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Untersuchungen zur Eignung entomopathogener

und zur Identifizierung hyperparasitärer Pilze als Antagonisten der Honigbienenmilbe

Varroa destructor

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der

Ruhr-Universität Bochum

Arbeitsgruppe Verhaltensbiologie und Didaktik der Biologie

vorgelegt von

Markus Holt

aus

Gladbeck

Bochum

Februar 2010

Investigations into the suitability of

entomopathogenic fungi and the identification of hyperparasitic fungi as antagonists of the honeybee

mite Varroa destructor

Dissertation to obtain the degree Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) Faculty of Biology and Biotechnology

International Graduate School of Biosciences Ruhr-University Bochum

SG Behavioural Biology and Didactics of Biology

submitted by

Markus Holt

from

Gladbeck

Bochum

February 2010

Gutachter:

Prof. Dr. Wolfgang H. Kirchner

Prof. Dr. Günter A. Schaub

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .................................................................................................. 7

1.1 Die westliche Honigbiene Apis mellifera und ihr Parasit Varroa

destructor ................................................................................................. 7

1.2 Ansätze und Probleme bisheriger Bekämpfungsstrategien .................... 12

1.3 Entomopathogene Pilze als Antagonisten von Varroa destructor ........... 14

1.4 Zielsetzung ............................................................................................. 19

2 Material und Methoden ........................................................................... 21

2.1 Versuchstiere und verwendete Pilzstämme ............................................ 21

2.2 Medien und Puffer .................................................................................. 22

2.3 Bestimmung optimaler Kulturbedingungen ............................................. 23

2.4 Bestimmung einer ausreichenden Oberflächensterilisationsdauer

gesammelter Milben ............................................................................... 23

2.5 Ermittlung geeigneter Konservierungsmethoden gesammelter Milben ... 24

2.6 Erfassung der Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Bienenlarven ...... 25

2.7 Bestimmung der Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Adultbienen

und Milben .............................................................................................. 27

2.8 Erfassung des Pilzwachstums aus behandelten Milben ......................... 30

2.9 Halbfreilandversuch an Apis mellifera-Völkern zur Wirkung

entomopathogener Pilze auf Adultbienen, Bienenlarven und -puppen

sowie Varroa destructor .......................................................................... 30

2.10 Erfassung der subletalen Effekte entomopathogener Pilze auf

Adultbienen ............................................................................................ 33

2.11 Erfassung des Einflusses entomopathogener Pilze auf das

Immunsystem von Adultbienen .............................................................. 37

2.12 Screening ausgewählter Völker auf potentiell spezifische

Varroapathogene Pilze ........................................................................... 39

2.13 Identifizierung von Pilzen im Pilzscreening ............................................. 40

2.14 Statistik und Parameter der grafischen Darstellung ................................ 44

3 Ergebnisse ............................................................................................. 46

3.1 Voruntersuchungen ................................................................................ 46

3.1.1 Kulturbedingungen ................................................................................. 46

Inhaltsverzeichnis

3.1.2 Wirkung unterschiedlicher Oberflächensterilisationszeiten auf das

Pilzwachstum aus Milben ....................................................................... 48

3.1.3 Einfluss der Konservierungsmethode der Milben auf das

Pilzwachstum ......................................................................................... 50

3.2 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Larven ....................................... 51

3.3 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Adultbienen ............................... 52

3.3.1 Lecanicillium muscarium: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte

Mortalität ................................................................................................. 52

3.3.2 Metarhizium anisopliae: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte

Mortalität ................................................................................................. 54

3.3.3 Beauveria bassiana: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte

Mortalität ................................................................................................. 56

3.3.4 Paecilomyces fumosoroseus: Mortalität/Versuchsgruppe und

kumulierte Mortalität ............................................................................... 58

3.4 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Milben ....................................... 60

3.4.1 Lecanicillium muscarium: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte

Mortalität ................................................................................................. 60


Mortalität ................................................................................................. 62


Mortalität ................................................................................................. 64


kumulierte Mortalität ............................................................................... 66

3.5 Pilzwachstum aus behandelten Milben ................................................... 68

3.5.1 Lecanicillium muscarium ........................................................................ 68

3.5.2 Metarhizium anisopliae ........................................................................... 69

3.5.3 Beauveria bassiana ................................................................................ 70

3.5.4 Paecilomyces fumosoroseus .................................................................. 71

3.6 Wirkung entomopathogener Pilze auf Adultbienen, Bienenlarven

und -puppen sowie Varroa destructor im Halbfreilandversuch ............... 72

3.6.1 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Bienen

pro Volk .................................................................................................. 73

3.6.2 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Larven

pro Volk .................................................................................................. 74

Inhaltsverzeichnis

3.6.3 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Puppen

pro Volk .................................................................................................. 75

3.6.4 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenfall pro Tag

und Volk ................................................................................................. 76

3.6.5 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenendbefall

adulter Bienen ........................................................................................ 77


verdeckelter Brut .................................................................................... 78

3.7 Subletale Effekte entomopathogener Pilze auf Adultbienen ................... 79

3.7.1 Ernährungszustand im Langzeit-in-vitro-Assay ...................................... 79

3.7.2 Nahrungsaufnahme im Langzeit-in-vitro-Assay ...................................... 80

3.7.3 Lernleistung von Adultbienen im PER-Assay ......................................... 82

3.7.4 Diskriminationsfähigkeit von Adultbienen im Langzeit-PER-Assay......... 84

3.7.5 Einfluss entomopathogener Pilze auf das Immunsystem von

Adultbienen ............................................................................................ 86

3.8 Sreening ausgewählter Völker auf potentiell spezifische

Varroapathogene Pilze ........................................................................... 88

3.8.1 Populationsdynamik und Milbenbefall von Apis mellifera-Völkern .......... 89

3.8.2 Korrelation der Abundanz von Varroa destructor in Bienenvölkern

und des Pilzwachstums aus Milben ........................................................ 92

3.8.3 Spektrum identifizierter Spezies im Pilzscreening .................................. 95

3.8.4 Charakteristika von Meira geulakonigii ................................................. 101

3.8.5 Charakteristika von Simplicillium lamellicola ........................................ 104

4 Diskussion ............................................................................................ 109

5 Zusammenfassung ............................................................................... 126

6 Summary .............................................................................................. 128

7 Literatur ................................................................................................ 130

Einleitung

7

1 Einleitung

1.1 Die westliche Honigbiene Apis mellifera und ihr Parasit Varroa

destructor

Die westliche Honigbiene Apis mellifera LINNAEUS (Hymenoptera) ist eine von

neun Arten der Gattung Apis und unter ihnen die einzige, die außerhalb des

Sippenzentrums Asien verbreitet ist. Ursprünglich im nördlichen Afrika vorkommend,

dehnte sie postglazial in prähistorischer Zeit ihr Verbreitungsgebiet in den

eurasischen Raum aus (Whitfield et al. 2006). In historischer Zeit erfolgte eine

anthropogen bedingte weltweite Verbreitung, so dass Apis mellifera inzwischen ein

Kosmopolit ist, der alle tropischen, subtropischen und gemäßigten Klimate besiedelt

und nur in den Polregionen fehlt. Im Zusammenhang mit der weltweiten

Industrialisierung der Landwirtschaft nahm ihre ökonomische Bedeutung als

Bestäuber wichtiger menschlicher Nutzkulturen gegenüber der Bedeutung der

traditionell genutzten Produkte (Honig, Wachs) enorm zu. Beispielsweise ist allein die

kalifornische Mandelindustrie auf die Bestäubung durch eine Million Bienenvölker

angewiesen (Ratnieks et al. 2010). Inzwischen wird der weltwirtschaftliche Wert, der

durch die erbrachten Bestäubungsleistungen entsteht, auf 153 Milliarden Euro pro

Jahr (Angabe für 2005) geschätzt, entsprechend 9,5 Prozent des Wertes der

jährlichen Weltagrarproduktion an Lebensmitteln (Gallai et al. 2008). Auf Obst- und

Gemüsekulturen entfallen dabei jeweils 50 Milliarden Euro p.a.; die Bedeutung für

Kulturen essbarer Ölfrüchte wird auf 39 Milliarden Euro p.a. taxiert (Southwick et al.

1992; Gallai et al. 2008).

Ihrer wirtschaftlichen Bedeutung entsprechend stellt der Befall mit Parasiten

eine latente Gefahr für Bienenvölker in Kultur dar; dabei ist die intrakolonial hohe

Dichte verwandter Individuen sowie die in der Regel ebenfalls hohe Dichte von

Bienenvölkern in menschlicher Obhut ein die Ausbreitung von Pathogenen prinzipiell

begünstigender Faktor. Apis mellifera wird von einigen, inzwischen gut untersuchten

Parasiten befallen: Paenibacillus larvae ASH EMEND. GENERSCH ist ein ausschließlich

die Bienenbrut befallendes Pathogen, ebenso der Pilz Ascosphaera apis OLIVE AND

SPILTOIR, während Aspergillus flavus LINK neben Bienenbrut auch andere

Organismen, aber nur sehr selten adulte Bienen befällt. Das Grampositive Bakterium

Einleitung

8

Paenibacillus larvae beispielsweise ist in einer Dosis von nur etwa zehn Sporen

infektiös für junge Larven, die es mit dem Futter aufnehmen. Die Proliferation findet

im Mitteldarm der Larven ohne sichtbare Gewebszerstörungen statt, wie Yue mit

FISH (fluorescence-in-situ-hybridization)-Analysen zeigen konnte (Yue et al. 2008).

Während die Bakterien in diesem Stadium als Kommensalen im Wirt leben, werden

später Proteasen exprimiert, die lytisch auf interzelluläre Strukturen wirken und den

Bakterien nach Degradation des Darmepithels einen Übertritt ins Hämozoel

ermöglichen. In der Folge bildet sich durch Auflösung der Wirtsgewebe eine

fadenziehende Masse, die zu einem Schorf eintrocknet, der von Arbeiterinnen

aufgenommen wird, die so zur Verbreitung des Pathogens beitragen. Verflug

zwischen eng zusammenstehenden Völkern bedingt dann die schnelle Ausbreitung

der Infektion auch interkolonial. Während die Transmission von Paenibacillus larvae

horizontal stattfindet, verläuft sie bei allen anderen Parasitosen von Apis mellifera

vertikal – wie auch bei Melissococcus plutonius BAILEY AND COLLINS, einem

Pathogen, das eine vergleichbare Symptomatik zeigt, aber auf Kolonieebene in der

Regel nicht letal wirkt. Im Gegensatz zu den beiden vorgenannten Pathogenen

befallen die Sporidien Nosema apis ZANDER und Nosema ceranae FRIES nur adulte

Bienen; hier erfolgt die Verbreitung durch von infizierten Arbeiterinnen im Volk

abgegebenen Kot, der bei seiner Beseitigung durch bis dahin nicht betroffene

Imagines zu deren Ansteckung führt. Nosemainfektionen verlaufen nicht letal – dies

gilt auch für den Befall mit einem weiteren Vertreter der Protozoa, Malpighamoeba

mellificae PRELL.

Im Wesentlichen sind die Wirt-Parasit-Beziehungen zwischen Apis mellifera und

ihren Pathogenen stabil: Das Immunsystem des einzelnen Individuums ebenso wie

supraindividuelle Adaptionen gegenüber Pathogenen schließen Totalverluste auf

Volksebene in der Regel aus. Das gilt auch für den Befall mit Acarapis woodi RENNIE,

einer Milbe, die die thorakalen Tracheen adulter Bienen besiedelt und bei massivem

Befall durch Einschränkung der Respirationsfähigkeit zur Flugunfähigheit der Tiere

führt.

Mitte des 20. Jahrhunderts kam es zu ersten Beobachtungen eines bis dahin

auf Apis mellifera unbekannten Parasiten: 1952 wurde die Milbe Varroa destructor

ANDERSON AND TRUEMAN; (Mesostigmata: Varroidae) erstmals auf Apis mellifera in

den östlichen Küstenregionen der damaligen UdSSR entdeckt (bis 2000: Varroa

jacobsoni OUDEMANS (Anderson et al. 2000)). In der Folge kam es sowohl zu einer

Einleitung

9

natürlichen Migration Richtung Westen als auch zu anthropogen bedingten

Verschleppungen. Mitte der 50er Jahre des 20. Jahrhunderts wurde Varroa in

Pakistan gefunden, 1967 erreichte sie Bulgarien und 1977 Westdeutschland (Ritter

1982). Die Milbe ist inzwischen mit Ausnahme der Polregionen sowie Australiens

weltweit verbreitet.

Varroa destructor ist ein durchschnittlich 1 Millimeter langer und 1,5 Millimeter

breiter Vertreter der Mesostigmata und damit – gemessen an der Größe des Wirtes –

der größte bekannte Ektoparasit. Der gesamte Lebenszyklus ist an den Wirt

gebunden und gliedert sich in zwei Phasen: Während der phoretischen Phase kommt

es auf adulten Bienen zur Ausbreitung zwischen Völkern (Kuenen et al. 1997). Als

obligater Parasit ist Varroa hochadaptiert in Bezug auf die Ausbeutung von

Wirtssignalen: Kirchner konnte erstmals nachweisen, dass die Milben in der Lage

sind, Lichtreize und Vibrationen wahrzunehmen; derartige Vibrationen sind ein häufig

verwendetes Signal in Apis mellifera-Staaten (Kirchner 1987, 1993; Kirchner et al.

1986). In der phoretischen Phase halten sich die Milben auf den Bienen bevorzugt

zwischen den überlappenden Sterniten auf und ernähren sich von der Hämolymphe

des Wirtes (Sammataro et al. 2000). Während der reproduktiven Phase migrieren

adulte Weibchen in Brutzellen des Wirtes kurz vor deren Verdeckelung. Hierbei sind

olfaktorische Signale von zentraler Bedeutung. Die Milben sind vermutlich aufgrund

der distinkten Kohlenwasserstoffbouquets von Arbeiterinnen in der Lage, nach dem

Verlassen einer Brutzelle gezielt auf Bienen derjenigen Alterskohorte zu wechseln,

die sich innerhalb des Volkes hauptsächlich um die Brutpflege kümmert, so dass die

Wahrscheinlichkeit maximiert wird, in die unmittelbare Nähe von Brutzellen zu

gelangen (Kraus 1993; Chiroudi et al. 1997; Kuenen et al. 1997). Zellen, in denen

Drohnen aufgezogen werden, zeigen einen acht- bis zehnfach höheren Befall als

Arbeiterinnenzellen, was zum einen in der höheren Frequenz begründet liegt, mit der

Drohnenbrutzellen durch Arbeiterinnen aufgesucht werden, zum anderen in der

längeren Puppenruhe männlicher Bienen (Boot et al. 1995). Die Identifikation

geeigneter Brutzellen, i.e. Zellen, in denen sich eine Larve im fünften Larvenstadium

15 - 20 Stunden (Arbeiterinnen) bzw. 40 - 50 Stunden (Drohnen) vor der

Verdeckelung der Zelle befindet, wird ebenfalls durch das Differenzierungsvermögen

von Varroa gegenüber kutikulären Kohlenwasserstoffen des Wirtes ermöglicht.

Garrido konnte an Honigbienen erstmals für Insekten zeigen, dass es einen

kairomonalen Effekt polarer, kutikularer Fraktionen von Larven unmittelbar nach der

Einleitung

10

Verdeckelung auf die Initiation der Oogenese von Varroa gibt (Garrido et al. 2004).

Drei Tage nach Verdeckelung wird ein erstes Ei gelegt, aus dem sich innerhalb von

sechs Tagen ein adultes Männchen entwickelt (Steiner et al. 1994). Aus den

folgenden Eiern entwickeln sich Weibchen, die noch in der Zelle begattet werden.

Die Nymphenstadien ernähren sich während der Entwicklung von der Hämolymphe

der Bienenlarve, die einer „feeding zone“ genannten, vom adulten Weibchen

geschaffenen Öffnung der Puppenkutikula des Wirtes entnommen wird (Donzé et al.

1994). Ein bis zwei Tochtermilben gelangen zur Reife und verlassen mit der

Muttermilbe und der schlüpfenden Biene die Zelle. Martin ermittelte für

Arbeiterinnenbrutzellen eine Reproduktionsrate zwischen 1,3 und 1,5, für

Drohnenbrutzellen eine Rate zwischen 2,2 und 2,6 (Martin 1994a, 1994b).

Ursprünglicher Wirt der Milbe war die östliche Honigbiene Apis cerana

FABRICIUS. Ihr Verbreitungsgebiet umfasst den Indischen Subkontinent, Südostasien

sowie Teile Chinas und des östlichen Russlands. Neben Apis mellifera ist sie der

einzige von Menschen als Nutztier gehaltene Vertreter der Gattung. Die genauen

Umstände des Wirtswechsels sind nicht bekannt. Als wahrscheinlich wird

angenommen, dass es während einer sympatrischen Phase nach Verbringen von

Völkern der westlichen Honigbiene nach Ostasien und damit ins Verbreitungsgebiet

des ursprünglichen Wirtes in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts, die zunächst für

einen unbekannten Zeitraum eine Koexistenz der beiden Apisarten ohne

Wirtswechsel beinhaltete, zu einem Wirtswechsel in diesem Gebiet kam (Oldroyd

1999).

Die Gattung Varroa umfasst vier Arten; innerhalb der Art Varroa destructor

werden sechs Haplotypen unterschieden, von denen vier Apis mellifera parasitieren.

Zwei dieser Haplotypen, der japanisch-thailändische und der koreanische sind

hochpathogen für Apis mellifera (De Guzman et al. 1999). Der Befall von Völkern der

westlichen Honigbiene mit diesen Haplotypen führt – mit Ausnahme von

Populationen in Südamerika und vermutlich einigen Regionen in Afrika – obligat

innerhalb von längstens drei bis vier Jahren zum Tod der Völker (Beetsma 1994).

Ursächlich hierfür sind Vitalitätsverluste durch den Verlust von Hämolymphe während

der Ontogenese, was zu einem reduzierten Gewicht der adulten Tiere führt; diese

Vitalitätsverluste bedingen zum Beispiel bei Drohnen eine reduzierte Flugleistung

(Duay et al. 2002). Parasitierte Adulti von Apis mellifera zeigen aber nicht nur

signifikante Unterschiede in Bezug auf die Quantität ihrer Hämolymphe, auch die

Einleitung

11

Proteinkonzentration in der Hämolymphe sinkt, und die Quotienten hoch- und

niedermolekularer Fraktionen differieren in Abhängigkeit vom Parasitierungsgrad

(Weinberg et al. 1985). Die durchschnittliche Lebensdauer von Arbeiterinnen

reduziert sich in Korrelation zum steigenden Brutbefallsgrad stark parasitierter

Kolonien im Spätsommer um bis zu 50 Prozent (Ritter et al. 1984; Kovac et al. 1988).

Untersuchungen an Arbeiterinnen zeigten eine Verminderung der assoziativen

Lernfähigkeit und eine reduzierte Rückkehrrate zum Volk (Kralj et al. 2007).

Unabhängig von den Schäden durch den Entzug von Hämolymphe kommt es zu

Schäden durch Viren, als deren Vektor Varroa fungiert, nachgewiesen exemplarisch

für das Kashmir bee virus, das Sacbrood virus, das Israeli acute paralysis virus und

das Deformed wing virus (Boecking et al. 2008). Letzteres beispielsweise führt

während der Ontogenese zur Entwicklung nichtfunktionaler Flügel, so dass adulte

Tiere für den Staat essentielle Aufgaben nicht wahrnehmen können. Dabei ist das

Deformed wing virus auch für Varroa infektiös, ohne allerdings klinische Symptome

zu verursachen, die bekannt geworden wären: Strangspezifische RT-PCR-Ansätze

konnten zeigen, dass virenreplikationsassoziierte DNA auch in den Milben auftrat

(Gisder et al. 2009). Für das Israeli acute paralysis virus demonstrierte Ball in

Untersuchungen an britischen Apis mellifera-Kolonien, dass persistierende, für die

Bienen subletale Virusvorkommen mit steigendem Befall durch Varroa „aktiviert“ und

damit letal werden können (Ball 1989).

Letale Schäden durch Varroa treten bei Apis cerana nicht auf – Wirt und Parasit

befinden sich im evolutiven Gleichgewicht. So vermehrt sich Varroa aus bisher

unbekannten Gründen nicht in Arbeiterinnenbrut, mehrfach befallene Drohnenbrut

kommt nicht zum Schlupf, so dass die in die Zellen migrierten Milben und ihre

Nachkommen mit den parasitierten Drohnen sterben, und adulte Bienen sind in der

Lage, Varroamilben auf anderen Bienen und in Brutzellen zu erkennen und diese

durch Allo- und Auto-„grooming“ zu entfernen, beziehungsweise auszuräumen (Peng

et al. 1987; Boecking et al. 1999; Boot et al. 1999). Auf Volksebene trägt ein

„absconding“ genanntes Verhalten, bei dem relativ stark befallene Nester verlassen

werden und damit der Anteil der Milben, der sich in Brutzellen befindet, zurückbleibt,

zu einer Reduzierung der Parasitenlast bei. Den gleichen Effekt hat (für die das Nest

verlassende Kohorte) das Schwärmen; dieses zentrale Element der Vermehrung

aller hoch eusozialen Bienenarten wird bei von Menschen gehaltenen Völkern von

Einleitung

12

Apis mellifera aber zumindest teilweise unterdrückt, da es aus ökonomischer

Perspektive unerwünscht ist.

1.2 Ansätze und Probleme bisheriger Bekämpfungsstrategien

Das obligate Sterben von Varroa befallener Bienenvölker macht – um

wirtschaftliche Einbußen bis zur maximalen Größe des wirtschaftlichen

Gesamtnutzens der westlichen Honigbiene zu vermeiden – weltweit den Einsatz von

Bekämpfungsmaßnahmen erforderlich. 177 von Menschen genutzte Kulturen sind

ganz oder teilweise von der Bestäubung durch Honigbienen abhängig (Crane 1990).

Für die USA schätzt Levin den wirtschaftlichen Nutzen auf 19 Milliarden Dollar pro

Jahr, während Southwick 1,6 - 5,7 Milliarden Dollar angibt (Levin 1984; Southwick et

al. 1992). Für Neuseeland werden die durch Varroa verursachten jährlichen Schäden

auf 267 - 602 Milllionen US-Dollar pro Jahr taxiert (McNeely et al. 2001).

Klassische Bekämpfungsmittel bis in die jüngste Zeit waren Akarizide auf der

Basis von Organophosphaten, Pyrethroiden und Amidinen. Allerdings reichern sich

diese fettlöslichen Substanzen im Bienenwachs und damit letztendlich auch im Honig

an, was aus lebensmittelhygienischer Sicht unerwünscht ist (Martel et al. 2007).

Darüber hinaus kam es Mitte der 1990er Jahre zum Auftreten von Resistenzen

(Milani 1999).

Standard in der Bekämpfung von Varroa destructor sind zurzeit organische

Säuren, namentlich Ameisensäure, Oxalsäure und Milchsäure (Calderone 1999;

Nanetti et al. 2003). Sie haben den Vorteil, ohnehin natürlicher Bestandteil des

Honigs zu sein. Zum richtigen Zeitpunkt appliziert, treten in den Bienenprodukten

keine Residuen auf, die oberhalb des natürlicherweise vorhandenen Levels liegen.

Ihr Nachteil besteht darin, dass sie ein hohes Anwenderwissen voraussetzen:

Ameisensäure wirkt varroazid auch in verdeckelten Brutzellen, die Applikation von

Oxal- und Milchsäure ist demgegenüber nur in brutfreien Phasen der

Volksentwicklung erfolgversprechend; darüber hinaus ist die therapeutische Wirkung

von Ameisensäure stark von abiotischen Faktoren wie der Umgebungstemperatur

und -feuchte abhängig. Der zielgenaue Einsatz aller drei Säuren setzt außerdem

voraus, dass genaue Informationen zum Befallsgrad eines Volkes mit Varroa

Einleitung

13

destructor vorliegen. Zudem ist ihr therapeutischer Index gering: Die

Schadensschwellen für Varroa destructor und Apis mellifera liegen dicht beieinander;

Überdosierung können zum Totalverlust des Bienenvolkes führen, Unterdosierungen

sind unwirksam.

In jüngerer Zeit wurde versucht, ursprünglich bei Apis cerana identifizierte

Varroatoleranzmerkmale, i.e. das Entfernen infizierter Brut und das Allo- und

Autogrooming von Arbeiterinnen, die in geringem Ausmaß auch bei Apis mellifera

beobachtet wurden, durch gezielte Selektion auf Populations- und individueller

Ebene zu selektieren. Versuche mit Völkern vermeintlich varroatoleranter Herkünfte

aus Ostasien zeigten allerdings, dass die Varianz im Befall auf milbenspezifische

Faktoren zurückzuführen war (Harris et al. 2003). Versuche, in denen die

Pathogenität des in Südamerika vorkommenden Milben-Haplotyps in Bezug auf

Bienen dortiger, varroatoleranter Herkünfte (sogenannte „afrikanisierte“ Bienen, eine

Hybride aus europäischen und afrikanischen Unterarten von Apis mellifera) und

europäischer Herkünfte getestet wurden, wiederum kamen zu dem Schluss, dass es

offenbar auch bienenspezifische Toleranzfaktoren gibt; allerdings scheinen sie nicht

unabhängig von weiteren Parametern aufzutreten: Varroatolerante Bienen aus dem

tropischen Brasilien zeigten diese Toleranz in gemäßigten Klimaten nicht mehr – ein

Effekt, der möglicherweise auf unter diesen Bedingungen veränderte

Individuenstärken des einzelnen Volkes und eine stärkere, saisonal klimabedingte

Populationsdynamik des Bienenvolkes zurückzuführen ist (Rosenkranz 1999;

Correa-Marques et al. 2002). Angenommen werden auch höhere Fitnesskosten

eines ausgeprägten Groomingverhaltens in gemäßigten Klimaten (Vandame et al.

