studien über das choleragift

(Aus dem Hygienischen Institut der Universita~ Berlin. - - Direktor: Prof. M. Hahn)

Studien iiber das Choleragift.

Von Martin Hahn und Julius Hirsch.

Mit 6 Tcxtabbfldungen.

Inhalt . I. Zur Endo~oxinfrage (S. 356).

II. Ziiehtungsverfahren zur Giftgcwinnung (S. 357). I I I . Eigenschaften und Genese des Giftes (S. 364). IV. Anreicherung des Giftes durch Dialyse (S. 369). V. Uber das antitoxisehe Choleraserum (S. 373).

VI. l~ber das Cholerah~molysin (S. 375).

Wenn wir im folgenden unsere Beobachtungen mitteilen, 'die wir in mehrj~hriger Besch~ftigung mi t dem Choleragift gewonnen h~ben, so mSch~en wir yon vornherein betonen, daft wir weir davon entfernt sind, ein einigermafen abgeschlossenes Bild yon dem Gegenstande zu liefern. Wechselnde theoretische und praktische Gesichtspunkte haben uns bei unserer Arbeit geleitet, mannigfache Einzelfragen sind angeschnitten und zum Teil nur unvollst~ndig beantwortet worden. Die folgende Darstellung kann dahcr nichts anderes Ms eine Zusammenstellung unserer Versuchsergebnisse bieten und macht kein'en Anspruch darauf, die in der Li teratur niedergelegten vielf~ltigen und zum Teil widersprechenden Beobachtungen restlos zu kl~ren. Andererseits mSc}iten wir auch glcich eingangs betonen, dab manche unserer Ergebnisse und unserer praktischen Erfahrungen nicht nur fiir die Kenntnis des Choleragiftes, sondern fiir die der bak~eriellen Toxine fiberhaupt yon Bedeutung sein diirften.

I .

Schon vor 20 ffahren, als der eine 1 yon nns sich.mit der Darstellung yon Choleratoxin besch~ftigte, s tand im Vordergrund des Interesses die Frage, ob das Gi~* des Choleraerregers zu den ,,echten, sezelalierten" Bakteriengiften zu zahlen oder als ein , ,Endotoxin" (P]ei]]er) zu bezeich- nen sei. Die auch heute noch divergierenden Ansichten hieriiber linden einen deutlichen Ausdruck in der neuesten Auflage des Handbuches der

1 M. Hahn, Miinch. reed. Wsehr. 1906 und 1910, 736.

356 M. Hahn und J. Hirseh:

pathogenen Mikroorganismenl; einersei~s in dem yon KoUe und Prigge bearbeiteten Abschnitt fiber die Cholera asiatica, andererseits in dem Beitrag yon R. Kraus, ~ber Toxine und Antitoxine der Vibrionen.

Uns schein~, dab yon den beiderseits vorgebrachten Argumenten diejenigen am schwersten zu widerlegen sind, die als Gegenbeweise an- gefiihrt werden. Wenn die Anhtinger der Endotoxinlehre behaupten, dab das Choleratoxin erst dureh den Zerfall der Vibrionen in LSsung geht, so kann man das Gleiche yon den ,,eehten" Toxinen annehmen und das Vorkommen yon ,,sezernierten" Giften fiberhaupt in Frage stellen~, denn aueh die sekund~re Giftbildung aus dem Ni~hrsubstrat, wie sie Walbum und Dernby fiir das Diphtheriegift annehmen, setzt voraus, dal] erst spezi]isch wirksame Zellbestandteile (Fermente) aus- gelaugt bzw. ausgeschieden werden. Andererseits daft der Tatsache, dab , ,Endotoxine" bei allen Cholerastammen, 15sliehe Gifte aber bisher nur bei einigen wenigen nachgewiesen werden l:onnten, keine entscheidende Bedeutung beigelegt werden. Wir wissen, dab z .B . auch unter den Diphtheriestammen solche, die starke Gifte produzieren, au~erordentlich selten sind, und es erseheint nicht erstaunlich, dab bei einem erst in erheblich hSheren GrSi~enordnungen wirksamen Gifte, wie dem Choleratoxin, selbst der qualitative Naehweis meis~ens mi~lingt. Die Tatsaehe, dal] alle - - einschliel~lich der yon uns dargestellten - - Cholera- gif~e in ihrer wirksamen Menge um mehrere Zehnerpotenzen hinter der der sogenannten ,,eehten" Toxine zuriiekbleiben, diirfte auch der Grund daffir sein, dab erstens die Antitoxinproduktion entsprechend geringere Ausbeuten ergibt und dab zweitens die Geltung des Gesetzes der Multipla sich einem fiberzeugenden Nachweise entzieht.

Die Diskussion fiber die Frage, ob das Choleragift als Ekto- oder Endotoxin zu betrachten ist und ob iiberhaupt ein essentieller Unter- schied zwischen den ,,sezernierten" und den fest am Zellplasma haftenden Bakteriengiften bestebt, hat in ihrem Prinzip und auch in vielen beiderseits angefiihrten Argumen~en eine unverkennbare ~hnliehkeit mit einem Streite, der lange Zeit hindurch die biologische Forschung besch~ftigt hat. fd~ber den Unterschied zwisehen den spezifisch wirkenden gel(isten Enzymen und den sogenann~en ,,geformten Fermenten" finder sich in der alteren Fermentl i teratur eine Ffille yon widerstreitenden Theorien und jahrzehntelang hat dieses Thema im Mittelpunkt des Interesses gestand6n. )Taehdem einmal die Zymase, die als Prototyp der geformten Fermente gegolten hatte, yon der Hefezelle abgetrennt (E. Buchner und M. Hahn) und dadurch den gel6sten Enzymen gleich-

1 III. Aufl., 41, 1 und 2, 609 (1928); im Hinblick auf die neuerdings dort erfolgte Zusammenstellung der Literatur fiber das Choleragift sehen wir yon einer Wiedergabe der einsehlagigen Arbeiten ab.

2 2I. Eiwler, Z. Immun.forsehg 56, 209 (1928).

Studien fiber das Choleragift. 357

gestellt war, hat die fortschreitende Erkenntnis - - insbesondere unter Anwendung physikalisch-chemischer Gesichtspunkte und Methoden zu dem Ergebnis gefiihrt, dab ,,sich eine wirklieh haarscharfe Grenze zwischen den yon der Zelle an die umgebenden Medien abgegebenen Enzymen und den anderen, ganz lest an ihr haftenden Fermenten gar nicht ziehen l~Bt. t teute sind Ferment und Enzym v611ig gleichbedeutende Synonyma geworden" (C. Oppenheimera).

Es ist nicht nur der Paralle]ismus der angeffihrten Problemstellung, sondern anch eine geudsse biologische und physikalisch-chemische ~bereinstimmung zwisehen den Toxinen und Fermenten (beztiglich der Ge- nese, der spezifisch gerichteten Wirkung, der komplizierten Struktur), die uns zu der Meinung kommen liil]t, dab auch die Unterscheidung zwischen Ektotoxinen und Endotoxinen sich einmal als belanglos er- weist, wenfi unsere Kenntnis von den bakteriellen Giften im al!gemginen weiter fortgeschritten sein wird.

II .

Wir diirfen uns nieht dariiber t~uschen, dab - - selbst bei den klassischen Giftbildnern, dem Tetanus- und dem Diphtherieerreger - - die Funktion der Giftbildung vorerst noch .vollkommen undurchsic~ltig ist. Wir wissen nicht, warum gerade einige wenige St~mme in vitro Gift produzieren, die Mehrzahl jedoch - - trotz manchmal enormer kl[nischer Toxizit~tt - - i n der Laboratoriumsknltur versagt. Es ist uns nicht bekannt, welche Bedingungen fiir eine konstante und intensive Giftproduk- tion ausschlaggebend sind. I)ie Bereitung der )7~hrbSden fiir eine er- giebige Giftpr~iparation basiert aussehliei31ich auf rein praktischen Er- fahrungen und die zahlreichen Arbeiten, die durch Variation des Nahr. substrates eine reproduzierbare Steigerung der Gifterzeugung zu er- reiehen suchten, haben zu sehr widerspreehenden Ergebnissen gef/ihrt. Dem entspreehend bewegt sieh auch die industrielle Gewinnung yon Bakteriengiften heute noeh auI einer rein empirisehen Basis, deren Ein- faohheit und Unsicherheit an den frtiheren primitiven Stand der myko- logisehen Technik (z. B. der I-Iefefabriken, der Brauereien) erinnert, bevor die Einfiihrung wissenschaftlich fundierter Verfahren diesen In. dustriezweig zu seiner heutigen wirtschaftlich rationel]en Betriebsffih- rung befiihigte.

Auch beim Choleraerreger waren wir auf den Zufall angewiesen, der uns einen relativ giftigen Stamm auffinden lieB. Selbstverst~ndlich haben wir uns immer wieder bemtiht, aus einer groBen l~eihe yon St~immen giftbildende Erreger herauszufinden, was uns in einzelnen l~l len unter Anwendung anreichernder Verfahren auch gliickte. Stets maehten wir die Beobachtung, dab - - wenn i iberhaupt bei dem betreffenden Stamm

C. Oppenheimer, Die Fermente. V. Aufl., 1, 11 (1925). Zeitschr. L Hygiene. Bd. 110. ~4

358 M. Hahn und J. Hirsch:

eine Gif~bildung nachzu'weisen war u die Menge des Toxins yon der Z a h l der in der Kul tur lSsung vorhandenen Keimen abh~ngig ist. Das Ziel des anzuwendenden Ziichtungsveffahrens war also, ein schnelles und iippiges Anwachsen der Ku l tu ren zu erreichen.

Die LSsung dieser Aufgabe wurde du t ch die Ergebnisse yon Stoff- wechse]untersuchungen erleichtert, die der eine y o n uns an Cholera- kul turen auf chemisch definierten N~hrlSsungen un t e rnommen ha t te 1. Als Quelle der Energie fiir das W a c h s t u m k a n n der V. cholerae sowohl E iwe i~abbauproduk te (Pepton, Peptide, Aminos~uren) als auch Kohle- hyd ra t e ausnutzen.

Die energetische 3rerwertung stickstoffhal~iger Kohlenstoffverbindungen finder nut bei Kohlehydra$mangel statt und kann nur ausseh]ieBlich auf oxydativem Wege d.h. bei Gegenwart yon Sauerstoff vollzogen werden. Der Umsatz wird durch oxydative Abspaltung yon Ammoniak eingeleitet: R �9 CH �9 NH 2 �9 COOH ~ O

R �9 CO �9 COOH H- NHs. Stehen dagegen dem V. cholerae Kohlehydrate zur Verfiigung, so werden diese als energielieterndes Substrat den Eiweil~abbauprodukten bei weitem vorgezogen. Unter anaeroben Bedingungen wird aus den Kohlehydraten die Energie naturgem~B ausschlieBlich dutch Spaltungsvorg~nge gewonnen; aber auch untcr aeroben Bedingungen finder zu etwa 80% ein an- oxybiontischer Abbau des Zuckersubstrates start. Die Umsetzung verl~uft auf zwei ve~schiedenen und voneinander unahh~ingigen Wegen: 1, als Milchs&ure- g~rung: C~H1206 ~ 2Ct t a �9 CHOH. COOtt; 2. unter Aufspaltung der Hexose in Ameisens~ure, Essigs~ure und J~thylalkohol: Csttl~O ~ ~- H20 ~ 2 HCOOH

CHs- COOH -~ CH 3 �9 CH2OH. Bei Gegenwart yon Sauerstoff werden nur etwa 20% des umgesetzten Zuckers oxydativ ausgenutzt (veratmet).

