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Signaltransduktion in der T-Zellaktivierung
Reporter-Gen-Assay
Molekulare Zellbiologie von Immunzellen
Blockpraktikum SS 2008
Referenten: Felix Eppler, Sibylle Molt
10.07.08
Einleitung
• Phosphorylierung der der Tyrosinreste der ITAMs durch Src-Kinasen
• Rekrutierung der Syk-Kinase ZAP-70
• Aktivierung von ZAP-70 durch Tyrosin-Phosphorylierung von Lck und Fyn
Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
Zap70
• Tyrosinkinase Phosphoryliert die Adapterproteine SLP-76 und LAT (linker of T cell activation)
• Aktivierung der PL Cγ und Ras-Proteine• Ausgelöste Signalkaskade aktiviert die
Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB binden an die jeweiligen Erkennungssequenzen im IL-2 Promotor Induktion der Synthese des IL-2
• IL-2 fördert die Proliferation und Differenzierung der T-Zelle
Cytohesin-1
• Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF) für kleine ADP-Ribosylierungsfaktoren
• Überwiegend in Zellen des hämatopoetischen System exprimiert
• Wurde als spezifischer Interaktionspartner der β2-Untereinheit (CD18) des Integrins LFA-1 identifiziert (Kolanus et al.)
Ziel des Versuchs
• Untersuchung des Einflusses von Zap70 und Cytohesin-1 auf den IL-2 Reporter und damit auf die T-Zellaktivierung
• Ist Cytohesin-1 an Signalkaskaden der T-Zellaktivierung beteiligt?
• Mutanten – Zap70K- inaktive Mutante (dominant negativ)– Zap70Y292F funktionserhöhende Mutante
Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
• Dominant-negative Cytohesin-1 Sec-7 Mutante (Cytohesin-1 E157K) in Jurkat E6 T-Zellen unterbindet nicht nur den GDP/GTP-Austausch an ARF1, sondern auch die LFA-1-vermittelte Adhäsion an ICAM-1
Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
IL-2 Reporter-Gen Assay
• Hinter der Promotor-Region wurde das IL-2 Gen durch eine Luciferase cDNA ersetzt Luciferaseexpression wird dadurch u.a. von den Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB kontrolliert
Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
Luciferase Assay System
• Luciferase spaltet das Substrat Luciferin in Anwesenheit von ATP zu Oxyluciferin
• Die emittierten Photonen können mit Hilfe eines Luminometers detektiert werden
Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
Versuchsdurchführung
• Elektroporation der LT-Zellen mit Marker (GFP), Reporter (IL2) und Test-DNA (Vektorkontrolle, Cytohesin1 wt, Cytohesin1 E157K, Zap70K-, ZAP70Y292F)
• Stimulation der Zellen für 6 Stunden mit Okt3 (α CD3ε) und PMA (Phorbolester)
• Überprüfung der Transfektionseffizienz Bestimmung der GFP-Expression der einzelnen Transfektionen im FACS
• Messung der Luciferase Aktivität (Luminometer) und Proteinkonzentration (mittels BCA)
• Excel Auswertung
Ergebnisse
Als Beispiel: Transfektionseffizienz von Cytohesin-1 E157K ermittelt durch FACS-Analyse (27,66%)
ErgebnisseTransfektionseffizienz Proteinkonzentration
(mg/ml)Luciferase Aktivität
Vektorkontrolle 26,6% Stim (1): 0,739
Stim (2): 0,803
Us (1): 0,756
Us (2): 0,67
Stim (1): 210213
Stim (2): 205821
Us (1): 979
Us (2): 1173
ZAP70 K- 19,9% Stim (1): 0,671
Stim (2): 0,87
Us (1): 0,692
Us (2): 0,823
Stim (1): 4553
Stim (2): 4442
Us (1): 516
Us (2): 691
ZAP70 Y292F 20,27% Stim (1): 0,633
Stim (2): 0,686
Us (1): 0,616
Us (2): 0,655
Stim (1): 44713
Stim (2): 51351
Us (1): 823
Us (2): 808
Cytohesin-1 wt 11,7% Stim (1): 0,857
Stim (2): 0,976
Us (1): 0,963
Us (2): 0,846
Stim (1): 59143
Stim (2): 53592
Us (1): 262
Us (2): 309
Cytohesin-1 E157K 27,66% Stim (1): 0,48
Stim (2): 0,88
Us (1): 0,634
Us (2): 0,783
Stim (1): 92826
Stim (2): 115140
Us (1): 1712
Us (2): 1770
Ergebnisse
Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten aus 2 Experimenten
Diskussion
• Vektorkontrolle stimuliert: IL2-Promotor wird sehr effizient aktiviertVektor hat keinen Einfluss auf T-Zellaktivierung
• ZAP70 K- stimuliert:
IL2-Promotor wird kaum aktiviert
ZAP70 hat eine wichtige Funktion im Rahmen der T-Zellaktivierung
Diskussion
• ZAP70 Y292F stimuliert:schwache Aktivierung des IL2-PromotorsMutante scheint negative Einwirkung auf die T-
Zellaktivierung zu habenEine erhöhte Aktivierung des IL2-Promotors
wäre zu erwarten gewesen (Zeitlmann et al., 1998)
Müsste mit einem neuen Ansatz nochmals durchgeführt werden
Diskussion• Cytohesin-1 E157K stimuliert:sehr schwache Aktivierung des IL2-PromotorsDominant negative Mutante scheint negativen
Einfluss auf T-Zellaktivierung zu haben
• Cytohesin-1 wt stimuliert:sehr effiziente Aktivierung des IL2-Promotorsleichte Steigerung gegenüber der
VektorkontrolleCytohesin-1 scheint eine Rolle in der T-
Zellaktivierung zu spielen