2002). Dem entgegen stehen Berichte über langfristig ohne Behandlung

überlebende, nicht bewirtschaftete Populationen auch in Europa (Le Conte et al.

2007). Unklar ist, ob es auch in bewirtschafteten Bienenvölkern zu einem mutmaßlich

stabilen Wirt-Parasit-Verhältnis kommen könnte: Sich selbst überlassene Völker in

Schweden zeigten eine geringere Zahl aufgezogenen Nachwuchses und es traten

vermehrt Brutkrankheiten auf – diese Faktoren können zum einen den beobachteten

verringerten Parasitenbefall erklären, sind zum anderen in Populationen in Kultur

unerwünscht und unterliegen damit Manipulationsversuchen durch die Bienenhalter;

es erscheint fraglich, ob unter diesen Bedingungen der gleiche Selektionsdruck

existiert, wie in unbeeinflussten Völkern und ob es somit zu analogen adaptiven

Prozessen kommt (Rosenkranz et al. 2005). Für die Annahme, bienenspezifische

Einleitung

14

Faktoren seien nicht unerheblich, spricht auch die Beobachtung, dass L5-Stadien

europäischer Honigbienen sich im Vergleich zu denen afrikanisierter Honigbienen

doppelt so attraktiv für Varroa zeigten (Guzman-Novoa et al. 1999). Da Aumeier

diesen Effekt in in vitro-Wahlversuchen aber nicht nachweisen konnte, spielen

offenbar auch hier bisher unbekannte Effekte auf supraindividueller Ebene eine Rolle

(Aumeier et al. 2002). Trotzdem wird versucht, mit Ansätzen auf individueller Ebene

Honigbienenarbeiterinnen, die ein ausgeprägtes Ausräum- und Putzverhalten zeigen,

zu fertilisieren und mithilfe des aus den männlichen Nachkommen gewonnenen

Spermas Eier dieser Arbeiterinnen in vitro zu befruchten, um Königinnen zu erhalten,

die eine hohe Heritabilität der gewünschten Merkmale zeigen (Bienefeld et al. 2007;

Büchler et al. 2008). Das gleiche Ziel verfolgen Microarrayversuche, die differentielle

Expressionsmuster von Puppen aus nicht varroatoleranten und toleranten Völkern

vergleichen. Navajas fand hier eine Korrelation der Expression die neuronale

Entwicklung steuernder Gene und des Grooming- bzw. Hygieneverhaltens (Navajas

et al. 2008). Bisher liegen zu diesen Versuchen allerdings noch keine Ergebnisse

vor, die ein Überleben von Honigbienen ohne Behandlung erhoffen lassen. Versuche

mit Micrococcacaeen und Bacillacaeen als Kontrollagentien haben sich bisher

ausschließlich auf Laborassays beschränkt (Tsagou et al. 2004).

1.3 Entomopathogene Pilze als Antagonisten von Varroa

destructor

Angesichts der nach wie vor evidenten Herausforderung, eine nachhaltige und

effiziente Bekämpfungsstrategie gegen Varroa destructor zu entwickeln, sind etwa ab

dem Jahr 2000 zunehmend auch entomopathogene Pilze als potentielle

Antagonisten von Varroa ins Blickfeld der Forschung gerückt. Auch wenn die

Lebenszyklen entomopathogener Pilze komplex sind und zahlreiche, auf einzelne

Gattungen beschränkte Besonderheiten ausweisen, gleichen sie sich in wesentlichen

Aspekten ihrer Biologie häufig: Aus Dauersporen, die im Fall von Zygosporen aus

Hyphenfusionen, im Fall von Azygosporen durch Abschnürung terminaler

Hyphenenden hervorgegangen sind, entwickeln sich in Phasen, in denen die Wirte

aktiv sind, infektionsfähige Konidien. Konidien werden ohne das Zwischenstadium

Einleitung

15

Dauerspore ebenfalls gebildet, wenn entomopathogene Pilze in ihren Wirten zur

Reife gekommen sind und es zu direkten Infektionen weiterer Wirte kommen kann.

Der exakte Mechanismus der Differenzierung zwischen Ziel- und

Nichtzielorganismen ist in Bezug auf Insekten noch unklar. Aus Studien an Pflanzen

wird geschlussfolgert, dass spezifische Induktoren exprimiert werden, die mit

membrangebundenen Rezeptoren von Wirtszellen interagieren und zur Expression

eines Produktes führen, das seinerseits an Rezeptoren auf der Oberfläche des

Pathogens bindet und über Messengermoleküle die Expression für die Infektion

essentieller Enzyme initiiert (Bölker 2002). Bei Kontakt zu Wirtsoberflächen kommt es

zur Bildung eines Appressoriums, aus dem ein Keimschlauch austritt, der die

Kutikula des Wirtes mechanisch oder histolytisch durchdringt; daran beteiligt sein

können trypsinähnliche Proteasen, Carboxypeptidasen, Aminopeptidasen,

Esterasen, Lipasen, Chitinasen und weitere Enzyme, die überwiegend aus

Untersuchungen an Metarhizium anisopliae METSCHNIKOW und Beauveria bassiana

BALSAMO bekannt sind (Leger et al. 1991, 1993, 1996, 1997; Poinar et al. 1998). Die

Bildung von Appressorien kann aber bei manchen Arten auch in vitro auf

nichtartifiziellen Oberflächen ausgelöst werden. In einigen wenigen Fällen dringt der

Parasit auch ohne vorherige Ausbildung eines Appressoriums ein (Brobyn et al.

1977). Lytische Enzyme sowie Lektine können, zum Beispiel im Fall von Metarhizium

anisopliae, bereits auf der Oberfläche der Konidien vorhanden sein; zwingende

Voraussetzung für die Keimung ist zudem das Vorhandensein von Kohlenstoff- und

Stickstoffquellen auf der Wirtskutikula. Zwar können unspezifische Kohlenstoff-

beziehungsweise Stickstoffquellen in vitro auch eine Keimung initiieren, qualitative

und quantitative Differenzen hierbei scheinen jedoch ebenfalls eine wichtige Rolle bei

der Wirtserkennung zu spielen (Andrews et al. 1997). Innerhalb des Wirtes werden

dann zellwandlose Protoplasten gebildet, die mutmaßlich vom Immunsystem des

Wirts nicht oder nur schlecht detektiert werden können, oder es kommt zur Bildung

zönozytischer Hyphen oder einzelliger „hyphal bodies“ (Beauvais et al. 1989). Der

Tod des Wirtes tritt durch Faktoren wie den Verbrauch seiner Stoffwechselreserven,

mechanische Zerstörung von Geweben, die Freisetzung von Toxinen wie Pyridin-2,6-

Dicarbonsäure oder eine Kombination dieser Effekte ein (Claydon et al. 1982; Pell et

al. 2001).

Hawksworth listet nahezu 750 entomopathogene Pilzspezies aus 56 Gattungen

auf, die mit Arthropoden assoziiert sind (Hawksworth et al. 1995). Auf der Basis

Einleitung

16

dieses Pools sind mittlerweile über 20 Mykopestizide entwickelt worden,

überwiegend auf der Basis der Ascomyzeten Beauveria bassiana, Metarhizium

anisopliae, Lecanicillium muscarium ZIMMERMANN und Paecilomyces fumosoroseus

WIZE, die im Wesentlichen gegen Homopteren, Coleopteren, Lepidopteren, Dipteren

und Orthopteren zum Einsatz kommen (Shah et al. 1999; de Faria et al. 2007). Ein

kommerzielles Produkt, das aus einem Beauveria bassiana-Isolat entwickelt worden

ist, wird gegen die Milbe Tetranychus urticae KOCH in Gewächshauskulturen von

Rosen eingesetzt, Metarhizium anisopliae wurde erfolgreich gegen Ixodes ricinus

LINNAEUS sowie Boophilus annulatus SAY, Hyalomma excavatum KOCH und

Rhipicephalus sanguineus LATREILLE verwendet (Wright et al. 1996; Gindin et al.

2002; Strasser et al. 2007). Schon seit etwa 20 Jahren und damit sehr gut untersucht

sind ebenfalls die Wirt-Parasit-Interaktionen für Paecilomyces fumosoroseus,

Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana sowie insbesondere Lecanicillium

muscarium und die Weiße Fliege Trialeurodes vaporariorum WESTWOOD, die ein

bedeutender Schädling in Gewächshauskulturen ist; auf Basis dieser Erkenntnisse

sind gleichsam kommerzielle Produkte entwickelt worden, die seitdem erfolgreich

gegen Trialeurodes, aber auch andere wirtschaftlich bedeutende phytophage

Arthropoden appliziert werden (Wraight et al. 2000; de Faria et al. 2001, 2007;

Malsan et al. 2002). Die Pilze zeichnen sich durch leichte Kultivierbarkeit, ein

begrenztes Wirtsspektrum, eine hohe Pathogenität für verschiedene Stadien von

Trialeurodes vaporariorum und ihre Nichtpathogenität für Menschen aus (Ferron

1978; Mier et al. 1991; Ortiz-Caton et al. 1996).

In Assoziation zu Milben, die wie Tetranychus urticae Parasiten wirtschaftlich

bedeutender Kulturen oder Nutztiere sein können, sind 58 Pilzspezies bekannt, die in

der Lage sind, Wirte aller drei Ordnungen der Actinotrichida sowie innerhalb der

Anactinotrichida Vertreter der Ixodida und Gamasida zu infizieren: 24 Spezies sind

45 Wirten der Actinotrichida, 16 zehn Wirten der Ixodida und 18 insgesamt 14 Wirten

der Gamasida zugeordnet. Allein in Ixodes ricinus fand Kalsbeek sechs

Hyphomyceten; van der Geest beschreibt 30 Pilze für 16 Milbenfamilien (Kalsbeek et

al. 1995; van der Geest et al. 2000). Zwei dieser in Milben gefundenen Pilze –

Neozygites floridana WEISER AND MUMA und Hirsutella thompsonii FISHER – sind in

anderen Arthropodenklassen bisher nicht nachgewiesen worden (Chandler et al.

2000). Zwar ist Neozygites floridana als gamasidenspezifisch klassifiziert und könnte

daher ein potentieller Antagonist für Varroa destructor sein, ohne gleichzeitig Apis

Einleitung

17

mellifera negativ betreffende Seiteneffekte zu haben, allerdings konnte dieser Pilz

nicht in vitro kultiviert werden. Demgegenüber infiziert der zweite bisher nur Milben

zugeordnete Pilz Hirsutella thompsonii ausschließlich Vertreter der Actinedida und

wird erfolgreich gegen Phyllocoptruta oleivora ASHMEAD in Zitruskulturen und

Eriophyes guerreronis KEIFER auf Kokospalmen eingesetzt (McCoy 1981; Lampedro

et al. 1989; Allen et al. 1994).

Versuche zur Kontrolle von Vertretern der Ixodida konzentrierten sich daher auf

für diese Gruppe unspezifische Pilze, namentlich Beauveria bassiana, Metarhizium

anisopliae, Paecilomyces farinosus BROWN AND SMITH, Paecilomyces fumosoroseus

und Lecanicillium muscarium. Bittencourt konnte zeigen, dass Metarhizium, isoliert

aus anderen Arthropodenklassen, in der Lage war, Boophilus microplus CANESTRINI,

einen wirtschaftlich bedeutenden Parasiten auf Vieh, in vitro zu infizieren (Bittencourt

et al. 1994a, 1994b). Metarhizium anisopliae- und Beauveria bassiana-Isolate, die in

Ostafrika außerhalb der Acari gefunden wurden, befielen im Experiment

Rhipicephalus appendiculatus NEUMANN (Mwangi et al. 1995).

Anfang der letzten Dekade wurden erste Versuche unternommen, eine

potentiell antagonistische Wirkung unspezifischer entomopathogener Pilze auf

Varroa destructor und Apis mellifera zu testen. Dabei ist die Unterscheidung der

Pilze in (Labor-)Stämme für das Verständnis wichtig; die Pilze werden in der Folge

der Einfachheit halber aber nur unter ihrem Artnamen angesprochen – gemeint ist in

allen Fällen der der jeweiligen Untersuchung zugrundeliegende Stamm im Sinne

eines infraspezifischen Taxons respektive das Isolat einer Art.

Kanga gibt für zwei Isolate von Hirsutella thompsonii und Metarhizium

anisopliae, die in Laborversuchen an Milben auf Puppen und an Versuchsvölkern

(nur Hirsutella thompsonii) getestet wurden, bei denen eine konidienhaltige

Detergenslösung versprüht wurde, an, diese seien geeignet, Varroapopulationen

signifikant zu reduzieren, ohne Bienen zu schädigen; er bestimmte eine LT90 von vier

Tagen für Hirsutella thompsonii und von sechs Tagen für Metarhizium anisopliae

(Kanga et al. 2002). Für Bienen schloss er anhand vergleichbarer

Pilzwachstumsraten aus toten, nicht oberflächensterilisierten Bienen, sie würden

durch die Pilzstämme nicht negativ beeinflusst. Eine strenge Korrelation zwischen

der Zahl gefallener Milben und den aus diesen ohne Oberflächensterilisation

gewachsenen Pilzen sah er als Beleg für eine Infektion von Varroa destructor durch

Hirsutella thompsonii an. In einem weiteren Versuch an Völkern, die entweder mit

Einleitung

18

Konidienpulver oder dem pyrethroidhaltigen Tierarzneimittel Apistan behandelt

wurden, fand Kanga vergleichbare Mortalitätsraten und schlussfolgerte daraus auf

eine Eignung von Metarhizium als Kontrollagens (Kanga et al. 2003, 2005). In einem

Versuch, in dem 2006 Metarhizium-Konidien mit Hilfe von mit ihnen bedeckten

Kunststoffstreifen appliziert wurden, bestätigten sich die Ergebnisse (Kanga et al.

2006). Bei neun untersuchten Isolaten von Hirsutella thompsonii, die Peng

ausschließlich in vitro in Bezug auf ihre Wirkung auf Milben und Honigbienenpuppen

testete, indem sie Milben über eine reife Hirsutella-Kultur laufen ließ

beziehungsweise Puppen auf eine Hirsutella-Kultur legte, wurde für drei Isolate eine

Infektionsfähigkeit für Varroa destructor gefunden (Peng et al. 2002). Peng gibt für

diese drei Isolate eine LT50 von zwei, drei und vier Tagen an; eine negative Wirkung

auf Bienenpuppen wurde nicht festgestellt. Als Kontrollen wurden Gruppen

verwendet, die zu Medienplatten ohne Pilzkulturen Kontakt hatten. Shaw fand

demgegenüber für alle von ihr im Laborexperiment untersuchten Isolate eine

Infektionsfähigkeit für Varroa; alle wiesen darüber hinaus eine der Kontrollgruppe

vergleichbare oder höhere (bis zu 100 Prozent innerhalb des

Untersuchungszeitraums) Mortalität, bezogen auf adulte Bienen, auf (Shaw et al.

2002). In den Versuchen von Gerritsen an zuvor nicht vereinheitlichten Völkern mit

drei kommerziell erhältlichen Produkten auf der Basis von Metarhizium anisopliae-

und Lecanicillium muscarium-Stämmen zeigten sich keine signifikant erhöhten

Sterberaten für Varroa destructor und Apis mellifera (Gerritsen et al. 2006). 2006

untersuchte James den Metarhizium-Stamm, mit dem Kanga gearbeitet hatte, vor

dem Hintergrund der Fragestellung, welche Applikationsform die effektivste sei,

konnte dieses Mal aber keinerlei signifikante Effekte des Pilzes finden; zusätzlich

waren längstens nach 20 Tagen (Kanga 2003: 40 Tage) noch keimfähige Konidien

vorhanden (Kanga 2003; James et al. 2006). Meikle verglich drei Gruppen in vivo:

Eine wurde mit einem aus Varroa destructor isolierten Beauveria bassiana-Stamm

behandelt, eine weitere als Kontrolle mit einem als Matrix dienenden Pulver, während

die dritte Gruppe unbehandelt blieb (Meikle et al. 2007). Die Völker waren aus einer

zuvor nicht vereinheitlichten Grundgesamtheit gebildet worden und differierten in

Bezug auf die erfassten Parameter „Bienenmasse“ und „Fläche verdeckelter Brut“.

Völker der mit Konidien behandelten Gruppe wiesen einen signifikant erhöhten

Milbenfall am sechsten und achten Tag nach Applikation auf. Milben aus den mit

Konidien behandelten Völkern zeigten, ohne zuvor oberflächensterilisiert worden zu

Einleitung

19

sein, in allen Fällen ein signifikant höheres relatives Pilzwachstum. In einer

Repetition mit einer größeren Zahl nicht vereinheitlichter Völker und vier

verschiedenen Gruppen (Konidien und Carnaubawachsmatrix, Konidien und

Weizenmehlmatrix, Weizenmehl, keine Behandlung) trat ein verstärkter Milbenfall in

der Konidien-Carnaubawachsgruppe auf; dieser war allerdings nicht signifikant

erhöht (Meikle et al. 2008b). Der Milbenfall der Konidien-Weizenmehlgruppe lag

unterhalb des Falls der Weizenmehlgruppe und an drei Tagen auch unterhalb des

Falls der Kontrolle. Signifikant erhöhtes relatives Pilzwachstum aus einer

Konidiengruppe wertet Meikle als Beleg für die Eignung des Pilzes als

Varroaantagonist. Eine zweite Wiederholung erbrachte keinerlei Belege für eine

signifikante Reduktion der Parasitenlast der Versuchsvölker (Meikle et al. 2009).

Effekte entomopathogener Pilze auf Apis mellifera auf subletaler Ebene wurden

bisher in keiner Studie untersucht. Dabei könnte zum Beispiel eine Beeinträchtigung

des Lernvermögens und der Diskriminationsfähigkeit bei einem staatenbildenden

Insekt, das über komplexe Fähigkeiten zur räumlichen Orientierung und

olfaktorischen Differenzierung im Zusammenhang mit der Kommunikation innerhalb

des Staates verfügt, negative Konsequenzen haben. Gleiches gilt für eine

physiologische Belastung durch die pathogenbedingte Induktion einer Immunantwort

– auch dieser Aspekt ist bisher nicht untersucht worden. Dabei ist inzwischen auch

für die Honigbiene die Aktivierung einer Kaskade bestätigt, wie sie für andere

Insekten beschrieben ist (Evans et al. 2006; Müller et al. 2008; Randolt et al. 2008).

1.4 Zielsetzung

Entomopathogene Pilze erscheinen vor dem Hintergrund der Schwierigkeiten

der etablierten Behandlungsmethoden gegen Varroa destructor lohnend für eine

Erforschung als potentielle Antagonisten zu sein. Die bisherigen Untersuchungen

zeigen sehr variable respektive widersprüchliche Ergebnisse, die zum Teil

möglicherweise auf die Diversität dieser sehr pleomorphen Pilze zurückzuführen sind

– allerdings differierten die Resultate nicht nur zwischen den beteiligten Gruppen,

sondern auch bei Untersuchungen an identischen Isolaten innerhalb einer Gruppe.

Viele dieser Studien basieren auf unterschiedlichen methodischen Ansätzen, die

Einleitung

20

Interpretationen der Ergebnisse schwierig und ihre Vergleichbarkeit unmöglich

machen. Keine einzige Untersuchung beschäftigte sich mit der Frage einer

potentiellen Wirkung entomopathogener Pilze auf die Larvenstadien und das

Puppenstadium von Apis mellifera. Ebenso wenig standen mögliche subletale, aber

für die Bienen bedeutsame Effekte, wie eine Beeinträchtigung der Futteraufnahme,

des Lernvermögens oder des Immunsystems im Fokus von Untersuchungen. Und

schließlich lag keine Untersuchung vor, die sich mit dem Einfluss beschäftigt, den in

den Populationen vorhandene Pilze auf die Dynamik dieser Populationen und damit

auch auf die Varroapathologie von Apis mellifera haben könnten und die dabei

möglicherweise bisher in Varroa unentdeckte Pilze findet. Die vorliegende Arbeit

sollte anhand von vier Stämmen derjenigen Spezies entomopathogener Pilze, die

bisher hauptsächlich Gegenstand von Untersuchungen waren, die genannten Lücken

schließen, um eine valide, reproduzierbare Methodenbasis zur Untersuchung

entomopathogener Pilze in Bezug auf ihre Wirkung auf Varroa destructor und Apis

mellifera zu schaffen. Dies sollte eine bisher noch nicht existente Untersuchung einer

möglichen letalen Wirkung auf Larven und Puppen von Apis mellifera einschließen.

Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob es eventuell subletale Effekte

entomopathogener Pilze auf Apis mellifera gibt, die in den bisherigen Versuchen

methodisch bedingt nicht hätten festgestellt werden können. Schließlich sollte

versucht werden, in vivo einen möglichen Zusammenhang zwischen der Abundanz

von Varroa destructor in Bienenvölkern und dem Vorkommen von Pilzen in Varroa

destructor zu untersuchen und im Rahmen eines Screenings varroaspezifische und

damit eventuell als Antagonisten geeignete Pilze zu erfassen.

Material und Methoden

21

2 Material und Methoden

2.1 Versuchstiere und verwendete Pilzstämme

Die Honigbienen (Apis mellifera) stammten aus Versuchsvölkern der AG

Verhaltensbiologie und Didaktik der Biologie der Ruhr-Universität Bochum, die im

Botanischen Garten der Ruhr-Universität Bochum sowie auf dem Versuchsgelände

der AG im Lottental, ebenfalls Bochum, untergebracht waren. Für die Unterbringung

wurden Holzkästen (im Folgenden „Magazine“ genannt) mit einer Grundfläche von

520 x 380 mm eingesetzt, die aus einzelnen, 220 mm hohen Modulen bestanden und

damit dem im Jahresverlauf schwankenden Raumbedarf eines Bienenvolkes

angepasst werden konnten. Die Magazine schlossen unten mit einem Rahmen (im

Folgenden „Gitterboden“ genannt) gleicher Grundfläche ab, der mit einem

Edelstahlgitter der Maschenweite 2 x 2 mm bespannt war, so dass von den im

Magazin befindlichen Bienen abfallende Organismen in einer unterhalb des Gitters

anbringbaren Polyethylenwanne gesammelt werden konnten, ohne durch Bienen

verschleppt werden zu können.

Die Völker wurden einheitlich nach anerkannten Praxisregeln geführt und

verfügten alle über eine Königin. Die Milben (Varroa destructor) stammten ebenfalls

aus Versuchsvölkern der AG. Völker, die Bestandteil des Screenings auf

entomopathogene Pilze waren, oder Donorvölker für Versuche an Milben wurden

entgegen der sonst üblichen Praxis im Spätsommer von der Applikation varroazider

Mittel ausgenommen, um die Ergebnisse nicht zu verfälschen, beziehungsweise eine

ausreichende Anzahl von Versuchsmilben zur Verfügung zu haben. Sämtliche

Versuche an Apis mellifera und Varroa destructor orientierten sich an den derzeit

gültigen Standards für Untersuchungen an Honigbienen (OEPP/EPPO 2001).

Die in den Untersuchungen zu Kulturbedingungen unspezifischer

entomopathogener Pilze, in den in vitro-Assays, im Versuch zur Duftdifferenzierung

und im Halbfreilandversuch untersuchten Pilze stammten vom

Landesgesundheitsamt Stuttgart (Metarhizium anisopliae (M.a. 153), Paecilomyces

fumosoroseus (P.fr. 9), Beauveria bassiana (B.b. 29)) beziehungsweise der Firma

Koppert BV, Niederlande (Lecanicillium muscarium („Mycotal“)).

Sämtliche Untersuchungen fanden in den Jahren 2005 - 2009 statt.


22

2.2 Medien und Puffer

Die Zusammensetzung von Medien und Puffern ist im Text erläutert;

komplexere Medien und Puffer sind nur namentlich erwähnt, ihre Zusammensetzung

ist Tabelle 2.1 zu entnehmen.

