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Tierärztliche Hochschule Hannover

Die Rolle des Natrium/Protonenaustauschers NHE3 und seiner PDZ-Adapterproteine NHERF1 und PDZK1 bei der intestinalen Anionensekretion

und Natriumchloridabsorption

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Jutta Hillesheim

Münster

Hannover 2010

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. U. Seidler

Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und

Endokrinologie

Medizinische Hochschule Hannover

und

Prof. Dr. K. Huber

Physiologisches Institut

Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. K. Huber

und

Prof. Dr. U. Seidler

2. Gutachter: Prof. Dr. H. Y. Naim

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2010

Meinen Eltern

Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

BROERE, N., M. CHEN, A. CINAR, A. K. SINGH, J. HILLESHEIM, B. RIEDERER, M. LUNNEMANN, I. ROTTINGHAUS, A. KRABBENHÖFT, R. ENGELHARDT, B. RAUSCH, E. J. WEINMAN, M. DONOWITZ, A. HUBBARD, O. KOCHER, H. R. DE JONGE, B. M. HOGEMA u. U. SEIDLER (2009): Defective jejunal and colonic salt absorption and altered Na+/H+-exchanger 3 (NHE3) activity in NHE regulatory factor 1 (NHERF1) adaptor protein-deficient mice. Pflügers Arch 457, 1079-1091

BROERE, N., J. HILLESHEIM, B. TUO, H. JORNA, A. B. HOUTSMULLER, S. SHENOLIKAR, E. J. WEINMAN, M. DONOWITZ, U. SEIDLER, H. R. DE JONGE u. B. M. HOGEMA (2007): Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activation is reduced in the small intestine of Na+/H+ exchanger 3 regulatory factor 1 (NHERF1)- but not NHERF2-deficient mice. J Biol Chem 282, 37575-37584

CINAR, A., J. HILLESHEIM, B. TUO, B. RIEDERER, M. MANNS, O. KOCHER u. U. SEIDLER (2005): The PDZ-domain binding protein PDZK1/cap70 is involved in the regulation of murine intestinal NHE3 and CFTR function. Abstract: Gastroenterology 128, A-368

HILLESHEIM, J., B. RIEDERER, B. TUO, M. CHEN, M. MANNS, J. BIBER, C. YUN, O. KOCHER u. U. SEIDLER (2007): Down regulation of small intestinal ion transport in PDZK1- (CAP70/NHERF3) deficient mice. Pflügers Arch 454, 575-586

SEIDLER, U., I. ROTTINGHAUS, J. HILLESHEIM, M. CHEN, B. RIEDERER, A. KRABBENHÖFT, R. ENGELHARDT, M. WIEMANN, Z. WANG, S. BARONE, M. MANNS u. M. SOLEIMANI (2008): Sodium and chloride absorptive defects in the small intestine in Slc26a6 null mice. Pflügers Arch 455, 757-766

SEIDLER, U., A. K. SINGH, A. CINAR, M. CHEN, J. HILLESHEIM, B. HOGEMA u. B. RIEDERER (2009): The role of the NHERF family of PDZ scaffolding proteins in the regulation of salt and water transport. Ann N Y Acad Sci 1165, 249-260

INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

1 Einleitung ...................................................................................................... 1

2 Literatur ........................................................................................................ 3

2.1 Transportmechanismen im Dünndarm ................................................................... 3

2.2 Interaktion durch PDZ-Proteine .............................................................................. 4

2.3 Transportproteine im Dünndarm ............................................................................ 5

2.3.1 Na+/H+-Austauscher Isoform 3 (NHE3) ............................................................... 5

2.3.2 Cystic fibrosis transmembran conductance regulator (CFTR) ............................. 7

2.3.3 Die Ionenaustauscher der Slc26-Familie .............................................................. 8

2.3.3.1 Putative anion transporter 1 (PAT1) ............................................................. 8

2.3.3.2 Down regulated in Adenoma (DRA) ............................................................ 9

2.3.4 Natrium/Glucose Kotransporter (SGLT1) ........................................................... 9

2.3.5 Adapterproteine im Dünndarm ........................................................................... 10

2.3.5.1 Na+/H+ exchanger regulatory factor Isoform 1 (NHERF1) ........................ 11


2.3.5.3 PDZ-domain protein by kidney 1 (PDZK1) ............................................... 13


2.4 Die Ussing-Kammer ................................................................................................ 14

2.5 Bedeutung der Literatur für die eigene Fragestellung ......................................... 14

INHALTSVERZEICHNIS

3 Hypothese und Ziele ................................................................................... 16

4 Material und Methoden ............................................................................. 17

4.1 Tiere .......................................................................................................................... 17

4.1.1 NHE3 Knock-out Mäuse .................................................................................... 18

4.1.2 NHERF1 defiziente Mäuse ................................................................................ 19

4.1.3 PDZK1 Knock-out Mäuse .................................................................................. 19

4.1.4 Haltungsbedingungen ......................................................................................... 19

4.1.5 Tötung der Mäuse und Gewinnung des Gewebes .............................................. 20

4.1.6 Präparation der Mukosa ..................................................................................... 20

4.2 Ussing-Kammer Experimente ................................................................................ 21

4.2.1 Die Ussing-Kammer ........................................................................................... 21

4.2.2 Bestimmung der elektrophysiologischen Parameter .......................................... 23

4.2.3 Isotopen-Fluxe .................................................................................................... 27

4.3 Versuchsablauf......................................................................................................... 28

4.4 Geräte ....................................................................................................................... 31

4.5 Statistik und Darstellung der Ergebnisse .............................................................. 32

4.6 Substanzen und Lösungen ...................................................................................... 33

4.6.1 Substanzen .......................................................................................................... 33

4.6.2 Lösungen ............................................................................................................ 33

5 Ergebnisse ................................................................................................... 35

INHALTSVERZEICHNIS

5.1 Die Wildtyp-Mäuse .................................................................................................. 35

5.2 Veränderungen bei NHE3-defizienten Mäusen .................................................... 39

5.3 Veränderungen bei NHERF1-defizienten Mäusen ............................................... 45

5.4 Veränderungen bei PDZK1-defizienten Mäusen.................................................. 49

5.5 Vergleich der Gendefekte ....................................................................................... 54

6 Diskussion .................................................................................................... 56

6.1 Durchgeführte Versuche ......................................................................................... 56

6.2 Auswirkungen der NHE3-Defizienz ....................................................................... 57

6.3 Messungen der NHERF1-defizienten Mäuse ........................................................ 61

6.4 Messungen der PDZK1-defizienten Mäuse ........................................................... 64

6.5 Vergleich zwischen den verschiedenen Gendefekten ........................................... 67

6.6 Wechselwirkungen zwischen NHERF1 und NHERF2......................................... 69

6.7 PDZ-Adapterproteine sind nicht immer austauschbar ....................................... 70

6.8 Ausblick in die Zukunft .......................................................................................... 71

7 Zusammenfassung ...................................................................................... 72

8 Summary ..................................................................................................... 74

9 Literaturverzeichnis ................................................................................... 75

10 Anhang ......................................................................................................... 91

11 Danksagung ................................................................................................. 96

VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

ABC ATP-binding cassette

ad auf eine bestimmte Menge auffüllen

Aq dest. destilliertes Wasser („aqua destillata“)

ATP Adenosintriphosphat

BBM Bürstensaummembran

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CAP70 CFTR associated protein mit einem Molekulargewicht von 70 kDA

= PDZK1

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

cGMP cyclisches Guaninmonophosphat

CF cystic fibrosis, zystische Fibrose, Mukoviszidose

CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

CLD chloride loosing diarrhea

cpm Counts pro Minute

DPe Elektroden-Eigenpotentialdifferenz

DRA down regulated in adenoma

DMSO Dimethylsulfoxid

EBP50 Ezrin binding phosphoprotein mit einem Molekulargewicht von 50 kDA

= NHERF1


EDTA Ethylendiamintetraacetat

EPAC exchange protein activated by cAMP

µEq Mikroequivalent

ERM Ezrin Radixin Moesin

E3KARP NHE3 kinase A regulatory protein = NHERF2

Gt Gewebeleitfähigkeit

Ic Klemmstrom

Isc Kurzschlussstrom

IKEPP intestinal and kidney enriched PDZ protein =NHERF4

J Fluxrate

kBq Kilobecquerel

kDA Kilodalton

MW arithmetischer Mittelwert

NaPi IIa Natriumphosphat Kotransporter

NHE Na+/H+ exchanger (Natrium/Protonen-Austauscher)

NHE1 Na+/H+ exchanger isoform 1



NHERF Na+/H+ exchanger releasing factor

NHERF1 Na+/H+ exchanger releasing factor isoform 1

NHERF2 Na+/H+ exchanger releasing factor isoform 2


NHERF3 Na+/H+ exchanger releasing factor isoform 3 = PDZK1

NHERF4 Na+/H+ exchanger releasing factor isoform 4 = PDZK2

NKCC Na+/K+/2Cl–-Kotransporter

OCTN2 organic cation/carnitine transporter N2

PAT1 putativ anion transporter 1 = Slc26a6

PDt transepitheliale Potentialdifferenz

PDZ PSD-95, Drosophila discs-large protein, Zonula occludens

PDZK1 PDZ-domain protein by kidney 1 = NHERF3

PDZK2 PDZ-domain protein by kidney 2 = NHERF4

PEPT1 H+/Dipeptid Transporter 1

PGE2 Prostaglandin E2

PKA Proteinkinase A

R Gewebewiderstand (resistance)

Rf Flüssigkeitswiderstand

SEM standard error of mean = Standardfehler

Slc Solute carrier

Slc26a3 Solute carrier26a3 = DRA

Slc26a6 Solute carrier26a6 = PAT1

sog. so genannte

SGLT1 sodium/glucose linked transporter 1

TTX Tetrodotoxin


USA United States of America

WPI Firma World Precision Instruments

WT Wildtyp

Chemische Elemente werden entsprechend der internationalen Nomenklatur abgekürzt.

1 EINLEITUNG 1

1 Einleitung

Durch die jahrelange klinische Beobachtung von Patienten, die an zystischer Fibrose leiden,

wurde u.a. festgestellt, dass diese wesentlich weniger zu sekretorischer Diarrhöe neigen als

gesunde Menschen. Dies wird auf die krankheitsbedingt veränderte Permeabilität des Darmes

der Patienten zurückgeführt, denn im Darm kommt es zu zahlreichen Salz- und

Flüssigkeitstransporten durch die Darmschleimhaut. Einen Hauptmechanismus für diesen

Transport stellt die elektroneutrale Natriumchloridresorption dar, die vor allem an dem

Na+/H+-Austauscher Isoform 3 (NHE3) und den Anionenaustauschern DRA (down regulated

in adenoma) und PAT1 (putative anion transporter 1) stattfindet. Die Hemmung dieses

Transportprozesses sowie die Stimulation der Anionensekretion (vor allem von Cl– und

HCO3–) im Darm sind die wichtigsten Mechanismen von Diarrhöen, seien sie infektiös,

hormonell, medikamentös oder entzündlich bedingt. Demzufolge wäre eine Aufhebung der

Hemmung der Natriumchloridabsorption eine äußerst effektive Durchfalltherapie. Diese

Hemmung kommt durch die Bildung eines Proteinkomplexes zustande, der aus Transport-

und Ankerproteinen sowie zytoskeletalen Strukturen und den beteiligten Proteinkinasen

besteht.

Mäuse, denen das Transportprotein CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance

regulator) fehlt, zeigen diese Hemmung nicht und auch die Cl–/HCO3–-Sekretion lässt sich

nicht mehr stimulieren. Sie leiden an intestinaler Verstopfung. Bei Menschen mit zystischer

Fibrose ist es ähnlich. Sie neigen zu rezidivierenden intestinalen Obstruktionszuständen und

sind weniger anfällig für sekretorische Diarrhöen.

Mäuse mit fehlender CFTR-Expression weisen genau das auf, was man bei der Therapie der

sekretorischen Diarrhöe erreichen möchte. Die Entwicklung neuer Antidiarrhoika könnte sich

auf die Erforschung der Ursachen für die fehlende Hemmung der elektroneutralen

Natriumchloridresorption stützen. Den Mäusen fehlt nicht nur die Hemmung der NaCl-

Resorption. Sie weisen auch eine starke Expression von Adapterproteinen - wie z. B. PDZ-

domain protein by kidney 1 (PDZK1) und Na+/H+ exchanger releasing factor Isoform 1

(NHERF1) - auf, die sowohl an CFTR als auch an die Transportproteine NHE3 und / oder

DRA und PAT1 binden.

2 1 EINLEITUNG

Anhand von NHE3-, NHERF1- und PDZK1-defizienten Mäusen sollen die Konsequenzen für

den Salztransport durch die veränderten Multiproteinkomplexe untersucht werden. Ziel dieser

Arbeit ist es, sowohl Informationen über den Einfluss der Adapterproteine auf die Interaktion

verschiedener Transportproteine zusammenzustellen als auch Erkenntnisse über den

ausgewogenen Wechsel zwischen Absorption und Sekretion im Darm zu gewinnen.

2 LITERATUR 3

2 Literatur

2.1 Transportmechanismen im Dünndarm

Entlang des gesamten Darmtraktes finden zahlreiche Transportvorgänge statt. Flüssigkeit und

Elektrolyte werden absorbiert und sezerniert (FIELD u. SEMRAD 1993). Für diese Ionen-

und Flüssigkeitsverschiebungen sind bestimmte Ionentransportproteine zuständig (FIELD

2003).

Die elektroneutrale Natrium-Chlorid-Absorption ist der Hauptmechanismus der intestinalen

Salz- und Flüssigkeitsresorption (FIELD 2003). Diese wird hauptsächlich durch den Natrium-

Protonen-Austauscher NHE3 (SCHULTHEIS et al. 1998) sowie die Chlorid-Bikarbonat-

Austauscher DRA (SCHWEINFEST et al. 2006; SIMPSON et al. 2007) und PAT1

(SIMPSON et al. 2007) bewirkt.

Die elektrogene Anionensekretion, die auch die Abgabe von Flüssigkeit an das Darmlumen

nach sich zieht, erfolgt fast ausschließlich durch den Anionenkanal CFTR (FIELD 1993;

SHEPPARD u. WELSH 1999; FIELD 2003). CFTR steht mit verschiedenen

Anionenaustauschern der Solute carrier26-Familie (Slc26) in Verbindung, so dass es zu einer

wechselseitigen Regulation kommt. Zu diesen Slc26-Anionenaustauschern gehören unter

anderem auch PAT1 und DRA (KO et al. 2004; LAMPRECHT u. SEIDLER 2006;

SIMPSON et al. 2007). Wie diese Regulation genau vonstattengeht, ist noch weitgehend

unbekannt.

Wird die Darmschleimhaut stimuliert, kommt es zu einer vermehrten Chloridsekretion durch

CFTR und einer Hemmung der Natriumchloridresorption (FIELD 2003). Experimentell kann

eine solche Stimulation durch Forskolin ausgelöst werden. Forskolin ist ein Analogon von

cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) (K. SEAMON u. DALY 1981; K. B. SEAMON

et al. 1981; CUTHBERT u. SPAYNE 1982; BIRNBAUMER et al. 1983; HILDEBRANDT u.

BIRNBAUMER 1983; HUDSON u. FAIN 1983).

Die Stimulation von CFTR sowie die Hemmung der Natriumchloridabsorption sind die

pathophysiologische Ursache von infektiös, inflammatorisch, hormonell, erblich und auch

medikamentös bedingter sekretorischer Diarrhöe. Es kommt zu Flüssigkeitssekretion sowie

mangelnder Flüssigkeitsabsorption (FIELD 2003). Voraussetzung für die Stimulation der

Anionensekretion und die Hemmung der Natriumchloridaufnahme ist die Bildung eines

4 2 LITERATUR

Multiproteinkomplexes aus Transport-, Adapter- und Ankerproteinen sowie zytoskeletaler

Strukturen und Proteinkinasen (FIELD 2003; GUGGINO 2004). Die Möglichkeit der

Aufhebung dieser Hemmung könnte die effektivste Therapie sekretorischer Diarrhöen

darstellen. Bisher ist die orale Rehydratation die wichtigste Therapie. Dabei macht man sich

die Natrium-gekoppelte Glukoseaufnahme zu Nutze, um Flüssigkeitsverluste des Patienten

auszugleichen (DROZDOWSKI u. THOMSON 2006).

Patienten mit zystischer Fibrose (Mukoviszidose) sind für sekretorische Diarrhöe weniger

anfällig. CFTR-defiziente Mäuse zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie Mukoviszidose-

Patienten (SEIDLER et al. 1997). Im Darm von Mäusen, die kein funktionstüchtiges CFTR-

Protein exprimieren, können cAMP-, cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) sowie Ca+-

abhängige Agonisten weder eine Chlorid- noch eine Bicarbonatsekretion hervorrufen

(SEIDLER et al. 1997).

Die Tiere zeigen also genau das, was man therapeutisch bei sekretorischer Diarrhöe erreichen

möchte.

2.2 Interaktion durch PDZ-Proteine

Bei den PDZ-Proteinen handelt es sich um Proteine, die eine oder mehrere PDZ-Domänen

enthalten. Diese PDZ-Domänen sind Protein-Protein-Interaktionsmodule, die an

Aminosäuresequenzen ihres Zielproteins binden, normalerweise an das C-terminale Ende. Die

Bezeichnung PDZ stammt von den Anfangsbuchstaben der zuerst charakterisierten Proteine

mit dieser Bindungsstelle (PSD-95, Drosophila discs-large protein, Zonula occludens)

(SHENG 1996; GUGGINO u. STANTON 2006).

Adapterproteine binden mit ihren PDZ-Domänen an das C-terminale Ende von

Transportproteinen (SHORT et al. 1998; S. WANG et al. 1998; KARTHIKEYAN et al. 2001;

LEE et al. 2007). Viele Adapterproteine besitzen mehr als eine PDZ-Domäne, so dass sie

weitere Bindungen eingehen können. Dadurch kommt es zur Bildung von Signalkomplexen

aus vielen Proteinen (FANNING u. ANDERSON 1999), wodurch die Transportaktivität der

Transportproteine beeinflusst wird (GISLER et al. 2001; GUGGINO 2004).

Verschiedene Expressionsstudien lassen vermuten, dass PDZ-Adapterproteine z. B. für die

maximale cAMP-vermittelte Aktivierung des CFTR-Anionenkanals erforderlich sind

2 LITERATUR 5

(ROSSMANN et al. 1999; RAGHURAM et al. 2001) sowie für die cAMP-, cGMP- und Ca2+-

mediierte Hemmung von NHE3 (YUN et al. 1997; LAMPRECHT et al. 1998; WEINMAN et

al. 1998; ZIZAK et al. 1999; WEINMAN et al. 2000a; 2000b).

Das Wissen über die funktionalen Aufgaben von PDZ-Adapterproteinen in nativen Zellen

oder Geweben ist bisher jedoch noch sehr unvollständig (SHENG 1996; BEZPROZVANNY

u. MAXIMOV 2001; SHENG u. SALA 2001; LAMPRECHT u. SEIDLER 2006).

2.3 Transportproteine im Dünndarm

Transportproteine sind erforderlich, um nicht membrangängige Moleküle oder Ionen durch

die Zellwand zu schleusen. Sie bilden entweder Kanäle oder Transporter, durch deren

Transportaktivität die Zelle auf äußere Einflüsse reagiert. Abb. 1 (Seite 6) zeigt eine

schematische Darstellung einer Dünndarmzelle mit Ionentransport.

2.3.1 Na+/H+-Austauscher Isoform 3 (NHE3)

Das Transportprotein NHE3 (Na+/H+ exchanger isoform 3) ist zusammen mit ein oder

mehreren Proteinen der Slc26-Anionenaustauscherfamilie für die elektroneutrale

Natriumchloridabsorption zuständig (ZACHOS et al. 2005). Ihm wird eine große Bedeutung

an der verringerten Natrium- und Wasserabsorption bei Durchfallerkrankungen zugeschrieben

(SCHULTHEIS et al. 1998). Gemeinsam mit dem weniger bedeutenden NHE2 ist NHE3 in

der apikalen Membran unter anderem im Dünndarm lokalisiert (HOOGERWERF et al. 1996;

ZACHOS et al. 2005).

Die Hemmung von NHE3 via cAMP ist auf NHERF1 oder NHERF2 angewiesen. Nur wenn

eines dieser beiden Adapterproteine gemeinsam mit NHE3 in einer Zelle exprimiert wird,

wird NHE3 durch cAMP gehemmt (WEINMAN u. SHENOLIKAR 1997).

Sowohl NHERF1 als auch NHERF2 interagieren mit dem C-terminalen Ende von NHE3 und

können zusätzlich an Ezrin binden (YUN et al. 1998), das als Ankerprotein für die cAMP-

abhängige Proteinkinase A (PKA) fungiert. NHERF1 und NHERF2 sind daher Bindeglieder

6

Abb. 1: Ionentransport im Dünndarm

: Ionentransport im Dünndarm

2 LITERATUR

2 LITERATUR 7

zwischen NHE3 und Ezrin und bringen PKA in die Nähe von NHE3. Die Beweglichkeit von

NHE3 in der Membran wird auf diese Weise eingeschränkt (CHA et al. 2004). Durch die

räumliche Nähe kann PKA durch cAMP phosphorylieren und NHE3 hemmen

(DRANSFIELD et al. 1997; YUN et al. 1997; LAMPRECHT et al. 1998; DONOWITZ et al.

2005a; LAMPRECHT u. SEIDLER 2006).

2.3.2 Cystic fibrosis transmembran conductance regulator (CFTR)

Der Chlorid-Kanal CFTR ist in vielen Epithelien der wichtigste Anionentransporter

(SHEPPARD u. WELSH 1999). Er gehört zu der großen ABC-Familie. Er besitzt daher eine

ATP-binding cassette (SHEPPARD u. WELSH 1999). Über diese Bindung an ATP gewinnt

CFTR die Energie für den aktiven Transport von Chlorid durch die Zellmembran. CFTR wird

durch cAMP aber auch durch PKA aktiviert (SUN et al. 2000a; LEE et al. 2007).

Den Namen „Cystic fibrosis transmembran conductance regulator“ hat der Transporter durch

die erbliche Erkrankung der zystischen Fibrose erhalten, bei der es zu einer Mutation des

CFTR-Gens kommt (FIELD 1993), und die sich in abnormalen Elektrolyttransporten in

epithelialen Geweben, besonders in Atemwegen, Pankreas und Darm äußert (COLLINS

1992). Die Krankheit wird auch als Mukoviszidose bezeichnet.

Während Patienten mit zystischer Fibrose an Obstruktionen leiden, bewirkt eine

Überstimulation von CFTR eine sekretorische Diarrhöe, an der viele Menschen sterben.

Gemeinsam mit anderen Anionentransportproteinen ist CFTR für die elektrogene Chlorid-

und Bicarbonatsekretion im Darm verantwortlich (SEIDLER et al. 1997; THIAGARAJAH u.

