titel der diplomarbeit charakterisierung von...
TRANSCRIPT
DIPLOMARBEIT
Titel der Diplomarbeit
„Charakterisierung von Phenylpropan-
Verbindungen aus Scrophularia lucida“
verfasst von
Tobias Ledermüller
angestrebter akademischer Grad
Magister der Pharmazie (Mag.pharm.)
Wien, 2015
Studienkennzahl lt. Studienblatt: A 449
Studienrichtung lt. Studienblatt: Diplomstudium Pharmazie
Betreut von: ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Liselotte Krenn
Danksagung
Ich möchte mich zuerst bei Frau Univ.-Prof. Dr. Verena M. Dirsch, Vorstand des
Departments für Pharmakognosie, für die Möglichkeit der Durchführung meiner
praktischen Arbeit an ihrem Department bedanken.
Ich bedanke mich auch in besonderer Weise bei Frau ao. Univ. Prof. Mag. Dr.
Liselotte Krenn für die stets lehrreiche, freundliche und geduldige Betreuung im
Rahmen der gesamten Arbeit.
Des Weiteren möchte ich mich auch bei Apothekerin Andrea Lubich, bei Dr. Martin
Zehl und dem ganzen Department für Pharmakognosie bedanken, die nicht nur für
ein angenehmes Arbeitsklima sorgten, sondern auch immer eine helfende Hand für
mich übrig hatten.
Nicht zuletzt bin ich Gott, meiner Familie, meinen Freunden und meinen
Studienkollegen äußerst dankbar. Ohne ihre Hilfe und ermutigende Unterstützung
wäre der Abschluss meines Studiums bestimmt nicht möglich gewesen.
Vielen Dank.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Aufgabenstellung ..................................... 1
2. Material und Methoden ...................................................... 3
2.1. Untersuchungsmaterial ................................................................... 3
2.2. Angewendete Methoden .................................................................. 4
2.2.1. Dünnschichtchromatographie (DC) ................................................ 4
2.2.2. Säulenchromatographie (SC) .......................................................... 5
2.2.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ....................... 6
2.2.4. Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) ............................. 8
3. Ergebnisse ......................................................................... 8
3.1. Präparative Trennung mittels Dünnschichtchromatographie ..... 8
3.2. Säulenchromatographie 1 (SC 1) ................................................. 11
3.3. Säulenchromatographie 2 (SC 2) ................................................. 12
3.4. Vergleiche mit Referenzsubstanzen............................................. 16
3.4.1. Charakterisierung der Säure-Derivate............................................17
3.4.2. Untersuchung von Fraktion SC 2 / SF 14 .......................................18
3.4.3. Untersuchung von Fraktion SC 2 / SF 21 .......................................21
3.4.4. Untersuchung der Fraktionen SC 2 / SF 24, 25, 26 und 27 ...........23
3.5. Strukturaufklärung mittels HRMS ................................................ 25
3.6. Quantifizierung .............................................................................. 26
3.6.1. Gewinnung der Reinsubstanzen ....................................................27
3.6.1.1. Aufreinigung von Homoplantaginin............................................27
3.6.1.2. Aufreinigung von Scrovalentinosid ............................................27
3.6.1.3. Koelziosid und Hispidulin ...........................................................30
3.6.2. Stammlösungen und Verdünnungsreihen .....................................30
3.6.3. Quantifizierung von Homoplantaginin ...........................................31
3.6.4. Quantifizierung von Koelziosid ......................................................34
3.6.5. Quantifizierung von Scrovalentinosid............................................37
3.6.6. Quantifizierung von Hispidulin....................................................... 40
4. Diskussion ....................................................................... 44
5. Zusammenfassung .......................................................... 46
6. Summary .......................................................................... 47
7. Literaturverzeichnis ......................................................... 48
8. Abbildungsverzeichnis .................................................... 50
9. Tabellenverzeichnis ......................................................... 52
Abkürzungsverzeichnis
AAS…………………………………….……………Anisaldehyd-Schwefelsäure
CCID…………………………………Circular Chemorepellent Induced Defects
DC…………………………………….…………….Dünnschichtchromatographie
DMSO……………………...…………………………..………….Dimethylsulfoxid
ELSD……………………………….…….Evaporative Light Scattering Detector
ESI…………………………………….……………...Elektronen Spray Ionisation
EtOAc…………………………………….……………………………...Ethylacetat
HPLC…………………….………….High Performance Liquid Chromatography
HRMS…………………….………………...High Resolution Mass Spectrometry
MeOH………………………………………………………………………Methanol
NL……………………………………….……………..……………………Nachlauf
NS…………………………………………………….………………..Niederschlag
NST A/ PEG……………….………Naturstoffreagenz A/ Polyethylenglykol 400
SC…………………………………………………………Säulenchromatographie
SF………………………………………………….………………..Sammelfraktion
SPE………………………………………………..………..Solid Phase Extraction
T………………………………………………………………………….………..Teil
TOF……………………………………………………………..……..Time of Flight
ÜS…………………………………………….…………………………...Überstand
1
1. Einleitung und Aufgabenstellung
Der Familie der Scrophulariaceae gehören mehr als 220 Gattungen an, zu welchen
unter anderem die Gattung Scrophularia zählt. Deren verschiedene Arten finden eine
breite Anwendung in der Volksmedizin bei Ekzemen, Psoriasis, Krätze, entzündlichen
Erkankungen und Tumoren [1, 2]. Eine dieser Arten ist Scrophularia lucida (L.). Sie
ist vorwiegend im mediterranen Raum, in der Türkei, Griechenland und Italien zu
finden [3].
Abbildung 1: Scrophularia lucida (L.)1
Für die Gattung Scrophularia wurden bereits antiinflammatorische, antibakterielle,
zytotoxische und einige weitere Effekte beschrieben [2, 4]. Aus diesem Grund wurden
im Zuge einer Studie fünf verschiedene Vertreter der Gattung auf ihre Anti-Tumor-
Wirkung untersucht. Hierzu wurde u.a. ein Zell-Modell für Brustkrebs-Metastasierung
herangezogen, um auf Aktivität der ausgewählten Arten zu prüfen [1].
1 Quelle: http://azalas.de/blog/?page_id=4175 (zuletzt aufgerufen am: 20.1.2015)
2
Ein notwendiger Schritt für die Metastasierung des Tumors ist eine „Lochbildung“
(gap-formation) im betroffenen Endothel, wodurch Tumorzellen in Lymph- und/oder
Blutbahn eindringen und Metastasen in Lymphknoten oder entfernten Körperregionen
bilden [1].
Im Rahmen der Studie wurde der CCID-Assay (Circular chemorepellent induced
defects) angewendet. Hierbei wurde eine einlagige Schicht von Lymphendothelzellen
mit MCF-7 Brustkrebszell-Sphäroiden inkubiert. Nach wenigen Stunden Inkubation
wurde auf Größe und Zahl der Löcher geprüft, welche nach Behandlung mit den
Extrakten der verschiedenen Scrophularia-Arten entstanden sind [1].
Es zeigte sich, dass es unter Einwirkung eines methanolischen Extraktes von
Scrophularia lucida zu einer signifikanten Hemmung der gap-formation gekommen
war [1].
Die Ergebnisse der Studie und die Untersuchungen vorhergehender Diplomarbeiten
zur Aufklärung der Sekundärmetabolite bilden die Grundlage der vorliegenden
Diplomarbeit. Da es über Scrophularia lucida keine Informationen über die chemische
Zusammensetzung der Sekundärmetabolite einschließlich der wirksamen
Komponenten gab, war es das Ziel dieser Arbeit, die Charakterisierung des
Inhaltsstoffmusters fortzusetzen, um Scrophularia lucida innerhalb der Gattung
chemotaxonomisch besser zuordnen zu können. Die bisher unbekannten
Phenylpropan-Verbindungen vor allem aus der Ethylacetat-Fraktion (siehe 2.1., Seite
3) sollten identifiziert und vier Hauptkomponenten des methanolischen Extraktes
quantitativ bestimmt werden.
Abbildung 2: Aktivität im CCID-Assay: Reduktion der Löcher unter
Behandlung mit dem Methanol-Extrakt von Scrophularia lucida [1]
3
2. Material und Methoden
2.1. Untersuchungsmaterial
In vorangegangen Diplomarbeiten [5, 6] standen 158 g methanolischen Extraktes von
Scrophularia lucida zur Verfügung. Das Pflanzenmaterial stammte aus der Türkei.
Der Extrakt wurde anschließend nach der Methode von Wall et al. vorgereinigt.
Danach standen eine Petrolether-, Chloroform-, Ethylacetat- und eine Butanol-
Fraktion zur Verfügung [5].
Im Zuge dieser Diplomarbeit wurden die in Tabelle 1 angeführten Fraktionen zur
weiteren Untersuchung verwendet.
Tabelle 1: Verwendete Fraktionen
Fraktion Menge (mg) Quelle Weitere Aufarbeitung
SPE 2 / 1 + 2 38,2 [7] SC 1
SPE 2 / 3 - 8 10,3 [7] SC 1
SPE 2 / 9 - 11 10,6 [7] Präparative Trennung mittels DC
SC 1 / SF 8 385,0 [5] SC 2
SC 3 / SF 12 24,5 [5] Isolierung von Homoplantaginin;
Quantifizierzung
SL 1 133,4 [6] Quantifizierung
SL 2 208,4 [6] SC 3; Quantifizierung
4
2.2. Angewendete Methoden
2.2.1. Dünnschichtchromatographie (DC)
Die Dünnschichtchromatographie wurde zur Überprüfung der Einzel- bzw.
Sammelfraktionen angewendet.
Andererseits wurden mehrere Inhaltsstoffe mit Referenzsubstanzen auf ihre Identität
geprüft.
Es wurde verschiedene DC-Systeme verwendet:
Stationäre Phase:
a) Kieselgel-Fertigplatte 60 F254 (Merck®)
b) Polyamid-Fertigplatte 6 F254 (Sigma-Aldrich®)
c) Kieselgel-Fertigplatte mit Konzentrierungszone (Merck®)
Mobile Phase:
1. Ethylacetat + Ameisensäureconc.+ Essigsäureconc. + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
2. Toluol + Petrolether + Butanon + MeOH (15 + 4,5 + 9 + 12)
3. Chloroform + MeOH + Essigsäureconc. (2 + 1 + 2)
4. Ethylacetat + MeOH + Ameisensäureconc. + Wasser (70 + 8 + 4 + 4)
Detektion:
Naturstoffreagenz A/ Polyethylenglykol 400 (NST A/PEG):
Zur Detektion wurde bei den Analysen mit den mobilen Phasen 1 - 3 die entwickelte
DC-Platte zunächst mit 1% methanolischer Naturstoffreagenz A-Lösung (NST A) und
nach kurzem Zwischentrocknen mit 5% ethanolischer Polyethylenglykol-400-Lösung
(PEG) besprüht. Nach etwa 10 – 15 Minuten konnte unter UV-Licht bei 366 nm
ausgewertet werden [8].
