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Dissertation

vorgelegt zur Erlangung des Grades eines Doktors an der Fakultät für Chemie der

Ruhr-Universität Bochum

Untersuchung von spezifischen Protein-

Protein-Interaktionen am Beispiel von

hGBP1 und

strukturelle Charakterisierung von

proteinresistenten Peptidthiolen

von

Andreas Kerstan

angefertigt am Lehrstuhl

Physikalische Chemie I (Fakultät Chemie)

Betreuer: Prof. Dr.Wöll/ Prof. Dr. Herrmann

Abgabe: 15.10.10

Kapitel 0 Titel und Inhaltsverzeichnis

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2006 bis Februar 2010 an der

Fakultät für Chemie und Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung

von Herrn Prof. Dr. Christof Wöll und Prof. Dr. Christian Herrmann angefertigt.

Referent: Prof. Dr. Christof Wöll

Koreferent: Prof. Dr. Christian Herrmann


Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ............................................................................................................................ 1

1.1 Die ursprüngliche Idee dieser Arbeit: Die Anwendung der Oberflächenanalytik auf

Protein-Protein-Interaktionen ............................................................................................... 1

1.2 Maßgeschneiderte Oberflächen- die Bedeutung der Biosensorik am Beispiel der

Funktionsweise von hGBP1 ................................................................................................. 2

1.3 Proteinresistente (Bio-)Oberflächen ..................................................................................... 3

1.4 Zielsetzung ........................................................................................................................... 5

2 Theoretische Grundlagen .................................................................................................. 7

2.1 Spezifische und unspezifische (Protein-)Adsorption an Oberflächen bei der

Entwicklung von (Bio)sensoren ........................................................................................... 7

2.2 Allgemeine mechanistische Aspekte der Proteinadsorption an Festkörperoberflächen ...... 8

2.3 Bestimmende Faktoren der Proteinadsorption an Festkörper-oberflächen .......................... 9

2.4 Die Besonderheiten der Oligoethylenglykol(OEG)-SAM-Oberflächen ............................ 12

2.5 Herstellung von selbstorganisierenden Monolagen (SAMs) ............................................. 16

2.6 Peptidthiol-SAMs ............................................................................................................... 18

2.7 Die Verwendung des Biotin-Streptavidin-Systems als Immobilisierungs-Assay .............. 21

2.8 Das Immunprotein hGBP1- ein Vertreter aus der Dynamin Superfamilie ........................ 26

2.8.1 Interferone als Botenstoffe der Immunantwort ........................................................ 26

2.8.2 Gemeinsamkeiten GTP-bindender Protein ............................................................... 28

2.8.3 Die GBPs als Vertreter der Dynamin-verwandten Proteine ..................................... 29

2.8.4 Mx-Proteine als Vertreter der Dynamin Superfamilie mit antiviraler Aktivität ...... 31

2.8.5 Die Familie der Guanylat-bindenden Proteine ......................................................... 32

2.8.6 Das Humane Guanylat-bindende Protein 1- funktionelle und strukturelle

Aspekte ..................................................................................................................... 33

2.9 Kurzdarstellung anderer verwendeter Proteine .................................................................. 36

3 Material und Methoden ................................................................................................... 38

3.1 Materialien für Oberflächenanalytik .................................................................................. 38

3.1.1 Verwendete Substrate ............................................................................................... 38

3.1.2 Metalle für thermische Bedampfung im Vakuum .................................................... 38

3.1.3 Puffer und Lösungsmittel ......................................................................................... 38


3.1.4 Thiolierte Reagenzien für Oberflächenmodifikation ............................................... 38

3.1.5 Verwendete Proteine ................................................................................................ 39

3.2 Methoden für die Oberflächenanalytik............................................................................... 39

3.2.1 Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie ........................................................ 39

3.2.1.1 Metallisierung der Substrate für die SPR-Messungen ................................... 44

3.2.1.2 Präparation der SAMs .................................................................................... 45

3.2.1.3 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen zur Untersuchung

verschiedener hGBP1-Mutanten und ihres Dimerisierungsverhalten ............ 45

3.2.1.4 Überprüfung der Proteinresistenz von Peptidthiolen ..................................... 47

3.2.2 Rasterkraftmikroskopie ............................................................................................ 48

3.2.2.1 Kontakt- und Tapping-Modus ........................................................................ 50

3.2.2.2 Nanoshaving und Nanografting ..................................................................... 53

3.2.2.3 Mikrokontaktstempeln .................................................................................... 55

3.2.2.4 Experimenteller Teil ....................................................................................... 57

3.2.2.4.1 Metallisierung der Substrate für die AFM-Messungen ........................ 57

3.2.2.4.2 Herstellung lateral strukturierter Oberflächen ...................................... 57

3.2.3 Infrarotspektroskopie/-mikroskopie ......................................................................... 60

3.2.3.1 FT-IR Mikroskopie ......................................................................................... 61

3.2.3.2 Infrarotspektroskopie an Proteinen................................................................. 62


3.2.3.3.1 Attenuated total reflection (ATR)-FT-IR-Messungen .......................... 64

3.2.3.3.2 Messungen am IR-Mikroskop .............................................................. 65

3.2.3.3.3 Überprüfung der Peptidthiol-Monolage ............................................... 66

3.2.3.3.4 Einfluss von Trifluorethanol (TFE) auf die Sekundärstruktur des

Peptidthiols ........................................................................................... 66

3.2.3.3.5 Inkubation von Puffer in Abhängigkeit von der Zeit ........................... 67

3.2.3.3.6 IR-Messungen des Peptidthiols in Lösung ........................................... 67

3.2.4 Quartz Crystal Microbalance Dissipation (QCM-D) ............................................... 67

3.2.5 Experimenteller Teil ................................................................................................. 69

3.2.5.1 QCM-Messungen zur Untersuchung verschiedener hGBP1-Mutanten und

ihres Dimerisierungsverhaltens ...................................................................... 69

3.2.6 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie ......................................................................... 69


3.2.6.1.1 Herstellung fluoreszeinmarkierter Proteine .......................................... 71


3.2.6.1.2 Messungen mit dem Fluoreszenzmikroskop ........................................ 71

3.3 Materialien für die molekularbiologischen und biophysikalischen Methoden .................. 72

3.3.1 Chemikalien .............................................................................................................. 72

3.3.2 Verbrauchsmaterialien .............................................................................................. 72

3.3.3 Reagenzienkits .......................................................................................................... 73

3.3.4 Enzyme und Marker ................................................................................................. 73

3.3.5 Säulenmaterialien ..................................................................................................... 73

3.3.6 Antibiotika ................................................................................................................ 73

3.3.7 Mikroorganismen ..................................................................................................... 74

3.3.8 Nährmedien .............................................................................................................. 74

3.3.9 Vektoren ................................................................................................................... 75

3.3.10 Mutationsprimer ...................................................................................................... 75

3.3.11 Sequenzierprimer .................................................................................................... 76

3.3.12 Puffer ....................................................................................................................... 77

3.4 Molekularbiologische Methoden ........................................................................................ 78

3.4.1 Isolierung von Plasmid-DNA ................................................................................... 78

3.4.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ........................................................................ 78

3.4.3 Sequenzierung .......................................................................................................... 79

3.4.4 Herstellung kompetenter Zellen ............................................................................... 79

3.4.5 Quick Change Site Directed Mutagenesis ................................................................ 80

3.4.6 Transformation ......................................................................................................... 80

3.4.7 Verdau von DNA mittels Restriktionsenzymen ....................................................... 81

3.4.8 Ligation .................................................................................................................... 81

3.5 Proteinbiochemische Methoden ......................................................................................... 81

3.5.1 Präparative Proteinexpression .................................................................................. 81

3.5.2 Zellernte .................................................................................................................... 82

3.5.3 Zelllyse ..................................................................................................................... 82

3.5.4 Co2+

-NTA-Affinitätschromatographie ..................................................................... 82

3.5.5 Größenausschlusschromatographie .......................................................................... 83

3.5.6 Aufkonzentrierung über Ultrafiltration .................................................................... 84

3.5.7 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ....... 84

3.5.8 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Gill und von Hippel (1989) ...................... 85

3.5.9 Biotinylierung von Proteinen mit Maleimid-PEG11-Biotin ...................................... 85


3.5.10 Quantifizierung der Biotinylierung von Proteinen ......................................... 86

3.6 Biophysikalische Methoden ............................................................................................... 87

3.6.1 Ermittlung von Nukleotidkonzentrationen ............................................................... 87

3.6.2 Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC ......................................... 87

3.6.3 Messungen der Nukleotidhydrolyse ......................................................................... 88

3.6.4 Zirkulardichroismus (Circular Dichroism, CD)-Spektroskopie .............................. 88


3.6.5 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight)......... 90


3.6.5.1.1 Überprüfung der Reinheit der Peptidproben ........................................ 91

3.6.5.1.2 Detektion verschiedener immobilisierter Proteine auf einer

Goldoberfläche ..................................................................................... 91

3.6.5.1.3 Detektion von Streptavidin und hGBP1 ............................................... 92

4 Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den Aufbau eines

Multikomponentensystems auf SAM-Oberflächen ...................................................... 93

4.1 Synthese und Aufreinigung von hGBP1 ............................................................................ 93

4.2 Biotinylierung von hGBP1 ................................................................................................. 95

4.2.1 Biotinylierung über einen lysinspezifischen Biotinamidocaproylanker .................. 95

4.2.2 Diskussion der Ergebnisse ........................................................................................ 98

4.2.3 Biotinylierung über einen cysteinspezifischen Biotinmaleinimidanker ................. 100

4.2.4 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ................................................ 104

4.3 Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin- hGBP1-Systems ........ 105

4.3.1 Massenspektrometrischer Nachweis des immobilisierten Streptavidin und

hGBP1 an der Biotin-SAM-Oberfläche ................................................................. 105

4.3.1.1 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ...................................... 108

4.3.2 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen ........................................................... 109

4.3.2.1 Einfluss der verwendeten Biotinthiolkonzentration auf die

Immobilisierung von hGBP1 ........................................................................ 109


4.3.2.3 Überprüfung der unspezifischen Adsorption von Streptavidin und hGBP1

auf einem reinen OH-Thiol-SAM ................................................................ 115

4.3.2.4 Kontrolle der Streptavidinbelegung ............................................................. 116

4.3.3 Schichtdickenbestimmung mittels AFM und QCM ............................................... 119



4.3.4 Überprüfung der GTP-Hydrolyse Aktivität der hGBP1-Mutanten in Lösung

und an der Oberfläche ............................................................................................ 127


5 Dimerisierungsstudien von immobilisiertem hGBP1: Das Streptavidin-

hGBP1/hGBP1-System .................................................................................................. 137

5.1 Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin-hGBP1/hGBP1-

Systems ............................................................................................................................. 137

5.1.1 SPR-Bindungsstudien von hGBP1 wt mit den immobilisierten hGBP1-

Mutanten ................................................................................................................. 137

5.1.2 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ................................................ 140

5.1.3 Untersuchung der Dimerisierung von hGBP1 an die immobilisierten hGBP1-

Mutanten mittels AFM und QCM .......................................................................... 141

5.1.4 Überprüfung der Dimerisierung von hGBP1 wt mittels konfokaler

Fluoreszenzmikroskopie ......................................................................................... 145

5.1.5 Diskussion der Ergebnisse ...................................................................................... 147

5.2 Kinetikstudien zur Dimerisierung von hGBP1 mittels SPR ............................................ 149

6 Synthese und strukturelle Untersuchung von proteinre-sistenten Thiolen auf der

Basis von Peptiden ......................................................................................................... 154

6.1 Zusammenfassung der Ergebnisse für das 10er-Peptidthiol ............................................ 154

6.2 Synthese und strukturelle Analyse des 25er-Peptidthiols ................................................ 161

6.2.1 Synthese und Charakterisierung des 25er-Peptidthiols mittels HPLC und

MALDI-TOF .......................................................................................................... 161

6.2.2 Herstellung des Peptid-SAMS und Überprüfung der Proteinresistenz mittels

SPR ......................................................................................................................... 163

6.2.3 Sekundärstrukturanalysen des Peptidthiols mit der Infrarotspektroskopie ............ 169

6.2.3.1 Trockenmessungen im Volumen (Transmission) und im SAM

(Reflexion) .................................................................................................... 169

6.2.3.2 Sekundärstrukturanalyse des Peptidthiols in Lösung mittels IR und CD .... 171

6.2.3.2.1 IR- und CD-Messungen in D2O ......................................................... 171

6.2.3.2.2 Einfluss von Trifluorethanol auf die Sekundärstruktur des

Peptidthiols ......................................................................................... 175

6.2.3.3 Messungen des Peptidthiols an der Oberfläche in Pufferlösung .................. 180


6.2.3.3.1 ATR FT-IR-Messung im Fluss (D2O) ................................................ 180

6.2.3.3.2 ATR FT-IR-Messungen des Peptidthiol-SAMs am Hyperion IR-

Mikroskop (Bruker) ............................................................................ 182


7 Zusammenfassungen und Ausblick .............................................................................. 194

7.1 Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den Aufbau eines

Multikomponentensystems auf SAM-Oberflächen .......................................................... 194

7.2 Dimerisierungsstudien von oberflächengebundenem hGBP1: Das Streptavidin-

hGBP1/hGBP1-System .................................................................................................... 196

7.3 Synthese und strukturelle Untersuchung proteinresistenter Thiole auf der Basis von

Peptiden ............................................................................................................................ 197

8 Quellenverzeichnis ......................................................................................................... 200

9 Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 213

10 Tabellenverzeichnis ....................................................................................................... 217

11 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................. 218

12 Publikationen ................................................................................................................. 222

13 Lebenslauf ....................................................................................................................... 223

14 Danksagung .................................................................................................................... 224

Kapitel 1 Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Die ursprüngliche Idee dieser Arbeit: Die Anwendung der Ober-

flächenanalytik auf Protein-Protein-Interaktionen

Als Ende 2006 das im Rahmen dieser Doktorarbeit zu bearbeitende Projekt beschrieben

wurde, sollte das interdisziplinäre Arbeiten, auf der einen Seite die Herstellung

rekombinanter Proteine und deren biochemische und biophysikalische Charakterisierung

und auf der anderen Seite das Aufbringen dieser Proteine auf Self-Assembled Monolayers

(SAMs) und die Untersuchung ihres Interaktionsverhaltens über verschiedene Oberflä-

chenmethoden, im Vordergrund stehen. Das zu untersuchende humane Guanylat-

bindende Protein 1 (hGBP1), für das einige antivirale Effekte nachgewiesen werden

konnten (Anderson, 1999; Itsui, Y.Sakamoto, N.; Kurosaki, M.; Kanazawa, N.; Tanabe,

Y.; Koyama, T.;Takeda,Y.Nakagawa, M. et al., 2006; Itsui, Y. et al., 2009) sollte

hinsichtlich seiner bereits bekannten enzymatischen nukleotidabhängigen GTPase-

Aktivität, die durch Selbstassemblierung (Dimerisierung) beschleunigt wird, näher

untersucht werden (Prakash, Renault et al., 2000; Praefcke et al., 2004). Bis dato konnte

nämlich nur die Kristallstruktur des Monomers geklärt werden, aber eine erfolgreiche

Kristallisation des full length hGBP1 in seinem assemblierten dimeren bzw. tetrameren

Zustand ist erfolglos geblieben (Prakash, Praefcke et al., 2000). Dabei wurde auf das

bereits vorhandene Wissen über Struktur und Funktionsweise dieses Proteins

zurückgegriffen und dieses Know-How mit der Erfahrung über die Präparation von

Goldsubstraten und organischen Oberflächen sowie die Adsorption von Proteinen an

Oberflächen geschickt miteinander kombiniert. In diesem Zusammenhang sind die

Arbeiten von Dr. Grunwald (Grunwald, C. et al., 2004; Grunwald, Ch. et al., 2005) und

Dr. Rolf Chelmowski (Chelmowski et al., 2007) zu nennen. die ein System, bestehend aus

biotinylierten Thiolen an einer Goldoberfläche und dem aus der Literatur zahlreich

beschriebenen Streptavidin (Weber, 1989; Wilchek /Bayer, 1990; Freitag, 1997; Klumb et

al., 1998), im Lehrstuhl etabliert haben. Dieses äußerst stabile Biotin-Streptavidin-System

diente als eine Art „Unterbau“ für die Bindung von verschiedenen, mit einem Biotinanker

gekoppelten hGBP1-Mutanten, die dann nukleotidabhängig an andere hGBP1-Moleküle

gebunden werden sollten, um Dimerisierungsstudien durchzuführen.


2

1.2 Maßgeschneiderte Oberflächen- die Bedeutung der Biosensorik am

Beispiel der Funktionsweise von hGBP1

Diese Arbeit soll am Beispiel der Dimerisierung von hGBP1 als konkretes Anwendungs-

beispiel für eine spezifische, gewünschte Wechselwirkung einen Einblick in die Mög-

lichkeiten der Biosensorik und die kontrollierte Herstellung von Oberflächen mit ge-

wünschten Eigenschaften geben. Der spezifische Nachweis von (Bio-)molekülen (V.

/Dierk-Meyer-Lüerßen, 2003), z. B. bei Antigen-Antikörper-Reaktionen, über maß-

geschneiderte Sensoroberflächen ist hierbei ein sehr wichtiger und bedeutender An-

wendungsbereich. Gerade aus pharmakologischer und medizinischer Sicht sind die

Aufklärung der Struktur und Funktionsweise von Proteinen sowie die Wechselwirkung

mit anderen Proteinen von entscheidender Bedeutung, um auf diese Weise neue

Wirkstoffe für die Kontrolle bestimmter Stoffwechselvorgänge zu entwickeln. Aufgrund

der bedeutsamen Funktion des hGBP1 als ein Schlüsselprotein im menschlichen

Immunsystem wurden in den letzten Jahren besondere Anstrengungen unternommen, die

Anordnung der einzelnen Bausteine dieses Proteins zu klären und die Art und Weise, wie

es mit anderen Biomolekülen in Wechselwirkung tritt, besser zu verstehen, um Ansätze

für gezieltes Drug Design zu schaffen. Erst vor kurzem konnte die inhibierende Wirkung

von Zn2+

-Zyklen-Komplexen auf die Wechselwirkung des in der Literatur zahlreich

beschriebenen Ras-Proteins mit anderen Effektoren wie Raf nachgewiesen werden

(Rosnizeck et al.). Das Ras-Protein agiert in der Zelle als eine Art „molekularer Schalter“,

der nukleotidabhängig in einen aktiven oder inaktiven Zustand versetzt werden kann.

Mutationen im Ras-Gen können das Protein dauerhaft aktivieren, was zu unkontrolliertem

Zellwachstum führt und somit vielfach zur Entstehung von Krebs. Bei 30 % aller Tumore

konnten Mutationen im Ras-Gen nachgewiesen werden (Bos, 1989). Genauso wie die

Krebsforschung ist auch die Erforschung der biologischen Funktionsweisen und

Wirkmechanismen von Immunproteinen wie das hGBP1 von besonderer Brisanz, denn

hier liegt der Schlüssel zur Entwicklung von gezielt wirksamen Medikamenten und somit

zur Bekämpfung von Krankheitserregern. 2006 konnte zwar der grundsätzliche

Reaktionsmechanismus des Guanylat-bindenden Proteins hGBP1 aufgeklärt werden

(Kunzelmann et al., 2006) und damit eine gute Basis gelegt werden, um nun auch die

Verbindung zwischen Funktion und „biologischer Wirkung“, also der eigentlichen

„Immunreaktion“ (Ghosh et al., 2006) herzustellen, aber die vollständige fundierte


3

Aufklärung der Kinetik des Dimerisierungsprozesses konnte bis dato nicht erbracht

werden.

Abbildung 1-1: Molekulare Ansicht zweier hGBP1-Moleküle (das eine hinten in blau und

das andere davor durchsichtig in grün. Durch das Nukleotid GTP (Kugeln in blau, rot und

grau) wird die Interaktion gesteuert (Pressemitteilung Ruhr-Universität Bochum vom

29.9.2006)

Da die Dissoziationskonstante der Dimerisierung bisher nur unter Verwendung eines

vereinfachten Dimerisierungsmodells abgeschätzt werden konnte (Dissertation Simone

Kunzelmann, 2006), sollte diese Arbeit und die Anwendung der Oberflächenplas-

monenresonanzspektroskopie und anderer Oberflächenmethoden (Rasterkraftmikrosko-

pie, engl.: Atomic Force Microscopy (AFM); Mikrofeinwaage, engl.: Quartz Crystal Mic-

robalance (QCM), etc.) dazu dienen, diese Wissenslücke zu schließen. Des Weiteren

sollte der für die Untersuchung des Dimerisierungsprozesses entwickelte Assay soweit

etabliert werden, dass er auch routinemäßig auf andere Prozesse wie die Tetramerisierung

von hGBP1 oder auf andere Proteininteraktionen anwendbar ist.

1.3 Proteinresistente (Bio-)Oberflächen

Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit ist die Entwicklung und strukturelle Untersuchung von

Oberflächen, die proteophobe Eigenschaften aufweisen, also die Adsorption von Bioma-

terialien wie Proteinen vermeiden. Ein Anwendungsbereich, bei dem genau solche Eigen-

schaften erwünscht sind, ist die Herstellung von Implantaten in der Medizintechnik

(Gottenbos et al., 2000). Das Problem mit dem man hier zu kämpfen hat, ist die

immunologisch bedingte Abwehrreaktion des Körpers, der die Implantate als Fremdkör-


4

per erkennt und versucht sie abzustoßen. Auf den Implantaten bilden sich unerwünschte

Biofilme, die den Einheilungserfolg und die vollständige Herstellung der Organfunktion

negativ beeinträchtigen können (Gristina, 1987; Khardori /Yassien, 1995; Kasemo, 1998;

Heard, 2001; Emerson, 2004). In den vergangenen Jahren wurden große Anstrengungen

unternommen und zahlreiche empirische Untersuchungen durchgeführt mit dem Ziel, die

Abwehrreaktion des Körpers einzuschränken, gar zu verhindern oder auf der anderen

Seite die Ausbildung von Proteinfilmen auf den Implantaten zu vermeiden. Trotz allem

treten in ca. 10 % der Fälle Biofilmbildungen auf, die sehr oft mit großen Komplikationen

für den Patienten, wie starke Entzündungen, verbunden sind. Die Zerstörung dieser Filme

im Nachhinein war bisher immer erfolglos, woraus man schlussfolgern konnte, dass es

darauf ankommt Strategien zu entwickeln, die die Ausbildung dieser Beläge erst gar nicht

zulassen. Da in den meisten Fällen die Implantate aus hydrophoben Kunststoffen

bestehen, bedingt dies eine starke unspezifische Adsorption von Proteinen und folglich

eine begünstigte Ausbildung von Biofilmen auf den Implantaten. Beschichtungen mit

antibakteriellen Substanzen wurden bereits erprobt (Suci et al., 1998; Schierholz /Beuth,

2001), blieben aber erfolglos, zumal das Risiko von körperinterner Resistenzbildung

besteht. Zurzeit arbeitet man an Strategien, die darauf abzielen, die Implantate und das

umliegende Gewebe besser miteinander zu verknüpfen, um so die Ausbildung von

Biofilmen von vorne herein zu blocken. Diese Problematik wurde zum Anlass

genommen, biomimetische Oberflächen auf der Basis von Peptiden und einem daran

gebundenen Thiolanker zu schaffen (Chelmowski et al., 2008).

Abbildung 1-2: Herstellung proteinresistenter, biokompatibler Oberflächen auf der Basis

von Peptidthiolen. Durch den Thiolanker bildete sich eine selbstorganisierende Monolage

(SAM) auf der Goldoberfläche aus (Chelmowski et al., 2008).


5

Dabei wurde die Aminosäuresequenz auf der Basis von Regeln aus früheren Untersu-

chungen über proteinresistente organische Oberflächen ermittelt (Ostuni, E., Yan, L.,

Whitesides, G. M., 1999; Chapman, Ostuni, Takayama et al., 2000; Chapman, Ostuni,

Yan et al., 2000; Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003; Herrwerth, S.

et al., 2003) und ein Grad an Proteinresistenz erhalten, der vergleichbar mit dem von

Polyethylenglykol (PEG)- SAMs ist, die die am stärksten ausgeprägtesten proteophoben

Eigenschaften von allen bisher untersuchten SAMs aufweisen (Prime /Whitesides, 1991;

Harris, 1992; Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003). Der Sekundär-

struktur, in der die an die Oberfläche gebundenen Moleküle vorliegen, kommt bei der

Entstehung dieser Proteinresistenz eine maßgebliche Bedeutung zu (Harder et al., 1998),

die in dieser Arbeit über Infrarot- und CD-Spektroskopie näher untersucht werden soll.

1.4 Zielsetzung

Ein System, bestehend aus Biotin und dem biotinbindenden Protein Streptavidin soll dazu

genutzt werden, ein zentrales Protein der Immunabwehr, nämlich das hGBP1, hinsichtlich

seiner für die Dynamin-Familie typischen nukleotidabhängigen Selbstassemblierung

(Dimerisierung) näher zu untersuchen. Hierfür soll in erster Linie die Oberflächenplas-

monenresonanzspektroskopie genutzt werden, die sowohl Informationen über die adsor-

bierten Massen der zu untersuchenden Proteine und somit auch über molare Verhältnisse

liefert, als auch Studien über die Bindungskinetik erlaubt. Darüber hinaus werden Metho-

den wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) und die Mikrofeinwaage (QCM) herangezogen,

um die Schichtdicken der nacheinander aufgebrachten Schichten zu ermitteln und daraus,

unter Einbeziehung der Kristallstrukturen der beteiligten Proteine, also Streptavidin und

hGBP1, Modelle zu entwickeln, die zum einen Informationen über die Orientierung und

Anordnung der monomeren hGBP1-Moleküle auf der Oberfläche und zum anderen

während ihrer Assemblierung zu einem dimeren Komplex liefern. Da es sich bei hGBP1

um eine GTPase handelt, lässt sich anhand der GTP-Hydrolyseaktivität nachweisen, ob

das Protein auf der Oberfläche nativ ist.

Im letzten Teil steht die Untersuchung der Proteinresistenz von Peptidthiolen hinsichtlich

ihrer strukturellen Eigenschaften im Vordergrund, die bereits im Fokus des Interesse vor-

heriger Arbeiten standen (Chelmowski et al., 2008). Hierbei wurde versucht, die bereits

bekannten Charakteristika von klassischen proteinresistenten Thiolen, allen voran des

PEG-Thiol, auf eine alternative, „körperverwandte“ Molekülklasse, nämlich Amino-


6

säuren, zu übertragen, um über biologische Bausteine eine höhere Verträglichkeit und

Stabilität bei Langzeitanwendungen der Proteinresistenz z. B. in der Medizin zu er-

reichen. Das Peptiddesign basierte hierbei auf aus der Literatur hergeleiteten Regeln. In

den Vorarbeiten stand in erster Linie der Nachweis der Proteinresistenz im Vordergrund.

Nun soll es darum gehen, mögliche Gründe für die nachgewiesene Proteophobie der

Peptidthiole in der vorliegenden Sekundärstruktur zu suchen Zur Ermittlung der

Sekundärstrukturelemente soll in erster Linie die FT-IR- und CD-Spektroskopie dienen.

Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

7

2 Theoretische Grundlagen

2.1 Spezifische und unspezifische (Protein-)Adsorption an Oberflächen

bei der Entwicklung von (Bio)sensoren

Bevor auf ein konkretes Anwendungsbeispiel einer spezifischen Protein-Protein-Interak-

tion eingegangen werden kann, muss man zunächst die Wechselwirkungen zwischen

Proteinen und Festphasenoberflächen betrachten, denn diese spielen bei der Entwicklung

von Sensoren aller Art eine nicht unerhebliche Rolle (Kasemo, 1998; Lottspeich, 1998;

Weinberger et al., 2000; Janiak, 2001; Herrwerth, S. et al., 2003; Czeslik, 2004). Die

Wechselwirkungen zwischen Proteinen und künstlichen Oberflächen können dabei sehr

unterschiedlicher Natur sein. Ein proteinresistentes Verhalten wird nur sehr selten beo-

bachtet. Zumeist kommt es zu unspezifischer Adsorption der Proteine an der Oberfläche.

Bereits in der Einleitung wurde auf die Anwendung von Implantaten in der Medizin und

die Anlagerung von Proteinen an die zumeist aus Kunststoff bestehenden Implantato-

berflächen ausführlich eingegangen. In der Biosensorik kommt es darauf an, dass die

verwendeten Oberflächen auf ihren jeweiligen Anwendungsbereich abgestimmt sind. Nur

so kann die spezifische Detektion von (Bio-)molekülen auch wirklich gewährleistet

werden. Des Weiteren spielen Faktoren wie die Kostengünstigkeit, Zeitersparnis,

Spezifität und Nachweisgrenze der Sensoren in der Industrie eine wichtige Rolle. Die

Proteine gehören zu der Gruppe von Biomolekülen, denen bei der Entwicklung von

Sensoren in der Medizin und Pharmazie ein besonderes Interesse zukommt. Die

Anwendungen reichen vom Nachweis bestimmter allergischer Reaktionen bis hin zu

HIV-Tests, Medikamentenwirksamkeitstest und Tumor-Markern bei der

Krebsfrüherkennung. Bei diesen Tests kommt es darauf an, nicht nur einzelne

Proteinnachweise zu erbringen, sondern ein ganzes Portfolio von Proteinen zu detektie-

ren, die für ein bestimmtes Krankheitsbild charakteristisch sind. So genannte Proteinmik-

rochips werden für den parallelen Nachweis von Proteinen mittels Kombinierung ver-

schiedener miniaturisierter Sensoren auf einem Chip zunehmend eingesetzt. In der Medi-

zin stellt die Anwendung dieser Chips eine enorme Zeitersparnis und Hilfestellung bei der

Diagnose von Krankheiten dar. Aber auch in der Pharmazie werden bereits

hochdurchsatzfähige (High Throughput)-Screening Verfahren angewandt, die die Wirk-

samkeit eines Medikamentes überprüfen. Als letztes Anwendungsbeispiel sei die Bedeu-

tung der Proteomik in der Biochemie genannt. Über den Nachweis und die Untersuchung


8

der Gesamtheit aller in einer Zelle oder einem Lebewesen unter definierten Bedingungen

und zu einem definierten Zeitpunkt vorliegenden Proteine erhofft man sich, das Zusam-

menspiel von regulatorischen Schlüsselproteinen des Organismus besser zu verstehen, um

somit Krankheiten wie Krebs, Parkinson und HIV besser therapieren zu können.

Bei der Entwicklung von Biosensoren muss darauf geachtet werden, dass die Ankopplung

der zu untersuchenden Proteine spezifisch vonstatten geht und unerwünschte,

unspezifische Wechselwirkungen von anderen Proteinen nicht zustande kommen. Der

perfekte Sensor kombiniert also ein Zusammenspiel zwischen spezifischer Interaktion

oder Adsorption, die nachgewiesen werden soll, und Proteinresistenz gegenüber

unerwünschten Biomolekülen. Eine besondere Herausforderung der Wissenschaft besteht

somit darin, die biophysikalischen und biochemischen Prozesse der Protein-Oberflächen-

Wechselwirkung besser zu verstehen, um eine höhere Kompatibilität von Sensoren in den

jeweiligen Anwendungsbereichen zu gewährleisten.

2.2 Allgemeine mechanistische Aspekte der Proteinadsorption an Fest-

körperoberflächen

Die spontane Adsorption von Proteinen, die in einer wässrigen Lösung vorliegen, an

Festkörperoberflächen ist ein Phänomen, dass für fast alle Materialien auftritt (Czeslik,

2004). Für diese Oberflächenaktivität sind elektrostatische sowie hydrophobe

Wechselwirkungen, aber auch entropische Effekte bei der Wasserverdrängung verant-

wortlich. Jedenfalls können die Ursachen nicht an einzelnen strukturellen Eigenheiten der

Proteine festgemacht werden. Nicht selten resultiert aus der Festkörperoberflächenad-

sorption eine Denaturierung des Proteins, sämtliche strukturelle und funktionelle Merk-

male gehen dabei verloren. Um die wirkenden Triebkräfte besser zu verstehen, sollte

zunächst ein Blick auf den sehr komplexen Aufbau von Proteinen geworfen werden, der

sich aus der Aminosäuresequenz und der sich daraus ergebenden Sekundär- und

Tertiärstruktur zusammensetzt. Die 20 natürlichen Aminosäuren lassen sich grundsätzlich

in drei Gruppen kategorisieren:

- Aminosäuren mit unpolaren, hydrophoben Seitenketten

- Aminosäuren mit positiv oder negativ geladenen Seitenketten

- Aminosäuren mit polaren, hydrophilen Seitenketten


9

Zumeist hat der Proteinkern einen hydrophoben Charakter und wirkt stabilisierend auf die

Tertiärstruktur des Proteins. An der Proteinoberfläche findet man in erster Linie polare

und geladene Aminosäurereste. Durch diesen amphiphilen Charakter der Proteine kann

zumindest teilweise die sehr hohe Oberflächenaktivität begründet werden, doch spielen

zusätzlich die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Oberfläche selbst eine Rolle.

Im Allgemeinen gilt, dass Proteine für hydrophobe Oberflächen affiner sind als für hyd-

rophile. Im Falle von Glas (Si-OH), einer hydrophilen Oberfläche, findet man jedoch bei-

spielsweise ein umgekehrtes Verhalten (Czeslik, 2004). Ein besseres Verständnis für die

bei der Proteinadsorption ablaufenden Vorgänge zu erhalten, war in den letzten Jahren

Gegenstand der Forschung. Die dabei erzielten Ergebnisse werden im Folgenden näher

erläutert.

2.3 Bestimmende Faktoren der Proteinadsorption an Festkörper-

oberflächen

Die Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen resultiert aus einer Summe von

Wechselwirkungen, auf die an dieser Stelle näher eingegangen werden soll. Zum einen

sind es schwache Wechselwirkungen, wie van-der-Waals-Kräfte, also Wechselwirkungen

zwischen zwei induzierten Dipolen, die zwar einzeln betrachtet nur sehr wenig Einfluss

haben, aber in ihrer Summe große Auswirkungen mit sich bringen können. Neben

Wechselwirkungen zwischen induzierten Dipolen seien noch zusätzlich Kräfte zwischen

ausschließlich permanenten Dipolen (elektrostatische Wechselwirkungen) und zwischen

einem permanenten und einem induzierten Dipol an dieser Stelle genannt (Hiemenz

/Rajagopalan, 1997). Besonders bei sehr kleinen Distanzen zur Oberfläche spielen Dipol-

Dipol-Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Sie hängen entscheidend von den

Geometrien der beteiligten Strukturen ab.

Eine weitere wichtige Komponente ist die Auswirkung elektrostatischer

Wechselwirkungen, die von der Anzahl an geladenen Aminosäuren im Protein und von

den gewählten Pufferbedingungen bzw. der elektrolytischen Umgebung sowie der

Ladungsdichte an der Interaktionsoberfläche abhängen. Bestimmte im Puffer gelöste

Metallionen (Na+

oder Mg2+

) können die Ladung der Aminosäuren gewissermaßen

aufheben und folglich Wechselwirkungen mit der Oberfläche verhindern oder zumindest

schwächen. Ionische Wechselwirkungen sind wie die schwachen Wechselwirkungen


10

geometrie- und richtungsabhängig, doch haben einen deutlich höheren Betrag und eine

größere Reichweite.

Den höchsten Einfluss auf die Adsorption von Proteinen an Grenzflächen haben hydro-

phobe Wechselwirkungen (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003;

Czeslik, 2004). In wässrigen Puffern findet man für unpolare Gruppen eine nur sehr ge-

ringe Löslichkeit, da sich entlang der hydrophoben Kontaktfläche so genannte „Wasser-

käfige“ von hoher Ordnung formieren (low-entropy water), die mit einer starken Ab-

nahme der Entropie einhergehen. Insgesamt gilt, dass polare Gruppen viel eher eine

Wechselwirkung mit einer ebenfalls polaren Gruppe eingehen (Wasser-Wasser) und glei-

chermaßen unpolare Gruppen einen unpolaren Interaktionspartner bevorzugen. Die

Wechselwirkung zwischen unpolarer und polarer Gruppe ist dagegen nicht begünstigt.

Proteine haben einen insgesamt hydrophoben Kern, was im Umkehrschluss bedeutet, dass

an der Oberfläche nur sehr wenige hydrophobe Aminosäurereste vorhanden sind. Wenn

nun die Distanz zwischen Protein und Oberfläche klein genug wird, treten die hydropho-

ben Aminosäureseitenketten mit der Oberfläche in Kontakt, was zur Folge hat, dass der

hydrophobe Proteinkern auseinander fällt. Der meist irreversible Verlust der Tertiär- und

Quartärstruktur und damit die Denaturierung des Proteins ist die zwangsläufige

Konsequenz dieses Vorgangs. Die hydrophobe Wechselwirkung hat den höchsten Betrag

im Vergleich zu elektrostatischen und van-der-Waals-Wechselwirkungen und hängt

entscheidend von der Polarität der Oberfläche ab. Hydrophobe Oberflächen zeigen in der

Regel einen hohen Grad an Proteinadsorption, da die Oberfläche durch die Ausbildung

des Biofilms eine Abschirmung vor dem entropisch ungünstigen Kontakt mit dem Wasser

erfährt. Im Vergleich zu den beschriebenen polaren Wechselwirkungen haben

hydrophobe Wechselwirkungen nur eine geringe Reichweite und sind auch nicht

orientierungsabhängig.

Ein weiterer Faktor, der die Proteinadsorption beeinflusst, ist die Konformationsentropie

des Proteins. Die Faltungsstabilität eines gelösten, ungefalteten und eines gelösten, ge-

falteten Proteins ist nicht sehr hoch und erreicht gerade mal Werte zwischen 20 bis

60 kJ/mol. Proteine lassen sich somit als äußerst dynamische, flexible und intrinsisch

instabile Systeme auffassen, die auf kleinste Veränderungen, z.B. das Anbieten einer

organischen Oberfläche, reagieren. In zahlreichen Studien wurde gezeigt (Norde, 1996;

Czeslik, 2004), dass in der Regel ein Protein bei Adsorption an einer Oberfläche seine

Konformation verändert, also denaturiert, was gleichzeitig zu einer Erhöhung der

Bindungsenergie des Proteins mit der Oberfläche führt. Neben rein energetischen


11

Effekten spielen dabei auch wieder entropische Effekte (Konformationsentropie des

Proteins) eine Rolle. In einigen Fällen wird gemutmaßt, dass eine deutliche Zunahme der

Entropie aus der Proteinadsorption resultiert (Norde, 1996; Czeslik, 2004). Andere

Studien belegen, dass die Gesamtzunahme der Enthalpie durch die Adsorption so groß

werden kann, dass bei physiologischem pH-Wert die Bindung des Proteins an die

Oberfläche und seine Denaturierung praktisch irreversibel ist (Ball et al., 1996; Calonder

et al., 2001).

Zusammenfassend kann man folgenden Mechanismus für die unspezifische Proteinad-

sorption an Oberflächen vorschlagen:

Das Protein wird durch elektrostatische Kräfte, die von Ionen an der Oberfläche

ausgehen, über große Reichweiten an die Oberfläche gezogen.

Mit zunehmender Annäherung an die Oberfläche nimmt der Einfluss der attrakti-

ven „schwachen“ Wechselwirkungen zu und die Geometrie des Proteins wird ver-

zerrt.

Ist einmal der direkte Kontakt mit der Oberfläche hergestellt, so koppeln die ver-

einzelnd an der Oberfläche des Proteins auftretenden hydrophoben

Aminosäureseitenketten an die Substratoberfläche.

Aus der Summe von polaren, „schwachen“ und hydrophoben Wechselwirkungen

resultiert eine so starke Verzerrung des Proteins (partielle Denaturierung), dass es

seine Struktur vollständig verliert und somit die hydrophoben Aminosäuren, die

im nativen Zustand den hydrophoben Kern des Proteins bilden, ebenfalls für

Wechselwirkungen mit der Oberfläche zur Verfügung stehen.

Um die Vorgänge der Proteinadsorption an Oberflächen noch besser zu verstehen, können

aufgrund der zahlreich beschriebenen Einflüsse bei der Proteinadsorption sehr unter-

schiedliche Ansatzpunkte gewählt werden. Zum einen kann man beispielsweise den Ein-

fluss der Temperatur auf die Adsorption untersuchen, um die Bedeutung des entropischen

Beitrags herauszuarbeiten, zum anderen kann man das umgebende Medium variieren.

Man hat zum Beispiel das Adsorptionsverhalten in D2O mit H2O in einer bereits veröf-

fentlichten Studie verglichen (Grunwald, Ch. et al., 2005) und im Falle der Proteine

Rinderserumalbumin (BSA) und Ribonuklease A (RNase) in deuteriertem Wasser eine

deutlich verlangsamte Proteinadsorption gegenüber D2O festgestellt. Da D2O bereits rou-

tinemäßig bei anderen Techniken zur Untersuchung biologischer Grenzflächen (Neutro-

nenstreuung), aber auch zur strukturellen Untersuchung von Biomolekülen (NMR, IR)


12

eingesetzt wird und sich bewährt hat, erhofft man sich nun auch für die Erforschung der

unspezifischen Proteinadsorption auf Oberflächen, einen entscheidenden Fortschritt durch

den Einsatz von „schwerem“ Wasser machen zu können.

2.4 Die Besonderheiten der Oligoethylenglykol(OEG)-SAM-Oberflä-

chen

Zum ersten Mal wurden Polyethylenglykole (PEGs) mit großen Molekulargewichten in

den 80er Jahren zur Erzeugung proteinresistenter Oberflächen verwendet (Poly(ethylene

Glycol) Chemistry, 1992). Die Proteine und Zellen wurden dabei aus wässriger Pufferlö-

sung der Oberfläche zugeführt. Das proteophobe Verhalten der PEGs wurde mit „steri-

scher Repulsion“ erklärt. Hinter diesem Begriff verbirgt sich ein entropischer Effekt, der

dadurch zustande kommt, dass die Adsorption der Proteine die Beweglichkeit der PEG-

Polymerketten, die in das Wasser frei hereinragen, einschränkt, was eine Abnahme der

Entropie zur Folge hat. Den genauen Ursachen für die proteinresistenten Eigenschaften

der PEG-Oberflächen wurde in den Folgejahren auf den Grund gegangen. Besonders ist

hier die Gruppe um Whitesides (Boston) zu nennen, die ein Modellsystem entwickelte,

das auf selbstassemblierenden Monoschichten (SAMs) aus OEG-Alkanthiolen (OEGs)

auf einer Goldschicht basierte. Die SAMs konnten durch verschiedene oberflächenphysi-

kalische Methoden näher untersucht werden. Hierfür wurden Organothiole mit verschie-

denen OEG-Einheiten eingesetzt und systematische Untersuchungen durchgeführt (Pale-

Grosdemagne, 1991; Prime /Whitesides, 1991). Die Monoschichten bieten gegenüber

dem PEG mit hohem, polydispersem Molekulargewicht den entscheidenden Vorteil, dass

sie monodispers sind und eine wohldefinierte Grenzschicht zur Flüssigkeit aufweisen.

Obwohl die Ethylenglykol-Einheiten auf der Oberfläche in ihrer Bewegungsfreiheit von

Anfang an deutlich eingeschränkter sind als im Falle der zuvor untersuchten PEG-Poly-

mere, konnte auch hier Proteinresistenz festgestellt werden (Herrwerth, S., Eck, W.,

Reinhardt, S., Grunze, M., 2003). Diese Ergebnisse belegten, dass das Phänomen der

Proteinresistenz von PEG-Oberflächen nicht alleine mit sterischer Repulsion zu erklären

ist. In weiteren Studien konnten einige kritische Faktoren herausgearbeitet werden, die

den Grad der Proteinresistenz der kurzen, monodispersen OEG-Filme entscheidend beein-

flussen (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003). Nur wenn das ω-Ende

mehr als zwei EG-Einheiten aufweist, wurden proteophobe Eigenschaften festgestellt


13

(Abbildung 2-1). Für Alkanthiole mit drei Ethylenglykoleinheiten und einer terminalen

Methoxyfunktion wurde zusätzlich die innerhalb der Monoschicht vorliegende

Konformation der OEGs als wichtiger Faktor für Proteinresistenz identifiziert.

SH

OOH

6

SH

OOH

3

SH

OOH

2

SH

OOH

Abbildung 2-1: OEG-Thiol mit unterschiedlicher Anzahl an Ethylenglykoleinheiten. Mit

steigender Anzahl der Ethylenglykoleinheiten (EG-Einheiten) wird ein höherer Grad an Proteinre-

sistenz erreicht. Aufgrund der chemischen Instabilität (Oxidationsempfindlichkeit) der OEG-

Thiole kann eine Degradation beobachtet werden, die mit einem gleichzeitigen Verlust der Pro-

teinresistenz einhergeht.

Auf Gold wurde mit Hilfe der Infrarotspektroskopie eine helikale Struktur der OEGs

ermittelt, die sich proteophob verhält, wohingegen auf Silber eine planare („all trans“)

Konformation nachgewiesen werden konnte, die keine proteinresistenten Eigenschaften

mehr aufweist (Pertsin et al., 1998). Aufgrund der höheren Packungsdichte auf Silber im

Vergleich zu Gold kommt es zu einer lateralen Kompression, die die helikale

Konformation kollabieren lässt. Ähnliche amorphe und helikale Konformationen konnte

man auch bei den polydispersen proteinresistenten PEG-Monoschichten nachweisen

(Tokumitsu et al., 2002). Untersuchungen mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) belegten

zusätzlich, dass elektrostatische Abstoßungskräfte mit hohen Reichweiten von bis zu

10 nm von den OEGs ausgehen. Die Studien erfolgten hier an Methoxy-terminierten

Alkanthiolen mit drei EG-Einheiten (Feldman et al., 1999; Dicke /Hahner, 2002b; Dicke

/Hahner, 2002a). Man begründete die gefundene Abstoßung damit, dass sich aufgrund

einer präferentiellen Adsorption von Hydroxid-Ionen aus der den SAM umgebenen


14

Elektrolytlösung (Autoprotolyse) eine negative Oberflächenladung aufgebaut hat.

Entsprechend ergänzende Berechnungen konnten diese Annahme bestätigen (Kreuzer et

al., 2003).

Aus den bisher durchgeführten Forschungsarbeiten, wobei hier besonders die Studien in

den Gruppen von Grunze (Heidelberg) und Whitesides (Boston) zu nennen sind

(Chapman, Ostuni, Takayama et al., 2000; Chapman, Ostuni, Yan et al., 2000; Ostuni, E.,

Chapman, Holmlin et al., 2001; Ostuni, E., Chapman, Liang et al., 2001; Herrwerth, S.,

Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003) konnten einige Kriterien für das Phänomen der

Proteinresistenz bei „klassischen“ proteinresistenten PEG bzw. OEG-Oberflächen herge-

leitet werden:

Das Innere des SAMs muss hydrophil sein (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S.,

Grunze, M., 2003). Diese Regel beruht auf der Beobachtung, dass bei Verwen-

dung von hydrophobem Oligopropylenglykol statt OEG keine proteophoben Ei-

genschaften mehr festgestellt werden.

Bei loser Packungsdichte der SAMs mit einiger Unordnung und möglicher

Defektstrukturen wird eine höhere Proteinresistenz festgestellt als bei dichter Pa-

ckung. Diese Beobachtung korreliert mit der Notwendigkeit, dass Wasser in den

SAM eindringt, was durch Monte-Carlo-Simulationen belegt werden konnte

(Pertsin /Grunze, 2000; Pertsin et al., 2002).

Nur bei loser Packungsdichte kann sich die helikale Struktur der OEG-Einheiten

ausbilden, was die Voraussetzungen dafür schafft, dass Hydroxid-Ionen über

Wasserstoffbrückenbindungen im OEG-SAM eingefangen und „fixiert“ werden

(Kreuzer et al., 2003). Da die Oberflächen der meisten Proteine tendenziell

negativ geladen sind und gleichzeitig die Hydroxid-Ionen nicht verdrängt werden

können, zeigt der negativ geladene Film aufgrund der Abstoßungseffekte

Proteinresistenz.

Einige Fallbeispiele, in denen negativ geladene Oberflächen (SiO2) ohne proteophobe

Eigenschaften (Czeslik et al., 2002; Czeslik, 2004), aber auch Proteine mit positiver

Nettoladung (Lysozym), die ebenfalls nicht an den OEG-Film binden, identifiziert wur-

den, zeigen aber auch deutlich, dass das Phänomen der Proteinresistenz noch nicht voll-

ständig verstanden ist und dass die Erklärungsansätze noch kein vollständiges Bild erge-

ben. Hier bedarf es weiterer Forschungen von PEG und OEG-Oberflächen, aber auch an-

derer organischer Oberflächen, um die Anwendbarkeit der aufgestellten Regeln auf an-


15

dere Systeme zu überprüfen. Die hohe Oxidationsempfindlichkeit der terminalen EG-

Einheiten, die mit der Zeit degradiert werden und nicht mehr proteinresistent wirken, und

die hohe Instabilität der OEG-Matrix (Flynn et al., 2003) sind nicht zuletzt triftige

Gründe, dass nach alternativen proteophoben Oberflächen ohne EG-Einheiten gesucht

wird. Aus der Literatur können hierfür schon einige Beispiele genannt werden, die im

Folgenden aufgelistet sind:

Maltose-terminierte SAMs (Prime /Whitesides, 1991)

Tripropylensulfoxid SAMs (Deng et al., 1996)

zwitterionische SAMs (Holmlin et al., 2001; Ostuni, E., Chapman, Liang et al.,

2001; Kane et al., 2003)

Peptidthiol-SAMs (Chelmowski et al., 2008)

Es konnte in Studien, in denen gezielt nach Molekülen gesucht wurde, die sich für

proteinresistente SAMs eignen (Chapman, Ostuni, Takayama et al., 2000; Chapman,

Ostuni, Yan et al., 2000; Ostuni, E., Chapman, Holmlin et al., 2001; Ostuni, E., Chapman,

Liang et al., 2001), die These herausgearbeitet werden, dass Organothiole

Wasserstoffbrückenakzeptoren besitzen müssen, um Proteinadsorption verhindern zu

können. Den gegensätzlichen Effekt, nämlich eine hohe Proteinaffinität, erreicht man,

wenn dagegen Wasserstoffbrückendonoren verwandt werden. Auch diese Beobachtung

konnte jedoch bereits im Falle von Mannitol-Gruppen nicht bestätigt werden (Luk et al.,

2000), was wiederum zeigt, dass der Mechanismus der Proteinresistenz komplizierter und

komplexer zu sein scheint als bisher angenommen. Abschließend sei noch erwähnt, dass

sich bis heute alle Studien, in denen die Proteinresistenz von alternativen Oberflächen

untersucht wurde, an OEG-SAMs orientieren, da sie als die Moleküle gelten, die die

ausgeprägtesten proteophoben Eigenschaften haben. Deswegen ist es umso bemer-

kenswerter, dass es im Jahre 2008 gelungen ist (Chelmowski et al., 2008), Thiole auf der

Basis von Peptiden als SAMs auf Goldoberflächen einzusetzen, die in ihrer Proteinresis-

tenz vergleichbar mit den OEG-Filmen sind. Ob im Falle der Peptidthiol-SAMs ähnliche

oder andere Erklärungsansätze für die starke Proteophobie im Vergleich zu den OEG-

Filmen herangezogen werden können, ist Gegenstand dieser Arbeit.


16

2.5 Herstellung von selbstorganisierenden Monolagen (SAMs)

In den bisherigen Ausführungen wurde der Begriff der SAMs (Self Assembled

Monolayers), also selbstorganisierenden Monolagen, im Bezug auf Funktionalisierungen

von Oberflächen schon zahlreich erwähnt und spielt bei den in dieser Arbeit beschriebe-

nen Anwendungen eine entscheidende Rolle. An dieser Stelle soll auf die schnelle und

kostengünstige Herstellung von SAMs, die in vielen Bereichen ihre Anwendung findet,

näher eingegangen werden (Ulman, 1991; Dubois /Nuzzo, 1992). SAMs sind ultradünne,

organische Filme, die durch einfaches Eintauchen eines Metallsubstrates in Lösung von

Organothiolen hergestellt werden können.

Abbildung 2-2: Selbstorganisation von Organthiolen. Schematischer Aufbau eines Alkanthiols

(links): SH-Ankergruppe, Rückgrat (-CH2-Kette) und Funktionalität. Zur schnellen und kosten-

günstigen Herstellung von SAMs wird das Metallsubstrat in eine Thiollösung getaucht und der

SAM formiert sich auf der Metalloberfläche. Die Bindung des Thiols erfolgt über die SH- Anker-

gruppe.

Die vielseitigen Einsatzmöglichkeiten dieser Filme sind durch die hohe strukturelle Qua-

lität bezüglich ihrer Stabilität und Ordnung begründet, die es ermöglicht, diese Oberflä-

chen sogar in der Elektronenstrahllithographie einzusetzen (Gölzhäuser et al., 2000). Die

Defektdichte der SAMs ist bei der richtigen Wahl des Metallsubstrates und des Lösungs-

mittels so klein, dass beste Voraussetzungen für den Ätzprozess nach Strukturierung mit

dem Elektronenstrahl gegeben sind. Oft ist es notwendig, dass die SAMs für bestimmte

Anwendungen in geeigneter Weise funktionalisiert werden müssen. So kommt es zum

Beispiel in der Biosensorik darauf an, SAMs für den spezifischen Nachweis von

Molekülen zu entwickeln. Die sehr stabile terminierende CH3-Einheit wird hierbei durch

passende funktionelle Gruppen ersetzt. Das in dieser Arbeit für die SAM-Herstellung


17

verwandte Biotinthiol ist ein gutes Beispiel für ein Molekül, dass das spezifische

Ankoppeln des Proteins Streptavidin ermöglicht. Zur Oberflächenfunktionalisierung

mittels SAMs existieren bereits eine ganze Reihe von Publikationen, wobei an dieser

Stelle die Arbeiten von Nuzzo und Dubois (Dubois /Nuzzo, 1992) sowie Ulman (Ulman,

1991) Erwähnung finden sollen. Aufgrund der sehr umfangreichen Studien der letzten

Jahre über SAMs soll an dieser Stelle auf die Übersichtsartikel von Whitesides (Love et

al., 2005), Wöll (Kind /Wöll, 2008) und Schreiber (Schreiber, 2000) verwiesen werden.

In dieser Arbeit werden eine Reihe von Thiolen zur Oberflächenfunktionalisierung ver-

wendet, die an dieser Stelle vorgestellt werden sollen:

1. Oktadekanthiol

SH

Abbildung 2-3: Strukturformel des Oktadekanthiols (ODT)

Das Oktadekanthiol (ODT) wird im weiteren Verlauf als CH3-Thiol bezeichnet, da es

insbesondere im Projekt „Proteinresistente Peptidthiole“ für die Herstellung einer beson-

ders proteophilen Oberfläche verwendet wird, um einen 100 %-Wert (Positivreferenz) für

die Proteinadsorption zu haben, der mit der Adsorption auf Peptidthiol in Bezug gesetzt

werden kann.

2. Biotinthiol

SH

NH

O

OO

HN

O

S

NH

HN

O

Abbildung 2-4: Strukturformel des Biotinthiols

Das biotinylierte Alkanthiol, dessen Strukturformel in Abbildung 2-4 gezeigt ist, wird im

weiteren Verlauf als Biotinthiol abgekürzt. Über die Biotingruppe kann das Protein


18

Streptavidin binden. Auf weitere Details zum Biotin/Streptavidin-System wird in Kapitel

2.7 eingegangen.

3. OEG-Thiol

O SHO

OO

OO

HO

Abbildung 2-5: Strukturformel des proteophoben OEG-Thiols (Oligoethylenglykol-Thiol).

Das Thiol besitzt am ω-Ende sechs OEG-Gruppen und wird durch eine OH-Gruppe terminiert.

Das proteophobe Alkanthiol, dessen Strukturformel in Abbildung 2-5 gezeigt ist, wird im

weiteren Verlauf OEG-Thiol genannt. Bei der Herstellung lateral strukturierter Oberflä-

chen über das Mikrokontaktstempeln und zum Vergleich mit den Peptidthioloberflächen

bezüglich ihrer proteinresistenten Eigenschaften wird es in dieser Arbeit angewandt.

4.Merkapoundekan-1-ol

HO SH

Abbildung 2-6: Strukturformel des proteophoben Merkaptoundekan-1-ol (OH-Thiol)

Das proteophobe Alkanthiol, dessen Strukturformel in Abbildung 2-6 zu sehen ist, wird

im Folgenden OH-Thiol genannt. Zusammen mit Biotinthiol bildet es den Misch-SAM,

der für die Immobilisierung von Streptavidin verwendet wird. Es soll einmal als

„Abstandhalter“ für die Biotinthiole fungieren, die insgesamt nur zu einem Anteil von

10 % dem Gemisch zugesetzt werden. Auf der anderen Seite hat es proteophobe

Eigenschaften, die die unspezifische Bindung von Proteinen vermeidet bzw. drastisch

reduziert. Deswegen wird es auch als Referenzthiol für das Peptidthiol eingesetzt und die

Proteinadsorption auf beiden Oberflächen miteinander verglichen.

2.6 Peptidthiol-SAMs

Die Herstellung von Peptidoberflächen mittels selbstassemblierenden Peptidmolekülen

findet schon seit Mitte der 90er Jahre Erwähnung (Zull et al., 1994). Auf besonderes Inte-

resse stoßen in diesem Zusammenhang so genannte PNA-Moleküle (Peptide Nucleic


19

Acid, PNA), die aus chemischer Sicht aufgrund ihres ungeladenen Peptidrückgrates, statt

des negativ geladenen Phosphatrückgrates der DNA, wie ein Peptid betrachtet werden

können. In erster Linie werden aber mit den PNAs größtenteils Hybridisierungsstudien

durchgeführt, die in dieser Arbeit keine Rolle spielen. Die Herstellung von künstlichen,

„proteinähnlichen“ Oberflächen auf der Basis von natürlichen Bausteinen (Aminosäuren)

ist im Vorfeld bereits behandelt worden und bildete somit eine gute Basis für die in dieser

Arbeit durchgeführten Studien. Auf der einen Seite existieren bereits Studien über die

Immobilisierung der Peptide an der Oberfläche, ihre dabei erhaltene Orientierung und

Anordnung (Herbert et al., 1997; Miura et al., 1998b; Miura et al., 1998a; Iizuka-Sakano

et al., 1999; Kimura et al., 2000), auf der anderen Seite ging aber auch die Stoßrichtung

hin zum näheren Verständnis der chemischen und physikalischen Eigenschaften der auf

der Basis von Peptiden erzeugten Filme (Margel et al., 1993; Zull et al., 1994; Duschl et

al., 1996; Fujita et al., 1998; Imanishi et al., 1999; Schultz et al., 1999; Iizuka-Sakano et

al., 2000; Kimura et al., 2000; Ptak et al., 2001; Houseman et al., 2002; Hyun et al., 2002;

Song, S. H. et al., 2003). Insgesamt lassen sich zwei Kernanwendungen für die Peptid-

SAMs benennen. Zum einen geht es dabei um die selektive und dauerhafte Immobilisie-

rung von ganzen Zellen auf strukturierten Peptidoberflächen, zum anderen um sensori-

sche und speziell biosensorische Anwendungen der Peptidfilme. Seit dem Jahr 2000 un-

tersucht man sogar den Einsatz von Peptidelementen in der molekularen Elektronik, was

völlig neue Möglichkeiten für die zukünftige Forschung im Bereich der Peptidchemie

eröffnet.