VERKMAN 2003; MOUNT u. ROMERO 2004; ALLEN u. FLEMSTROM 2005). CFTR

bindet viele andere Proteine und kann Einfluss auf zahlreiche Zellfunktionen nehmen, nicht

nur auf den Transport von Chlorid und Bikarbonat (BARRETT u. KEELY 2000; GUGGINO

2004; LI u. NAREN 2005; GUGGINO u. STANTON 2006; LAMPRECHT u. SEIDLER

2006). Mit dem C-terminalen Ende bindet CFTR an verschiedene PDZ-Adapterproteine, so

dass es zu Multiproteinkomplexen vernetzt werden kann (SHORT et al. 1998; S. WANG et

al. 1998; SUN et al. 2000b; KARTHIKEYAN et al. 2001; LEE et al. 2007). Durch diese

Adapterproteine findet eine wechselseitige Regulation zwischen NHE3 und CFTR statt, wenn

8 2 LITERATUR

sie in Zellen koexprimiert werden (AHN et al. 2001; BAGORDA et al. 2002; FAVIA et al.

2006).

Eine solche wechselseitige Steuerung ist möglicherweise die Ursache dafür, dass bei CFTR-

defizienten Mäusen die Hemmung von NHE3 und DRA im Darm vollständig fehlt

(GAWENIS et al. 2002).

Für drei der vier NHERF-Proteine wurde gezeigt, dass sie an CFTR binden. Dadurch scheint

dessen Aktivität und Lokalisation in der apikalen Zellmembran gesteuert zu werden (S.

WANG et al. 1998; GUGGINO 2004; THELIN et al. 2005). Wie bei NHE3 verbinden

NHERF1 oder NHERF2 den Ionenkanal CFTR mit Ezrin und dem Zytoskelett und schränken

so dessen Beweglichkeit ein (HAGGIE et al. 2004; BATES et al. 2006; HAGGIE et al. 2006).

Des Weiteren induzieren sie eine Dimerisation von CFTR und erhöhen so die

Wahrscheinlichkeit, dass der Ionenkanal geöffnet wird (S. WANG et al. 2000; RAGHURAM

et al. 2001).

2.3.3 Die Ionenaustauscher der Slc26-Familie

Zu der Familie der Ionenaustauscher Slc26 gehören zehn verschiedene Anionenaustauscher,

unter anderem DRA (Slc26a3) und PAT1 (Slc26a6) (MELVIN et al. 1999; LOHI et al. 2003;

KO et al. 2004; MOUNT u. ROMERO 2004). Die Ionentransporter der Slc26-Familie sind

gewebespezifisch. Die beiden Slc26-Anionentransporter im Darm (DRA und PAT1) werden

durch CFTR aktiviert und bewirken unter anderem den elektroneutralen Cl–/HCO3–-

Austausch (MOUNT u. ROMERO 2004).

2.3.3.1 Putative anion transporter 1 (PAT1)

PAT1, der auch als Slc26a6 bezeichnet wird, ist ein Anionenaustauscher (Z. WANG et al.

2002; CHERNOVA et al. 2005). Er transportiert zwei HCO3–-Ionen gegen ein Cl–-Ion

(MOUNT u. ROMERO 2004). Bisher wurde PAT1 in Niere, Pankreas und Darm lokalisiert.

Im Dünndarm liegt er apikal in der Bürstensaummembran (Z. WANG et al. 2002; LOHI et al.

2003).

2 LITERATUR 9

Da PAT1 und NHE3 in der apikalen Membran der Villi im Dünndarm koexprimiert werden

(Z. WANG et al. 2002; 2005), wird vermutet, dass diese beiden Austauscher für die

Absorption von Chlorid und Natrium im Dünndarm verantwortlich sind (HOOGERWERF et

al. 1996; SCHULTHEIS et al. 1998; ZACHOS et al. 2005). PAT1 ist in der Lage, zusätzlich

zu Bikarbonat auch Oxalate aus der Nahrung zu absorbieren (MOUNT u. ROMERO 2004).

Die Adapterproteine NHERF1 und NHERF2 binden ebenfalls an PAT1 und beeinflussen

dessen Funktion und Lokalisation (LOHI et al. 2003).

Bei PAT1-defizienten Mäusen konnte im Duodenum eine verminderte Bicarbonatsekretion

beobachtet werden (Z. WANG et al. 2005). Diese findet fast ausschließlich in der Spitze der

Mikrovilli statt (SIMPSON et al. 2007), der Exprimierungsstelle von PAT1.

2.3.3.2 Down regulated in Adenoma (DRA)

Der Anionenaustauscher DRA (Slc26a3) wurde zuerst als möglicher Tumorsuppressor im

Kolon entdeckt (SCHWEINFEST et al. 1993). Wie PAT1 gehört er zu der Slc26-Familie.

DRA wird in der apikalen Membran vom Darmepithel, vor allem im Duodenum, exprimiert

(SIMPSON et al. 2007) und transportiert ein HCO3–-Ion gegen zwei Cl–-Ionen (MOUNT u.

ROMERO 2004). Gemeinsam mit dem dominanteren Anionenaustauscher PAT1 und dem

Natrium-Protonenaustauscher NHE3 ist DRA für die elektroneutrale Natrium-

chloridabsorption im Darm zuständig und beeinflusst sowohl CFTR als auch NHE3

(SIMPSON et al. 2007).

Die Fehlfunktion dieses Transporters führt zu kongenitaler Chlorid-Diarrhöe (Chlorid-loosing

diarrhea = CLD) (HÖGLUND et al. 1996; CHERNOVA et al. 2003).

2.3.4 Natrium/Glucose Kotransporter (SGLT1)

Der Natrium/Glucose Kotransporter SGLT1 (sodium glucose linked transporter 1) ist

ebenfalls in der apikalen Membran der Darmzelle lokalisiert. Dieses Transportprotein bringt

je zwei Na+-Ionen und ein Glukosemolekül aus dem Darmlumen in die Zelle (MACKENZIE

et al. 1998; DIEZ-SAMPEDRO et al. 2004; DROZDOWSKI u. THOMSON 2006). Bei

einem niedrigen luminalen Glukosespiegel macht er sich die Energie des Natriumgradienten

10 2 LITERATUR

und das Membranpotential zu Nutze, um Glukose gegen ihren Gradienten in die Zelle zu

schleusen (DIEZ-SAMPEDRO et al. 2004; KELLETT u. BROT-LAROCHE 2005;

PFANNKUCHE u. GABEL 2009). Bei einem erhöhten Glukosespiegel im Lumen steigt die

Aktivität von SGLT1 und führt zur elektrogenen Natriumaufnahme (MACKENZIE et al.

1998; KELLETT u. BROT-LAROCHE 2005; DROZDOWSKI u. THOMSON 2006). Eine

erhöhte Transportrate des Natrium/Glukose-Kotransporters wiederum steigert im Darm die

Aktivität von NHE3 (TURNER u. BLACK 2001; ZHAO et al. 2004; SHIUE et al. 2005).

Zusammen mit Natrium und Glukose zieht SGLT1 auch Wasser mit in die Zelle (WRIGHT u.

LOO 2000).

2.3.5 Adapterproteine im Dünndarm

Adapterproteine sind multifunktionelle Proteine, d. h. sie binden an verschiedene Proteine

(WEINMAN 2001). LAMPRECHT et al. (2002) stellten Unterschiede in der Affinität

zwischen unterschiedlichen Adapterproteinen und verschiedenen Ionenaustauschern fest.

Möglicherweise übernehmen Adapterproteine so eine Schalterfunktion im Darm, um

zwischen Elektrolytresorption und -sekretion zu wechseln.

Ein wichtiger Mechanismus für die Interaktion von CFTR sowie NHE3 mit anderen Proteinen

ist das PDZ-Bindemotiv (meistens am C-terminalen Ende des Transportproteins), über das

Bindungen zu PDZ-Domänen von Adapterproteinen eingegangen werden können.

Zu den Adapterproteinen gehören auch die NHERF-Proteine, die im Darm exprimiert werden

(MILEWSKI et al. 2001; SWIATECKA-URBAN et al. 2002; GUGGINO 2004;

DONOWITZ et al. 2005a; 2005b; LAMPRECHT u. SEIDLER 2006; DONOWITZ u. LI

2007). NHERF-Proteine binden über ihre PDZ-Domänen an unterschiedliche

Transportproteine in der Zellmembran. Zu ihren Bindungspartnern gehören CFTR und NHE3,

die eine Schlüsselrolle bei der Regulierung von Elektrolyt- und Flüssigkeitstransport im Darm

spielen, aber auch DRA und PAT1, die gemeinsam mit CFTR und NHE3 die Salzabsorption

und Bicarbonatsekretion im Darm bewerkstelligen (KOCHER et al. 1998; LAMPRECHT et

al. 1998; LAMPRECHT et al. 2002; LOHI et al. 2003).

Expressionsstudien an verschiedenen Spezies geben Hinweise darauf, dass eine Interaktion

von NHERF-Adapterproteinen mit CFTR und auch NHE3 für viele Prozesse des jeweiligen

2 LITERATUR 11

Transportproteins in der Zelle entscheidend ist wie z. B. für Trafficking und

Membranabundanz (MOYER et al. 1999; 2000; MILEWSKI et al. 2001; SWIATECKA-

URBAN et al. 2002), Dimerisation (S. WANG et al. 2000; RAGHURAM et al. 2001),

Membrangängigkeit (CHA et al. 2004; HAGGIE et al. 2004; BATES et al. 2006; HAGGIE et

al. 2006), Membranretention und endozytisches Recycling (SWIATECKA-URBAN et al.

2002). Ebenso kommt es zu Interaktion mit anderen Transportern (BAGORDA et al. 2002;

KO et al. 2004; FAVIA et al. 2006; LI et al. 2007) und zur Bildung von Multiprotein-

Komplexen, die rezeptorvermittelte Signale direkt auf die Transportproteine übertragen

können (HALL et al. 1998; 1999; MAUDSLEY et al. 2000; LAU u. HALL 2001; NAREN et

al. 2003; HE et al. 2004; LI et al. 2005).

NHERF1, NHERF2 und PDZK1 (=NHERF3) verstärken in heterologen Expressionssystemen

die Aktivität von CFTR (SUN et al. 2000b; S. WANG et al. 2000; RAGHURAM et al. 2001).

Des Weiteren wird eine cAMP-induzierte Hemmung von NHE3 beschrieben, für die

NHERF1 oder NHERF2 erforderlich sind (LAMPRECHT et al. 1998; ZIZAK et al. 1999;

LAMPRECHT u. SEIDLER 2006; DONOWITZ u. LI 2007).

2.3.5.1 Na+/H+ exchanger regulatory factor Isoform 1 (NHERF1)

NHERF1 wurde als erstes NHERF-Protein entdeckt und wird daher teilweise auch nur

NHERF genannt (WEINMAN et al. 1995). NHERF1 entspricht dem humanen EBP50 (Ezrin-

binding phosphoprotein mit einem Molekulargewicht von 50 kDa) (RECZEK et al. 1997;

RECZEK u. BRETSCHER 1998; BRETSCHER et al. 2000). Es bindet an NHE3

(WEINMAN et al. 1995; FANNING u. ANDERSON 1999; WEINMAN et al. 2000a) und

CFTR (FANNING u. ANDERSON 1999; MOYER et al. 2000).

Durch PKA phosphoryliert und reguliert NHERF1 sowohl Na+/H+-Austauscher (YUN et al.

1997; FANNING u. ANDERSON 1999) als auch CFTR (RAGHURAM et al. 2003). An

dieser Regulation ist auch Ezrin beteiligt (LAMPRECHT et al. 1998; FANNING u.

ANDERSON 1999). Es entsteht ein Multiproteinkomplex aus Transportprotein, NHERF1,

PKA und Ezrin (WEINMAN et al. 2000a). In Zellkulturen von NHERF1 defizienten Mäusen

fehlt die cAMP-mediierte Hemmung von NHE3 (WEINMAN et al. 2003; CUNNINGHAM et

al. 2004).

12 2 LITERATUR

Strukturell ähnelt NHERF1 dem NHERF2 (WEINMAN et al. 1993; RECZEK u.

BRETSCHER 1998; YUN et al. 1998). Beide besitzen jeweils zwei PDZ-Domänen (LEE et

al. 2007) und eine ERM (Ezrin-Radixin-Moesin)-Domäne, mit der sie über Ezrin an Aktin im

Zytoskelett binden. Sie übernehmen teilweise auch gleiche Funktionen wie z. B. bei der

Bindung von CFTR, wobei es durch die ERM-Domäne zu einer räumlichen Annäherung an

PKA und dadurch zu einer Phosphorylierung und einer cAMP-vermittelten Aktivierung von

CFTR kommt (SHORT et al. 1998; SUN et al. 2000b). Beide binden auch an den

Anionenaustauscher PAT1 (LOHI et al. 2003). Des Weiteren haben beide die Fähigkeit zu

oligomerisieren und auf diese Weise signalgebende Komplexe zu begünstigen (LAU u.

HALL 2001).

Eine cAMP-unabhängige Aktivierung von CFTR kann NHERF1 auslösen, indem es einen

Multiprotein-Komplex aus dem ß2-adrenergen Rezeptor, Ezrin, PKA und CFTR vermittelt

(HALL et al. 1998; NAREN et al. 2003). Für die wechselseitige Regulation zwischen CFTR

und den Slc26-Austauschern ist NHERF1 unerlässlich (KO et al. 2004). NHERF1 bindet

jeweils an den C-Terminus von CFTR, NHE3, DRA und PAT1 (KO et al. 2004).

Bei der Steuerung von CFTR konkurriert NHERF1 mit dem Protein Shank2 um dieselbe

Bindungsstelle. Während NHERF1 die Wahrscheinlichkeit der Öffnung von CFTR steigert,

hemmt Shank2 die Aktivität des Chloridkanals (LEE et al. 2007).


NHERF2, der auch als E3KARP (NHE3 kinase A regulatory protein) bezeichnet wird, enthält

wie NHERF1 zwei PDZ-Domänen und eine ERM-Domäne, über die NHERF2 mit dem

Zytoskelett verknüpft ist (SUN et al. 2000b). Er erfüllt ähnliche Aufgaben wie NHERF1

(YUN et al. 1997; SHORT et al. 1998; SUN et al. 2000b). NHERF2 ist im Gegensatz zu

NHERF1 in der Lage, NHE3 nicht nur über PKA, sondern auch über die Proteinkinase C

(PKC) zu aktivieren (LAMPRECHT u. SEIDLER 2006).

2 LITERATUR 13

2.3.5.3 PDZ-domain protein by kidney 1 (PDZK1)

PDZK1 gehört ebenfalls zu den NHERF-Proteinen und wurde zuerst in Nierenkarzinomen

beschrieben (KOCHER et al. 1995). Es wird auch als NHERF3 oder CAP70 (=CFTR

associated protein mit einem Molekulargewicht von 70 kDa) bezeichnet (S. WANG et al.

2000). Im Dünndarm von Mäusen wird PDZK1 stark exprimiert (S. WANG et al. 2000;

KOCHER et al. 2003b).

PDZK1 enthält vier PDZ-Domänen (S. WANG et al. 2000), aber keine Ezrin-Radixin-

Moesin-Domäne. Dadurch unterscheidet es sich strukturell von NHERF1 und NHERF2

(SCHREIBER et al. 2004; DONOWITZ et al. 2005a; ZACHOS et al. 2005). Über seine PDZ-

Domänen bildet es ebenfalls makromolekulare Komplexe (S. WANG et al. 2000).

In vitro bindet PDZK1 an CFTR und NHE3 sowie an die Anionentransporter PAT1 und

DRA. Diese sind allesamt wichtige Transportproteine für die Anionensekretion und die

Salzabsorption im Darm. Die Aktivität des Ionenkanals CFTR wird z. B. durch die Bindung

an PDZK1 erhöht (S. WANG et al. 2000; GISLER et al. 2001). Neben den

Transportproteinen bindet PDZK1 aber auch an das Adapterprotein NHERF1 (GISLER et al.

2003b), das ebenfalls im murinen Dünndarm vorkommt. Daher wird vermutet, dass NHERF1

und PDZK1 gemeinsam Netzwerke aus Membranproteinen und regulatorischen

Komponenten in der apikalen Membran bilden (GISLER et al. 2003b).

Um die Funktion von PDZK1 innerhalb von Multiproteinkomplexen und seinen Einfluss auf

Ionenkanäle zu untersuchen, entwickelten KOCHER et al. (2003a) den PDZK1 Knock-out

Mäusestamm. Diese Mäuse zeigen keine offensichtlichen Krankheitserscheinungen, haben

eine normale Elektrolytkonzentration des Körpers und eine histologisch normale

Darmmukosa (KOCHER et al. 2003a). Der Lipoproteinmetabolismus der Leber ist jedoch

gestört (KOCHER et al. 2003b).


NHERF4 wird auch IKEPP (intestinal and kidney enriched PDZ protein) oder PDZK2

genannt. Wie PDZK1 enthält auch NHERF4 vier PDZ-Domänen und keine Ezrin-Radixin-

Moesin-Domäne (RAGHURAM et al. 2003; SCHREIBER et al. 2004; DONOWITZ et al.

14 2 LITERATUR

2005a). NHERF4 wird hier der Vollständigkeit halber als Mitglied der NHERF-Familie

erwähnt, wird in der vorliegenden Arbeit allerdings nicht weiter behandelt.

2.4 Die Ussing-Kammer

Das Verfahren der Ussing-Kammer dient der experimentellen Bestimmung des aktiven

Ionentransportes durch Epithelien und wurde zuerst von Ussing und Zerhan beschrieben. Mit

dieser Methode wurden zunächst an Froschhautepithelien parallele Messungen des

entstehenden Stroms und der Natriumbewegungen - die so genannten „Natriumfluxe“ -

durchgeführt (USSING u. ZERAHN 1951). Auf dieser Grundlage basiert das im Kapitel 4

„Material und Methoden“ beschriebene Messverfahren, mit dem die vorliegenden Daten

ermittelt wurden.

2.5 Bedeutung der Literatur für die eigene Fragestellung

Es ist bekannt, dass sowohl CFTR als auch NHE3 durch Multiproteinkomplexe gesteuert

werden, die aus dem Ionentransporter, Adapterproteinen, Ankerproteinen zum Zytoskelett

und den entsprechenden Proteinkinasen bestehen (SHENG u. SALA 2001; SHENOLIKAR et

al. 2004; LAMPRECHT u. SEIDLER 2006). Die Erforschung der genauen Bedeutung der

zuständigen PDZ-Adapterproteine hat jedoch erst begonnen.

Es wird vermutet, dass Adapterproteine nicht nur Proteinkomplexe bilden, die nur ein

Transportprotein beinhalten, sondern dass sie die Transporter über Komplexbildung

miteinander vernetzen und auf diese Weise eine wechselseitige Regulation der

Transportmechanismen in der Zelle erfolgt (LOHI et al. 2003).

Viele der bisherigen Erkenntnisse über PDZ-Proteine wurden anhand von heterologen

Expressionssystemen oder Zellkulturen gewonnen. Durch die Entwicklung von Knock-out

Mäusen kann inzwischen auch natives Gewebe untersucht werden. Anhand von

entsprechenden Knock-out Mäusen, denen das Transportprotein NHE3 (SCHULTHEIS et al.

1998) oder die Adapterproteine NHERF1 (SHENOLIKAR et al. 2002) oder PDZK1

(KOCHER et al. 2003a) fehlen, werden durch die vorliegenden in vitro-Studien am nativen

Darm Veränderungen des Salztransportes gezeigt. Diese Veränderungen werden durch ihr

2 LITERATUR 15

Fehlen in den Multiproteinkomplexen ausgelöst. Auch eine mögliche Kompensation durch

andere Adapterproteine kann in nativem Gewebe im Gegensatz zu Zellkulturen verdeutlicht

werden. Dadurch soll zum einen untersucht werden, wie die Adapterproteine die Interaktion

der verschiedenen Transportproteine miteinander steuern, und zum anderen, wie zwischen

Absorption und Sekretion im Darm umgeschaltet wird. Diese Steuerung von Absorption und

Sekretion ist sowohl bei sekretorischer Diarrhöe als auch bei zystischer Fibrose nicht mehr

intakt.

In Medikamente, die mit den PDZ-Bindungsstellen interagieren, werden große Hoffnungen

gesetzt (ZHONG u. NEUBIG 2001; DEV 2004; N. X. WANG et al. 2008b). Sie könnten eine

sehr effiziente Therapie gegen Diarrhöe darstellen (LAMPRECHT u. SEIDLER 2006; LEE et

al. 2007).

Die vorliegende Arbeit soll weitere Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen den

Transport- und Adapterproteinen in nativem Dünndarmgewebe bringen und somit einen

Beitrag zur künftigen Entwicklung von Antidiarrhoika leisten.

16 3 HYPOTHESE UND ZIELE

3 Hypothese und Ziele

Das Jejunum ist ein Gewebe, in dem zahlreiche Ionentransportprozesse stattfinden. Es wird

vermutet, dass es auch im nativen Gewebeverband des Darmes zu Fehlfunktionen der Salz-

und Flüssigkeitstransporte kommt, wenn Transport- oder Adapterproteine fehlen. Zu diesen

Proteinen gehören unter anderem das Transportprotein NHE3 sowie die Adapterproteine

NHERF1 und PDZK1. Es besteht die Möglichkeit, dass der Funktionsausfall eines einzelnen

Adapterproteins von einem anderen kompensiert werden könnte.

Die vorliegende Arbeit soll die Auswirkung der drei genannten Gendefekte auf die

Transportkapazität des Darmes darstellen. Des Weiteren soll anhand des nativen Jejunums

von NHE3-, NHERF1- und PDZK1 Knock-out Mäusen gezeigt werden, ob es zu

Kompensationen bei der Natriumaufnahme oder bei der Ladungsverschiebung kommt und

welche Einflüsse die Adapterproteine auf die Interaktion zwischen den Transportproteinen

haben. So sollen Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen den Transportproteinen

NHE3 und CFTR und ihren Adapterproteinen NHERF1 und PDZK1 sowie über die Funktion

dieser Proteine bei Natriumchloridabsorption und Anionensekretion in nativem

Dünndarmgewebe gewonnen werden.

Die Erkenntnisse über die einzelnen, an den Transportvorgängen beteiligten PDZ-Proteinen,

tragen dazu bei, Angriffsstellen an Proteinen auszumachen, die besonders geeignet sind, um

als Angriffspunkte für Antidiarrhoika zu fungieren. In der Zukunft könnten so Medikamente

entwickelt werden, die über ihre Interaktion mit PDZ-Domänen oder PDZ-Bindemotiven eine

effektive Therapie sowohl gegen Durchfallerkrankungen als auch gegen Verstopfungen

ermöglichen könnten.

