stimulationsversuche mit crh an menschlichem myometrium
TRANSCRIPT
Aus der Universitäts-Frauenklinik
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br
Stimulationsversuche mit Corticotropin-Releasing
Hormone (CRH) an menschlichem Myometrium
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2007
von Almut Hampel
geboren in Neuss
Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters
1. Gutachter: PD Dr. Wolfgang Schäfer
2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Ralf Gutwald
Jahr der Promotion: 2008
„Nicht der Beginn wird belohnt,
sondern einzig und allein das Durchhalten.“
Katharina von Siena
Inhaltsverzeichnis I
I Inhaltsverzeichnis
II Abkürzungsverzeichnis........................................................................IV
1 Einleitung................................................................................................ 1
1.1 Die Geburt beim Menschen...................................................................... 1
1.1.1 Anatomische Grundlagen der schwangerschaftsspezifischen Strukturen 1
1.1.2 Physiologische Zusammenhänge zur Steuerung von Schwangerschaft
und Geburt ............................................................................................... 5
1.2 Das CRH-System................................................................................... 10
1.2.1 CRH ....................................................................................................... 11
1.2.2 CRH-Bindeprotein .................................................................................. 12
1.2.3 Urocortin ................................................................................................ 13
1.2.4 CRH-Rezeptoren.................................................................................... 14
1.3 Biologische Wirkungen von CRH ........................................................... 16
1.3.1 Die Bedeutung von CRH für die Geburt ................................................. 16
1.4 Prostaglandine ....................................................................................... 19
1.4.1 Biosynthese und Metabolismus der Prostaglandine...............................20
1.4.2 Bedeutung der Prostaglandine für die Geburt ........................................ 22
1.4.3 Prostaglandin-Rezeptoren im Myometrium ............................................ 24
1.5 Zielsetzung dieser Arbeit........................................................................ 27
2 Material und Methoden ........................................................................ 28
2.1 Material .................................................................................................. 28
2.1.1 Kommerziell erhältliche Chemikalien und Lösungen.............................. 28
2.1.2 Kits ......................................................................................................... 31
2.1.3 Selbst hergestellte Puffer und Lösungen ............................................... 31
2.2 Patientinnendaten .................................................................................. 33
2.3 Methoden ............................................................................................... 36
2.3.1 Gewinnung und Präparation der Gewebeproben................................... 36
2.3.2 Kurzzeit-Gewebekultur von Myometriumbiopsien zur Untersuchung der
Prostaglandin-Synthese ......................................................................... 38
2.3.3 Lactatdehydrogenase (LDH)-Test .......................................................... 41
2.3.4 Enzymimmunoassays (EIAs) ................................................................. 43
2.3.5 Zellkultur von RC-4B/C1- und AtT20-Zellen........................................... 47
Inhaltsverzeichnis II
2.3.6 Ribonukleinsäure (RNA)-Extraktion ....................................................... 50
2.3.7 RT-PCR ................................................................................................. 53
2.3.8 Immunhistochemie (IHC) und Immuncytochemie (ICC) ......................... 56
3 Ergebnisse............................................................................................ 61
3.1 Prostaglandinsekretion im Myometrium ................................................. 61
3.1.1 Prostacyclin............................................................................................ 61
3.1.2 PGE2 ...................................................................................................... 67
3.2 IHC und ICC........................................................................................... 68
3.2.1 Histologische Charakterisierung von Myometriumbiopsien.................... 68
3.2.2 Immuncytochemische Untersuchung von RC-4B/C1-Zellen .................. 78
3.3 ACTH-EIA als CRH-Bioassay ................................................................ 79
3.3.1 Basale Zeitkinetik ................................................................................... 80
3.3.2 Vergleich verschiedener Kulturmedien................................................... 81
3.3.3 CRH als Stimulationsfaktor .................................................................... 81
3.4 Laborinterne Qualitätssicherung ............................................................ 84
3.4.1 Vitalität der Myometriumbiopsien ........................................................... 84
3.4.2 Parallelmessungen beim 6-keto-PGF1α-EIA........................................... 86
3.4.3 Intra- und Interassayvariabilität der EIAs ............................................... 87
3.4.4 Pipettenvergleich und Kontrolle des EIA-Readers ................................. 88
3.4.5 Molekularbiologische Untersuchung von RC-4B/C1- und AtT20-Zellen.91
4 Diskussion............................................................................................ 93
4.1 Untersuchungen zur Wirkung von CRH im Myometrium........................ 93
4.1.1 Prostaglandine ....................................................................................... 93
4.1.2 Histologische Charakterisierung des Myometriums ............................... 99
4.1.3 Verteilung der CRH-Rezeptoren im Myometrium................................. 101
4.2 CRH-Bioassay...................................................................................... 107
4.3 Methodische Aspekte........................................................................... 108
4.3.1 Gewebekultur ....................................................................................... 109
4.3.2 Interindividuelle Unterschiede .............................................................. 110
4.3.3 Prostaglandin-Assays .......................................................................... 111
4.4 Ausblick................................................................................................ 113
5 Zusammenfassung ............................................................................ 115
6 Literatur .............................................................................................. 116
Inhaltsverzeichnis III
III Abbildungsverzeichnis.........................................................................VI
IV Tabellenverzeichnis ............................................................................VIII
V Danksagung...........................................................................................IX
Abkürzungsverzeichnis IV
II Abkürzungsverzeichnis
3-2B12 Fibroblasten-Ak Klon 3-2B12
5B5 Fibroblasten-Ak Klon 5B5
6-keto-PGF1α 6-keto-Prostaglandin F1α
A260 Absorption bei 260 nm
A280 Absorption bei 280 nm
A320 Absorption bei 320 nm
Abb. Abbildung
ABC-Komplex Streptavidin-Peroxidase-Komplex
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
AFP Alpha-Fetoprotein
Ak Antikörper
AP Alkalische Phosphatase
AtT20 Maushypophysen-Zelllinie AtT20
BEL Beckenendlage
bp Basenpaare
BSA Bovines Serum Albumin
Ca2+
Calcium
cAMP Cyclisches Adenosin-Monophosphat
CAP Contraction-Associated Protein
cDNA Complementary DNA
cGMP Cyclisches Guanosin-Monophosphat
COX Cyclooxygenase
CRE cAMP-Response Element
CRH Corticotropin-Releasing Hormone
CRH-BP CRH-Bindeprotein
CRH-R1 CRH-Rezeptor 1
CRH-R2 CRH-Rezeptor 2
Cx Connexin
DcZAHL Choriale Dezidua von Patientin Nr.ZAHL
D-PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
DAB 3,3’-Diaminobenzidin
ddH2O Wasser von mindestens doppelt-destillierter Reinheit
DEPC Diethylpyrocarbonat
DHEAS Dehydroepiandrosteronsulfat
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP Desoxynucleosidtriphosphat
DP PGD2-Rezeptor
ECCC European Collection of Cell Cultures
EDTA Ethylene Diamine-Tetra Acetic Acid
EIA Enzym-Immunoassay
EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium
EP PGE2-Rezeptor
ERK Extracellular-Signal-Related Kinase
FBS Fetal Bovine Serum
FP PGF2α-Rezeptor
Gαs/q/i-Protein Guanylnucleotid-bindendes-Protein
GR Glucocorticoid-Rezeptor
HBSS Hank’s Balanced Salt Solution
HEPES N(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethansulfonsäure
ICC Immuncytochemie
IHC Immunhistochemie
IL Interleukin
IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium
IP PGI2-Rezeptor
Abkürzungsverzeichnis V
IP3 Inositoltriphosphat
IUGR Intrauterine Growth Retardation
K Konzentration
KB Kilo-Basen
kDa Kilo-Dalton
KP Kontrollprobe(n)
LDH Lactat-Dehydrogenase
Lig., Ligg. Band, Bänder
LPS Lipopolysaccharid
MZAHL Myometrium von Patientin Nr.ZAHL
MAPK Mitogen-Activated-Protein Kinase
MLCK Myosin-Light-Chain-Kinase
mM millimolar
mRNA Messenger RNA
NADH Nicotinamidadenindinucleotid, reduziert
NADPH Nicotinamidadenindinucleotid-Phosphat, reduziert
nM nanomolar
NNR Nebennierenrinde
NO Stickstoffmonoxid
OD Optische Dichte
PZAHL Plazenta von Patientin Nr.ZAHL
PAF Platelet Activating Factor
PBS Phosphate Buffered Saline
PBT PBS-BSA-Triton
PCR Polymerase Chain Reaction
PG Prostaglandin(e)
PGDH 15-Hydroxy-Prostaglandin-Dehydrogenase
PGE2 Prostaglandin E2
PGF2α Prostaglandin F2α
PGHS Prostaglandin-H-Synthase
PGI2 Prostaglandin I2, Prostacyclin
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
PLA2 Phospholipase A2
PLC Phospholipase C
RC-4B/C1 Rattenhypophysen-Zelllinie RC-4B/C1
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
RT Reverse Transkription
s. siehe
S Standard
SD Standard Deviation, Standardabweichung
sog. sogenannt
SS Schwangerschaft
SSW Schwangerschaftswoche
Tab. Tabelle
TAE Tris-HCl/Acetat/EDTA
TBE Tris-HCl/Borsäure/EDTA
TNFα Tumor-Nekrose-Faktorα
TP Thromboxan-Rezeptor
UCN Urocortin
Vk Variationskoeffizient
vol Volumen
vWF von Willebrand-Faktor
wg. wegen
g Erdbeschleunigung
Z.n. Zustand nach
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Die Geburt beim Menschen
Die Geburt beim Menschen unterliegt einem komplexen Steuerungsprozess. Die
beteiligten Hormone und Signalstoffe sind zwar weitgehend identifiziert, ihre
Interaktionen zur Ruhigstellung des Uterus während der Schwangerschaft und zur
Auslösung des Geburtsvorgangs jedoch im Detail nicht endgültig geklärt. Besonders
interessant ist in diesem Zusammenhang die Determinierung der Schwangerschafts-
dauer. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden physiologischen Prozesse
bildet die Basis für Einblicke in die Pathomechanismen, die zur Frühgeburt führen. Seit
Mitte der Neunziger Jahre deuten zahlreiche Forschungsergebnisse darauf hin, dass
placentar gebildetes Corticotropin-Releasing Hormone (CRH) eine wichtige Bedeutung
als einflussreicher Faktor für Schwangerschaftsdauer und Geburtsauslösung hat [24,
67, 86, 132].
1.1.1 Anatomische Grundlagen der schwangerschaftsspezifischen Strukturen
Der Uterus ist ein unpaares muskuläres Hohlorgan, das bei der nicht-schwangeren
geschlechtsreifen Frau 7-9 cm lang und birnenförmig ist und ca. 80-120 g wiegt. Das
untere Drittel bildet die Cervix uteri, die oberen zwei Drittel das Corpus uteri, welches
oberhalb der Eileiterabgänge vom Fundus uteri kuppelartig überragt wird. Cervix und
Corpus werden durch eine 0,5-1 cm lange Enge, den Isthmus uteri, miteinander ver-
bunden.
Die ca. 3 cm lange Cervix besteht zu 90% aus Bindegewebe und bildet mit Hilfe
eines zähen, alkalischen Schleimpfropfes den festen unteren Abschluss des Uterus,
der sich erst in der peripartalen Phase öffnet.
Das Corpus uteri besteht zu 70% aus glatter Muskulatur (Myometrium), die von
einem Bindegewebsgerüst durchzogen ist. Der Innenraum des Corpus, das Cavum
uteri, ist mit Gebärmutterschleimhaut (Endometrium) ausgekleidet. Außen ist das
Corpus von Peritoneum überzogen (Perimetrium) und liegt in der Peritonealfalte des
Lig. latum uteri.
Einleitung 2
Der Isthmus wird aufgrund seines Wandaufbaus, der überwiegend aus
Bindegewebe und nur zu einem geringen Teil aus glatter Muskulatur besteht,
anatomisch zur Cervix gerechnet, obwohl seine Drüsen eher denen des Endometriums
entsprechen [165].
Während der Schwangerschaft steigt das Gewicht des Uterus um mehr als das
Zehnfache auf 1000-1500 g. Das Volumen des Cavum uteri erreicht bis zum
Entbindungstermin ca. 5 l. Dabei kommt es zu einer ausgeprägten Hypertrophie der
vorhandenen glatten Muskelzellen (von ca. 40 µm auf 800 µm Länge bei einer Verdrei-
fachung ihres Durchmessers) und einer Zunahme des Bindegewebes. Eine Muskel-
hyperplasie tritt dagegen kaum auf. Die Muskeldichte ist im Fundus und Corpus am
größten und fällt in Richtung Cervix ab. Die vordere und hintere Uteruswand enthalten
mehr Muskelgewebe als die seitlichen Wandabschnitte. Die inneren Wandschichten
des Corpus sind dabei dichter mit Myocyten durchsetzt als die äußeren. Außerdem
dehnt sich die muskuläre Wand im Schwangerschaftsverlauf und wird dadurch dünner;
am Ende der Schwangerschaft ist sie am Fundus, ausgehend von ca. 2 cm, nur noch
0,5-1 cm dick.
Die Cervix bleibt bis kurz vor der Geburt straff verschlossen, dann kommt es zu
einer Auflockerung des Gewebes durch vermehrte Flüssigkeitseinlagerung und
enzymatische Zerstörung der Kollagenfaserbündel und der bindegewebigen Grund-
substanz (Cervixreifung).
Der Isthmus dehnt und verlängert sich im Verlauf der Schwangerschaft, um dem
heranwachsenden Fetus zusätzlichen Platz zu gewähren. Ab dem 3. Trimenon wird er
als unteres Uterinsegment bezeichnet. Myometriumbiopsien für Laboruntersuchungen
können im Rahmen einer Sectio caesarea im Zuge der Wundrandbegradigung i.d.R.
nur aus diesem Segment entnommen werden.
Der uterine Blutfluss steigt vom Beginn der Schwangerschaft bis zur Geburt um
den Faktor 100 auf ca. 500 ml/min. Ab dem 3. Schwangerschaftsmonat nimmt der
Uterus, bedingt durch das Wachstum der Frucht, eine eiförmige Gestalt an [95].
Die unterschiedliche Verteilung der Muskulatur in den einzelnen Uterusabschnitten
führt zu einem differentiellen Reaktionsmuster unter der Geburt: Während der Wehen
findet eine aktive, meist vom linken Tubenwinkel des Fundus ausgehende Kontraktion
des Corpus statt. Das untere Uterinsegment kann wegen seines hohen Bindegewebs-
anteils nicht an der Wehentätigkeit mitwirken, sondern wird passiv gedehnt. Dadurch,
Einleitung 3
dass es durch die Ligg. cardinalia und sacrouterina im kleinen Becken fixiert ist, wird
es bei jeder Kontraktion (Retraktion) des Corpus uteri auseinander gezogen
(Distraktion). Die Grenze zwischen aktivem und passivem Teil des Uterus wird durch
einen Kontraktionsring, die Bandl-Furche, gebildet. Sie wandert mit fortschreitender
Geburt nach kranial und ist durch die Bauchdecke zunehmend tastbar [15, 165].
Die Placenta ist am Geburtstermin ein rundes bis ovales, scheibenförmiges Organ
im oberen oder mittleren Corpus uteri, das in der Mitte 2-4 cm dick ist, einen
Durchmesser von 15-20 cm hat und ca. 500 g wiegt. Sie ist dreischichtig aufgebaut:
Direkt ans Myometrium grenzend liegt die Basalplatte (Decidua und Syncytio-
trophoblast), daran schließen sich die Kotelydonen (Zottenbäume) an, welche zur
Fruchthöhle hin in der Chorionplatte (Syncytiotrophoblast und Cytotrophoblast) fest
verankert sind. An der maternalen Seite werden die durch Bindegewebssepten
voneinander getrennten Kotelydonen von mütterlichem Blut umspült. Der Syncytio-
trophoblast dient dabei als sog. Placentaschranke der Trennung von mütterlichem und
fetalem Kreislauf. Die fetale Seite ist von Amnion überzogen. Als gemeinsam von
Mutter und Fetus gebildetes Organ dient die Placenta der fetalen Ernährung und
Atmung sowie dem Stoffaustausch. Des Weiteren gilt sie als zentraler Ort der
hormonellen Regulation und produziert Steroid-, neuroendokrine - und schwanger-
schaftstypische Proteohormone [165].
Die Eihäute bestehen aus dem Amnion, das aus der Embryonalanlage
hervorgegangen ist, und dem von der Blastocyste gebildeten Chorion. Durch die
zunehmende Fruchtwasserproduktion in der Amnionhöhle wird das Amnion nach
außen gedrängt, bis es eng am Chorion anliegt und beide zusammen als doppelte
Wandung die Fruchthöhle umgeben. Das Chorion ist eng mit der Decidua verzahnt,
nimmt als sog. Paraplacenta aktiv am maternofetalen Stoffaustausch teil und
produziert Prostaglandine u.a. Uterotonine. Das Amnion bildet einen geringen Teil des
Fruchtwassers; seine glatte Oberfläche sorgt für eine ungehinderte Beweglichkeit von
Fetus und Nabelschnur [165].
Die Decidua ist das Ergebnis eines funktionellen und strukturellen Umbaus des
sekretorischen Endometriums. Diese „Schwangerschaftsschleimhaut“ [165] stellt die
maternale Kontaktzone zum Embryo dar. In der Frühphase der Schwangerschaft
erleichtert sie die Adhäsion und Implantation der Blastocyste, fördert die Entwicklung
der Placenta und begrenzt gleichzeitig deren Invasion in die Uteruswand. Nach
Einleitung 4
heutigem Kenntnisstand werden diese Funktionen v.a. durch immunkompetente Zellen
(Makrophagen, Granulocyten, T- und B-Lymphocyten) vermittelt, die in diesem
Stadium in großer Zahl vorhanden sind. Später dient die Decidua der Blutversorgung
der gefäßlosen Eihäute und ist für den Ionen- und Wassertransport im Fruchtwasser
von Bedeutung. Sie ist beteiligt an der Synthese von Oxytocin, Prolaktin, Relaxin, CRH
und Prostaglandinen [95, 185].
1.1.1.1 Myometrium
Das Myometrium ist die Tunica muscularis des Uterus und besteht aus vier
unscharf abgrenzbaren Muskelschichten, die durch viel Bindegewebe voneinander
getrennt und unterteilt sind. Von außen nach innen werden sie als Stratum
subserosum, Stratum supravasculosum, Stratum vasculosum und Stratum sub-
mucosum bezeichnet.
Das Stratum subserosum bildet eine dünne, longitudinal zur Uterusachse ausge-
richtete Muskelschicht. Das daran anschließende Stratum supravasculosum ist aus
mehreren, überwiegend zirkulär verlaufenden Lamellen von glatten Muskelzügen
aufgebaut. Es steht in Kontakt mit der Längsmuskulatur von Vagina und Eileiter.
Während der Schwangerschaft dienen diese beiden Schichten der Stabilisierung des
Uterus.
Das Stratum vasculosum ist die mittlere Schicht, welche die Hauptmasse des
Myometriums ausmacht. Diese Schicht enthält viele große Blut- und Lymphgefäße.
Die muskelstarken Arteriolen haben besonders in der Schwangerschaft einen korken-
zieherartig geschlängelten Verlauf und werden daher als Spiralarterien bezeichnet. Sie
setzen sich bis in das Blutgefäßsystem des Endometriums fort. Im Stratum
vasculosum sind die kurzen, dicken Muskelbündel, von denen unter der Geburt die
Wehen ausgehen, dreidimensional angeordnet.
Die innerste Schicht, das Stratum submucosum, ist ca. 5-7 mm dick und besteht
aus dicht beieinander liegenden, v.a. longitudinal ausgerichteten Muskelzügen.
Insgesamt bilden die spiralförmigen Muskelstränge des Myometriums ein Netz,
dessen Maschen während der Schwangerschaft weitergestellt werden und das so
angeordnet ist, dass sich der Kontraktionsdruck unter der Geburt optimal vom Fundus
Richtung Cervix ausbreiten kann [10, 85, 104].
Einleitung 5
Abb. 1: Bauprinzip der Uterusmuskulatur. Dargestellt sind die scherengitterartig einstrahlenden, sich überkreuzenden myometrialen Muskelzüge, die eine optimale Kraftübertragung vom Fundus Richtung Cervix gewährleisten. Aus [148].
Die Leiomyocyten zeigen im Myometrium häufig Übergangsformen zu Fibroblasten
(Myofibroblasten). Diese Zellen besitzen myofibrillenartige Bündel aus Aktin- und
Myosinfilamenten („Stressfasern“). Sie haben kontraktile Eigenschaften, nehmen aber
zusätzlich aktiv Kollagenvorläufer auf und synthetisieren die extrazelluläre Matrix.
Während sie in der ersten Zyklushälfte eher faserbildend-sekretorisch tätig sind,
verhalten sie sich in der zweiten Zyklushälfte und in der Schwangerschaft überwiegend
kontrahierend [85, 111]. Ferner kommt es in der Schwangerschaft vor, dass sich v.a.
im Stratum submucosum vorhandene undifferenzierte Bindegewebszellen in
Muskelzellen umwandeln [85].
1.1.2 Physiologische Zusammenhänge zur Steuerung von Schwangerschaft und Geburt
Mit der Geburt endet die Schwangerschaft beim Menschen im Normalfall nach 38
Wochen (40 Wochen post menstruationem). Auf dramatische Weise gibt der Uterus
seine Funktion als Schutz- und Ernährungsorgan für den Fetus auf und wird binnen
Stunden mithilfe koordinierter Wehen zum Austreibungsorgan. Dies ist mit enormen
physiologischen Umstellungsvorgängen sowohl im mütterlichen als auch im kindlichen
Organismus verbunden.
Einleitung 6
Da das Kind als „haploidentisches Allotransplantat“ [165] fremdes genetisches
Material vom Vater in sich trägt, müsste es eigentlich bei der Mutter Abstoßungs-
reaktionen hervorrufen. Diese werden verhindert, indem unter Progesteron-Einfluss in
der Frühschwangerschaft eine mütterliche Immuntoleranz aufgebaut wird, so dass der
Fetus sich unter geschützten Bedingungen entwickeln kann. Am Ende der Schwanger-
schaft wird die bis dahin stabile Balance zwischen schwangerschaftserhaltenden und
geburtsauslösenden Faktoren gestört. Der Uterus wird in subtiler Weise auf die Wehen
vorbereitet, und die mütterlichen Abwehrkräfte werden wieder aktiviert, so dass es
durch einen selektiven und kontrollierten Gebrauch von Entzündungsreaktionen zur
Geburt kommt [93]. Hierbei handelt es sich um eine Kaskade von sich gegenseitig
verstärkenden, teils irreversiblen Prozessen, die in der Cervixreifung, der Mutter-
mundsöffnung und schließlich der Austreibung des Feten eskalieren [185].
Ein großes Spektrum unterschiedlicher Signalstoffe umfasst die schwanger-
schaftserhaltenden und geburtsauslösenden Faktoren. Dazu gehören Peptide und
Proteohormone (Oxytocin, CRH, Cytokine), Steroidhormone (Progesteron, Östrogene,
Cortisol), Lipidmediatoren (Eicosanoide, Platelet Activating Factor (PAF)) sowie der
intrazelluläre Botenstoff Calcium. Als Zielgewebe dieser Signalstoffe gelten v.a. das
Myometrium, die Cervix und die Decidua, wichtige Syntheseorte sind aber auch die
Placenta und die Eihäute. Ihre Wirkung entfaltet sich über alle drei Ebenen der
hormonellen Signalübertragung (endokrin, parakrin, autokrin), und zwar in einer
Intensität, die bei kaum einem anderen physiologischen Prozess beobachtet werden
kann. Die komplexen funktionellen Wechselbeziehungen zwischen den einzelnen
Faktoren in vivo konnten trotz zahlreicher in vitro-Untersuchungen noch nicht lückenlos
geklärt werden.
1.1.2.1 Phasen der uterinen Aktivität
Der Funktionszustand des Uterus als Erfolgsorgan der Wehentätigkeit lässt sich
während Schwangerschaft und Geburt in vier Phasen einteilen: Ruhigstellung (Phase
0), Aktivierung (Phase 1), Stimulation (Phase 2) und Involution (Phase 3) [151]. Jede
Phase steht unter dem Einfluss unterschiedlicher Signalstoffe.
Phase 0 erstreckt sich über den größten Teil der Schwangerschaft und ist unter
dem Einfluss von Progesteron durch eine relative uterine Ruhe gekennzeichnet.
Progesteron wird im ersten Trimenon vom Corpus luteum und anschließend von der
Einleitung 7
Placenta gebildet; seine Serumspiegel steigen beim Menschen im Schwangerschafts-
verlauf kontinuierlich an und fallen im Gegensatz zu anderen Spezies auch bei
Wehenbeginn nicht ab. Als weitere Mediatoren, die eine relaxierende Wirkung auf das
Myometrium haben, gelten das über den Second Messenger cyclisches Adenosin-
monophosphat (cAMP) wirkende Prostacyclin (PGI2) [156] und Stickstoffmonoxid (NO),
das seine Wirkung über cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) vermittelt [14]. In
dieser Phase gibt es im Uterus wenige interzelluläre Verbindungen und somit eine
geringe elektrische Kopplung. Die Cervix bleibt fest und geschlossen.
In den letzten Wochen der Schwangerschaft beginnt Phase 1 und mit ihr die
Cervixreifung. Vasodilatorische Substanzen (z.B. Prostaglandin (PG)E2) und chemo-
taktische Cytokine, sog. α-Chemokine (z.B. Interleukin (IL)-8), wirken synergistisch,
indem sie die Invasion von neutrophilen Granulocyten begünstigen [94]. Diese setzen
Proteasen, v.a. Kollagenasen und Hyaluronidasen, und weitere inflammatorische
Cytokine frei, die das cervikale Bindegewebe erweichen und kontrolliert abbauen. Teile
der Decidua werden freigelegt, so dass die selektiven Entzündungsreaktionen auf
diese übergreifen können (Decidua-Aktivierung).
Des Weiteren wird in dieser Phase der Uterus aktiviert, indem das Myometrium für
kontraktionsauslösende Stoffe (Uterotonine) wie Oxytocin, Prostaglandine (PGE2 und
PGF2α) und PAF sensitiviert und somit seine Kontraktionsbereitschaft erhöht wird. Dies
geschieht durch die vermehrte Expression der spezifischen Rezeptoren für diese
Uterotonine. Allein die Zahl der Oxytocinrezeptoren nimmt in dieser Phase um das
Hundertfache zu [95]. Außerdem kommt es, ausgehend vom Fundus uteri, zu einer
verstärkten Ausbildung von Ionenkanälen und Gap Junctions aus Connexin-43, einem
lokal in den Myocyten synthetisierten Protein [198]. Durch die hohe Anzahl von
interzellulären Verbindungen entsteht ein funktionelles elektrisches Syncytium, das
eine synchrone Kommunikation zwischen den Zellen und somit eine einheitliche
Ausrichtung der Muskelkontraktionen ermöglicht.
Die Phase der Aktivierung steht unter dem wachsenden Einfluss von Östrogenen.
Diese werden von der Placenta durch Umwandlung von Dehydroepiandrosteron-Sulfat
(DHEAS) aus der fetalen Nebennierenrinde (NNR) gebildet; ihre Synthese nimmt im
Schwangerschaftsverlauf zu. Da die Östrogenbildung von der fetalen DHEAS-
Produktion abhängig ist, gilt der maternale Östrogen-Serumspiegel als Parameter für
den Reifegrad der fetalen Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse.
Einleitung 8
Unmittelbar präpartal wird der aktivierte Uterus durch o.g. Uterotonine stimuliert
(Phase 2), so dass rhythmische Wehen entstehen. Die elektromechanische Kopplung
ist in dieser Phase optimal, die Wirkungsmöglichkeit von Oxytocin, PGE2 und PGF2α
maximal ausgebildet. Dabei kommt es erst dann zu einer koordinierten Wehentätigkeit,
wenn die kontraktionsfördernden Faktoren gegenüber den kontraktionshemmenden
überwiegen. Dies geschieht vermutlich nicht nur in Folge einer gesteigerten Produktion
von uteruskontrahierenden, sondern auch durch eine Unterdrückung von
relaxierenden Faktoren. Die Regulation erfolgt dabei weniger über eine Konzen-
trationserhöhung der stimulatorischen Substanzen im mütterlichen Blut, sondern ist in
hohem Maße von der Dichte und Sensitivität der spezifischen Rezeptoren abhängig. In
dieser Phase steigt beispielsweise die Oxytocin-Rezeptordichte nochmals um das 2-
3fache an. Im Rahmen einer positiven Rückkopplungsschleife führt die Reizung von
Dehnungsrezeptoren in der Cervix über sensorische Afferenzen zu einer weiteren
Oxytocin-Freisetzung aus dem Hypophysenhinterlappen (Ferguson-Reflex) [97]. Am
Ende der Stimulationsphase findet die Geburt des Kindes statt.
In Phase 3 wird die Placenta geboren. Durch weitere Kontraktionen (sog.
Nachwehen) beginnt der Uterus, sich unter Oxytocin-Einfluss auf seine ursprüngliche
Größe zurückzubilden (Involution). Dieser Prozess dauert ca. sechs Wochen. Eine
schnelle postpartale Kontraktion des Myometriums, die zur Abklemmung der
Spiralarterien führt, ist essentiell für die physiologische Blutstillung. Sie wird durch
einen hohen lokalen PGE2- und PGF2α-Spiegel vermittelt.
Einleitung 9
Abb. 2: Phasen der uterinen Aktivität während der Schwangerschaft und Geburt. Schwangerschaft und Geburt sind in vier Phasen unterteilt: Ruhigstellung des Uterus (Phase 0), Aktivierung des Uterus (Phase 1), Stimulation des Myometriums (Phase 2) und Involution des Uterus (Phase 3). Dargestellt sind die für jede Phase der uterinen Aktivität charakteristischen Prozesse und beteiligten Signalstoffe. Modifiziert nach [26, 185]. CRH: Corticotropin-Releasing Hormone; NO: Stickstoffmonoxid; Ca
2+: Calcium
1.1.2.2 Steuerung der Kontraktion im Myometrium
Das Myometrium ist sympathisch, parasympathisch und sensorisch über den
Plexus hypogastricus inferior innerviert. Sympathikus-vermittelt kommt es über α-
Rezeptoren zur Uteruskontraktion und Vasokonstriktion, während die parasym-
pathischen Efferenzen über β-Rezeptoren eine Relaxation des Myometriums
zusammen mit einer Vasodilatation bewirken. Dabei ist die Bedeutung der direkten
Einleitung 10
Innervation einer humoralen Rezeptormodulation durch Uterotonine (α-Rezeptoren)
und kontraktionshemmende Faktoren (β-Rezeptoren) untergeordnet. Dies steht im
Einklang mit der Beobachtung, dass die Innervationsfähigkeit des Myometriums im
Schwangerschaftsverlauf abnimmt [18]. Klinische Bedeutung hat der Einsatz von β-
Sympathomimetika (z.B. Fenoterol) zur Tokolyse.
Die Kontraktion der einzelnen Muskelzelle beruht auf der Interaktion der
kontraktilen Proteine Aktin und Myosin (Querbrückenzyklus). Nach Phosphorylierung
der regulatorischen leichten Myosinkette durch die Myosin-Light-Chain-Kinase (MLCK)
kommt es zu einem Verschieben der Aktin- gegen die Myosinfilamte. Dabei wird unter
Adenosintriphosphat (ATP)-Verbrauch die darin gespeicherte chemische Energie in
mechanische Energie umgesetzt. Die entscheidende Rolle bei der Regulation dieses
Prozesses spielt die freie intrazelluläre Calcium (Ca2+)-Konzentration. Der Membran-
depolarisierung folgt ein Einstrom von Ca2+ durch spannungsabhängige Ca2+-Kanäle,
was zu einer Stimulation der MLCK führt und somit die Kontraktion ermöglicht. Das
Protein Calmodulin dient dabei als Ca2+-Sensor. Eine Erschlaffung der Muskelzelle
erfolgt durch einen Abfall der Ca2+-Konzentration durch Wiederaufnahme von Ca2+ ins
endoplasmatische Retikulum, Ausstrom über energieabhängige Membrankanäle oder
Austausch von Ca2+ gegen Natrium [95].
Essentielle Voraussetzung für synchronisierte Kontraktionen der Einzelzellen und
somit eine koordinierte Wehentätigkeit ist eine interzelluläre Erregungsleitung durch
die Ausbildung von Gap Junctions. Grundsätzlich können alle Myocyten spontan
depolarisieren. Diejenigen Zellen, deren Erregungsschwelle am niedrigsten ist und am
schnellsten erreicht wird, haben eine Schrittmacherfunktion für den gesamten Uterus.
Meistens findet sich ein Erregungszentrum im Fundus im Bereich eines Tubenwinkels,
von dem aus sich die Kontraktionen mit einer Geschwindigkeit von ca. 2 cm/s Richtung
Cervix bewegen [97].
1.2 Das CRH-System
CRH entfaltet seine Wirkung durch Bindung an zwei membranständige Rezeptor-
Isoformen (CRH-R1 und CRH-R2), von denen jeweils noch weitere Subtypen
existieren. Neben CRH binden an diese Rezeptoren auch die verwandten Polypeptide
Einleitung 11
Urocortin I-III. Außerdem existiert ein CRH-Bindeprotein (CRH-BP), welches durch
Bindung an CRH dessen Bioverfügbarkeit herabsetzt.
1.2.1 CRH
CRH ist ein 41 Aminosäuren langes Polypeptid, das 1981 als hypothalamisches
Neuropeptid charakterisiert wurde [211]. Durch Auslösung einer Reaktionskaskade
koordiniert es die neuroendokrine Stressantwort. Im Hypothalamus wird es
vornehmlich in den Nuclei paraventriculares aus einem 191 Aminosäuren langen Pro-
Hormon gebildet. Über das hypophysäre Portalgefäßsystem gelangt es in die
Hypophyse, wo es im Vorderlappen die Ausschüttung von Adrenocorticotropem
Hormon (ACTH) reguliert. ACTH erreicht über den Körperkreislauf die NNR und
stimuliert dort die Cortisolausschüttung. Cortisol und ACTH wirken im Sinne einer
negativen Rückkopplungs-Schleife hemmend auf die hypothalamische CRH-
Ausschüttung, während Stress in all seinen Erscheinungsformen (physisch, psychisch
sowie auf zellulärer Ebene) einen positiven Impuls darstellt.
Kurze Zeit nach seiner Erstbeschreibung wurde CRH auch außerhalb des Hypo-
thalamus nachgewiesen, zunächst weit verbreitet im Zentralen Nervensystem (ZNS),
dann auch in peripheren Organen. 1982 wurde es erstmalig in der Placenta gefunden
[192], später in weiblichen und männlichen Reproduktionsorganen: Myometrium [36],
Endometrium [127], Ovarien [126], Hoden [205]. Während die CRH-Sekretion im ZNS
vornehmlich unter neuronaler Kontrolle steht, wird das periphere CRH ausschließlich
durch humorale Faktoren reguliert: Die Synthese und Freisetzung von CRH werden
von PGE2 und PGF2α, Noradrenalin, IL-1 und Oxytocin stimuliert, von Progesteron und
NO hingegen gehemmt [132]. Überdies wirkt Cortisol stimulierend auf die placentare
CRH-Synthese. Diese positive Rückkopplungs-Schleife steht im krassen Gegensatz zu
den Wirkungsmechanismen im Hypothalamus.
Bei nicht-schwangeren Frauen ist CRH im peripheren Plasma bei einer
Konzentration von 10-20 pg/ml kaum nachweisbar. In der Schwangerschaft steigen die
CRH-Plasmaspiegel kontinuierlich an. Ab der 35. Schwangerschaftswoche ist ein
exponentieller Anstieg zu verzeichnen, der seinen Höhepunkt unter der Geburt findet;
die während der Wehentätigkeit messbaren Konzentrationswerte von 1000-10000
pg/ml entsprechen den Konzentrationen im hypophysären Portalgefäßsystem in
Einleitung 12
Stresssituationen [132]. Die mögliche Bedeutung dieser Befunde für die
Geburtsauslösung wird in Kapitel 1.3.1 näher besprochen werden. Post partum
normalisiert sich die CRH-Konzentration im mütterlichen Plasmaspiegel innerhalb von
wenigen Tagen.
Eine Schwierigkeit bei der Untersuchung des Zusammenhangs zwischen placentar
gebildetem CRH und der Geburt beim Menschen besteht darin, dass nur die Placenta
von Primaten die Fähigkeit besitzt, CRH zu bilden [176]. Bei Pavianen [57] und
Rhesusaffen [54] steigen zwar im Laufe der Schwangerschaft die CRH-Plasmaspiegel
an, doch ein exponentieller Anstieg wenige Wochen vor dem Geburtstermin ist nur bei
Gorillas und Schimpansen zu beobachten [200]. Diese Tatsache schränkt die
Erhebung experimenteller Daten stark ein, da die üblichen Tiermodelle nicht
herangezogen werden können.