5
Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagens (AAS):
Bei Verwendung der mobilen Phase 5 zur Detektion der Inhaltsstoffe aus der
Chloroform-Fraktion, wurde mit einer frisch bereiteten Mischung aus 0,5 ml
Anisaldehyd, 10 ml Eisessig, 85 ml Methanol und 5 ml Schwefelsäureconc besprüht.
Anschließend wurde die DC-Platte für wenige Minuten im Trockenschrank bei 100°C
erhitzt. Danach konnte bei Tageslicht ausgewertet werden [8].
2.2.2. Säulenchromatographie (SC)
Es wurden zwei verschiedene Systeme verwendet, um das komplexe
Inhaltsstoffmuster der verwendeten Fraktionen (s. Tabelle 1, S. 3) besser auftrennen
zu können.
Stationäre Phase:
A) Polyamid (Roth®)
Die Trennung erfolgt hier vor allem auf Grund unterschiedlicher Affinität, aber auch
auf Grund der Größe von Molekülen eines Stoffgemisches und eignet sich gut, um
Phenole und Carbonsäuren zu trennen [9].
B) Sephadex® LH-20 (Sigma -Aldrich®)
Sephadex besteht aus hydroxypropylierten Dextranen. Als stationäre Phase eignet
es sich ebenfalls zur Trennung von phenolischen Verbindungen [10].
Mobile Phase:
Zur Trennung der Stoffgemische wurden bei Verwendung von Polyamid als stationäre
Phase Gemische von Ethanol und Wasser und bei Verwendung von Sephadex
Methanol/Wasser-Gemische in unterschiedlichen Konzentrationen als mobile Phase
eingesetzt.
6
Die weiteren Parameter sind bei der jeweiligen SC angegeben.
Es wurde jede zehnte Fraktion in einem geeigneten DC-
System überprüft. Bei Übereinstimmung der Inhaltsstoffe
der analysierten Fraktionen wurden diese zu Sammel-
fraktionen vereinigt.
2.2.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Die HPLC wurde zur Identitätsprüfung von Komponenten des Untersuchungs-
materials eingesetzt. Die in Dünnschichtchromatogrammen aufgezeigten Über-
einstimmungen von Inhaltsstoffen mit Referenzsubstanzen sollten durch Vergleich in
der HPLC bestätigt werden.
Die HPLC wurde auch zur Quantifizierung von vier ausgewählten Hauptinhaltsstoffen
des methanolischen Extraktes von Scrophularia lucida herangezogen.
Vor jeder Analyse wurde die Analysen-Lösung zentrifugiert.
Abbildung 3: Säulenchromatographie
7
Tabelle 2: HPLC-Parameter
Zur Kontrolle der Reinheit der Standards, welche für die Quantifizierung verwendet
wurden, kam ein Evaporative Light Scattering Detector (ELSD-LT, Shimadzu®) zum
Einsatz. Der Vorteil dieser Detektionsmethode besteht darin, dass damit auch nicht
chromophore Verbindungen detektiert werden können.
Mobile Phase [5]:
A: Destilliertes Wasser, mit Ameisensäure auf pH 3 eingestellt
B: Acetonitril / Destilliertes Wasser pH 3 (80 + 20)
Gradient [5]:
2 Konzentration für Identitätsprüfung
Gerät (Shimadzu®) Einstellungen
Pumpe LC - 20AD Injektionsvolumen 10µl
Detektor SPD - M20A
(Dioden-Array-
Detektor)
Temperatur 25°C
Säulenofen CTO – 20AC Konzentration der
Analysenlösungen2
0,5 mg/ml
Autosampler SIL – 20AC HT Flussrate 1 ml/min
Säule Luna 5µ C18 100A
250x 4,6 mm,
Phenomenex, USA
Detektion 200 nm -
400 nm
Konzentration Zeit
5% 20% B 15 min
20% B isokratisch 10 min
20% 50% B 40 min
50% 95% B 15 min
8
2.2.4. Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS)3
Die HRMS wurde verwendet, um jene Substanzen, deren Struktur durch HPLC-
Vergleich nicht aufgeklärt werden konnte, über das Molekulargewicht und das
Fragmentierungsverhalten zu identifizieren.
Die Versuche wurden am maXis HD ESI-Qq-TOF Massenspektrometer (Bruker
Daltonics®) durchgeführt. Die Probenlösungen wurden mit einer Flussrate von 3
µL/min direkt in die ESI-Quelle infundiert.
Die ESI-Quelle wurde mit folgenden Parametern betrieben: Kapillarspannung: 2,0 –
4,0 kV, Verneblungsgas: 0,4 bar (N2), Trockengasfluss: 4,0 L/min, Trockengas-
temperatur: 200°C. Die Massenspektren wurden in einem Bereich von 50 m/z bis
1550 m/z aufgenommen. Die Summenformeln konnten mit Hilfe des Programms
Bruker Compass Data Analysis 4.2 ermittelt werden, basierend auf einer
Massengenauigkeit von Δm/z ≤ 2 ppm und einem Isotopenmustervergleich.
3. Ergebnisse
3.1. Präparative Trennung mittels
Dünnschichtchromatographie
Im ersten Schritt sollten die zwei gelb fluoreszierenden Banden bei Rf= 0,73 und Rf=
0,79 (s. Abb. 4, S. 9) in der Fraktion SPE 2/ 9-11 [7] einzeln dargestellt werden.
Dazu erfolgte ein Vorversuch zur Ermittlung einer geeigneten mobilen Phase für die
Auftrennung mittels DC (s. Abb. 4, S. 9).
3 Für die Durchführung der MS-Messungen bedanke ich mich bei Herrn Dr. Martin Zehl,
Institut für Pharmakognosie, Universität Wien.
9
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
Die zwei gelb fluoreszierenden Banden konnten in der DC ausreichend getrennt
dargestellt werden (s. Abb. 4), deshalb wurde die dafür benützte mobile Phase für die
anschließende Trennung verwendet.
Für die präparative Trennung (s. Abb. 5) wurde eine Kieselgel-Platte mit
Konzentrierungszone verwendet und die Fraktion SPE 2/ 9-11 (10,6 mg) [7]
aufgetragen. Nach der Entwicklung der DC wurden beide Banden getrennt
voneinander von der Platte abgekratzt.
Stationäre Phase: Kieselgel-Platte mit Konzentrierungszone; 20 cm x 20 cm
Mobile Phase:
EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: Tageslicht
Bahn Fraktion
1 SPE 2/ 3-8 [7]
2 SPE 2/ 9-11 [7]
Bande 2
Bande 1
1 2
Abbildung 4 : DC der Fraktionen SPE 2/ 3-8 [7] und SPE 2/ 9-11 [7]
Abbildung 5: Präparative DC-Trennung
10
Die Substanzen, die den gelben Banden 1 bzw. 2 entsprachen (s. Abb. 5, S. 9),
wurden mit einer Mischung aus Methanol/Chloroform (7:1) vom Kieselgel gelöst,
mittels Dünnschichtchromatographie überprüft und mit Kämpferol-3-O-rutinosid
verglichen.
Abbildung 6: DC-Prüfung der isolierten Banden 1 und 2
Stationäre Phase: Polyamid-Fertigplatte 6 F254 (Sigma-Aldrich®)
Mobile Phase: Toluol + Petrolether + Butanon + MeOH (15 + 4,5 + 9 + 12)
Detektion: NST A/ PEG
Abbildung 6 zeigt, dass die weniger polare, gelb fluoreszierende Substanz in der
Bande 1 angereichert war. Der Vergleich mit der Referenz zeigte auch deutlich, dass
es sich bei der angereicherten Substanz nicht um Kämpferol-3-O-rutinosid handelt.
Es wurden 3,7 mg der Substanz erhalten.
In Bande 2 wurden zwei dunkel gefärbte Komponenten detektiert, bei denen es sich
um Derivate von Homoplantaginin handeln könnte. Es wurden 5,2 mg des Gemisches
erhalten.
Bahn Fraktion
1 SPE 2/ 1 + 2 [7]
2 Kämpferol-3-O-rutinosid
3 Bande 1
4 Bande 2
1 2 3 4
11
3.2. Säulenchromatographie 1 (SC 1)
Um eine ausreichende Menge für die Strukturaufklärung von der Substanz in Bande
1 (s. Abb. 6, S. 10) zu gewinnen, wurden die Fraktionen SPE 2/ 1+2 [7] und SPE 2/
3-8 [7] (s. Tabelle 1, S. 3) vereinigt und mittels SC 1 unter folgenden Bedingungen
aufgetrennt.
Füllhöhe: 65 cm
Säulendurchmesser: 1,2 cm
Stationäre Phase: Polyamid (Roth®)
Mobile Phase: Ethanol/Wasser-Gemische
Aufgetragene Menge: 48,4 mg
Flussrate: 3 ml/ 30 min
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 SPE 2/ 1-8
Abbildung 7: DC der Sammelfraktionen der SC 1
12
Tabelle 3: Sammelfraktionen der SC 1
In der DC der Sammelfraktionen von SC 1 (s. Abb. 7, S. 11) ist zu sehen, dass es zu
einer Auftrennung gekommen ist, die gewünschte Reindarstellung von einzelnen
Komponenten wurde allerdings nicht erreicht. Da die isolierten Mengen zu gering für
eine Reindarstellung von Komponenten waren, wurden einzelne Sammelfraktionen
der SC 1 für den Vergleich mit Referenzsubstanzen (s. 3.4., S. 16) herangezogen.
3.3. Säulenchromatographie 2 (SC 2)
Für die Säulenchromatographie 2 wurde die Fraktion SC 1/ SF 8 [5] (s. Abb. 8)
ausgewählt, da eine ausreichende Menge verfügbar war und die Möglichkeit zur
Reindarstellung und anschließenden Identifizierung mehrerer Substanzen des
komplexen Inhaltsstoffmusters gegeben war.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
Sammelfraktion Einzelfraktion Menge (mg) Mobile Phase
SC1 / SF 1 2 – 28 1,0 30% Ethanol SC1 / SF 2 29 – 50 0,5
SC1 / SF 3 51 – 60 0,1
SC1 / SF 4 61 – 80 0,1
SC1 / SF 5 81 – 129 0,9 40% Ethanol SC1 / SF 6 130 – 137 1,4
SC1 / SF 7 138 – 140 1,6
SC1 / SF 8 141 – 150 8,5
SC1 / SF 9 151 – 160 5,3 50% Ethanol SC1 / SF 10 161 – 170 3,9
SC1 / SF 11 171 – 190 10,3
SC1 / SF 12 191 – 290 7,6
SC 1/ SF 8
Abbildung 8: DC der Fraktion SC 1/ SF 8 [5]
13
SC 2 wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Füllhöhe: 75 cm
Säulendurchmesser: 2,5 cm
Stationäre Phase: Sephadex® LH-20 (Sigma -Aldrich®)
Mobile Phase: Methanol/Wasser-Gemische
Aufgetragene Menge: 385 mg
Flussrate: 5 ml/ Stunde
Es wurde jede zehnte Fraktion mittels Dünnschichtchromatographie überprüft. Bei
Übereinstimmung des Inhaltsstoffmusters wurden die Fraktionen vereinigt. Auf diese
Weise wurden 908 Einzelfrakionen gesammelt, die zu 32 Sammelfraktionen vereinigt
wurden. In Sammelfraktion 21 kam es zur Bildung eines farblosen Niederschlags.