Medium/Puffer Bestandteil Bezugsquelle Malzextraktagar (MEA) 30 g/l Malzextrakt Roth

5 g/l Pepton Applichem 15 g/l Agar Applichem ddH2O add. 1 Liter

Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

10 g/l Pepton Applichem 40 g/l Glucose-Monohydrat Baker 15 g/l Agar Applichem ddH2O add. 1 Liter

Yeast Pepton Dextrose Agar (YPDA)

40 g/l Glucose-Monohydrat Baker 10 g/l Pepton Applichem 10 g/l Hefeextrakt Applichem 15 g/l Agar Applichem ddH2O add. 1 Liter

Potato Dextrose Agar (PDA) 4 g/l Kartoffelextrakt Applichem, anwendungsfertige Mischung

20 g/l Glucose-Monohydrat 15 g/l Agar ddH2O add. 1 Liter

H2O-Agar 15 g/l Agar Applichem ddH2O add. 1 Liter

CM-Flüssigmedium 1,5 g/l KH2PO4 Fluka 0,5 g/l KCl Applichem 0,5 g/l MgSO4 Riedel-de Haën 3,7 g/l NH4Cl Roth 10 g/l Glucose-Monohydrat Baker 2 g/l Trypton Applichem 2 g/l Hefeextrakt Applichem 1ml/l 0,1% ZnSO4 Applichem 1 ml/l 0,1% FeCl2 Applichem 1ml/l 0,1% MnCl2 Applichem ddH2O add. 1 Liter

Lysepuffer (600 µl) 22 µl 1M Tris pH 8 Applichem 220 µl 250 mM EDTA Applichem 88 µl 5 M NaCl Roth 2,2 µl 20% SDS Roth ddH2O add. 600 µl

TE-Puffer 10 mM Tris pH 7,5 Applichem 1 mM EDTA Applichem

Tabelle 2.1: Komplexere Medien und Puffer, die im Text nur namentlich aufgeführt werden.


23

2.3 Bestimmung optimaler Kulturbedingungen

Untersucht wurden Malzextraktagar (MEA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA),

Yeast Pepton Dextrose Agar (YPDA) und Potato Dextrose Agar (PDA).

Je Liter Kulturmedium wurden die angegebenen Mengen in ddH2O gelöst und

im Autoklaven bei 121°C sterilisiert. Anschließend wurden sterile 9 mm-Petrischalen

je etwa 3 mm hoch mit dem Medium gefüllt. Die Beimpfung erfolgte mit unmittelbar

zuvor geernteten Sporen aus Stammkulturen: Reife Sporen wurden mit 9 ml 0,85%

NaCl/0,1% Tween 80 (im Folgenden auch (Konidien-)Erntelösung genannt) pro

Petrischale durch Abkratzen mit einem sterilen Löffel suspendiert. Um ebenfalls

losgelöstes Myzel oder Kultursubstrat zu entfernen, wurde anschließend zweimal

durch sterile Filter (Sartorius 288) filtriert. Alle verwendeten Glasgeräte wurden zuvor

ebenfalls heißluftsterilisiert. Die Erfassung der Sporenkonzentration in der

Suspension erfolgte über Auszählung eines Aliquots in einer Neubauerzählkammer.

Anschließend wurde die Impfsuspension mit 0,85% NaCl/0,1% Tween 80 auf 107

Sporen/ml eingestellt. Zur Inokulation wurden je 5 µl mit einer sterilen Pipettenspitze

zentral auf die Platte gesetzt. Die Kultur erfolgte bei 25°C im Dauerdunkel für 14

Tage im Wärmeschrank (Memmert UNB 500). Die Erfassung der Parameter

„Koloniedurchmesser“ und „Konidiendichte“ wurde wie folgt durchgeführt: Zunächst

wurden die Petrischalen auf Millimeterpapier gesetzt, um den Koloniedurchmesser

zu erfassen. Anschließend wurde mit einem sterilen Spatel (Breite 2 cm) ein Quadrat

ausgestochen, das in eine neue Petrischale überführt wurde und dessen Konidien

wie oben beschrieben geerntet wurden. Die Auszählung erfolgte wiederum in einer

Neubauerzählkammer.

2.4 Bestimmung einer ausreichenden

Oberflächensterilisationsdauer gesammelter Milben

Unter den Gitterboden stark von Varroa destructor befallener Völker wurde zum

Auffangen der Milben eine Polyethylenwanne geschoben. Aus dem täglichen

Milbenfall der Versuchsvölker wurden die Milben manuell abgesammelt, gepoolt und

auf sieben Versuchsgruppen verteilt. Die Milben wurden in der Folge – mit


24

Ausnahme der Sterilisationszeit – gleich behandelt: Zunächst erfolgte durch

Eintauchen in 0,5% NaOCl die Oberflächensterilisation – je nach Gruppe für 10, 15,

20, 40, 60, 120 oder 240 Sekunden. Anschließend wurden die Milben in steriles

ddH2O überführt und für 30 Sekunden darin bewegt, um eventuell noch anhaftendes

NaOCl zu entfernen. Eine weitere Gruppe wurde keiner Oberflächensterilisation

unterzogen, sondern nur in sterilem ddH2O geschwenkt. Danach erfolgte mit sterilen

Holzstäbchen einzeln die Platzierung auf sterilen H2O-Agar-Platten und Kultur bei

25°C im Dauerdunkel. Einsetzendes Pilzwachstum wurde täglich erfasst, Milben, die

Pilzwachstum zeigten, wurden zur Vermeidung von Kreuzinfektionen unter sterilen

Bedingungen entfernt.

2.5 Ermittlung geeigneter Konservierungsmethoden gesammelter

Milben

Aus dem natürlichen Totenfall stark befallener Bienenvölker wurden die

gestorbenen Milben jeden Tag wie oben beschrieben gewonnen. Die Milben wurden

in der Folge gepoolt und in zwei Gruppen aufgeteilt: Eine Gruppe wurde bei

-26°C für sieben Tage eingefroren, die andere bei Raumtemperatur und

Raumfeuchte auf Filterpapier ebenfalls für sieben Tage getrocknet. Die Milben der

beiden Gruppen wurden im Fortgang gleich behandelt: Zunächst wurden sie durch

Eintauchen in 0,5% NaOCl für 120 Sekunden oberflächensterilisiert, eventuell noch

anhaftendes NaOCl dann durch Schwenken in sterilem ddH2O entfernt. Die Milben

wurden anschließend mit sterilen Holzstäbchen auf H2O-Agar-Platten überführt und

in der Folge bei 25°C und Dauerdunkel im Wärmeschrank kultiviert. Die

Überwachung eventuellen Pilzwachstums erfolgte täglich. Milben, die Pilzwachstum

zeigten, wurden inklusive des umgebenden Agars unter sterilen Bedingungen mit

einem sterilen Spatel ausgestochen, um Kreuzinfektionen zu vermeiden.


25

2.6 Erfassung der Mortalität mit Pilzkonidien behandelter

Bienenlarven

Die Methodik basiert auf einem von Peng entwickelten, aber modifizierten

Protokoll: Versuchsvölkern wurden Brutwaben mit Eiern kurz vor dem Schlupf der

Larven ohne aufsitzende Bienen entnommen, ins Labor gebracht und bis zur

Verwendung bei hoher Luftfeuchte gehalten (Peng et al. 1996). Im Labor wurden

sterile 24-well-Platten (Gibco) wie folgt vorbereitet: Zunächst wurde eine Larvendiät,

bestehend aus 20 ml Gelée royale und 10 ml einer Zuckerlösung (3,0 g Fruktose,

3,0 g Glukose (beide Baker) auf 33,3 ml steriles ddH2O), hergestellt, homogenisiert

und für mindestens 30 Minuten im Thermoblock auf eine Temperatur von 35°C

erwärmt. Dann wurden sechs Näpfe der 24-well-Platte mit Wasser gefüllt (jeweils

diagonal gegenüberliegend ein Endnapf jeder Reihe); anschließend erfolgte das

Einbringen von je 300 µl des Futters in je drei Näpfe pro Platte mit Hilfe einer

Omnifax-Tubukulin-Spritze. Den Waben wurden dann unter Kaltlicht frisch aus den

Eiern geschlüpfte Larven mit Hilfe einer Umlarvnadel entnommen und diese

zunächst auf vorgewärmte, mit einem angefeuchteten sterilen Papier (KimWipe)

ausgelegte Petrischalen gesetzt. In den Petrischalen erfolgte dann die Applikation

von entweder 1x106 Konidien/Larve, die wie unter 2.3 beschrieben gewonnen

wurden, oder eines entsprechenden Volumens Kontrolllösung durch Besprühen.

Anschließend wurden die Larven mittels der Umlarvnadel jeweils zu zehnt in einen

mit Futter ausgestatteten 24-well-Napf gesetzt (Abbildung 2.1). Die Hälterung

erfolgte in der Folge im Brutschrank bei 35°C und einer relativen Luftfeuchte von 90

Prozent. Alle 24 Stunden wurden die Larven mit Hilfe steriler, gebogener Laborspatel

passender Größe in neue, jeweils mit frisch zubereitetem und erwärmtem Futter

befüllte Näpfe umgesetzt und dabei schrittweise vereinzelt. Beim Umsetzen war

darauf zu achten, die Larven nicht um die Längsachse zu drehen, um ein allseitiges

Verkleben der Kutikula (und Verschluss der Stigmen beidseitig) zu vermeiden. Tote

und kranke Larven wurden entfernt und die jeweilige Zahl überlebender Larven

registriert; sofern eine Larve nicht eindeutig als krank oder tot klassifiziert werden

konnte, wurde sie in einem gesonderten Napf weiterkultiviert, bis Tod oder Überleben

feststanden – die Datierung im Fall des Todes erfolgte dann für den Tag der

Separation. Kurz vor der Verpuppung am sechsten oder siebten Tag des

Larvenstadiums (Mitteldarm öffnet sich, dunklere, kaudal gelegene Zone durch


26

Abgabe von Harnkristallen wird sichtbar, und die Larve streckt sich) wurden die

Larven in einen neuen, mit KimWipe-Papier ausgelegten Napf umgesetzt; zuvor

wurden die Larven vorsichtig auf KimWipe-Papier gerollt, um anhaftende

Futtersaftreste zu entfernen. Dieses Verfahren wurde in der Folge (nochmals 24h

später) wiederholt, bis kein Kot mehr abgegeben wurde. Danach wurden die Larven

unberührt im Brutschrank gehältert.

Abb. 2.1: Hälterung von Larven in vitro in 24-well-Platten. Je Reihe ist zur Erhöhung der

relativen Feuchte ein Gefäß mit ddH2O gefüllt. Larven vor der Verpuppung liegen auf

sterilem Papier.


27

2.7 Bestimmung der Mortalität mit Pilzkonidien behandelter

Adultbienen und Milben

Die Methodik zur Untersuchung der Mortalität mit Konidien unspezifischer

entomopathogener Pilze behandelter Adultbienen und aufsitzender Milben war für

alle untersuchten Pilze gleich und wird deshalb an dieser Stelle für beide Versuche

beschrieben.

Herstellung der Applikationssuspension entomopathogener Pilze:

Circa drei Wochen vor Versuchsbeginn wurden MEA-Platten aus den Pilz-

Stammkulturen frisch inokuliert und bei 25°C im Dauerdunkel gehalten, um zu

Versuchsbeginn eine möglichst hohe Anzahl Konidien ernten zu können. Die

Konidienernte erfolgte wie unter 2.3 beschrieben.

Bereitstellung adulter Bienen:

Adulte Bienen wurden Versuchsvölkern, die zuvor eine Behandlung mit 85%

Ameisensäure durchlaufen hatten und deshalb als „milbenfrei“

beziehungsweise „milbenarm“ klassifiziert werden konnten, durch Abschütteln

von Brutwaben durch einen Trichter in einen Eimer mit Gitterboden oder durch

Absaugen von Brutwaben mit Hilfe eines modifizierten Handstaubsaugers

entnommen. Anschließend erfolgte dreiminütiges Begasen der Tiere mit CO2

und nach erfolgreicher Betäubung eine Verteilung zunächst auf mit 30 radial

angebrachten Bohrungen versehene Polyethylenflaschen.

Bereitstellung von Milben:

Die zur Untersuchung benötigten Milben wurden unbehandelten

Versuchsvölkern, die in vorangegangenen Analysen des Milbenbefalls eine

hohe Milbenabundanz aufwiesen, wie folgt entnommen: Mehrere tausend den

Brutwaben aufsitzende Adultbienen wurden durch einen Trichter in einen mit

einem Gitter versehenen Eimer abgeschüttelt. Danach erfolgte ein Verschluss

der oberen Eimeröffnung durch ein Edelstahlsieb und durch dieses die

Applikation von jeweils 40 Gramm fein vermahlener Saccharose. Der Eimer

wurde anschließend manuell kreisend für etwa fünf Minuten bewegt und die von

den Bienen abfallenden Milben wurden in einer unter dem Eimer stehenden

Wanne aufgefangen. Diese Prozedur wurde mit jeweils fünf bis sechs

Donorvölkern wiederholt, um eine ausreichende Anzahl Milben zur Verfügung

zu haben. Die gesammelten Milben wurden anschließend zweimal mit ddH2O


28

gewaschen und der gelöste Zucker durch ein Feinsieb von den Milben getrennt.

Abschließend wurden die Milben auf feuchtem Laborpapier bis zu ihrer weiteren

Verwendung gehältert. Von Milben befreite Bienen wurden ohne weitere

Behandlung in ihre Herkunftsvölker zurückverbracht.

Besatz der Hälterungskäfige mit Bienen und Milben:

Die in Polyethylenflaschen bereitstehenden Bienen wurden erneut mit CO2

begast, den Flaschen entnommen und mit Milben besetzt: Je 50 Bienen

erhielten durch einzelnes Heranführen der Bienen an die Milben mit Hilfe einer

Pinzette einen Besatz von 25 Milben – das selbständige Aufsteigen auf die

Biene bei Annäherung derselben diente dabei als Vitalitätstest für die Milben.

Die Bienen mit den ihnen aufsitzenden Milben wurden dann in Edelstahl-

Versuchskäfige (50 x 75 x 40 mm) überführt. Die Käfige besaßen eine

durchlöcherte Bodenplatte und wurden an einer Seite mit einer Glasplatte zur

optischen Kontrolle verschlossen. Um Verschmutzungen durch Abgabe von Kot

zu reduzieren, wurden passende Papierstücke auf den Boden der Kästen

gelegt, die täglich gewechselt wurden. Im Weiteren wurden Bienen und Milben

in diesen in Brutschränken im Dauerdunkel bei 35°C und einer relativen

Luftfeuchte von 90 Prozent gehältert. Die Verabreichung von Futter (2M

Saccharoselösung) und Wasser erfolgte ad libitum. Die Hälterungskäfige

wurden einzeln auf Aluminiumprofile (50 x 30 x 30 mm) in Polyethylenwannen

(110 x 110 x 30 mm) gestellt, deren Rand innen 10 mm breit mit Vaseline

bestrichen wurde, um ein Entkommen abgefallener aber noch lebender Milben

zu verhindern (Abb. 2.2). Nach einem Tag wurden zunächst die durch das

Besatzverfahren eventuell letal geschädigten Tiere erfasst und entfernt.

Zur Applikation der Suspension wurden die Käfige einzeln entnommen, die

Glasscheibe durch ein Edelstahlgitter (Maschenweite 2 x 2 mm) ersetzt und die

je 50 Bienen und 25 Milben mit 0,544 ml der jeweiligen Konidiensuspension, die

mit Erntelösung (0,1% Tween 80, 0,5% NaCl) auf eine Konzentration 9 x 107

Konidien/ml eingestellt war, besprüht, so dass eine Konidiendosis von 1 x 106

Konidien/Biene erreicht wurde. Edelstahlgitter wurden nach Gruppen getrennt

verwendet und vor Wiederverwendung jeweils durch Ausglühen sterilisiert. Die

verwendeten 10-ml-Sprühflaschen waren zuvor durch Sprühtests, Auszählen

der Konidienkonzentration von Ausgangs- und versprühter Suspension in einer

Neubauerzählkammer und Ausplattieren einer Verdünnungsreihe versprühter


29

Suspension auf MEA-Platten auf Düsengängigkeit der Konidien und deren

Keimfähigkeit nach Düsendurchgang untersucht worden. Flaschen wurden

ebenfalls getrennt nach Gruppen verwendet und jeweils durch mehrmaliges

Spülen mit 70% Ethanol, gefolgt von Spülen mit ddH2O desinfiziert. Die

Kontrollgruppe wurde mit 0,544 ml 0,1% Tween 80, 0,5% NaCl pro 50 Bienen

besprüht, das als Emulgator für die Konidiensuspension diente.

Im Fortgang wurde der tägliche Bienen- und Milbentotenfall unter Rotlicht

erfasst, um die Bienen nicht zu stören. Tote Bienen wurden ebenso wie tote

Milben mit Pinzetten entfernt, die Bienen wurden nach sorgfältigem Absuchen

auf noch aufsitzende Milben verworfen, die Milben gesammelt und später auf

Pilzwachstum untersucht. Futter und Wasser wurden ergänzt und

gegebenenfalls verschmutzte Scheiben ausgewechselt.

Abb. 2.2: Aufbau des in vitro-Assays für Adultbienen. Unterbringung von je 50 Bienen

und 25 Milben in Hälterungskäfigen mit Zuckerlösung (Spritze) und Wasser (1,5 ml-

Reaktionsgefäß) ad libitum. Die Käfige stehen auf Aluminiumprofilen, die in Schalen,

deren Rand mit Vaseline bestrichen ist, untergebracht sind.


30

2.8 Erfassung des Pilzwachstums aus behandelten Milben

Zur Erfassung des anteiligen Pilzwachstums (i.e. der Anteil der gesammelten

Milben, aus denen Pilze wuchsen) aus dem Gesamtmilbenfall der in vitro-Assays an

Adultbienen und Milben (2.7) wurden die in diesen Versuchen gestorbenen Milben

täglich getrennt nach Pilz- und Versuchsgruppe gesammelt und zunächst durch 120-

sekündiges Eintauchen in 0,5% NaOCl gefolgt von Spülen in sterilem ddH2O für 30

Sekunden oberflächensterilisiert. Die Milben wurden dann mit sterilen Holzstäbchen

auf H2O-Agar-Platten gesetzt und bei 25°C im Dauerdunkel in Klimaschränken

kultiviert. Die Platten wurden täglich auf eventuelles Pilzwachstum kontrolliert;

Milben, die ein Pilzwachstum zeigten, wurden zu Vermeidung von Kreuzinfektionen

unter sterilen Bedingungen entfernt und verworfen.

2.9 Halbfreilandversuch an Apis mellifera-Völkern zur Wirkung

entomopathogener Pilze auf Adultbienen, Bienenlarven und

-puppen sowie Varroa destructor

Um in Bezug auf Verwandtschaftsgrad, Milbenbefall und Altersstruktur

vollkommen einheitliche Ausgangsbedingungen in jedem Versuchsvolk zu schaffen,

wurden insgesamt 21 Honigbienenvölkern die Königinnen entnommen und die

Bienen ohne Larvenstadien und Puppenstadium, aber mit aufsitzenden Milben in der

phoretischen Phase zunächst zu drei je etwa 20000 Bienen starken Großgruppen

vereinigt, die in zweiseitig vergitterten Zargen untergebracht waren und drei Tage bei

5°C im Dauerdunkel in einer Klimakammer gehältert wurden. Die zuvor

entnommenen Königinnen wurden in kleinen, geschlossenen Drahtkäfigen

zugehängt. Die Fütterung der Großgruppen erfolgte durch aufgelegten Futterteig

(Apifonda, Südzucker AG) und mit in umgedrehten Honiggläsern mit perforiertem

Deckel bereitgestellter 2M Saccharoselösung ad libitum.

Zu Beginn des eigentlichen Versuchs erfolgte unter Besprühen mit Wasser eine

Fusion der drei Großgruppen zu einer Supergruppe, die mechanisch durch

vorsichtiges Umrühren mit einer Schaufel und Schütteln in Bezug auf eine eventuell

vorhandene Nicht-Gleichverteilung der Einzelbienen vor dem Hintergrund der


31

Herkunft der Einzelbienen aus den Ausgangsgroßgruppen oder ihrer Alterstruktur

respektive ihres Befalls mit Milben, homogenisiert wurde. Die Verteilung der Bienen

erfolgte in gleich großen Quantitäten auf die insgesamt zehn Versuchsvölker, die in

Kästen gleicher Bauart auf leeren Waben untergebracht waren und je eine der zuvor

den Ausgangsvölkern entnommene Königin im Drahtkäfig unter Futterteigverschluss

erhielten, so dass die Königinnen innerhalb von 24 Stunden unter Verbrauch des

Futterteiges durch die Arbeiterinnen befreit wurden. Die Gabe von Wasser, Pollen

und Futter erfolgte ad libitum über eine Tränke pro Versuchsgruppe sowie den

Waben direkt aufgelegten Futterteig, der während des Versuchszeitraums laufend

ergänzt wurde, und zugehängte Futterwaben. Die Unterbringung der Kästen erfolgte

in zwei je 20 x 4 Meter großen Flugzelten am gleichen Standort und mit gleicher

Ausrichtung, so dass eventuelle Lageeffekte ausgeschlossen werden konnten

(Abbildung 2.3). Pilz- und Versuchsgruppe waren je in einem Zelt untergebracht, um

eine eventuelle Verschleppung von Lecanicillium-Konidien zu verhindern. Die

Fluglöcher der Völker in jedem Flugzelt wiesen in jeweils unterschiedliche

Himmelsrichtungen und waren farbig markiert, um ein Verfliegen von Bienen

zwischen den Völkern weitestgehend auszuschließen. Die Völker standen auf

Holzpaletten, um sie einerseits der Bodenfeuchte zu entziehen, und andererseits

durch Unterlegen von Holzkeilen exakt waagerecht ausrichten zu können. Zur

Erfassung des Milbenfalls wurde unter den Gitterboden jedes Volkes eine

passgenaue Polyethylenwanne geschoben, die etwa 5 Millimeter hoch mit Pflanzenöl

gefüllt wurde, um ein Verwehen gefallener Milben durch Wind, vor allem aber ein

Wegtragen durch fouragierende Ameisen zu verhindern. Nach dem Besatz wurde

sowohl den Pilz- als auch den Kontrollvölkern 24 Stunden Zeit gegeben, sich an die

Flugzelte und die zugesetzten Königinnen zu gewöhnen.

Die Vorbereitung der Konidiensuspension erfolgte zunächst nach

Herstellerspezifikation („Mycotal“, Koppert BV). Die additivhaltige Suspension wurde

dann aber gefiltert (Sartorius 288), um die Konidien von der Additivmatrix zu trennen

und die Konidiensuspension düsengängig zu machen. Anschließend wurde die

Konidienzahl pro Milliliter mit Hilfe einer Neubauerzählkammer bestimmt und die

Sporensuspension durch Verdünnen mit Wasser so eingestellt, dass mit vier

Pumpstößen pro Wabenseite aus einer 1,5-Liter-Sprühflasche eine single-bee-Dosis

von 1 x 106 Konidien appliziert werden konnte. Düsengängigkeit der Konidien und


32

deren Keimfähigkeit nach Düsendurchgang waren zuvor nach Sprühtests und

Ausplattieren einer Verdünnungsreihe auf MEA-Platten überprüft worden.

Die Pilzgruppe wurde einen Tag nach Besatz mit Lecanicillium muscarium-

Konidiensuspension besprüht, die Kontrollgruppe mit dem entsprechenden Volumen

Suspension, das analog aus konidienfreier Additivmatrix hergestellt wurde, die die

Firma Koppert zur Verfügung stellte.

In der Folge wurde der Milbenfall täglich durch Auszählen der ins Öl gefallenen

Milben erfasst, die Bienenzahl und die Zahl der Brutstadien wurden zu Beginn und

nach sieben, 14 und 17 Tagen durch Auflegen eines Schätzrahmens bestimmt. Nach

Ermittlung der Bienenzahl und Abschütteln der adulten Bienen in die Versuchsvölker

wurde mit Hilfe der gleichen Vorgehensweise die Zahl offener oder verdeckelter

Brutzellen erfasst. Die Zahl zum Zeitpunkt der Schätzung fouragierender

Arbeiterinnen wurde über die Erfassung innerhalb einer Minute an- beziehungsweise

abfliegender Bienen ermittelt. Der Kasteninnenwand ansitzende Bienen wurden

ebenfalls zur Gesamtzahl addiert.

Der relative Endbefall der Bienen wurde zum Versuchsende durch

Untersuchung der Arbeiterinnen ermittelt: Alle noch in den Völkern befindlichen

adulten Tiere wurden gesammelt, getötet und durch Waschen mit einer

detergenshaltigen Waschlösung von den aufsitzenden Milben befreit. Die abgelösten

Milben wurden anschließen in geeigneten Sieben aufgefangen und ebenso wie die

Bienen einzeln gezählt. Ebenfalls durch Auswaschen und Einzelauszählung wurde

der relative Milbenendbefall der verdeckelten Brut ermittelt: Zunächst wurden die

verdeckelten Brutzellen gezählt, nach Einfrieren mechanisch entdeckelt und die in

ihnen befindlichen Milben und Puppen mit einem scharfen Wasserstrahl ausgespült.

Nach Abschluss des Versuchs wurden alle Versuchstiere nach Autoklavieren

entsorgt.


33

2.10 Erfassung der subletalen Effekte entomopathogener Pilze auf

Adultbienen

Die Bienen für diesen Versuch stammten aus milbenarmen Versuchsvölkern

und wurden wie zuvor beschrieben gewonnen; ihnen standen 2M Saccharoselösung

und Wasser ad libitum zur Verfügung. Die Hälterung erfolgte analog zu den anderen

in vitro-Versuchen in Metallkäfigen bei 35°C und hoher Luftfeuchte im

Wärmeschrank. Zu Beginn des Versuchs wurden die Bienen mit einem den in

anderen Versuchen verwendeten Volumen äquivalenten Volumen

Konidienerntelösung besprüht. In der Folge wurden die Tiere keiner weiteren

Behandlung unterzogen, lediglich gestorbene Bienen wurden entfernt. Der Gruppe

Abb. 2.3: Aufstellung der Versuchsvölker in einem von zwei 20 x 4 Meter

großen Zelten auf waagerecht ausgerichteten Paletten mit versetzter

Ausrichtung der Fluglöcher.


