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Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Prof. Dr. Dr. André Gessner
06.04.2016
Trends und Herausforderungen in der Infektionsdiagnostik: Resistenzerkennung und Mikrobiomanalyse
Resistenzentwicklung MRSA
Die Resistenzsituation in Europa ist bereits kritisch. In den nächsten Jahren ist eine weitere Zunahme von Resistenzen zu erwarten.
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EARSS 2012 De Kraker, PLoS Medicine 2011
Multiresistente Bakterien
ESKAPE-Bakterien:
Enterococcus faecium
Staphylococcus aureus
Klebsiella pneumoniae
Acinetobacter baumannii
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter species
WHO: Antibiotikaresistenz = eines der 3 größten Gesundheitsprobleme weltweit!
MRGN
1983-1987 1988-1992 1993-1997 1998-2002 2003-20040
2
4
6
8
10
12
14
16
Immer weniger neue Antibiotika
Neuzulassungen durch die FDA
10 x 20-Initiative (IDSA) gestartet aber im internationalen Studienregister derzeit nur 9 i. v. Substanzen in Phase 2 – 3 keine mit befriedigenden Spektrum !!
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• Gene „schon immer da“, sehr vielfältig
und oft primär unbekannt: Phänotypie!!
• „moderne“ Selektionsprozesse
• nicht sachgemäßer Antibiotika-Einsatz in
Humanmedizin
• Ausbreitung durch Hygienemängel
• Tierzucht / Landwirtschaft
MIKROBIOM-Verschiebungen
Ursachen von Resistenzzunahmen
Antony van Leeuwenhoek 1632–1723
Wir sind nicht allein….
„….that the people living in our United Netherland are not as many as the living animals that I carry in my own mouth this very day.“
1677, Royal British Society
10 x mehr bakterielle als humane Zellen!
„Normalflora“ – Mikrobiota - Mikrobiom
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100 x mehr bakterielle als humane Gene!
Universitätsklinikum Regensburg
Das Mikrobiom: mehr als „nur“ Bakterien Bakterien
Viren Pilze
Einzeller/Archaeen
Mikrobiom
Human Microbiome Project (HMP)
2007 initiiert durch das NIH, EU: MetaHit-Konsortium
ca. 80 % der Bakterien bis jetzt nicht angezüchtet
Hochdurchsatz-Sequenzierung der 16s-rRNA-Gene
300 Probanden, je 15-18 Körperstellen, 2-3 Visisten
> 1500 Bakterienspezies, derzeit 419 Genome komplett (GI) und 1366 Genome gesamt
140 Mio. 29 Mio. US$
Human Microbiome Project (HMP)
Interindividuelle Unterschiede: O.1 % humanes Genom, 50 % Microbiome
Ähnlichkeiten: Individuum > eineiige Zwillinge > Familie > reg. Kohorte
Plastizität: Einfluß von Nahrung, Antibiotika, Infektionen (!)……..
Cho and Blaser, Nature Reviews Genetics April 2012
Wirt + Mikrobiom = „Superorganismus“
Modifiziert nach Reid et al., Nature Reviews Microbiology 2011
Frühe Besiedelung mit Mikroorganismen
Haut: Geburtskanal Umgebung
Oronasopharyngeal: Nahrung Migration von der Haut Umgebung
GI-Trakt: Nahrung Umgebung
Urogenital-Trakt: Geburtskanal Migration von Haut und GI-Trakt Umgebung
Darmmikrobiom
Unser „vergessenes Organ“
Totale Masse ca. 1,5 kg Mikroben im Darm = > 10000 x Menschen auf der Erde 30 % des fäkalen Volumens Synthese von Vitaminen, Aminosäuren.. Die meisten Plasma-Metabolite sind bakteriell Schutz vor Krankheitserregern
Das Darmmikrobiom hat bei vielen Erkrankungen größeren Einfluß als das Patientengenom
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Individuelle Mikrobiom-Stabilität
David et al., Genome Biology, 2014
Mikrobiom und Übergewicht / Fettleibigkeit
Risiko für: Herzkreislauferkrankungen, Diabetes, Krebserkrankungen, Erkrankungen des Bewegungsapparates………
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Keimfreie Mäuse „Germ free mice“
Mikrobiom Analyse: Von der Korrelation zur Kausalität
> 1500 Zitationen
Bacterioidetes Firmicutes mehr Enzym-Gene für Abbau sonst unverdaulicher Kohlenhydrate
ob/ob Leptin -/- Microbiom
Transplantation
Das Darmmikrobiom beeinflußt die Nahrungsverwertung, Fettleibigkeit
Mikrobiom-Verschiebung: mögliche Mechanismen
Wachstums-förderung
Warum ?