Hauptgrundlage des in dieser Arbeit behandelten Projektes über die strukturelle Untersu-

chung von proteinresistenten SAMs auf der Basis von Peptidthiolen sind die bereits ver-

öffentlichten Studien, in denen zunächst vornehmlich der eigentliche Nachweis der Pro-

teinresistenz für Peptid-basierende SAMs erbracht wurde (Chelmowski et al., 2008).

Basierend auf Auswahlkriterien aus früheren Studien über proteinresistente organische

Oberflächen (Ostuni, E., Yan, L., Whitesides, G. M., 1999; Chapman, Ostuni, Takayama

et al., 2000; Chapman, Ostuni, Yan et al., 2000; Herrwerth, S. et al., 2003) konnten für

das Peptiddesign entsprechende Regeln aufgestellt werden:

keine hydrophoben Seitenketten, da hydrophobe Reste die unspezifische

Proteinadsorption verstärken würde; die Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, Pro, Ile, Leu

und Val scheiden daher aus. Gly und Ala gelten formal zwar auch als hydrophob,

wurden aber aufgrund der hohen Bedeutung für die Flexibilität der Peptidstruktur


20

mit einbezogen. Trotz allem sollte darauf geachtet werden, dass der Anteil hydro-

philer Reste in Nachbarschaft von Glycin und Alanin überwiegt.

An terminaler Position sollte eine neutrale Aminosäure wie Ser oder Thr verwen-

det werden.

Auf schwefelhaltige Aminosäuren wurde verzichtet, um die Ausbildung des

Peptid-SAMs auf der Goldoberfläche nicht zu stören. Die Aminosäuren Cys und

Met können an die Goldoberfläche als Thiolate binden (Sasaki et al., 1997;

Qingwen et al., 2001).

Da für OEGs auf Gold eine helikale Struktur nachgewiesen werden konnte, die

sich begünstigend auf die Proteinresistenz auswirkt, wurde für die Peptidthiole

ebenfalls eine α-helikale Struktur angestrebt. Peptide mit helikalen Sekundär-

strukturelementen waren bereits im Vorfeld erfolgreich auf Oberflächen aufge-

bracht und hinsichtlich ihrer Orientierung und lateralen Packungsdichte charakte-

risiert worden (Duschl et al., 1996; Herbert et al., 1997; Fujita et al., 1998; Miura

et al., 1998b; Miura et al., 1998a; Iizuka-Sakano et al., 1999; Imanishi et al., 1999;

Iizuka-Sakano et al., 2000; Kimura et al., 2000; Miura et al., 2001; Song, S. H. et

al., 2003). Bei den helikalen Peptiden, die in diesen Arbeiten verwendet wurden,

konnte ein Helixdipolmoment analog zum Dipolmoment der Ethylenglykole

nachgewiesen werden. Als helixbildende Aminosäuren kamen damit Lys, Ala,

Glu, Leu und Met in Frage. Aufgrund ihres tendenziell hydrophoben Charakters

wurde die Aminosäure Lys so platziert, dass sie sich im Inneren des Peptid-SAMs

befindet, um hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Wasser bzw. Proteinmole-

külen zu vermeiden.

Darüber hinaus wurde auf den Einsatz geladener Aminosäuren verzichtet, um

unter anderem eine durch elektrostatische Wechselwirkung hervorgerufene

Proteinadsorption zu vermeiden.

Außerdem wurde bei der Komposition der Aminosäuresequenz berücksichtigt,

dass nicht nur die letzten 3 bis 4 Aminosäuren, die mit dem Protein an der Peptid-

SAM-Oberfläche direkt wechselwirken können, für die Eigenschaft der Mono-

schicht verantwortlich sind, sondern dass auch die innere Struktur der SAMs, z. B.

hinsichtlich möglicher Einlagerung von Wassermolekülen, eine nicht unwesentli-

che Rolle spielen.


21

Auf Basis dieser Kriterien wurde das folgende Peptid synthetisiert und über die 1,3-

dipolare Cycloaddition (Huisgen Reaktion; (Chelmowski et al., 2009)) mit einem Thiol

verbunden:

Abbildung 2-7: Schema zur verwendeten Aminosäuresequenz für das Peptid mit Thiolanker

(Thioester). Peptid A wurde nach den oben aufgestellten Kriterien synthetisiert. Peptid B sollte

als Kontrolle dienen; deswegen wurden Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten verwendet.

Das verwendete Peptid hatte eine Länge von 10 Aminosäuren, um zu gewährleisten, dass

mindestens zwei komplette Windung einer Helix zustande kommen konnten (α-Helix: 3,6

Aminosäurereste pro Windung).

2.7 Die Verwendung des Biotin-Streptavidin-Systems als Immobilisie-

rungs-Assay

Das Homotetramer Streptavidin aus dem Bakterium Streptomyces avidinii ist ein Protein,

welches sich aus vier monomeren Einheiten von ca. 13 kDa zusammensetzt. Das Gen

konnte vollständig entschlüsselt werden, so dass für Streptavidin Standardexpressionsys-

teme existieren, die einen Einbau der Geninformationen in Bakterien (E. coli) und eine

gezielte Überexpression ermöglichen. Auch eine spezifische Veränderung der

Geninformationen, also z. B. ein Einbau gezielter Punktmutationen oder die Erzeugung

von Deletionsmutanten, ist dadurch möglich. Aufgrund der Tatsache, dass die Biotin-

Streptavidin-Bindung zu den stärksten nicht-kovalenten Bindungen zählt (Ka ~ 1014

-1015

M-1

), wird diese Wechselwirkung in den verschiedensten Methoden der Biochemie wie

der Affinitätschromatographie, der Immunohistochemie, für die Entwicklung von

Gensonden oder aber auch in der DNA-Chip-Technologie (Niemeyer, C. M., Sano, T.,

Smith, C. L., Cantor, C. R.,. 1994; Niemeyer, C. M. et al., 1999; Liu et al., 2006; Su,


22

2005) und anderen analytischen Anwendungen (Schmidt, H.-L., Schumann, S. W.,

Scheller, F., 1992; Willner, 1999) ausgenutzt.

Abbildung 2-8: Kristall von Streptavidin mit vier gebundenen Biotinmolekülen. Die vier

monomeren Einheiten sind in grün, rot, blau und gelb-grün dargestellt( links). Die Biotine sind

tief in den Bindungstaschen der jeweiligen Monomere verankert. Eine monomere Einheit mit

gebundenem Biotin ist dargestellt (rechts) (Weber, 1989).

Jedes Monomer ist in der Lage, ein Molekül Biotin zu binden. Zahlreiche Studien haben

die Komplexbildung zwischen Streptavidin und Biotin bereits thematisiert, so dass ein

sehr detailliertes Bild über die existierenden Wechselwirkungen auf Biotin innerhalb der

Bindungstasche entstanden ist (Weber, 1989; Wilchek /Bayer, 1990; Freitag, 1997; Knoll

et al., 2000). Unter physiologischen Bedingungen kommt der Streptavidin-Biotin-

Komplex ausschließlich durch nicht-kovalente polare und unpolare Wechselwirkungen

zustande. Die Arbeiten von Weber (Weber, 1989) und Hendrickson (Hendrickson et al.,

1989) über die Struktur des Streptavidin-Biotin-Komplexes lassen sich an dieser Stelle

für weiterführende Informationen heranziehen. Im Gegensatz zu Avidin, das ebenfalls

Biotin bindet, liegt der isoelektrische Punkt für Streptavidin im neutralen Bereich (ca. 7,

je nach Literatur auch 5 bis 6). Darüber hinaus hat Streptavidin eine geringere

Gesamtladung und bindet auch nicht an Kohlenhydrat-Rezeptoren, da es nicht zu den

Glykoproteinen zählt (Wilchek /Bayer, 1990). Auf diese Weise ist es gegenüber

unspezifischer Bindung deutlich unempfindlicher als Avidin.

Streptavidin fungiert in der Regel als eine Art „Linker“, da es in einem ersten Schritt mit

1 bis 2 seiner 4 Biotin-Bindungstaschen an eine Thiolschicht mit einer funktionellen


23

Biotingruppe binden kann und in einem zweiten Schritt weitere biotinylierte Proteine

über die zwei freien Bindungsplätze zu immobilisieren vermag. Aufgrund der hohen Af-

finität zwischen Streptavidin und Biotin kann davon ausgegangen werden, dass jedes zu-

gängliche Biotin an Streptavidin gebunden wird. Somit lässt sich ein hohes Maß an spezi-

fischer Proteinadsorption (gilt für Proteine mit Biotinanker) erreichen. Des Weiteren weiß

man, dass Streptavidin bei geeigneten experimentellen Bedingungen ausschließlich eine

Monolage auf der Oberfläche bildet. Die Ausbildung von multimeren Streptavidin-

komplexen konnte bis dato nicht beobachtet werden, wenn alle Bindungsstellen auf der

Oberfläche besetzt sind (Grunwald, C. et al., 2004).

Die Dissoziation des Streptavidin von Biotin lässt sich durch verschiedene Faktoren ge-

zielt beeinflussen. Mit zunehmender Nettoladung des Proteins kommt es zu einer leichte-

ren Freisetzung des Liganden. Die stärkste Bindung entsteht am isoelektrischen Punkt

(Green /Toms, 1973; Green, 1974; Wilchek /Bayer, 1990). Die hohe Enthalpie der Biotin-

Streptavidin Bindung führt außerdem zu einer starken Temperaturabhängigkeit. Für eine

Temperaturerhöhung von gerade mal 5 K konnte bereits eine Verdoppelung der Disso-

ziationsrate gemessen werden (Green, 1974; Wilchek /Bayer, 1990). Es sollte des

Weiteren darauf geachtet werden, dass sich am Biotin oder in der Umgebung

irgendwelche sperrigen Gruppen befinden, die eine Bindung zu Streptavidin stören

könnten. Durch Abstandhalter (spacer), also zum Beispiel durch den Einbau von CH2-

Ketten, können solche sterischen Hinderungen vermieden werden.

In einigen lehrstuhlinternen Vorarbeiten (Grunwald, C. et al., 2004; Chelmowski et al.,

2007) wurde bereits das Biotin-Streptavidin-System eingehend untersucht und für den

Aufbau supramolekularer Strukturen, also Mehrschichtensystemen, genutzt. Das Strepta-

vidin war über ein Thiol mit Biotinanker (Biotinthiol) an eine Goldoberfläche gebunden.

Als Modellprotein wurde eine mit einem Biotinamidocaproylanker verlinkte Peroxidase

(horse radish peroxidase, HRP) verwendet. Die enzymatische Aktivität der Peroxidase

auf der Oberfläche wurde über eine bereits etablierte Farbreaktion nachgewiesen (Rendl,

1998).

Besonderes Augenmerk wurde bei der Untersuchung des Mehrschichtensystems auf eine

kontrollierte und möglichst spezifische Adsorption der Proteinkomponenten Streptavidin

und Merrettichperoxidase gelegt. Dazu wurde in einem ersten Schritt die Biotinthiol-

Konzentration variiert, um herauszufinden, welches Mischungsverhältnis für die Adsorp-

tion des Streptavidins optimal ist.


24

Abbildung 2-9: Variation der Biotinthiolkonzentration und die Auswirkung auf die

Adsorption von Streptavidin (200 nm). Die Inkubation erfolgte jeweils für 15 min. Die Fehler-

balken zeigen die Streuung von jeweils 4 Messungen. Der prozentuale Anteil von Biotinthiol

bezieht sich jeweils auf das Mischverhältnis mit Merkaptoundekanol (OH-Thiol) (Chelmowski et

al., 2007).

Die höchste Belegung mit Streptavidin konnte in einem Bereich zwischen 5 und 10 %

Biotinthiol erreicht werden. Aufgrund sterischer Effekte, die in früheren Studien bereits

beschrieben wurden (Spinke, 1993), führt eine weitere Erhöhung der Biotinthiol-

konzentration zu einer Verminderung der Streptavidinbelegung. Auch eine weitere

Verringerung der Biotinthiolkonzentration unterhalb von 5 % war für die Adsorption von

Streptavidin eher kontraproduktiv, da die möglichen Bindestellen für das Protein mehr

und mehr verarmen. Als entscheidendes Kriterium für eine reproduzierbare Adsorption

von Streptavidin wurde zudem die Inkubationszeit für die SAM-Herstellung

hervorgehoben. Ein Minimum von 2 bis 3 Stunden sollte für die Inkubation unbedingt

eingehalten werden, um unerwünschte unspezifische Wechselwirkungen des Proteins mit

der Oberfläche zu vermeiden. Weiterhin wurde die Kontrolle der Streptavidinbelegung

über Variation der Inkubationszeit bzw. Konzentration bei gleichzeitiger Konstanthaltung

der Biotinthiolkonzentration (5 % Biotinthiol) eingehend untersucht. Die dadurch

erzielten Erkenntnisse bilden die Grundlage für die in dieser Arbeit beschriebenen

Studien für das Protein hGBP1. Die Streptavidinkinetik folgt einem zweiphasigen Prozess

mit einem stark ausgeprägten linearen Teil (Diffusionsrate: 0,0049 s-1

), der etwa 80 % der

Streptavidinadsorption ausmacht, und einem biexponentiellen Verlauf, dem die restlichen

20 % der Adsorption folgen (Abbildung 2-10).


25

Abbildung 2-10: Adsorptionskinetik von Streptavidin (200 nm) auf 5 % Biotinthiol. Das

SPR-Signal wurde vor dem Fitten normiert. Deutlich unterscheidbar ist eine zunächst lineare

Phase, die einen biexponentiellen Verlauf übergeht (Chelmowski et al., 2007).

Die lineare Phase weist dabei auf eine erwartungsgemäß schnelle Adsorption von

Streptavidin an die SAM-Oberfläche. Für den exponentiellen Anteil, der durch zwei

verschiedene Prozesse dominiert wird, kann zum einen die spezifische Adsorption des

Streptavidins an die Biotinthiole und zum anderen die unspezifische Adsorption des

Streptavidins an die OH-terminierten Bereiche der Oberfläche, die deutlich langsamer

vonstatten geht (0,006 s-1

gegenüber 0,081 s-1

), verantwortlich sein. Trotz dieses stark

vereinfachten Modells wurden gute Übereinstimmungen mit den weiterführenden

Untersuchungen zur unspezifischen Adsorption und den erzielten Ergebnisse bei den

AFM-Experimenten erzielt, so dass die gewonnenen Erkenntnisse auch für diese Arbeit

genutzt werden konnten. Um die Reproduzierbarkeit der Streptavidinbeladung zu

gewährleisten und störende Effekte wie Adsorption an den Gefäßwänden

(Proteinverarmung) und Lösungsmittelverdampfung, sollte außerdem mindestens eine

Konzentration von 0,2 µM Streptavidin eingesetzt werden. Alle Kinetiken in Abbildung

2-11 zeigen sehr große Unterschiede bezüglich ihrer Kinetik und maximalen Beladung,

was darauf schließen lässt, dass sich die Verarmung der Lösung bei gering konzentrierten

Proteinlösungen signifikant auf die Adsorption von Streptavidin auswirkt.

Mit Hilfe dieser Erkenntnisse sollte das für das Streptavidin-Peroxidase-

Multikomponentensystem entwickelte Assay auch auf das deutlich komplexere System

Streptavidin/biotinyliertes hGBP1/hGBP1 übertragen und durch weitere methodische


26

Ergänzungen erweitert werden, um final Kinetikstudien über die Homodimerisierung von

hGBP1 durchführen zu können.

Abbildung 2-11: Diffusionslimitierte Adsorption des Streptavidins auf dem Biotinthiol-

SAM. Die Immobilisierungsdichte zeigt sehr starke Schwankungen auch bei Verwendung dersel-

ben Konzentration; m(ads) bezieht sich auf die total adsorbierte Masse an Protein (Chelmowski et

al., 2007).

2.8 Das Immunprotein hGBP1- ein Vertreter aus der Dynamin

Superfamilie

2.8.1 Interferone als Botenstoffe der Immunantwort

Da es sich bei dem humanen Guanylat-bindenden Protein (hGBP1) um ein antivirales

Immunprotein handelt, das durch so genannte Interferone, also Botenstoffe, die die spezi-

fische Immunantwort aktivieren, aber auch bakterielle und wachstumshemmende Effekte

haben, induziert wird, werden im Folgenden zunächst die grundsätzlichen Mechanismen

der Immunantwort skizziert, bevor das hGBP1 in seiner Struktur und Funktion

beschrieben wird. Die Interferone α und β gehören zu den so genannten Typ I Interfero-

nen, wohingegen Interferon γ dem Typ II zugeordnet wird. Ein durch ein Virus befallener

Organismus reagiert mit der Ausschüttung der Interferone des Typs I. Durch Bindung der

Interferone an einen Rezeptor (Interferon α/β-Rezeptor-Komplex, IFNAR), wird eine

Signaltransduktionskaskade in Gang gesetzt, die über den so genannten „JAK-STAT-


27

pathway“ beschrieben wird (Kotenko /Pestka, 2000). Die Abkürzungen beziehen sich auf

zwei unterschiedliche Proteinfamilien: Die „Janus Activating Kinases“ (JAKs) und die

„Signal Transducer and Activator of Transcription“ (STATs 1 und 2). Diese

Signalproteine sind in der Lage, die intrazellulären Signale vom Interferon-Rezeptor zum

Zellkern zu übertragen, um dort die Genexpression zu verändern (Darnell et al., 1994).

Um in den Zellkern zu gelangen, werden STAT1 und 2 zuvor durch eine aktivierende

Phosphorylierungskaskade dimerisiert.

Abbildung 2-12: Schematische Darstellung des JAK-STAT-Signaltransduktionsweges.

Stimulation der α- und β-Ketten des Interferon γ-Rezeptors (IFNγ-Rα und IFNγ-Rβ) durch Interfe-

ron γ (1); Aktivierung von JAK durch Autophosphorylierung sowie nachfolgende Phosphorylie-

rung von Tyrosinresten an der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors (2); JAK Aktivierung

führt zur Bildung von STAT1-Bindungsstellen, STAT1-Monomere werden aus dem Cytosol zum

Rezeptor rekrutiert und phosphoryliert (3); durch die Tyrosin-Phosphorylierung dimerisieren die

STAT1-Proteine (4) und werden zum Zellkern transloziert (5), wo sie an eine bestimmte DNA-

Sequenz (Gamma Activated Sequence, GAS) binden und die Transkription von Zielgenen in Gang

setzen (entnommen und verändert aus (Shuai /Liu, 2003)).

Im Gegensatz zu Interferon α und β, die von Leukozyten (Interferon α) und Fibroblasten

(Interferon β) ausgeschüttet werden, erfolgt die Exkretion von Interferon γ durch natürli-

che Killerzellen und durch zytotoxische CD4 oder CD8 T-Lymphozyten (CTL).

(Schoenborn /Wilson, 2007). Auch für Interferon γ existieren spezielle Rezeptoren

(Interferon γ- Rezeptoren, IFN-R), die nach Bindung zweier Interferon-Moleküle (Dimer)

einen aktiven Rezeptorkomplex bilden. Der Aktivierung der JAKs über Phosphorylierung

folgt, ähnlich wie bei Interferon α und β, eine Rekrutierung, Aktivierung und Dimerfor-


28

mation von STAT1. Nach Serinphosphorylierung wird das aktive STAT-Homodimer in

den Zellkern transloziert und sorgt dort für eine Transkriptionsaktivierung (Stark et al.,

1998; Shuai /Liu, 2003).

Für Interferone konnten sowohl antiproliferative und apoptotische (Maher et al., 2007)

Effekte nachgewiesen und ihre Rolle als Immunmodulator gezeigt werden (Platanias,

2005). Auch die direkte Hemmung der viralen Replikation wurde über verschiedene

Signalwege beschrieben (Meurs et al., 1990; Frese et al., 1996; Zhao et al., 1996).

Der antivirale Effekt der Interferone gegen das Encephalomyocarditis und Vesicular

stomatitis Virus wurde später unter anderem durch eine nachgewiesene Resistenz-

vermittlung über hGBP1 ergänzt (Anderson, 1999; Itsui, Y.Sakamoto, N.; Kurosaki, M.;

Kanazawa, N.; Tanabe, Y.; Koyama, T.;Takeda,Y.Nakagawa, M. et al., 2006; Itsui, Y. et

al., 2009). Der genaue Wirkmechanismus von hGBP1 konnte jedoch bis heute nicht

geklärt werden.

2.8.2 Gemeinsamkeiten GTP-bindender Protein

Das hGBP1 gehört zu den GTP-bindenden Proteinen (GNBP), die an zahlreichen zellulä-

ren Prozessen wie die interzelluläre Signalweiterleitung, die Proteinbiosynthese und der

Transport von Vesikeln (Bourne et al., 1990) beteiligt sind. Die GNBPs lassen sich

grundsätzlich in fünf Superfamilien unterteilen, nämlich die heterotrimeren G-Proteine,

Signalerkennungspartikel, Faktoren für die Proteinbiosynthese, Ras-homologe kleine

GTPasen und die Großen Dynamin verwandten GTPasen, zu denen auch die Guanylat

bindenden Proteine (GBPs), also auch hGBP1 zählen. Alle GTP-bindenden Proteine sind

in der Lage, abhängig von Mg2+

-Komplexierung, Guaninnukleotide zu binden und zu

hydrolysieren, also Guanosintriphosphat (GTP) zu Guanosinddiphosphat (GDP) umzuset-

zen. Bei hGBP1 kommt die Besonderheit hinzu, dass es nicht nur in der Lage ist, GTP zu

GDP und Orthophosphat zu hydrolysieren, sondern GDP auch zu GMP umzusetzen

(Schwemmle /Staeheli, 1994; Praefcke et al., 1999; Kunzelmann et al., 2006). Die

Nukleotidhydrolyse der GTP-bindenden Proteine wird durch hochkonservierte Sequenz-

motive vermittelt (Bourne et al., 1991). Als Modell für eine GTPase-Domäne, die sich

auch in anderen GNBs in völlig identischer oder durch Insertionen oder Extensionen mo-

difizierter Form wiederfindet (Vetter /Wittinghofer, 2001), kann die gut untersuchte

Struktur des Ras-Proteins (Rat Sarcoma) mit seinen konservierten Sequenzmotiven her-


29

angezogen werden (Walker et al., 1982; Milburn et al., 1990; Saraste et al., 1990;

Wittinghofer /Pai, 1991; Schmidt, G. et al., 1996; Chook /Blobel, 1999; Cool et al., 1999;

Vetter et al., 1999). Die meisten GNBPs sind innerhalb der Zelle eine Art molekularer

Schalter, der je nach gebundenem Guaninnukleotid, entweder ein oder ausgeschaltet ist.

Die Nukleotidbindung führt zu einer veränderten Bindungspezifität nachgeschalteter Ef-

fektoren. Das Ras-Protein ist zum Beispiel in aktiver Form in der Lage, das

Effektorprotein Raf-Kinase (Rapidly Growing Fibrosarcoma or Rat Fibrosarcoma, Raf)

zu binden, das wiederum mit anderen Proteinen in Wechselwirkung tritt. Am Ende dieser

Signaltransduktionskaskade steht dann eine gezielte Regulation der Transkription be-

stimmter Zielgene. Die Nukleotidhydrolyse und der Nukleotidaustausch werden bei den

Ras-homologen GTPasen durch GTPase aktivierende Proteine (GAPs) und Guaninnuk-

leotid-Austauschfaktoren (GEFs) beschleunigt (McCormick, 1989; Cherfils /Chardin,

1999; Praefcke /McMahon, 2004; Bos et al., 2007). Im Gegensatz dazu benötigt hGBP1

als Vertreter der Dynamin Superfamilie sowie einige andere kleinere GTPasen keine

GAPs, sondern stimuliert sich durch Homooligomerisierung, wodurch die katalytische

Aktivität signifikant um das 20-fache erhöht wird (Prakash, Renault et al., 2000;

Kunzelmann et al., 2006). Deswegen wird hGBP1 auch als G Protein Activated by

Nucleotide Dependant Dimerization (GAD) klassifiziert. Ein Gendefekt des für die

GNBPs beschriebenen GTPase-Zyklus kann in vielen Fällen drastische Auswirkungen

auf die Signalweiterleitung und das Überleben der Zelle haben. Mutationen im Ras Gen

führen zum Beispiel in 30 % aller Fälle zu Krebs, da das Ras Protein aufgrund einer Un-

empfindlichkeit gegenüber GAPs ständig in seiner aktiven Form verbleibt, was zu einer

unkontrollierten Zellproliferation führt (Cox /Der, 2002). Dieses Beispiel zeigt deutlich,

wie empfindlich die Regulationsmechanismen innerhalb der Zellen sind und wie bedeut-

sam es ist, die Struktur und Funktionsweise bestimmter Schlüsselproteine (Ras

(Protoonkogen); hGBP1 (Immunprotein) zu kennen, um gezielt durch Einsatz bestimmter

Wirkstoffe (Medikamente) in die Signaltransduktionswege eingreifen zu können.

2.8.3 Die GBPs als Vertreter der Dynamin-verwandten Proteine

HGBP1 wird in die Gruppe der Dynamin-verwandten oder auch Großen GTP-bindenden

Proteine eingeordnet. Die wichtigsten Eigenschaften lassen sich wie folgt zusammenfas-

sen:


30

Vorkommen in verschiedensten Organismen wie Pflanzen, Vertebraten und

Bakterien (Obar et al., 1990; Gu /Verma, 1996; Moshnikova et al., 2006).

Beteiligung an zahlreichen Prozessen: Vesikelabschnürung, Differenzierung von

Zellorganellen, Pathogenresistenz

Domänenarchitektur und Funktion deutlich von den kleinen klassichen GTPasen

wie Ras unterscheidbar: Große GTPase-Domäne (ca. 300 Aminosäuren) mit den

klassischen konservierten Bindungsmotiven und weiteren Insertionen (Praefcke/

McMahon, 2004), Mittel-Domäne, GTPase-Effektor-Domäne, zumeist weitere

Domänen wie Pleckstrin-Homologie-Domänen (PHD) oder Prolin-reiche Domä-

nen (PRD) etc., die die Proteine zu den Zielkompartimenten leiten.

Die Funktion der GEFs und GAPs bei Ras als Initiatoren des Nukleotidaustausches und

als GTP-Hydrolyse-Beschleuniger wird im Falle der Mitglieder der Dynamin Superfami-

lie von der Mittel- und GTPase-Effektor-Domäne sowie der relativ geringen Affinität zu

GTP ersetzt (McCormick, 1989; John et al., 1990; Schwemmle /Staeheli, 1994; Richter et

al., 1995; Binns et al., 1999; Cherfils /Chardin, 1999; Stowell et al., 1999; Klockow et al.,

2002; Praefcke /McMahon, 2004).

Wie bereits erwähnt, nennt sich die Familie, denen die GBPs zugeordnet werden, „Große

Dynamin-verwandte GTPasen“. Im Folgenden soll kurz dargestellt werden, worin diese

Verwandtschaft begründet ist.

Abbildung 2-13: Vergleich der Domänenstruktur von Dynamin und GBP. Die GTPase-Do-

mäne, Mittel-Domäne und GTPase-Effektordomäne (GED) können sowohl in Dynamin als auch

GBPs identifiziert werden. Im Gegensatz zu den GBPs weist das Dynamin zusätzlich eine Prolin-

reiche-Domäne sowie eine PH-Domäne auf.

Wie die GBPs weist auch das Dynamin eine GTPase-Domäne mit den klassischen kon-

servierten Bindungsmotiven, eine Mitteldomäne und eine GTPase-Effektordomäne auf.

Zusätzlich findet man eine Prolin-reiche Domäne und eine Pleckstrin-Homologie-Do-

mäne (PHD), die auf eine Membranassoziation hindeuten könnte (Ferguson et al., 1994).

Für das Dynamin konnte auch, analog zu den GBPs, eine nukleotidabhängige Aktivität,

nämlich die Interaktion mit Mikrotubuli, gezeigt werden (Shpetner /Vallee, 1989). Ein


31

GTP-abhängiger Effekt auf die Vesikelabschnürung, bei dem Dynamine ringartige

Strukturen an röhrenförmigen Ausstülpungen der Membran ausbilden (Takei et al., 1995),

wurde bereits beschrieben. Wie genau das zur Vesikelabschnürung beiträgt und welcher

Mechanismus sich dahinter verbirgt, ist bis heute nicht geklärt. Entscheidend ist, dass bei

allen beschriebenen Modellen die Aktivität von Dynamin durch GTP vermittelt wird und

dass die Homooligomerisierung von Dynamin ein entscheidender Bestandteil der

Funktion des Proteins ist, wie zahlreiche Studien belegen (Binns et al., 1999; Muhlberg

/Schmid, 2000; Sever et al., 2000; Narayanan et al., 2005; Roux et al., 2006; Mears et al.,

2007; Bashkirov et al., 2008; Pucadyil /Schmid, 2008; Mettlen et al., 2009).

Die Selbstassemblierung von Dynamin zu helikalen Strukturen scheint in dem

Zusammenhang dafür verantwortlich zu sein, dass sich Vesikel abschnüren können. Die

Mitteldomäne kommt dabei als Angriffsfläche für die nukleotidabhängige Assemblierung

in Frage. Durch Einbau gezielter Mutationen in diesem Bereich konnte die Ausbildung

von Dynamin-Oligomeren inhibiert werden (Ramachandran et al., 2007). Des Weiteren

wurden signifikante Erhöhungen der kooperativen GTPase-Aktivität beobachtet, die mit

der GTPase-Effektor-Domäne in Verbindung gebracht werden konnte (Warnock et al.,

1996; Muhlberg et al., 1997; Song, B. D. et al., 2004).

2.8.4 Mx-Proteine als Vertreter der Dynamin Superfamilie mit antiviraler Aktivität

Die Mx-Proteine wurden zum ersten Mal dadurch entdeckt, dass eine Mutation im Gen

für Mx bei Mäusen mit einem Verlust der Resistenz gegenüber Orthomyxoviren einher-

geht (Lindenmann, 1962; Haller et al., 1979). Wie Dynamin besitzen diese Proteine eine

GTPase-Domäne, eine Mitteldomäne und zusätzlich ein Leucin-Zipper-Motiv (LZ-Mo-

tiv), das den Interaktionsbereich für Dimerisierung bildet (Melen et al., 1996). Analog

zum Dynamin weisen sie ebenfalls eine geringe Affinität gegenüber GTP auf und

oligomerisieren nukleotidabhängig, was die GTPase-Aktivität erhöht (Nakayama et al.,

1993; Staeheli et al., 1993; Kochs et al., 2002). Auch größere ringförmige Strukturen und

GDP-abhängige dicht gepackte Komplexe konnten beobachtet werden. Im Gegensatz zu

hGBP1 wird die antivirale Aktivität der Mx-Proteine duch Interferon α und β, nicht aber

durch Interferon γ vermittelt. Sowohl in Mäusen als auch im Menschen konnte diese

Aktivität gegen zahlreiche Viren nachgewiesen werden (Dreiding et al., 1985; Haller et

al., 1998; Chieux et al., 2001; Gordien et al., 2001; Haller /Kochs, 2002; Andersson et al.,


32

2004; Sadler /Williams, 2008). Als Besonderheit gilt, dass für die Isoformen Mx1 und 2

unterschiedliche Zellkompartimente identifiziert wurden (Sadler /Williams, 2008), was

auf eine gezielte antivirale Aktivität schließen lässt. Über die GTPase-Effektor-Domäne

und das Leucin-Zip-Motiv wird die Oligomerisierung vermittelt (Di Paolo et al., 1999),

doch hängt die antivirale Aktivität nicht von dieser Assemblierung ab. Vielmehr geht die

Theorie dahin, dass der oligomere Zustand nur als eine Art Ruhezustand beschrieben

werden kann und das die Monomere die Bekämpfung der Viren bewerkstelligen (Janzen

et al., 2000). Die Guanylat-bindenden Proteine, die im Folgenden beschrieben werden,

weisen wie die Mx-Proteine eine antivirale Aktivität auf und vereinen gleichzeitig die

vom Dynamin bekannte Struktur und das nukleotidabhängige Oligomerisierungsverhalten

auf sich.

2.8.5 Die Familie der Guanylat-bindenden Proteine

Zum ersten Mal wurden Vertreter der Guanylat-bindenden Proteine (GBPs) bei der Be-

handlung von humanen Fibroblasten mit Interferonen entdeckt, die in Folge dessen

resistent gegenüber VSV waren. Für die Resistenz konnten vier Kandidaten mit Massen

zwischen 44 und 68 kDa ausgemacht werden, deren Synthese durch Interferon induziert

wurde (Knight /Korant, 1979). Insbesondere zwei Proteine schienen von der

Interferonzugabe besonders beeinflusst worden zu sein: Ein Protein mit einer Größe von

56 kDa, welches durch Interferon α und β induziert wurde, und ein weiteres mit einer

Größe von 65 kDa, dessen Expression wesentlich stärker von Interferon γ abhing (Cheng

et al., 1983). Die Bindungsaffinität gegenüber GTP, GDP und GMP konnte für beide

Proteine nachgewiesen werden (Cheng et al., 1985; Cheng et al., 1991), so dass beide

später als Guanylat-bindende Proteine klassifiziert wurden. Bis heute konnten im

Menschen 7 verschiedene GBPs mit hoher Sequenzhomologie gefunden werden. Das

kodierende Gen für alle GBPs befindet sich auf einem Cluster in Chromosom 1

(Olszewski et al., 2006). In Mäusen wurden sogar 11 Gene, die für GBPs kodieren

identifiziert, aber auf verschiedenen Chromosomen, (3 Cluster auf Chromosom 3 und 5;

(Degrandi et al., 2007; Kresse et al., 2008)). Auch in Ratten, Hühnern, Fischen etc.

wurden GBPs gefunden (Asundi et al., 1994; Schwemmle et al., 1996; Robertsen et al.,

2006). Über Untersuchungen der Promotorsequenzen wurden entscheidende Hinweise

gefunden, die auf eine interferonabhängige Stimulation hindeuten. Für hGBP1-4 sowie 6


33

und 7 und auch mGPB 1-6 ließen sich Transkriptionsbindungsstellen für interferonabhän-

gige Transkriptionsfaktoren identifizieren (Olszewski et al., 2006). Auch die Beteiligung

von murinen GBPs an der zellulären Immunantwort wurde durch ihre nachgewiesene

Assoziation an intrazelluläre Krankheitserreger (Monocytogenes, Toxoplasma Gondii)

gezeigt (Degrandi et al., 2007). Des Weiteren konnten Auswirkungen auf die

Zellproliferation gezeigt werden (Gorbacheva et al., 2002).

2.8.6 Das Humane Guanylat-bindende Protein 1- funktionelle und strukturelle As-

pekte

Wie bereits im vorherigen Abschnitt erwähnt, wird hGBP1 vornehmlich durch Interfe-

ron γ induziert und zwar in vaskulären Endothelzellen von Darm, Magen, Milz etc.

(Lubeseder-Martellato et al., 2002). Die antiviralen Eigenschaften ließen sich durch den

Nachweis der Resistenz gegen Vesicular Stomatitis Viren, Encephalomyocarditis und

Hepatitis C Viren (Anderson, 1999; Itsui, Y.Sakamoto, N.; Kurosaki, M.; Kanazawa, N.;

Tanabe, Y.; Koyama, T.;Takeda,Y.Nakagawa, M. et al., 2006; Itsui, Y. et al., 2009) fest-

stellen. Hinzu kommen antibakterielle Effekte gegen Chlamydien (Tietzel et al., 2009)

und das Auftreten von hGBP1 als sekretiertes Protein bei bakterieller Menningitis

(Naschberger et al., 2006). Es konnte ferner gezeigt werden, dass hGBP1 als Mediator bei

der inhibitorischen Wirkung von inflammatorischen Cytokinen auf die Aktivität von

Endothelzellen fungiert (Guenzi et al., 2001) und dass dafür nur bestimmte Domänen von

hGBP1 nötig sind. Darüber hinaus setzt die Inhibierung der so genannten Matrix-Metallo-

Protease und die damit einhergehende Unterdrückung der Angiogenese (Kapillarwachs-

tum) von Endothelzellen die Hydrolyseaktivität von hGBP1 voraus (Guenzi et al., 2003).

Als Biomarker von Darmkrebs (kolorektalem Karzinom) konnte ebenfalls hGBP1 etab-

liert werden. Die Überexpression des Proteins führt dabei zu einer erhöhten Überlebens-

rate (Naschberger et al., 2008). Weiterführende Studien zielen nun darauf ab, wie diese

Erhöhung der Überlebensrate zustande kommt und ob hGBP1 als direkter Vermittler oder

indirekt über andere Effektoren fungiert. Über die Lokalisation von hGBP1 innerhalb der

Zelle ließ sich bis dato die Feststellung machen, dass nach Induktion durch Interferon γ

eine granuläre Verteilung im Cytosol beobachtbar ist (Lubeseder-Martellato et al., 2002).

Die Überführung von hGBP1 in den Übergangszustand, also GDP gebundenen Zustand,

mittels Aluminiumfluorid führt jedoch zu einer Verlagerung an den Golgi-Apparat, eine


34

Zellorganell, das für die Exozytose eine entscheidende Rolle spielt und aus einem Stapel

von flachen membranumschlossenen Zisternen besteht. Dafür ist eine Farnesylierung von

hGBP1 an seiner CaaX-Box erforderlich (Modiano et al., 2005; Tripal et al., 2007). Da

die Kristallstruktur für das monomere hGBP1 gelöst werden konnte (Prakash, Praefcke et

al., 2000), lässt sich die Struktur äußerst detailliert beschreiben. HGBP1 ist ein Protein

mit einer molekularen Masse von 67 kDa und weist eine längliche Struktur auf, die dieses

Protein besonders interessant für rasterkraftmikroskopische Untersuchungen macht, die in

dieser Arbeit durchgeführt wurden. Da sich Länge (130 Å) und Breite (ca. 30 bis 40 Å)

deutlich unterscheiden, lassen sich anhand von Höhenprofilen an einer über

Mikrokontaktstempeln lateral strukturierten SAM-Oberfläche Aussagen über die Orien-

tierung des hGBP1 auf der Oberfläche machen.

Abbildung 2-14: Kristallstruktur von hGBP1 full length im nukleotidfreien Zustand. Die

GTPase-Domäne (LG-Domäne, blau) ist direkt mit der Mitteldomäne (orange) verbunden, die

sich um 90 Å von der LG-Domäne entfernt. Die GTPase-Effektor-Domäne (GED) ist in grün

dargestellt und erstreckt sich 120 Å in Richtung der LG-Domäne. Das Farnesylierungsmotiv be-

findet sich innerhalb der CaaX-Box und befähigt das hGBP1 zur Membranassoziation.

Auch für hGBP1 findet man die für die Mitglieder der Dynamin-Familie bekannte Domä-

nenstruktur aus großer GTPase Domäne, Mitteldomäne und GTPase-Effektor-Domäne

mit C-terminaler CaaX-Box (589

CTIS592

), die auch in Ras zu finden ist und als Erken-

nungssequenz für Isoprenylierung dient. Die Membranassoziation kann nur im

isoprenylierten Zustand erfolgen (Der /Cox, 1991; Kato et al., 1992; Modiano et al., 2005;

Wright /Philips, 2006). Die längliche Struktur des hGBP1 ergibt sich daraus, dass sich die

Mitteldomäne ca. 90 Å von der GTPase-Domäne entfernt. Gleichzeitig erstreckt sich die

GTPase-Effektor-Domäne über eine Länge von 120 Å wieder in Richtung GTPase-Do-

mäne zurück, wobei die Vermittlung über zwei Drei-Helix-Bündel der Mitteldomäne er-

folgt (Prakash, Praefcke et al., 2000). Bis auf einige Insertionen entspricht die GTPase-

Domäne von hGBP1 der minimalen GTPase-Domäne von Ras mit den typischen konser-


35

vierten Nukleotidbindungsmotiven. Kleinere Unterschiede ergeben sich beim Erken-

nungsmotiv für die Guaninbase und ihre Positionierung in der Nukleotibindungstasche

(Praefcke et al., 1999; Prakash, Renault et al., 2000).

Wie bereits für Dynamin und die Mitglieder der Dynamin Superfamilie beschrieben, bil-

det hGBP1 nukleotidabhängig ebenfalls Oligomere (Dimere und Tetramere; (Prakash,

Renault et al., 2000; Praefcke et al., 2004)) und zeigt kooperative Hydrolyse, also

enzymatische Aktivität, (Kunzelmann et al., 2005), die es möglich macht, die Beibehal-

tung dieser Aktivität nach Immobilisierung auf einer SAM-Oberfläche nachzuweisen und

Rückschlüsse auf mögliche Denaturierung zulässt. Nur im dimerisierten Zustand erreicht

die katalytische Aktivität ein Maximum. Gegenüber der im monomeren Zustand nach-

weisbaren Basalaktivität steigert die Dimerisierung die GTP-Hydrolyserate um das 20-

fache (Kunzelmann et al., 2005). Die Dimerisierung über die GTPase-Domänen, die rönt-

genkristallographisch gelöst werden konnte (Ghosh et al., 2006) wird über GppNHp, ein

nicht hydrolysierbares GTP-Analog, vermittelt. Daraus ließ sich ein mögliches Modell für

die Dimerisierung vom vollständigen hGBP1 (full length) entwickeln.

Abbildung 2-15: Modell für das hGBP1-Dimer in Anwesenheit von GppNHp. Die Struktur

der dimerisierten GTPase-Domäne konnte durch das nicht hydrolysierbare GTP-Analog GppNHp

(rot) bestimmt werden. Die Modellierung des hGBP1-Dimers erfolgte über die Röntgenkristall-

struktur der dimerisierten GTPase-Domäne. Nachträglich wurden die helikalen Domänen (grün)

in die ermittelte Struktur eingefügt (Ghosh et al., 2006).

Eine Kristallstruktur des hGBP1 Dimers für zwei vollständige Proteine existiert bis heute

nicht, so dass auf indirektem Wege, wie in dieser Arbeit aufgezeigt, einen Zugang zu den

mechanistischen Eigenschaften der Dimerisierung, z. B. über die Untersuchung der

Kinetik, gesucht werden muss. Für die GTPase-Domänen im Komplex mit GDP und

Aluminiumfluorid konnte ebenfalls eine Kristallstruktur gelöst werden. Im GDP-


36

gebundenen Zustand ist hGBP1 in der Lage Tetramere auszubilden (Praefcke et al.,

2004).

Was hGBP1 von anderen Mitgliedern der Dynamin Superfamilie unterscheidet, ist zum

einen die Tatsache, dass es GTP, GDP und GMP mit gleicher Affinität bindet (Cheng et

al., 1983; Cheng et al., 1991) und dass es zum anderen GTP nicht nur zu GDP, sondern

auch weiter zu GMP umsetzt (Schwemmle /Staeheli, 1994; Praefcke et al., 1999;

Kunzelmann et al., 2006). Aufgrund dieser Besonderheit wollte man mehr über den

genauen Mechanismus der Hydrolysereaktion herausfinden. Das Lösen der

Kristallstrukturen von hGBP1 und der dimerisierten G-Domänen mit verschiedenen

Nukleotiden ermöglichte eine detaillierte Beschreibung dieses Vorgangs (Scheffzek et al.,

1997; Ghosh et al., 2006; Kunzelmann et al., 2006).

2.9 Kurzdarstellung anderer verwendeter Proteine

Zur Überprüfung der Proteinresistenz der in dieser Arbeit hergestellten Peptidthiol-SAMs

wurden die Proteine Fibronektin, Rinderserumalbumin (BSA) und Fibrinogen verwendet.

Fibronektin ist ein heterodimeres, stabförmiges Glykoprotein der extrazellulären Matrix

und besteht zu 5 % aus Carbohydraten, die an membrangebundene Rezeptorproteine bin-

den. Auch die Bindung an andere Proteine der extrazellulären Matrix wie Collagen, Fib-

rin oder Heparansulfat konnte gezeigt werden. In seiner löslichen, über Disulfidbrücken

gebundenen Form (zwei Polypeptidketten (Monomere) von je 230 kDa) ist es auch im

Blutplasma zu finden. Ansonsten liegt es als unlösliches Glykoprotein-Dimer vor. Da es

in der Lage ist, Zellen mit der extrazellulären Matrix zu verbinden, hat es den Namen

„Zellkleber“ erhalten. Aufgrund seiner A-typischen stabförmigen Struktur, seiner hohen

molekularen Masse und seiner Funktion als Adhäsionsprotein eignet es sich besonders

gut zur Überprüfung der Proteinresistenz, zumal die Einbettung von Implantaten auch

über solche Proteine vermittelt wird. Das in dieser Arbeit verwendete Fibronektin wurde

direkt aus dem Blutplasma isoliert.

Fibrinogen ist ein hexamerer Proteinkomplex, bestehend aus je zwei α-, β- und γ-Unter-

einheiten. Die Untereinheiten sind über Disulfidbrücken so miteinander verbunden, dass

der Amino-Terminus aller Untereinheiten das Zentrum des Komplexes bildet, nämlich die

so genannte E-Domäne. Die einzelnen Monomere führen als Coiled-Coil-Struktur von

dieser Domäne weg. Mit Fibronektin kann es Heteropolymere ausbilden. Fibrinogen liegt

im Blutplasma vor und wird bei Blutgerinnung in Fibrin umgewandelt. Außerdem fun-


37

giert es als Kofaktor bei der Blutgerinnung, weist also ebenfalls sehr „klebrige“

Eigenschaften auf, die es zu einem „Härtetest“ für die Peptidthiole machen. Auch in

früheren Studien wurde Fibrinogen bereits verwendet (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt,

S., Grunze, M., 2003).

Im Gegensatz zu Fibrinogen und Fibronektin ist BSA ein globuläres Protein mit einem

Molekulargewicht von ca. 66 kDa. Albumine gehören zu den am häufigsten vorkommen-

den Proteinen im Blutplasma. Seine Hauptfunktionen bestehen in der Regulation des

Blutes, im Aufrechterhalten des kolloidosmotischen Drucks, in der Bindung von anorga-

nischen Ionen sowie im Transport von Fettsäuren, Steroidhormonen und Pharmaka.

Kapitel 3 Material und Methoden

38

3 Material und Methoden

3.1 Materialien für Oberflächenanalytik

3.1.1 Verwendete Substrate

Siliziumwafer mit [100] Orientierung Silchem Handelsgesellschaft mbH,

Freiberg

Glassubstrate (D263T Dünnglas) Schott AG,

3.1.2 Metalle für thermische Bedampfung im Vakuum

Titan 99,8 %; 6 mm Pellets ChemPur Feinchemikalien, Karlsruhe

Gold 99,99 %; 1-4 mm Granulat ChemPur Feinchemikalien, Karlsruhe

3.1.3 Puffer und Lösungsmittel

Milli-Q-Wasser

Deuteriumoxid 99,9 % Deutero GmbH; Kastellaun

Ethanol, technisch J.T. Baker, Deventer

Ethanol p.a., J.T. Baker, Deventer

Tris-DCl 10 mM Tris (pH 7,4)

Puffer C* 50 mM Tris, 5 mM MgCl2 (pH 7,9)

3.1.4 Thiolierte Reagenzien für Oberflächenmodifikation

n-Oktadekanthiol, 96 % Arcos, AC35498-0250

n-Dekanthiol, 96 % Arcos

11-Hydroxy-1-undecanthiol, 98 % Aldrich, 510467

Biotinyliertes Thiol Synthese: PD Dr. Andreas Terfort

(Universität Hamburg)

OEG(6)-Thiol Synthese: Dr. Wolfgang Eck (Uni

Heidelberg);

Prochimnia Surfaces Sopot (Polen)


39

3.1.5 Verwendete Proteine

Streptavidin, rekombinant aus E. coli Sigma S-0677

Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma A-7906

Fibronektin Sigma F-2006

Fibrinogen Sigma F-3879

3.2 Methoden für die Oberflächenanalytik

3.2.1 Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie

Bei der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (Surface Plasmon Resonance,

SPR) steht in erster Linie die Charakterisierung der Wechselwirkung zweier oder mehre-

rer Interaktionspartner hinsichtlich ihrer kinetischen und thermodynamischen Interakti-

onseigenschaften und der Spezifität der Bindung im Vordergrund. Das grundsätzliche

Prinzip beruht auf der Messung der so genannten Oberflächenplasmonenresonanz, eines

Phänomens, das aus der Totalreflexion von Licht an der Grenzfläche zwischen einem

Metall und einem Nichtleiter auftritt (Liedberg et al., 1995; Alves et al., 2005). In den

letzten Jahren hat sich diese Methode zu einer wichtigen Methode zum Nachweis von

vornehmlich biochemischen Reaktionen und Interaktionen zwischen Biomolekülen (An-

tigen-Antikörperreaktionen, etc.) entwickelt, aber findet auch intensiven Einsatz bei der

Analyse von Bindungseigenschaften verschiedener Arzneimittel und erleichtert somit das

Auffinden neuer Medikamente in der Pharmazeutischen Industrie immens. Die Vorzüge

der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie liegen hierbei darin begründet, dass

oberflächennahe Phänomene, zumeist Protein-Proteininteraktionen, zeitaufgelöst und

ohne weitere Markierungen der beteiligten Moleküle durch z. B Fluoreszenzfarbstoffe,

beobachtet werden können. Der Einsatz von Flusszellen ermöglicht zudem eine Untersu-

chung der Biomoleküle unter physiologischen (wässrigen) Bedingungen und bei optima-

ler Gleichgewichtseinstellung der Interaktion über die Regulierung der Flussrate. Auf-

grund dieser Vorzüge konnte sich eine Reihe von kommerziell erhältlichen SPR- Syste-

men (Firma Reichert, BIAcore etc.) in den letzten Jahren im Bereich der Biosensorik

etablieren.

Dass Oberflächenplasmonen als Lösung der Maxwell-Gleichungen dargestellt werden

können, wenn man stetige Randbedingungen annimmt, konnte schon sehr früh vorausge-


40

sagt werden (1909 Sommerfeld, 1941 Fano), doch die eigentliche praktische Umsetzung

dieser Berechnungen gelang erst in den 60er Jahren und fand in der Entwicklung der

ersten SPR-Geräte in den 90er Jahren seinen bisherigen Höhepunkt. Das damals entwi-

ckelte Konzept bildet bis heute die Grundlage der Oberflächenplasmonenspektroskopie

und soll im Folgenden aspektweise dargestellt werden.

In Metallen liegt aufgrund der Tatsache, dass die äußeren Valenzelektronen von Metallen

(Gold, Silber, Kupfer) durch die inneren, abgeschlossenen Schalen vom Kern stark abge-

schirmt sind, eine höhere Beweglichkeit der selbigen vor und sie können in ihrer Gesamt-

heit als Elektronengas modellhaft beschrieben werden. Bei diesem so genannten

Plasmakonzept werden die positiven Atomrümpfe vernachlässigt. Aus dieser höheren

Beweglichkeit der Elektronen resultieren oszillierende Fluktuationen der Ladungsdichte,

die sich in Form elektromagnetischer Wellen (Plasmonen) ausbreiten. Grundsätzlich

werden zwei Arten von Plasmonen unterschieden, die je nach ihrer Lokalisation,

entweder parallel zur Grenzfläche (Oberflächenplasmonen) oder im Inneren des Metalls

(Volumenplasmonen), unterschieden werden können. Volumenplasmonen sind hierbei

Longitudinalwellen und Oberflächenplasmonen Transversalwellen, die sich entlang der

Grenzfläche zwischen Metall und Dielektrikum ausbreiten. Die beiden Typen von

Plasmonen interferieren nicht miteinander. Die Quantenmechanik weist Licht einen

Teilchen- und Wellencharakter zu (Welle-Teilchen-Dualismus), so dass Oberflächenplas-

monenwelle und Lichtwelle auch als Lichtteilchen (Photonen) beschrieben werden

können, was bei idealer Wechselwirkung (Interferenz) der beiden Wellen zufolge hat,

dass sowohl Energie als auch Impuls vollständig übertragen werden müssen. Dies setzt

eine Übereinstimmung des Wellenvektors und der Polarisation des Lichtes (p-

Polarisation) und der Oberflächenplasmonen voraus. Nur wenn das einfallende Licht p-

polarisiert ist, können über die zur Grenzfläche senkrechte Projektion des elektrischen

Feldes Schwingungen im Metallfilm angeregt werden. Im Normalfall ist eine direkte

Anregung der Oberflächenplasmonen mit Hilfe des monochromatischen, einfallenden

Lichtes nicht möglich, was aus der Betrachtung der Dispersionskurven der Plasmonen

und des Lichtes ersichtlich wird. Um eine Anregung zu erreichen, wird ein Prisma, der als

optischer Koppler fungiert, in den Strahlengang gebracht und sorgt durch seinen höheren

Brechungsindex im Vergleich zu Luft für eine Dämpfung der Lichtgeschwindigkeit und

folglich für eine Herabsetzung der Steigung der Lichtgeraden.


41

Abbildung 3-1: Darstellung der Dispersionskurven von Oberflächenplasmonen (OP) und

Volumenplasmonen (VP). Nur wenn die Lichtgerade durch ein Dielektrikum geschickt und so-

mit die Steigung herabgesenkt wird, entsteht ein Schnittpunkt mit der Dispersionskurve der Ober-

flächenplasmonen.

Die Dispersionskurven von Licht und Oberflächenplasmonen bilden somit einen

Schnittpunkt und die Voraussetzung für Resonanz ist geschaffen. Die gewählte

Anordnung von Lichtquelle, Prisma und angrenzender Metallschicht folgt der so

genannten Kretschmann-Raether-Konfiguration. Das Licht wird durch das Prisma direkt

auf einen dünnen Gold oder auch Silberfilm gelenkt, wodurch es an der Basis des Prismas

zur Totalreflexion kommt. Die an der Grenzschicht Glas-Metall entstehende evaneszente

Welle dringt in den Metallfilm ein und tritt mit den Oberflächenplasmonen an der

Grenzschicht Metall-Luft in Resonanz. Im Gegensatz dazu wird bei der Otto-

Konfiguration die evaneszente Welle über einen dünnen Luftspalt zur Metallfläche

geleitet und regt die Oberflächenplasmonen an. Aufgrund der leichteren experimentellen

Beherrschbarkeit der Kretschmann-Raether-Anordnung, hat sich diese weitgehend

durchgesetzt und kommt in den meisten kommerziell erhältlichen SPR-Spektrometern zur

Anwendung. Für beide Anordnungen gilt: In der Nähe des so genannten Oberflächenplas-

monenresonanzwinkels stimmt die Komponente des Wellenvektors des einfallenden

Lichtes entlang der Grenzfläche mit dem Wellenvektor der Oberflächenplasmonen

überein und es kommt zur Resonanz. Das Lichtfeld der einfallenden Welle ragt teilweise

in die benachbarte Metallschicht bzw. Metallschicht mit adsorbierter dielektrischer

Schicht hinein (evaneszente Welle), was aus den Stetigkeitsbedingungen für das


42

elektromagnetische Feld resultiert, und sorgt für eine Energieübertragung auf die frei

beweglichen Elektronen im Metallfilm, die zu schwingen beginnen (Plasmonen).

Abbildung 3-2: Messkonfiguration für Oberflächenplasmonen nach Raether und

Kretschmann. Das p-polarisierte Licht tritt in das Prisma ein und wird direkt auf die an der Basis

angrenzende Goldschicht gelenkt, so dass der Lichtstrahl total reflektiert wird. Der Messwinkel Θ

entspricht nicht dem inneren Grenzflächenwinkel α, da der Lichtstrahl an den Seitenflächen des

Prismas gebrochen wird. Daher muss zunächst eine mathematische Relation hergestellt werden.

Abbildung 3-3: Optische Anregung der Oberflächenplasmonen. Im linken Bild wird der

einfallende Lichtstrahl direkt total reflektiert und eine Anregung der Oberflächenplasmonen

kommt nicht zustande. Im rechten Bild stimmen die Wellenvektoren des Lichtes kx und der

Oberflächenplasmonen (ksp) überein und die Energie und der Impuls können idealerweise

vollständig übertragen werden und die Bedingung für Resonanz ist somit erfüllt.

Ein großer Teil der Energie des Lichtes verbleibt in der Elektronenschwingung und die

Plasmonen lassen sich somit indirekt über eine abgeschwächte Totalreflexion

nachweisen. Im Reflektivitätswinkel Diagramm entsteht ein markantes Plasmonenreso-

nanzminimum, das von der Schichtdicke des Goldes, dem Brechungsindex des

Glasprismas und der Wellenlänge der verwendeten Lichtquelle (Laser oder Leuchtdiode)


43

abhängt. Die Schichtdicke des Goldes wird so klein gewählt, dass sie im Vergleich zur

Wellenlänge des Lasers oder der Leuchtdiode (in unserem Fall 780 nm) keinen Einfluss

auf den Verlauf des Lichtstrahls an der Grenzfläche Glas-Gold hat und somit die Lage des

Resonanzminimums kaum beeinflusst. Bei Aufbringung einer dielektrischen Schicht

(Thiol) auf die Metallschicht, die eine Oberflächenreaktion zur Folge hat, verändert sich

der Brechungsindex in der Nähe der Oberfläche und der Resonanzwinkel wird zu höheren

Winkeln verschoben. Die daraus resultierende Dispersionskurve ist gegenüber dem Fall

einer unbeschichteten Metalloberfläche etwas weiter herabgesenkt.

Abbildung 3-4: Veränderungen der Dispersionskurve der Oberflächenplasmonen nach Auf-

bringung einer Molekülschicht. Die Kurve wird herabgesenkt, was gemäß der Definition des

Wellenvektors zu einer Verschiebung des Resonanzminimums zu größeren Winkelwerten führt.

Bei den Thiolen kommt die Absenkung der Dispersionskurve auch dadurch zustande,

dass durch die Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen Schwefel und Gold eine

drastische Veränderung der elektronischen Struktur der Metalloberfläche resultiert, was

sich aus folgendem Zusammenhang ergibt:

n ( 1)

Für Kinetikmessungen erfolgt die Auftragung des Resonanzminimums gegen die Zeit.