34

wurden täglich Bienen entnommen, die zunächst auf Eis betäubt und denen dann

nach Fixierung des Thorax mit einer Pinzette durch Abziehen das Abdomen entfernt

wurde. Bei vorsichtiger Vorgehensweise wird dabei die am Oesophagus hängende

Honigblase nach kranial herausgezogen. Anschließend wurde die Honigblase mit

einer feinen Schere abgetrennt und auf einer Analysewaage (Sartorius) gewogen.

Der mögliche Einfluss entomopathogener Pilze auf das Lernverhalten wurde im

Rahmen einer Rüsselreflexdressur (auch PER-Dressur, „Poboscis Extension Reflex-

Dressur“) untersucht (Bittermann et al. 1983).

Für jede Versuchsreihe wurden den Versuchsvölkern 1000 Bienen durch

Abschütteln entnommen und nach CO2-Betäubung in Metallkästen (50 x 75 x 40

mm³) mit jeweils 50 Bienen überführt. Die Kästen verfügten über eine durchlöcherte

Bodenplatte und wurden an einer Seite mit einer Glasplatte verschlossen. Die

Hälterung der Bienen erfolgte bei 35°C und einer relativen Luftfeuchte von 90

Prozent im Dauerdunkel des Brutschrankes. Bis zum Dressurtag standen 2M

Saccharoselösung und Wasser ad libitum zur Verfügung. In der Pilzgruppe erfolgte

nach Besatz die Applikation von 0,544 ml Konidiensuspension des Pilzes

Lecanicillium muscarium einer Konzentration von 9 x 107 Konidien/ml, so dass eine

single-bee-Dosis von 1 x 106 Konidien/Biene erreicht wurde. Analog wurde die

Kontrollgruppe je Kasten mit 0,544 ml 0,1% Tween 80, 0,5% NaCl besprüht, das als

Emulgator für die Konidiensuspension diente.

Vor der Rüsselreflexdressur wurde den Bienen in Abhängigkeit vom erwarteten

Füllungsvolumen der Honigblase und dem ermittelten durchschnittlichen

Futterverbrauch Futter entzogen, so dass sie zu Beginn der Rüsselreflexdressur

hungrig waren. Die am Versuch teilnehmenden Bienen wurden aus den Kästen

entfernt und nach Betäubung durch Kühlung auf Eis einzeln in Reaktionsgefäße (1,5

ml, Eppendorf), deren Spitzen abgeschnitten waren, eingeführt. Die Tiere wurden am

Thorax so mit Klebeband fixiert, dass Vorderbeine, Rüssel und Antennen frei

beweglich blieben. Um eine Flucht aus den Reaktionsgefäßen zu verhindern, wurden

diese hinter dem Abdomen der Bienen mit Papierstopfen blockiert.

Etwa eine Stunde nach Einbringen der Bienen in die Reaktionsgefäße

(Abbildung 2.4) begann die PER-Testphase: Die Antennen der Bienen wurden alle

30 Minuten mit einem in 2M Saccharoselösung getauchten Schmelzpunkt-

Bestimmungsröhrchen (80 mm x 1 mm) berührt. Bienen, die auf die Gabe dieses

unbedingten Reizes nicht mit Herausstrecken des Rüssels reagierten, wurden für die


35

Rüsselreflexdressur verworfen. In der Testphase erfolgreiche Bienen wurden

anschließend in den PER-Versuchsaufbau (Abbildung 2.5) eingesetzt.

Für die Rüsselreflexdressur wurden Geraniol als Dressurduft und Citral als

Vergleichsduft (beide SIGMA-ALDRICH) verwendet. Dazu wurden jeweils 10 µl des

Duftstoffes auf ein Stück Filterpapier (Grade 288, 90 mm Durchmesser, 80 g/m²)

aufgetragen und das Filterpapier in fabrikneue Glaspasteurpipetten (Länge 150 mm)

eingebracht. Als Kontrolle diente unbehandeltes Filterpapier in einer

Glaspasteurpipette.

Die Pipetten führten den Bienen aus einer Druckluftflasche einen konstanten

Luftstrom von 50 ml/min zu, der durch ein Peltierelement auf 35°C aufgeheizt wurde.

Die Gabe des Duftreizes war über ein Magnetventil steuerbar, während ein zweiter

duftloser Luftstrom gleicher Durchflussmenge appliziert wurde, der eine Assoziation

der bloßen Luftbewegung mit dem unbedingten Reiz verhindern sollte. Bienen, die

sich auf dem drehbaren Karussell unmittelbar vor der Versuchsposition befanden,

wurden durch ein Holzbrett vom gerade applizierten Duft abgeschirmt. Zusätzlich war

über der Versuchsposition ein Ventilator angebracht, der für eine schnelle Abfuhr des

applizierten Duftes sorgte, um die anderen auf dem Karussell befindlichen Bienen

nicht zu beeinträchtigen.

Die Rüsselreflexdressur beinhaltete zunächst drei Lernakte, an die sich

abwechselnd acht Test- und Vergleichsakte anschlossen. Nach dem zweiten und

fünften Vergleichsakt wurde eine Kontrolle durchgeführt. Nach Positionierung der

jeweiligen Versuchsbiene unmittelbar vor den Pipettenspitzen und einer

Gewöhnungszeit von etwa fünf Sekunden wurde der Luftstrom für sechs Sekunden

mittels Magnetventilsteuerung von der Kontrollpipette auf die Pipette mit Dressurduft

umgeleitet. Nach etwa zwei Sekunden wurden die Antennen der Biene mit 2M

Saccharoselösung berührt und die Biene wurde nach Herausstrecken des Rüssels

damit belohnt. Bienen, die auf den neutralen Luftstrom mit einem Rüsselreflex oder

nicht auf den unbedingten Reiz reagierten, wurden aus dem Versuch entfernt. Auf

der horizontalen, drehbaren Scheibe des „Karussells“ befanden sich

Aufnahmebohrungen für 20 Reaktionsgefäße; jede Einzelbiene konnte etwa alle acht

bis zehn Minuten getestet werden.

Während der acht Testakte erfolgte keine Konditionierung mehr – die Tiere

wurden also nur bei einer positiven Antwort auf den bedingten Reflex durch Gabe


36

von Saccharoselösung belohnt. Antworten auf den Vergleichsduft oder Antworten

während der zwei Kontrollakte wurden in keinem Fall belohnt.

Die Klassifikation der Antworten erfolgte in den Kategorien „unbedingter

Reflex“, „bedingter Reflex“, „Reaktion auf Luft“ oder „keine Reaktion“.

Zur Untersuchung der Fragestellung, ob es einen Effekt der Applikation eines

entomopathogenen Pilzes auf die Futteraufnahme der Einzelbiene gibt, wurde der

Futterverbrauch je Einzelkasten alle 24 Stunden durch Wiegen der das Futter

enthaltenden Spritze und Differenzbildung zum 24 Stunden zuvor gemessenen Wert

erfasst; parallel wurde die Zahl der je Kasten noch verbliebenen Bienen ermittelt.

Abb. 2.4: Honigbienenarbeiterin in der Rüsselreflexdressur; das Tier wird während der Konditionierung

mit Saccharoselösung belohnt; links oben die Spitzen der Glaspasteurpipetten, durch die Dressur- und

Vergleichsduft appliziert werden.


37

2.11 Erfassung des Einflusses entomopathogener Pilze auf das

Immunsystem von Adultbienen

Versuchsvölkern wurden adulte Bienen durch Abschütteln entnommen und mit

CO2 betäubt. Anschließend erfolgte die Verteilung auf sieben Versuchsgruppen mit je

50 Bienen. Der Versuchsgruppe „amputiert“ wurde jeweils ein Bein amputiert, um

eine obligate Immunantwort auszulösen und eine Positivkontrolle zu erhalten. Die

anderen Gruppen wurden mit 0,544 ml einer Konidiensuspension besprüht, so dass

eine single-bee-Dosis von 1 x 106 Konidien/Biene erreicht wurde. Appliziert wurden

Konidien der entomopathogenen Pilze Lecanicillium muscarium, Metarhizium

anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus, sowie Sporen von

Saccharomyces cerevisiae MEYEN. Die Negativkontrollgruppe erhielt eine äquivalente

Dosis konidienfreier Erntelösung. Analog zu allen anderen in vitro-Assays wurden die

Abb. 2.5: Versuchsapparatur zur Durchführung der Rüsselreflexdressur:

Glaspasteurpipetten mit Peltierelement, Ventilator, „Karussell“, Signalgeber.


38

Honigbienen anschließend in Metallkäfigen bei 35°C und hoher Luftfeuchtigkeit im

Dauerdunkel gehältert; Futter und Wasser standen ad libitum zur Verfügung. 24

Stunden später wurde den Bienen nach Betäubung auf Eis Hämolymphe

entnommen: Auf Thorax und Abdomen der Bienen wurde nach Abtrennen der Tibia

eines Mittelbeines leichter Druck ausgeübt, bis ein Hämolymphtropfen austrat, der

mit einer Eppendorfpipette aufgenommen wurde. Je 5 µl Hämolymphe wurden in ein

200 µl-Eppendorfgefäß überführt, das 1 µl einer Lösung Phenylthioharnstoff 0,1

mg/ml und des Proteaseinhibitors Aprotinin 0,1 mg/ml (beide SIGMA ALDRICH)

enthielt, um ein Melanisieren der Hämolymphe zu vermeiden. Die Lagerung erfolgte

bei -26°C im Gefrierschrank.

Als Teststämme für den Immunversuch wurden Escherichia coli (B) CASTELLANI

AND CHALMERS (DSM 613, DSMZ, Braunschweig) und Bacillus subtilis (168) COHN

(Mikrobielle Antibiotikaforschung, Ruhr-Universität Bochum) verwendet. Aus den

Stammkulturen wurden je 40 ml einer sterilen LB-Flüssigkultur (5 g/L Hefeextrakt, 10

g/L Trypton, 10 g/L NaCl, alle Applichem) angeimpft und über Nacht bei 37°C und

120 rpm inkubiert. Am nächsten Morgen wurden aus dieser Kultur erneut 5 ml LB

flüssig angeimpft; die Inkubation erfolgte bei 37°C und 120 rpm sowie stündlicher

Probennahme und Messung im Photometer (Shimadzu UVmini 1240) bis zu einer

OD650 von 0,5. Dem Ansatz wurde daraufhin ein Aliquot entnommen und mit LB

flüssig 1:10 verdünnt. 1 µl dieser Verdünnung wurden dann mit je 1,5 µl der

gewonnenen Hämolymphe vermischt; zwei weitere Ansätze enthielten keine

Hämolymphe, sondern nur 1 µl einer Lösung Phenylthioharnstoff 0,1 mg/ml und des

Proteaseinhibitors Aprotinin 0,1 mg/ml beziehungsweise sterilfiltriertes Streptomycin

100 µg/ml. Die Ansätze wurden kurz anzentrifugiert und anschließend für zwei

Stunden bei 37°C inkubiert. Jeder Ansatz wurde dann auf 10 µl aufgefüllt und es

wurde eine Verdünnungsreihe über 6 Potenzen erstellt (je 2 µl auf 18 µl LB-Medium).

2 µl je Ansatz wurden anschließen auf sterilen LB-Platten (5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L

Trypton, 10 g/L NaCl, 15 g/L Agar, alle Applichem) ausplattiert und im Brutschrank

bei 37°C inkubiert. 24 Stunden später erfolgte die Auszählung und Ermittlung der

Zahl koloniebildender Einheiten (colony forming units, cfu) in Abhängigkeit von der

Verdünnungsstufe.


39

2.12 Screening ausgewählter Völker auf potentiell spezifische

varroapathogene Pilze

Die Erfassung der Bienenzahl erfolgte wie unter 2.9 beschrieben während des

jeweiligen Sommerhalbjahrs an insgesamt 215 Versuchsvölkern in vierwöchigen

Abständen fünfmal je Volk. Zur Ermittlung des täglichen Milbenfalls wurde unter das

Gitter des Bodens eines Volkes für je drei Tage eine passgenaue Polyethylenwanne

geschoben, die ein Verwehen gefallener Milben durch Wind verhinderte. Der

Milbenfall wurde für jedes Volk während des Untersuchungszeitraums an 21

Terminen durch genaues Auszählen ermittelt.

Zur Untersuchung einer eventuellen Korrelation von Milbenbefall und dem

Vorkommen von Pilzen wurden auf der Basis der Populationsschätzungen Völker

ausgewählt, deren Milbentotenfall in Bezug auf die Erzielbarkeit eines Pilzwachstums

in vitro untersucht wurde. Den zu untersuchenden Völkern wurde dazu eine

passgenaue Auffangwanne untergeschoben und der tägliche Milbenfall über einen

Zeitraum von bis zu zwei Wochen pro Volk gesammelt. Im Labor erfolgte dann die

Oberflächensterilisation durch Eintauchen der Milben in 0,5% NaOCl für 120

Sekunden und anschließendes Spülen in sterilem ddH2O. Danach wurden die Milben

– getrennt nach Herkunftsvölkern – mit sterilen Holzstäbchen auf H2O-Agar-Platten

(15 g/L Agar, Applichem) überführt und bei 25°C im Dauerdunkel in Brutschränken

kultiviert. Das aus diesen Milben erfolgte Pilzwachstum wurde registriert; Milben, die

ein Pilzwachstum zeigten, wurden entfernt und getrennt unter gleichen Bedingungen

weiterkultiviert, um eine Kreuzinfektion der auf den Agarplatten verbliebenen Milben

zu vermeiden. Der Einschub der Schubladen über bis zu zwei Wochen bedingte,

dass es zur Verschleppung von Milben durch fouragierende Ameisen kam. Aus

diesem Grund konnte nicht gleichzeitig der Befall des Volkes über den

Milbentotenfall in der Auffangwanne erfasst werden. Allen Völkern wurden deshalb

während der Phase des Milbensammelns Proben von etwa 1000 adulten Bienen

entnommen, die ausgezählt und deren aufsitzende Milben nach Abwaschen mit einer

Detergenslösung und Absieben ebenfalls erfasst wurden.


40

2.13 Identifizierung von Pilzen im Pilzscreening

Lactophenolblaufärbung

Um die isolierten Pilze nicht nur molekularbiologisch charakterisieren zu

können, wurden mikroskopische Präparate angelegt: Nach Beladen eines

Objektträgers mit 10 µl Lactophenolblau (Sigma Alrich) wurde ein transparenter,

einseitig klebender Kunststofffilmstreifen auf die Wuchszone im Randbereich des

Pilzes gedrückt, um Konidien und Myzel zu übertragen; der Streifen wurde

anschließend auf den Lactophenolblautropfen gelegt und nach Trocknen

mikroskopiert.

Flüssigkultur und DNA-Extraktion

Um Aussagen zur Spezieszugehörigkeit der im Screening aus den Milben

gewachsenen Pilze treffen zu können, wurden diese auf der Basis von

Sequenzdaten identifiziert: Zunächst erfolgte durch wiederholtes Überimpfen auf

MEA-Platten eine Isolation der gewachsenen Pilze, bis eine Kontamination durch

Fremdkulturen ausgeschlossen werden konnte. Die Kultur der isolierten Pilze erfolgte

bei 25°C im Dauerdunkel in Klimaschränken. Zur Gewinnung der DNA wurde je Pilz

eine Petrischale mit autoklaviertem CM-Flüssigmedium mit drei unter sterilen

Bedingungen ausgestochenen Myzelstücken beimpft und drei Tage bei 25°C im

Dauerdunkel kultiviert. Nach Einsetzen eines deutlichen Pilzwachstums in der

Flüssigkultur wurden die Agarstücke mit Hilfe steriler Pipettenspitzen entfernt, das

Myzel durch Zerreißen mit sterilen Pipettenspitzen grob zerkleinert und 2,0-ml-

Reaktionsgefäße (Eppendorf) zu einem Drittel mit Myzel gefüllt. Es folgte

Zentrifugation bei 16000 g für zwei Minuten und Abpipettieren des Überstandes. Je

Eppendorfgefäß wurden dann 600 µl Lysepuffer zugefügt. Anschließend folgten

sechs Homogenisier-Gefrier-Auftauzyklen: 1 Minute Homogenisierung im

Reagenzglasschüttler (Vortex), 30 Sekunden Gefrieren in flüssigem Stickstoff, 1

Minute Auftauen im Wasserbad (GFL) bei 70°C. Danach wurde der Gefäßinhalt bei

70°C komplett aufgetaut. Anschließend wurde unter dem Abzug 1 ml Phenol (Roth)

zugegeben, homogenisiert, und 15 Minuten bei 13500 g, 4°C zentrifugiert.

Der Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt und 1 ml Phenol-Chloroform-


41

Isoamylalkohol zugegeben. Danach wurde wiederum homogenisiert und bei 13500 g

und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Nach erneuter Überführung des wässrigen

Überstandes erfolgte die Zugabe von 0,5 Vol. 7,5M Ammoniumacetat und 1 Vol

Isopropanol. Nach vorsichtigem Invertieren und Aufbewahren bei -26°C über Nacht

wurde am nächsten Morgen bei 16000 g für 40 Minuten zentrifugiert, der Überstand

vorsichtig abgegossen und das Pellet mit 300 µl 70% Ethanol gewaschen. Nach

folgender Zentrifugation bei 16000 g für 10 Minuten wurde der Überstand verworfen

und das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Abschließend erfolgte die Zugabe

von je 30 µl autoklaviertem ddH2O.

DNA-Aufreinigung

Die Proben wurden zunächst unter Vermeidung des Mitführens des nicht

resuspendierten Anteils in ein neues Eppendorfgefäß überführt, mit 4 µl RNase A (10

mg/ml, Fermentas) vermischt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurde die Lösung mit 1 Vol Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (Roth)

versetzt, ausgeschüttelt und bei 12300 g für 10 Minuten abzentrifugiert. Der wässrige

Überstand wurde unter Vermeidung des Mitführens der Interphase in ein neues

Eppendorfgefäß pipettiert, bevor der Vorgang wiederholt wurde. Anschließend

erfolgte ein Ausschütteln mit 1 Vol Chloroform, erneutes Ausschütteln und

Abzentrifugieren bei 12300 g für 10 Minuten und danach ein Versatz mit 0,6 Vol

Isopropanol. Nach Inkubation bei -26°C wurde bei 16000 g in 45 min quantitativ

abzentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen, bei 45°C im Thermoblock getrocknet

und das Pellet danach erneut in 30 µl autoklaviertem ddH2O aufgenommen. Die

Überprüfung der Extraktion und Aufreinigung erfolgte über eine Roh-DNA-

Agarosegelelektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel (NEEO Ultra, Roth) und

anschließende Färbung und Dokumentation unter einer UV-Bank (Biometra

BioDocAnalyze). Die aufgereinigten DNA-Proben wurden bis zur weiteren

Verwendung bei -26°C im Gefrierschrank gelagert.


42

Konzentrationsbestimmung

Die Bestimmung der Konzentration erfolgreicher Extraktionen erfolgte

photometrisch (Shimadzu UVmini 1240 Spectrophotometer): 5 µl DNA-Extrakt

wurden mit 95 µl TE-Puffer zu einer 1:10-Lösung verdünnt und in eine

Photometerküvette gegeben; der Nullabgleich erfolgte gegen TE-Puffer. Die OD-

Messung wurde dann mit jeweiligem Nullabgleich bei 260 und 280 nm durchgeführt.

PCR

Verwendet wurden je Ansatz 1µl 10x PCR-Puffer (Sigma Aldrich), 1µl dNTP-Mix

2mM (MWG) je 0,5 µl forward-/reverse-Primer, 0,2 µl RedTaq-Polymerase 5U/µl

(Sigma Aldrich) und ddH2O add. 10 µl. Grundsätzlich lief ein Ansatz als

Negativkontrolle ohne DNA mit.

Die verwendeten Primer (ITS1F (Bruns et al. 1993) und ITS4 (White et al.

1990), beide MWG) hatten folgende Sequenzen:

ITS1F 5´-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3´ ITS4 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´

Als Protokoll für die PCR (Thermocycler: Biometra UNO Thermoblock) wurden

nach Voruntersuchungen die in Tabelle 2.2 zusammengefassten Parameter

verwendet.

Schritt Temperatur (°C) Dauer (min) Initiale Denaturierung 94 3 Denaturierung 94 0,5 Annealing 55 0,5 Elongation 68 1 Finale Elongation 68 3 Ende 4 ∞

Die Kontrolle der PCR auf Erfolg und eventuelle Kontaminationen erfolgte auf

einem 1,7% Agarosegel.

30

Tabelle 2.2: Parameter der PCR der ITS-Region


43

PCR-Cleanup

Die Amplifikate wurden enzymatisch aufgereinigt. Verwendet wurden

Exonuclease I aus Escherichia coli und Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (beide

Fermentas). 5 µl des PCR-Produkts wurden mit je 0,25 µl Exonuclease I und 0,5 µl

SAP versetzt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte die

Inaktivierung bei 85°C für 15 Minuten (Thermomixer comfort, Eppendorf).

Sequenzierung

Die Sequenzierung erfolgte am Lehrstuhl für Biochemie I – Rezeptorbiochemie

der Ruhr-Universität Bochum auf einem Applied Biosystems 3130 xl Genetic

Analyzer nach den Spezifikationen des Lehrstuhls. Primer für die Sequenzierung war

ITS1F wie oben beschrieben.

Datenbankabfrage, Alignment und Stammbaumkonstruktion

Die Identifizierung der Pilze erfolgte durch Abgleich mit bereits abgelegten

Sequenzdaten in der EMBL Nucleotide Sequence Database

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/fasta33/nucleotide.html, Stand Juni 2009). Als Parameter

wurden die in Tabelle 2.3 dargestellten Einstellungen verwendet.

Program FASTADatabases EMBL FungiMatrix noneGap open -14Gap extend -4KTUP 6Expectation upper value 10,0Expectation lower value defaultDNA strand bothSequence Range Start-EndDatabase Range Start-EndFilter noneStatistical estimates Regress

Tabelle 2.3: Übersicht der für die EMBL-Abfrage verwendeten Einstellungen


44

Das Alignment der Sequenzen erfolgte unter Verwendung des Programms

MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) Version 4 auf einem PC unter

Windows XP (Tamura et al. 2007).

Die Alignierung wurde mit ClustalW durchgeführt. Anschließend wurden alle

Sites am Sequenzanfang und -ende, die nicht in allen Sequenzen ein Signal geliefert

hatten, manuell entfernt. Die Berechnung eines ungewurzelten Baumes auf der Basis

der Alignierung mit dem Neighbor-Joining-Verfahren wurde ebenfalls mit MEGA 4.0

durchgeführt (Saitou et al. 1987; Wägele 2001). Die Distanzwerte wurden nach dem

Maximum Likelihood-Verfahren ermittelt (Tamura et al. 2004).

Der Baum wurde außengruppenlos ohne orthologen Datensatz berechnet.

Als Parameter für die Baumberechnung wurden die in Tabelle 2.4 dargestellten

Einstellungen verwendet.

2.14 Statistik und Parameter der grafischen Darstellung

Die verwendeten statistischen Tests, der Stichprobenumfang und die

ermittelten Signifikanzniveaus sind zu den jeweiligen Ergebnissen angegeben.

Einzelheiten zur Durchführung der Tests können Backhaus, Sachs und Siegel

entnommen werden (Siegel et al. 1988; Backhaus 2008; Sachs et al. 2009).

Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt in Balken-, Linien-, Streudiagrammen,

einer Streudiagrammmatrix oder Box- und Whiskerplots. Im Fall von Box- und

Whiskerplots ist als unterteilende Linie der Box der Median dargestellt. Im unteren

Bereich der Box wird das 25. Perzentil, im oberen Bereich der Box wird das 75.

Perzentil dargestellt. Die Länge der Whisker beträgt das 1,5-fache der Höhe der Box;

Data Type NucleotideAnalysis Phylogeny reconstructionMethod Neighbor-JoiningGaps/Missing Data Complete DeletionModel Nucleotide: Maximum Composite LikelihoodSubstitutions to Include d: Transitions + TransversionsPattern among Lineages Same (Homogeneous)Rates among sites Uniform rates

Tabelle 2.4: Übersicht der für die Baumberechnung verwendeten Einstellungen in MEGA 4.0


45

falls keine Fälle mit Werten in diesem Bereich vorhanden sind, wird die Länge durch

den maximalen beziehungsweise minimalen Wert festgelegt. Ausreißer sind als

Punkte dargestellt und umfassen Werte, die nicht innerhalb der Whisker liegen.

Extremwerte sind durch Sterne dargestellt und umfassen all jene Fälle, deren Werte

mehr als dreimal so groß sind wie die Höhe der Boxen. Im Fall von

Regressionsgeraden sind die Werte der quadratischen Regression jeweils

angegeben.