1.2.2 CRH-Bindeprotein
Das CRH-Bindeprotein (CRH-BP) ist ein 322 Aminosäuren langes, 37 kDa
schweres Glykoprotein, das nur bei Menschen und Gorillas zu finden ist [168, 200].
Außer in der Leber, dem Hauptsyntheseort, und im ZNS [168] wurde CRH-BP-mRNA
bisher in der Placenta, den Eihäuten und der Decidua [163], jedoch nicht im
Myometrium nachgewiesen. Als einziges spezifisches Bindeprotein für Neuropeptide
verhindert es die Interaktion von CRH mit den CRH-Rezeptoren und blockiert auf diese
Weise dessen Bioaktivität. Während andere Bindeproteine als Trägersubstanzen für
Hormone dazu dienen, die Halbwertszeit ihrer Liganden zu verlängern, bewirkt CRH-
BP ein schnelles Verschwinden von CRH und auch UCN aus dem Blutkreislauf [182].
Dabei ist die Bindung von CRH an CRH-BP zeit- und dosisabhängig.
Bei Nicht-Schwangeren und während des größten Teils der Schwangerschaft liegt
die CRH-BP-Konzentration im peripheren Plasma deutlich höher als die von CRH, so
dass zirkulierendes CRH weitgehend in gebundener Form vorliegt. Somit wird eine
Stimulation der Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse durch placentar gebildetes
CRH verhindert, und die ACTH-Ausschüttung in der Hypophyse bleibt trotz steigender
CRH-Plasmaspiegel unbeeinträchtigt. In den letzten Schwangerschaftswochen sinken
die CRH-BP-Konzentrationen im mütterlichen Plasma stark ab, so dass es zu einer
Sättigung des vorhandenen CRH-BP kommt und zunehmend freies, biologisch aktives
Einleitung 13
CRH zirkuliert [113, 131]. Dieser Effekt trägt zu dem oben erwähnten exponentiellen
CRH-Anstieg bei. Innerhalb von 48 Stunden nach der Geburt steigen die CRH-BP-
Spiegel wieder auf das Niveau vor Beginn der Schwangerschaft [132].
Abb. 3: Die mütterlichen Plasmaspiegel von CRH und CRH-BP im Schwangerschaftsverlauf. Aufgetragen sind die Mittelwerte ± SD der bei 485 Patientinnen gemessenen Konzentrationen an immunreaktivem CRH (offene Kreise) bzw. CRH-BP (ausgefüllte Quadrate) im maternalen Plasma gegen die Tage bis zur Geburt. Aus [131].
1.2.3 Urocortin
Urocortin ist ein 40 Aminosäuren langes, CRH-verwandtes Peptid, das erstmals
1995 im Rattenhirn nachgewiesen wurde [213]. Inzwischen wurden zwei weitere
Urocortin-Formen entdeckt: Urocortin II und -III [112, 175]. Die DNA-Sequenz von
Urocortin weist eine 63%ige Homologie zu Urotensin aus Fischen und eine 41%ige
Homologie zu humanem CRH auf [40]. Als CRH-Agonist bindet es mit ähnlich hoher
Affinität an CRH-BP und CRH-R1 und kann dieses kompetitiv verdrängen. Seine
Affinität zu CRH-R2 und auch seine Second-Messenger-Aktivität liegen um ein
Vielfaches höher als jene von CRH, so dass es als endogener Ligand von CRH-R2
vorgeschlagen wurde [213]. Ebenso wie CRH stimuliert es über beide CRH-
Rezeptoren die cAMP-Produktion und ist in der Lage, die Hypothalamus-Hypophysen-
NNR-Achse zu aktivieren [40]. Außer im ZNS wurde Urocortin im Gastrointestinaltrakt
[143], auf Lymphocyten [6], in der Placenta, den Eihäuten und der glatten
Gefäßmuskulatur des Myometriums [161] nachgewiesen. Auf die fetoplacentare
Einheit wirkt es 30-mal stärker vasodilatorisch als CRH. Diese Beobachtung führte zu
der Hypothese, dass Urocortin lokal produziert wird und regulatorisch auf die
Einleitung 14
uteroplacentare Durchblutung wirkt [33]. Der Nachweis in den intrauterinen Geweben
und im maternalen Plasma war allerdings nicht von allen Forschungsgruppen
reproduzierbar, so dass fraglich bleibt, welche Rolle Urocortin bei der Geburt spielt [48,
56]. Ein Anstieg der Urocortin-Plasmaspiegel analog zum Verlauf des CRH-Spiegels in
den letzten Wochen der Schwangerschaft wurde jedoch von keiner Arbeitsgruppe
beschrieben.
1.2.4 CRH-Rezeptoren
Die CRH-Rezeptoren gehören zur Klasse II der heptahelikalen Guanylnucleotid-
bindenden (G-)Protein-gekoppelten Rezeptoren, welche die Zellmembran siebenmal
mit α-Helices durchspannen [60, 204]. Sie vermitteln die Wirkung ihrer Liganden CRH
und Urocortin vorwiegend über die Adenylatcyclase, den Second Messenger cAMP
und die Proteinkinase (PK)A [62], es sind aber auch andere Signaltransduktionsketten
nachgewiesen worden, bei denen Ca2+ als Second Messenger und verschiedene
Kinasen eine Rolle spielen [179]. Beim Menschen wurden zwei Rezeptor-Subtypen,
CRH-R1 und CRH-R2, gefunden, die auf unterschiedlichen Genen codiert sind [126,
128]. Ihre Aminosäuresequenzen sind zu 70% identisch [39].
Das CRH-R1-Gen liegt auf Chromosom 17q21. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit
waren vier durch differentielles Spleißen entstandene Rezeptor-Isoformen bekannt,
CRH-R1α, -R1β, -R1c und -R1d [64]. Seitdem wurden noch vier weitere Isoformen
identifiziert, nämlich CRH-R1e-h [122]. Die codierende Sequenz des CRH-R1β liegt
auf allen 14 Exons, die anderen Isoformen weisen jeweils typische Deletionen auf.
CRH und Urocortin haben eine ähnlich hohe Affinität zu CRH-R1, wobei die Affinität
von CRH in der Spätschwangerschaft ansteigt [74].
Das CRH-R2-Gen liegt auf Chromosom 7p14. Als Spleißvarianten entstehen die
Rezeptor-Isoformen CRH-R2α, -R2β und -R2γ, die sich nur in ihrer N-terminalen
Sequenz unterscheiden [159]. Zu CRH-R2 weist Urocortin eine deutlich höhere
Affinität auf als CRH [213].
Viele der genannten Rezeptor-Isoformen sind bisher nur auf mRNA-Ebene
identifiziert. Inwieweit sie tatsächlich in funktionelle Proteine umgeschrieben werden,
ist noch ungeklärt.
Einleitung 15
Abb. 4: CRH-R1 beim Menschen mit seinen Spleißvarianten. Die gesamte Sequenz stellt den Rezeptor-Subtypen CRH-R1β dar. Gekennzeichnet sind die den anderen Subtypen fehlenden Sequenz-Abschnitte. Modifiziert nach [64].
Außerhalb des ZNS wurde CRH-R1 in der Nebenniere, in der Haut, in den Ovarien
und Hoden gefunden [27], CRH-R2 in peripheren Blutgefäßen, in der Skelett- und
Herzmuskulatur sowie im Gastrointestinaltrakt [115].
Zur räumlichen Verteilung der Rezeptoren in den intrauterinen Geweben liegen
teilweise widersprüchliche Ergebnisse vor. CRH-R1 wurde im Myometrium von
mehreren Forschungsgruppen sowohl bei Schwangeren als auch bei Nicht-
Schwangeren nachgewiesen [58, 59, 178, 203]. Grammatopoulos et al. [58, 61] fanden
heraus, dass bei Nicht-Schwangeren die Rezeptor-Isoformen CRH-R1α und R1-β
sowie CRH-R2β vorkommen, während in der Schwangerschaft außerdem -R2α und
am Termin zusätzlich noch -R1c und -R1d exprimiert werden. Die Expression von
CRH-R2 in gravidem Myometrium [58, 80, 178, 203, 218] bzw. Placenta, Eihäuten und
Decidua [47, 87] konnte jedoch nicht von allen Forschungsgruppen bestätigt werden.
Im Hinblick auf die unterschiedlichen Funktionen der verschiedenen Bereiche des
Uterus unter der Geburt (starke Kontraktionen im Corpus uteri bei Relaxation des
unteren Uterinsegments) wird eine variable Verteilung der CRH-Rezeptoren im
Myometrium diskutiert [117, 203]. Außerdem wird vermutet, dass sich im Verlauf der
Schwangerschaft im Myometrium das CRH-Rezeptor-Expressionsmuster und mit ihm
Einleitung 16
die Second-Messenger-Bildung durch eine unterschiedliche G-Protein-Kopplung
verändert [60]. Bis wenige Wochen vor der Geburt trägt CRH durch Bindung an CRH-
R1α über PKA und einen Gαs-Signaltransduktionsweg zur Ruhigstellung des
Myometriums bei, dann jedoch werden Rezeptoren exprimiert, die über einen Gαq-
Signaltransduktionsweg und PKC zu Kontraktionen der Myocyten führen [67]. Zu
diesem Effekt trägt eine Oxytocin-vermittelte Desensitivierung der ursprünglichen
CRH-R1α bei [65].
1.3 Biologische Wirkungen von CRH
Seit seiner Erstbeschreibung 1981 sind neben der namensgebenden Wirkung als
Aktivator der Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse im Rahmen der neuroendo-
krinen Stressantwort (ACTH heißt im Englischen „Corticotropin“) eine Vielzahl weiterer
CRH-Funktionen bekannt geworden. So spielt CRH eine Rolle in weiblichen und
männlichen Reproduktionsorganen (Ovulation, Geschlechtshormonsynthese), bei der
Regulation von lokalen Stressreaktionen der Haut, cardiovaskulären Reaktionen,
Emotionen (Ängste, Depressionen), kognitiven Fähigkeiten (Aufmerksamkeit,
Erinnerung), Ess- und Sozialverhalten, und als proinflammatorischer Mediator in
lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen [24, 107, 118, 202, 216].
Interessanterweise lassen sich diese scheinbar ganz unterschiedlichen Funktionen
ebenfalls unter der zentralen Aufgabe von CRH, nämlich der Koordination sämtlicher
neuroendokrinen, vegetativen, elektrophysiologischen, immunologischen und
verhaltensbezogenen Adaptationsvorgänge des Körpers in Stresssituationen, sub-
sumieren. Zweifellos stellt auch die Geburt einen durch Stress gekennzeichneten
Prozess dar, da sowohl im mütterlichen als auch im kindlichen Organismus innerhalb
weniger Stunden immense physiologische Umstellungsleistungen erbracht werden
müssen. In den folgenden beiden Abschnitten soll daher die Bedeutung von CRH für
die Geburt näher beleuchtet werden.
1.3.1 Die Bedeutung von CRH für die Geburt
Zahlreiche Untersuchungen deuten auf einen Zusammenhang zwischen
maternalen CRH-Plasmaspiegeln und dem Zeitpunkt der Geburt hin [21, 43, 78, 100,
Einleitung 17
214]. McLean et al. [131] zeigten in einer Studie mit fast 500 Patientinnen, dass der ab
Anfang des zweiten Trimenons beobachtete, in den letzten Schwangerschaftswochen
exponentielle CRH-Anstieg (s. 1.2.1) bei Frauen, die später eine Frühgeburt hatten,
einen besonders schnellen, steilen Verlauf hatte, während er sich bei Frauen, die über
den errechneten Termin hinaus übertrugen, deutlich langsamer entwickelte. Schon bei
der ersten Blutentnahme in der 16.-18. SSW war bei ersteren Frauen der CRH-Spiegel
gegenüber später termingerecht Entbindenden erhöht, bei letzteren erniedrigt. Daraus
entstand die Hypothese, dass die Dauer der Schwangerschaft durch eine anhand des
CRH-Spiegels abzulesende „placentare Uhr“ schon zu einem frühen Gestations-
zeitpunkt determiniert wird: Ein frühzeitig hoher CRH-Spiegel würde demnach zu einer
ebenfalls frühzeitigen Sättigung von CRH-BP führen, und der daraus folgende Anstieg
des freien, biologisch aktiven CRH würde geburtsauslösende Mechanismen triggern.
Eingehende Untersuchungen haben inzwischen allerdings gezeigt, dass die alleinige
Bestimmung der CRH-Konzentration einen relativ niedrigen prognostischen Wert für
eine drohende Frühgeburt hat, da zum einen große interindividuelle Unterschiede
zwischen den Konzentrationswerten verschiedener Patientinnen bestehen und zum
anderen ein niedriger CRH-Wert die Möglichkeit einer Frühgeburt, die durch
pathologische Ereignisse wie aszendierende Infektionen ausgelöst wird, nicht
ausschließt. Dennoch korreliert ein frühzeitiges hohes CRH-Konzentrations-Niveau
relativ spezifisch mit einem stark erhöhten Risiko für eine Frühgeburt. Durch eine
Bestimmung weiterer Parameter, beispielsweise Alpha-Fetoprotein (AFP) und
Fibronektin sowie Östradiol im Speichel, könnte es gelingen, eine genauere
Vorhersage über den Zeitpunkt der Geburt zu treffen [26, 132].
Bis kurz vor der Geburt wird die Produktion von placentarem CRH durch
Progesteron supprimiert. Durch die Reifung der fetalen Hypothalamus-Hypophysen-
NNR-Achse oder auch durch fetalen Stress wie Hypoxie kommt es in den letzten
Schwangerschaftswochen zu steigenden Cortisolspiegeln. Diese stimulieren para-
doxerweise die Genexpression und Sekretion von CRH in der Placenta [28, 101, 177],
so dass es am Ende der Schwangerschaft bei steigenden CRH-Spiegeln zu einer
positiven Rückkopplungsschleife kommt, die die CRH-Konzentration weiter ansteigen
lässt. Dies steht im krassen Gegensatz zur Regulation des hypothalamischen CRH,
welches im Sinne einer negativen Rückkopplungsschleife durch Cortisol gehemmt
wird.
Einleitung 18
Die hohe Cortisolkonzentration in der Spätschwangerschaft trägt zur Reifung der
fetalen Lunge bei, indem sie die Produktion von Surfactant A und Phospholipiden
fördert.
Ein weiterer Effekt von placentarem CRH ist die direkte Stimulation der DHEAS-
Synthese in der fetalen Nebennierenrinde [199]. Dieses androgene Steroid gelangt
über den kindlichen Kreislauf in die Placenta und wird dort als Substrat für die
Östrogensynthese verwendet. Die zunehmende Östrogendominanz im mütterlichen
Kreislauf antagonisiert die ruhigstellende Wirkung von Progesteron auf den Uterus,
indem sie die Expression von Oxytocinrezeptoren und die Bildung von Gap Junctions
im Myometrium sowie die Prostaglandin-Synthese in den Eihäuten stimuliert, so dass
der Uterus kontraktionsbereit wird (Phase 1 der uterinen Aktivität; s. 1.1.2.1). CRH hat
demnach einen indirekt stimulatorischen Effekt auf die myometriale Kontraktilität.
Eine direkte Steigerung der Kontraktilität durch CRH ließ sich zwar nicht
nachweisen, doch zeigten sich in vitro synergistische Effekte mit den Uterotoninen
Oxytocin und PGF2α, deren Wirkung CRH deutlich verstärkte [8, 170]. Allerdings ießen
sich diese Effekte nicht von allen Forschungsgruppen zweifelsfrei nachweisen [193].
Neben der Stimulierung von DHEAS und Cortisol in der fetalen Nebennierenrinde
stellt ein starker vasodilatorischer Effekt auf die fetoplacentare Einheit und die uterinen
Gefäße die am besten beschriebene Wirkung von placentarem CRH dar [34, 108].
Dieser Effekt wird über eine NO/cGMP-abhängige Signaltransduktionskaskade
vermittelt [35]. Dadurch wird ein verstärkter Zustrom von Signalstoffen und energie-
liefernden Molekülen ermöglicht.
Eine zweite positive Rückkopplungsschleife, in die CRH eingebunden ist, findet
sich in den Eihäuten. Hier wurden direkte parakrine Effekte von CRH zur Stimulation
der Prostaglandin-Synthese beschrieben [83]. Diese führen wiederum zu einer
gesteigerten CRH-Synthese in der Placenta und den Eihäuten [162, 164]. Cortisol
bildet eine Schnittstelle der beiden beschriebenen positiven Rückkopplungs-
mechanismen, indem es einerseits die Expression des Schrittmacher-Enzyms der
Prostaglandin-Synthese, die Prostaglandin-H-Synthase (PGHS)-2, aktiviert [53] und
andererseits ihr Haupt-Abbauenzym, die 15-Hydroxy-Prostaglandin-Dehydrogenase
(PGDH), supprimiert [158].
Einleitung 19
1.4 Prostaglandine
Tab. 1: Übersicht über wichtige Prostaglandin-Effekte. Dargestellt sind beispielhafte Prostaglandin-Wirkungen in verschiedenen Organsystemen und Gewebearten. Modifiziert nach [225] und [135].
Organsystem/Gewebe Prostaglandin Wirkungen
PGF2α Kontraktion
PGE2 Kontraktion oder Relaxation
Prostacyclin Relaxation
Glatte Muskulatur
Thromboxan Kontraktion
Prostacyclin Vasodilatation Herz-Kreislauf-System
Thromboxan Vasokonstriktion
Prostacyclin Thrombocyten-Aggregationshemmung
Blut
Thromboxan Thrombocyten-Aggregation
PGF2α Steigerung der Aktivität Gastrointestinaltrakt
PGE2 Steigerung der Aktivität,
Hemmung der Säuresekretion
Niere PGE2, Prostacyclin Natriurese,
Reninfreisetzung
Männliche Geschlechtsorgane PGE2 Erektion, Ejakulation, Spermientransport
Weibliche Geschlechtsorgane PGF2α, PGE2 Geburt/Wehen, Menstruation, Ovulation, Befruchtung
Knochen PGE2 Knochenbildung, Knochenresorption
PGF2α Bronchokonstriktion
PGE2 Brochodilatation
Bronchialsystem
Thromboxan Bronchokonstriktion
Haut PGF2α, PGE2 Entzündungsförderung
Die Prostaglandine dienen als Lipid-Mediatoren der Signal-Vermittlung zwischen
dem Gesamtorganismus bzw. der Umwelt und der einzelnen Zelle. Im Gegensatz zu
„echten“ Hormonen werden sie lokal produziert, vermitteln aber hormonartige Effekte
innerhalb der Zelle. Aufgrund dessen sind sie Teil eines Netzwerks der inter- und
intrazellulären Kommunikation [124]. Außer in Erythrocyten werden sie in allen Zellen
des Körpers synthetisiert und sind somit an allen wichtigen physiologischen Prozessen
beteiligt [72, 135]. Auf ihre Bedeutung für die Geburt soll in den folgenden Abschnitten
näher eingegangen werden; eine Übersicht über ihre Funktionen in anderen
Organsystemen gibt Tab. 1. Charakteristisch für alle Prostaglandine ist ihre äußerst
Einleitung 20
geringe Konzentration im Gewebe, ihre bedarfsabhängige lokale Produktion und ihr
rascher Abbau zu biologisch weitgehend inaktiven Metaboliten [225]. Ihre
Halbwertszeit im Blutkreislauf beträgt weniger als eine Minute [41].
1.4.1 Biosynthese und Metabolismus der Prostaglandine
Die Prostaglandine gehören als Abkömmlinge der mehrfach ungesättigten C-20-
Fettsäure Arachidonsäure neben den Leukotrienen zu den Eicosanoiden. Ihre Bio-
synthese verläuft in drei Stufen [196]: Zunächst wird Arachidonsäure durch Phospho-
lipase (PL)A2 und -C aus Phospholipiden der Zellmembran mobilisiert. Während PLC
in den Eihäuten gleich bleibend exprimiert wird, steigt die PLA2-Expression im
Schwangerschaftsverlauf an, was auf eine Bedeutung für die uterine Arachidonsäure-
Mobilisierung hindeutet [38]. Im nächsten Schritt wird die Arachidonsäure durch die
Cyclooxygenase (COX)-Aktivität der PGHS in PGG2 umgewandelt und anschließend
durch ihre Peroxidase-Aktivität zu PGH2 reduziert. Nach seiner Cyclooxygenase-
Aktivität wird die PGHS im weiteren Text als COX bezeichnet. Dieses Enzym liegt in
zwei Isoformen vor. Die COX-1 wird konstitutiv in fast allen Körperzellen exprimiert,
während die COX-2 induzierbar ist. Dies geschieht v.a. durch Cytokine und
Wachstumsfaktoren im Rahmen inflammatorischer Prozesse [72] und wird vermittelt
über eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor (NF)κB [7, 106]. Die
letzte Stufe der Prostaglandin-Synthese beinhaltet die Umwandlung von PGH2 in
PGE2, PGF2α, PGD2, Thromboxan und Prostacyclin durch spezifische Synthasen. Ihr
Abbau erfolgt durch Oxidierung zu biologisch weitgehend inaktiven 15-keto- und
13,14-dihydro-keto-Metaboliten durch die NAD+-abhängige PGDH [44].
Im Schwangerschaftsverlauf ist ein Anstieg der Prostaglandin-Spiegel im Plasma
und Urin zu beobachten, der u.a. auf einer gesteigerten Aktivität der induzierbaren
COX-2 im Amnion und Myometrium beruht [45, 197]. Sie ist am Termin ca. 100fach
stärker exprimiert als die konstitutive COX-1, deren Expression sich weder während
der Schwangerschaft noch unter der Geburt verändert [194, 195]. Zur myometrialen
COX-Aktivität unter der Geburt liegen zwar von verschiedenen Forschungsgruppen
z.T. kontrovers Befunde vor [73, 228], die bei unterschiedlichen Untersuchungen eine
gesteigerte, eine gleich bleibende, respektive erniedrigte Enzymaktivität feststellten,
doch zweifellos ist die COX-Aktivität im Myometrium von Schwangeren höher als bei
Nicht-Schwangeren [141]. Im Laufe der Schwangerschaft aktiviert die mechanische
Einleitung 21
Dehnung des Myometriums durch den wachsenden Fetus die COX-2 und führt auf
diesem Weg zu einer gesteigerten Prostaglandin-Produktion im Myometrium. Dies ist
möglicherweise als Gegenregulations-Mechanismus zu werten, der die katabolen
Effekte des in der Schwangerschaft auftretenden Hypercortisolismus und die durch
Cortisol hervorgerufene Hemmung der myometrialen Prostacyclin-Synthese anta-
gonisiert [32].
Im Amnion bewirkt CRH eine COX-2-vermittelte Steigerung der Prostaglandin-
Synthese durch eine Stimulation proximaler Calcium/cAMP Response Element (CRE)-
Sequenzen [23, 84, 207]. Während Glucocorticoide in den meisten Zelltypen
hemmend auf die COX-2 wirken, üben sie in den Eihäuten paradoxerweise einen
stimulierenden Effekt aus [137, 227].
Im Amnion ist fast keine PGDH-Aktivität zu beobachten [29, 152], im Chorion zeigt
sie hingegen eine sehr hohe Aktivität. Nach einer gängigen Vorstellung dient sie somit
als relative metabolische Barriere für die Passage kontraktil wirkender Prostaglandine
aus dem Amnion in die Decidua und das Myometrium, wo sie Kontraktionen auslösen
würden [145, 152]. Tatsächlich fand sich bei bis zu 15% der idiopathischen
Frühgeburten eine PGDH-Insuffizienz [151]. Eine zweite mögliche Sichtweise wäre,
dass auch maternal produzierte Prostaglandine aus der Decidua daran gehindert
werden sollen, auf die fetale Seite zu gelangen und dort Mediatoren wie Matrix-
Metalloproteinasen zu aktivieren, die zur Induktion des Blasensprungs beitragen
würden [130].
Erst in der Spätschwangerschaft sinkt die PGDH-Expression und -Aktivität [81].
Dieser Effekt ist besonders stark ausgeprägt bei vorzeitiger Wehentätigkeit [52, 181,
212]. Allerdings wurden hinsichtlich der PGDH-Aktivität auch widersprüchliche Daten
erhoben, die für einen Anstieg der PGDH-Aktivität im Verlauf der Schwangerschaft und
unter der Geburt sprechen [187]. Zur Klärung der genauen Zusammenhänge bedarf es
also weiterer Untersuchungen.
Cortisol bewirkt über eine Hemmung der PGDH einen Anstieg der Prostaglandin-
Konzentration. Diesem Effekt steht eine Stimulation der PGDH durch Progesteron
entgegen [25]. Möglicherweise werden beide Wirkungen durch eine kompetitive
Bindung beider Steroidhormone an den Glucocorticoid-Rezeptor (GR)α vermittelt.
Dieser Konkurrenz-Mechanismus könnte zu einem lokalen Progesteron-Entzug, z.B.
im Fundus-Bereich, beitragen [201] und wurde in ähnlicher Form auch bei der
Regulation des CRH-Gens durch Progesteron und Cortisol beobachtet [86]. Neben
Einleitung 22
Cortisol ruft auch CRH über erhöhtes cAMP eine Hemmung der PGDH im Chorion
hervor [109]. Challis sah darin ein ähnliches Wirkungsmuster: Substanzen, die in den
Eihäuten die COX-2 stimulieren (CRH, Cortisol, IL-1β, TNFα), hemmen im Chorion die
PGDH [24].
1.4.2 Bedeutung der Prostaglandine für die Geburt
Dass die Prostaglandine eine wichtige Rolle für die Wehentätigkeit spielen, wird
aus folgenden Befunden deutlich: Während der Wehentätigkeit ist ein starker Anstieg
der Prostaglandin-Spiegel in Plasma und Urin zu beobachten [91, 155], durch exogene
Prostaglandin-Gabe lassen sich Wehen induzieren und durch COX-Inhibitoren effektiv
hemmen [90]. Außerdem steigern sie in vitro die myometriale Kontraktilität [154] und
wirken synchronisierend auf die Kontraktionen [51].
Wenngleich ihre Bedeutung für die myometriale Kontraktilität die bestuntersuchte
Eigenschaft der Prostaglandine im Zusammenhang mit der Geburt darstellt, zeichnet
sich ab, dass sie für die anderen vier physiologischen Vorgänge, die den Geburts-
prozess kennzeichnen, ebenfalls eine zentrale Bedeutung haben [153]: Sie induzieren
den Blasensprung durch Aktivierung von Matrix-Metallo-Proteinasen, die einen
kontrollierten Kollagen-Abbau katalysieren [130], sie sind durch Regulierung von
Veränderungen im Stoffwechsel der extrazellulären Matrix an der Cervixreifung
beteiligt [16, 92] und tragen postpartal zur Placentalösung und Involution des Uterus
bei [150].
Als weitere spezifische Funktionen der Prostaglandine, die schon im Laufe der
Schwangerschaft eine Rolle spielen, werden u.a. ihr Beitrag zur Aufrechterhaltung des
uteroplacentaren Blutflusses durch Regulation des Gefäßtonus [17, 172],
stimulierende Effekte auf die fetale Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse [24],
immunmodulierende Effekte und die Induktion von Gap Junctions diskutiert [185].
Unter der Geburt unterstützen sie außerdem die fetale Adaptation an den
Wehenprozess, indem sie auf fetale Bewegungen und Atmung zur Energieeinsparung
einen hemmenden Einfluss ausüben [96, 209].
Aus den soeben beispielhaft aufgeführten Prostaglandin-Effekten wird deutlich,
dass Prostaglandine ein komplexes spezifisches Wirkungsspektrum haben. Dabei
verbindet sie die Fähigkeit, die Aktivität aller glatten Muskelzellen unspezifisch zu
Einleitung 23
modulieren [185]. Im Folgenden sollen die in der vorliegenden Arbeit untersuchten
Prostaglandine Prostacyclin und PGE2 kurz charakterisiert werden:
Prostacyclin hat den größten Anteil an der myometrialen Prostaglandin-
Konzentration und wird im Vergleich zu anderen uterinen Geweben auch nur hier in
nennenswerten Mengen produziert [31, 45, 66, 156, 167, 184, 186, 221]. Dabei übt es
durch Bindung an seinen spezifischen Rezeptor (IP) über die Gαs-gekoppelte
Adenylatcyclase/cAMP/PKA-Signaltransduktionskaskade eine uterusrelaxierende und
somit schwangerschaftserhaltende Wirkung aus [146, 156, 219]. In der Spät-
schwangerschaft führt ein wehenunabhängiger Aktivitäts-Anstieg der vorwiegend in
den Myofibrillen der Myocyten [140] lokalisierten PGI-Synthase zu einer zunehmenden
Prostacyclin-Sekretion [72]. Dies spricht möglicherweise für eine Beteiligung dieses
Prostaglandins an der Cervixreifung. Des Weiteren steigert Prostacyclin den utero-
placentaren Blutfluss durch NO/cGMP-vermittelte Vasodilatation sowie durch
Hemmung des vasokonstriktiven Einflusses von PGF2α [34, 119]. In diesem
Zusammenhang spielt es möglicherweise eine wichtige Rolle zur Prävention uteriner
Hypoxie und zur Verhinderung thromboembolischer Komplikationen in der maternalen
und uteroplacentaren Zirkulation [45, 72, 224].
PGE2 ist das vorherrschende Prostaglandin in allen intrauterinen Geweben mit
Ausnahme des Myometriums [23, 53]. Es gilt neben PGF2α als potenter Stimulator der
uterinen Kontraktilität; beide Stoffe sind in der Lage, in jedem Stadium der
Schwangerschaft Wehen zu induzieren [185]. Klinisch wird diese Eigenschaft schon
seit einigen Jahren zur Geburtseinleitung eingesetzt [174]. Dabei ist in vitro die
Fähigkeit von PGE2, myometriale Kontraktionen zu erzeugen, 8-10fach höher als die
von PGF2α, und PGE2 wird dort auch 8-10-mal stärker gebunden [79, 125]. Allerdings
wirkt es im Gegensatz zu PGF2α, das über seinen spezifischen Rezeptor (FP)
ausschließlich kontrahierende Effekte auf das Myometrium ausübt, v.a. auf den
Fundus-/Corpusbereich kontrahierend, während es auf das untere Uterinsegment
einen eher relaxierenden Effekt hat [185]. Außerdem wurden in diesem Uterusbereich
konzentrationsabhängige Effekte beobachtet: In niedrigen Konzentrationen wirkte es
kontraktionsstimulierend, in höheren kontraktionshemmend [191, 220]. Diese gegen-
sätzlichen PGE2-Wirkungen können auf eine räumlich- und zeitlich-differenzielle
Rezeptor-Expression zurückgeführt werden. Unter 1.4.3 wird dieses Thema näher
erläutert werden. Die Tatsache, dass nicht nur im Myometrium als Zielorgan
Einleitung 24
kontraktionsassoziierter Wirkungen PGE2-Rezeptoren exprimiert werden, sondern
auch in den Eihäuten und in der Placenta [68], deutet auf parakrine und autokrine
PGE2-Effekte hin. Die spezifische PGE-Synthase zeigt im Vergleich zur PGI-Synthase
eine schwächere myometriale Expression, die im Schwangerschaftsverlauf und
während der Wehentätigkeit keinen Veränderungen unterliegt [52]. Im Myometrium ist
sie im Cytoplasma der Myocyten, in vaskulären Muskelzellen und im Gefäßendothel zu
finden [52].
1.4.3 Prostaglandin-Rezeptoren im Myometrium
Die Prostaglandine vermitteln ihre Wirkung über spezifische Rezeptoren in der
Membran der Zielzellen [37]. Benannt nach ihren Liganden, lassen sie sich in
verschiedene Subtypen unterteilen, welche die Produktion unterschiedlicher Second
Messenger bewirken. Außerdem sind zahlreiche Spleißvarianten identifiziert worden,
die eine Kopplung an unterschiedliche G-Proteine vermitteln (Gαs, Gαq, Gαi) [102]. Im
Hinblick auf ihre Funktion im Myometrium erfolgt eine Einteilung der Rezeptoren in
eine kontraktile und eine relaxatorische Gruppe. Kontraktile Prostaglandin-Rezeptoren
(EP1 und EP3 für PGE2, FP für PGF2α, TP für Thromboxan) gehören neben den
Oxytocin-Rezeptoren, Gap Junctions und Ionenkanälen zu den kontraktions-
assoziierten Proteinen (CAPs). Sie bewirken eine Kontraktion der Myocyten, indem sie
die intrazelluläre Ca2+-Freisetzung stimulieren bzw. die Adenylatcyclase hemmen, so
dass die cAMP-Produktion gesenkt wird. Relaxierende Prostaglandin-Rezeptoren (DP
für PGD2, EP2 und EP4 für PGE2, IP für PGI2) steigern über eine Aktivierung der
Adenylatcyclase die cAMP-Synthese [22]. Im schwangeren Myometrium sind bis auf
DP alle Rezeptor-Typen vorhanden, EP3 allerdings nur auf Endothel- und
Stromazellen, während alle anderen auf Myocyten exprimiert sind. Dies lässt
vermuten, dass der Kontraktionseffekt von PGE2 am Termin v.a. direkt EP1- und nur
indirekt EP3-vermittelt entsteht [110].
Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Rezeptoren unterschiedliche
Affinitäten aufweisen können [72]. Aus dieser Beobachtung wurde die Hypothese
abgeleitet, dass bei geringen Prostaglandin-Konzentrationen Rezeptoren aktiviert
werden, die sich in einem „High-Affinity-State“ befinden, während solche im „Low-
Affinity-State“ im Ruhezustand bleiben. Je nach Affinitäts-Zustand des Rezeptors
könnten unterschiedliche Signaltransduktionswegen aktiviert werden. So lässt sich
Einleitung 25
erklären, warum dasselbe Prostaglandin im Myometrium sowohl kontrahierende als
auch relaxierende Effekte hervorrufen kann. Eine derartige biphasische, dosis-
abhängige Wirkung zeigte PGE2 in vitro im unteren Uterinsegment vor Beginn der
Wehentätigkeit; auf eine initiale Stimulation folgte eine Inhibition der Kontraktilität
[191, 220]. Übertragen auf die Situation in vivo könnte dies bedeuten, dass die
vergleichsweise niedrigen PGE2-Konzentrationen während des größten Teils der
Schwangerschaft das untere Uterinsegment zum Schutz des Feten angespannt halten
und erst die höheren PGE2-Konzentrationen kurz vor der Geburt relaxierend wirken
und somit eine Passage des Feten durch den Geburtskanal ermöglichen [22, 69].
Die Tatsache, dass im Myometrium sowohl kontraktile als auch relaxatorische
Prostaglandin-Rezeptoren vorhanden sind, könnte außerdem für eine zeitlich-
differenzielle Rezeptor-Regulation, z.B. durch sich verändernde Hormon-
konstellationen, sprechen [144]. EP2 und EP3 sowie FP sind im schwangeren
gegenüber dem nicht-schwangeren Uterus herrunterreguliert [129]. Während FP am
Geburtstermin wieder verstärkt exprimiert wird, um myometriale Kontraktionen zu
vermitteln [206], sinkt die EP2-Expression im Myometrium im Schwangerschaftsverlauf
ab [110, 138]. Neuere Studien fanden am Geburtstermin einen signifikanten Anstieg
der Expression des kontraktilen EP1 [4, 69], der allerdings auch im unteren
Uterinsegment zu beobachten war. Dies könnte auf eine Beteiligung an postpartalen
Kontraktionen zur Uterusinvolution hindeuten [4], ein für die physiologische Blutstillung
essentieller Prozess. Letztlich sind die beschriebenen Unterschiede in Abhängigkeit
vom Gestationsalter noch nicht endgültig geklärt.
Ferner liegen Befunde vor, die auf eine räumlich-differenzielle Rezeptor-Verteilung
hinweisen. Besonders im unteren Uterinsegment findet sich eine starke EP2-
vermittelte, relaxierende PGE2-Wirkung; der kontraktile EP3 hingegen ist im Fundus-
/Corpusbereich stärker exprimiert als im unteren Uterinsegment [4, 69, 191]. EP4, IP
und TP werden im Myometrium gleich bleibend exprimiert und nicht durch Wehen
beeinflusst [4, 69, 196]. Dabei findet sich eine stärkere IP-Expression in longitudinalen
als in zirkulären Muskelzügen; am schwächsten ist sie in glatter Gefäßmuskulatur
ausgeprägt [173].
Nach neueren Erkenntnissen existieren neben den zellmembrangebundenen auch
nukleäre Prostaglandin-Rezeptoren. Bisher wurde im Myometrium für EP1 und EP4
eine Assoziation mit dem Zellkern nachgewiesen [11, 12, 69]. Da beispielsweise auch
Einleitung 26
die cytosolische PLA2 und beide COX-Isoformen in der nukleär-perinukleären Region
lokalisiert sind [142, 147], ist es wahrscheinlich, dass lokal produzierte Prostaglandine
über die nukleären Rezeptoren Effekte ausüben können, die über die direkte
Stimulation oder Inhibition der myometrialen Kontraktilität hinausgehen; z.B. wäre auf
diese Weise eine Modulation der Gentranskription möglich [69]. Insgesamt wird
deutlich, dass die Vermittlung der Prostaglandin-Wirkungen über ihre spezifischen
Rezeptoren ein Thema darstellt, das in seiner Komplexität noch viele Fragen aufwirft.