4 MATERIAL UND METHODEN 17

4 Material und Methoden

Um die Rolle des Natrium/Protonenaustauschers NHE3 und seiner PDZ-Adapterproteine

NHERF1 und PDZK1 bei der intestinalen Anionensekretion und Natriumchloridabsorption zu

erforschen, wurden in vitro Versuche an isolierten Epithelien des Jejunums von Mäusen

durchgeführt.

Die Ussing-Kammer, eine Vorrichtung für Ionentransportstudien, wird in Kapitel 4.2

„Ussing-Kammer-Experimente“ beschrieben. Mit dieser Versuchsapparatur wurden die in

vitro Versuche unternommen, bei denen nicht die Funktion eines einzelnen Proteins gemessen

wurde, sondern die Funktion eines Gewebeverbandes mit allen darin enthaltenen Zellspezies.

Durch diese Ussing-Kammer-Versuche konnte bei den gendefizienten Mäusen beurteilt

werden, welche Funktion die Tunica mucosa des Darmes als solche noch erbringen konnte,

wenn ein bestimmtes Gen fehlte.

4.1 Tiere

Als Versuchsmaterial kam isolierter Darm von Knock-out Mäusen sowie von deren gesunden

Wurfgeschwistern als Kontrollgruppe zum Einsatz. Als Elterntiere wurden sowohl

heterozygote als auch homozygote Mäuse eingesetzt. Da die gesunden Geschwister sich nur

durch den gewünschten Gendefekt von den Knock-out Mäusen unterschieden, wurden somit

nur diejenigen Unterschiede in den Ionenverschiebungen gemessen, die durch den

entsprechenden Gendefekt ausgelöst wurden. Den Mäusen fehlte entweder das

Transportprotein NHE3 oder eines der Adapterproteine NHERF1 und PDZK1. Alle diese

Proteine gehören zu Multiproteinkomplexen, die unter anderem bei der Natriumpassage durch

das Darmepithel eine Rolle spielen. Ihre genaue Funktion wird in den Kapiteln 4.1.1 bis 4.1.3

für die unterschiedlichen Mäuse beschrieben.

Pro Versuchsgruppe wurden acht bzw. neun Tiere untersucht. Über geschlechtsspezifische

Unterschiede bei der Sekretion und Absorption von Anionen und Salzen ist nichts bekannt.

Da diese auch für die vorliegende Fragestellung nicht von Interesse sind, wurden für die

vorliegenden Versuche Tiere beiderlei Geschlechts verwendet. Die Geschlechterverteilung in

den jeweiligen Knock-out- sowie deren Kontrollgruppen ist in allen Versuchsgruppen

identisch (In der NHE3 Versuchsgruppe je fünf männliche und drei weibliche Tiere bei den

18 4 MATERIAL UND METHODEN

Knock-out Mäusen und in der Kontrollgruppe, in der NHERF1-Versuchsgruppe je fünf

männliche und vier weibliche Tiere, in der PDZK1-Versuchsgruppe je vier männliche und

vier weibliche Tiere). Um pro Tier möglichst viele Daten gewinnen zu können, wurden von

jedem Tier bis zu sechs Darmstücke parallel gemessen.

Die in dieser Arbeit verwendeten Mäuse wurden im Alter von ca. drei Wochen mittels

Polymerase Kettenreaktion genotypisiert. Damit war sichergestellt, dass die Tiere auch den

gefragten Gendefekt besaßen.

Im Alter von drei bis vier Monaten wurden die Tiere mit einem Gewicht von ca. 20 g für die

Versuche herangezogen.

Der Darm der PDZK1- und NHERF1-defizienten Mäuse wies bei der Präparation für die

Versuche keine makroskopisch oder lichtmikroskopisch sichtbaren Veränderungen zu

Normalmäusen auf. Bei den NHE3 defizienten Mäusen fiel makroskopisch eine Dilatation des

gesamten Darmtraktes auf. Diese war besonders in Zäkum und Kolon stark ausgeprägt.

Die gesunden Wurfgeschwister dienten jeweils als Kontrollgruppe.

4.1.1 NHE3 Knock-out Mäuse

Dem Natrium/Protonen-Austauscher Isoform3 (NHE3), den das Maus-Gen Slc9a3 kodiert,

wird eine Bedeutung an der verringerten Natrium- und Wasserabsorption bei

Durchfallerkrankungen zugeschrieben (SCHULTHEIS et al. 1998). Die NHE3 Knock-out

Mäuse wurden von der Arbeitsgruppe von G. E. Shull an der University of Cincinnati

entwickelt, um die physiologische Bedeutung von NHE3 bei verschiedenen Krankheiten zu

untersuchen. SCHULTHEIS et al. beschrieben die Entwicklung der NHE3 Knock-out Mäuse

und ihren Phänotyp. Der Phänotyp der NHE3-defizienten Mäuse deutete durch die Dilatation

des Darmes auf eine wichtige Rolle von NHE3 bei der Natriumchlorid- und Wasserabsorption

in Niere und Darm hin. Die Tiere litten unter einer leichten Diarrhöe, einem intestinalen

Absorptionsdefekt, einer milden Azidose und erniedrigtem Blutdruck. Der Darm war

erweitert und der Darminhalt war alkalischer als bei gesunden Mäusen. In der Niere war die

Bikarbonat- und Flüssigkeitsresorption gestört (1998). Die aus Cincinnati stammende

Zuchtlinie wurde zunächst über etliche Jahre mit dem original kongenen Background an der


Universität Essen gezüchtet und dann an der Medizinische Hochschule Hannover mit dem

original 129 Background weitergezüchtet.

4.1.2 NHERF1 defiziente Mäuse

NHERF1 ist für die Hemmung von NHE3 unerlässlich. Um diesen Mechanismus in der Niere

näher zu untersuchen, wurden die NHERF1-defizienten Mäuse im Labor von E. J. Weinman

im Duke University Medical Center in Durham entwickelt. Bei den männlichen Mäusen

wurden histologisch unauffällige Organe sowie normale Elektrolytspiegel im Blut

beschrieben, mit Ausnahme einer verminderten Phosphatkonzentration im Serum, die mit

einem renalen Phosphatverlust einhergeht. Die weiblichen Tiere hingegen waren kleiner und

schwächer und gingen innerhalb ca. eines Monats ein (SHENOLIKAR et al. 2002). Die für

die vorliegenden Versuche eingesetzten Mäuse waren alle fünf Generationen mit dem

genetischen Background FVB/n rückgekreuzt worden. Die weiblichen NHERF1-Null-Mäuse

wiesen keine Unterschiede bezüglich Lebensfähigkeit und Fruchtbarkeit zu den Wildtyp-

Mäusen auf, die früher beschrieben wurden.

4.1.3 PDZK1 Knock-out Mäuse

Das Protein PDZK1 wurde erstmals in Nierenkarzinomen beschrieben (KOCHER et al.

1995). Um seine Wirkung auf den Lipoproteinmetabolismus zu untersuchen, wurden die

PDZK1 Knock-out Mäuse von O. Kocher im Beth Israel-Deaconess Medical Center in

Boston, USA entwickelt (KOCHER et al. 2003a; 2003b). Ihnen liegt der Mäusestamm

C57BL/6 und 129SvEv zugrunde, aus dem das PDZK1-Gen durch homologe Rekombination

entfernt wurde. Diese Mäuse haben eine normale Elektrolytkonzentration des Blutes und eine

histologisch normale Darmmukosa (KOCHER et al. 2003a).

4.1.4 Haltungsbedingungen

Alle Tiere wurden im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover unter

standardisierten Licht- und Klimakonditionen gezüchtet und gehalten. Die Mäuse wurden bis

zum Tag des Experimentes ad libitum mit Nahrung und Wasser versorgt. Die


Zusammensetzung des Futters entsprach dem Standard für Versuchsmäuse, so dass ein

unerwünschter Einfluss auf die Darmentwicklung und seine Aktivität vermieden wurde.

Die Tierversuche erfolgten nach den zugelassenen Regeln der Medizinische Hochschule

Hannover und der örtlichen Behörden für Tierschutz (Regierungspräsidium).

4.1.5 Tötung der Mäuse und Gewinnung des Gewebes

Die Betäubung der Tiere erfolgte mit 100%igem CO2, das in eine geschlossene Box

eingeleitet wurde. Nach Befüllen der Box wurde das Tier eingesetzt und gewartet, bis es

betäubt war. Die Tötung erfolgte unmittelbar im Anschluss durch zervikale Dislokation.

Zunächst wurde das Abdomen entlang der Linea alba eröffnet, der Magen-Darmtrakt bis

einschließlich Kolon entnommen und unmittelbar danach, noch bevor er eröffnet wurde, mit

4°C kalter, sauerstoffgesättigter modifizierter Ringerlösung gespült, um den Darminhalt zu

entfernen. Zusammensetzung und Temperatur dieser Lösung dienten auch dazu, die

Ischämietoleranz des Gewebes zu erhöhen sowie eine Autolyse zu vermeiden. Der Zusatz von

Indomethazin unterdrückte die traumatisch bedingte Prostaglandin-Ausschüttung. Das für die

Versuche verwendete Jejunum wurde bis zur Präparation in dieser Lösung aufbewahrt.

4.1.6 Präparation der Mukosa

Für den Versuch musste das verwendete Epithel, die Tunica mucosa, frei von darunter

gelegenen Gewebeschichten sein. Hierfür wurde das Darmstück entlang des Mesenteriums

mit einer feinen Schere eröffnet und in einer mit Paraffin ausgegossenen Kunststoffschale

mittels Insektennadeln unter dem Mikroskop fixiert. Über seitlich in die Schale eintretende

Glasfaserkabel wurde das Präparat beleuchtet. Die Präparation fand ebenfalls in frischer,

kalter und oxygenierter Ringerlösung statt. Unter dem Stereomikroskop (Vergrößerung 10 x

21) wurde das Darmstück nun durch das so genannte „Strippen“ vorsichtig von Muskulatur

und Serosa befreit. Dabei wurden die Tunica serosa, Tunica muscularis, Stratum longitudinale

und circulare und - soweit möglich - auch die Tela submukosa mit einer spitzen Pinzette

abpräpariert, bis die Zottenstruktur der Tunica mukosa erkennbar war. Danach wurde das

präparierte Darmstück zwischen den Hälften der Plexiglaskammer aufgespannt und in die

vorbereitete Versuchsapparatur (siehe Kapitel 4.2.1 „Die Ussing-Kammer“) eingesetzt. Mit


der Äquilibrierungsphase des Versuches wurde unmittelbar begonnen. Während dieser Phase

sollten die Messwerte eine Stabilität erreichen, auf deren Grundlage die eigentliche Messung

begonnen werden konnte. Nur Gewebestücke, die in dieser Zeit adäquate Werte aufwiesen,

wurden für die Versuche herangezogen.

Eine unvollständige Entfernung des Plexus submucosus während der Präparation könnte

ungewollte Signalschwankungen des Kurzschlussstroms (Isc) und der transepithelialen

Potentialdifferenz (PDt) verursachen. Um diese zu vermeiden, wurde Tetrodotoxin (TTX), das

Gift des Kugelfisches, zugegeben. Es hemmt die schnellen Natriumkanäle neuronaler Zellen.

So wurde die Neurotransmitterausschüttung blockiert und Signalschwankungen von Isc und

PDt vermieden.

4.2 Ussing-Kammer Experimente

Mit der Ussing-Kammer, einem nach dem dänischen Physiologen Hans Henriksen Ussing

benannten Verfahren, werden Ionentransportstudien an isolierten Epithelien durchgeführt. Der

Versuchsaufbau der Ussing-Kammer wird in Abb. 2 (Seite 22) dargestellt.

4.2.1 Die Ussing-Kammer

Die Versuche mit der Ussing-Kammer dienten in der vorliegenden Arbeit der Messung von

Ionentransporten durch isolierten Dünndarm von Mäusen. Die Versuchsapparatur wurde

durch das zu untersuchende Epithel in zwei Kompartimente unterteilt. Dabei zeigte die

mukosale oder auch als luminal bezeichnete Seite des Darmgewebes zur linken

Kammerhälfte, die Serosafläche zur rechten Kammerhälfte.

Das präparierte Darmstück wurde in eine zweiteilige Plexiglaskammer, die eigentliche

Ussing-Kammer, eingespannt, die die Gewebefläche auf 0,067 cm² definierte. Zwischen

Gewebe und Plexiglaskammer lagen „O“-Ringe aus dünnem Parafin („Parafilm“), um die

Druckstellen am Rand des Gewebes, die so genannten „Edge damages“ zu minimieren.

Der darüberliegende Teil der Versuchsapparatur bestand aus zwei doppelwandigen

Glassäulen, die zwei getrennte Flüssigkeitskreisläufe besaßen. Der äußere Kreislauf führte

37°C warmes Wasser, das kontinuierlich zwischen dem Glasreservoir und einem Wasserbad

22

Abb. 2: Schematische Darstellung des Ussingbestehend aus Pufferreservoiren, Plexiglaskammer, Elektroden und Messstation

zirkulierte und als Wärmequelle diente. Der innere Kreislauf stellte ein nach oben

zugängliches Pufferreservoir dar, durch das die Zugabe von Substanzen sowie die Abnahme

von Proben ermöglicht wurden. Das Gewebe wurde auf beiden Seiten mit Pufferlösungen

4 MATERIAL UND METHODEN

: Schematische Darstellung des Ussing-Kammer-Setups, bestehend aus Pufferreservoiren, Plexiglaskammer, Elektroden und Messstation




ATERIAL UND METHODEN

bestehend aus Pufferreservoiren, Plexiglaskammer, Elektroden und Messstation





umspült, deren genaue Zusammensetzung unter dem Kapitel 4.6 „Substanzen und Lösungen“

aufgeführt wird.

Beide Pufferlösungen wurden während des gesamten Versuches mit Carbogen, einem

Gasgemisch aus 95% O2 und 5% CO2, in Raumtemperatur mit einem Druck <1 bar begast,

der durch Druckminderer an den Gasflaschen und an der Versuchsapparatur eingestellt wurde.

Dieser „Gaslift“ versorgte das Epithel mit Sauerstoff und bewirkte gleichzeitig eine

kontinuierliche und gleichmäßige Zirkulation der Lösungen. Beides diente der Erhaltung der

Funktion des Darmgewebes.

Die Glassäulen und die Ussing-Kammer waren über Schläuche miteinander verbunden. Die

elektrische Messung erfolgte durch die unter Kapitel 4.2.2. „Bestimmung der

elektrophysiologischen Parameter“ beschriebene Messanlage, die über Elektroden mit der

Ussing-Kammer verbunden war.

Der genaue Ablauf der Versuche wird unter Kapitel 4.3 „Versuchsablauf“ beschrieben.

4.2.2 Bestimmung der elektrophysiologischen Parameter

Für die Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Parameter als

Kenngrößen des Dünndarmepithels ermittelt:

Der Kurzschlussstrom (Isc) als Ausdruck der elektrogenen Resorptions- und

Sekretionsleistung des Epithels und

die Gewebeleitfähigkeit (Gt) als Maß für die Dichtigkeit und Integrität des Gewebes.

Signifikante Veränderungen der Gt konnten ein Hinweis auf Schädigung des Gewebes sein.

Mit einer computergesteuerten Voltage / Current Clamp Messstation, die an einen PC

angeschlossen war, erfolgte die kontinuierliche Anzeige und Erfassung der

elektrophysiologischen Parameter sowie die Applikation von Strom. Sämtliche Messgrößen

[Gewebeleitfähigkeit (Gt), Kurzschlussstrom (Isc) und Gewebepotentialdifferenz (PDt)]

konnten numerisch oder grafisch für jede Kammer getrennt erfasst und dargestellt werden.

Die Ussing-Kammer wurde über zwei Elektrodenpaare mit der Messeinrichtung verbunden.

Diese Elektroden bestanden aus jeweils einer Kunststoffhülse, die mit in KCl gelöster

Agarose ausgegossen war. In die Kunststoffhülse war eine Silberelektrode eingebettet. Die


entstandenen Agarosegelbrücken verbanden also die eigentlichen Strom- bzw.

Spannungselektroden mit der Ussing-Kammer.

Die linke Kammerhälfte, zu der die mukosale Seite des Darmgewebes zeigte, wurde an den

Minuspol angeschlossen, während der Pluspol der rechten Kammerhälfte mit der Serosafläche

verbunden war. Über das gewebenahe Elektrodenpaar (blau, voltage) wurde die

transepitheliale Potentialdifferenz (PDt) zwischen der mukosalen und der serosalen

Epithelseite gemessen. Über die gewebefernen Elektroden (rot, current) konnte ein externer

Strom (I) auf das Epithel übertragen werden (siehe Seite 22, Abb. 2: „Schematische

Darstellung des Ussing-Kammer-Setups“).

Die Potentialdifferenz zwischen den getrennten Kompartimenten entstand durch elektrogene

Ionentransportmechanismen am Epithel.

Bei den Ussing-Kammer-Versuchen werden zwei Messmodi unterschieden: Der Open-circuit-

und der Short-circuit-Modus.

Open-circuit-Modus:

Die sich über das Gewebe einstellende Potentialdifferenz wird in diesem Modus nicht

ausgeglichen, sondern nur gemessen. So bleibt der transepitheliale elektrische Gradient

erhalten und beeinflusst nach wie vor den Ionentransport.

Während der Äquilibrierungsphase diente diese Messeinstellung der Erholung des Gewebes

von den vorangegangenen Manipulationen bei Entnahme, Präparation und Einspannen.

Die transepitheliale Potentialdifferenz bzw. Spannung (U) wurde direkt über die gewebenahen

Agarosegelbrücken gemessen. Für die Ermittlung von Gewebewiderstand (Rt) und

Leitfähigkeit (Gt) wurde ein definierter Strompuls (∆I) (von 100 µA und <1 s Dauer) durch

die gewebefernen Agarosegelbrücken über das Gewebe geleitet. Durch den Widerstand des

Gewebes entstand eine kurzfristige Änderung der Potentialdifferenz (∆PDt). Aus dieser ließen

sich Gewebewiderstand und Leitfähigkeit nach dem ohmschen Gesetz (U=R·I) berechnen.


Der Gewebewiderstand berechnet sich wie folgt:

R� = ∆PD�

∆I

Der reziproke Wert des Gewebewiderstandes entspricht der Gewebeleitfähigkeit:

G� = 1

R�

Daraus ergibt sich für die Gewebeleitfähigkeit die Formel

G� = ∆I

∆PD�

U=Spannung: Dafür wird die Potentialdifferenzänderung (∆PDt) eingesetzt.

R=Widerstand: Hier handelt es sich um den Gewebewiderstand (Rt).

I=Stromstärke: Es werden die definierten Strompulse ∆I angenommen.

Short-circuit-Modus

Unter diesen so genannten Kurzschlussstrombedingungen wird die Potentialdifferenz durch

eine externe Stromquelle über die gewebefernen Elektroden auf 0 mV ausgeglichen. Dadurch

werden elektrogen angetriebene Ionentransporte unterbunden. Der hierzu benötigte Strom

wird Klemmstrom (Ic) genannt.

Die 22Na+-Flux-Studien wurden unter Short-circuit-Bedingungen durchgeführt. Der Ic gleicht

den elektrischen Gradienten zwischen beiden Kammerhälften als mögliche Triebkraft des

Ionentransportes aus. In den Versuchen für diese Arbeit wurde somit gewährleistet, dass die

gemessenen Natriumverschiebungen nicht durch die entstehende Potentialdifferenz bedingt

waren. Veränderungen im Ic zeigten Ionenbewegungen an, die einen elektrischen Gradienten

über dem Gewebe aufbauten.

Da das Dünndarmepithel durch seine gut durchlässigen tight junktions (Schlussleisten) ein so

genanntes „leaky epithelium“ darstellt, kann es als annähernd kurzgeschlossen angesehen

werden. Der entstehende Strom wird Kurzschlussstrom (short-circuit-current oder Isc)

genannt. Der eingespeiste Strom (Ic) entspricht in seinem Betrag dem Kurzschlussstrom (Isc),


der durch den aktiven Transport von Ionen durch das Epithel erzeugt wird. Dieser Strom ist

jedoch entgegengesetzt gerichtet (Ic = -Isc).

Definitionsgemäß ist der Isc positiv, wenn die positiven Ladungsträger von mukosal nach

serosal wandern. Dies geschieht entweder durch eine Resorption von Kationen (von mukosal

nach serosal) oder durch Anionensekretion (von serosal nach mukosal).

In diesem Kurzschlussmodus schaltete die Voltage / Current Clamp-Einrichtung alle sechs

Sekunden in den open-circuit-Modus, um die Potentialdifferenz zu messen und die

Gewebeleitfähigkeit zu berechnen.

Da die Potentialdifferenz als Folge von Ionentransport durch das Gewebe entstanden ist,

entspricht der externe Ausgleichsstrom (Ic) dem aktiven Ionentransport durch das Epithel,

vorausgesetzt es liegt kein chemischer Gradient vor, der passive Ionenbewegungen induziert.

Daher müssen Ionenkonzentration und pH-Wert auf beiden Seiten des Epithels gleich sein.

Dies war in den vorliegenden Versuchen durch entsprechende Pufferlösungen gewährleistet.

Der Kurzschlussstrom wird in µA/cm² gemessen und mit dem Faktor 0,03744 in

µmol/(cm2·h) umgerechnet. Findet ein Nettoionentransport von einem µmol eines einwertigen

Ions (1 µEq) in einer Stunde über eine Gewebefläche von 1 cm2 statt, so entspricht das einem

Isc von 1 µEq/(cm2·h). Bei einem einwertigen Ion - wie in den vorliegenden Daten das

Natrium - kann man 1 µEq mit 1 µmol gleichsetzen. Das ergibt dann einen Isc von

1 µmol/(cm²·h). 1µA entspricht dem Netto-Flux von 10,4 pmol/s eines univalenten Ions.

Daraus berechnet sich die Formel für die Umrechnung:

1 μA

cm²= 0,03744

μmol

cm² ∙ h

So wird ein direkter Vergleich mit der zugrunde liegenden Ionenverschiebung und den

Fluxraten ermöglicht.

Die Gewebeleitfähigkeit wird in mS/cm² angegeben.


4.2.3 Isotopen-Fluxe

Isotopen-Fluxe sind Bewegungen einer Menge von Ionen über eine semipermeable Membran.

Ionen bewegen sich sowohl passiv durch Diffusion als auch durch aktive Transportprozesse

der Zelle. Sie wandern von serosal nach mukosal und in entgegengesetzter Richtung.

Der Isc spiegelt nur die Summe der Ionenbewegungen durch das Epithel wider, gibt aber

keinen Aufschluss darüber, welche Ionen im Einzelnen an seiner Entstehung beteiligt sind.

Die Bewegung bestimmter Ionen kann mit Hilfe geeigneter Nuklide gemessen werden.