Daraufhin wurde der Überstand abdekantiert und der Niederschlag als Fraktion 21
NS bezeichnet.
14
Abbildung 9: DC der Sammelfraktionen von SC 2
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
15 16 17 18 19 20 21 21NS 22 23 24 25 26 27 28 29 30 NL Vgl.
15
Tabelle 4: Sammelfraktionen der SC 2
Sammelfraktion Einzelfraktion Ausbeute (mg) Mobile Phase
1 1 – 110 7,8
Methanol 30%
2 111 – 130 0,7
3 131 – 140 0,2
4 141 – 150 0,1
5 151 – 160 0,1
6 161 – 200 2,0
7 201 – 280 6,6
8 281 – 310 1,9
9 311 – 330 2,6
10 331 – 350 0,5
11 351 – 400 4,9
12 401 – 410 3,9
13 411 – 420 12,7
14 421 – 440 67,0
15 441 – 450 ÜS 4,7
16 441 -450 NS+ 451 – 460 ÜS
13,6
17 451 – 460 NS 4,7
18 461 – 470 11,0
19 471 – 500 32,0
20 501 – 580 87,6
21 581 – 640 63,2
21 NS 7,6
22 641 – 690 16,1 Methanol 40%
23 691 – 720 5,9
24 721 – 750 8,0
25 751 – 770 4,6
26 771 – 800 4,5
27 801 – 820 2,6
28 821 – 840 1,9 Methanol 50% 29 841 – 880 2,5
30 881 – 908 1,7
NL Nachlauf 0,1 Methanol 60%
Auch bei der zweiten Säulenchromatographie kam es nicht zur gewünschten
Reindarstellung von Einzelsubstanzen. Die Sammelfraktionen 2 bis 6 waren in sehr
geringer Menge vorhanden (s. Tabelle 4) und wurden deshalb nicht weiter untersucht.
In den Fraktionen 1 bis 11 zeigten sich nach dem Besprühen mit NST A/PEG unter
UV366 zahlreiche blau fluoreszierende Banden (s. Abb. 9, S. 14), bei welchen es sich
vermutlich um Phenolcarbonsäure-Derivate handelte. In SF 8 ist eine blau
fluoreszierende Hauptkomponente bei Rf= 0,80 erkennbar, welche mittels DC-
Vergleich (s. 3.4.1., S. 17) und HRMS (s. 3.5., S. 25) analysiert wurde.
16
In den Fraktionen 12 bis 14 wurden zwei Flavonoid-Komponenten bei Rf=0,37 und
bei Rf=0,47 detektiert, bei welchen es sich aufgrund der Fluoreszenzfarben
vermutlich um Kämpferol- und Quercetinmono- oder Diglykoside handelte.
Von Sammelfraktion 15 bis 22 war eine dunkel gefärbte Bande bei Rf=0,61 sichtbar,
welche für das Vorliegen des Flavonoids Homoplantaginin in den Fraktionen sprach
[5].
Von Fraktion 18 bis 27 waren in der oberen Hälfte der DC (s. Abb. 9, S. 14) mehrere
gelb fluoreszierende Banden detektierbar, deren Fluoreszenz für Flavonoide
charakteristisch ist.
Die Identifizierung der Komponenten erfolgte durch Vergleiche der DC- und HPLC-
Charakteristika mit bekannten Referenzsubstanzen [11].
3.4. Vergleiche mit Referenzsubstanzen
Zunächst wurden Versuche zur Identifizierung der Inhaltsstoffe mittels DC
durchgeführt. Bei Übereinstimmungen in Rf-Wert und Fluoreszenzfarbe der Banden
von Referenz und Komponente einer Fraktion, wurde mit einem zweiten,
unterschiedlichen chromatographischen Verfahren, in diesem Fall mittels HPLC (s.
2.2.3., S. 6), die Übereinstimmung bestätigt und die Identität der entsprechenden
Substanz bewiesen.
Stationäre Phase: Kieselgel
60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
Legende s. Tabelle 5, S. 17
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Abbildung 10: DC-Vergleiche mit Referenz-Substanzen
17
Tabelle 5: DC-Vergleiche mit Referenz-Substanzen
Die DC (Abb. 10, S. 16) zeigte beim Vergleich der Fraktionen mit den
Referenzsubstanzen Übereinstimmungen. Die gelb fluoreszierende Bande von SC 2/
SF 13 bei Rf=0,37 stimmt mit jener von Rutin auf Bahn 1 überein und die hellblau
fluoreszierende der Fraktion SC 1/ SF 8 bei Rf= 0,70 mit jener des
Phenylcarbonsäure-Derivates Verbascosid. Die gelb fluoreszierende Bande von SC
1/ SF 8 bei Rf= 0,57 war mit zwei Referenzsubstanzen, Hyperosid und Nepitrin,
vergleichbar.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurden weitere Sammelfraktionen mit
verschiedenen Referenzsubstanzen verglichen.
3.4.1. Charakterisierung der Säure-Derivate
Aufgrund der DC (s. Abb. 10 S. 16) wurde vermutet, dass in der Fraktion SC 1/ SF 8
Verbascosid enthalten ist. Da auch in den Fraktionen SC 1/ SF 1 und SC 2/ SF 8 blau
fluoreszierende Hauptkomponenten detektiert wurden, sollten diese Säure-Derivate
ebenfalls identifiziert werden.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
Bahn Fraktion/ Substanz
1 SC 1 / SF 1
2 Verbascosid
3 SC 2 / SF 8
Bahn Referenz / Fraktion Bahn Referenz / Fraktion
1 Rutin 7 Astragalin
2 Eriodictyol 8 SC 1 / SF 1
3 SC 2 / SF 13 9 Verbascosid
4 Nepitrin 10 SC 1 / SF 8
5 Luteolin-7-O-glucosid 11 Hyperosid
6 SC 2 / SF 13
1 2 3
Abbildung 11: DC-Vergleich mit Verbascosid
18
Der Vergleich mit Verbascosid (s. Abb. 11, S. 17) zeigte, dass es sich bei den intensiv
blau fluoreszierenden Banden von Fraktion SC 1/ SF 1 bei Rf= 0,33 und Fraktion SC
2/ SF 8 bei Rf= 0,80 nicht um dieses Phenolcarbonsäure-Derivat handelte. Ein HPLC-
Vergleich von SC 2/ SF8 mit Verbascosid zeigte ebenfalls keine Überstimmung der
Retentionszeiten und bestätigte dieses Resultat.
Die Hauptkomponente der Fraktion SC 2/ SF 8 wurde daher mittels HRMS untersucht
(siehe 3.5., S. 25).
3.4.2. Untersuchung von Fraktion SC 2 / SF 14
Bei allen dünnschichtchromatographischen Untersuchungen der Sammelfraktionen
13 und 14 der SC 2 zeigte sich einen Tag nach Durchführung der DC eine Rot-
Verfärbung der Bande bei Rf= 0,69. Dieses Verhalten ist charakteristisch für das
Flavanon Eriodictyol [11]. Da es sich hierbei, wie bereits gezeigt (s. Abb. 10, S. 16),
nicht um das Aglykon handeln konnte, wurde die Sammelfraktion 14 mit Eriodictyol-
7-O-glucosid verglichen.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
In der Sammelfraktion 14 war die rote Bande bei Rf= 0,69 nur sehr schwach zu sehen.
Somit konnte das Vorkommen von Eriodictyol-7-O-glucosid nicht eindeutig
nachgewiesen werden.
Bahn Fraktion/Substanz
1 SC 2/ SF 14
2 Eriodictyol-7-O-glucosid
1 2
Abbildung 12: DC-Vergleich mit Eriodictyol-7-O-glucosid
19
Die Sammelfraktion 14 der SC 2 wurde außerdem mit den Referenzsubstanzen Rutin
und Kämpferol-3-O-rutinosid verglichen.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
Wie in Abbildung 13 zu sehen ist, stimmten die Banden von Referenz und
Komponenten der Sammelfraktion überein. Die gelb fluoreszierende Bande bei
Rf=0,37 von Rutin (Bahn 1) und die türkis fluoreszierende Bande bei Rf=0,47 von
Kämpferol-3-O-rutinosid (Bahn 3) zeigen denselben Rf-Wert und dieselbe
Fluoreszenzfarbe wie die zwei Hauptkomponenten in Sammelfraktion 14.
Diese dünnschichtchromatographischen Übereinstimmungen wurden mittels HPLC
überprüft, um das Vorliegen von Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid in der
Sammelfraktion 14 zu bestätigen.
Bahn Fraktion/ Substanz
1 Rutin
2 SC 2/ SF 14
3 Kämpferol-3-O-rutinosid
1 2 3
Abbildung 13: DC-Vergleich mit Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid
20
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
Das Chromatogramm der Referenz Rutin (s. Anhang 1 und 2, S. 53) zeigte eine
Übereinstimmung des Substanzpeaks bei Retentionszeit und UV-Spektrum mit dem
Peak der Sammelfraktion 14 bei 33,31 min.
Die Komponente aus SC 2/ SF 14, die nach 38,35 min eluiert wurde, konnte mit Hilfe
der Referenz als Kämpferol-3-O-rutinosid (s. Anhang 3 und 4, S. 54) identifiziert
werden, da die Retentionszeit und UV-Spektrum übereinstimmten.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
33
.31
0/1
78
62
03
/13
20
06
38
.34
6/8
55
08
28
/79
35
93
42
.48
2/1
28
55
29
0/1
21
29
64
46
.88
1/3
38
57
2/3
17
88
47
.12
3/1
52
08
3/1
53
41
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
mAU 33.31
237
282
449
205
256
354
Abbildung 14: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 14
Abbildung 15: UV-Spektrum von Rutin in SF 14, bei 33,31 min
Kämpferol-3-O-
rutinosid
Rutin
21
Durch die Vergleiche in zwei unterschiedlichen chromatographischen Systemen
konnte das Vorkommen der Flavonoldiglykoside Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid
in der Sammelfraktion 14 bestätigt werden. Beide Komponenten waren in
Scrophularia ilwensis nachgewiesen worden [12].