Einleitung 27
1.5 Zielsetzung dieser Arbeit
Zur Klärung der Bedeutung von placentarem CRH für die hormonelle Steuerung
der Geburt beim Menschen wurde in dieser Arbeit in vitro untersucht, ob CRH eine
Wirkung auf die Prostaglandin-Synthese im humanen Myometrium ausübt. Myome-
triale Gewebeproben aus dem unteren Uterinsegment wurden dazu bei Schnitt-
entbindungen nach unkomplizierten Schwangerschaftsverläufen am Geburtstermin vor
Einsetzen der Wehentätigkeit gewonnen. Im Einzelnen wurden folgende Aufgaben und
Fragestellungen bearbeitet:
1. Haben CRH und sein verwandtes Peptid Urocortin sowie IL-1β einen
stimulierenden Einfluss auf die 6-keto-PGF1α- und PGE2-Synthese im
Myometrium?
2. In welchen Zellen des myometrialen Gewebeverbands werden die CRH-
Rezeptoren CRH-R1 und CRH-R2 exprimiert, und wie sind die einzelnen
Zelltypen immunhistochemisch zu charakterisieren?
3. Ist die Messung der ACTH-Sekretion der Maus-Hypophysen-Zelllinie AtT20 für
die Etablierung eines Bioassays zur Überprüfung der biologischen CRH-Aktivität
geeignet?
4. Welche methodischen Aspekte sind im Umgang mit Gewebekulturen und EIAs zu
beachten, und inwieweit ist eine große Streuung der EIA-Messwerte auf
technische und bedienerassoziierte Aspekte zurückzuführen?
Material und Methoden 28
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Kommerziell erhältliche Chemikalien und Lösungen
Sämtliche verwendeten Säuren, Laugen und Salze waren vom Reinheitsgrad p.a.
und wurden, sofern nicht in folgender Liste aufgeführt, von den Firmen Merck
(Darmstadt), Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen) oder Carl Roth GmbH
(Karlsruhe) bezogen.
Das verwendete Wasser stammte aus einer Reinstwasseranlage (Milli-Q plus PF,
Millipore, Eschborn). Es entsprach in der Reinheit mindestens doppelt destilliertem
Wasser (ddH2O). In RNA- und RT-PCR-Experimenten wurde das kommerziell
erhältliche Reinstwasser Aqua ad iniectabilia (B. Braun, Melsungen) verwendet.
Agarose Invitrogen, Karlsruhe
Ak-Klon-3-2B12 Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen
Ak-Klon5B5 DAKO Diagnostika, Hamburg
Anti-α-Aktin-Ak DAKO Diagnostika, Hamburg
Anti-CD68-Ak DAKO Diagnostika, Hamburg
Anti-CRH-R1/R2-Ak Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA
Anti-vWF-Ak DAKO Diagnostika, Hamburg
BSA für die IHC Bovines Serum-Albumin, Fraktion V, pH 7,0, Standard Grade; Serva, Heidelberg
BSA für die Zellkultur Bovines Serum-Albumin, Fraktion V, Katalog-Nr. A9418, ≥96%, Zellkultur-getestet; Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Deisenhofen
Chloroform J.T. Baker, Deventer, Holland
CRH Corticotropin-Releasing Hormone; Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
DakoCytomation Target Retrieval Solution
S1700, pH 6,1; DAKO Diagnostika, Hamburg
DEPC-Wasser Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
Material und Methoden 29
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium D 6546; 0,265 g/l CaCl2·2H2O, 0,0001 g/l Fe(NO3)3·9H2O, 0,09767 g/l MgSO4, 0,4 g/l KCl, 3,7 g/l NaHCO3, 6,4 g/l NaCl, 0,109 g/l Na H2PO4, 0,084 g/l L-Arginin·HCl, 0,0626 g/l L-Cystin·2HCl, 0,584 g/l L-Glutamin; 0,03 g/l Glycin; 0,042 g/l L-Histidin·HCl·H2O, 0,105 g/l L-Isoleucin, 0,105 g/l L-Leucin, 0,146 g/l L-Lysin·HCl, 0,03 g/l L-Methionin, 0,066 g/l L-Phenylalanin, 0,042 g/l L-Serin, 0,095 g/l L-Threonin, 0,016 g/l L-Tryptophan, 0,10739 g/l L-Tyrosin·2Na·2H2O, 0,094 g/l L-Valin, 0,004 g/l Cholinchlorid, 0,004 g/l Folsäure, 0,0072 g/l myo-Inositol, 0,004 g/l Niacinamid, 0,004 g/l D-Pantothensäure, 0,004 g/l Pyridoxin·HCl, 0,004 g/l Riboflavin, 0,004 g/l Thiamin·HCl, 4,5 g/l D-Glucose, 0,0159 g/l Phenolrot·Na; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
DMSO Dimethylsulfoxid; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
dNTP-Mix (10 mM) Invitrogen, Karlsruhe
D-PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline; 0,2 g/l KH2PO4, 0,2 g/l KCl, 8,0 g/l NaCl, 1,15 g/l Na2HPO4; Invitrogen, Karlsruhe
EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium M 2279; 0,265 g/l CaCl2·2H2O, 0,09767 g/l MgSO4, 0,4 g/l KCl, 2,2 g/l NaHCO3, 6,8 g/l NaCl, 0,122 g/l Na2HPO4, 0,126 g/l L-Arginin·HCl, 0,0313 g/l L-Cystin·HCl, 0,042 g/l L-Histidin·HCl·H2O, 0,052 g/l L-Isoleucin, 0,052 g/l L-Leucin, 0,0725 g/l L-Lysin·HCl, 0,015 g/l L-Methionin, 0,032 g/l L-Phenylalanin, 0,048 g/l L-Threonin, 0,01 g/l L-Tryptophan, 0,0519 g/l L-Tyrosin·2Na·2H2O, 0,046 g/l L-Valin, 0,001 g/l Cholinchlorid, 0,001 g/l Folsäure, 0,002 g/l myo-Inositol, 0,001 g/l Niacinamid, 0,001 g/l D-Pantothensäure, 0,001 g/l Pyridoxin·HCl, 0,0001 g/l Riboflavin, 0,001 g/l Thiamin·HCl, 1,0 g/l Glucose, 0,011 g/l Phenolrot·Na, 0,292 g/l L-Glutamin; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
FBS Fetal-bovines Serum; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
H2O2 30% Wasserstoffperoxid; Merck, Darmstadt
Hämalaun „Mayers Hämalaunlösung für die Mikroskopie“; Merck, Darmstadt
Material und Methoden 30
Ham’s F12 Nutrient Mixture N 4888; 0,0441 g/l CaCl2·2H2O, 0,0000025 g/l CuSO4, 0,000834 g/l FeSO4·7H2O, 0,123 g/l MgCl2·6H2O, 0,224 g/l KCl, 1,176 g/l NaHCO3, 7,599 NaCl, 0,14204 g/l Na2HPO4, 0,000863 g/l ZnSO4·7H2O, 0,009 g/l L-Alanin, 0,211 g/l L-Arginin·HCl, 0,01501 g/l L-Asparagin·H2O, 0,0133 g/l L-Asparaginsäure, 0,035 g/l L-Cystein·HCl·H2O, 0,0147 g/l L-Glutamat, 0,00751 g/l Glycin, 0,2096 g/l L-Histidin·3HCl·H2O, 0,00394 g/l L-Isoleucin, 0,0131 g/l L-Leucin, 0,0365 g/l L-Lysin·HCl, 0,00448 g/l L-Methionin, 0,00496 g/l L-Phenylalanin, 0,0345 g/l L-Prolin, 0,0105 g/l L-Serin, 0,0119 g/l L-Threonin, 0,00204 g/l L-Tryptophan, 0,00778 g/l L-Tyrosin·2Na·2H2O, 0,0117 g/l L-Valin, 0,0000073 g/l D-Biotin, 0,01396 g/l Cholinchlorid, 0,00132 g/l Folsäure, 0,018 g/l myo-Inositol, 0,000037 g/l Niacinamid, 0,00048 g/l D-Pantothensäure, 0,000062 g/l Pyridoxin·HCl, 0,000038 g/l Riboflavin, 0,00034 g/l Thiamin·HCl, 0,00136 g/l Vitamin B12, 1,802 g/l D-Glucose, 0,00408 g/l Hypoxanthin, 0,000048 g/l Linolsäure, 0,0013 g/l Phenolrot, 0,000161 g/l Putrescin·HCl, 0,11 g/l Na-Pyruvat, 0,00021 g/l Thioctansäure, 0,00073 g/l Thymidin, 0,146 g/l L-Glutamin; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
Hasenserum Alexis GmbH, Grünberg
HBSS Hank’s Balanced Salt Solution; 8,0 g/l NaCl, 0,4 g/l KCl, 48 mg/l Na2HPO4, 60 mg/l K H2PO4, 1 g/l Glucose, 0,35 g/l NaHCO3; Biochrom, Berlin
IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium E 15-819; 165 mg/l CaCl2, 330 mg/l KCl, 0,076 mg/l KNO3, 97,7 mg/l MgSO4, 0,0173 mg/l Na·Selenit·5 H2O, 4505 mg/l NaCl, 125 mg/l Na2HPO4·H2O, 3024 mg/l NaHCO3, 25 mg/l L-Alanin, 84 mg/l L-Arginin·HCl, 28,4 mg/l L-Asparagin·H2O, 30 mg/l L-Asparaginsäure, 91,24 mg/l L-Cystin·2HCl, 75 mg/l L-Glutamat, 584 mg/l L-Glutamin, 30 mg/l Glycin, 42 mg/l L-Histidin·HCl·H2O, 105 mg/l L-Isoleucin, 105 mg/l L-Leucin, 146 mg/l L-Lysin·HCl, 30 mg/l L-Methionin, 66 mg/l L-Phenylalanin, 40 mg/l L-Prolin, 42 mg/l L-Serin, 95 mg/l L-Threonin, 16 mg/l L-Tryptophan, 103,79 mg/l L-Tyrosin·2Na·2H2O, 94 mg/l L-Valin, 0,013 mg/l Biotin, 4 mg/l D-Calcium-Pantothenat, 4 mg/l Cholinchlorid, 4 mg/l Folsäure, 7,2 mg/l i-Inositol, 4 mg/l Niacinamid, 4 mg/l Pyridoxin·HCl, 0,4 mg/l Riboflavin, 4 mg/l Thiamin·HCl, 0,013 mg/l Vitamin B12, 4500 mg/l D-Glucose, 5958 mg/l HEPES, 15 mg/l Phenolrot, 110 mg/l Na-Pyruvat; PAA Laboratories, Cölbe
Lyphochek Immunoassay Plus Control
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
NADH β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, reduziert Di-Natriumsalz 340-102; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
Material und Methoden 31
Pferdeserum Serva, Heidelberg
Pronase 0,1% Linaris, Wertheim-Bettingen
Protease-Inhibitor-Cocktail
P8340; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
RNA-Marker 0,24-9,5 Kb; Invitrogen, Karlsruhe
Romulin AEC Amino-9-Ethyl-Carbazol; Biocarta, Hamburg
Superscript II, RNase-frei Reverse Transkriptase; Invitrogen, Karlsruhe
Taq Polymerase Invitrogen, Karlsruhe
Triton X-100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
Urocortin Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg
2.1.2 Kits
6-keto-PGF1α-EIA-Kit Biotrend, Köln
ACTH-Immulite-Kit und Verdünner DPC Biermann, Bad Nauheim
peqGOLD Trifast Kit Peqlab Biotechnologie, Erlangen
PGE2-EIA-Kit Biotrend, Köln
Pyrocheck-Kit DPC Biermann, Bad Nauheim
Vectastain Elite ABC-Kit, Goat IgG Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA
2.1.3 Selbst hergestellte Puffer und Lösungen
1x DNA-Ladepuffer 5% Glycerin 5 mM EDTA 0,005% Bromphenolblau 0,005% Xylencyanol FF
Formaldehyd, deionisiert 100 ml Formaldehyd 5 g AG 501-X8 Resin; Bio-Rad, München 30 min bei Raumtemperatur rühren, Formaldehyd mit Resin lagern
Formalin 4% 4% Formaldehyd in 1x PBS für die IHC
Formamid, deionisiert 20 ml Formamid 1 g AG 501-X8 Resin; Bio-Rad, München 30 min bei Raumtemperatur rühren, 1 ml Aliquots bei -20°C
HomogenisierungslösungLDH 50 mM Tris 0,154 M KCl
NADH-Lösung 14,1 mM NADH in 1% (m/v) NaHCO3-Lösung
Material und Methoden 32
10x NK-Lösung 1,37 M NaCl 0,5 M KCl
1x NKH-Lösung 1x NK-Lösung 2 mM HEPES, pH 7,4 immer frisch ansetzen aus 10x NK-Lösung und 1 M HEPES
25x PBS für die IHC 188 g/l K2HPO4 (43 mM) 180 g/l NaCl (123 mM) 33 g/l Na2HPO4 (10 mM)
PBT-Lösung für die IHC 10 ml PBS 100 mg BSA 20 µl Triton
1x RNA-Ladepuffer 20% deionisiertes Formamid 20% Glycerin 20 mM EDTA 0,02% Bromphenolblau 0,02% Xylencyanol FF
SubstratlösungLDH 44,7 mM K2HPO4
7,35 mM KH2PO4
625 µM Na-Pyruvat
50x TAE-Puffer 2 M Tris 2 M Eisessig (Acetic Acid) 50 mM EDTA, pH 8,0
10x TBE-Puffer 0,89 M Tris 0,89 M Borsäure 20 mM EDTA, pH 8,0
Tris/EDTA-Puffer für die IHC 10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 9,0
10x Zitratpuffer 0,1 M Zitronensäure 0,1 M Natriumzitrat, pH 6,0
Mögliche Wirkungen von CRH wurden an Gewebeproben sowie in Zellkulturen
untersucht. Das für diese Experimente eingesetzte, synthetische Peptid CRH (0,1 mg;
Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg, bzw. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisen-
hofen) wurde in lyophilisiertem Zustand bezogen. Nach Herstellerangaben gilt das bei
-80°C gelagerte, gefriergetrocknete Peptid als jahrelang stabil. In gelöstem Zustand
hingegen wird ein Verbrauch innerhalb 2-3 Monaten empfohlen. Zur Aliquotierung
wurden die Lyophilisate zunächst in 1 ml durch Helium-Begasung sauerstofffreiem
ddH2O gelöst, in Aliquots à 100 µl (CRH, entsprach 10 µg) aufgeteilt und mit einer
Gefriertrocknungsanlage (ALPHA 2-4, Christ Medizinischer Apparatebau, Osterode/
Material und Methoden 33
Harz) wieder lyophilisiert. Anschließend wurden die Proben mit Stickstoff begast und
bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.
2.2 Patientinnendaten
In dieser Arbeit wurde myometriales Gewebe (M) von Patientinnen untersucht, bei
denen in der Universitätsfrauenklinik Freiburg eine Kaiserschnittentbindung (Sectio
caesarea) durchgeführt worden war. Für vergleichende Untersuchungen an weiterem
schwangerschaftsspezifischen Geweben wurden zusätzlich Placenta (P)- und choriale
Decidua (Dc)-Proben verwendet. Alle Proben wurden durch die Abkürzung der
Gewebeart und die laufende Patientinnen-Nummer kodiert. In den überwiegenden
Fällen erfolgte die Gewebegewinnung nach geplanter, primärer Sectio am Geburts-
termin, d.h. vor Beginn muttermundswirksamer Wehentätigkeit, nach Beendigung der
37. Schwangerschaftswoche (s. Tab. 2). Die Indikation zu diesem Eingriff wurde aus
unterschiedlichen Gründen gestellt, beispielsweise wegen einer geburtsunmöglichen
bzw. -erschwerenden Kindslage, vorausgegangenen operativen Eingriffen am Uterus
oder wegen Verdachts auf ein relatives Missverhältnis zwischen kindlichem Kopf und
mütterlichem Innenbecken-Durchmesser. Ein geringer Teil der Proben stammt von
Patientinnen, bei denen bis zum Zeitpunkt der termingerechten Schnittentbindung
muttermundswirksame Wehen eingesetzt hatten; hier wurde eine sekundäre Sectio
durchgeführt (s. Tab 3). Wie der tabellarischen Übersicht über die klinischen Daten der
Patientinnen sowie die Verwendung der Gewebeproben zu entnehmen ist, gab es in
beiden Gruppen Patientinnen, bei denen es im Laufe der Schwangerschaft zu einer
vorzeitigen Wehentätigkeit gekommen war.
Die Probengewinnung für die vorliegende Arbeit erfolgte im Rahmen des von der
Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderten Projekts „Rolle von CRH bei
der Auslösung der Geburt“, für das ein positives Votum der Ethik-Kommission der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg vorliegt (Ethik-Antrag 190/98 vom 05.10.1998).
Alle Frauen gaben vor der Gewebeentnahme nach ausführlicher Aufklärung ihr
schriftliches Einverständnis.
Material und Methoden 34
Tab. 2: Klinische Daten und Gewebeverwendung der termingerechten primären Sectiones. Patientinnen mit vorzeitiger Wehentätigkeit sind mit (+) gekennzeichnet. „G/P“ bezeichnet die Anzahl der bisherigen Schwangerschaften und Geburten. Die Gewebearten sind mit „M“ (Myometrium), „P“ (Placenta) oder „Dc“ (Decidua) bezeichnet.
Pa
t.-N
r.
Alt
er
SS
W
G/P
We
he
n
Sectio-Indikation Anamnese
Ge
we
be
Te
st
6 38 39+1 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Unauffällige Amniozentese in der 15.SSW, Z.n. sekundärer Sectio 1990 bei relativem Missverhältnis, Medikation: Paracetamol und Tramal ab der 34. SSW wg. Lumboischialgie
M IHC
19 35 38+0 I/II - Gemini Diskordantes fetales Wachstum, Schwere Dermatose, Medikation: Jodthyrox
M P
IHC
56 29 37+5 I/I - Tracheostoma der Mutter
Z.n. Kehlkopftrauma 1996 M IHC
57 36 37+4 V/II - Beckenendlage Z.n. dreimaligem Abort M Dc
IHC
59 37 39+3 IV/III - Re-re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Harnwegsinfekt in der 36. SSW mit Antibiotika-Einnahme, Z.n. 2 Sectiones wg. drohender kindlicher Asphyxie, Z.n. Abruptio, Medikation: Jod, Magnesium
M IHC
66 36 40+6 I/I - V.a. relatives Missverhältnis, 18-jährige Sterilitätsanamnese
Z.n. 3x ICSI, aktuell: spontane Konzeption
M IHC
80 43 37+4 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Z.n. Notsectio bei Gemini-SS 1975 bei Geburtsstillstand, Tod des 1. Zwillings unter der Geburt, Tod des 2. Zwillings 03/99 an einem Asthmaanfall
M PGE2
89 29 37+2 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Z.n. sekundärer Sectio 1997 bei Geburtsstillstand, Z.n. Unterschenkelvenenthrombose 1994
M 6keto-PGF1α
90 34 38+4 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Blutungen in der 10. SSW, Diätetisch gut eingestellter Gestationsdiabetes seit der 30. SSW, Z.n. sekundärer Sectio 1996 wg. kindlicher Asphyxie
M 6keto-PGF1α
97 28 38+3 II/I - Beckenendlage Z.n. Abruptio 1997 (7. SSW), Wendeversuch in der 36. SSW, Medikation: Jod, Eisen, Folsäure
Dc PGE2
99 30 38+ III/III - Re-re-Sectio bei absolutem Missverhältnis wg. querverengten, schräg ovalen Beckens
Z.n. 2 primären Sectiones 1991 und 1993
M 6keto-PGF1α
100 35 39+6 I/II - Gemini, 1. Zwilling Beckenendlage, 2. Zwilling Querlage
Arabin-Pessar seit der 24. SSW M 6keto-PGF1α
102 26 37+6 I/II - Gemini, beide Querlage
Unauffällige SS-Anamnese M LDH
104 26 38 III/I (+) Beckenendlage Cerclage und Einlage eines Arabin-Pessars wg. Cervixinsuffizienz und beginnenden Fruchtblasenprolapses,
M LDH
Material und Methoden 35
Pa
t.-N
r.
Alt
er
SS
W
G/P
We
he
n
Sectio-Indikation Anamnese
Ge
we
be
Te
st
immer wieder leichte vorzeitige Wehentätigkeit, Z.n. Notfallcerclage 2000, Z.n. Spätabort in der 21. SSW 1999, Medikation: Magnesium
105 32 38 III/II (+) Gemini, 1. Zwilling Schädellage, 2. Zwilling Beckenendlage
Tokolyse wg. vorzeitiger Wehentätigkeit in der 27.-36. SSW, Wachstumsdifferenz der Gemini von ca. 5 Wochen, Arabin-Pessar in der 27.-34. SSW
M 6keto-PGF1α
PGE2
106 38 39+1 III/III - Re-re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Z.n. unauffälliger Amniocentese in der 16. SSW, Z.n. 2 Sectiones 1997 und 1999, 1999 Tod des Kindes am 3. Lebenstag wg. Osteogenesis imperfecta
M 6keto-PGF1α
PGE2
107 24 39+1 IV/II - Fetale Spina bifida bekannt seit 20. SSW
Z.n. Clomifen-Therapie, Vaginale Blutung in der 12. SSW, Z.n. Vakuumextraktion 1997 bei grünem Fruchtwasser, Z.n. 2 Aborten 1999 (8. und 12. SSW)
M 6keto-PGF1α
PGE2
109 37 36+6 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis, Gemini, beide Beckenendlage
Z.n. Sectio bei Geburtsstillstand 1994,Arabin-Pessar seit der 24. SSW, Intraoperative PGF2α-Infusion
M 6keto-PGF1α
110 33 37+1 II/II (+) Drillinge nach IVF Cervixinsuffizienz, Intermittierende vorzeitige Wehentätigkeit, Medikation: Magnesium, Calcium, Jodid, Folsäure
M 6keto-PGF1α
111 35 36+5 I/I (+) Querlage, Vorzeitiger Blasensprung
Tokolyse wg. vorzeitiger Wehentätigkeit
M 6keto-PGF1α
112 35 39 I/II - Gemini, 1. Zwilling Beckenendlage, 2. Zwilling Schädellage
Unauffällige SS-Anamnese, Z.n. Beinvenenthrombose 1990 bei bekannter Faktor V-Mutation
M 6keto-PGF1α
113 33 40 III/III - Re-re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Vorzeitiger Blasensprung in der 36. SSW, Bronchitis
M 6keto-PGF1α
114 31 39+2 III/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis
B-Streptokokken-positiver Vaginalabstrich
M 6keto-PGF1α
115 35 39+2 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis, V.a. Makrosomie
Insulinpflichtiger Gestationsdiabetes, Depression
M 6keto-PGF1α
116 30 38+3 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Harnwegsinfektion in der 37. SSW, Z.n. primärer Sectio 1997 bei relativem Missverhältnis
M 6keto-PGF1α
117 39 38+4 V/III - Re-re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Z.n. 2 Aborten, Z.n. 2 Sectiones wg. engen Beckens, Z.n. Abortus imminens-Blutung in der Früh-SS, Intermittierende Arrhythmien, V.a. chronische Sinusitis
M P
6keto-PGF1α
118 34 38+7 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Z.n. primärer Sectio 1997 bei relativem Missverhältnis
P 6keto-PGF1α
Material und Methoden 36
Tab. 3: Klinische Daten und Gewebeverwendung der termingerechten sekundären Sectiones. Patientinnen mit vorzeitiger Wehentätigkeit sind mit (+) gekennzeichnet. „G/P“ bezeichnet die Anzahl der bisherigen Schwangerschaften und Geburten. „M“ beschreibt die Gewebeart (Myometrium).
Pa
t.-N
r.
Alt
er
SS
W
G/P
We
he
n
Sectio-Indikation Anamnese
Ge
we
be
Te
st
88 36 38+6 III/II + Beckenendlage Tokolyse wg. vorzeitiger Wehentätigkeit nach Wendeversuch in der 31. SSW, Z.n. Interruptio 1991, Z.n. IUFT 1999
M 6keto-PGF1α
98 43 39+6 V/III + Re-Sectio bei relativem Missverhältnis
Beginnende Wehentätigkeit am Tag der geplanten Sectio
M LDH
2.3 Methoden
2.3.1 Gewinnung und Präparation der Gewebeproben
2.3.1.1 Myometrium
Im Rahmen der Wundbereinigung wurde vom Operateur vom oberen Rand des
unteren Uterinsegments ein 1-3 cm3 großes, 1-2 g schweres Stück Myometrium
entnommen. Bei Raumtemperatur wurde dieses umgehend in Hank’s Balanced Salt
Solution (HBSS; Biochrom, Berlin) ins Labor transportiert und dort auf einer
Reinraumwerkbank (Antares 48/72; Biohit, Köln) weiterverarbeitet. Unter langsamem
Schütteln auf einem Schüttler (MS 2 Minishaker; IKA Works, Wilmington, NC, USA)
wurde das Gewebe mehrfach in Dulbecco’s Phospate Buffered Saline (D-PBS;
Invitrogen, Karlsruhe) gewaschen. Das sorgfältige Waschen diente der Entfernung von
Blutrückständen, die durch Eicosanoidproduktion die Versuchsergebnisse verfälschen
könnten. Anschließend wurde das Myometrium mit einer sterilen Schere in kleine
Stückchen von 10-30 mg Feuchtgewicht geschnitten und auf einem Papiertuch
abgetupft, um bei der Feststellung des Feuchtgewichtes auf einer digitalen Waage
(AB54; Mettler-Toledo GmbH, Gießen) Messunterschiede zu vermeiden.
Stichprobenartig wurde ein Teil der Myometriumbiopsien zur späteren histo-
logischen Charakterisierung des Gewebes (s. 2.3.8) in 4%iger PBS-gepufferter
Formalinlösung über Nacht fixiert und in Paraffin eingebettet.
Material und Methoden 37
Ferner wurde zur Vervollständigung einer Gewebebank für weiterführende
laborinterne Untersuchungen jeweils ein Stückchen pro Gewebeprobe in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Die Verarbeitungsdauer von der
Entgegennahme des Gewebes im Operationssaal bis zum Schockgefrieren betrug 30-
55 Minuten.
2.3.1.2 Placenta
Die Gewinnung von Placentaproben erfolgte primär im Kreißsaal nach Entnahme
des Placentarestblutes. Dazu wurden mit Hilfe einer sterilen Schere oder eines
Skalpells aus einer Kotelydone relativ nah am Nabelschnuransatz, wo die Placenta
meist die größte Dicke aufweist, würfelförmige Stücke von 4-8 cm3 herausgeschnitten.
Es wurde darauf geachtet, für die Entnahme makroskopisch möglichst homogen
aussehende Bereiche mit wenigen Blutgefäßen oder Bindegewebssepten
auszuwählen. Zur Weiterverarbeitung (Waschen, Schockgefrieren, Kurzzeit-
Gewebekultur bzw. Einbetten in Paraffin) wurden die Proben anschließend in HBSS
(Biochrom) ins Labor gebracht und dort analog dem unter 2.3.1.1 beschriebenen
Vorgehen verwertet.
2.3.1.3 Decidua
Zu Beginn des Versuchszeitraumes der vorliegenden Arbeit (2000-2004)
existierten zwei verschiedene Methoden der Decidua-Gewinnung. Einerseits wurde
vom Operateur bei einer Sectio das Cavum uteri postnatal mit sterilen Tupfern
ausgewischt und nach Transport in HBSS (Biochrom) ins Labor durch Abpräparation
von den Tupfern sog. uterine Decidua (Du) gewonnen. Die zweite Methode bestand im
Abschaben der Decidua-Schicht unter Laborbedingungen mit einer sterilen stumpfen
Pinzette vom Chorion, weshalb die auf diese Weise gewonnene Decidua als chorial
(Dc) bezeichnet wurde. Nachdem Frau Dr. Eva Schumacher [188] im Rahmen ihrer
medizinischen Dissertation bewiesen hatte, dass die durch die zweite Methode
erhaltene choriale Decidua anatomisch intakter blieb, wurde erstere Methode nicht
weiter durchgeführt. Die Weiterverarbeitung der Decidua erfolgte wie unter 2.3.1.1
beschrieben.
Material und Methoden 38
2.3.2 Kurzzeit-Gewebekultur von Myometriumbiopsien zur Untersuchung der Prostaglandin-Synthese
2.3.2.1 Allgemeiner Versuchsablauf
Zur Untersuchung der basalen Prostaglandin-Synthese im Myometrium und ihrer
Stimulierbarkeit durch CRH wurden Myometriumbiopsien für 24 Stunden inkubiert. Die
Kultivierung erfolgte in Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM; PAA
Laboratories, Cölbe) mit stabilem L-Glutamin und NaHCO3 mit 1% Antibiotika- und
Antimykotika-Zusatz (100 units/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 250 ng/ml
Amphotericin B; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen). Dieses Basalmedium
wurde im Labor einmalig mit einem Pyrocheck-Kit (DPC Biermann, Bad Nauheim)
negativ auf Endotoxine getestet. Dadurch konnte eine unspezifische Stimulation
proinflammatorischer Mediatoren ausgeschlossen werden. Kultiviert wurden die
Gewebeproben bei 37°C in einem Begasungsbrutschrank (CB210; WTC Binder,
Tuttlingen) in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO2.
Der Kulturbeginn lag maximal 2 Stunden nach dem Geburtszeitpunkt. In jede
Vertiefung (Well) einer sterilen Kulturplatte für die Zellkultur mit 24 Vertiefungen à 16
mm Durchmesser (24-Well-Platte; Costar Corporation, Cambridge, MA, USA) wurden
3 Gewebestückchen in 1 ml Nährmedium gegeben.
Um das durch physikalische Reize bei Gewinnung und Präparation eventuell leicht
traumatisierte Gewebe zu äquilibrieren und somit falsch-hohe Prostaglandin-
Messwerte zu vermeiden, wurde der Hauptinkubationsphase eine 30-60-minütige
Vorinkubation vorgeschaltet, an deren Ende die Gewebestückchen in ein neues Well
mit frischem Medium transferiert wurden.
Eine Veränderung der Inkubationsbedingungen in den einzelnen Wells im Verlauf
der Kurzzeitkultur durch Entnahme relativ großer Aliquots des Kulturüberstandes
wurde vermieden, indem jedem Ansatz eine bestimmte Inkubationsdauer zugeordnet
wurde und weiterhin der Überstand nach Ablauf dieser Zeit aliquotiert und mittels
Enzymimmunoassay (EIA) auf seine 6-keto-PGF1α- bzw. PGE2-Konzentration
untersucht wurde. Um außergewöhnlich hohe oder niedrige Messwerte (sog.
Ausreißer) als solche zu erkennen, wurden jeweils Triplikate, d.h. 3 Ansätze, unter
identischen Bedingungen kultiviert und gemessen. Ein Schüttler im Brutschrank
(Innova, Nürtingen) sorgte für eine gleichmäßige Durchmischung der Proben während
Material und Methoden 39
der gesamten Kultivierungszeit, die ohne Vorinkubationszeit 22-24 Stunden betrug.
Nach der Inkubation wurden die Kulturüberstände bis zur Analyse bei -20°C gelagert.
Bei insgesamt 24 Inkubationsversuchen wurden die Inkubationsbedingungen wie im
Folgenden beschrieben variiert und in Tab. 4 dargestellt.
Tab. 4: Inkubationsbedingungen in der Kurzzeit-Gewebekultur von Myometriumbiopsien zur Untersuchung der Prostaglandin-Synthese. “Inkubation AB“ bezeichnet eine zweigeteilte Inkubationsphase von 6-7h (A), nach denen die Gewebeproben in frisches Kulturmedium umgesetzt und für weitere 16-17h (B) inkubiert wurden. „Inkubation C“ beschreibt eine einteilige Inkubationsphase von 22-24h. Bei den mit „*“ gekennzeichneten Gewebeproben wurden statt Triplikaten Hexaplikate gemessen. „Basal“ bedeutet die Untersuchung der basalen PG-Synthese, „stimuliert“ die Zugabe von CRH und anderen potentiellen Stimulanzien.
Inkubation AB Inkubation C
Basal Stimuliert Basal Stimuliert IMDM/HBSS
M88 +
M89 +
M90 +
M99 +
M100 + +
M101 + +
M102 + +
M104 + +
M105 + +
M106 + +
M107 + +
M109 +
M110 +
M111 +
M112 +
M113 +
M114*
M115*
M116*
M117
2.3.2.2 Unterteilung der Hauptinkubationszeit in zwei Phasen (n=8)
Ausgehend von früheren laborinternen Ergebnissen von Nathalie Stratz
(unveröffentlichte Daten), bei denen sehr große interindividuelle Schwankungen der
Prostaglandin-Werte zwischen den einzelnen Patientinnen auffielen, wurde die Haupt-
Material und Methoden 40
inkubationsphase unterteilt in eine Phase A und eine Phase B: Nach 6-7 Stunden
wurde das Gewebe in neues Nährmedium umgesetzt, in dem dann für weitere 16-17
Stunden die Inkubation fortgesetzt wurde. Dadurch erhoffte man sich eine Art interne
Kontrolle durch Korrelation der Werte der Phase B zu Phase A einer einzelnen
Patientin.
Abb. 5: Beobachtung der Prostaglandin-Synthese bei zweigeteilter Hauptinkubationszeit. a) basal (n=5), b) nach Zugabe potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β; n=3). „V“ beschreibt eine Vorinkubationszeit von 30-60 min. Nach den ersten 6-7h der Hauptinkubationszeit (A) wurden die Gewebeproben in frisches Kulturmedium umgesetzt und für weitere 16-17h (B) mit oder ohne Zugabe potentieller Stimulanzien inkubiert. Zu den mit „x“ markierten Zeitpunkten wurde Kulturüberstand zur Prostaglandin-Messung abgenommen.
Bei einem Teil der Versuche (n=5) wurde nun zu unterschiedlichen Zeitpunkten
(nach 5, 6, 7, 20, 21, 22 Stunden) die Konzentration von 6-keto-PGF1α zur Bestimmung
des zeitlichen Verlaufs der basalen Sekretion gemessen.
Bei anderen Versuchen (n=3) wurden den Kulturansätzen in Phase B CRH,
Urocortin und Interleukin (IL)-1β. Zur Verlaufsbeobachtung der basalen 6-keto-PGF1α-
Sekretion wurde bei 3 Ansätzen in Phase B nur das Medium gewechselt. Im EIA
wurden dann stimulierte und unstimulierte Ansätze hinsichtlich ihrer 6-keto-PGF1α-
bzw. PGE2-Synthese zu verschiedenen Zeitpunkten miteinander verglichen.
Material und Methoden 41
2.3.2.3 Versuche mit nur einer Inkubationsphase (n=16)
Bei einer zweiten Gruppe von Versuchen (n=16) wurde im Anschluss an die
Vorinkubation nur eine einzige 22-24-stündige Inkubationsphase durchgeführt.
Abb. 6: Beobachtung der Prostaglandin-Synthese bei nur einer Inkubationsphase. a) basal (n=4), b) nach Zugabe potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β; n=9).„V“ beschreibt eine Vorinkubationszeit von 30-60 min, „C“ die Hauptinkubationszeit von 22-24h. Zu den mit „x“ markierten Zeitpunkten wurde Kulturüberstand zur Prostaglandin-Messung abgenommen.
Zur Beobachtung der Zeitkinetik wurde die 6-keto-PGF1α-Konzentration am Ende
der Inkubationszeit nach 22-24 Stunden bestimmt (n=4). Zusammen mit einer
Messung des Überstandes dieser Proben nach 6-7 Stunden diente dies dem Vergleich
zu Proben, bei denen nach 6-7 Stunden ein Mediumwechsel erfolgt war.
Um möglicherweise die Kulturbedingungen zu optimieren, wurde parallel zum
etablierten Einsatz von IMDM als Kulturmedium in einigen Ansätzen (n=3) HBSS
(Biochrom, Berlin) benutzt. Anhand der 6-keto-PGF1α-Konzentration wurde dann
überprüft, welches Nährmedium für die Kurzzeit-Myometriumkultur besser geeignet ist.
Bei der Hälfte der Versuchsansätze wurden statt Gewebe-Triplikaten Hexaplikate
kultiviert, um Schwankungen des Messwert-Mittelwertes der Parallelansätze zu
minimieren.