Der fixe Winkel wird so gewählt, dass er sich etwa ein Drittel vom Minimum entfernt im

linken Ast der Kurve befindet, da dieser steiler ist als der rechte und somit eine höhere

Messempfindlichkeit erzielt werden kann. Durch Verschiebung der Resonanzkurve bei


44

Bindung von Molekülen an die Oberfläche kann direkt die Intensitätsänderung zeitauf-

gelöst gemessen werden.

Abbildung 3-5: Plasmonenresonanzkurven für zwei verschiedene Zeitpunkte T1 und T2

(links) und die Auftragung des Oberflächenplasmonenresonanzwinkels gegen die Zeit

(rechts). Die Kurve im rechten Bild beschreibt die typische Oberflächenadsorptionskinetik eines

Proteins

Die dabei entstehende Adsorptionskinetik kann genutzt werden, um molare Massen oder

molare Verhältnisse bei Mehrschichtensystemen zu berechnen, da zwischen Verschie-

bung des Plasmonenresonanzminimums und der Masse der angelagerten Moleküle (Pro-

teine) ein proportionaler Zusammenhang besteht. Ein entscheidender Vorteil der Oberflä-

chenplasmonenresonanzspektroskopie bei Untersuchung von Protein-Protein-Interaktio-

nen besteht zudem darin, dass keine Markermoleküle, z. B. Fluoreszenzlabel, an die zu

untersuchenden Moleküle gebunden werden müssen, um eine Adsorption in Echtzeit ver-

folgen zu können.

3.2.1.1 Metallisierung der Substrate für die SPR-Messungen

Die vorgefertigten Glaswafer (D263T) der Firma Schott AG mit den Dimensionen

12 x12x0,9 mm wurden vor der Bedampfung mit absolutem Ethanol (Reidel de Haën)

gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Der für die Beschichtung verwendete Me-

tallverdampfer stammt von der Firma Leybold Inficon und ist vom Typ XTC/2. Etwa 20

bis 25 Glassubstrate konnten pro Bedampfungsvorgang auf eine Metallscheibe mittels

Haftaufklebern befestigt werden. Hierbei musste darauf geachtet werden, dass nur ein

kleiner Bereich des Glaswafers mit dem Kleber bedeckt wird, damit bei der späteren Ent-


45

fernung des Wafers keine Rückstände des Klebers am Glas zurückbleiben. Da die

Glasscheiben während des Bedampfungsvorganges nach unten zeigten, war es

gleichzeitig notwendig, die Fixierung mit dem Kleber so vorzunehmen, dass die Scheiben

sich nicht von der Metallscheibe lösen konnten. Trotz kleiner Kleberkontaktfläche eine

möglichst hohe und stabile Fixierung der Glaswafer zu schaffen, stellte eine besondere

Herausforderung dar, die außerordentlich sorgfältig durchgeführt werden musste. Da es

sich bei SPR um eine optische Methode handelt, sind saubere und homogene Glas bzw.

Goldsubstrate absolute Voraussetzung. Zunächst wurde als Haftvermittler eine

Titanschicht von 12 Å auf das Glas mit einer Rate von 1 Ås-1

aufgedampft, gefolgt von

einer 485 Å dicken Goldlage (Bedampfungsrate: 15 Ås-1

). Die Bedampfung wurde bei

einem Druck von ca. 10-7

bar und Raumtemperatur durchgeführt. Die Aufbewahrung der

Goldwafer erfolgte bis zu ihrem Gebrauch im Exsikator.

3.2.1.2 Präparation der SAMs

Die mit Gold beschichteten Goldwafer wurden vor der SPR-Messung mehrfach mit

Ethanol gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Die Inkubation mit den jeweiligen

Thiolen erfolgte meistens (auf Abweichungen wird explizit im Ergebnisteil eingegangen)

in einer ethanolischen Lösung für 2-3 Stunden bis zu 24 Stunden. Die Konzentration der

Thiole wurde stets konstant bei 1 mM gehalten. Nach Inkubation wurden die Wafer wie-

derum mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Dann konnten die mit dem jeweiligen

SAM modifizierten Goldwafer in das SPR Gerät (Firma Reichert, Xantec (Düsseldorf))

eingesetzt werden.

3.2.1.3 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen zur Untersuchung verschiedener

hGBP1-Mutanten und ihres Dimerisierungsverhalten

Das System für die SPR-Messungen besteht aus einem Autosampler, einer Pumpe und

einem Spektrometer (alle von der Firma Reichert, Inc. Walden Avenue, Depew, NY).

Über eine Flusszelle kann die Probe auf die Chip-Oberfläche aufgetragen werden und

anschließend die nicht adsorbierten Moleküle mithilfe eines Puffers entfernt werden. Die

Zeiträume der Assoziations- und Dissoziationsphasen können PC-gesteuert festgelegt


46

werden. Über den Autosampler werden die vorbereiteten Proben automatisch in ge-

wünschter Reihenfolge über den Chip geleitet.

Während die Protein-Probe über den Chip geleitet wird, kann die Änderung des Bre-

chungsindex des Systems und somit die Änderung des Resonanzwinkels im Messprog-

ramm in Echtzeit verfolgt werden. Die Änderung des reflektierten Lichtes bei einem fi-

xierten Einfallswinkel wird in der Resonanzeinheit µRIU (Refractive Index Units)

angegeben und gegen die Zeit aufgetragen. Der nicht adsorbierte Anteil des Proteins wird

mit Hilfe eines konstanten Pufferflusses vom Chip entfernt. Beginnt das Protein von der

Oberfläche zu dissoziieren, kann dies ebenfalls am Bildschirm beobachtet werden, da

eine Verschiebung des Plasmonenresonanzminimums proportional zur Masse der angela-

gerten Proteine ist. Die Masse der adsorbierten Proteine ergibt sich aus der Resonanzein-

heit des SPR-Signals. Indem die Veränderung des Minimums an Lichtreflexion über

einen gewissen Zeitraum gemessen wird, kann auf die Veränderung des Brechungsindex

RI (refractive index; besitzt keine Einheit) geschlossen werden. Ein ΔRI von 1x10-6

entspricht einer adsorbierten Proteinmasse von 1 pg/mm² (0,1 ng/cm²) auf der

Chipoberfläche und dies wiederum wird definiert als 1,6145 µRIU bzw. 1 RU (response

unit) im Biacore System. Im verwendeten SPR-System der Firma Reichert gelten

folgende Werte:

1 µRIU = 0,05946 ng/cm².

Die Umrechnung für das Biacore System erfolgt nach der folgenden Vorgehensweise:

1 RU = 1,6145 µRIU

ng/cm ² 0,059460,0961,6145

µRIU 1

Für die SPR-Messungen wurden die mit Gold bedampften Goldwafer mit Ethanol von

Verunreinigungen befreit und mit Stickstoff getrocknet. Danach wurden die Wafer mit

einer Lösung aus 10 % Biotinthiol und 90 % Merkaptoundekanol für ca. 3 Stunden bei

Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die Wafer erneut mit Ethanol gereinigt und in einem

Stickstoffstrom getrocknet worden waren, konnten sie in die Messkammer des Spektro-

meters eingebaut werden. Dafür wurde das Prisma mit einem Tropfen Immersionsöl be-

deckt und der Wafer mit einer Pinzette vorsichtig in die Messzelle gelegt. Das Immer-

sionsöl sorgte für luftfreie Messbedingungen, da der Einschluss von Luft zu fehlerhaften

Messungen führen würde. Der Goldwafer wird durch die Messzelle in zwei Halbzellen


47

unterteilt. Dadurch kann eine Halbzelle als Referenz dienen, während die andere

Halbzelle als eigentliche Messzelle fungiert.

Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Beide Halbzellen wurden

zunächst durch einen konstanten Pufferstrom (Flussrate: 5 µl/min) mit Puffer C* (50 mM

Tris-HCl (pH 7,9), 5 mM MgCl2) äquilibriert, bis eine konstante Basislinie beobachtet

werden konnte. Durch beide Halbzellen wurde für 20 Minuten eine 0,4 µM Streptavidin-

Lösung (gleicher Puffer) geleitet. In der Referenzzelle wurden anschließend 5 µM hGBP1

ohne Biotinanker in Anwesenheit von 50 µM GppNHp über die mit Streptavidin

terminierte Oberfläche für 45 Minuten gegeben. Über die Messzelle wurden zunächst die

biotinylierten Mutanten von hGBP1 in einer Endkonzentration von 1 µM geschickt. Um

das Dimerisierungsverhalten von hGBP1 analysieren zu können, wurde darauf folgend

die Messzelle mit einer Lösung aus 5 µM hGBP1 wt in Anwesenheit von 10 µM

GppNHp inkubiert. Auch diese beiden Inkubationsschritte erfolgten über einen Zeitraum

von 45 Minuten. Zwischen jedem Inkubationsschritt erfolgte eine Dissoziations- oder

Waschphase von mindestens 20 Minuten. Der für alle Proben verwendete Loop hatte ein

Volumen von 250 µl.

Die jeweiligen Proteinlösungen wurden in dem Probenhalter des Autosamplers vorgelegt.

Mit Hilfe der verwendeten Software konnte die Reihenfolge, die Flussrate und die Dauer

der Probeninkubation festgelegt werden. Der Autosampler sorgte für eine automatisierte

Probengabe und Injektion eines exakten Probenvolumens. Nach jedem Inkubationsschritt

wurde die Injektionsapparatur des Autosamplers dreimal mit Puffer C (ohne DTT) von

Probenrückständen gereinigt.

Das für die Inkubation verwendete Streptavidin ist kommerziell erhältlich (Invitrogen).

Alle hGBP1 Mutanten und hGBP1 wt full length wurden eigenständig präpariert

(Abschnitt 3.5.1).

3.2.1.4 Überprüfung der Proteinresistenz von Peptidthiolen

Die Inkubation der Goldwafer erfolgte für 24 Stunden in ethanolischer Lösung. Von je-

dem der folgenden Thiole wurde 1 mM vorgelegt: OEG-Thiol, Merkapto-undekan-1-ol

(OH-Thiol), Oktadekanthiol und Dekanthiol (CH3-Thiole) und das synthetisierte

Peptidthiol. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Volumen

des Loops betrug 100 µl. Über die Flusszelle wurden über einen Zeitraum von 15 Minu-


48

ten jeweils die Proteine BSA, Fibronektin und Fibrinogen in einer Konzentration von

1 mg/ml gegeben. Danach erfolgte eine Dissoziation von ca. 20 Minuten. Die

Waschphase wurde abgebrochen, wenn vorher ein Plateauwert erreicht war.

Die Proteinresistenz des Peptidthiols wurde nicht nur auf Gold-, sondern auch auf

Silberwafern durchgeführt. Die Präparation der Silberwafer erfolgte nach derselben

Vorschrift wie bei den Goldwafern. Auch die Durchführung der SPR-Messungen wurde

nach der oben beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt.

3.2.2 Rasterkraftmikroskopie

Im Jahre 1981 wurde das Rastertunnelmikroskop (Scanning Tunneling Microscope,

STM), das die Untersuchung von Proben im atomaren Bereich ermöglicht, von Binnig

und Bohrer entwickelt. Da diese Methode auf der Entstehung des so genannten Tunnel-

stroms zwischen der zu untersuchenden Oberfläche und der Spitze des Hebelarms

(Cantilever), mit der die Probe abgerastert wird, beruht und somit ausschließlich auf

halbleitende und leitende Proben anwendbar ist, können biologische Proben nur dann un-

tersucht werden, wenn sie vorher mit leitenden Schichten von z. B. Kohlenstoff und Pla-

tin überzogen wurden. Da jedoch bei biologischen Proben, insbesondere Proteinen, die

Beibehaltung sämtlicher biomolekularer und struktureller Eigenschaften absolute Voraus-

setzung für die sinnvolle Anwendung biophysikalischer Methoden ist, erweist sich die

Herstellung der Leitfähigkeit mittels Beschichtung als absolut kontraproduktiv, da ein

Verlust dieser Eigenschaften in den meisten Fällen die Folge ist. Erst 1986 gelang es den

Wissenschaftlern Binnig, Gerber und Quate eine weitere Variante der Rastersonden-

mikroskopie zu entwickeln, die Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy,

AFM). Der Vorteil dieser Variante besteht darin, dass sie auch auf nicht leitende Oberflä-

chen übertragen werden kann. Mit Hilfe einer feinen Spitze wird die Probe, die auf einer

Piezokeramik befestigt ist und durch einen Piezoscanner in drei Raumrichtungen (x, y, z)

beweglich ist, abgetastet und dabei die direkte Kraft gemessen, die auf den schwingenden

Hebelarm wirkt, an dem die Spitze befestigt ist. Die Auslenkung des Cantilevers hängt

hierbei von der Topologie der Oberfläche ab. Der Lichtstrahl eines Lasers wird von der

Rückseite des Hebelarms reflektiert und auf eine Photodiode mit vier Quadranten gelenkt.

Je nach Bewegung der Spitze durch die Oberflächenbeschaffenheit der Probe trifft der


49

Lichtstrahl an anderen Positionen auf der Diode auf. Der Photostrom wird durch einen

I/U-Konverter in eine Spannung U umgewandelt.

Abbildung 3-6: Schematische Darstellung der wichtigsten Bauteile eines Rasterkraftmikro-

skops. Ein Rasterkraftmikroskop setzt sich im Allgemeinen aus einem Laser, einem Hebelarm

oder Cantilever mit einer Spitze, einem Vier-Quadranten-Detektor (Photodiode) und einem 3D-

Piezoscanner zusammen. Die Signalverarbeitung und Steuerung erfolgt über einen PC.

Die Viersegment-Diode ermöglicht es, sowohl die Auf- und Abbewegung als auch die

Torsion des Cantilevers zu registrieren. Es kommt dabei zu einem Spannungsunterschied

zwischen den beiden oberen und unteren Quadranten, die für die vertikale Bewegung des

Cantilevers steht und proportional zur Normalkraft ist, die auf die Spitze wirkt. Die

Spannung zwischen linken und rechten Feld ist dagegen proportional zur Lateralkraft und

steht für die Torsion. Das Differenzsignal lässt sich direkt in ein Höhenprofil umwandeln.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Auflagekraft des Cantilevers konstant zu

halten und dafür das piezokeramische Element über Rückkopplung nachzuregulieren. In

diesem Fall bewegt sich also die auf der Piezokeramik fixierte Probe gemäß ihrer

Oberflächentopographie und nicht der Cantilever selbst. Aus dem Steuersignal des Piezos

ergibt sich hierbei die Information zur Oberflächenbeschaffenheit. Auflösungsvermögen

bis hin in den atomaren Bereich sind bei dieser Technik realisierbar. Für die

Rasterkraftmikroskopie kann man verschiedene Faktoren formulieren, die entscheidend

die Auflösung des Mikroskops beeinflussen. Hier ist zum einen das Material zu

benennen, aus dem die Spitze besteht, zum anderen die Härte des Cantilevers, an dem


50

Spitze befestigt ist und die über die so genannte Elastizitäts-Kraft-Konstante K für ver-

schiedene Canitlever ermittelt werden kann.

3

3

4

Eh bK

l

(2)

E = Elastizitätsmodul; h = Dicke des Cantilevers; b = Breite des Hebelarms; l = Länge des Hebel-

arms

Die Elastizitäts-Kraft-Konstanten variieren in Bereichen von 0,01 und 50 N/m. Auch die

Beschaffenheit der Probe muss an dieser Stelle hervorgehoben werden, denn insbeson-

dere für biologische Probe, z. B. Proteine, gilt, dass sie gegenüber zu hohen Kräften sehr

druckempfindlich sind und man Gefahr läuft, die Probe beim Abrastern zu zerstören. Die

Strukturen von Proteinen oder Proteinkomplexen werden darüber hinaus durch relativ

schwache Wechselwirkungen zusammengehalten und der direkte, ständige Kontakt der

Spitze des Cantilevers mit der Probe würde zwangsläufig dazu führen, dass das Protein an

der Spitze hängen bleibt. Aus diesen Gründen wird auf biologische Proben weitgehend

der so genannte Tapping-Modus angewandt, bei dem die Spitze die Oberfläche nur „an-

tippt“. Auf diese Weise können Scherkräfte eliminiert und vertikal wirkende Kräfte mi-

nimiert werden. Weiter unten folgt eine detailliertere Beschreibung der beim Raster-

kraftmikroskop vorhandenen Betriebsarten, insbesondere dem Tapping-Modus. Auch

äußere Störeinflüsse wie externe Schwingungen, Schall und Temperatur haben eine signi-

fikante Auswirkung auf das Auflösungsvermögen des Rasterkraftmikroskops. Deswegen

kommen schwingungsgedämpfte Tische und spezielle Abdeckungen für das Mikroskop

zum Einsatz. Im Falle von thermischer Drift ist es oft ratsam, die Probe in die Apparatur

einzubauen und dann einige Zeit zu warten, bis sich das thermische Gleichgewicht einge-

stellt hat.

3.2.2.1 Kontakt- und Tapping-Modus

Wie der Name schon sagt, hat im Kontaktmodus die Spitze des Cantilevers direkten

Kontakt mit der Oberfläche und rastert diese ab. Dabei kann entweder die Höhe des

Cantilevers konstant gehalten werden oder die Kraft, mit der der Cantilever die Probe

berührt. Die erste Variante kam in dieser Arbeit ausschließlich zum Einsatz. Wie bereits

erwähnt, lassen sich die erhaltenen Spannungswerte direkt in die Topographie der


51

Oberfläche umrechnen. Eine weitere Möglichkeit, die Oberfläche darzustellen, ist die

Bestimmung von Reibungskräften (friction forces). Wenn der Cantilever über die

Oberfläche rastert, entstehen im Kontakt-Modus Reibungskräfte, die in einer Torsion des

Cantilevers resultieren. Dies führt je nach Beschaffenheit der Probe hinsichtlich ihrer

Homogenität und Rauhigkeit und je nach Beschaffenheit der Cantilever-Spitze im Bezug

auf ihre Geometrie und das Material, aus dem sie besteht, zu unterschiedlichen Photoströ-

men und auf dem Detektor, der Vier-Quadranten-Photodiode, und folglich zu

unterschiedlichen Spannungswerten. Somit lassen sich über die Reibungskraftmikros-

kopie sogar zwei gleich hohe Adsorbate (z B. zwei Thiole mit unterschiedlichen

funktionellen Gruppen (OH- und CH3-), wenn die Reibungseigenschaften unterschiedlich

genug sind, direkt auf einer Oberfläche nebeneinander darstellen. Höhen- und

Reibungsmodus können parallel und völlig unabhängig voneinander angewandt werden.

Da jede Linie zweimal gemessen wird, kann zwischen einer Trace- („Hin“-bewegung)

und Retrace- („Zurück“-bewegung) Messung unterschieden werden. Somit lässt sich

Height und Friction jeweils bei der einen oder anderen Bewegungsrichtung des

Cantilevers anwenden. Da der Cantilever bei trace- und retrace-Scan in entgegengesetzte

Richtungen verdreht wird, erhält man im Reibungskraft-Modus invertierte Bilder. Die

Qualität der Reibungsbilder wird zudem durch den Scan-Winkel zwischen Spitze und

Probe beeinflusst, der im besten Fall 90° zum Cantilever verlaufen sollte, um auch kleine

Strukturen und Kanten besser abbilden zu können.

Generell ist der Kontakt-Modus für die in dieser Arbeit zu vermessenden Proteinmulti-

schichten nicht geeignet, da der direkte Kontakt der Spitze mit den Proteinen aufgrund

der wirkenden Scher- und Druckkräfte zwangsläufig dazu führt, dass die Proteine ihre

native Struktur verlieren oder dass sie sogar vollständig von der Oberfläche entfernt wer-

den. Selbst wenn die eigentliche Protein-Protein-Interaktion erhalten bleibt, ist die kor-

rekte Bestimmung von Höhenunterschieden nahezu unmöglich, da die Spitze, insbeson-

dere bei den nur durch relativ schwache Wechselwirkungen zusammengehaltenen Protei-

nen, beim direkten Kontakt mit der Oberfläche Verformungen hervorruft, die das Ergeb-

nis drastisch verfälschen. Da es in dieser Arbeit darauf ankam, verschiedene Protein-Pro-

tein-Interaktionen nachzuweisen und die gemessenen Höhenunterschiede mit vorhande-

nen Kristallstrukturen zu vergleichen, wurde auf den Tapping-Modus zurückgegriffen,

bei dem Scherkräfte eliminiert und vertikal wirkende Kräfte minimiert werden können, da

der direkte Kontakt auf ein leichtes, frequenzielles „Antippen“ der Oberfläche reduziert

wird. Mit anderen Worten die für diesen Modus verwendeten Spezial-Cantilever


52

(Tapping Mode Cantilever, TM-Cantilever) werden bei ihrer Eigenfrequenz ω0 (50 –

500 kHz) und der entsprechenden konstanten Amplitude zum Schwingen gebracht. Was

beim Tapping-Modus nun ausgenutzt wird, ist der direkte Zusammenhang zwischen Van-

der-Waals-Potential und dem Abstand zur Oberfläche und den darauf befindlichen

Strukturen. Solange der Cantilever unbeeinflusst vom Van-der-Waals-Potential ist, be-

stimmt die Federkonstante und die verwendete Anregungsenergie die Amplitude der

Schwingung desselbigen. Wenn die Distanz zur Oberfläche klein genug wird, werden die

Resonanzfrequenz und somit auch die Amplitude erniedrigt, da sich das Van-der-Waals-

Potential und Spitzenpotential nun überschneiden. Gemäß der Schwingungsfrequenz des

Cantilevers erfährt der in Richtung Photodiode reflektierte Lichtstrahl eine ständige Ab-

lenkung, was in einer Auf- und Ab- Bewegung des auf dem Detektor projizierten Licht-

flecks resultiert. Die Auslenkung ist ein Maß für die Amplitude, mit der der Cantilever

schwingt. Die Software ist nun in der Lage, die durch das Abrastern der Oberfläche vari-

ierende Auslenkung des Hebelarms mit einem vorgegebenen Soll-Wert zu vergleichen

und daraus eine Root-Mean-Square-Amplitude (RMS-Amplitude) zu ermitteln:

2 2

min max

2Amplitude

Signal SignalRMS

(3)

Dieser so genannte Amplitude Setpoint lässt sich vom Nutzer des Gerätes vor Beginn der

Messung einstellen und wird durch die Steuerung des piezokeramischen Elements in x-,

y-und z-Richtung über den bereits erwähnten Rückkopplungsmechanismus konstant ge-

halten. Der Sollwert sollte so gewählt werden, dass er nicht zu niedrig ist, da ansonsten

die Probe durch die zu fest aufgedrückte Spitze zerstört werden könnte, und auch nicht zu

hoch festgelegt wird, da daraus ein schwacher Kontakt zwischen Probe und Spitze resul-

tiert, der die Aufnahme der Oberflächentopographie kaum möglich macht. Im so ge-

nannten Phasenmodus ist es darüber hinaus möglich, die Phasenverschiebung gegenüber

der vorliegenden Phase bei der Schwingung des Cantilevers und der tatsächlichen Oszil-

lation des Hebelarms, beeinflusst durch unterschiedliche Oberflächeneigenschaften, wie

Reibung, Viskoelastizität usw., zu messen und dadurch eine lateral strukturierte Probe mit

z. B. zwei unterschiedlich terminierten Thiolen abzubilden. Was bei der Abbildung

ausgenutzt wird, ist der durch die Phasenverschiebung resultierende Phasenkontrast.

Exemplarisch ist in Abbildung 3-7 beispielhaft ein AFM-Bild dargestellt, bei welcher

eine lateral strukturierte Oberfläche nacheinander mit Streptavidin und


53

Meerrettichperoxidase inkubiert wurde. Da im Topographiemodus kein signifikanter

Höhenunterschied zwischen den verwendeten Thiolen gemessen werden konnte, wurde

das Bild im Phasenmodus aufgenommen. Die laterale Strukturierung ermöglicht die

Ermittlung von Höhenunterschieden zwischen den OEG-Thiol gefüllten und damit

proteinresistenten Stempelflächen und den Stegen.

Abbildung 3-7: Strukturierte SAM-Oberfläche vor und nach stufenweiser Adsorption

mehrerer Proteinschichten: A) Phasenbild einer Oberfläche mit unterschiedlichen

Thiolfunktionalisierungen: OEG(6)-Thiol (Quadrate, Stempelflächen) vs. Misch-SAM, bestehend

aus 10 % Biotinthiol und 90 % Merkaptoundekan-1-ol (Stege); B) Topographiebild nach Inkuba-

tion mit dem Protein Streptavidin, welches insgesamt vier Bindungstaschen für Biotin besitzt und

nach Inkubation im Bereich der Stege für einen Höhenanstieg sorgt; C) Topographiebild nach

Immobilisierung der biotinylierten Meerrettichperoxidase (bHRP) an Streptavidin, was einen

signifikanten Höhenanstieg gegenüber reinem Streptavidin zufolge hat (B2 und C2).

Die ermittelten Höhen können dann mit den durch Kristallstrukturen bekannten Dimensi-

onen der verwandten Proteine verglichen und Rückschlüsse auf ihre möglichen Orientie-

rungen an der Oberfläche gezogen werden.

3.2.2.2 Nanoshaving und Nanografting

Neben dem Mikrokontaktstempeln (Micro-Contact Printing, µCP) gibt es noch eine an-

dere Möglichkeit, lateral strukturierte Oberflächen herzustellen. Hierzu wird die Kraft,

mit der der Cantilever über die Oberfläche rastert, soweit erhöht, dass es möglich wird,

einzelne oder mehrere molekulare Schichten lokal herauszukratzen (Nanoshaving) und

die frei gekratzte Stelle gleichzeitig mit anderen Molekülen wieder aufzufüllen (Nano-

grafting). Da sich die neu eingebauten Moleküle deutlich vom Untergrund unterscheiden,

werden sie als Nanostruktur im topographischen Bild sichtbar. Beispielsweise bietet diese


54

Methode die Möglichkeit, Alkylthiole von einer Goldoberfläche vollständig zu entfernen

und die dadurch entstehende „eingravierte“ Struktur, im einfachsten Fall ein rechteckiges

oder quadratisches „Loch“, direkt wieder durch Beigabe eines anderen Alkylthiols aufzu-

füllen. Wenn sich die beiden Thiole in ihrer Länge signifikant unterscheiden, ist ein topo-

graphisches Bild ausreichend, um zwischen den beiden Thiole differenzieren zu können.

Ansonsten gibt auch ein Phasenbild oder im Kontaktmodus ein Reibungsbild Informatio-

nen über die unterschiedlichen Moleküle.

Abbildung 3-8: Strukturierung von SAM beschichteten Goldoberflächen mit dem AFM:

Nanoshaving und Nanografting. Nanoshaving (links) beschreibt das lokale Herauskratzen des

an der Oberfläche gebundenen Materials, dem Nanografting (rechts) geht ebenfalls das Shaving

der Oberfläche voraus, nur wird hier die frei gekratzte Fläche direkt wieder mit anderen Molekü-

len wieder aufgefüllt. Beispielhaft sei hier das Nanoshaving eines Thiols und den Austausch

durch ein anderes Thiol gezeigt (zur Verfügung gestellt von Tatjana Ladnorg, KIT Karlsruhe).

Die Anzahl der durch das Nanoshaving entstandenen Areale kann beliebig erweitert

werden und jedes Mal mit anderen Thiolen aufgefüllt werden, so dass auf der Oberfläche

eine Vielzahl von unterscheidbaren Bereichen entsteht, die mit dem Rasterkraftmikroskop

nachgewiesen werden können. In dieser Arbeit wird das Nanoshaving zum Nachweis von

Protein-Protein-Interaktionen auf einer mit Biotinthiol beschichteten Goldoberfläche

eingesetzt. Da die Kristallstrukturen der hierbei verwendeten Proteine (Streptavidin,

hGBP1) bekannt sind, lassen sich anhand der gemessenen Oberflächentopographie und


55

der daraus ermittelten Höhenprofile Rückschlüsse auf die Orientierung der Biomoleküle

auf der Oberfläche ziehen.

Um auszuschließen, dass der Cantilever bei der „Oberflächenrasur“ nicht nur das

biologische Material und den SAM, sondern womöglich auch noch ein Teil des Goldes

von der Oberfläche kratzt, werden die gemessenen Höhenprofile mit Oberflächen

verglichen, die über Mikrokontaktstempeln strukturiert wurden. Die Stempelflächen

werden mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol aufgefüllt, um eine definierte Höhe null

festzulegen. Danach füllt man die Stege nacheinander mit Biotinthiol, Streptavidin und

biotinyliertem hGBP1. Auch die Dimerisierung mit einem weiteren Molekül hGBP1 wird

über die Messung des Höhenprofils nachgewiesen. Durch den Vergleich mit dem

Mikrokontaktstempeln soll das Nanoshaving als potenzielle alternative Methode zur

lateralen Strukturierung von Oberflächen und Ermittlung von Höhenprofilen in dieser

Arbeit etabliert werden.

3.2.2.3 Mikrokontaktstempeln

Das Mikrokontaktstempeln ermöglicht die Herstellung lateral strukturierter Oberflächen

durch die Aufbringung bestimmter Moleküle mittels eines Polymerstempels, der in unse-

rem Fall aus Polydimethylsiloxan (PDMS (Dow corning; Sylgard 184)) besteht. Da sich

Alkanthiole auf Goldsubstraten spontan zu selbstordnenden Monolagen formen, bilden

sie, wenn der mit dem gewünschten Thiol beladene Stempel sanft auf das Gold gedrückt

wird, ausschließlich im Bereich der Stempelfläche eine einzelne Molekülschicht aus.

Hinzu kommt, dass das PDMS nicht mit den aufzustempelnden Substanzen reagiert und

aufgrund seiner hohen Elastizität eventuelle Rauhigkeiten auf dem Goldsubstrat auszu-

gleichen vermag. Die Thiolmoleküle können in das PDMS hineindiffundieren und errei-

chen nach Trocknung des Stempels auch umgekehrt über denselben Vorgang die Gold-

oberfläche. Um eine Strukturierung der Goldsubstrate mit hoher Qualität zu erreichen, ist

höchste Sorgfalt bei der Herstellung des Stempels geboten. Durch Abgießen von mikro-

strukturierten „Masterobjekten“ können PDMS-Stempel mit hoher Präzision hergestellt

werden. Eine mit einem gängigen Zeichenprogramm erstellte Vorlage (Maske) wird

hierzu auf Chrom (Strukuren < 20 µm) oder eine Polymerfolie (> 20 µm) übertragen.

Durch diese Maske wird ein Siliziumwafer, der zuvor mittels Spin-Coating mit einem

Photolack beschichtet wurde, mit UV-Licht bestrahlt. Nach Entwicklung des Wafers


56

bleibt, abhängig vom Photolack, der bestrahlte oder nicht bestrahlte Bereich des Wafers

als Struktur zurück. Nun erfolgt das bereits erwähnte Übergießen des Masters mit dem

PDMS. Nach Aushärtung des PDMS wird die Masterschablone nach Silanisierung zur

besseren und zerstörungsfreien Abtrennung vom fertigen Stempel abgelöst

Abbildung 3-9: Mikrokontaktstempeln eines Thiols auf einem Goldsubstrat. Zunächst wird

der PDMS-Stempel mit dem gewünschten Thiol beladen und dann auf den mit Gold beschichteten

Silizium- oder Glaswafer sanft aufgedrückt. Nach Entfernung des Stempels bleibt das Thiol in

den Stempelbereichen zurück und die Goldoberfläche zeigt eine laterale Strukturierung.

.Der fertig strukturierte Stempel wird nun für einige Minuten in die gewünschte

Thiollösung eingelegt oder mit ihr benetzt und nach Trocknung mittels Stickstoff auf

einen mit Gold beschichteten Siliziumwafer gesetzt. Die Ausbildung der Struktur erfolgt

meist schon nach 1 bis 2 Minuten und kann nach Wegätzen des restlichen Goldes mit

einem einfachen Lichtmikroskop überprüft werden. Ansonsten werden die nach dem

Stempelvorgang frei gebliebenen Bereiche der Oberfläche (Stege) mit anderen

gewünschten Thiolen und weiteren (Bio-)Molekülen aufgefüllt.

Als besondere Vorteile dieser Methode seien an dieser Stelle die hohe Langlebigkeit,

schnelle Reinigung durch kurze Behandlung im Ultraschallbad und leichte Verformbar-


57

keit der Stempel genannt, die auch die Strukturierung von unebenen und gewölbten Ober-

flächen erlaubt. Auch die Tatsache, dass die Herstellung der Stempel und das Stempeln

selbst nicht sehr kostenintensiv sind, hat zu einer Etablierung dieser Technik in der In-

dustrie geführt.

3.2.2.4 Experimenteller Teil

3.2.2.4.1 Metallisierung der Substrate für die AFM-Messungen

Für die Bedampfung wurden polierte Siliziumwafer mit einer [100]-Oberflächenterminie-

rung (Prolog Semicor LTD, Ukraine) verwendet und nach der Vorschrift zur Herstellung

der SPR-Goldwafer bedampft (Abschnitt 3.2.1.1). Vor der Bedampfung erfolgten einige

Waschvorgänge mit Aceton (Fluka) und Ethanol (Riedel de Haën). Die Aufdampfung von

ca. 80 Å Titan erfolgte bei einer Rate von bis zu 2 Ås-1

, gefolgt von 1200 Å Gold

(15 Ås-1

). Die Siliziumwafer wurden für die AFM-Messungen zu quadratischen

Bruchstücken von ca. 10 x 10 mm zurechtgeschnitten. Anschließend erfolgte die laterale

Strukturierung mittels Mikrokontaktstempeln oder über Nanoshaving.

3.2.2.4.2 Herstellung lateral strukturierter Oberflächen

1. Mikrokontaktstempeln

Die Herstellung des PDMS-Stempel wurde bereits beschrieben (Abschnitt 3.2.2.3). Für

die Messung von Schichtdicken verschiedener Proteinlagen sollte ein strukturierter Sili-

ziumwafer hergestellt werden, der aus 3 µm x 3 µm- Quadraten besteht. Die Abstände

zwischen den einzelnen Quadraten betrugen ebenfalls 3 µm (Stege). Für das Stempeln

wurde die Stempelfläche für ca. 1 Minute mit einer ethanolischen Lösung von 1 mM

OEG(6)-Thiol inkubiert. Danach wurde der Überstand der Lösung vorsichtig mit einem

fußelfreien Tuch entfernt und der Stempel im Stickstoffstrom getrocknet. Die struktu-

rierte und mit dem Thiol beladene Seite des Stempels wurde vorsichtig auf die Goldober-

fläche gedrückt. Nach ca. 90 s wurde der Stempel wieder entfernt. Die Goldoberfläche

wurde nach gründlichem Waschen mit absolutem Ethanol und Trocknen im Stickstoff-

strom mit einer 1mM ethanolischen Lösung von 10 % Biotinthiol und 90 % Merkapto-

undekanol inkubiert. Nach ca. 5 min wurde wiederum mit Ethanol gewaschen und darauf

geachtet, dass der Wafer nun vollständig trocken war. Dann folgten weitere Inkubations-


58

schritte mit 0,4 µM Streptavidin und 1 µM biotinyliertes hGBP1 sowie 5 µM hGBP1

ohne Biotinanker mit 50 µM GppNHp. Die Inkubation erfolgte bei jedem Schritt über 20

min. Zwischen den Behandlungen mit den jeweiligen Proteinlösungen wurde die Oberflä-

che zwei bis drei Mal mit dem Puffer C* (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, pH 7,9), in

dem sich auch die Proteine befanden, gewaschen. Es war zu beachten, dass die

Oberfläche nicht trocken werden durfte, um eine Denaturierung der Proteine zu

vermeiden. Die Lagerung der Wafer erfolgte in einer mit Puffer C* und 5 µM hGBP1

ohne Anker und 50 µM GppNHp befüllten Petrischale. Das Protein und GppNHp wurden

deswegen in den Puffer gegeben, damit im Falle von möglicher Dissoziation der schwach

gebundenen hGBP1 wt-Moleküle an die immobilisierten hGBP1 Mutanten ständig

hGBP1 nachgeliefert und wieder neu binden kann.

2. Nanoshaving

Auch mittels Nanoshaving wurden Proteinmultilagen hinsichtlich ihrer Schichtdicken

untersucht und die erzielten Ergebnisse mit den über Mikrokontakstempeln ermittelten

Werten verglichen. Ein mit Gold beschichteter Siliziumwafer wurde nacheinander mit

dem im vorherigen Abschnitt bereits beschriebenen Misch-SAM, bestehend aus 10 %

Biotinthiol und 90 % Merkaptoundekanol, für ca. 5 Minuten inkubiert. Nach gründlichem

Waschen und Trocknen des Wafers im Stickstoffstrom wurde dieser nacheinander mit

Streptavidin (0,4 µM) und zwei biotinyliertem hGBP1-Mutanten (jeweils 1 µM) behan-

delt. Die Proteine wurden jeweils für ca. 20 Minuten auf der Oberfläche belassen und

dann 2- bis 3-mal mit Puffer (siehe Abschnitt 3.2.1.2) gewaschen. Die Strukturierung der

Goldoberfläche wurde erst nach Einbau des Wafers in das Rasterkraftmikroskop mit Hilfe

des Cantilevers durchgeführt. Die so genannte Drive Amplitude, also die Spannung des

Piezoelements und folglich die Kraft, mit der der Cantilever auf die Oberfläche drückt,

wurde auf ca. 150 mV gesetzt, was einer Erhöhung um das 3 bis 4fache der für die Auf-

nahme der Oberflächentopographie normalerweise eingesetzten Spannung entspricht

(Messparameter für die AFM-Aufnahmen siehe Tabelle 1). Auf diese Weise konnte ein

quadratisches Loch mit definierter Seitenlänge, die über die Software NanoScope

einstellbar war, in die Oberfläche gekratzt und abschließend die Höhendifferenz zwischen

ausgekratztem Bereich und dem Rest der abgerasterten Fläche (15 x 15 µm) ermittelt

werden. Die Auswertung der Oberflächentopographie erfolgte ebenfalls über NanoScope

sowie über die Software SPIP.


59

3. AFM-Messungen

Für alle Messungen mit Proteinen wurde der Tapping-Modus verwendet, um eine extreme

Verformung oder gar Zerstörung der auf dem Biotinthiol-SAM aufgebrachten Proteine,

also Streptavidin und hGBP1, zu vermeiden. Des Weiteren mussten die Proteinschichten

in Flüssigkeit (Abschnitt 3.1.3) abgerastert werden, um die native Struktur der Proteine

und damit ihre Aktivität aufrechtzuerhalten. Entweder wurde ein Tropfen des Puffers

direkt auf den Goldwafer gegeben, um somit eine vollständige Benetzung der Oberfläche

zu erreichen, oder eine Flüssigkeitszelle mit angebrachten Teflonschläuchen zur Bespü-

lung und zur Entfernung des Puffers wurde auf die Apparatur gesetzt. Bei allen Messun-

gen kam der Tapping-Cantilever vom Typ NP-20 zum Einsatz.

Die Auswahl des gewünschten Ortes auf der Oberfläche für das Scanning erfolgte durch

mechanische Positionierung der Probe relativ zur Spitze in zwei orthogonalen Richtun-

gen. Da die Spitze des Cantilevers selbst nicht zu sehen war, wurde die Oberseite des

Cantilevers zur Orientierung verwendet. Danach konnte der Laserstrahl justiert werden,

so dass er vollständig vom freien Ende des Cantilevers reflektiert wurde. Die Schwin-

gungsamplitude sollte maximal sein, um die größtmögliche Sensitivität zu erreichen. Der

reflektierte Laserstrahl sollte genau im Zentrum des Photodetektors auftreffen, so dass bei

der Abwesenheit einer Biegung des Cantilevers das Regelungssignal am Gerät genau null

ist. Über die Software Nanoscope konnten nun die Parameter für die Aufnahme der Bilder

festgelegt werden. Zunächst wurde mit Scan Range die Länge der Seite eines quadrati-

schen Rasters und somit die Größe des abgebildeten Bereichs der Probe festgelegt. Über

Scan angle konnte der Winkel, mit dem der Cantilever über die Oberfläche rastert,

bestimmt werden. Die Geschwindigkeit, mit der sich die Spitze über die Oberfläche be-

wegt, wurde über die Scan rate eingestellt. Die Geschwindigkeit sollte so klein sein, dass

das Regelungssystem der Topographie folgen kann, aber auch groß genug, um in realisti-

scher Zeit das gewünschte Bild zu erhalten. Der Wert des Z-Limit bestimmte effektiv die

Auflösung bzw. den Kontrast des Bildes, denn dort wurde festgelegt, wie hoch der Can-

tilever schwingen konnte. Über die Drive Amplitude wurde die Spannung des

Piezoelements und somit die Kraft, die auf die Oberfläche ausgeübt wird, gewählt. Die

beiden Parameter Proportional gain und Integral gain gaben die Sensitivität an, mit der

Höhen und Tiefen der Probe erkannt werden können. Über die Drive Frequency konnte

die Schwingungsfrequenz des Cantilevers festgelegt werden. Waren alle Werte überprüft

worden, erfolgte die automatische Spitzenannäherung. Während die Probe gescannt


60

wurde, mussten die Parameter des Regelungssystems immer wieder korrigiert werden, um

die Qualität des Bildes und die laterale Auflösung zu optimieren.

Tabelle 1: Parameter für rasterkraftmikroskopische Aufnahmen

Scan range 15 bis 20 µm, für Nanoshaving 3 bis 5 µm

Scan angle 0, 45 oder 90 °

Scan rate Überblickscan: 1,5 s-1

; Feinscan: <1 s-1

Z-limit 3 µm

Drive amplitude ca. 50 mV/ Nanoshaving: 150 mV

Proportional gain 3

Integral gain 0,5

Drive frequency 9,5 kHz

3.2.3 Infrarotspektroskopie/-mikroskopie

Die Grundlage der Infrarotspektroskopie basiert auf der Wechselwirkung der zu untersu-

chenden Probe mit dem eingestrahlten Licht. Durch Absorption werden in den Probemo-

lekülen Schwingungen angeregt und es erfolgt ein Übergang in einen angeregten Zustand.

Da eine direkte Proportionalität zwischen der Wechselwirkung elektromagnetischer

Strahlung und dem Dipolmoment des Moleküls besteht, wird Absorption und Emission

nur dann beobachtet, wenn sich das Dipolmoment ändert. Dabei entscheidet der atomare

Aufbau des Probenmoleküls darüber, welche charakteristischen Schwingungsbanden im

Strahlungspektrum entstehen. Aus diesem Grund ist die Infrarotspektroskopie die Me-

thode der Wahl, wenn es um eine einfache und schnelle Strukturaufklärung von organi-

schen Molekülen, einschließlich Peptiden und Proteinen, geht. Wie viele Schwingungen

die zu untersuchenden Molekülen ausführen kann, hängt von der Anzahl der Freiheits-

grade ab, die wiederum für lineare (3N-5) und gewinkelte Moleküle (3N-6) unterschied-

lich definiert sind. Man unterscheidet grundsätzlich zwischen so genannten Deformati-

ons- und Biegeschwingungen, bei denen die Veränderung des Dipolmomentes durch eine

Modifizierung der Bindungswinkel zustande kommt, und Streckschwingungen, die sich

aus der Veränderung der Bindungslängen ergeben. Außerdem hat die chemische Umge-

bung der Moleküle oder einzelner Bindungen einen großen Einfluss auf die

Schwingungsfrequenz. Die Kopplung mit anderen Molekülschwingungen, die reduzierten


61

Massen der beteiligten Atome, die Bindung zu Nachbaratomen und die Art der Bindung

(Kraftkonstante) sind entscheidende Faktoren, die in sehr sensitiver, aber auch selektiver

Art und Weise Einfluss auf die Verschiebung der Absorptionsbanden im Spektrum

nehmen.

Da in dieser Arbeit die Vibrationsspektren von selbst-assemblierenden Monolagen, Pep-

tidthiolen, an Goldoberflächen betrachtet werden sollen, muss neben den genannten Kri-

terien die Oberflächenauswahlregel beachtet werden. In der Nähe elektrisch leitender

Oberflächen, also auch Gold, können aufgrund der Tatsache, dass Feldkomponenten des

anregenden elektrischen Feldes, die parallel zur Oberfläche verlaufen, unterdrückt wer-

den, bestimmte Absorptionsbanden im Spektrum fehlen. Das einfallende p-polarisierte

Infrarotlicht lässt sich zur Erläuterung der Auswahlregel in einen tangentialen und nor-

malen Anteil aufspalten. Die parallel zur Oberfläche gerichtete Komponente verursacht

eine Verschiebung der im Gold frei beweglichen Elektronen parallel zur Oberfläche.

Durch die daraus resultierende Anhäufung von Elektronen und positiv geladenen Atom-

rümpfen entsteht an der Metalloberfläche ein elektrisches Feld, das dem äußeren Feld

entgegengesetzt gerichtet ist. Die Ladungsverschiebung erfolgt solange, bis das durch die

Polarisation erzeugte und äußere Feld gleich stark sind und sich folglich zu null addieren.

Die senkrecht zur Oberfläche gerichtete Feldkomponente, also der Normalteil, erfährt

eine Verstärkung, da das erzeugte Polarisationsfeld dem äußeren Feld gleichgerichtet ist

und sich zu diesem addiert. Vornehmlich werden also an einer leitenden Metalloberfläche

Molekülschwingungen mit einem zur Oberfläche senkrechten Übergangsdipolmonent

angeregt.

3.2.3.1 FT-IR Mikroskopie

In dieser Arbeit kommt neben der Infrarotspektroskopie auch die –mikroskopie zum Ein-

satz. Das dafür verwendete Mikroskop ist das Hyperion 3000/ Vertex 700 der Firma

Bruker. Monolagen auf Substraten, z. B. Gold, mit hohem Brechungsindex lassen sich

sowohl mit einem GIR- (Grazing Incidence Reflectance) als auch einem ATR-

(Attenuated Total Reflection)-Objektiv gut abbilden und analysieren. Zusätzlich wird mit

einem so genannten Streiflichtobjektiv gearbeitet, das den Lichtstrahl unter einem viel

flacheren Winkel als bei der direkten Transmission auf die Probe auftreffen lässt und so-

mit eine Analyse von sehr dünnen Schichten (Monolagen) erlaubt. Auf diese Weise er-


62

reicht man eine 25-fache Verstärkung gegenüber der Transmission und auch die Emp-

findlichkeit ist deutlich erhöht, da der Lichtstrahl die Probe zweimal passiert (Abbildung

3-10).

Abbildung 3-10: Strahlengang im Streiflichtobjektiv für IR/VIS (Bruker Optics)

Über die Veränderung der Polarisation lässt sich zusätzlich mit dem GIR-Objektiv festzu-

stellen, ob eine monomolekulare Schicht vorliegt, da in diesem Fall nur bei p-polarisier-

tem Licht die Absorptionsbanden zu sehen sind. Beide Objektive, sowohl ATR als auch

GIR, erlauben eine Analyse von Monolagen anhand ihrer Bandenstruktur, wobei die

Ortsauflösung und Empfindlichkeit bei der ATR-Technik deutlich erhöht ist. Bei

Schwingungen senkrecht zur Probenoberfläche kann ein Verstärkungsfaktor von bis zu

100 erreicht werden. Nachteil der ATR-Technik ist, dass nicht kontaktfrei gemessen wer-

den kann, was eine Veränderung oder sogar Zerstörung der Probe nicht gänzlich aus-

schließt. Um den Druck, mit dem die Probe berührt wird, kontrollieren zu können, sind

elektronische Drucksensoren am Objektiv angebracht. Die Messungen mit dem GIR-Ob-

jektiv können hingegen völlig kontaktfrei vonstatten gehen.

3.2.3.2 Infrarotspektroskopie an Proteinen

Neben gängigen Methoden zur Strukturaufklärung wie NMR, Röntgenstrukturanalyse

und Elektronenmikroskopie gewinnt auch die Infrarotspektroskopie bei der Aufklärung

biologischer Reaktionen und der Struktur von Biomolekülen zunehmend an Bedeutung,

da sie Informationen liefert, die mit den anderen Methoden nicht erhalten werden, und ein


63

Einsatz von Markern oder Sonden wie z. B. in der Fluoreszenz-Mikroskopie/

Spektroskopie vermieden werden kann. Aussagen über Struktur und Umgebung des

Proteinrückgrats sind ebenso möglich wie die Zugänglichkeit zu dynamischen Prozessen,

z.B. die Änderung von Bindungslängen und –geometrien während einer Proteinreaktion,

die Modifizierung chemischer Gruppen (Protonierung) oder Veränderungen der Ladungs-

dichte einer chemischen Bindung. Aufgrund der Vielzahl von möglichen Schwingungen

im Protein ist die Überlappung einzelner Banden im Schwingungsspektrum zu groß, um

die Beiträge einzelner Aminosäuren oder bestimmter Aminosäuregruppen unterscheiden

zu können. Darüber hinaus werden die C=O Moden des Peptids durch eine starke Was-

serbande bei 1650 cm-1

überlagert, die sich schon bei sehr geringen Schichtdicken von

gerade mal 10 µm aufgrund des hohen Wassergehaltes der Proben drastisch auf die

Transmission des eingestrahlten Lichtes (< 10 %) auswirkt. Da die C=O Valenzschwin-

gung der Carbonylpeptidgruppe zu mehr als 80 % zu der für die Sekundärstrukturanalyse

von Peptiden wichtigen Amid I-Bande beiträgt, wird zumeist in deuteriertem Wasser, also

D2O, und nicht H2O gemessen, da hier die C=O Mode nicht mit der Wasserbande

überlappt, was aus einer niederfrequenten Verschiebung um 450 cm-1

resultiert.

Insgesamt sorgt die Messung in deuteriertem Wasser zu einer Veränderung der Massen

der beteiligten Atome und der Schwingungsfrequenz und somit zu einer verschobenen

Lage der Absorptionsbanden, die wiederum abhängig von der Sekundärstruktur ist.

Während β-Schleife und β-Faltblatt bis zu 10 cm-1

zu niedrigeren Wellenzahlen verscho-

ben sind, zeigen alle anderen Strukturelemente nur eine Verschiebung um maximal

5 cm-1

. Die Amid II Bande bei ca. 1540 bis 1615 cm-1

, die zu 40 bis 60% N-H

Biegeschwingung, zu 18 bis 40% C-N Streckschwingung und zu ca. 10% (C-C)-Streck-

schwingung auf sich vereint, erfährt dagegen in D2O ein drastische Verschiebung um

etwa 100 cm-1

zu kleineren Wellenzahlen, da der Anteil an N-H Biegeschwingung völlig

verschwindet und die Lage der Amid II nur noch von der (C-N)-Steckschwingung

abhängt. Somit kann das Entstehen des Amid II Signals als Marker für einen

erfolgreichen H/D-Austausch betrachtet werden und ermöglicht zudem eine Kontrolle

über den erzielten Protonierungsgrad. Neben der Amid I und II Bande können einer

freien, planaren Peptidgruppe sieben weitere Schwingungsmoden zugeordnet werden, die

mit Amid A und B (bei ca. 3300 cm-1

bzw. 3100 cm-1

) und Amid III bis VII (Amid III:

1390 bis 1430 cm-1

; Amid IV; 620-640 cm-1

; Amid V: 530-580 cm-1

; Amid VI: 535-

606 cm-1

; Amid VII: ca. 200 cm-1

) bezeichnet werden. Während die oft sehr intensiven

Amid I und II Banden wichtige Informationen über die Sekundärstruktur eines Proteins


64

liefern, werden die Amid III bis VII Banden aufgrund ihrer Unempfindlichkeit gegenüber

strukturellen Veränderungen im Protein und ihrer sehr breiten Konturen, die eine

Auflösung in unterschiedliche Anteile zusätzlich erschweren, kaum berücksichtigt.

Abbildung 3-11: Amid I-Moden verschiedener Sekundärstrukturelemente (E. Goormaghtigh

et. al. (1994))

Die sehr starke Korrelation zwischen der Amid I Bande und der Struktur der zu

vermessenden Biomoleküle kommt dadurch zustande, dass zwischen den C=O

Schwingungen starke Veränderungen der Dipolwechselwirkungen entstehen, wenn die

Lage und Intensität der Bindungswinkel Φ und Θ und somit die exakte Geometrie des

Proteins modifiziert werden. Über Fourier-Selbstdekonvolution lässt sich die Amid I-

Bande in ihre überlappenden Bestandteile aufspalten, was eine anteilmäßige Bestimmung

der in dem zu untersuchenden Protein enthaltenen Sekundärstrukturelemente erlaubt.


3.2.3.3.1 Attenuated total reflection (ATR)-FT-IR-Messungen

Das für die ATR-FT-IR-Messungen verwendete Spektrometer stammte von der Firma

Bruker (Bruker Optics, Ettlingen) und hat die Typenbezeichnung IFS66. Eine vertikale

ATR-Multireflektionseinheit war dem Spektrometer angeschlossen. Das Internal

Reflection Element war ein trapezförmiger Germaniumkristall mit den Maßen 52 x 20 x 2

mm und einem Öffnungswinkel von 45 °, der zu 25 internen Reflexionen führt. Die Be-

dampfung des Germaniumkristalls erfolgte mit dem Metallbedampfer der Firma Leybold

Inficon (XTC/2). Die Durchführung wurde bereits im Abschnitt beschrieben. Die Dicke

der Titanschicht betrug 80 Å, die der Goldschicht 150 Å. Vor der Bedampfung wurde die


65

Kristalloberfläche mit einer Mischung von Methanol und Chloroform chemisch gereinigt

und dann gründlich abgespült. Es folgte ein kurzes Eintauchen des Kristalls in Schwefel-

säure, um den hydrophilen Charakter der Oberfläche zu erhalten. Danach wurde mit des-

tilliertem Wasser gespült und die Germaniumplatte im Stickstoffstrom getrocknet.

Für die Messungen wurden 150 µl einer 10 mM Peptidthiollösung (Puffer: 10 mM Tris-

DCl, pH 7,4; Einstellen des pH-Wertes mit DCl (2M) hergestellt und ca. 200 ml Laufpuf-

fer (gleiche Zusammensetzung) bereitgestellt. Nachdem der Kristall in die Apparatur ein-

gesetzt und mit dem Laufpuffer gespült worden war, konnte das Peptidthiol mit einer

Flussrate von 5 µl/min über die Oberfläche geleitet werden. Als Referenz wurde das Sig-

nal des reinen Germaniumkristalls mit Goldschicht verwendet. Über die Software OPUS

war es möglich, sowohl das IR-Spektrum auch während der laufenden Adsorption des

Peptidthiols zu betrachten als auch die Adsorptionskinetik zu verfolgen. Um sämtliche

unter der Amid I-Bande befindlichen Peaks zu identifizieren, wurden die 2. Ableitungen

der Spektren gebildet. Außerdem wurde über die von Goormaghtigh (1994) und Ollesch

(2006) beschriebene Kurvenanpassung eine Aufspaltung der Amid I-Bande in die durch

die Sekundärstrukturelemente hervorgerufenen unterschiedlichen Rückgratabsorptionen

vorgenommen.

3.2.3.3.2 Messungen am IR-Mikroskop

Das hier verwendete IR-Mikroskop (Hyperion 3000/ Vertex 70) wurde von der Firma

Bruker in Ettlingen zur Verfügung gestellt. Das Gerät war wahlweise mit einem 20fachen

ATR-Objektiv und einem 15fachen GIR-Objektiv ausgestattet. Die Messzeiten betrugen

in der Regel eine Minute (auf Abweichungen wird explizit hingewiesen). Die erreichbare

spektrale Auflösung lag bei 4cm-1

bei einem messbaren Spektralbereich von 600 bis

4000 cm-1

. Über einen Quecksilber-Cadmiumtellurid (MCT, Mercury-Cadmium-

Telluride)-Detektor wurde das Licht eingefangen und in ein Absorptionsspektrum über-

setzt. Über die Software OPUS wurde die Steuerung des Mikroskops vorgenommen. Für

die Aufnahmen wurden 10 x 10 mm Goldsiliziumwafer (Präparation siehe Abschnitt

3.2.2.4.1) vorbereitet, die in Peptidthiollösung (1 mM Peptidthiol gelöst in 10 mM Tris-

DCl (pH 7,4), pH Einstellung mit DCl (2M)) über ca. 24 Stunden bei Raumtemperatur

inkubiert worden waren. Parallel dazu wurde ein Wafer in Kalibrierlösung, bestehend aus

einem deuteriertem Thiol (1mM Hexadekanthiol in Ethanol, A. Tefort), inkubiert und als


66

Referenz eingesetzt. Am Mikroskop wurden verschiedene Messreihen durchgeführt, die

im Folgenden dargestellt sind.

3.2.3.3.3 Überprüfung der Peptidthiol-Monolage

Über den Einsatz des GIR-Objektives konnte die Polarisation des einfallenden Lichtes

verändert werden. Nur bei p-polarisiertem Licht sollte die Peptidthiollage anhand des

Bandenspektrums detektierbar sein, nicht aber bei s-Polarisation. Über diese Unterschei-

dung sollte festgestellt werden, ob es sich wirklich um eine monomolekulare

Peptidthiolschicht auf dem Goldwafer handelt. Hierzu wurde ein Goldwafer aus der

Peptidthiollösung mit einer Teflonpipette genommen, einige Male mit Puffer (10 mM

Tris, pH 7,4) gespült und mittels Stickstoffstrom getrocknet. Nach Fixierung auf dem

Objekttisch wurde der Wafer mit Licht unterschiedlicher Polarisation bestrahlt und zeit-

gleich jeweils ein Spektrum aufgenommen.

3.2.3.3.4 Einfluss von Trifluorethanol (TFE) auf die Sekundärstruktur des Peptidthiols

Der stabilisierende Einfluss von TFE auf insbesondere helikale Strukturen in Proteinen ist

bereits nachgewiesen worden (Sticht et al., 1994; Shiraki et al., 1995; Kentsis /Sosnick,

1998; Luo /Baldwin, 1998; Myers et al., 1998). Aus diesem Grund sollte in diesem Ver-

suchsteil der Einfluss von TFE auf das Peptidthiol ebenfalls untersucht werden. Dafür

waren die Peptidthiollösungen, in denen die Goldwafer über 24 Stunden eingelegt wur-

den, mit TFE angereichert. Die eingesetzten Konzentrationen betrugen 5%, 10%, 30%

und 50 % (alle v/v). Der Puffer (10 mM Tris-DCl in D2O (pH 7,4)) und die eingesetzte

Konzentration an Peptidthiol (1 mM) waren jeweils identisch. Zunächst wurde der Ein-

fluss der unterschiedlichen TFE-Konzentrationen nach Herausnahme der Wafer aus der

jeweiligen Lösung mit einer Teflonpipette und Trocknung im Stickstoffstrom untersucht,

anschließend wurde ein Tropfen Puffer dazugegeben und erneut gemessen. Für alle Mes-

sungen wurde das ATR-Objektiv verwendet.