In den hier vorliegenden Versuchen kam das radioaktive Isotop 22Na+ zum Einsatz, wobei der

Nettonatriumflux die Summe sämtlicher Bewegungen von Natriumionen über das Epithel

darstellte, aktiv wie passiv. Berechnet wurde der Nettonatriumflux aus den jeweils in die

einzelnen Richtungen gemessenen Fluxe.

Die 22Na+-Fluxstudien wurden unter Short-circuit-Bedingungen durchgeführt, um den

elektrogen bedingten Ionentransport auszuschalten.

Nach der Stabilisierung der Isc und Gt-Werte (etwa 20-30 Minuten nach dem Aufspannen)

wurde in das Pufferreservoir entweder der serosalen oder mukosalen Kammerhälfte

radioaktives 22Na+ einpipettiert. Dies wurde als so genannte „heiße Seite“ bezeichnet. Je

nachdem auf welcher Seite das 22Na+ zugegeben wurde, konnte der Natriumionentransport

von serosal nach mukosal (JNasm) oder umgekehrt (JNa

ms) gemessen werden. In der einen

Hälfte der Kammern, die mit Gewebestücken einer einzigen Maus bestückt waren, wurde der

Natriumtransport von mukosal nach serosal gemessen. Hier wurde das Natriumisotop der

mukosalen Pufferlösung zugegeben. Um die Fluxrate von serosal nach mukosal zu messen,

wurde den anderen Kammern der radioaktive Tracer serosal zugegeben. Die zugegebene

Menge Natrium betrug jeweils 74 kBq/ml.

Da die Strahlung von 22Na+ aus einem β- und einem γ-Anteil besteht, konnten die

Natriumproben ohne weitere Zusätze in einem γ-Zähler gemessen werden.

Anhand der Ergebnisse, die in Counts pro Minute (cpm) angegeben wurden, wurde die

Fluxrate (J) von mukosal nach serosal bzw. serosal nach mukosal nach der folgenden Formel

bestimmt:


J��Na�� =

∆cts ∙ (t$ − t&) ∙ c(

cts) ∙ ∆t ∙ A ∙ V+

J22Na+m-s= Natrium-Fluxrate von mukosal nach serosal

∆ cts = Differenz der Counts von zwei aufeinander folgenden Abnahmen [cpm]

(t1-t0)= Abnahmeintervall

cm= Konzentration des nicht markierten Ions [mmol]

ctsh= Mittelwert der Counts der heißen Seite

∆t= Abnahmeintervall [h]

A= Epithelfläche [cm²]

Vp= Probenvolumen [ml]

Die Fluxrate wurde als Ionenzahl pro Fläche und Zeiteinheit [µmol/(cm²·h)] angegeben.

Die Nettofluxrate war die Differenz der unidirektionalen Fluxraten ( Jnet=Jms-Jsm). Sie gab die

Summe der Ionenbewegungen des radioaktiven Ions wieder.

JNanet=JNa

ms-JNa

sm

4.3 Versuchsablauf

Bei dieser Versuchsanordnung konnten bis zu sechs Diffusionskammern gleichzeitig und

unabhängig voneinander bedient werden.

Das Experiment umfasste einen Zeitraum von 165 Minuten nach Zugabe des Isotops. Zuvor

gab es eine ca. 30-minütige Äquilibrierungsphase, in der sich die Werte einpendelten. Danach

erfolgte nach 85 Minuten eine Stimulation mit serosal zugegebenem Forskolin (10 µM) und

nach 125 Minuten die luminale Zugabe von D-Glukose (25 mM). Der Versuchsablauf ist in

Abb. 3 auf Seite 29 abgebildet.

Die Zugabe von Forskolin bewirkt eine cAMP abhängige Stimulation von PKA und stimuliert

durch den erhöhten cAMP-Spiegel die Chloridsekretion. Dadurch steigt der Isc an.

4 MATERIAL UND METHODE

Abb. 3: Versuchsablauf

MATERIAL UND METHODEN 29


Glukose aktiviert den Natrium/Glukose-Kotransporter SGLT1 und führt so zu verstärkter

Aufnahme von Glukose und diente in den vorliegenden Versuchen als Kontrolle für die

Vitalität des Gewebes. Der Isc steigt ebenfalls an.

Während der gesamten Versuchsdauer erfolgte alle sechs Sekunden eine Aufzeichnung des Isc

und der Gt. Beide wurden sowohl als Verlaufskurve als auch als Balkendiagramm dargestellt,

wobei die Balken den Plateaus entsprechen, die sich basal und nach Zugabe der Stimulanzien

eingependelt hatten.

Bevor das Darmgewebe in die Ussing-Kammer eingespannt werden konnte, mussten bei

leerer Plexiglaskammer folgende Werte ermittelt werden: Zum einen der

Flüssigkeitswiderstand (Rf), der durch die Pufferlösungen zwischen den Messflächen der

Agarosegelbrücken besteht und zum anderen das Eigenpotential der spannungsmessenden

Elektrode (DPe).

Danach konnte die Ussing-Kammer geöffnet werden, um das präparierte Gewebe einzusetzen

und den Versuch zu beginnen. Die Voltage-Clamp-Anlage korrigierte dann die ermittelten

Parameter automatisch um das Elektrodeneigenpotential und den Flüssigkeitswiderstand.

Durch die Umspülung des Gewebes mit isoosmolaren Pufferlösungen in denselben Volumina

existierten weder ein Ionen- noch ein Druckgradient. Dadurch entstanden keine treibenden

Kräfte für eine passive Nettoionenverschiebung.

Die Pufferlösungen unterschieden sich auf der mukosalen und der serosalen Seite des

eingespannten Gewebes. Beide Lösungen sind unter Kapitel 4.6 „Substanzen und Lösungen“

aufgeführt. Da beide Pufferlösungen isoosmolar waren und identische Volumina eingesetzt

wurden, waren sowohl der hydrostatische Druck als auch der Konzentrationsgradient als

Triebkraft für Ionenbewegungen ausgeschaltet.

Das Indomethazin in der basolateralen Pufferlösung hemmt die endogene

Prostaglandinsynthese und hemmt dadurch die cAMP-Synthese, welche sonst die Chlorid-

und Bicarbonatsekretion stimulieren würde.

Tetrodotoxin hemmt die schnellen Natriumkanäle von Neuronen und verhindert

Signalschwankungen von Isc und PDt. Es wurde ebenfalls der basolateralen Pufferlösung

zugesetzt.


Nach Einpendeln der Basalwerte bewirkte Forskolin die Hemmung von NHE3 sowie die

Stimulation von CFTR über cAMP.

Eine luminale Erhöhung der Glukosekonzentration zum Ende des jeweiligen Versuches

stimulierte den elektrogenen SGLT1 und diente als Vitalitätskontrolle des Gewebes.

Einige der vielen aktiven Ionentransportmechanismen an Epithelien sind elektrogen (unter

anderem durch CFTR und SGLT1), das heißt sie erzeugen über dem Epithel eine

Potentialdifferenz bzw. Spannung. Diese wird durch den Kurzschlussstrom-Modus

ausgeglichen.

Nachdem das Gewebestück eingespannt wurde und die Isc und Gt-Werte sich eingependelt

hatten (etwa 20-30 Minuten nach dem Aufspannen), wurde das radioaktive 22Na+ zugegeben.

Es folgte eine weitere Äquilibrierungsphase von 45 Minuten und dann wurden alle

20 Minuten fünf Aliquots à 100 µl aus beiden Reservoiren abgenommen. Insgesamt erfolgten

sieben Abnahmen, aus denen sechs Flux-Intervalle berechnet wurden. Direkt nach der dritten

Probenabnahme, also nach zwei Intervallen, erfolgte bilateral die Zugabe von Forskolin. Nach

zwei weiteren Abnahmen wurde mukosal Glukose zugegeben und erneut zwei Proben

abgenommen.

Der Versuchsablauf war für alle Versuche bei allen Mäusegruppen gleich. So konnte nicht nur

zwischen den einzelnen Defekten und dem jeweiligen Wildtyp verglichen werden, sondern

auch Rückschlüsse auf Unterschiede zwischen den verschiedenen Gendefekten gezogen

werden, da die Messbedingungen gleich waren.

4.4 Geräte

Die Ussing-Kammern wurden von der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung

gestellt. Sie bestanden aus zwei Plexiglas-Zylindern, die eine ovale, 0,067 cm² große Öffnung

an der Gewebeseite hatten und je vier „Lüer“-kompatible Steckverbindungen an der runden

Außenseite besaßen. Über zwei dieser Lüer-Verbindungen erfolgte der Anschluss des

Glasreservoires und über die anderen beiden die Volt- bzw. Stromelektrode.

Die Glasreservoire sowie deren Halterungen wurden von der Firma World Precision

Instruments (WPI) in Sarasota, USA hergestellt.


Die Silberelektroden incl. Kunststoffhülsen stammten ebenfalls von der Firma WPI. Die

Agarosegelbrücken wurden vor den Versuchen im Labor der Gastroenterologie gegossen.

Dafür wurden 0,6 g 3%ige Agarose in 20 ml 3 molarer KCl-Lösung durch Erwärmen gelöst

und die Flüssigkeit mit Hilfe einer Spritze und eines Silikonschlauches in die Kunstoffhülsen

gefüllt. Nachdem das Agarosegel erkaltet war, wurde die Silberelektrode aufgeschraubt.

Kurze Hülsen wurden für die gewebenahen Messelektroden verwendet, lange Hülsen für die

gewebefernen Strom applizierenden Elektroden.

Das Mikrocomputer gestützte Voltage / Current Clamp Interface stammte von der Firma

Mußler, Aachen. Sie erfasste und berechnete die Daten der sechs Kammern gleichzeitig und

unabhängig voneinander. Da die Kammern nicht zeitgleich von einer Person mit Gewebe

bestückt und Proben abgenommen werden konnten, arbeitete jede Kammer etwas zeitversetzt.

So konnten die einzelnen Kammern separat bedient und ausgewertet werden.

Die für die Präparation verwendete Lichtquelle „Lumina“ wurde von der Firma Chiu

Technical Corporation, USA hergestellt. Sie brachte über lichtleitende Glasfaserkabel das

Licht sehr nah an das Gewebe heran, ohne Wärme zuzuführen, die bei der Präparation

unerwünscht gewesen wäre.

Das Stereomikroskop stammte von der Firma Wild Heerbrugg, Schweiz und war das Modell

M3Z, bei dem die Vergrößerung von 10 x 21 genutzt wurde.

Der Gamma-Zähler für die Messung der radioaktiven Natriumproben war der γ-Counter

Wallac 1480 WIZARDTM3’’ der Firma Wallac, Turku, Finnland.

4.5 Statistik und Darstellung der Ergebnisse

Wie die Übersicht in Kapitel 4.3 „Versuchsablauf“ (Seite 29) zeigt, wurden zwei basale

Natriumfluxe und je zwei Fluxe nach Stimulation mit Forskolin und Glukose gemessen. Die

aufeinander folgenden zwei Fluxperioden wurden jeweils zu einem gemeinsamen Mittelwert

für basale und Forskolin- bzw. Glukose-stimulierte Fluxe zusammengefasst, wenn sie sich

nicht statistisch signifikant voneinander unterschieden.

Eine Ausnahme bildete die PDZK1-Versuchsgruppe, bei der die Fluxe nach Stimulation mit

Forskolin getrennt dargestellt wurden (1. nach Forskolin; 2. nach Forskolin).


Alle Ergebnisse wurden als arithmetische Mittelwerte (MW) zusammen mit dem

Standardfehler des Mittelwertes (± SEM = standard error of mean) dargestellt. Die statistische

Signifikanz wurde durch den t-Test nach Student bestimmt. Werte von p<0,05 wurden als

statistisch signifikant angesehen.

Die Auswertung der ermittelten Rohdaten erfolgte mit der Software Excel von Microsoft.

Für die Statistik wurde n=1 definiert als arithmetisches Mittel der Werte von einer Maus. n=x

meint also, dass x Mäuse verwendet wurden. Bei den Isotopenfluxen wurden die Werte von

bis zu drei einzelnen Gewebestücken einer Maus für einen Versuch gemittelt. Für

Kurzschlussstrom und Gewebeleitfähigkeit wurden bis zu sechs Gewebestücke verwendet.

Zur besseren Vergleichbarkeit mit den Fluxraten wurde der Isc von der Einheit µA/cm2 mit

Hilfe des Faktors 0,03744 auf µmol/(cm2·h) umgerechnet.

4.6 Substanzen und Lösungen

4.6.1 Substanzen

Die in den Experimenten verwendeten chemischen Substanzen werden im Anhang aufgeführt.

Alle Substanzen waren von analytischer Reinheit bzw. dem höchsten erhältlichen

Reinheitsgrad.

4.6.2 Lösungen

Die Zusammensetzung der Inkubationspuffer für die Messungen wird auf der nächsten Seite

in Tabelle 1 „Zusammensetzung der Lösungen“ dargestellt. Mukosal wurde Puffer I und

serosal Puffer II eingesetzt. Der pH-Wert betrug 7,4 und die Osmolarität 308 mosmol/l.


Tabelle 1: Zusammensetzung der Lösungen

I serosale

Pufferlösung II mukosale Pufferlösung

modifizierte Ringerlösung

Substanz mmol/l mmol/l mmol/l

NaCl 108 118 145,5

KCl 3 3 4

MgSO4 · 7H2O 1,3 1,3

KH2PO4 2,25 2,25

NaHCO3 22 22

CaCl2 · 2 H2O 2 2 3

Glukose 8,9

Mannit 8,9

Indomethazin 0,03 0,05

Na-Pyruvat 10

TTX 0,001

5 ERGEBNISSE 35

5 Ergebnisse

In den vorliegenden Untersuchungen wurden jeweils die Ergebnisse von gendefizienten

Mäusen mit denen ihrer Wildtyp-Geschwister verglichen.

5.1 Die Wildtyp-Mäuse

Die hier gezeigten Daten der Wildtyp-Mäuse stellen eine Zusammenfassung der

Kontrollgruppen zu den drei Knock-out Gruppen dar. Sie sollen verdeutlichen, wie sich

normales Gewebe verhält und einen Überblick über die einzelnen Auswertungsbereiche

liefern.

Natriumfluxe bei Wildtyp-Mäusen

Die Natriumfluxe, welche die Natriumbewegungen durch das Jejunum zeigen, wurden

zunächst als unidirektionale Fluxe gemessen, aus denen dann der Nettonatriumflux berechnet

wurde.

Bei allen Versuchsgruppen verlief die primäre Bewegungsrichtung von Natrium aus dem

Lumen in die Zelle und drückte sich in den mukosal nach serosal verlaufenden Fluxraten aus.

Der basale Wert lag bei den Wildtyp-Mäusen bei 27,8 ± 0,8 µmol/(cm²·h). Der stimulierende

Einfluss von Forskolin auf den Anionenkanal CFTR ging gleichzeitig mit einem hemmenden

Einfluss auf die Natriumaufnahme einher (p<0,001). Ein starker Anstieg der

Natriumresorption war nach der Zugabe von Glukose zu verzeichnen (23,1 ± 0,7

µmol/(cm²·h) nach Forskolin zu 37 ± 1,3 µmol/(cm²·h) nach Glukose).

36 5 ERGEBNISSE

Abb. 4: Mukosal nach serosal gerichtete Natriumfluxe in gesundem Jejunum Signifikante Unterschiede (p<0,001) werden durch * gekennzeichnet.

Die von serosal nach mukosal verlaufenden Fluxraten im gesunden Jejunum lagen basal bei

20,3 ± 0,9 µmol/(cm²·h) und waren nicht signifikant durch die zugegebenen Substanzen

Forskolin und Glukose zu beeinflussen (19,4 ± 0,7 µmol/(cm²·h) nach Forskolin und 19,8 ±

0,7 µmol/(cm²·h) nach Glukose).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

basal nach Forskolin nach Glukose

J ms

[µm

ol/(

cm²·

h)]

Natriumflux mukosal-serosal Wildtyp

n=25

*

*

5 ERGEBNISSE 37

Abb. 5: Serosal nach mukosal gerichtete Natriumfluxe in gesundem Jejunum Keine signifikanten Unterschiede nach Forskolin und Glukose.

Der Nettonatriumflux an isolierter Mukosa vom Jejunum wurde aus den bidirektionalen 22Na+-Fluxen berechnet. Dafür wurde bei jeder einzelnen Maus der serosal nach mukosal

verlaufende Flux von dem mukosal nach serosalen Flux abgezogen. Der Nettonatriumflux

spiegelte demzufolge die Natriumabsorption aus dem Darmlumen wider. Basal lag er bei 7,3

± 1,1 µmol/(cm²·h) und zeigte ebenso wie die mukosal nach serosalen Fluxraten eine

Hemmung nach Forskolinzugabe auf 3,7 ± 0,9 µmol/(cm²·h) sowie einen Anstieg nach

Glukosegabe auf 17,7 ± 1,3 µmol/(cm²·h).

0

5

10

15

20

25


J sm

[µm

ol/(

cm²·

h)]

Natriumflux serosal-mukosal Wildtyp

n=25

38 5 ERGEBNISSE

Abb. 6: Nettonatriumflux in gesundem Jejunum Signifikante Unterschiede (p<0,001) werden durch * gekennzeichnet.

Kurzschlussstrommessung bei Wildtyp-Mäusen

Der basal gemessene Kurzschlussstrom lag bei 0,3 ± 0,1 µmol/(cm²·h). Er gab den

elektrogenen Transport von Ionen über den Dünndarm wieder, der durch den Isc ausgeglichen

wurde. Die Anionensekretion überstieg die Kationenresorption im Ruhezustand nur minimal.

Die Stimulation des Gewebes mit Forskolin bewirkte einen Anstieg des transepithelialen

Kurzschlussstromes auf 6,0 ± 0,3 µmol/(cm²·h). Die Zugabe von Glukose löste einen weiteren

Anstieg des Isc auf 12,6 ± 1,1 µmol/(cm²·h) aus. Beide Anstiege (∆Isc 5,7 ± 0,2 µmol/(cm²·h)

nach Forskolin und ∆Isc 6,6 ± 0,9 µmol/(cm²·h) nach Glukose) fielen signifikant aus

(p<0,001). Die Basalwerte der Isc unterschieden sich bei allen Mäusegruppen nicht signifikant

voneinander (p≥0,05) und die gemessenen Anstiege nach Stimulation mit Forskolin bzw.

Glukose waren bei allen Mäusegruppen signifikant unterschiedlich (p<0,001).

0

5

10

15

20

25


J net

[µm

ol/(

cm²·

h)]

Nettonatriumflux Wildtyp

n=25

*

*

5 ERGEBNISSE

Abb. 7: Isc-Verlauf in gesundem JejunumBeide Anstiege fallen signifikant aus (

5.2 Veränderungen bei NHE3

Bei früheren Untersuchungen wurde festgestellt, dass nicht nur Adapterproteine die

Transportproteine in der Zellmembran steuern, sondern dass die Transportproteine sich auch

gegenseitig beeinflussen können. Um die Bedeutung von NHE3, der eine elektroneutrale

Natriumabsorption durch Austausch gegen H

Natriumionen zu untersuchen, wurden bilaterale Natriumfluxuntersuchungen an isoliertem

Jejunum von NHE3-defizienten Mäusen und deren Wurfgeschwistern vom Wildtyp

durchgeführt. An denselben gemischtgeschlechtlichen

Kurzschlussstrom des Gewebes aufgezeichnet, um Veränderungen des elektrogenen

Ionentransportes, der weitgehend auf CF

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

55 60 65 70 75 80

I sc

[µm

ol/(

cm²·

h)]

Forskolin

n=25

Verlauf in gesundem Jejunum Beide Anstiege fallen signifikant aus (p<0,001).

Veränderungen bei NHE3-defizienten Mäusen


n der Zellmembran steuern, sondern dass die Transportproteine sich auch


Natriumabsorption durch Austausch gegen H+-Ionen bewirkt, für die Gesamtbewegung von


defizienten Mäusen und deren Wurfgeschwistern vom Wildtyp

durchgeführt. An denselben gemischtgeschlechtlichen Mäusen wurde parallel dazu der


Ionentransportes, der weitgehend auf CFTR beruht, aufzeigen zu können.

80 85 90 95 100105110115120125130135140Zeit [min]

Isc-Verlauf WT

Glukose

Forskolin

39


n der Zellmembran steuern, sondern dass die Transportproteine sich auch


Ionen bewirkt, für die Gesamtbewegung von


defizienten Mäusen und deren Wurfgeschwistern vom Wildtyp

Mäusen wurde parallel dazu der


140145150155160165

40 5 ERGEBNISSE

Veränderungen der Natrium-Fluxraten

Im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen war der basale Natriumflux von mukosal nach serosal

in NHE3-defizientem Jejunum signifikant reduziert (p<0,05). Während sich der Na+-Flux

nach Stimulation des Gewebes mit Forskolin in WT-Mäusen signifikant verminderte (basal

24,5 ± 0,8 µmol/(cm²·h) zu 20,9 ± 0,6 µmol/(cm²·h) nach Forskolin), blieb er in den Knock-

out Tieren nahezu unverändert (basal 22,5 ± 0,7 µmol/(cm²·h) zu 21,8 ± 0,7 µmol/(cm²·h)

nach Stimulation). Sowohl der basale als auch der Forskolin-stimulierte Wert in den NHE3-

defizienten Mäusen glich dem Forskolin-stimulierten Wert der Wildtyp-Mäuse. Die luminal

zugegebene Glukose stimulierte die Natriumpassage von mukosal nach serosal signifikant.

Abb. 8: Mukosal nach serosal gerichtete Natriumfluxe der NHE3-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet.

Die von serosal nach mukosal gemessenen Natrium-Fluxe unterschieden sich nicht signifikant

voneinander. Weder gab es zwischen den unterschiedlichen Mäusegruppen Unterschiede noch

übten die zugegebenen Stimulanzien Forskolin und Glukose einen signifikanten Einfluss auf

die Sekretion von Natrium aus.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45


J ms

[µm

ol/c

m²·h

]

Natriumflux mukosal-serosal NHE3NHE3 +/+NHE3 -/-

n=8

*

****

*

5 ERGEBNISSE 41

Alle Fluxwerte der NHE3-Versuchsgruppe werden als Mittelwert mit Standardfehlern und

Signifikanzen in Tabelle 2 (Seite 42) aufgeführt.

Die basale Nettonatriumabsorption fiel im NHE3-defizienten Gewebe ebenfalls signifikant

geringer aus als diejenige im Jejunum der Wildtyp-Kontrolle (7,1 ± 1,6 µmol/(cm²·h) in WT

zu 3,4 ± 1,1 µmol/(cm²·h) in NHE3 –/–). Auch der signifikant hemmende Effekt von

Forskolin im NHE3+/+-Dünndarm (basal 7,1 ± 1,6 µmol/(cm²·h) zu 3,8 ± 1,2 µmol/(cm²·h)

nach Forskolin) konnte bei NHE3 –/–-Gewebe nicht beobachtet werden (basal 3,4 ± 1,1

µmol/(cm²·h) zu 2,5 ± 1,1 µmol/(cm²·h) nach Forskolin). Wie bei den einseitigen Fluxen

unterschied sich auch bei den Nettonatriumfluxen die Stimulation des Na+/Glukose-

Kotransporters durch luminale Zugabe von Glukose zwischen den beiden Versuchsgruppen

nicht.