2.3.3 Lactatdehydrogenase (LDH)-Test
Bei Versuchen mit Gewebeverbänden ist es notwendig, die Gewebevitalität nach
Abschluss der Kultur zu überprüfen. Zur Routineuntersuchung hat sich der
Lactatdehydrogenase-Test nach Benford & Hubbard [9] bewährt. Ihm liegt das Prinzip
Material und Methoden 42
zu Grunde, dass bei Zell- und Gewebeschädigungen in einem frühen Stadium die
Membranintegrität gestört wird und dadurch cytoplasmatische LDH aus dem Intra- in
den Extrazellulärraum gelangt. Die Vitalität einer Gewebekultur kann demnach
charakterisiert werden, indem nach einer Gewebeinkubation die LDH-Aktivität im
Medium zur Gesamt-LDH-Aktivität in Beziehung gesetzt wird. Die Gesamt-LDH-
Aktivität wird durch Zellaufschluss ermittelt und stellt die Summe der Aktivitäten im
Medium und im Gewebe dar. Die Messung der LDH-Aktivität basiert auf der
physiologischen Eigenschaft der LDH, unter Verbrauch von Nicotinamidadenin-
dinucleotid (NADH+H+) Pyruvat zu Lactat umzusetzen. Diese enzymatische Reaktion
kann UV-photometrisch quantifiziert werden, indem die Extinktionsabnahme des
zugegebenen NADH+H+ bei 366 nm über einen Zeitraum von 5 Minuten verfolgt wird.
Im Endokrinologischen Labor hat Frau Dr. Karin Werner [217] diese Methode im
Rahmen ihrer naturwissenschaftlichen Doktorarbeit etabliert.
Für die vorliegende Arbeit wurde zum einen überprüft, inwiefern sich das
nochmalige Umsetzen der Myometriumstückchen in frisches Kulturmedium während
der Hauptinkubationsphase (Versuchsaufbau s. 2.3.2.2) im Vergleich zur Verwendung
desselben Mediums für die gesamte Dauer der Inkubation auf die Gewebevitalität
auswirkt. Ferner wurde die Vitalität des Gewebes im zeitlichen Verlauf nach der
Vorinkubationsphase, nach 6 Stunden und nach Beendigung der Gewebekultur
betrachtet.
Hierzu wurden die Kulturüberstände nach Abnahme bei 4°C zwischengelagert und
bis zur photometrischen Messung auf Eis transportiert. Die Gewebeproben wurden in
Mikrodismembrierkammern in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Homogenisierung
des Gewebes erfolgte dann unter Zugabe von 1 ml HomogenisierungslösungLDH
(50 mM Tris, 0,154 M KCl) für je ca. 90 Sekunden im Mikrodismembrator II (B. Braun,
Melsungen). Das auf diese Weise erhaltene Homogenisat wurde nach Auftauen für 5
Minuten bei 12000-mal g zentrifugiert (Rotixa RPO; Hettich Zentrifugen, Tuttlingen),
dekantiert und bis zur Messung auf Eis gelagert. Zur Messung der LDH-Aktivität
wurden 3 ml SubstratlösungLDH (44,7 mM K2HPO4, 7,35 mMKH2PO4, 625 µM Na-
Pyruvat) mit je 300 µl Probe (Gewebesuspension bzw. Kulturüberstand) vermischt und
zum Start der Enzymreaktion mit 50 µl NADH-Lösung (14,1 mM NADH in 1%, m/v,
NaHCO3-Lösung) versetzt. Nach Bestimmung des Extinktionsanfangswertes wurde
nun die Extinktion bei 366 nm, gemessen im Spektralphotometer Ultrospec 3000
Material und Methoden 43
(Pharmacia Biotech, Cambridge, Großbritannien), über einen Zeitraum von 5 Minuten
alle 15 Sekunden notiert. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne Pyruvat. Abschließend
wurde die Gewebevitalität aus dem Verhältnis der (intrazellulären) LDH-Aktivität des
Homogenisats zur Gesamt-LDH-Aktivität in Prozent berechnet.
2.3.4 Enzymimmunoassays (EIAs)
2.3.4.1 6-keto-PGF1αααα- und PGE2-EIA
Zur Bestimmung der 6-keto-PGF1α- und PGE2-Konzentration in den Kulturüber-
ständen der Myometrium-Kurzzeitkultur wurden kommerzielle, kompetitive Correlate-
EIA Kits der Firma Biotrend (Köln) verwendet (6-keto-PGF1α n=16, PGE2 n=4).
Bei diesem Zwei-Antikörper-Test ist eine 96-Well-Mikrotiterplatte beschichtet mit
Anti-Schaf-Antikörpern vom Esel, die gegen einen polyklonalen Anti-6-keto-PGF1α-
Antikörper vom Schaf bzw. gegen einen monoklonalen Anti-PGE2-Antikörper gerichtet
sind. Nach dem Prinzip der kompetitiven Bindung konkurriert während einer zwei-
stündigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur, während der die Mikrotiterplatte zur
gleichmäßigen Durchmischung auf einem horizontalen Schüttler (KS 130 basic; IKA,
Staufen) platziert wird, unmarkiertes 6-keto-PGF1α bzw. PGE2 aus der Gewebekultur
mit markiertem 6-keto-PGF1α bzw. PGE2 aus dem Kit, das kovalent mit intestinaler
alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelt ist. Im Anschluss an diesen Vorgang werden
überschüssige Reagenzien in fünf sorgfältigen Waschgängen mit gepufferter
Salzlösung, die nichtionische Detergenzien zur Zurückdrängung unspezifischer
Bindungen enthält, entfernt, sämtliche Flüssigkeit aus den Vertiefungen herausgeklopft
und p-Nitrophenylphosphat als Substrat hinzugefügt. Die AP dient als Amplifizierungs-
system zur Sichtbarmachung der ablaufenden Immunreaktion, indem sie einen Farb-
umschlag von grün nach gelb bewirkt. Nach 45 Minuten wird die Reaktion durch
Zugabe von Stop-Lösung beendet. Die Intensität der gelben Farbe ist proportional zum
Verdrängungsgrad des markierten Antigens und hat ein Absorptionsmaximum bei 405
nm. Somit kann durch Messung der optischen Dichte in einem EIA-Reader (Anthos
Labtec Instruments, Walz/Salzburg, Österreich) die 6-keto-PGF1α- bzw. PGE2-
Konzentration der untersuchten Proben quantifiziert werden.
Material und Methoden 44
Als Grundlage für die Berechnungen der 6-keto-PGF1α-Konzentration diente eine
Standardkurve, die durch eine Verdünnungsreihe einer mitgelieferten 6-keto-PGF1α-
Lösung mit einer Konzentration von 500000 pg/ml zustande kam. In 7 Verdünnungs-
schritten entstanden 7 sog. Standards (S1-S7) mit in Tab. 5 dargestellten Konzen-
trationen. Für die Standardkurve des PGE2-Assays wurde eine 8-schrittige
Verdünnungsreihe, ausgehend von 50000 pg/ml, durchgeführt (s. Tab. 5).
Tab. 5: Konzentrationen (in pg/ml) der Prostaglandin-Standards. Der S4 wurde in allen Assays als Präzisionskontrollprobe mitgeführt.
6-keto-PGF1α PGE2
S1 3,2 39
S2 16 78
S3 80 156
S4 400 313
S5 2000 625
S6 10000 1250
S7 50000 2500
S8 5000
Die Kulturüberstände wurden je nach erwartetem Konzentrationsbereich im 6-keto-
PGF1α-Assay 5- bis 500fach verdünnt, im PGE2-Assay 2- bis 40fach verdünnt
eingesetzt.
Die Kreuzreaktivitäten der verwendeten Antiseren mit anderen Eicosanoiden sind
in Tab. 6 zusammengefasst.
Tab. 6: Kreuzreaktivitäten der in den Prostaglandin-EIAs verwendeten Antiseren mit anderen Eicosanoiden.
Eicosanoid Kreuzreaktivität
mit 6-keto-PGF1αKreuzreaktivität mit
PGE2
6-keto-PGF1α 100% 0,6%
2,3-dinor-6-keto-PGF1α 3,17%
PGF2α 1,67% 0,7%
PGD2 0,6%
PGF1α 0,6% 1,4%
PGE1 0,2% 70%
6,15-diketo-13,14-dihydro-PGF1α 0,12% <0,1%
13,14-dihydro-15-keto-PGF1α <0,01% <0,1%
15-keto-PGF2α <0,01%
Material und Methoden 45
Eicosanoid Kreuzreaktivität
mit 6-keto-PGF1αKreuzreaktivität mit
PGE2
PGA2 <0,01% 0,1%
PGB1 <0,01% 0,1%
PGE2 <0,01% 100%
Thromboxan B2 <0,01% <0,1%
15-HpETE <0,01%
PGE3 16,3%
2.3.4.2 ACTH-Festphasen-Chemilumineszenz-EIA
Ein kommerzieller Festphasen-Chemilumineszenz-EIA der Firma DPC Biermann
(Bad Nauheim) wurde auf einem Analyseautomaten (Immulite®) durchgeführt, um die
ACTH-Sekretion einer Ratten- (RC-4B/C1) und einer Maus-Hypophysen-Zelllinie
(AtT20) zu überprüfen. Über die klassische neuroendokrine Stimulationskaskade, bei
der die ACTH-Sekretion in Hypophysenzellen durch das hypothalamische CRH
angeregt wird, sollte dies als indirekte Kontrolle der Bioaktivität des in Gewebe- und
Zellkultur experimentell eingesetzten, synthetischen CRH dienen. Die herstellenden
Firmen garantieren zwar die Reinheit, nicht jedoch die Funktionalität ihrer Produkte.
Der ACTH-Assay ist nach dem Sandwich-Prinzip aufgebaut: Eine mit spezifischen,
monoklonalen Anti-ACTH-Antikörpern von der Maus beschichtete Polystyrolkugel im
Immulite®-Teströhrchen dient als Festphase, an die während einer 30-minütigen
Inkubationszeit ACTH aus dem Kulturüberstand bindet. Während einer zweiten
halbstündigen Inkubationszeit bindet ein zweiter, mit AP als Amplifikator markierter,
polyklonaler Anti-ACTH-Antikörper vom Kaninchen an das bereits gebundene ACTH.
Es entsteht ein sog. Sandwich-Komplex. Beide Bindungsreaktionen laufen bei 37°C
ab. Ungebundene Komponenten werden anschließend mittels einer speziellen
Zentrifugalwaschtechnik entfernt. Als Chemilumineszenz-Substrat wird Peroxidase aus
Meerrettich, Adamantyldioxetanphosphat, hinzugefügt und von der gebundenen AP
während der folgenden 10-minütigen Inkubation hydrolysiert. Die dabei ausgelöste
Lichtemission ist der ACTH-Konzentration in den Proben direkt proportional.
Da den Assay eine hohe Präzision und Stabilität auszeichnet, müssen keine
Standard-Kontrollproben pipettiert werden. Die Standardkurven sind als „Master-
kurven“ im Analyseautomaten gespeichert. Alle 4 Wochen bzw. bei Verwendung einer
Material und Methoden 46
neuen Charge wird mit einem hoch- und einem niedrig-konzentrierten Kalibrator (DPC
Biermann) eine neue Kalibration durchgeführt.
Beim ersten Versuchsdurchlauf wurden die Proben jeweils zunächst 1:10 mit
Kulturmedium und anschließend noch 1:10 mit einem spezifischen Verdünnungspuffer
(DPC Biermann) verdünnt, je nach Messergebnissen wurde dann mit unterschied-
lichen Verdünnungen noch einmal nachgemessen, wobei das Spektrum von der
unverdünnten Probe der RC-4B/C1-Zelllinie bis zur 3000fach verdünnten Probe der
AtT20-Zelllinie reichte. Als Kontrolle diente ein Placenta-Extrakt, der durch Zerstoßen
eines frischen, sorgfältig mit PBS gewaschenen Placenta-Stückes unter Zugabe von
Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) selbst
hergestellt wurde. Laut Angaben des Herstellers ist der Assay hochspezifisch für
ACTH; demnach sind Kreuzreaktivitäten des verwendeten Antiserums zu anderen in
der Probe vorkommenden ACTH-Fragmenten vernachlässigbar niedrig.
2.3.4.3 Qualitätskontrolle der EIAs
Die Variationskoeffizienten (Vk) der Intraassay-Präzision und Interassay-Präzision
werden aus dem Mittelwert und der Standardabweichung der Einzelmesswerte
errechnet. Sie wurden für die Prostaglandin-EIAs mit Hilfe von Präzisionskontroll-
proben bestimmt, deren Konzentrationen im Bereich des 50%-Intercept-Wertes lagen.
Diese Bedingung wurde am ehesten vom S4 erfüllt, der vierten Verdünnungsstufe der
mitgelieferten Standardlösung. Um Messwert-Unterschiede durch Pipettierungenauig-
keiten zu vermeiden, wurde der S4 einmal zu Beginn der Versuchsreihe in großer
Menge hergestellt, in Portionen für je einen Assay aliquotiert und bei -20°C gelagert.
Zur Ermittlung der Intraassay-Präzision wurden in einem Assay 6-8 Kontrollproben
eingesetzt, von denen 2 Proben vor, 4 in der Mitte und 2 nach den biologischen
Proben angeordnet wurden. Die Interassay-Präzision wurde überprüft, indem in jedem
Assay 2 Kontrollproben auf der Mikrotiterplatte zwischen den Standards und den
biologischen Proben mitgeführt wurden.
Zur Qualitätskontrolle des ACTH-Assays wurde ein kommerzielles Kontrollserum
(Lyphochek Immunoassay Plus Control) der Firma Bio-Rad Laboratories GmbH,
München, benutzt, da von DPC Biermann keine ACTH-Kontrolle erhältlich war. Alle
Material und Methoden 47
gemessenen Werte lagen im akzeptablen Bereich der vom Hersteller für andere
Geräte angegebenen Werte.
Die biologischen Proben wurden bei allen EIAs als Duplikate oder Triplikate, z.T.
auch als Hexaplikate eingesetzt. Im Rahmen der 6-keto-PGF1α-EIAs wurden einmalig
18 Parallelansätze auf den Gehalt dieses Prostaglandins untersucht.
Des Weiteren wurde einerseits die Genauigkeit der verschiedenen verwendeten
Pipetten (Einzelpipette, Multipette, Mehrkanalpipette) untersucht und andererseits die
Präzision unterschiedlicher Pipettierer. Im Rahmen dieser Kontrolltests wurde
außerdem die Messgenauigkeit des EIA-Readers überprüft, indem im Anschluss an
eine Messung dieselbe Mikrotiterplatte nach Drehung um 180° ein zweites Mal
gemessen wurde.
2.3.5 Zellkultur von RC-4B/C1- und AtT20-Zellen
2.3.5.1 Steriles Arbeiten
Um bei der Zellkultur sterile Bedingungen zu gewährleisten, wurden alle Pinzetten,
Scheren und Glasgeräte vor Gebrauch autoklaviert und nach Gebrauch in Buraton
eingeweicht. Sämtliche Labormaterialien aus Kunststoff wurden sterilisiert von
verschiedenen Herstellern bezogen. Die keimfrei auszuführenden Arbeiten wurden auf
einer Sterilbank (ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA) durchgeführt, wobei der
Arbeitsplatz vor der Arbeit mit 70%igem Ethanol und nach der Arbeit mit Barizidal
desinfiziert wurde. Die Sterilbank bot zusätzlich die Möglichkeit einer 2-stündigen UV-
Bestrahlung zur Keimabtötung.
2.3.5.2 Allgemeine Kulturbedingungen
Mit dem Ziel, einen Bioassay zur Kontrolle der biologischen Aktivität des für die
Stimulationsversuche mit der Kurzzeit-Myometriumkultur eingesetzten synthetischen
CRH zu etablieren, wurden von der European Collection of Cell Cultures (ECCC;
Salisbury, Großbritannien) zwei Zelllinien aus Hypophysen-Adenomen bezogen: die
Ratten-Zelllinie RC-4B/C1 und die Maus-Zelllinie AtT20.
Material und Methoden 48
Die RC-4B/C1-Zellen zeichneten sich aus durch konfluierendes Wachstum in einer
Mischung aus DMEM und Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) im Verhältnis
1:1 mit 10% fetal-bovinem Serum (FBS) und 2 mM Glutamin (jeweils von Sigma-
Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen). Die AtT20-Zellen wuchsen hingegen frei
schwimmend und Aggregate bildend. Als Kulturmedium wurde vergleichend einerseits
DMEM, andererseits Ham’s F12 Nutrient Mixture mit Zusätzen (Sigma-Aldrich Chemie
GmbH) benutzt. Die Zellen wurden aufgetaut, in 25-cm2-Kulturflaschen mit
Gasaustauschöffnung (BD Biosciences, Heidelberg) in 12 ml Medium ausgebracht und
in Begasungsbrutschränken kultiviert, wobei die RC-4B/C1-Zellen eine wasserdampf-
gesättigte Atmosphäre von 10% CO2 und 90% Luft bei 34°C benötigten, während die
AtT20-Zellen in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre von 5% CO2 und 95% Luft
bei 37°C am besten gediehen. Gesundes Wachstum und fehlende Kontamination
wurden täglich durch Betrachtung der Zellen unter dem Invers-Mikroskop (DM IL;
Leica Mikroskope und Systeme GmbH, Wetzlar) kontrolliert. Nach jeweils 2-3 Tagen
wurde ein Mediumwechsel vorgenommen, und bei Bedarf wurden die Zellen in neue
Kulturflaschen umgesetzt. Die AtT20-Zellen mussten hierzu bei 220-mal g
abzentrifugiert werden. Als Indikator für die Notwendigkeit eines Mediumwechsels
diente ein Farbumschlag des Mediums von rot nach gelb, der durch eine Veränderung
des pH-Wertes aufgrund des vermehrten Anfalls von Stoffwechselprodukten bei
höheren Zellzahlen hervorgerufen wurde. Ab der 3. Passage wurden jeweils mit einem
Teil der Zellen ACTH-Experimente (z.B. Untersuchungen der basalen ACTH-
Sekretion, s. 2.3.5.3, Stimulationsversuche mit CRH, s. 2.3.5.4) durchgeführt.
Alternativ wurde ein Teil der Zellen für Immuncytochemie-Experimente (s. 2.3.8.1) auf
zweikammerigen Kultur-Objektträgern (Culture Slides; BD Biosciences) ausgesät,
während ein letzter Teil in flüssigem Stickstoff zur späteren Verwendung (z.B.
Isolierung von Total-RNA) schockgefroren und bei -80°C gelagert wurde.
2.3.5.3 Langzeitbeobachtung der basalen ACTH-Sekretion
Als Grundlage für die Stimulationsversuche mit CRH diente eine Beobachtung der
basalen ACTH-Sekretion der AtT20-Zellen über einen Zeitraum von 4,25 Tagen (104
Stunden). Für diese Versuche wurden die Zellen auf sterilen 6-Well-Kulturplatten
(Costar Corporation) in 5 ml Medium pro Well kultiviert. Eine Entnahme von 20 µl
Kulturüberstand erfolgte dabei nach 0, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 54, 72, 80, 96 und 104
Material und Methoden 49
Stunden. Zusätzlich wurde dabei untersucht, ob sich DMEM oder Ham’s F12 als
Kulturmedium geeigneter erweist.
2.3.5.4 Stimulationsversuche mit CRH
In Anlehnung an die unter 2.3.2 beschriebenen Experimente, in denen eine
Stimulation der Kurzzeit-Myometriumkultur mit CRH durchgeführt wurde, erfolgten
auch mit den beiden Zelllinien Stimulationsversuche. Im Folgenden wird das schon in
der Gewebekultur eingesetzte, 1999 von Bachem Biochemica GmbH (Heidelberg)
bezogene CRH als „alt, lyophilisiert“ bezeichnet. Dies geschieht zur Abgrenzung von
CRH, das 2001, unmittelbar vor den Versuchen mit den beiden Zelllinien, von zwei
verschiedenen Firmen erworben wurde („neu“, Bachem, und „Sigma“, Sigma-Aldrich
Chemie GmbH).
Die RC-4B/C1-Zellen wurden auf sterilen 6-Well-Platten in je 5 ml Nährmedium
ausgesät und am 4. Tag (nach 96 Stunden) mit CRH (alt, lyophilisiert) stimuliert. Das
CRH wurde in zwei verschiedenen Konzentrationen (K) eingesetzt: K1=2,1 nmol/l,
K2=0,21 nmol/l. Nach Stimulation wurden bis zur 6. Stunde im Stunden-, bis zur 12.
Stunde im 2-Stunden-Rhythmus, dann nach 24, 48 und 72 Stunden jeweils 20 µl-
Aliquots entnommen und bei -20°C bis zur Messung der ACTH-Konzentration am
Immulite® zwischengelagert. Als Kontrolle wurde eine unstimulierte Probe mitgeführt.
Während des gesamten Inkubationszeitraumes von einer Woche wurden zur Über-
prüfung der Zellproliferation täglich die Zellzahlen sowohl in den stimulierten als auch
in den unstimulierten Wells bestimmt.
Bei den Stimulationsversuchen mit den AtT20-Zellen (n=7) wurden die
Inkubationsbedingungen hinsichtlich verschiedener Fragestellungen mehrfach modi-
fiziert. Nach mehrfacher Parallelkultur in DMEM und Ham’s F12 (n=3) wurde nur noch
Ham’s F12 als Kulturmedium benutzt, da DMEM nicht besser geeignet erschien. Bei
n=4 Versuchen wurde das CRH der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH eingesetzt,
einmal das „neue“, in entgastem Wasser gelöste CRH von Bachem benutzt, während
das „alte, lyophilisierte“ CRH bei jedem Versuch verwendet wurde, wobei allerdings
verschiedene Konzentrationen (10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM, 0,1 nM) eingesetzt
wurden, um eine Konzentrationsabhängigkeit der Stimulierbarkeit zu überprüfen. Mit
einer Ausnahme, bei der die Kultur schon nach 6 Stunden beendet wurde, lagen die
Material und Methoden 50
Entnahmezeitpunkte der Kulturüberstände jeweils bei 0, 2-6, 18, 24 und 27 Stunden
nach Stimulation.
2.3.6 Ribonukleinsäure (RNA)-Extraktion
2.3.6.1 Durchführung der Total-RNA-Isolierung
Aus den Zellen beider Hypophysen-Zelllinien wurde nach der Single-Step-Methode
von Chomczynski & Sacchi [30] cytoplasmatische RNA isoliert, um im nächsten Schritt
mittels RT-PCR (Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion) zu überprüfen,
ob sie CRH-Rezeptoren exprimieren. Da der Erfolg dieser Methode von der möglichst
vollständigen Abwesenheit der äußerst stabilen RNasen abhing, wurden sämtliche
Glasgefäße vorher autoklaviert und sterile Materialien aus Kunststoff verwendet, die
laut Herstellerangaben für die Molekularbiologie getestet, also garantiert RNase- und
DNase-frei waren. Es wurde der peqGOLD Trifast Kit (Peqlab, Erlangen) verwendet.
Zunächst wurden die bei -80°C gelagerten Zellpellets aus ca. 106 Zellen in
flüssigen Stickstoff gegeben und für 1-2 Minuten im Mikrodismembrator II (B. Braun,
Melsungen) pulverisiert. Zur vollständigen Zerstörung der Zellen und Denaturierung
von RNasen wurden die Zellen in 1 ml Guanidiniumisothiocyanat-Phenol-Lösung
resuspendiert. Es folgte eine 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, um die
Dissoziation der Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Zur Phasentrennung aufgrund
unterschiedlicher Polarität wurde pro ml Trifast 200 µl Chloroform (J.T. Baker,
Deventer, Holland) zugegeben und die Proben für 15-30 Sekunden kräftig geschüttelt,
bis sie milchig aussahen. Nach einer 5-minütigen Ruhephase wurden sie für 10
Minuten bei 14000-mal g bei Raumtemperatur zentrifugiert, was zu einer Auftrennung
in drei Phasen führte: eine untere, rote Phenol-Chloroform-Phase, eine obere,
farblose, wässrige Phase und eine dazwischen liegende Interphase. Da die Inter- und
Unterphase DNA und Proteine enthielten, während sich die RNA ausschließlich in der
oberen, wässrigen Phase befand, musste diese unter Vermeidung jeglicher
Kontamination vorsichtig abgenommen und in ein steriles Reaktionsgefäß transferiert
werden.
Im nächsten Schritt wurde die Präzipitation der RNA durchgeführt, indem die
Proben pro Anteil Trifast mit einem halben Anteil Isopropanol (Merck, Darmstadt) für
Material und Methoden 51
15 Sekunden gevortext und für 20 Minuten bei -20°C inkubiert wurden. Nach 35-
minütiger Zentrifugation bei 14000-mal g bei 4°C wurde der Überstand abgenommen,
das gelartige RNA-Präzipitat zweimal mit 75%igem Ethanol (J.T. Baker) gewaschen,
für 15 Sekunden gevortext und nochmals für 10 Minuten unter gleichen Bedingungen
zentrifugiert. Ehe die RNA wieder gelöst werden konnte, wurde das Pellet ca. 10
Minuten luftgetrocknet, bis es nicht mehr weiß, sondern durchscheinend aussah. Um
die Löslichkeit der RNA zu gewährleisten, wurde jedoch darauf geachtet, das Pellet
nicht vollständig auszutrocknen.
Zur Inaktivierung der eventuell trotz Einhaltens der Reinheitsvorschriften vorhan-
denen RNasen erfolgte das Lösen der RNA nun durch Zugabe von 100 µl 0,1%igem
Diethylpyrocarbonat (DEPC-)Wasser unter kräftigem Vortexen.
2.3.6.2 Qualitative Erfolgskontrolle durch RNA-Agarose-Gelektrophorese
Als qualitative Methode zur Reinheitsüberprüfung der isolierten RNA diente die
Agarose-Gelelektrophorese. Da cytoplasmatische RNA eukaryotischer Zellen zu 95%
aus ribosomaler RNA besteht, die sich aus 28S-, 18S- und 5S-RNA zusammensetzt,
laufen die 28S- und 18S-Moleküle in zwei scharfen, definierten Banden, die somit als
interne Marker benutzt werden können.
Für die Herstellung eines 1,5%igen, nicht-denaturierenden Gels wurde Agarose
(Biotrend, Köln) in 50 ml 1x TBE-Puffer (pH 8,3; 89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM
EDTA) unter Hitzezufuhr vollständig gelöst und mit 0,04% Ethidiumbromid (Sigma-
Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) versetzt. Das Gel wurde in eine horizontale
Gelapparatur (Mini-sub cell GT, Bio-Rad Laboratories) gegossen, bei der ein Kamm
als Platzhalter für die Probentaschen diente. Beim Gießvorgang entstandene Luft-
blasen wurden sorgfältig entfernt, da sie wie auch ein zu geringer Lösungsgrad der
Agarose einen Störfaktor für die gleichmäßige Bandenwanderung darstellen. Vor jeder
RNA-Analyse wurde die Gelapparatur für mindestens 10 Minuten in 0,5 M NaOH
eingeweicht und anschließend mit ddH2O gewaschen, um RNase-Kontaminationen zu
vermeiden.
Zu je 2 µl der unter 2.3.6.1 gewonnenen RNA-Lösung wurde nach 5-minütiger
Denaturierung im Wasserbad bei 65°C (TW12 EcoTemp, Julabo Labortechnik GmbH,
Seelbach) und 1-minütiger Abkühlung auf Eiswasser 10 µl 1x RNA-Ladepuffer (20%
Material und Methoden 52
deionisiertes Formamid, 20% Glycerin, 20 mM EDTA, 0,02% Bromphenolblau, 0,02%
Xylencyanol FF) gegeben, die Proben in die Taschen des Gels geladen und mit TBE-
Puffer überschichtet. Durch das im Ladepuffer enthaltene Glycerin wird die spezifische
Dichte der Lösung erhöht, so dass die Proben in die Taschen des Gels hinabsinken.
Das Bromphenolblau dient als markierender Farbstoff für die „Lauffront“ der Banden.
Zusätzlich wurde ein kommerzieller 0,24-9,5 Kb-RNA-Marker als Längenstandard
(Invitrogen, Karlsruhe) auf das Gel aufgetragen.
Die Elektrophorese, bei der die negativ geladenen RNA-Moleküle je nach Größe in
einer bestimmten Geschwindigkeit Richtung Anode wandern (je kleiner, desto
schneller und weiter), erfolgte bei 60 V und 40 mA mit einem Electrophoresis Power
Supply-Gerät (EPS 300; Pharmacia Biotech). Sie dauerte ca. 30 Minuten.
Anschließend konnten die mit Ethidiumbromid gefärbten Banden auf einem
Transilluminator (302 nm; Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen) sichtbar
gemacht und mit einem digitalen Image Documentation and Analysis System (IDA;
Raytest, Straubenhardt) aufgenommen werden.
2.3.6.3 Quantitative Erfolgskontrolle durch Photometrie
Zur Kontrolle, ob tatsächlich reine RNA extrahiert wurde, und zur quantitativen
Analyse der RNA-Menge wurde eine Messung der optischen Dichte (OD) bei 260 nm
(A260) in einem Spektralphotometer (Ultrospec 3000; Pharmacia Biotech) durchgeführt.
Bei dieser Wellenlänge haben die Basen der Nukleinsäuren ein Absorptionsmaximum.
Die A260 wurde gegen die Absorption bei 320 nm (A320) als Nullwert abgeglichen, da
bei dieser Wellenlänge weder Nuklein- noch Aminosäuren absorbieren. Anhand der
Absorption bei 280 nm (A280) wurde die Lösung auf mögliche Proteinverunreinigung
geprüft, da aromatische Aminosäuren bei dieser Wellenlänge ein Absorptions-
maximum haben. Das A260/A280-Verhältnis lag zwischen 1,7 und 1,9. Dies spricht für
einen hohen Reinheitsgrad der RNA spricht.
Bei der Durchführung wurden die Proben auf Eis gelagert. Der Nullabgleich
erfolgte mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deisenhofen). Die RNA-Lösung wurde mit DEPC-Wasser 1:50 weiter verdünnt. Nach
Sambrook & Russell [180] entspricht eine A260 von 1 einer Konzentration von etwa 40
µg/µl RNA. Da mit dieser Methode RNA nicht von Desoxyribonukleinsäure (DNA)
Material und Methoden 53
unterschieden werden kann, ist bei der RNA-Quantifizierung unbedingt auf die
Abwesenheit von DNA zu achten.
2.3.7 RT-PCR
2.3.7.1 Reverse Transkription
Die aus den Ratten- bzw. Maushypophysen-Zellen gewonnene RNA (s. 2.3.6.1)
wurde mit Hilfe der RT-PCR vervielfältigt und auf die Genexpression der CRH-
Rezeptoren CRH-R1 (GenBank Accession No. L23332) und CRH-R2 (Accession No.
U34587) untersucht. Bei dieser Methode wird zunächst die RNA von der Reversen
Transkriptase, einem Enzym aus Retroviren, in komplementäre DNA (cDNA)
umgeschrieben, die dann mittels PCR so lange amplifiziert wird, bis ausreichende
Mengen zur weiteren Charakterisierung, z.B. mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese,
zur Verfügung stehen. Da RNA aufgrund hoher Instabilität nicht für eine direkte
Amplifikation nutzbar ist, ist der „Umweg“ über die stabilere cDNA erforderlich. Um den
Umschreibeprozess beginnen zu können, benötigt die Reverse Transkriptase ein
Oligonukleotid als Primer, das zur Zielsequenz auf dem RNA-Strang komplementär ist,
sich dort anlagert und als Startermolekül für die Synthese eines komplementären
DNA-Stranges dient. Für die weitere Synthese werden Random-Hexamer-Primer, die
sich als Gemisch verschiedener Hexamere an unterschiedliche RNA-Sequenzen
anlagern, hinzugefügt. Hierbei erfolgt die Synthese immer vom 5’- bis zum 3’-Ende der
RNA.
Zunächst wurden 2 µg der Total-RNA auf ein Gesamtvolumen von 16 µl mit
DEPC-Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) aufgefüllt, in einem Thermocycler (T-
Gradient 96, Biometra, Göttingen) für 5 Minuten bei 85°C denaturiert und bis zur
Weiterverarbeitung auf Eis gelagert. Zur denaturierten RNA wurde dann bis zu einem
Gesamtvolumen von 30 µl First Strand RT Buffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM
KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM Dithioethritol (DTT) und 5 µM Random Hexameren je 0,65
mM Desoxynucleosidtriphosphat (dNTP) und 10 units/µl Superscript II Reverser
Transkriptase (alle Reagenzien von Invitrogen, Karlsruhe) gegeben. Pipettiert wurde,
um Kontaminationen weitestgehend zu vermeiden, in einer mit UV-Licht bestrahlbaren
PCR-Box (P.C.R. Chamber, PLAS LABS, Lansing, MI, USA). Die cDNA-Synthese
wurde für 90 Minuten bei 42°C im Thermocycler durchgeführt. Durch Hitzeinaktivierung
Material und Methoden 54
des Enzyms für 15 Minuten bei 85°C wurde die Reaktion beendet. Die auf diese Weise
gewonnene cDNA wurde mit DEPC-Wasser in einem Endvolumen von 90 µl gelöst
und bei -20°C gelagert.
2.3.7.2 First-Round und Nested PCR
Zu 1 µl der unter 2.3.7.1 synthetisierten cDNA (entsprechend 20-100 ng revers
transkribierter Total-RNA) wurden 20 mM Tris HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM
MgCl2, je 200 µM dNTP, 0,025 units/µl Taq Polymerase (hitzestabile DNA-Polymerase
aus Thermus aquaticus; alle von Invitrogen, Karlsruhe) und je 400 nM jedes
spezifischen Primers (s. Tab. 7; synthetisiert bei TIB Molbiol, Berlin) gegeben. Dieses
Reaktionsgemisch wurde mit Aqua ad iniectabilia (B. Braun, Melsungen) bis zu einem
Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt. Im Thermocycler (T-Gradient 96, Biometra,
Göttingen) wurde zunächst die cDNA für 5 Minuten bei 95°C vollständig denaturiert,
anschließend in 35 Zyklen die cDNA amplifiziert. Ein Zyklus bestand jeweils aus der
Trennung der DNA-Doppelstränge (Denaturierung) für 30 Sekunden bei 94°C, der
Anlagerung der Primer an die Zielsequenz (Annealing) für 40 Sekunden bei 62°C und
der eigentlichen Neusynthese des komplementären DNA-Stranges (Elongation) für 90
Sekunden bei 72°C. Um die vollständige Polymerisation aller cDNA-Stränge zu
gewährleisten, wurde der Reaktionsansatz nach Wetzka et al. [218] abschließend ein
weiteres Mal für 10 Minuten bei 72°C inkubiert. Zur Positivkontrolle der PCR wurde die
Genexpression von Cyclophilin A (Cyph; Accession No. Y00052), einem ubiquitär
exprimierten sog. „Haushaltsgen“, untersucht, da von diesem zellulären Rezeptor von
Cyclosporin kaum Expressionsschwankungen bekannt sind.
Da für die Zielgene CRH-R1 und -R2 nach nur einer PCR-Runde (First Round
PCR) kein oder nur ein schwaches Signal detektiert worden war, wurde anschließend
nach einer Methode von Knippers et al. [98] eine weitere PCR-Runde (Nested PCR)
mit eingeschachtelten Primerpaaren durchgeführt, die innerhalb des ersten Amplikons
lagen. Dadurch wurden sowohl Sensitivität als auch Spezifität der Reaktion erhöht. 1 µl
einer 1:500-Verdünnung des Reaktionsansatzes aus der First Round PCR diente
dabei als cDNA-Matrize. Die Reaktionsbedingungen waren für First Round und Nested
PCR identisch.
Material und Methoden 55
Tab. 7: Verwendete Primerpaare für die RT-PCR.
Zielgen Richtung Sequenz Amplikon-
Länge Referenz
First Round PCR
CRH sense antisense
5’-TGGATCTCACCTTCCACCTC-3’ 5’-CATTGTGTTGCTGCTGCAC-3’
308 bp Ahmed et al., 2000
CRH-R1 sense antisense
5’-GCCCTGCCCTGCCTTTTTCTA-3’ 5’-GCTCATGGTTAGCTGGACCA-3’
334 bp Stevens et al, 1998
CRH-R2 sense antisense
5’-GCAGCTCGTTGACCATGAAG-3’ 5’-GACACGAAGAAACCCTGGAA-3’
561 bp Sehringer, 2003
Cyclophilin A sense antisense
5’-AGGGTGGTGACTTCACACGCCAT-3’5’-GTCTTGCCATTCCTGGACCCAAA-3’
268 bp Behan et al., 1996
Nested PCR
CRH-R1 sense antisense
5’-ACAAACAATGGCTACCGGGA-3’ 5’-TCGCAGGCACCGGATGCTC-3’
216 bp Rodrigues-Linarez et al., 1998 Di Blasio et al., 1997
CRH-R2 sense antisense
5’-GCAGCTCGTTGACCATGAAG-3’ 5’-GATGCACCATCCGATGAAGA-3’
196 bp Sehringer, 2003
Die PCR-Bedingungen wurden im Endokrinologischen Labor von Frau Dr. Silke
Biller [13] im Rahmen ihrer medizinischen Dissertation etabliert. Die Auswahl der
spezifischen Primerpaare beruhte einerseits auf bereits veröffentlichten Publikationen,
andererseits auf der biologischen Doktorarbeit von Herrn Dr. Bernd Sehringer [190].