67

3.2.3.3.5 Inkubation von Puffer in Abhängigkeit von der Zeit

Ein Goldwafer wurde aus der Peptidthiollösung mit einer Teflonpinzette genommen, ei-

nige Male mit Puffer gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Zunächst erfolgte die

Messung des Wafers im trockenen Zustand. Auch verschiedene Stellen auf dem Wafer

wurden untersucht, um die Homogenität der SAM-Schicht zu überprüfen. Anschließend

wurde ein Tropfen deuterierter Puffer auf den Wafer gegeben und in Zeitintervallen von 5

min jeweils ein Spektrum aufgenommen. Die letzte Aufnahme erfolgte bei 30 min. Aus

allen Messungen wurde das zuvor aufgenommene Puffer-Referenzspektrum subtrahiert.

3.2.3.3.6 IR-Messungen des Peptidthiols in Lösung

Vergleichsmessungen des Peptidthiols in Lösung wurden am Confocheck IR–Spektro-

meter der Firma Bruker (Bruker Optics, Ettlingen) durchgeführt. Dieses Spektrometer

ermöglicht direkte Messungen von Proteinen in Lösung, um auf diese Weise Informatio-

nen über Konzentrationen, Konformationsänderungen (bei Temperierung oder pH-Wert

Änderung) und Sekundärstrukturen zu erhalten.

Die für die Inkubation der Goldwafer verwendeten Peptidthiollösungen wurden mit einer

Hamiltonspritze in die Injektionskammer des Spektrometers gegeben (Volumen 10 µl)

und gegen den reinen Puffer als Referenz gemessen. Das Peptidthiol wurde sowohl in

reinem Puffer als auch in Puffer mit 10, 30 und 50 % TFE gemessen. Vor jeder Messung

musste ein neues Referenzspektrum des mit unterschiedlichen Konzentrationen an TFE

angereicherten Puffers aufgenommen werden.

3.2.4 Quartz Crystal Microbalance Dissipation (QCM-D)

QCM-D steht für Quartz Crystal Microbalance Dissipation und beschreibt ein Verfahren,

bei dem aus dem Verhalten eines resonant schwingenden Quarzsensors Rückschlüsse auf

die Eigenschaften mit dem Sensor in Kontakt stehender bzw. daran haftender Medien

gezogen werden können. Aufgrund der sehr hohen Genauigkeit und der Möglichkeit,

diese Methode auch in flüssigen Medien anwenden zu können, wird sie neben der Oberf-

lächenplasmonenspektroskopie zur Untersuchung von funktionellen Oberflächen, Pro-

tein-Protein- oder Protein-Festphasen-Interaktionen vermehrt angewendet. Die in dieser

Arbeit verwendete Quarzkristallmikrowaage der Firma Q-sense (Q-sense E4) ist zudem in


68

der Lage, nicht nur die Adsorption von starren und sehr dünnen Filmen zu messen, son-

dern auch die viskoelastischen Eigenschaften dünner Filme durch Einbeziehung der so

genannten Dissipation, also dem Energieverlust des Systems, zu berücksichtigen.

Wie bei allen QCM Systemen ist das Grundprinzip immer das gleiche. Die resonante An-

regung des Quarzsensors, meist eine flache Scheibe oder Zylinder, erfolgt über die Anle-

gung einer Wechselspannung, die über zwei an Ober- und Unterseite aufgedampfte Elekt-

roden induziert wird.

Abbildung 3-12: QCM- Quarzsensor. Der Sensor besteht aus einem dünnen Quarzplättchen,

dass zwischen zwei Elektroden gespannt ist (Raimund Sauter, LOT-Oriel Group Europe (Q-

sense)).

Entscheidend ist hierbei, dass die Resonanzfrequenz direkt von der oszillierenden Masse

abhängig ist. Nimmt diese Masse durch Adsorption eines Films zu, verringert sich die

Frequenz. Die Abhängigkeit zwischen Masse- und Frequenzänderung ist durch die so

genannte Sauerbrey-Gleichung gegeben:

C fm

n

(4)

n = Obertonzahl (1,3,5,…,13); Δf = Resonanzfrequenzänderung; Δm = Massenänderung;

C = massensensitive Konstante (17,7 ng Hz-1

cm-2

für 5 MHz Quarzkristall)

Für Proteinfilme muss zumeist eine deutlich höhere Elastizität des aufgetragenen Films

angenommen werden. Dies hat einen dämpfenden Effekt auf die Schwingung, da solche

elastischen Filme der Oszillation nicht exakt folgen können. Über den Grad der Dämp-

fung lässt sich die adsorbierte „nasse“ Masse (ko-adsorbierte Wassermoleküle) und In-

formationen über viskoelastische Eigenschaften des zu untersuchenden Systems ableiten.

Ist die Dichte des verwendeten Lösungsmittels und der Probe bekannt, kann zusätzlich

die Schichtdicke des adsorbierten Films über die Beziehung

m h (5)


69

und der Sauerbrey-Gleichung oder über das viskoelastische Modell nach Kelvin-Voigt

berechnet werden. In dieser Arbeit wird diese Methode zur Bestimmung der Schichtdicke

eines Protein-Multikomponentensystems herangezogen und mit Ergebnissen, die mit dem

Rasterkraftmikroskop (AFM) erhalten wurden, verglichen.

3.2.5 Experimenteller Teil

3.2.5.1 QCM-Messungen zur Untersuchung verschiedener hGBP1-Mutanten und

ihres Dimerisierungsverhaltens

Zunächst wurde die Goldschicht auf dem Quarzsensor mit Biotinthiollösung (10 % Bio-

tinthiol und 90 % Merkaptoundekanol in absolutem Ethanol) über ca. 2 Stunden inku-

biert, indem ein Tropfen der Lösung auf die Oberfläche gegeben wurde. Nach Verduns-

tung des Lösungsmittels wurde wiederum ein Tropfen nachgegeben. Die etwas umständ-

liche Vorgehensweise musste deshalb angewandt werden, da die Elektroden nicht mit

dem Thiol belegt werden durften. Somit war ein Eintauchen des Quarzplättchens in

Thiollösung nicht möglich. Die Inkubation mit Streptavidin (0,4 µM), den hGBP1 Mu-

tanten (1 µM) und hGBP1 ohne Anker (10 µM) in Anwesenheit von GppNHp (50 µM)

erfolgte in ähnlicher Weise, wie bereits im Abschnitt 3.2.1.3 beschrieben. Der verwendete

Laufpuffer als auch der zur Verdünnung der Proteinstammlösungen verwandte Puffer war

50 mM Tris-HCl (pH 7,9) und 5 mM MgCl2.

Da im Gegensatz zu den SPR-Messungen die Schläuche des QCM-Fließystems einen

größeren Durchmesser haben, wurde die Flussrate auf 15 µl/ min festgelegt, um ähnliche

Bedingungen zu schaffen wie bei den SPR-Messungen. Die Auswertung der

Frequenzspektren erfolgte über die Q-Sense Software. Aus der Frequenzerniedrigung und

Dissipation konnte unter Einbeziehung der Dichte (für Proteinlösungen ca. 1,3 kg/ m3) die

Schichtdicke der einzelnen Proteinschichten nach Sauerbrey und/oder Voigt berechnet

werden (Voinova, 1999; Zhang et al., 2009).

3.2.6 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie

Neben der bereits beschriebenen Rasterkraftmikroskopie stellt die Fluoreszenzmikrosko-

pie eine weitere Methode zur Darstellung von Oberflächen und kleiner Objekte dar. An

die zu untersuchenden Objekte, z. B. Proteine, werden hierfür spezielle Fluoreszenzmar-


70

ker angeheftet, die dann mit der passenden Wellenlänge des eingestrahlten, monochro-

matischen Lichtes zum Leuchten angeregt werden. Ein spektral getrennter Farbkanal er-

laubt die Detektion der vom angeregten Farbstoff ausgehenden Lichtemission. Anre-

gungs- und Emissionswellenlängen sowie die Wahl der Filter und Verstärkungsfaktoren

müssen auf den ausgewählten Farbstoff abgestimmt sein. Nachteil dieser Methode im

Gegensatz zur Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und Rasterkraftmik-

roskopie (AFM) ist die Notwendigkeit, Markermoleküle einzusetzen, die chemisch an das

zu untersuchende Objekt angebunden werden müssen. Insbesondere bei der Untersuchung

von Protein-Protein oder auch Protein-Festphasen-Interaktionen muss deswegen darauf

geachtet, dass die für den Farbstoff gewählte Bindungsstelle so gewählt wird, dass die

gewünschten Wechselwirkungen, die es zu untersuchen gilt, nicht gestört oder gar ver-

hindert werden. Der entscheidende Vorteil der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin,

dass aufgrund der spektralen Trennung zwischen Anregung und Emission ein hohes Sig-

nal-Rausch-Verhältnis erzielt wird und somit kleinste Substanzmengen des Farbstoffes

nachgewiesen werden können. Bei ausreichender Auflösung ist sogar die Unterscheidung

einzelner Moleküle möglich. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, die

gebundene Menge des Farbstoffes quantifizieren zu können. Zwischen der Intensität der

emittierten Strahlung und der Anzahl an Farbstoffmolekülen besteht ein proportionales

Verhältnis, das jedoch an Metalloberflächen aufgrund von möglichen Quenching-Effek-

ten nur bedingt gilt.

Bei der Auswahl des Farbstoffes sollte insbesondere eine hohe Fluoreszenzintensität der

entscheidende Faktor sein. Um diese zu erzielen, bedarf es einer möglichst hohen Inten-

sität des eingestrahlten Lichtes und einer günstigen Fluoreszenzausbeute, d. h. es sollte

möglichst viel Strahlung von Versuchsobjekt zurück emittiert werden.

0 (2,303 )FI I c d (6)

IF = Fluoreszenzintensität; I0 = Intensität des eingestrahlten Lichtes; = Fluoreszenzausbeute

(emittierte Photonen/absorbierte Photonen); ε = molarer Extinktionskoeffizient; c = Konzentration

des Fluoreszenzfarbstoffes; d = Schichtdicke der Küvette

Für die Fluoreszenzmessungen wurde der Farbstoff Fluoreszein 5-maleimid verwendet,

der in der Lage ist, spezifisch an die Aminosäure Cystein zu binden. Bei Fluorezcein han-

delt es sich um einen Standardfarbstoff, für den die Lasersysteme der (meisten) Fluores-

zenzmikroskope die entsprechende Anregungswelle erzeugen können. Anregungs- und


71

Emissionswellenlänge liegen darüber hinaus weit genug auseinander, so dass die anre-

gende Lichtstrahlung den Detektor nicht stört. Durch den Maleimid-Anker ist außerdem

eine gezielte Anbindung an das zu untersuchende Protein, nämlich hGBP1, möglich, wo-

durch erreicht werden kann, dass der Dimerisierungsprozess, der unter dem Fluoreszenz-

mikroskop nachgewiesen werden sollte, nicht gestört wird.


3.2.6.1.1 Herstellung fluoreszeinmarkierter Proteine

Die Herstellung fluoreszeinmarkierter Proteine erfolgte über Fluoreszenzfarbstoffe, die an

Maleinimid über einen Anker gekoppelt waren und somit an Cysteine unter Bildung eines

Thioethers selektiv binden konnten. Der Fluoreszenzmarker wurde von der Firma

MoBiTec GmbH (Göttingen) zur Verfügung gestellt. Das Fluoreszein wurde in einem 2-

fachen Überschuss gegenüber dem Protein eingesetzt. Die Kopplungsreaktion erfolgte in

Phosphatpuffer (K2HPO4/ KH2PO4 (pH 7) über Nacht auf Eis (4 °C)). Am nächsten Tag

wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 mM Dithiothreitol (DTT) gestoppt und das

überschüssige Fluoreszein über eine NAP5-Säule (GE, Healthcare, München) abgetrennt,

so dass das Protein in großer Reinheit vorlag. Abschließend erfolgte, je nach weiterer

Verwendung des Proteins, eine Umpufferung in Puffer C* (50 mM Tris-HCl (pH 7,9) und

5 mM MgCl2) und eine Aufkonzentrierung des Proteins. Die Markierungseffizienz wurde

über die Ermittlung der Absorption des Fluoreszeins (λmax = 492 nm; ε = 83000 M-1

cm-1

)

in Relation zur Proteinkonzentration (λmax = 280 nm; ε = 44800 M-1

cm-1

) ermittelt.

3.2.6.1.2 Messungen mit dem Fluoreszenzmikroskop

Für die Messungen stand das konfokale Mikroskop Leica TCS SP2 AOBS zur Verfü-

gung. Die Anregungswellenlänge des Fluoreszeins betrug 492 nm. Für die Bilder wurde

eine 40fache Vergrößerung verwendet. Die Lichtintensität lag bei 813 mV. Wie im Ab-

schnitt 3.2.2.4.2 für die AFM-Substrate beschrieben, wurden für die Messungen lateral

strukturierte Proteinproben hergestellt. Auf die Goldwafer wurde ein Standarddeckgläs-

chen gesetzt und mit Hilfe von Nagellack auf dem Wafer befestigt, damit dieser auf dem

Objektträger fixiert ist. Anschließend erfolgte der Einbau in das Mikroskop. Für eine

möglichst kontaktfreie Mikroskopie des Präparates wurde ein Puffertropfen


72

(Puffer C*)auf die Probe gesetzt und ein hochauflösendes Wasserimmersionsobjektiv in

die unmittelbare Nähe der Probe gebracht. Zur Detektion der Fluoreszenzstrahlung diente

ein Photomultiplier mit drei verschiedenen Farbkanälen. Hier wurde ausschließlich der

grüne Farbkanal verwendet.

Für die Fokussierung wurde das Objektiv zunächst ganz nach unten gefahren und das

Objektiv mit ca. 50 µl Immersionsflüssigkeit, also Puffer, benetzt. Anschließend wurde

die Probe eingebaut und mit einem Gegengewicht in z-Richtung fixiert. Die Halterung

wurde anschließend direkt über dem Objektiv positioniert. Durch Betätigung des Grob-

triebes konnte nun das Objektiv an das Präparat angenähert werden. Die Annäherung

wird zunächst gestoppt, wenn der Puffertropfen auf dem Objektiv sich mit dem Präparat

verbindet. Die Laserintensität wurde im nächsten Schritt auf 100 % gesetzt und weiter

vorsichtig angenähert, um jeglichen Kontakt mit der Probe zu vermeiden. Gleichzeitig

konnte während des Annäherns die Zunahme des Fluoreszenzsignals beobachtet werden.

Irgendwann war dann die laterale Strukturierung der Probe zu erkennen.

3.3 Materialien für die molekularbiologischen und biophysikalischen

Methoden

3.3.1 Chemikalien

In dieser Arbeit wurden Chemikalien der Firmen Applichem GmbH (Darmstadt), Boeh-

ringer Ingelheim GmbH (Ingelheim), Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe); Enzo Life

Sciences GmbH (Lörrach), Fermentas GmbH (St. Leon-Rot), GE Health Care GmbH

(München), Mallinckrodt Baker (Griesheim), Merck KGaA (Darmstadt), Qiagen GmbH

(Hilden), Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München) und Serva GmbH (Heidelberg) bezo-

gen, die allesamt in höchster Reinheit vorlagen.

3.3.2 Verbrauchsmaterialien

Entsalzungssäulchen Zeba Spin Thermo Fisher Scientific GmbH,

Bonn

Konzentratoren Vivaspin 20 und 500 Sartorius Stedim Biotech GmbH,

Göttingen

Membranfilter ME24 0,2 μm Whatman GmbH, Dassel


73

Spritzenfilter Filtropur S 0,2 und 0,4 μm Sarstedt AG & Co, Nümbrecht

3.3.3 Reagenzienkits

QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen GmbH, Hilden

QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen GmbH, Hilden

3.3.4 Enzyme und Marker

BamHI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

DpnI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

KOD Hot Start-DNA-Polymerase Merck KG, Darmstadt

MassRuler DNA-Ladder High-Range Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

MassRuler DNA-Ladder Low-Range Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Page Ruler Protein Ladder Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Protein Molecular Weight Marker Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Trypsin Serva GmbH, Heidelberg

T4 DNA-Ligase Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

3.3.5 Säulenmaterialien

HisPur Cobalt Resin Thermo Fisher Scientific GmbH,

Bonn

Nickel-NTA-Agarose Superflow Qiagen GmbH, Hilden

Superdex 75 GE HealthCare GmbH, München

Superdex 200 GE HealthCare GmbH, München

3.3.6 Antibiotika

Ampicillin Applichem GmbH, Darmstadt

Chloramphenicol Applichem GmbH, Darmstadt


74

Verwendete Konzentrationen in den Medien: 100 mg/l Ampicilin; 50 mg/l Ampicilin und

12,5 mg/l Chloramphenicol.

3.3.7 Mikroorganismen

TG1 supE, hsdD5, thi, D (lac-proAB), F‘[traD36, proAB+, lacIq,

lacZDM15] (Gibson, 1984)

XL1-Blue recA1, end A1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac,

[F‘, proAB, lacIqZDM15, Tn10 (Tetr)], (Bullock und

Fernandez, 1987)

BL21 (DE3) B, F-, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm, ompT, l(DE3)

(Studier /Moffatt, 1986)

3.3.8 Nährmedien

Alle Medien wurden vor der Benutzung 20 Minuten bei 121°C autoklaviert.

LB-Medium

10 g/l Bacto Trypton

5 g/l Hefeextrakt

10 g/l NaCl

pH 7,4 mit NaOH

LB-Agar-Medium


5 g/l Hefeextrakt

10 g/l NaCl

12 g/l Agar

TB-Medium


24 g/l Hefeextrakt

12, 54 g/l K2HPO4


75

2, 31 g/l KH2PO4

4 ml/l Glycerin

3.3.9 Vektoren

In dieser Arbeit wurden die Vektoren pQE80I und pQE9 (Qiagen, Hilden) verwendet. Die

Vektoren kodieren für einen 6fachen His-tag, eine Ampicilinresistenz und ein T5-Pro-

motor/Lactose Operon Element, das die Möglichkeit bietet, die Genexpression durch

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu induzieren.

3.3.10 Mutationsprimer

hGBP1 C12A sense

5’- CAT GAC AGG CCC AAT GGC GCT CAT TGA GAA CAC- 3’

hGBP1 C12A antisense

5’- GTG TTC TCA ATG AGC GCC ATT GGG CCT GTC ATG- 3’

hGBP1 C82A sense

5’- GGA ATC TGG ATG TGG GCG GTG CCC CAC CCC AAG- 3’


5’- CTT GGG GTG GGG CAC CGC CCA CAT CCA GAT TCC- 3’

hGBP1 C225S sense

5’- AAC CTG CCC AGA CTC TCG ATC CGG AAA TTC TTC- 3’

hGBP1 C225S antisense

5’- GAA GAA TTT CCG GAT CGA GAG TCT GGG CAG GTT- 3’

hGBP1 C235A sense

5’- CTT CCC AAA GAA AAA AGC GTT TGT CTT TGA TCG GCC C- 3’


5’- GGG CCG ATC AAA GAC AAA CGC TTT TTT CTT TGG GAA G- 3’

hGBP1 C270A sense

5’- CAA CAA GTA GCA GAC TTC GCG TCC TAC ATC TTT AG- 3’


5’- CTA AAG ATG TAG GAC GCG AAG TCT GCT ACT TGT TG- 3’

hGBP1 C311S sense

5’- GTG GGG ATC TGC CGT CGA TGG AGA ACG CAG TC- 3’



76

5’- GAC TGC GTT CTC CAT CGA CGG CAG ATC CCC AC- 3’

hGBP1 C396A sense

5’- GCG GGA TGA CTT TGC GAA ACA GAA TCA GGA AGC- 3’


5’- GCT CAA GCT CAG CTA ATT AAG CTT GGC TGC AGG- 3’

hGBP1 C407S sense

5’- GCA TCA TCA GAT CGT TCC TCA GGT TTA CTT CAG GTC- 3’


5’- GAC CTG AAG TAA ACC TGA GGA ACG ATC TGA TGA TGC- 3’

hGBP1 K485C sense

5’- GAC CAG ACT CTC ACA GAA TGC GAA AAG GAG ATT GAA GTG GAA CGT- 3’

hGBP1 K485C antisense

5’- ACG TTC CAC TTC AAT CTC CTT TTC GCA TTC TGT GAG AGT CTG GTC- 3’

hGBP1 Q577C sense

5’- GCA GAA TAA TGA AAA ATG AGA TAT GCG ATC TCC AGA CGA AAA TGA GAC G- 3’

hGBP1 Q577C antisense

5’- CGT CTC ATT TTC GTC TGG AGA TCG CAT ATC TCA TTT TTC ATT ATT CTG C- 3’

hGBP1 C589S sense

5’- GAG ACG ACG AAA GGC ATC TAC CAT AAG CTA AAG ACC- 3’


5’- GGT CTT TAG CTT ATG GTA GAT GCC TTT CGT CGT CTC- 3’

3.3.11 Sequenzierprimer

pQE sense

5’- GTA TCA CGA GGC CCT TTC GTC T- 3’

pQE antisense

5’- CAT TAC TGG ATC TAT CAA CAG GAG- 3’

hGBP1 300-319 sense

5’- ATC TGG ATG TGG TGT GTG CC- 3’

hGBP1 300-319 antisense

5’- GGC ACA CAC CAC ATC CAG AT- 3’

hGBP1 570-589 sense

5’- TCA GCT GAC TTT GTG AGC TT- 3’

hGBP1 570-589 antisense

5’- AAG CTC ACA AAG TCA GCT GA- 3’


77

3.3.12 Puffer

Vor Gebrauch wurden alle Puffer filtriert und entgast.

Puffer A

50 mM Tris

5 mM MgCl2

500 mM NaCl

2 mM Imidazol

pH 7,9

Puffer B20

50 mM Tris

5 mM MgCl2

100 mM NaCl

10 mM Imidazol

pH 7,9

Puffer B150 (pH 7,9)

50 mM Tris

5 mM MgCl2

100 mM NaCl

150 mM Imidazol

Puffer C (pH 7,9)

50 mM Tris

5 mM MgCl2

2 mM DTT

Puffer C* (pH 7,9)

50 mM Tris

5 mM MgCl2


78

Puffer Biotinyl./Fluoresz.(pH 7)

50 mM Phosphatpuffer (K2PO4/KH2PO4 (1:1))

5 mM MgCl2

PufferHPLC (pH 6,5)

10 mM Tetrabuthylammoniumbromid (TBA- Br)

30 mM Dikaliumhydrogenphosphat

70 mM Kaliumdihydrogenphosphat

200 μM Natriumazid

PufferGill (pH 6,5)

50 mM Kaliumphosphat-Puffer

5 mM MgCl2

6 M Guanidinhydrochlorid

3.4 Molekularbiologische Methoden

3.4.1 Isolierung von Plasmid-DNA

Plasmide aus E.coli Zellen wurden mittels eines Präparations-Kit (QIAprep Spin Miniprep

Kit) der Firma Qiagen (Hilden) isoliert. Die Durchführung erfolgte gemäß den Angaben

des vom Hersteller beigefügten Handbuches. Die alkalische Lyse zum Aufbruch der Zel-

len, die Fällung der Proteine mit Natriumdodecylsulfat und ihre Aufreinigung mittels

Anionenaustauschersäule sind die zentralen Schritte der Präparation. Die hochreine

Plasmid-DNA wird abschließend in einem kleinen Volumen Puffer (50 µl) aufgenommen

und steht für die sich anschließende Polymerase-Ketten-Reaktion und Transformation zur

Verfügung. Falls nötig, sollte die Lagerung der DNA-Lösung bei -20 °C erfolgen.

3.4.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die Polymerase-Ketten-Reaktion dient der Vervielfältigung von Genfragmenten. Zur se-

lektiven Vervielfältigung kommen hitzestabile Polymerasen und zwei Oligonukleotide

zum Einsatz. Diese Primer, die bei der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) bestellt wurden,

sind dem folgenden PCR-Ansatz hinzu pipettiert worden:


79

PCR-Ansatz (50 µl)

30- 500 ng Template DNA

1 µl 5‘-Primer (sense) (100 µM)

1 µl 3‘-Primer (antisense) (100 µM)

4,5 µl dNTP-Mix

5 µl 10x KOD-Polymerase Puffer

3 µl MgCl2

1 µl KOD-Polymerase

Das eingesetzte PCR-Gerät Mastercycler der Firma Eppendorf (Hamburg) wurde so pro-

grammiert, dass insgesamt zwischen 25 und 35 Zyklen durchlaufen wurden. Die initiale

Denaturierung erfolgte bei 95 °C für eine Minute, gefolgt von einer zyklischen Erhitzung

(1 min, 95 °C). Bei 54 °C wurde jeweils für 1 Minute hybridisiert und der Zyklus mit der

Elongation durch die Polymerase bei 72 °C (1- 1,5 min) abgeschlossen.

3.4.3 Sequenzierung

Am Lehrstuhl für Biochemie II wurde zur Kontrolle der PCR die eine Sequenzierung der

amplifizierten DNA durchgeführt. Hierfür kam das ABI 3130xl (Applied Biosystems,

Foster City, USA) zum Einsatz. 5 µl der isolierten Plasmid-DNA (150 ng/ µl) und 5 µl

der Sequenzierprimer (Endkonzentration 10 pmol/µl) wurden mitgeschickt. Methodisch

erfolgte die Sequenzierung gemäß der klassischen Sanger-Methode, nur das für die Mar-

kierung keine radioaktiven, sondern fluoreszierende Sonden verwendet wurden.

3.4.4 Herstellung kompetenter Zellen

Für die sich anschließende Transformation wurden zunächst kompetente E.coli Zellen (E.

coli TG1, XL1-blue, BL21 (DE3)) aus 5 ml Übernachtkulturen hergestellt. Je 1ml wurden

auf 100 ml LB-Medium am nächsten Tag übergeimpft und bei 37 °C und bis zu einer

OD600 von 0,5- 0,6 herangezogen (Zeitraum 1- 3 Stunden). Anschließend erfolgte eine 20-

minütige Inkubation auf Eis. Bei 8000 U/min und 4 °C wurden für 5 Minuten die Zellen

mittels Zentrifugation sedimentiert, bevor das Pellet in eiskaltem TSS-Puffer (10 % PEG

8000, 5 % DMSO, 50 mM MgCl2 in LB Medium ohne NaOH, pH 6,5) resuspendiert


80

wurde. Nach Ergänzung von 15 %-igen Glyzerin wurden Aliquots von 300 µl zusammen-

pipettiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren (Lagerung: -80 °C).

3.4.5 Quick Change Site Directed Mutagenesis

Mittels Quick Change Site Directed Mutagenesis wurden Punktmutationen in eine ent-

sprechende Ziel-DNA eingebaut. Über Primer, die die gewünschte Mutation enthalten,

konnte das zu verändernde Zielgen mittels PCR modifiziert werden. Die für den PCR-

Ansatz verwendete KOD-Polymerase besaß eine 3‘→ 5‘- Exonucleaseaktivität. Der Ver-

dau des Template-Vektors erfolgte über die Restriktionsendonuclease DpnI, die spezi-

fisch für methylierte DNA ist. Somit konnte gezielt ausschließlich die Template-DNA

abgebaut werden. Anschließend erfolgte die Transformation der modifizierten DNA.

Beim Primer-Design wurde darauf geachtet, dass die Empfehlungen des Quick Change

Site Directed Mutagenesis-Kits (Stratagene Europe, Amsterdam) befolgt werden. Die

Länge des Primers sollte zwischen 25 und 45 Basen liegen und die zu mutierende Posi-

tion etwa in der Mitte platziert sein. Die Schmelztemperatur sollte bei ≥ 78 °C liegen. Der

GC-Gehalt sollte ≥ 40 % betragen. Alle verwendeten Primer wurden bereits im Abschnitt

aufgeführt. Der folgende Reaktionsansatz wurde im Allgemeinen verwendet:

PCR-Ansatz (50 µl)

1 µl Template DNA

1,5 µl 5‘-Primer (sense) (100 µM)

1,5 µl 3‘-Primer (antisense) (100 µM)

5 µl dNTP-Mix (2 mM)

5 µl 10x KOD-Polymerase Puffer

4,5 µl MgSO4 (25 mM)

1 µl KOD-Polymerase

30 µl H2O

3.4.6 Transformation

250 µl der kompetenten E. coli-Zellen wurden langsam auf Eis aufgetaut und mit 5-

20 ml eines Ligationsansatzes versetzt. Nach einer Stunde Inkubation auf Eis wurde der

Ansatz einem Hitzeschock unterzogen, indem eine abrupte Erwärmung auf 42 °C für 60s


81

erfolgte. Nach kurzer Abkühlung (2 min) auf Eis wurden dem Ansatz 900 µl LB-Medium

ohne Antibiotikum zugefügt, gefolgt von einer weiteren Stunde Inkubation bei 37 °C.

Nach Zentrifugation bei 14000 U/min wurde das Zellpellet in 150 µl des Überstandes

aufgenommen und auf mit Antibiotika versetzte Agar-Nährböden gegeben, die dann über

Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert wurden.

3.4.7 Verdau von DNA mittels Restriktionsenzymen

Der Enzymverdau wurde in einem Volumen von 40 µl durchgeführt. Die Wahl des Puf-

fers und die Länge der Inkubation sind hierbei Parameter, die es im Besonderen zu be-

achten gilt, da Enzyme je nach pH-Wert und Zusammensetzung des Puffers unterschied-

liche Aktivitäten zeigen. Die Inkubation erfolgte stets bei 37 °C im Brutschrank. Hierbei

sollte auf Hinweise des Herstellers geachtet werden. Die Auftrennung der erhaltenen

DNA-Fragmente wurde mittels Agarosegelelektrophorese bewerkstelligt und anschlie-

ßend die erwünschten Fragmente aus dem Gel herausgeschnitten. Zur Trennung der Ban-

den auf dem Gel wurde ein spezieller Probenpuffer verwandt (0,25 % (w/v) Bromphenol-

blau, 30 % Glyzerol (v/v), 0,25 % Xylen-Cyanol, pH 8,0) und die Detektion der DNA-

haltigen Banden erfolgte mittels 0,001 % Ethidiumbromid und unter einer UV-Lampe.

3.4.8 Ligation

Vektor-DNA und Proben-DNA (gewünschtes Fragment) wurden im Verhältnis 1:4 im

Ligationspuffer (Fermentas, St- Leon-Roth) gemischt. Nach Zugabe von 1U der T4-

DNA-Ligase der Firma Fermentas (St. Leon-Roth) wurde der Ansatz mit einem Gesamt-

volumen von 20 µl über Nacht bei 4 °C oder inkubiert.

3.5 Proteinbiochemische Methoden

3.5.1 Präparative Proteinexpression

Von Übernacht-Kulturen der transformierten E.coli-Zellen wurde je eine Zellkolonie mit

einer Pipettenspitze von dem mit Ampicilin angereicherten Agar-Nährböden abgenom-

men und in 100 ml TB-Medium überführt. Es erfolgte eine Inkubation über Nacht bei

37°C.


82

Die Vorkultur wurde am darauf folgenden Morgen auf 4 mal 2,5 l autoklaviertes TB-Me-

dium gleichmäßig verteilt und über Tag bei 37°C und 150 rpm auf einem Schüttelgerät

bis zu einer OD600 von 0,5 bis 0,6 herangezogen. Nach Reduzierung der Temperatur auf

25 °C wurde die Überexpression des auf dem Vektor kodierten Proteins mit 100 µM

IPTG eingeleitet und über Nacht auf dem Schüttler inkubiert.

3.5.2 Zellernte

Die Zellernte erfolgte mittels Zentrifugation bei 7000g für 15 Minuten. Der Überstand

wurde verworfen und das Pellet direkt weiterbearbeitet oder bei -80 °C bis zur weiteren

Verwendung gelagert.

3.5.3 Zelllyse

Das nach Zentrifugation erhaltene Zellpellet wurde in einem Lysepuffer (50 mM Tris-

HCL pH 7,9, 5 mM MgCl2, 1 mM PMSF und 1,5 % Triton X100) resuspendiert und, falls

es zuvor bei -80 °C gelagert war, auf diese Weise langsam aufgetaut. Dann erfolgte die

Behandlung der Zell-Lösung mit Ultraschallwellen (Amplitude 80%, 1s Puls/Pause im

Wechsel) für insgesamt 10 Minuten. Um die Temperatur der Zell-Lösung jedoch mög-

lichst niedrig zu halten, wurde der Zellaufschluss unter ständigem Kühlen mit Eis und in

Intervallen von je einer Minute durchgeführt.

Anschließend wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation (4°C; 23000 rpm; 45 Minu-

ten; Rotor: SA 300) abgetrennt. Die gewünschten Proteine befanden sich im Überstand

und wurden im nächsten Schritt durch Affinitätschromatographie mit Hilfe einer Cobalt-

Säule aufgereinigt.

3.5.4 Co2+

-NTA-Affinitätschromatographie

Die Proteinaufreinigung erfolgte mit Hilfe einer HisPur-Cobalt-Resin-Säule. Das zu iso-

lierende Protein besaß einen His-tag (6 Histidin-Reste). Dieser His-tag komplexierte mit

den im Matrixmaterial der Säulen enthaltenen 3-wertigen Cobalt-Metallionen und immo-

bilisierte somit das gesuchte Protein auf der Säule. Alle unerwünschten Proteine konnten

durch Waschschritte von der Säule entfernt werden. Die Elution des gesuchten Proteins


83

erfolgte mithilfe von Imidazol, das in deprotonierter Form mit zunehmender Affinität die

Histidin-Reste aus dem Co-Komplex verdrängt und somit das gesuchte Protein wieder

von der Säule löste.

Zunächst wurde die Co-Säule mit entgastem Puffer C* über Nacht bei einer Flussrate von

0,3 ml/min gereinigt. In einem nächsten Schritt wurde die Äquilibrierung (Volumen:

25 ml) mit Puffer A (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM Imi-

dazol) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min für 2 Stunden durchgeführt. Anschließend er-

folgte die Beladung der Cobaltsäule mit dem Überstand des Zellaufschlusses (Flussrate:

3,5ml/min) und mit einem 4-fachen Säulenvolumen von Puffer A (Flussrate: 2ml/min).

Unspezifisch gebundene Proteine wurden mit Puffer B10 (50 mM Tris-HCl (pH 8,0),

100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Imidazol) bei einer Flussrate von 4 ml/min von der

Säule gespült. Dann erfolgte der Wechsel zu Puffer B150 (50 mM Tris-HCl, 100 mM

NaCl, 5 mM MgCl2, 150 mM Imidazol), der dazu diente, das mit His-tag markierte, übe-

rexprimierte Protein von der Säule zu spülen und in 4 ml-Fraktionen aufzufangen.

3.5.5 Größenausschlusschromatographie

Die Gelfiltration ist eine Methode zur Auftrennung von Molekülen. Die Säulenmatrix

bildet Poren mit definiertem Durchmesser. Große Moleküle können nicht in die Poren

eindringen und werden ausgeschlossen, während kleinere Moleküle in die Poren

diffundieren. Kleinere Moleküle brauchen somit länger, die Säule zu durchlaufen als grö-

ßere Moleküle; die Moleküle werden somit anhand ihrer Größe aufgetrennt.

Die Protein enthaltenden Fraktionen der Affinitätschromatographie wurden vereinigt und

auf Eis langsam mit 3 M (NH4)2SO4 versetzt, um durch Wasserentzug die Proteine zu prä-

zipitieren. Nach dieser Ammoniumsulfatfällung erfolgte eine Zentrifugation mit

8400 rpm bei 4°C für 15 Minuten (Rotor: Sorvall Heräus). Der Überstand wurde

verworfen und das Pellet in ca. 4 ml Puffer C* resuspendiert. Die Gelfiltrationssäule

(Säulenmaterial: Sephadex® 200 (26/60) wurde blasenfrei mit Hilfe einer Spritze mit der

Protein-Lösung beladen und die Fraktionierung erfolgte über Nacht bei einer Flussrate

von 0,4 ml/min in 4 ml-Fraktionen. Aus dem entstandenen Elutions-Diagramm war

ersichtlich, in welchen Fraktionen sich das gesuchte Protein befand.


84

3.5.6 Aufkonzentrierung über Ultrafiltration

Die Aufkonzentrierung der Proteinfraktionen aus der Größenausschlusschromatographie

wurde mit Zentrifugationsröhrchen (Vivascience, USA) durchgeführt. Die Porengröße der

Filtermembran konnte wahlweise zwischen 10 und 100 kDa gewählt werden. Durch eine

Zentrifugation bei 4000 rpm und 4 °C konnten alle Bestandteile, die kleiner als die Poren

waren, durch diese hindurchgedrückt werden. Oberhalb der Membran blieb die

aufkonzentrierte Proteinlösung zurück, die mit einer Pipette abgenommen werden

konnte.

3.5.7 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Aus dem Elutionsdiagramm der Proteinaufreinigung über die Cobaltsäule ging hervor, in

welchen aufgefangenen Eluat-Fraktionen sich das gesuchte Protein befindet. Über eine

SDS-Gelelektrophorese konnte nun der Reinheitsgrad des gewonnenen Proteins bestimmt

werden. Das Detergenz SDS denaturiert Proteine und bindet spezifisch an die

Polypeptidkette. Durch die negative Ladung des Sulfats wird die Eigenladung des

Proteins vernachlässigbar und das Verhältnis von Ladung zu Größe ist für jedes Protein

annähernd gleich. Somit bewegen sich die Proteine annähernd proportional zu ihrer

Größe durch das Gel. Durch die Verwendung eines Protein-Markers bei der SDS-PAGE

Methode, der Proteine definierter molekularer Massen enthält, lässt sich ein unbekanntes

Protein anhand seines Molekulargewichts identifizieren (Schägger und von Jagow 1987).

In diesem Versuch wurde mit einem diskontinuierlichen System aus zwei Gelen gearbei-

tet, einem Sammelgel zur Konzentration der Proben und einem Trenngel zur

Probenauftrenunng. Das vertikale Gelelektrophoresesystem stammt von der Firma

BioRad (München). Die verwendeten Gele wurden nach folgender Rezeptur erstellt:

Trenngel 12,5 % Sammelgel 3,9 %

Protogel 3,1 ml Protogel 0,65 ml

Lower Tris 1,9 ml Upper Tris 1,25 ml

H2O 3,1 ml H2O 3,1 ml

TEMED 5 µl TEMED 5 µl

APS 10 % 100 µl APS 10 % 50 µl


85

Den Proben wurde ein Probenpuffer (125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 50 % Glyzerin,

10 % SDS, 10 mM β-Merkaptoethanol, 0,01 % Bromphenolblau) zugesetzt. Je 5 µl Probe

wurden mit 15 µl Probenpuffer verdünnt. Zusätzlich wurde ein Marker (Protein

Molecular Weight Marker: 14,4; 18,4; 25; 35; 66; 116 kDa (Fermentas, St. Leon-Rot))

aufgetragen. Die Auftrennung der Gele erfolgte bei einer Spannung von 110 V.

Anschließend wurden die Gele für ca. 15 Minuten gefärbt (Färbelösung: 0,1 % (w/v)

Coomassie Brilliant Blue G250, 0,1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R250, 40 %

Ethanol (v/v), 10 % Essigsäure (v/v)). Der nicht gebundene Farbstoff wurde mit Wasser

entfernt.

3.5.8 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Gill und von Hippel (1989)

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde zunächst der molare Extinktionskoeffi-

zient des Proteins bei 280 nm über die Anzahl der Tryptophan- Tyrosin- und Phenylala-

ninreste pro Molekül bestimmt. Über das Lambert-Beersche Gesetz wurde die Konzent-

ration der Proteinlösung ermittelt: A = c*d*ε

Um eine Extinktion zwischen 0,2 und 0,9 zu erreichen, wurde das Protein in 20 mM Ka-

liumphosphat und 6 M Guanidiniumhydrochlorid (pH 6,5) aufgenommen. Dieses Lö-

sungsmittel diente auch als Referenz für die Bestimmung der Absorption mittels UV-

Licht (280 nm). Zur Berechnung des Extinktionskoeffizienten gibt es diverse Internetpro-

gramme wie z. B. „ProtParam“. Die Messungen wurden mit dem Zweistrahlspektrometer

Specord 200 der Firma Analytik Jena vorgenommen.

3.5.9 Biotinylierung von Proteinen mit Maleimid-PEG11-Biotin

Um die verwendeten Proteine an Oberflächen binden zu können, wurde ein Linker benö-

tigt, der Protein und Oberfläche miteinander verbindet. Das Streptavidin/Biotin-System

bot sich hierfür an. Auf den für die SPR und AFM-Messungen verwendeten Goldoberflä-

chen befand sich das Protein Streptavidin. Die zu untersuchenden Proteine mussten bioti-

nyliert werden, damit sie über das Streptavidin an die Oberfläche binden konnten. Für die

Biotinylierung wurde das Kit „Maleimid-PEG11-Biotin“ von Thermo Scientific verwen-

det. Maleimid-PEG11-Biotin ist ein langkettiges, wasserlösliches Reagenz, welches Pro-

teine biotinylieren kann, die über Sulfhydrylgruppen verfügen. Die Maleimid-Gruppe


86

reagiert effizient und speziell mit reduzierten, freien Sulfhydrylgruppen bei einem pH-

Wert von 6,5 -7,5. Dabei werden stabile Thioether-Bindungen ausgebildet. Die einzuset-

zende Menge an Maleimid-PEG11-Biotin richtete sich nach der Anzahl der freien Sulf-

hydrylgruppen, der gewünschten Modifizierungsrate sowie der Konzentration des zu bio-

tinylierenden Proteins. Zunächst wurde eine 250 mM Stocklösung des Biotin Reagenzes

angefertigt. Die Menge an benötigtem Biotin Reagenz wurde gemäß der Anweisungen

des Kits „Biotin Quantitation Kit“ von Thermo Scientific kalkuliert:

Bevor die Biotinylierung durchgeführt werden konnte, musste eine Umpufferung des

Proteins stattfinden. Das Protein wurde in Puffer C aufbewahrt. Das im Puffer C

enthaltene DTT oxidiert Thiolgruppen, was eine Störung der Biotinylierung zufolge hätte.

Deswegen wurde das Protein mit Hilfe von speziellen Säulen (Resin Zeba Desalter Spin

Columns; Thermo Scientific) in Phosphat-Puffer (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4 im

Verhältnis 1:1 (pH 7)) überführt.

Die berechnete Menge an 250 mM Biotin Reagenz wurde zu der Proteinlösung gegeben.

Die Inkubation wurde auf Eis durchgeführt und konnte von 2 Stunden bis zu einer Nacht

variiert werden. Um die Kopplungsreaktion zu stoppen, fand eine Zugabe von 2 mM Di-

thioerythritol (DTE) statt. Anschließend wurde das biotinylierte Protein mit Hilfe der

Resin Zeba Spin Columns gemäß Vorschrift erneut in Puffer C* (ohne DTT) umgepuffert.

3.5.10 Quantifizierung der Biotinylierung von Proteinen

Für die Quantifizierung der Biotinylierung wurde das „EZTM

Biotin Quantitation Kit“ von

Thermo Scientific verwendet. HABA (4'-Hydroxyazobenzen-2-carboxylische Säure) ist

ein Reagenz, welches die schnelle Bestimmung des Mol-Verhältnisses von Biotin zu

Protein ermöglicht. Dafür wird das biotinylierte Protein zu einer Mischung aus HABA

und Avidin gegeben. Da Biotin eine höhere Affinität zu Avidin aufweist als das HABA,

verdrängt es das HABA und bindet an das Avidin. Dieser Vorgang kann über ein Photo-

meter verfolgt werden, da die Absorption bei 500 nm proportional zunimmt.

Dem auf Raumtemperatur gebrachten HABA/Avidin Mix wurde 100 µl ultrareines Was-

ser hinzugefügt und gut gemischt. In einer Küvette wurden 800 µl PBS-Puffer vorgelegt

und das Photometer bei 500 nm auf null gestellt. Nachfolgend wurden 100 µl der

HABA/Avidin Lösung in die Küvette gegeben und durch Invertieren gemischt. Die Ab-

sorption wurde gemessen und als A500 HABA/ Avidin (A500 H/A) notiert. Anschließend


87

wurden 100 µl der biotinylierten Proteinprobe in die Küvette gegeben und die Absorption

bei 500 nm als A500 HABA/Avidin/Biotin-Probe (A500 H/A/B) vermerkt. Die Quantifizie-

rung des Verhältnisses von Biotin zu Protein konnte gemäß den Anweisungen des Kits

von Thermo Scientific ermittelt werden.

3.6 Biophysikalische Methoden

3.6.1 Ermittlung von Nukleotidkonzentrationen

Für die Bestimmung von Nukleotidkonzentrationen wurden Absorptionsmessungen bei

253 nm durchgeführt. Der verwendete Puffer war 20 mM Tris-HCl (pH 7,9). Für die

Messungen wurde ein molarer Extinktionskoeffizient von ε 253 = 13700 M-1

cm-1

verwen-

det (Hiratsuka, 1983).

3.6.2 Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC

Lenzen (von Lenzen et al., 1995) hat eine Methode zur Bestimmung der Reinheit und

Analyse von Nukleotidgemischen über reversed-phase HPLC entwickelt. Prinzip der

Methode ist die Interaktion der hydrophoben stationären Phase mit dem Ionenpaar, das

aus dem Nukleotid selbst und dem in der mobilen Phase enthaltenen Tetrabutylammo-

niumbromid-Ionen (TBA-Br) besteht. Je nach Anzahl der vorhandenen Phosphatgruppen

variiert die Menge an gebundenem TBA-Br und somit die Retentionszeit. Zur Auftragung

der Proben wurde eine BT 4100 HPLC-Pumpe (Jasco- Groß-Umstadt) verwendet. Die

Trennung wurde über eine 25 cm Reprosil 100 C18 Säule (Dr. Maisch, Ammerbuch,

Entringen) vorgenommen. Um Verunreinigungen der Säule durch denaturierte Proteine

zu vermeiden, kam zusätzlich eine Nucleosil 100-5 C18 Vorsäule zum Einsatz. Als

Laufpuffer wurde 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,5), 10 mM TBA-Bromid, 0,3 mM

Natriumazid und 7,5 % Acetonitril verwendet. Die Detektion erfolgte mit Hilfe des

Photodiodenarray-Detektors MD-2010 (Jasco, Groß-Umstadt) bei einer Wellenlänge von

253 nm.


88

3.6.3 Messungen der Nukleotidhydrolyse

Über reversed-phase HPLC konnte die steady state Hydrolysegeschwindigkeit von GTP

durch das Protein hGBP1 ermittelt werden, um auf diese Weise Aufschluss über die en-

zymatische Aktivität des Proteins in Lösung und an einer Goldoberfläche zu erhalten. Für

die Messung in Lösung wurden die Proteine auf eine Konzentration von 0,5 µM mit Puf-

fer C* (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2 (pH 7,9)) verdünnt und GTP (Endkonzentration

50 µM) hinzugefügt. Die Inkubation erfolgte bei 25 °C. Nach unterschiedlichen Zeit-

punkten von einigen Minuten wurden 20 µl der Probe auf die Säule aufgetragen und die

Anteile von GTP, GDP und GMP konnten aus dem Elutionsdiagramm entnommen wer-

den. Der Anteil von nicht umgesetzten GTP wurde gegen die Inkubationszeit aufgetragen.

Die Anfangsgeschwindigkeit wurde bis 40 % GTP-Umsatz durch lineare Regression an-

gepasst. Die spezifische Aktivität ergibt sich aus dem Quotient von Anfangsgeschwindig-

keit und Proteinkonzentration.

Für die Messung der spezifischen Aktivität von hGBP1 auf einer mit einem Biotinthiol-

SAM (10 %) und Streptavidin modifizierten Goldoberfläche wurde ebenfalls eine GTP-

Konzentration von 50 µM eingesetzt. Die Oberfläche hatte eine Fläche von ca. 80 cm².

Da der runde, mit einer Goldschicht von 1200 Å beschichtete Siliziumwafer (siehe Her-

stellung der Substrate für AFM Messungen) in eine speziell dafür entwickelte Kunststoff-

schablone eingefasst war, konnte ein definiertes Volumen von 2,5 ml der GTP-Lösung

direkt auf die Oberfläche gegeben werden. Hierbei musste darauf geachtet werden, dass

der gesamte Wafer mit der GTP-Lösung beschichtet war. Die Inkubation erfolgte bei

Raumtemperatur. Nach bestimmten Inkubationszeiten wurden 20 µl der GTP-Lösung mit

einer Hamilton-Spritze vorsichtig abgenommen und der Anteil an GTP über HPLC, wie

oben beschrieben, bestimmt.

3.6.4 Zirkulardichroismus (Circular Dichroism, CD)-Spektroskopie

Zur Bestimmung von Sekundärstrukturelementen eines Proteins oder Peptids kann die so

genannte CD-Spektroskopie (Circular Dichroism) herangezogen werden, die es ermög-

licht, die optische Aktivität asymmetrischer Moleküle in Lösung zu untersuchen. Da α-

Helices und β-Faltblätter chiral sind, sind sie ebenfalls optisch aktiv und lassen sich mit-

tels dieser Methode detektieren. Das grundsätzliche Prinzip der CD-Spektroskopie beruht

darauf, dass linear polarisiertes Licht durch ein (chirales) Medium geschickt und die


89

Modifikation durch die Wechselwirkung mit der zu untersuchenden Substanz betrachtet

wird. Die Lichtwellen werden wellenlängenabhängig in ihrer Polarisationsrichtung

gedreht, was dann als Rotationsdispersion bezeichnet wird. Wenn zusätzlich die beiden

zirkular polarisierten Anteile, aus denen eine polarisierte Welle besteht, verschieden stark

absorbiert werden, wird von Zirkulardichroismus gesprochen.

Abbildung 3-13: Schematisches CD-Spektrum der Sekundärstrukturelemente random coil,

α-Helix und β-Faltblatt.

Für die einzelnen Sekundärstrukturelemente lassen sich in den jeweiligen Spektren

charakteristische Minima und Maxima benennen, die im Folgenden benannt sind:

Die Amid Bindung zeichnet sich durch einen schwachen, aber breiter n → π*

Übergang bei 220 nm und intensiver π → π* Übergang bei 190 nm.

Random: Positives Signal bei 212 nm (π → π*) und negatives bei 195 nm

(n → π*)

β-Faltblatt: Negativer n → π* Übergang (217 nm), π → π* positiv zwischen 195

und 197 nm; weiteres Signal bei 180 nm. Da β-Faltblattstrukturen sowohl parallel

oder antiparallel angeordnet sein können oder Mischformen beider möglich sind,

sie außerdem inter- oder intramolekular vorkommen und auch unterschiedliche

Verdrillungen aufweisen können, sind die CD-Spektren von Faltblättern lang nicht

so starr wie für Helices und zeigen eine höhere Abhängigkeit gegenüber den Sei-


90

tenketten der Aminosäuren, die das zu untersuchende Peptid bilden, und dem

verwendeten Lösungsmittel.

α-Helix: Aufspaltung des π → π* Übergangs in den senkrecht polarisierten Über-

gang bei 192 nm und parallel polarisierten Übergang bei 209 nm; Rotverschie-

bung zu 222 nm


Um zu überprüfen, welche Sekundärstrukturelemente in dem in dieser Arbeit syntheti-

sierten Peptidthiol auftreten, sollte neben den infrarotspektroskopischen und-mikroskopi-

schen Methoden auch die CD-Spektroskopie zum Vergleich herangezogen werden, auch

wenn sie sich ausschließlich dazu eignet, die Peptide in Lösung und nicht an einer Gold-

oberfläche zu vermessen. Die Peptidproben (1 mM Peptidkonzentration) wurden in einem

Puffer mit physiologischem pH-Wert (10 mM Tris, pH 7,4) angesetzt. Des Weiteren

folgten Messreihen mit 10 %, 30 % und 50 % Trifluorethanol. Anschließend wurden die

Spektren dazu genutzt, die Anteile bestimmter Sekundärstrukturelemente im Peptid zu

bestimmen, da sich der Dichroismus von Random, Helix und Faltblatt unterscheidet.

3.6.5 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight)

Zur massenspektrometrischen Bestimmung von Biomolekülen kommt die MALDI-TOF-

Massenspektrometrie (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight Mass

Spectrometry) zum Einsatz. Mit dieser Methode lassen sich Moleküle mit Moleku-

larmassen von bis zu 500 kDa messen. Dazu werden die Probenmoleküle in eine organi-

sche, niedermolekulare Matrix eingebettet und schonend mittels gepulster Laserstrahlung

ionisiert. Trifft der Laserstrahl auf die Matrix, absorbiert diese seine Energie und schützt

somit die Probenmoleküle vor Zerstörung. Anschließend überträgt die Matrix Energie auf

die Probenmoleküle, was zunächst zu ihrer Desorption und schließlich zu ihrer Ionisie-

rung führt. Die gasförmigen Ionen werden nun beschleunigt und durch ein Flugrohr ge-

schickt. Am Ende des Flugrohres werden die Ionen detektiert und können aufgrund ihrer

Massen unterschiedlichen Flugzeiten getrennt werden.


91


3.6.5.1.1 Überprüfung der Reinheit der Peptidproben

Nachdem die Peptide in einem Mikrowellen Peptide Synthesizer (Firma CEM) herge-

stellt und bereits einer ersten Vorreinigung mittels HPLC unterzogen worden waren,

sollte die massenspektrometrische Untersuchung dazu dienen, die Reinheit des

Peptidthiols zu überprüfen. Als Matrix wurde Dihydroxybenzoesäure (DHB) eingesetzt,

die gesättigt in 30 % Acetonitril und 0,1 TFA vorlag. Zunächst wurde ein Tropfen (1-

2 µl) einer 2 mM Peptidthiollösung (in 10 mM Tris, pH 7,9) auf die Stahlplatte gegeben

und durch einen Tropfen Matrixlösung ergänzt. Nach dem Trocknen wurde die Stahl-

platte eingeschleust und gemessen.

3.6.5.1.2 Detektion verschiedener immobilisierter Proteine auf einer Goldoberfläche

Mit einem Biotinthiol-SAM (10 % Biotinthiol, 90 % Mercatoundecanol) modifizierte

Goldwafer, die zuvor über SPR mit den Proteinen Streptavidin und biotinyliertem hGBP1

beladen worden waren, wurden mittels MALDI hinsichtlich der Fragestellung untersucht,

ob es möglich ist, die einzelnen Proteinkomponenten bekannter Masse auf dem Wafer

identifizieren zu können. Als Matrix wurde Zimtsäure verwendet. Diese lag gesättigt in

30 % Acetonitril und 0,1 % TFA vor. Der Goldwafer wurde zunächst auf den Stahlträger

aufgeklebt. Um zu vermeiden, dass die Goldoberfläche nicht mehr im Fokus des Lasers

liegt, musste im Vorfeld ein Loch in die Stahlplatte gefräst werden, das mit der Dicke des

Wafers exakt übereinstimmt. Anschließend wurde ein Tropfen der Matrixlösung auf die

Oberfläche pipettiert. Nach Verdampfung des Lösungsmittels konnte die Platte in das

Massenspektrometer eingebaut werden. Zur Detektion wurde eine Standardmethode über

die Software hochgeladen. Mit Hilfe einer ebenfalls auf dem Stahlträger aufgetragenen

Kalibrierlösung konnte zunächst anhand der bekannten Massen der in der Lösung enthal-

tenen Proteine (Protein Calibration Standard II, Bruker) die gemessenen Daten den Refe-

renzwerten angepasst werden, umso exakte Ergebnisse zu erhalten. Während des sich

anschließenden Messvorgangs wurde die Laserintensität auf ca. 40 % eingestellt und die

Anzahl der Laserpulse (Shots) auf 200 festgelegt. Jedes Spektrum konnte direkt abgespei-

chert und abschließend alle brauchbaren Spektren aufsummiert werden.


92

3.6.5.1.3 Detektion von Streptavidin und hGBP1

Die beiden Proteine Streptavidin und hGBP1 wurden nicht nur an einer Goldoberfläche,

sondern auch in Lösung vergleichsweise gemessen. Zusätzlich sollte auch Biotinthiol,

welches zur Bildung des SAMs auf der Goldoberfläche benutzt wurde, um Streptavidin

daran binden zu können, detektiert werden. Um das bestmögliche Ergebnis zu erzielen,

wurden verschiedene Matrizes ausprobiert. Zum Einsatz kamen Sinapinsäure, Dihydroxy-

benzoesäure (DHB) und Zimtsäure, alle gelöst in 30 % Acetonitril und 0,1 % TFA.

0,75 µl der Proben und 0,75 µl der Matrixlösung wurden auf dem Strahlträger auf-

getragen (Dried Droplet Crystallization) und es wurde gewartet, bis das Lösungsmittel

vollständig weggetrocknet war. Die weitere Verfahrensweise wurde bereits im vorausge-

gangenen Abschnitt besprochen. Die Anzahl der Shots betrug hier 50.

Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System

93

4 Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den

Aufbau eines Multikomponentensystems auf SAM-Ober-

flächen

Aufgrund der über Röntgenkristallographie gelösten Struktur, der markanten länglichen

Form und seiner enzymatischen Aktivität, die durch Selbstassemblierung noch verstärkt

wird, eignet sich das Immunprotein hGBP1 im besonderen Maße für das über Streptavi-

din als „Mediator“ aufgebaute Immobilisierungsassay. Hinzu kommt die bereits gut etab-

lierte Überexpression des Proteins in E. coli und seine Aufreinigung (Schwemmle

/Staeheli, 1994), die im Folgenden zunächst beschrieben ist

4.1 Synthese und Aufreinigung von hGBP1

Nach Aufzucht einer Kultur mit einem Volumen von 10 Litern wurden zunächst die Zel-

len abzentrifugiert, in Lysepuffer resuspendiert und mittels Ultraschall aufgeschlossen.

Die Suspension mit den aufgeschlossenen Zellen wurde erneut zentrifugiert, um eine

Trennung zwischen Zellresten und Proteinen zu erreichen. Mittels Co2+

-NTA-Affinitäts-

chromatographie erfolgte die Isolierung des mit einem His-tag versehenen hGBP1 vom

Rest des Protein-Pools. Über einen Probensammler wurde der Durchfluss in 4 ml-

Fraktionen aufgefangen. Die proteinhaltigen Fraktionen konnten anschließend auf ein

SDS-Gel aufgetragen werden (Abbildung 4-1).

Abbildung 4-1: SDS-Gel der hGBP1-haltigen Fraktion nach der Cobaltsäule. Alle Fraktionen

zeigen eine markante Bande bei ca. 67 kDa (rot umrandet), was dem Molekulargewicht von

hGBP1 entspricht. Anhand des mitgelaufenen Proteinstandardmarkers (M) konnte die Laufstrecke

der Bande der entsprechenden Masse zugeordnet werden.


