Spannhoff A, et al., J Med Chem. 50, 2319, 2007

15

ZellulZellulääre re AktivititAktivititäätt / Selektivit/ Selektivitäät t

25 50 1502

0

25

50

75

100

Met

hyla

tion

leve

l (%

)

25 50 150 µM

H4R3 H3K4 (SET7/9)

Hypomethylierung in HepG2 ZellenSelektivität für Histon H4R3

25 50 150 25 50 15

0 25 50 150

0

25

50

75

100

1 2 3

c(µM)

Met

hyla

tion

leve

l (%

) AMI-1

Substrat-kompetitiv

NH

NH2

NH

NH2

(2)

NSC 35605

µM

HighHigh--ThroughputThroughput ScreeningScreening• Biol. Testung von 9 000 strukturell diversen

Verbindungen (Chembridge Diversity) lieferte 9 aktive Inhibitoren – meist SAM Analoge (Hit Rate ~0.1 %)

• Nur eine Nicht-SAM Verbindung mit Selektivität gegenüber PRMT1 identifiziert

OH

NH

NH

O

OH

SO3O3SNa

+Na

+

- -AMI-1

HighHigh--ThroughputThroughput--ScreeningScreening

Bedford et al. J Biol Chem 279, 23892, 2004

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SucheSuche nachnach WirkstoffenWirkstoffen wennwenn keinekeine 3D 3D StrukturStruktur des Targetproteins des Targetproteins verfverfüügbargbar

istist

BeispielBeispiel: : SucheSuche nachnach neuartigenneuartigenHistaminHistamin HH33--AntagonistenAntagonisten

HH33 Rezeptor Rezeptor

• Keine 3D Struktur des H3 Rezeptors verfügbar

• GPCR

• Membranprotein

• Wichtiger Auto/Hetero

Rezeptor im ZNS

• Antagonisten zur

Steigerung kognitiver

Funktionen

Homologiemodell des H3 Rezeptors

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PharmakophorPharmakophor ModellierungModellierung

Datensatz mit aktiven H3 Antagonisten

H3 Pharmakophor Modell

PharmakophorPharmakophor ModellModell

CATALYST

Validierung anhand aktiver Antagonisten (~400)Diskriminierung aktiver und inaktiver Verbindungen

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Wie sensitiv ist der Wie sensitiv ist der PharmakophorPharmakophor??

Datenbank mit 13 000Verb. versus

H3 Antagonisten

Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening

• Datenbank• Maybridge Database ~55 000 Verbindungen

• 3D Strukturen (~13000)• Stereoisomere, Auswahl von basischen

Verbindungen• Pharmakophor Modell - CATALYST

• Validiert an 418 aktiven Liganden• Ligand Docking GOLD (~1700)

• Visuelle Analyse des Bindungsmodus • Auswahl von 7 Verbindungen für die

biologische TestungSchlegel, B. et al. JCAMD 2007

19

NH

NH

ON S N

O

NCl

NN O

Cl

CF3

CF3NH

NH

S

NO

CF3

CF3

N

NO

N N

O N

N CF3

CF3

NH

ClNH

OCl

SO

N

HTS-07217 PD-00043 RJC-03033

BTB-12683 CD-04850 CD-06177

BTB-08079

Getestete VerbindungenGetestete Verbindungen

- Alle 7 aktive Antagonisten mit Ki zwischen 79 nM – 6 µM- 2 Potente Antagonisten (nM) mit neuem Chemotyp

BTBBTB--0807908079

KI 79 nM hH3

20

ÄÄhnlichkeit zu bekannten Antagonistenhnlichkeit zu bekannten Antagonisten

0.4587.8979BTB-08079

0.5682.212958CD-06177

0.4760.136258CD-04850

0.5165.973655BTB-12683

0.5981.10383RJC-03033

0.5579.211024PD-00043

0.4572.892459HTS-07217

Tanimoto Coefficient

GoldScoreKi (nM)Compound

Chemische Ähnlichkeit

WieWie lassenlassen sichsich WirkstoffeWirkstoffe mitmit HilfeHilfe von von computercomputer--basiertenbasierten MethodenMethoden

optimierenoptimieren??

BeispielBeispiel: : BerechnungBerechnung der der freienfreienBindungsenergieBindungsenergie von Proteinvon Protein--Ligand Ligand

KomplexenKomplexen mitmit MolekMoleküüldynamikldynamikSimulationenSimulationen

21

Freie BindungsenergieFreie Bindungsenergie

Ligand-protein Komplex

Wassermoleküle

∆Sint

∆H, ∆Shydr∆H, ∆Sinserted water

∆HDR

Wee1 Kinase Wee1 Kinase

22

MolekMoleküüldynamik Simulationldynamik SimulationBetrachtung der Protein-Ligand Interaktion mittels Moleküldynamik Simulation

MMMM--PBSAPBSA

144 Wee1 Kinase Inhibitoren

23

VorhersageVorhersage

30 neue Inhibitoren

Ziel: Ziel: SelektivititSelektivititäätsplotstsplots ffüür Kinasenr KinasenSelektivitätsplots für verschiedene Inhibitoren an verwandten Kinasen

24

ZusammenfassungZusammenfassung

•• ComputerComputer--basiertebasierte Methoden als Methoden als essentieller Bestandteil der essentieller Bestandteil der präklinischenpräklinischenWirkstoffforschungWirkstoffforschung

•• Wichtig als Ideengenerator für die Wichtig als Ideengenerator für die Synthese und TestungSynthese und Testung

•• Virtuelles Screening liefert oft Virtuelles Screening liefert oft komplementäre Treffer zum HTSkomplementäre Treffer zum HTS

•• Ziel: Schnelle Vorhersage der Profile von Ziel: Schnelle Vorhersage der Profile von Wirkstoffen (Selektivitäten, Wirkstoffen (Selektivitäten, AntiAnti--TargetTargetEffekte, ADME)Effekte, ADME)

AcknowledgementsAcknowledgements• Dr. Sonja Schlimme - Suhaib Shekfeh• Dr. Rene Meier - Luca Carlino• Urszula Uciechowska - Ralf Heinke• German Erlenkamp• Martin Pippel• Kanin WichapongMartin-Luther-Universität

Halle-Wittenberg

Albert-Ludwigs-UniversitätFreiburg

• Prof. Manfred Jung• Dr. Astrid Spannhoff• Jörg Schemies• Martin Schmitt• Dr. Robert Neugebauer

Heinrich-Heine-UniversitätDüsseldorf

• Prof. H.-D. Höltje• Dr. Birgit Schlegel

Universität Regensburg • Prof. R. Seifert• David Schnell

Johann-Wolfgang-GoetheUniversität Frankfurt

• Prof. H. Stark

Leopold-Franzens UniversitätInnsbruck

• Prof. Thierry Langer• Dr. Gerhard Wolber• Dr. Christian Laggner

Funding: EU FP7, DFG, Krebshilfe, Sander Stiftung, Land Sachsen-Anhalt