2.3.7.3 DNA-Agarose-Gelelektrophorese
Analog der unter 2.3.6.2 beschriebenen RNA-Agarose-Gelelektrophorese wurden
die PCR-Produkte mittels 2%iger Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die hierfür
verwendeten Gele enthielten neben 2% Agarose (m/v) 1x TBE-Puffer (pH 8,3) und 0,4
µg/ml Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen). Die DNA wurde in
einem Probenvolumen von 10-20 µl mit 1x DNA-Ladepuffer (5% Glycerin, 5 mM
EDTA, 0,005% Bromphenolblau, 0,005% Xylencyanol FF) aufgetragen und mit 1x
TBE-Puffer überschichtet. Je nach Größe der zu erwartenden Banden wurde ein 1Kb
Plus- oder ein 50 bp-DNA-Marker (beide von Invitrogen, Karlsruhe) benutzt. Die
Elektrophorese erfolgte bei einer Stromstärke von 60 mA.
Material und Methoden 56
2.3.8 Immunhistochemie (IHC) und Immuncytochemie (ICC)
2.3.8.1 Vorbehandlung der Gewebeproben und Zellen
Zur histologischen Charakterisierung von Myometriumbiopsien wurden Paraffin-
schnitte verwendet. Dazu wurden ca. 1 cm2 große Gewebeproben aus dem unteren
Uterinsegment über Nacht in 4%iger, PBS-gepufferter Formalinlösung (4% Form-
aldehyd in 1x PBS für die IHC) fixiert, in Paraffin eingebettet, mit Hilfe eines Mikrotoms
(Leica, Bensheim) zu 5 µm dicken Schnitten verarbeitet, auf silanisierte Objektträger
(DAKO Diagnostika, Hamburg) aufgezogen und immunhistochemisch angefärbt. Dabei
wurden möglichst aufeinander folgende Gewebeschnitte vom oberen Ende, aus der
Mitte und vom unteren Ende eines Paraffinblocks so verwendet, dass der jeweilige zu
untersuchende Parameter in Schnitten aus allen drei Bereichen parallel angefärbt
werden konnte. Die Einbettung der Biopsien wurde freundlicherweise vom
Histologischen Labor der Universitäts-Frauenklinik durchgeführt. Vor Beginn der
eigentlichen immunhistochemischen Färbung wurde zunächst eine Entparaffinierung
der Schnitte durch eine halbstündige Wärmebehandlung bei 55°C im Wärmeschrank
(WTC Binder) durchgeführt, gefolgt von einer sukzessiven Rehydrierung durch eine
absteigende Alkoholreihe (je 5 Minuten in Xylol 100% und Ethanol 100%, dann für je 2
Minuten in Ethanol 96%, 80% und 70%).
Zur qualitativen Eignungsprüfung der Rattenhypophysen-Zelllinie RC-4B/C1 als
CRH-Bioassay wurden die Zellen nach Kryofixation immuncytochemisch untersucht.
Um die Vorteile des konfluierenden, adhärenten Zellwachstums optimal nutzen zu
können, wurden die Zellen auf speziellen, unbehandelten Kultur-Objektträgern (Culture
Slides; BD Biosciences) mit einem zweigeteilten Kammeraufsatz aus Kunststoff, der
ein Volumen von 250 µl Nährmedium pro Kammer fasste, über 2-3 Tage kultiviert, bis
ein intakter Monolayer entstanden war. Dann wurde das Medium mit überschüssigen
Zellen verworfen, der Kammeraufsatz vom Objektträger entfernt, die angewachsenen
Zellen mit 1x PBS für die IHC gewaschen und trocknen gelassen. Die Fixierung
erfolgte für 5 Minuten bei Raumtemperatur in Methanol und für 3 Minuten bei –20°C in
Aceton. Nach einer 2-stündigen Lufttrocknungsphase wurden die Objektträger in
Alufolie verpackt und bis zur Färbung bei -80°C gelagert. Die Rehydrierung nach dem
Auftauen erfolgte für 3 Minuten in 1x NKH-Lösung (137 mM NaCl, 50 mM KCl, 2 mM
HEPES, pH 7,4).
Material und Methoden 57
Anschließend wurden die Gewebeschnitte bzw. Zellen mit einem Markierstift für
die Immunhistochemie (DAKO Pen, DAKO Diagnostika) eingekreist. Dieser Stift
hinterlässt auf dem Objektträger eine farbige, hydrophobe, leicht erhabene Schicht, so
dass die aufgetragenen Reagenzien (50 µl) auf den umkreisten Bereich beschränkt
bleiben und nicht auslaufen können. Dies spart nicht nur Reagenzien und bietet
Schutz vor Austrocknung der Oberfläche, sondern hat überdies den Vorteil, dass
parallel mehrere Schnitte auf dem Objektträger mit jeweils unterschiedlichen
spezifischen Antikörpern inkubiert werden können.
2.3.8.2 Auswahl der spezifischen Antikörper
Zum Nachweis von CRH-Rezeptoren wurden polyklonale Ziegen-Antikörper (Ak)
eingesetzt, und zwar ein unspezifischer, gegen beide Rezeptoren gerichteter (Anti-
R1/R2unspez.) und je ein spezifischer Antikörper (Anti-R1 spez. bzw. Anti-R2spez.; alle von
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Der Anti-R1 spez. sc-12381 ist gegen
ein Epitop in Richtung des N-Terminus des humanen CRH-R1-Rezeptors zwischen
Aminosäure-Position 81 und 109 gerichtet. Obwohl die Homologie zum CRH-R2-
Rezeptor in diesem Bereich 55% beträgt, ist mit einer Kreuzreaktivität laut
Herstellerangaben nicht zu rechnen, da nie mehr als 5 Aminosäuren nebeneinander
identisch sind. Mit diesem Antikörper sind alle bekannten Spleißvarianten des CRH-
R1-Rezeptors mit Ausnahme des CRH-R1e nachweisbar. Der Anti-R2spez. sc-1826 ist
gegen ein N-terminales Epitop des CRH-R2β-Rezeptors der Maus zwischen
Aminosäure-Position 47 und 66 gerichtet. Ab Position 55 werden die Sequenzen von
CRH-R2α, -β und -γ identisch und weisen mit einer Übereinstimmung von 11 von 12
Aminosäuren eine hohe Sequenz-Homologie zum humanen CRH-R2-Rezeptor auf.
Zum CRH-R1-Rezeptor besteht hingegen eine vernachlässigbare Homologie von
maximal 35%.
Um die Expression der CRH-Rezeptoren innerhalb des myometrialen Gewebe-
verbandes zu beurteilen, wurden als Vergleichsparameter verschiedene Zelltypen mit
spezifischen, monoklonalen Maus-Antikörpern angefärbt: Glatte Muskelfasern wurden
mit einem Antikörper gegen α-Aktin nachgewiesen, Gefäßendothelzellen mit einem
Antikörper gegen von-Willebrand-Faktor (vWF), Makrophagen mit einem Antikörper
gegen das Oberflächenantigen CD68 und Fibroblasten mit dem Antikörper-Klon 5B5
(alle von DAKO Diagnostika) bzw. Klon 3-2B12 (Acris Antibodies GmbH, Hidden-
Material und Methoden 58
hausen). Beide Fibroblasten-Antikörper-Klone sind gegen Epitope in der β-Untereinheit
der humanen Prolyl-4-Hydroxylase, dem Schrittmacher-Enzym der Kollagensynthese,
gerichtet. Ihr Unterschied liegt laut Herstellerangaben in ihrer Eignung für
verschiedene Fixierungsarten: Während 5B5 besonders geeignet für den Fibroblasten-
nachweis in Gefrierschnitten und cytologischen Präparaten ist, zeichnet sich 3-2B12
zusätzlich durch gute Verwendbarkeit für Paraffinschnitte aus. Als Positivkontrolle für
CD68 wurde ein Deciduaschnitt mit angefärbt.
In mehreren Vorversuchen wurde für die Gewebeschnitte die jeweils optimale
Verdünnung der Antikörper mit PBT-Lösung (1x PBS für die IHC, 1% BSA für die IHC;
Serva, Heidelberg, 0,2% Triton X 100; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen,
lösen unter Rühren bei 5°C) bestimmt. Sie betrug für die Anti-CRH-Ak zur Färbung der
Gewebeschnitte und für die Anti-α-Aktin-Ak 1:100, für Anti-vWF-Ak und Anti-CD68-Ak
1:25 und für 5B5 1:200. Für den Einsatz von 3-2B12 bei den Myometriumbiopsien ließ
sich keine Verdünnung ermitteln, die reproduzierbar gute Ergebnisse geliefert hätte; in
den überwiegenden Fällen wurde dieser Klon in einer Verdünnung von 1:100 benutzt.
Zum Vergleich wurde er bei paraffinfixierten Hautschnitten im Rahmen einer
Verdünnungsreihe (1:25, 1:50, 1:100, 1:200 und 1:400) verwendet. Die RC-4B/C1-
Zellen wurden mit dem Anti-CRH-R1/R2unspez. in einer Verdünnung von 1:75, mit dem
Anti-R1spez. in einer Verdünnung von 1:100 und mit dem Anti-R2spez. in einer
Verdünnung von 1:100 untersucht.
Als zusätzliche Überprüfung der Zellen auf Eignung als CRH-Bioassay untersuchte
Herr Dr. Feuerhake in der Abteilung Neuropathologie der Universitätsklinik Freiburg
freundlicherweise die Zellen auf die Expression von ACTH-Rezeptoren. Er führte mit
einem spezifischen Antikörper gegen den ACTH-Rezeptor (DAKO Diagnostika) eine
Verdünnungsreihe (1:50, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000) durch. Als Positivkontrolle
diente eine menschliche Hypophyse, die mit Anti-ACTH-Ak in einer Verdünnung von
1:50 angefärbt wurde.
2.3.8.3 Der immunologische Färbevorgang
Den ersten Schritt der eigentlichen Färbeprozedur bildete die Inaktivierung von
endogen vorhandenen Peroxidasen durch die 10-minütige Zugabe von Wasserstoff-
peroxid (H2O2) 3% in 1x PBS für die IHC. Dieser Arbeitsschritt, sowie alle weiteren, bei
denen die Gewebeschnitte mit Reagenzien überschichtet wurden, erfolgte durch
Material und Methoden 59
Inkubation bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer auf einem taumelnden
Schüttler (Reax 3; Heidolph, Schwabach). Als nächstes wurde bei den Gewebe-
schnitten eine hitzeinduzierte Antigen-Demaskierung durch Aufkochen im Dampfkoch-
topf für 5 Minuten durchgeführt. Als Kochpuffer diente standardmäßig 10 mM
Zitratpuffer (0,1 M Zitronensäure, 0,1 M Natriumzitratlösung; Merck, Darmstadt). Zur
Optimierung der Färbungs-Ergebnisse wurde vergleichend für die α-Aktin- und CD68-
Färbungen Tris/EDTA-Puffer für die IHC (pH 9,0; 10 mM Tris, 1 mM EDTA) und für die
vWF- und Fibroblasten-Färbungen DakoCytomation Target Retrieval Solution
eingesetzt (S1700, pH 6,1; DAKO Diagnostika). Bei den Zellen wurden die Epitope
durch 15-minütige Andauung mit Pronase 0,1% (Linaris, Wertheim-Bettingen)
demaskiert. Nach Waschen im Glastrog für 2-mal je 5 Minuten in 1x PBS für die IHC
wurden unspezifische Bindungsstellen innerhalb von 30 Minuten mit 10%igem Hasen-
(CRH-Rezeptoren; Alexis, Grünberg) bzw. Pferdeserum (alle übrigen o.g. Antigene;
Serva, Heidelberg) in PBS abgesättigt. Anschließend wurde das jeweilige Serum durch
Abklopfen der Objektträger auf einem Zellstofftuch entfernt, die Schnitte wurden
jedoch nicht gewaschen.
Die Inkubation mit dem spezifischen Primärantikörper erfolgte für mindestens 2
Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C. Anschließend wurde eine 30-
60-minütige Inkubation mit einem polyklonalen, biotinylierten, 1:200 mit PBT
verdünnten Anti-Ziegen-Antikörper vom Hasen (CRH-Rezeptoren) bzw. Anti-Maus-
Antikörper vom Pferd (alle anderen o.g. Antigene) durchgeführt. Beide Zweitantikörper
stammten aus dem Vectastain Elite ABC Kit (Goat bzw. Mouse IgG; Vector
Laboratories, Burlingame, CA, USA).
Nach Waschen für 2x je 5 Minuten in 1x PBS für die IHC folgte eine Über-
schichtung der Präparate für 30 Minuten mit einem Streptavidin-Peroxidase-Komplex
(ABC-Komplex aus dem Vectastain Elite ABC Kit, 1% Lösung A, 1% Lösung B, in 1x
PBS für die IHC mindestens 30 Minuten vor Gebrauch angesetzt) mit anschließendem
erneuten 10-minütigen Waschgang. Im Vergleich zu peroxidasegekoppelten Zweit-
antikörpern als Amplifikatoren zeichnet sich der Gebrauch des ABC-Komplexes als
Detektionssystem dadurch aus, dass das Signal verstärkt, die Farbreaktion intensiver
und somit der Test empfindlicher wird.
Als Peroxidase-Substrat zum Sichtbarmachen des gebundenen Antikörpers
wurden bei einem Teil der Proben 3,3’-Diaminobenzidin-Tabletten-Sets (Fast-DAB;
Material und Methoden 60
Sigma-Aldrich Chemie GmbH) nach Angabe des Herstellers in ddH2O gelöst
(Endkonzentration: 0,7 mg/ml DAB, 1,6 mg/ml Harnstoff-Hydrogenperoxid, 0,6 M Tris)
und je 100 µl hinzugegeben, bis eine makroskopisch sichtbare bräunliche Färbung der
Schnitte erfolgt war. Diese Farbreaktion dauerte bei Raumtemperatur 5-7 Minuten,
wurde durch Spülen (5 Minuten) mit ddH2O beendet, und die Schnitte wurden für 10
Minuten in ddH2O gestellt. Vergleichsweise wurde bei einem anderen Teil der Proben
als Peroxidase-Substrat flüssiges Romulin AEC (Biocarta, Hamburg) verwendet, was
eine rötliche Färbung der Schnitte zur Folge hatte. Obwohl Romulin AEC laut
Herstellerangaben das weniger sensitive Chromogen ist, bietet es gegenüber DAB,
welches karzinogene Eigenschaften hat, den Vorteil der geringeren Toxizität.
Die Gegenfärbung der Zellkerne wurde über 30 Sekunden mit 1%iger, filtrierter
„Mayers Hämalaunlösung für die Mikroskopie“ (Merck, Darmstadt) durchgeführt.
Anschließend wurden die Präparate für mindestens 5 Minuten unter fließendem
Leitungswasser abgespült. Zur Dehydrierung der gefärbten Schnitte wurden die
Objektträger nach einer aufsteigenden Alkoholreihe (je 2 Minuten in Ethanol 70%,
80%, 96% und 100%) in Xylol überführt und anschließend nach Zugabe einiger
Tropfen Entellan (Merck) mit Deckgläsern abgedeckt und über Nacht zum Trocknen im
Abzug stehen gelassen. Positive Färbungen stellten sich bei Verwendung von DAB
intensiv braun, bei Romulin AEC orange-rot dar, während die Zellkerne durch das
Hämalaun blau-violett angefärbt wurden.
Als Negativkontrollen dienten Proben, die ohne Primärantikörper inkubiert,
ansonsten aber identisch behandelt wurden. Somit konnten unspezifische Bindungen
des Sekundärantikörpers identifiziert werden. Ferner wurden Placentaproben mit dem
Antikörper gegen α-Aktin inkubiert, um anhand eines Gewebetyps, der bekannter-
maßen keine glatten Muskelzellen aufweist, zu überprüfen, ob der Antikörper wirklich
eine hohe Spezifität für Leiomyocyten aufweist. Die Beurteilung der gefärbten Schnitte
wurde unter einem Lichtmikroskop (Carl Zeiss, Jena) vorgenommen.
Ergebnisse 61
3 Ergebnisse
3.1 Prostaglandinsekretion im Myometrium
3.1.1 Prostacyclin
3.1.1.1 Basale Zeitkinetik
Da Prostacyclin aufgrund seiner schnellen Metabolisierung unter Labor-
bedingungen schlecht zu untersuchen ist, wurde stattdessen die Sekretion seines
stabilen Metaboliten 6-keto-PGF1α gemessen. Die basale Sekretion im Myometrium
wurde im zeitlichen Verlauf der Gewebekultur beobachtet, um Bezugsdaten für einen
Vergleich mit der Sekretion nach Zugabe potentiell stimulierender Substanzen (CRH,
Urocortin, IL-1β) zu erheben (n=5).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Vor 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 20h 22h 24h
Inkubationszeit
Ko
nz./
FG
(p
g/m
g)
M99
Abb. 7: Zeitlicher Verlauf der basalen 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium. „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebe-proben (in pg/mg). „Vor“ steht für die Vorinkubationsphase in der Kurzzeit-Gewebekultur, die der Hauptinkubation vorgeschaltet war.
Trotz großer Schwankungen der Einzelwerte innerhalb der Triplikatmessungen
ergab sich ein grundsätzlich ähnlicher Zeitverlauf, der in Abb. 7 exemplarisch
dargestellt ist: Nach einem leichten Anstieg der Messwerte zwischen der Entnahme
des Kulturüberstandes während der Vorinkubation und zum Startpunkt der
Ergebnisse 62
eigentlichen Inkubation bei 0 Stunden fielen sie bis zur Entnahme bei 1 Stunde stark
ab, um dann bis zum Maximalwert bei 7 Stunden stetig anzusteigen. Gegen Ende der
Kultur (20-24 Stunden) pendelten sie sich ca. auf 4-Stunden-Niveau ein.
3.1.1.2 Vergleich verschiedener Kulturmedien
Zur Optimierung der Kulturbedingungen der Kurzzeit-Gewebekultur wurde ein
Versuchsaufbau konzipiert, in dem manche Myometriumproben (n=3) parallel in IMDM
und HBSS kultiviert wurden. Anschließend wurde anhand der Messung der 6-keto-
PGF1α-Sekretion die Reaktion des Gewebes auf die verschiedenen Nährmedien
verglichen.
Es stellte sich heraus, dass die Messwerte für die Konzentration bezogen auf das
Feuchtgewicht (in pg/mg) bei der Verwendung von IMDM in allen Fällen höher lagen
als bei HBSS. Während der Unterschied überwiegend nicht sehr ausgeprägt war,
fanden sich bei einer Probe für IMDM mehr als doppelt so hohe Werte wie für HBSS.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
M088 M089 M090
Gewebe-Nr.
Ko
nz./
FG
[p
g/m
g] IMDM
HBSS
Abb. 8: Vergleich von IMDM und HBSS als Nährmedium für die Myometriumbiopsien in der Kurzzeit-Gewebekultur anhand der 6-keto-PGF1α-Sekretion. „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebeproben.
Bei allen Proben wichen die Werte innerhalb der Triplikatmessungen sehr stark
voneinander ab. Bei einem Vergleich dieser Schwankungsfaktoren zeigte sich, dass
sie bei HBSS (ca. Faktor 6) überwiegend höher lagen als bei IMDM (Faktor 1,5-2,2);
dieser Effekt ist in Tab. 8 dargestellt.
Ergebnisse 63
Tab. 8: Schwankungsfaktoren zwischen jeweils dem kleinsten und dem größten Einzelmesswert innerhalb einer Triplikatmessung. „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Myometriumproben. Die Proben sind gekennzeichnet durch einen Buchstaben für die Gewebeart (hier „M“ für Myometrium) in Verbindung mit einer Zahl, die einer bestimmten Patientin zugeordnet ist.
Kulturmedium M88
Konz./FG [pg/mg]
Max. Faktor
M89 Konz./FG [pg/mg]
Max. Faktor
M90 Konz./FG [pg/mg]
Max. Faktor
2583 1109 914
9527 1605 1024
IMDM
21498
8,3
2399
2,2
1350
1,5
Mittelwert 11203 1704 1096
Standardabweichung 9568 650 227
1431 913 246
5229 1058 738
HBSS
8219
5,7
1529
1,7
1474
6,0
Mittelwert 4960 1167 819
Standardabweichung 3402 323 618
3.1.1.3 Stimulation mit CRH, Urocortin und IL-1β
Zur Untersuchung etwaiger Stimulationseffekte auf die 6-keto-PGF1α-Sekretion
wurden Myometriumbiopsien mit CRH, Urocortin und IL-1β inkubiert.
Durch keine der zugegebenen potentiellen Stimulanzien konnte eine reproduzier-
bare Stimulation beobachtet werden. Dennoch war, bezogen auf die jeweiligen
Basalwerte, die Tendenz zu einer leichten Stimulation sowohl durch CRH als auch in
etwas schwächerer Form durch Urocortin und IL-1β zu verzeichnen.
Ergebnisse 64
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
M109 M110 M111 M112 M113
Proben-Nr.
Ko
nz./
FG
[p
g/m
g]
Basal(-)
CRH(-)
UCN(-)
IL-1ß(-)
Abb. 9: Basale und stimulierte 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium (109-113). „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebeproben.
3.1.1.4 Modifikation der Hauptinkubationsphase
Mit dem Ziel, starke inter- und intraindividuelle Schwankungen der 6-keto-PGF1α-
Konzentrationswerte durch unterschiedliche Korrelation der Werte zu kontrollieren,
wurde bei einem Teil der Versuche (n=8) die Hauptinkubationsphase in die Phasen A
und B unterteilt und wurden die Gewebeproben nach Ablauf der Phase A in neuem
Kulturmedium weiter inkubiert.
Ein Vergleich der basalen Konzentrationswerte bezogen auf das Feuchtgewicht
der Proben zum Zeitpunkt des Umsetzens und am Ende der Inkubation zeigte, dass
das Umsetzen der Proben zu einer deutlichen Konzentrationsabnahme geführt hatte.
Hingegen hatte bei den Proben, die nur einer Inkubationsphase ausgesetzt gewesen
waren, die Konzentration zugenommen. In Abb. 10 ist diese Beobachtung beispielhaft
dargestellt; hier stand einer Abnahme um 42% bei unterteilter Inkubationsphase eine
Zunahme um 28% bei nur einer Inkubationsphase gegenüber.
Das gleiche Ergebnis galt für die mit o.g. Substanzen potentiell stimulierten
Gewebeproben: Die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht war
nach Phase B durchweg niedriger als nach Phase A, d.h. es war keine Stimulation
erkennbar. Die Ausnahme von dieser Beobachtung bildeten die Proben einer einzigen
Ergebnisse 65
Patientin (M106), bei der sowohl die basalen als auch die stimulierten Messwerte nach
Phase B deutlich höher waren als nach Phase A (nicht gezeigt).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
M100-AB M100-C
Proben-Nr. und Inkubationsart
Ko
nz./
FG
(p
g/m
g)
7h
24h
Abb. 10: Einfluss der Inkubationsart in der Kurzzeit-Gewebekultur auf die 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium (M100). “AB“ bezeichnet eine zweigeteilte Inkubationsphase von 6-7h (A), nach denen die Gewebeproben in frisches Kulturmedium umgesetzt und für weitere 16-17h (B) inkubiert wurden. „C“ beschreibt eine einteilige Inkubationsphase von 22-24h. „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebeproben.
Des Weiteren fiel auf, dass trotz des Versuches einer Korrelation der Messwerte
von Phase B auf Phase A sehr große interindividuelle Schwankungen auftraten. Dabei
handelte es sich um voneinander abweichende 6-keto-PGF1α-Sekretionsmuster der
verschiedenen Patientinnen, die sich nicht nur in den Absolutwerten, sondern auch in
der prozentualen Konzentrationsänderung (33-79%) darstellten. Das gleiche Problem
zeigte sich beim Versuch einer Normalisierung der Konzentrationswerte nach Phase A
auf die Werte vom Ausgangspunkt der Kultur bei 0 Stunden. Die prozentuale Zu- bzw.
Abnahme der Konzentration dieser beiden Korrelationsversuche (B bezogen auf A und
A bezogen auf 0 Stunden) sind in Tab. 9 zusammengetragen.
Erschwerend kamen große intraindividuelle Abweichungen hinzu; auch hier unter-
lagen sowohl die absoluten Einzelwerte als auch die mit den Einzelwerten berechnete
prozentuale Konzentrationszu- bzw. -abnahme sehr großen Schwankungen (z.B. 19-
57% bei M99).
Ergebnisse 66
Tab. 9: Prozentuale Veränderungen der 6-keto-PGF1α-Konzentration im Verlauf der Kurzzeit-Myometriumkultur. Die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Myometriumbiopsien (Konz./FG in pg/ml) wurde dreimal gemessen: das erste Mal zu Beginn der Inkubationszeit (0h), das zweite Mal am Ende der ersten Hauptinkubationsphase (A), das dritte Mal am Ende der zweiten Hauptinkubations-phase (B), die mit dem Ende der Gewebekultur zusammenfiel. Bei „A bezogen auf 0h“ wurde die prozentuale Konzentrationszu- bzw. -abnahme berechnet, die zwischen dem Messzeitpunkt bei 0h und dem Ende von Phase A stattgefunden hatte. Nach gleichem Schema erfolgte die Berechnung der Konzentrationsänderung bei „B bezogen auf A“. „MW“ steht für den arithmetischen Mittelwert der ebenfalls dargestellten Einzelwerte. Grüne Pfeile nach oben zeigen eine Zunahme-, rote Pfeile nach unten eine Abnahmetendenz der 6-keto-PGF1α-Konzentration an.
Proben-Nr. Stimulanz 0h [Konz./FG] A [Konz./FG] B [Konz./FG] A bezogen auf 0h B bezogen auf A
M99 - 882 1015 690 15% � -32% �
- 927 778 1084 -16% � 39% �
- 619 908 900 47% � -1% �
- 797 2528 1734 217% � -31% �
MW - 806 1307 1102 62% � -16% �
M100 - 1683 902 -46% �
- 1655 1641 -1% �
- 946 719 -24% �
MW - 1428 1087 -24% �
M102 - 26632 43144 62% �
- 26632 18866 -29% �
- 26632 6035 -77% �
MW - 26632 22682 -15% �
M105 - 1453 1731 799 19% � -54% �
- 1336 1234 244 -8% � -80% �
- 732 1515 521 107% � -66% �
MW - 1174 1493 521 27% � -65% �
CRH 1402 447 -68% �
CRH 1589 699 -56% �
CRH 1498 755 -50% �
MW-CRH 1496 634 -58% �
IL-1ß 1766 1222 -31% �
IL-1ß 833 532 -36% �
IL-1ß 2036 1362 -33% �
MW-IL-1ß 1545 1039 -33% �
UCN 1131 1077 -5% �
UCN 877 717 -18% �
UCN 1243 222 -82% �
MW-UCN 1084 672 -38% �
M106 - 393 181 303 -54% � 67% �
- 543 376 396 -31% � 5% �
- 796 283 464 -64% � 64% �
MW - 577 280 388 -52% � 38% �
CRH 277 576 108% �
CRH 274 283 3% �
Ergebnisse 67
Proben-Nr. Stimulanz 0h [Konz./FG] A [Konz./FG] B [Konz./FG] A bezogen auf 0h B bezogen auf A
CRH 433 654 51% �
MW-CRH 328 504 54% �
IL-1ß 86 3953 4497% �
IL-1ß 855 7146 736% �
IL-1ß 173 314 82% �
MW-IL-1ß 371 3804 925% �
M107 - 1379 5774 1567 319% � -73% �
CRH 1095 1456 782 33% � -46% �
UCN 1331 1041 486 -22% � -53% �
IL-1ß 1877 1622 1053 -14% � -35% �
3.1.2 PGE2
Zur Beurteilung der PGE2-Sekretion im Myometrium wurde ihr zeitlicher Verlauf im
Rahmen der Gewebekultur beobachtet (n=4). Dabei wurde die Sekretion nach Zugabe
potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β) mit der basalen Sekretion verglichen.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Vor 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 22h
Inkubationszeit
Ko
nz./
FG
(p
g/m
g)
basal
CRH
UCN
IL-1ß
Abb. 11: Zeitlicher Verlauf der basalen PGE2-Sekretion im Myometrium (M107). „Konz./FG“ beschreibt die PGE2-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebeproben (in pg/mg). „Vor“ steht für die Vorinkubationsphase in der Kurzzeit-Gewebekultur, die der Hauptinkubation vorgeschaltet war. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Triplikatmessungen.
Für letztere ergab sich eine weitgehend analoge Zeitkinetik zu den Beobachtungen
der basalen 6-keto-PGF1α-Sekretion: Zwischen der Entnahme während der Vorinku-
bation und der Entnahme bei 0 Stunden blieben die Messwerte auf dem gleichen
Ergebnisse 68
Niveau oder stiegen leicht an, fielen bis zu 1 Stunde stark ab und stiegen dann wieder
deutlich an, um zwischen 4 und 6 Stunden ein Maximum zu erreichen. Einzig der 22-
Stunden-Messwert bei Beendigung der Kultur wich deutlich vom Verlaufsmuster bei
der 6-keto-PGF1α-Sekretion ab, indem ein starker Abfall zu beobachten war. Eine
Stimulation durch die zugegebenen Substanzen war nicht zu erkennen; die Messwerte
lagen sogar meistens noch unter den unstimulierten. In Abb. 11 ist der zeitliche Verlauf
der PGE2-Sekretion am Beispiel der Myometriumbiopsie M107 dargestellt.
3.2 IHC und ICC
3.2.1 Histologische Charakterisierung von Myometriumbiopsien
Zum besseren Verständnis der z.T. uneinheitlichen und schwer reproduzierbaren
Ergebnisse der Untersuchungen zur Prostaglandin-Sekretion (s. 3.1) wurden die
Myometriumbiopsien histologisch charakterisiert. Dafür wurden zum einen verschie-
dene im Myometrium vorkommende Zelltypen nachgewiesen und ihr ungefährer
mengenmäßiger Anteil abgeschätzt, zum anderen die Verteilung der CRH-Rezeptoren
innerhalb der Gewebeproben beurteilt. Als Negativkontrollen wurden bei den
Färbungen jeweils Proben mitgeführt, die ohne den Primärantikörper inkubiert wurden;
bei keiner dieser Kontrollen zeigte sich eine Braunfärbung (nicht gezeigt).
Aufgrund der geringeren Toxizität wurde in der überwiegenden Anzahl der
Färbungen Romulin AEC als Peroxidase-Substrat verwendet, obwohl sich heraus-
stellte, dass sich hierbei das spezifische Färbungen kennzeichnende Orange-Rot z.T.
deutlich schlechter von dem durch Hämalaun blau-violett gefärbten Hintergrund abhob
als das durch DAB hervorgerufene intensive Braun. Außerdem kam es bei der
Verwendung von Romulin AEC häufiger vor, dass abgesehen von der spezifischen
Rotfärbung ein unspezifischer rosaroter Schleier über einem Großteil des Gewebe-
schnittes zu beobachten war.
Ergebnisse 69
Abb. 12: Qualitätsvergleich der Chromogene Romulin (A, C) und DAB (B, D) in immunhisto-chemischen Färbungen. Dargestellt sind repräsentative Myometriumschnitte (M57, M59), in denen CRH-R1 (A, B) und vWF (C, D) lokalisiert wurden. Durch Romulin (A, C) werden die spezifischen Zielstrukturen rot, durch DAB (B, D) braun gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Auffällig ist, dass sich die mit DAB angefärbten Strukturen kontrastreicher von den Zellstrukturen im Hintergrund hervorheben. Bei der Verwendung von Romulin war ein Rosaschleier zu beobachten, der sich über den ganzen Gewebeschnitt zog (C). Fotografiert wurde bei 400- (A, B) bzw. 100facher (C, D) Vergrößerung.
3.2.1.1 Endothel
Zum Nachweis von Gefäßendothel wurde ein Antikörper gegen vWF verwendet,
der von den Endothelzellen als Trägerprotein des Hämostasefaktors VIII gebildet wird.
Bei einer sehr guten bis hervorragenden Färbeintensität konnten die Blutgefäße
eindeutig identifiziert werden. Sie zogen sich in allen Größenordnungen durch die
gesamte untersuchte Gewebeprobe. Dabei gab es bei der repräsentativ dargestellten
Probe (M59) geringe Unterschiede im subjektiv geschätzten Anteil, den die Gefäße
jeweils bezogen auf den ganzen Gewebeschnitt ausmachten: Die meisten Gefäße (ca.
10%) fanden sich am Anfang, die wenigsten (ca. 5%) am Ende der Probe, wobei diese
Einteilung willkürlich beim Schneidevorgang der Paraffinblöcke erfolgt war und in
keinem Zusammenhang mit tatsächlichen anatomischen Gegebenheiten stand.
Interessant war ferner, anhand der Färbung festzustellen, dass nicht jeder Spalt im
Gewebe, der der Form nach für ein Gefäß hätte gehalten werden können, sich auch
tatsächlich als ein solches erwies.
Ergebnisse 70
Abb. 13: Immunhistochemischer Nachweis von Gefäßendothel in Myometrium mittels eines Antikörpers gegen vWF. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (A), von der Mitte (B) und vom Ende (C) einer Myometriumprobe (M59). VWF-positive Zellen sind braun gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Die Pfeile weisen auf Gewebeauflockerungen und Spalten (Sp) hin, die der Form nach mit Blutgefäßen zu verwechseln wären. Fotografiert wurde bei 400facher Vergrößerung.
3.2.1.2 Makrophagen
Makrophagen wurden identifiziert durch einen Antikörper gegen CD68, ein Glyko-
protein, das zellspezifisch nur von Makrophagen als Oberflächenantigen exprimiert
wird.
Bei einer guten Färbeintensität konnten Makrophagen in der gesamten repräsenta-
tiven Gewebeprobe (M59) sowohl gewebeständig als auch gefäßnah nachgewiesen
werden. Ihr Anteil bezogen auf den ganzen Schnitt betrug maximal ca. 5%, wobei er in
dem als „Ende“ bezeichneten Teil der Biopsie kleiner ausfiel als am Anfang und in der
Mitte. In allen drei repräsentativen Schnitten fanden sich klar abgrenzbare
Einzelzellen, aber auch zu Reihen oder kleinen Nestern gruppierte Makrophagen.
Als Positivkontrolle für den verwendeten Antikörper wurde parallel eine Decidua-
Probe mit angefärbt. Dieses Gewebe hatte sich in der Vergangenheit durch einen
vergleichsweise hohen Makrophagen-Anteil ausgezeichnet, was hier bestätigt werden
konnte; er lag bei ca. 10%. Bei einer hervorragenden Färbeintensität waren die Zellen
sehr deutlich erkennbar. Wie im Myometrium waren sie sowohl einzeln als auch zu
Nestern angeordnet zu finden (s. Abb. 22).
Ergebnisse 71
Abb. 14: Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen im Myometrium mittels eines Antikörpers gegen CD68. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (A), von der Mitte (B) und vom Ende (C) einer Myometriumprobe (M59). CD68-positive Zellen sind rot gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Die Pfeile markieren gewebsständige (gs) oder gefäß-nahe (gn) Makrophagen, die als Einzelzellen oder gruppiert in Reihen oder kleinen Nestern vorkamen. Fotografiert wurde bei 400facher Vergrößerung.
3.2.1.3 Myocyten
Leiomyocyten wurden durch einen Antikörper gegen α-Aktin kenntlich gemacht,
ein Strukturprotein des Cytoskeletts, das einen zentralen Bestandteil des Kontraktions-
apparats von Muskelzellen bildet.
Beide verwendeten Chromogene führten zu einer hervorragenden Färbeintensität,
wobei DAB eine relativ homogene Verteilung der Braunfärbung innerhalb der
einzelnen Zellen bewirkte, während es bei Romulin AEC zu einer intensiveren
Rotfärbung in den Randbereichen der Zellen mit zentralen Aufhellungen kam. Dadurch
ließen sich die einzelnen Myocyten besser voneinander abgrenzen, so dass sich ein
insgesamt klareres Bild von der Gewebestruktur ergab. Trotz des besseren
Farbkontrastes bei der Verwendung von DAB lieferte Romulin AEC hier also das
bessere Gesamtergebnis. Die Myocyten waren in der gesamten Gewebeprobe gegen-
über anderen Zellarten mit einem Anteil von ca. 55-65% am häufigsten vertreten. Der
Bindegewebsanteil lag jedoch z.T. nur knapp unter dem der Myocyten; bei einer
repräsentativen Probe schwankte er zwischen 30% (Anfang) und 40% (Ende).
Als zusätzliche Negativkontrolle für den eingesetzten Antikörper wurde eine
Placenta-Probe mit angefärbt, da in diesem Gewebe keine Leiomyocyten zu erwarten
sind. Bei keinem der drei Schnitte fand sich eine Braunfärbung.