Ergebnisse

46

3 Ergebnisse

Um Aussagen darüber gewinnen zu können, ob als Kontrollagentien geeignet

erscheinende, entomopathogene Pilze eine negative Wirkung auf die Larvenstadien

beziehungsweise das Puppenstadium von Honigbienen respektive adulte

Honigbienen sowie adulte Milben haben und ob eine signifikant erhöhte

Pilzwachstumsrate bei Milben post mortem detektierbar war, wurden in den

Untersuchungen mit einer definierten Einzeldosis Konidien des jeweils untersuchten

Pilzes behandelte Individuen mit nur mit einer entsprechenden Menge der

Erntelösung behandelten Individuen in der Kontrollgruppe verglichen. Die dabei

verwendeten methodischen Ansätze unterschieden sich bei Honigbienen in

Abhängigkeit vom untersuchen Stadium des Tieres und differierten darüber hinaus

zwischen den Labor- und den Halbfreilanduntersuchungen. Im Folgenden werden

deshalb vor der Ergebnisbeschreibung zunächst noch einmal kurz die verwendeten

methodischen Ansätze vor dem Hintergrund der Zielsetzung des jeweiligen Versuchs

erläutert.

3.1 Voruntersuchungen

3.1.1 Kulturbedingungen

Um ein für die untersuchten entomopathogenen Pilze, vor allem aber für die im

Screening zu isolierenden Pilze mit unbekannten Kulturansprüchen geeignetes

Medium zu finden, das eine möglichst geringe Zahl von Arten durch Nichteignung

ausschließt, wurden die zur Verfügung stehenden entomopathogenen Pilze auf vier

unterschiedlichen Medien kultiviert und untersucht, inwiefern sich die Zahl erntbarer

Konidien pro Flächeneinheit sowie die Koloniedurchmesser unterschieden.

Die PDA- und YPDA-Nährböden wiesen bei jeweils einem untersuchen Pilz

(Beauveria bassiana beziehungsweise Paecilomyces fumosoroseus) deutlich

geringere erzielbare Konidiendichten und Koloniedurchmesser im Vergleich zur

Restgruppe auf, so dass diese beiden Medien mit Blick auf die Erfassung

undetektierte Pilze in phylogenetischer Nähe zu Beauveria bassiana und

Ergebnisse

47

Paecilomyces fumosoroseus verworfen wurden. Malzextraktagar zeigte sich bei

sonst ähnlichen Ergebnissen im Vergleich zu Sabouraud-Dextrose-Agar in der Kultur

von Beauveria bassiana überlegen, so dass Malzextraktagar als das Medium

angesehen wurde, mit dem mit vergleichsweise großer Wahrscheinlichkeit neue Pilze

kultiviert werden können (Abb. 3.1).

Abbildung 3.1: Medieneignung, gemessen als Zahl erntbarer Konidien pro Quadratzentimeter

Kulturfläche (Abszisse) und als Koloniedurchmesser in Zentimetern (Ordinate), untersucht für vier

Pilze und die vier Medien Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA), Malzextraktagar (MEA), Hefe-Pepton-

Dextrose-Agar (YPDA) und Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA). Die im Durchschnitt besten Ergebnisse,

vor allem mit Blick auf die Kultur zukünftiger, unbekannter Pilze, lieferte Malzextraktagar.

Ergebnisse

48

3.1.2 Wirkung unterschiedlicher Oberflächensterilisationszeiten auf das

Pilzwachstum aus Milben

Die Beantwortung der Frage, ob ein Pilzwachstum nach Dosisapplikation

entomopathogener Pilze in den Versuchen im Labor- sowie im Halbfreilandmaßstab

nachweisbar war, setzte voraus, dass in der Kultur der Milben ein Wachstum der den

Milben äußerlich anhaftenden, opportunistischen Saprophyten oder anderer Pilze

weitestgehend ausgeschlossen werden konnte. Ebenso sollte im Screening auf

unbekannte Pilze ausschließlich eine Kultur interioren Ursprungs erfolgen.

Zu ermitteln war deshalb eine Mindeststerilisationszeit, die einen

weitestgehenden Ausschluss des Wachstums aus den Milben äußerlich anhaftenden

Diasporen sicherstellte. Gesammelte Milben wurden deshalb gepoolt und dem

Sterilans NaOCl für definierte Zeiträume ausgesetzt. Signifikante Reduktionen des

erzielbaren anteiligen Wachstums (Pilze pro 100 Milben) traten nach 20 und 120

Sekunden auf – in der Folge wurde deshalb eine Oberflächensterilisationszeit von

120 Sekunden verwendet (n = 212, p (a - b) < 0,01; p (a - c, b - c) < 0,001; χ2-Test,

zweiseitig; Abb. 3.2).

Ergebnisse

49

Abbildung 3.2: Pilzwachstum bis zu elf Tagen nach Behandlung als Ergebnis der Oberflächensterilisation

von Milben mit 0,5% NaOCl-Lösung in Abhängigkeit von der Sterilisationszeit. Während bei

Sterilisationszeiten von bis zu 60 Sekunden Pilzwachstum in bis zu 40% der Fälle auftrat, sank der Wert

bei einer Sterilisationszeit von 120 Sekunden und mehr auf unter 5% (n = 212, p (a - b) < 0,01; p (a - c, b -

c) < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

a

c

a

ab

b

b

b

c

Tage nach Behandlung

Ergebnisse

50

3.1.3 Einfluss der Konservierungsmethode der Milben auf das

Pilzwachstum

Sofern Milben nicht sofort nach dem Sampling verarbeitet werden konnten,

mussten sie in geeigneter Weise bis zur Aufarbeitung aufbewahrt werden. Zur

Untersuchung der Frage, ob Trocknung oder Einfrieren in der Weiterkultur ein

höheres relatives Pilzwachstum erwarten ließen, wurden Milbensamplings gepoolt,

anschließend auf die beiden Versuchsgruppen verteilt und unter sonst einheitlichen

Bedingungen kultiviert.

Aus eingefrorenen Milben ließ sich ein gegenüber getrockneten Milben

signifikant höheres relatives Pilzwachstum erzielen (n für die beiden Gruppen jeweils

= 250; p < 0,001; ***; χ2-Test, zweiseitig; Abb. 3.3).

***

Abbildung 3.3: Pilzwachstum in Abhängigkeit von der Konservierungsart (luftgetrocknet/eingefroren)

gesammelter Milben; n für die beiden Gruppen jeweils = 250. Gefrorene Milben ermöglichten das

Wachstum einer signifikant höheren Anzahl von Pilzen pro 100 Milben als luftgetrocknete Milben (p

< 0,001; ***; χ2-Test, zweiseitig).

Ergebnisse

51

3.2 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Larven

Da applizierte Pilzsporen eines potentiellen Antagonisten von Varroa destructor

mittelbar oder unmittelbar auch in offene Brutzellen gelangen, wurde untersucht, ob

es einen spezifischen Effekt der zur Verfügung stehenden entomopathogenen Pilze

auf Bienenbrut im Zeitraum vom L1-Stadium bis zum Schlupf gibt.

Nach Applikation einer Individualdosis von 1 x 106 Konidien unmittelbar nach

dem Schlupf der Larve aus dem Ei erfolgte eine Kultur in vitro mit 24-stündigem

Monitoring der Larvenmortalität bis 21 Tage nach Versuchsbeginn.

Die kumulierte Kurve jeder Gruppe zeigte einen asymptotischen Verlauf: Es

kam zu einer hohen Mortalitätsrate in den ersten sechs Tagen nach Applikation,

danach nahm die Rate bis zum Schlupf der adulten Biene stark ab. Lediglich in der

Beauveria bassiana-Gruppe kam es zwischen Tag sieben und Tag neun erneut zu

einem starken Anstieg – die Intergruppendifferenzen wichen aber zu keinem

Zeitpunkt signifikant voneinander ab. Die kumulierte Mortalität überstieg am

Versuchsende in keiner Gruppe einen Wert von 20 Prozent (N für jede Gruppe =

120; p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig; Abb. 3.4).

Abbildung 3.4: Kumulierte prozentuale Mortalität mit Konidien unspezifischer entomopathogener Pilze

beziehungsweise ausschließlich mit Erntelösung behandelter Larven. N für jede Gruppe = 120.

Intergruppendifferenzen sind nicht signifikant; χ2-Test, zweiseitig.

KontrolleBeauveria bassiana Lecanicillium muscarium Metarhizium anisopliae Paecilomyces fumosoroseus


Ergebnisse

52

3.3 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Adultbienen

Im Fokus der bisherigen Untersuchungen zum Einsatz von Antagonisten gegen

Varroa destructor standen entomopathogene Pilze, die überwiegend aus anderen

Arthropodenklassen isoliert wurden. Um verlässliche Aussagen zu deren

Wirksamkeit in Bezug auf Apis mellifera treffen zu können, wurden die vier

verwendeten Pilzstämme in vitro unter exakt definierten Bedingungen getestet: Pro

Versuchsgruppe wurden je 50 Bienen nach Applikation einer single-bee-Dosis von

106 Konidien in Metallkäfigen im Wärmeschrank gehältert. Je Pilz wurden 60 Assays

angesetzt. Pollenteig, 2M-Zuckerlösung und Wasser standen ad libitum zur

Verfügung. Die Bienenmortalität wurde täglich erfasst. Die Kontrollgruppe wurde

analog behandelt, zu Beginn des Versuchs aber lediglich mit einem äquivalenten

Volumen Erntelösung ohne Konidien besprüht. Im Folgenden sind die Ergebnisse für

die vier untersuchten Pilze aufgelöst nach Einzeltagen und kumulativ dargestellt.

3.3.1 Lecanicillium muscarium: Mortalität/Versuchsgruppe und

kumulierte Mortalität

Bienen, die mit dem entomopathogenen Pilz Lecanicillium muscarium

behandelt wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe am vierten und siebten

Tag nach Applikation signifikant beziehungsweise höchstsignifikant erhöhte

Mortalitätsraten (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen; N gesamt = 60 Assays; p vier

Tage nach Behandlung < 0,05; *; p sieben Tage nach Behandlung < 0,001; ***; t-

Test, zweiseitig; Abb. 3.5). In der kumulierten prozentualen Mortalität unter dem

Einfluss von Lecanicillium muscarium zeigte sich nach analogem Verlauf der

Mortalitäten von Versuchsgruppe und Kontrollgruppe bis einschließlich des dritten

Tages nach Behandlung eine zunehmende Diskrepanz ab dem dritten Tag nach

Behandlung, in deren Folge die kumulierte Mortalität der Lecanicillium-Gruppe über

derjenigen der Kontrollgruppe lag. Diese Differenz führte über die gesamte

Versuchsdauer zu einer höchst signifikanten Differenz der kumulierten Raten (p <

0,001; χ2-Test, zweiseitig).

Ergebnisse

53


Abbildung 3.5: Mortalität mit dem Pilz Lecanicillium muscarium behandelter Bienen je

Versuchsgruppe (50 Bienen, unten) und Tag sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben)

über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 50 Bienen. Am vierten und siebten

Tag nach Behandlung kam es zu einer signifikant erhöhten Bienensterblichkeit (p < 0,05; *;

beziehungsweise p < 0,001; ***; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen differieren die

Gesamtmortalitäten höchst signifikant voneinander (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

Versuchsgruppe Kontrolle Lecanicillium muscarium


* ***n.s. n.s. n.s.

kum

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mo

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B

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ersu

chs

gru

pp

e

Ergebnisse

54


Mortalität

Nach Applikation der Versuchsdosis des Pilzes Metarhizium anisopliae kam es

nach einer sehr geringen Mortalität an den ersten beiden Tagen zu einem leichten

Anstieg des täglichen Totenfalls. Die Differenzen zwischen Kontrollgruppe und

Versuchsgruppe an den einzelnen Tagen waren aber zu keinem Zeitpunkt signifikant

(N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test,

zweiseitig; Abb. 3.6). Zwischen Kontrollgruppe und Versuchsgruppe traten unter dem

Einfluss von Metarhizium anisopliae in der kumulierten prozentualen Mortalität über

den gesamten Versuchsverlauf nur geringe Unterschiede auf. Der

Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen (p > 0,05; χ2-Test,

zweiseitig).

Ergebnisse

55

Abbildung 3.6: Mortalität mit dem Pilz Metarhizium anisopliae behandelter Bienen je

Versuchsgruppe (50 Bienen, unten) und Tag und kumulierte prozentuale Mortalität (oben)

über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 50 Bienen. Unterschiede in der

Mortalität pro Tag sind nicht signifikant (p > 0,05; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen

differieren die Gesamtmortalitäten nicht signifikant voneinander (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

days post treatment Tage nach Behandlung

kum

uli

erte

Bie

nen

mo

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ität

B

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ort

alit

ät/V

ersu

chs

gru

pp

e

Versuchsgruppe Kontrolle Metarhizium anisopliae


n.s.

Ergebnisse

56


Mortalität

Unter dem Einfluss von Beauveria bassiana kam es nach einem sehr geringen

Bienentotenfall an den ersten beiden Tagen nach Dosisapplikation zu einer Zunahme

ab dem dritten Tag nach Behandlung. Signifikante Unterschiede zwischen den

beiden Versuchsgruppen traten am vierten und sechsten Tag nach Applikation auf:

An beiden Tagen kam es zu einem gegenüber der Kontrollgruppe erhöhten

Bienentotenfall in der mit Beauveria bassiana behandelten Gruppe (N pro

Versuchsgruppe = 50 Bienen; N gesamt = 60 Assays; p für Tag vier und Tag sechs

nach Behandlung < 0,05; *; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.7). Der erhöhte Bienentotenfall

in der mit dem entomopathogenen Pilz Beauveria bassiana behandelten Gruppe an

den Tagen vier und sechs spiegelt sich in einer deutlichen Divergenz der kumulierten

prozentualen Mortalitäten an diesen Tagen wieder. Infolgedessen lag die

Gesamtmortalität der Pilzgruppe zum Versuchsende zehn Tage nach Applikation

höchst signifikant über derjenigen der Kontrollgruppe (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

Ergebnisse

57

Abbildung 3.7: Mortalität mit dem Pilz Beauveria bassiana behandelter Bienen je

Versuchsgruppe (50 Bienen, unten) und Tag sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben)

über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 50 Bienen. Am vierten und sechsten

Tag nach Behandlung kam es zu einer signifikant erhöhten Bienensterblichkeit (p < 0,05; *; t-

Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen differieren die Gesamtmortalitäten höchst signifikant

voneinander (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

days post treatment


kum

uli

erte

Bie

nen

mo

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B

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enm

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rup

pe

Versuchsgruppe Kontrolle Beauveria bassiana


n.s. n.s. n.s. * *

Ergebnisse

58



Nach Applikation der Versuchsdosis des Pilzes Paecilomyces fumosoroseus kam es

nach einer sehr geringen Mortalität an den ersten beiden Tagen zu einer leichten

Zunahme des täglichen Totenfalls bis Tag sieben nach Behandlung; danach sank die

Mortalitätsrate wieder leicht. Die Differenzen zwischen Kontrollgruppe und der mit

Paecilomyces fumosoroseus behandelten Versuchsgruppe an den einzelnen Tagen

waren zu keinem Zeitpunkt signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen; N gesamt

= 60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.8). Ab Tag drei nach Applikation von

Konidiendosis beziehungsweise Kontrolllösung kam es zu einer leichten Divergenz

der kumulierten Mortalitäten zwischen Paecilomyces fumosoroseus- und

Kontrollgruppe; nach zehn Tagen wichen die kumulierten Mortalitäten höchst

signifikant voneinander ab (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

Ergebnisse

59

Abbildung 3.8: Mortalität mit dem Pilz Paecilomyces fumosoroseus behandelter Bienen je

Versuchsgruppe (50 Bienen, unten) und Tag sowie kumulierte prozentuale (oben) Mortalität

über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 50 Bienen. Unterschiede in der


differieren die Gesamtmortalitäten höchst signifikant voneinander (p < 0,001; χ2-Test,

zweiseitig).

kum

ulie

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Bie

nen

mo

rtal

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B

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ort

alit

ät/V

ersu

chsg

rup

pe

days post treatment

Versuchsgruppe Kontrolle Paecilomyces fumosoroseus


n.s.


Ergebnisse

60

3.4 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Milben

Ebenfalls im in vitro-Assay wurde untersucht, ob die applizierten single-bee-

Dosen Auswirkungen auf die Überlebensrate adulter Weibchen von Varroa

destructor in der phoretischen Phase haben: Pro Versuchsgruppe wurden je 50

Bienen aus Völkern, die unmittelbar zuvor eine Behandlung mit Varroaziden

durchlaufen hatten, aber rückstandsfrei waren, mit genau 25 Milben besetzt, die

direkt vor Versuchsbeginn aus hochbefallenen Völkern gewonnen wurden. Nach

Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Kontrolllösung wurde die

Milbenmortalität täglich erfasst. Im Folgenden sind die Ergebnisse für die vier

untersuchten Pilze aufgelöst nach Einzeltagen und kumulativ dargestellt.

3.4.1 Lecanicillium muscarium: Mortalität/Versuchsgruppe und


Nach Applikation der Versuchsdosis des Pilzes Lecanicillium muscarium stieg

die Mortalitätsrate zunächst an und erreichte Maxima an den Tagen drei und fünf

nach Behandlung mit einem Milbenfall von etwa vier Milben pro Assay und Tag.

Differenzen zwischen Kontrollgruppe und der mit Lecanicillium muscarium

behandelten Versuchsgruppe an den einzelnen Tagen waren zu keinem Zeitpunkt

signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen und 25 Milben; N gesamt = 60

Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.9). Zwischen Kontrollgruppe und

Versuchsgruppe traten unter dem Einfluss von Lecanicillium muscarium in der

kumulierten prozentualen Mortalität über den gesamten Versuchsverlauf nur geringe

Unterschiede an den Tagen drei und sechs/sieben auf. Der Intergruppenvergleich

zeigt zum Versuchsende keine signifikanten Differenzen (p > 0,05; χ2-Test,

zweiseitig).

Ergebnisse

61

Abbildung 3.9: Mortalität mit dem Pilz Lecanicillium muscarium behandelter Milben je

Versuchsgruppe und Tag (25 Milben, unten) sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben)

über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 25 Milben. Unterschiede in der



kum

ulie

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Milb

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ort

alit

ät

Milb

enm

ort

alit

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ersu

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rup

pe

days post treatment

n.s.




Ergebnisse

62


Mortalität

Die Mortalitätsrate unter dem Einfluss von Metarhizium anisopliae erreichte ihre

Maxima an den Tagen drei, fünf und sechs, bevor sie bis zum Ende der

Untersuchung zehn Tage nach Applikation kontinuierlich sank. Deutliche Differenzen

zwischen Kontrollgruppe und Pilzgruppe traten nicht auf; die Abweichungen der

Verteilungen an den Einzeltagen waren zu keinem Zeitpunkt des untersuchten

Zeitraums signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen und 25 Milben; N gesamt =

60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.10). Zu keinem Zeitpunkt des

Versuchs hatte der entomopathogene Pilz Metarhizium anisopliae einen Einfluss auf

die Mortalitätsrate der Pilzgruppe, der sich in einer deutlichen Divergenz der

kumulierten Mortalitäten widerspiegelte – zum Versuchsende traten keine

signifikanten Differenzen auf (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

Ergebnisse

63

Abbildung 3.10: Mortalität mit dem Pilz Metarhizium anisopliae behandelter Milben je





kum

ulie

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Milb

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Milb

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rup

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days post treatment

n.s.




Ergebnisse

64


Mortalität

Im Beauveria bassiana-Versuch stieg die Mortalitätsrate innerhalb der ersten

drei Versuchstage zunächst an, um dann wieder in etwa auf das Ausgangsniveau

abzusinken. An den Tagen fünf und sechs lag die Mortalitätsrate der Pilzgruppe über

der der Kontrollgruppe, an den Tagen sieben und zehn wies die Kontrollgruppe eine

erhöhte Mortalitätsrate auf – allerdings waren die Abweichungen der Verteilungen an

den Einzeltagen zu keinem Zeitpunkt des untersuchten Zeitraums signifikant (N pro

Versuchsgruppe = 50 Bienen und 25 Milben; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test,

zweiseitig; Abb. 3.11). Die voneinander abweichenden Verteilungen – auf nicht

signifikantem Niveau – der Mortalitätsraten von Pilz- und Kontrollgruppe in der

Betrachtung der Einzeltage des Beauveria bassiana-Versuchs führen zu einem

divergierenden Kurvenverlauf bei Auftragung der kumulierten Mortalitätsraten. Diese

wichen aber nach zehn Tagen nicht signifikant voneinander ab (p > 0,05; χ2-Test,

zweiseitig).

Ergebnisse

65

Abbildung 3.11: Mortalität mit dem Pilz Beauveria bassiana behandelter Milben je





kum

ulie

rte

Milb

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Milb

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ort

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rup

pe

days post treatment

n.s.




Ergebnisse

66



Zwischen Tag zwei und fünf lag die Mortalitätsrate im Paecilomyces

fumosoroseus-Versuch in beiden Gruppen bei etwa zwei Milben pro Tag;

Abweichungen der Verteilungen voneinander traten auf, waren aber zu keinem

Zeitpunkt des Versuchs signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen und 25

Milben; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.12). Bis Tag

sieben nach Behandlung kam es in der Untersuchung des entomopathogenen Pilzes

Paecilomyces fumosoroseus zu einem weitestgehend ähnlichen Verlauf der

kumulierten Mortalitäten. In der Folge divergierten die Kurven zwar, so dass in der

Summe zum Versuchsende die Mortalität der Pilzgruppe über derjenigen der

Kontrollgruppe lag, diese Differenz war allerdings nicht signifikant (p > 0,05; χ2-Test,

zweiseitig).

Ergebnisse

67

Abbildung 3.12: Mortalität mit dem Pilz Paecilomyces fumosoroseus behandelter Milben je





kum

ulie

rte

Milb

enm

ort

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ät

Milb

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ort

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ersu

chsg

rup

pe

days post treatment




n.s.

Ergebnisse

68

3.5 Pilzwachstum aus behandelten Milben

Um einen signifikanten Einfluss entomopathogener Pilze auf die Mortalität von

Varroa destructor im Laborassay verifizieren zu können, wurde untersucht, welche

Pilzwachstumsrate (Anteil Milben, aus denen ein Pilz wuchs) sich aus den im Milben-

in vitro-Versuch gestorbenen Milben erzielen ließ: Die in diesem Versuch

gestorbenen Milben wurden täglich abgesammelt, gepoolt und ein Aliquant kultiviert.

Im anschließenden Monitoring bis Tag 13 nach Behandlung wurde das tägliche

Pilzwachstum aus Einzelmilben erfasst; Einzelmilben, die Pilzwachstum zeigten,

wurden zur Verhinderung von Kreuzinfektionen steril entfernt. Im Folgenden sind die

Ergebnisse von Pilz- und Kontrollgruppe für den jeweiligen untersuchten Pilz

einander gegenübergestellt. Auf der Ordinate aufgetragen ist das kumulierte,

prozentuale Pilzwachstum in Prozent an den jeweiligen Tagen nach

Behandlungsbeginn, auf der Abszisse sind die Tage des Samplings der Milben

aufgetragen. Unterschiedliche Kreisgrößen geben das prozentuale Wachstum in

Prozent in sechs Kategorien wieder (0 - 5, 5 - 10, 10 - 15, 15 - 20, 20 - 25). Der

verstrichene Zeitraum bis zu einer Zunahme im Wachstum der jeweiligen

Einzelgruppe ergibt sich aus der Differenz von Ordinaten- und Abszissenbetrag.

3.5.1 Lecanicillium muscarium

In der Kultur der während der Versuchsdauer des Lecanicillium muscarium-

Versuchs gesammelten Milben setzte ein detektierbares Pilzwachstum in den

jeweiligen Tagesgruppen etwa vier bis fünf Tage nach dem Tod der Milben ein.

Erhöhte Wachstumsraten traten in der Kontrolle bei den an den Tagen fünf, sieben

und acht nach Versuchsbeginn gestorbenen Milben auf, in der Pilzgruppe an Tag

acht. Der Intergruppenvergleich dieser Tage zeigte aber keine signifikanten

Differenzen (N Kontrolle = 128, N Lecanicillium muscarium = 146; p für alle

Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig; Abb. 3.13).

Ergebnisse

69

3.5.2 Metarhizium anisopliae

Die Pilzgruppe der Kultur der während der Versuchsdauer des Metarhizium

anisopliae-Versuchs gesammelten Milben zeigte ein verstärktes Pilzwachstum bei

Milben, die am Tag der Behandlung sowie an den Tagen zwei und drei nach

Behandlung starben – das Wachstum setzte jeweils etwa vier Tage nach Milbenfall

ein. In der Kontrolle kam es in der Kohorte, die vier Tage nach Behandlung fiel,

ebenfalls vier Tage nach dem Milbenfall zu einem detektierbaren Wachstum. Der

Intergruppenvergleich über alle Tage zeigte aber keine signifikanten Differenzen (N

Kontrolle = 182, N Metarhizium anisopliae = 185; p für alle Vergleiche > 0,05, Fishers

Exact Test, zweiseitig; Abb. 3.14).

Abbildung 3.13: Kumuliertes prozentuales Pilzwachstum aus Milben, die während des

Lecanicillium muscarium-Versuchs starben. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten

Differenzen zwischen den Einzeltagen (N Kontrolle = 128, N Lecanicillium muscarium = 146; p

für alle Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig).