Abb. 9: Nettonatriumabsorption der NHE3-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet.

0

5

10

15

20

25


J net

[µm

ol/(

cm²·h

)]

Nettonatriumflux NHE3

NHE3 +/+NHE3 -/-

n=8

*

*

****

42 5 ERGEBNISSE

Tabelle 2: Natriumfluxwerte (J22Na+ [µmol/(cm2·h)]) im Jejunum von NHE3 Knock-out-

und Normalmäusen, (je n=8), signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet

Veränderungen des Kurzschlussstroms

Der basal gemessene Kurzschlussstrom zeigte sowohl in den NHE3-defizienten als auch in

den nicht defizienten Tieren gleiche Werte [0,4 ± 0,1 µmol/(cm²·h)]. Der nach

Forskolinzugabe gemessene Strom stieg in den NHE3 +/+-Mäusen signifikant (p<0,05)

stärker an als bei ihren NHE3 –/–-Geschwistern (∆Isc 6,3 ± 0,3 µmol/(cm²·h) in NHE3 +/+ zu

∆Isc 5,2 ± 0,2 µmol/(cm²·h) in NHE3 –/–). Die Reaktion der beiden Gruppen auf Glukose war

nicht signifikant unterschiedlich.

MW ± SEM, Signifikanz zum vorherigen Wert basal nach Forskolin nach Glukose mukosal-serosal NHE3 +/+ 24,5 ± 0,8 20,9 ± 0,6 * 35,1 ± 2,2 ** NHE3 –/– 22,5 ± 0,7 21,8 ± 0,7 ns 38,2 ± 0,2 ** Signifikanz zwischen * ns ns den Mäusegruppen serosal-mukosal NHE3 +/+ 17,3 ± 1,2 17,1 ± 1,3 ns 16,8 ± 2,1 ns NHE3 –/– 19,2 ± 0,7 19,4 ± 0,8 ns 19,5 ± 1,9 ns Signifikanz zwischen ns ns ns

den Mäusegruppen

Netto NHE3 +/+ 7,1 ± 1,6 3,8 ± 1,2 * 18,3 ± 2,4 ** NHE3 –/– 3,4 ± 1,1 2,5 ± 1,1 ns 18,6 ± 3,2 ** Signifikanz zwischen * ns ns den Mäusegruppen

5 ERGEBNISSE 43

Abb. 10: Mittelwerte des Isc basal, nach Forskolin- und Glukosegabe in der NHE3-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede zwischen NHE3 +/+ und NHE3 –/– (p<0,05) werden durch * gekennzeichnet. Die basalen Werte sowie die Werte nach Forskolin und Glukose unterschieden sich innerhalb einer Mäusegruppe signifikant ( p<0,001), werden der Übersichtlichkeit halber nicht in der Abbildung gekennzeichnet.

Veränderungen der Gewebeleitfähigkeit

Die Gewebeleitfähigkeit war mit 39,2 ± 3,0 mS/cm² in NHE3 –/–-Jejunum signifikant

(p<0,05) niedriger als in der Kontrollgruppe (55,6 ± 5,8 mS/cm²).

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00


I sc

[µm

ol/(

cm²·

h)]

Isc NHE3

NHE3 +/+NHE3 -/-

n=8

*

44 5 ERGEBNISSE

Abb. 11: Unterschied in der Gewebeleitfähigkeit bei der NHE3-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede (p<0,05) werden durch * gekennzeichnet.

Zusammenfassung

Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung der Natriumabsorption von

mukosal nach serosal durch cAMP nur in Tieren vom Wildtyp vorkam. In NHE3-defizienten

Mäusen fehlte sie vollständig. Dafür entsprach die basale Natriumabsorption bei den NHE3-

defizienten Mäusen der durch cAMP gehemmten Natriumabsorption bei den Wildtyp-

Geschwistern.

Der geringe, aber doch signifikante Unterschied im Anstieg des transepithelialen Stroms

durch cAMP zeigte einen Einfluss von NHE3 auf elektrogene Transportprozesse im Darm.

Die Forskolin-stimulierte elektrogene Anionensekretion war in NHE3-defizienten Tieren

geringer als bei Wildtyp-Mäusen. Weiterhin verminderte das Fehlen von NHE3 die

Gewebeleitfähigkeit in nativem Jejunum.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

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70,0

Gt

[mS

/cm

²]Gewebeleitfähigkeit NHE3

NHE3 +/+NHE3 -/-

n=8

*

5 ERGEBNISSE 45

5.3 Veränderungen bei NHERF1-defizienten Mäusen

Etliche Studien deuten auf eine wichtige Rolle der NHERF-Proteine bei der Steuerung von

Ionentransportern hin, die durch Bildung von Multiprotein-Komplexen zu Stande kommt. In

Expressionssystemen und Zellkulturen zeigt NHERF1 eine regulatorische Funktion bezüglich

Aktivität und Trafficking von NHE3 und CFTR. In dieser Arbeit mit NHERF1 Knock-out

Mäusen wurde natives Jejunum in vitro untersucht. Dadurch konnten Einflüsse des

Adapterproteins NHERF1 auf alle Transportprozesse des Jejunums dargestellt werden, die in

nativem Gewebe noch weitgehend unbekannt sind. An diesen Transportprozessen sind auch

NHE3 und CFTR beteiligt.


Auch bei diesen beiden Versuchsgruppen unterschieden sich nur die Fluxe von mukosal nach

serosal signifikant voneinander, während die Fluxe von serosal nach mukosal nach den

Stimulationen keine Abweichungen von den Basalwerten zeigten. Alle Natriumfluxe mit

Standardfehlern und Signifikanzen der NHERF1-Versuchsgruppe sind in Tabelle 3 (Seite 47)

aufgeführt.

Die mukosal nach serosal gerichteten Natriumfluxe zeigten bei den NHERF1-defizienten

Mäusen basal signifikant geringere Werte als in der Kontrollgruppe (30,1 ± 1,7 µmol/(cm²·h)

in WT zu 27,0 ± 1,3 µmol/(cm²·h) in NHERF1 –/–). Beide Mäusegruppen reagierten mit einer

signifikanten Hemmung auf Forskolin (26,3 ± 1,4 µmol/(cm²·h) in WT zu 23,3 ± 0,9

µmol/(cm²·h) in NHERF1 –/–) und einem signifikanten Anstieg auf Glukose.

46 5 ERGEBNISSE

Abb. 12: Mukosal nach serosal gerichtete Natriumfluxe der NHERF1-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet.

Die Nettonatriumabsorption, die sich aus den unilateralen Fluxen ergab, war basal in

NHERF1-defizienten Mäusen folglich signifikant geringer als in nicht defizienten Mäusen

(8,9 ± 1,3 µmol/(cm²·h) in WT zu 5,2 ± 1,1 µmol/(cm²·h) in NHERF1 –/–). Die Hemmung der

Fluxrate durch Forskolin blieb in beiden Mäusegruppen bestehen (basal 8,9 ± 1,3

µmol/(cm²·h) auf 5,8 ± 1,3 µmol/(cm²·h) in WT zu basal 5,2 ± 1,1 µmol/(cm²·h) auf 2,0 ± 1,4

µmol/(cm²·h) in NHERF1 –/–). Die Stimulation der Glukose-getriebenen Natriumaufnahme

brachte in beiden Gewebegruppen eine signifikante Steigerung auf 17,2 ± 2,4 µmol/(cm²·h) in

WT und 15,1 ± 1,6 µmol/(cm²·h) in NHERF1 –/–, bei der sich die Mäusegruppen nicht

signifikant unterschieden.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45


J ms

[µm

ol/(

cm²·

h)]

Natriumflux mukosal-serosal NHERF1

NHERF1 +/+NHERF1 -/-

n=9

*

*

**

****

5 ERGEBNISSE 47

Abb. 13: Nettonatriumabsorption der NHERF1-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet.

Tabelle 3: Natriumfluxwerte (J²²Na+ [µmol/(cm²·h)]) im Jejunum von NHERF1 Knock-out- und Normalmäusen, (je n=9), signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet MW ± SEM, Signifikanz zum vorherigen Wert basal nach Forskolin nach Glukose mukosal-serosal NHERF1 +/+ 30,1 ± 1,3 26,3 ± 1,4 * 38,2 ± 3,1 ** NHERF1 –/– 27,0 ± 0,8 23,3 ± 0,9 * 36,0 ± 2,1 ** Signifikanz zwischen * * ns den Mäusegruppen serosal-mukosal NHERF1 +/+ 21,1 ± 1,3 20,4 ± 1,2 ns 21,0 ± 1,8 ns NHERF1 –/– 21,7 ± 1,3 21,4 ± 1,3 ns 20,9 ± 2,0 ns Signifikanz zwischen ns ns ns

den Mäusegruppen

Netto NHERF1 +/+ 8,9 ±1,3 5,8 ± 1,3 * 17,2 ± 2,4 ** NHERF1 –/– 5,2 ±1,1 1,4 ± 2,0 * 15,1 ± 1,6 ** Signifikanz zwischen * * ns den Mäusegruppen

0

5

10

15

20

25


J net

[µm

ol/(

cm² ·h

)]Nettonatriumflux NHERF1

NHERF1 +/+NHERF1 -/-

n=9

*

*

*

*

**

**

48 5 ERGEBNISSE


Nach gleichem basalen Isc [0,3 ± 0,1µmol/(cm²·h)] reagierte das NHERF1-defiziente Gewebe

mit einem signifikant geringeren Anstieg auf die Stimulation mit Forskolin (∆Isc 4,5±0,2

µmol/(cm²·h) in NHERF1 +/+ zu ∆Isc 2,9 ± 0,2 µmol/(cm²·h) in NHERF1 –/–). Die

Glukosezugabe bewirkte bei beiden Gewebegruppen einen ähnlichen Anstieg des

Kurzschlussstroms (∆Isc 2,7 ± 0,2 µmol/(cm²·h) in NHERF1 +/+ zu ∆Isc 3,4 ± 0,3

µmol/(cm²·h) in NHERF1 –/–, ns).

Abb. 14: Mittelwerte des Isc basal, nach Forskolin- und Glukosegabe in der NHERF1-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede zwischen NHERF1 +/+ und NHERF1 –/– (p<0,05) werden durch * gekennzeichnet. Die basalen Werte sowie die Werte nach Forskolin und Glukose unterschieden sich innerhalb einer Mäusegruppe signifikant (p<0,001), werden der Übersichtlichkeit halber nicht in der Abbildung gekennzeichnet.


In den beiden NHERF1-Versuchsgruppen unterschied sich die Gewebeleitfähigkeit nicht

signifikant voneinander (46,9 ± 4,9 mS/cm² in WT zu 46,3 ± 4,3 mS/cm² in NHERF1 –/–).

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00


I sc

[µm

ol/(

cm²·

h)]

Isc NHERF1

NHERF1 +/+

NHERF1 -/-

n=9

*

5 ERGEBNISSE 49

Zusammenfassung

Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Daten, dass das Fehlen von NHERF1 sowohl die

basale Na+-Absorption durch NHE3 signifikant herabsetzte als auch eine Reduktion der

cAMP-vermittelten Aktivierung der elektrogenen Anionensekretion durch CFTR auslöste.

Die Wirkung von cAMP bei der Hemmung der Natriumabsorption blieb bei den NHERF1

Knock-out Mäusen jedoch erhalten. Der Natrium-gekoppelte Glukose-Kotransporter war

durch den Gendefekt ebenfalls nicht beeinflusst, so dass die Natriumfluxraten sowie die

Kurzschlussströme in vergleichbarem Umfang anstiegen.

5.4 Veränderungen bei PDZK1-defizienten Mäusen

Wie NHERF1 gehört auch PDZK1 zu den NHERF-Proteinen und ist an der Bildung von

Multiproteinkomplexen beteiligt, welche die Aktivität der Ionentransporter beeinflussen. Es

ist bekannt, dass PDZK1 sowohl an CFTR und NHE3 als auch an NHERF1 bindet. In

Expressionssystemen wurde von einer Dimerisation von CFTR durch PDZK1 berichtet, die

mit einer Erhöhung der Transportleistung von CFTR einhergeht. Über die regulatorische

Funktion von PDZK1 für NHE3 ist jedoch auch in Expressionssystemen nichts bekannt. Wie

bei den NHERF1 Knock-out Mäusen wurde anhand von nativem Jejunum der PDZK1-

defizienten Mäuse der Einfluss des PDZK1-Proteins auf die Transportproteine des Jejunums

untersucht.


Bei der Untersuchung der einseitigen Natriumfluxe von mukosal nach serosal zeigte sich,

dass der Dünndarm der Knock-out Mäuse eine signifikant geringere basale Fluxrate aufwies

(28,5 ± 1,1 µmol/(cm²·h) in PDZK1 +/+ zu 22,8 ± 1,1 µmol/(cm²·h) in PDZK1 –/–). Bei den

Wildtyp-Mäusen konnte wie in den vorigen Versuchsgruppen eine signifikante Hemmung

nach Forskolin auf 22,3 ± 1,1 µmol/(cm²·h) beobachtet werden. Der zweite Forskolinflux

unterschied sich nicht signifikant von dem ersten. Im Gegensatz dazu unterschied sich der

erste Flux nach Forskolin bei den PDZK1-defizienten Mäuse nicht signifikant von dem

basalen. Bei dem zweiten Flux nach Forskolin war jedoch ein signifikanter Unterschied zur

basalen Natriumfluxrate auszumachen [basal 22,8 ± 1,1 µmol/(cm²·h) zu 20,4 ± 1,2

50 5 ERGEBNISSE

µmol/(cm²·h)]. Die Reaktion auf Glukose war in beiden Gruppen ähnlich. Alle Fluxe der

PDZK1-Versuchsgruppe sind in Tabelle 4 (Seite 52) als Mittelwert mit Standardfehlern und

Signifikanzen aufgeführt.

Abb. 15: Mukosal nach serosal gerichtete Natriumfluxe der PDZK1-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet.

Die Natrium-Fluxe, die von serosal nach mukosal gemessen wurden, waren - wie schon bei

den anderen Mäusegruppen beschrieben - zwischen den PDZK1 +/+- und PDZK1 –/–-

Gruppen basal vergleichbar und zeigten auch keine signifikante Veränderung auf die Zugabe

von Forskolin oder Glukose.

Wie in den vorherigen Versuchen gingen die Unterschiede in der Nettonatriumabsorption auf

die mukosal nach serosal gerichteten Fluxraten zurück. Die basale Nettonatriumabsorption im

PDZK1-defizienten Dünndarmepithel war gegenüber dem nicht PDZK1-defizienten Gewebe

signifikant vermindert (6,6 ± 1,1 µmol/(cm²·h) in PDZK1 +/+ zu 3,6 ± 1,9 µmol/(cm²·h) in

PDZK1 –/–). Zudem wurde auch bei den Nettofluxen deutlich, dass eine signifikante (p<0,05)

Hemmung durch Forskolin bei den gesunden Mäusen bereits in der ersten Fluxrate auftrat

(basal 6,6 ± 1,5 µmol/(cm²·h) zu 1,4 ± 0,8 µmol/(cm²·h) erster Flux nach Forskolin), bei den

PDZK1 defizienten jedoch erst in der zweiten Fluxrate nach Forskolingabe (basal 3,6±1,9

0

5

10

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50

basal 1. nach Forskolin 2. nach Forskolin nach Glukose

J ms

[µm

ol/(

cm²· h

)]

Natriumflux mukosal-serosal PDZK1

PDZK1 +/+

PDZK1 -/-

n=8 *

*

*

**

**

5 ERGEBNISSE 51

µmol/(cm²·h) zu 0,8 ± 0,7 µmol/(cm²·h) zweiter Flux nach Forskolin). Die signifikante

Steigerung der Natriumaufnahme nach Glukosezugabe wies wie auch in den unidirektionalen

Fluxen keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Mäusegruppen auf.

Abb. 16: Nettonatriumabsorption der PDZK1-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet.

0

5

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basal 1. nach Forskolin 2. nach Forskolin nach Glukose

J net

[µm

ol/(

cm² ·h

)]

Nettonatriumflux PDZK1

PDZK1 +/+

PDZK1 -/-

n=8

*

*

*

****

52 5 ERGEBNISSE

Tabelle 4: Natriumfluxwerte (J²²Na+ [µmol/(cm²•h)]) im Jejunum von PDZK1 Knock-out- und Normalmäusen, (je n=8), signifikante Unterschiede werden durch * (p<0,05) bzw. ** (p<0,001) gekennzeichnet. Die mit # markierten Signifikanzen beziehen sich jeweils auf den Basalwert der jeweiligen Zeile. MW ± SEM, Signifikanz zum vorherigen Wert (Ausnahme #) basal 1. nach Forskolin 2. nach Forskolin nach Glukose

mukosal-serosal PDZK1 +/+ 28,5 ±1,1 22,3 ± 1,1 * 21,4 ± 0,8 ns 39,4 ± 3,0 ** PDZK1 –/– 22,8 ± 1,1 21,7 ± 1,6 ns 20,4 ± 1,2 * # 34,5 ± 2,4 ** Signifikanz zwischen * ns ns ns den Mäusegruppen

serosal-mukosal PDZK1 +/+ 21,4 ± 1,8 21,0 ± 1,5 ns 20,3 ± 0,7 ns 21,6 ± 1,2 ns PDZK1 –/– 19,2 ± 1,3 19,4 ± 1,4 ns 19,6 ± 1,7 ns 19,4 ± 1,5 ns Signifikanz zwischen ns ns ns ns den Mäusegruppen

Netto PDZK1 +/+ 6,6 ± 1,5 1,4 ± 0,8 * 1,1 ± 1,1 ns 17,8 ± 2,2 ** PDZK1 –/– 3,6 ± 1,9 2,3 ± 1,2 ns 0,8 ± 0,7 * # 15,1 ± 2,0 ** Signifikanz zwischen * ns ns ns den Mäusegruppen


Die Isc-Kurven der beiden Versuchsgruppen waren mit 0,1 ± 0,1 µmol/(cm²*h) in WT und 0,4

± 0,2 µmol/(cm²*h) in PDZK1 –/– vergleichbar. Wie der basale Wert unterschieden sich auch

der durch Forskolin stimulierte Anstieg des Kurzschlussstromes nicht signifikant zwischen

der PDZK1 Knock-out [∆Isc 5,5 ± 0,5 µmol/(cm²·h)] und der Wildtyp-Gruppe [∆Isc 6,5 ± 0,4

µmol/(cm²·h)]. Der Anstieg des Kurzschlussstromes nach Glukosezugabe war in beiden

Mäusegruppen ebenfalls vergleichbar (∆Isc 5,2 ± 1,0 µmol/(cm²·h) in PDZK1 +/+ zu ∆Isc 5,1

± 0,8 µmol/(cm²·h) in PDZK1 –/–).

5 ERGEBNISSE 53

Abb. 17: Mittelwerte des Isc basal, nach Forskolin- und Glukosegabe in der PDZK1-Versuchsgruppe Signifikante Unterschiede zwischen PDZK1 +/+ und PDZK1 –/– (p<0,05) werden durch * gekennzeichnet. Die basalen Werte sowie die Werte nach Forskolin und Glukose unterschieden sich innerhalb einer Mäusegruppe signifikant ( p<0,001), werden der Übersichtlichkeit halber nicht in der Abbildung gekennzeichnet.


Die Gewebeleitfähigkeit war in PDZK1-defizientem Gewebe nicht signifikant unterschiedlich

zu Wildtyp-Gewebe (81,3 ± 8,3 mS/cm² in WT zu 63 ± 5,5 mS/cm² in NHERF1 –/–).

Zusammenfassung

Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse Veränderungen in der NHE3-Aktivität von PDZK1-

defizienten Mäusen. Diese wirkt sich in einer stark reduzierten basalen Transportrate von

Natriumionen sowie durch eine Verzögerung der Regulation von NHE3 durch cAMP aus.

Unterschiede in der CFTR-Aktivität konnten nicht beobachtet werden. Der Transport von

Glukose und Natrium durch SGLT1 war in Abwesenheit von PDZK1 ebenfalls intakt. So kam

es zu keinem signifikanten Unterschied bei der elektrogenen Natriumabsorption, die sich in

0,0

2,0

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6,0

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14,0


I sc

[µm

ol/(

cm²·

h)]

Isc PDZK1

PDZK1 +/+

PDZK1 -/-

n=8

*

54 5 ERGEBNISSE

einem vergleichbaren Anstieg der Nettonatriumabsorption und des Kurzschlussstromes

darstellte.

5.5 Vergleich der Gendefekte

Um eine mögliche Kompensation eines einzelnen Gendefektes darstellen zu können, wurden

die Nettofluxe und Kurzschlussströme der einzelnen Knock-outs miteinander verglichen.

Vergleich der Nettonatriumfluxe

Bei dem Vergleich der Nettonatriumfluxe konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen

den Gendefekten ausgemacht werden.

Tabelle 5: Vergleich der Nettonatriumfluxwerte (J²²Na+ [µmol/(cm²·h)]) im Jejunum von den drei Gendefekten untereinander

Vergleich der Nettofluxe der Knock-out Mäuse

MW ± SEM / Signifikanz

basal nach Forskolin

1. Wert 2. Wert

NHE3/NHERF1 NHE3 –/– 3,4 ± 1,1 2,5 ± 1,1 NHERF1 –/– 5,2 ±1,1 1,4 ± 2,0 Signifikanz ns Ns

NHE3/PDZK1 NHE3 –/– 3,4 ± 1,1 2,5 ± 1,1 PDZK1 –/– 3,6 ± 1,9 2,3 ± 1,2 0,8 ± 0,7 Signifikanz ns Ns ns

NHERF1/PDZK1 NHERF1 –/– 5,2 ±1,1 1,4 ± 2,0 PDZK1 –/– 3,6 ± 1,9 2,3 ± 1,2 0,8 ± 0,7

Signifikanz ns Ns ns

5 ERGEBNISSE 55

Vergleich der Kurzschlussströme

Es wurden nur die Kurzschlussströme nach Zugabe von Forskolin verglichen, da nur hier

Unterschiede zwischen den Knock-out Mäusen und ihren Kontrollgruppen festgestellt werden

konnten.

Während sich die PDZK1 Knock-out Mäuse und die NHE3-Gruppe nicht signifikant

unterscheiden, sind die Werte der NHERF1-Gruppe signifikant niedriger als die von NHE3

und PDZK1.