94

Die Fraktionen mit dem Protein wurden danach vereinigt und mit 3 M Ammoniumsulfat

gefällt. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Proteinpellet resuspendiert und auf eine

Sephadex® 200 Gelfiltrationssäule aufgetragen Auch hier wurde der Durchfluss wieder

in 4 ml-Fraktionen aufgefangen und zeitgleich über das angeschlossene UV-Spektrometer

die Absorption des Durchflusses bei 280 nm gemessen (Abbildung 4-2). Das dabei

aufgezeichnete Elutionsdiagramm zeigt einen deutlichen Peak für das hGBP1-Monomer

sowie im geringfügigem Maße für das Dimer und andere Verunreinigungen, die durch

unspezifische Bindung an die Cobaltsäule zustande kommen und erst durch die

Gelfiltration vom reinen Protein abgetrennt werden:

Abbildung 4-2: Elutionsprofil der Aufreinigung von hGBP1 mit der Gelfiltrationssäule

(Superdex 200, 26/60; GE Healthcare). Die Kurve zeigt die Absorption bei 280 nm. Das

monomere hGBP1 wird von anderen Verunreinigungen und dimerisierten Proteinen abgetrennt.

Die proteinhaltigen Fraktionen können anschließend auf ein SDS-Gel aufgetragen und danach

aufkonzentriert werden.

Über ein SDS-Gel konnten besonders reine Fraktionen identifiziert (Abbildung 4-3),

anschließend vereinigt und mittels Ultrafiltration aufkonzentriert werden. Die

Proteinkonzentrationsbestimmung erfolgte nach der Methode von Gill und Hippel (Gill

/von Hippel, 1989). Der verwendete Extinktionskoeffizient betrug 44800 M-1

cm-1

. Da ein

ständiges Auftauen und Wegfrieren der Proteinlösung zur Denaturierung und somit zur

Zerstörung der biologischen Aktivität des Proteins führen kann, wurde die Proteinlösung

in Fraktionen von 5 oder 10 µl aliquotiert, mit Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C

bis zur weiteren Verwendung gelagert.


95

Abbildung 4-3: Gelfoto der gesammelten Fraktionen nach der Gelfiltration. Das monomere

Protein ist bei ca. 67 kDa zu sehen (rot umrandet). Die besonders reinen Fraktionen wurden über

Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend bei -80 °C gelagert.

4.2 Biotinylierung von hGBP1

4.2.1 Biotinylierung über einen lysinspezifischen Biotinamidocaproylanker

Die Biotinylierung von hGBP1 in seiner Wildtyp-Form für die spätere Immobilisierung

an der Streptavidin-terminierten SAM-Oberfläche wurde zunächst über das

lysinspezifische Biotinamidohexanoyl-6-aminohexansäure-N-Hydroxysuccinimidester

(Biotinamidocaproyl, Sigma) getestet. Da Biotinamidocaproyl photometrisch nicht

messbar ist, wurde jeweils in einem parallelen Ansatz das Fluoreszein 5-

Carboxyfluoresceinsuccinimidylester eingesetzt, das in seiner Kopplungschemie dem

Biotinanker entspricht.

COOH

O OHHO

C

O

N

O

O

Abbildung 4-4: Strukturformel von 5-Carboxyfluoresceinsuccinimidylester und

Biotinamidocaproyl. Beide Moleküle folgen der gleichen Kopplungschemie.

Um dies zu erreichen, trug sowohl der Anker als auch Fluorescein eine funktionelle

Succinimidylester-Gruppe, die spezifisch an Aminogruppen von Lysinen bindet. Das

NH NH

S

O

HN

ONH

O HN

O

OO

N

O

O

Biotinamidhexanoyl-6-aminohexansäure-

hydroxysuccinimidylester

5-Carboxyfluorescein-

succinimidylester


96

Fluoreszein (molarer Extinktionskoeffizient: 68000 M-1

cm-1

) absorbierte Licht bei

492 nm und emittierte es bei 519 nm. Dadurch war die Kopplung des Fluoreszeins an

Lysinreste spektrometrisch quantifizierbar und konnte auf die spätere Biotinylierung

übertragen werden. Dabei wurde die Annahme gemacht, dass nicht nur die

Kopplungschemie, sondern auch die Kopplungsausbeute, also die Menge an gekoppeltem

Biotinanker bzw. Fluoreszein, identisch ist. In Vorversuchen wurden zunächst

verschiedene Kopplungsbedingungen ausgetestet. Die finalen Standardtestbedingungen

ergaben sich wie folgt:

50-100 µM hGBP1 (in NaHCO3-Puffer)

5facher Überschuss Biotinamidocaproyl (in DMF)

ad 500 µl NaHCO3-Puffer (pH: 8,3)

über Nacht auf Eis

Umpuffern in Standardpuffer (Puffer C*)

Besonders wichtig war die Inkubation auf Eis, um die Denaturierung des hGBP1 zu

vermeiden und die native Struktur sowie die enzymatische Aktivität zu erhalten. Des

Weiteren musste der pH-Wert sehr exakt eingestellt werden, um eine möglichst

spezifische Fluoreszeinierung bzw. Biotinylierung zu erreichen. Der leicht basische pH-

Wert von 8,3 sollte in erster Linie zur Markierung des N-Terminus führen, da sein pKa-

Wert niedriger ist als bei den anderen Lysinen (pKa: 9- 9,5), von denen es im hGBP1 49

gibt. Nachdem der Labeling-Ansatz 1 bis 2 mal über eine NAP5-Säule aufgereinigt

worden war, um nicht gebundenes Fluorescein abzutrennen, wurde die Extinktion bei

280 nm und 519 nm gemessen und ins Verhältnis gesetzt. Bei der Berechnung des

Verhältnisses wurde berücksichtigt, dass der Fluoreszenzfarbstoff auch bei 280 nm

absorbiert und zu der gemessenen Extinktion beiträgt. Exemplarisch ist in der Abbildung

4-5 ein Wellenlängen-Scan für verschiedene Verdünnungen einer hGBP1 Lösung nach

der Fluoreszeinierung gezeigt, aus dem die effektive Labeling-Effizienz berechnet werden

konnte. Die Konzentration der Proteinlösung betrug in diesem Falle ca. 150 µM. Das

Verhältnis von Protein zu Fluoreszein betrug 1: 1,06. Die Reproduzierbarkeit dieser

Labeling-Effizienz war sehr stark von der genauen Einstellung des pH-Wertes abhängig.

Bei geringfügig höheren pH-Werten als 8,3 wurden neben dem N-Terminus zusätzliche

Lysine markiert, wie Abbildung 4-6 zeigt.


97

Abbildung 4-5: Wellenlängenscans von hGBP1 mit Fluoreszenz-Label. Für die

Proteinkonzentrationsbestimmung wurden verschiedene Verdünnungen der Proteinlösung einge-

setzt. Die gemessene Absorption sollte im linearen Bereich zwischen 0,2 und 0,9 liegen, um die

Konzentration der Proteinlösung möglichst genau bestimmen zu können.

Die Anzahl der nicht protonierten Lysine ist bei einem exakt eingestellten pH-Wert von

8,3 ca. 1. Bei einem pH-Wert von 9 liegen tendenziell 2 Label und bei pH 9,5 sogar drei

Abbildung 4-6: pH-abhängige Labeling-Effizienz von 5 Carboxyfluoreszeinsuccinimidyl-

ester. Die Erhöhung des pH-Wertes von 8,3 auf 9 und 9,5 führt zu einem höheren Anteil an nicht

protonierten Lysinen, die damit für die Kopplung mit dem Fluoreszenzmarker zur Verfügung

stehen.


98

Anker vor. Wird der pH-Wert noch weiter bis auf 10 bzw. 10,5, nimmt die Anzahl der

Label drastisch zu, da dann alle Lysine in ihrer nicht protonierten Form vorliegen.

4.2.2 Diskussion der Ergebnisse

Die pH-abhängige und lysinspezifische Kopplung des Biotinankers an hGBP1 hat einige

Nachteile hinsichtlich der Intention, das hGBP1 spezifisch zu biotinylieren und kontrol-

liert, mit vorhersagbarer Orientierung auf einer Streptavidin-terminierten Oberfläche zu

immobilisieren:

1. Eine pH-abhängige Kontrolle bedingt eine sehr exakte Einstellung des pH-Wertes und

der Kopplungsbedingungen. Geringfügige Abweichungen verändern die Kopplungs-

ausbeute. Aufgrund der hohen Anzahl an Lysinen (49) ist darüber hinaus die genaue

Identifizierung der Position der Anker sehr arbeitsintensiv. Zunächst müsste ein

tryptischer Verdau durchgeführt werden und anschließend die über Massenspektrometrie

erhaltenen Massen den Fragmentsequenzen von hGBP1 zugeordnet werden. Erst dann

wäre eine Identifzierung der durch die Ankerkopplung veränderten Fragmentmassen

möglich

2. Bei einem exakt eingestellten pH-Wert von 8,3 lag die Labeling-Effizienz zumeist bei

ca. 1, was darauf schließen lässt, dass unter diesen Bedingungen mit großer Wahrschein-

lichkeit (auch ein anderes Lysin mit hoher Exporniertheit ist nicht generell

ausgeschlossen) der N-Terminus (pKs = 7,5-7,9) markiert ist. Der N-Terminus liegt zwar

nicht direkt in der Interaktionsfläche von hGBP1, aber in der GTPase-Domäne, die die

Dimerisierung vermittelt. Deswegen ist bei N-terminaler Kopplung des Ankers davon

auszugehen, dass die Immobilisierung von biotinyliertem hGBP1 an Streptavidin zu einer

Hemmung der Dimerisierung führt, da dann die GTPase-Domäne zur Oberfläche

gerichtet und folglich nicht (oder kaum) zugänglich ist. Diese Annahme kann durch die

SPR-Messung in Abbildung 4-7 bestätigt werden. Streptavidin, biotinyliertes hGBP1 und

hGBP1 wt wurden nacheinander über einen 10%-igen Biotinthiol-SAM geleitet. Einmal

erfolgte die Bindung von hGBP1 wt mit GppNHp (50 µM) und einmal ohne. In beiden

Fällen ist kaum ein Unterschied bezüglich der Beladung festzustellen, was im

Umkehrschluss heißt, dass die beobachtbare Adsorption nicht mit der Dimerisierung von


99

hGBP1 korreliert. Dieser Vorgang ist offensichtlich gehemmt. Völlig unabhängig davon,

ob der Anker N-terminal gebunden oder an ein Lysin mit hoher Zugänglichkeit gebunden

ist, zeigt die SPR-Messung, dass Dimerisierungsstudien von hGBP1 wt mit einem

lysinspezifischen Biotinamidocaproylanker nicht möglich sind.

Abbildung 4-7: Konsekutive Immobilisierung von Streptavidin, lysinspezifisch biotinyl-

iertem hGBP1 und hGBP1 wt mit und ohne GppNHp. Alle Komponenten wurden jeweils für

10 min bei einer Flussrate von 5 µl/min über die Oberfläche gegeben. Danach erfolgte jeweils

eine Dissoziationsphase von ebenfalls 10 Minuten. Der Positivprobe für hGBP1 wt wurde 50 µM

GppNHp zugesetzt.

3. Für die Biotinylierung mit Biotinamidocaproyl wurden zwar die gleichen Kopp-

lungsbedingungen wie für das Fluoreszenzlabel gewählt, doch wurde die Annahme

gemacht, dass bei gleicher Kopplungschemie auch die Kopplungsausbeute die gleiche ist.

Da sich der Biotinanker und der Floureszeinanker (Abbildung 4-4) in ihrer chemischen

Struktur deutlich unterscheiden, ist nicht auszuschließen, dass dies auch zumindest

geringfügige Auswirkungen auf die Kopplungsausbeute haben könnte.

Aufgrund der dargestellten Nachteile wurde die cysteinspezifische Biotinylierung für alle

hGBP1-Varianten ausgewählt, auf die im nächsten Abschnitt eingegangen wird.


100

4.2.3 Biotinylierung über einen cysteinspezifischen Biotinmaleinimidanker

In der Primärstruktur von hGBP1 liegen 9 Cysteine vor. Die Anzahl der möglichen ge-

koppelten Anker ist somit deutlich kleiner als bei den Lysinen. Die Cysteine sind über die

gesamte Sekundärstruktur des Proteins verteilt (Abbildung 4-8). Davon befinden sich 5

Cysteine innerhalb der GTPase-Domäne (LG-Domäne) von hGBP1 (Cys 12, 82, 225, 235

und 270). Cys 311, 396 und 407 sind in der Mitteldomäne lokalisiert, das Cys 589 ist Teil

des hochflexiblen Isoprenylierungsmotivs. Für diese Cysteine lassen sich Unterschiede in

der Exposition gegenüber dem, sie umgebenden, Solvenz feststellen.

Abbildung 4-8: Kristallstruktur von hGBP1 mit Nukleotid (rot) und Mg2+

(grau). Alle

Cysteine sind über die schwarzen Pfeile markiert. 5 Cysteine sind in der LG-Domäne, 3 in der

Mitteldomäne un das Cys 589 im CaaX-Motiv lokalisiert.

Eine Abschätzung der Exporniertheit der einzelnen Cysteine ist über die Accessible

Surface Area (ASA) möglich. Die ASA gibt Informationen über die solvenzexponierte

Oberfläche des zu untersuchenden Moleküls. Dazu wird eine Sonde (Kugel mit einem

Radius von 1,4 Å, entspricht dem Radius eines Wassermoleküls) über die zu

untersuchende Oberfläche bewegt wird (Kristallstruktur des Proteins). Unter

Einbeziehung eines entsprechenden Algorithmus wird anschließend die ASA berechnet

(Tsodikov et al., 2002; Richards, 1977). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt

(Vöpel et al., 2009). Aufgrund dieser Berechnungen und des zur Überprüfung der

vorhergesagten Zugänglichkeiten durchgeführten 5,5´-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure)

(DTNB)-Tests (Vopel et al., 2009) konnten nun Mutanten von hGBP1 hergestellt werden,

in denen insbesondere die Cysteine, die sich in der GTPase-Domäne befinden und für die

eine hohe Exporniertheit berechnet wurde, durch Einführung einer gezielten

Punktmutation ausgetauscht worden sind.


101

Tabelle 2: Ergebnisse der ASA Berechnung. Die Kristallstrukturen von hGBP1 ohne Nukleotid

(1dg3, PDB) und die der LG-Domänen gebunden an GDP*AlFx (2b92, PDB) wurden für die

Berechnung verwendet (entnommen aus Vöpel et al., 2009). Das C589 ist Teil des hochflexiblen

Isoprenylierungsmotivs und wurde bei der Berechnung nicht miteinbezogen.

Aminosäure ASA (Å²) PDB: 1dg3 ASA (Å²) PDB: 2b92

Cys 12 14,1 22,8

Cys 82 0 0,9

Cys 225 7,6 36,3

Cys 235 2,3 2,1

Cys 270 12,1 15,3

Cys 311 7,3 -

Cys 396 18,5 -

Cys 407 0 -

Cys 589 - -

Um eine spezifische und vor allen Dingen vorhersagbare Kopplung des Biotinankers zu

ermöglichen, wurde für alle in dieser Arbeit verwendeten hGBP1-Mutanten eine hGBP1-

Variante verwendet, die im Folgenden mit Cys5 bezeichnet wird. In der Cys5-Mutante

sind die Cysteine ausgetauscht worden, für die in den ASA-Berechnungen eine hohe

Exporniertheit vorhergesagt wurde. Die betroffenen Cysteine sind C12, C270, C311,

C396 und C589 (Teil des Isoprenylierungsmotivs (CaaX-Box)). Das C225 hat nur im

nukleotidgebundenen Zustand eine hohe Zugänglichkeit und sollte auf die Biotinylierung

keinen Einfluss haben, da diese nukleotidfrei vonstatten geht. Auf der Basis der Cys5-

Abbildung 4-9: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Glutamin an der Position 577.

Das Glutamin (Q) wurde durch ein Cystein (C), um an dieser Position eine gezielte Kopplung des

Biotinankers zu ermöglichen.


102

Mutante wurden weitere Mutanten hergestellt, die für die Bindung an Streptavidin auf der

Biotin-SAM-Oberfläche genutzt werden sollten. Zum einen wurde eine Einfachmutante

erzeugt, bei der an der Position 577 ein Glutamin durch ein Cystein ersetzt wurde.

Zum anderen wurde neben der Einführung des Cysteins an der Stelle 577 ein weiteres

Cystein an der Position 485 eingebaut. Diese auf der Basis von Cys5 hergestellte Dop-

pelmutante ist in Abbildung 4-10 dargestellt:

Abbildung 4-10: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Glutamin 577 und Lysin 485.

Beide Positionen wurden durch ein Cystein ersetzt.

Bei der dritten Mutante sollte ausschließlich die Position 485 biotinyliert werden

(Abbildung 4-11).

Abbildung 4-11: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Lysin 485. Das Lysin wurde

für eine spezifische Biotinmaleinimidverankerung durch ein Cystein ersetzt.

Die beiden Einfachmutanten Q577C und K485C sollten im Vergleich zur zweifach

biotinylierten Mutante Q577C/ K485C erwartungsgemäß ein anderes Bindungsverhalten

und in Folge dessen eine andere Orientierung und Flexibilität auf der Oberfläche zeigen.


103

Dies nachzuweisen und zu belegen, steht im Vordergrund dieses 1.Projektes (Kapitel 4).

Erst im zweiten Projekt (Kapitel 5) soll die Dimerisierung von hGBP1 betrachtet und

hinsichtlich kinetischer Aspekte untersucht werden. Da die Dimerisierung hauptsächlich

über die G-Domäne vermittelt wird, wurde für diese Studien in erster Linie die Mutante

K485C (Abbildung 4-11) erzeugt, bei der dieser Bereich frei zugänglich ist und das hGBP1

praktisch als „Fängermolekül“ für in Lösung befindliche hGBP1-Moleküle fungieren

kann.

Für die Biotinylierung der drei Mutanten wurde das Kit „Maleimid-PEG11-Biotin“

(Thermo Scientific) verwendet. Der Linker ist 59,1 Å lang und hat eine molare Masse von

922,09 g/mol. Die Reaktionsbedingungen und die Berechnung der benötigten Menge an

Biotin Reagenz wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die

Kopplungsreaktion erfolgte für 2 Stunden auf Eis in 50 mM Phosphatpuffer.

Anschließend wurde in Puffer C* umgepuffert. Neben der Einfach- und Doppelmutante

wurde jeweils ein dritter Ansatz mit der nicht mutierten Cys5 angesetzt, um

auszuschließen, dass neben den Cysteinen an der Position 577 und/oder 485 noch andere

Cysteine unter den gewählten Reaktionsbedingungen mit dem Biotinanker reagieren.

Für die Quantifizierung der Biotinylierung wurde das „EZTM

Biotin Quantitation Kit“ von

Thermo Scientific verwendet. Alle Arbeitsschritte wurden gemäß Anleitung durchgeführt.

Zur Überprüfung des Farbtests wurde zunächst die vom Hersteller mitgelieferte

Merrettichperoxidase (HRP), die ausschließlich einen Biotinanker besaß, eingesetzt.

Tabelle 3: Ergebnisse der Quantifizierung der Biotinylierungseffizienz über das "EZTM

Bio-

tin Quantitation Kit".

Protein Anzahl der Anker

Merrettichperoxidase (HRP) 1,05

Cys5 0,08

Einfachmutante Q577C 1,1

Doppelmutante Q577C/ K485C 1,96

Einfachmutante K485C 0,98

Dieser eine Anker konnte mit einer Varianz von weniger als 10 % ermittelt werden.

Die Ergebnisse der Quantifizierung sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Da für die Merrettichperoxidase genau ein Anker nachgewiesen werden konnte, wurde

der Beweis erbracht, dass unter den gewählten Versuchsbedingungen der Farbtest funkti-


104

oniert. Desweiteren wurde für die Cys5-Mutante, die die Basis für die anderen Mutanten

(Q577C und Q577C/K485C) bildet, keine Ankerkopplung nachgewiesen und damit ge-

zeigt, dass die in der Cys5 vorhandenen Cysteine bei den verwendeten Inkubationszeiten

von 2 Stunden und den Reaktionsbedingungen (auf Eis in Phosphatpuffer) keine Kopp-

lungsreaktion mit dem Biotinanker eingehen. Erwartungsgemäß wurden für die Doppel-

mutante zwei Anker und für die beiden Einfachmutanten ein Anker mit hoher Effizienz

nachgewiesen.

4.2.4 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse

Im Gegensatz zu der lysinspezifischen und pH-abhängigen Biotinankerkopplung erweist

sich die Kopplung über die Cysteine in hGBP1 als deutlich einfacher und vor allen Din-

gen effektiver. Da es im hGBP1 nur 9 Cysteine (aber 49 Lysine) gibt, von denen 5 eine

hohe Exporniertheit gegenüber dem umgebenden Solvenz zeigen (Berechnung über

ASA), war es durch Einführung gezielter Punktmutationen möglich, diese Cysteine durch

Serin oder Alanin zu ersetzen. Die daraus entstandene Cys5-Mutante wurde eingesetzt,

um die an den Positionen 577 und/oder 485 gezielt eingefügten Cysteine mit einem

Biotinmaleinimidanker zu koppeln. Über einen Farbschnelltest, der die direkte

Quantifizierung der gebundenen Anker im Protein ermöglicht, wurde die erfolgreiche

Kopplung von einem Anker an die Einfachmutanten und zwei Anker an die

Doppelmutante nachgewiesen. Da für die veränderte Cys5 keine Ankerkopplung

festgestellt werden konnte, war damit gezeigt, dass sich die Anker an der Position 577

und/oder 485 befinden müssen. Bei der lysinspezifischen Kopplung wäre die Substitution

aller Lysine durch Punktmutationen im vorgegebenen Zeitrahmen nicht möglich gewesen.

Auch der für die cysteinspezifische Kopplung angewandte Farbtest zur Quantifizierung

ist wegen der hohen Anzahl an Lysinen nicht anwendbar. In dem Fall wäre der

zeitintensive Weg über enzymatischen Verdau und massenspektrometrischen (MALDI)

Nachweis unumgänglich.


105

4.3 Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin-

hGBP1-Systems

4.3.1 Massenspektrometrischer Nachweis des immobilisierten Streptavidin und

hGBP1 an der Biotin-SAM-Oberfläche

Im nächsten Schritt wurde ein Goldwafer mit einem aufgebrachten Biotinthiol-SAM

(10%ig im Bezug auf OH-Thiol) und den über Oberflächenplasmonenspektroskopie im-

mobilisierten Proteinen Streptavidin und hGBP1 mit His-tag und Biotinanker einer mas-

senspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF unterzogen, um die detektier-

ten Massen mit den aus der Kristallstruktur theoretisch ermittelten Massen zu verglei-

chen. Exemplarisch wurde für die Immobilisierung die Einfachmutante Q577C

verwendet.

Zunächst wurden die Massen von Streptavidin und hGBP1 in Lösung gemessen. Für

diese Messung wurde das hGBP1 ohne Biotinanker eingesetzt. Die verwendeten Matrizes

waren bei Streptavidin Sinapinsäure und bei hGBP1 Zimtsäure:

Abbildung 4-12: MALDI-Spektrum von Streptavidin. Die verwendete Matrix ist Sinapinsäure.

Der Peak mit der höchsten Intensität bei m/z = 13105,5 entspricht einem Streptavidin-Monomer.

Die aktive Form von Streptavidin, das Tetramer, ist nur sehr schwach zu erkennen (m/z =

52256,7).


106

Das tetramere Streptavidin hat eine molare Masse von 52168 kDa (UniProt: P22629), was

gut mit der im MALDI-Spektrum erhaltenen Masse übereinstimmt (m/z = 52256,7).

Abbildung 4-13: MALDI-Spektrum von hGBP1. Die verwendete Matrix ist Zimtsäure. Die

beiden Peaks bei 69507,7 und 34753,8 lassen sich der molaren Masse von hGBP1 als einfach und

zweifach geladenes Molekülion zuordnen.

Abbildung 4-14: MALDI-Spektrum von Biotinthiol auf einer Goldoberfläche. Der Peak bei

m/z= 596,7 entspricht dem Molekulargewicht von Biotinthiol mit einem Na+-Addukt


107

Des Weiteren lassen sich das dimere und monomere Streptavidin (m/z = 26150,2 und

13105,5) detektieren. Das MALDI-Spektrum von hGBP1 (Abbildung 4-13) zeigt zwei

markante Peaks bei m/z = 69507,7 und 34753,8, die der Masse von hGBP1 (69384 g/mol;

UniProt: P32455). Im nächsten Spektrum (Abbildung 4-14) erfolgte die direkte Ionisierung

des Biotinthiol-SAMs von der Goldoberfläche. Da für den Misch-SAM, bestehend aus

10 % Biotinthiol und 90 % Merkaptoundekanol, keine ausreichenden Intensitäten erreicht

werden konnten, wurde eine Goldoberfläche mit 100 % Biotinthiol präpariert. Der Peak

bei 596,7 entspricht dem Biotinthiol (574 g/mol) und einem Na+-Addukt. Das

Streptavidin konnte auf der Biotinthiol-SAM-Oberfläche (hier Misch-SAM, bestehend

aus 10 % Biotinthiol und 90 % OH-Thiol) nach Immobilisierung über Oberflächenplas-

monenresonanzspektroskopie als einfach (m/z = 6508,8) und zweifach (m/z = 13003,2)

geladenes Monomer sowie Dimer (m/z = 26081,3) nachgewiesen werden (Abbildung

4-15)

Abbildung 4-15: MALDI-Spektrum von immobilisiertem Streptavidin auf einem

Biotinthiol-SAM. Das Streptavidin wurde mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie

(SPR) immobilisiert. Das Streptavidin-Monomer (m/z = 13003,15 (einfach geladen) und 6508,8

(zweifach geladen)) sowie das Dimer (m/z = 26081,3) lassen sich dem Spektrum zuordnen.

Wird die Oberfläche anschließend mit hGBP1 beladen, lässt sich ein schwacher Peak bei

ca. m/z = 70430 identifizieren (Abbildung 4-16), der dem hGBP1 (m/z = 69507,7) mit

Biotinanker (M = 922,09 g/mol) zuzuordnen ist.


108

Abbildung 4-16: MALDI-Spektrum von nacheinander immobilisiertem Streptavidin und

hGBP1 auf einem Biotinthiol-SAM. Die Immobilisierung erfolgte über SPR. Streptavidin-

Monomer (13390,9) und Dimer (26415,4) sowie das hGBP1 mit His-tag und Biotinanker

(70430,4) lassen sich den gemessenen Massen zuordnen.

4.3.1.1 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse

Die Ergebnisse der MALDI-Messungen zeigen, dass die beiden Proteinkomponenten,

Streptavidin und hGBP1 sowie das Biotinthiol als wichtigste SAM-Komponente

erfolgreich auf der Goldoberfläche immobilisiert werden konnten und direkt auf dem

SPR-Chip detektierbar waren. Besonders hervorzuheben ist darüber hinaus, dass

Streptavidin in Lösung (Abbildung 4-12) nicht nur als Monomer und Dimer, sondern

auch in seiner tetrameren Form, wenn auch mit sehr geringer Intensität, detektierbar war.

Erst kürzlich (Wortmann et al., 2007) wurde in diesem Zusammenhang das so genannte

„first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry“ untersucht. Dahinter verbirgt sich

die Beobachtung, dass „nicht-kovalente“ Proteinkomplexe wie das tetramere Streptavidin

nur nach einem einzigen Laserpuls detektierbar seien und bei weiteren Shots direkt in

Monomere und Dimere zerfallen. Deswegen ist es umso bemerkenswerter, dass es bei

geringer Laserintensität und 50 Shots gelungen ist, das tetramere Streptavidin zu

identifizieren. Auch wenn die Intensität des Massenpeaks noch sehr gering ausfällt, ist

eine erste Grundlage für zukünftige Studien gelegt.


109

4.3.2 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen

4.3.2.1 Einfluss der verwendeten Biotinthiolkonzentration auf die Immobilisierung

von hGBP1

In vorherigen Arbeiten (Chelmowski et al., 2007) wurde bereits untersucht, welchen Ein-

fluss die verwendete Biotinthiolkonzentration auf die Belegungsdichte von Streptavidin

hat und welches Mischungsverhältnis zwischen Biotinthiol und OH-Thiol für die

Immobilisierung des Proteins optimal ist. Hierbei wurde festgestellt, dass im Bereich

zwischen 5 und 10 % Biotinthiol die Belegung von Streptavidin maximal ist und der

Anteil an unspezifischer Adsorption minimiert werden kann. In dieser Arbeit wurde

zusätzlich der Einfluss der Biotinthiolkonzentration auf die Immobilisierung von hGBP1

auf Streptavidin gemessen. Hierzu wurden die SPR-Goldwafer mit verschieden

konzentrierten Biotinthiol-Lösungen im Bereich zwischen 0,1 und 10 % (die Verdünnung

erfolgte mit OH-Thiol-Lösung) über 3 Stunden inkubiert und anschließend mittels SPR

die beiden Proteinkomponenten Streptavidin und biotinyliertes hGBP1 (Einfachmutante

Q577C und Doppelmutante Q577C/K485C) über die SAM-Oberfläche geleitet

Abbildung 4-17: Konsekutive Immobilisierung von Streptavidin und biotinyliertem hGBP1

(Doppelmutante Q577C/K485C) auf unterschiedlich biotinylierten SAMs. Die

Prozentangaben in der Legende beziehen sich auf die Konzentration an Biotinthiol in der binären

Mischung mit OH-Thiol.


110

Für die Einfachmutante K485C wurde diese Studie nicht durchgeführt. In Abbildung 4-17

ist die konsekutive Immobilisierung von Streptavidin und exemplarisch für die

Doppelmutante gezeigt.

Abbildung 4-18: Beladung der Oberfläche mit Streptavidin und den beiden hGBP1-

Mutanten (Q577C und Q577C/K485C) in Abhängigkeit von der Biotinthiolkonzentration.

Die Konzentration von Biotinthiol bezieht sich auf die binäre Mischung mit OH-Thiol.

Die Kopplung von Streptavidin und den beiden hGBP1-Mutanten Q577C und

Q577C/K485C in Abhängigkeit von der Biotinthiolkonzentration sind in Abbildung 4-18

zusammengefasst. In Tabelle 4 sind die Maximalwerte der Beladung für Streptavidin und

den beiden hGBP1-Mutanten bei der jeweiligen Biotinthiol-Konzentration dargestellt.

Streptavidin erreicht erwartungsgemäß im Bereich zwischen 5 und 10 % Biotinthiol die

höchste Beladung mit 160 bzw. 154 ng/cm2 (Chelmowski et al., 2007). Ansonsten lässt

sich das Immobilisierungsverhalten von Streptavidin so beschreiben, dass zwischen 0,1

und 0,4 % einen im Rahmen der Fehlergrenzen einheitlicher Wert von knapp 40 ng/cm²

festgestellt werden kann, der beim Übergang von 0,4 (37 ng/cm²) zu 0,6 % (110 ng/cm²)

auf den dreifachen Wert rapide ansteigt. Die Entwicklung zwischen 0,6 und 5 %

Biotinthiol lässt sich dagegen eher mit einem kontinuierlichen Anstieg der

Streptavidinbelegung beschreiben. Für die Einfachmutante Q577C ist ein analoges

Verhalten zum Streptavidin festzustellen. Auch hier liegt die Maximalbelegung zwischen

5 und 10 % Biotinthiol (190 bzw. 185 ng/cm²).


111

Tabelle 4: Ergebnisse der Belegung von Streptavidin und den biotinylierten hGBP1-

Mutanten in Abhängigkeit von der Biotinthiolkonzentration

Biotinthiol-

Konzentration

[mol-%]

Maximale Beladung

Streptavidin

[ng/cm²]

Maximale Beladung

K485C/Q577C

[ng/cm²]

Maximale Beladung

Q577C

[ng/cm²]

0,1 38 ± 5 78 ± 5 59 ± 5

0,2 32 ± 5 92 ± 5 60 ± 5

0,4 37 ± 5 85 ± 5 55 ± 5

0,6 110 ± 5 90 ± 5 162 ± 5

0,8 105 ± 5 85 ± 5 163 ± 5

1 130 ± 5 72 ± 5 175 ± 5

5 160 ± 5 65 ± 5 190 ± 5

10 154 ± 5 52 ± 5 185 ± 5

Wie bei Streptavidin steigt die Maximalbelegung beim Übergang von 0,4 (55 ng/cm²) zu

0,6 % Biotinthiol sprunghaft auf den dreifachen Wert an. Dagegen zeigt die

Doppelmutante ein innerhalb des untersuchten Biotinthiolkonzentrationsbereiches

unabhängiges Immobilisierungsverhalten. Insgesamt nimmt die Belegung von 0,1 bis

10 % Biotinthiol um ein Drittel ab. Ein sprunghafter Anstieg zwischen 0,4 und 0,6 %

Biotinthiol kann nicht beobachtet werden.

Die Ermittlung der molaren Verhältnisse zwischen Streptavidin und den beiden Mutanten

ergeben sich im Bereich von 5 und 10 % Biotinthiol wie folgt. Für die Berechnung wird

die erhaltene Beladung durch die molare Masse von Streptavidin (52 kDa) bzw. hGBP1

(69 kDa) geteilt und die erhaltenen Werte ins Verhältnis gesetzt:

Beispiel (10 % Biotinthiol):

52 154(Doppelmutante) (Strep) 0,0008 0,003 0,27

69.000 52.000

Das molare Verhältnis von Streptavidin zur Doppelmutante ist somit 1: 0,27. Auf ein

hGBP1-Molekül kommen also ca. 4 Tetramere Streptavidin. Dementsprechend ergeben

sich für die Berechnung der anderen molaren Verhältnisse bei 10 % Biotinthiol folgende

Werte:

Streptavidin: Einfachmutante = 1 : 0,95


112

Doppelmutante: Einfachmutante = 1 : 3,55

Das Verhältnis von Streptavidin zu der Einfachmutante Q577C kann demnach mit

meinem 1:1-Verhältnis beschrieben werden. Die Beladung der Einfachmutante im

Vergleich zur Doppelmutante ist drei- bis vierfach höher. Bei 0,4 % Biotinthiol, also

direkt vor dem sprunghaften Anstieg der Beladung mit Streptavidin und der

Einfachmutante, ergeben sich die folgenden molaren Verhältnisse:

0,4 % Biotinthiol:

Streptavidin: Einfachmutante = 1: 1,17

Streptavidin: Doppelmutante = 1: 1,81

Doppelmutante: Einfachmutante = 1: 0,72

Das Verhältnis von Streptavidin zur Einfachmutante bleibt auch hier in etwa 1:1. Die

Belegung der Doppelmutante jedoch ist bei 0,4 % Biotinthiol fast doppelt so groß

gegenüber Streptavidin und auch im Vergleich zur Einfachmutante wird ca. ein Drittel

mehr immobilisiert.


Aus diesen Ergebnissen ließen sich für die weitere Vorgehensweise wichtige Erkennt-

nisse ziehen. Die Veränderung der Biotinthiolkonzentration hat einen gravierenden Ein-

fluss auf das Gesamtsystem mit den Komponenten Streptavidin und den beiden biotiny-

lierten hGBP1-Mutanten. Im Bereich zwischen 5 und 10 % Biotinthiol lassen sich die

gemessenen Beladungen und berechneten molaren Verhältnissen sehr gut mit den be-

kannten molekularen Geometrien der beteiligten Proteine und den aufgrund der Einfach-

bzw. Mehrfachbiotinylierung zu erwartenden unterschiedlichen Orientierungen der

beiden hGBP1-Mutanten in Einklang bringen. Für die Einfachmutante ist gegenüber der

Doppelmutante bei 10 % Biotinthiol eine 3 bis 4-fach höhere Belegung ermittelt worden.

Wenn davon ausgegangen wird, dass die Einfachmutante mit einem Anker an die

Oberfläche gebunden ist, die Doppelmutante jedoch mit zwei Ankern, die an den beiden

Enden der langen Seite des Moleküls lokalisiert sind, ergeben sich für die Mutanten

unterschiedliche Footprints, also Kontaktflächen mit der Oberfläche. Der Anker der

Einfachmutante ist im Bereich der GTPase-Domäne von hGBP1 lokalisiert. Die Mutante


113

Q577C sollte also senkrecht auf der Oberfläche stehen, wobei die G-Domäne zur

Oberfläche gerichtet ist. Wird die aus der Kristallstruktur bekannte Geometrie von

hGBP1 für die Berechnung des Footprints zugrundegelegt ((2-3) nm x 4 nm x 13 nm)

würde die Kontaktfläche ca. 8 bis 12 nm² groß sein. Im Gegensatz dazu besitzt die

Doppelmutante zwei Anker an den beiden Enden der langen Seite von hGBP1 (13 nm),

die dazu führen, dass das hGBP1 flach auf der Oberfläche liegt und damit einen 3 bis 4-

fach höheren Footprint (3 x 13 nm = 39 nm²) auf der Oberfläche einnimmt. Folglich ist

zu erwarten, dass die gemessene Belegung für die Doppelmutante ca. 3 bis 4-fach kleiner

ausfallen müsste als für die Einfachmutante, was durch das molare Verhältnis von 1 zu

3,55 (Doppelmutante: Einfachmutante) bestätigt wird. Auf Basis dieser Überlegungen

lässt sich ebenso begründen, warum die Einfachmutante bei 10 % Biotinthiol in einem 1

zu 1 Verhältnis (1: 0,95 ↔ Streptavidin: Einfachmutante), die Doppelmutante in einem 1

zu 4 Verhältnis (1: 0,276 ↔ Streptavidin: Doppelmutante) gegenüber Streptavidin an die

Oberfläche bindet. Während der Footprint der Einfachmutante ausreichend klein ist, um

eine Bindung mit jedem Streptavidin-Molekül einzugehen, werden bei der

Doppelmutante 3 bis 4 Proteine Streptavidine bedeckt. Die Bindung der Q577C/K485C

an die Oberfläche erfolgt also nur über jedes vierte Molekül Streptavidin, wodurch auch

zu erklären wäre, warum die Immobilisierung der Doppelmutante auch im Bereich

zwischen 0,1 und 0,4 % Biotinthiol konstant bleibt. Streptavidin verfügt, wenn es an eine

organische Oberfläche angekoppelt wird, über eine Kontaktfläche von 4,5 nm * 5,3 nm =

23,85 nm². In einem dicht gepackten SAM aus Alkanthiolen wird diese Fläche von mehr

als 111 Alkanthiol-Molekülen ausgefüllt, sofern man den Platzbedarf pro Alkanthiol-

Molekül mit 21,4 Å² ansetzt. In einer Proteinmonolage benötigen die Proteine mehr Platz

als die geometrische Grundfläche. Für Streptavidin wurde eine maximale

Flächenausfüllung von 66 % in einem zweidimensionalen Proteinkristall gemessen (Knoll

et al., 2000). Auf biotinylierten Lipiden, wo die Streptavidine gegeneinander verschiebbar

sind, wurde eine Flächenausfüllung von 65 % und auf biotinylierten SAM-Oberflächen

von 53 % beobachtet, d. h. um eine vollständige Streptavidin-Monolage an einer

organischen Dünnschicht aufzubauen, genügt es, auf 222 OH-Thiole statistisch ein

Biotinthiol anzukoppeln, was einer Konzentration von 0,45 mol-% Biotinthiol entspricht

(Ostuni, E., Yan, L., Whitesides, G. M., 1999). Diese theoretischen Überlegungen lassen

sich mit den gemessenen Beladungen in Einklang bringen. Beim Übergang von 0,4 zu

0,6 % steigt die Adsorption von Streptavidin auf ca. das Dreifache des ursprünglichen

Wertes an (110 → 37 ng/cm²). Gemäß den statistischen Berechnungen ist bei 0,4 % der


114

Aufbau einer Streptavidin-Monolage nicht mehr möglich, bei 0,6 % dagegen schon. Der

Grund, warum die Immobilisierung der Doppelmutante zwischen 0,1 und 0,4 %

Biotinthiol jedoch konstant bleibt, lässt sich so erklären, dass, wie bereits erwähnt, ca. 3

bis 4 Moleküle Streptavidin von der flach auf der Oberfläche liegenden Mutante bedeckt

werden und somit an der Bindung nicht beteiligt sind. Erst bei weiterer Abnahme der

Biotinthiolkonzentration müsste folgerichtig auch die Belegung der Doppelmutante

abnehmen. Da die Einfachmutante an jedes Streptavidin-Molekül bindet, sollte sich die

Immobilisierung parallel zur Belegung von Streptavidin verhalten, was durch die

Ergebnisse bestätigt wird. Beim Übergang von 0,4 zu 0,6 % Biotinthiol ist sowohl bei

Streptavidin als auch bei der Q577C ein sprunghafter Anstieg der Adsorption

festzustellen.

Des Weiteren lässt sich zwischen von 0,4 und 10 % ein höherer Anteil an unspezifischer

Bindung der Einfachmutante an die mit Streptavidin belegte Oberfläche feststellen.

Während bei 0,4 % Biotinthiol das molare Verhältnis von Streptavidin zu Einfachmutante

1: 1,17 beträgt, verändert sich der Wert bei 10 % auf 1: 0,95, nähert sich also einem

exakten 1:1-Verhältnis an. Dieses Ergebnis untermauert die in früheren Studien

beschriebenen Beobachtungen (Chelmowski et al., 2007), dass der Anteil an unspezifisch

gebundenem Protein zwischen 5 und 10 % Biotinthiol am geringsten ist. Des Weiteren

wurde festgestellt, dass unterhalb von 5 % Biotinthiol die Bindungsstellen für

Streptavidin zunehmend verarmen, was zu einer verminderten Belegung führt. Auch dies

kann durch die Ergebnisse bestätigt werden. Die Beladung hat ein Maximum zwischen 5

und 10 % Biotinthiol (160 bzw. 154 ng/cm²) und sinkt kontinuierlich auf 130 (1 %

Biotinthiol) und weiter auf 110 bzw 105 ng/cm² ab (0,6 bzw 0,8 % Biotinthiol), bevor

dann der abrupte Abfall folgt, der, wie beschrieben, dadurch zustande kommt, dass eine

Streptavidin-Monolage nicht mehr ausgebildet werden kann. Obwohl die Belegung der

Doppelmutante insgesamt relativ konstant ist, ist ein leichtes Absinken der Beladung

Anstieg der Adsorption von 78 ng/cm² bei 0,1 % Biotinthiol auf 52 ng/cm² be1 10 %

Biotinthiol festzustellen. Auch hier kann sicherlich mit einer Abnahme an unspezifischer

Adsorption argumentiert werden, was ein weiteres Argument für eine Beibehaltung der

ursprünglichen Biotinthiolkonzentration von 10 % Biotinthiol für die weiteren

Messungen ist. Darüber hinaus könnte der Anstieg der Beladung auch damit erklärt

werden, dass mit zunehmender Verarmung der Streptavidin-Moleküle auf der Oberfläche

die Doppelmutante nicht mehr mit beiden Ankern an die Oberfläche immobilisiert,

sondern teilweise nur mit einem, was eine Verkleinerung des Footprints und damit die


115

Möglichkeit für eine höhere Belegung bietet. Auch diese Erklärung führt aber ebenso zu

der Erkenntnis, dass die Verringerung der Biotinthiolkonzentration unterhalb von 5 %

Biotinthiol die Belegung mit Streptavidin und hGBP1 unkontrollierbar macht und keine

eindeutigen Aussagen über molare Verhältnisse und Orientierung der Moleküle auf der

Oberfläche zulassen, da zunehmend störende Faktoren, wie die unerwünschte spezifische

Bindung, auf die Messungen Einfluss nimmt.

4.3.2.3 Überprüfung der unspezifischen Adsorption von Streptavidin und hGBP1

auf einem reinen OH-Thiol-SAM

In Abbildung 20 ist die unspezifische Adsorption der verwendeten Proteine auf einem

OH-terminierten SAM dargestellt. Zunächst wurde Streptavidin dreimal hintereinander

jeweils für 45 Minuten inkubiert (A1- A3). Die Mehrfachinkubation diente dazu, auch die

unspezifische Adsorption von Streptavidin auf Streptavidin zu betrachten. Anschließend

erfolgte die Adsorption von hGBP1 ohne Anker direkt auf Streptavidin (A4). In allen

Fällen A1 bis A4 fällt die Adsorption sehr gering aus und steigt maximal auf 2 ng/cm² an.

Abbildung 4-19: Unspezifische Adsorption von Streptavidin und hGBP1 auf einem reinen

OH-Thiol-SAM. Die grüne und rote Kurve zeigen die unspezifische Adsorption von Streptavidin

auf einem SAM aus OH-Thiol (A1-A3) und die von hGBP1 ohne Anker auf dem unspezifisch

adsorbierten Streptavidin (A4). In der schwarzen Kurve (B) ist die unspezifische Adsorption von

hGBP1 auf dem OH-Thiol-SAM dargestellt.


116

Da nach Dissoziation (Waschen) der Wert sowohl für Streptavidin als auch für hGBP1

wieder auf null (Mads > 0,5 ng/cm²) abfällt, sind für den beobachtbaren Anstieg in erster

Linie minimale „Bulk“-Effekte verantwortlich. Die unspezifische Adsorption von hGBP1

direkt auf OH-Thiol fällt mit ca. 5 ng/cm² geringfügig höher aus und sinkt auch während

der Dissoziationsphase nicht weiter ab. Insgesamt ist für alle beteiligten Proteinkompo-

nenten die unspezifische Bindung zwar messbar, aber sehr schwach und damit kaum von

Relevanz.

4.3.2.4 Kontrolle der Streptavidinbelegung

Im Abschnitt 2.7 wurde bereits ausführlich über das Biotin-Streptavidin-System gespro-

chen und anhand des in der Literatur beschriebenen Fallbeispiels (Chelmowski et al.,

2007) konnten bereits wichtige Erkenntnisse bezüglich der Adsorptionskinetik und Bele-

gung von Streptavidin gewonnen werden, die in dieser Arbeit ihre Anwendung finden.

Um die Reproduzierbarkeit der Belegung für verschiedene Goldwafer zu überprüfen,

wurden SPR-Goldchips für exakt zwei Stunden in 10 % Biotinthiol und 90 % OH-Thiol

inkubiert und anschließend Streptavidin für 20 Minuten mittels SPR inkubiert. Die Er-

gebnisse sind in Abbildung 4-20 und Tabelle 4 dargestellt.

Abbildung 4-20: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Adsorption von Streptavidin auf

verschiedenen SPR-Goldchips. Die Goldchips wurden zwei Stunden mit 10 % Biotinthiol und

90 % OH-Thiol inkubiert. Anschließend wurde über 20 Minuten Streptavidin (0,4 µM) über die

Oberfläche geleitet.


117

Tabelle 5: Streptavidin-Belegung auf verschiedenen Goldchips

Anzahl der Messungen Adsorption Streptavidin [ng/cm²]

1 (hellblaue Kurve) 137

2 (gelbe Kurve) 141

3(braune Kurve) 137

4 (schwarze Kurve) 137

5 (violette Kurve) 142

6 (rote Kurve) 141

7 (dunkelgrüne Kurve) 141

8 (dunkelblaue Kurve) 140

9 (olivgrüne Kurve) 140

Der Mittelwert der Einzeladsorptionen ergibt sich zu 139,6 ng/cm², die Standardab-

weichung beträgt ± 2 ng/cm², was einer prozentualen Abweichung von weniger als 2 %

entspricht.

Abbildung 4-21: Adsorption von Streptavidin (1. Anstieg) und den beiden hGBP1-Mutanten

auf einem Biotinthiol-SAM (2.Anstieg). Die Belegungsdichte mit Streptavidin (ca. 145 ng/cm²)

ist bei 10 % Biotinthiol gut kontrollierbar und reproduzierbar. Die Beladung der Einfach- (rote

Kurve) und Doppelmutante (schwarze Kurve) erfolgt ca. in einem 3:1-Verhältnis. Die

unspezifische Adsorption für das nicht biotinylierte hGBP1 ist in der blauen Kurve dargestellt.


118

In der Abbildung 4-21 ist zunächst die Bindungskinetik der beiden hGBP1-Mutanten

Q577C und Q577C/K485C auf Streptavidin gezeigt. Für die Präparation des Goldwafers

wurde 10 % Biotinthiol verwendet, um eine möglichst maximale Belegung zu erreichen

und den Anteil an unspezifischer Adsorption gering zu halten, und für ca. 3 Stunden

inkubiert. Die Belegung mit Streptavidin (0,4 µM) und Dissoziation erfolgte jeweils über

20 Minuten, bevor die beiden hGBP1-Mutanten (1 µM) und als Referenz hGBP1 ohne

Anker für weitere 20 Minuten über die Oberfläche geschickt wurden. Die anschließende

Dissoziationsphase erfolgte hier über 50 Minuten Wie in Abschnitt 4.3.2.2 bereits

besprochen, lassen sich die beiden Mutanten anhand ihrer Belegung unterscheiden, die

aus der unterschiedlichen Anzahl von Ankern (1 bzw. 2 Anker) und der daraus ergebenen

Orientierung auf der Oberfläche resultieren.

Abbildung 4-22: Bindungskinetiken der drei hGBP1-Mutanten. Die drei Mutanten sind

anhand ihres Bindungsverhaltens klar unterscheidbar. Die Belegung erfolgt in einem 3:2:1

Verhältnis (Q577C: K485C: Q577C/K485C).

In einer weiteren Messserie wurden zusätzlich die Mutante K485C hinsichtlich ihres

Immobilisierungsverhaltens untersucht und ihre Belegungsdichte mit den anderen beiden

Mutanten verglichen. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 4-22 dargestellt. Für beide

Messungen (Abbildung 4-21) ergibt sich eine einheitliche Belegung mit Streptavidin

von145 ng/cm², was einer Belegung von ca. 30 % entspricht, wenn für Streptavidin eine


119

Kontaktfläche (Footprint) von 23,85 nm² angenommen (Ostuni, E., Yan, L., Whitesides,

G. M., 1999; Knoll et al., 2000) wird. Während der Dissoziationsphase bleibt die

Streptavidinbelegung aufgrund der starken Bindung zu Biotin konstant. Die

Immobilisierung der beiden hGBP1-Mutanten Q577C und Q577C/K485C erfolgt

erwartungsgemäß sehr rasch und zeigt auch während der Waschphase (Dissoziation) eine

stabile Belegung (Abbildung 4-21). Die maximale Beladung der Einfachmutante Q577C

ist dreimal höher (ca.205 ng/cm²) als für die Doppelmutante (77 ng/cm²). Auf eine

hGBP1-Doppelmutante kommen drei Tetramere Streptavidin, bei der Einfachmutante ein

Molekül. Die unspezifische Adsorption der hGBP1-Variante ohne Anker fällt mit <

5 ng/cm² erwartungsgemäß schwach aus.

Obwohl in der zweiten Messserie (Abbildung 4-22) die Beladung der Einfachmutante

Q577C und der Doppelmutante insgesamt etwas kleiner ausfällt (182 zu 68 ng/cm²), wird

auch hier ein 3:1-Verhältnis erhalten. Die Belegungsdichte für die Mutante K485C ist in

etwa genauso hoch (178 ng/cm²) wie bei der anderen einfach biotinylierten hGBP1-

Variante.

4.3.3 Schichtdickenbestimmung mittels AFM und QCM

Zur Verifizierung der SPR Daten wurden im nächsten Schritt die Schichtdicken der

Proteinlagen mittels Rasterkraftmikroskopie und Mikrofeinwaage bestimmt. Abbildung

4-23 zeigt die Ergebnisse für die AFM-Messungen an einem strukturierten Biotinthiol-

SAM, auf dem nacheinander Streptavidin und die hGBP1-Mutanten Q577C und

Q577C/K485C immobilisiert worden sind. Die Strukturierung erfolgte über das

Abkratzen der Oberfläche mit Hilfe der AFM-Spitze, der dabei mit hoher Kraft über die

Oberfläche rastert. Diese Technik wird als Nanoshaving bezeichnet und ist neben dem

Mikrokontaktstempeln eine mittlerweile gängige Methode zur lateralen Strukturierung

von Oberflächen. Für alle Messungen wurde der so genannte Tapping-Modus verwendet,

um Kompressionseffekte möglichst gering zu halten. Auf die Mutante K485C wurde das

Nanoshaving nicht angewendet. Die Topographiebilder zeigen deutlich, dass die

gebundenen Proteine eine geschlossene und homogene Schicht auf der Oberfläche bilden.

Über die Software SPIP konnte eine Querschnittsflächenanalyse durchgeführt und daraus

die Höhenprofile ermittelt werden. Für das Multikomponentensystem, welches sich aus

den Proteinen Streptavidin und hGBP1 zusammensetzt, ergibt sich bei der Doppelmutante


120

eine Höhe von (63,4± 10) Å und bei der Einfachmutante eine Höhe von (165± 5) Å. Wird

die in vorherigen Studien (Chelmowski et al., 2007) ermittelte Höhe von (42,2 ± 10) Å

zugrunde, ergeben sich aus der Höhendifferenz Schichtdicken von (21,2 ± 10) Å für die

Doppelmutante und (122,8 ± 10) Å für die Einfachmutante.

Abbildung 4-23: Topographiebilder (oben) und Höhenprofile (unten) nach Inkubation mit

Streptavidin und den hGBP1-Mutanten (links: Doppelmutante Q577C/K485C; rechts:

Einfachmutante Q577C). Durch Abkratzen (Nanoshaving) entsteht ein „Loch“ (dunkler

rechteckiger Bereich) in der Oberfläche, das bei der Schichtdickenbestimmung als Referenz

(Höhe = 0 nm) dient. Innerhalb der weißen Rechtecke in den Topographiebildern wurden die

Höhenprofilanalysen durchgeführt. Die ermittelte Höhe für die Streptavidin (ca. 4 nm) und der

Doppelmutante entspricht etwa nur einem Drittel der ermittelten Höhe für Streptavidin und

Einfachmutante (16,5 nm).

Beim Vergleich mit der Kristallstruktur von hGBP1 findet man bei den gemessenen

Höhen eine gute Übereinstimmung mit den Maßen der breiten Seite (20 -30 Å) bzw.

langen Seite (130 Å) von hGBP1. Zusammen mit den SPR-Ergebnisse unterstützen die

gemessenen Schichtdicken die Annahme, dass die Doppelmutante mit der langen Seite

auf der Oberfläche liegt, wohingegen die Einfachmutante mit der langen Seite orthogonal

zur Oberfläche orientiert ist.

Da beim Nanoshaving nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann, dass der SAM und die

daran gebundenen Proteinschichten nur teilweise von der Oberfläche gekratzt werden und

somit die „ausgekratzte“ Fläche keine eindeutig definierte Nullwert-Referenz darstellt,

wurden Kontrollexperimente mittels Mikrokontaktstempeln durchgeführt. Im Bereich der


121

Abbildung 4-24: Topographiebilder nach Inkubation mit Streptavidin (links), der

Doppelmutante Q577C/K485C (Mitte) bzw. der Einfachmutante Q577C (rechts). Die Stem-

pelflächen (dunkle Quadrate, 3 µm x 3 µm) sind mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol inkubiert

worden, die Stege (helle Bereiche) sind die Bereiche, in denen sich ein Biotinthiol-SAM und die

beteiligten Proteinkomponenten Streptavidin und/ oder hGBP1 befinden. Unter den Topographie-

bildern sind die jeweiligen Höhenprofile dargestellt. Die angegebenen Höhen für die Mutanten

beziehen sich immer auf die Summe von Streptavidin + hGBP1 Doppel- bzw. Einfachmutante.

Stempelflächen (dunkle Quadrate, Abbildung 4-24) befindet sich proteinresistentes

OEG(6)-Thiol, das präzise differentielle Höhenmessungen ermöglicht. In den Stegen zwi-

schen den Quadraten (helle Bereiche, Abbildung 4-24) sind nacheinander Biotinthiol,

Streptavidin sowie die beiden Einfach- (Q577C und K485C) bzw. Doppelmutante von

hGBP1 inkubiert worden. Die biotinylierten und mit den Proteinen inkubierten Bereiche

der Oberfläche können im Topographie-Modus deutlich unterschieden werden und

ergeben für alle immobilisierten Komponenten eindeutig zuzuordnende

Höhenunterschiede. Anhand der lateralen Strukturierung können, ähnlich wie beim

Nanoshaving, die Höhen der Proteinschichten charakterisiert werden. Die

Höhenmessungen (cross section) liefern für das Streptavidin (Abbildung 4-24) eine Höhe

von (41,3 ± 10) Å. Dieses Ergebnis stimmt mit dem über Nanoshaving erhaltenen Wert

gut überein und zeigt darüber hinaus eine gute Übereinstimmung mit Vermessungen der

Kristallstruktur von Streptavidin (Bank, 2005). Nach der sich anschließenden Inkubation

mit den hGBP1-Mutanten Q577C/K485C und Q577C steigt die Höhe der

Gesamtproteinlage auf (76,3 ± 10) Å und (163 ± 10) Å für die Einfachmutante an. Der

Unterschied zur Höhe der Streptavidinlage beträgt demnach (35 ± 10) Å für die

Doppelmutante und (121,7 ± 10) Å für die Einfachmutante. Auch diese gemessenen

Höhen stimmen gut mit den über Nanoshaving erhaltenen Werten überein und

unterstützen die Annahme, dass die beiden hGBP1-Mutanten in der Weise orientiert sind,


122

dass sie zum einen flach auf der Oberfläche liegen und über zwei Anker an Streptavidin

gebunden sind (Doppelmutante) und zum anderen senkrecht auf der Oberfläche stehen, so

dass die lange Seite von hGBP1 orthogonal zur Oberfläche steht (Einfachmutante).

In einer weiteren Messung wurde auch die Schichtdicke für die Mutante K485C ermittelt.

Abbildung 4-25: Topographiebilder einer lateral strukturierten Oberfläche nach Inkuba-

tion mit Streptavidin und der hGBP1-Mutante K485C. Die Aufnahme dieser Bilder erfolgte

analog zu den beiden anderen Mutanten.

Für die Doppelschicht von Streptavidin und der Mutante ergibt sich eine Höhe von

insgesamt (159,7 ± 10) Å. Nach Subtraktion der Schichtdicke von Streptavidin konnte

eine Höhe von (119,2 ± 10) Å für die Mutante K485C ermittelt werden. Dieses Ergebnis

spricht dafür, dass die Mutante mit der langen Seite auf der Oberfläche steht, und

bestätigt die über SPR erhaltenen Daten.

Ergänzend zu den AFM und SPR-Daten wurde die QCM-D-Technik angewendet, um die

Immobilisierung der beiden hGBP1-Mutanten zu untersuchen. Durch Einbeziehung des

Dissipationsfaktors erlaubt diese Methode nicht nur die Bestimmung der Masse von

dünnen Monolagen, sondern liefert auch Informationen über strukturelle (viskoelastische)

Eigenschaften des adsorbierten Films. Durch Multifrequenzmessungen und gleichzeitiger

Bestimmung der Dissipation, also des Energieverlusts des Systems, bietet die QCM-D-

Technik die Möglichkeit, sowohl die Schichtdicke als auch die Viskosität und Elastizität

zu berechnen. Hierfür wird ein mathematisches Modell angewendet, das auf dem

viskoelastischen Modell nach Voigt und Kelvin beruht.