Ergebnisse 72
Abb. 15: Immunhistochemischer Nachweis von Leiomyocyten im Myometrium mittels eines Antikörpers gegen α-Aktin. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (D), von der Mitte (A, B, E) und vom Ende (F) einer Myometriumprobe (M59). α-Aktin-positive Zellen sind rot (A, D, E, F) bzw. braun (B) gefärbt. Bei A und B wurde die Chromogene Romulin (A) und DAB (B) verglichen: Während DAB eine homogene Braunfärbung der Myocyten bewirkt hat, finden sich bei Romulin zentrale Aufhellungen (Pfeile, zA) in den Zellen. Die Beschriftung „BG“ an den Markierungspfeilen weist auf bindegewebige Strukturen hin. Bei C ist ein Placentaschnitt gezeigt, der als Negativkontrolle für die α-Aktin-Färbung diente. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Fotografiert wurde in 100- (A-C) bzw. 400facher Vergrößerung (D-F).
3.2.1.4 Fibroblasten
Der Nachweis von Fibroblasten als repräsentative Bindegewebszellen gestaltete
sich als äußerst diffizil. Laborintern etabliert war ursprünglich der Antikörper-Klon 5B5
gegen Prolyl-4-Hydroxylase, das Schrittmacher-Enzym der Kollagensynthese.
Dieser Antikörper hatte gute, reproduzierbare Ergebnisse geliefert, die jedoch zu
einem späteren Zeitpunkt nicht mehr bestätigt werden konnten: Bei einer guten
Färbeintensität wurden in der untersuchten paraffinfixierten Myometriumprobe nur
randständige Fibroblasten angefärbt; der Antikörper konnte nicht in den Gewebeschnitt
eindringen (s. Abb. 16).
Zur Überprüfung, ob dies in der Fixierungsmethode begründet war, wurde eine
Myometriumbiopsie als Gefrierschnitt aufbereitet und dann mit dem Klon 5B5
behandelt. Das Ergebnis war ein hoher Anteil (ca. 40%) intensiv braun gefärbter
Zellen, die sich durch die gesamte Probe zogen. Anteil und Verteilung ließen darauf
schließen, dass es sich tatsächlich um Fibroblasten handelte. Allerdings hatte das
Ergebnisse 73
Gewebe unter der Kryofixation deutlich mehr gelitten als vergleichbare paraffinfixierte
Proben; die Gewebestrukturen erschienen verwaschen und waren weniger deutlich
identifizierbar.
Abb. 16: Immunhistochemischer Nachweis von Fibroblasten im Myometrium mittels Antikörper-Klon 5B5. Dargestellt sind repräsentative Myometriumschnitte (M56-57), die paraffin- (A) oder kryofixiert (B-C) worden waren. 5B5-positive Zellen sind rot (A) bzw. braun (B-C) gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Auffällig ist, dass in A nur Fibroblasten am Rande des Gewebeschnitts angefärbt wurden. Bei den Gefrierschnitten B-C wirken die Gewebestrukturen verwaschen und sind nicht eindeutig erkennbar. Fotografiert wurde in 100- (B) bzw. 400facher (A, C) Vergrößerung.
Um auch bei paraffinfixierten Gewebeproben einen zuverlässigen Fibroblasten-
nachweis zu erreichen, wurde daher im Folgenden der Klon 3-2B12 eingesetzt, der
ebenfalls gegen die Prolyl-4-Hydroxylase gerichtet ist.
In mehreren Versuchen unter Verwendung unterschiedlicher Verdünnungen wurde
deutlich, dass dieser Klon insofern nicht erwartungsgemäß funktioniert hatte, als dass
er statt Fibroblasten Leiomyocyten angefärbt hatte. Zu diesen hatte er eine sehr hohe
Affinität, wie an der hohen Färbeintensität noch bei einer Verdünnung von 1:200
anstelle der vom Hersteller empfohlenen 1:50 abzulesen war. Dass es sich um
Myocyten handelte, war an ihrer Form und Verteilung in der Gewebeprobe erkennbar
(s. 3.2.1.3). Die Strukturen, die ihrer Form nach dem Bindegewebe zugeordnet werden
mussten, wiesen keinerlei spezifische Rotfärbung, sondern nur die blau-violette
Hintergrundfärbung durch Hämalaun auf.
Ergebnisse 74
Abb. 17: Misslungener Versuch eines immunhistochemischen Nachweises von Fibroblasten im Myometrium mittels eines Antikörper-Klon 3-2/B12. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Dargestellt ist ein repräsentativer Myometriumschnitt (M6) in 100facher (A) und 400facher (B) Vergrößerung. Das Farbschema ist irreführend: Während die Myocyten (My), die eigentlich durch die Hintergrundfärbung mit Hämalaun blau sein müssten, intensiv rot gefärbt sind, weisen die Strukturen, die der Form nach dem Bindegewebe (BG) zugeordnet werden müssen, eine Blaufärbung auf.
Zur Kontrolle, ob der Klon 3-2B12 grundsätzlich funktionierte, wurde er im Rahmen
einer Versuchsreihe mit verschiedenen Verdünnungen bei einer Hautprobe eingesetzt.
Es fanden sich zahlreiche intensiv rot gefärbte Zellen im Corium, aber auch in der
Epidermis, wobei die beste Färbeintensität bei einer Verdünnung von 1:100 erzielt
wurde. Die Negativkontrolle wies keine Rotfärbung auf. Allerdings ließ die Tatsache,
dass so viele Zellen in der Epidermis angefärbt wurden, Zweifel aufkommen, ob es
sich dabei tatsächlich um Fibroblasten handelte.
Abb. 18: Immunhistochemischer Nachweis von Fibroblasten in der Haut mittels Klon 3-2/B12. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Dargestellt ist ein repräsentativer Hautschnitt in 400facher Vergrößerung (A) und als Negativkontrolle ein Schnitt, der ohne Primär-antikörper inkubiert wurde (B). 3-2/B12-positive Zellen sind rot gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun.
3.2.1.5 Nachweis von CRH-R1
Die gesamte repräsentativ dargestellte Myometriumprobe zeigte eine sehr starke
Expression von CRH-R1. Die Rotfärbung, die diesen Rezeptor kenntlich machte, war
bei einer mittelgradigen Färbeintensität so ausgeprägt, dass die Schnitte bei einer
kleinen mikroskopischen Vergrößerung den Haupteindruck „rot“ vermittelten. Dabei
Ergebnisse 75
war weder die Anfärbung der einzelnen Zellen noch ihre Verteilung im Gewebeschnitt
homogen. Mit Ausnahme des Gefäßendothels, in dem der CRH-R1 gelegentlich
deutlich exprimiert wurde, war eine sichere Zuordnung zu den einzelnen im
myometrialen Gewebeverband vorhandenen Zellen nur teilweise möglich, da sich die
Zellgrenzen verschwommen bis gar nicht darstellten. Dennoch war es aufgrund des
mengenmäßigen Anteils der Leiomyocyten nahe liegend, dass CRH-R1 vornehmlich
diesem Zelltyp zugeordnet werden konnte, wobei auch eine Assoziation mit
Makrophagen nicht auszuschließen war. Beim Vergleich der Gewebeschnitte vom
Anfang, von der Mitte und vom Ende der beispielhalften Probe (M59) fielen zunächst
hinsichtlich der Anteile der unterschiedlichen Zellarten zueinander keine größeren
Unterschiede auf. Die Betrachtung in der Übersichtsvergrößerung verdeutlichte
jedoch, dass der Schnitt vom Ende der Biopsie in dem insgesamt recht kompakten
Muskelgewebe wesentlich mehr große Gefäße aufwies. Diese Beobachtung konnte
bei anderen Myometriumproben bestätigt werden.
Als Positivkontrolle für den Antikörper gegen CRH-R1 wurde eine Deciduaprobe
mit angefärbt. Bei einer mittelgradigen Färbeintensität fand sich der Rezeptor auch in
diesem Gewebe sehr ausgeprägt in decidualen Stromazellen, verteilt über die
gesamte Probe, sowie in Gefäßendothelzellen.
Ergebnisse 76
Abb. 19: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R1 in Myometrium und Decidua. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (A-B) und vom Ende (C-D) einer Myometrium- (M59) und einer Deciduaprobe (Dc57, E). CRH-R1-positive Zellen sind rot gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. In der Übersichtsvergrößerung (100fach) entsteht aufgrund der hohen Rezeptordichte für die Gewebeschnitte A und C der Gesamteindruck „rot“. In der 400fachen (B, D-E) Vergrößerung zeigen sich CRH-R1-positive Gefäßendothelzellen (Pfeile, GF).
Dass immunhistochemische Färbungen mit kritischem Blick beurteilt werden
sollten und nicht jede intensive Rotfärbung zwangsläufig für Spezifität spricht, ergab
sich aus einigen beispielhaften Färbungen, in denen Artefakte das Bild verfälschten:
Immer wieder waren Effekte zu beobachten, bei denen die Probenränder besonders
intensiv rot gefärbt waren. Ferner kam es vor, dass die Rotfärbung körnig wirkte und
sich z.T. an den Zellgrenzen abgelagert hatte.
Ergebnisse 77
Abb. 20: Artefakte bei immunhistochemischen Färbungen. Dargestellt sind exemplarische Myometriumschnitte (M19, M57), bei denen während des Färbevorgangs Artefakte entstanden. Neben der spezifischen Rotfärbung von CRH-R1 sind in A starke Randeffekte (RE) zu erkennen. In B zeigen sich körnige Ablagerungen (kA) des roten Farbstoffs an den Zellrändern. Fotografiert wurde in 100- (A) bzw. 400facher (B) Vergrößerung.
3.2.1.6 Nachweis von CRH-R2
Auch CRH-R2 war in der gesamten als repräsentativ ausgewählten Gewebeprobe
stark exprimiert, wenn auch nach subjektiver Einschätzung etwas weniger als CRH-
R1. Bei einer guten Färbeintensität war die spezifische Rotfärbung besser abgrenzbar
vom Hintergrund, was bei einer geringen mikroskopischen Vergrößerung zu einem
eher fleckig-roten Gesamteindruck führte. Eine definitive Zuordnung zu bestimmten
Zelltypen blieb schwierig, doch lag auch hier die Vermutung nahe, dass CRH-R2 v.a.
in Leiomyocyten zu finden war, wobei Makrophagen ebenfalls in Frage kamen. Im
Gegensatz zu CRH-R1 war keine Affinität zu Gefäßendothelzellen festzustellen. Im
Schnitt des willkürlich bestimmten Endes der repräsentativen Gewebeprobe (M19) war
der Bindegewebsanteil in dem insgesamt kompakten, aber von vielen kleinen Gefäßen
durchsetzten Muskelgewebe etwas höher als am Anfang und in der Mitte (nicht
gezeigt).
Ergebnisse 78
Abb. 21: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R2 im Myometrium. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte von der Mitte einer Myometriumprobe (M19). CRH-R2-positive Zellen sind rot gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Fotografiert wurde in 100- (A) bzw. 400facher (B) Vergrößerung.
Eine mit dem Antikörper gegen CRH-R2 parallel angefärbte Decidua-Probe zeigte
bei mittelgradiger bis guter Färbeintensität eine starke Expression des Rezeptors in
decidualen Stromazellen, jedoch nicht in den Gefäßwänden. Ferner legte der
Vergleich eines Schnittes mit der o.g. CD68-Färbung die Vermutung nahe, dass CRH-
R2 makrophagenassoziiert vorkommt.
Abb. 22: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R2 und Makrophagen in Decidua. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (A, C) und von der Mitte (B) einer Deciduaprobe (Dc57). CRH-R2-positive Zellen sind rot gefärbt (A-B). Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Ein Vergleich mit den in C dargestellten, braun gefärbten CD68-positiven Zellen, die einzeln (EZ) oder in gruppiert in Nestern (N) vorliegen, deutet auf eine CRH-R2-Expression nicht nur in decidualen Stromazellen, sondern auch in Makrophagen hin. Fotografiert wurde in 400facher Vergrößerung.
3.2.2 Immuncytochemische Untersuchung von RC-4B/C1-Zellen
Im Rahmen der Suche nach einer für einen validen CRH-Bioassay tauglichen
Zelllinie wurden die Rattenhypophysen-Zellen RC-4B/C1 auf ihre Expression von
CRH-Rezeptoren und ACTH immuncytochemisch untersucht. Als Negativkontrollen
wurden Proben verwendet, die ohne Primärantikörper inkubiert wurden.
Sowohl ein unspezifischer Antikörper, der nicht zwischen den Rezeptortypen
differenzierte, als auch die Antikörper gegen CRH-R1 und CRH-R2 detektierten CRH-
Ergebnisse 79
Rezeptoren bei einer guten Färbeintensität nur auf wenigen Zellen. Bei der
Auswertung der CRH-R1- und CRH-R2-Färbungen zeigten sich auf dem Objektträger
gelblich-braune, die Zellen umgebende Ränder, die am ehesten auf Lagerungseffekte
zurückzuführen sind. Die als Positivkontrolle durchgeführte ACTH-Färbung ergab bei
einer sehr guten Färbeintensität einen deutlichen Nachweis von ACTH. Alle Negativ-
kontrollen wiesen keinerlei Braunfärbung auf.
Abb. 23: Immuncytochemische Lokalisation von CRH- und ACTH-Rezeptoren auf RC-4B/C1-Zellen. Rezeptor-positive Zellen sind braun gefärbt: CRHunspezifisch (A), CRH-R1 (B), CRH-R2 (D), ACTH, (E). Zusätzlich traten gelblich-braune Artefakte (Pfeile, LE) am Rande der Zellen auf. Die Negativkontrollen (C, F) wurden ohne Primärantikörper inkubiert. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Fotografiert wurde in 400facher Vergrößerung.
3.3 ACTH-EIA als CRH-Bioassay
Mit dem Ziel, einen validen Bioassay zu entwickeln, um die Aktivität des in
Gewebe- und Zellkultur eingesetzten synthetischen CRH zu überprüfen, wurden zwei
ACTH-sezernierende Hypophysen-Zelllinien kultiviert und ihre ACTH-Sekretion mittels
EIA quantifiziert. In Vorversuchen wurde die Ratten-Zelllinie RC-4B/C1 eingesetzt. Da
die Messwerte für ACTH bei Zugabe von CRH in verschiedenen Konzentrationen
(maximal 2,1 nM) unterhalb der Nachweisgrenze blieben (nicht gezeigt), wurden die
Hauptversuche mit schwimmenden, nicht-adhärenten AtT20-Mauszellen durchgeführt
(n=7).
Ergebnisse 80
Zur Kontrolle der Funktionsfähigkeit des EIAs diente die Messung des ACTH-
Gehaltes eines Placenta-Extraktes. Hier war die Konzentration so hoch, dass
sämtliche Werte oberhalb des Messbereichs lagen. Damit war erwiesen, dass der Test
grundsätzlich funktionierte.
3.3.1 Basale Zeitkinetik
Die Zeitkinetik der basalen ACTH-Sekretion in AtT20-Zellen wurde beobachtet
(n=7), um Basisdaten für einen Vergleich mit der Sekretion nach Zugabe von CRH zu
erhalten.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0h 2h 3h 4h 5h 6h 18h 24h 27h
Inkubationsdauer
Ko
nz.
(ng
/ml)
basal
Abb. 24: Zeitkinetik der basalen ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD der Konzentration (in ng/ml) aus Triplikatmessungen.
Obwohl es in den ersten Stunden nach der 6-stündigen Vorinkubationsphase noch
zu Schwankungen der Messwerte kam, war dennoch eine relativ stabile Zunahme der
ACTH-Konzentration, mit einem leichten Plateau zwischen 4-6 Stunden und 18-24
Stunden zu beobachten. Ab 27 Stunden wichen die Werte dann so sehr voneinander
ab, dass keine allgemeingültige Aussage zum Sekretionsverhalten mehr getroffen
werden konnte. In Abb. 24 ist daher ein typischer Kurvenverlauf bis zum Zeitpunkt von
27 Stunden beispielhaft dargestellt.
Ergebnisse 81
3.3.2 Vergleich verschiedener Kulturmedien
Um die Kulturbedingungen möglichst optimal zu gestalten, wurden die AtT20-
Zellen in zwei verschiedenen Nährmedien kultiviert und anschließend ihre ACTH-
Sekretion vergleichend gemessen (n=3).
Es stellte sich heraus, dass nach den ersten vier Stunden sämtliche ACTH-
Konzentrationswerte der in Ham’s F12 gewachsenen Zellen auf einem deutlich
niedrigeren Niveau lagen als die Werte der in DMEM kultivierten Zellen. Während
erstere sich v.a. im zweistelligen ng/ml-Bereich bewegten, waren die DMEM-Werte
eher im dreistelligen Bereich angesiedelt. Außerdem verlief die ACTH-Sekretion bei
den Zellen aus Ham’s F12 insgesamt langsamer, d.h. mit einer geringeren
Steigerungsrate. In Abb. 25 ist ein repräsentatives Beispiel graphisch dargestellt.
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
0 2 4 6 8 10 12
Inkubationsdauer (h)
Ko
nz.
(ng
/ml)
DMEM
Ham's F12
Abb. 25: ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen im zeitlichen Verlauf nach Kultivierung in verschiedenen Nährmedien (DMEM und Ham’s F12). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD der Konzentration (in ng/ml) aus Triplikatmessungen.
3.3.3 CRH als Stimulationsfaktor
Nachdem CRH als Stimulationsfaktor für die ACTH-Synthese bei allen Versuchen
mit den AtT20-Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen (0,1-10 nM) hinzugefügt
worden war, wurde der zeitliche Verlauf der ACTH-Konzentration dokumentiert.
Ergebnisse 82
Die beste Stimulation zeigte sich regelmäßig bei einer CRH-Konzentration von 10
nM, so dass diese Konzentration schließlich beibehalten wurde. Das Stimulations-
verhalten des niedriger konzentrierten CRH war insofern nicht eindeutig, als dass zwar
mit Ausnahme der ersten 3-4 Stunden immer eine deutliche Stimulation gegenüber
den Basalwerten, jedoch keine gleichbleibende Konzentrationsabhängigkeit erkennbar
war. Dies ist in Abb. 26 ersichtlich. Aus der Zeitkinetik der ACTH-Sekretion ließen sich
optimale Zeitpunkte bei 6 oder 18 Stunden zum Vergleich verschiedener Stimulations-
versuche feststellen. Zu diesen Zeitpunkten fand sich im Kurvenverlauf eine relativ
stabile Steigung der Konzentrationswerte. Allerdings fiel auch hier, wie bei den
Versuchen zur 6-keto-PGF1α-Sekretion, eine sehr große Streuung der Einzelwerte
innerhalb der gemessenen Triplikate auf.
0
10
20
30
40
50
60
70
0h 2h 3h 4h 5h 6h 18h 24h 27h
Inkubationsdauer
Ko
nz.
[ng
/ml]
basal
0,1 nM
1 nM
10 nM
Abb. 26: Stimulation der ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen durch Zugabe von CRH in verschiedenen Konzentrationen (0,1 nM, 1 nM, 10 nM). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD der Konzentration (in ng/ml) aus Triplikatmessungen.
Sogar noch größer waren die Unterschiede der Messwerte, wenn man mehrere
Stimulationsversuche, die unter identischen Bedingungen durchgeführt worden waren,
miteinander verglich. Die Werte lagen hier auf ganz unterschiedlichem Niveau, wobei
sowohl die basalen als auch die stimulierten Werte von diesen Schwankungen bis zu
Faktor 10 betroffen waren. Abb. 27 verdeutlicht dieses Phänomen.
Ergebnisse 83
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
V1 V2 V3 V4 V5
Versuch
Ko
nz.
[ng
/ml]
Basal
CRH-10 nM
Abb. 27: ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen bei verschiedenen CRH-Stimulationsversuchen. Verglichen wurden jeweils die Konzentrationswerte (in ng/ml) der mit 10 nM CRH stimulierten Versuchs-ansätze mit denen der unstimulierten Ansätze. Die Versuche sind mit V1-5 durchnummeriert. Dargestellt sind die Mittelwerte + SD aus Triplikatmessungen.
Zur Kontrolle, ob das „alte“ CRH, das im Labor ca. 2 Jahre in lyophilisierter Form
bei -80°C aufbewahrt worden war, seine volle Bioaktivität behalten hatte, wurde im
Zuge dieser Versuchsreihe neues, gelöstes CRH bestellt und wurden vergleichende
Untersuchungen durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass das „alte“ CRH die ACTH-
Sekretion keineswegs schlechter und sogar gleichmäßiger stimulierte als das „neue“.
Letzteres führte immer wieder zu „Ausreißern“, bei denen ein Einzelwert aus einer
Duplikatmessung bis zu dreimal höher lag als der andere. Zur Veranschaulichung sind
in Abb. 28 zwei Stimulationsversuche exemplarisch dargestellt.
Ergebnisse 84
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
V1 V2Versuch
Ko
nz.
(ng
/ml)
Basal
Basal
CRH-alt
CRH-alt
CRH-neu
CRH-neu
Abb. 28: Vergleich des Stimulationseffektes durch „altes“ versus „neues“, gelöstes CRH auf die ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen. Das CRH wurde jeweils in einer Konzentration von 10 nM verwendet. Dargestellt sind die Konzentrations-Einzelwerte (in ng/ml) aus Duplikatmessungen. Die Versuche sind mit V1-2 durchnummeriert.
3.4 Laborinterne Qualitätssicherung
3.4.1 Vitalität der Myometriumbiopsien
Zur qualitativen Überprüfung der Gewebekultur und der verschiedenen Versuchs-
bedingungen, die im Rahmen der Kultur zur Anwendung kamen, wurde die Vitalität der
Myometriumbiopsien mithilfe des LDH-Tests kontrolliert.
Aus der Beobachtung zum zeitlichen Verlauf (n=2) ergab sich, dass die Vitalität
des Gewebes nach der Vorinkubationsphase am höchsten war, nach 6 Stunden
bereits nachgelassen hatte, bis sie nach Beendigung der 22-stündigen Kultur noch bei
56-71,3% lag.
Ergebnisse 85
0
20
40
60
80
100
120
0h 6h 22h
Inkubationszeit
Vit
ali
tät
(%)
M98
M104
Abb. 29: Vitalität der Myometriumproben im zeitlichen Verlauf der Kurzzeit-Gewebekultur.
Des Weiteren wurde untersucht, inwieweit sich das Umsetzen der Gewebeproben
in neues Kulturmedium nach den ersten 6-7 Stunden der Hauptinkubationsphase
hinsichtlich der Gewebevitalität nach Beendigung der Kultur bemerkbar machte. Es
stellte sich heraus, dass der Mediumwechsel in 3 von 4 Fällen für das Gewebe nicht
förderlich gewesen war, sondern ihm eher geschadet hatte: Während die Vitalität nach
nur einer Hauptinkubationsphase (C) noch mindestens bei 50,3% lag, sank sie bei der
unterteilten Inkubation (AB) bis auf 37,9% ab. Es wurde daher in Folgeversuchen auf
das Umsetzen der Biopsien verzichtet.
Ergebnisse 86
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
M99 M100 M102 M104Gewebe-Nr.
Vit
ali
tät
(%)
AB
C
Abb. 30: Einfluss der Inkubationsart in der Kurzzeit-Gewebekultur auf die Vitalität der Myometriumproben. Überprüft wurde die Gewebevitalität (in %) nach Beendigung der Kultur. “AB“ bezeichnet eine zweigeteilte Inkubationsphase von 6-7h (A), nach denen die Gewebeproben in frisches Kulturmedium umgesetzt und für weitere 16-17h (B) inkubiert wurden. „C“ beschreibt eine einteilige Inkubationsphase von 22-24h.
3.4.2 Parallelmessungen beim 6-keto-PGF1α-EIA
Während die biologischen Proben bei den EIAs üblicherweise als Triplikate,
manchmal auch als Duplikate oder Hexaplikate eingesetzt wurden, erfolgte im
Rahmen der Untersuchungen zur 6-keto-PGF1α-Sekretion einmalig eine Messung von
18 parallelen Vorinkubationsansätzen. Dies sollte die Frage klären, ob eine größere
Anzahl gemessener Parallelansätze den Schwankungsfaktor zwischen den einzelnen
Messwerten verkleinere.
Das Ergebnis war negativ; die Einzelwerte bewegten sich zwischen 294 und 1770
pg/mg, was gleichbedeutend mit einem Schwankungsfaktor von 6 war. Zur Demon-
stration ist diese Untersuchung in Abb. 31 graphisch dargestellt.
Ergebnisse 87
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 MW
Ansatz-Nr.
Ko
nz./
FG
[p
g/m
g]
Abb. 31: Basale 6-keto-PGF1α-Konzentration im Mediumüberstand von Parallelansätzen in der Kurzzeit-Myometriumkultur. Dargestellt ist die Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht (in pg/mg) von 18 parallelen Ansätzen während der Vorinkubationsphase und ihr arithmetischer Mittelwert (MW).
3.4.3 Intra- und Interassayvariabilität der EIAs
Zur Qualitätssicherung der Prostaglandin-EIAs wurden in jedem Assay immer an
der gleichen Stelle der Mikrotiterplatte 6-8 Präzisions-Kontrollproben (KP) mitgeführt,
aus denen der Variationskoeffizient (Vk) der Intraassay-Variabilität berechnet wurde.
Zwei dieser Kontrollproben dienten außerdem der Berechnung des Vk der Interassay-
Variabilität. Die Ergebnisse dieser Berechnungen sind in Tab. 10 dargestellt.
Versuchsweise wurde überprüft, inwiefern sich die Werte für die Intraassay-Variabilität
verändern, wenn in die Berechnungen statt aller Kontrollproben nur die ersten vier
einfließen. In
Tab. 11 sind die erste und die zweite Berechnung gegenübergestellt. Bei ca. der
Hälfte der ausgewerteten EIAs führte letztere zu einer besseren Intraassay-Variabilität.
Zur Kontrolle des ACTH-Assays wurde ein kommerzielles Kontrollserum benutzt.
Ergebnisse 88
Tab. 10: Intra- und Interassay-Variabilität der EIAs. Vk (in%) steht für die Variationskoeffizienten, die aus dem Mittelwert und der Standardabweichung der Einzelwerte berechnet wurden.
EIA Anzahl der Versuche Intraassay-Vk Interassay-Vk
6-keto-PGF1α 13 13-34% 25%
PGE2 4 9-66% 36%
ACTH 7 6-9% 18%
Tab. 11: Berechnung der Intraassayvariabilität der 6-keto-PGF1α-EIAs mit allen versus den jeweils ersten vier Kontrollproben. Grün unterlegt sind die Werte, die sich in der zweiten Berechnung verbessert hatten. Vk (in%) steht für die Variationskoeffizienten, die aus dem Mittelwert und der Standardabweichung der Einzelwerte berechnet wurden.
1. Berechnung 2. Berechnung
Intraassay-Vk berechnet mit allen Kontrollproben
Intraassay-Vk berechnet mit den ersten 4 Kontrollproben
14,1% 15,8%
13,0% 9,3%
20,4% 9,8%
18,0% 23,1%
34,4% 34,9%
28,4% 31,7%
30,4% 21,0%
18,1% 22,9%
13,5% 15,5%
16,4% 14,4%
18,2% 15,3%
28,4% 10,8%
16,2% 15,2%
3.4.4 Pipettenvergleich und Kontrolle des EIA-Readers
Zur Klärung, ob die starken Ergebnisschwankungen in den Prostaglandin-EIAs auf
Pipettierungenauigkeiten zurückzuführen waren, wurden sowohl die im Labor verwen-
deten Pipetten als auch die Pipettierleistung verschiedener Benutzer miteinander
verglichen, indem vorgegebene Volumina einer Neutralrotlösung auf eine Mikrotiter-
platte pipettiert wurden und anschließend die Aktivitäten im EIA-Reader gemessen
wurden.
Ergebnisse 89
Die Vks der Einzelpipetten lagen zwischen 1,2% (1000µl-Pipette) und 16,1% (10µl-
Pipette). Mit der für die EIAs hauptsächlich eingesetzten 200µl-Pipette wurde ein sehr
guter Vk von 1,6% erreicht. Die Multipette lag mit einer Vk von 4,0% im mittleren
Bereich. Beim Vergleich der Pipettierleistungen von Doktorandin und Doktorvater
erzielte die Doktorandin, die auch sämtliche EIAs pipettiert hatte, den besseren Vk
(7,0% versus 9,6%).
Tab. 12: Kontrolle der im Labor verwendeten Pipetten und Vergleich der Pipettierleistung verschiedener Benutzer. Für die erste Messung wurden vorgegebene Volumina mit den verschiedenen Einzelpipetten und der Multipette pipettiert, für die zweite Messung verwendeten A. Hampel und W. Schäfer nacheinander dieselbe Einzelpipette, um ein vorgegebenes Volumen zu pipettieren. Dargestellt sind die Aktivitäten in dpm. Aus den Einzelwerten wurden die Mittelwerte (MW), Standardabweichungen (SD) und Vks (in %) berechnet.
Pipette 10-100µl 50-200µl 100-1000µl 2-20µl 0,5-10µl Multi (50µl) 10-100µl 10-100µl
Volumen 50µl 150µl 500µl 10µl 5µl 50µl 50µl 50µl
Untersucher A. Hampel A. Hampel A. Hampel A. Hampel A. Hampel A. Hampel A. Hampel W. Schäfer
1 8967 26745 88707 1695 1134 9243 5896 5974
2 9668 27177 90125 1893 1000 9131 6467 5439
3 6519 28086 90102 1743 998 8938 6788 6014
4 9158 27008 87407 1788 983 8879 6702 5238
5 8871 26968 87758 1669 1207 8932 6927 7170
6 9024 26923 87280 1933 1047 9342 6230 6755
7 8980 26919 89793 1796 1051 8895 5712 7244
8 9023 27239 89430 1879 928 8913 6851 7208
9 9320 26581 88901 1684 1081 8900 7469 7210
10 9073 26919 89063 1877 976 8819 6978 6418
11 9009 27277 88908 1879 1213 9068 7209 6427
12 9131 26126 86618 1865 1083 7717 7198 6756
13 9524 26406 87805 1785 1227 9114 7012 5737
14 8855 26659 87741 1945 826 8988 7087 6659
15 9054 26234 87958 1831 1092 8856 7031 7018
16 9235 26695 86824 1779 993 9328 7325 7070
17 9578 26686 89586 1801 989 9081 7202 6822
18 9340 26763 88508 1910 846 8568 7030 6942
MW 9018 26856 88473 1820 1037 8928 6840 6561
SD 667 441 1099 85 114 357 480 633
VK% 7,4 1,6 1,2 4,7 10,9 4,0 7,0 9,6
1. Messung 2. Messung
Ferner wurde kontrolliert, mit welcher Präzision der EIA-Reader seine Messungen
durchführte, indem im Anschluss an eine Messung die Mikrotiterplatte mit den
pipettierten Volumina um 180° gedreht und noch einmal gemessen wurden.
Dabei fiel auf, dass der Reader jeweils in Reihe D und auf den Positionen rechts
unten in der Ecke die höchsten Messwerte bestimmte. Die Unterschiede waren jedoch
als geringfügig einzustufen. Bei dieser Untersuchung wurde zusätzlich noch die für die
Ergebnisse 90
EIAs ebenfalls gelegentlich eingesetzte Mehrkanalpipette überprüft. Mit ihr wurden
gute Vks von 2,3-2,9% erreicht.
Tab. 13: Vergleich von Einzelpipette, Multipette und Mehrkanalpipette und Überprüfung des EIA-Readers. Gemessen wurde die optische Dichte (OD). Nach der ersten Messung (a) wurde die Mikrotiterplatte um 180° gedreht und noch einmal gemessen (b). Grün markiert sind die jeweils höchsten Messwerte einer Reihe. Aus den Einzelwerten wurden die Mittelwerte (MW), Standardabweichungen (SD), Vks (in %) und der Median berechnet.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,115 0,115 0,117 0,116 0,115 0,115 0,114 0,114 0,114 0,114 0,113 0,113
B 0,117 0,117 0,117 0,117 0,116 0,116 0,116 0,116 0,116 0,114 0,116 0,115
C 0,114 0,116 0,116 0,117 0,115 0,114 0,114 0,114 0,114 0,115 0,113 0,115D 0,122 0,123 0,121 0,121 0,119 0,119 0,118 0,118 0,117 0,117 0,117 0,115
E 0,113 0,114 0,114 0,115 0,113 0,117 0,113 0,112 0,112 0,111 0,112 0,11
F 0,113 0,116 0,113 0,112 0,113 0,111 0,113 0,112 0,113 0,118 0,112 0,114
G 0,115 0,118 0,117 0,118 0,117 0,115 0,115 0,116 0,12 0,115 0,114 0,113H 0,116 0,118 0,12 0,117 0,117 0,117 0,117 0,119 0,117 0,119 0,116 0,116
MW
SD
Vk%Median
a)
0,117
0,003
2,280,12
0,115
0,002
1,860,12
0,115
0,002
1,990,11
Mehrkanalpipette Multipette 200er-Einzelpipette
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,109 0,108 0,111 0,113 0,111 0,109 0,108 0,108 0,107 0,109 0,11 0,109
B 0,111 0,108 0,109 0,111 0,109 0,109 0,109 0,11 0,111 0,111 0,111 0,11
C 0,107 0,107 0,112 0,109 0,107 0,107 0,107 0,108 0,108 0,108 0,109 0,109
D 0,113 0,114 0,115 0,115 0,113 0,113 0,126 0,112 0,112 0,112 0,112 0,11
E 0,105 0,105 0,106 0,107 0,105 0,105 0,105 0,104 0,105 0,106 0,106 0,106
F 0,104 0,104 0,104 0,104 0,104 0,103 0,105 0,105 0,108 0,106 0,106 0,106
G 0,108 0,109 0,107 0,109 0,108 0,108 0,108 0,107 0,108 0,109 0,109 0,11
H 0,108 0,107 0,11 0,11 0,109 0,109 0,111 0,111 0,111 0,113 0,113 0,112
MW
SD
Vk%
Median
b)
0,002
200er-Einzelpipette
0,109 0,1090,109
Mehrkanalpipette
0,11 0,11 0,11
2,93 3,79 2,12
0,003 0,004
Multipette
Bei einer Gesamtbetrachtung der technischen und methodischen Schwierigkeiten
im Umgang mit EIAs wirkt es plausibel, dass sie in ihrer Gesamtheit zu einer mangeln-
den Beurteilbarkeit etwaiger Stimulationseffekte von CRH, Urocortin und IL-1β geführt
haben. Die Zusammenhänge, die zu den hohen Intraassay-Variabilitäten führten,
konnten allerdings nicht abschließend geklärt werden und bedürfen weiterer
Untersuchungen.
Ergebnisse 91
3.4.5 Molekularbiologische Untersuchung von RC-4B/C1- und AtT20-Zellen
3.4.5.1 RNA-Extraktion
Im Rahmen der Qualitätssicherung wurde nach der RNA-Extraktion aus Zellen
beider Hypophysen-Zelllinien sowohl die Menge der isolierten RNA photometrisch
gemessen (s. 2.3.6.3) als auch eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, um
ihren Reinheitsgrad zu überprüfen.
Die Agarose-Gelelektrophorese lieferte für beide Zelllinien gute Ergebnisse mit
einer deutlich erkennbaren, klar abgegrenzten 28S-Bande bei ca. 5,0 KB und einer
18S-Bande bei ca. 1,9 KB. Die nahezu vollständige Abwesenheit eines Schmiers
deutet auf einen hohen Reinheitsgrad der RNA hin. Das Gel für AtT20 ist in Abb. 32
dargestellt.
Abb. 32: Total-RNA von AtT20-Zellen. Dargestellt ist ein mit 1x TBE gepuffertes 1%iges Agarosegel. „28S“ bezeichnet die 28S-rRNA-Bande, „18S“ die 18S-rRNA-Bande eukaryotischer Zellen; sie wurden mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Zur Ermittlung der Laufstrecke der Banden (28S bei ca. 5,0 KB, 18S bei ca. 1,9 KB) wurde ein DNA-Marker („ladder“, L) verwendet.
3.4.5.2 RT-PCR
Mittels RT-PCR wurde die Expression von CRH-Rezeptoren in den Zellen der
beiden Hypophysen-Zelllinien als unabdingbare Voraussetzung für ihre Einsatz-
möglichkeit als CRH-Bioassay überprüft. Dabei diente als zusätzliche Positivkontrolle
Ergebnisse 92
für die PCR die Untersuchung des Haushaltsgens Cyclophilin A. Das erwartete
Amplikon in einer Länge von 268 bp erschien in der Agarose-Gelelektrophorese bei
beiden Zelllinien als klar abgrenzbare, deutliche Bande. CRH-R1 und -R2 wurden
mithilfe von eingeschachtelten Primerpaaren im Rahmen einer Nested PCR
untersucht. Während die Bande für das Amplikon von CRH-R1 in einer Länge von 216
bp bei den RC-4B/C1-Zellen undeutlich, bei den AtT20-Zellen aber sehr scharf und
abgegrenzt zum Vorschein kam, ließ sich für CRH-R2 kein klares Signal nachweisen.