Milbenfall days post treatment Kontrolle

Milbenfall days post treatment Lecanicillium muscarium

days

pos

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ent

Milbenfall Tage nach BehandlungKontrolle

Milbenfall Tage nach Behandlung Lecanicillium muscarium

Tag

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lun

g

Ergebnisse

70

3.5.3 Beauveria bassiana

Ein deutlich verstärktes Pilzwachstum trat in der Kultur der während der

Versuchsdauer des Beauveria bassiana-Versuchs gesammelten Milben in beiden

Gruppen bei den direkt nach Behandlung gestorbenen Milben sowie in der Tag-

sieben-Kohorte der Beauveria bassiana-Gruppe auf. Es setzte zwei Tage nach dem

Fall der Milben der Tag-sieben-Kohorte und vier Tage nach Fall in der Tag-eins-

Kohorte ein. Während der Intergruppenvergleich aller anderen Tage keine

signifikanten Differenzen zeigte, kam es in der Tag-sieben-Kohorte in der Pilzgruppe

zu einem signifikant erhöhten Wachstum (N Kontrolle = 192, N Beauveria bassiana =

194; p für Tag sieben nach Behandlung < 0,05, p für alle anderen Vergleiche > 0,05,

Fishers Exact Test, zweiseitig; Abb. 3.15).

Abbildung 3.14: Kumuliertes prozentuales Pilzwachstum aus Milben, die während des Metarhizium

anisopliae-Versuchs starben. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen

zwischen den Einzeltagen (N Kontrolle = 182, N Metarhizium anisopliae = 185; p für alle Vergleiche

> 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig).


Milbenfall days post treatment Metarhizium anisopliae

days

pos

t tre

atm

ent


Milbenfall Tage nach Behandlung Metarhizium anisopliae

Tag

e n

ach

Beh

and

lun

g

Ergebnisse

71

3.5.4 Paecilomyces fumosoroseus

In der Kultur der während der Versuchsdauer des Paecilomyces fumosoroseus-

Versuchs gesammelten Milben setzte ein Pilzwachstum in den jeweiligen

Tagesgruppen etwa vier bis fünf Tage nach dem Tod der Milben ein. Erhöhte

Wachstumsraten traten in der Kontrolle bei den an Tag zwei, in der Pilzgruppe bei

den an den Tagen eins und zwei gestorbenen Milben auf. Die Differenzen zwischen

den jeweiligen Versuchsgruppenkohorten waren nicht signifikant (N Kontrolle = 171,

N Paecilomyces fumosoroseus = 182; p für alle Vergleiche > 0,05, Fishers Exact

Test, zweiseitig; Abb. 3.16).

Abbildung 3.15: Kumuliertes prozentuales Pilzwachstum aus Milben, die während des Beauveria

bassiana-Versuchs starben. Der Intergruppenvergleich zeigt für Tag sieben nach Behandlung eine

signifikante Differenz zwischen den Gruppen (N Kontrolle = 192, N Beauveria bassiana = 194; p für

Tag sieben nach Behandlung < 0,05, p für alle anderen Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test,

zweiseitig).


Milbenfall days post treatment Beauveria bassiana

days

pos

t tre

atm

ent

*


Milbenfall Tage nach Behandlung Beauveria bassiana

Tag

e n

ach

Beh

and

lun

g

Ergebnisse

72

3.6 Wirkung entomopathogener Pilze auf Adultbienen,

Bienenlarven und -puppen sowie Varroa destructor im

Halbfreilandversuch

Insbesondere bei staatenbildenden Insekten sind in vitro-Versuche hoch

artifiziell – eine Übertragbarkeit ihrer Schlussfolgerungen auf die Verhältnisse, wie

sie unter Freilandbedingungen innerhalb eines Staates vorkommen, ist deshalb nicht

ohne Weiteres möglich. Im Halbfreilandversuch wurde deshalb ergänzend zu den

Laborversuchen exemplarisch die Wirkung eines entomopathogenen Pilzes –

Lecanicillium muscarium – auf die Zahl adulter Bienen, Larvenstadien und Puppen

sowie die Abundanz von Varroa destructor analysiert. Der Versuch wurde an zehn in

Bezug auf Verwandtschaftsgrad und Alterstruktur der Einzelbienen sowie ihren Befall

mit Varroa destructor vereinheitlichten, je etwa 5500 Individuen starken Völkern

vorgenommen. Der Milbenfall wurde täglich, Bienenzahl und Zahl der Brutstadien

wurden zu Beginn und nach sieben, 14 und 17 Tagen erfasst.

Abbildung 3.16: Kumuliertes prozentuales Pilzwachstum aus Milben, die während des Paecilomyces

fumosoroseus-Versuchs starben. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen

zwischen den Einzeltagen (N Kontrolle = 171, N Paecilomyces fumosoroseus = 182; p für alle

Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig).


Milbenfall days post treatment Paecilomyces fumosoroseus

days

pos

t tre

atm

ent


Milbenfall Tage nach Behandlung Paecilomyces fumosoroseus

Tag

e n

ach

Beh

and

lun

g

Ergebnisse

73

3.6.1 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Bienen

pro Volk

Während des gesamten Versuchszeitraumes kam es zu einer kontinuierlichen

Abnahme der Bienenzahl von zunächst etwa 5500 Bienen pro Volk auf etwa 1000

Bienen pro Volk zum Versuchsende. Die Bienenzahl der Völker der Pilz- und der

Kontrollgruppe wichen dabei nicht signifikant voneinander ab (N Kontrolle/Pilzgruppe

= je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb.

3.17).

Abbildung 3.17: Veränderung der Bienenzahl pro Volk der Pilz- und der Kontrollgruppe nach

Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Erntelösung über den Versuchszeitraum von

17 Tagen. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen an den Einzeltagen (N

Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig).

n.s. n.s. n.s. n.s.


An

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l Bie

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Ergebnisse

74

3.6.2 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Larven

pro Volk

Die Völker verfügten sieben Tage nach Applikation von Konidiensuspension

beziehungsweise Erntelösung über ein maximal etwa 1500 Zellen umfassendes

Brutnest, das in der Folge auf etwa 300 Zellen pro Volk schwand. Differenzen in der

Zahl der Brutzellen zwischen den beiden untersuchten Gruppen waren nicht

signifikant (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle

Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.18).

Abbildung 3.18: Veränderung der Zahl der Brutzellen (L1 - L5-Stadium) pro Volk der Pilz- und der

Kontrollgruppe nach Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Erntelösung über den

Versuchszeitraum von 17 Tagen. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen an

den Einzeltagen (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05,

t-Test, zweiseitig).

n.s. n.s. n.s. n.s.


Lar

ven

(L1

– L5

)/Vo

lk


Ergebnisse

75

3.6.3 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Puppen

pro Volk

14 Tage nach Versuchsbeginn wurden in den Völkern je etwa 350 verdeckelte

Brutzellen registriert; diese Zahl stieg zum Versuchsende nur noch leicht. Es kam

nicht zu einer signifikanten Differenz der Zahl verdeckelter Zellen zwischen Pilz- und

Kontrollgruppe (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle

Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.19).

Abbildung 3.19: Veränderung der Anzahl verdeckelter Brutzellen pro Volk der Pilz- und der

Kontrollgruppe nach Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Erntelösung über den

Versuchszeitraum von 17 Tagen. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen

an den Einzeltagen (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche

> 0,05, t-Test, zweiseitig).

n.s. n.s. n.s. n.s. Versuchsgruppe

Kontrolle Lecanicillium muscarium

Anz

ahl P

upp

en/V

olk


Ergebnisse

76

3.6.4 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenfall pro Tag

und Volk

Um Aussagen zu einem eventuellen Einfluss von Lecanicillium muscarium auf

die in den Völkern befindlichen Milben treffen zu können, wurde der Milbenfall täglich

erfasst. Dazu wurde unter das Gitter des Bodens eine passgenaue, mit Pflanzenöl

gefüllte Wanne geschoben, das eine Migration gefallener, aber noch lebender Milben

ebenso wie das Absammeln der Milben durch fouragierende Ameisen oder ein

Verwehen durch Wind verhinderte. Die gestorbenen Milben wurden täglich erfasst

und anschließend entfernt.

Zu Versuchsbeginn lag die Rate bei etwa 18 Milben pro Tag und Volk, fiel dann

an Tag zwei auf etwa 10 Milben, um anschließend wieder auf den Ausgangswert zu

steigen. Nach sieben Tagen sank der tägliche Milbenfall kontinuierlich in beiden

Gruppen auf unter 10 Milben pro Tag und Volk. Zwischen den Gruppen auftretende

Differenzen waren an den jeweiligen Tagen nicht signifikant (N Kontrolle/Pilzgruppe =

je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb.

3.20).

Abb. 3.20: Täglicher Milbenfall pro Volk über den gesamten Versuchszeitraum.

Intergruppendifferenzen an den jeweiligen Einzeltagen waren nicht signifikant (N Kontrolle/Pilzgruppe

= je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig).

n.s.


Milb

enfa

ll/T

agxV

olk


Ergebnisse

77


adulter Bienen

Zur Ergänzung des Milbenfallmonitorings wurde zum Versuchsende der

Milbenbefall adulter Bienen erfasst: Alle Bienen, die sich 17 Tage nach Applikation

von Pilzsuspension und Kontrolllösung noch in den Völkern befanden, wurden

gesammelt, getötet und durch Waschen mit einer detergenshaltigen Waschlösung

von den aufsitzenden Milben befreit. Die abgelösten Milben wurden anschließen in

geeigneten Sieben aufgefangen und ebenso wie die Bienen einzeln gezählt. Der

Endbefall der adulten Bienen lag bei etwa 12 Prozent – signifikante Unterschiede

zwischen den Gruppen traten nicht auf (N Lecanicillium muscarium = 3812, N

Kontrolle = 3125; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.21).

Abb. 3.21: Endbefall der adulten Bienen (prozentual) zum Versuchsende.

Signifikante Unterschiede zwischen Pilz- und Kontrollgruppe traten nicht auf (N

Lecanicillium muscarium = 3812, N Kontrolle = 3125; p für alle Vergleiche >

0,05, t-Test, zweiseitig).

n.s.

Lecanicillium muscarium Kontrolle

En

db

efal

l Bie

nen

Ergebnisse

78


verdeckelter Brut

Ebenfalls durch Auswaschen und Einzelauszählung wurde der Milbenendbefall

der verdeckelten Brut ermittelt: Zunächst wurden die verdeckelten Brutzellen gezählt,

nach Einfrieren entdeckelt und die in ihnen befindlichen Milben und Puppen mit

einem scharfen Wasserstrahl ausgespült. Sowohl in der Pilz- als auch in der

Kontrollgruppe waren etwa 20 Prozent der Zellen befallen – signifikante

Unterschiede zwischen beiden Gruppen traten nicht auf (N Lecanicillium muscarium

= 1802, N Kontrolle = 2127; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb.

3.22).

Abb. 3.22: Endbefall der verdeckelten Brut (prozentual) zum Versuchsende.

Signifikante Unterschiede zwischen Pilz- und Kontrollgruppe traten nicht auf (N

Lecanicillium muscarium = 1802, N Kontrolle = 2127; p für alle Vergleiche >

0,05, t-Test, zweiseitig).

Lecanicillium muscarium Kontrolle

En

db

efal

l Bie

nen

n.s.

Ergebnisse

79

3.7 Subletale Effekte entomopathogener Pilze auf Adultbienen

Die in vitro-Versuche konnten erfassen, ob es zu einer erhöhten Mortalitätsrate

kam oder nicht – sie lieferten aber keine Erklärung, warum es zu einer solchen

Erhöhung kam und ob es eventuell weitere, subletale Effekte gab, die für eine

potentielle Anwendung von Bedeutung sind.

Um Hinweise zu erhalten, ob entomopathogene Pilze subletale Auswirkungen

auf Honigbienen haben könnten, wurden mit Pilzsporen beziehungsweise nur mit

einer Kontrolllösung behandelte Gruppen in Bezug auf ihre Futteraufnahme pro

Zeiteinheit als mögliches Indiz zum Beispiel einer Schädigung des Darmkanals,

sowie in Bezug auf ihr Lernvermögen als mögliches Indiz für eine Beeinträchtigung

wichtiger sozialer und räumlicher Orientierungskomponenten untersucht. Im

Folgenden werden die jeweiligen Ansätze kurz erläutert, bevor die Ergebnisse

beschrieben werden.

3.7.1 Ernährungszustand im Langzeit-in-vitro-Assay

In klassischen PER-Dressuren werden die Bienen den Völkern wenige Stunden

vor Versuchsbeginn entnommen – naturgemäß ist das in einem Versuch, der über

einen Zeitraum von 12 Tagen potentielle subletale Langzeiteffekte einer Behandlung

mit entomopathogenen Pilzen aufdecken soll, nicht möglich. Das sich daraus

ergebende Problem besteht in einem im Vergleich zur dem Volk direkt entnommenen

Biene a priori nicht kalkulierbaren Sättigungszustand der in vitro ad libitum mit Futter

versorgten Bienen, da Langzeit-PER-Versuche mit gekäfigten Bienen nie zuvor

etabliert worden sind. Das Hungern der Einzelbiene ist aber Voraussetzung für ein

Gelingen des Versuchs. In Vorserien hatte sich gezeigt, dass es starke

Schwankungen bezüglich der nötigen Dauer der Hungerphase gab: Beobachtet

wurden Hungerphasen von mehr als 12 Stunden, die nötig waren, um Bienen zur

Versuchsteilnahme zu bewegen, aber auch eine Mortalitätsrate von über 50 Prozent

nach einer Hungerphase von nur einer halben Stunde. Zunächst wurde deshalb

untersucht, ob über den Versuchszeitraum Veränderungen im Honigblasengewicht

und damit im Ernährungszustand auftraten, die eine Kalkulation der nötigen Dauer

Ergebnisse

80

des Futterentzugs ermöglichten. Dazu wurden Bienen, denen Futter ad libitum zur

Verfügung stand, getötet, die Honigblasen präparativ entnommen und gewogen.

Der zeitliche Verlauf der in Kategorien zusammengefassten Ergebnisse zeigt

eine deutliche Abnahme des Honigblasengewichts mit Futter ad libitum versorgter

Bienen von etwa 10 mg auf deutlich unter 5 mg – diese Abnahme korrelierte mit

einer beobachten Zunahme des Kotblasenvolumens mit zunehmender

Versuchsdauer und der Beobachtung, dass es während der gesamten

Versuchsdauer nicht zum Absetzen von Kot in den Hälterungskäfigen kam. Die

Differenz zwischen erster und dritter Kategorie war hochsignifikant (p < 0,001), die

Differenzen zwischen erster und zweiter beziehungsweise zweiter und dritter

Kategorie waren nicht signifikant, aber dicht an der Signifikanzgrenze (p > 0,05, N je

Kategorie = 18, ONEWAY ANOVA; Abb. 3.23).

3.7.2 Nahrungsaufnahme im Langzeit-in-vitro-Assay

Um Aussagen zu der Frage gewinnen zu können, ob die Applikation von

Konidien eines entomopathogenen Pilzes in vitro einen Einfluss auf die täglich von

Abb. 3.23: Veränderung des Honigblasengewichts im Untersuchungszeitraum.

Einteilung in Kategorien von vier beziehungsweise fünf Tagen. Über den

Gesamtzeitraum nahm das Honigblasengewicht höchst signifikant auf unter 5 mg

ab (N je Kategorie = 18, p Kategorie 1 - 3 < 0,001, p Kategorie 1 - 2, 2 - 3 > 0,05,

ONEWAY ANOVA).

b ab a

days post treatment

Ho

nig

bla

sen

gew

ich

t in

mg


Ergebnisse

81

Bienen verbrauchte Futtermenge hat, und um Richtwerte für ein zielgenaues Timing

des Futterentzugs vor Beginn der PER-Dressur in Abhängigkeit vom zu erwartenden

Ernährungszustand zu erhalten, wurden die Futterverbräuche von Pilz- und

Kontrollgruppe an den Einzeltagen erfasst und miteinander verglichen. Futter stand

den Bienen ad libitum in Laborspritzen zur Verfügung, der Verbrauch wurde über

stundengenaue Entnahme und Wiegen der Spritzen vor dem Wiederauffüllen

ermittelt.

Der Futterverbrauch pro Stunde und Biene lag über den gesamten

Versuchszeitraum bei etwa 0,002 ml. Zwischen Pilz- und Kontrollgruppe und

zwischen den Einzeltagen traten keine signifikanten Differenzen auf (N = 251; p für

alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.24).

Abb. 3.24: Futterverbrauch von Pilz- und Kontrollgruppe in ml pro Biene und Stunde an den

jeweiligen Einzeltagen. Zwischen den Gruppen und im Intertagesvergleich traten keine

signifikanten Differenzen auf (N = 251, p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig).

days post treatment

Ver

bra

uch

ml/h

xBie

ne

n.s.



Ergebnisse

82

3.7.3 Lernleistung von Adultbienen im PER-Assay

Zur Analyse potentieller Effekte eines entomopathogenen Pilzes auf das

Lernvermögen von Honigbienen wurde ein Langzeit-PER-Assay verwendet. Das

Lernen von Honigbienen im PER-Assay folgt dabei den Regeln von klassischer und

instrumenteller Konditionierung. Die Versuchsbienen wurden mit einem Duft als

unkonditioniertem Reiz konfrontiert, dem ein Kontaktieren von 2M Zuckerlösung mit

den Antennen und anschließendes Trinkenlassen folgte. Während der

Konditionierungsphase wurde dann der ursprünglich neutrale Duftreiz mit dem

unbedingten Reiz assoziiert, so dass bei erfolgreichem Lernen auf die Duftgabe ein

Herausstrecken des Rüssels folgte.

Über die insgesamt vier Lernakte des Tests kam es zu einer linearen Zunahme

der positiven Antworten (in Prozent der Gesamtantworten) von null im ersten Lernakt

auf etwa 50 Prozent im vierten Lernakt beider Gruppen. Die Ergebnisse der

Einzelakte differierten signifikant bis höchst signifikant voneinander, während

zwischen den Versuchsgruppen keine signifikanten Unterschiede auftraten. (N

Kontrolle = 107, N Pilz = 110; p für alle Vergleiche innerhalb eines Lernaktes > 0,05,

p b - c < 0.05, p c - d < 0,01, p b - d < 0,001, p a - (b/c/d) < 0,001, χ2-Test, zweiseitig;

Abb. 3.25).

Ergebnisse

83

Abb. 3.25: Lernerfolg aller am Test beteiligten Bienen der Pilz- und Kontrollgruppen über vier

Lernakte. Unterschiede zwischen den Lernakten waren signifikant bis höchstsignifikant (N Kontrolle

= 107, N Pilz = 110; p b - c < 0.05, p c - d < 0,01, p b - d < 0,001, p a - (b/c/d) < 0,001), zwischen

Pilz- und Kontrollgruppe traten innerhalb eines Lernaktes keine signifikanten Unterschiede auf (p >

0,05, χ2-Test, zweiseitig).


Lernakt

pos

itive

Ant

wo

rten

in P

roze

nt

a a

b b

c

c

d d

Lernakt

Ergebnisse

84

3.7.4 Diskriminationsfähigkeit von Adultbienen im Langzeit-PER-Assay

In der Langzeit-PER-Dressur erfolgte die Untersuchung eines möglichen

Einflusses von Lecanicillium muscarium auf das Lernvermögen adulter Honigbienen

über insgesamt 20 Tests je Einzelbiene: Je achtmal wurde die Reaktion auf den

konditionierten Reiz (Geraniol) im Wechsel mit einem Vergleichsduft (Citral),

unterbrochen von zwei Kontrolldurchgängen nach den Durchgängen zwei und fünf, in

denen eine potentielle Reaktion auf zugeströmte Luft ohne Test- oder

Vergleichssubstanz getestet wurde, analysiert. Verglichen wurden Bienen der Pilz-

und der Kontrollgruppe, getestet wurde über einen Zeitraum von 12 Tagen in drei

Wiederholungen. Bienen, die keine Reaktionen mehr zeigten oder auf Luft

reagierten, wurden ausgeschlossen.

Im Folgenden sind – als Maßstab der Diskriminationsfähigkeit – die

prozentualen Antwortdifferenzen von Pilz- und Kontrollgruppe einander

gegenübergestellt. Unter prozentualer Antwortdifferenz wird die Differenz zwischen

gegebenen positiven Antworten auf die Testsubstanz in Prozent und gegebenen

positiven Antworten auf die Vergleichssubstanz in Prozent verstanden.

Die Antwortdifferenzen schwankten in der Pilzgruppe zwischen 16,7 Prozent

und 37,5 Prozent, in der Kontrollgruppe zwischen 25,0 Prozent und 39,2 Prozent.

Von einem Versuchsintervall abgesehen (Tage acht und neun nach Applikation von

Lecanicillium muscarium beziehungsweise Kontrolllösung) lag die Antwortdifferenz

der Kontrollgruppe immer über derjenigen der Pilzgruppe. In den Intervallen vier,

sechs, acht, zehn und zwölf waren die Intergruppendifferenzen nicht signifikant

voneinander verschieden (p > 0,05, χ2-Test, zweiseitig), im Intervall eins allerdings

kam es zu einem hoch signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen, i.e.,

unter dem Einfluss von Lecanicillium muscarium lernten Honigbienen in der PER-

Dressur signifikant schlechter, zwischen Test- und Vergleichssubstanz zu

unterscheiden (N Kontrolle = 107, N Pilz = 110; p Intervalle 4 - 12 > 0,05, p Intervall 2

< 0,01, χ2-Test, zweiseitig; Abb. 3.26).

Ergebnisse

85

Abb. 3.26: Prozentuale Antwortdifferenz innerhalb der Kontroll- und Pilzgruppe über einen

Zeitraum von 12 Tagen in Zweitagesintervallen. Die Differenz lag in der Kontrollgruppe mit

Ausnahme des vierten Intervalls stets über der der Pilzgruppe, die Intergruppendifferenzen der

Intervalle zwei, drei, vier, fünf und sechs wichen aber nicht signifikant voneinander ab (p >

0,05, χ2-Test, zweiseitig). Im ersten Intervall kam es dagegen zu einer hochsignifikanten

Intergruppendifferenz: Unter dem Einfluss von Lecanicillium muscarium lernten die Bienen

deutlich schlechter (N Kontrolle = 107, N Pilz = 110; p < 0,01, **, χ2-Test, zweiseitig).

day

s p

ost

trea

tmen

t

Antwortdifferenz Testsubstanz -Vergleichssubstanz

Kontrolle Lecanicillium muscarium

**

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

Tag

e n

ach

Beh

and

lun

g

Ergebnisse

86

3.7.5 Einfluss entomopathogener Pilze auf das Immunsystem von

Adultbienen

Für entomopathogene Pilze kann angenommen werden, dass sie unter

Umständen auch Nichtzielorganismen in einer Weise schädigen, die über den

Nachweis der Induktion einer Immunantwort belegbar ist. Eine solche Immunantwort

wiederum könnte zum Beispiel mit einem reduzierten Kognitionsvermögen

korrelieren. Um Hinweise auf diesen denkbaren Zusammenhang zu erhalten, wurden

immunisierte beziehungsweise Kontrollbienen einem sensitiven Immunassay

unterzogen, der Aufschlüsse über eine potentielle Immunantwort geben konnte. Der

Nachweis einer Aktivierung der IMD- oder Toll-Kaskade erfolgt dabei über eine

Suppression des Wachstums mit Hämolymphe behandelter Bienen inkubierter

Bakterien (Müller et al. 2008). Es wurden Versuchsgruppen gebildet, die entweder

mit Konidien von Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae, Beauveria

bassiana, Paecilomyces fumosoroseus, beziehungsweise als Kontrolle mit Sporen

von Saccharomyces cerevisiae oder konidienfreier Erntelösung besprüht wurden.

Den Bienen einer weiteren Gruppe wurde zu Versuchsbeginn jeweils ein Bein

amputiert, um eine obligate Immunantwort zu initiieren. 24 Stunden später wurde den

Bienen nach Betäubung Hämolymphe entnommen, die mit je einer Grampositiven

und einer Gramnegativen Bakterienkultur in der log-Phase in einer

Verdünnungsreihe über sieben Potenzen inkubiert und dann auf Nährmedium

ausplattiert wurde. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Zahl kolonieformender

Einheiten (colony forming units, cfu) als Maßstab für eine eventuell induzierte

Immunantwort erfasst.

Die Ergebnisse der Gruppe amputierter Bienen und der Bakterienkulturen, die –

ohne Hämolymphzusatz – nur mit einer Aprotinin-Phenylthioharnstoff-Lösung

beziehungsweise Streptomycinlösung versetzt wurden, validierten die Methodik der

Untersuchung.

Im vergleichenden Versuch mit dem Grampositiven Bakterium Bacillus subtilis

zeigte sich eine gegenüber Saccharomyces cerevisiae und der Erntelösung um

nahezu 90 Prozent verringerte Zahl kolonieformender Einheiten im Lecanicillium

muscarium-, Metarhizium anisopliae-, und Beauveria bassiana-Ansatz. Im

Paecilomyces fumosoroseus-Ansatz kam es zu keiner Reduktion (Abb. 3.27).