123

Abbildung 4-26: Frequenz- und Dissipationsänderung während der Inkubation mit

Streptavidin und der hGBP1-Mutanten Q577C und Q577C/K485C für die Oberschwingun-

gen 5 (schwarz/ grün) und 7 (rot/ blau).

Abbildung 4-27: Schichtdickenberechnung für Streptavidin und die beiden hGBP1 Mutan-

ten Q577C und Q577C/K485C über QCM-D. Unter Einbeziehung der Multifrequenz- und

Dissipationsmessungen während der Immobilisierung der Proteinkomponenten konnte über die

integrierte Software Q-tools die Schichtdicke der adsorbierten Schichten ermittelt werden.

In Abbildung 4-26 ist exemplarisch die gleichzeitige zeitaufgelöste Frequenz- und

Dissipationsantwort beim Aufbau des Streptavidin-/hGBP1-Systems für die Doppelmu-

tante und die Einfachmutante Q577C gezeigt. Aus diesen Informationen lässt sich direkt

die Schichtdicke der einzelnen Proteinlagen berechnen.


124

Abbildung 4-28: Schichtdickenberechnung für Streptavidin, die hGBP1-Mutante K485C

Dies wurde für alle drei Mutanten durchgeführt Die Höhe der Streptavidinschicht beläuft

sich gemäß den Daten auf (42 ± 10) Å (Abbildung 4-27, links), (40 ± 10) Å (Abbildung

4-27, rechts) sowie (39 ± 10) Å und zeigt auch hier eine hohe Übereinstimmung mit der

Höhe von Streptavidin in der Kristallstruktur.

Tabelle 6: Zusammenstellung der Schichtdickenbestimmung für Streptavidin und die

hGBP1-Mutanten mittels AFM und QCM-D

AFM QCM-D

(in Å) (in Å)

Nanoshaving µCP

Streptavidin 42 ±10 41 ± 10 (42/40 /39 )± 10

Doppelmutante 21 ±10 35 ± 10 30 ± 10

Einfachmutante Q577C 123 ±10 122 ± 10 111 ± 10

Einfachmutante K485C 120 ± 10 119 ± 10

Darüber bestätigen die errechneten Schichtdicken für die Mutanten von (30 ± 10) Å

(Q577C/K485C), (110 ± 10) Å (Q577C) und (118 ± 10) Å unter Berücksichtigung der

angegebenen Fehlergrenzen die Höhenprofilmessungen, die über AFM erhalten worden

sind.

Damit wird auch über QCM-D das unterschiedliche Bindungs- und Orientierungsverhal-

ten der beiden hGBP1-Mutanten bestätigt. Die erhaltenen Daten machen eine deutliche

Unterscheidung des Bindungsverhaltens der beiden hGBP1-Einfachmutanten im

Vergleich zur Doppelmutante möglich und lassen sich mit den AFM und SPR-Resultaten


125

gut in Einklang bringen. Die erhaltenen Schichtdicken für AFM und QCM-D sind in

Tabelle 6 nochmal zusammengestellt:


Insgesamt führen alle auf die drei hGBP1-Mutanten angewandten oberflächenspek-

troskopischen Methoden, basierend auf unterschiedlichen biophysikalischen

Eigenschaften, zu derselben Schlussfolgerung bezüglich ihrer Orientierung auf der

Oberfläche.

Abbildung 4-29: Mögliches Modell (Schema) für die Immobilisierung von Streptavidin und

der hGBP1-Einfachmutante Q577C auf einem Biotinthiol-SAM. Der SAM sowie der

Biotinmaleinimidanker sind schematisch durch kurze (OH-Thiol) und lange schwarze Striche

(Biotinthiol, Biotinanker) dargestellt. Die Einfachmutante Q577C bindet über jedes Molekül

Streptavidin an die Oberfläche.

Das unterschiedliche Bindungsverhalten der einfach biotinylierten hGBP1-Mutanten

beruht auf der Tatsache, dass die sie jeweils nur einen Biotinanker besitzen, nämlich

einmal in der Nähe der G-Domäne (α 13, Position 577) und einmal auf der


126

gegenüberliegenden Seite in der α12 (Position 485), die Doppelmutante jedoch zwei

Anker an beiden genannten Positionen.


der hGBP1-Einfachmutante K485C an Streptavidin.


der hGBP1-Doppelmutante auf einem Biotinthiol-SAM.


127

Die Einfachbiotinylierung führt bei beiden Mutanten Q577C und K485C gemäß der

angewandten Methoden SPR, AFM und QCM dazu, dass das hGBP1 mit der langen Seite

orthogonal zur Oberfläche steht und somit einen dreifach kleineren Footprint (ca. 12 nm²)

als die aufgrund der Zweifachbiotinylierung flach auf der Oberfläche liegenden

Doppelmutante (39 nm²) erzeugt. Die Werte zur Berechnung der Kontaktfläche ergeben

sich dabei aus der Kristallstruktur von hGBP1. Final lassen sich aus den gewonnenen

Erkenntnissen somit für die drei hGBP1-Mutanten schematische Modelle für die

Immobilisierung an der Oberfläche erstellen (Abbildung 4-29-31).

4.3.4 Überprüfung der GTP-Hydrolyse Aktivität der hGBP1-Mutanten in Lösung

und an der Oberfläche

Um zu überprüfen, ob das an der Oberfläche immobilisierte hGBP1 seine enzymatische

Aktivität beibehält, wurde seine Fähigkeit ausgenutzt, GTP zu GDP und GMP zu

hydrolysieren. Über Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

konnten die Nukleotide voneinander getrennt und der jeweilige Anteil bestimmt werden.

Die für eine bestimmte Konzentration spezifische Aktivität ergab sich dabei direkt aus

dem zeitlichen Verlauf der GTP-Hydrolyse. Aus der Steigung wurde dafür zunächst die

Reaktionsgeschwindigkeit im steady state bestimmt und anschließend durch die Protein-

konzentration geteilt. Unter der Annahme, dass während der Reaktion nur hGBP1-

Monomere und Dimere im Gleichgewicht vorliegen und die spezifische Aktivität sich aus

der Summe der Hydrolysegeschwindigkeiten der beiden Spezies ergibt, kann die Kon-

zentrationsabhängigkeit durch Gleichung (7) beschrieben werden. Die Anpassung einer

Bindungsgleichung ergibt die Parameter der Reaktion (Smin, Smax, Kd).

22

min max min

4 4. *

( )d dK KE E E

spez Aktivität s s sE

(7)

mit smin = minimale spezifische Aktivität

smax = maximale spezifische Aktivität

[E] = Proteinkonzentration

Kd = Dissoziationskonstante des Dimers


128

Die Auftragung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration gibt Aufschluss

über die Kooperativität der Reaktion. Für die in dieser Arbeit verwendete Cys-5-Mutante

von hGBP1, die die Basis für die Doppelmutante Q577C/K485C und Einfachmutante

Q577C bildet, wurde bereits im Vorfeld die GTP-Hydrolyse gemessen und Informationen

über die spezifische Aktivität erhalten (Dissertation Vöpel, 2009). Für die Messungen

wurden jeweils 350 µM GTP umgesetzt. Die maximale spezifische Aktivität der Cys-5 ist

mit ca. 38 min-1

um den Faktor 1,8 gegenüber hGBP1 wt erhöht (Kunzelmann et al.,

2006). Im Folgenden sind die Ergebnisse des Aktivitätstests in Lösung und an der

Oberfläche für die beiden hGBP1-Mutanten dargestellt. Für alle Messungen wurde eine

Nukleotidkonzentration von 50 µM eingesetzt. Die Proteinkonzentration in Lösung

(0,5 µM) wurde so gewählt, dass GTP in einem 100-fachen Überschuss vorlag.

Abbildung 4-32: Konzentrationsabhängigkeit der GTPase-Reaktion von hGBP1-Cys-5

(Dissertation Tobias Vöpel, 2010) . Die Hydrolyse wurde im Steady State mit 350 µM GTP

bei 25 °C gemessen.

Links: Zunächst wurde der zeitliche Verlauf der Hydrolyse für Proteinkonzentrationen von

0,0156 µM, 0,0625 µM, 0,25 µM, 0,5 µM, 1 µM, 2 µM, 3 µM und 4 µM dargestellt (umso höher

die Konzentration, desto steiler der Verlauf). Aus der Steigung der linearen Regression wurde die

spezifische Aktivität für die eingesetzten Proteinkonzentrationen ermittelt.

Rechts: Auftragung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration

Die Belegung der Goldwafer mit hGBP1 konnte aus den SPR-Bindungskinetiken

errechnet werden und unter Berücksichtigung des definierten Volumens an Puffer (V =

2,5 ml) und der Fläche des Goldwafers (78,5 cm²), mit dem die Oberfläche bedeckt

wurde, in eine „Konzentration“ umgerechnet werden. Für die Einfachmutanten K485C

und Q577C ergab sich ein einheitliche Konzentration von ca. 0,08 µm, für die Doppelmu-

tante 0,033 µM. GTP (50 µM) lag damit für die Oberflächenmessungen in einem 625

bzw. 1515-fachen Überschuss vor. Aufgrund der äußerst geringen Konzentrationen der


129

hGBP1-Mutanten an der mit Flüssigkeit (Puffer) bedeckten Oberfläche und der

Wärmeempfindlichkeit von hGBP1, wurde die eingesetzte GTP-Konzentration von 350

auf 50 µM herabgesetzt. Damit konnte eine im Rahmen der Fehlergrenzen detektierbare

GTP-Umsetzung deutlich schneller nachgewiesen werden, da weniger Substrat in Lösung

vorlag und mögliche Denaturierungseffekte der immobilisierten hGBP1-Moleküle

vermieden wurden. Der Grund, warum die Nukleotidkonzentration nicht auf einen,

parallel zu den Messungen in Lösung, 100-fachen Überschuss gegenüber der

Proteinkonzentration angepasst werden konnte, war das Detektionslimit des eingesetzten

Detektors.

In Lösung ergeben sich für alle drei Mutanten insgesamt sehr ähnliche Aktivitäten von

14 min-1

(Q577C), 20 min-1

(K485C)und 17 min-1

(Q577C/K485C) (Abbildung 4-33).

Abbildung 4-33: Aktivitätstest der hGBP1-Mutanten in Lösung (25 °C). Der zeitliche Verlauf

der Hydrolyse wurde bei einer Konzentration von 0,5 µM hGBP1 und einem 100fachen Über-

schuss GTP (50 µm) durchgeführt. Aus der Steigung der linearen Regression der GTP-Hydrolyse

wurde die spezifische Aktivität ermittelt. Desweiteren ist die gleichzeitige GDP- und GMP-

Produktion dargestellt.


130

An der Oberfläche fällt die Aktivität um einen Faktor von ca. 2,4 bei der Doppelmutante

(7,04 min-1

), um einen Faktor 4,6 bei der Einfachmutante Q577C (3,07 min-1

) und sogar

um einen Faktor 20 bei der anderen Einfachmutante kleiner aus als in Lösung. Als

Referenz wurde ein mit Biotinthiol und Streptavidin beladener Goldwafer verwendet und

synchron zu dem Wafer mit hGBP1 mit der GTP-Lösung bedeckt. Zeitgleich wurden

jeweils Aliquots für die HPLC-Messungen abgenommen.

Abbildung 4-34: Aktivitätstest der hGBP1-Mutanten an der Oberfläche (25 °C). Die Hydro-

lyse wurde im Steady State bei 50 µM GTP gemessen. Die berechneten hGBP1-Konzentrationen

ergaben sich aus den Bindungskinetiken, die mittels SPR gemessen worden waren. Als Referenz

(siehe Graphen oben) wurde ein mit Biotinthiol und Streptavidin belegter Wafer verwendet, der

parallel zu dem mit hGBP1 besetzten Wafer mit GTP-Lösung bedeckt wurde. Aus der Steigung

der linearen Regression wurden die spezifischen Aktivitäten ermittelt.

In beiden Fällen (Abbildung 4-34, oben) konnte für die Referenzprobe erwartungsgemäß

keine Aktivität gemessen werden. Wie bereits erwähnt, wurden für alle Messungen der

Umsatz von 50 µM GTP gemessen. Um die erhaltenen Aktivitäten mit der in Abbildung

4-32 dargestellten Auftragung der spezifischer Aktivitäten, die bei 350 statt 50 µM GTP


131

gemessen wurden, besser vergleichen und beurteilen zu können, wurde exemplarisch für

die Einfachmutante (0,5 µM) die Hydrolyse sowohl bei 50 µM als auch 350 µM GTP in

Lösung bei 25 °C gemessen und der Einfluss der eingesetzten GTP-Konzentration auf die

Hydrolyserate bestimmt. Die gemessene spezifische Aktivität für 350 µM GTP

(Abbildung 4-35) beträgt 25,72 min-1

und ist um den Faktor 1,8 höher als für 50 µM GTP

(13,94 min-1

).

Abbildung 4-35: Messung der Hydrolyseaktivität bei 350 µM GTP und 0,5 µM hGBP1.

Tabelle 7: Übersicht zu den gemessenen Hydrolyseaktivitäten

Konzentration

(µM) Aktivität (min

-1) GDP/GMP (%)

Protein GTP

Einfach-

mutante

Q577C

Einfach-

mutante

K485C

Doppel-

mutante Cys 5

Einfach-

mutante

Q577C

Einfach-

mutante

K485C

Doppel-

mutante

Lösung 0,5 350 26 34

0,5 50 14 20 17 24/62 29/41 28/60

Oberfläche

0,08 50 3 28/16

0,08 50 1 50/15

0,03 7 42/13

Eine weitere wichtige Beobachtung kann bei Betrachtung der GDP- und GMP-Produktion

gemacht werden. In Lösung ist das Hauptprodukt der Hydrolyse innerhalb der

gemessenen Zeiträume von 3 bis maximal 5 Minuten für alle Mutanten GMP (siehe


132

Tabelle 7). An der Oberfläche jedoch ist die GMP-Produktion deutlich reduziert und das

Verhältnis GDP:GMP ändert sich bei allen Mutanten zugunsten von GDP. Besonders

deutlich fällt dieser Trend bei der Einfachmutante K485C aus.


Für die reine Cys-5-Mutante ohne Biotinanker wurde eine Aktivität in Lösung für 0,5 µM

hGBP1 und 350 µM GTP von 33,9 min-1

gefunden (Abbildung 4-32). Im direkten Ver-

gleich sind die gemessenen Aktivitäten für die Einfach- und Doppelmutante bei 50 µM

GTP (Abbildung 4-33) ca. halb so groß (13,94 bzw. 16,97 min-1

). Der Einfluss der GTP-

Konzentration geht zusätzlich mit einem Faktor von ca. 1,8 in die Berechnung mit ein,

wie die Messung der Einfachmutante bei 350 µM GTP zeigt (Abbildung 4-35). Die

Hydrolysegeschwindigkeit des Enzyms nimmt also erwartungsgemäß bei höherer Sub-

stratkonzentration deutlich zu (25,72 statt 13,94 min-1

) Dass die gemessene Aktivität der

biotinylierten Einfachmutante bei 350 µM GTP trotz allem nochmal um einen Faktor von

1,3 kleiner als für die unbehandelte Cys-5-Mutante ausfällt (Vergleich: Abbildung 4-32

und Abbildung 4-35), ist auf den Einfluss durch die Präparationsschritte während der

Biotinylierung zurückzuführen. Das Auftauen der Proteinlösung, die Inkubation über

Nacht und die Umpufferung können dabei einen negativen Einfluss auf die enzymatische

Aktivität von hGBP1 haben. Da trotz allem für beide biotinylierte hGBP1-Mutanten eine

signifikante Aktivität gemessen werden konnte, ist der Nachweis erbracht, dass die

Proteine weiterhin nativ sind. Des Weiteren muss berücksichtigt werden, dass für die

Messungen in Abbildung 4-32 und Abbildung 4-35 unterschiedliche Protein-Pools

verwendet wurden, die aufgrund der sehr aufwendigen und zeitintensiven Präparation und

Aufreinigung in ihrer Aktivität deutliche Unterschiede aufweisen können.

Auf der Oberfläche sind die Aktivitäten bei 50 µM GTP für alle Mutanten mit 3,04 min1

(Q577C), 1 min-1

(K485C) und 7,04 min-1

(Doppelmutante) deutlich niedriger als in

Lösung (Faktor 4,6 (Q577C), 20 (K485C) bzw. 2,6 (Doppelmutante)). Besonders deutlich

fällt der Unterschied bei der Einfachmutante K485C aus. Eine eingeschränkte

Zugänglichkeit des Substrates GTP zum immobilisierten hGBP1 und das aufgrund der

dichteren Packung möglicherweise limitierte Diffusionsvermögen der Substrate wurde

bereits in vorherigen Studien (Chelmowski et al., 2007) als Grund für eine reduzierte

Aktivität an der Oberfläche angeführt. Da jedoch das Substrat GTP im Vergleich zum


133

Protein sehr klein ist und obendrein in großem Überschuss in der Lösung vorliegt, sollten

sich die eingeschränkte Zugänglichkeit oder Diffusionslimitierungen, wenn überhaupt,

nur geringfügig auf die Aktivität auswirken.

Abbildung 4-36: Dimerisierungsmodell von hGBP1 (nach Gosh et al., 2006)

Vielmehr ist anzunehmen, dass sich die Situation in Lösung und an der Oberfläche

dahingehend unterscheidet, dass in Lösung Homo-Dimerisierung ungehindert stattfinden

und die Aktivität beschleunigt, an der Oberfläche durch die Immobilisierung der Proteine

jedoch behindert oder zumindest eingeschränkt wird, so dass die Proteine als Monomere

vorliegen und ausschließlich eine Basalaktivität zeigen.

Abbildung 4-37: Modell der Verteilung von Streptavidin bei 50 % Belegung. Die Streptavi-

din-Moleküle (schwarze Felder) sind wie auf einem Schachbrettmuster verteilt und liegen so nah

beieinander (entlang der Diagonalen, weiß), dass eine direkte Interaktion zwischen hGBP1-Mole-

külen, die an Streptavidin gebunden sind, möglich wäre.

Wenn etwa ein Faktor 4-5 für den Einfluss der Dimerisierung auf die Aktivität in dem

von uns verwendeten Konzentrationsbereich annimmt (vgl auch (Ghosh et al., 2006) ,


134

spricht die gemessene Hydrolysegeschwindigkeit der beiden Einfachmutanten mit 3,04

(Q577C) und 1 min-1

eindeutig für das Vorliegen von Monomeren auf der Oberfläche, die

keine Wechselwirkungen eingehen können.

Da der Anker sich an der Position 577 befindet und somit in der Nähe der G-Domäne, die

die Dimerisierung hauptsächlich vermittelt, ist eine Wechselwirkung mit benachbarten

hGBP1-Molekülen ohnehin sehr unwahrscheinlich. Hinzu kommt, dass die Abstände

zwischen den hGBP1-Molekülen zu klein sind, um Dimerisierung zu ermöglichen. Die

schwarzen Felder stellen Streptavidin-Moleküle dar, auf die in der nächsten Schicht das

hGBP1 binden soll. Wie bereits erwähnt, ist die maximale Flächenausfüllung von

Streptavidin ca. 53 %, was unter der Annahme, dass die Verteilung auf der Oberfläche

gleichmäßig ist, zu dem Modell in Abbildung 4-37 führen würde. Die Belegung mit

Streptavidin ergibt sich jedoch unter den gewählten Bedingungen (Inkubationszeiten mit

Biotinthiol etc., Puffer) zu 25-30 % (maximal 35 %), woraus sich das Modell in

Abbildung 4-38 ergibt. Es ist unter Berücksichtigung des Dimerisierungsmodells

(Abbildung 4-36) klar ersichtlich, dass bei einer Belegung von 25 % die Abstände

zwischen den Streptavidin-Molekülen zu klein sind (ca. 4-5 nm), damit die immobilisierte

hGBP1-Varianten Q577C und K485C eine Interaktion mit den Nachbarn eingehen kann.

Abbildung 4-38: Modell der Verteilung von Streptavidin bei 25 % Belegung. Die Abstände

zwischen den Streptavidin-Molekülen betragen ca. 4-5 nm, wenn man von einer gleichmäßigen

Verteilung der Proteine ausgeht.

Da die G-Domäne der Einfachmutante als zusätzlich erschwerender Faktor zur

Oberfläche gerichtet ist und somit benachbarte G-Domänen der gebundenen hGBP1-

Moleküle aufgrund der Biotinankerbindung an Streptavidin sich nur sehr schwer


135

zueinander ausrichten können, ist die Dimerisierung von benachbarten Einfachmutanten

auszuschließen.

Anders sieht die Situation bei der Doppelmutante aus, die über zwei Anker an die

Oberfläche gebunden ist und somit mit der langen Seite auf dieser liegt. Die gemessenen

Aktivitäten in Lösung und Oberfläche unterscheiden sich gerade mal um einen Faktor 2,5,

was nicht für das ausschließliche Vorliegen von Monomeren an der Oberfläche spricht.

Obwohl die Zweifachbiotinylierung zu einer deutlich eingeschränkten Beweglichkeit und

Flexibilität der Doppelmutante im Vergleich zu den Einfachmutanten führt, ist die

Wahrscheinlichkeit, dass die G-Domänen zweier gebundener hGBP1-Moleküle

interagieren, deutlich höher. Da die hGBP1-Moleküle auf der Oberfläche liegen, sind zum

einen die GTP-bindenden Domänen nicht wie bei den Einfachmutanten zur Oberfläche

gerichtet, sondern deutlich freier zugänglich, und zum anderen ist Möglichkeit gegeben,

dass sich die benachbarten Doppelmutanten zumindest teilweise in der Weise ausrichten,

wie es durch das Dimerisierungsmodell vorgegeben ist (vgl. Abbildung 4-36).

Abbildung 4-39: Mögliches Modell der Dimerisierung der hGBP1-Doppelmutante zwischen

immobilisierten Nachbarmolekülen. Zwei hGBP1-Moleküle (Doppelmutanten) sind so an der

Oberfläche fixiert, dass die beiden G-Domänen (weiße Pfeile) die Dimerisierung vermitteln kön-

nen.

Diese in der Abbildung 4-39 gezeigte Konstellation setzt voraus, dass die G-Domänen

zweier benachbarter hGBP1-Moleküle direkt einander zugewandt sind, da ansonsten

durch die zweifache Bindung an die Streptavidin-Moleküle wenig Bewegungsspielraum

für die hGBP1-Moleküle besteht, sich aufeinander zuzubewegen. Sicherlich wird der in

der Abbildung beschriebene Fall nur vereinzelt vorkommen, doch im Mittel wird sich

dies auf die gemessene Aktivität auswirken. Die Ergebnisse bestätigen dies.


136

Die Betrachtung der GDP und GMP-Produktion in Lösung und an der Oberfläche hat zu

einem ebenfalls interessanten Ergebnis geführt (Tabelle 7). Offenbar ist die GMP-

Produktion auf der Oberfläche gehemmt und GDP konnte für alle hGBP1-Mutanten als

Hauptprodukt ermittelt werden, GMP dagegen nur marginal. Im Rahmen der Doktorarbeit

von Adrian Syguda konnte bereits postuliert werden, dass der tetramere Übergangs-

zustand essentiell für die Hydrolyse von GDP zu GMP ist. Dies wirkt sich folglich auf

das Produktverhältnis der Hydrolyse aus, das in Richtung GMP verschoben wird.

In einer vor kurzem veröffentlichten Studie wurde desweiteren festgestellt, dass die

Tetramerisierung durch den Kontakt zwischen den Helices α12/13 und der α4´ vermittelt

wird. Wenn dieser Kontakt durch eine Quervernetzung (Cross-linker) verankert wird,

können wichtige strukturelle Änderungen, die zu einer Freisetzung der Interaktions-

flächen in der α12/13 führen und somit die Tetramerisierung vermitteln, nicht vollzogen

werden und GDP wird als Hauptprodukt der Hydrolyse erhalten (Vopel et al., 2010). Eine

dauerhafte Auflösung dieses Kontakts führt dagegen hauptsächlich zu GMP. Auf der

Oberfläche sind im Unterschied zur Situation in Lösung die biotinylierten hGBP1-

Mutanten zum einen sehr dicht gepackt und zum anderen an Streptavidin immobilisiert

sind, so dass hier eine Tetramerisierung nicht stattfinden kann. GTP sollte daher

hauptsächlich zu GDP, aber nicht zu GMP hydrolisiert werden, was durch die Ergebnisse

bestätigt wird.

Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System

137

5 Dimerisierungsstudien von immobilisiertem hGBP1: Das

Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System

Nachdem zunächst das Streptavidin-hGBP1-System auf einer Biotinthiol-SAM-Oberflä-

che hinsichtlich des Bindungsverhaltens der beteiligten Proteinkomponenten, also

Streptavidin und die hGBP1-Mutanten Q577C, K485C und Q577C/K485C, untersucht

wurde, sollte es in diesem Projekt darum gehen, die Dimerisierung von hGBP1 bezüglich

kinetischer Aspekte zu beleuchten. Diese Untersuchung wurde hauptsächlich auf der

Basis der Mutante K485C (Abbildung 4-11) durchgeführt, da bei dieser hGBP1-Variante

die G-Domäne zur Umgebung gerichtet ist, so dass eine uneingeschränkte Bindung von

solvatisierten hGBP1-Molekülen in Anwesenheit von GppNHp möglich ist. Die anderen

beiden Mutanten, also die Einfachmutante Q577C, bei der die G-Domäne zur Oberfläche

gerichtet ist, und die Doppelmutante Q577C/K485C werden ebenfalls bezüglich ihrer

Dimerisierungsfähigkeit auf der Oberfläche in diesem Kapitel betrachtet und mit der

Mutante K485C verglichen.

5.1 Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin-

hGBP1/hGBP1-Systems

5.1.1 SPR-Bindungsstudien von hGBP1 wt mit den immobilisierten hGBP1-

Mutanten

In Abbildung 5-1 ist die Immobilisierung von Streptavidin und den drei Mutanten

K485C, Q577C und Q577C/K485C sowie die jeweilige Bindung von hGBP1 wt

gegenübergestellt. Die Belegung mit Streptavidin (0,4 µM) erfolgte über 20 Minuten,

bevor die jeweiligen hGBP1-Mutanten (1 µM) ebenfalls für 20 Minuten über die

Oberfläche geleitet wurden. Im letzten Schritt erfolgte die Inkubation mit hGBP1 wt

(5 µM) ohne Anker in Anwesenheit von 50 µM GppNHp über 40 Minuten. Bei der

Mutante K485C wurde die Inkubationsphase mit hGBP1 wt auf 60 Minuten erhöht, um

auch hier einen Plateauwert für die Belegung zu erreichen. Die Dissoziationsphase betrug

jeweils weitere 20 Minuten. Abbildung 5-2 zeigt nochmal separat Bindungskinetiken für

zwei unterschiedliche Pools der Mutante K485C und die jeweilige Bindung von hGBP1

wt in Anwesenheit von GppNHp. Obwohl die Belegungsdichte der Mutante in Messung 2

um ca. ein Drittel reduziert ist, wird in beiden Messungen für hGBP1 wt eine maximale


138

Belegung von knapp 130 ng/cm² erreicht. Ein möglicher Grund für diese Beobachtung

könnte sein, dass die Dimerkomplexe ausreichend Platz auf der Oberfläche benötigen, um

sich bilden können. In diesem Zusammenhang sei auch nochmal auf die Abbildung 4-36

verwiesen, in der verdeutlich wird, dass bei Dimerisierung die Mittel- und GTPase-

Effektordomäne voneinander wegzeigen, was zu einer Spannweite von insgesamt 230 Å

führt.

Abbildung 5-1: Konsekutive Beladung der SAM-Oberfläche mit Streptavidin, den drei

hGBP1-Mutanten und hGBP1 wt ohne Anker in Anwesenheit von 50 µM GppNHp. Alle

Inkubationsschritte erfolgten über 15 Minuten mit anschließender Dissoziation.

Genau diese Spannweite könnte der Grund sein, warum die Belegungsdichte mit hGBP1

wt ohne Anker einen Maximalwert anstrebt, der sich auch bei höherer Beladung mit der

biotinylierten Mutante nicht weiter steigern lässt. Dass die Belegungsdichte für

unterschiedliche Pools von Protein ein wenig variieren kann, kann zahlreiche Gründe

haben, aber hängt zumeist mit der Präparation des Proteins zusammen. In dieser Studie

kommen noch weitere kritische Schritte wie die Biotinylierung und Immobilisierung an

der Oberfläche hinzu, die eventuell dazu geführt haben könnten, dass ein kleiner Teil der

Proteine zwar biotinyliert, aber denaturiert ist und sich auf der Oberfläche entfaltet hat.

Dies führt zu einem größeren Footprint und folglich zu einer kleineren Belegung.

Nichtsdestotrotz konnte für die Bindung von hGBP1 wt bei geringerer Belegungsdichte


139

der Mutante in Anwesenheit von GppNHp ein nahezu exaktes 1:1-Verhältnis (1:0,9)

(Abbildung 5-2, grüne Kurve) gegenüber der Mutante festgestellt werden. Für Messung 1

(Abbildung 5-2, blaue Kurve) fällt die Belegung etwas schwächer aus, so dass hier das

molare Verhältnis 1: 0,6 beträgt.

Abbildung 5-2: Konsekutive Beladung der SAM-Oberfläche mit Streptavidin, der hGBP1-

Mutante K485C und hGBP1 wt in Anwesenheit von 50 µM GppNHp.

Abbildung 5-3 stellt die Wt-Belegung auf allen hGBP1-Mutanten nochmal gegenüber.

Als Referenz wurde zum einen hGBP1 wt direkt über Streptavidin geleitet, zum anderen

wurde kein GppNHp, das für die Dimerisierung essentiell ist, dem Protein zugefügt. Auch

nach Abzug der durch die die Referenzmessungen erhaltenen Belegungen würde das

molare Verhältnis zwischen hGBP1 wt und der K485C immer noch 1:0,5 (Messung 1,

Abbildung 5-2 ) bzw. 1:0,8 (Messung 2, Abbildung 5-2) betragen und somit auf einen

hohen Dimerisierungsgrad auf der Oberfläche hindeuten. Bei vollständiger Belegung der

Oberfläche mit der Mutante K485C (Messung 1) liegt demnach jedes zweite verankerte

Protein als Dimerkomplex vor. Im Gegensatz dazu ist Wt-Belegung bei der Einfachmu-

tante Q577C kaum höher als bei den Referenzmessungen, wohingegen im Falle der

Doppelmutante eine ebenfalls signifikante Immobilisierung von hGBP1 wt feststellbar ist.

Das molare Verhältnis zwischen immobilisierter Doppelmutante (ca. 68 ng/cm², vgl.

Abbildung 4-22) und Wildtyp (55 ng/cm²) beträgt 1:0,8.


140

Abbildung 5-3: Belegung von hGBP1 wt in Anwesenheit von 50 µM GppNHp auf den drei

hGBP1 Mutanten. Im Gegensatz zu den Mutanten Q577C und Q577C/K485C zeigt die Mutante

K485C einen deutlichen Dimerisierungseffekt. Die Belegunsdichte der anderen Mutanten ist

kaum größer als die messbare Adsorption bei den Referenzmessungen.

5.1.2 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse

Die Tatsache, dass sich bei der K485C der Anker in der α12 auf der von der G-Domäne

abgewandten Seite befindet und folglich die Mutante so an die Oberfläche dirigiert, dass

die G-Domäne zur Umgebung gerichtet und damit frei zugänglich für in Lösung

befindliche hGBP1-Moleküle ist, hat gemäß den SPR-Ergebnissen einen begünstigenden

Effekt auf die Dimerisierung. Etwa 50 % der hGBP1-Mutanten (bei Messung 2 in

Abbildung 5-2 sogar 90 %) binden an ein Wildtyp-Molekül. Durch den erhöhten

Platzbedarf, den der Dimerkomplex auf der Oberfläche benötigt und die dichte Belegung

der Mutante K485C kann die Beladung mit hGBP1 wt nicht über einen Maximalwert

hinaus (etwa 130 ng/cm²) gesteigert werden. Im Gegensatz dazu ergibt sich für die

anderen Einfachmutante Q577C keine signifikante Belegung mit hGBP1 wt. Da bei der

Q577C die G-Domäne zur Oberfläche gerichtet ist und für die Dimerisierung kaum oder

gar nicht zugänglich ist, ist die Dimerisierung aus sterischen Gründen nicht möglich. Bei

der Doppelmutante dagegen ist ein ebenfalls ein hoher Dimerisierungsgrad festzustellen.

Wahrscheinlich führt hier die Mehrfachbiotinylierung dazu, dass die G-Domäne, da die

Mutante mit der langen Seite auf der Oberfläche liegt, für Moleküle aus der Lösung


141

zugänglich wird und mit ihnen Dimerkomplexe ausbildet. Desweiteren haben die in

Abschnitt 4.3.4 durchgeführten Aktivitätstests bereits gezeigt, dass die Doppelmutante

scheinbar zusätzlich in der Lage ist, auch mit benachbarten, immobilisierten hGBP1-

Molekülen Dimerkomplexe zu bilden. Insgesamt gilt also: Umso besser die G-Domäne

des immobilisierten hGBP1-Moleküls zugänglich ist, desto eher werden Dimere

ausgebildet. Zur Absicherung dieser Daten wurden analog zu Kapitel 4 die Schichtdicken

der Proteinlagen, diesmal nach Immobilisierung von hGBP1 wt bestimmt

5.1.3 Untersuchung der Dimerisierung von hGBP1 an die immobilisierten hGBP1-

Mutanten mittels AFM und QCM

Im nächsten Schritt wurde versucht, die Bindung von hGBP1 wt an die immobilisierten

Mutanten mit AFM und QCM nachzuweisen. Für die rasterkraftmikroskopischen

Messungen wurden mittels Mikrokontaktstempeln lateral strukturierte Oberflächen

hergestellt.

Abbildung 5-4: Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin, der hGBP1-Doppelmu-

tante und hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp. Die Stempelflächen (dunkle Quadrate, 3 x

3 µm) sind mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol inkubiert worden, die Stege (helle Bereiche)

sind die Bereiche, in denen sich der Biotinthiol-SAM und die beteiligten Proteinkomponenten

Streptavidin, die Doppelmutante und hGBP1 wt befinden. Unter dem Topographiebild ist das

Höhenprofil (erstellt über Nanoscope) dargestellt. Die angegebene Höhe bezieht sich auf

Abbildung 4-24, in der bereits die Schichtdicke nach Inkubation mit Streptavidin und der

Doppelmutante (76,3 ± 10) Å dargestellt sind.


142

Die Stempelflächen wurden mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol gefüllt, die

Stegbereiche nacheinander mit 10 % Biotinthiol, Streptavidin, den biotinylierten hGBP1-

Mutanten und hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp. In den Abbildung 5-4 und

Abbildung 5-5 sind die Ergebnisse nach Inkubation mit Streptavidin und der

Doppelmutante sowie der Einfachmutante K485C dargestellt.

Für die Einfachmutante Q577C konnte, wie bereits die SPR-Messungen gezeigt hat, kein

zusätzlicher Anstieg der Schichtdicke nach Inkubation mit hGBP1 wt nachgewiesen

werden. Deswegen ist hierfür kein Topographiebild gezeigt. Bei der Doppelmutante steigt

die Schichtdicke von (76,3 ± 10) Å (vgl. Abbildung 4-24 ) auf (98,1 ± 10) Å an. Aus der

Differenz der beiden Werte ergibt sich eine Höhe von (21,8 ± 10) Å. Diese ermittelte

Höhe zeigt eine gute Übereinstimmung mit der Länge der breiten Seite von hGBP1.

Analog kann für die Einfachmutante K485C einen Höhenzuwachs von ursprünglich

(159,7 ± 10) Å auf (188,1 ± 10) Å nachgewiesen werden, wenn hGBP1 wt hinzugegeben

wird. Daraus ergibt sich eine Höhendifferenz von (28,4 ± 10) Å, was in etwa dem Wert

entspricht, der für die Doppelmutante gefunden wurde.

Abbildung 5-5: Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin, der hGBP1-Mutante

K485C und hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp. Die angegebene Höhe bezieht sich auf

Abbildung 4-25, in der bereits die Schichtdicke nach Inkubation mit Streptavidin und der

Doppelmutante (15,97 ± 10) Å dargestellt sind. Das Höhenprofil wurde über die Software SPIP

erstellt

Ergänzend zu den AFM- und SPR-Daten wurde die QCM-D-Technik angewendet, um

einen möglichen Anstieg der Schichtdicke durch die Bindung von hGBP1 wt


143

nachzuweisen. Bereits in den Abbildung 4-27 und Abbildung 4-28 wurden die

Schichtdickenberechnungen für Streptavidin und die beiden hGBP1-Mutanten Q577C

und Q577C/K485C gezeigt. In den Abbildung 5-6 und Abbildung 5-7 sind nun die

Schichtdickenberechnungen für die Mutanten dargestellt, nachdem hGBP1 wt über die

Oberfläche in Anwesenheit von GppNHp über die Oberfläche geleitet worden ist. Da die

Mutante K485C separat vermessen wurde und sich die Injektionszeiten geringfügig

unterscheiden (für Streptavidin 50 statt 60 Minuten, außerdem Inkubation mit hGBP1 wt

über 80 Minuten statt 35 Minuten), wurde diese Messung separat dargestellt.

Insbesondere die Inkubation mit hGBP1 wt musste deutlich verlängert werden, da

ansonsten kein Plateau erreicht worden wäre.

Abbildung 5-6: Schichtdickenberechnung über QCM-D für hGBP1 wt nach Immobilisie-

rung an die zuvor immobilisierten hGBP1-Mutanten Q577C und Q577C/K485C. Unter

Einbeziehung der Multifrequenz- und Dissipationsmessungen konnte über die integrierte

Software Q-tools die Schichtdicke der Proteinlagen ermittelt werden.

Für die Einfachmutante Q577C konnte ein Schichtdickenzuwachs von 2,1 nm nach

Inkubation mit hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp ermittelt werden. Auf der

Doppelmutante immobilisierten weitere 5,2 nm und auf der Einfachmutante K485C sogar

8,3 nm. Die gemessenen Schichtdicken für die Wildtyp-Belegung sind in der folgenden

Abbildung 5-8 nochmal gegenübergestellt. Auch hier wurde die K485C wiederum separat

behandelt.


144

Abbildung 5-7: Schichtdickenberechnung für Streptavidin, die hGBP1-Mutante K485C und

hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp.

Abbildung 5-8: Schichtdickenberechnung von hGBP1 wt mittels QCM-D für die drei

hGBP1-Mutanten. In den Referenzmessungen (schwarz) wurde zum einen hGBP1 wt direkt über

Streptavidin geleitet. Desweiteren wurde hGBP1 wt ohne GppNHp injiziert.

Der Zuwachs der Schichtdicke infolge der Inkubation mit hGBP1 wt ist bei der Einfach-

mutante Q577C ist in etwa mit den Referenzen gleichzusetzen (Abbildung 5-8). Als

Referenzen wurde hGBP1 wt direkt auf Streptavidin inkubiert, um den unspezifisch

gebundenen Anteil der Adsorption zu ermitteln. Desweiteren wurde hGBP1 ohne

GppNHp injiziert und über die Oberfläche geleitet. Für die Doppelmutante ergibt sich

demnach nach Abzug der Referenz, bei der hGBP1 direkt über Streptavidin geleitet


145

wurde, ein Schichtdickenzuwachs von ca. (32 ± 10) Å infolge der Wildtyp-Immobili-

sierung. Für die Referenz ohne GppNHp beträgt der Schichtdickenzuwachs sogar (38 ±

10) Å.

Tabelle 8: Ermittelter Schichtdickenzuwachs für die drei hGBP1-Mutanten nach Beladung

der Oberfläche mit hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp

AFM QCM-D

(in Å) (in Å)

Einfachmutante

K485C 29 ±10 36 ± 10/ 63 ± 10

Doppelmutante 22 ± 10 32 ± 10/ 37 ± 10

Einfachmutante

Q577C

Für die Schichtdickenberechnung der Mutante K485C sind noch größere Unterschiede bei

den Referenzmessungen festzustellen. Hier ergibt sich nach Abzug der Referenz „hGBP1

wt auf Streptavidin“ eine Schichtdicke für hGBP1 wt von (36 ± 10) Å und für die

Referenz ohne GppNHp sogar (63 ± 10) Å. Zur besseren Übersicht sind alle Werte in

Tabelle 8 nochmal zusammengefasst.

5.1.4 Überprüfung der Dimerisierung von hGBP1 wt mittels konfokaler

Fluoreszenzmikroskopie

In den vorausgegangenen Dimerisierungsstudien von hGBP1 konnte im Falle der

Doppelmutante Q577C keine Bindung von hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp.

detektiert werden. Zurückgeführt wurde diese Beobachtung darauf, dass diese Mutante

nach Immobilisierung an der Oberfläche so orientiert ist, dass die G-Domäne zur

Oberfläche zeigt und somit für andere hGBP1-Moleküle nicht zugänglich ist Für die in

Abbildung 5-9 gezeigten fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen wurden Goldwafer

zunächst mittels Mikrokontaktstempeln lateral strukturiert. Die gestempelten Bereiche

wurden mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol inkubiert. In den Stegbereichen erfolgte die

konsekutive Immobilisierung von Biotinthiol, Streptavidin, den Mutanten Q577C bzw.

exemplarisch für die Doppelmutante, für die über SPR, AFM und QCM eine signifikante

Dimerisierung festgestellt werden konnte, und fluoreszenzmarkiertem hGBP1 wt in


146

Anwesenheit von 50 µM GppNHp. Für die Mutante K485C wurde diese Studie nicht

durchgeführt. Die Proteinlösungen wurden jeweils ca. 20 Minuten auf der Oberfläche

belassen. Zwischen den Inkubationsschritten erfolgte ein 4-5 maliges Waschen mit Puffer

C (50 mM Tris, 5 mM MgCl2, pH 7,9). Im Falle einer Dimerisierung sollte das

fluoreszenzmarkierte hGBP1 in den Stegbereichen anhand des emittierten Lichtes (grün)

detektierbar sein. Auf dem Wafer, der mit der Doppelmutante Q577C/K485C inkubiert

wurde, kann, wie in Abbildung 5-9 (links) zu sehen ist, eine signifikante Belegung mit

fluoreszenzmarkiertem hGBP1 wt nachgewiesen werden, die spezifisch in den

Stegbereichen detektierbar ist. Für die Einfachmutante Q577C ist dagegen keine

Immobilisierung von hGBP1 wt erkennbar (Abbildung 5-9, Mitte).

Abbildung 5-9: Fluoreszenzmikroskopie Aufnahmen von lateral strukturierten SAMs. Auf

dem Wafer, der mit der Doppelmutante Q577C/K485C inkubiert wurde (links) ist die laterale

Strukturierung gut zu erkennen. Fluoreszenzmarkiertes hGBP1 ist bevorzugt in den Stegbereichen

an die Oberfläche gebunden. Für die Einfachmutante dagegen ist keine Strukturierung zu erken-

nen (Mitte). Eine spezifische Beladung mit hGBP1 wt kann nicht nachgewiesen werden. Das

gleiche Resultat wird erhalten, wenn GppNHp (50 µM) bei der Inkubation von

fluoreszenzmarkiertem hGBP1 auf der immobilisierten Doppelmutante weggelassen wird

(rechts).

Um nachzuweisen, ob es sich bei dem beobachtbaren Effekt bei der Doppelmutante auch

wirklich um dimerisiertes hGBP1 handelt, wurde ein weiteres Experiment in

Abwesenheit von GppNHp durchgeführt (Abbildung 5-9, rechts). Auch hier ist keine

Immobilisierung detektierbar.

3 µm


147

Wie bei den anderen verwendeten Messmethoden kann mittels konfokaler

Fluoreszenzmikroskopie für die Doppelmutante eine deutliche Belegung mit hGBP1 wt in

Anwesenheit von GppNHp nachgewiesen werden. Ohne Nukleotid ist dieser Effekt nicht

mehr beobachtbar, was darauf schließen lässt, dass die Bindung von Wildtyp spezifisch

ist und aus der Dimerisierung an der Oberfläche resultiert. Dagegen ist für die

Einfachmutante Q577C keine Bindung von Wildtyp-hGBP1 detektierbar. Diese

Beobachtung konnte auch bei SPR, AFM und QCM gemacht werden. Durch die

Fluoreszenzmikroskopie, die gegenüber SPR sogar deutlich sensitiver ist, konnte

ebenfalls die Annahme bestätigt werden, dass aufgrund der Tatsache, dass die

Doppelmutante auf der Oberfläche liegt und somit die G-Domäne besser zugänglich ist

als bei der Einfachmutante Q577C, die Dimerisierung begünstigt wird.

5.1.5 Diskussion der Ergebnisse

Für die Doppelmutante als auch für die K485C konnte eine Dimerisierung mit hGBP1 wt

in Anwesenheit von GppNHp nachgewiesen werden. Bei der anderen Einfachmutante ist

die Dimerisierung nicht möglich, da die G-Domäne in dem Fall zur Oberfläche gerichtet

und somit für andere hGBP wt-Moleküle nicht zugänglich ist Unter Einbeziehung der

SPR, AFM und QCM-D-Daten und unter der Annahme, dass die Dimerisierung an der

Oberfläche genauso wie in dem bereits beschriebenen Dimerisierungsmodell von hGBP1

(Ghosh et al., 2006) vonstatten geht, könnte die Bindung von hGBP1 wt an die Doppel-

mutante in etwa wie in Abbildung 5-11 aussehen. Alle ermittelten Daten deuten darauf

hin, dass die Mutante mit der flachen Seite auf der Oberfläche liegt und über zwei Anker

immobilisiert wird. Nach Inkubation mit hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp ergibt

sich ein Höhenzuwachs von ca. 2 nm mittels AFM und je nach gewählter Referenz 3,2

(hGBP1 wt direkt auf Streptavidin) bzw. 3,7 nm (hGBP1 wt ohne GppNHp) mittels

QCM. Gemäß dem Dimerisierungsmodell sollte die Interaktion zwischen

immobilisiertem hGBP1 und hGBP1 wt in der Weise erfolgen, dass die beiden G-

Domänen die Dimerisierung vermitteln und die Mittel- und GTPase-Effektor-Domänen

der beiden Moleküle voneinander weg zeigen. Das in Abbildung 5-10 dargestellte Modell

liefert auch eine Erklärung dafür, warum die über AFM ermittelten Schichtdicken sich

deutlich von den QCM-Daten unterscheiden. Mittel und GTPase-Effektor-Domäne des

gebundenen hGBP1-wt sind zur Umgebung gerichtet und daher in ihrer Beweglichkeit


148

sehr flexibel. Dies führt dazu, dass eine genaue Höhenbestimmung gar nicht möglich ist,

wenn davon ausgegangen wird, dass die gemessene Höhe die Distanz zwischen

gebundener G-Domäne und dem abgewinkelten Rest des Proteins beschreibt

Abbildung 5-10: Mögliches Modell (Schema) für die Dimerisierung von hGBP1 wt an die

immobilisierte hGBP1-Doppelmutante. Die in den AFM und QCM-D Messungen ermittelten

Höhen von 2,1 bzw. 3,2 und 3,7 nm zeigen deutliche Unterschiede (Ghosh et al., 2006). Durch

Mittel- und GTPase-Effektordomänen von hGBP1 wt sind an der Oberfläche zur Umgebung

gerichtet und folglich sehr flexibel sind, was eine genaue Höhenbestimmung nicht möglich macht.

Hinzu kommt, dass es sich bei AFM um eine mechanische Methode handelt. Auch wenn

für alle Messungen der Tapping-Modus eingesetzt wurde, der Berührungen mit der Probe

weitgehend vermeiden soll, sind leichte Kompressionen nicht ausgeschlossen. Es ist klar

ersichtlich, dass die mechanische Kraft des Cantilevers sich insbesondere auf den zur

Umgebung gerichteten, flexiblen „Schwanz“ (Mittel- und GTPase-Effektor-Domäne) von

hGBP1 auswirkt. Diese Annahme wird dadurch unterstützt, dass die über AFM

ermittelten Schichtdicken deutlich kleiner sind als die über QCM berechneten Höhen.

Das Dimerisierungsmodell für die K485 C an der Oberfläche ist in Abbildung 5-11

dargestellt. Unter Berücksichtigung, dass bei vollständiger Belegung mit der Mutante

K485C jedes zweite Streptavidin-Molekül mit einer hGBP1-Mutante interagiert und den

Informationen aus dem Dimerisierungsmodell (Ghosh et al., 2006) lassen sich die

schematisch dargestellten Verhältnisse an der Oberfläche (Abbildung 5-11) während der

Dimerisierung sehr anschaulich beschreiben und zeigen darüber hinaus eine große

Übereinstimmung mit der über AFM und QCM-D ermittelten Höhe , die sich für die

Belegung von hGBP1 wt ergibt.


149

Abbildung 5-11: Mögliches Modell für die Dimerisierung von K485C und hGBP1 wt in

Anwesenheit von GppNHp an der Oberfläche. Aus den AFM-Daten lässt sich ein

Höhenzuwachs von ca. 2,8 nm, aus den QCM-Daten sogar von 3,6 und 6,3 nm ermitteln.

Dass auch hier die über AFM ermittelte Höhe im Vergleich zu den QCM-Daten kleiner

ausfällt, kann wiederum mit der hohen Flexibilität des „Schwanzes“ von hGBP1 erklärt

werden. Für eine solche Anordnung der Dimere, wie sie in Abbildung 5-11 angenommen

wird, muss postuliert werden, dass die Abstände zwischen den immobilisierten

Molekülen groß genug ist. Da die Streptavidin-Belegung ca. 25 % beträgt (Abbildung

4-38) und nur etwa mehr jedes zweite Streptavidin ein hGBP1-Molekül gebunden hat,

sind auch diese Voraussetzungen erfüllt.

5.2 Kinetikstudien zur Dimerisierung von hGBP1 mittels SPR

Nachdem in den vorangegangenen Studien verschiedene hGBP1-Mutanten an eine Ober-

fläche immobilisiert worden waren und ein unterschiedliches Bindungsverhalten, bedingt

durch die Lokalisation und Anzahl der Biotinanker, gezeigt werden konnten, wurden im

Anschluss Kinetikstudien zur Dimerisierung von hGBP1 mittels SPR angestrebt. Für

diese Untersuchungen war besonders die hGBP1-Mutante K485C geeignet, die einen

Biotinanker innerhalb der α12 auf der von der G-Domänen abgewandten Seite trägt und

somit in der Weise an der Oberfläche immobilisiert, dass der GTP-bindende Bereich, der


150

hauptsächlich die Dimerisierung vermittelt, zur Umgebung gerichtet ist. Somit kann die

K485C-Mutante als „Fängermolekül“ für in Lösung befindliche hGBP1-Moleküle fungie-

ren, wenn GppNHp als Mediator des Dimerisierungsprozesses präsent ist. Der hohe Bin-

dungsgrad von hGBP1 wt in Anwesenheit von Nukleotid an die immobilisierte K485C-

Mutante, der durch SPR-Messungen gezeigt werden konnte, zeigt, dass die Dimerisierung

an der Oberfläche nahezu ungehemmt erfolgen kann. Außerdem wurde eine hohe

Reproduzierbarkeit des Bindungsverhaltens ermittelt und damit beste Voraussetzungen

geschaffen, um konzentrationsabhängige Bindungskinetikstudien durchzuführen. Im

Vergleich zur Doppelmutante zeigt die K485C auch keine Wechselwirkung mit anderen

immobilisierten hGBP1-Mutanten, was durch die Aktivitätstests gezeigt werde konnte,

und steht somit für hGBP1-Moleküle aus der Lösung vollständig zur Verfügung. Dafür

wurde wiederum das aus den vorherigen Kapiteln bekannte Multikomponentensystem,

bestehend aus Streptavidin, der hGBP1-Mutante und hGBP1 wt in Anwesenheit von

GppNHp auf einem Biotinthiol-SAM aufgebaut.

Abbildung 5-12: SPR-Bindungskinetik von hGBP1 wt an die immobilisierte hGBP1-Mu-

tante K485C in Anwesenheit von GppNHp.

Die Konzentration von Streptavidin (0,4 µM) und der Mutante (1 µm) wurde konstant

halten und ausschließlich die Konzentration des Wildtyps variiert. Zu den hGBP1 wt

Proben wurden jeweils 50 µM GppNHp hinzugegeben. In Abbildung 5-12 sind die

Ergebnisse der Wildtyp-Belegung dargestellt. Die Geschwindigkeitskonstanten kobs erster

Ordnung wurden aus Kurvenanpassungen einer einfach exponentiellen Funktion erhalten.


151

Abbildung 5-13 zeigt eine Auftragung der beobachtbaren Geschwindigkeitskonstanten

gegen die Proteinkonzentration. Die Geschwindigkeits-konstanten der Assoziation kass

und Dissoziation kdiss wurden aus der Steigung bzw. dem Achsenabschnitt einer linearen

Regression erhalten. Die lineare Anpassung folgt dabei folgender Gleichung:

1obs off onk k k hGBP (8)

Die Geschwindigkeitskonstante kdiss für die Bindungskinetik von hGBP1 beträgt demnach

0,03952 s-1

, kass ergibt einen Wert von 0,0053 µM-1

s-1

.

Abbildung 5-13: Kinetik der Assoziation von hGBP1 an die immobilisierte hGBP1-Mutante

K485C wt mit 50 µM GppNHp. Die Assoziationskinetiken wurden mittels SPR erhalten. Die

Geschwindigkeitskonstanten wurden aus Anpassungen einer einfach exponentiellen Funktion er-

halten und in Abhängigkeit zur Proteinkonzentration gesetzt. Die Geschwindigkeitskonstanten der

Assoziation kass und der Dissoziation kdiss wurden aus der Steigung bzw. dem Achsenabschnitt

einer linearen Regression ermittelt.

Aus diesen Werten kann ein KD von 7,45 µM berechnet werden. Dieser Wert zeigt eine

gute Übereinstimmung mit dem KD, der sich ergibt, wenn nicht der Achsenabschnitt als

kdiss gewählt wird, sondern der Mittelwert, der sich aus den Anpassungen einer einfach

exponentiellen Funktion der einzelnen Kurven ergibt (Abbildung 5-12). Die hergeleitete

Geschwindigkeitskonstante kdiss ist nur geringfügig kleiner (0,03352 s-1

) als der

Achsenabschnitt und der sich daraus ergebene KD von 6,32 µM zeigt eine hohe


152

Übereinstimmung. Hier ist jedoch kritisch zu sehen, dass sich während der

Dissoziationsphase kein GppNHp in der Lösung befand. Aus diesem Grund vereinen sich

während der Dissoziation zwei Prozesse, zum einen die Dissoziation des Nukleotids und

zum anderen die Dissoziation des Dimers. Hinzu kommt, dass alle Kurven zeigen, dass

insgesamt nur sehr wenig von der Oberfläche dissoziiert. Es wäre eigentlich zu erwarten

gewesen, dass die Dissoziation von hGBP1 wt deutlich schneller erfolgt und ein schneller

Abfall der Kurve zu beobachten ist. Dies kann anhand der Daten nicht bestätigt werden.

Um den Einfluss der Nukleotiddissoziation während der durch die Kurven beschriebenen

Dissoziationsphase besser beurteilen zu können, wurden zur weiteren Überprüfung und

Absicherung anschließend die Maximalwerte der Belegung gegen die

Proteinkonzentrationen aufgetragen (Abbildung 5-14) und mittels folgender Gleichung

angepasst:

22

0 00

min max min0

1 / 4 ( 1 / 4) 11 ( 1 1 )

1

d dads ads adshGBP K hGBP K hGBP

s hGBP hGBP hGBPhGBP

( 9)

Da die Plateauwerte einen Gleichgewichtszustand zwischen gebundenen und ungebunde-

nen Molekülen, also Assoziation und Dissoziation beschreiben, sollte der erhaltene KD

von 8,89 µM von störenden Effekten wie Massentransport in der Assoziationsphase oder

Rebinding in der Dissoziationsphase bereinigt sein. Da auch dieser KD sich kaum von den

Werten unterscheidet, die über die Kurvenanpassungen erhalten wurden, können diese

Effekte weitgehend ausgeschlossen werden. Desweiteren wird im Gleichgewicht der

Dimerisierungsprozess und damit auch die Dissoziation in Anwesenheit von GppNHp

betrachtet. Da der über die Kurvenanpasssungen ermittelte KD (6,32 µM) sich kaum von

dem über die Plateauwerte bestimmten Wert (8,89 µM) unterscheidet, kann ein Einfluss

durch die Dissoziation von GppNHp als gering eingeschätzt werden. Beide KD-Werte

beschreiben ein und denselben Prozess, nämlich die Dimerisierung von hGBP1. Dass die

Dissoziation in Abbildung 5-14 insgesamt sehr gering ausfällt, mag hauptsächlich mit der

niedrigen Flussrate von 5 µl/min zusammenhängen, die den Abtransport der Proteine

eventuell erschweren könnten.


153

Abbildung 5-14: Auftragung der Plateau-Werte der Wildtyp-Belegung gegen die Protein-

konzentration. Aus einer Kurvenanpassung konnte die Dissoziationskonstante KD ermittelt

werden.

Da jedoch Vergleichsdaten für höhere Flussraten nicht vorliegen, lassen sich darüber

keine konkreten Aussagen treffen.

Vergleicht man abschließend die über SPR ermittelten KD-Werte mit der in vorherigen

Studien über Single Turnover-Kinetikstudien bestimmten Dissoziationskonstante

(Dissertation Kunzelmann, 2006), die auf 0,88 µM abgeschätzt werden konnte, so liegen

alle Daten in derselben Größenordnung. An dieser Stelle sei noch mal erwähnt, dass die

Bestimmung der Dissoziationskonstante des GTP-gebundenen hGBP1-Dimers aus der

Konzentrationsabhängigkeit der Single Turnover-Kinetik auf der Annahme eines stark

vereinfachten Dimerisierungsmodell beruht und nicht direkt aus den Daten erhältlich ist.

Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole

154

6 Synthese und strukturelle Untersuchung von proteinre-

sistenten Thiolen auf der Basis von Peptiden

6.1 Zusammenfassung der Ergebnisse für das 10er-Peptidthiol

Im Abschnitt 2.6 wurden die bisher durchgeführten Studien über die Untersuchung von

Peptidthiol-SAMs bereits vorgestellt und die Motivation für die Verwendung solcher

SAMs herausgearbeitet (Chelmowski et al., 2008). Da für die Synthese der Peptide aus-

schließlich natürliche Bausteine, nämlich Aminosäuren, verwendet werden, könnten sol-

che Peptidthiol-SAMs in der Medizintechnik für die Beschichtung von Implantatoberflä-

chen oder in der Entwicklung von Kontaktlinsen zum Einsatz kommen, um die uner-

wünschte Bildung von Biofilmen aufgrund der immunologisch bedingten Abwehrreaktion

des Körpers zu vermeiden. Die Auswahl der verwendeten Aminosäuren erfolgte dabei auf

der Basis von früheren Studien über proteinresistente organische Oberflächen, insbeson-

dere über die OEG-Thiol-SAMs (Abschnitt 2.4).

Für das in dieser Untersuchung verwendete 10er Peptid , das über 1,3-dipolare

Cycloaddition mit einem Thiol verbunden wurde (Chelmowski et al., 2009) konnte der

Nachweis eines hohen Grades an Proteinresistenz erbracht werden (Tabelle 9) Die

Abfolge der Arbeitsschritte erfolgte dabei, wie bereits im Abschnitt 2.6 und in dem veröf-

fentlichten Artikel von 2008 beschrieben (Chelmowski et al., 2008). Zunächst erfolgte die

Überprüfung eines hohen Reinheitsgrades (MALDI/ ESI-MS), anschließend der Nach-

weis der Proteinresistenz mittels SPR. Zur weiteren Charakterisierung des Peptid-SAMs

wurde die Infrarotspektroskopie und XPS Messungen herangezogen. Anhand der Amid I-

Bande wurde zum einen versucht, auf eventuell vorliegende Sekundärstrukturelemente zu

schließen, zum anderen sollte anhand der Schichtdickenbestimmung mittels XPS und

über die Höhe der angelagerten Moleküle direkt Informationen über die vorliegende

Konformationen erhalten werden.

In der folgenden Abbildung sind die Adsorptionskurven für Streptavidin auf verschieden

terminierten SAMs gezeigt. Gegen Streptavidin zeigt der Peptidthiol-SAM des 10er-Pep-

tids ein hohes Maß an Proteinresistenz. Der CH3-terminierte SAM gilt dabei als Kon-

trolle, bei der eine sehr stark ausgeprägte unspezifische Adsorption stattfindet, während

der OEG(6)-Thiol-SAM proteinresistent ist. Tabelle 9 fasst die Ergebnisse der Adsorp-

tionsmessungen zusammen. Auf dem CH3-terminierten SAM und auf dem Peptid-2-SAM

(Erläuterung Abschnitt 2.6), auf dem aufgrund einer hohen Anzahl an hydrophoben


155

Aminosäuren ein hohes Maß an unspezifischer Adsorption zu erwarten ist, adsorbiert viel

Protein, wohingegen auf dem OEG(6)-Thiol-SAM keine Adsorption festgestellt werden

konnte. Die beobachtbare Adsorption für den Peptid-1-SAM zeigt das gleiche Ergebnis

wie für die OEG-Terminierung.

Tabelle 9: Zusammenfassung der Streptavidin-Adsorption auf dem 10er-Peptidthiol-SAM

SAM CH3 Peptid-2 OEG(6) Peptid-1

m (ads): [ng/cm²] c=0,01 mg/ml 66,3 62,3 ≤0,1 ≤0,1

m (ads): [ng/cm²] c=1,00 mg/ml 131,02 - ≤0,1 4,06

Für einen besseren Vergleich mit der Literatur wurden die Messungen mit einer Protein-

konzentration von 1 mg/ml wiederholt, die Injektionszeit wurde aus denselben Gründen

auf 10 min erhöht. Die Ergebnisse mit den höheren Konzentrationen entsprechen etwa

den gemessenen Adsorptionen, die mit der niedrigeren Konzentration erzielt wurden.

Auch für andere Proteine wie BSA und Fibronektin konnten die proteinresistenten Eigen-

schaften des Peptidthiols bestätigt werden.

Abbildung 6-1: IR-Spektren des Peptid-1-Thiol-SAMs als Volumenspektrum (KBr, oberes

Spektrum) und an der Oberfläche vor (unteres Spektrum) und nach (mittleres Spektrum)

Inkubation des Streptavidins (15 min) (Chelmowski et al., 2008).

Ergänzend zu den SPR-Messungen wurden IR-Spektren aufgenommen. Dazu wurden

Au/Si-Wafer hergestellt und anschließend in Stücke von 20 mm x 30 mm geschnitten und


156

mit Ethanol gesäubert sowie im Stickstoffstrom getrocknet. Die Wafer wurden dann für

24 Stunden in einer 1 mM Lösung der Peptidthiole eingelegt. Anschließend wurden die

fertigen Substrate erneut mit Ethanol gewaschen und wiederum getrocknet. Nach Auf-

nahme des IR-Spektrums wurde der Wafer in einer 200 nm Streptavidin-Lösung inkubiert

und nach 15 Minuten erneut ein Spektrum aufgenommen. Die Inkubation mit Streptavidin

führt zu keiner signifikanten Änderung des Signals, so dass davon ausgegangen werden

kann, dass sich kein Protein angelagert hat. Die Banden der IR-Messungen sind in

Tabelle 10 zusammengefasst.

Tabelle 10: Vergleich der IR-Spektren im Volumen und an der Oberfläche vor und nach

Adsorption des Streptavidins. Anhand der Amid I-Bandenverschiebung (rot markiert) können

Aussagen über eventuell vorliegende Sekundärstrukturelemente erfolgen.

Gruppe KBr SAM

vor Strep.-Inkubation nach Strep.Inkubation

Amid-A 3330 3291 3303

C=C (Triazol-Ring) 3069 3073 3067

CH (aliphatisch) 2931 2927 2924

Amid I 1673 1690 1689

Amid II 1546 1545 1545

Amid III 1130 1078 1081

Amid IV 826 802 811

Die für das Protein charakteristischen Amid-Banden (-A, -I, -II, -III, -IV) sind deutlich zu

erkennen. Über die Lage der Amid-I Bande ist es möglich, dem Peptidthiol Sekun-

därstrukturelemente zuzuordnen. Nach Goormaghtigh (Goormaghtigh et al., 1994) erge-

ben sich dabei folgende Bandenzuordnungen:

Abbildung 6-2: Amid I-Moden verschiedener Sekundärstrukturelemente (Goormaghtigh et

al., 1994).


157

Demnach können die Amid-I Banden des Peptid-1-Thiols bei 1674 bzw. 1690 cm-1

oder

nach Inkubation bei 1689 cm-1

einem β-Faltblatt (KBr) bzw. einer β-Schleife (SAM) zu-

geordnet werden, wenn ausschließlich das Maximum der Amid I-Bande zugrunde gelegt

wird. Es ist aus dem IR-Spektrum klar ersichtlich, dass die Amid I-Bande eine relativ

breite konturlose Bande darstellt, die sich aus überlappenden Einzelkomponenten zu-

sammensetzt, die für verschiedene Sekundärstrukturelemente charakteristisch sind

(Abbildung 6-3). Daher werden gängige Verfahren angewandt, um das Spektrum zu

dekonvolieren und somit eine bessere Auflösung zu erreichen. Eine davon ist die Bildung

der 2. Ableitung. Es ergeben sich dabei schmalere Banden mit negativem Vorzeichen.

Um die unter den Amid I-Banden befindlichen Komponenten zu entschlüsseln, kam auch

für das Peptidthiol diese Methode zur Anwendung. Das Ergebnis (Abbildung 6-3) zeigt

eine negative, gerade noch vom Rauschen unterscheidbare Bande bei ca. 1652 cm-1

, aber

nicht bei 1674 cm-1, was etwa genau der Mitte der Amid I-Bande entspricht, wenn keine

weiteren Maßnahmen zur Verbesserung der Auflösung unternommen werden (Abbildung

6-3).

Abbildung 6-3: Ausschnitt aus dem IR-Spektrum des Peptidthiols. Dargestellt sind die

charakteristischen Amid I und Amid II-Bande des Peptids (oben) und die 2. Ableitung (unten).

Insgesamt ist der Amid I-Peak sehr breit, was darauf hindeutet, dass sich mehrere

Einzelkomponenten unter der Bande befinden. Wird genau die Mitte der dargestellten Bande

genommen, ergibt sich ein Wert für die Bandenverschiebung von ca. 1674 cm-1

und ca. 1550 für

die Amid II-Bande. In der 2. Ableitung ergibt sich bei 1652 cm-1

eine einzige negative Bande, die

vom Rauschen gerade noch unterscheidbar ist.


158

Wird die Bandenstruktur für H2O herangezogen(Abbildung 6-2), so lässt sich der durch

die 2. Ableitung erhaltene Werte entweder einer Helix oder aber einer ungeordneten

Struktur zuordnen, aber nicht einem β-Faltblatt. Dieses Beispiel zeigt deutlich, dass für

die Sekundärstrukturanalyse von Proteinen mittels IR zum einen gewährleistet sein muss,

dass die Intensitäten der Spektren ausreichend hoch und die Banden scharf genug sein

müssen, um eine direkte Analyse ohne Auflösungsverbesserung vornehmen zu können.

Oft reicht IR als einzige Methode oft nicht aus, um eine eindeutige Struktur zu ermitteln,

da die Bandenbereiche der einzelnen Sekundärstrukturelemente sich teilweise stark

überlappen.

Zur weiteren Charakterisierung wurden deswegen mit dem Peptid-Thiol-SAM XPS-Mes-

sungen durchgeführt, um Informationen über die Schichtdicke des SAMs zu erhalten. Als

Referenz wurde ein Oktadekanthiol SAM vorbereitet und eine Schichtdicke von 22 Å

angenommen (Herleitung über NIST X-ray Photoelectron Spectroscopy Database). Des

Weiteren konnte eine Formel für die Schichtdickenbestimmung aus der Literatur herange-

zogen werden (Fuxen, 2001). Für die Analyse wurden die Flächen unter der Au4f und

C1s-Banden integriert. Über eine numerische Lösung der Gleichung zur Ermittlung der

Höhe des Films konnte eine Schichtdicke des Peptid-Thiol-SAMs von 56,6 ± 6 Å erhalten

werden. Diese Höhe passt zu einem Thiolanker (20,8 Å) mit einem Dekapeptid (30 Å),

das zu einem β-Faltblatt angeordnet ist, und deckt sich mit dem IR-Ergebnis, wenn die

unveränderte Amid I-Bande, aber nicht die 2. Ableitung als Grundlage genommen wird.

Eine ganz andere mögliche Interpretation der Ergebnisse muss aber an dieser Stelle

ebenfalls in Erwägung gezogen werden. Die in XPS ermittelten Schichtdicken könnten

auch darauf hinweisen, dass das Peptidthiol nur sehr leicht gewunden ist oder sogar gar

keine geordnete Struktur hat (random). Nach Bildung der 2. Ableitung ergibt sich im IR-

Spektrum eine negative Bande bei. 1652 cm-1

, die anhand der Tabelle in Abbildung 6-2

sowohl einer Helix als auch einer ungeordneten Struktur zugeordnet werden könnte.

Zusammen mit den XPS-Messungen jedoch ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine α-Helix

vorliegt, eher gering einzuschätzen.

Um weitere Anhaltspunkte zu sammeln, die auf eine bestimmte Sekundärstruktur des

10er-Peptidthiols hindeuten könnten, wurden Simulationen mit verschiedenen Algorith-

men durchgeführt (MLRC, DBM, GORIV). Die Internetplattform „Network Protein

Sequence“ (www.nps.pbil.ibcp.fr, NetworkProteinSequence, TBIS, 2000, 25, 147-150)

http://www.nps.pbil.ibcp.fr/


159

bietet die Möglichkeit, alle drei Algorithmen zu verwenden. Das Ergebnis dieser

Simulationen ist in folgender Tabelle dargestellt:

Tabelle 11: Simulationsergebnisse für die Sekundärstrukturbestimmung des Peptids für

drei verschiedene Algorithmen

Sekundärstruktur MLRC DBM GORIV

α-Helix 0 0 0

β-Faltblatt 0 0 0

Schleife 80 0 50

ungeordnet 20 100 50

Besonders die Ergebnisse der Simulation über GORIV und MLRC würden die aus den

IR-Ergebnissen ableitbare Schleifenstruktur zumindest teilweise bestätigen, aber viel eher

wird durch alle drei Algorithmen eine ungeordnete Struktur favorisiert. Damit fällt eine

helikale Struktur, wie sie bei OEG-Thiol auf Goldoberflächen gefunden wurde und als

entscheidender Mediator der Proteinresistenz identifiziert werden konnte, für das 10-er-

Peptid gemäß den Daten heraus. Bei Verlust seiner helikalen Struktur verliert ein OEG-

SAM auch seine proteinresistenten Eigenschaften. Da diese Sekundärstruktur für das

Peptidthiol nicht gefunden werden konnte, müssen andere Mechanismen für die

Proteinresistenz verantwortlich sein.

Unter Berücksichtigung, dass in einem Peptid im Gegensatz zu einem Protein sehr viel

schwächere Wechselwirkungen wirken, die zu einer stabilen Konformation führen

könnten, ist das ermittelte Ergebnis zunächst einmal nicht unbedingt überraschend. Es ist

durchaus viel eher realistisch, dass es sich bei dem 10er-Peptidthiol sowohl im Volumen,

aber auch als SAM, um ein dynamisches System handelt, dass sich zufällig zu einer

Struktur anordnet. Hinzu kommt an der Oberfläche, dass der durch die

nachbarschaftlichen Abstoßungen resultierende Abstand zwischen den Peptiden, die mehr

Volumen einnehmen als das OEG-Thiol, nach Formierung des SAMs wahrscheinlich für

die Ausbildung von geordneten Sekundärstrukturelementen, besonders für helikale

Strukturen, nicht ausreicht. Viel eher könnten die proteinresistenten Eigenschaften des

10er-Peptids auf die verhältnismäßig hohe Anzahl an Hydroxylgruppen der Serine in dem

Peptid zurückzuführen sein, die auf der Oberfläche einem OH-terminierten SAM sehr

ähnlich sind und somit Proteinresistenz zeigen.

Unter Berücksichtigung der experimentellen Ergebnisse und in die Diskussion einge-

brachten theoretischen Überlegungen für das 10er-Peptid wurden für die weitere Vorge-


160

hensweise, also die Synthese weiterer Peptidthiole, Methodenauswahl, Wahl der Ver-

suchsbedingungen etc., folgende Schlussfolgerungen gezogen:

1. Ein längeres Peptid sollte eher in der Lage sein, eine helikale Struktur mit mehre-

ren Windungen auszubilden, da eine größere Flexibilität und Beweglichkeit des

Peptids gegeben ist. Des Weiteren konnte für das OEG-Thiol festgestellt werden,

dass eine Verlängerung der Kette zu einem höheren Grad von Proteinresistenz

führt. Aus diesem Grund sollte überprüft werden, ob dies auch analog für das

Peptidthiol gilt.

2. Der hydrophile Charakter soll durch Verwendung von Serin noch verstärkt

werden, da insbesondere in der OH-Gruppe des Serinrestes der Schlüssel zu einer

starken Proteophobie liegen könnte (ähnlich wie beim OH-Thiol).

3. Auch Glycin als guter Helixbildner soll verstärkt bei der Synthese berücksichtigt

werden.

4. Da weder die XPS noch die IR-Daten unter physiologischen Bedingungen, d. h. in

wässriger Umgebung bei einem pH-Wert zwischen 7,4, ermittelt wurden, sollten

nun die Peptidthiole im Hinblick auf ihr mögliches Einsatzgebiet, nämlich auf Im-

plantaten oder Kontaktlinsen im menschlichen Körper, untersucht werden. Von

Proteinen weiß man, dass ihre Struktur ausschließlich in wässriger Umgebung bei

physiologischem pH-Wert erhalten bleibt. Ansonsten setzt eine Denaturierung des

Proteins, also eine Veränderung oder gar Zerstörung der nativen Struktur, ein.

Auch wenn das Peptidthiol deutlich kleiner als ein Protein ist, sind auch hier

mögliche Unterschiede in der Sekundärstruktur in Luft oder Vakuum im Ver-

gleich zur „natürlichen“ Umgebung nicht auszuschließen.

5. Da der Abzug der Wasserbande (H2O) im Amid I-Bereich nicht ganz unproblema-

tisch ist und die relativen Flächenanteile der „angefitteten“ Kurven beeinflussen

kann, wurde die folgenden Messungen weitgehend in D2O durchgeführt, welches

im Bereich der Amidbande nicht absorbiert. Die Kontrolle des

Deuterierungsgrades des Proteins kann dabei über das Verschwinden des Amid II-

und das Entstehen des sogenannten Amid II‘-Signals bei 1450 cm-1

in D2O über-

prüft werden.


161

6.2 Synthese und strukturelle Analyse des 25er-Peptidthiols

Aus den im vorherigen Abschnitt aufgestellten Kriterien wurde eine Aminosäuresequenz

mit einer Länge von 25 Aminosäuren für das neue Peptid ausgewählt.

Abbildung 6-4: Aminosäuresequenz und chemische Struktur des verwendeten 25er-Peptids

und des Thiolankers. (Bild erstellt in CS Chem DRAW)

Die Bindung des Peptids an das Thiol erfolgte über 1,3-dipolare Cycloaddition. Sämtliche

Synthese- und Aufreinigungsschritte wurden analog zum 10er-Peptid durchgeführt. Die

gewählte Peptidsequenz ist in Abbildung 6-4 dargestellt. Da bereits für das 10er-Peptid

eine hohe Proteinresistenz gefunden worden war, wurde die Sequenz um 5 SSG-Einheiten

verlängert, da insbesondere in den Serinresten, also den Hydroxylgruppe, ein

entscheidender Faktor für Proteophobie vermutet wurde.

6.2.1 Synthese und Charakterisierung des 25er-Peptidthiols mittels HPLC und

MALDI-TOF

Sämtliche Syntheseschritte wurden im Lehrstuhl für Anorganische Chemie I

durchgeführt. Die Peptidsynthese erfolgte analog zum 10-mer in einem kommerziellen

Peptid-Synthesizer (Firma CEM) Der Ansatz bestand dabei aus 0,1 mM Leu-Wang-Harz

(Beladung 0,69 mmol/g), 0,2 M Aminosäurelösungen in DMF, 0,26 mmol

Azidoessigsäure, 0,5 M Aktivator TBTU/HOBt und 2 M DIPEA Lösung. Die fertigen

Peptide wurden anschließend über HPLC und MALDI charakterisiert. Die Synthese und

Charakterisierung von Oligo-Peptiden ist bereits etabliert und in der Literatur weit

verbreitet. Das MALDI-Spektrum ist in Abbildung 6-6 dargestellt und zeigt deutlich

einen Peak bei m/z = 2389, was dem Massenpeak des Peptidthiols entspricht (vergleiche

Abbildung 6-6). Aus dem Massenspektrum kann somit eindeutig auf das gewünschte


162

Peptidthiol geschlossen werden. Die HPLC zeigt zusätzlich, dass die Substanz in großer

Reinheit vorliegt.

Abbildung 6-5: HPLC-Spektrum des Produktes aus der Synthese des 25er-Peptids.

Abbildung 6-6: MALDI-Spektrum des 25er-Peptidthiols. Der Peak bei m/z = 2389 kann

eindeutig dem Peptidthiol zugeordnet werden. Zudem liegt das Hauptprodukt in großer

Reinheit vor.


163

Für die anschließende Click-Reaktion wurden die Peptide für 72 Stunden in einer Lösung

aus CuI (0,2123 mmol), DIPEA (12,73 mmol) und 11-Thioacetyl-undekansäure-

propargyl-amid (0,1698 mmol) in DMF (1,1 ml) inkubiert. Für die Experimente wurde

eine Stammlösung der Peptide in Ethanol angesetzt (c = 36 mM). Für die weiteren

Experimente wurden jeweils Lösungen mit einer Peptidthiolkonzentration von 1 mM

angesetzt.

6.2.2 Herstellung des Peptid-SAMS und Überprüfung der Proteinresistenz mittels

SPR

Die Herstellung der Au/Si-Wafer wurde, wie bereits für das 10er-Peptidthiol beschrieben

(Abschnitt 3.2.2.4.1), hergestellt. Die präparierten SAMs wurden mittels IR-Spektrosko-

pie (Reflexions-Absorptionsspektroskopie, IRRAS) sowohl im Volumen als auch auf der

Oberfläche (SAM) charakterisiert.

Abbildung 6-7: IR-Spektrum des 25er-Peptidthiols im Volumen (KBr). Die charakteristi-

schen Bandenverschiebungen sind durch schwarze Striche im Spektrum markiert.

Anhand der Spektren sollten zunächst nur die charakteristischen Amid-Banden identi-

fiziert und die Banden im Volumen und im SAM miteinander verglichen werden, bevor

dann im Folgenden zunächst die Proteinresistenz des SAMs überprüft und anschließend


164

eine Sekundärstrukturanalyse anhand der Amid I-Bande vorgenommen wurde. Die für die

Peptide charakteristischen Amid-Banden I und II sind deutlich zu erkennen.

Abbildung 6-8: IR-Spektrum des 25er-Peptidthiols im SAM.

Tabelle 12: Zusammenfassung der wichtigsten Banden für das 25er-Peptidthiol im Volumen

(KBr) und im SAM.

Gruppe Volumen SAM

Amid-A 3290 3330

Amid-I 1622 1677

Amid-II 1519 1549

Amid-III 1207 -

Amid-IV/V 800 816

C=C (Triazolring) 3071 3067

CH (aliphatisch) 2935 2928

Auch für die Amid III und IV (V) kann zumindest teilweise eine Zuordnung getroffen

werden. Eine grobe Analyse der Sekundärstruktur anhand der Gesamtspektren ergibt für

den SAM eine Schleifenstruktur (evtl. auch ein β-Faltblatt). Im Volumen würde alles auf

ein β-Faltblatt hindeuten. Ohne weitere Auflösungsverbesserung der Spektren zeigen die

Ergebnisse für das 10-er und 25-er-Peptid bezüglich der Sekundärstrukturen, die anhand


165

der Banden den beiden Molekülen zugeordnet werden können, eine hohe

Übereinstimmung. (siehe auch Tabelle 10).

Zur Überprüfung der Proteinresistenz wurde die Adsorption verschiedener Proteine,

nämlich Streptavidin, BSA, Fibronektin und Fibrinogen gemessen. Die Vorgehensweise

erfolgte analog zum 10-er-Peptid, nur das längere Messzeiten von 20 Minuten und eine

Flussrate von 5 µl/min verwendet wurden. Exemplarisch sind die Adsorptionskurven für

Fibrinogen und Fibronektin auf verschieden terminierten SAMs gezeigt. Alle Ergebnisse

sind in Abbildung 6-11 zusammengefasst. Hier sind die verwendeten Proteine und die

jeweiligen Adsorptionen auf Gold nach einer 20 minütigen Dissoziationsphase

dargestellt. Desweiteren wurden die gemessenen Belegungsdichten mit dem aus

Abschnitt 6.1 beschriebenen 10er-Peptid verglichen.

Abbildung 6-9: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Fibrinogen auf verschieden

terminierten SAMs. Start und Ende der Inkubation sind mit gestrichelten Linien gekenn-

zeichnet.

Für alle getesteten Proteine zeigt das Peptidthiol einen hohen Grad an Proteinresistenz.

Besonders für Fibronektin und Fibrinogen, das für seine „klebrigen“ Eigenschaften be-

kannt ist und schon in früheren Studien mit OEG-Thiol (Herrwerth, S., Eck, W.,

Reinhardt, S., Grunze, M., 2003) verwendet wurde, ist die Proteophobie besonders ausge-

prägt und mit OEG-Thiol vergleichbar. Etwas kleiner, aber durchaus deutlich, fällt der


166

Effekt bei Streptavidin und BSA aus. Für das 10er-Peptidthiol wurde der

Proteinresistenzgrad nur für Streptavidin, BSA und Fibronektin ermittelt.

Abbildung 6-10: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Fibronektin.

615 16

816 19

14 1 5148 7

19

92

31 30

239

349

0

50

100

150

200

250

300

350

400

SA BSA Fibronectin Fibrinogen

Ad

sorp

tion

[n

g/c

m²]

10er-Peptidthiol 25er-Peptidthiol OEG-Thiol OH-Thiol CH3-Thiol

Abbildung 6-11: Zusammenfassung der Proteinadsorption auf verschiedenen SAMs für

Gold.


167

Der Vergleich der gemessenen Adsorptionen mit dem 25er-Peptidthiol deutet insgesamt

auf eine hohe Übereinstimmung hin. Sowohl für den 10er- als auch den 25er-Peptidthiol-

SAM auf Gold konnte somit ein hohes Maß an Proteinresistenz gezeigt werden. Für

Silberoberflächen, auf der die Packungsdichte der PEG-Thiole deutlich höher ist und

somit die Ausbildung von helikalen Strukturen verhindert wird, konnte in vorherigen

Studien der Nachweis erbracht werden, dass ein OEG-SAM seine proteophoben

Eigenschaften verliert. Wenn die Sekundärstruktur in gleichem Maße beim Peptidthiol

ein entscheidender Faktor für Proteinresistenz ist, sollte ein ähnlicher Effekt wie beim

OEG-Thiol zu beobachten sein, wenn die SPR-Messungen auf Silberoberflächen

wiederholt werden. Exemplarisch ist die Adsorption von Fibrinogen auf verschieden

terminierten SAMs, die auf Silberwafern aufgebracht worden sind, in Abbildung 6-12

dargestellt. Da je nach SAM die Dissoziationsphasen, aber auch Assoziationsphasen

unterschiedlich lange dauerten, wurde die Länge der Inkubationsphasen teilweise variiert

(CH3-Thiol-SAM) bzw. die Läufe eher beendet, da die Oxidationsempfindlichkeit der

Silberwafer sehr hoch ist und somit die Läufe so kurz wie möglich gehalten werden

mussten. Für das 10er-Peptidthiol wurden die SPR-Messungen auf Silber nicht

durchgeführt.

Abbildung 6-12: Zusammenfassung der Adsorption von Fibrinogen auf verschieden

terminierten SAMs für Silber.


168

Die Zusammenfassung der Adsorption für alle Proteine und SAMs ist in Abbildung 6-13

dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Proteinresistenz für das Peptidthiol

vollständig erhalten bleibt, sogar teilweise noch verstärkt wird.

0,59 7 10,5

92 45

12

43

75

5

40

239

300

0

50

100

150

200

250

300

350

SA BSA Fibronectin Fibrinogen

Ad

sorp

tio

n [

ng

/cm

²]

Peptidthiol OEG-Thiol OH-Thiol CH3-Thiol

Abbildung 6-13: Zusammenfassung der Proteinadsorption auf verschiedenen SAMs für

Silber.

Dagegen nehmen die proteophoben Eigenschaften des OEG-Thiol-SAMs

erwartungsgemäß merklich ab. Bei allen verwendeten Proteinen adsorbiert mindestens

mehr als das Doppelte auf der Oberfläche als bei Gold. Die SPR-Ergebnisse stützen die

schon zuvor gemachten Beobachtungen, dass auf Silber die Packungsdichte der OEG-

Thiole zu hoch ist, um helikale Strukturen auszubilden und somit die Proteinresistenz

verringert oder sogar ganz verloren geht. Da die Peptidthiole gemäß den Resultaten ihre

proteophoben Eigenschaften auch auf Silberoberflächen beibehalten, scheinen hier,

analog zum 10-er-Peptid andere Mechanismen zu wirken als beim OEG-Thiol. Um dies

zu zeigen, wurden im Anschluss Sekundärstrukturanalysen mittels IR durchgeführt.


169

6.2.3 Sekundärstrukturanalysen des Peptidthiols mit der Infrarotspektroskopie

6.2.3.1 Trockenmessungen im Volumen (Transmission) und im SAM (Reflexion)

Die in Abbildung 6-7 und Abbildung 6-8 gezeigten IR-Spektren wurden zur besseren

Erkennung von Einzelkomponenten mit Hilfe der 2. Ableitung, im Bereich der Amid I-

Abbildung 6-14: IR-Spektrum (Transmission) des Peptidthiols im Volumen (KBr) gemessen

an Luft und 2. Ableitung des Spektrums (Gesamtspektrum siehe Abbildung 6-7)

Abbildung 6-15: IR-Spektrum (Reflexion) des Peptidthiols im SAM gemessen an Luft und 2.

Ableitung des Spektrums. (Gesamtspektrum siehe Abbildung 6-8)


170

Bande besser aufgelöst. Aus den unveränderten Spektren konnten bis dato die Erkennt-

nisse gewonnen werden, dass sich das Peptidthiol im Volumen tendenziell zu einem

β-Faltblatt, an der Oberfläche zu einer Faltblatt- oder Schleifenstruktur formt (vgl.

Abschnitt 6.2.2). Nach der Feinstrukturanalyse ergeben sich jedoch folgende Ergebnisse:

Die 2. Ableitung zeigt in beiden Fällen, sowohl an der Oberfläche als auch im Volumen,

ein Minimum bei 1652 cm-1

. Zusätzlich kann bei der Volumenmessung eine weitere ne-

gative Bande bei 1684 cm-1

ausgemacht werden, die sich jedoch nur geringfügig vom

Rauschen unterscheidet. Diese Ergebnisse würden, analog zum 10er-Peptid, für eine

weitgehend ungeordnete Struktur sprechen. Im Volumen kann zusätzlich eine β-

Faltblattstruktur anhand der Bande bei 1684 cm-1

identifiziert werden, die jedoch eine

geringere Intensität aufweist als die Bande bei 1652 cm-1

. An der Oberfläche (SAM) ist

ausschließlich ein schwacher negativer Peak bei 1652 cm-1

detektierbar, der sich nur

wenig vom Rauschen absetzt. Insgesamt scheint also die β-Faltblattstruktur an der

Oberfläche zu verschwinden, doch muss hinsichtlich der Interpretation der Ergebnisse

berücksichtigt werden, dass die Intensitäten an der Oberfläche deutlich geringer sind als

im Volumen, so dass nur schlechte Signal/Rausch-Verhältnisse erreicht werden und

schwache Banden unter Umständen nicht mehr detektierbar sind. Da die Ergebnisse für

das 10-er- und 25-er-Peptid große Übereinstimmungen zeigen, können ähnliche

strukturelle Gegebenheiten angenommen werden. Aus diesem Grund ist es

wahrscheinlicher, dass die Bandenverschiebung bei 1652 cm-1

auch beim 25er-Peptid in

erster Linie für eine ungeordnete Struktur spricht, zumal die XPS-Messungen und

Simulationen beim 10-er-Peptid keinen Anhaltspunkt für gewundene Strukturen lieferten.

Das bedeutet jedoch nicht, dass helikale oder partiell helikale Strukturen prinzipiell

ausgeschlossen sind. Der negative Peak bei 1652 cm-1

könnte auch als Mischung

zwischen einem dominierenden Random-Anteil und einem kleineren helikalen Anteil

gedeutet werden.

Um der Klärung dieser Frage nachzugehen, wurden im Anschluss für eine vertiefende

Konkretisierung dieser Resultate zunächst Messungen in Lösung bei physiologischem

pH-Wert durchgeführt und anschließend mit der Situation im trockenen und befeuchteten

SAM verglichen. Um eine möglichst hohe Auflösung für die Messungen an der

Oberfläche zu erreichen, wurden die ab dem Abschnitt 6.2.3.3 gezeigten Messungen im

SAM mit einer ATR-Einheit durchgeführt (Hyperion 3000 (Bruker))


171

Ein Vergleich zur CD-Spektroskopie sollte darüber hinaus Aufschluss darüber geben, ob

das Peptidthiol durch eine ungeordnete oder aber eine helikale Struktur dominiert wird,

da die IR-Daten keine eindeutige Zuordnung zulassen.

6.2.3.2 Sekundärstrukturanalyse des Peptidthiols in Lösung mittels IR und CD

6.2.3.2.1 IR- und CD-Messungen in D2O

Für die Untersuchung der Sekundärstruktur in Lösung wurde standardmäßig statt in H2O

in D2O gemessen (Konfocheck, Bruker), da der Abzug der H2O-Bande im Amid I-Be-

reich sehr problematisch ist und zu ungewünschten Verschiebungen der relativen Flä-

chenanteile der angefitteten Kurven führen kann. Gleichzeitig sollten die Messungen zü-

gig durchgeführt werden, um den Austausch von Deuterium zu Wasserstoff nicht zu weit

fortschreiten zu lassen, da ansonsten die H2O-Bande im Laufe der Zeit (einige Minuten

bis einige Stunden je nach Stabilität der Proteinstruktur) wieder auftaucht und zu schwer

einkalkulierenden Bandenverschiebungen führen kann.

Das IR-Spektrum des Peptidthiols in D2O (Abbildung 6-16) stellt nur einen Ausschnitt

dar, in dem die Amid I und II-Banden gezeigt sind. Anhand der Amid-I Bande kann

definitiv dem Peptidthiol eine Schleifenstruktur zugeordnet werden.

Abbildung 6-16: IR-Spektrum des Peptidthiols in D2O und 2. Ableitung.


172

Das zweite Maximum bei 1652 cm-1

spricht entweder für eine ungeordnete Struktur oder

eine α-Helix.

Abbildung 6-17: Berechnung der Anteile für die Einzelkomponenten der Amid I-Bande.


173

Die Amid-II-Bande bei ca. 1460 cm-1

zeigt deutlich an, dass das umgebende Medium

D2O ist. Auch für die 2. Ableitung ergeben sich dieselben Bandenzuordnungen.

Des Weiteren wurde versucht anhand verschiedener Kurvenanpassungen eine

Dekomposition der Amid I-Bande nach vorangegangener Fourier-Selbstdekonvolution

durchzuführen. Je nach Kurvenanpassung ergeben sich dabei verschiedene Anteile. In

beiden Fits ergibt sich demnach ein hoher Anteil an Helix, gepaart mit einer, je nach

Anpassung, ungeordneten oder Schleifenstruktur. Die Ergebnisse würden insgesamt dafür

sprechen, dass der nach Bildung der 2. Ableitung entstehende Peak bei 1650 cm-1

durchaus auch einer Helix zugeordnet werden kann. Hinzu kommt die negative Bande bei

1674 cm-1,

die, wie bereits erwähnt, für einen zusätzlichen Schleifenanteil spricht, der

durch die in Abbildung 6-17 durchgeführte Dekomposition der Amid I-Bande bestätigt

wird. Anhand der Anteilsberechnungen (Abbildung 6-17) lässt sich aber auch sehr gut

veranschaulichen, wie problematisch eine quantitative Beurteilung und auch eine

eindeutige Zuordnung der Sekundärstruktur ist. Je nach Anpassung wird von zwei oder

drei Anteilen ausgegangen, die relativ hohe prozentuale Schwankungen zeigen. Für die

Kurven wurden noch weitere Anpassungen (Fits) durchgeführt (Kurven nicht gezeigt),

die stets stark voneinander abwichen. Auch deutlich höhere Random-Anteile als in der

rechten Kurve kamen dabei teilweise zustande. Hinzu kommt bei der Interpretation der

Peptidthiolstruktur in Lösung mittels IR noch ein ganz anderes Problem, nämlich dass für

die Synthese des Peptids Trifluoressigsäure (TFA) benötigt wird , das eine starke

Infrarotbande bei 1673 cm-1

aufweist und somit einen Teil des Amid I-Bandenbereiches

überdeckt. Die Peptidthiole wurden zwar einige Male mit 0,1 M Salzsäure (HCl)

gewaschen (Andrushchenko et al., 2001), doch kann ein vollständiges Entfernen von TFA

zunächst einmal nicht garantiert werden.

Trotz allem bleibt zunächst festzuhalten, dass die durchgeführte

Einzelkomponentenzerlegung zumindest qualitativ Hinweise auf helikale Strukturen

liefert, die je nach Fit die Gesamtstruktur des Peptids sogar dominieren.

Um die IR-Daten aus den genannten Gründen besser beurteilen zu können, wurde ein

CD-Spektrum in Lösung aufgenommen (Abbildung 6-18). Anschließend wurden die

Anteile der Sekundärstrukturelemente anhand von verschiedenen Methoden nach Reed

und Yang berechnet (Chen, 1971; Lux, 1972; Reid et al., 1981; Reed, 1997).


174

Abbildung 6-18: CD-Spektren des Peptidthiols. Als Referenz wurde der reine Puffer (D2O,

10 mM Tris, pH 7,4) ohne Peptidthiol eingesetzt.

Diese Methoden waren in der dem CD-Spektrometer beigefügten Software integriert und

basieren auf Datensätzen von nativen Vergleichsproteinen, deren Sekundärstruktur

bekannt ist.

Tabelle 13: Berechnung der Sekundärstrukturanteile mittels CD-Spektroskopie

Sekundärstrukturelemente Anteile der Sekundärstrukturelemente

(Reed/Yang)

α-Helix 6/0

β-Faltblatt 31,3/23,6

β-Turn 0/17,7

Random-Coil 67,3/58,7

Die Anteile, die sich daraus ergeben (Tabelle 13), sind für beide Methoden zum größten

Teil Random, was an dem schwach ausgeprägten Maximum bei ca. 212 nm (p→p*) und

dem deutlichen Minimum bei 195 nm (n→p*) in den Spektren (Abbildung 6-18) zu

erkennen ist. Zu geringeren Anteilen (31 % (Reed) bzw. 24 % (Yang)) treten auch β-

Faltblatt-Strukturen auf. Desweiteren liefert die Methode nach Yang auch Hinweise auf

β-Schleifen (17,7 %). Zu einem sehr geringen Anteil konnten auch Helixstrukturen

identifiziert werden (Reed, 6 %). Werden diese CD-Daten zugrundegelegt und mit den


175

IR-Daten verglichen, kann klar bestätigt werden, dass sich die in Abbildung 6-17

durchgeführte Einzelkomponentenzerlegung für eine quantitative Sekundärstrukturana-

lyse nicht wirklich eignet, zumal je nach Anpassung sowohl die Anzahl der berechneten

Sekundärstrukturelemente und als auch die sich ergebenden Anteile stark variieren.

Prinzipiell könnte man den negativen Peak bei 1674 cm-1

im IR-Spektrum (Abbildung

6-16) dem TFA zuordnen, doch würde dieser Peak auch einer β-Schleife entsprechen, die

sich ebenfalls aus den Berechnungen der CD-Spektren ergibt. Der Einfluss durch TFA ist

scheinbar äußerst gering einzuschätzen. Der zweite negative Peak bei 1652 cm-1

würde

zusammen mit den CD-Ergebnissen größtenteils einer Random-Struktur zuzuordnen sein,

gepaart mit einem marginalen Anteil Helix.

6.2.3.2.2 Einfluss von Trifluorethanol auf die Sekundärstruktur des Peptidthiols

Auch die folgenden Messreihen wurden sowohl mit IR- als auch CD-Spektroskopie

durchgeführt. Insgesamt wurde der Einfluss von Trifluorethanol auf die Struktur des

Peptidthiols getestet. Von Trifluorethanol (TFE) ist bekannt, dass es helikale Strukturen

stabilisiert bzw. induziert (Sticht et al., 1994; Shiraki et al., 1995; Kentsis /Sosnick, 1998;

Luo /Baldwin, 1998; Myers et al., 1998). Wenn das Peptidthiol zu einer Helix, zumindest

partiell gefaltet ist, sollte das TFE diesen Effekt verstärken.

Abbildung 6-19: IR-Spektren des Peptidthiols in H2O (rote Kurve) und 5 % Trifluorethanol

(schwarze Kurve) im Bereich von 1400 bis 1750 cm-1

.


176

Zunächst wurde eine Messung bei 5 % TFE durchgeführt (Abbildung 6-19). Hier ist

allerdings zu bemerken, dass hier H2O und nicht D2O verwendet wurde. und nicht

verwendet. Um auszuschließen. dass durch die H2O-Bande die Amid-I-Bande verdeckt

wird und nach Berechnung der 2. Ableitung wichtige Strukturinformationen verloren

gehen, wurde eine weitere Messreihe mit 10%, 30 % und 50 % TFE in D2O durchgeführt

(Abbildung 6-21). Im Bereich zwischen 1400 und 1750 cm-1

sieht es im Falle von 5 %

Trifluorethanol in H2O (Abbildung 6-19) zunächst so aus, als ob Trifluorethanol keinen

entscheidenden Einfluss auf die Absorptionsbande bei ca. 1652 cm-1

, die sowohl einer

Helix als auch einer ungeordneten Struktur zugeordnet werden könnte, hat.

Abbildung 6-20: IR-Spektren des Peptidthiols in H2O und 5 % Trifluorethanol (TFE) im

Bereich von 1600 bis 1700 cm-1

.

Wird jedoch ausschließlich der Amid I-Bereich betrachtet (Abbildung 6-20), so wird eine

Bandenverschiebung von 1649 cm-1

(rote Kurve) auf 1655 cm-1

(schwarze Kurve) nach

Zugabe von 5 % Trifluorethanol beobachtet. Der andere negative Peak bei ca. 1680 cm-1

,

der einem β-Faltblatt bzw. einer Schleife zugeordnet werden kann, verschiebt sich jedoch

nicht. Der beobachtete Shift hat somit nichts damit zu tun, dass sich das Gesamtspektrum

durch Zugabe von TFE aufgrund eines systematischen Fehlers bei Verrechnung mit

Referenz o.ä. insgesamt verschoben hat, sondern scheint definitiv in der Struktur des

Peptidthiols begründet zu sein. Eine mögliche Deutung dieser Beobachtung wäre zum

einen, dass ohne TFE das Peptidthiol in einer ungeordneten Struktur vorliegt, mit TFE


177

auch helikale Anteile, die auf intramolekularen Umstrukturierungen basieren,

hinzukommen. Zum anderen wäre es auch möglich, dass die meisten Peptidthiole

weiterhin ungeordnet vorliegen und nur eine kleinere Population helikale Windungen

ausbildet. Damit bleibt festzuhalten, dass eine Umstrukturierung des Peptidthiols unter

dem Einfluss von TFE eintritt, die durchaus als Induktion von Helices interpretiert

werden kann.

Leider konnten die Messungen für 10 %, 30 % und 50 % TFE (Abbildung 6-21), die in

D2O durchgeführt wurden, den beobachteten Bandenshift nicht bestätigen, da das

Signal/Rausch-Verhältnis deutlich schlechter war.

Abbildung 6-21: IR-Spektren des Peptidthiols in D2O und verschiedenen TFE-

Konzentrationen.

Bis auf die in H2O im Vergleich zu D2O aufgrund der unterschiedlichen Massen der

beteiligten Atome H und D und der daraus resultierenden Veränderung der

Schwingungsfrequenz Verschiebung der Banden zu höheren Wellenzahlen (ca. 3-5 cm-1

)

können keine weiteren signifikanten Unterschiede im Spektrum ausgemacht werden.

Insgesamt sind nach 2. Ableitung zwei negative Banden bei 1674 cm-1

(β-Faltblatt oder

Schleife) und eine schwache konturlose Bande bei ca. 1646 cm-1

(ungeordnet/ Helix) zu

sehen, die wiederum für Helix oder Random sprechen würde.

Um herauszufinden, ob die beobachtete Bandenverschiebung ein Hinweis auf eine

strukturelle Veränderung des Peptidthiols von einer ungeordneten zu einer Helixstruktur


178

sein könnte, wurden zur Kontrolle CD-Messungen durchgeführt. Desweiteren sollte

ausgeschlossen werden, dass die Trifluoressigsäure die Amid I-Bande partiell überdeckt

und zu verfälschten Ergebnissen geführt hat. Da der durch Trifluorethanol hervorgerufene

Shift ausschließlich in H2O beobachtet werden konnte, wurden die CD-Messungen in

demselben Lösungsmittel (10 mM Tris-HCl, pH 7,4) durchgeführt. Sämtliche Ergebnisse

der CD-Messungen sind in Tabelle 14 zusammengefasst. Eine helikale Struktur kann

gemäß den Berechnungen der Sekundärstrukturelemente mittels CD-Spektroskopie

sowohl über Reid als auch über Yang nahezu ausgeschlossen werden. Außerdem sind

auch keine signifikanten Veränderungen des Spektrums mit zunehmender TFE-

Konzentration zu beobachten. Es dominieren ungeordnete Strukturen und β-

Faltblattanteile, die bei 30 und 50 % TFE einen Anteil von bis zu 40 % haben. Der

Random-Anteil ist bei allen TFE-Konzentrationen sehr stark ausgeprägt (ca. 60 %), zeigt

jedoch insgesamt eine abnehmende Tendenz. Bei einer Konzentration von 10 % TFE

können zusätzlich ca. zu einem Drittel auch β-Schleifen, jedoch im Vergleich zu 30 und

50 % TFE kein β-Faltblatt identifiziert werden. Der Anteil an β-Schleifen fällt bei 0, 30

und 50 % TFE mit 17,7, 16,7 und 8,5 % deutlich geringer aus.

Abbildung 6-22: CD-Spektren des Peptidthiols für verschiedene TFE-Konzentrationen

Ob dies rein zufällig zustande gekommen ist oder ob ein TFE-Anteil von 10 %

insbesondere Schleifenstrukturen stabilisiert oder sogar induziert, kann aufgrund


179

fehlender Vergleichsdaten nicht bestätigt werden. Beim Vergleich mit den IR-Spektren

zeigt sich insgesamt eine hohe Übereinstimmung mit den CD-Daten. Auch hier findet

man zu geringeren Anteilen β-Faltblattstrukturen anhand der Bandenverschiebung

(1674 cm-1

) sowie einen dominanten Anteil Random (1652 cm-1

), der mit der negativen

IR-Bande bei 1652 cm-1

korreliert.

Tabelle 14: Berechnung der Sekundärstrukturanteile mittels CD-Spektroskopie

Peptidthiol

(Reed/Yang)

+0% TFE +10% TFE +30% TFE +50% TFE

α-Helix 1,4/0 0,6/0 0/4,3 4,5/0

β-Faltblatt 31,3/23,6 0/0 40,7/27,5 33,5/40

β-Turn 0/17,7 31,1/33,1 0/16,7 0/8,5

Random-Coil 67,3/58,7 68,4/66,9 59,3/51,5 62/51,5

Unter Einbeziehung der CD-Daten müsste der negative Peak bei 1652 cm-1

im IR-

Spektrum in erster Linie einer ungeordneten Struktur zugeordnet werden. Die

Sekundärstruktur des Peptidthiols wird also demnach durch einen dominanten Random-

Anteil bestimmt. Desweiteren gibt es Hinweise auf helikale Anteile, die im Vergleich zur

ungeordneten Struktur jedoch deutlich geringer ausfallen. Hierfür seien zum einen die

Einzelkomponentenzerlegung der Spektren (Abbildung 6-17), gemessen in D2O, die

Bandenverschiebung bei der IR.-Messung vor und nach Zugabe von 5 % TFE (Abbildung

6-20) sowie die CD-Messung in D2O ohne TFE (Abbildung 6-18) genannt. Weder für die

IR-Messungen noch für die CD-Messreihe in D2O konnte nach Zugabe von 10, 30 und

50 % TFE ein induktiver Effekt beobachtet werden. Eventuell muss durch weitere

Vergleichsdaten geklärt werden, ob die beobachtete Bandenverschiebung von der

eingesetzten TFE-Konzentration abhängt und inwieweit das eingesetzte Lösungsmittel,

also H2O oder D2O, dabei eine Rolle spielt. Der Shift konnte nämlich ausschließlich in

H2O nachgewiesen werden. Es ist nicht auszuschließen, dass die im Vergleich zu den

Deuteriumbrücken deutlich stärkeren Wasserstoffbrücken den induktiven Effekt von TFE

noch begünstigen. Jedoch muss an dieser Stelle auch erwähnt werden, dass das

Signal/Rausch-Verhältnis zumindest bei den IR-Messungen in D2O nicht ausreichte, um

bezüglich irgendwelcher Bandenshifts, hervorgerufen durch TFE, konkrete Aussagen

treffen zu können. Es bleibt also abschließend festzuhalten, dass die vorliegenden Daten

für das Peptidthiol in Lösung eine vorwiegend ungeordnete Struktur zeigen. Zusätzlich

können β-Faltblätter und zu geringerem Anteil auch β-Schleifen eindeutig nachgewiesen


180

werden. Besonders hervorzuheben ist an dieser Stelle jedoch, dass es auch Hinweise

darauf gibt, dass zumindest in geringfügigem Maße auch helikale Strukturen vorliegen

könnten.

Im nächsten Schritt sollte der Frage nachgegangen werden, ob sich die Sekundärstruktur

des Peptidthiols im SAM verändert, wenn die Oberfläche entweder mit Puffer (H2O und

D2O) benetzt oder die gesamte Aufbringung des SAMs im Fluss (D2O) vonstatten geht.

6.2.3.3 Messungen des Peptidthiols an der Oberfläche in Pufferlösung

6.2.3.3.1 ATR FT-IR-Messung im Fluss (D2O)

Für diese Messungen wurde das Peptidthiol im Fluss an eine Goldoberfläche

(Schichtdicke ca. 15 nm) adsorbiert, die auf einen Germanium-ATR-Kristall aufgebracht

wurde (Schichtdicke des Goldes: ca. 12 nm). Der dafür verwendete Puffer (10 mM Tris,

pH 7,4) wurde mit D2O hergestellt und der pH mit DCl eingestellt. Für die Detektion

wurde die ATR FT-IR-Technik angewandt. Bei den Oberflächenmessungen erweist sich

insgesamt die Bandenintensität als limitierender Faktor.

Abbildung 6-23: Adsorptionskinetik des Peptidthiols.


181

Bei Oberflächenmessungen im Fluss, bei denen ausschließlich der nach Inkubation

adsorbierte Peptidthiol-SAM untersucht wird, sollte die Trifluoressigsäure keine Rolle

spielen und somit auch nicht im IR-Spektrum absorbieren, da die Oberfläche nach Einbau

des Kristalls reichlich mit Puffer gespült wird.

Abbildung 6-23 zeigt zunächst die Adsorption von Peptidthiol an der Oberfläche. Wäh-

rend der Dissoziationsphase sinkt die Kurve geringfügig ab, stabilisiert sich dann aber auf

einem konstanten Wert (ca. 0,002). Damit ist gezeigt, dass der SAM sich erfolgreich auf

der Oberfläche gebildet hat.

Aus dem IR-Spektrum kann eine Bandenposition von 1666 cm-1

hergeleitet werden

(Abbildung 6-24), die wie bei den Transmissions-Messungen des SAMs an Luft einer

Schleifenstruktur zugeordnet werden kann. Durch D2O wird das Maximum der Amid I-

Bande erwartungsgemäß ein wenig zu kleineren Wellenzahlen verschoben (1666 statt

1674 cm-1

). Aufgrund des schlechten Signal/ Rausch-Verhältnisses kann aus dem

Spektrum nach Bildung der 2. Ableitung keine negativen Peaks identifiziert werden.

Abbildung 6-24: IR-Spektrum des Peptidthiols an einer Goldoberfläche in D2O (Flussmes-

sung).

Dafür sind zwei positive Banden bei 1684 und 1652 cm-1

zu sehen, die auch schon in den

vorangegangenen Reflexions-Messungen für den SAM an Luft gefunden wurden und

einer Faltblatt bzw. Schleife sowie einer ungeordneten Struktur und/oder Helix

zugeordnet werden konnten. Eventuell sind jedoch in diesem Fall die Bandenpositionen


182

rein zufällig dieselben wie bei den Peaks in den Spektren zuvor, da die

Auflösungsverbesserung mittels 2. Ableitung ausschließlich zu schmaleren Banden mit

negativen Vorzeichen führen sollte. Die Aussagekraft des Feinstrukturspektrums

(Abbildung 6-24, rechts) ist also insgesamt sehr gering einzuschätzen. Diese Messung

wurde auch in H2O wiederholt (Spektren nicht gezeigt), doch ergab keine neuen

Erkenntnisse. Hier erwies sich das Herausrechnen der H2O-Bande scheinbar als

limitierender Faktor.

Eine Feinstrukturauflösung durch Berechnung der 2. Ableitung lieferte keine weiteren

strukturellen Informationen. Besonders problematisch ist bei dieser Messtechnik die

Bedampfung des Germanium-Kristalls. Ist die Goldschicht zu inhomogen oder zu dick,

mindert dies die gemessenen Bandenintensitäten drastisch. Besser als die Bedampfungs-

methode eignet sich die Beschichtung mittels Sputtering, da eine deutlich höhere

Homogenität und Stabilität der Schicht erreicht werden kann. Zukünftig soll diese

Methode zur Verbesserung der Signalintensitäten zum Einsatz kommen.

6.2.3.3.2 ATR FT-IR-Messungen des Peptidthiol-SAMs am Hyperion IR-Mikroskop

(Bruker)

Am IR-Mikroskop Hyperion 3000 (Bruker) wurden weitere IR-Spektren des Peptidthiols

aufgenommen und versucht, mit Hilfe eines ATR-Objektivs eine möglichst hohe

Auflösung zu erreichen. Es wurden Messungen des SAMs sowohl trocken und mit Puffer,

H2O und D2O (jeweils mit 10 mM Tris, pH 7,4), benetzt durchgeführt, um eventuelle

Konformationsänderungen beim Übergang von einem zum anderen Zustand festzustellen.

Auch TFE kam wieder als „Helixstabilisator“ zum Einsatz, um eventuelle Bandenshifts

detektieren zu können. Vor allem in Hinblick auf die durchgeführten IR und CD-

Messungen in Lösung sollten die am IR-Mikroskop erhaltenen Daten als Vergleich

dienen, um eventuelle strukturelle Unterschiede im SAM ausmachen zu können. Zunächst

wurde der SAM, der zuvor in 1 mM Peptidthiollösung (Puffer 10 mM Tris in D2O, pH

7,4) inkubiert worden war, vollständig getrocknet und vier verschiedene Messpunkte auf

dem Wafer ausgewählt, um die Homogenität des SAMs zu überprüfen (Abbildung 6-25).

Dies wurde für zwei verschiedene Datensätze durchgeführt. Die gefundenen

Bandenpositionen bei 1650 (random und/oder Helix)) und 1674 cm-1

(Faltblatt/Schleife)

nach Anwendung der 2. Ableitung, die auch schon zuvor über die Reflexionsmethode


183

erhalten wurden, (Abbildung 6-15) können auch mit der ATR-Technik bestätigt werden.

Hinzu kommt noch ein weiterer Peak bei 1681 cm-1

. Im unveränderten Spektrum kann die

Amid I-Bande bei 1668 cm-1

einer Schleifenstruktur zugeordnet werden. Die 2. Ableitung

weist sowohl auf Schleife (1668 cm-1

) als auch auf Faltblatt (1631/ 1681 cm-1

) und zu

einem hohen Anteil auf eine ungeordnete Struktur (ca. 1650 cm-1

) hin. Auch eine

Kombination aus ungeordneter und helikaler Struktur ist durchaus möglich.

Abbildung 6-25: IR-Spektrum des Peptidthiol-SAMs im trockenen Zustand an vier

verschiedenen Messpunkten und 2. Ableitung (gezeigt sind 2 Datensätze mit jeweils 4 Mes-

sungen). Von einem Datensatz wurde die 2. Ableitung gebildet.

Durch die zuvor erhaltenen Daten in Lösung und für den trockenen SAM ist auch bei

dieser Messreihe jedoch nicht davon auszugehen, dass die Bande bei 1650 cm-1

ausschließlich einer Helix entspricht.

Danach wurde ein Tropfen H2O auf die Oberfläche gegeben und in Zeitabständen von

jeweils 5 Minuten gemessen. Bei dieser Messreihe sollte es darum gehen, strukturelle

Unterschiede zwischen trockenen und feuchten SAM herauszuarbeiten Innerhalb des

gemessenen Zeitraumes von 30 Minuten sind die Spektren sehr einheitlich und es ist auf

ersten Blick keine Verschiebung der Amid I-Bande zu erkennen Die Mitte der Amid I-

Bande liegt im Reinspektrum bei 1663 cm-1, was einer Schleifenstruktur entspricht. Nach

Berechnung der 2. Ableitung ergeben sich bei grober Auflösung zwei deutliche Minima

bei 1650 cm-1

(random und/oder Helix) und 1681 cm-1

(Faltblatt). Desweiteren sind zwei


184

schwächere Peaks bei 1635 und 1666 cm-1

zu erkennen, die ebenfalls einer Faltblatt- und

einer Schleifenstruktur zugeordnet werden können.

Abbildung 6-26: Entwicklung des IR-Spektrums des Peptidthiol-SAMs während einer

Inkubation mit H2O.

Eine besondere Beobachtung konnte gemacht werden, als die Bande bei ca. 1650 cm-1

,

wie in Abbildung 6-27 zu sehen, höher aufgelöst wurde. Für die gemessenen Zeitpunkte

ist ein kontinuierlicher Shift der Bande von anfänglich 1648 cm-1

im trockenen Zustand

zu 1651 cm-1

zu beobachten. Diese Veränderung um 3 Wellenzahlen ist sicherlich nicht

sehr deutlich, aber reproduzierbar und damit ein Hinweis auf eine strukturelle

Veränderung des Peptidthiols. Die anderen Banden bleiben nämlich während der

Inkubation mit H2O an derselben Position. Vielleicht ist es zunächst einmal nicht

sonderlich überraschend, dass das Peptidthiol, sobald es von H2O umgeben ist, aufgrund

von Wechselwirkungen (H-Brücken, elektrostatische Wechselwirkungen etc.) mit dem

Solvenz seine Struktur verändert. Aber die Tatsache, dass es sich insbesondere um den

Peak bei ca. 1650 cm-1

handelt, der nicht eindeutig einer Sekundärstruktur zuzuordnen ist,

sondern einer Random- oder Helixstruktur, macht diese Beobachtung so interessant,

zumal aus vorherigen Studien bekannt ist, dass die helikale Struktur von OEGs einen

entscheidenden Einfluss auf die Proteinresistenz hat.

Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass nicht nur in Lösung, sondern auch beim

Übergang von trockener zu nasser Oberfläche scheinbar Umstrukturierungen im


185

Peptidthiol stattfinden. Eine mögliche Interpretation wäre auch hier, dass bei Zugabe von

H2O sich im Peptidthiol-SAM ein Teil der Moleküle von einer anfangs größtenteils

ungeordneten Struktur in eine helikale oder partiell helikale Struktur umwandelt.