Tabelle 6: Vergleich der Kurzschlussströme (Isc [µmol/(cm²•h)]) im Jejunum von den drei Gendefekten untereinander

Vergleich der Kurzschlussströme der Knock-out Mäuse

MW ± SEM / Signifikanz

nach Forskolin Δ Forskolin NHE3/NHERF1 NHE3 –/– 5,7 ± 0,3 5,22 ± 0,2 NHERF1 –/– 3,3 ± 0,2 2,9 ± 0,2 Signifikanz * * NHE3/PDZK1 NHE3 –/– 5,7 ± 0,3 5,22 ± 0,2 PDZK1 –/– 5,9 ± 0,5 5,5 ± 0,5 Signifikanz ns ns NHERF1/PDZK1

NHERF1 –/– 3,3 ± 0,2 2,9 ± 0,2 PDZK1 –/– 5,9 ± 0,5 5,5 ± 0,5 Signifikanz * *

56 6 DISKUSSION

6 Diskussion

6.1 Durchgeführte Versuche

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der basalen elektroneutrale Natriumchloridresorption

sowie die cAMP-mediierte Hemmung der Salzabsorption bei verminderter Expression der

Transport- oder Adapterproteine im Jejunum von Wildtyp- bzw. genetisch modifizierten

Mäusen. Dadurch kann ein quantitativer Zusammenhang zwischen der Expression der

Adapterproteine und der Aufhebung der Hemmung der Elektrolyt- und Flüssigkeitsresorption

ermittelt werden. Die Ussing-Kammer bietet im Gegensatz zu Zellkulturen den Vorteil, einen

nativen Gewebeverband untersuchen zu können.

Da geschlechtsspezifische Unterschiede für die untersuchten Ionentransporte im Darm nicht

bekannt sind und auch nicht Teil der Untersuchung waren, wurden für die vorliegende Arbeit

Tiere beiderlei Geschlechts verwendet. Um eine mögliche Beeinflussung der Ergebnisse

durch geschlechtsspezifische Unterschiede auszuschließen, entsprach die Geschlechter-

verteilung in der Kontrollgruppe jeweils der ihrer jeweiligen Knock-out Gruppe.

Natriumfluxe

Die Natriumabsorption überstieg im Jejunum die Sekretion. Veränderungen in den

Nettonatriumfluxen gingen auf Unterschiede in den von mukosal nach serosal gerichteten

Fluxraten zurück. Forskolin aktiviert die Adenylatzyklase (K. B. SEAMON et al. 1981) und

hemmt auf diesem Weg die Transportleistung von NHE3 (YUN et al. 1997; LAMPRECHT et

al. 1998; DONOWITZ u. LI 2007).

Während die Versuchsgruppen deutliche Unterschiede in der basalen und Forskolin-

stimulierten Natriumabsorption aufwiesen, bewirkte die Aktivierung des SGLT1 in allen

Versuchsgruppen vergleichbare Anstiege des Natriumfluxes. Diese Ergebnisse bestätigen,

dass die Funktion des SGLT1 nicht von NHE3 oder den untersuchten NHERF-

Adapterproteinen abhängig ist (FIELD 2003).

In allen Mäusen veränderten sich die Fluxraten von serosal nach mukosal durch Stimulation

des Jejunums mit Forskolin und Glukose nicht signifikant. Dies zeigt die Unabhängigkeit der

Transportproteine an der basolateralen Membran von den vorgenommenen Stimulationen.

6 DISKUSSION 57

Anstieg des Kurzschlussstromes

Forskolin aktiviert die Adenylatzyklase und über diesen Weg den Anionentransporter CFTR,

der nun verstärkt Anionen aus der Zelle ins Darmlumen ausschleust. Untersuchungen an

CFTR Knock-out Mäusen zeigten, dass der Forskolin-bedingte Anstieg des

Kurzschlussstromes ausschließlich durch CFTR bewerkstelligt wird. Bei diesen Mäusen fehlt

die Stimulation vollständig (SEIDLER et al. 1997). Gleiche Ergebnisse lieferten Versuche mit

Dünndarm von CFTR/NHERF1-Doppelknock-out Mäusen (BROERE et al. 2007). Die in den

vorliegenden Untersuchungen ermittelten Unterschiede im Anstieg des Kurzschlussstromes

nach Forskolingabe können daher einer veränderten Stimulation von CFTR zugeschrieben

werden.

Die Aktivierung des Natrium/Glukose-Kotransporters SGLT1 durch eine luminal erhöhte

Glukosekonzentration löste ebenfalls einen Anstieg des Isc aus. SGLT1 arbeitet wie CFTR

elektrogen. Der Anstieg des Kurzschlussstromes war in diesem Fall ein Maß für den CFTR-

unabhängigen elektrogenen Transport.

6.2 Auswirkungen der NHE3-Defizienz

Veränderungen in der Natriumabsorption

Das Fehlen von NHE3 führte zu einer Verminderung der Natriumabsorption, die sich in

signifikant geringeren basalen Natriumfluxraten (sowohl mukosal-serosal als auch netto)

ausdrückte. Die Hemmung der Natriumabsorption nach Forskolingabe war nur im Jejunum

von den Wildtyp-Mäusen zu beobachten. Sowohl die basale als auch die Forskolin-stimulierte

Natriumabsorptionsrate des NHE3-defizienten Gewebes entsprach der Absorptionsrate nach

Hemmung von Forskolin in der Kontrollgruppe.

GAWENIS et al. haben ebenfalls Fluxstudien an NHE3-defizienten Mäusen durchgeführt

(2002). Obwohl sich viele Parallelen der Ergebnisse zeigen, gibt es einige Unterschiede in

den Resultaten im Vergleich zu den vorliegenden Ergebnissen: In den Versuchen für diese

Arbeit wurde nur mit Forskolin gehemmt. Die Hemmung mit Forskolin und zusätzlich IBMX

bewirkte eine stärkere Hemmung der Natriumabsorption sowie eine verminderte

Gewebeleitfähigkeit (GAWENIS et al. 2002; SEIDLER et al. 2008). Auch konnte in der

vorliegenden Arbeit keine Wirkung bei allein eingesetztem Forskolin auf die

58 6 DISKUSSION

Natriumsekretion festgestellt werden, die von GAWENIS et al. mit Forskolin und IBMX

beschrieben wird (2002). Eine mögliche Ursache für die Diskrepanz der Ergebnisse ist die

unterschiedliche Präparation des Darmes. Für die vorliegende Arbeit wurde gestrippter Darm

verwendet, so dass der Muskeltonus und die Gewebedicke keinen Einfluss auf die

Transportleistung des Gewebes ausüben konnten. Des Weiteren unterbanden die Substanzen

TTX und Indomethazin bei den vorliegenden Versuchen die Ausschüttung von

Neurotransmittern und Prostaglandin E2, die die Sekretion stimulieren. In dieser

unterschiedlichen Gewebebehandlung könnte die fehlende Forskolinwirkung auf den serosal

nach mukosal gerichteten Natriumflux und der höhere Anstieg des Isc in den vorliegenden

Versuchen liegen. Auch eine Diarrhöe-bedingte Hypertrophie der submukosalen Strukturen

bei den NHE3-defizienten Mäusen könnte ein Einflussfaktor sein. Ein weiterer Unterschied

war die längere Äquilibrierungsphase der vorliegenden Versuche, da sich herausgestellt hatte,

dass die Fluxraten sich teilweise erst nach ca. einer Stunde stabilisierten.

Unterschiede in der Aktivierung der elektrogenen Anionensekretion von CFTR

Die transepitheliale Natrium-Absorption ist im Darm nicht vollständig, jedoch zum Großteil

durch NHE3 bedingt (GAWENIS et al. 2002). Verschiedene Studien beschreiben, dass NHE3

und CFTR sich gegenseitig steuern, wenn sie in Zellkulturen gemeinsam exprimiert werden

(AHN et al. 2001; BAGORDA et al. 2002; FAVIA et al. 2006).

Die Stimulation von CFTR, die bei den vorliegenden Versuchen durch den Anstieg des

Kurzschlussstroms anzeigt wurde, fiel in den NHE3-defizienten Mäusen signifikant geringer

aus als in der Kontrollgruppe. Der Unterschied war jedoch recht gering und zeigte, dass die

cAMP-vermittelte Stimulation der Chloridsekretion durch CFTR von dem fehlenden NHE3

nur leicht verringert wurde. Diese verminderte Aktivierung von CFTR wird durch Chlorid-

Fluxe bestätigt. Dabei fällt der Anstieg der Chloridsekretion bei den NHE3 Knock-out

Mäusen ebenfalls geringer aus als in der Kontrollgruppe (SEIDLER et al. 2008).

Bisher wurde in Expressionsstudien die Bedeutung der Bindung von NHE3 an PDZ-Adapter

für verschiedene Prozesse in der Zelle gezeigt, wie z. B. für die laterale Beweglichkeit von

NHE3 in der apikalen Membran (CHA et al. 2004) und Komplexbildung mit CFTR

(BAGORDA et al. 2002; FAVIA et al. 2006), aber auch mit anderen signalgebenden

6 DISKUSSION 59

Einheiten der Zelle (HALL et al. 1998; LAMPRECHT et al. 1998; HALL et al. 1999; ZIZAK

et al. 1999).

Ein möglicher Mechanismus, über den NHE3 mit CFTR oder anderen Proteinen interagiert,

ist daher das PDZ-Bindemotiv, mit dem die Transportproteine an PDZ-Adapterproteine wie

z. B. NHERF1, NHERF2 oder PDZK1 binden (DONOWITZ et al. 2005a; 2005b;

LAMPRECHT u. SEIDLER 2006; DONOWITZ u. LI 2007). BAGORDA et al. beschreiben

in renalen Zellkulturen eine Interaktion zwischen NHE3 und CFTR über einen

Proteinkomplex aus NHERF2, Ezrin und Proteinkinase A (BAGORDA et al. 2002). Im

nativen Mäusedarm ist die cAMP-vermittelte CFTR-Aktivierung jedoch wenig von NHE3

abhängig. Eine mögliche Ursache kann die unterschiedliche Lokalisation der

Transportproteine sein. CFTR wird in der Basis und in der Krypten der Mikrovilli exprimiert,

NHE3 dagegen in der Bürstensaummembran (SEIDLER et al. 2008).

Einfluss von NHE3 auf die Chloridabsorption

NHE3 steht nicht nur mit CFTR in Verbindung, sondern arbeitet im Darm auch mit

Anionenaustauschern wie PAT1 und DRA zusammen. Diese Kopplung von NHE3 an die

Slc26-Anionenaustauscher zeigte sich sowohl in einer erniedrigten basalen Fluxrate wie auch

in einer fehlenden cAMP-vermittelten Hemmung der Ionenabsorption, die in NHE3-

defizienten Mäusen neben Natrium (wie die vorliegenden Ergebnisse zeigen) auch für Chlorid

beobachtet wird (SEIDLER et al. 2008). Diese Vermutung wird durch eine Reduktion der

basalen elektroneutralen NaCl-Absorption gestützt, die bei PAT1-defizientem Jejunum

beobachtet werden konnte. In PAT1 Knock-out Mäusen ist jedoch wie in gesunden Mäusen

die cAMP-vermittelte Hemmung der NaCl-Absorption erhalten. Aus diesem Grund liegt die

Vermutung nahe, dass NHE3 im Jejunum nicht nur an PAT1 gekoppelt ist. Die Feststellung,

dass die NHE3-Abundanz und seine Verteilung in PAT1-defizienten murinem Jejunum

unverändert ist, stützt diese Theorie (SEIDLER et al. 2008). Der ebenfalls im Dünndarm

vorkommende Transporter DRA ist wahrscheinlich der weitere Partner für NHE3 (JACOB et

al. 2002; SIMPSON et al. 2007). Da aber auch andere Slc26-Austauscher im Dünndarm

exprimiert werden, können nur weitere Untersuchungen Klarheit darüber schaffen. Auch der

Mechanismus der wechselseitigen Steuerung ist noch nicht endgültig geklärt.

60 6 DISKUSSION

Schon in den 80er Jahren des 20. Jahrhunderts vermuteten KNICKELBEIN et al. eine

Kopplung des Natrium/Protonen-Austausches an den Chlorid/Bikarbonat-Austausch in der

Bürstensaummembran. Diese schrieben sie einer Veränderung des pH-Wertes zu (1983;

1985). Es wird angenommen, dass sich dieser Mechanismus einer pH-Wert Änderung an der

subapikalen Membran abspielt und auf diese Weise PAT1 und NHE3 einander aktivieren

(CHARNEY et al. 2002a; 2002b). Das Fehlen von NHE3 könnte eine Verschiebung des pH-

Wertes nach sich ziehen und dadurch die Natriumabsorption abschwächen (SEIDLER et al.

2008). Eine mögliche pH-Wert Veränderung konnte in den vorliegenden Versuchen nicht

aufgezeichnet werden. Diesbezüglich sind weitere Studien notwendig.

Neben einer Regulierung über den pH-Wert ist eine strukturelle Interaktion von NHE3 und

PAT1 ein möglicher Mechanismus der wechselseitigen Steuerung. Diese könnte durch die

PDZ-Bindungsmotive der Ionenaustauscher erfolgen, mit denen sie PDZ-Adapterproteine

binden (SEIDLER et al. 2008). Beide Transportproteine binden an die gleichen

Adapterproteine der NHERF-Familie (LAMPRECHT u. SEIDLER 2006). Für CFTR und

PAT1 (bzw. DRA) wurde eine solche Aktivierung bereits gezeigt (KO et al. 2004).

Durchlässigkeit der tight junctions

Die Gewebeleitfähigkeit war bei den NHE3-defizienten Tieren signifikant geringer als in der

Kontrollgruppe. Sie wird durch den transepithelialen Widerstand bedingt. Da der

überwiegende Teil dieser Leitfähigkeit auf parazellulärem Wege stattfindet (FRIZZELL u.

SCHULTZ 1972; POWELL 1974), deuten Unterschiede in der Gewebeleitfähigkeit auf eine

Veränderung der Dichtigkeit der tight junctions hin. Das Fehlen von NHE3 scheint also die

Durchlässigkeit der tight junctions zu beeinflussen.

Eine weitere Beobachtung, die sich aus dem Vergleich zwischen den Natrium- und den

Chloridfluxen ergibt, sind die bilateral signifikant höheren Natrium-Fluxraten im Vergleich

zu den Chlorid-Fluxraten. Dies liegt vermutlich daran, dass die tight junctions im Jejunum

kationenselektiv sind (SEIDLER et al. 2008).

6 DISKUSSION 61

Zusammenfassung

Gemeinsam mit den Daten von SEIDLER et al. (2008) zeigen die vorliegenden Ergebnisse,

dass NHE3 in nativem Jejunum für eine Hemmung der Natriumchloridaufnahme aus dem

Darmlumen durch cAMP erforderlich ist. Daher liegt die Vermutung nahe, dass NHE3 und

seine assoziierten Proteine das Hauptziel für die Hemmung durch cAMP bilden. Für die

elektroneutrale Salzaufnahme in nativem Jejunum ist NHE3 zusammen mit mehreren

Anionenaustauschern verantwortlich.

Des Weiteren zeigen die vorliegenden Daten, dass NHE3 einen - wenn auch geringen -

Einfluss auf die Aktivität von CFTR sowie auf die Durchlässigkeit der tight junctions ausübt.

6.3 Messungen der NHERF1-defizienten Mäuse

Veränderungen der basalen Natriumabsorption von NHE3

In der vorliegenden Arbeit wurde basal eine signifikant geringere Natriumabsorption in dem

NHERF1-defizienten Jejunum im Vergleich zur Kontrollgruppe gezeigt. Die cAMP-

vermittelte Hemmung der Natrium-Absorption durch NHE3 wird nicht durch das Fehlen von

NHERF1 beeinträchtigt.

Es wird im Dünndarm von einer signifikant reduzierten NHE3-Abundanz in der

Bürstensaummembran berichtet (BROERE et al. 2009). In dieser Reduktion der NHE3-

Abundanz könnte eine Ursache für die verminderte basale Natriumabsorption begründet sein,

da eine Komplexbildung, an der NHERF1 beteiligt ist, den Transporter NHE3 an die

Zellmembran bindet (CHA et al. 2004) und so seine Transportleistung beeinflussen kann.

Unterschiede in der Aktivierung der elektrogenen Anionensekretion von CFTR

Die elektrogene Anionensekretion wies basal keine Unterschiede auf. Es wurde jedoch eine

signifikant geringere Aktivitätssteigerung von CFTR durch cAMP in der NHERF1-

defizienten Versuchsgruppe in Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe festgestellt.

Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Aufzeichnungen des Isc während der Messung von

Chloridfluxen erzielt. In diesen Versuchen wurde ein verminderter Anstieg der

62 6 DISKUSSION

Nettochloridabsorption nach Forskolingabe in NHERF1-defizientem Epithel ermittelt, der

zeigt, dass der Anstieg des Kurzschlussstromes die Aktivitätssteigerung der Chloridsekretion

durch CFTR widerspiegelt (BROERE et al. 2007; 2009). Als mögliche Ursache für diesen

geringeren Anstieg der elektrogenen Anionensekretion kommt ein verringertes Vorkommen

von CFTR in der Bürstensaummembran der Krypten von NHERF1-defizienten Mäusen in

Betracht (BROERE et al. 2007).

Studien an Zellkulturen weisen auf die große Bedeutung der NHERF-Adapterproteine bei der

Aktivierung von CFTR hin (GUGGINO u. STANTON 2006). Die Lokalisation von CFTR ist

in NHERF1-defizienten jejunalen Zellen unverändert, während die Expression von CFTR

geringfügig vermindert ist. Diese geringen Veränderungen bei Fehlen von NHERF1 sprechen

gegen NHERF1 als Schlüsselprotein bei der Steuerung von CFTR (BROERE et al. 2007).

Trotzdem sorgt NHERF1 für mehr aktives CFTR in der apikalen Membran. Dieses könnte

durch eine Verknüpfung von CFTR an das Zytoskelett geschehen (BROERE et al. 2007).

Neben einer geringeren Präsenz von CFTR in der apikalen Membran kommt aber auch eine

Verringerung der intrazellulären Chloridkonzentration durch basolaterale Ionentransporter

wie z. B. NKCC (Na+/K+/2Cl–-Kotransporter) als Ursache der verminderten CFTR-Aktivität

bei Fehlen von NHERF1 in Frage (BARRETT u. KEELY 2000). Eine Regulation der

basolateralen Anionenabsorption durch cAMP wurde durch verschiedene Studien belegt

(D'ANDREA et al. 1996; LYTLE u. FORBUSH 1996; DARMAN u. FORBUSH 2002;

BACHMANN et al. 2003). Andere Untersuchungen haben gezeigt, dass CFTR-Kanäle auch

unter nicht stimulierten Bedingungen geöffnet sind und dass die Anionensekretion im Darm

unter bestimmten Umständen nicht durch Vorgänge an der apikalen Membran begrenzt wird,

sondern durch Ionentransporte an der basolateralen Zellmembran (BROERE et al. 2007).

Veränderungen des Natriumchloridtransportes

Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass NHERF1 eine wichtige Rolle bei der

Regulation der Transportproteine NHE3 und CFTR spielt. Die Bedeutung von NHERF1 wird

auch durch die Feststellung unterstrichen, dass die Häufigkeit von CFTR und NHE3 in

NHERF1-defizientem Mäusedarm vermindert ist (SEIDLER et al. 2009). Während für CFTR

bereits eine rezeptorspezifische Regulation durch NHERF1 nachgewiesen werden konnte

(NAREN et al. 2003), bleibt ein solcher Mechanismus für NHE3 bisher nur Spekulation.

6 DISKUSSION 63

Für die NHERF1-defizienten Mäuse wurde durch die vorliegenden Daten sowie durch die

Untersuchungen von BROERE et al. (2009) eine verminderte Salzabsorption als Folge des

Fehlens von NHERF1 bewiesen. Es gibt jedoch keine Hinweise auf intravaskuläre Salz- und

Flüssigkeitsverluste. Es wird vermutet, dass eine Reduktion der Sekretionsleistung des

Darmes diese verminderte Absorption kompensiert, da auch CFTR über NHERF1 gesteuert

wird (SEIDLER et al. 2009). Für diese Möglichkeit spricht der Anstieg der Sekretionsleistung

von CFTR, der in der vorliegenden Arbeit durch den cAMP-vermittelten Anstieg des

Kurzschlussstromes dargestellt werden konnte und der in der NHERF1-defizienten

Versuchsgruppe geringer ausfiel als in der Kontrollgruppe. Auch die von BROERE et al.

(2007; 2009) beschriebenen Daten von Isc und Chlorid-Fluxen bestätigen diese Theorie.

Im Jejunum von NHERF1-defizienten Mäusen ist die Flüssigkeitsabsorption in vivo

herabgesetzt (BROERE et al. 2009). Zugkraft für Flüssigkeitsbewegungen im Darm sind

Ionenverschiebungen. Ebenso wie die vorliegenden Natrium-Fluxraten weisen auch die

Chlorid-Fluxe eine Reduktion der basalen Nettoabsorption in NHERF1-defizientem Jejunum

auf (BROERE et al. 2009). Diese Feststellung unterstreicht die Kopplung zwischen Natrium-

und Chloridabsorption und den Einfluss von NHERF1 auf diese Salzaufnahme.

Unterschiede zu anderen Organen und Darmsegmenten

Die Steuerung von NHE3 und CFTR durch NHERF1 unterscheidet sich zwischen

verschiedenen Organen und auch zwischen den einzelnen Darmabschnitten. Beispielsweise

hemmt in der Niere eine hohe cAMP-Konzentration die Natrium-Absorption nur in den

isolierten Nierentubuli von gesunden Mäusen, nicht jedoch bei NHERF1-Defizienz. Dieser

Verlust der Hemmung wird der fehlenden cAMP-abhängigen Phosphorylierung von NHE3

zugeschrieben (WEINMAN et al. 2003; MURTAZINA et al. 2007). Wie die vorliegenden

Daten zeigen, ist diese Hemmung im Jejunum von NHERF1-defizienten Mäusen weiterhin

erhalten. In NHERF1-defizientem Ileum wiederum ist nicht nur diese Hemmung erhalten

(BROERE et al. 2007), sondern auch die basale NHE3-Aktivität ist mit derjenigen in der

Kontrollgruppe vergleichbar (MURTAZINA et al. 2007; BROERE et al. 2009). Die

Unterschiede bei der Stimulation von CFTR, die im Jejunum gezeigt wurden, traten im Ileum

hingegen nicht auf (BROERE et al. 2007).

64 6 DISKUSSION

In der Niere wurde ein weiterer hemmender Mechanismus über EPAC (exchange protein

activated by cAMP) für die Aktivierung von NHE3 entdeckt. Sowohl im Ileum als auch im

Jejunum konnte diese Hemmung nicht nachgewiesen werden (HONEGGER et al. 2006;

BROERE et al. 2009).