Ergebnisse

87

020406080

100120140160180200

Beauv

eria b

assia

na

Paecil

omyc

es fu

mos

orose

us

Met

arhizi

um a

nisopli

ae

Leca

nicilliu

m mus

cariu

m

Sacch

arom

yces

cere

visia

e

ampu

tiert

Aprotin

in + P

henylt

hioha

rnsto

ff

Strept

omyc

in

Negativ

kont

rolle

cfu*

10^-

8/m

l

Die Untersuchung mit dem Gramnegativen Bakterium Escherichia coli B (DSM

613) bestätigte zunächst im „Amputations-“, Aprotinin/Phenylthioharnstoff-,

Streptomycin- und Negativkontrollansatz die Ergebnisse des Bacillus subtilis-

Versuchs. Gegenüber Saccharomyces cerevisiae war die Zahl kolonieformender

Einheiten um 90 (Beauveria bassiana, Lecanicillium muscarium) bis 97 Prozent

(Metarhizium anisopliae) reduziert, in der Paecilomyces fumosoroseus-Gruppe kam

es zu einer Minderung von 78 Prozent (Abb. 3.28).

Abb. 3.27: Anzahl der in einer mit Hämolymphe inkubierten Kultur von Bacillus subtilis

gebildeten kolonieformenden Einheiten (cfu) in Abhängigkeit von der Behandlung der

Bienen. Bei „Aprotinin + Phenylthioharnstoff“ und „Streptomycin“ handelt es sich um

Kontrollen, die nicht Bestandteil einer differenzierenden Behandlung waren. Im

Vergleich zur Saccharomyces cerevisiae-Gruppe trat eine deutliche cfu-Reduktion bei

Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae und Beauveria bassiana auf.

Ergebnisse

88

3.8 Sreening ausgewählter Völker auf potentiell spezifische

varroapathogene Pilze

Eine maximale Wirtsspezifität ist von zentraler Bedeutung für die Eignung eines

antagonistischen, hyperparasitären Pilz, der keine oder zumindest möglichst geringe

Seiteneffekte in Bezug auf Nichtzielorganismen zeigen sollte. Potentiell spezifische

Abb. 3.28: Anzahl der in einer mit Hämolymphe inkubierten Kultur von Escherichia coli

B gebildeten kolonieformenden Einheiten (cfu) in Abhängigkeit von der Behandlung

der Bienen. Bei „Aprotinin + Phenylthioharnstoff“ und „Streptomycin“ handelt es sich

um Kontrollen, die nicht Bestandteil einer differenzierenden Behandlung waren. Im

Vergleich zur Saccharomyces cerevisiae-Gruppe trat eine deutliche cfu-Reduktion bei

Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus und

Beauveria bassiana auf.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Beauv

eria b

assia

na

Paecil

omyc

es fu

mos

orose

us

Met

arhizi

um a

nisopli

ae

Leca

nicilliu

m mus

cariu

m

Sacch

arom

yces

cere

visia

e

ampu

tiert

Aprotin

in + P

henylt

hioha

rnsto

ff

Strept

omyc

in

Negativ

kont

rolle

cfu*

10^-

8/m

l

Ergebnisse

89

Hyperparasiten zu finden, die möglicherweise als Antagonisten von Varroa destructor

geeignet sind, war deshalb eines der Hauptziele der vorliegenden Untersuchung.

Dazu wurden über insgesamt vier Jahre (2005 - 2008) sämtliche

Versuchsvölker einem Monitoring von Populationsdynamik und Varroabefall

unterzogen. Repräsentative Völker dieses Monitorings (i.e. Völker, die einen sehr

hohen, sehr niedrigen oder durchschnittlichen Milbenbefall aufwiesen) wurden

daraufhin ausgewählt und zusätzlich auf das aus gestorbenen Milben aus diesen

Völkern erfolgende Pilzwachstum untersucht, um mögliche Korrelationen zwischen

Milbenbefall und anteiligem Pilzwachstum zu finden, ohne zunächst die Art beteiligter

Pilze zu berücksichtigen.

Im Anschluss daran wurden im Screening gefundene Pilze isoliert, in Reinkultur

genommen, mikroskopisch typisiert und auf der Basis ihrer Sequenzdaten

identifiziert. Im Folgenden werden die jeweiligen Ansätze kurz erläutert, bevor die

Ergebnisse beschrieben werden.

3.8.1 Populationsdynamik und Milbenbefall von Apis mellifera-Völkern

Die Auswahl von Kandidatenvölkern erfolgte von 2005 - 2008 auf der Basis von

Populationsschätzungsdaten und der Erfassung des Milbenfalls als repräsentativen

Maßstabes für den Befall eines Volkes mit Milben. 2005 wurden 12, 2006 55, 2007

81 und 2008 67 Völker in die Untersuchung einbezogen. Die Bienenzahl wurde

während des jeweiligen Sommerhalbjahres in vierwöchigen Abständen insgesamt

fünfmal erfasst. Der Milbenfall wurde für jedes Volk während des

Untersuchungszeitraums an 21 Terminen mit einer untergeschobenen

Kunststoffwanne ermittelt. Die Abbildungen 3.29 und 3.30 zeigen exemplarisch den

Verlauf der Populationsdynamik und des Milbenfalls für sechs untersuchte Völker.

Trotz ähnlicher Entwicklungen in Bezug auf die Bienenzahl kam es bei ansonsten

gleichen Ausgangsbedingungen und gleicher Behandlung der Völker im

Jahresverlauf zu sehr unterschiedlichen Befallsgraden mit Varroa destructor, die vor

dem Hintergrund der Annahme einer Beteiligung pathogener Pilze an der Mortalität

von Milben als Hinweis darauf gedeutet wurden.

Ergebnisse

90

Volk 19

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Bie

nen

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Milbenfa

ll/Tag

Anzahl Bienen

Milbenfall/Tag Volk 19

Volk 18

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Bie

nen

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Milbenfa

ll/T

ag

Anzahl Bienen


Volk 14

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Bie

nen

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Milbenfa

ll/T

ag

Anzahl Bienen


Abb. 3.29: Entwicklung der Bienenanzahl und des täglichen Milbenfalls von drei

exemplarisch ausgewählten Völkern über einen Zeitraum von etwa 150 Tagen. In allen

Fällen handelte es sich um im Vorjahr gebildete Völker, die gleichartig geführt wurden.

Auch bei ähnlicher Entwicklung der Bienenzahl im Jahresverlauf kam es zu sehr

unterschiedlichen Entwicklungen des Varroabefalls.

Ergebnisse

91

Abb. 3.30: Entwicklung der Bienenanzahl und des täglichen Milbenfalls von drei

exemplarisch ausgewählten Völkern über einen Zeitraum von etwa 150 Tagen. In allen

Fällen handelte es sich um im Vorjahr gebildete Völker, die gleichartig geführt wurden.

Auch bei ähnlicher Entwicklung der Bienenzahl im Jahresverlauf kam es zu sehr

unterschiedlichen Entwicklungen des Varroabefalls.

Volk 21

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Bie

nen

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Milben

fall/T

ag

Anzahl Bienen


Volk 5

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Bie

nen

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Milb

enfa

ll/Tag

Anzahl Bienen


Volk 4

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Bie

nen

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Milb

enfa

ll/Tag

Anzahl Bienen


Milb

enfa

ll/T

ag

Milb

enfa

ll/T

ag

Milb

enfa

ll/T

ag

Bie

nen

B

ien

en

Bie

nen

Monat

Ergebnisse

92

3.8.2 Korrelation der Abundanz von Varroa destructor in Bienenvölkern

und des Pilzwachstums aus Milben

Auf der Basis des jährlichen Monitorings der Versuchsvölker wurden zur

Untersuchung einer eventuellen Korrelation von Milbenbefall und Vorkommen von

Pilzen Völker ausgewählt, deren Milbentotenfall in Bezug auf die Erzielbarkeit eines

Pilzwachstums in vitro untersucht wurde. Dazu wurden täglich über einen Zeitraum

von bis zu zwei Wochen pro Volk die in die Auffangwanne gefallenen Milben

gesammelt, oberflächensterilisiert und unter sterilen Bedingungen auf H2O-Agar

kultiviert. In der Folge wurde das aus diesen Milben erfolgte Pilzwachstum registriert.

Da der Einschub der Schubladen über bis zu zwei Wochen bedingte, dass es zur

Verschleppung von Milben durch fouragierende Ameisen kam, konnte nicht

gleichzeitig der Befall des Volkes über den Milbentotenfall in der Auffangwanne

erfasst werden. Allen Völkern wurden deshalb Proben von etwa 1000 adulten Bienen

entnommen, die exakt ausgezählt und deren aufsitzende Milben nach Abwaschen

mit einer Detergenslösung und Absieben ebenfalls erfasst wurden.

Im Folgenden sind die Ergebnisse für die Zusammenhänge zwischen

Milbenbefall pro Biene und anteiligem Pilzwachstum zunächst getrennt für die Jahre

2005 (Abb. 3.31, N = fünf Völker), 2006 (Abb. 3.32, N = 19 Völker), 2007 (Abb. 3.33,

N = 16 Völker) und 2008 (Abb. 3.34, N = 17 Völker), im Anschluss daran in einer

Übersicht (Abb. 3.35, N Gesamt = 57 Völker) dargestellt. Das Quadrat des

Korrelationskoeffizienten nach Pearson ist in der jeweiligen Grafik angegeben.

Für 2005, 2006 und 2008 zeigt sich ein Zusammenhang zwischen Milbenbefall

und Pilzwachstum – im Jahr 2007 gibt es einen solchen Zusammenhang nicht. Für

die Jahre 2005 und 2008 ist die Korrelation – für 2005 allerdings vor dem

Hintergrund eines geringen Stichprobenumfangs – mit mittlerer Güte belegt, in 2006

zeigte sich eine sehr starke Korrelation der beiden Variablen.

Ergebnisse

93

Abb. 3.32: Zusammenhang zwischen Bienenbefall mit Milben (Milben pro 100 Bienen) und anteiligem

Pilzwachstum (Anzahl aus 100 Milben gewachsener Pilze) für das Jahr 2006. Mit zunehmendem

Milbenbefall nahm das anteilige Pilzwachstum ab (N = 19, Pearson-Korrelation, R2=0,745).



Milbenbefall nahm das anteilige Pilzwachstum ab (N = fünf, Pearson-Korrelation, R2=0,408).

Ergebnisse

94


Pilzwachstum (Anzahl aus 100 Milben gewachsener Pilze) für das Jahr 2007. Eine Korrelation der

beiden Variablen trat nicht auf (N = 16, Pearson-Korrelation, R2=0,004).



Milbenbefall nahm das anteilige Pilzwachstum ab (N = 17, Pearson-Korrelation, R2=0,466).

Ergebnisse

95

3.8.3 Spektrum identifizierter Spezies im Pilzscreening

In der Untersuchung eventueller Korrelationen zwischen dem Milbenbefall von

Bienenvölkern und dem Vorkommen von Pilzen in ihnen, i.e. in den Milben, stand die

phylogenetische Zugehörigkeit der Pilze zunächst nicht im Fokus. In einer weiteren

Analyse wurden deshalb die gefundenen Pilze typisiert, um Aussagen zur Häufigkeit

verschiedener Pilzgruppen treffen zu können und potentielle Antagonisten von

Varroa destructor zu identifizieren.

Im Screening Pilzwachstum zeigende Milben wurden zu diesem Zweck entfernt

und die aus ihnen gewachsenen Pilze über mehrere Stufen auf MEA-Agarplatten

isoliert.

Abb. 3.35: Übersicht des Zusammenhangs zwischen Bienenbefall mit Milben (Milben pro 100 Bienen)

und anteiligem Pilzwachstum (Anzahl aus 100 Milben gewachsener Pilze) für die Jahre 2005 – 2008.

Mit zunehmendem Milbenbefall nahm das anteilige Pilzwachstum ab (N Gesamt = 57, Pearson-

Korrelation, R2=0,289). Pfeile markieren die Völker, in denen potentiell milbenpathogene Pilze

gefunden wurden (siehe Kapitel 3.8.3).

Ergebnisse

96

Anschließend erfolgte durch Anfertigung von Lactophenolblaupräparaten eine

mikroskopische Typisierung und nach Überführung in Flüssigkulturen, DNA-

Extraktion, sowie Amplifikation der ITS-Regionen der rDNA mit folgender

Sequenzierung und Abgleich (FASTA) mit der EMBL Nucleotide Sequence Database

(EMBL Fungi, Stand Juni 2009) eine Einordnung auf Basis der Sequenzdaten

(Tabelle 3.1).

Isolat Spezies/EMBL Länge (bp)

Ähnlichkeit zu publizierten Sequenzen

Referenz

MH 01 Cladosporium sp. 8506 556 98,7 % EM_FUN:EF120425 MH 02 Penicillium echinulatum RAPER AND THOM 592 99,5 % EM_FUN:EU128595 MH 03 Penicillium corylophilum DIERCKX 589 98,6 % EM_FUN:AF033450 MH 04 Penicillium corylophilum 592 98,3 % EM_FUN:AY373906 MH 05 Penicillium citreonigrum DIERCKX 590 98,3 % EM_FUN:AY373908 MH 06 Cladosporium sp. 8506 545 99,0 % EM_FUN:EF120425 MH 07 Cladosporium cladosporioides DE VRIES 548 97,8 % EM_FUN:EU301112 MH 08 Cladosporium cladosporioides 560 98,7 % EM_FUN:AY251074 MH 09 Cladosporium cladosporioides 560 99,5 % EM_FUN:AJ876482 MH 10 Cladosporium cladosporioides 548 99,8 % EM_FUN:EF151439 MH 11 Cladosporium cladosporioides 557 99,5 % EM_FUN:EF405864 MH 12 Penicillium adametzioides ABE 586 99,6 % EM_FUN:AF033403 MH 13 Cladosporium oxysporum BERKELEY AND CURTIS 557 99,8 % EM_FUN:EF136374 MH 14 Simplicillium lamellicola ZARE AND GAMS 611 99,7 % EM_FUN:AF108480 MH 15 Cladosporium cladosporioides 550 99,6 % EM_FUN:AY251074 MH 16 Penicillium brevicompactum DIERCKX 560 99,8 % EM_FUN:AF521657 MH 17 Eupenicillium tularense PADEN 588 96,3 % EM_FUN:AF033487 MH 18 Cladosporium cladosporioides 534 97,8 % EM_FUN:AY251074 MH 19 Cladosporium sp. 8506 555 99,1 % EM_FUN:EF120425 MH 20 Cladosporium cladosporioides 544 99,6 % EM_FUN:EU272532 MH 21 Phlebiella christiansenii LARSSON AND HJORTSTAM 575 98,6 % EM_FUN:EU118659 MH 22 Penicillium corylophilum 589 100,0 % EM_FUN:AF034456 MH 23 Cladosporium cladosporioides 545 98,2 % EM_FUN:AF455519 MH 24 Penicillium brevicompactum 586 99,5 % EM_FUN:EF634407 MH 25 Cladosporium cladosporioides 556 98,5 % EM_FUN:AY251074 MH 26 Cladosporium sp. 8506 556 99,3 % EM_FUN:EF120425 MH 27 Cladosporium cladosporioides 557 99,4 % EM_FUNAY251074 MH 28 Penicillium corylophilum 592 100,0 % EM_FUN:AF033450 MH 29 Phlebiella christiansenii 576 99,1 % EM_FUN:EU118659 MH 30 Cladosporium cladosporioides 547 98,6 % EM_FUN:DQ810182 MH 31 Penicillium corylophilum 590 99,5 % EM_FUN:AF034457 MH 32 Cladosporium oxysporum 553 99,4 % EM_FUN:DQ912837 MH 33 Cladosporium cladosporioides 557 98,6 % EM_FUN:AY251074 MH 34 Cladosporium sp. 8506 558 98,2 % EM_FUN:EF120425 MH 35 Cladosporium cladosporioides 560 98,2 % EM_FUN:EU670719 MH 36 Simplicillium lamellicola 615 98,5 % EM_FUN:AF108480 MH 38 Cladosporium cladosporioides 556 98,9 % EM_FUN:EU272532 MH 39 Cladosporium cladosporioides 533 98,2 % EM_FUN:EU272532 MH 40 Cladosporium cladosporioides 554 98,6 % EM_FUN:AJ300334 MH 41 Cladosporium cladosporioides 558 99,1 % EM_FUN:EU272532 MH 42 Cladosporium cladosporioides 543 98,9 % EM_FUN:EU272532 MH 43 Cladosporium cladosporioides 557 98,0 % EM_FUN:AY251074 MH 44 Cladosporium cladosporioides 542 98,7 % EM_FUN:EU272532 MH 45 Yarrowia lipolytica VAN DER WALT AND ARX 585 98,1 % EM_FUN:DQ680839 MH 46 Penicillium citreonigrum str. 586 99,0 % EM_FUN:EF198645 MH 47 Meira geulakonigii BOEKHOUT, GERSON AND SZTEIJNBERG 628 99,5 % EM_FUN:AB204894

Tabelle 3.1 (Fortsetzung auf folgender Seite): Speziesidentifikation der isolierten Pilze auf der Basis des

Abgleichs der Sequenzdaten mit bereits in der EMBL-Datenbank (Stand Juni 2009) publizierten

Sequenzen. Beschreiber sind nur im jeweils ersten Listeneintrag aufgeführt.

Ergebnisse

97

Abbildung 3.36 zeigt die Häufigkeiten der gefundenen Arten: Insgesamt wurden

97 Stämme isoliert. Vier Stämme (Cladosporium cladosporioides, Cladosporium

oxysporum, Cladosporium sp. 8506, Cladosporium sp. ZJ8-4B 18S) der Ordnung

Capnodiales stellten 58,4 Prozent der gefundenen Pilze. Quantitativ zweitgrößte

Gruppe mit 27,2 Prozent der detektierte Pilze waren die Eurotiales mit sieben

Stämmen (Eupenicillium tularense, Penicillium adametzioides, Penicillium

brevicompactum, Penicillium citreonigrum, Penicillium citreonigrum str., Penicillium

corylophilum, Penicillium echinulatum. Die restlichen 14,4 Prozent verteilten sich auf

MH 48 Cladosporium cladosporioides 555 99,3 % EM_FUN:AY251074 MH 49 Cladosporium cladosporioides 552 98,2 % EM_FUN:AF455472 MH 50 Cladosporium oxysporum 550 99,2 % EM_FUN:EF136374 MH 51 Cladosporium cladosporioides 559 99,1 % EM_FUN:AY251074 MH 52 Penicillium corylophilum 574 98,5 % EM_FUN:AY373906 MH 53 Mucor hiemalis WEHMER 641 99,0 % EM_FUN:AJ876489 MH 54 Cladosporium cladosporioides 557 98,6 % EM_FUN:EU272532 MH 55 Cladosporium cladosporioides 552 98,2 % EM_FUN:AY251074 MH 56 Cladosporium cladosporioides 544 98,2 % EM_FUN:EU301112 MH 57 Cladosporium sp. ZJ8-4B 18S 556 97,2 % EM_FUN:FJ037773 MH 58 Cladosporium cladosporioides 544 99,4 % EM_FUN:EU272532 MH 59 Cladosporium cladosporioides 558 98,3 % EM_FUN:AY251074 MH 61 Cladosporium sp. 8506 557 98,7 % EM_FUN:EF120425 MH 62 Penicillium brevicompactum 585 99,5 % EM_FUN:DQ123637 MH 63 Penicillium corylophilum 592 99,0 % EM_FUN:AF034456 MH 64 Cladosporium cladosporioides 552 98,2 % EM_FUN:EF151439 MH 65 Cladosporium cladosporioides 555 97,8 % EM_FUN:AJ876482 MH 66 Penicillium brevicompactum 578 99,8 % EM_FUN:DQ123638 MH 67 Cladosporium cladosporioides 550 98,7 % EM_FUN:EU301112 MH 68 Penicillium brevicompactum 580 98,5 % EM_FUN:AY373897 MH 69 Penicillium brevicompactum 587 98,0 % EM_FUN:DQ123637 MH 70 Cladosporium cladosporioides 557 98,7 % EM_FUN:EF136373 MH 71 Penicillium corylophilum 590 98,9 % EM_FUN:AY373906 MH 72 a Mucor hiemalis 647 99,7 % EM_FUN:DQ118992 MH 72 b Mucor hiemalis 650 98,4 % EM_FUN:AJ876489 MH 73 a Psathyrella candolleana MAIRE 709 99,0 % EM_FUN:AM712281 MH 73 b Psathyrella candolleana 710 98,4 % EM_FUN:DQ093736 MH 74 Cladosporium sp. ZJ8-4B 18S 558 98,2 % EM_FUN:FJ037773 MH 75 Cladosporium sp. 8506 18 S 560 98,7 % EM_FUN:EF120425 MH 76 Cladosporium cladosporioides 556 98.0 % EM_FUN:AY251074 MH 77 Psathyrella candolleana 701 99,9 % EM_FUN:AB470847 MH 78 Cladosporium cladosporioides 536 98,2 % EM_FUN:AJ876482 MH 79 Penicillium citreonigrum str. 585 99,5 % EM_FUN:AY373908 MH 80 Penicillium brevicompactum 584 98,3 % EM_FUN:DQ123637 MH 81 Cladosporium oxysporum 18 S 552 99,4 % EM_FUN:EF136374 MH 82 Penicillium citreonigrum str. 581 99,6 % EM_FUN:AY373908 MH 83 Cladosporium cladosporioides 557 97,3 % EM_FUN:AY251074 MH 84 Mucor hiemalis f. hiemalis 648 99,2 % EM_FUN:EU484277 MH 85 Cladosporium sp. 8506 556 97,8 % EM_FUN:EF120425 MH 86 Cladosporium sp. 8506 554 98,5 % EM_FUN:EF120425 MH 87 Cladosporium cladosporioides 559 98,4 % EM_FUN:EU272532 MH 88 Penicillium brevicompactum 563 99,1 % EM_FUN:AY373897 MH 89 Cladosporium cladosporioides 541 99,4 % EM_FUN:AY251074 MH 90 Cladosporium sp. 8506 550 98,9 % EM_FUN:EF120425 MH 91 Cladosporium cladosporioides 556 97,3 % EM_FUN:EU301112 MH 92 Cladosporium sp. 8506 559 99,4 % EM_FUN:EF120425 MH 93 Cladosporium cladosporioides 523 96,7 % EM_FUN:AY251074 MH 94 Cladosporium cladosporioides 556 99,4 % EM_FUN:EU301112 MH 95 Cladosporium sp. 8506 548 98,2 % EM_FUN:EF120425 MH 96 Phlebiella christiansenii 576 99,6 % EM_FUN:EU118659

Ergebnisse

98

Penicillium cit reonigrum str.; 4,1

Penicillium cit reonigrum; 4,1

Penicillium brevicompactum; 8,2

Penicillium adametzioides; 1,0

M ucor hiemalis; 4,1

Eupenicillium tularense; 1,0

M eira geulakonigii; 1,0

Cladosporium sp. ZJ8-4B 18S; 2,1

Cladosporium sp. 8506; 11,0

Cladosporium oxysporum; 4,1

Cladosporium cladosporioides; 41,2

Penicillium corylophilum; 7,7

Phlebiella christ iansenii; 3,1

Penicillium echinulatum; 1,0

Psathyrella candolleana; 3,1

Simplicillium lamellicola; 2,1

Yarrowia lipolyt ica; 1,0

ein Isolat (Psathyrella candolleana, 3,1 Prozent) der Ordnung Agaricales, je einen

Vertreter der Hypocreales (Simplicillium lamellicola) mit 2,1 Prozent, der Mucorales

(Mucor hiemalis) mit 4,1 Prozent, der Saccharomycetales (Yarrowia lipolytica) mit 1,0

Prozent, der Corticiales (Phlebiella christiansenii) mit 3,1 Prozent und mit Meira

geulakonigii, der 1,0 Prozent stellte, auf einen Vertreter der Exobasidiomycetidae

einer Ordnung incertae sedis.

Die phylogenetischen Beziehungen auf der Basis der ITS-Sequenzdaten sind in

Abb. 3.37 dargestellt (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method,

Distanzindex: Substitutionen pro Site, MEGA4). Zwei große Abteilungen innerhalb

der Pilze spiegeln sich auch im Phylogramm mit dem Cluster Capnodiales-

Hypocreales-Saccharomycetales-Eurotiales als Vertreter der Ascomycota und dem

Cluster Agaricales-Meira geulakonigii-Corticiales als Vertreter der Basidiomycota

wieder.

Abb. 3.36: Zuordnung von 97 im Screening isolierten Pilzen auf der Basis eines Abgleichs der

Sequenzen mit der EMBL-Fungi-Datenbank und Häufigkeit nach Zuordnung: 87,7 Prozent waren

Vertreter der Pezizomycotina, 4,1 Prozent der Mucoromycotina, 3,1 Prozent der Agaricomycotina und je

ein Prozent der Saccharomycotina und Ustilaginomycotina.

Ergebnisse

99

Die Mucorales als Vertreter der Zygomycota sind in der Analyse ohne direkte

Verwandte und clustern, bedingt durch die untersuche DNA-Region, als Artefakt

innerhalb der Basidiomycota. Nahezu alle Vertreter der beiden Cluster werden von

opportunistischen, euryöken Saprobionten gestellt, in beiden Clustern tritt aber auch

je ein Pilz auf, der Arten zugeordnet ist, die für Arthropoden pathogen sein können:

Innerhalb der Basidiomycota handelt es sich um Meira geulakonigii (Isolat MH47-

ITS1F), im Ascomycota-Cluster um Simplicillium lamellicola (Isolate MH 14-ITS1F

und MH 36-ITS1F).