Abbildung 6-27: Bandenshift während Inkubation mit H2O

Anschließend wurde die Messung mit D2O (10 mM Tris, pH 7,4) wiederholt, um auch

hier festzustellen, ob das Peptidthiol an der Oberfläche seine Struktur verändert, wenn es

von Puffer umgeben ist. Des Weiteren sollten eventuelle Unterschiede zwischen den

H2O-Spektren (Abbildung 6-26) und D2O-Spektren (Abbildung 6-28) herausgearbeitet

werden. Gegenüber dem H2O-Spektrum ist die Amid I-Bande in D2O erwartungsgemäß

geringfügig zu kleineren Wellenzahlen verschoben. Die 2. Ableitung offenbart analog zu

H2O einen Peak bei ca. 1650 cm-1

(Random), und weitere negative Banden bei 1679 und

1630 (β-Faltblatt) und 1663 cm-1

(β-Schleife). Nur das IR-Spektrum nach 20 Minuten

Inkubation (Abbildung 6-28, cyan) zeigt ausschließlich eine schwache konturlose Bande

bei 1663 cm-1

. Eventuell ist hier beim Abzug der Referenz etwas schief gelaufen. Anhand

der Amid II-Bande (Abbildung 6-28, links), die auch nach 20 Minuten eine deutliche

Absorption bei 1460 cm-1

(D2O), aber nur eine schwache Absorption bei 1540 cm-1

(H2O)

aufweist, kann ausgeschlossen werden, dass sich das in der Umgebung befindliche H2O

bemerkbar gemacht und zu einem Austausch von D zu H geführt hat.


186

Abbildung 6-28: IR-Spektren während Inkubation mit D2O (10 mM Tris, pH 7,4).

Bis auf die üblichen geringfügigen Bandenverschiebungen bei H2O und D2O, die aus den

unterschiedlichen Massen der schwingenden Atome resultieren (H und D), können keine

drastischen Abweichungen der Bandenpositionen und folglich keine strukturellen

Unterschiede des Peptidthiols in leichtem und schweren Wasser nachgewiesen werden.

Aufgrund des deutlich schlechteren Signal/Rausch-Verhältnisses kann darüber hinaus für

die Messreihe in D2O nicht festgestellt werden, ob es zu irgendwelchen Bandenshifts,

insbesondere für die Bande bei 1650 cm-1

, während der Inkubation gekommen ist. An

dieser Stelle sei jedoch betont, dass für die Oberflächenmessungen generell, sowohl für

H2O und D2O, sehr schlechte Signale erreicht wurden. Dass dieser Bandenshift in H2O

überhaupt zu beobachten war, erforderte eine hohe Reinheit der SAM-Oberfläche und ein

äußerst gründliches Arbeiten. Solch scharfe Signale, wie in Abbildung 6-27 gezeigt,

wurden nur sehr selten erhalten. Es kann also anhand der Daten nicht ausgeschlossen

werden, dass eine ähnliche Bandenverschiebung bei einem weniger verrauschten Signal

auch in D2O zu beobachten wäre. Um abschließend beurteilen zu können, ob H2O und

D2O unterschiedliche strukturelle Einflüsse auf das Peptidthiol haben, bedarf es zukünftig

weiterer Vergleichsdaten.

Auch für den SAM an der Oberfläche wurde der Einfluss von Trifluorethanol getestet. In

einem ersten Schritt wurden die Au/Si-Wafer nach Inkubation in 10, 30 und 50 % TFE

(10 mM Tris (D2O), pH 7,4) getrocknet und dann vermessen (Abbildung 6-29).


187

Anschließend wurde ein Tropfen des Puffers mit der jeweiligen TFE-Konzentration auf

die Oberfläche gegeben und erneut Spektren aufgenommen (Abbildung 6-30). Die

Amid I-Bande zeigt für die Trockenmessung hinsichtlich ihrer Absorption (1667 cm-1

)

eine gute Übereinstimmung mir den Spektren in Abbildung 6-25, bei denen ebenfalls im

trocknen Zustand gemessen und eine Schleifenstruktur identifiziert wurde. Die 2.

Ableitung liefert kein eindeutiges Ergebnis, sondern nur eine flache sehr breite konturlose

negative Bande bei ebenfalls 1663 cm-1

. In diesem Fall hat die Feinstrukturauflösung

mittels 2. Ableitung zu keinen weiteren Erkenntnissen geführt.

Ähnlich wie bei den vorangegangenen Messungen in reinem H2O und D2O sind für die

Feuchtmessung nach Berechnung der 2. Ableitung mehrere negative Banden zu erkennen

(Abbildung 6-26, Abbildung 6-30).

Abbildung 6-29: IR-Spektren nach Inkubation mit TFE (trocken). Die 2. Ableitung liefert nur

für 10 % TFE 2 schwache Minima bei 1663 und 1654 cm-1

.

Es ergeben sich Minima bei 1650 (random und/ oder Helix), 1662 (Schleife) sowie 1620,

1631 und 1679 cm-1

(Faltblatt). Auswirkungen auf die Amid I-Banden durch TFE können

in den Spektren nicht festgestellt werden, da die 2. Ableitung sehr verrauschte negative

Banden mit äußerst geringer Intensität liefert. Ein wenig aus der Reihe fällt in dem

Zusammenhang die 2. Ableitung für 10 % TFE in Abbildung 6-30, die bei 1650 cm-1

eine

positive Bande statt einer negativen wie bei den anderen TFE-Konzentrationen zeigt.

Durch entsprechende Vergleichsmessungen wird zu klären sein, ob dieses Verhalten

durch eine schlechte Referenzmessung für diese Probe zustande gekommen ist oder ob


188

dies ein Indiz dafür darstellt, dass an der Oberfläche bei 10 % TFE der wahrscheinlich

vorliegende Random(und/oder Helix)-Anteil verschwindet und ausschließlich β-Schleifen

und β-Faltblätter auftreten. Die Messungen in Lösung haben zumindest keinen Hinweis

darauf geliefert, dass es bei 10 % TFE zu irgendwelchen strukturellen Unterschieden

kommt, zumal TFE dafür bekannt ist, helikale Strukturen zu induzieren. Somit bleibt es

eher fraglich, ob dieser beobachteten positiven Bande bei 1650 cm-1

irgendeine

Bedeutung zukommt.

Abbildung 6-30: IR-Spektren während Inkubation mit TFE (verschiedene TFE-

Konzentrationen). Die Oberflächen wurden vor der Messungen mit TFE-haltigem Puffer

betropft.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass die Messungen keinen induktiven Effekt von TFE

zeigen und damit auch keine weiteren strukturellen Informationen liefern. Dies mag in

erster Linie damit zusammenhängen, dass die Spektren zu verrauscht und somit für eine

Sekundärstrukturanalyse nicht geeignet sind. Es stellt sich aber besonders hinsichtlich der

Feuchtmessung wiederum die Frage, ob die Spektren in H2O (statt D2O) ein anderes

Ergebnis erzielt worden wäre. Die Bedeutung des Lösungsmittels, insbesondere die

Unterschiede zwischen leichtem und schwerem Wasser, wird in weiterführenden Studien

noch herauszuarbeiten sein.


189


In dieser Studie sollte es darum gehen, Peptid-basierende proteophobe Oberflächen

herzustellen, die auf lange Sicht auch in der Industrie, z.B. für die Beschichtung von

Implantaten oder Kontaktlinsen, eingesetzt werden können, um die Ausbildung von

Biofilmen zu vermeiden. Dazu wurde ein Peptidthiol mit 25 Aminosäuren auf der Basis

von „Design Rules“ synthetisiert, die bereits in einer vorherigen Studie (siehe

Dissertation Chelmowski/ Chelmowski et al., 2008) für ein anderes stark proteophobes

Peptid mit 10 Aminosäuren (10er-Peptid) herausgearbeitet wurden. Zunächst sollte,

analog zum 10er-Peptid, auch für das 25er-Peptidthiol die Proteinresistenz nachgewiesen

werden. Es zeigt auf Goldoberflächen eine vergleichbare Proteinresistenz sowohl zum

10er-Peptidthiol als auch zum OEG-Thiol, das für seine starke Proteophobie bekannt ist.

Auf Silberoberflächen kann die Beobachtung gemacht werden, dass das 25er-Peptidthiol

seine Proteinresistenz vollständig beibehält, wohingegen das OEG-Thiol erwartungsge-

mäß einen Teil seiner proteophoben Eigenschaften einbüßt. Vom OEG-Thiol ist aus

früheren Studien bekannt, dass es sein proteinabweisendes Potential aus der Ausbildung

helikaler Strukturen und der damit verbundenen Wassereinlagerung schöpft. Da die

Packungsdichte auf Silber- im Vergleich zu Goldoberflächen höher ist, können jedoch

helikale Strukturen nicht mehr so leicht ausgebildet werden, was einen Verlust der

Proteinresistenz zur Folge hat (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003).

Aus dieser Beobachtung kann, wenn für das Peptidthiol ähnliche Mechanismen wie für

die OEG-Thiole angenommen werden, also zunächst geschlussfolgert werden, dass die

Struktur nicht für die Proteinresistenz des Peptids verantwortlich ist. Vielmehr scheint der

Grund für die Proteophobie wohl eher in der verwendeten Aminosäuresequenz und den

Aminosäureresten zu liegen. Der hohe Anteil an Hydroxylgruppen in den Serinen führt

offenbar dazu, dass der daraus resultierende SAM einem OH-terminierten SAM, der

ebenfalls proteophob ist, ähnelt und damit vergleichbare Eigenschaften entwickelt.

Gegenüber einen reinem OH-Thiol-SAM ist die Proteinresistenz sogar stärker ausgeprägt

(Abbildung 6-11 und Abbildung 6-13). Ein Grund für diese Beobachtung könnte sein,

dass die OH-Gruppen nicht dicht nebeneinander an der Oberfläche stehen, sondern in die

Struktur des Peptidthiols eingegliedert sind. Dadurch entsteht eine höhere Unordnung, die

im Vergleich zu einer dichten Packung in einer gesteigerten Proteinresistenz resultiert.

Ähnliche Beobachtungen konnten bereits für das OEG-Thiol gemacht werden (Pertsin

/Grunze, 2000; Pertsin et al., 2002)


190

Die Resultate der Sekundärstrukturanalyse bestätigen die These, dass die Konformation

scheinbar keinen Einfluss auf die Proteophobie hat, aber nur teilweise. Sämtliche

Ergebnisse sind in Tabelle 15 zusammengefasst (siehe zum Vergleich Abbildung 6-2)

Tabelle 15: Zusammenfassung der Ergebnisse der Sekundärstrukturanalyse des

Peptidthiols. Die Messungen. in denen es fundierte Hinweise auf helikale Strukturen gab,

sind rot gekennzeichnet.

Methode 10er-Peptid 25er-Peptid

IR Spektrum 2. Ableitung Spektrum 2. Ableitung

KBr (Volumen) Schleife random β-Faltblatt random/β-Faltblatt

in Lösung (D2O) random/Schleife random/Helix/ Schleife

in Lösung (D2O)+ TFE random random/Schleife

In Lösung (H2O)+ TFE Schleife random/Helix/Schleife

SAM ; im Fluss (D2O) random/β-Faltblatt random/β-Faltblatt

SAM-trocken β-Faltblatt Schleife random

SAM nach Ink. in D2O-trocken Schleife random/Schleife/β-Faltblatt

SAM (Ink. mit H2O)- trocken/ nass Schleife random/Helix

SAM (Ink. mit D2O)- trocken/ nass random random/Schleife/β-Faltblatt

SAM nach TFE-Ink. (D2O)- trocken Schleife random/Schleife

SAM (Ink. mit TFE (D2O)-nass random random/Schleife/β-Faltblatt

XPS

SAM Faltblatt/random

Simulation

Schleife/ungeordnet

CD-Spektroskopie

In Lösung random/Helix/Faltblatt/Schleife

Die Daten für beide Peptidvarianten (10er- und 25erPeptid) zeigen zunächst einmal ein

sehr ähnliches Bild, was überraschenderweise nur auf geringfügige strukturelle

Unterschiede hindeutet. Insbesondere für das deutlich längere 25er-Peptid wäre zu

erwarten gewesen, dass es gegenüber dem 10er-Peptidthiol deutliche strukturelle

Unterschiede aufweist und vielleicht eher dazu neigt, auch helikale Windungen

auszubilden. Sowohl im Volumen (KBr), in Lösung und im trockenen und „feuchten“

SAM ergibt sich eine Sekundärstruktur, die durch einen ungeordneten Anteil (random)

dominiert wird. Hinzu kommen Schleifen-und β-Faltblattanteile, die sich ausschließlich

hinsichtlich ihrer Ausprägung, die anhand der relativen Bandenintensitäten qualitativ

ermittelt wurde, geringfügig unterscheiden. Bei näherer Betrachtung können jedoch

geringfügige Unterschiede festgestellt werden, die für die Gesamtinterpretation der

Ergebnisse sehr bedeutsam sind. Von besonderem Interesse für diese Studie war die


191

negative Bande (2. Ableitung), die in den vorliegenden Messungen zwischen 1648 und

1655 cm-1

zu sehen ist. Gemäß den Bandenzuordnungen nach Goormaghtigh (Abbildung

6-2) könnte sie sowohl einer Random- als auch einer Helixstruktur zuzuordnen sein.

Insbesondere der Nachweis einer helikalen Struktur der Peptidthiole wäre von

außerordentlicher Brisanz, weil damit eine mögliche Antwort auf die Frage erbracht wäre

ob das Peptidthiol zumindest einen Teil seines proteinabweisenden Potentials aus seiner

Struktur schöpft oder ausschließlich aus den Hydroygruppen der eingebauten Serine.

Im Folgenden möchte ich zunächst auf die Ergebnisse der IR-Messungen im Volumen

und in Lösung eingehen. Alle Daten deuten auf eine vorwiegend ungeordnete Struktur

hin, die auch Anteile von β-Faltblättern und teilweise auch β-Schleifen enthält. Einige

Ergebnisse (Tabelle 15) liefern aber auch Hinweise darauf, dass zumindest zu geringen

Anteilen auch helikale Strukturen auftreten. An dieser Stelle sei die Einzelkomponenten-

zerlegung in D2O (Abbildung 6-17), die CD-Messung, ebenfalls gemessen in D2O

(Abbildung 6-18) und die Bandenverschiebung in H2O nach Zugabe von 5 % TFE

(Abbildung 6-20) genannt. Die Zerlegung in Einzelbanden eignet sich zwar nicht für eine

quantitative Beurteilung der Anteile, aber zumindest für eine qualitative Bewertung.

Diese spricht durchaus dafür, dass helikale Strukturen vorliegen. Auch die beobachtete

Bandenverschiebung nach Zugabe von TFE ist ein Indiz dafür, dass eine

Umstrukturierung stattgefunden hat (Byler /Susi, 1986). Das bedeutet nicht, dass davon

ausgegangen werden kann, dass sämtliche Peptidthiole helikal gewunden sind. Vielmehr

wird entweder nur ein kleiner Teil der Moleküle in dieser Konformation vorliegen oder

aber alle Moleküle partiell helikal strukturiert sein. Die CD-Messung des Peptidthiols

bestätigt zusätzlich, dass Helices zu kleineren Anteilen vorliegen. Warum für höhere

Konzentrationen an TFE (Abbildung 6-21) kein induktiver Effekt nachgewiesen werden

konnte und welche Rolle dabei das Lösungsmittel, entweder H2O oder D2O, spielt, muss

in zukünftigen Studien noch gezeigt werden.

An der Oberfläche sind im Vergleich zu den Messungen in Lösung die identifizierten

negativen Banden insgesamt nahezu identisch, so dass es sehr unwahrscheinlich ist, dass

die Struktur des Peptidthiols sich von einem eher dominierenden Random-Anteil (vgl.

CD-Spektren Abbildung 6-18 und Abbildung 6-22 sowie Tabelle 13) an der Oberfläche

zu einer dominanten Helixstruktur umwandelt. Vielmehr scheint es sich um ein eher

dynamisches System zu handeln, das in Anbetracht der Tatsache, dass in einem Peptid

nur sehr schwache Wechselwirkungen auftreten, die kaum dazu ausreichen, eine

geordnete Struktur zu erzeugen, durchaus wahrscheinlich ist. Für diese These spricht


192

außerdem, dass sowohl in Lösung als auch an der trockenen und feuchten Oberfläche fast

alle bekannten Sekundärstrukturen gleichzeitig nachgewiesen werden können. Es ist eher

unwahrscheinlich, dass Faltblatt-, Schleifen- und ungeordnete Struktur alle in einem

einzigen Peptidthiolmolekül gleichzeitig vorliegen, sondern das ein Teil der Moleküle

zum Zeitpunkt der IR-Aufnahme die Konformation eines β-Faltblattes, andere die einer

β-Schleife oder einfach nur ungeordnet vorliegt. An dieser Stelle sei bemerkt, dass ein

Infrarotspektrum zunächst einmal nur eine Momentaufnahme ist und nicht direkt auf die

Dynamik des Systems schließen lässt. Wenn jedoch von einer Dynamik ausgegangen

wird, wäre es aber durchaus auch denkbar, dass das Peptidthiol zumindest partiell und im

geringen Maße auch helikal strukturiert ist. Bei detaillierter Betrachtung der Daten kann

dies auch für die Messung im SAM nicht kategorisch ausgeschlossen werden. Während

der zwanzigminütigen Inkubation mit H2O, also beim Übergang vom trockenen zum

nassen SAM, ist eine kontinuierliche Bandenverschiebung um drei Wellenzahlen von

1648 zu 1651 cm-1

zu erkennen., die als schwacher induktiver Effekt hin zu helikalen

oder partiell helikalen Strukturen gedeutet werden könnte. In D2O konnte diese

Beobachtung nicht gemacht werden. Ob damit jedoch gezeigt ist, dass dieser Effekt H2O-

spezifisch ist, kann anhand der Daten bis dato geklärt werden, da insbesondere an der

Oberfläche die Bandenintensitäten sowohl für H2O als auch D2O zumeist so gering

waren, dass nach Berechnung der 2. Ableitung eine seriöse Sekundärstrukturanalyse nicht

möglich gewesen wäre. Hier erweist sich für die meisten Messungen die Signalintensität

als limitierender Faktor und könnte eventuell auch verhindert haben, dass ein ähnlicher

Effekt in D2O festzustellen war. Für weiterführende zukünftige Studien wird es auf sehr

konstante Messbedingungen essentiell ankommen, um maximale Signalintensität zu

erreichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit gesammelten

Hinweise auf eventuell helikale Strukturen zunächst einmal nur punktuelle (jedoch

reproduzierbare) Beobachtungen sind, die aber in Hinblick auf die Motivation dieser

Studie, nämlich, analog zu den OEGS, für den Peptidthiol-SAM ebenfalls helikale

Strukturen auf Goldoberflächen nachzuweisen, betont werden sollten und für die Planung

weiterführender Studien genutzt werden sollten. Auch der beobachtete durch TFE

hervorgerufene Effekt in Lösung bedarf weiterer Vergleichsdaten. Insbesondere sollte

auch hier die Frage geklärt werden, ob der Shift H2O-spezifisch und reproduzierbar ist

und inwieweit die eingesetzte Konzentration an TFE eine Rolle dabei spielen könnte. Bei

der anderen TFE-Messreihe wurden 10, 30 und 50 % TFE eingesetzt und D2O als


193

Solvenz verwendet, was einen direkten Vergleich mit der Messung in H2O vor und nach

Zugabe von 5 % TFE schwierig gestaltet.

Zusammenfassend lässt sich zur Beurteilung der Sekundärstruktur sagen, dass insgesamt

die Unterschiede in Lösung, im Volumen (KBr), an der Oberfläche und auch zwischen

getrockneter und befeuchteter Oberfläche gering ausfallen. In allen Fällen gibt es einen

dominanten ungeordneten Anteil sowie in geringerem Maße β-Faltblatt- und

Schleifenstrukturen. Es gibt aber auch Hinweise darauf, dass helikale oder partiell

helikale Anteile durchaus möglich sind.

Kapitel 7 Zusammenfassung und Ausblick

194

7 Zusammenfassungen und Ausblick

Die Untersuchung von Proteinwechselwirkungen mit unterschiedlichen SAMs, aber auch

die Betrachtung von Interaktionen zwischen Proteinen über verschiedene

oberflächenspektroskopische Verfahren, sollte im Vordergrund dieser Arbeit stehen. Die

beiden Hauptmethoden waren zum einen die Oberflächenplasmonenspektroskopie (SPR),

die dazu genutzt wurde, das Bindungsverhalten der verwendeten Proteine und

verschiedener Proteinmutanten unter Berücksichtigung kinetischer Aspekte auf

(bio)organischen SAMs zu charakterisieren, zum anderen die Infrarotspektroskopie, die

eine Identifizierung der chemischen Struktur der verwendeten Moleküle für die SAM-

Herstellung und eine Sekundärstrukturanalyse der selbigen ermöglichte.

7.1 Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den Aufbau

eines Multikomponentensystems auf SAM-Oberflächen

Ein Assay, bestehend aus einem Thiol mit Biotingruppe und dem Biotin-bindenden Strep-

tavidin, wurde entwickelt, um das Immunprotein hGBP1 und verschiedene hGBP1-

Mutanten an eine Goldoberfläche zu binden und hinsichtlich des Bindungsverhaltens und

der, durch die Anzahl und Lokalisation der Anker, resultierenden Orientierung der ver-

wendeten Mutanten durch eine Kombination verschiedener Techniken (SPR, AFM,

QCM) zu charakterisieren. Für die Messungen mit dem Rasterkraftmikroskop wurden

über das Mikrokontaktstempeln und die Technik des Nanoshavings lateral strukturierte

Oberflächen hergestellt. Das Stempeln erfolgte mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol. Die

ungestempelten Flächen wurden mit 10%-Biotinthiol, Streptavidin und den verschiedenen

hGBP1-Mutanten aufgefüllt. Für die SPR-Goldchips und die QCM-Sensoren wurde

ausschließlich 10% Biotinthiol verwendet. Insgesamt konnte durch die Verwendung

verschiedener Oberflächenmethoden ein konsistentes Bild der hGBP1-Immobilisierung

erstellt und unter Berücksichtigung der Kristallstrukturen der zu untersuchenden Proteine

in ein schematisches Immobilisierungsmodellmodell übertragen werden.

Als wichtige Voraussetzungen dafür kam zum Tragen, dass die Interaktion zwischen

hGBP1 und Streptavidin sehr spezifisch ist und nur eine vernachlässigbare unspezifische

Adsorption festgestellt werden kann. Dies wurde über eine Variation der Biotinthiolkon-

zentration und Streptavidinbelegung festgestellt. Die Orientierung der an das Streptavidin


195

gebundenen hGBP1-Mutanten hängt entscheidend davon ab, mit wie viel Biotinankern

sie versehen sind und wo die Anker lokalisiert sind. Da hGBP1 ein längliches Protein ist,

entsteht bei zwei Biotinanker, die an den beiden Enden der langen Seite von hGBP1

gebunden sind, ein etwa dreifach höherer Footprint als bei einem Biotinanker, der nur an

einem Ende des Proteins lokalisiert ist. Über die Belegungsdichte, die mittels SPR

bestimmt wurde, und eine Ermittlung der Schichtdicke über AFM und QCM konnte diese

Annahme eindeutig nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde anhand der AFM-Bilder

gezeigt, dass die Proteine eine echte Monolage auf der Oberfläche ausbilden, die sehr

homogen ist und kaum Defektstellen aufweist. Da es sich bei hGBP1 um ein Enzym

handelt, ließ sich anhand seiner GTP-Hydrolyseaktivität nachweisen, dass es auf der

Oberfläche weiterhin katalytisch aktiv ist. Für die doppelt biotinylierte hGBP1-Mutante,

die flach auf der Oberfläche liegt, wurde gerade mal eine 2,5-fach kleinere Aktivität wie

in Lösung gefunden, dagegen für die einfach biotinylierten Mutanten eine 4,5- bis 20-fach

kleinere Aktivität. Da bekannt ist, dass die Hydrolyseaktivität von hGBP1 durch die

Selbstassemblierung (Homodimerisierung) beschleunigt wird und in Lösung ein

Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer vorliegt, konnte anhand der gemessenen

Aktivität, die höher ist als die für hGBP1-Monomere charakteristische Basalaktivität,

gezeigt werden, dass die doppelt biotinylierte hGBP1-Mutante durch die Zugänglichkeit

der G-Domäne, die die Dimerisierung hauptsächlich vermittelt, auf der Oberfläche mit

benachbarten Molekülen interagiert, die Einfachmutanten aufgrund der zu hohen

Belegungsdichte, die die Ausbildung von Dimerkomplexen verhindert, jedoch nicht.

HGPB1 ist in der Lage, GTP zu GDP und GMP zu hydrolysieren. Für alle drei Mutanten

konnte jedoch eine gehemmte GMP-Produktion auf der Oberfläche nachgewiesen

werden. Diese Daten bestätigen zunächst die bereits in vorherigen Studien geäußerte

These, dass hGBP1 für die Hydrolyse von GDP zu GMP einen tetrameren

Übergangszustand durchlaufen muss, der sich an der Oberfläche aufgrund der hohen

Proteindichte und der daraus resultierenden zu geringen Distanzen zu den benachbarten

Molekülen nicht ausbilden kann. Um bezüglich dieser Beobachtung fundierte Aussagen

treffen zu können, werden jedoch weitere Vergleichsdaten nötig sein.


196

7.2 Dimerisierungsstudien von oberflächengebundenem hGBP1: Das

Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System

Nachdem im ersten Projekt verschiedene hGBP1-Mutanten an eine Oberfläche

immobilisiert worden waren und ein unterschiedliches Bindungsverhalten, bedingt durch

die Anzahl und Lokalisation der Biotinanker, gezeigt werden konnte, wurden in Projekt 2

Kinetikstudien zur Dimerisierung von hGBP1 mittels SPR angestrebt. Für diese Untersu-

chungen war besonders die hGBP1-Mutante K485C geeignet, die einen Biotinanker in-

nerhalb der α12 auf der von der G-Domänen abgewandten Seite trägt und somit in der

Weise an der Oberfläche immobilisiert, dass der GTP-bindende Bereich, der hauptsäch-

lich die Dimerisierung vermittelt, zur Umgebung gerichtet ist. Somit kann die K485C-

Mutante als „Fängermolekül“ für in Lösung befindliche hGBP1-Moleküle fungieren,

wenn GppNHp als Mediator des Dimerisierungsprozesses präsent ist. Durch den hohen

Bindungsgrad von hGBP1 wt in Anwesenheit von Nukleotid an die immobilisierte

K485C-Mutante (1:1 Verhältnis), der durch SPR-Messungen gezeigt werden konnte und

ein Beleg dafür ist, dass die Dimerisierung an der Oberfläche nahezu ungehemmt

erfolgen kann, und die hohe Reproduzierbarkeit des Bindungsverhaltens waren beste

Voraussetzungen geschaffen, um konzentrationsabhängige Bindungskinetikstudien

durchzuführen. Auch für die an beiden Enden biotinylierte Mutante konnte ein hohe

Belegung von hGBP1 wt festgestellt werden, da auch hier die G-Domäne für Moleküle

aus der Lösung zugänglich ist. Dagegen wurde für eine weitere einfach biotinylierte

Mutante (Q577C), bei der die G-Domäne nach Immobilisierung zur Oberfläche gerichtet

und daher nicht zugänglich ist, keine Dimerisierung festgestellt. Zur Ermittlung des

Höhenzuwachses nach Bindung von hGBP1 wt wurden wiederum andere

Oberflächenmethoden wie AFM und QCM zur Schichtdickenbestimmung angewandt

Dabei konnte gezeigt werden, dass die Doppelmutante und die K485C-Mutante in der

Weise dimerisieren, wie es in vorherigen Studien bereits modellhaft dargestellt wurde

(Ghosh et al., 2006). Des Weiteren verdeutlichen die AFM-Daten, dass sich die Dimere

homogen auf der Oberfläche verteilen und eine echte Monolage bilden. Im Falle der

anderen Einfachmutante Q577C war es auch über AFM, QCM sowie konfokaler

Fluoreszenzmikroskopie möglich, die Hemmung der Dimerisierung an der Oberfläche

nachzuweisen. Es gilt die Regel: Umso besser die Zugänglichkeit der G-Domäne

gewährleistet ist, desto besser funktioniert die Selbstassemblierung.


197

Mit der K485C wurden anschließend Dimerisierungsstudien durchgeführt, bei denen Dis-

soziationskonstanten von 7,45 µM bzw. 6,35 µM (kdiss aus Achsenabschnitt bzw. aus den

angepassten Dissoziationskurven) und 8,89 µM (aus Plateauwerten, Maximalwerte) er-

mittelt werden konnten. Alle Werte unterscheiden sich kaum und liegen in derselben

Größenordnung des KD-Wertes, der bereits in vorherigen Studien aus Single Turnover-

Kinetiken abgeschätzt wurde (Dissertation Kunzelmann, 2006).

Für zukünftige Arbeiten kann das entwickelte Assay genutzt werden, um zum einen auch

das Phänomen der Tetramerisierung von hGBP1 zu untersuchen, zum anderen aber auch

das Bindungsverhalten von anderen katalytisch aktiven Proteinen und deren Interakti-

onspartnern zu charakterisieren und Kinetikstudien durchzuführen.

7.3 Synthese und strukturelle Untersuchung proteinresistenter Thiole

auf der Basis von Peptiden

In diesem Teil wurden SAMs auf der Basis von Peptiden hergestellt und charakterisiert

(Chelmowski et al., 2008). Die Kopplung an die Metalloberfläche erfolgte mit einem

Thiolanker, der mittels 1,3-dipolare Cycloaddition an das Peptid gebunden wurde. In

früheren Arbeiten wurde bereits ein 10er-Peptid-SAM mittels IRRAS charakterisiert und

die Proteinresistenz für verschiedene Proteine (Streptavidin, BSA, Fibronektin) unter-

sucht. Hierbei konnte eine Adsorption aller Proteine ermittelt werden, die der Größenord-

nung eines OEG(6)-terminierten SAMs (<0,1 ng/cm²) sehr nahe kam. Da dieser Ansatz

zu stark proteophoben SAMs führte, wurde auf der Basis dieses Dekapeptids eine Erwei-

terung der Aminosäuresequenz um 5 SSG-Einheiten vorgenommen und zur Charakteri-

sierung wiederum die Infrarotspektroskopie herangezogen. Die Überprüfung der Protein-

resistenz erfolgte über die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. Dabei konnte

sowohl auf Gold- als auch auf Silberoberflächen ein hohes Maß an Proteinresistenz für

BSA, Streptavidin, Fibrinogen und Fibronektin festgestellt werden. Im Gegensatz zum

OEG(6)-Thiol-SAM behielt der Peptidthiol-SAM seine proteophoben Eigenschaften auf

Silberwafern bei, was darauf hindeutete, dass die Struktur des Peptidthiols nicht in erster

Linie für die Proteinresistenz verantwortlich ist. Von OEG-Thiol-SAMs ist bekannt, dass

sie auf Silberwafern aufgrund der höheren Packungsdichte gegenüber Gold ihre proteo-

phoben Eigenschaften verlieren, da sie keine helikalen Strukturen mehr ausbilden können.

Um dies zu überprüfen, wurden Sekundärstrukturanalysen mittels IR und CD sowie XPS


198

(nur für das 10er-Peptid) durchgeführt. Dabei wurden die Peptidthiole sowohl im Volu-

men als auch im SAM untersucht. Für das 25er-Peptidthiol und den 25er-Peptidthiol-

SAM wurden zusätzlich IR-Spektren an Luft als auch in Lösung bei physiologischem pH-

Wert aufgenommen und der Einfluss von Trifluorethanol als Helixstabilisator getestet.

Insgesamt wurden größere Unterschiede zwischen Luft und wässriger Lösung bzw. SAM

(trocken/feucht) hinsichtlich der vorliegenden Sekundärstruktur nicht festgestellt. Für

beide Peptidvarianten wurde eine größtenteils ungeordnete Struktur gefunden. Des

Weiteren konnten Schleifen- und Faltblattanteile identifiziert werden und für das 25er-

Peptidthiol auch punktuelle Hinweise gesammelt werden, die auf helikale oder partiell

helikale Struktur hindeuten könnten.

Die Ergebnisse zeigen somit insgesamt, dass der hohe Anteil an OH-Gruppen innerhalb

des Peptids, bedingt durch die Aminosäure Serin, hauptverantwortlich für die

proteinresistenten Eigenschaften ist. Die Tatsache, dass der Peptidthiol-SAM tendenziell

proteinresistenter ist als ein reiner OH-SAM, kann damit begründet werden, dass die OH-

Gruppen in der Peptidschicht in viel höherer Unordnung vorliegen, die, analog zum OEG-

Thiol, zu stärkerer Ausprägung der proteinabweisenden Eigenschaften führt. Aufgrund

der gesammelten Indizien für helikale Strukturen deutet jedoch auch vieles darauf hin,

dass zumindest in geringfügigem Maße die Sekundärstruktur des Peptids zur

Proteinresistenz beiträgt.

Zukünftig könnten weitere Peptide synthetisiert werden und dabei völlig andere

Aminosäurekombination gewählt werden, die nicht unbedingt auf der Basis der „Design

Rules“ für OEG-Thiol entwickelt werden müssen. Die vorliegende Arbeit zeigt deutlich,

dass sich die Eigenschaften der OEGs nicht unbedingt auf andere Moleküle (Peptidthiol)

übertragen lassen. Andererseits sind die Studien zu den OEGS die einzigen

Anhaltspunkte, die für das Design zur Verfügung stehen. Ein direktes

Anschlussexperiment an diese Arbeit wäre dabei die stufenweise Reduzierung der Serine,

um zu überprüfen, ob die Hydroxylgruppen definitiv die Proteinresistenz verursachen

oder ob es noch andere Gründe gibt.

Für eine weiterführende Sekundärstrukturanalyse des 25er-Peptidthiols sollte sowohl der

Einfluss von TFE sowie des eingesetzten Solvenz, also H2O und D2O, noch detaillierter

betrachtet werden, wenn von einem dynamischen System ausgegangen wird, müsste auch

die Temperaturabhängigkeit mit in Betracht gezogen werden. Auch eine zeit-und

ortsaufgelöste in situ-Messung sowie eine Simulation des 25er-Peptidthiols könnte


199

wichtige strukturelle Informationen liefern, vor allem in Hinblick auf die Dynamik des

Systems, liefern. Desweiteren wäre es sinnvoll als Vergleich Peptide heranzuziehen, die

in vorangegangenen Studien als helikal identifiziert werden konnten und mit dem 25er-

Peptidthiol zu vergleichen.

Kapitel 8 Quellenverzeichnis

200

8 Quellenverzeichnis

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Kapitel 9 Abbildungsverzeichnis

213

9 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-1: Molekulare Ansicht zweier hGBP1-Moleküle ........................................................ 3

Abbildung 1-2: Herstellung proteinresistenter, biokompatibler Oberflächen. ................................. 4

Abbildung 2-1: OEG-Thiol mit unterschiedlicher Anzahl an Ethylenglykoleinheiten. ................. 13

Abbildung 2-2: Selbstorganisation von Organthiolen. ................................................................... 16

Abbildung 2-3: Strukturformel des Oktadekanthiols (ODT) ......................................................... 17

Abbildung 2-4: Strukturformel des Biotinthiols ............................................................................. 17

Abbildung 2-5: Strukturformel des proteophoben OEG-Thiols ..................................................... 18

Abbildung 2-6: Strukturformel des proteophoben Merkaptoundekan-1-ol (OH-Thiol) ................ 18

Abbildung 2-7: Schema zur verwendeten Aminosäuresequenz für das Peptid .............................. 21

Abbildung 2-8: Kristall von Streptavidin mit vier gebundenen Biotinmolekülen. ........................ 22

Abbildung 2-9: Variation der Biotinthiolkonzentration ................................................................. 24

Abbildung 2-10: Adsorptionskinetik von Streptavidin (200 nm) auf 5 % Biotinthiol. .................. 25

Abbildung 2-11: Diffusionslimitierte Adsorption des Streptavidins auf dem Biotinthiol-SAM.... 26

Abbildung 2-12: Schematische Darstellung des JAK-STAT-Signaltransduktionsweges.. ............ 27

Abbildung 2-13: Vergleich der Domänenstruktur von Dynamin und GBP. .................................. 30

Abbildung 2-14: Kristallstruktur von hGBP1 full length im nukleotidfreien Zustand................... 34

Abbildung 2-15: Modell für das hGBP1-Dimer in Anwesenheit von GppNHp.. .......................... 35

Abbildung 3-1: Darstellung der Dispersionskurven von Oberflächenplasmonen .......................... 41

Abbildung 3-2: Messkonfiguration für Oberflächenplasmonen nach Raether und Kretschm.. ..... 42

Abbildung 3-3: Optische Anregung der Oberflächenplasmonen. .................................................. 42

Abbildung 3-4: Veränderungen der Dispersionskurve der Oberflächenplasmonen ....................... 43

Abbildung 3-5: Plasmonenresonanzkurven für zwei verschiedene Zeitpunkte ............................. 44

Abbildung 3-6: Schematische Darstellung- Rasterkraftmikroskop. ............................................... 49

Abbildung 3-7: Strukturierte SAM-Oberfläche (AFM) ................................................................. 53

Abbildung 3-8: Strukturierung von SAM beschichteten Goldoberflächen mit dem AFM: ........... 54

Abbildung 3-9: Mikrokontaktstempeln eines Thiols ...................................................................... 56

Abbildung 3-10: Strahlengang im Streiflichtobjektiv für IR/VIS (Bruker Optics) ........................ 62

Abbildung 3-11: Amid I-Moden verschiedener Sekundärstrukturelemente .................................. 64

Abbildung 3-12: QCM- Quarzsensor. ............................................................................................ 68

Abbildung 3-13: Schematisches CD-Spektrum der Sekundärstrukturelemente ............................. 89

Abbildung 4-1: SDS-Gel der hGBP1-haltigen Fraktion nach der Cobaltsäule. ............................. 93

Abbildung 4-2: Elutionsprofil der Aufreinigung von hGBP1 mit der Gelfiltrationssäule. ............ 94


214

Abbildung 4-3: Gelfoto der gesammelten Fraktionen nach der Gelfiltration.. .............................. 95

Abbildung 4-4: Strukturformel von 5-Carboxyfluoresceinsuccinimidylester ............................... 95

Abbildung 4-5: Wellenlängenscans von hGBP1 mit Fluoreszenz-Label....................................... 97

Abbildung 4-6: pH-abhängige Labeling-Effizienz von 5 Carboxyfluoreszeinsuccinimidylester.. 97

Abbildung 4-7: Konsekutive Immobilisierung von Streptavidin ................................................... 99

Abbildung 4-8: Kristallstruktur von hGBP1 mit Nukleotid (rot) und Mg2+

(grau).. .................... 100

Abbildung 4-9: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Glutamin an der Position 577. ..... 101

Abbildung 4-10: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Glutamin 577 und Lysin 485 ..... 102

Abbildung 4-11: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Lysin 485.. ................................. 102

Abbildung 4-12: MALDI-Spektrum von Streptavidin. ................................................................ 105

Abbildung 4-13: MALDI-Spektrum von hGBP1. Die verwendete Matrix ist Zimtsäure............ 106

Abbildung 4-14: MALDI-Spektrum von Biotinthiol auf einer Goldoberfläche. ......................... 106

Abbildung 4-15: MALDI-Spektrum von immobilisiertem Streptavidin ..................................... 107

Abbildung 4-16: MALDI-Spektrum von nacheinander immobilisiertem Streptavidin/hGBP1. . 108

Abbildung 4-17: Konsekutive Immobilisierung von Streptavidin/biotinyliertem hGBP1 ......... 109

Abbildung 4-18: Beladung der Oberfläche mit Streptavidin/ hGBP1-Mutanten ........................ 110

Abbildung 4-19: Unspezifische Adsorption von Streptavidin und hGBP1 . ............................... 115

Abbildung 4-20: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Adsorption von Streptavidin ........... 116

Abbildung 4-21: Adsorption von Streptavidin und den beiden hGBP1-Mutanten ...................... 117

Abbildung 4-22: Bindungskinetiken der drei hGBP1-Mutanten. ................................................ 118

Abbildung 4-23: Topographiebilder (oben) und Höhenprofile (unten) ....................................... 120

Abbildung 4-24: Topographiebilder nach Inkubation mit Streptavidin und Mutanten. .............. 121

Abbildung 4-25: Topographiebilder einer lateral strukturierten Oberfläche ............................... 122

Abbildung 4-26: Frequenz- und Dissipationsänderung ............................................................... 123

Abbildung 4-27: Schichtdickenberechnung für Streptavidin/hGBP1 Mutanten .......................... 123

Abbildung 4-28: Schichtdickenberechnung für Streptavidin, die hGBP1-Mutante K485C ........ 124

Abbildung 4-29: Mögliches Modell für die Immobilisierung von Streptavidin/Q577C ............. 125

Abbildung 4-30: Mögliches Modell für die Immobilisierung von Streptavidin/K485C. ............ 126

Abbildung 4-31: Mögliches Modell für die Immobilisierung von Streptavidin/Doppelm. ......... 126

Abbildung 4-32: Konzentrationsabhängigkeit der GTPase-Reaktion .......................................... 128

Abbildung 4-33: Aktivitätstest der hGBP1-Mutanten in Lösung (25 °C). .................................. 129

Abbildung 4-34: Aktivitätstest der hGBP1-Mutanten an der Oberfläche (25 °C). ...................... 130

Abbildung 4-35: Messung der Hydrolyseaktivität bei 350 µM GTP und 0,5 µM hGBP1. ......... 131

Abbildung 4-36: Dimerisierungsmodell von hGBP1 (nach Gosh et al., 2006) ........................... 133


215

Abbildung 4-37: Modell der Verteilung von Streptavidin bei 50 % Belegung. ........................... 133

Abbildung 4-38: Modell der Verteilung von Streptavidin bei 25 % Belegung. ........................... 134

Abbildung 4-39: Mögliches Modell der Dimerisierung ............................................................... 135

Abbildung 5-1: Konsekutive Beladung der SAM-Oberfläche mit Streptavidin, Mutanten ......... 138

Abbildung 5-2: Konsekutive Beladung der SAM-Oberfläche mit Streptavidin, K485C. ............ 139

Abbildung 5-3: Belegung von hGBP1 wt in Anwesenheit von 50 µM GppNHp. ....................... 140

Abbildung 5-4: Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin/ hGBP1-Doppelm. ............. 141

Abbildung 5-5: Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin/K485C ................................ 142

Abbildung 5-6: Schichtdickenberechnung über QCM-D. ............................................................ 143

Abbildung 5-7: Schichtdickenberechnung für Streptavidin/hGBP1-Mutante K485C/wt. ........... 144

Abbildung 5-8: Schichtdickenberechnung von hGBP1 wt mittels QCM-D. ............................... 144

Abbildung 5-9: Fluoreszenzmikroskopie Aufnahmen von lateral strukturierten SAMs. ............. 146

Abbildung 5-10: Mögliches Modell (Schema) für die Dimerisierung von hGBP1 wt ................. 148

Abbildung 5-11: Mögliches Modell für die Dimerisierung .......................................................... 149

Abbildung 5-12: SPR-Bindungskinetik von hGBP1 wt ............................................................... 150

Abbildung 5-13: Kinetik der Assoziation von hGBP1. ................................................................ 151

Abbildung 5-14: Auftragung der Plateau-Werte d ....................................................................... 153

Abbildung 6-1: IR-Spektren des Peptid-1-Thiol-SAMs als Volumenspektrum ........................... 155

Abbildung 6-2: Amid I-Moden verschiedener Sekundärstrukturelemente. ................................. 156

Abbildung 6-3: Ausschnitt aus dem IR-Spektrum des Peptidthiols. ............................................ 157

Abbildung 6-4: Aminosäuresequenz und chemische Struktur des verwendeten 25er-Peptids .... 161

Abbildung 6-5: HPLC-Spektrum des Produktes aus der Synthese des 25er-Peptids. .................. 162

Abbildung 6-6: MALDI-Spektrum des 25er-Peptidthiols. ........................................................... 162

Abbildung 6-7: IR-Spektrum des 25er-Peptidthiols im Volumen (KBr).. ................................... 163

Abbildung 6-8: IR-Spektrum des 25er-Peptidthiols im SAM. ..................................................... 164

Abbildung 6-9: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Fibrinogen ................................. 165

Abbildung 6-10: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Fibronektin. ............................. 166

Abbildung 6-11: Zusammenfassung der Proteinadsorption auf SAMs für Gold. ........................ 166

Abbildung 6-12: Zusammenfassung der Adsorption von Fibrinogen .......................................... 167

Abbildung 6-13: Zusammenfassung der Proteinadsorption auf SAMs für Silber. ....................... 168

Abbildung 6-14: IR-Spektrum (Transmission) des Peptidthiols im Volumen (KBr) ................... 169

Abbildung 6-15: IR-Spektrum (Reflexion) des Peptidthiols im SAM gemessen an Luft ............ 169

Abbildung 6-16: IR-Spektrum des Peptidthiols in D2O und 2. Ableitung. .................................. 171

Abbildung 6-17: Berechnung der Anteile für die Einzelkomponenten der Amid I-Bande. ......... 172


216

Abbildung 6-18: CD-Spektren des Peptidthiols.. ......................................................................... 174

Abbildung 6-19: IR-Spektren des Peptidthiols in H2O (rote Kurve) und 5 % Trifluorethanol. ... 175

Abbildung 6-20: IR-Spektren des Peptidthiols in H2O und 5 % Trifluorethanol (TFE). ............. 176

Abbildung 6-21: IR-Spektren des Peptidthiols in D2O und verschied. TFE-Konzentrationen. ... 177

Abbildung 6-22: CD-Spektren des Peptidthiols für verschiedene TFE-Konzentrationen ........... 178

Abbildung 6-23: Adsorptionskinetik des Peptidthiols. ................................................................ 180

Abbildung 6-24: IR-Spektrum des Peptidthiols an einer Goldoberfläche in D2O. ...................... 181

Abbildung 6-25: IR-Spektrum des Peptidthiol-SAMs im trockenen Zustand ............................. 183

Abbildung 6-26: Entwicklung des IR-Spektrums des Peptidthiol-SAMs .................................... 184

Abbildung 6-27: Bandenshift während Inkubation mit H2O ....................................................... 185

Abbildung 6-28: IR-Spektren während Inkubation mit D2O (10 mM Tris, pH 7,4). ................... 186

Abbildung 6-29: IR-Spektren nach Inkubation mit TFE (trocken).. ............................................ 187

Abbildung 6-30: IR-Spektren während Inkubation mit TFE. ...................................................... 188

Kapitel 10 Tabellenverzeichnis

217

10 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Parameter für rasterkraftmikroskopische Aufnahmen ................................................... 60

Tabelle 2: Ergebnisse der ASA Berechnung. ............................................................................... 101

Tabelle 3: Ergebnisse der Quantifizierung der Biotinylierungseffizienz ..................................... 103

Tabelle 4: Ergebnisse der Belegung von Streptavidin/ biotinylierte hGBP1-Mutanten i............. 111

Tabelle 5: Streptavidin-Belegung auf verschiedenen Goldchips................................................. 117

Tabelle 6: Schichtdickenbestimmung für Streptavidin/hGBP1-Mutanten ................................... 124

Tabelle 7: Übersicht zu den gemessenen Hydrolyseaktivitäten ................................................... 131

Tabelle 8: Ermittelter Schichtdickenzuwachs für die drei hGBP1-Mutanten .............................. 145

Tabelle 9: Zusammenfassung der Streptavidin-Adsorption auf dem 10er-Peptidthiol-SAM ...... 155

Tabelle 10: Vergleich der IR-Spektren im Volumen und an der Oberfläche. .............................. 156

Tabelle 11: Simulationsergebnisse für die Sekundärstrukturbestimmung des Peptids ................ 159

Tabelle 12: Zusammenfassung der wichtigsten Banden für das 25er-Peptidthiol........................ 164

Tabelle 13: Berechnung der Sekundärstrukturanteile mittels CD-Spektroskopie ........................ 174

Tabelle 14: Berechnung der Sekundärstrukturanteile mittels CD-Spektroskopie ........................ 179

Tabelle 15: Zusammenfassung der Ergebnisse der Sekundärstrukturanalyse des Peptidthiols. ... 190

Kapitel 11 Abkürzungsverzeichnis

218

11 Abkürzungsverzeichnis

Å Ångström (1 Å = 1*10-10

m)

AG Aktiengesellschaft

AFM Atomic Force Microscopy (Rasterkraftmikroskopie)

ASA Accessible Surface Area

ATR Attenuated Total Reflexion

bHRP Biotinylated Horse Radish Peroxidase

BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

c Konzentration

ca. circa

CD Circular Dichroism (Zirkulardichroismus)

CTL CD4 oder CD8 T-Lymphozyten

d Schichtdicke der Küvette

dest. destilliert

DNA Desoxyribonukleinsäure

D2O Deuteriumoxid

d. h. das heißt

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTNB 5,5´-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure)

DTT Dithiothreitol

ESI-MS Electrospray Ionisation- Mass Spectrometry

et al. et alii (und andere)

GAP GTPase-aktivierende Proteine

GBP Guanylat-bindende Proteine

GDP Guanosindiphosphat

GED GTPase-Effektor-Domäne

GEF Guaninnukleotid Austauschfaktor

g/l Gramm pro Liter

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung

GMP Guanosinmonophosphat

GNBP GTP-bindende Proteine

GppNHp Guanosin-5´-(βγ-imino)-triphosphat

GTP Guanosintriphosphat

H2O Wasserstoffoxid (Wasser)

HCl Chlorwasserstoff, Salzsäure

hGBP humanes Guanylat-bindendes Protein

HIV humanes Immundefizienz-Virus

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IFNAR Interferon α/β-Rezeptor Komplex

IFNR Interferon γ-Rezeptoren

Inc. Incorporated

Ink. Inkubation

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

IRRAS Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie


219

JAK Janus Kinase

K Kelvin

K2HPO4 Dikaliumhydrogenphosphat

KCl Kaliumchlorid

kDa Kilodalton

KG Kommanditgesellschaft

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

kJ Kilojoule

l Liter

LG Large Globular

MALDI-TOF Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-

Time of flight

M-1

cm-1

pro Mol pro Zentimeter

mGBP murines Guanylat-bindendes Protein

Mg2+

Magnesium-Ion

MgCl2 Magnesiumdichlorid

mg/l Milligramm pro Liter

MgSO4 Magnesiumsulfat

min Minute

ml Milliliter

mM Millimolar

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxid

ng Nanogramm

nm Nanometer

NTA Nitrilotriessigsäure

OD optische Dichte

OEG Oligoethylenglykol

PCR Polymerasekettenreaktion

PDMS Polydimethylsiloxan

PDB Protein Data Bank

PEG Polyethylenglykol

pH Potentia Hydrogenii

PHD Pleckstrin-Homologie-Domäne

pmol/µl Pikomol pro Mikroliter

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PNA Peptide Nucleic Acid

PRD Prolin-reiche Domäne

Prof. Professor

QCM Quartz Crystal Microbalance

(Quarzkristallmikrofeinwaage)

QCM-D Quartz Crystal Microbalance Dissipation

Ras Rat Sarcoma

RMS Root Mean Square (quadratisches Mittel)

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease A

RNAi Ribonukleinsäure Interferenz

s Sekunde


220

SA Streptavidin

SAM(s) Self-assembled Monolayer(s)

SDS Natriumdodecylsulfat

sog. sogenannte(r,s)

s.o. siehe oben

SP Surface Plasmon(s)

SPR Surface Plasmon Resonance Spectroscopy

(Oberflächenplasmonenresonanzspektrokopie)

STAT Signal Tranducer and Activator of Transcription

STM Scanning Tunneling Microscopy

(Rastertunnelmikroskopie)

TBA-Br Tetrabutylammoniumbromid

TEM Transmission Electron Microscopy

Transmissionelektronenmikroskopie

TFA Trifluoroacetic acid (Trifluoressigsäure)

TFE Trifluorethanol

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

Tris-HCl Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid

u.a. und andere

µl Mikroliter

µm Mikrometer

UV Ultraviolett

V Volt

vgl. vergleiche

VIS Visible

VP Volumenplasmonen

VSV Vesicular Stomatitis Virus

wt Wildtyp

XPS X-ray Photo electron Microscopy

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

Symbole:

α Alpha

β Beta

γ Gamma

ε Extinktionskoeffizient

λ Lambda

% Prozent

Aminosäuren Ein- und Dreibuchstabencode:

Alanin Ala A

Cystein Cys C

Asparaginsäure Asp D

Glutaminsäure Glu E

Phenylalanin Phe F

Glycin Gly G

Histidin His H


221

Isoleucin Ile I

Lysin Lys K

Leucin Leu L

Methionin Met M

Asparagin Asn N

Prolin Pro P

Glutamin Gln Q

Arginin Arg R

Serin Ser S

Threonin Thr T

Valin Val V

Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

Kapitel 12 Publikationen

222

12 Publikationen

1. R. Chelmowski, S. D. Koster, A. Kerstan, A. Prekelt, C. Grunwald, T. Winkler,

N.,Metzler-Nolte, A. Terfort and C. Woll (2008). "Peptide-based SAMs that resist the

adsorption of proteins." J Am Chem Soc 130(45): 14952-3.

2. A. Kerstan, T. Ladnorg, Ch. Grunwald, T. Vöpel, D. Zacher, Ch. Herrmann, Ch. Wöll.

„HGBP1 as a model system investigated by several surface techniques”,

Biointerphases, accepted

3. A. Kerstan, Tobias Vöpel, T. Ladnorg, D. Zacher, Ch.Wöll, Ch. Herrmann.

"Immobilization of biotinylated hGBP1 on surfaces and investigation of ist

oligomerization using various biophysical and biochemical techniques”, in progress

Kapitel 13 Lebenslauf

223

13 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Kerstan, Andreas

Anschrift: Theodor-Otte-Str. 146

45897 Gelsenkirchen

0209/1486614

Mail: [email protected]

Geburtsdatum: 28.04.1981 in Gelsenkirchen

Familienstand: ledig

Voraussichtlicher Berufsabschluss

WS 2010 Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer.nat.)

Hochschulstudium

WS 06/07 - WS 10/11 Promotion im Fachbereich Biochemie

an der Ruhr-Universität Bochum

WS 01/02 - WS 06/07 Master of Science im Fachbereich Biochemie

an der Ruhr-Universität Bochum

Abschluss: Master Biochemiker

Studienschwerpunkte: Biophysikalische Chemie; Proteinbiochemie,

Oberflächenchemie

Wehrdienst

07/2000 – 05/2001: Deines-Bruchmüller-Kaserne Koblenz

Schulbildung

08/1991 – 05/2000: Max-Planck-Gymnasium Gelsenkirchen-Buer, Abitur

08/1986 – 05/1990: Grundschule an der Flurstraße, Gelsenkirchen

Besondere Kenntnisse und Interessen

Fach: Business to Business Marketing, Grundkenntnisse

EDV: Word, Excel, PowerPoint, Corel Draw, Chem Draw, Isis

Draw, Nanoscope IIIa, Pymol

Sprachen: Englisch, Latein, Französisch

Interessen: Lesen, Schreiben, Tennis, Fitness, Musik hören

Kapitel 14 Danksagung

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14 Danksagung

Ohne die Hilfe vieler fleißiger „Bienchen“, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen

haben, wäre dieses Schriftstück in der vorliegenden Form nicht zustande gekommen.

Dafür möchte ich mich von ganzem Herzen bedanken. Falls ich jemanden vergessen

sollte, bitte nicht böse sein.

Allen voran möchte ich ein ganz dickes Dankeschön an Herrn Herrmann richten, der mir

vor allen Dingen in den letzten Monaten, aber auch während der gesamten Zeit meiner

Promotion, mit Rat und Tat zur Seite stand. Das große Interesse an meiner Arbeit, die

konstruktiven Diskussionen und auch die eine oder andere kritische Äußerung haben mir

sehr geholfen, die Höhen und Tiefen, die man während der Jahre durchlebt, zu überstehen

und gestärkt daraus hervorzugehen. Kurzum von Ihnen habe ich viel gelernt und Sie als

echt „korrekten“ Menschen kennengelernt. Ihnen und Herrn Wöll gilt gleichermaßen der

Dank, dass mir die Möglichkeit gegeben wurde, an sehr spannenden Forschungsthemen

arbeiten zu dürfen, und dass ich die nötige finanzielle und wissenschaftliche

Unterstützung bekommen habe. Sie haben stets dafür gesorgt, dass zu jeder Zeit die

besten Voraussetzungen für wissenschaftliches Arbeiten gegeben waren. Danke!

Rolf und Tatjana danke ich ganz besonders für die tolle Zusammenarbeit und die vielen

amüsanten Stunden. Solche Sätze wie „Nimm dir was von dem großen Igel, der

schmeckt“ oder „dann hol dir ne Pulle“ werde ich nie vergessen.

Natürlich möchte ich auch die anderen „Bürobewohner“ Andreas Prekelt, Daniel Käfer,

Stefanie Winkler und ganz besonders Paavo Pohndorff, und Stanislav Gann erwähnen,

die unser Büro zum Besten im ganzen Lehrstuhl gemacht haben. Und nochmal ein großes

Dankeschön an Paavo und Stan: Ohne Euch wäre ich zwischendurch ganz schön

aufgeschmissen gewesen!!!

Ich danke dem ganzen Lehrstuhl für die vielen Ratschläge und Unterstützung, aber auch

die tolle Atmosphäre. An dieser Stelle seien im Besonderen erwähnt: Ruth, Angelika,

Ulla, Herr Birkner, Herr Ader („Goldader“), Liu, Herr Zwingmann, Jennifer, Xia, Asif,

Herr Wasmuth und Herr Krause, etc…Auch der „Witte-Fraktion“ möchte ich an dieser

Stelle nochmal einen herzlichen Gruß schicken, besonders Jan und Christian.

Auch die Unterstützung beim „Peptidthiol-Projekt“, die ich durch Herrn Grunwald

erfahren habe, soll in dieser Danksagung besondere Erwähnung finden. Danke, Christian!

Kapitel 14 Danksagung

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Ich danke der AG Protein-Protein-Interaktion für die vielen konstruktiven Gespräche und

die Unterstützung, die ihr mir entgegengebracht habt. Ganz besonders möchte ich in dem

Zusammenhang Tobias, Maik und Adrian hervorheben.

Ohne Kooperationen mit anderen Lehrstühlen wäre die Arbeit so nicht zustande

gekommen, deswegen ein „Dankeschön“ an David, Denise, Sebastian und Jörn (Rub)

sowie Stefan Heissler (Kit), den Leuten der Firma Bruker und Herrn Terfort (ohne das

Alkinthiol wäre ich verloren gewesen).

Zu guter Letzt danke ich meinen Freunden und meiner Familie, allen voran meinen

Eltern, die mir dieses Studium ermöglicht haben und mich stets moralisch sowie tatkräftig

unterstützt haben, und Steffi für die Korrektur meiner Arbeit und den festen Glauben an

mich (und natürlich dafür, dass es dich gibt).

Kapitel 15 Eidesstattliche Erklärung

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Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die hier vorgelegte Dissertation

eigenständig, ohne unerlaubte Hilfe und unter ausschließlicher Verwendung der

angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt habe. Diese Dissertation ist in der

vorliegenden oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen Institution eingereicht

worden.

Bochum, im Oktober 2010

untersuchung von spezifischen protein-protein ... · dissertation vorgelegt zur erlangung des...

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