Die aus der chemischen Analyse des Stoffumsatzes erwiesene Be- vorzugung der Kohlehydra te als Energiequelle fiir die Vermehrung des V. cholerae wird durch die E f fah rung best~tig~, dab dieser Erreger auf zuckerhal~igen N~hrmedien wesen~lich schneller und iippiger gedeiht als auf zuckeffreien. So enth~lt z, B. - - bei gleieher Einsaa~ - - eine 8sti indige Cholerabouillonkul~ur mi t einem Zusatz von 0,2 % Glu- cose 4 Milliarden K e i m e / c c m gegen 136 MiUionen/ccm der zuckerfreien l~i~hrlSsung. I m allgemeinen wird zwar zur Ziiehtung yon Vibrionen der Zusatz yon Koh lehydra t en zum N~hrboden nicht allzu hiiufig ange- wendet . Das aerophile Verhal ten der Erreger auf r e i n e n PeptonlSsungen, das zu der bekannten Anreicherung an tier 0berfl~che der N~hrfliissig- keit fiihrt, ist gerade fiir die prakt ische Choleradiagnose aul~erordentlich wertvoll und andererseits fi ihrt der Zuckerabbau eine sehr schnelle und eine so erhebliche Si~uerung des Milieus herbei, da$ schon nach kurzer Zeit die Kul~ur abst i rbt .

Aus der Tab. 1 geht liervor, d a $ in einer alkalischen Boui l lonkul tur schon ein Zuckerumsatz yon 0,2% - - t r o ~ z Gegenwar~ yon Phospha t - puffer - - eine s tarke Si~uerung hervorruf t .

. . . . ~ J u l i u ~ H i r s c h , Z . Hyg. 1@6, 433 (1926); 109,387 (1928) - - Klin. Wschr. 1926, l~r. 24.


Tabe]le 1. iV~hrl6sung: BouiUon, m/~ o Phosphatpuffer, T~ 8,2. Zusatz stelgender Glucosemenffen, gleichmSflig beimp/t mit einer Abschwemmung yon einer 24sti~ndigen AgarIcultur Cholera Calcutta 30. Unter anaerobeu Bedingungen bel 37 ~ 20 Stunden

bebri~tet. Naeh 20 Stunden:

Nr. Anf~nglicher Wachstum Glucosegehalt (Trfibung)

0,1% 0,2 % 0,4% 0,6% 0,8% 1,0% 1,5% 2,0%

q - § q - q - +

q - - b + q - - k + q - + +

+ §

1%hIingscho Reaktion

negativ ~9

(positiv) positiv

~9

~9

6,9 6,6 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8

impfen und zur Entnahme dient, ist wie ein Reagensrohr ab- flammbar, tr~gt in seinem verengten Mittelteil einen sterilen Wattepfropfen und ist mit einem Gummistopfen versehlossen. Wir lassen den Gasstrom durch das besondere, winkelig nach unten gebogene Abf/ihrungsrohr (A) aus$reten und nicht durch den langen Entnahmetubus, den wit deshalb gasdicht verschlossen halten; durch diese MaBnahme wird vermieden, dab der sterile Watteversehlufl des Entnahmetubus und der Tubus selbst dureh Kondenswasser befeuchtet wird, was im Hinblick auf die haufige ]~ntnahme fiir die ErhaRung

P l a t t e n a n s s t r i c h

Reinkultur

steril

~9

D a die K a p a z i t ~ t e iner P h o s p h a t p u f f e r k o n z e n t r a t i o n yon 1~ol/30 n ich t e inmal ausre icht , u m die aus der S p a l t u n g k le inerer Zuckermengen he rvorgehenden S~uren zu puffern, so b le iben fi ir d ie A u f r e c h t e r h a l t u n g e iner d e m V. cholerae zut r~gl ichen H - I o n e n k o n z e n t r a t i o n n u t zwei M6gl ichkei ten, sofern m a n den gi inst igen E f f ek t des Zuckers auf die W a c h s t u m s i n t e n s i t ~ t ausn i i t zen wil l : E n t w e d e r m a n z i ich te t u n t e r Zu- sa tz yon Ca l c iumca rbona t oder m a n kor r ig ie r t ]aufend die Ver / inderung

�9 der Mi l i eureak t ion d u t c h Zu t rop fen a lkal ischer L6sungen. Tro tz tech- n ischer Schwier igke i ten u n d t ro t z ze i t r aubender U m s t ~ n d l i c h k e i t h a b e n wir d iesen zwei ten Weg vorgezogen, da de r s o n s t / i b l i c h e K r e i d e z u s a t z die N~hr lSsung nu r auf schwach sauerer Reak~ion ha l t u n d bei gr61]eren F l f i ss igke i t smengen - - auch wenn m a n die L6sung ven t i l i e r t - - 6f~ers infolge ungeni igender Berfihrungsfl~che zu l angsam u n d d a m i t unvol l - k o m m e n in F u n k t i o n ~ri t t .

Zur Regutierung der Milieureaktion diente uns folgende Apparatur: Als ZtichtungsgefaBe werden die schon Irfiher 1 bcschriebenen Jenenser Kolben

(1/~--2 1) benutzt (Abb. 1), welche mat einem Gaszufiihrungs- rohr (Z), einem Gasableitungsrohr (A) und einem langen ~ , . J Tubus (TI) versehen sind. Dieser Tubus, welcher zum Be-

Abb. 1~ ZIlehtungs- kolben mit Zutropf-

vorrichtung.

einer Reinkultur yon wesentlicher Bedeutung war. Es sei auch bei dieser Gelegenheit bemerkt, dab - - bei der Ztichtung im Sauerstoffstrom - - der

1 Z. Hyg. 109, 403 (1928).

24*

360 I~L Hahn und J. t t irseh:

Entnahmetubus erst nach Entfernen des Wattestopfens abgeflammt werden darf, da sonst die Watte liehterloh abbrennt.

Ein zweiter kurzer Tubus (T2) dient der Zufiihrung der die H-Ionenkonzen- tration regulierenden F1/issigkeit. Dieser Tubus tr/~gt einen einfach durchbohrten Gummistopfen, dureh welchen eine dickwandige Tropfcapillare durehgefiihrt ist. Die Capillare ist ~ mittels eines mit Schraubklemme armierten kurzen Schlaueh- st/ickes ~ mit dem (gleichfalls capillaren) AbfluBrohr einer 250 cem fassenden Mariotteschen Flasehe (M) verbunden. Der Hals der Mariotteschen Flasche ist mit einem doppelt durchbohrten Gummistopfen versehen. Durch die eine :Bohrung geht die luftzuffihrende diekwandige Capillare, die zweite Bohrung dient dazu, beim Einsetzen des Stopfens einen Uberdruck zu vermeiden, der die Fliissigkeit durch die Luftcapillare rfiekw/irts herauspressen w(irde; in diese Bohrung wird zum endgiiltigen Verschlufl ein kurzer Glasstab gesteekt. Die Mariottesehe Flasehe hat - - im Gegensatz zum einfaehen Tropftriehter - - den Vorteil konstanter Aus- fluBgeschwindigkeit, so dab unter Benutzung der Klemmsehraube der ZufluB yon lXlatronlauge ffir einen bestimmten Zeitabsehnitt genau dosierbar is~.

Kolben und Mariottesehe tVlasche werden getrennt sterilisiert. In den im Trockensehrank vorsterilisierten Kolben wird die fertige, sterile N/~hrl6sung (jedoeh ohne Zuekerzusatz) noch heiB eingefiillt, in den kurzen Tubus wird der mit de~c ZufluBeapillare und ihrem zugeklemmten Verbindungsschlauch armierte Gummi- stopfen eingesetzt, der lange Tubus und die zu- und abfiihrenden Gasr6hren bleiben mit Wattepfropfen versehlossen und es erfolgt eine 8chluBsterilisation im Dampf- topf. Zum Bebrfiten benutzten wir einen groBen (50 1 fassenden) W'asserthermo- staten mit einem einfaehen Quecksilberthermoregulator an der Gasbeheizung. l~ach endgiiltiger Sterilisation wird der noch heifle Kolben in das ~Vasserbad versenkt, der Wattepfropfen des langen Tubus wird bis zur verengten Mitre ein- geschoben und dartiber wird mit einem Gummistopfen ein gasdichter VerschluI] hergestellt. ])as Gaseinleitungsrohr wird mit dem entspreehenden gaszuffihrenden Schlauch verbunden. Die Abktihlung crfolgt zweekm/~Big unter Ventilation (mit O~ oder 2q~), die w/ihrend der ganzen Dauer der Ziichtung fortgesetzt wird und die (neben biologischen Zwecken) der meehanisehen Durchmisehung der Kultur - - insbesondere beim Zutropfen :con Lauge - - client.

]3as fo r t l au fende Neu t ra l i s i e ren bzw. Alka l i s ie ren e iner in zucker- h a l t i g e r LSsung wachsenden K u l t u r e r fo rder t eine st~Lndige Kon t ro l l e de r H - I o n e n k e n z e n t r a t i o n . F i i r die e rs ten o r ien t ie renden Versuche bl ieb uns na turgemiiB n ich ts anderes i ibrig, als in kurzen Ze i t abs t~nden l~roben zur Fe s t s t e l l ung des p• -Punktcs zu e n t n e h m e n und den Zusa tz von N a t r o n l a u g e so zu regul ieren, d a b eine R e a k t i o n zwischen p ~ 8,2 bis 7,8 e ingeha l t en wurde .

I n dem K u r v e n b i l d 2 i s t der Ver lauf eines solchen Vcrsuches dar - gestel l t . Als N/~hrl6sung d i c n t bei d icsem Ansa t z 1 proz. Pe p tonw a sse r (480 ecm) m i t e inem P h o s p h a t p u f f e r g e h a l t yon 1/a 0 Mol. ; zugese tz t werden 0,18% Glucose. E t w a 31/2 S t u n d e n nach der Be impfung i s t die t I - I o n e n k o n z e n t r a t i o n yon p H 8 , 4 nach PH7,9 ve r sehoben ; de r Zus~atz yon 18 ccm n/10-Iqatronlauge s te l l t die K u l t u r auf p~ 8,2 ein. Iqach wei te ren 45 Minuten . is t bere i ts wieder PH 7,9 erre icht , auf den gleichen Zusa tz yon I~at ronlauge erfolg~ j e t z t nu r noch ehm Eins te l lung auf PH 8,1. I m wei teren Verlaufe muB die Zugabe yon l~a~ronlauge in

Studien tiber das Choleragift. 361

stets kfirzeren Zeitabst/~nden und in steigenden Mengen erfolgen; der korrigierende Effekt wird trotzdem immer geringer, l~ach etwa 51/2 Stun. den tritt ganz unmittelbar keine Vergnderung der korrigierten tt-Ionen. konzentration mehr ein, der Zuekergehalt yon 0,18% ist erschSpft und damit ist eine weitere Sguerung unmSglieh. Zum Vergleich ist in das gleiche Diagramm die Versehiebung der [H]'-Konzentration einer nicht regulierten Kulturl5sung eingetragen. Dutch derartige Versuehsreihen haben wir zun/~chst den zeitlichen Verlauf der pH-Sehwankungen, die Konzentration und die Menge der anzuwendenden Lauge und die Ge- sehwindigkeit des Zutropfens rein empirisch feststellen mfissen. Es liegt im Wesen des Ziichtungsvorganges, dab diese Feststellungen keine allgemein giiltigen Werte ergeben, sondern nur einen ungef~ihren A n h a l t s p u n k t ffir die unter bestimmten Ver- suchsbedingungen in Frage kommenden GrSBen. Jeder Kulturansatz zeigt - - selbst bei gleichem N/thrsubstrat - - einen besonderen Ablauf, z. B. in der Geschwindigkeit des Anwaehsens und in dem dadurch hervorgerufenen Substratumsatz. Zeitliche Sehwankungen im Einsetzen der Sauerung, die auch nur

215" q5 + 30+15+s '

J oe

8,2 go

%

\

%

~tundan

1 % P e p t o n w a s s e r m i t 0 , 1 8 % G l u c o s e . PH r e g u l i e r t , - - - - ~ H n i c h t r e g u l i e r t .