Abb. 33: mRNA-Nachweis von CRH-R1 (a) und Cyclophilin (b) in AtT20-Zellen. Für die Primerpaare wurde jeweils eine Negativkontrolle ohne cDNA („No Template Control“, NTC) mitgeführt. Cyclophilin-mRNA diente als Positivkontrolle für den Erfolg der RT-PCR. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5%igen Agarosegelen aufgetrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Zur Ermittlung der Laufstrecke der Banden wurde ein DNA-Marker („ladder“, L) verwendet.
Diskussion 93
4 Diskussion
4.1 Untersuchungen zur Wirkung von CRH im Myometrium
4.1.1 Prostaglandine
In dieser Arbeit wurden die Prostacyclin- und PGE2-Sekretion und ihre Stimulier-
barkeit durch CRH in humanem Myometrium des unteren Uterinsegments untersucht.
Das Hauptaugenmerk der Untersuchungen lag dabei auf 6-keto-PGF1α als stabilem
Metaboliten von Prostacyclin. Diese beiden Prostaglandine waren bei Metabolismus-
studien mit [3H]-Arachidonsäure in 24 Stunden inkubierten Myometriumbiopsien als
Hauptmetabolite aufgefallen [184]. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert
werden, dass die basale Prostacyclin-Synthese im unteren Uterinsegment ca. 15-20-
mal höher ist als die PGE2-Sekretion. Die Wirkung von CRH auf die 6-keto-PGF1α-
Produktion war aufgrund großer inter- und intraindividueller Streuungen der Messwerte
schwer beurteilbar. Eine statistische Auswertung wurde wegen der kleinen
untersuchten Fallzahl (n=8) nicht durchgeführt. Die vorläufigen Ergebnisse zeigten
eine Tendenz zu einer leichten Stimulation der 6-keto-PGF1α-Synthese, die allerdings
nicht zuverlässig reproduzierbar war. Die PGE2-Synthese wurde durch keine der
zugegebenen Substanzen stimuliert. Dieses Ergebnis ist jedoch aufgrund der kleinen
Versuchsgruppe (n=4) nicht als repräsentativ zu werten.
In der Literatur wird eine im Schwangerschaftsverlauf zunehmende Prostaglandin-
Synthese beschrieben, die v.a. durch eine gesteigerte Aktivität der induzierbaren COX-
2 im Amnion und Myometrium zustande kommt [45, 197]. Sie ist am Termin ca.
100fach stärker exprimiert als die konstitutive COX-1 [194]. Allerdings ist diese
Expressionssteigerung schon deutlich vor dem Geburtstermin zu beobachten, so dass
eine maßgebliche Beteiligung der COX-2 an der Weheninduktion unwahrscheinlich ist
[82]. Interessanterweise zeigte sich in einer neueren Studie zwar eine Erhöhung der
COX-2-mRNA Expression unter Wehen am Termin, jedoch nicht bei vorzeitiger
Wehentätigkeit [3]. In der Spätschwangerschaft tragen eine reduzierte PGDH-
Expression und -Aktivität und somit eine niedrigere Prostaglandin-Metabolismus-Rate
zusätzlich zu den erhöhten Prostaglandin-Spiegeln bei [81]. Dieser Effekt ist bei
vorzeitiger Wehentätigkeit besonders stark ausgeprägt [52, 181, 212], so dass die
Diskussion 94
Vermutung nahe liegt, dass ein Zusammenbruch der durch die choriale PGDH
aufgebauten metabolischen Barriere in einem ursächlichen Zusammenhang mit der
vorzeitig erhöhten myometrialen Kontraktilität steht. Allerdings wurden hinsichtlich der
PGDH-Aktivität auch kontroverse Daten erhoben, die für einen Anstieg der PGDH-
Aktivität im Verlauf der Schwangerschaft und unter der Geburt sprechen [187]. Dieses
Thema ist demnach noch nicht abschließend geklärt.
Der Befund der vorliegenden Arbeit, dass die myometriale Sekretion von
Prostacyclin ca. 15-20-mal höher als die PGE2-Sekretion ist, steht im Einklang mit
früheren Daten, nach denen PGI2 als Haupteicosanoid im schwangeren und nicht-
schwangeren Myometrium in vielen Spezies, inkl. Mensch, identifiziert wurde [31, 45,
156, 167, 184, 221]. Seine Konzentration steigt im Schwangerschaftsverlauf bis zum
Geburtstermin sowohl im Fruchtwasser [136] und im maternalen Plasma [223] als
auch im Myometrium [141, 169] stetig an. Dabei ist das Myometrium das einzige
intrauterine Gewebe, in dem überhaupt eine nennenswerte Prostacyclin-Sekretion
stattfindet [66, 186]. Entgegen der nahe liegenden Vermutung, dass die steigenden
Konzentrationen im Zusammenhang mit der ebenfalls zunehmenden Kontraktionskraft
des Uterus stehen, wurde eine Hemmung der myometrialen Kontraktilität durch
Prostacyclin beobachtet [156, 191, 219]. Dennoch gibt es mehrere Möglichkeiten, wie
Prostacyclin sowohl zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft als auch zum
Geburtsprozess beitragen kann:
Die Bindung von Prostacyclin an seinen spezifischen Rezeptor IP führt über die
Gαs-gekoppelte Adenylatcyclase/cAMP/PKA-Signaltransduktionskaskade entweder zur
Inaktivierung der MLCK oder zur Phosphorylierung einer membranständigen Ca2+-
Bindungsstelle zur Herabsetzung der freien Ca2+-Konzentration, so dass es zu einer
Inhibition der myometrialen Aktivität kommt [146]. Somit trägt es zur Ruhigstellung des
Uterus bei. Zahradnik et al. betrachteten Prostacyclin daher als antagonistischen
Regulator im Wechselspiel mit den Uterotoninen PGF2α und Oxytocin zur
Sicherstellung von Relaxationen des Myometriums zwischen den rhythmischen
Kontraktionen in der Wehenpause [226]. Bei Myometriumstreifen in vitro bewirkte es
zunächst eine Kontraktion, die aber nach kurzer Zeit in eine Relaxation überging [137,
228]. Angesichts solcher Beobachtungen stellt sich die Frage, wie übertragbar die
Ergebnisse auf die Situation in vivo sind: Hat endogen produziertes Prostacyclin
wirklich einen relaxierenden Effekt auf das Myometrium, oder spiegeln die publizierten
Diskussion 95
in vitro-Ergebnisse nach Superfusion von Prostaglandinen nur pharmakologische
Effekte wider?
Gehemmt wird die Prostacyclin-Sekretion durch Cortisol. Dieser Effekt wird
möglicherweise durch eine dehnungsassoziierte Stimulation der COX-2 antagonisiert
[32], um auch bei wachsendem Fetus eine Ruhigstellung des Myometriums während
des größten Teils der Schwangerschaft zu gewährleisten.
In den letzten Schwangerschaftswochen geht ein Anstieg der PGI-Synthase-
Aktivität mit einer Zunahme der Prostacyclin-Sekretion einher. Dies könnte auf eine
Beteiligung von Prostacyclin an der Cervixreifung hindeuten [72]. Die PGI-Synthase ist
im Myometrium in den Myofibrillen lokalisiert [140]. Am Geburtstermin ist dort und in
den Eihäuten ein signifikanter, wehenunabhängiger Abfall dieses Enzyms zu
beobachten, während die PGE-Synthase unverändert bleibt. Giannoulias et al. [52]
interpretierten dieses Phänomen als Zeichen für den nachlassenden relaxierenden
Einfluss von Prostacyclin auf das Myometrium. Diese Interpretation ist insofern
problematisch, als dass sie keine plausible Erklärung für die am Termin im Vergleich
zu PGE2 immer noch deutlich höhere Prostacyclin-Sekretion liefert.
Prostacyclin und CRH weisen gemeinsame Eigenschaften auf. Neben ihrer
Fähigkeit, intrazelluläre Vorgänge über den Second Messenger cAMP anzuregen [67,
119, 156], bewirken sie beide eine NO/cGMP-vermittelte Vasodilatation. Darüber
hinaus verhindert Prostacyclin thromboembolische Komplikationen in der maternalen
und uteroplacentaren Zirkulation [45, 224] und steigert den uteroplacentaren Blutfluss
durch Hemmung des vasokonstriktiven Einflusses von PGF2α. Auf diese Weise
gewährleistet es einen adäquaten Zufluss oxygenierten Blutes, der v.a während der
Wehentätigkeit essentiell zur Bereitstellung der für den Kontraktionsapparat nötigen
energiereichen Phosphate ist [34, 119]. Kommt es dennoch zu einer persistierenden
uterinen Hypoxie, wird vermehrt CRH ausgeschüttet, welches über eine Stimulation
der fetalen ACTH- und DHEAS-Sekretion die Östrogensynthese steigert [199]. Diese
fetale Stresssituation führt also zu einer myometrialen Aktivierung.
Trotz der beschriebenen synergistischen Wirkungen von Prostacyclin und CRH
deuten Indizien darauf hin, dass die beiden Substanzen zwar parallele
Wirkungsmechanismen haben, diese aber unterschiedlichen Regulationsmecha-
nismen unterliegen. So ist beispielsweise der vasodilatorische Effekt von PGI2, nicht
aber von CRH, durch COX-2-Inhibitoren hemmbar [35]. Das würde bedeuten, dass sie
Diskussion 96
sich in ihrer Wirkung auf die Zielzellen zwar überschneiden, aber keinen direkten
Einfluss aufeinander ausüben. Der in der vorliegenden Arbeit erhobene Befund, dass
CRH und Urocortin die myometriale Prostacyclin-Synthese nicht stimulieren, steht im
Einklang mit dem Ergebnis einer Untersuchung der Prostacyclin-Sekretion in
myometrialen Primärzellkulturen [24, 66]. Hier zeigte CRH ebenfalls keine Wirkung.
Die Befunde zu kontraktilen CRH-Effekten im Zusammenhang mit Prostaglandinen
werden kontrovers diskutiert. Quartero et al. [171] beobachteten zwar eine
Verstärkung der Oxytocin- und PGF2α-induzierten myometrialen Kontraktilität durch
CRH, mehrheitlich ergaben jedoch in vitro-Studien, dass CRH keinen Einfluss auf die
basale, PGF2α- und Oxytocin-stimulierte Aktivität des Myometriums bei Schwangeren
am Geburtstermin nimmt und auf die basale, IL-1β- und Oxytocin-stimulierte Synthese
des kontraktil wirkenden PGE2 sogar einen hemmenden Einfluss hat [66, 83, 193]. Zu
diesen Beobachtungen passen auch die stichprobenartig erhobenen PGE2-Daten der
vorliegenden Arbeit. Dass diese Wirkung nicht nur myocytenassoziiert auftritt, zeigte
eine Untersuchung zu CRH-Effekten auf die PGE2- und 6-keto-PGF1α-Synthese in
Fibroblasten und Endothelzellen [46]. Vieles spricht also dafür, dass CRH während
des größten Teils der Schwangerschaft sowohl durch direkte, rezeptorvermittelte
Wirkungen (s. 4.1.3) als auch durch seinen Einfluss auf die Synthese kontraktiler
Prostaglandine im Myometrium eine protektive Rolle zur Verhinderung von
Kontraktionen und eines verfrühten Ausstoßens des Feten spielt.
Dennoch ist bekannt, dass CRH einen stimulierenden Einfluss auf die
Prostaglandin-Synthese in der Placenta, den Eihäuten und der Decidua ausübt [26,
83, 109]. Diese Funktion gewinnt in mütterlichen und kindlichen Stresssituationen, in
denen das Wohlergehen des Feten im Uterus akut gefährdet ist, an Bedeutung.
Kindlicher Stress ruft über die Aktivierung der fetalen Hypothalamus-Hypophysen-
NNR-Achse eine gesteigerte Cortisol-Synthese hervor, die ihrerseits die CRH-
Sekretion stimuliert. Erhöhte CRH-Spiegel wurden beispielsweise im Nabelschnurblut
von Neugeborenen gefunden, die einem Sauerstoffmangel ausgesetzt waren oder
eine intrauterine Wachstumsverzögerung (Intrauterine Growth Retardation, IUGR)
aufwiesen [215]. CRH führt in diesem Fall über eine Stimulierung der PGHS und eine
Hemmung der PGDH zu einer erhöhten Synthese kontraktil wirkender Prostaglandine,
so dass eine Kaskade in Gang gesetzt wird, die letztlich zur Frühgeburt führt. Analog
kann diese Kaskade auch durch maternalen Stress induziert werden [78]. Dazu zählen
Diskussion 97
neben emotionalen Stressoren auch physische, z.B. Unterernährung [21]. Diese
Ergebnisse stehen im Einklang mit der Beobachtung, dass Frauen, die vorzeitig
entbanden, erhöhte CRH-Plasmaspiegel aufwiesen [132]. Verstärkt wird die soeben
beschriebene myometriale Aktivierung durch die Einbindung von Prostaglandinen in
eine weitere positive Rückkopplungsschleife (s. auch Abb. 34): PGE2 und PGF2α
führen über eine Aktivierung der 11β-Hydroxy-Steroid-Dehydrogenase-1 im Chorion zu
einer Umwandlung von Cortison in aktives Cortisol. Dieses bewirkt eine Stimulation
von CRH und COX-2 sowie eine Inhibition der PGDH, so dass wiederum die
Prostaglandin-Synthese und konsekutiv die Kontraktilität des Myometriums gesteigert
wird [21, 24]. Dieser Cortisol-Effekt, der auch bei exogener Glucocorticoid-Gabe auftritt
[42], ist in vivo allerdings nur transient: Bei länger andauernder Glucocorticoid-Gabe
wird letztlich die Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse supprimiert, so dass durch
eine verminderte Östrogensynthese die myometriale Aktivierung herabgesetzt wird
[24].
Zum Einfluss der Prostaglandine auf die myometriale Kontraktilität wurde in vitro
beobachtet, dass sich ihre Wirkung mit Einsetzen der Wehentätigkeit ändert [191,
220]: Vor Einsetzen der Wehen zeigte PGF2α keinen Einfluss auf den Fundus,
während es im unteren Uterinsegment kontraktionsstimulierend wirkte. PGE2 hingegen
stimulierte das Fundusmyometrium und zeigte im unteren Uterinsegment eine
biphasische Wirkung, bei der es nach einer initial hervorgerufenen Kontraktion zu einer
Relaxation kam. Während der Wehentätigkeit hingegen wurde der Fundus durch beide
Prostaglandine zu Kontraktionen angeregt, im unteren Uterinsegment blieb PGF2α
jedoch wirkungslos, und PGE2 bewirkte eine Hemmung der Kontraktilität. Diese
Beobachtungen stehen im Einklang mit der Hypothese einer funktionellen
Regionalisierung des Uterus [22, 69]: Während das untere Uterinsegment während
des größten Teils der Schwangerschaft einen kontraktilen Phänotyp aufweist, um den
Feten sicher im Uterus zu halten, entspannt es sich unter der Geburt, um dessen
Passage zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu ist der Fundus-/Corpusbereich während
der Schwangerschaft relaxiert, doch am Geburtstermin gehen von hier die Wehen aus.
Es zeichnet sich also ab, dass unterschiedliche Prostaglandin-Wirkungen – die sogar
durch dasselbe Prostaglandin in unterschiedlichen Uterus-Regionen hervorgerufen
werden können –eine wichtige Rolle für die Steuerung der gegensätzlichen Muskel-
tätigkeit in den verschiedenen uterinen Bereichen spielen. Die Basis für diese
unterschiedlichen Prostaglandin-Wirkungen bildet eine fein abgestimmte Regulation
Diskussion 98
und eine zeitlich- sowie räumlich-differenzielle Expression der spezifischen,
membrangebundenen Prostaglandin-Rezeptoren [4, 69, 191, 196]. Dabei sind v.a. die
verschiedenen Subtypen des PGE2-Rezeptors von Bedeutung. In der vorliegenden
Arbeit sind die Funktionen dieser Rezeptoren unter 1.4.3 detailliert erläutert worden.
Urocortin zeigte in den vorliegenden Untersuchungen eine CRH-analoge Wirkung,
indem es die 6-keto-PGF1α-Synthese nicht deutlich veränderte. Auf die PGE2-Synthese
schien es eine eher hemmende Wirkung auszuüben, doch ist dieses Ergebnis
aufgrund der geringen Anzahl untersuchter Proben mit Vorsicht zu betrachten.
Urocortin wird eine kontraktionssteigernde Wirkung auf das Myometrium zuge-
schrieben [160]. Diese wird Gαq-Protein-gekoppelt über eine Aktivierung von
Phospholipase C (PLC) und Inositoltriphosphat (IP3) sowie PKC vermittelt und führt
über die Aktivierung einer Mitogen-Activated-Protein (MAP)-Kinase zu einem Anstieg
der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Urocortin aktiviert Gαq 10-mal stärker als CRH
[61]. Seit Beginn dieser Arbeit wurden zwei weitere Urocortin-Formen entdeckt,
Urocortin II und III; beide haben eine deutlich höhere Affinität zu CRH-R2 als CRH
selbst [112, 175]. Urocortin II bindet an CRH-R2 und bewirkt über eine Aktivierung der
Extracellular-Signal-Regulated-Kinase (ERK)-Kaskade und PKC eine Aktivierung der
MLCK; außerdem ist für diesen Prozess die Aktivierung einer RhoA-assoziierten
Kinase nötig [88]. cAMP setzt die Fähigkeit von Urocortin zur Aktivierung der ERK-
Kaskade herab, so dass eine reduzierte Kontraktilität resultiert [157]. Florio et al. [48]
beobachteten einen deutlich erhöhten Urocortin-Plasmaspiegel während der
Wehentätigkeit. Dabei war die Urocortin-Konzentration in der fetalen Zirkulation
deutlich höher als jene im mütterlichen Kreislauf. Es wurde die Hypothese abgeleitet,
dass Urocortin als fetales Signal zur Förderung von Reifungs- und
Entwicklungsvorgängen, welche die Adaptation an das extrauterine Leben
ermöglichen, die Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse aktiviert [48]. Allerdings
bleibt nach wie vor unklar, ob die erhöhten fetalen Urocortin-Spiegel Ursache oder
Ergebnis der geburtsassoziierten Prozesse sind.
Il-1β zeigte in dieser Arbeit im unteren Uterinsegment ebenfalls keinen eindeutigen
Effekt auf die Prostaglandin-Synthese. Frühere Studien belegten jedoch, dass Prosta-
glandine durch proinflammatorische Cytokine wie Il-1β und TNFα in Myometrium-Pri-
märkulturen vor und nach Uterus-wirksamen Wehen über eine Aktivierung der PLA2
oder eine Induktion der COX-2 stimulierbar waren [139], [45, 66, 166, 167]. Dabei zeigte
Diskussion 99
Prostacyclin bei nachgewiesener Infektion (Chorioamnionitis) einen signifikant
niedrigeren IL-1β-Effekt; es wurde 4fach weniger stimuliert als PGE2 [66]. Eine
mögliche Interpretation dieser Daten könnte sein, dass Prostacyclin zwar beim
physiologischen Geburtsprozess in das proinflammatorische Cytokin-Prostaglandin-
Netzwerk involviert ist, bei pathologischen Mechanismen zur Geburtsauslösung jedoch
eine untergeordnete Rolle spielt.
4.1.2 Histologische Charakterisierung des Myometriums
Bei der histologischen Charakterisierung der humanen Myometriumbiopsien zeigte
sich ein Myocyten-Anteil von 55-65%, eingebettet in ein Bindegewebsgerüst mit
heterogen verteilten Blutgefäßen und Makrophagen. Nach Lehrbuchmeinung finden
sich im unteren Drittel des Uterus deutlich weniger Muskel- als Bindegewebszellen
[165]. Allerdings hatten auch Wetzka (persönliche Mitteilung) und andere
Forschungsgruppen [116, 222] in Biopsien aus dem unteren Uterinsegment einen
hohen Anteil kontraktiler Elemente von bis zu 69% gefunden. Ferner fiel bei einem
direkten Vergleich der Gewebezusammensetzung an verschiedenen Stellen derselben
Probe deren Inhomogenität auf; der Prozentsatz der einzelnen Zellarten variierte um
ca. 5-10%. Im Zusammenhang mit den Prostaglandin-Stimulationsversuchen könnte
diese Beobachtung eine Rolle spielen, da letztlich nicht geklärt ist, welche Zellen des
myometrialen Gewebeverbands welche Prostaglandine in welcher Menge produzieren.
Abgesehen von einem eingeschränkten Fibroblasten-Nachweis mit dem
Antikörper-Klon 5B5 im Kryoschnitt nach einer Methode von Kasper [89], bei dem es
zu einer Schädigung des Gewebes durch die Kryofixation kam, konnten
bindegewebige Strukturen im Paraffinschnitt nur aufgrund ihrer charakteristischen
Form und Verteilung identifiziert werden. Der spezifische Nachweis von Fibroblasten
mit dem Antikörper-Klon 3-2B12 gegen die β-Untereinheit von Prolyl-4-Hydroxylase
misslang. Obwohl dieses Schlüsselenzym der Kollagensynthese als Fibroblasten-
Marker gilt [5], wurden statt Fibroblasten Myocyten angefärbt. Zu diesen wies der
Antikörper eine sehr hohe Affinität auf. Es ist bekannt, dass im Myometrium viele
Übergangsformen zwischen Myocyten und Fibroblasten vorkommen, welche die
Fähigkeit zur Kollagensynthese besitzen. Dies würde zwar eine gewisse Kreuz-
reaktivität des Antikörpers erklären, die auch vom Hersteller eingeräumt wurde (Acris
Diskussion 100
Antibodies GmbH, Dr. Peter Bubeck, persönliche Mitteilung von), jedoch keineswegs
die Tatsache, dass ausschließlich Myocyten, aber kein Bindegewebe angefärbt wurde.
Zur Überprüfung der grundsätzlichen Spezifität des Antikörpers wurde er bei einer
Hautprobe eingesetzt. Auch dieses Ergebnis ist kritisch zu beurteilen, da nicht nur im
Corium, der Bindegewebsschicht der Haut, eine große Anzahl Zellen angefärbt wurde,
sondern auch in der Epidermis, deren Hauptanteil Epithelzellen ausmachen. Zusam-
menfassend bleibt zu konstatieren, dass der Klon 3-2B12 für den Fibroblasten-
Nachweis im Myometrium offenbar nicht geeignet war. In Erwägung zu ziehen wäre
der Einsatz anderer Fibroblasten-Marker, z.B. eines Antikörpers gegen das Hitze-
schockprotein (Hsp)-47 [105] oder des Antikörper-Klons FibAS02 gegen das
Oberflächen-Antigen CD90 [103]. Diese offenen Fragen müssen weiter abgeklärt
werden, was im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht möglich war.
In der Literatur sind zahlreiche Unterschiede zwischen dem unteren Uterinsegment
und dem Corpus-/Fundusbereich des Uterus beschrieben. Im unteren Uterinsegment
sind statt CAPs v.a. relaxationsassoziierte Proteine zu finden, z.B. das durch
Progesteron induzierbare Connexin (Cx)-26, EP2 und EP4 [191, 208]. Dennoch wurde
beobachtet, dass die Expression und Aktivität von COX-1 und -2 und somit die
Prostaglandin-Synthese-Kapazität hier viel höher ist als in den übrigen
Uterusbereichen [201]. Nach Einsetzen der Wehen wurde 15-mal mehr COX-2-mRNA
nachgewiesen als vorher [45]. Diese Beobachtung ist nicht zwangsläufig als
Widerspruch zu den non-kontraktilen Eigenschaften des unteren Uterinsegments zu
werten, da die Prostaglandine dort evtl. eher an der Cervixreifung als an der Myocyten-
Kontraktion beteiligt sind [196].
Im Corpus-/Fundusbereich kommen das Gap Junction-Protein Cx-43 und andere
für die Aktivierung des Myometriums nötige CAPs vor. Ihre Expression wird einerseits
durch die Aktivierung der fetalen Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse und
andererseits durch die mechanische Dehnung des Uterus induziert. Diese beiden fetal
gesteuerten Wege verlaufen separat, aber dennoch voneinander abhängig [117].
Sehringer [190] fand in einer Fundusprobe eine stärkere CRH-R2-Expression als im
unteren Uterinsegment. Sollte sich diese Beobachtung in weiteren Untersuchungen
bestätigen, könnte sie für eine kontraktionsassoziierte CRH-R2-Funktion sprechen.
Nach aktueller Lehrmeinung wird angenommen, dass im unteren Uterinsegment
durch passive Dehnung die Passage des Feten ermöglicht wird, während vom Fundus
Diskussion 101
die Wehentätigkeit ausgeht [15, 165]. Möglicherweise kommt die Relaxation im
unteren Uterinsegment während der Wehentätigkeit im Sinne einer funktionellen
Autonomie des Uterus durch regionale Unterschiede in der Genexpression, z.B. des
Cx-26-Gens, zustande [24]. Zu dieser Hypothese würde eine räumlich-differenzielle
Rezeptorverteilung passen, wie sie für CRH-, Prostaglandin- und Oxytocin-Rezeptoren
vorgeschlagen wurde [1, 49, 117, 140, 203]. Nähere Informationen zu diesem Thema
finden sich in der vorliegenden Arbeit unter 1.4.3 und 4.1.3.
Ein limitierender Faktor bei Untersuchungen am menschlichen Myometrium ist die
Gewinnung geeigneten Probenmaterials, da bei physiologischen Schwangerschafts-
verläufen im Rahmen von geplanten Sectiones caesareae in der Regel nur
Myometriumbiopsien vom oberen Rand des unteren Uterinsegments genommen
werden können. Diese Tatsache wirft in der Geburtsforschung die Frage auf, inwieweit
die Daten aus diesen Untersuchungen auf andere uterine Regionen übertragbar sind.
Trotz der oben beschriebenen regionalen Unterschiede kamen mehrere Studien zu
dem Ergebnis, dass derartige Rückschlüsse durchaus zulässig sind [116, 219, 222].
Luckas machte beispielsweise vergleichende in vitro-Kontraktionsbeobachtungen an
Myometriumstreifen aus dem unteren und oberen Uterinsegment im Organbad und
fand keinen Unterschied der kontraktilen Eigenschaften [116]. Allerdings wurde in
dieser Studie Myometriumgewebe vom oberen Rand des Sectio-Einschnittes als aus
dem oberen Uterinsegment stammend definiert. Wenngleich Studien dieser Art die
Validität der gängigen Probengewinnungspraxis stützen, ist die Übertragbarkeit der
Daten angesichts der ebenfalls nachgewiesenen Differenzen im Sinne einer sauberen
wissenschaftlichen Methodik immer wieder aufs Neue zu hinterfragen.
4.1.3 Verteilung der CRH-Rezeptoren im Myometrium
Als Hauptsyntheseort für CRH gilt zwar die Placenta [183, 192], aber auch im
Myometrium wird CRH im Schwangerschaftsverlauf in steigenden Konzentrationen
gebildet, die ein Maximum während der Wehentätigkeit erreichen [36]. In der
vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit das Myometrium auch als Zielgewebe
für CRH-Wirkungen in Frage kommt. Dabei erfolgte der CRH-Rezeptor-Nachweis
ausschließlich auf der Basis immunhistochemischer Untersuchungen. Außer im
Bindegewebe konnte CRH-R1 in allen myometrialen Zelltypen, inklusive dem Gefäß-
endothel, sehr stark nachgewiesen werden. Paralleluntersuchungen detektierten
Diskussion 102
außerdem in Decidua eine starke CRH-R1-Expression sowohl in Stroma- als auch in
Endothelzellen. Dieser Befund bestätigte Daten von Wetzka et al. [218]. CRH-R2
wurde in Myocyten und Makrophagen deutlich exprimiert, jedoch nicht in Gefäß-
endothelzellen. Bei der genauen Betrachtung der Rezeptor-Expression fiel eine
inhomogene Verteilung nicht nur innerhalb der einzelnen Zellen, sondern in Bezug auf
den gesamten Gewebeschnitt auf. Ein derartiges, mosaikartiges Expressionsmuster
von CRH und CRH-Rezeptoren wurde schon von Wetzka et al. [218] beschrieben, die
dieses Phänomen dadurch erklärten, dass die Myometriumprobe möglicherweise in
einer frühen Aktivierungsphase des Uterus gewonnen wurde, ehe es zu einer
synchronisierten Rezeptor-Aktivierung über die Ausbildung von Gap Junctions
gekommen war. Eine neuere Studie fand außerdem eine unregelmäßige CRH-
Rezeptor-Verteilung in der Zellmembran von Myocyten [123]. Aus diesem Befund
wurde die Hypothese abgeleitet, dass es möglicherweise sog. „Hotspots“ der CRH-
Rezeptor-Expression gibt, die in bestimmten, begrenzten Bereichen spezifische
Signaltransduktionswege aktivieren.
In den letzten Jahren wurden myometriale CRH-Rezeptoren nicht nur in
Leiomyocyten, sondern auch in uterinen Fibroblasten [58], gewebeständigen
Makrophagen und Endothelzellen [218] sowie Leukocyten [55] nachgewiesen. Dabei
könnte ihre Expression in Fibroblasten für eine Beteiligung an der Cervixreifung
sprechen. Ihre Zahl und Bindungsaffinität nehmen im Verlauf der Schwangerschaft
stark zu [74]. Bei Schwangeren findet sich CRH-R1 v.a. im Myometrium und in den
Eihäuten, wobei seine Expression im Vergleich zu Nicht-Schwangeren geringer ist,
während der Wehentätigkeit aber stark zunimmt. Im unteren Uterinsegment ist er
stärker vertreten als im Corpus-/Fundusbereich des Uterus [203]. Jirecek et al. [80]
zeigten, dass CRH-R2 ein entgegengesetztes Expressionsmuster aufweist; er ist am
Geburtstermin stark exprimiert, aber während der Wehentätigkeit kaum noch
nachweisbar. Bei Frauen mit Frühgeburtsbestrebungen ist er schwächer ausgeprägt
als bei Frauen mit unkomplizierten Schwangerschaftsverläufen. Dieser Befund wurde
so gedeutet, dass es zur Verhinderung exzessiver Kontraktionen in bestimmten
Stadien der Geburt zu einer Herrunterregulation von CRH-R2 kommt, und belegt somit
indirekt eine kontraktionsassoziierte Funktion dieses Rezeptors. Passend zu dieser
Hypothese fand Sehringer [190] bei einer einzelnen Fundusprobe eine stärkere CRH-
R2-Expression als bei den üblichen Proben aus dem unteren Uterinsegment. Diese
Beobachtung muss anhand größerer Probenzahlen weiter abklärt werden.
Diskussion 103
Nach vergleichenden Untersuchungen von Grammatopoulos [58, 61] an
schwangerem versus nicht-schwangerem Myometrium kommt bei Nicht-Schwangeren
v.a. CRH-R1α und -R1β sowie CRH-R2β vor. In der Schwangerschaft werden noch -
R2α und am Geburtstermin zusätzlich -R1c und -R1d exprimiert. Einschränkend muss
angemerkt werden, dass der Expressionsnachweis der meisten CRH-Rezeptor-
Subtypen bisher nur auf mRNA-Ebene erfolgt ist, also keine Rückschlüsse auf die
Existenz funktioneller Proteine zulässt. Dennoch deuten diese Daten darauf hin, dass
CRH-1c und -R1d am Ende der Schwangerschaft eine Rolle spielen und dass die
biologischen Wirkungen von CRH und Urocortin im Myometrium in den verschiedenen
Schwangerschaftsstadien über unterschiedliche CRH-Rezeptor-Subtypen vermittelt
werden. Die Expressionsregulierung dieser Subtypen ist ein dynamischer Prozess, der
über bisher unbekannte Mechanismen erfolgt [63]. Die teilweise kontroversen Daten
zur Rezeptor-Expression im Myometrium [58, 178, 203] sind möglicherweise durch die
Heterogenität des Patientinnenkollektivs erklärbar: Zwar stammten alle Proben von
Patientinnen am Geburtstermin ohne Wehen, aber es konnte nicht prognostiziert
werden, wann die Wehen eingesetzt hätten und in welcher Aktivitätsphase sich der
Uterus somit zum Zeitpunkt der Probenentnahme befand.
Der im Myometrium am stärksten ausgeprägte CRH-Rezeptor-Subtyp ist CRH-
R1α. Gαs-Protein-gekoppelt führt die Bindung seines Liganden über die Adenylat-
cyclase/cAMP/PKA-Signaltransduktionskaskade zu einer Inaktivierung der MLCK,
indem deren Affinität für den Calcium-Calmodulin-Komplex herabgesetzt wird [50].
Dadurch wird die myometriale Kontraktilität gehemmt. Noch verstärkt wird diese
Wirkung durch Stimulation weiterer relaxierender Signaltransduktionswege, z.B. eine
PKA-abhängige oder -unabhängige Aktivierung von Guanylatcyclase, die über cGMP
zur Bildung von NO führt [2], sowie eine Hemmung der Cytokin-induzierten
myometrialen Prostaglandin-Synthese [67]. CRH hat folglich über CRH-R1, zumindest
über das Gαs-Protein, keinen direkten stimulatorischen Effekt auf die Synthese
kontraktiler Prostaglandine [24]. Eine indirekte kontraktionsstimulierende Wirkung ist
hingegen durch die Stimulation der Prostaglandin-Synthese in der Placenta und im
Amnion möglich [26, 83, 109].
Interessanterweise verändert sich während der Schwangerschaft die Affinität von
CRH zu CRH-R1. Die zunächst stetig steigende, am Geburtstermin jedoch erniedrigte
Affinität [62] lässt auf myometriumsrelaxierende CRH-Effekte während des größten
Diskussion 104
Teils der Schwangerschaft, aber auch auf eine Veränderung der CRH-Funktion in
Richtung kontraktionsunterstützender Effekte unter der Geburt, schließen. Mehrere
Indizien stützen dieses Modell. Zum einen wurde beobachtet, dass das gleichmäßig im
gesamten Myometrium exprimierte Gαs-Protein kurz vor der Geburt herrunterreguliert
wird [201]. Ferner bewirkt Oxytocin gegen Ende der Schwangerschaft über die
Aktivierung von PKC eine CRH-R1α-Desensitivierung, so dass es über eine
Aktivitätsminderung der Adenylatcyclase und eine verringerte cAMP-Produktion zu
einer Abschwächung der relaxierenden Wirkung kommt [66, 67]. Des Weiteren mindert
PKC über eine Desensitivierung von CRH-R1β die Aktivität einer membran-
gebundenen Guanylatcyclase, so dass die muskelentspannende Wirkung aufgrund
einer verringerten cGMP-Produktion weiter reduziert wird [2, 122]. Vergleichende
Studien zeigten, dass im Myometrium eine PKC-Aktivierung nur am Geburtstermin
erfolgt. Dies könnte möglicherweise in der vorher zu geringen Anzahl von Oxytocin-
Rezeptoren begründet sein [63]. Insgesamt spricht einiges dafür, dass den an beiden
CRH-Rezeptoren nachgewiesenen, multiplen potentiellen PKC-Bindungsstellen [63]
eine wichtige Bedeutung für die Rezeptor-Regulation zukommt.
In diesem Zusammenhang steht die Tatsache, dass CRH-R1 während der Wehen-
tätigkeit vornehmlich im unteren Uterinsegment verstärkt exprimiert wird, nicht
zwangsläufig im Widerspruch zu der Erkenntnis, dass es am Termin unter Wehen zu
einer CRH-R1-Desensitivierung kommt. Möglicherweise ist die verstärkte Expression
dieses Rezeptors im unteren Uterinsegment als gegenregulatorische Maßnahme des
Körpers zu werten, damit bei einer Abschwächung der CRH-R1-vermittelten
relaxierenden Wirkung das untere Uterinsegment dennoch entspannt und die Passage
des Feten ermöglicht werden kann. Das würde bedeuten, dass sich die Desensi-
tivierung von CRH-R1 letztlich v.a. im Fundus auswirkt. Die Beobachtung, dass nicht
alle CRH-Rezeptoren oxytocinsensitiv sind [67], somit die Möglichkeit zu einer
differenziellen Regulation besteht, könnte dieses Modell unterstützen. Eine räumlich-
differenzielle CRH-Rezeptorverteilung, wie sie ebenfalls für Oxytocin- und
Prostaglandin-Rezeptoren vorgeschlagen wurde [1, 49, 140], würde scheinbar
gegensätzliche CRH-Wirkungen in verschiedenen Bereichen des Uterus plausibel
machen [117, 203].