3.4.3. Untersuchung von Fraktion SC 2 / SF 21
Die Sammelfraktion 21 der SC 2 wurde bezüglich der intensiv gelb fluoreszierenden
Bande bei Rf=0,56 näher untersucht. Aus einer vorhergehenden Diplomarbeit [5]
lagen Hinweise vor, dass Nepitrin im methanolischen Extrakt von Scrophularia lucida
enthalten sein könnte. Daher sollten diese Hinweise bestätigt werden.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
Bahn Fraktion/Substanz
1 SC 2 / SF 21
2 Nepitrin
1 2
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 nm
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
1100
mAU 38.35
28
1
26
5
34
7
Abbildung 16: UV-Spektrum von Kämpferol-3-O-rutinosid in SF 14, bei 38,35 min
Abbildung 17: DC-Vergleich von SC 2/ SF21 mit Nepitrin
22
Auf Grund der Überstimmung im DC-Vergleich (s. Abb. 17, S. 21), wurde die HPLC
als zweites chromatographisches System zum Identitätsnachweis herangezogen.
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
Abbildung 19: UV-Spektrum von Nepitrin in SF 21, bei 37,18 min
Die Vergleiche mittels DC und HPLC bestätigten die Identität von Nepitrin in der
Sammelfraktion 21 von SC 2, da bei der HPLC-Analyse der Referenz (s. Anhang 5
und 6, S. 54-55) Nepitrin nach 37,11 min eluiert wurde und sich ein völlig
überstimmendes UV-Spektrum mit dem Inhaltsstoff in SF 21 zeigte. Nepitrin ist ein
selten vorkommendes Flavonol, welches schon in Scrophularia ningpoensis
identifiziert werden konnte [13].
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
37
.18
4/4
92
92
48
42
.23
4/1
01
40
25
5
45
.58
3/6
38
30
0
48
.14
2/9
57
62
64
9.1
28
/18
03
96
4
52
.57
6/4
13
10
49
Abbildung 18: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 21
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000mAU
37.18
26
1
24
2
29
8
20
6
34
5
27
1
25
6
Nepitrin
23
3.4.4. Untersuchung der Fraktionen SC 2 / SF 24, 25, 26 und 27
Die drei gelb fluoreszierenden Flavonoide der Sammelfraktionen 24 bis 27 der
Säulenchromatographie 2 mit Rf-Werten von 0,67 bis 0,79, wurden mittels
Dünnschichtchromatographie mit ausgewählten Referenzsubstanzen verglichen.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)
Detektion: NST A/ PEG
Bahn Fraktion/ Referenz
1 SC 2/ SF 26
2 Luteolin-7-O-glucosid
3 SC 2/ SF 27
4 Nepetin
5 SC 2/ SF 24
Der Vergleich der Sammelfraktionen mit Nepetin (s. Abb. 20), dem Aglykon des
Flavonoids Nepitrin (s. 3.4.3., S. 21), zeigte keine Übereinstimmung, da die Referenz
eindeutig apolarer war als die zu identifizierenden Substanzen.
Der Vergleich mit Luteolin-7-O-glucosid (s. Abb. 20) deutete darauf hin, dass die
intensiv gelb fluoreszierende Bande bei Rf=0,67 in den untersuchten
Sammelfraktionen mit dieser Substanz übereinstimmte.
Daher wurden die Fraktionen 24 bis 27 auch mittels HPLC mit Luteolin-7-O-glucosid
verglichen.
1 2 3 4 5
Abbildung 20: DC-Vergleich von SC 2/ SF 24, 26 und 27
24
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
Abbildung 22: UV-Spektrum von Luteolin-7-O-glucosid in SF 27, bei 34,97 min
Anhand der Retentionszeit und des UV-Spektrums der Referenz (s. Anhang 7 und 8,
S. 55) konnte eine Übereinstimmung mit dem Substanzpeak der Fraktion zweifelsfrei
gezeigt werden. Luteolin-7-O-glucosid konnte auch in Fraktion 25 und 26 (s. Anhang
9, 10, 11 und 12, S. 56 und 57) nachgewiesen werden.
Das Flavonol Luteolin-7-O-glucosid war bisher unbekannt in der Gattung Scrophularia
und konnte somit in Scrophularia lucida zum ersten Mal nachgewiesen werden.
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
mAU 34.97
20
4
23
6
29
6
21
1
34
7
25
4
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
1250mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
15
.60
5/8
94
09
9
18
.12
9/2
03
89
30
34
.96
8/1
52
57
07
2
37
.18
6/8
64
26
0
40
.94
0/1
64
01
18 4
1.7
17
/94
69
32
42
.25
3/1
18
86
24
48
.45
8/1
07
05
15
54
.18
6/8
34
03
0
Abbildung 21: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 27
Luteolin-7-O-
glucosid
25
3.5. Strukturaufklärung mittels HRMS
Um über das Molekulargewicht und das Fragmentierungsverhalten auf die Strukturen
schließen zu können, wurden die Komponenten, die mittels Referenz-Vergleich nicht
identifiziert werden konnten, mittels hochauflösender Massenspektrometrie
untersucht.
Aus Fraktion SC 2 / SF 8 wurde der Substanzpeak bei einer Retentionszeit von 28,11
min mittels HPLC präparativ gewonnen (s. Abb. 23).
HPLC-Methode
(s. 2.2.3., S. 7)
Die dadurch gewonnene Substanz-Lösung wurde anschließend mittels HRMS im
Negativ-Ionenmodus analysiert.
Das Massenspektrum (s. Anhang 13, S. 58) zeigte, dass es sich um eine Verbindung
mit einem Molekulargewicht von 168 Da und der Summenformel C8H8O4 handelte.
Diese Resultate legten nahe, dass es sich um Vanillin– oder Isovanillinsäure handeln
könnte. Beide Benzoesäure-Derivate waren bereits in der Gattung Scrophularia
nachgewiesen worden [14, 15].
Daher wurde ein HPLC-Vergleich der Fraktion SC 2/ SF 8 mit Vanillinsäure (4-
Hydroxy-3-methoxybenzoesäure) durchgeführt.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
21
.59
1/1
42
18
14
28
.10
9/2
37
43
71
Abbildung 23: HPLC-Chromatogramm von SC 2 / SF 8
26
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
Da die Vergleichssubstanz bereits nach 19,55 min eluiert wurde, konnte das
Vorliegen von Vanillinsäure ausgeschlossen werden. Die Überstimmung der UV-
Spektren von Vanillinsäure und der Komponente mit Rt= 28,11 min in der
Sammelfraktion 8 (s. Anhang 14 und 15, S. 59) spricht für das Vorliegen eines
strukturverwandten Isomers des untersuchten Benzoesäure-Derivates wie
Isovanillinsäure (3-Hydroxy-4-methoxybenzoesäure).
Ein Strukturbeweis war allerdings nicht möglich, da entsprechende
Referenzsubstanzen im Rahmen dieser Diplomarbeit nicht verfügbar waren.
3.6. Quantifizierung
Zum Abschluss der Charakterisierung des Inhaltsstoffmusters des methanolischen
Extraktes von Scrophularia lucida wurden vier Komponenten des Extraktes quantitativ
bestimmt. Einerseits wurden die drei Hauptinhaltsstoffe Homoplantaginin, Koelziosid,
und Scrovalentinosid quantifiziert. Andererseits wurde Hispidulin quantitativ
bestimmt, welches in aktivitätsgeleiteten Untersuchungen von Fraktionen des
methanolischen Extrakts eine hohe Aktivität gezeigt hatte [16].
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
19
.87
7/8
86
33
99
85
.29
4/1
02
08
1
Abbildung 24: HPLC-Chromatogramm von Vanillinsäure
27
3.6.1. Gewinnung der Reinsubstanzen
Die Quantifizierung erfolgte mittels externer Standardisierung in HPLC-Analysen. Für
die Bestimmungen war es notwendig, die Substanzen zur Herstellung einer
Stammlösung in möglichst reiner Form zu gewinnen.
3.6.1.1. Aufreinigung von Homoplantaginin
Das Flavonoid Homoplantaginin war in einer vorangegangen Diplomarbeit [5] aus der
Ethylacetat-Fraktion des methanolischen Extraktes gewonnen worden. Allerdings
stand es nicht in ausreichender Reinheit und Menge zur Verfügung. Aus diesem
Grund wurde die Fraktion SC 3 / SF 12 (s. 2.1., S. 3), in der Homoplantaginin die
Hauptkomponente darstellte, aufgereinigt. Dazu wurde die Fraktion (24,5 mg) in
wenigen ml Chloroform gelöst und anschließend mit 1-2 ml Methanol versetzt. Daraus
kristallisierte unter Kühlung ein hellgelber Niederschlag von Homoplantaginin, der
abzentrifugiert wurde.
Die Reinheit des gewonnenen Homoplantaginins wurde mittels ELSD (s. 2.2.3., S. 7)
und unter UV-Detektion überprüft.
3.6.1.2. Aufreinigung von Scrovalentinosid
Das Iridoidglykosid Scrovalentinosid (=SL 2) war in der Chloroform-Fraktion des
methanolischen Extraktes von Scrophularia lucida nachgewiesen worden [6]. Bei
einer HPLC-Untersuchung der zur Verfügung stehenden Substanz zeigte sich, dass
die Reinheit für eine Quantifizierung nicht ausreichend war (s. Abb. 25, S. 28).
Deswegen sollten mittels Säulenchromatographie Begleitsubstanzen abgetrennt
werden.
28
HPLC-Methode (s.2.2.3., S. 7)
Säulenchromatographie 3:
Die Säulenchromatographie wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Füllhöhe: 60 cm
Säulendurchmesser: 1,2 cm
Stationäre Phase: Sephadex® LH-20 (Sigma -Aldrich®)
Mobile Phase: Methanol 40%
Aufgetragene Menge: 104,2 mg SL 2 [6]
Flussrate: 5 ml/ Stunde
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + MeOH + konz. Ameisensäure + Wasser (70 + 8 + 4 + 4)
Detektion: AAS-Reagens
Bahn Fraktion
1 SC 3 / 14
2 SC 3 / 24
3 SC 3 / 34
4 SC 3 / 44
Vergleich SL 2 [6]
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
2.9
16
/84
40
61
4.1
39
/10
61
26
55
.28
1/3
88
99
6
69
.24
4/2
03
53
56
9.9
32
/69
83
51
1 2 3 4 Vgl.