Eine mögliche Regulation von CFTR findet durch NHERF1 in Verbindung mit dem β2-

adrenergen Rezeptor statt. In Expressionssystemen wurde dieser Mechanismus von NAREN

et al. beschrieben (2003). Im nativen Duodenum ist die Bicarbonatsekretion durch CFTR

untersucht worden. Eine Hemmung des β2-adrenergen Rezeptors verringerte die

Sekretionsrate bei gesunden Mäusen. Das Fehlen dieser Hemmung in NHERF1-defizientem

Duodenum zeigt, dass sie NHERF1-spezifisch ist (SEIDLER et al. 2009). Verschiedene

Expressionsstudien deuten auf weitere solcher NHERF1-abhängigen, rezeptorvermittelten

Prozesse nicht nur im Darm hin (LIEDTKE u. WANG 2006; B. WANG et al. 2007; PAN et

al. 2008; B. WANG et al. 2008a).

Alle diese beschriebenen Unterschiede zeigen, dass die Steuerung der Absorptions- und

Sekretionsvorgänge in den Zellen sehr komplex ist und dass nicht ohne weiteres von einem

Organ auf ein anderes geschlossen werden darf.

Zusammenfassung

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass NHERF1 im Jejunum für die Aktivierung von

NHE3 vermutlich durch Bildung eines NHE3-Ezrin-Komplexes unerlässlich ist.

Außerdem ist NHERF1 ein Faktor bei der Regulation der CFTR-Aktivität im Jejunumepithel

und ist für die vollständige Aktivierung von CFTR durch cAMP von Bedeutung.

6.4 Messungen der PDZK1-defizienten Mäuse

Veränderungen der NHE3-Aktivität

Die vorliegenden Ergebnisse unterstreichen die bedeutende Rolle des PDZ-Adapterproteins

PDZK1 für die Regulation der elektroneutralen Natriumabsorption im Jejunum. Es konnte

eine Reduktion der basalen Nettonatriumabsorption in PDZK1 defizientem Jejunum um fast

6 DISKUSSION 65

die Hälfte festgestellt werden sowie eine zeitverzögerte Hemmung durch den Anstieg des

intrazellulären cAMP-Gehaltes. Beides äußerte sich in einer Reduktion der Natriumfluxe von

mukosal nach serosal und drückt die Relevanz von PDZK1 für die Aktivität von NHE3 aus.

ROSSMANN et al. zeigten, dass PDZK1 bevorzugt an den Anionenaustauscher DRA bindet,

der als Partner von NHE3 bei der intestinalen NaCl-Aufnahme fungiert (2005). Aus diesem

Grund wurden die vorliegenden sowie weitere Untersuchungen über die Bedeutung von

PDZK1 im Darm durchgeführt (CINAR et al. 2005; HILLESHEIM et al. 2007). Dabei stellte

sich neben den Defekten in der Natriumabsorption im Jejunum heraus, dass dort -

möglicherweise als kompensatorische Reaktion auf den Gendefekt - auch der

Expressionslevel von NHE3 mRNA signifikant erhöht ist. Dieser Anstieg der NHE3 mRNA-

Expression geht weder mit einem veränderten Proteingehalt an NHE3 in den Enterozyten

noch mit einer Verminderung der NHE3-Abundanz in der Bürstensaummembran einher. Das

Fehlen von PDZK1 scheint sich also in einem erhöhten Umsatz (Turnover) von NHE3, nicht

aber in einem verminderten NHE3-Gehalt in der Membran auszuwirken. Möglicherweise ist

die Retentionszeit von NHE3 in der Membran verkürzt. Die Lokalisation von NHE3 in der

Bürstensaummembran zeigt keine Unterschiede in den beiden Gruppen. Neben NHE3 wurde

auch das Expressionsniveau von PDZK1 und NHERF1 entlang des Dünndarmes gemessen.

Beide sind bei nicht defizientem Darm in den Enterozyten und der Bürstensaummembran

stark exprimiert. PDZK1 wurde dem Gendefekt entsprechend nur im Darm von Mäusen des

Wildtyps gefunden, während das Vorkommen von NHERF1 von dem fehlenden PDZK1

unbeeinflusst bleibt.

Regulation von CFTR

Die Versuche mit nativem Jejunum gaben keine Hinweise auf eine Regulation von CFTR

durch PDZK1 in diesem Darmabschnitt. Der Kurzschlussstrom unterschied sich in den

vorliegenden Versuchen am Jejunum nicht zwischen den beiden Mäusegruppen. Es fällt

jedoch auf, dass es Unterschiede in den einzelnen Darmabschnitten gibt. In der Mukosa des

Duodenums wurde in vergleichbaren Versuchen nach gleichen Basalraten ein leicht

reduzierter Anstieg nach Forskolingabe bei den PDZK1-defizienten Mäusen festgestellt.

Dieser ging mit einem signifikant reduzierten Anstieg der Bicarbonatsekretion einher. Dies

lässt einen leichten Defekt in der maximalen CFTR-Aktivierung durch cAMP im Duodenum

vermuten (CINAR et al. 2005; HILLESHEIM et al. 2007). In Expressionssystemen wird

66 6 DISKUSSION

ebenfalls eine Reduktion der CFTR-Stimulation bei Abwesenheit von PDZK1 beschrieben

(HAGGIE et al. 2004).

Auch die Funktion von PDZK1 scheint komplexer zu sein, als zunächst vermutet. Es wurde

beispielsweise gezeigt, dass eine CFTR-Mutante, der das C-terminale PDZ-Bindungsmotiv

fehlt, nicht in der Lage ist, an die Plasmamembran zu gelangen und dort durch cAMP

aktiviert zu werden (OSTEDGAARD et al. 2003). PDZK1 und auch NHERF1 steigern die

Aktivität des CFTR-Kanals. Hierfür kommt eine Dimerisierung (S. WANG et al. 2000;

RAGHURAM et al. 2001) oder eine Phosphorylierung von CFTR durch PKA in Betracht

(SUN et al. 2000a; NAREN et al. 2003; LI u. NAREN 2005). Es gibt jedoch auch

gegensätzliche Berichte über eine Hemmung von CFTR durch Anwesenheit von PDZK1 in

Zusammenhang mit anderen Transportern (LI et al. 2007). Diese unterschiedlichen Berichte

über die Wirkung von PDZK1 auf CFTR erklären möglicherweise die unterschiedlichen

Ergebnisse in Jejunum und Duodenum. Es scheint zu einer unvollständigen Kompensation im

Duodenum und einer vollständigen Kompensation von PDZK1 durch NHERF1 oder

NHERF2 im Jejunum zu kommen. Diese Vermutung wird durch unveränderte Expression von

CFTR sowie einem deutlich erhöhten NHERF1-mRNA Expressionsniveau gestützt

(HILLESHEIM et al. 2007).

PDZK1 beeinflusst weitere Transportproteine

Neben CFTR und NHE3 bindet PDZK1 auch an andere Proteine im Darm und sein Fehlen

löst dort schwere Defekte aus. Zu den PDZK1-regulierten Proteinen gehören z. B. Mucin

(Muc17), das in der Zellmembran vorkommt (MALMBERG et al. 2008), sowie zwei

Mitglieder von weiteren Slc-Familien. Es sind Slc22a5, auch OCTN2 (organic cation/carnitin

transporter N2) genannt (KATO et al. 2005; KATO et al. 2006), und der H+/Dipeptid

Transporter PEPT1 (Slc15a1) (SUGIURA et al. 2008). Auch hier wird eine Regulation durch

Komplexbildung vermutet.

6 DISKUSSION 67

Zusammenfassung

Zusammen zeigen die vorliegenden Daten die Wichtigkeit des PDZ-Adapterproteins PDZK1

für die Regulation des Natrium/Protonen-Austauschers NHE3 im Jejunum. Eine schnelle

Reaktion der Zelle auf äußere Einflüsse scheint bei fehlendem PDZK1 nicht möglich zu sein.

Des Weiteren zeigen sie einen fehlenden Einfluss auf CFTR im Jejunum der - im Gegensatz

zur Regulation von NHE3 - jedoch lokal spezifisch für diesen Darmabschnitt ist. Die

regionalen Unterschiede im Darm sowie zwischen Darm und Niere zeigen, dass die Steuerung

von NHE3 und CFTR durch PDZK1 wesentlich komplexer ist als zunächst vermutet. Es sind

noch weitere Untersuchungen auf molekularer und funktionaler Ebene notwendig, um den

Regulationsmechanismus genauer zu verstehen.

6.5 Vergleich zwischen den verschiedenen Gendefekten

In allen drei Versuchsgruppen waren die basalen Nettonatriumfluxraten der Knock-out Mäuse

um etwa die Hälfte reduziert. Die Hemmung durch Forskolin fehlte bei den NHE3 Knock-out

Mäusen. Bei den PDZK1 Knock-out Mäusen trat die Hemmung verzögert auf. Das Fehlen

von NHERF1 hatte keinen Einfluss auf die cAMP-vermittelte Hemmung von NHE3.

Der Anstieg des Kurzschlussstroms nach Stimulation mit Forskolin fiel in den NHE3- und

NHERF1-defizienten Mäusen signifikant geringer aus als in den Kontrollmäusen. Der

Unterschied war in den NHERF1 Knock-out Mäusen jedoch signifikant ausgeprägter als bei

den NHE3-defizienten Tieren. Dies verdeutlichte die Aktivierung von CFTR durch NHERF1,

die vielfach beschrieben wird (MOYER et al. 2000; KARTHIKEYAN et al. 2001;

RAGHURAM et al. 2001; RAGHURAM et al. 2003). In der PDZK1 Versuchsgruppe wiesen

die Knock-out und Wildtyp-Mäuse ähnliche Isc-Werte auf.

Nur in der NHE3 Versuchsgruppe wurden signifikante Unterschiede der Schlussleisten

festgestellt, die sich in der verminderten Gewebeleitfähigkeit äußerte. Das Fehlen der beiden

PDZ-Adapter beeinflusst die tight junctions offenbar nicht.

68 6 DISKUSSION

NHERF1 und PDZK1

Für die Funktion von NHE3 im nativen Jejunum sind die Adapterproteine NHERF1 und

PDZK1 beide notwendig. Ihr Fehlen löst jedoch teilweise unterschiedliche Defekte aus. Beide

senkten die basalen Natriumtransportraten. Jedoch beeinflusst nur PDZK1 die Regulation von

NHE3 durch cAMP. Diese war in den NHERF1-defizienten Mäusen intakt.

In den NHERF1-defizienten Mäusen wurde eine starke Reduktion des PDZK1-Proteinlevels

festgestellt (BROERE et al. 2007). Umgekehrt ist die NHERF1-Abundanz in PDZK1-

defizientem Jejunum nicht eingeschränkt (HILLESHEIM et al. 2007). Wie die vorliegenden

Daten zeigen, war NHERF1 jedoch nicht oder nur zeitverzögert in der Lage, das Fehlen von

PDZK1 bei der Funktion von NHE3 auszugleichen. Weitere Unterschiede zeigen die beiden

Adapterproteine PDZK1 und NHERF1 in der Expression in den unterschiedlichen

Darmsegmenten (HILLESHEIM et al. 2007).

Da in vitro bereits gezeigt wurde, dass NHERF1 zusammen mit PDZK1 Heterodimere zur

Steuerung von NHE3 wie auch von PAT1 bildet (GISLER et al. 2003b), wird vermutet, dass

diese Komplexbildung für die Stabilität oder Expression von PDZK1 notwendig ist. Für diese

Vermutung spricht die Feststellung, dass es in der Niere von NHERF1- sowie von PDZK1-

defizienten Mäusen zu einer verminderten Abundanz von NaPi-IIa, einem Natrium/Phosphat-

Kotransporter der Niere, kommt (SHENOLIKAR et al. 2002; CAPUANO et al. 2005).

Es wurde gezeigt, dass beide, NHERF1 und PDZK1, das Verankern von NHE3 in der

Bürstensaummembran der Darmzellen beeinflussen und für normale Salz- und

Flüssigkeitstransportraten im Darm erforderlich sind (HILLESHEIM et al. 2007; BROERE et

al. 2009).

NHERF1 scheint jedoch unter Umständen ein Fehlen von PDZK1 ausgleichen zu können.

Beispielsweise haben CAPUANO et al. festgestellt, dass die NHERF1-Abundanz in den

proximalen Nierentubuli von PDZK1-defizienten Mäusen durch eine stark phosphathaltige

Diät um ca. 50% gesteigert werden kann (2005). Auf eine weitere mögliche Kompensation

des Fehlens von PDZK1 durch NHERF1 deuten die vorliegenden Messungen des

Kurzschlussstromes in den PDZK1-defizienten Mäusen hin. Im Jejunum war der cAMP-

vermittelte Anstieg der elektrogenen Anionensekretion mit der Kontrollgruppe vergleichbar.

Für diese Erkenntnis kommen zwei Ursachen in Betracht. Zum einen ist es möglich, dass

6 DISKUSSION 69

PDZK1 nicht an der Stimulation von CFTR beteiligt ist oder zum anderen, dass NHERF1 in

der Lage ist, das Fehlen von PDZK1 vollständig zu kompensieren.

Neben einer möglichen direkten Kompensation des Fehlens von PDZK1 bzw. NHERF1 durch

das jeweils andere PDZ-Adapterprotein kommt auch eine indirekte Kompensation durch

Anpassung der Sekretionsraten an eine verminderte Absorption in Frage (BROERE et al.

2009). Die vorliegenden Daten zeigen eine verminderte Forskolin-bedingte Aktivierung von

CFTR jedoch nur für NHERF1.

Die Frage, ob sich Gendefekte von NHERF1 und PDZK1 gegenseitig potenzieren, wurde mit

Doppelknock-out Mäusen zu beantworten versucht. In Studien mit NHERF1/PDZK1

Doppelknock-out Mäusen konnte keine weitere Reduktion der Flüssigkeitsabsorption im

Jejunum im Gegensatz zu NHERF1 Knock-out Mäusen festgestellt werden und auch die

NHE3-Abundanz in der jejunalen Bürstensaummembran entsprach derjenigen von NHERF1

Knock-out Mäusen, so dass PDZK1 hier keinen weiteren Einfluss auszuüben scheint. Im

Kolon hingegen bewirkt der Doppelknock-out von NHERF1 und PDZK1 eine Reduktion der

Säureaktivierung von NHE3 sowie eine vollständige Hemmung der NHE3-Aktivität durch

Forskolin. Diese Werte entsprechen denen der PDZK1 Knock-out Mäusen (CINAR et al.

2005; BROERE et al. 2009). Bei den NHERF1-defizienten Tieren ist die Säureaktivierung

deutlich stärker und die Hemmung durch cAMP ist erhalten. Hierin könnte die Tatsache

begründet sein, dass in PDZK1 –/–-Mäusen im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte mRNA-

Levels für NHE3 gemessen wurden. Diese mögliche Kompensation des Gendefektes wurde in

NHERF1 –/–-Mäuse nicht beobachtet.

6.6 Wechselwirkungen zwischen NHERF1 und NHERF2

Obwohl NHERF1 und NHERF2 sich in ihrer Struktur stark ähneln und teilweise auch gleiche

Funktionen haben, scheint NHERF1 und nicht NHERF2 für die Stimulation der

Anionensekretion im Dünndarm erforderlich zu sein (BROERE et al. 2007). Es wird sogar

beschrieben, dass NHERF2 in Zellkulturen eine hemmende Wirkung auf CFTR besitzt (LI et

al. 2005; FAVIA et al. 2006). Untersuchungen an NHERF1/NHERF2 Doppelknock-out

Mäusen zeigen, dass der cAMP-vermittelte Anstieg des Kurzschlussstromes der Steigerung in

NHERF1 Knock-out Mäusen entsprach. NHERF2 kompensiert daher nicht das Fehlen von

NHERF1 (BROERE et al. 2007). Während allein NHERF1 für die cAMP-vermittelte

70 6 DISKUSSION

Regulation von CFTR erforderlich ist, sind NHERF1 und NHERF2 bei der cAMP-mediierten

Hemmung von NHE3 austauschbar (CHA et al. 2005).

6.7 PDZ-Adapterproteine sind nicht immer austauschbar

Die PDZ-Adapterproteine der NHERF-Familie weisen zwar eine hohe strukturelle

Ähnlichkeit ihrer PDZ-Domänen und teilweise auch in ihrer Gesamtstruktur auf, ihre

Funktionen sind jedoch größtenteils sehr spezifisch. Für NHERF1 und NHERF2 konnte in

Zellkulturen gezeigt werden, dass NHERF1 zwar bei der cAMP-vermittelten Hemmung das

Protein NHERF2 ersetzen kann, nicht jedoch bei der Calcium-vermittelten Hemmung (LEE-

KWON et al. 2003; LAMPRECHT u. SEIDLER 2006).

In PS120 Fibroblasten spielt Ezrin als Ankerprotein für die Proteinkinase A eine wichtige

Rolle in dem Multiproteinkomplex zwischen NHERF1 und NHE3 (LAMPRECHT et al.

1998). In der Niere scheint ein anderes Ankerprotein (D-AKAP-II) bei der Komplexbildung

von PDZK1 entscheidender zu sein. Dies ist ein Hinweis auf unterschiedliche

Zusammensetzung der Signalkomplexe und damit auf die Vielschichtigkeit der Regulation

von Transportproteinen, nicht nur durch PDZ-Adapterproteine (GISLER et al. 2003a). Ein

weiterer Baustein dieser komplexen Regulation ist ein zusätzlicher Steuerungsmechanismus

von NHE3 in der Niere. Neben cAMP ist dort auch das Protein EPAC (exchange protein

activated by cAMP) in der Lage, NHE3 zu steuern (HONEGGER et al. 2006; MURTAZINA

et al. 2007). Auch für diese Hemmung ist NHERF1 erforderlich (MURTAZINA et al. 2007).

Ein solcher Mechanismus konnte im Darm nicht nachgewiesen werden (BROERE et al.

2009).

Es gibt verschiedene Überlegungen, worin die Unterschiede in der Funktion der PDZ-Adapter

begründet liegen können.

Zum einen gibt es Unterschiede in ihrem Aufbau. Während NHERF1 und NHERF2 neben

ihren zwei PDZ- auch eine EMR-Domäne besitzen, hat PDZK1 insgesamt vier PDZ-

Domänen, aber keine EMR-Domäne (LAMPRECHT u. SEIDLER 2006). Dadurch können sie

unterschiedliche Bindungen eingehen.

Zum anderen konnten für DRA Unterschiede in der Affinität zwischen Transportprotein und

den PDZ-Adaptern NHERF1 und PDZK1 gezeigt werden (ROSSMANN et al. 2005). Solche

6 DISKUSSION 71

Vorlieben für bestimmte Bindungspartner sind auch bei anderen Transportproteinen

vorstellbar.

6.8 Ausblick in die Zukunft

Um die vielfältigen Regulationsmechanismen des Natriumchloridtransportes auf molekularer

Ebene zu verstehen, sind noch viele Untersuchungen notwendig. Trotzdem bleiben PDZ-

Proteine mögliches Ziel einer gezielten Antidiarrhoika-Entwicklung. Erste Fortschritte sind

auf diesem Gebiet schon erzielt worden.

Vor einiger Zeit rückte eine PDZ-spezifische Therapie in greifbare Nähe. Es wurde ein

Molekül entdeckt, das in das PDZ-Bindemotiv am C-terminalen Ende der Transportproteine

passt und so die Interaktion mit den PDZ-Adapterproteinen unterbricht. Dieser

vielversprechende Inhibitor ist in der Lage, die CFTR-Aktivität in den Bronchien zu

reduzieren (FUJII et al. 2007). Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Interaktion zwischen

CFTR und NHERF1 für die vollständige Aktivierung von CFTR in nativem Gewebe

notwendig ist. Demzufolge liegt hier ein möglicher Ansatz, um eine neue Klasse von

Antidiarrhoika zu entwickeln, die direkt bei der Interaktion von Transport- und

Adapterprotein ansetzt. Es könnte sowohl eine Reduktion der Chloridsekretion durch CFTR

sowie eine Steigerung der Natriumabsorption durch NHE3 möglich sein.

72 7 ZUSAMMENFASSUNG

7 Zusammenfassung

Jutta Hillesheim (2010)

Die Rolle des Natrium/Protonenaustauschers NHE3 und seiner PDZ-Adapterproteine

NHERF1 und PDZK1 bei der intestinalen Anionensekretion und Natriumchlorid-

absorption

Eine gestörte Absorption und Sekretion von Salzen und Flüssigkeit im Darm kann zu

Durchfallerkrankungen oder Obstruktionen wie bei Mukoviszidose führen. Im gesunden

Darm ist das Protein NHE3 einer der wichtigsten Ionentransporter bei der Natriumabsorption.

Er wird wie auch weitere Transportproteine unter anderem durch PDZ-Adapterproteine

gesteuert.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Auswirkungen der Abwesenheit des Transportproteins

NHE3 sowie seiner Adapterproteine NHERF1 und PDZK1 auf die intestinale

Natriumchloridabsorption und Anionensekretion zu untersuchen. Weiterhin sollten Hinweise

auf mögliche Wechselwirkungen mit anderen Transportproteinen sowie Kompensations-

mechanismen bei den entsprechenden Gendefekten aufgezeigt werden.

Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit den genannten Gendefekten und deren gesunde

Geschwister untersucht. Mit der Ussing-Kammer wurde die Natriumabsorption im Jejunum

ermittelt und die Parameter Kurzschlussstrom und Gewebeleitfähigkeit aufgezeichnet.

Die gewonnenen Ergebnisse bestätigen die Bedeutung von NHE3 für die Natriumabsorption.

NHE3 scheint für etwa die Hälfte der Nettonatriumaufnahme aus dem Darmlumen

verantwortlich zu sein und ebenfalls für die Hemmung der Natriumabsorption durch cAMP.

Der vermutete Einfluss von NHE3 auf die Anionensekretion von CFTR konnte in den

vorliegenden Daten ebenfalls bestätigt werden. Eine überraschende Feststellung war die

erhöhte Gewebeleitfähigkeit, die auf eine vermehrte Durchlässigkeit der tight junctions bei

NHE3-Defizienz hindeutet.

Die Daten des Adapterproteins NHERF1 lassen darauf schließen, dass es für die Funktion von

NHE3 im Ruhezustand der Darmzelle unerlässlich ist, nicht jedoch für die cAMP-vermittelte

Hemmung von NHE3. Anders verhält es sich bei der Wirkung auf den Chloridkanal CFTR.

7 ZUSAMMENFASSUNG 73

Hier beeinflusst NHERF1 die basale Transportleistung nicht. Die ebenfalls durch cAMP

ausgelöste Stimulation von CFTR kann jedoch nur in Anwesenheit von NHERF1 vollständig

stattfinden.