Abnahme von Pathogenen Weniger mikrobielle „Antimetabolite“ Geringerer mikrobieller Nährstoffverbrauch Verbesserte Nahrungsresorption
Antibiotika im Tierfutter
Modifiziert n. Brüssow, 2015
Antibiotika in der Tiermast
Antibiotika fördern die Gewichtszunahme in der Tiermast durch Mikrobiom-Verschiebungen!
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April 2011
Mikrobiom und Kardiovaskuläre Erkrankungen
Das Darmmikrobiom beeinflußt kardiovalskuläre Erkrankungen
Starke Zunahme immunologisch bedingter Erkrankungen
1950
100
60
40
20
0
80
1980 1960 1970 1990 2000
Asthma
Typ 1 Diabetes
Multiple Sklerose Morbus
Crohn
400
300
200
100
Inzidenz d. Imm
unkrankheiten (%)
Bach J-F, N Engl J Med 2002; 347: 911-920
Nature, Online 26. Oktober 2011
Mögliche Rolle des Mikrobioms bei multipler Sklerose
Keimfreie Mäuse sind geschützt
Das Darmmikrobiom beeinflußt Autoimmunerkrankungen des ZNS
Segementierte filamentöse Bakterien
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Brandtzaeg et al., Muc. Immunol. 2008
duodenal mucosa
Keimfreie Tiere: Reduktion von Keimzentren
Plasmazellen, sIgA, regulatorischen T Zellen,……..
Mikrobiom-Mukosales Immunsystem
Mikrobiom und Krebs
Mikrobiom Zielstrukturen und Strategien für die Krebsprävention
Schwabe and Jobin, Nature Rev. Cancer, Nov. 2013
Mikrobiom und Krebs
Das Mikrobiom beeinflusst entscheidend den Erfolg moderner Krebstherapien
Schwabe and Jobin, Science, Nov. 2015
Checkpoint inhibitors
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Bidirektionale Kommunikation Mikrobiom -Nervensystem
Das Darmmikrobiom beinflußt unsere Psyche und umgekehrt
Psychosoziale Stressoren (Katecholamine)
Angstverhalten Autismus (Corticoide, BDNF)
S.M. Collins et al. 2012 Neurotransmitter von Darmbakterien
Universitätsklinikum Regensburg
• Atherosklerose • ITP
• Typ2 Diabetes
• C. difficile Infektion • Reizdarmsyndrom • M. Crohn, Colitis ulcerosa
• Fettleibigkeit
• Fettleber
• Multiple Sklerose • Chron. Müdigkeitssyndrom
Mikrobiomtranplantation als Therapieoption
Universitätsklinikum Regensburg
Technischer Durchbruch: Mikrobiomanalyse mittels Next Generation Sequencing
(NGS)
Über 80 % der Bakterien des Mikrobioms sind im Labor bislang nicht anzüchtbar!
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Mikrobiomanalyse mittels Next Generation Sequencing (NGS) Stuhlprobe
Darminhalt
DNA-Isolierung aus Coloninhalt mit Stuhl-Kit zur Vermeidung
von PCR-Inhibition
PCR-Amplifikation mit bakterienspezifischen Primern
mit End-Tags für Genomsequencer
Erfolgskontrolle mit Agarosegel oder
Bioanalyzer
Aufreinigung der Amplicons mit Ampure magnetic Beads
Qualitätskontrolle mit dem Bioanalyzer und Quantifizierung
mit Pico-Green, Library-Präparation
Emulsions-PCR Aufbereitung der Emulsions-PCR, Anreicherung von DNA-
haltigen Beads
Sequenzierungslauf PicoTiterPlate beladen
Datenanalyse
Bakterielle Resistenzen: Nukleinsäure-basierte
in Kombination mit phänotypischen Tests
Mikrobiom: Individuell veränderbar
größer als wir
Krankheitsassoziationen: Allgemein- bis Zahnmedizin
Anwendungsreife therapeutische Optionen für Prophylaxe und Therapie
Molekulare Diagnostik durch NGS
(Qualitätssicherung!)
Zusammenfassung
Vielen Dank!
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Nicole Bezold Sigrid Bülow Joachim Gläsner Andreas Hiergeist Christine Irtenkauf Holger Melzl Udo Reischl Rainer Spang Frank Stämmler
Ernst Holler Daniela Sporrer Peter Oefner