Abb. 2. Verhalten der H-Ionenkonzentration mit und o h u e R e g u l i e r u n g .

um 20--30 Minuten differierer~, sind durchaus m6glieh und miissen selbstverst~ndlieh beaehtet werden. Die gr6$te Schwierigkeit liegt darin, dal3 bei fortsehreitender S~ureproduktion die Menge der in der Zeiteinheit er- forderliehen Natronlauge keineswegs konstant ist. DiG Gr61]e des Zucker- umsatzes bzw. die S~urebildung steigt mit waehsender Keimzahl und zwar solange etwa, bis die grSBte Keimdichte erreieht ist, dann abet wird die S~iuerung ziemlich pl6tzlieh aul3erordentlieh verlangsamt, so da6 zu diesem Zeitpunkt ein weiteres Zutropfen yon Lauge leicht zu einer -0beralkalisierung fiihren kann. AuBerdem verl/tuft der chemische Vorgang der Abs~ttigung bei fortschreitender Neubildung yon H-Ionen' keineswegs so, dab eine einfache lineare Beziehung zu der ftir dig Ein- haltung einer bestimmten H-Ionenkonzentration notwendigen Laugen- menge besteht. Zu Beginn der Umsetzung ist der zugesetzte Puffer noeh an dem Ausgleich der Sehwankungen beteiligt, bei fortschreitendem

362 M. Hahn und J. I-Iirseh:

Zuckerzerfall wird jedoch die Kapazigit des Puffers gegeniiber den 1LI- Ionen sehnell erschSpft sein. I n der N/s reiehert sieh ein Gemisch mehr oder weniger dissoziierter ameisensaurer, essigsaurer und milch- saurer Salze an, so dab eine fortsehreitende, aber unberechenbare Ver- t~nderung der Konzentration der freien Ionen stattfindet.

Wir sehen davon ab, die zahlreichen Ans~tze im einzelnen aufzuftih- ren, aus denen die Sehwierigkeiten beim Regulieren der Milieureaktion hervorgehen. Der wechselnde Grad der S/~uerung, der jedesmal yore Umfang des Zuckerumsatzes bzw. yon der Wachstumsintensit/~t ab- h~ngt, zeigt sich darin, dal] zur Aufrechterhaltung einer neutrMen bis alkalisehen Reaktion ftir 400 eem Kultur Mengen yon 50--170 ccm ~/,n-Natronlauge, ffir 1000ccm Kultur Mengen yon 150--300 ccm 3/4 n-Natronlauge gebraueht werden. Eine gewisse Steuerung des S~ue- rungsprozesses wird dadurch erreicht, dal3 der anf/~ngliche Zuckergehalt der KulturlSsung nieht fiber 0,2% angesetzt wird. Hierdurch wird auf jeden Fall vermieden, dab - - selbst bei sehr sehnellem Anwaehsen der K~fltur - - eine vorzeitige, das Waehstum und die Giftbildung irreversibel sch~digende ~bers~ue~ng eintdtt . Der fiir den weiteren Energiebedarf beuStigte Zucker wird beim Neutralisieren - - gelSst in der neutralisieren- den Lauge (und zwar in einer Konzentration yon 3,3 bzw. 4,5% ~) - - der Kultur zugeffihrt.

Der enge Zusammenhang zwischen Keimvermehrung mad S~uerung geht aus folgendem tabellarisehen Versuchsprotokoll hervor:

Tabelle 2. Versuch Nr. 4. Ndihrl6sung: 400 ccm Bouillon, enthaltend 0,05% Glucose und 1/, 0 Mol Phosphatpu//er, Trr 8,4. Beimp/t mit Cholera P. Ziichtung im N-Strom.

Nach Zahl der Keime Stunden PH (direkt geziihl$)

2 3 4 5 51/, S"/4

10 25

8,4 8,4 8,1 8,2 8,1 8,0 8,1 8,3

Beginn des Zutropfens einer n/2-NaOH mit 3 proz. __> Glucosegehalt

ZUnehmende Tropfgesch~%digkeit SchluB des Zutropfens z "~

1,2- 10: 1,9 �9 l0 T 4,2.107 6,0. l0 s 1,8.109 2,0.10 ~ 2,2.109

Dementsprechend sind bei der praktischen Zfiehtung beziiglieh der Laugenzugabe 3 Phasen zu beobachten: die 1. Phase, in der das Puffer-

1 Die entsprcchend konzentriertcn L6sungen der Lauge und des vorher sterilisierten Zuckers werden erst vor dem Zutropfen vermischt; die auftretende Gelbf~rbung (Karamelisicrm~g) ist belanglos.

In der 4. his 10. Stunde nach erfolgter Einsaat werden im ganzen 78 ccm a/2-NaOH zur Erhaltung einer Reaktion zwischen Pa 8,0--8,1 der Kultur zu- gesetzt.


system zur Aufrechterhalbung der an/angliehen H-Ionenkonzentrat ion ausreicht und die - - je naeh der Kapaziti~t des Puffers - - ungefahr, die ersten 2 - -4 Stunden nach der Beimpfung umfal3t; die 2. Phase, die mit der_i~derungder H-Ionenkonzentration beginnt und in der zur Erhaltung einer alkalischen l~eaktion ein steigender Zusatz yon Lauge erforderlich ist; die - - etwa 10 Stunden nach der Einsaat beginnende - - 3. Phase, in welcher nach Absehlul3 der Keimvermehrung die bestehende H-Ionen- konzentration keine erhebliehe :a~nderung mehr erleidet. Mit Beginn dieser letzten Phase, in deren weiterem Verlaufe die Absterbevorgange in den Vordergrund riicken, ist der Zusatz yon Lauge zu unter- brechen.

Wie das angefiihrte Bcispiel (Versuch 2qr. 4) zeigt, gelingt es, mittels der Zutropfmethode, innerhalb der 2. kritischen Phase die H-Ionenkonzen- t rat ion konstant zu erhalten. ])as Verfahren ist jedoch in der besehrie- benen Form aul~erordentlich umst~ndlich und mit einer erheblichen Unsicherheit behaftet. Selbst bei kurzfristigen PH-Kontrollen gelingt es nicht immer, die Tropfgeschwindigkeit a u / d a s richtige Tempo ein- zustellen, auch wenn man - - a u f Grund zahlrcicher Beobaehtungen konzedieren daft, dab sich die pa-Schwankungen in einem bis zum Neutralpunkt reichenden Gebiete bewegen. Eine wesentliehe Verein- fachung und Verbesserung des Verfahrens konnten wir dureh den Zusatz eines Indicators zur Kulturl6sung erreichen. Wir benutzen als Indicator Phenolrot, welches im p~-Gebiet yon 8,4--6,8 e inen Farbenumschlag yon rot - -gelb aufweist. In einer Konzentrat ion yon 0,4 mg in 100 ecru ~IahrlSstmg zeigt der Farbstoff eine ausreichende Intensi tat und hemmt weder das Bakterienwaehstum noch die Giftproduktion. An die Stelle der Stichproben, welche lediglich die an einem bestimmten Zei tpunkt herrschende H-Ionenkonzentrat ion anzeigen kSnnen, t r i t t die kontinuier- liche Kontrolle der Milieureaktion durch Beobachtung des Indicators. Die jeweilige Gesch~4ndigkeit des Laugezusatzes wird so reguliert, dal~ der bei der anf~nglichen H-Ionenkonzentration yon ion 8,2---7,9 bestehende rote Farbton der LSsung wShrend der ganzenWachstumsperiode e~hal~en bleibt. ~ach einiger ~bung, die ja fiir alle eolorimetrischen Methoden erforderlich is~, gelingt es unschwer, die Reaktionssehwan- kungen der wachsenden Kul tur zu meistern; die Beobachtung wird dadurch erleiehtert, dab man den Boden des Wasserthermostaten mit weil~en Fliel~en auslegt.

]:)as besehriebene Zfichtungsverfahren, welches durch den fraktio- nier ten Glucosezusatz und durch d i e gleiehzeitige Aufrechterhaltung einer alkalischen l~eaktion charakterisiert ist, erm6glicht dem V. eholerae eine intensive Ausnutzung der Kohlehydrate, ohne dal3 eine Selbst, vergiftung der I~ultur eintf i t t ; 6--10 Stunden nach der Beimpfung ist eine maximale Vermehrung der Choleravibrionen erreicht.

'364 1~. Hahn und J. Hirsch:

Gleichzeitig war mit dieser Methode die MSglichkeit gegeben - - den Lebensbedingungen des Choleraerregers im infizierten Darm ent- spr'eehend - - die Ziichttmg der Vibrionen unter streng ana~roben Be- dingungen durchzufiihren. An diese M6glichkeit ba t ten wit urspriing- lich gewisse Hoffnungen beziiglich einer Steigerung der Giftmenge ge- knfipft. Es ha t sich jedoch ergeben, dab ein Untersehied zwisehen aeroben u n d anaeroben Kul turen auf zuekerhaltigen N/ihrlSsungen in der Gift- ausbeute nicht bes~eht, und da2 sieh eine besondere S~uerstoffempfind- lichkeit des Giftes nicht naehweisen l/~l]t.

Bisher ist es uns nicht gelungen, einen Cholerastamm ausfindig zu machen, der auf chemisch-de]inierten N/ihr]Ssungen gedeiht, wie wir sie zum Studium der Stoffwechselvorgis bei anderen Cholerast/s b e n u t z t haben, und der gleichzeitig stark Gift bildet. Der yon uns in e rs te r Linie zur Giftproduktion herangezogene S tamm P kann mi t Asparagins/iure als einziger N-Quelle nicht auskommen. Andererseits ist es mfglieh, den Peptonzusatz der iibliehen Bouillon durch Asparagins/~ure z u ersetzen, ohne dab - - bei ausreichender K o h l e h y d r a t v e r s o r g u n g - die Wachstumsintensit~t und die Giftproduktion des Stammes wesent- lieh herabgesetzt w~rd. Wenn auch die - - aus theoretisehen Griinden so erstrebenswe~%e - - Giftproduktion auf chemisch definierten Sub- s traten bisher nicht zu erreichen ist, so bietet die Ausschaltung des Peptons wenigstens den praktischen Vorteil, da~ die aus peptonfreien Kul turen hergestellten Trockenpr~parate sich weniger hygroskopiseh verhalten; als Ersatz des fibliehen l proz. Peptongehaltes des Fleiseh- wassers genfigt eine Menge yon etwa 0,3 % Asparagins~ure, so dal3 auch das Troekengewicht der N~hrl6sung verminder t wird.