Die Erkenntnis, dass CRH durch Bindung an CRH-R1α über das Adenylat-
cyclase/cAMP/PKA-System eine Relaxation des Myometriums bewirkt, bildete die
Diskussion 105
Basis zu der Annahme, dass CRH keine direkten kontraktionsstimulierenden Effekte
ausübt [8, 60, 170]. Zunächst in nicht-schwangerschaftsspezifischen Geweben
(Leydig-Zellen, fetale Nebenniere) wurden jedoch CRH-Rezeptoren gefunden, die über
den PLC/Inositol-Triphosphat (IP3)/PKC-Signaltransduktionsweg die intrazelluläre
Ca2+-Konzentration erhöhen [20, 210]. Im Myometrium wurde außerdem eine
Aktivierung unterschiedlicher G-Proteine beobachtet [60]: Während bei Nicht-
Schwangeren keine Kopplung von CRH-Rezeptoren an das Adenylatcyclase/cAMP-
System nachgewiesen werden konnte, führt bei Schwangeren die Aktivierung eines
kurzen, 45 kDa schweren und eines langen, 52 kDa schweren Gαs-Proteins über jene
Signaltransduktionskette zur myometrialen Ruhigstellung. Am Geburtstermin konnte
nur noch das kurze Gαs-Protein, aber zusätzlich ein Gαq-Protein detektiert werden [75],
welches über die PLC/IP3-Kaskade Kontraktionen auslöst [61]. Die Aktivierung von
Gαq erfolgt dabei durch Urocortin in 10facher Stärke im Vergleich zu CRH [61], so
dass bisher ungeklärt ist, inwieweit CRH an der Aktivierung dieses G-Protein-Typs
beteiligt ist. Anhand von Untersuchungen zu Urocortin konnte für CRH-R2 eine
kontraktionsassoziierte Wirkung nachgewiesen werden: Karteris et al. [88] fanden
heraus, dass Urocortin II über CRH-R2 eine Aktivierung der ERK-Kaskade und PKC
eine Aktivierung der MLCK bewirkt und somit die myometriale Kontraktilität steigert.
Basierend auf den Daten zur Kopplung der CRH-Rezeptoren an unterschiedliche
G-Proteine wurde die Hypothese aufgestellt, dass CRH in der Schwangerschaft
myometriale Kontraktionen verhindert, am Termin jedoch über Gαq die myometriale
Kontraktilität erhöht [76]. Ein erhöhter CRH-Plasmaspiegel bei pathologischen
Schwangerschaftsverläufen, die mit einem erhöhten Frühgeburtsrisiko einhergehen,
würde in diesem Modell den Versuch des Körpers darstellen, den Fetus vor zu früher
Entbindung zu schützen. Zu einer Regulationsmöglichkeit der CRH-Genexpression
wurde eine Hypothese aufgestellt, nach der Cortisol mit Progesteron in Placenta und
Eihäuten um die Bindung an den Glucocorticoid-Rezeptor konkurriert [86]. Die
hemmende Wirkung von Progesteron, die während des überwiegenden Teils der
Schwangerschaft dominiert [149], würde demnach durch die im
Schwangerschaftsverlauf steigenden Cortisol-Spiegel zunehmend aufgehoben, so
dass es letztlich zu einem Anstieg der CRH-Konzentration käme. Eine ähnliche
Progesteron-Cortisol-Interaktion ist auch zur Regulation der Prostaglandin-Synthese
beschrieben worden [24]. In vivo wurde beobachtet, dass auch nach exogener
Diskussion 106
Glucocorticoid-Gabe der CRH-Plasmaspiegel über 50% gegenüber dem
Ausgangswert steigt [121].
Abb. 34: Darstellung der dualen CRH-Funktion mit relaxierenden sowie kontrahierenden Effekten auf das Myometrium.Dieses Schema gibt einen Überblick über direkte CRH-R1- und Gαs-gekoppelte Relaxationswirkungen und indirekte, über die Stimulation von Prostaglandinen gesteuerte Kontraktionseffekte sowie ihre möglichen Interaktionen. Mit einer gestrichelten Linie und „?“ markiert ist der bislang hypothetische Gαq-gekoppelte kontrahierende CRH-Effekt. In das Schema integriert sind die Modelle der kompetitiven Steuerung der CRH-Expression durch Progesteron und Cortisol über den Glucocorticoid-Rezeptor und der CRH-R1-Desensitivierungseffekt von Oxytocin. CRH: Corticotropin-Releasing Hormone; CRH-R: CRH-Rezeptor; COX-2: Cyclooxygenase-2; PG: Prostaglandin; PGDH: 15-Hydroxy-Prostaglandin-Dehydrogenase; PKC: Proteinkinase C; EP: PGE2-Rezeptor; cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat; IP3: Inositoltriphosphat.
Abschließend ist zu bemerken, dass das Modell, nach dem CRH während des
größten Teils der Schwangerschaft an der Ruhigstellung des Uterus, dann aber auch
an den für eine rhythmische Wehentätigkeit notwendigen Kontraktionen beteiligt ist
und eine maßgebliche Rolle für den komplikationslosen Übergang zwischen diesen
beiden gegensätzlichen Funktionszuständen des Uterus spielt, zunehmend an
Attraktivität gewinnt [63, 67, 76, 203], jedoch bis heute spekulativ bleibt. Aus der
Komplexität der dargestellten CRH-Wirkungen lässt sich somit ableiten, dass eine
Einzelmessung von CRH im Plasma zur Bestimmung des Frühgeburtsrisikos wenig
aussagekräftig ist. Eine Parallelmessung verschiedener Parameter, z.B. von CRH,
Diskussion 107
AFP, Fibronektin und Östradiol im Speichel, könnte möglicherweise zu einer
Steigerung des prädiktiven Wertes beitragen [26, 132].
4.2 CRH-Bioassay
Die Überprüfung der Bioaktivität von CRH ist keine triviale Angelegenheit, da die
Bioaktivität dieses Peptidhormons schon bei einem proteolytischen Abbau von zwei
Aminosäureresten auf <0,1% reduziert wird [134]. Bei Forschungsprojekten, die den
langjährigen Einsatz synthetischen CRHs erforderlich machen, erscheint es daher
sinnvoll und notwendig, zu kontrollieren, wie bioaktiv das Hormon nach Lagerung in
lyophilisiertem Zustand noch ist, zumal die Herstellerfirmen nur eine Garantie auf die
Reinheit, jedoch nicht die Bioaktivität geben. Geeignet sind für diesen Zweck die
Untersuchung der durch CRH angeregten ACTH-Sekretion in Hypophysenzellen und
die Bestimmung des Second Messengers cAMP. Als Teil der vorliegenden Arbeit
wurde die ACTH-Sekretion zweier Hypophysen-Zelllinien untersucht.
Bei Vorversuchen mit der Ratten-Zelllinie RC-4B/C1 blieben sowohl die basalen
Messwerte für ACTH als auch diejenigen, welche nach CRH-Stimulation bestimmt
wurden, unterhalb der Nachweisgrenze. Eine Überprüfung mittels RT-PCR und
Immuncytochemie ergab eine deutliche Expression von CRH-Rezeptor-mRNA sowie -
Protein. Eine weitere Abklärung, warum der Bioassay ergebnislos blieb, war im
Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich.
Die Hauptversuche wurden daher mit schwimmenden, nicht-adhärenten AtT20-
Mauszellen durchgeführt. CRH-Bioassays mit dieser Zelllinie wurden auch schon von
anderen Autoren unter unterschiedlichen Kulturbedingungen beschrieben [19, 70, 71,
120, 133]. In Vorversuchen wurde CRH-Rezeptor-mRNA in den AtT20-Zellen nachge-
wiesen.
Zur Optimierung der Methodik wurden im Rahmen dieser Arbeit die Kultur-
bedingungen für die AtT20-Zellen systematisch variiert. Da in den ersten 6 Stunden
nach Aussaat der Zellen große Schwankungen der Messwerte und erst danach ein
stabiler ACTH-Anstieg zu beobachten waren, wurde im Folgenden erst nach einer 6-
stündigen Vorinkubationsphase mit CRH stimuliert. Ein Vergleich zweier Kulturmedien
ergab für Ham’s F12 einen im zeitlichen Verlauf langsameren ACTH-Anstieg mit einer
Diskussion 108
geringeren Steigerungsrate gegenüber DMEM. Da unter diesen Bedingungen etwaige
Stimulationseffekte durch CRH besser zu erkennen waren, wurde entschieden, Ham’s
F12 weiter zu verwenden.
Es stellte sich heraus, dass das „alte“ CRH, das ca. zwei Jahre in lyophilisierter
Form bei -80°C aufbewahrt worden war, die ACTH-Sekretion nicht schlechter, sondern
sogar etwas gleichmäßiger stimulierte als das neue. Seine anhaltende Bioaktivität war
somit erwiesen. Das bedeutete, dass die schlechte Reproduzierbarkeit der
Prostaglandin-Stimulationsversuche auf andere Faktoren zurückzuführen war. Die
besten Stimulationseffekte wurden in AtT20-Zellen bei einer CRH-Konzentration von
10 nM beobachtet; in geringeren Konzentrationen eingesetztes CRH führte zu stark
streuenden Ergebnissen. Der Einsatz noch höherer Konzentrationen erscheint wenig
sinnvoll, da andernfalls eine zu große Diskrepanz zur physiologischen CRH-
Konzentration im Blutplasma (1000-10000 pg/ml am Geburtstermin) in Kauf genom-
men würde.
Obwohl die biologische Aktivität des eingesetzten synthetischen CRH zweifelsfrei
erwiesen wurde, da die durch CRH stimulierten ACTH-Werte durchweg höher lagen
als die basalen Konzentrationswerte, schränkten große Schwankungen der Replikat-
messungen – ähnlich wie bei den Prostaglandin-Untersuchungen – die Validität des
Assays ein. Dieses Problem wurde noch dadurch verstärkt, dass die Werte der
einzelnen, unter identischen Bedingungen durchgeführten Stimulationsversuche um
den Faktor 10 schwankten. Auch in weiterführenden Experimenten mit adhärenten
AtT20-Zellen gelang es trotz zusätzlicher Optimierungsschritte im Endokrinologischen
Labor nicht, dieses Phänomen auszumerzen [189]. Daher wurde ein CRH-Bioassay
etabliert, in dem die cAMP-Sekretion der AtT20-Zellen bestimmt wurde; dieser lieferte
zuverlässiger reproduzierbare Ergebnisse [190]. Wie Dr. Bernd Sehringer in Erfahrung
brachte, stellt die durch CRH stimulierte ACTH-Sekretion zwar eine wichtige
physiologische Funktion dar, ist jedoch im in vitro-Versuch eine schwierig zu
bestimmende Größe [99].
4.3 Methodische Aspekte
Die Übertragbarkeit von in vitro-Versuchen auf die physiologischen Zusammen-
hänge in vivo ist nur eingeschränkt möglich, da immer nur isolierte Teilsysteme
Diskussion 109
betrachtet werden können, die Umgebungsfaktoren und Wechselwirkungen der
einzelnen Parameter außer Acht lassen. Ferner ist bei Untersuchungen zu mutmaß-
lichen Stimulationseffekten einzelner Substanzen kritisch zu hinterfragen, ob die
Wirkung der exogen zugeführten Substanz nicht nur pharmakologische Effekte wider-
spiegelt. Rückschlüsse auf die physiologische Situation im Gesamtorganismus durch
die in vitro gewonnenen Erkenntnisse bleiben somit bis zu einem gewissen Grade
spekulativ.
Erschwerend kommt hinzu, dass in der humanen Geburtsforschung die Studien-
gruppen zwangsläufig sehr klein sind, da die Geburt ein speziesspezifischer Vorgang
zu sein scheint, der durch Tiermodelle nicht hinreichend erklärt werden kann. Die
Probengewinnung beim Menschen ist jedoch aus ethischen Gründen häufig nur einge-
schränkt möglich. So lässt sich z.B. myometriales Fundusgewebe bei Schwangeren
nur gewinnen, wenn im Anschluss an eine Sectio caesarea eine Hysterektomie durch-
geführt wird. Dies kommt sehr selten vor. Die geringe Anzahl vergleichbarer Proben
kann zu widersprüchlichen Ergebnissen führen.
4.3.1 Gewebekultur
Als Untersuchungsobjekt für die in dieser Arbeit beschriebenen Prostaglandin-
Stimulationsversuche diente nicht eine Zellkultur, sondern eine myometriale Gewebe-
kultur, da bei dieser die Gewebearchitektur noch weitgehend erhalten ist. Während es
bei einer Primärzell-Isolierung durch die Isolierungsprozedur und den Gewebeverdau
zu einer Veränderung der Zusammensetzung der Zellpopulation und der Eigen-
schaften der Zellen kommen kann, ist in einer Gewebekultur auch die Erkennung
indirekter Effekte durch parakrine Zell-zu-Zell-Signale möglich. Bei Zellkulturen besteht
eher die Gefahr, dass unerwünschte Effekte durch eine Reaktion der Zellen auf die
Manipulation während der Isolierung hervorgerufen werden. So wurde beispielsweise
von Lonsdale [114] eine starke Aktivierung der Cytokin-Synthese infolge des
Gewebeverdaus beobachtet. Gerade bei Prostaglandin-Untersuchungen könnte dieser
Effekt aufgrund der diversen Interaktionen zwischen Prostaglandinen und Cytokinen
zu verfälschten Ergebnissen führen.
Im Rahmen methodischer Untersuchungen wurden einige Aspekte der Versuchs-
bedingungen für die Kurzzeit-Myometriumkultur modifiziert. Ein Vergleich verschie-
Diskussion 110
dener Kulturmedien ergab bei Verwendung der gepufferten Salzlösung HBSS eine
größere Streuung der 6-keto-PGF1α-Konzentrationswerte innerhalb der Triplikat-
messungen als für das Vollmedium IMDM. Aus diesem Grund wurde entschieden, das
bis dato im Labor etablierte IMDM weiter zu verwenden. Das Umsetzen der
Myometriumbiopsien in frisches Nährmedium nach den ersten 6-7 Stunden der
Inkubation führte im Vergleich zur 6-keto-PGF1α-Sekretion nicht umgesetzter Proben
zu einer deutlichen Konzentrationsabnahme sowie zu einer stärkeren Abnahme der
Gewebevitalität (37,9% versus 50,3%). Daher wurde in späteren Versuchen die Haupt-
inkubationsphase nicht mehr unterteilt.
Die Vitalität der kultivierten Proben ist bei Gewebekulturen ein essentielles
Kriterium für die mögliche zeitliche Ausdehnung der Kultur. In dieser Arbeit durch-
geführte Untersuchungen zeigten eine stetige Abnahme der Gewebevitalität im
Kulturverlauf; nach 22 Stunden war sie bis auf 56% abgesunken. Eine Fortführung der
Kultur über mehr als 24 Stunden hinaus wäre also wenig sinnvoll.
Neben den genannten Vorteilen hat jede Gewebekultur auch klare Nachteile. So
ist ein limitierender Faktor für die Untersuchung der Wirkung exogen hinzugefügter
Substanzen deren begrenzte Eindringtiefe in das Gewebe. Dieser Schwierigkeit wurde
hier entgegengewirkt, indem die Myometriumprobe in kleine Stückchen geschnitten
und CRH im Überschuss hinzugefügt wurde. Außerdem wurde nach der Vor-
inkubationsphase das Kulturmedium gewechselt, um endogene Proteasen auszu-
waschen. Trotz dieser Maßnahmen ist ein proteolytischer Abbau und somit eine
Inaktivierung der hinzugefügten Substanzen vor Erreichen der Zielzellen unter den
durchgeführten experimentellen Bedingungen nicht ganz auszuschließen.
4.3.2 Interindividuelle Unterschiede
Als Kernproblem bei der Auswertung der Prostaglandin-Stimulationsversuche
manifestierten sich starke interindividuelle Schwankungen der Prostaglandin-Konzen-
trationswerte. Dabei wichen die Sekretionsmuster der einzelnen Patientinnen nicht nur
in den Absolutwerten, sondern auch prozentual stark voneinander ab. Auch der
Versuch einer Art internen Korrelation der 6-keto-PGF1α-Messwerte von Phase B auf
Phase A bzw. von Phase A auf die Werte vom Ausgangspunkt der Kultur bei 0
Stunden führte zu keiner einheitlich erkennbaren Zu- bzw. Abnahmetendenz im zeit-
Diskussion 111
lichen Verlauf. Eine mögliche Ursache für die große Schwankungsbreite der
Messwerte könnte in der Heterogenität des untersuchten Patientinnenkollektivs
begründet sein: Zwar wurden alle Myometriumbiopsien bei geplanten Schnitt-
entbindungen nach einem unkomplizierten Schwangerschaftsverlauf und vor
Einsetzen der Wehentätigkeit gewonnen, aber die genaue Phase der uterinen Aktivität,
in der sich die Patientin zum Zeitpunkt der Sectio caesarea befand, blieb unbekannt.
Es ist also ungewiss, ob sich der Uterus bei Gewebeentnahme noch weitgehend in der
Phase der Ruhigstellung, der Aktivierung oder kurz vor Eintritt in die Phase der
Stimulation befand.
Große Unterschiede der Konzentrationswerte verschiedener Patientinnen wurden
auch im Rahmen von CRH-Untersuchungen beschrieben. So fand McLean individuell
stark differierende CRH-Plasmaspiegel [132]. Inzwischen wurde entdeckt, dass die
Zugehörigkeit zu einer bestimmten ethnischen Gruppe mit Unterschieden des CRH-
Niveaus im Plasma einhergeht. Schwarze Amerikanerinnen haben beispielsweise
niedrigere CRH-Spiegel als Frauen anderer ethnischer Gruppen. Dennoch wurde auch
bei ihnen eine Korrelation zwischen einem erhöhten CRH-Spiegel im zweiten
Trimenon und einem erhöhten Frühgeburtsrisiko festgestellt [77]. Diese Erkenntnisse
deuten darauf hin, dass CRH ein sehr spezifischer, aber wenig sensitiver Indikator für
drohende Frühgeburtlichkeit ist, d.h. dass bei einem hohen Plasmaspiegel eine
Frühgeburt wahrscheinlich ist, ein unauffälliger Plasmaspiegel aber die Möglichkeit
einer Frühgeburt nicht ausschließt.
4.3.3 Prostaglandin-Assays
Eine weitere Dimension des Kernproblems der großen Schwankungsbreite der
Prostaglandin-Konzentrationswerte zeigte sich anhand starker Streuungen innerhalb
der Replikatbestimmungen. Der Versuch, diese intraindividuellen Schwankungen
durch Messung des Kulturüberstands einer größeren Anzahl von Parallelansätzen zu
minimieren, schlug fehl. Bei einer Messung von 18 Ansätzen schien sogar eine
Verstärkung des Problems aufzutreten. Ein derartiger zeit- und kostenintensiver
Mehraufwand ist also weder für eine bessere Interpretierbarkeit noch für eine
gesteigerte Reproduzierbarkeit der Stimulationsversuche zielführend. Da diese
Streuungen der Werte zumindest teilweise durch Gewebeinhomogenitäten der
kultivierten Myometriumproben, z.B. durch unterschiedliche Endothelanteile, bedingt
Diskussion 112
sind, ließe sich das Problem durch Untersuchungen in Zellkulturen reduzieren. Die
Verwendung von Myocyten-, Makrophagen- oder Endothel-Primärzellkulturen birgt
jedoch anders geartete Schwierigkeiten: Durch mögliche Veränderung der
ursprünglichen Zelleigenschaften und fehlende Interaktionen zwischen verschiedenen
Zelltypen werden Rückschlüsse auf die physiologische Bedeutung etwaiger CRH-
Wirkungen auf die Prostaglandinsynthese noch schwieriger als bei der Verwendung
von Gewebekulturen (s. 4.3.1).
Die hohe Intraassay-Variabilität der Prostaglandin-EIAs war möglicherweise zum
Teil darauf zurückzuführen, dass die Kontrollproben über die gesamte Mikrotiterplatte
verteilt wurden. Eine lange Pipettierdauer kann einen negativen Einfluss auf die
Messwerte haben, da bei Schritten mit kurzen Inkubationszeiten die ersten und letzten
Proben auf einer Mikrotiterplatte unterschiedlich lange inkubiert werden. In ca. der
Hälfte der Fälle führte eine Berechnung der Intraassay-Variabilität zu besseren
Werten, wenn statt aller 6-8 Kontrollproben nur die ersten vier in die Berechnung
einflossen. Es wäre also in Erwägung zu ziehen, alle Kontrollproben direkt
nacheinander zu pipettieren.
Weitere potentielle Störfaktoren, die zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der
Stimulationsversuche beitragen können, sind Pipettierprobleme, Randeffekte an der
Mikrotiterplatte, z.B. durch einen Temperaturgradienten, und Messungenauigkeiten
des EIA-Readers. Bei den hier beschriebenen Untersuchungen fielen Pipettier-
probleme nicht stark ins Gewicht. Die hauptsächlich verwendete Pipette wies einen
hervorragenden Vk von 1,6% auf, und der „Risikofaktor Mensch“ zeigte mit einem Vk
von 7% eine akzeptable Pipettierleistung. Randeffekte an der Mikrotiterplatte waren
ebenfalls nicht auffällig. Allerdings zeigte der EIA-Reader Messungenauigkeiten. Er
maß immer in der dritten Reihe (D) die höchsten Werte, wie anhand der Messung
einer um 180° gedrehten Mikrotiterplatte gezeigt wurde. Dieses Phänomen ist u.U.
durch ein nicht mehr exakt justiertes Linsensystem aufgrund gealterten Klebstoffs
erklärbar und wurde tatsächlich bei einer Überprüfung des EIA-Readers von der
Herstellerfirma diagnostiziert. Da die sechste Kontrollprobe bei der Plattenbelegung
immer in Reihe D platziert war, ist es nicht verwunderlich, dass in ca. der Hälfte der 6-
keto-PGF1α-Versuche die Intraassay-Variabilität besser wird, wenn nur die ersten vier
Kontrollproben in die Auswertung einfließen.
Diskussion 113
4.4 Ausblick
Obwohl in der vorliegenden Arbeit keine signifikanten CRH-Effekte auf die
myometriale Prostaglandinsynthese beobachtet wurden, können diese aufgrund der
methodisch bedingten starken Streuung der Messwerte dennoch nicht ausgeschlossen
werden. Weiterführende Untersuchungen mit einer verbesserten Methodik sind daher
notwendig:
Für eine größere Präzision der Prostaglandin-Messungen wäre es sinnvoll, einen
neuen EIA-Reader einzusetzen, die verwendeten Pipetten regelmäßig zur Kontrolle
einzuschicken, mit besonderer Sorgfalt zu pipettieren sowie in einer Versuchsreihe
immer die gleichen routinierten Menschen pipettieren zu lassen.
Um einen direkten Bezug zwischen dem histologischen Aufbau des Myometriums
und der Prostaglandin-Sekretion herstellen zu können, sollte die Biopsie einer
Patientin – soweit es die Größe zulässt – jeweils zur Hälfte für die IHC und zur Hälfte
für die Prostaglandin-Untersuchungen in Gewebekultur verwendet werden.
Ferner wäre eine Etablierung von Markerproteinen zur genauen Zuordnung, in
welcher Phase der uterinen Aktivität sich die Patientin befindet, hilfreich, um die
Homogenität des untersuchten Patientinnenkollektivs zu steigern.
Für ein tiefergehendes Verständnis der Mechanismen für eine dynamische
Regulation der CRH-Rezeptor-Subtypen sollten weitere Untersuchungen durchgeführt
werden, um beispielsweise die physiologische Bedeutung der unterschiedlichen
myometrialen G-Proteine und der Regulation und Interaktion ihrer Signaltransduktions-
wege zu eruieren. Auf diesem Gebiet sind noch viele Fragen offen, z.B. zur Bedeutung
des im Myometrium identifizierten Gαi.
Da die Betrachtung von Einzelparametern für umfassende Erkenntnisse im
Zusammenhang mit dem menschlichen Geburtsprozess offensichtlich nicht ausreicht,
könnten cDNA-Microarrays evtl. einen klärenden Beitrag leisten. Allerdings darf dabei
nicht vergessen werden, dass diese Methode lediglich die Beeinflussung der mRNA-
Menge verschiedener Zielgene abbildet, zudem aufwändig, teuer und nicht beweisend
für eine tatsächliche Expression funktionstüchtiger Proteine ist.
Diskussion 114
CRH spielt zweifellos eine wichtige Rolle beim Geburtsprozess. Dennoch bedarf
das Modell einer dualen Funktion dieses Hormons, das für den größten Teil der
Schwangerschaft eine ruhigstellende Wirkung auf den Uterus, in den letzten
Schwangerschaftswochen aber eine aktive Rolle bei kontraktilen Vorgängen postuliert,
weiterer Klärung. Bis zur endgültigen Entschlüsselung der miteinander verwobenen
physiologischen Interaktionen des Geburtsprozesses in all seinen Facetten ist es
sicherlich noch ein weiter, steiniger Weg, der sich jedoch zu gehen lohnt, um die Zahl
der Frühgeburten, die seit Jahren in den westlichen Industrieländern bei einem Anteil
von 7-15% stagniert, weiter zu senken.
Zusammenfassung 115
5 Zusammenfassung
Seit Mitte der Neunziger Jahre wird placentar gebildetem Corticotropin-Releasing
Hormone (CRH) eine wichtige Bedeutung für die hormonelle Steuerung der Geburt
beim Menschen zugemessen. Ziel dieser Arbeit war die in vitro-Untersuchung von
potentiellen parakrinen Effekten von CRH in menschlichem Myometrium zum Zeitpunkt
der Geburt. Dazu wurden in Kurzzeit-Gewebekulturen von Myometrium, das bei
Schnittentbindungen gewonnen wurde, Stimulationsversuche mit CRH mit der Mes-
sung von Prostaglandinen als Endpunkte durchgeführt. Als Nebenaspekte wurden
parallel die Wirkungen des CRH-verwandten Peptids und IL-1β untersucht. Weiterhin
wurde immunhistochemisch das Vorkommen verschiedener Zelltypen im Myometrium
sowie die Verteilung der CRH-Rezeptoren CRH-R1 und CRH-R2 untersucht. Zur
Überprüfung der Bioaktivität des eingesetzten CRH wurde ein Bioassay etabliert.
Ferner wurden im Rahmen der laborinternen Qualitätssicherung methodische Aspekte
im Umgang mit Gewebekulturen und Enzymimmunoassays (EIAs) adressiert.
Myometriumbiopsien aus dem unteren Uterinsegment wurden am Geburtstermin
bei primären Sectiones caesareae gewonnen und in 24-Stunden-Gewebekulturen mit
den Mediatoren CRH, Urocortin, und IL-1β inkubiert. Mittels EIA wurden der stabile
PGI2-Metabolit 6-keto-PGF1α und PGE2 im Medium quantifiziert. CRH, Urocortin und
IL-1β zeigten auf die Freisetzung von 6-keto-PGF1α keinen signifikanten Effekt. Die
Messergebnisse wiesen dabei eine hohe Streuung auf. Die immunhistochemische
Charakterisierung der untersuchten Myometriumproben mit einem Antikörper gegen α-
Aktin ergab einen Myocyten-Anteil von 55-65%. Die Leiomyocyten waren eingebettet
in ein Bindegewebsgerüst mit heterogen verteilten Gefäßen und Makrophagen. CRH-
R1 wurde außer im Bindegewebe in allen anderen Zelltypen der untersuchten
Myometriumproben immunhistochemisch nachgewiesen. CRH-R2 wurde in Myocyten
und Makrophagen, jedoch nicht im Gefäßendothel, angefärbt. Die biologische Aktivität
des eingesetzten CRH wurde durch Stimulierung von ACTH in einer Maus-Hypo-
physen-Zelllinie (AtT20) überprüft.
Der immunhistochemische Nachweis beider CRH-Rezeptoren im menschlichen
Myometrium stützt das Modell, dass placentares CRH über lokale, parakrine
Wirkungen an der hormonellen Steuerung der Geburt beteiligt ist. Im Rahmen der hier
vorgelegten Untersuchungen wurde jedoch kein signifikanter Einfluss auf die
myometriale Prostaglandinsynthese gefunden.
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228. Zuo J, Lei ZM, Rao CV, Pietrantoni M, Cook VD (1994) Differential cyclooxygenase-1 and -2 gene expression in human myometria from preterm and term deliveries. J Clin Endocrinol Metab, 79: 894-899.
Abbildungsverzeichnis VI
III Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Bauprinzip der Uterusmuskulatur. ..................................................................... 5
Abb. 2: Phasen der uterinen Aktivität während der Schwangerschaft und Geburt. ....... 9
Abb. 3: Die mütterlichen Plasmaspiegel von CRH und CRH-BP im Schwangerschaftsverlauf. ............................................................................ 13
Abb. 4: CRH-R1 beim Menschen mit seinen Spleißvarianten. .................................... 15
Abb. 5: Beobachtung der Prostaglandin-Synthese bei zweigeteilter Hauptinkubationszeit. a) basal (n=5), b) nach Zugabe potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β; n=3). .................................................. 40
Abb. 6: Beobachtung der Prostaglandin-Synthese bei nur einer Inkubationsphase. a) basal (n=4), b) nach Zugabe potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β; n=9). ....................................................................................................... 41
Abb. 7: Zeitlicher Verlauf der basalen 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium.......... 61
Abb. 8: Vergleich von IMDM und HBSS als Nährmedium für die Myometriumbiopsien in der Kurzzeit-Gewebekultur anhand der 6-keto-PGF1α-Sekretion.............. 62
Abb. 9: Basale und stimulierte 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium (109-113)..... 64
Abb. 10: Einfluss der Inkubationsart in der Kurzzeit-Gewebekultur auf die 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium (M100). .................................................... 65
Abb. 11: Zeitlicher Verlauf der basalen PGE2-Sekretion im Myometrium (M107)........ 67
Abb. 12: Qualitätsvergleich der Chromogene Romulin (A, C) und DAB (B, D) in immunhistochemischen Färbungen.............................................................. 69
Abb. 13: Immunhistochemischer Nachweis von Gefäßendothel in Myometrium mittels eines Antikörpers gegen vWF. ..................................................................... 70
Abb. 14: Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen im Myometrium mittels eines Antikörpers gegen CD68..................................................................... 71
Abb. 15: Immunhistochemischer Nachweis von Leiomyocyten im Myometrium mittels eines Antikörpers gegen α-Aktin................................................................... 72
Abb. 16: Immunhistochemischer Nachweis von Fibroblasten im Myometrium mittels Antikörper-Klon 5B5. .................................................................................... 73
Abb. 17: Misslungener Versuch eines immunhistochemischen Nachweises von Fibroblasten im Myometrium mittels eines Antikörper-Klon 3-2/B12. ........... 74
Abb. 18: Immunhistochemischer Nachweis von Fibroblasten in der Haut mittels Klon 3-2/B12......................................................................................................... 74
Abbildungsverzeichnis VII
Abb. 19: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R1 in Myometrium und Decidua...................................................................................................................... 76
Abb. 20: Artefakte bei immunhistochemischen Färbungen. ........................................ 77
Abb. 21: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R2 im Myometrium. ............... 78
Abb. 22: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R2 und Makrophagen in Decidua. ....................................................................................................... 78
Abb. 23: Immuncytochemische Lokalisation von CRH- und ACTH-Rezeptoren auf RC-4B/C1-Zellen. ............................................................................................... 79
Abb. 24: Zeitkinetik der basalen ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen. .......................... 80
Abb. 25: ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen im zeitlichen Verlauf nach Kultivierung in verschiedenen Nährmedien (DMEM und Ham’s F12). ................................. 81
Abb. 26: Stimulation der ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen durch Zugabe von CRH in verschiedenen Konzentrationen (0,1 nM, 1 nM, 10 nM)............................... 82
Abb. 27: ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen bei verschiedenen CRH-Stimulationsversuchen. ................................................................................ 83
Abb. 28: Vergleich des Stimulationseffektes durch „altes“, lyophilisiertes versus „neues“, gelöstes CRH auf die ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen. ............. 84
Abb. 29: Vitalität der Myometriumproben im zeitlichen Verlauf der Kurzzeit-Gewebekultur. .............................................................................................. 85
Abb. 30: Einfluss der Inkubationsart in der Kurzzeit-Gewebekultur auf die Vitalität der Myometriumproben. ..................................................................................... 86
Abb. 31: Basale 6-keto-PGF1α-Konzentration im Mediumüberstand von Parallelansätzen in der Kurzzeit-Myometriumkultur. .................................... 87
Abb. 32: Total-RNA von AtT20-Zellen. ........................................................................ 91
Abb. 33: mRNA-Nachweis von CRH-R1 (a) und Cyclophilin (b) in AtT20-Zellen......... 92
Abb. 34: Darstellung der dualen CRH-Funktion mit relaxierenden sowie kontrahierenden Effekten auf das Myometrium. ......................................... 106
Tabellenverzeichnis VIII
IV Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Übersicht über wichtige Prostaglandin-Effekte. ............................................... 19
Tab. 2: Klinische Daten und Gewebeverwendung der termingerechten primären Sectiones...................................................................................................... 34
Tab. 3: Klinische Daten und Gewebeverwendung der termingerechten sekundären Sectiones...................................................................................................... 36
Tab. 4: Inkubationsbedingungen in der Kurzzeit-Gewebekultur von Myometriumbiopsien zur Untersuchung der Prostaglandin-Synthese. ......... 39
Tab. 5: Konzentrationen (in pg/ml) der Prostaglandin-Standards. ............................... 44
Tab. 6: Kreuzreaktivitäten der in den Prostaglandin-EIAs verwendeten Antiseren mit anderen Eicosanoiden.................................................................................. 44
Tab. 7: Verwendete Primerpaare für die RT-PCR. ...................................................... 55
Tab. 8: Schwankungsfaktoren zwischen jeweils dem kleinsten und dem größten Einzelmesswert innerhalb einer Triplikatmessung........................................ 63
Tab. 9: Prozentuale Veränderungen der 6-keto-PGF1α-Konzentration im Verlauf der Kurzzeit-Myometriumkultur........................................................................... 66
Tab. 10: Intra- und Interassayvariabilität der EIAs....................................................... 88
Tab. 11: Berechnung der Intraassayvariabilität der 6-keto-PGF1α-EIAs mit allen versus den jeweils ersten vier Kontrollproben.......................................................... 88
Tab. 12: Kontrolle der im Labor verwendeten Pipetten und Vergleich der Pipettierleistung verschiedener Benutzer. .................................................... 89
Tab. 13: Vergleich von Einzelpipette, Multipette und Mehrkanalpipette und Überprüfung des EIA-Readers. .................................................................... 90
Danksagung IX
V Danksagung
Allen, die zum Entstehen und Gelingen der vorliegenden Arbeit beigetragen haben,
möchte ich meinen herzlichen Dank aussprechen!
Ich danke PD Dr. Wolfgang Schäfer für die Überlassung des Themas und seine Bereit-
schaft, mich trotz zahlreicher anderweitiger Belastungen bei der Niederschrift meiner
Arbeit zu unterstützen.
Prof. Dr. Dr. Ralf Gutwald danke ich für seine ermutigende Reaktion auf die Anfrage und
die Übernahme des Zweitgutachtens.
Bei Dr. Bernd Sehringer bedanke ich mich für die hervorragende fachliche Betreuung, die
praktische Anleitung sowie die vielen produktiven und fröhlichen Stunden im Laboralltag
(und beim Online-„Wer-wird-Millionär“-Spielen).
Den Mitarbeitern des Endokrinologischen und Klinisch-Chemischen Labors danke ich für
die freundliche Aufnahme in ihrer Mitte. Ganz besonders danke ich Eszter Benedek und
Claudia Nöthling, die mich mit viel Geduld, Humor und freundschaftlicher Herzlichkeit in
die praktischen Arbeitsabläufe einwiesen und zusammen mit Ruht Ziegler und Michael
Simon maßgeblich dazu beitrugen, dass die Zeit im Labor zu einer wertvollen Lebens-
erfahrung wurde.
Den Mitarbeitern des Cytologischen Labors danke ich für ihre Hilfe beim Einbetten und
Herstellen der Gewebeschnitte. Ein Dank geht außerdem an Dr. Feuerhake aus der
Neuropathologie für seine Bereitschaft, die ACTH-Färbung zu übernehmen.
Bei den Patientinnen, die ihr Einverständnis zur Entnahme einer Gewebeprobe gaben,
bedanke ich mich, dass sie diese Arbeit überhaupt erst ermöglichten. Danke auch an das
Kreißsaal- und OP-Team für die Unterstützung bei der Probensammlung.
Dr. Martina Weber-Timpe bin ich zu besonderem Dank für die vielen aufschlussreichen
Gespräche verpflichtet, mit deren Hilfe ich irgendwann tatsächlich schreiben konnte.
Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mich jahrelang ohne zu murren in meinen schein-
bar nie enden wollenden Doktorarbeitsbestrebungen unterstützt haben.
Ganz besonders herzlich bedanke ich mich bei meinen Freunden, die mit mir gelitten, sich
über kleinste Fortschritte mit mir gefreut haben und auch aus der Ferne in vielfältigster
Weise für mich da waren. Danke für all die aufbauenden Worte, persönlich, per SMS oder
Telefon, und für die Care-Pakete in der „Endspurt-Phase“. Besonders Astrid Moser und
Dorothee Reinfried danke ich für das tapfere (und schnelle!) Korrekturlesen.
Und schließlich gebührt ein riesengroßes Dankeschön meinem Freund Sven Hamel, der
nie aufgehört hat, an mich zu glauben, nie müde wurde, mich vom Boden wieder
aufzusammeln, meine Launen geduldig ertragen und mich mit tatkräftiger Hilfe in allen
Lebenslagen unterstützt hat, so dass ich diese schwierige Zeit (wider Erwarten) durch-
halten konnte.