Für das ebenfalls untersuchte Adapterprotein PDZK1 konnte in den ermittelten Daten nur ein

Einfluss auf NHE3 gezeigt werden. Diesen übt es nicht wie NHERF1 nur auf die basale

Transportleistung von NHE3 aus, sondern auch die Hemmung von NHE3 durch cAMP

konnte nur in Anwesenheit von PDZK1 unverändert gezeigt werden. Im Gegensatz zu

NHERF1 wurde in den durchgeführten Untersuchungen für PDZK1 kein Einfluss auf die

Funktion von CFTR nachgewiesen.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen vermuten, dass die Steuerung der

Ionentransportvorgänge im Darm viel komplexer ist als bisher angenommen wurde. Dennoch

bleibt eine medikamentöse Beeinflussung der PDZ-Bindungsstellen von Transportproteinen

weiterhin ein vielversprechender Ansatz sowohl für die Behandlung von Diarrhöen

unterschiedlicher Genese als auch von Mukoviszidose.

74 8 SUMMARY

8 Summary

Jutta Hillesheim (2010)

The role of the sodium/proton exchanger NHE3 and its PDZ domain proteins NHERF1

and PDZK1 as key mediator of intestinal anion secretion and sodium chloride

absorption.

Intestinal dysfunction in absorption and secretion of salt and liquids can cause diarrhea or

obstructions, as observed in cystic fibrosis patients. In physiological intestine, the NHE3

protein is an important ion transporter in the process of sodium uptake. PDZ domain proteins

are possible regulators of NHE3 and other transport proteins.

The aim of the present study is to investigate the effect of NHE3-deficiency as well as

NHERF1- and PDZK1-deficiency on the intestinal sodium chloride uptake and anion

secretion. Furthermore, possible interactions with other transport proteins as well as potential

compensatory mechanism were investigated.

For this purpose NHE3-, NHERF1- and PDZK1-deficient mice and their normal littermates

were analyzed in an ´Ussing´ chamber setup. In the isolated jejunum the sodium absorption as

well as short-circuit current and tissue conductance was determined. The results clearly

demonstrate the significance of NHE3 on sodium uptake. About 50% of sodium absorption is

NHE3 dependent, whereby NHE3 plays a central role in cAMP mediated inhibition on sodium

absorption. Moreover, NHE3 has a regulatory impact on the anion secretion by CFTR chloride

channel. Surprisingly, NHE3-deficient mice reveal an increased tissue conductance, which

indicate an enhanced permeability of the cellular tight junctions. Additional results imply that

the adaptor protein NHERF1 is a crucial regulator for the basal NHE3 activity levels, but it is

not essential for cAMP-mediated inhibition of NHE3. On the contrary, NHERF1 does not

affect the basal CFTR activity, but it is necessary for the complete cAMP mediated

stimulation of CFTR. In addition, data of the PDZK1-deficient mice provide an evidence for a

direct influence on NHE3 but not on CFTR. PDZK1 is important for the basal NHE3 activity

and is essential for the cAMP mediated inhibition of NHE3.

The results of the present study suggest that the regulation of intestinal ion transport is a

highly complex mechanism. However, pharmacological strategies that modify PDZ motifs of

transport proteins seem to be a promising target for treatment of diarrhea as well as cystic

fibrosis.

9 LITERATURVERZEICHNIS 75

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MOYER, B. D., J. DENTON, K. H. KARLSON, D. REYNOLDS, S. WANG, J. E. MICKLE, M. MILEWSKI, G. R. CUTTING, W. B. GUGGINO, M. LI u. B. A. STANTON (1999): A PDZ-interacting domain in CFTR is an apical membrane polarization signal. J Clin Invest 104, 1353-1361 MOYER, B. D., M. DUHAIME, C. SHAW, J. DENTON, D. REYNOLDS, K. H. KARLSON, J. PFEIFFER, S. WANG, J. E. MICKLE, M. MILEWSKI, G. R. CUTTING, W. B. GUGGINO, M. LI u. B. A. STANTON (2000): The PDZ-interacting domain of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is required for functional expression in the apical plasma membrane. J Biol Chem 275, 27069-27074 MURTAZINA, R., O. KOVBASNJUK, N. C. ZACHOS, X. LI, Y. CHEN, A. HUBBARD, B. M. HOGEMA, D. STEPLOCK, U. SEIDLER, K. M. HOQUE, C. M. TSE, H. R. DE JONGE, E. J. WEINMAN u. M. DONOWITZ (2007): Tissue-specific regulation of sodium/proton exchanger isoform 3 activity in Na+/H+ exchanger regulatory factor 1 (NHERF1) null mice. cAMP inhibition is differentially dependent on NHERF1 and exchange protein directly activated by cAMP in ileum versus proximal tubule. J Biol Chem 282, 25141-25151 NAREN, A. P., B. COBB, C. LI, K. ROY, D. NELSON, G. D. HEDA, J. LIAO, K. L. KIRK, E. J. SORSCHER, J. HANRAHAN u. J. P. CLANCY (2003): A macromolecular complex of β2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc Natl Acad Sci USA 100, 342-346 OSTEDGAARD, L. S., C. RANDAK, T. ROKHLINA, P. KARP, D. VERMEER, K. J. ASHBOURNE EXCOFFON u. M. J. WELSH (2003): Effects of C-terminal deletions on cystic fibrosis transmembrane conductance regulator function in cystic fibrosis airway epithelia. Proc Natl Acad Sci USA 100, 1937-1942 PAN, Y., E. J. WEINMAN u. J. L. DAI (2008): Na+/H+ exchanger regulatory factor 1 inhibits platelet-derived growth factor signaling in breast cancer cells. Breast Cancer Res 10, R5 PFANNKUCHE, H. u. G. GÄBEL (2009): Glucose, epithelium, and enteric nervous system: dialogue in the dark. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl) 93, 277-286 POWELL, D. W. (1974): Intestinal conductance and permselectivity changes with theophylline and choleragen. Am J Physiol 227, 1436-1443 RAGHURAM, V., H. HORMUTH u. J. K. FOSKETT (2003): A kinase-regulated mechanism controls CFTR channel gating by disrupting bivalent PDZ domain interactions. PNAS 100, 9620-9625


RAGHURAM, V., D. O. MAK u. J. K. FOSKETT (2001): Regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator single-channel gating by bivalent PDZ-domain-mediated interaction. Proc Natl Acad Sci USA 98, 1300-1305 RECZEK, D., M. BERRYMAN u. A. BRETSCHER (1997): Identification of EBP50: A PDZ-containing phosphoprotein that associates with members of the ezrin-radixin-moesin family. J Cell Biol 139, 169-179 RECZEK, D. u. A. BRETSCHER (1998): The carboxyl-terminal region of EBP50 binds to a site in the amino-terminal domain of ezrin that is masked in the dormant molecule. J Biol Chem 273, 18452-18458 ROSSMANN, H., O. BACHMANN, D. VIEILLARD-BARON, M. GREGOR u. U. SEIDLER (1999): Na+/HCO3

‒ cotransport and expression of NBC1 and NBC2 in rabbit gastric parietal and mucous cells. Gastroenterology 116, 1389-1398 ROSSMANN, H., P. JACOB, S. BAISCH, R. HASSOUN, J. MEIER, D. NATOUR, K. YAHYA, C. YUN, J. BIBER, K. J. LACKNER, W. FIEHN, M. GREGOR, U. SEIDLER u. G. LAMPRECHT (2005): The CFTR associated protein CAP70 interacts with the apical Cl‒/HCO3

‒ exchanger DRA in rabbit small intestinal mucosa. Biochemistry 44, 4477-4487 SCHREIBER, R., A. BOUCHEROT, B. MURLE, J. SUN u. K. KUNZELMANN (2004): Control of epithelial ion transport by Cl‒ and PDZ proteins. J Membr Biol 199, 85-98 SCHULTHEIS, P. J., L. L. CLARKE, P. MENETON, M. L. MILLER, M. SOLEIMANI, L. R. GAWENIS, T. M. RIDDLE, J. J. DUFFY, T. DOETSCHMAN, T. WANG, G. GIEBISCH, P. S. ARONSON, J. N. LORENZ u. G. E. SHULL (1998): Renal and intestinal absorptive defects in mice lacking the NHE3 Na+/H+ exchanger. Nature genetics 19, 282-285 SCHWEINFEST, C. W., K. W. HENDERSON, S. SUSTER, N. KONDOH u. T. S. PAPAS (1993): Identification of a colon mucosa gene that is down-regulated in colon adenomas and adenocarcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 90, 4166-4170 SCHWEINFEST, C. W., D. D. SPYROPOULOS, K. W. HENDERSON, J. H. KIM, J. M. CHAPMAN, S. BARONE, R. T. WORRELL, Z. WANG u. M. SOLEIMANI (2006): slc26a3 (dra)-deficient mice display chloride-losing diarrhea, enhanced colonic proliferation, and distinct up-regulation of ion transporters in the colon. J Biol Chem 281, 37962-37971


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‒ secretion. J Physiol 505, 411-423 SEIDLER, U., I. ROTTINGHAUS, J. HILLESHEIM, M. CHEN, B. RIEDERER, A. KRABBENHÖFT, R. ENGELHARDT, M. WIEMANN, Z. WANG, S. BARONE, M. MANNS u. M. SOLEIMANI (2008): Sodium and chloride absorptive defects in the small intestine in Slc26a6 null mice. Pflügers Arch 455, 757-766 SEIDLER, U., A. K. SINGH, A. CINAR, M. CHEN, J. HILLESHEIM, B. HOGEMA u. B. RIEDERER (2009): The role of the NHERF family of PDZ scaffolding proteins in the regulation of salt and water transport. Ann N Y Acad Sci 1165, 249-260 SHENG, M. (1996): PDZs and receptor/channel clustering: rounding up the latest suspects. Neuron 17, 575-578 SHENG, M. u. C. SALA (2001): PDZ domains and the organization of supramolecular complexes. Annu Rev Neurosci 24, 1-29 SHENOLIKAR, S., J. W. VOLTZ, R. CUNNINGHAM u. E. J. WEINMAN (2004): Regulation of ion transport by the NHERF family of PDZ proteins. Physiology (Bethesda), Md 19, 362-369 SHENOLIKAR, S., J. W. VOLTZ, C. M. MINKOFF, J. B. WADE u. E. J. WEINMAN (2002): Targeted disruption of the mouse NHERF1 gene promotes internalization of proximal tubule sodium/phosphate cotransporter type IIa and renal phosphate wasting. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11470-11475 SHEPPARD, D. N. u. M. J. WELSH (1999): Structure and function of the CFTR chloride channel. Physiol Rev 79, S23-45


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‒ exchanger in the upper villous epithelium of the murine duodenum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 292, G1079-1088 SUGIURA, T., Y. KATO, T. WAKAYAMA, D. L. SILVER, Y. KUBO, S. ISEKI u. A. TSUJI (2008): PDZK1 regulates two intestinal solute carriers (Slc15a1 and Slc22a5) in mice. Drug Metab Dispos 36, 1181-1188 SUN, F., M. J. HUG, N. A. BRADBURY u. R. A. FRIZZELL (2000a): Protein kinase A associates with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator via an interaction with ezrin. J Biol Chem 275, 14360-14366 SUN, F., M. J. HUG, C. M. LEWARCHIK, C. H. YUN, N. A. BRADBURY u. R. A. FRIZZELL (2000b): E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J Biol Chem 275, 29539-29546 SWIATECKA-URBAN, A., M. DUHAIME, B. COUTERMARSH, K. H. KARLSON, J. COLLAWN, M. MILEWSKI, G. R. CUTTING, W. B. GUGGINO, G. LANGFORD u. B. A. STANTON (2002): PDZ domain interaction controls the endocytic recycling of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem 277, 40099-40105 THELIN, W. R., C. A. HODSON u. S. L. MILGRAM (2005): Beyond the brush border: NHERF4 blazes new NHERF turf. J Physiol 567, 13-19 THIAGARAJAH, J. R. u. A. S. VERKMAN (2003): CFTR pharmacology and its role in intestinal fluid secretion. Curr Opin Pharmacol 3, 594-599 TURNER, J. R. u. E. D. BLACK (2001): NHE3-dependent cytoplasmic alkalinization is triggered by Na+/glucose cotransport in intestinal epithelia. Am J Physiol Cell Physiol 281, C1533-1541


USSING, H. H. u. K. ZERAHN (1951): Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiol Scand 23, 110-127 WANG, B., A. BISELLO, Y. YANG, G. G. ROMERO u. P. A. FRIEDMAN (2007): NHERF1 regulates parathyroid hormone receptor membrane retention without affecting recycling. J Biol Chem 282, 36214-36222 WANG, B., Y. YANG u. P. A. FRIEDMAN (2008a): Na+/H+ exchange regulatory factor 1, a novel AKT-associating protein, regulates extracellular signal-regulated kinase signaling through a B-Raf-mediated pathway. Mol Biol Cell 19, 1637-1645 WANG, N. X., H. J. LEE u. J. J. ZHENG (2008b): Therapeutic use of PDZ protein-protein interaction antagonism. Drug News Perspect 21, 137-141 WANG, S., R. W. RAAB, P. J. SCHATZ, W. B. GUGGINO u. M. LI (1998): Peptide binding consensus of the NHE-RF-PDZ1 domain matches the C-terminal sequence of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). FEBS Lett 427, 103-108 WANG, S., H. YUE, R. B. DERIN, W. B. GUGGINO u. M. LI (2000): Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell 103, 169-179 WANG, Z., S. PETROVIC, E. MANN u. M. SOLEIMANI (2002): Identification of an apical Cl‒/HCO3

‒ exchanger in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 282, G573-579 WANG, Z., T. WANG, S. PETROVIC, B. TUO, B. RIEDERER, S. BARONE, J. N. LORENZ, U. SEIDLER, P. S. ARONSON u. M. SOLEIMANI (2005): Renal and intestinal transport defects in Slc26a6-null mice. Am J Physiol Cell Physiol 288, C957-965 WEINMAN, E. J. (2001): New functions for the NHERF family of proteins. J Clin Invest 108, 185-186 WEINMAN, E. J., C. MINKOFF u. S. SHENOLIKAR (2000a): Signal complex regulation of renal transport proteins: NHERF and regulation of NHE3 by PKA. Am J Physiol Renal Physiol 279, F393-399 WEINMAN, E. J. u. S. SHENOLIKAR (1997): The Na+/H+ exchanger regulatory factor. Exp Nephrol 5, 449-452


WEINMAN, E. J., D. STEPLOCK, M. DONOWITZ u. S. SHENOLIKAR (2000b): NHERF Associations with Sodium/Hydrogen Exchanger Isoform 3 (NHE3) and Ezrin Are Essential for cAMP-Mediated Phosphorylation and Inhibition of NHE3 Biochemistry 39, 6123-6129 WEINMAN, E. J., D. STEPLOCK u. S. SHENOLIKAR (1993): CAMP-mediated inhibition of the renal brush border membrane Na+/H+ exchanger requires a dissociable phosphoprotein cofactor. J Clin Invest 92, 1781-1786 WEINMAN, E. J., D. STEPLOCK u. S. SHENOLIKAR (2003): NHERF-1 uniquely transduces the cAMP signals that inhibit sodium/hydrogen exchange in mouse renal apical membranes. FEBS Lett 536, 141-144 WEINMAN, E. J., D. STEPLOCK, K. TATE, R. A. HALL, R. F. SPURNEY u. S. SHENOLIKAR (1998): Structure-function of recombinant Na+/H+ exchanger regulatory factor (NHE-RF). J Clin Invest 101, 2199-2206 WEINMAN, E. J., D. STEPLOCK, Y. WANG u. S. SHENOLIKAR (1995): Characterization of a protein cofactor that mediates protein kinase A regulation of the renal brush border membrane Na+/H+ exchanger. J Clin Invest 95, 2143-2149 WRIGHT, E. M. u. D. D. LOO (2000): Coupling between Na+, sugar, and water transport across the intestine. Ann N Y Acad Sci 915, 54-66 YUN, C. H., G. LAMPRECHT, D. V. FORSTER u. A. SIDOR (1998): NHE3 kinase A regulatory protein E3KARP binds the epithelial brush border Na+/H+ exchanger NHE3 and the cytoskeletal protein ezrin. J Biol Chem 273, 25856-25863 YUN, C. H., S. OH, M. ZIZAK, D. STEPLOCK, S. TSAO, C. M. TSE, E. J. WEINMAN u. M. DONOWITZ (1997): cAMP-mediated inhibition of the epithelial brush border Na+/H+ exchanger, NHE3, requires an associated regulatory protein. Proc Natl Aca Sci USA 94, 3010-3015 ZACHOS, N. C., M. TSE u. M. DONOWITZ (2005): Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol 67, 411-443 ZHAO, H., H. SHIUE, S. PALKON, Y. WANG, P. CULLINAN, J. K. BURKHARDT, M. W. MUSCH, E. B. CHANG u. J. R. TURNER (2004): Ezrin regulates NHE3 translocation and activation after Na+/glucose cotransport. PNAS 101, 9485-9490


ZHONG, H. u. R. R. NEUBIG (2001): Regulator of G protein signaling proteins: novel multifunctional drug targets. J Pharmacol ExpTher 297, 837-845 ZIZAK, M., G. LAMPRECHT, D. STEPLOCK, N. TARIQ, S. SHENOLIKAR, M. DONOWITZ, C. H. YUN u. E. J. WEINMAN (1999): cAMP-induced phosphorylation and inhibition of Na+/H+ exchanger 3 (NHE3) are dependent on the presence but not the phosphorylation of NHE regulatory factor. J Biol Chem 274, 24753-24758

10 ANHANG 91

10 Anhang

Verwendete Substanzen

Agarose Typ III

Wird gelöst in: KCl (3M)

Firma: Sigma

Carbogen

95% O2 / 5% CO2

Firma: Linde

DMSO

Synonym: Dimethyl-Sulfoxyd

Strukturformel: (CH3)2SO

Firma: Sigma

EDTA

Synonym: Ethylendinitrilotetraessigsäure

Wird gelöst in: H2O

Firma: Merck

Forskolin

Synonym: Coleonol, Colforsin

Strukturformel: C22H34O7

Wird gelöst in: DMSO

Firma: Tocris

Glukose

Synonym: D-Glucose Monohydrat, Dextrose


Wird gelöst in: H2O bzw. in Basallösung

Firma: AppliChem

92 10 ANHANG

Indomethazin

Strukturformel: C19H16ClNO4

Wird gelöst in: Na2HPO4

Firma: Sigma

Kaliumchlorid

Strukturformel: KCl


Firma: Merck

Kaliumdihydrogenphosphat

Strukturformel: KH2PO4


Firma: Merck

Kalziumchlorid-Dihydrat

Strukturformel: CaCl2 x 2 H2O


Firma: Roth

Kohlendioxid 100%

Strukturformel: CO2

Firma: Linde

Magnesiumsulfat-Heptahydrat

Strukturformel: MgSO4 x 7 H2O


Firma: Roth

D-Mannitol

Synonym: Mannit


Firma: Merck

10 ANHANG 93

Natriumchlorid

Strukturformel: NaCl


Firma: Merck

Natrium-Citrat

Synonym: Tri-Natriumcitrat-2-Hydrat

Strukturformel: C6H5Na3O7 x 2 H2O

Firma: Merck

Natriumhydrogencarbonat

Strukturformel: NaHCO3


Firma: Sigma

Natriumhydrogenphosphat, wasserfrei

Strukturformel: Na2HPO4


Firma: Merck

Natriumhydroxid

Strukturformel: NaOH


Firma: Roth

Natrium-Pyruvat

Abkürzung: Pyruvat

Strukturformel: C3H3NaO3


Firma: Sigma

Radioaktives 22Na+

Strukturformel: 22NaCl

Firma: Amersham

94 10 ANHANG

Salzsäure

Abkürzung: HCl


Firma: Sigma

Sauerstoff 100%

Strukturformel: O2

Firma: Linde

Tetrodotoxin

Synonym: TTX, Fugu poison, Maculotoxin, Tarichatoxin

Strukturformel: C11H17N3O8

Wird gelöst in: Natrium-Citrat

Firma: Tocris

10 ANHANG 95

Firmenanschriften

Amersham Biosciences Europe GmbH

Freiburg

www.amershambiosciences.com

AppliChem GmbH

Darmstadt

www.AppliChem.de

Carl Roth GmbH & Co

Karlsruhe

www.carl-roth.de

Linde Gas Therapeutics GmbH & Co KG

München

www.linde-gas.com

Merck KG

Darmstadt

www.merck.de

Sigma-Aldrich Chemie Gmbh

München

www.sigmaaldrich.com

Tocris Bioscience

Bristol, UK

www.tocris.co

96 11 DANKSAGUNG

11 Danksagung

Für die Überlassung des interessanten Themas und die Freiheit, dieses selbständig bearbeiten

zu dürfen, danke ich meinen beiden Betreuerinnen Prof. Dr. Korinna Huber und Prof. Dr.

Ursula Seidler. Besonders bei Prof. Dr. Korinna Huber bedanke ich auch für Ihre Geduld.

Vielen Dank an meine Kollegen aus der Arbeitsgruppe an der Medizinischen Hochschule

Hannover für die gute Einarbeitung und stets freundschaftliche Zusammenarbeit im Labor.

Auf Inges und Reginas Unterstützung konnte ich in allen Dingen, die mit den Ussing-

Kammer Versuchen zusammenhingen, immer 100% zählen. Brigitte und Anja danke ich für

die Betreuung und Genotypisierung „meiner“ Mäuse. Es hat mir viel Spaß gemacht, mit Euch

allen zu arbeiten.

Mein ganz besonderer Dank gilt der Tierärztlichen Gemeinschaftspraxis Dr. B. Kemper und

H. Seth! Berit und Holger, Ihr seid die besten Chefs, die man sich wünschen kann! Durch

Eure Unterstützung habt Ihr es mir ermöglicht, in so kurzer Zeit den Endspurt zu bewältigen.

Ebenfalls ein großes Dankeschön an Christina, die mir viel Arbeit abgenommen hat.

Von Herzen danke ich auch meinen Freunden, besonders Antje, Kerstin, Carlo und Markus,

die schon während des Studiums immer für mich da waren. Sie haben nicht locker gelassen

und mich motiviert, nach langer Pause meine Dissertation wieder in Angriff zu nehmen. Ohne

Euch wäre ich sicherlich manches Mal verzweifelt.

Ein herzliches „Thank you“ an Susan und Hannes für ihre kurzfristige Unterstützung bei der

englischen Übersetzung.

Meinen Eltern danke ich von ganzem Herzen für ihre Unterstützung und Geduld. Sie haben

mir nicht nur das Studium und die Doktorarbeit ermöglicht, sie sind auch in jeder Lebenslage

für mich da. Danke, dass ich immer auf Euch zählen kann!

Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Freund Elmar bedanken. Deine Unterstützung

und Dein Rückhalt sind von unschätzbarem Wert.

tierärztliche hochschule hannover - kultur und wissen online · pdf file5.5 vergleich der...

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