I I I .

Die Auswerbung des Choleratoxins erfolgt am Meersehweinehen (200--220 g)l durch intraperitonea]e Injektion. Die Kn] tur wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren (Seitzfilter) yon den Bakterien befreit ; die noeh in der klaren L6sung befindliehen Keime werden - - durch Ventilation mittels eines durch ein Chloroform-Toluolgemisch geleiteten Luftstromes - - abget6tet . Als einfach t6dliche Dosis wird diejenige kleinste Menge bezeichne$, die ein Meersehweinehen yon 200--220 g innerhalb 24 Stunden unter den charakteristischen Vergi/ tungssympto- men t6tet.

Die markanteste Wirkung des Giftes am Meerschweinchen ist, wie schon seit P]ei/]ers Untersuchungen bekannt, der - - im Anschlul~ an die intraperitoneale

1 l~ber die Wirkung des Giftes auf das Kaninchen und auf den iiberlebenden 'Kaninchendarm haben wit bcreits kurz berichtet (Klin. Wschr. 11927, Nr 7 und 1928, Nr 52); eine ausffihrliehe Darstellung wird in einer besonderen _hrbeit erfotgen.


Injektion einsetzende - - initiale Temperatursturz, der innerhalb 2--3 Stunden die K6rpertemperatur des Tieres auf bis manchmal 30 ~ herabsinken l~Bt (siehe Abb. 3). Gleiehzeitig zeigt das vergiftete Tier in seiner K6rperhaltung eine allgemeine Erschlaffung: es ,,sitzt" nieht mehr, sondem ,,liegt" auf seiner hinteren KSrperpartie, w~hrend es sich mib den vorderen Ex~remit~ten aufrech~ bMt; dabei bestehen keineswegs eehte L~hmungen der hinteren :Extremit~ten. ~T~hrend der Muskeltonus im allgemeinen abnimmt, tritt infolge reichlicher Exsudation in die Bauebh6hle eine lokale Spannung der Bauehdecken auf; die Exsudation er- streckt sieh h~ufig aueh auf die Conjunctiven.

Nur bei Injektion eines Vielfaehen der einfaeh t6dlichen Dosis ffihren diese Symptome - - innerhalb 6---10 Stunden - - unmittelbar den Tod des Tieres herbei (siehc Abb. 4, I I und III). Im allgemeinen q0 f I~B~ um die 3. Stunde nach der Intoxikation 7~mp I der progressive Charakter der Symptome - - und 39 - ~ Vsz$-o,tr zwar ziemlich pl6tzlich - - nach: die Temperatur 3a h6r$ auf zu sinken, oft steigt Sie um 2--3 ~ an, im Falle einer nichtt6dliehen Dosis kehrt sie 3~ mehr oder weniger schnell zur normalen H6he 36 zurfick. Mit dem Stills~and des Temperaturstur- zes 1/~flt auch die Erschlaffung der hinteren Ex- 35 tremitaten wieder nach. Stundenlang sitzen die 3q Tiere zusammengekauert mit gestr/~ubtem Fell, ohne dab sieh ein Fortsehritt der Vergiftung 33 ~ '~T ~<ge.St M5,~5-.ll5r wahrnehmen 1/~l]t. Dann tritt eine allgemeine 32 Hinf/~lligkeit ein, die Tiere sind nieht mehr at f " '""- , imstande, sieh aus der Seitenlage aufzurieh- ~,~,,~ " ~13St ten, ein krampfartiges Zi~tern setz~ ein. 30 T ~ t ~ u Die Tiere sinken mit ausgebreiteten erschlaff- g8 ten Extremit~tten zusammen und - - zu- meist unber Atmungskr/~mpfen - - tritt der 28

lO V2Sr Tod ein. tcsz~accm

Die 8ektion ergibt: Exsudat in der Baueh- 2 3 * S a h6hle, manehmal aueh im Brustraum, fibrinOs- Abb. 8. Giftwirkung der 25 std. Kul- eitrige Bel/~ge auf der Leber und zuweilen tur Nr. 4. ]-Iypergmie der Dfinndarmschlingen. R6tung und Vergr6Berung der Nebennieren werden nicht in a]len F/illen beobachtet.

Es kommt nicht allzu selten vor, dab Meersehweinchen, die fiber 20 Stunden lang sieh in dem station/~ren Zustand bei einer K6rpertemperatur yon 33--35 ~ befunden haben, am 2. bis 3. Tage nach der Intoxikation sich wieder vollkommen erholen.

Die Wirkung des Choleragiftes auf das bleerschweinchen verlt~uft unter dem Bilde sines akuten Anfalles, dernur relativ kurze Zeit dauert, u n d der n u t bei ~ b e r f l u t u n g mi t erheblichen Gif tmengen unmi~te lba r zum Tode fiihrt . I m al lgemeinen folgt ein I/~ngerer station/~rer Z u s t a n d ; die Vermu~ung lieg~ nahe, dab h i emaeh der Tod n ieh t infolge p r imgrer Gif twirkung, sondern un t e r dem sekund~ren F, influB irreversibler Sch~i- d igungen eintrit~. Es mag dahingestel l t bleiben, ob die a k u t e n Ver- g i f tungssymptome des Meersehweinchens mi t der s o g e n a n n t e n ,,Cholera sieea" des Menschen vergleiehbar s ind; auf jeden Fa l l werden Dureh- f/~lle beim Meerschweinchen nach in t raper i tonea le r App l ika t ion des

366 M. Hahn und d. Hirsch:

Giftes selten beobachtet. Dagegen treten Durchf~]le etwa 20 Stunden nach 8ubcu taner Giftinjektion auf. Vom Unterhautzellgewebe aus - - i n (iem sich enorme Infiltrationen bilden - - wirkt das Gift nicht akut (temperatursenkend). Die subcutane Dosis letalis betr~gt etwa das 10fache der intraperitoncal wirksamen Menge.

Die eiIffach tSdliche Dosis (ip.) des Choleratoxins konnten wir - - freilich nicht immer - - bereits in 0,25 ccm der - - yon Bakterien be- freiten - - K u l t u r l S s u n g nachweisen. :Fiir den zeitHchen Verlauf der Giftbildung Jst die Wachstumsintensit~t der Kul tur yon Bedeutung; je rascher und dichter die Kultur anw~chst, desto friihzeitiger ist das Gift nachzuweisen. I n den unter Glucosezusatz ~ nach dem geschilderten Verfahren - - geziichteten Kulturen ist eine deutliche Toxinwirkung schon nach 6--10 Stunden zu erkennen, sobald n~mlich die maximale Keimdichte erreicht ist. I n zuckerffeien Ansi~tzen verli~uit die Gift. bildung wesentlich langsamer und liefert - - bei geringerem Wachstum -- geringere Giftausbcutcn.

Einen ttinweis auf die Genese des Toxins und ihren zeitlichen Ab- lauf gibt folgende Versuchsreihe: Aus einer wachsenden Kultur (Nr. 4, s. S. 362) werden nach 51/~--10--25 Stunden Proben entnommen und bis zur Kl~rung zentrifugiert. Die L6sungen werden yon den Bakterien- niederschl~gen getrennt. Die Bakterien werden in der gleichen Menge physiologischer Kochsalzl6sung wieder suspendiert. LSsungen und Sus- pensionen werden mit Chloroform sterilisier~ und je 2 ccm werden einem Meerschweinchen intraperitoneal injiziert.

Tabelle 3.

: 2 ccm klare L~sung Baktefien aus 2 ccm

Kultur Meer' [ Keim.zahl ~ Meer- .Nr. 4 schwein- I Wirkung (direkt schwein- Wirkung

chert gez~hlt) chert

51/2Std.

10 Std. 25 Std.

Nr--.567-Temperatursturz fiherlebt

,, 569 tot n. 12 Std. ,, 571 tot n. 7 Std.

3,6- I0 ~

4,4.109

kNr.568

,, 570 ,, 573

TemperaSursturz fiberleb~

keine Erscheinungen keine Erscheinungen

Ein ansohauliches Bild gibt der Verlauf der Temperaturkurven (Abb.: 4). �9

51/~ Stunden nach der Beimpfung ist die ~oxische - - temperatur- herabsetzende - - Wirkung der bakterienfreien L6sung ebenso grol~ wie die der dal4n gewachsenen Keime. Nach 10stfindiger Ziichtung hat die Toxiz i t~ yon 2 ccm L6sung deutlich zugenommen, w~hrend die ent- sprechende (urn etwa 12% erhShte) Keimzahl keine krankha~ten Er- scheinungen mehr auslSst. Der ]~akterielmiedersch]ag aus 2 ccm der

1 Die Keime wurden in der Zeissschen Zi~hlkammer im Dunkelfeld gcz~hlt:

Studlen iiber das ChoIeraglft. 367

25stiindigen Kul tur ist ebenfalls vollkommen unwirksam. Ein Vergleich der Xurve I mit der ihr entsprechenden Kurve der Abb. 3 (S. 365) zeigt die auBerordentliche Steigerung der Giitproduktion innerhalb 20 Stun- den: w~hrend an.fangs 2 ccm eine tSdliche Wirkung nicht hervorzurufen verm6gen, b e t r ~ die Dosis letalis 0,25 ecru. Eine deutliche Gift- produktion beginnt erst, sobald die maximalc Keimzahl erreicht ist. Mit einiger Wahrscheinlichkeit darf man annehmen, dab in der eigent- lichen Wachstumsphase - - im vorliegenden Falle des Versuehes 4 in

~ 3s _ a " / /

" t 2 33

32

8O

g9

g8

I I I . I I

3tund~n I. 5~/2std. K u l t u r N r . 4. II . 1 0 s t d . K u l t u r Nr. 4. I I I . 25std. K u l t u r N r . 4 .

1~I. 567, 2 com. ~ ~L 569, 2 ccm, ~ M. 571, 2 ccm, - - M. 568, 8 ,6 .109 t 12Std . t 7 $ t d .

Keime(aus2ccm) . - - M. 570, 4,4-'109 - - M. 573, Keime Keime (aus 2ccm). (aus 2 ccm).