Abbildung 25: HPLC-Chromatogramm von Scrovalentinosid (69,93 min) vor der SC 3
Abbildung 26: DC-Überprüfung der Fraktionen von SC 3
Scrovalentinosid
29
Es wurde jede zehnte Fraktion mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. In
Abbildung 26 (s. S. 28) ist zu sehen, dass Scrovalentinosid bei Rf=0,54 in Fraktion 24
fast rein vorlag. Um die erwünschte Komponente möglichst quantitativ zu gewinnen,
wurden auch die Fraktionen 18, 20, 22 und 28 mittels DC überprüft (s. Abb. 27 und
28).
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)
Mobile Phase: EtOAc + MeOH + konz. Ameisensäure + Wasser (70 + 8 + 4 + 4)
Detektion: AAS-Reagens
Da auch die Fraktionen 20 und 22 Scrovalentinosid in reiner Form enthielten, wurden
die Fraktionen 20 bis 26 vereinigt. Die Ausbeute betrug 44,4 mg.
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
18 28 20 22
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
2.9
67/1
57361
3.0
43/3
68319
69.2
01/1
08921
69.8
83/1
235463
Abbildung 29: HPLC-Chromatogramm von Scrovalentinosid nach der SC 3
Abbildung 28: DC-Überprüfung der Fraktionen 18 und 28 von SC 3
Abbildung 27: DC-Überprüfung der Fraktionen 20 und 22 von SC 3
Scrovalentinosid
30
Das HPLC-Chromatogramm (s. Abb. 29, S. 29) bestätigte die erfolgreiche
Aufreinigung von Scrovalentinosid durch die SC 3, das nun für die Erstellung der
Eichgeraden verwendet werden konnte.
3.6.1.3. Koelziosid und Hispidulin
Das zweite Iridoidglykosid Koelziosid (=SL 1), welches neben Scrovalentinosid aus
der Chloroform-Fraktion isoliert worden war [6], stand in ausreichender Reinheit zur
Verfügung.
Das Flavonoid-Aglykon Hispidulin, welches ebenfalls in der Chloroform-Fraktion des
methanolischen Extraktes nachgewiesen worden war [16], stand in reiner Form als
Standard zur Verfügung (Sigma-Aldrich®).
3.6.2. Stammlösungen und Verdünnungsreihen
Um die passenden Konzentrationen der Verdünnungslösungen zur Erstellung der
Eichgeraden zu ermitteln, wurde zunächst von jeder Substanz eine Lösung von je 1
mg/ml in DMSO angefertigt. In Abhängigkeit der Fläche des Substanzpeaks in den
Chromatogrammen von Methanol-Extrakt, Ethylacetat- und Chloroform-Fraktion,
wurde jede Stammlösung entsprechend verdünnt. Die Quantifizierung der
Substanzen erfolgte beim jeweiligen UV-Maximum.
Die Reinheit der verwendeten Standards wurde über die Verdünnungslösung mit der
höchsten und der zweitniedrigsten Konzentration jeder Verdünnungsreihe berechnet.
Tabelle 6: Reinheit der Standards
4 Reinheit deklariert vom Hersteller (Sigma-Aldrich®)
Standard Reinheit
Homoplantaginin 93,6%
Koelziosid 84,4%
Scrovalentinosid 88,0%
Hispidulin 98,0%4
31
3.6.3. Quantifizierung von Homoplantaginin
Die quantitative Bestimmung des Flavonoids Homoplantaginin erfolgte im MeOH-
Extrakt, der Ethylacetat- und der Chloroform-Fraktion.
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%334nm,4nm (1.00)
41
.46
7/1
06
49
21
42
.26
7/3
86
57
00
45
.71
7/3
34
51
8
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%334nm,4nm (1.00)
37
.18
7/3
83
23
6
41
.44
5/2
82
57
64
1.8
71
/38
74
2.2
44
/29
61
57
7
48
.11
5/1
40
32
24
9.0
93
/18
62
25
51
.01
6/2
26
15
9
52
.53
7/1
29
07
35
Abbildung 30: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 334 nm
Abbildung 31: HPLC-Chromatogramm der Ethylacetat-Fraktion bei 334 nm
Homoplantaginin
Homoplantaginin
32
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
Die Auswertung erfolgte bei einer Wellenlänge von 334 nm.
Für Stammlösung wurden 0,97 mg Homoplantaginin (s. 3.6.1.1., S. 27) in 1 ml DMSO
gelöst. Unter Berücksichtigung der Reinheit von 93,5% (s. Tabelle 6, S. 30), enthielt
die Stammlösung 0,9066 mg/ml Homoplantaginin. Für die Erstellung der Eichgerade
wurden sechs Verdünnungen analysiert.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
475
500
525
550
575
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%334nm,4nm (1.00)
42
.25
8/2
70
98
2
49
.09
9/3
70
67
3 50
.22
2/3
21
28
35
1.0
10
/27
59
85
51
.30
7/4
16
40
85
2.5
07
/15
66
49
85
3.1
55
/31
70
97
55
.08
2/1
73
72
52
59
.96
6/3
07
27
16
0.4
31
/14
78
63
4
62
.49
9/4
61
60
9
64
.20
2/5
80
59
36
5.1
76
/25
49
10
68
.63
7/6
25
54
16
8.8
29
/60
81
81
69
.59
2/5
43
54
78
70
.99
8/2
72
82
57
1.8
65
/46
44
72
72
.91
3/3
03
93
27
3.2
17
/52
82
12
74
.08
9/4
36
88
07
4.5
14
/40
02
70
74
.98
7/9
05
35
3 75
.22
8/2
69
51
1
76
.82
8/8
21
24
5
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
475
mAU 42.36
29
9
24
8
33
3
27
3
Abbildung 33: UV-Spektrum von Homoplantaginin bei 42,36 min
Abbildung 32: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 334 nm
Homoplantaginin
33
Tabelle 7: Herstellung der Eichlösungen von Homoplantaginin in DMSO
Verdünnungs-
lösung
Verdünnungsschritte Konzentration
(mg/ml)
Peakfläche
(n=2)
H1 1 T Stammlsg. + 2 T DMSO 0,3022 9 379 157
H2 2 T H1 + 1 T DMSO 0,2015 6 278 013
H3 1 T H1 + 1 T DMSO 0,1511 4 687 986
H4 1 T H3 + 1 T DMSO 0,0755 2 357 932
H5 1 T H3 + 3 T DMSO 0,0189 586 581
H6 1 T H4 + 9 T DMSO 0,0076 234 475
Abbildung 34: Eichgerade Homoplantaginin
Tabelle 8: Peakflächen von Homoplantaginin in den Untersuchungslösungen
y = 3E+07x - 357,1R² = 1
100000
1000000
1900000
2800000
3700000
4600000
5500000
6400000
7300000
8200000
9100000
10000000
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
Peakfläche
Konzentration (mg/ml)
Homoplantaginin (n=2)
Untersuchungslösung Konzentration
(mg/ml)
Peakfläche Homoplantaginin (n=2)
MeOH-Extrakt 4,26 3 826 192
Ethylacetat-Fraktion 0,41 2 990 176
Chloroform-Fraktion 4,30 275 263
Geradengleichung: y = 3*107x - 357,1
34
Aus den jeweiligen Peakflächen aus Tabelle 8 (s. S. 33) konnte mit Hilfe der
Geradengleichung die Konzentration und damit auch der Anteil des
Homoplantaginins in den entsprechenden Untersuchungslösungen errechnet werden
(s. Tabelle 9).
Tabelle 9: Ergebnisse der Quantifizierung von Homoplantaginin
Mit einem Anteil von 2,99% war Homoplantaginin ein Hauptinhaltsstoff des
methanolischen Extraktes von Scropularia lucida, der durch Verteilung stark in der
Ethylacetat- und in nur geringen Mengen in der Chloroform-Fraktion angereichert
wurde.
3.6.4. Quantifizierung von Koelziosid
Das Iridoidglykosid Koelziosid wurde sowohl im MeOH-Extrakt als auch in der
Chloroform-Fraktion quantifiziert.
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
Konzentration (mg/ml) Anteil (%)
Methanol-Extrakt 0,1276 2,99
Ethylacetat-Fraktion 0,0997 24,08
Chloroform-Fraktion 0,0092 0,21
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%276nm,4nm (1.00)
28
.76
7/1
13
29
5
34
.95
3/1
20
46
9 37
.22
1/5
05
27
53
8.0
22
/12
44
73
40
.17
2/1
19
83
64
1.4
68
/81
01
86
42
.26
7/3
23
79
50
45
.58
7/1
11
21
0
48
.14
2/1
40
97
94
8.6
13
/11
99
05
49
.12
0/3
31
73
75
0.0
57
/19
89
20 5
1.0
43
/58
34
02
52
.56
8/1
70
39
54
53
.28
5/1
28
45
1
55
.14
9/3
53
86
0
60
.52
3/1
15
32
9
69
.70
2/4
93
03
1
76
.49
4/2
32
70 76
.74
7/2
74
68
4
Abbildung 35: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 276 nm
Koelziosid
35
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S.7)
Die quantitative Bestimmung von Koelziosid erfolgte bei einer Wellenlänge von 276 nm.
Für die Herstellung der Stammlösung wurden 1,01 mg Substanz (s. 3.6.1.3., S. 30)
in 1 ml DMSO gelöst, wovon aufgrund der Reinheit von 84,4% (s. Tabelle 6, S. 30)
0,8554 mg Koelziosid enthalten war. Es wurden fünf Verdünnungslösungen
angefertigt.
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm-50
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
475
500
525
mAU 76.83
211
232
434
277
219
204
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
40.0
42.5
45.0
47.5
50.0
52.5
55.0
57.5
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%276nm4nm (1.00)
52
.52
0/1
03
74
5
55
.09
9/2
68
12
6
69
.65
1/3
96
76
0
75
.03
0/1
47
03
2
76
.46
7/3
18
42
76
.57
6/5
43
76
.72
3/3
94
77
27
7.3
48
/13
94
5
Abbildung 36: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 276 nm
Abbildung 37: UV-Spektrum von Koelziosid bei 76,83 min
Koelziosid
36
Tabelle 10: Herstellung der Eichlösungen von Koelziosid in DMSO
Verdünnungs-
lösung
Verdünnungsschritte Konzentration
(mg/ml)
Peakfläche
(n=2)
K1 1 T Stammlsg. + 9 T DMSO 0,0855 796 309
K2 3 T K1 + 1 T DMSO 0,0642 607 508
K3 1 T K1 + 1 T DMSO 0,0428 401 302
K4 1 T K2 + 1 T DMSO 0,0321 300 569
K5 1 T K3 + 1 T DMSO 0,0214 201 394
Abbildung 38: Eichgerade Koelziosid
Tabelle 11: Peakflächen von Koelziosid in den Untersuchungslösungen
y = 9E+06x + 4701,3R² = 1
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
0,015 0,025 0,035 0,045 0,055 0,065 0,075 0,085
Peakfläche
Konzentration (mg/ml)
Koelziosid (n=2)
Untersuchungslösung Konzentration
(mg/ml)
Peakfläche Koelziosid (n=2)
MeOH-Extrakt 4,26 276 905
Chloroform-Fraktion 0,48 406 258
Geradengleichung: y = 9*106x + 4701,3
37
Die Konzentration und der Anteil des Koelziosids in MeOH-Extrakt und Chloroform-
Fraktion wurden durch Einsetzen der Peakflächen der Komponente (s. Tabelle 11, S.