Abb. 4. Gi f twi rkung der Kul tur lSsung und der Bakter lem

den ersten 51/2 Stunden (s. Tab. 2, S. 362) - - die Giftbildung auBerordent- lich gering ist, dab also der Proze• sich zeitlich haupts~chlich in der ,,Absterbephas~" vollzieht. Es liegt naturgem~l] nahe, die Ents tehung des Giftes auf den Zerfall der Vibrionen zuriickzufiihren. Ein Blick auf die Kurven I und I I der Abb. 4 zeigt jedoch, dab auch die zhhlbaren Bakterien, yon denen ja nicht allc vermehrungsf~hig sind, cntgiftet werden, also Gift ,,abgeben". Dieser Vorgang k, a n n als Auslaugung der bereits im Absterben begriffenen, aber noch z~hlbaren Keime gedeutet werden. Die Lebensf~higkeit solcher ,,entgifteter" Keime muB noch geprfift werden; ihre Best~tigung wfirde jedoch keineswegs eine aktive ,,Giftsekretion" beweisen. Unsere Kenntnisse yon den physikalischen Eigenschaften der Bakterienoberfl~iche sind bisher im allgemeinen viel


zu unsicher, um entseheiden zu k6nnen, ob es sich hierbei um eine Sekretion, eine Ext rak t ion oder um einen Defekt der Zelloberflache handelt. Diesc Unsicherheit in der Beurteilung der Genese besteht - - unseres Erachtens - - auch heute noch ffir die klassischen Toxine, das Diphtherie- und dam Tetanusgift , so dab - - nieht nur aus den bereits (S. 356) dargelegten Grfinden - - d i e fibliche Unterscheidung zwischen Ekto- und Endotoxinen wenig berechtigt erscheint.

l~icht immer wird die maximale Giftmenge schon nach 24stiindiger Kul tur erreicht; die Zunahme der Toxizitat k a n n s i c h bis zum 3. bis 4. Tag hinziehen. Ebensowenig wird in allen Ansatzen desselben Stammes eine gleich groBe Giftausbeute erzielt. Eine gewisse Inkonstanz ist auch in der Bestandigkeit des gelSsten Giftes festzustellen. Wir haben in einzelnen Fallen beobachtet , da~ Kulturen fiber eine Woehe lang bei 37 ~ den erreichten Giftwert beibehielten; manchmal laBt die Toxizi tat sehon am 1. oder 2. Tage nach. Auch die Empfindlichkeit des gel6sten Toxins gegenfiber Warmeeinwirkung ist zeitlich erhebliehen Schwan- kungen unterworfen; manchmal wird das Gift naeh 2 oder 10 oder 15 Mi- nuten langem Erhitzen (100 ~ wirkungslos, zuweilen m u ] fiber 1/~ Stunde erhitzt werden. In dem dnrch Berkefeld-Kerzen gewonnenen Ultra- fil~rat ist das Gift nieht naehzuweisen; wenigstens tu f t das Fi l t ra t einer GiftlSsung, welehe mit 0,25 ccm ein Fieersehweinehen in 18 Stun- den tStet, mi t der doppelten Menge keine Erscheinungen hervor.

Alle diese Erfahrungen deuten darauf hin, dab das Choleragift zu jenen hoehmolekularen Substanzen geh6rt, deren Bestandigkeit in waBriger LSsung yon einer gro{len Zahl wechselnder Faktoren ab- hangig ist, z. B. der H-Ionenkonzentrat ion, dem Salzgehalt der LSsung, der Gegenwart anderer (Schutz-) Kolloide oder oberflaehenaktiver Stoffe ~.

Dieser lubile Charakter des gel5sten Choleratoxins macht sich vor allem stSrend bemerkbar , wenn es darauf ankommt, auf langere Zeit hinaus Prapara te mi t konstanter Giftwirkung in Handen zu haben. Mit t t i lfe des yon W . Gaede und W . S t r a u b 2 konstruie1~en Laborator iums- apparates zu Schnelltrocknung gelingt es, ohne wesentlichen Gif~verlust die flfissigen Kul turen in ein wirksames Troekentoxin zu fiberffihren. Wir haben auf diese Weise Pr~parate gewonnen, deren Dosis letalis auf Monate hindus 20--30 mg betragen hat. Da diese Prapara te sub- stantiell nichts anderes Ms getrocknete NahrlSsungen darstellen, so bestehen sis im wesentliehen aus anorganischen nnd organischen Salzen, unzersetztem Zucker, Eiweil3abbauprodukten und Extrakt ivs toffen;

1 In diesem Zusammenhang sei auf die - - auch yon Ornstein beobachtete - - Erscheinung hingewiesen, dab gifthaltige KulturlSsungen einen sehr best~ndigen, feinblasigen Schaum zeigen.

2 W. Gaede und W. Straub, Biochem. Z. 1165, 247 (1925).

Studien fiber das Choleraglfk 369

ihr Aschegeha l t allein betr~gt 50%. Der gewichtsm~iBige Antei l des Giftes dfirfte im Vergleieh zu dem der Ballaststoffe verschwindend klein sein.

IV.

Wir haben versucht , durch Dialyse m6glichst viel von den Ballast- stoffen zu entfernen, u m das Gift anzureicheml. Vorversuche zeigten uns, daft das Toxin die P e r g a m e n t m e m b r a n nicht merkbar durehwander t (Tab. 4).

Tabelle 4. Versuch 2tr. 9. Dos. let. 0,25 ccm. Je 15 ccm wet'den in Pergamenth~lsen ffegen nur 7 ccm Aqua dest. dialysiert.

Innenfliissigkeit

AuBenfliissigkeit

A. l~e~ ZimmerSemperatur B. I m Ei~schrank nach 48 std. Dialyse nach 28ffigiger Dialyse

M. 748

M. 747

0,5 cem ip.

2,0 ccm ip.

tot nach 14 Std.

keine Erschei- nungen

~ 1 ccm tot nach 23 Std. ip.

M. 770t 2 eem I voriibcrgehende, ip. geringe Tempera-

] tursenkung

Wir haben die Dialyse sowohl mi t einfachen Dialysierhiilsen (Schleicher & Schiill, Nr. 579), als auch mittels eines Schnelldialysators nach Gutb ier 1 - - in rot ierender gefalteter Hfilse unter gleichzeitiger Ri ihrung des Inha l t s in entgegengesetzter R ich tung - - durchgeffihrt.

Den Verlauf der Dialyse haben wir an der fortschreitenden Abnahme des Trockenriickstandes der zu dialysie- renden L6sung messend verfolgt. Zur schnellen und ausreichend exakten Trocknung yon kleinen, wenig kon- zentrierten Fliissigkeitsmengen (1 bis 5 ecru) haben wir uns einer Apparatur, die dem Trockenapparat yon Gaede und S t raub naehgebildet ist, bedient (Abb. 5). Eine diekwandige Glaskugel (K) yon etwa 70 mm Durehmesser tragt senkrech$ fibereinander zwei Tuben, und zwar einen oberen kleinen Tubus (etwa 20 mm ~) und einen unteren grSBeren (etwa 30 mm ~). Die Aufnahme des Trockengutes ge- sehieht in einem (vorher mit Ver- schluBstopfen austarierten) langhalsi- gen KSlbchen (T). ~ber den Kolben- hals wird ein Gummistopfen gezogen, tier genau in den unteren Tubus der

Abb. 5. Apparatur zur Bestlmmung des Trocken- rl tckstandes kleiner Fliissigkeitsmengen,

Glaskugel paflt, und zwar so, dab der obere Teil des Kolbenhalses in die Kugel 1 A . Gutbier, J . Huber Und W. Schieber, ~ber einen Schnelldialysator. Ber.

dtsch, chem. Ges. ~5, 1518 (1922).

370 M. Hahn und J . Hirsch:

hineinrag~. Zum Eintropfen der zu trocknenden l~lfissigkeit wird in den oberen Glas~ kugeltubus ein kleiner Tropftrichter eingesetzt, dessen Capillarrohr bis in die Mitre des TrockenkSlbchens ffihrt. Von der Glaskugel geht seitlich ein weites (etwa 14 mm ~) wagerechtes Rohr ab, das in etwa 20 cm Entfernung winkelig nach unten gebogen ist. Oer absteigende Sehenkel ist mit einem Gummistopfen armiert, der in den Hals eines gew5tmlichen Destillationskolbens eingepaBt ist. Der Kolben wird soweib mit konzentrierter Schwefels~ure gefiillt, dab das eingefiihrte Glasrohr knapp fiber der Schwefels~ureoberfl/~che endet. ])as Ansatzrohr des Destillierkolbens steht mit einer Gaede-Pumpe in Yerbindung. :Die Trockengewichtsbestimmung verli~uft nun folgendermaBen:

Je nach der Menge des zu erwartenden Troekengutes niram~ man ein tariertes Kflbehen yon 20--50"ccm Inhalt, der in den unteren Tubus passende Gummi- stopfen wird fiber den Kolbenhals gestreift, KOlbehen und Tropftrichter werden an der Glaskugel anmontiert, der mit Schwefels/iure geffillte Destillationskolben wird mit Eis gekfihlt. Sodann wird das System maximal (bis zu etwa 2 mm ttg) evakuiert. Nunmehr wird das TroekenkSlbchen in ein mit heil~em Wasser ge- fiilltes Beeherglas bis zur halbert ttalshShe versenkt und das Wasser zum Sieden erhitzt. Die zu trocknende abpipettierte Fliissigkeitsmenge wird in den unteren Teil des Tropftriehters eingef~llt, wobei man eine iiberfliissige Benetzung der Triehterwand vermeidet. Die Flfissigkeit wird tropfenweise eingelassen; die Troek- hung erfolgt an der heil~en Kolbenwand momentan, so dab 1--5 cem in wenigen Minuten getrocknet sind. SehlieBheh wird mit einer gleiehen Menge destillierten Wassers der Tropftriehter und sein Rohr nachgespiilt. Nunmehr wird das siedende Wasserbad entfernt; bis zur endgfiltigen Abkiihlung des K61bchens, die man durch Eintauehen in kaltes Wasscr besehleunigen kann, halt man das Vakuum aufrecht. Das EinstrSmen der Luft 1/~Bt man zweckm~l]ig dutch einen jenseits des Sehwefel- s/~urekolbens befindlichen Dreiwegehahn erfolgen. Nunmehr wird das KSlbehen abgenommen, der Gummistopfen wh'd abgestreift und das auBen sorgf~ltig ge- reinigte und abgetrocknete KSlbchen mit dem austarierten Stopfen versehlossen und dann gewogen. Zur Kontrolle erfolgt ein nochmaliges l~achtroeknen im Vakuumexsiceator fiber Phosphorpentoxyd his zur Gewichtskonstanz. Die stets in Doppelbestimmungen durchgefiihrten Analysen zeigten eine gute ]~bereinstimmung. Wenn an dem unteren Ende des Tropftrichterrohres sieh deutliche Spuren des Trockengutes vorfinden, muB selbstverst~ndlieh die betreffende Ana- lyse wiederholt werden.

Bei de r Dia lyse werder~ der LOsung zum Vermeiden y o n F/~ulnis einige Tropfen Toluol zugesetz t . :Die geffi l l ten Dia lys ierh i i l sen werden an - - m i t e inem Ste ig rohr yon aus re ichender L~nge (oder Quecks i lber - manomete r ) versehenen - - e ingeke rb ten G u m m i s t o p f e n luff~tich$ an- gebunden , so d a b die Dia lyse u n t e r d e m jeweil ig he r r schenden osmo- t i sehen D r u c k erfo]gt. Die Hi i l sen werden his zur t t S h e ihres l~liissig- kei tsspiegels in des t i l l ie r tes W a s s e r (in Weithals igen l~laschen von 2 - - 5 1 ) versenkb; das Wasse r wi rd 2 rea l a m Tage erneuer t . Bei de r Bes t im- mung des Trockengewich t s - - nach Beend igung der Dia lyse - - i s t se lbs~redend die Vo lumenzunahme der X~liissigkeit zu berf icks icht i - gen. Die naehfo]gende Tab . 5 g ib t eine Z u s a m m e n s t e l l u n g yon Ver- suchsergebnissen, aus denen der Ver lauf de r Dia lyse (Verminderung der Trockensubs tanz) , d ie h i e rdurch erziel te E inengung des Giftes (S te igerung der Gift igkeib des Trockenr f icks tandes) u n d die bei de r

Studien tiber das Choleragif~. :371

Dialyse e in t r e t enden Verluste an Gif~ (Vermindemmg der Zahl der Gifteinheiten) hervorgehen.

Tabelle 5. Dialyse in Pergamenthiilsen:

Ver- Anf~tngliche Zahl der such Gift Konzentra- I)ialyse-" Trocken- Dos. let. Gift- N~. :Nr. tion Dauer substanz efnheiten

I I I 3,6 % 48 Std.

72 Std.

72 Std.

48 Std.

48 Std.

6

I I I 3,6 %

IV 9,8 %

I I 1,4%

VIII 9,06 %

DVIII ~.,0 % 48 Std.

vorher . . . . nachher . . . vermindert um




vorher . . . . nachher . . . verminder t um


0,396 g 0,0485 g

87 Vo

0,396 g [ o,o196g

95%

2,113 g 0,163 g 92%

5,700 g 0,747 g

87%

9,700 g 1,890 g 80%

0,700 g 0,380 g

30,0 mg 5,9 ,,

30,0 ,, 2,8 ,,

13,5 ,, 2,0 ,,

20,0 ,, 4,0 ,,

60,0 12,6

12,6 8,0

13,2 8,2

37%

13,2 7,0

47%

156,5 81,5

47 %

285,0 186,7 34%

161,6 150,0

7%

55,5 47,5 14%

Alle Versuehe zeigen, da~ die Zahl der Gi f te inhe i ten im Laufe der Dialyse a b n i m m t , mad zwar is~ der Verlus~ u m so grSfler, je l~nger dialysiert wird (Versuch 2 u n d 3). Diese Herabse tzung der Gif twirkung ble ibt jedoeh - - zumal bei 48st i indiger Dialyse - - erheblich h in te r der Vermlnderung des Trockenr i icks tandes zuriick. Da ein Durchwande rn des Giites durch die Membran , auch in Versuehen (s. Tab. 4) mi~ kleineren Mengen yon AuBenflfissigkeit, n ieh t nachzuweisen ist, muI3 die A b n a h m e des Giftes in erster Linie auf seine Unbes t~ndigke i t i n w~13riger L6sung zuriickgefiihr~ werden. Auf jeden Fal l erreicht die Dialyse eine An- re ieherung des Giftes, die sieh deut l ich in der Steigerung der Gift igkeit des verb l iebenen Troekenr i icks tandes zu e rkennen gibt. Die Wieder- holung einer 48s t i indigen Dialyse (siehe Versuch 5 u n d 6) f i ihr t zu e inem geringeren Reinigungseffekt , da dureh die erste Dialyse die Menge des n ich t d ia lys ierbaren Antei ls gegeniiber der Menge der d ia lys ierbaren Subs t anzen erheblich gesteigert is$.

~-ber den Effekt der Dialyse in dem yon Gutbier angegebenen Sehnell- d ia lysator g ib t die folgende Tab. 6 Auskunf t .

372 l~I. Hahn und J. Hirsch:

Tabelle 6. Dialyse im Schndldialysator (nach Gutbier). Gegen flieBendes Leitungswasser yon 14 ~ diMysiert.

A. Modellversuch. [ B. Gi/tdialyse. 1 1 Fleischwasser, enthaltend 40 g [ 4,09 g GVII ~Iilchs~lure, mit NaOH auf ~E 7,8 [ 6,76 g GIX

eingestellt I 10,85 g Gift gelSst in 495 ccm Wasser

~r Trocken- weg- [ naoh urspriingl, wirkung yon Stun- Trocken- weg- Dos. let. 1 ccm auf Meet-

den" substanz dialysiert I den S ubstanz dia!ysiert 1 ccm = m g schweinchen

0 1 5V2 7V~

12 23

4,49 % 4,11% 2,93 % 2,55 % 1,92% 1,15%

0 8,4%

34,7 % 43,1% 57,3% 71,7%

0

8

23

2,19%

.1,63 %

1,35 %

0,835 %

0

25,6 %

38,3 %

61,9%

21,9

16,3

13,5

8,35

tStct

Terap.-Senkg.

tStet

In der gleichen Zeit ist die prozentuale und absolute (s. Abb. 6) 'Trockengewichtsabnahme de1: 4,49proz. IqfihrlSsung A (Modellversuch)

grSi3er als die der 2,19proz. Gift-

-~ 3 * Yersuch'A" ~ ' x gersuch B

~a ~ x i N

i I

I i I I

Abb. 6. Verlauf der Dialyse im Gutbier- Dialysator. 23 stiindiger Dialyse; bei einer

Trockengewichtsabnahme um rund 60% ist in dem vorliegenden Ansatz ein Verlust an Gift nicht nachzuweisen; (die inkomplette Wirkung der 8stfindigen Probe ist ~tir die Beurteilung des Endeffektes ohne Bedeutung). Die Dialyse ist also durchaus geeignet, e i n e Konzentrierung des Giftes zu erreichen, und wir haben ffir den praktischen Zweck der Antitoxinerzeugung auf diesem Wege erhebliche ~r gut wirksamen Giftes pr~- pariert. Die in den Tabellen angefiihrten Ergebnisse bieten lediglich allgemeine Anhaltspunkte fiir den zeitlichen Ablauf der Dialyse und ihren ]~iIffluI~ auf das Choleragift. Es bedarf noch ausgedehnter ver-

16sung B. Die Geschwindigkeit der .Dialyse ist - - unter sonst gleiohen Bedingungen abh~ngig yon der Konzentration. L ~ t man die Kurve B (Abb. 6) an d em ihrer Aiffangs- konzentration entsprechenden Punkt der Kurve A beginnen, so decken sich beide Kurven vollkommen: In gleichen Konzentrationsberei- chen verl~uft die Dialyse m i t der gleichen Geschwindigkeit. w as die Gfftigkei~ der L6sung B betrifft, so wirkt die anf~ngliche Dosis ]etalis yon 1 ccm auch noch nach


suchsreihen, um die optimalen Bedingungen - - beziiglich der Anfangs- konzentration, der Zeit, der Tempera tur usw. - - fiir eine rationeUe Gift- anreicherung durch Dialyse festzustellen.

V~

Die ersten orientierenden Versuehe zur Gewinnung eines anti- toxisehen Choleraserums i wurden an einer Ziege vorgenommen. In den ersten 7 Woehen der Behandlung mit Toxin zeigte das Tier keine krank- haften Erseheinungen; bei der fortgesetzten intravenSsen Injekt ion yon GiftlSsung t ra ten dann direkt im AnschluB an die Einspritzung shock- artige Erscheinungen auf, die zwar schnell vorfibergingen. Das Tier erschien jedoch im ganzen gesehiidigt, fraB schleeht und magerte s tark ab.

Eine neutralisierende Wirkung von normalem Ziegenserum konnten wir nicht feststellen. Dagegen ist - - sehon nach 5w6ehiger Behandlung mit insgesamt 34 (fiir Meerschweinchen) tSdliehen Dosen --:- i m Misch- versuch der neutralisierende Effekt sicher nachzuweisen : 0,5 ccm Ziegen- immunserum binden 4 tSdliehe Dosen. Nach weiteren 2 Wochen wird die gleiche Wirkungss t i rke schon von 0,25 ccm Serum erreieht. Die Fortsetzung der Toxinbehandlung ergab sodann - - bei verschleehtertem Allgemeinzustand des T i e r e s - - z u n i c h s t eine Herabsetzung des antitoxischen Wertes, dann wieder einen Anstieg, der jedoeh t rotz Zuffihrung erheblicher Giftmengen die Anfangswerte kaum iibertraf.

Das Entgegenkommen der Behrin 9- Werke (Marburg) ermSgliehte uns die Prtifung der antigenen Wirkung der yon uns hergestellten Gifte auch am Pferde vorzunehmen. Tab. 7 gibt eine Zusammenstellung der bei den ersten Versuchstieren erzielten Ergebnisse.

Der antitoxische Wer t der yore Pferd gewonnenen Immunsera bewegt sieh sehon yon vornherein in einer GrSBenordnung, die wir bei der Ziege - - selbst bei langdauernder Toxinbehandlung - - nieht erreichen konnten. Dieser Erfolg hat die Behring-Werke veranlaBt, die Hersfellung eines antitoxischen Choleraheilserums in grSBerem Urn- range aufzunehmen~.

Seit ungef/~hr 11/2 Jahren wird das yon den Behring-Werken erzeugte Heilserum in Indien einer praktisehen Priifung unterzogen. Die Zah l der mit Serum behandelten F/~lle betr/igt bis jetzt etwa 200. ~fir eine statistische Auswertung ist diese Zahl zu gering, zumal die )'~lle nicht

i Literatur fiber die antigene Wirkung des Choleragiftes siehe Handbuch der pathogenen Mikroorgardsmen. III . Aufl. : H. Hetsch 4 I, 171 ; R. Kraus ~, 609.

Auf die MSglichkeit der Auswertung des antitoxischen Choleraserums am isolierten Kaninchendarm haben wir bereits in einer kurzen Mitteilung hingewiesen (Klin. Wschr. 1927, Nr 7).

Zeitschr. f. Hygiene. Bd. 110. ~5


Tabe]le 7. Prii/ung des antltoxlschen P/erdeserums ( Behring- Werke).

schweinchen

Nr. 57 ,, 58 . ,, 59 ,, 62 ,, 63 ,, 64

Kontrollen 46 ,, 60 ,, 61

Nr. 2 1 0 . . . ,, 2 0 8 . . . ,, 2 0 4 . . .

Kontrolle 82.

Nr. 2 9 7 . . . ,, 3 1 2 . . . ,, 311 . . . . ,, 2 9 9 . . .

Kontrolle 309

Gift

GVII

G I

Zahl d. tlidl. Dos.

1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1

1 1 1 J 1

Gemisch ']~ Std. bei 37 ~

Serum ccm

PI. 1497desgl.desgl.V. 2. V. 1927

desgl. desgl. desgl.

DiphtherieHeilser.

Pf.1496v.19.IV.192~ desgl. desgl.

Pf. 1496 v.7.VI.192~ desgl. desgl. desgl.

Effekt

KeineErscheinungen desgl. desgl. desgl. desgl.

tot nach 24 Std. ,, ,, 24 ,, . . . . 18 ,,

24

KeineErscheinungen desgl.

tot nach 10 Std. . . . . 10 ,,

KeineErscheinungen geringe Temp.-Senk.

tot nach 20 Std . . . . . <21 ,, . . . . <22 ,,

wi~hrend der gleichen E p i d e m i e u n d au~e rdem an versch iedenen Or ten zur B e o b a c h t u n g k a m e n . I n der k l in i schen B e u r t e i l u n g der e inzelnen Fii l le s ind wir ledigl ieh auf die m e h r oder minde r vollst~ndigez~ Ber ich te y o n e twa 10 Beobach t e rn angewiesen. Aus diesen Ber i eh ten geh t hervor , dal3 die zum Teil r ech t g i ins t ig beeinf luBten Fs in ih re r Schwere sehr ve r seh iedenar t ig lagen. ~Wir h a l t e n es d a h e r f i ir zweckms die Beur t e i lung d e r p r a k t i s e h e n Ergebn i s se vor l~uf ig noeh zur i ickzus te l len , bis die A n w e n d u n g der a l t e rn i e r enden Methode , die b isher noch n i c h t in g rSf le rem Umfange erfolgte, bei d e r E r p r o b u n g yon mehre ren 100 F~l len e in k]areres Bi ld erg ib t .