36) in die Geradengleichung ermittelt.
Tabelle 12: Ergebnisse der Quantifizierung von Koelziosid
Im Vergleich zum Homoplantaginin war Koelziosid in deutlich geringerer
Konzentration im Methanol-Extrakt enthalten und wurde durch Verteilung fast
quantitativ in die Chloroform-Fraktion übergeführt.
3.6.5. Quantifizierung von Scrovalentinosid
Das zweite Iridoidglykosid Scrovalentinosid aus Scrophularia lucida wurde ebenfalls
im MeOH-Extrakt und der Chloroform-Fraktion quantitativ bestimmt.
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
Konzentration (mg/ml) Anteil (%)
MeOH-Extrakt 0,0302 0,71
Chloroform-Fraktion 0,0446 9,34
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%313nm,4nm (1.00)
18
.80
4/1
12
23
8
28
.71
6/1
68
07
8
34
.95
2/1
81
58
53
6.0
90
/17
00
65
37
.22
1/3
90
81
43
8.0
27
/15
91
83
40
.16
7/1
17
90
54
1.4
67
/78
02
02
42
.26
8/3
21
59
27
43
.12
8/1
15
44
0
45
.58
5/2
21
98
6
48
.13
9/1
11
44
74
8.6
17
/24
15
72
49
.11
9/3
22
09
55
0.0
57
/26
48
69
51
.04
4/1
19
96
06
51
.34
1/1
06
19
55
2.5
68
/16
69
08
15
3.2
92
/15
85
63
55
.14
8/5
80
54
6
60
.52
2/1
24
95
9
68
.75
9/2
11
96
36
9.7
02
/12
07
60
17
0.0
36
/70
93
7
74
.14
8/1
10
86
0
75
.90
9/9
34
24
76
.89
2/9
31
73
95
.89
3/1
52
47
7
Abbildung 39: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 313 nm
Scrovalentinosid
38
HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)
Für die Quantifizierung von Scrovalentinosid wurde eine Wellenlänge von 313 nm,
entsprechend dem UV-Maximum der Komponente, gewählt.
Die Lösungen, die zur Erstellung der Eichgerade gedient hatten, wurden durch
Verdünnen der Stammlösung (1,01 mg Substanz in 1 ml DMSO) hergestellt. Unter
Berücksichtigung der Reinheit von 88,0% (s. Tabelle 6, S. 30) waren 0,8891 mg
Scrovalentinosid in der Lösung enthalten. Es wurden fünf unterschiedliche
Verdünnungen des externen Standards vermessen.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%313nm4nm (1.00)
55
.09
7/4
61
23
3
69
.65
1/9
96
21
56
9.9
96
/13
31
2
75
.02
0/1
62
79
2
76
.86
5/1
95
65
1
95
.93
5/1
89
73
7
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
mAU 69.98
218
249
423
312
229
439
Abbildung 40: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 313 nm
Abbildung 41: UV-Spektrum von Scrovalentinosid bei 69,98 min
Scrovalentinosid
39
Tabelle 13: Herstellung der Eichlösungen von Scrovalentinosid in DMSO
Verdünnungs-
lösung
Verdünnungsschritte Konzentration
(mg/ml)
Peakfläche
(n=2)
S1 1 T Stammlsg. + 9 T DMSO 0,0889 1 607 510
S2 4 T S1 + 1 T DMSO 0,0711 1 286 785
S3 2 T S1 + 1 T DMSO 0,0593 1 067 917
S4 2 T S2 + 1 T DMSO 0,0474 853 748
S5 7 T S3 + 3 T DMSO 0,0415 742 853
Abbildung 42: Eichgerade von Scrovalentinosid
Tabelle 14: Peakflächen von Scrovalentinosid in den Untersuchungslösungen
y = 2E+07x - 17492R² = 1
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
0,035 0,045 0,055 0,065 0,075 0,085 0,095
Peakfläche
Konzentration (mg/ml)
Scrovalentinosid (n=2)
Untersuchungslösung Konzentration
(mg/ml)
Peakfläche Scrovalentinosid
(n=2)
MeOH-Extrakt 4,26 1 181 748
Chloroform-Fraktion 0,48 1 025 435
Geradengleichung: y = 2*107x - 17492
40
Unter Verwendung der Geradengleichung und der Peakfläche des Substanzpeaks
von Scrovalentinosid im MeOH-Extrakt und in der Chloroform-Fraktion (s. Tabelle 14,
S. 39) konnte die Konzentration der Komponente in den Untersuchungslösungen
ermittelt werden.
Tabelle 15: Ergebnisse der Quantifizierung von Scrovalentinosid
Die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung des Iridoidglykosids zeigten ebenfalls
eine starke Anreicherung von Scrovalentinosid in der Chloroform-Fraktion. Verglich
man die Ergebnisse mit jenen von Koelziosid (s. Tabelle 12, S. 37), so war
festzustellen, dass Scrovalentinosid die Hauptkomponente in der Chloroform-
Fraktion darstellte.
3.6.6. Quantifizierung von Hispidulin
Die Quantifizierung von Hispidulin erfolgte ausschließlich in der Chloroform-Fraktion,
da es sich hierbei nicht um eine Hauptkomponente des methanolischen Extraktes von
Scrophularia lucida handelte. Es wurde quantitativ bestimmt, da eine
aktivitätsgeleitete Untersuchung die hohe Aktivität von Hispidulin gezeigt hatte [16].
Bei Hispidulin handelt es sich um das Aglykon von Homoplantaginin.
Konzentration (mg/ml) Anteil (%)
MeOH-Extrakt 0,0560 1,41
Chloroform-Fraktion 0,0521 10,91
41
HPLC-Methode
(s. 2.2.3., S. 7)
Hispidulin wurde bei einer Wellenlänge 334 nm, dem UV-Maximum der Komponente
entsprechend, quantifiziert.
Zur Erstellung der fünf Verdünnungslösungen wurde eine Stammlösung mit 0,95 mg
Hispidulin in 1 ml DMSO angefertigt. Die Stammlösung beinhaltete, entsprechend der
Reinheit von 98,0% (s. Tabelle 6, S. 30), 0,931 mg Substanz.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
475
500
525
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%334nm4nm (1.00)
42
.25
8/2
70
98
2
49
.09
9/3
28
11
0 50
.22
2/2
69
01
55
1.0
10
/23
79
47
51
.30
7/3
72
39
95
2.5
07
/14
85
77
25
3.1
55
/24
07
94
55
.08
2/1
64
46
83
60
.43
1/1
48
37
58
62
.49
9/2
17
73
0
64
.20
2/4
06
04
06
5.1
76
/76
54
9
68
.63
7/5
13
99
26
8.8
29
/53
67
68
69
.59
2/5
30
40
42
70
.99
8/1
84
45
67
1.8
65
/37
20
73
72
.91
3/2
52
05
37
3.2
17
/45
69
50
74
.08
9/3
70
06
07
4.5
14
/35
03
31
74
.98
7/8
48
04
8 75
.22
8/2
28
94
2
76
.82
8/7
39
20
1
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325mAU 60.54
20
5
30
1
24
7
21
6
33
4
27
3
Abbildung 43: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 334 nm
Abbildung 44: UV-Spektrum von Hispidulin bei 60,54 min
Hispidulin
42
Tabelle 16: Herstellung der Eichlösungen von Hispidulin in DMSO
Abbildung 45: Eichgerade von Hispidulin
Tabelle 17: Peakfläche von Hispidulin in der Untersuchungslösung
y = 4E+07x - 44648R² = 0,9999
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Peakfläche
Konzentration (mg/ml)
Hispidulin
Verdünnungs-
lösung
Verdünnungsschritte Konzentration
(mg/ml)
Peakfläche
(n=2)
Hisp1 1 T Stammlsg. + 9 T DMSO 0,0931 3 921 578
Hisp2 1 T Hisp1 + 1 T DMSO 0,0466 1 919 522
Hisp3 2 T Hisp2 + 1 T DMSO 0,0310 1 283 460
Hisp4 2 T Hisp3 + 1 T DMSO 0,0207 832 503
Hisp5 3 T Hisp4 + 1 T DMSO 0,0155 623 062
Untersuchungslösung Konzentration
(mg/ml)
Peakfläche Hispidulin (n=2)
Chloroform-Fraktion 4,3 1 405 565
Geradengleichung: y= 4*107x - 44648
43
Um die Konzentration und den Anteil des Hispidulins in der Chloroform-Fraktion zu
bestimmen, wurde die Fläche des Substanzpeaks in der Untersuchungslösung (s.
Tabelle 17, S. 42) in die Geradengleichung eingesetzt.
Tabelle 18: Ergebnisse der Quantifizierung von Hispidulin
Konzentration (mg/ml) Anteil (%)
Chloroform-Fraktion 0,0363 0,84
44
4. Diskussion
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen weiteren Beitrag zur Charakterisierung des
Inhaltsstoffmusters eines methanolischen Extraktes von Scrophularia lucida zu
leisten, um die genannte Art innerhalb der Gattung Scrophularia chemotaxonomisch
besser zuordnen zu können.
Hierzu erfolgte eine Identifizierung von Komponenten der Ethylacetat-Fraktion, die in
vorangegangenen Diplomarbeiten bereits aufgetrennt und analysiert worden war
[5,7]. Fraktionen aus diesen Arbeiten wurden im Zuge dieser Arbeit mittels
Säulenchromatographie (SC 1 und SC 2) fraktioniert.
Insbesondere phenolische Substanzen des komplexen Inhaltsstoffmusters sollten für
eine anschließende Strukturaufklärung in möglichst reiner Form dargestellt werden.
Eine Reindarstellung von Inhaltsstoffen mittels SC konnte nicht erreicht werden. Es
war allerdings durch Vergleiche mit bekannten Flavonoiden [11] mittels
Dünnschichtchromatographie und High Performance Liquid Chromatography
möglich, die Identität einiger Komponenten zu bestimmen. Durch Übereinstimmung
von Rf-Werten und Fluoreszenz-Farben der Substanzbanden nach der Detektion mit
NST A/ PEG in der DC und der Retentionszeiten und UV-Spektren in der HPLC
wurden in der Sammelfraktion 14 der SC 2 Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid
nachgewiesen. In SC 2 / SF 21 konnte die Identität von Nepitrin bestätigt werden und
in den Sammelfraktionen 25, 26 und 27 konnte die Komponente mit Rf=0,67 Luteolin-
7-O-glucosid zugeordnet werden.
Die Flavonoide Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid waren bereits aus Scrophularia
ilwensis [12] und Nepitrin aus Scrophularia ningpoensis [13] bekannt. Luteolin-7-O-
glucosid wurde zum ersten Mal in der Gattung Scrophularia nachgewiesen.
Die Analysen der Hauptkomponente aus Sammelfraktion 8 der SC 2 mittels HRMS
und HPLC wiesen auf ein Derivat der Vanillinsäure hin. Die Identität konnte allerdings
auf Grund fehlender Referenz-Substanzen bzw. zu geringer Ausbeute der
Sammelfraktion nicht eindeutig bestimmt werden.
Außerdem wurden zur Charakterisierung des Inhaltsstoffmusters des methanolischen
Extraktes von Scrophularia lucida vier Komponenten im Methanol-Extrakt, der
Ethylacetat- und der Chloroform-Fraktion quantitativ bestimmt.
Die Quantifizierung erfolgte mittels HPLC und externer Eichung. Dazu mussten
Homoplantaginin durch Kristallisation und Scrovalentinosid durch SC aufgereinigt
werden. Für die Erstellung einer Eichgerade wurden fünf bzw. sechs Konzentrationen
45
des Standards vermessen. Durch die daraus ermittelte Geradengleichung konnte die
Menge und die Konzentration der jeweiligen Substanz in den Analysenlösungen
bestimmt werden.
Homoplantaginin konnte als Hauptinhaltsstoff von Scrophularia lucida, der sich
vorwiegend in der Ethylacetat-Fraktion und in geringem Ausmaß auch in der
Chloroform-Fraktion anreichert, bestimmt werden. Die Iridoidglykoside Koelziosid und
Scrovalentinosid sind im MeOH-Extrakt in geringerer Konzetration enthalten, werden
allerdings als Hauptkomponenten in der Chloroform-Fraktion angereichert. Hispidulin
zählt nicht zu den Hauptinhaltsstoffen von Scrophularia lucida, wurde aber auf Grund
seiner hohen Aktivität im CCID-Assay quantifiziert. Es war in der Chloroform-Fraktion
angereichert.
46
5. Zusammenfassung
Scrophularia lucida wird, wie auch andere Arten der Gattung Scrophularia, seit langer
Zeit in der traditionellen Medizin zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen
wie Ekzemen und Psoriasis angewendet. Aktivitätsgeleitete Untersuchungen zeigten
einen inhibierenden Effekt des methanolischen Extraktes auf einen wichtigen Schritt
im Zuge der Metastasierung von Brustkrebs.
Da bisher keine Daten zum Inhaltsstoffmuster von Scrophularia lucida vorlagen,
wurde in vorangegangenen Diplomarbeiten mit dessen Charakterisierung begonnen,
welche in der vorliegenden Arbeit fortgesetzt werden sollte.
Es wurden Fraktionen der Ethylacetat-Fraktion mittels Säulenchromatographie
aufgetrennt. Eine Reindarstellung von Einzelkomponenten konnte nicht erreicht
werden. Durch Vergleiche mit bekannten Flavonoiden in zwei unterschiedlichen
chromatographischen Systemen (DC, HPLC) konnte das Vorliegen der Flavonoide
Rutin, Kämpferol-3-O-rutinosid und Nepitrin nachgewiesen werden, welche bereits in
der Gattung Scrophularia bekannt waren. Luteolin-7-O-glucosid wurde zum ersten
Mal in der Gattung identifiziert.
Des Weiteren wurden vier Inhaltsstoffe des methanolischen Extraktes mittels HPLC
unter Verwendung von externen Standards quantitativ bestimmt. Das Flavonoid
Homoplantaginin wurde als Hauptinhaltsstoff des methanolischen Extraktes (2,99%)
und der Ethylacetat-Fraktion (24,08%) nachgewiesen. Die Iridoidglykoside Koelziosid
(9,34%) und Scrovalentinosid (10,41%) konnten als Hauptkomponenten der
Chloroform-Fraktion bestimmt werden. Das Flavonoid Hispidulin lag zu 0,84% in der
Chloroform-Fraktion vor.
Somit konnten die Daten zum Flavonoidmuster erweitert und zum ersten Mal die
quantitativen Anteile einiger Sekundärmetaboliten in Scrophularia lucida ermittelt
werden.
47
6. Summary
Scrophularia lucida, as well as other species of the genus Scrophularia has been used
since a long time in traditional medicine to treat inflammatory diseases like eczema
and psoriasis. Investigations showed an inhibiting effect of the methanolic extract on
an important step in the course of the metastasis of breast cancer.
Due to the fact that so far no data on the secondary metabolites of Scrophularia lucida
were available, the characterization was started in previous diploma theses, which
were to be continued in the present work.
Fractions of the ethylacetate fraction were initially separated by column
chromatography. As an isolation of single components was not possible, several
components were identified by comparison with authentic flavonoids in two different
chromatographic systems (TLC, HPLC). This way the flavonoids rutin, kaempferol-3-
O-rutinoside and nepitrin were confirmed in this species. Rutin and kaempferol-3-O-
rutinoside were already known in the genus Scrophularia. Luteolin-7-O-glucoside was
identified for the first time in the genus.
Furthermore, four secondary metabolites in the methanolic extract were quantified by
HPLC under external standardisation. The flavonoid homoplantaginin was
characterized as the main ingredient of the methanolic extract (2.99%) and the
ethylacetate fraction (24.08%). The iridoid-glycosides koelziosid (9.34%) and
scrovalentinoside (10.41%) were determined as the main components of the
chloroform fraction. The flavonoid hispidulin was quantified in the chloroform fraction
(0.84%).
Thus, the data on the flavonoid pattern were extended and the characterization of the
quantitative composition of some secondary metabolites of Scrophularia lucida are
described for the first time.
48
7. Literaturverzeichnis
[1] Giessrigl B., Yazici G., Teichmann M., Kopf S., Ghassemi S., Atanasov
A., Dirsch V., Grusch M., Jäger W., Özmen A., Krupitza G. (2012) Effects of
Scrophularia Extracts on tumor Cell Proliferation, Death and Intravasation
trough Lymphoendothelial Cell Barriers. International Journal of Oncology 40
(6): 2063-2074
[2] Galindez J.D., Lanza A.M.D., Matellano L.F. (2002) Biologically Active
Substances from the Genus Scrophularia. Pharmaceutical Biology 40 (1):
45-99
[3] http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?33420, zuletzt
aufgerufen am 03.03.2015
[4] Shen X., Eichhorn T., Greten H. J., Efferth T. (2012) Effects
of Scrophularia ningpoensis Hemsl. on Inhibition of Proliferation, Apoptosis
Induction and NF-κB Signaling of Immortalized and Cancer Cell Lines.
Pharmaceuticals 5 (2): 189-208
[5] Lewenhofer V. (2014) Isolierung phenolischer Wirkstoffe aus Scrophularia
lucida, Diplomarbeit, Universität Wien
[6] Schweighofer L. (2015) Aktivitätsgeleitete Untersuchungen von
Scrophularia lucida L., Diplomarbeit, Universität Wien
[7] Sumetsberger E., Diplomarbeit, Universität Wien, in Vorbereitung
[8] Wagner H., Bladt S., Zgainski E.M. (1983) Drogenanalyse,
Dünnschichtchromatographische Analyse von Arzneistoffen. Springer-
Verlag, Berlin: 299, 304
[9] Endres H., Hörmann H. (2006) Präparative und analytische Trennung
organischer Verbindungen durch Chromatographie an Polyamid.
Angewandte Chemie, 75 (6): 288-294
[10] http://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%
20Content/Files/1314716762536/litdoc18110722AB_20110830184615.pdf,
zuletzt aufgerufen am 21.01.2015
[11] Pemp E. (2005) Analytik pharmazeutisch relevanter Flavonoide mittels
HPLC/ UV, HPLC/ MS und HPLC/ UV/ MS. Dissertation, Universität Wien
[12] Calis I., Zor M., Basaran A. A., Wright A. D., Sticher O. (1993) Karsoside
and scropolioside D, two new iridoid glycosides from Scrophularia ilwensis.