Bezi igl ich des Nachweises de r Heilwirkung des an t i t ox i s chen Serums i m Tierexperiment sei folgendes ku rz be r i ch t e t : U m ein m i t de r e infach tSd l i ehen Dosis vergif teges Meersehweinchen ( T e m p e r a t u r 33 ~ zu r e t t en , wa r 1 S tunde naeh der I n j e k t i o n schon die 10fache Menge der im Misch- versueh neu t ra l i s i e renden Se rumgabe (0,05 ccm ip.) no tw e nd ig ; 2 S t u n d e n naeh der I n t o x i k a t i o n war diese Dosis unwivksam. N a e h i n t r a p e r i t o - nea ler In/ektion war be im Meersehweinehen 1 S tunde spa re r eine Dosis yon 0,05 cem Serum (ip.) v o l l k o m m e n unwi rksam. E i n H e i l v e r s u c h nach subcutaner In fek f ion h a t t e folgendes Ergebn i s (Tab. 8):

Studien fiber das Choleragift.

Tabelle 8.

375

Inflziert mit 1 Std. spiiter ]~tfekt Befund behandelt mit

226

89 225

1/e Schragagar P subcutan desgl. desgl.

0,05 ccm Serum Pf. 14961ntrakard.

desgl. unbehandelt

lebt

tot nach 22 St.

I Starkes Infiltrat an der Injek- tionsste]le

desgl. Sektion: Subcutis in weiterAus- dehnung um dieInjektionssteUe 6dematSs durchtr~nkt, l~eben- nieren gerStet. Abstriche yon Subcutis und Herzblut: Rein-

[ kulturen yon Vibrionen.

VI.

R. Kraus und seine Schiller 1 vertreten auch heute noch die An- sehauung, dab eehte Choleravibrionen keine H~motoxine erzeugen und betrachten diese Eigenschaft als differentialdiagnostisehes Merkmal fiir die yon ihnen als Paraeholeravibr ionen bezeichnete Gruppe. Zu dieser Gruppe werden vor allem die E1-Tor-Vibrionen und der Vibrio Nasik gereehnet, bei welchem Kraus ein fiir Kaninchen (iv.) aku t tSdliehes Gift* beschrieben hat. Bei der Beurteilung der h~molytischen F~hig- keiten stiitzen sieh Kraus und seine Anh~nger auf den 4on van Loghem angegebenen Unterschied zwischen eehter H~molyse und H~mo- digestion.

Der yon uns zur Toxinbereitung in erster Linie benutzte S tamm P ruf~ bei der Ziiehtung auf Hammelblutagarpla t ten schon nach wenigen Stunden eine intensive H~molyse hervor. Wit haben deshalb bei der Ermit t lung weiterer giftproduzierender St~mme - - neben d e m iib- lichen Identifizierungsverfahren (der Agglutination und des Pfeiffer- sehen Versuehes) - - stets die Priifung der h~molytischen F~hig- keiten herangezogen. Tab. 9 gibt eine Zusammenstellung des hRmo- lytischen Verhaltens der uns zug~ngliehen Cholerast~mme auf Hammel- blutagar.

�9 1 Siehe Handbuch der pathogenen Mikroorganismen. III . Aufl., ~ (1928). R. Kraus, S. 166; E. Pribram, S. 575. Eine ausfiihrliche Kritik der Krausschen Anschauungen, siehe ebenda 4 I, W. Kolle und R. Prigge, S. 52.

2 Eine akute spezifische Giftwirkung auf das Kaninchen konnten wir bei intraven5ser Injektion mit dem yon einem h~tmolysierenden Stamm (P) gewonnenen Toxin nicht feststellen. Im Blutdruckversuch war eine akute unspezifische Blut- drucksenkung, wie sie Kraus beschreibt, nur in solchen FAllen zu beobachten, bei welchen gr6Bere Giftmengen schnell injiziert warden.

25*

376 M. Hahn und J . Hirseh:

TabelIe 9.

8erie Zahl Davon hgmolysieren

Laboratoriumsst~mme verschiedener Herkunft . . 18 6 Indische Stgmme . . . . . . . . . . . . . . . 24 2 Stamme aus dem Statens Serum Inst. Kopenhagen 1 20 5

Zusammen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 13

Bemerkt sei, dab z .B . die 5 hgmolysierenden Kopenhagener St~mme yon agglutilfierendem Kaninchenserum (Robert-Koeh-Institut) bis zu dem angegebenen Verdiinnungsgrad 1:6400 agglutiniert werden.

W i r t e i l e n d a h e r nich~ die A n s c h a u u n g , d a b die t t ~ m o l y s i n b i l d u n g

be i , , e c h t e n " C h o l e r a v i b r i o n e n n i c h t v o r k o m m t u n d d a b ih r E r s c h e i n e n g e r a d e z u als M e r k m a l f i i r b e s t i m m t e c h o l e r a ~ h n l i c h e V i b r i o n e n zu be-

~ r a c h t e n ist . G e g e n diese A u f f a s s u n g s p r i c h t v e t a l l em a u c h d e r B e f u n d , dal~ be i e i n e m u n s e r e r S t ~ m m e ( C a l c u t t a i8) die h ~ m o l y s i e r e n d e F ~ h i g -

k e i t - - i n n e r h a l b y o n 2 M o n a t e n - - v e r l o r e n ging. A n d e r e r s e i t s h a b e n

unse re B e o b a c h t u n g e n (s. T a b . 10) e rgeben , d a b z w i s c h e n d e r h ~ m o -

l y s i e r e n d e n ~ g h i g k e i t d e r C h o l e r a v i b r i o n e n u n d i h r e r T o x i n p r o d u k t i o n

e in gewisse r Z u s a m m e n h a n g zu b e s t e h e n s c h e i n t .

Tabel~e 10.

H~mol 's ierendo St~imme N i c h t h i tmolys ierende S t i imme

Sta ture Dos . let . d. f l i issigen K u l t u r Sta ture D o s . let . d. f l i issigen K u l t u r

Calcutta 4 . .

R G A 3 . . �9 I I . . . . . P . . . . .

B . . . . .

E1 Tot . . . Kopeuhag. 8 a Kopenhag. 14

nach 48 Std. 2cem, nach 72 Std. 1 ccm

nach 24 Std. 1 ccm Keine Wirkung

nach 24 Std. 1/4 ccm nach 72 St& 2 ccm nach 24 Std. 2 ccm

Keine Wirkung naeh 48 Std. 2 ecm, nach

72 Std. 1 ccm

Calcutta 18 .

Calcutta 19 Calcutta 29 Calcutta 30 Kassauli . Lahore . . Kowno I .

Kopenhagen 7

Keine Wirkung

Wirkg. nach Anreieherg. Keine Wirkung

Von 8 St~mmen bilden 6 Gift Von 8 Stgmmen bildet 1 (in ma]3igem Umfang) Gift

D ie A u s w a h l de r n i c h t h ~ m o l y s i e r e n d e n S t ~ m m e e r fo lg t e wi l lk i i r l ioh :

be i d e r P r i i f u n g de r h ~ m o l y s i e r e n d e n S t ~ m m e h a b e n wi r d i e j e n i g e n

h e r a n g e z o g e n , d ie au f de r H a m m e l b l u t p l a t t e d e n s t i i r k s t en h ~ m o - lyb ischen E f f e k t h e r v o r b r a c h t e n . B e m e r k ~ sei, d a b be i de r o r i e n t i e r e n d e n

G i f t p r i i f u n g de r v e r s c h i e d e n e n S t ~ m m e n i c h t i m m e r d ie o p t i m M e n Be-

x Wit danken auch an dieser Stelle dem Stateus Serum Inst. Kopenhagen fiir die freundliche ~berlassung der St~mme. �9 ~ Die Nr.-Bezeichnung der Kopenhagener St~mme entspricht der Signatur in unserer Sammlung . . . . . . . .


dingung beziiglich der Ziichtung und vet allem der Zeit der Probe- entnahme erzielt werden konnten.

Aus vergleichenden Versuchen scheint hervorzugehen, dab das Auf- treten yon gelSstem H~molysin und die Produktion yon Toxin in den Kulturfliissigkeiten synchron verlaufen; es bedarf jedoch noeh weiterer Untersuehungen, um diese Beobaehtung sicher zu stellen.

Das HRmotoxin ist auch in den von uns hergestellten Troekengiften naehzuweisen: In der Versuchsanordnung yon Neisser und Wechsberg konnten wir z. B. bei dem Gift VII, dessen Dosis letalis 30 mg betr~gt, eine komplette tt~molyse mit 0,1 mg Troekensubstanz erzielen. Dem- entspreehend zeig~ auch das antitoxische Choleraserum antih~molytische Funktionen (s. Tab. 11).

T a b e l l e 11. Gi]t-Serumgemisch (2 ccm) 1/2 Stunde bei 37 ~ dann Zusatz von 1 Trop]ev: gewaschene Kaninchenblutk6"rperchen. Ablesung nach 2 Stunden (bei 37~

Y•I Serum Pf. 1496 Gift Serum Pf. 1497 (veto 19. IV.) H'~im~ XIII (vom 2. V.) Hlimolyse

1 mg 0,1 ccm 1 mg 0,1 ccm - - 1 ,, 0,01 ,, 1 ,, 0,01 ,, - -

,, 0,001 ,, 1 ,, 0,001 ,, 1 ,, 0,0001 ,, 1 ,, 0,0001 ,, Spur

1 mg 0,00001 ccm komplett 1 mg 0,00001 ccm komplett

- - 0,1 ,, - - - - 0,1 ,, - -

1 mg - - komplett 1 mg - - komplett

Ftir beide Seren liegt die antih~molysierende Grenzdosis gegeniiber 1 mg G X I I I bei 0,000I ccm. Setz~ man die Gfiltigkeit des Gesetzes der Multipla fiir die AbsRttigung H~molysin-Antih~imolysin voraus, so mfiBte die h~molytische Wirkung yon 35 mg G X I I I dutch 0,0035 cem Serum abges~ttigt werden. Wie die folgende Tab. 12 zeigt, lieg~ die absattigende Dosis minima]is des Serums Pf. 1497 (veto 2. V.) gegenfiber 35 mg G X I I I tats~ehlich zwisehen 0,004 und 0,002 eem.

Der Zusammenhang zwisehen h~imolysierender F~higkei~ und Toxin- wirkung, auf den bereits hingewiesen wurde, erfiihrt eine weitgehende Best~tigung dadurch, dab eine ein/ach t6dlicheGi/tdosis die gleiche Serum. menge zur Absiittiguny er]ordert, wie der mlt dieser Dosis verlcnis hdmolytische EHelct. Naeh Tab. 11 wird die h~molytisehe Wirkung von 35 mg G X I I I dureh (35 real 0,0001 eem----) 0,0035 ccm Serum 1496 (veto 19. IV.) abges~ttig~: naeh Tab. 7 liegt die neutralisierende Dosis fiir die einfach t~idliche Menge G X I I I (35 rag) zwischen 0,005 und 0,002 ecru. Als zweites Beispiel fiir diese Beziehung ist in Tab. 12 neben der H~molysin-AntihRmolysin-Titration - - zum Vergleich - - die Versuehsreihe einer Toxin-Antitoxin-Abs~ttigung (G VI I - - Serum Pf. 1497 veto 2. V.)

378 M . H a h n u n d J . Hirseh:

angeffihrt. Die Serumgrenzdosls fiir die Hi~molysin- u n d fiir die Toxin . Abs~t t igung (einer Dosis le~alis) ist die gleiche.

Tabelle 12. Gi/t-Serumffemisch 1/2 Stunde bei 37 ~ Serum P]. 1497 vom 2. V. 1927.

H l i m o l y s l n - A n t l h 5 m o l y s l n . 1 Tropfen gewasehene KaninchenblutkSrper-

ehen zu 4 ecru Gemisch G i ~ X I I I (Dos let. 85 rag)

35 nag . . . 35-,, . . . 35 ,, . . . 35 ,, . . . 35 ,, . . .