Journal of Natural Products 56 (4): 606-9
49
[13] Xu F., Xu X., Chen S., Zhongguo X. Z. (2013) Progress in chemical
constituents and bioactivities of Scrophularia ningpoensis. Modern Chinese
Medicine 15 (9): 752-759
[14] Fernandez, M. A.; Garcia, M. D.; Saenz, M. T. (1996) Antibacterial
activity of phenolic acid fractions of Scrophularia frutescens and
Scrophularia sambucifolia. Journal of Ethnopharmacology 53(1): 11-14
[15] Fernandez M. A.; Saenz M. T.; Garcia M. D. (1998) Anti-inflammatory
activity in rats and mice of phenolic acids isolated from Scrophularia
frutescens. The Journal of pharmacy and pharmacology 50(10): 1183-6
[16] Spitznagel A., Diplomarbeit, Universität Wien, in Vorbereitung
50
8. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Scrophularia lucida (L.) ...................................................................... 1
Abbildung 2: Aktivität im CCID-Assay: Reduktion der Löcher unter Behandlung mit
dem Methanol-Extrakt von Scrophularia lucida [1] .................................................... 2
Abbildung 3: Säulenchromatographie ..................................................................... 6
Abbildung 4 : DC der Fraktionen SPE 2/ 3-8 [7] und SPE 2/ 9-11 [7] ...................... 9
Abbildung 5: Präparative DC-Trennung .................................................................. 9
Abbildung 6: DC-Prüfung der isolierten Banden 1 und 2 ....................................... 10
Abbildung 7: DC der Sammelfraktionen der SC 1 ................................................. 11
Abbildung 8: DC der Fraktion SC 1/ SF 8 [5] ........................................................ 12
Abbildung 9: DC der Sammelfraktionen von SC 2 ................................................ 14
Abbildung 10: DC-Vergleiche mit Referenz-Substanzen ....................................... 16
Abbildung 11: DC-Vergleich mit Verbascosid ....................................................... 17
Abbildung 12: DC-Vergleich mit Eriodictyol-7-O-glucosid ..................................... 18
Abbildung 13: DC-Vergleich mit Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid ..................... 19
Abbildung 14: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 14 ...................................... 20
Abbildung 15: UV-Spektrum von Rutin in SF 14, bei 33,31 min ............................ 20
Abbildung 16: UV-Spektrum von Kämpferol-3-O-rutinosid in SF 14, bei 38,35 min
............................................................................................................................... 21
Abbildung 17: DC-Vergleich von SC 2/ SF21 mit Nepitrin ..................................... 21
Abbildung 18: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 21 ...................................... 22
Abbildung 19: UV-Spektrum von Nepitrin in SF 21, bei 37,18 min ........................ 22
Abbildung 20: DC-Vergleich von SC 2/ SF 24, 26 und 27 ..................................... 23
Abbildung 21: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 27 ...................................... 24
Abbildung 22: UV-Spektrum von Luteolin-7-O-glucosid in SF 27, bei 34,97 min ... 24
Abbildung 23: HPLC-Chromatogramm von SC 2 / SF 8 ....................................... 25
Abbildung 24: HPLC-Chromatogramm von Vanillinsäure ..................................... 26
Abbildung 25: HPLC-Chromatogramm von Scrovalentinosid (69,93 min) vor der SC
3 ............................................................................................................................. 28
Abbildung 26: DC-Überprüfung der Fraktionen von SC 3 ..................................... 28
Abbildung 27: DC-Überprüfung der Fraktionen 20 und 22 von SC 3 ..................... 29
Abbildung 28: DC-Überprüfung der Fraktionen 18 und 28 von SC 3 ..................... 29
Abbildung 29: HPLC-Chromatogramm von Scrovalentinosid nach der SC 3 ........ 29
Abbildung 30: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 334 nm ................ 31
Abbildung 31: HPLC-Chromatogramm der Ethylacetat-Fraktion bei 334 nm ........ 31
Abbildung 32: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 334 nm ......... 32
51
Abbildung 33: UV-Spektrum von Homoplantaginin bei 42,36 min .........................32
Abbildung 34: Eichgerade Homoplantaginin .........................................................33
Abbildung 35: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 276 nm ................34
Abbildung 36: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 276 nm .........35
Abbildung 37: UV-Spektrum von Koelziosid bei 76,83 min ....................................35
Abbildung 38: Eichgerade Koelziosid ....................................................................36
Abbildung 39: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 313 nm ................37
Abbildung 40: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 313 nm .........38
Abbildung 41: UV-Spektrum von Scrovalentinosid bei 69,98 min ..........................38
Abbildung 42: Eichgerade von Scrovalentinosid ...................................................39
Abbildung 43: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 334 nm .........41
Abbildung 44: UV-Spektrum von Hispidulin bei 60,54 min ....................................41
Abbildung 45: Eichgerade von Hispidulin ..............................................................42
52
9. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Fraktionen ........................................................................... 3
Tabelle 2: HPLC-Parameter..................................................................................... 7
Tabelle 3: Sammelfraktionen der SC 1 .................................................................. 12
Tabelle 4: Sammelfraktionen der SC 2 .................................................................. 15
Tabelle 5: DC-Vergleiche mit Referenz-Substanzen .............................................. 17
Tabelle 6: Reinheit der Standards ......................................................................... 30
Tabelle 7: Herstellung der Eichlösungen von Homoplantaginin in DMSO .............. 33
Tabelle 8: Peakflächen von Homoplantaginin in den Untersuchungslösungen ...... 33
Tabelle 9: Ergebnisse der Quantifizierung von Homoplantaginin ........................... 34
Tabelle 10: Herstellung der Eichlösungen von Koelziosid in DMSO ....................... 36
Tabelle 11: Peakflächen von Koelziosid in den Untersuchungslösungen ............... 36
Tabelle 12: Ergebnisse der Quantifizierung von Koelziosid ................................... 37
Tabelle 13: Herstellung der Eichlösungen von Scrovalentinosid in DMSO ............. 39
Tabelle 14: Peakflächen von Scrovalentinosid in den Untersuchungslösungen ..... 39
Tabelle 15: Ergebnisse der Quantifizierung von Scrovalentinosid .......................... 40
Tabelle 16: Herstellung der Eichlösungen von Hispidulin in DMSO ....................... 42
Tabelle 17: Peakfläche von Hispidulin in der Untersuchungslösung ...................... 42
Tabelle 18: Ergebnisse der Quantifizierung von Hispidulin .................................... 43
53
Anhang
Anhang 1: HPLC-Chromatogramm der Referenz Rutin
HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)
Anhang 2: UV-Spektrum von Rutin bei 34,11 min
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
mAU 34.11
23
7
28
2
43
9
20
3
25
6
35
4
44
8
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
2.9
15
/12
37
83 3
.65
2/2
38
74
64
.18
3/1
53
99
2
34
.10
9/2
84
11
46
54
Anhang 3: HPLC-Chromatogramm der Referenz Kämpferol-3-O-rutinosid
HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)
Anhang 4: UV-Spektrum von Kämpferol-3-O-rutinosid bei 38,33 min
Anhang 5: HPLC-Chromatogramm der Referenz Nepitrin
HPLC-Methode
(2.2.3., S. 7)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%345nm,4nm (1.00)
34
.98
4/3
30
01
37
.11
1/7
44
76
5
42
.19
5/1
28
17
84
2.9
20
/17
68
8
45
.07
5/6
08
8
52
.92
9/3
29
8
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 nm
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
40.0
42.5mAU 38.33
28
1
43
2
26
5
34
7
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
35
.55
2/1
14
22
70
/89
71
3
38
.32
8/3
34
27
5/3
02
86
Kämpferol-3-
O-rutinosid
Nepitrin
55
Anhang 6: UV-Spektrum von Nepitrin bei 37,11 min
Anhang 7: HPLC-Chromatogramm der Referenz Luteolin-7-O-Glucosid
HPLC-Methode
(2.2.3., S. 7)
Anhang 8: UV-Spektrum von Luteolin-7-Glucosid bei 35,05 min
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
mAU 35.05
23
5
29
6
20
5
34
8
25
4
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
mAU 37.11
24
2
29
8
21
4
34
5
27
1
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
475
500
525
550
575
600
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
35
.16
6/6
99
47
16
56
Anhang 9: HPLC-Chromatogramm von SC 2 / SF 25
HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)
Anhang 10: UV-Spektrum von SC 2 / SF 25 bei 34,89 min
Anhang 11: HPLC-Chromatogramm von SC 2 / SF 26
HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
3500
3750
4000
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
26
.55
5/1
83
06
11
34
.88
9/2
50
64
22
3
36
.96
1/6
25
39
99
8
39
.68
1/1
13
03
00
40
.01
1/1
07
83
38
64
0.9
31
/37
52
96
74
2.2
28
/49
40
22
1
43
.59
9/1
71
38
18 4
4.5
98
/32
69
04
1
46
.16
9/1
11
68
72
46
.66
1/2
12
54
004
7.5
50
/76
22
46
1 48
.08
5/5
76
46
68
48
.43
4/7
08
93
75
49
.62
6/1
06
50
23
50
.78
3/1
53
86
28
52
.28
4/5
73
74
42 5
2.9
96
/96
81
95
54
.34
5/1
16
81
65
56
.84
4/1
74
48
69
58
.19
8/9
03
14
4
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
3250
mAU 34.89
20
4
23
6
29
6
21
7
34
6
25
3
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%254nm,4nm (1.00)
28
.02
1/1
62
61
76
36
.35
9/1
70
13
56
7
41
.38
8/1
19
24
68
43
.09
0/1
96
20
37
49
.97
5/1
65
93
76
0
54
.03
1/6
63
45
32
77
.72
1/1
44
59
92
Luteolin-7-O-
glucosid
Luteolin-7-O-
glucosid
57
Anhang 12: UV-Spektrum von SC 2 / SF 26 bei 36,36 min
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
-250
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
mAU 36.36
20
5
23
6
29
5
21
3
34
7
25
3
58
Anhang 13: HRMS-Spektren im Negativ-Ionenmodus der Komponente bei 28,11 min aus SC 2/ SF 8
Meas. m/z # Ion Formula m/z err [ppm] Score
108.0217 1 C6H4O2 108.0217 -0.4 100.00
124.0166 1 C6H4O3 124.0166 0.3 100.00
152.0114 1 C7H4O4 152.0115 0.9 100.00
167.0351 1 C8H7O4 167.0350 -0.9 100.00
59
Anhang 14: UV-Spektrum von SC 2/ SF 8 bei 28,11 min
Anhang 15: UV-Spektrum von Vanillinsäure bei 19,88 min
Anhang 16: HPLC-Chromatogramm der Homoplantaginin-Verdünnungslösung H3
HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 nm
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
mAU 28.11
21
4
28
0
23
7
20
7
21
9
26
0
29
5
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
mAU 19.88
28
1
23
6
26
1
29
2
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
475
500
525
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%334nm,4nm (1.00)
37
.12
0/3
03
51
7
42
.18
1/4
68
09
73
52
.48
7/2
71
79
95
.82
9/1
07
00
1
60
Anhang 17: HPLC-Chromatogramm der Koelziosid-Verdünnungslösung K3
HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)
Anhang 18: HPLC-Chromatogramm der Scrovalentinosid-Verdünnungslösung S3
HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)
Anhang 19: HPLC-Chromatogramm der Hispidulin-Verdünnungslösung Hisp3
HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%276nm4nm (1.00)
6.8
72
/13
17
4
68
.84
2/3
52
16
9.6
08
/12
94
3
76
.11
4/1
11
24
76
.45
7/1
05
21
76
.70
7/4
00
45
87
7.3
38
/55
17
80
.76
2/4
49
2
82
.16
8/4
60
9
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%334nm,4nm (1.00)
60
.16
9/6
53
54
60
.53
8/1
28
81
83
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
mAU
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
%313nm,4nm (1.00)
55
.03
4/4
47
00
59
.98
5/4
01
3
68
.86
1/7
48
98
69
.61
7/1
06
38
75
72
.65
0/5
66
3
75
.02
0/9
07
7
61
62
Curriculum vitae
Ausbildung
Praktika
Juli 2006 Ströck – Brot GmbH, 1010 Wien
August 2007 Julius Meinl am Graben, 1010
Wien
September 2009 – Oktober 2010 TST GmbH Personaldienstleister
September 2011 – April 2015 Allerheiligen Apotheke, 1200 Wien
Name: Tobias Ledermüller
Geburtsdatum: 17.08.1990
Geburtsort: Wien
Staatsangehörigkeit: Österreich
Eltern: Dr. Herbert Ledermüller
Brigitte Ledermüller (geb. Mader)
1996 - 2000 Volksschule, 1210 Wien
2000 - 2008 BRG Bertha v. Suttner, 1210 Wien
04.06.2008 Reifeprüfung
März 2009 Beginn des Pharmazie-Studiums
an der Universität Wien