35 mg . . . 35 ,, . . . 3 5 , , . . .

Hgmo|yse S e r u m n a c h 2 S td .

bei ~7 ~

0,05 keine 0,01 ,, 0,00'. ~ ,, 0,00q~ ,, 0,00, L ,,

0,002 komplette 0,001 ,,

komplette

T o x i n - A n t i t o x i n Meersehweinehen intraperit oneal

I Gift VII (Dos. let.

80 rag)

30 mg 30 ,, 30 ,,

30 mg

Serum o e m

0,1 0,05 0,01

0,005

0,001

M. Nr.

57 58 59

63

64 60

30 mg 30 mg

Wirkung

k e i n o

k e i n e

tot nach 24 St. tot naeh 18 St.

Bei dieser q u a n t i t a t i v e n ~ b e r e i n s t i m m u n g zwischen der an t i tox i - schen u n d der an t ih~moly t i schen W i r k u n g des I m m u n s e r u m s liegt die Frage n~he, ob n i ch t i ibe rhaup t eine Iden t i t~ t zwischen beiden Effek ten u n d zwischen den en t sprechenden Ant igenen - - Tox in mad t t~mo. lys in 1 - - bes teht ? Zur Bean twor tung dieser Frage reicht unser bisheriges Versuchsmater ia l noch keineswegs aus. Jedoch muB hier darauf aufmerksam gemacht werden, dab auch bei anderen als h~molyt isch wi rkend b e k a n n t e n Giften der toxische Effekt sich auch an anderen K6rperzel len nachweisen 1~13~: wie z. B. bei der D u r c h b l u t u n g m i t Schlangcngif t i n der Leber ( M . H a h n u n d E . v. S k r a m l i k 2 ) . Die Leichtigkeit , m i t der m a n an Blu~k6rperchen die Effek~e solcher Gifte qua l i t a t iv u n d quan t i - t a t i v nachweisen kann , mag die Ursache dafiir sein, dab die Aufmerksam- kei t auf die hhmoly t i schen Effekte konzen t r ie r t u n d yon der W i r k u n g auf andcre K6rperzel len abge lenkt wurde. Es muB sehr zweifelhaft erscheinen, ob es i ibe rhaupt berechtig~ is~, dem h~molyt i schen Effekt hier eine Sonders te l lung einzuri iumen, n u r weil er leichter fests tel lbar ist, u n d ob n ich t wcitere Un te r suchungen dazu f i ihren k6nnen , yon einer a l lgemeinen oder wenigstens al lgemeineren zell- bzw. gewebs- schhdigenden W i r k u n g zu sprechen, worauf schon manche Erschei- n u n g e n an der Applikat ionsstel le hinweisen.

1 Huntemi211er (Z. Hyg. 68, 221 [1911]) nimmt an, dab das yon ihm dar- gestellte fiir Kaninchen (i. v.) akut wirksame Toxin mit dem H~molysin iden- tisch ist.

M. Hahn und E. v. Skramlik, Biochem. Z. 98, 120 (1919).


Die Giiltigkeit des Gesetzes der konstanten Proportionen fiir das System Cholerah~molysin-Antihamolysin bedarf noeh weiterer Beweise. Der Nachweis dieser Gesetzm~l~igkeit ftir die Abs~ttigung der toxische~ Wirkung scheitert - - unseres Eraeh~ns - - kaum an einer etwa vorhandenen essentiellen Verschiedenhei~ des Cholera~oxins yon den anderen bakteriellen Toxinen; trotzdem diirfte er vorerst nicht gelingen, solange namlich die gewonnenen Prgparate gewichtsmgBig mit einer erheblichen Menge yon BaUaststoffen behaftet sind, die M besonders bei den potenzierten Dosen-- auf die Reaktion Toxin-Antitoxin kaum ohne Einflul~ bleiben diirften.

Zusammen/assung. 1. Ebenso wie die moderne Fermentforschung einen prinzipiellen

Unterschied zwischen Ekto- ~md Endoenzymen (~ermen~ und Enzym) nicht mehr anerkennt, diiffte bei fortschreitender Kenntnis der bakteriellen Toxine - - die Unterscheidung zwischen Ekto- und Endotoxinen an Bedeutung verlieren.

2. Es wird ein Ziichtungsverfahren beschrieben, welches dureh frak- tionierten Zuekerzusatz und durch gleichzeitige dauernde Aufrech~- erhaltung einer alkalisehen Reaktion den Choleravibrionen eine intensive Ausnutzung der Kohlehydrate erm6glich~, ohne dab eine vorzeitige Selbstvergiftung der Kultur eintritt.

3. Die Wirkung des Choleragiftes auf das Meerschweinchen (bel intraperitonealer Injektion) verl~uft unter dem Bilde eines akuten An. falles (initialer Temperatursturz), dem ein station~res Stadinm folgt, in welchem das Tier unter dem sekund~ren Einflul~ irreversibler Sch~di. gungen zugrunde geht. Die Bildung des Giftes se~z~ ein, sobald in der Kultur eine maximale Keimzahl erreicht ist; sie erfolgt also zeitlieh haupts~chlieh in der Absterbephase. Daslabile Choleratoxin kann d~rch tterstellung eines wirksamen Troekenpr~iparates in eine best~Lndigere, dosierbare Form iiberffihrt werden.

4. Das Choleragift ist durch Pergamentmembranen nicht dialysier- bar. Dutch Dialyse kann ein erheblieher Teil der Ballaststoffe entfernt und so eine Anreicherung des Giftes erzielt werden.

5. Dutch Immunisierung von Ziege und Pferd wird ein wirksames antitoxisehes Serum gewonnen.

6. Der Naehweis yon Gift gelingr in erster Linie bei solehen Stiimmen, welche bei der Ziiehtung auf Hammelblutagarplatten eine deubllche Hi~molyse hervorrufen. Ein Zusammenhang zwischen der h~molysierenden F~higkeit und der toxischen Funktion wird dadurch wahrscheinlich gemacht, daI3 diejenige Serummenge, welche eine einfach tSdliehe Giftdosis abs~ttigt, gerade aueh den mit dieser Giftmenge verknfipften hhmolytischen Effekt neutralisier~.

3 8 0 M. H a h n u n d J . Hirseh:

1Vachlrag : W~hrend der Drueklegung vors tehender Arbei t erschien eine Mit tei lung

fiber Choleratoxine aus dem Ins t i t u t ffir Tropenhygiene in Leiden (Direktor: Prof. 1 ='. U..Flu) yon A. JR. Andu und J. van N ie~rk (Zbl. Bakter . I Orig. 112, 519 [1929]). Diese Untersuchung war im Hinbl ick auf nnsere vorlgufigen Mit- teflungen fiber diesen Gegenstand mi~ einem yon uns im M~rz 1927 i ibersandten S tamm Galcutta 30 ausgefiihrt worden. Die Verff. h a b e n die friihzeitige Bi ldung eines , ,gelfs ten" Toxins, die Wirkung des Giftes auf das Meerschweinchen und auf den isolierten Kaninchendarm best~tigen k6nnen. Abweichungen yon unseren Ergebnissen geben die Autoren hinsiehtl ich der Nhhrbodenberei~ung, der Viru- lenz und vor allem des serologischen Verhal tens des benu tz ten S tammes an.

Die Verff. f i ihren an, da6 bei Verwendung einer 0,1proz. GlucosebouiUon - - in Gegenwart yon Phosphatpuffer - - der Zusatz von 2% Kreide genfigt, u m w/~hrend des Wachs tums eine optimale H-Ionenkonzent ra t ion aufreehtzuerhal ten und glauben h ie rmi t sich im Gegensatz zu unseren Angaben zu befinden. Wi t bemerken hierzu: Wir haben nirgends behaupte t , , ,dab die K u l t u r mi t Hilfe von Puffer und Kreide unm6glich wgre" ; unsere ~ul3erung, dab CaC08 und Puffer n ich t ausreichend shld, bezieht sich auf einen wesenthch h fhe ren Glueosezusatz, wie wir ihn (fraktioniert) zur Erzielung eines maximalen Waehs tums vorgenommen haben. Die yon den holl~ndisehen Autoren mi t Kreide erzielte Kons tanz der alkalischen Reaktion sprich~ eher ffir eine unvollst~ndige Ausnti tzung selbst der 0 ,1proz . Zuekerlfsung nnd n icht fiir eine s~urebindende Wirkung der Kreide, @elche - - aus rein chemischen Grfinden - - erst bei neutra ler bzw. schwach saurer Reakt ion in Funk t ion trit$. (Erwhhnt sei, dab iiberdies auf S. 544, Zeile 21 die Zahlen der pH-Werte und auf S. 522, Zeile 9 und 14 die Zahlen fiir die Glucose- konzentra t ion s inns t f rende I)ruckfehler aufweisen.) Was die Virulenz des S tammes betrifft , so kSnnen wi t deren Nachlassen keine besondere :Bedeutung beimessen. Beziiglieh der Bewertung der Komplementablenkungsmethode f fir die Cholera- diagnostik weisen wi t auf die Ausfi ihrungen yon W. Kolle und R. Priffge (1. e., S. 74) bin. Ein Versagen der Agglutinatio~ des Stammes Calcut ta 30 is t uns bei Ver- wendung verschiedener Sera n icht begegnet. Wi t ffihren nachs tehend die Ergeh- nisse diesbezfiglicher Prfifungen an.

I Oalcutta30w~rd Datum Agglutinierendes Serum Titerwert agglutinie~ yon

Verdfinnungen bis

2 4 . u 1:6400

Sommer 1928

2. VII . 1929

In s t i t u t , ,Robert K o c h " . . . . . Behringwerke Pferdeserum vom 2. V.

1927 (St. P.) . . . . . . . . . I n s t i t u t , , R o b e r t K o c h " . . . . . , ,Pharmagans" . . . . . . . . . . Insti~u~ , ,Robert Koch" . . . . . , ,Pharmagans" . . . . . . . . . .

I:I000 1:6400 1:3000 1:3200 1:3000

i : 4000

1 : 4 0 0 0 1:6400 I : 12 800 I: 6400 1:12 800

I n einem merkwfirdigen Gegensatz zu der yon den Autoren beobachte ten serologischen Abweichung des Stammes Calc. 30 yon den echten Choleravibrionen ateht die Angabe (S. 540), da6 die Zentrifugatflt issigkeit Meerschweinchen n i ch t


nur gegen die lebenden Keime des eigenen Stammes (Calc. 30), sondern sogar gcgen die ]0faeh tSdiiche Keimdosis ihres , ech ten" Cholerastammes 169 im. munisiert.

Wir bedauern, dal} - - trotz des derzeitigen Anerbietens des Herrn Prof. F l u - -

die Autoren es unterlassen haben, vor Drueklegung ihrer Arbeit zur Aufkl~rung der vermeintliehen I)ivergenzen sich mit uns in Verbindung zu setzen oder wenigstens das Erscheinen unserer obigen ausfiihrlichen Arbeit abzuwarten; und dies um so mehr, als die wesentliehen Ergebnisse bezfiglich der Giftbildung und Gift- wirkung eine so befriedigende ~bereinstimmung mit unseren Befunden aufweisen, welche wit nicht etwa nur mit Calc. 30, sondern mit einer Reihe yon St~mmen (s. S. 376) erheben konnten.

studien über das choleragift

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