Ergebnisse

100

Capnodiales

Corticiales

Meira geulakonigii

Mucorales

Agaricales

Eurotiales

Hypocreales

Saccharomycetales

MH

40--

ITS

1F

MH

23--

ITS

1FM

H41

--IT

S1F

MH

43--

ITS

1F

MH

44--

ITS

1F

MH

49--

ITS

1F

MH

64--

ITS

1F

MH

67--I

TS1F

MH

8--IT

S1F

MH1-

-ITS1F

MH6--ITS1F

MH7--ITS1F

MH15--ITS1F

MH9--ITS1F

MH10--ITS1FMH11--ITS1FMH13--ITS1FMH18--ITS1FMH19--ITS1FMH25--ITS1FMH26--ITS1F

MH27--ITS1F

MH30--ITS1F

MH32--ITS1F

MH33--ITS1F

MH34--ITS1F

MH50--ITS1F

MH61--ITS1F

MH

65--ITS1F

MH

70--ITS1F

MH

58--ITS1F

MH

20--ITS

1F

MH

35--ITS

1F

MH

95--

ITS

1FM

H94

--IT

S1F

MH

93-

-IT

S1F

MH

92-

-IT

S1F

MH

91-

-IT

S1F

MH

90--

ITS

1FM

H89

--IT

S1F

MH

87--

ITS

1F

MH

86--

ITS

1F

MH

85--

ITS

1F

MH

83--I

TS1F

MH81

--ITS

1F

MH78

--ITS1F

MH76--ITS1F

MH75--ITS1F

MH74--ITS1F

MH59--ITS1F

MH57--ITS1F

MH56--ITS1FMH55--ITS1FMH54--ITS1FMH51--ITS1FMH48--ITS1FMH42--ITS1FMH39--ITS1F

MH38--ITS1F

MH14--ITS1FMH36--ITS1FMH45--ITS1F

MH16--ITS1F

MH68--ITS1F

MH24--ITS1FMH62--ITS1FMH66--ITS1FMH69--ITS1F

MH80--ITS1F

MH88--ITS1F

MH2--ITS1FMH12--ITS1F

MH17--ITS1F

MH46--ITS1F

MH5--ITS1F

MH

79--ITS1F

MH

82--ITS1F

MH

71--ITS1F

MH

52--ITS

1F

MH

31--ITS

1F

MH

63--ITS

1FM

H2

8--ITS

1F

MH

22--ITS

1FM

H4--IT

S1F

MH

3--ITS1F

MH

21--ITS1F

MH

29--ITS

1F

MH

96 --IT

S1

FMH

47--I T

S1F

MH

73a--ITS

1F

MH

73b

--ITS

1FM

H77--IT

S1F

MH

84--ITS

1FM

H53--IT

S1F

MH

72a--ITS

1F

MH

72b--ITS1F

0.05

Abb. 3.37: Phylogenetische Beziehungen von 97 Isolaten auf der Basis der ITS-Sequenzdaten (Alignment:

ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, 261 Positionen, Distanzindex: Substitutionen pro Site).

Ergebnisse

101

3.8.4 Charakteristika von Meira geulakonigii

Die Abbildungen 3.38 (eigene Daten rot markiert) und 3.39 verdeutlichen die

Beziehungen des gefundenen Isolates mit bereits publizierten Sequenzen, die der

Gattung Meira zugeordnet sind: Größte Homologie (Abb. 3.38, erste und zweite

Reihe) besteht zu den Isolaten PFS 014, das Yasuda publiziert hat, und AS 004, das

von Boekhout stammt und Typuskultur der Erstbeschreibung ist (Boekhout et al.

2003; Yasuda et al. 2007). Yasuda isolierte den Pilz aus Pyrus pyrifolia NAKAI-

Kulturen in Japan, Boekhout aus der phytopathogenen Milbe Phyllocoptruta oleivora

ASHMEAD auf Citrus grandis OSBECK-Kulturen in Israel. Das in der vorliegenden

Untersuchung gefundene Isolat aus Varroa destructor weist, verglichen mit den

beiden oben beschriebenen Isolaten, zwar nur geringe Sequenzdifferenzen auf, kann

aber von diesen abgegrenzt werden; Tabelle 3.2 gibt die paarweisen Distanzen zu

insgesamt elf, Arten der Gattung Meira zugeordneten Sequenzen an (Maximum

Composite Likelihood-Modell, 484 Sites).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 Meira geulakonigii PFS014

2 Meira geulakonigii AS004

0,000

3 Meira argovae AS005 0,043 0,043

4 Meira argovae AS003 0,043 0,043 0,000

5 MH47-ITS1F 0,002 0,002 0,043 0,043

6 Meira sp. Vega E1-92 0,021 0,021 0,043 0,043 0,023

7 Meira argovae AS006 0,043 0,043 0,000 0,000 0,043 0,043

8 Meira argovae AS002 0,043 0,043 0,000 0,000 0,043 0,043 0,000

9 Meira argovae MAFF 240320

0,047 0,047 0,008 0,008 0,047 0,043 0,008 0,008

10 Meira sp. Vega E2-32 0,047 0,047 0,008 0,008 0,047 0,043 0,008 0,008 0,004

11 Meira nashicola PFS 002

0,058 0,058 0,067 0,067 0,060 0,056 0,067 0,067 0,072 0,072

12 Meira sp. IZ-1189 0,058 0,058 0,065 0,065 0,060 0,051 0,065 0,065 0,069 0,069 0,004

Tabelle 3.2: Distanzmatrix für elf der Gattung Meira zugeordnete, publizierte Sequenzen sowie für das

eigene Isolat. Die geringsten Distanzen bestehen zu den zwei als Meira geulakonigii publizierten

Isolaten. Berechnung auf der Basis von 484 Sites, Maximum Composite Likelihood-Modell.

Ergebnisse

102

Abb. 3.38: Alignment für zehn der Gattung Meira zugeordnete, publizierte Sequenzen sowie für das

eigene Isolat (jeweils erste Zeile, gerahmt). Höchste Homologie (erste Reihe) besteht zu einem Isolat,

das aus der Milbe Phyllocoptruta oleivora isoliert wurden; EMBL-FASTA, Juni 2009.

Ergebnisse

103

Abb. 3.39: Phylogenetische Beziehungen von elf publizierten Sequenzen, die bisher der Gattung

Meira (Subtree: zwei als Meira geulakonigii identifizierte Isolate + eigenes Isolat) zugeordnet wurden

+ Sequenz des eigenen Isolats (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, 484

Positionen, Distanzindex: Substitutionen pro Site).

Ergebnisse

104

Meira geulakonigii zeigt im mikroskopischen Bild hyphenähnliche Strukturen,

die als Residuen der Ausgangskultur gedeutet werden können. Reife Konidien

erscheinen als fusiforme Zellen, die etwa sechs- bis siebenmal so lang wie breit sind

(Abb. 3.40).

3.8.5 Charakteristika von Simplicillium lamellicola

Das gefundene Isolat von Simplicillium lamellicola zeigt ebenfalls sehr hohe

Sequenzhomologien zu in den Datenbanken publizierten, insektenassoziierten,

pathogenen Pilzen (Abb. 3.41, eigene Daten rot markiert): Die höchsten

Übereinstimmungen (Distanzmatrix für Sequenzen von zwei als Simplicillium

lamellicola und vier als Lecanicillium lecanii publizierte Spezies sowie für das eigene

Isolat in Tabelle 3.3; Maximum Composite Likelihood-Modell, 465 Sites) fanden sich

zu einem Isolat von Ilyas, der Simplicillium lamellicola aus Coccoidaeen isolierte und

einem Isolat von Lee, der den Pilz in Bemisia tabaci GENNADIUS fand (Lee et al. 2007;

Ilyas et al. 2009). Im Versuch zeigte sich eine hohe Pathogenität des von Polar

Abb. 3.40: Mikroskopisches Präparat des eigenen Meira geulakonigii-

Isolats. Färbung mit Lactophenolblau.

10 µm

Ergebnisse

105

untersuchten Isolats von Simplicillium lamellicola gegenüber Boophilus microplus,

einer auf Vieh parasitierenden Zecke (Polar et al. 2005). Tuininga fand Simplicillium

lamellicola in Bodenproben und charakterisiert ihn als insektenpathogen (Tuininga et

al. 2009).

Die phylogenetischen Beziehungen von sechs dieser publizierten Sequenzen,

die Lecanicillium muscarium (syn. Verticillium lecanii) (vier) und Simplicillium

lamellicola (zwei) zugeordnet sind, und dem eigenen Isolat zeigt Abbildung 3.42:

Innerhalb des Simplicillium lamellicola-Clusters sind entsprechend der Distanzmatrix

keine Differenzen zu erkennen, der Cluster setzt sich deutlich von Lecanicillium

muscarium ab (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, 465


1 2 3 4 5 6

1 Simplicillium lamellicola KYK00006

2 Simplicillium lamellicola IAM 14701

0,000

3 Lecanicillium lecanii CBS122175

0,133 0,133

4 Lecanicillium lecanii EHS132

0,117 0,117 0,024

5 MH36-ITS1F 0,000 0,000 0,133 0,117

6 Lecanicillium lecanii C42 0,120 0,120 0,027 0,002 0,120

7 Lecanicillium lecanii 120 0,117 0,117 0,024 0,000 0,117 0,002

Tabelle 3.3: Distanzmatrix für Sequenzen von zwei als Simplicillium lamellicola und vier als

Lecanicillium lecanii publizierten Spezies sowie für das eigene Isolat. Zwischen den Simplicillium

lamellicola-Isolaten und dem eigenen Isolat gibt es für den verglichenen Abschnitt keine

Differenzen. Berechnung auf der Basis von 465 Sites, Maximum Composite Likelihood-Modell.

Ergebnisse

106

Abb. 3.41: Alignment für 10 den Spezies Simplicillium lamellicola (Reihen eins bis sechs, acht bis zehn) und

Guignardia vaccinii (Reihe sieben) zugeordnete, publizierte Sequenzen sowie für das eigene Isolat (jeweils

erste Zeile, gerahmt). Höchste Homologie besteht zu einem Isolat aus unbekannter Quelle (erste Reihe,

unpubliziert) und zu einem Isolat, das aus Coccidaeen isoliert wurde (zweite Reihe); EMBL-FASTA, Juni 2009.

Ergebnisse

107

Abb. 3.42: Phylogenetische Beziehungen von sechs publizierten Sequenzen, die Lecanicillium

muscarium (syn. Lamellicillium lecanii) (vier) und Simplicillium lamellicola (zwei) zugeordnet

sind und dem eigenen Isolat (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, 465


Ergebnisse

108

Im Gegensatz zu den zugespitzten Sporen von Meira geulakonigii zeigen sich

die Konidien im mikroskopischen Bild von Simplicillium lamellicola länglich

abgerundet; sie sind etwa fünfmal so lang wie breit; ihr Verbund löst sich nach

Abschnürung und bildet keine zusammenhängenden Ketten (Abb. 3.42).

Abb. 3.43: Mikroskopisches Präparat des eigenen Simplicillium

lamellicola-Isolats. Färbung mit Lactophenolblau.

10 µm

Diskussion

109

4 Diskussion

Entomopathogene Pilze als potentielle Antagonisten von Varroa destructor

werden als aussichtsreichste mittelfristige Lösung gesehen, um Apis mellifera-Völker

in Kultur halten zu können, ohne diesen Parasiten mit einer komplexen,

zeitaufwändigen Methodik bekämpfen zu müssen, da Erfolge in Versuchen, durch

markergestützte Selektion oder die gezielte Fertilisation und folgende Rückkreuzung

von Honigbienenarbeiterinnen, die ein Varroaantagonistisches Verhalten zeigen,

eine nachhaltige Varroaresistenz oder zumindest -toleranz zu erzielen, die

menschliche Eingriffe obsolet macht, bisher ausblieben (Büchler et al. 2008). Kurz

nach der letzten Jahrtausendwende wurde begonnen, verschiedene unspezifische

entomopathogene Pilze in Bezug auf ihre Wirkung auf Varroa destructor und Apis

mellifera zu testen. Auch wenn es in der Folge wiederholt zu Untersuchungen kam,

die eine antagonistische Wirkung entomopathogener Pilze konstatierten, liegen

bisher keine Berichte zu einem Durchbruch in Bezug auf einen Einsatz dieser Pilze

gegen Varroa vor.

Die in dieser Arbeit untersuchten Stämme von vier Pilzen – Beauveria

bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium muscarium und Paecilomyces

fumosoroseus – zeigten in vitro kein Potential, den Befall von Honigbienen mit dem

Ektoparasiten Varroa destructor signifikant zu senken – in allen Versuchen gab es

keine signifikanten Differenzen zwischen den mit Konidien behandelten Gruppen und

den Kontrollen. Maxima des täglichen Milbenfalls traten sowohl in den Pilzgruppen

als auch in den Kontrollen etwa an den Tagen zwei bis fünf auf, was als Effekt der

spezifischen Bedingungen, wie der Gewinnungsmethode oder dem Besprühen mit

der der Ernte der Konidien dienenden Lösung gedeutet werden kann. Geringe

Differenzen in der Mortalität zwischen den Kontrollen der einzelnen Versuche

wiederum sind der Methodik der Gewinnung der Versuchstiere geschuldet: Die große

Zahl benötigter Milben lässt sich nur aus jeweils unterschiedlichen Völkern gewinnen,

zudem sind derart umfangreiche Versuche nur seriell durchzuführen; damit ist davon

auszugehen, dass sich die Kohorten der verwendeten Milben (und auch Bienen) in

den in vitro-Versuchen zum Beispiel in Bezug auf ihre Altersstruktur nicht gleichen.

Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen decken sich nicht mit den

Ergebnissen der beiden anderen Studien an Milben in vitro, die sich mit den gleichen

Spezies beschäftigten (Kanga et al. 2002; Shaw et al. 2002). Shaw gibt für

Diskussion

110

behandelte Milben eine Mortalität von 63 bis 100 Prozent für den siebten Tag nach

Behandlung, für Milben der Kontrollgruppe eine zu vernachlässigende Mortalität an

und schließt die Kontrollgruppe in der Folge von der Analyse aus. In der

vorliegenden Arbeit lagen die Mortalitäten der Versuchs- und Kontrollgruppen in allen

Untersuchungen zwischen 70 und 80 Prozent, ohne signifikant voneinander

abzuweichen. Allerdings unterscheiden sich die Untersuchungen grundsätzlich in

ihrer Methodik: Im Gegensatz zur in dieser Arbeit beschriebenen Vorgehensweise

applizierte Shaw die Konidiensupension durch Eintauchen der Milben und hälterte

diese anschließend in Fünfergruppen auf Bienenpuppen, die in 1,5 ml-

Eppendorftubes untergebracht waren, bei 25 oder 30 Grad, also bei artifiziellen

Bedingungen, die sehr stark von den Verhältnissen im Brutnest von Honigbienen

abweichen: Die Mortalitäten in vitro gehälterter Larvenstadien und Puppen und damit

auch der Milben liegen über denen im Volk, die gewählten Temperaturen weichen

erheblich von den Brutnesttemperaturen ab und eine fünffache Parasitierung von

Puppen kommt allenfalls in Bienenvölkern unmittelbar vor deren Zusammenbruch vor

– ein Überleben von derart stark parasitierten Puppen und damit der Milben bis zur

Imaginalhäutung beziehungsweise bis zum Schlupf der Bienen erscheint äußerst

fraglich. Zur Behandlung der Kontrolle macht Shaw im Übrigen keine Angaben, was

die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zusätzlich erschwert.

Bestätigt werden die vorliegenden in vitro-Ergebnisse für Varroa destructor

durch die Ergebnisse des Halbfreilandversuchs: Abgesehen von der Beschränkung

des Flugraums gab es in Bezug auf die Haltungsbedingungen keine artifiziellen

Bedingungen, die Effekte auf Milben erklären könnten; auch hier konnte eine

Wirkung auf Varroa destructor nicht beobachtet werden

Kanga testete einen Stamm von Metarhizium anisopliae in Laborversuchen an

Milben auf Puppen, bei denen eine konidienhaltige Detergenslösung versprüht

wurde, und beobachtete eine signifikante Reduktion der Varroapopulationen, ohne

dass die Bienen geschädigt wurden; er bestimmte eine LT90 von sechs Tagen für

Metarhizium anisopliae (Kanga et al. 2002). In einem weiteren Versuch an Völkern,

die entweder mit Konidienpulver oder dem pyrethroidhaltigen Tierarzneimittel Apistan

behandelt wurden, fand Kanga vergleichbare Mortalitätsraten und schlussfolgerte

daraus auf eine Eignung von Metarhizium als Kontrollagens, obwohl die kumulierten

Mortalitätsraten zu Versuchsende teilweise unter denen der Kontrollgruppe lagen

(Kanga et al. 2003). In einem Versuch in 2006, in dem Metarhiziumkonidien mit Hilfe

Diskussion

111

von mit ihnen bedeckten Kunststoffstreifen appliziert wurden, bestätigten sich die

Ergebnisse (Kanga et al. 2006). 2006 untersuchte James den Metarhiziumstamm,

mit dem Kanga gearbeitet hatte, vor dem Hintergrund der Fragestellung, welche

Applikationsform die effektivste sei, konnte dabei aber keinerlei signifikante Effekte

des Pilzes finden; zusätzlich waren längstens nach 20 Tagen (Kanga 2003: 40 Tage)

noch keimfähige Konidien vorhanden (Kanga et al. 2003; James et al. 2006). In den

Freilandversuchen von Gerritsen mit drei kommerziell erhältlichen Produkten auf der

Basis von Metarhizium anisopliae- und Lecanicillium muscarium-Stämmen zeigten

sich signifikant erhöhte Sterberaten weder für Varroa destructor noch für Apis

mellifera (Gerritsen et al. 2006). Diese widersprüchlichen Ergebnisse können zum

einen darin begründet liegen, dass es sich bei den untersuchten Pilzen um

ausgesprochen pleomorphe Spezies handelt, was eine Vergleichbarkeit der

Untersuchungen, sofern sie nicht an identischen Stämmen vorgenommen wurden,

schwierig macht. So hat beispielweise das Konidienkeimverhalten verschiedener

Stämme Einfluss auf die Virulenz gegenüber Wirten: Für Beauveria bassiana wurde

von Talaei-Hassanloui gezeigt, dass unidirektional keimende Konidien

appressorienartige Strukturen ausbildeten und hochvirulent waren, während sich bi-

und multipolar keimende Konidien mit hyphenartigem Wachstum als kaum bzw. nicht

virulent herausstellten (Talaei-Hassanloui et al. 2007). Ähnliche Ergebnisse fand

Altre für Paecilomyces fumosoroseus als Pathogen von Plutella xylostella LINNAEUS:

Hier korrelierte die Virulenz hochsignifikant mit der Sporenlänge und der

Keimgeschwindigkeit (Altre et al. 1999). Darüber hinaus ergab beispielsweise eine

Revision von Verticillium lecanii auf rDNA-Basis, dass es sich um einen Komplex aus

den fünf Spezies Lecanicillium attenuatum ZARE AND GAMS, Lecanicillium lecanii ZARE

AND GAMS, Lecanicillium longisporum ZARE AND GAMS, Lecanicillium muscarium und

Lecanicillium nodulosum ZARE AND GAMS handelt (Zare et al. 2000; Gams et al. 2001;

Zare et al. 2001). Da einige Autoren die Revision ohne eigene Identifizierung des

ihnen vorliegenden Isolats durch einfachen Ersatz des Gattungsnamens

nachvollzogen haben, handelt es sich möglicherweise auch bei den im

Zusammenhang mit ihrer Rolle als potentielle Varroaantagonisten aktuell diskutierten

Spezies um unterschiedliche Arten (Sugimoto et al. 2003; Koike et al. 2007). Weil

deren Wirtsspektren erheblich divergieren und von Lepidopteren über Homopteren

bis zu Vertretern der Acari und der Annelida reichen, könnten unterschiedliche

Ergebnisse zur „gleichen“ Art hierin begründet liegen. Zum anderen differieren wie

Diskussion

112

auch in den in vitro-Versuchen die verwendeten Methodiken erheblich: Die in der

vorliegenden Untersuchung im Halbfreilandversuch verwendeten Völker wurden

durch Poolen aus Donorvölkern gebildet, so dass sie zwingend homogen in Bezug

auf potentielle Toleranz- oder Resistenzfaktoren von Bienenarbeiterinnen gegenüber

Varroa destructor, aber auch in Bezug auf den Verwandtschaftsgrad der

Arbeiterinnen untereinander und ihre Altersstruktur waren. Ebenso stellte diese

Vorgehensweise sicher, dass die Abundanz von Varroa in allen Versuchsvölkern zu

Beginn exakt gleich hoch war und die Völker mit gleichen Individuenzahlen adulter

Bienen sowie ohne Brutstadien, die während des Versuchs Einfluss auf die Zahl

adulter Bienen haben, starteten. Diese Vorgehensweise wurde lediglich von Kanga in

seinen Versuchen an Bienenvölkern gewählt (Kanga et al. 2003). Auch die

Applikationstechnik der Konidien wurde unterschiedlich gehandhabt: Die Konidien

der eigenen Versuche wurden als Suspension versprüht, Kanga brachte die Konidien

als Pulver in die Völker ein, Shaw ließ in ihren Laborversuchen Milben über reife

Pilzkulturen laufen (Shaw et al. 2002; Kanga et al. 2003). Nicht untersucht wurde in

beiden Ansätzen dabei der mögliche Einfluss eines nichttoxischen, mechanischen

Effekts der Applikation, vergleichbar dem nach Einbringen fein vermahlener

Saccharose in Bienenvölker; mit dieser Technik wurden in der vorliegenden

Untersuchung Milben für die in vitro-Versuche gewonnen (Aliano et al. 2005; Ellis et

al. 2009).

Für einen aus Varroa destructor isolierten Beauveria bassiana-Stamm

beschreibt Meikle nach Untersuchungen an je zwei Völkern – ausgehend von einer

zuvor nicht vereinheitlichten Grundgesamtheit – einer mit Konidien behandelten,

einer nur mit einem als Matrix dienenden Pulver behandelten und einer nicht

behandelten Gruppe einen signifikant erhöhten Milbenfall der mit Konidien

behandelten Gruppe am sechsten und achten Tag nach Applikation; die Völker

differierten zuvor in Bezug auf die erfassten Parameter „Bienenmasse“ und „Fläche

verdeckelter Brut“ (Meikle et al. 2007). Milben aus den mit Konidien behandelten

Völkern zeigten, ohne zuvor oberflächensterilisiert worden zu sein, in allen Fällen ein

signifikant höheres relatives Pilzwachstum. In einer Repetition mit einer größeren

Zahl nicht vereinheitlichter Völker und vier verschiedenen Gruppen (Konidien und

Carnaubawachsmatrix, Konidien und Weizenmehlmatrix, Weizenmehl, keine

Behandlung) trat ein erhöhter Milbenfall in der Konidien-Carnaubawachsgruppe auf,

dieser war allerdings nicht signifikant erhöht (Meikle et al. 2008b). Der Milbenfall der

Diskussion

113

Konidien-Weizenmehlgruppe lag unterhalb des Falls der Weizenmehlgruppe und an

drei Tagen auch unterhalb des Falls der Kontrolle. Signifikant erhöhtes relatives

Milbenwachstum aus einer Konidiengruppe wertet Meikle aber als Beleg für die

Eignung des Pilzes als Varroaantagonist. Eine zweite Wiederholung erbrachte

keinerlei Belege für eine signifikante Reduktion der Parasitenlast der Versuchsvölker,

was als Hinweis auf die Notwendigkeit einer homogenen Ausgangsbasis gewertet

werden kann (Meikle et al. 2009).

Die Daten der vorliegenden Arbeit belegen für drei der vier untersuchten Pilze

(Lecanicillium muscarium, Beauveria bassiana und Paecilomyces fumosoroseus)

signifikant eine negative Wirkung auf Bienen, die für Paecilomyces in der Kumulation

über den gesamten Untersuchungszeitraum sichtbar wurde, bei Lecanicillium und

Beauveria sogar signifikante Differenzen an Einzeltagen (vier und sieben respektive

vier und sechs) zeigte. Die Mortalitätsraten der Bienen lagen in der vorliegenden

Untersuchung nach zehn Tagen zwischen 30 und 40 Prozent in den Pilzgruppen und

20 bis 30 Prozent in den Kontrollen, was – bezogen auf die Kontrollen – die

Ergebnisse von Shaw stützt, deren Methodik zur Untersuchung an Honigbienen

ähnlich war (Shaw et al. 2002). In den Pilzgruppen traten in ihrer Untersuchungen

Mortalitäten von bis zu 100 Prozent 14 Tage nach Behandlung auf; von wenigen

Fällen abgesehen lagen sie immer über denen der Kontrollen. Für Bienen schloss

Kanga in seinem Versuch aus vergleichbaren Pilzwachstumsraten aus toten Bienen,

sie würden durch die Pilzstämme nicht negativ beeinflusst – allerdings wurden die

Oberflächen der Bienen nicht sterilisiert, was mit Blick auf opportunistische

Saprobionten problematisch sein dürfte (Kanga et al. 2003). Der Befund

unterschiedlicher Ergebnisse für Bienen bestätigt die großen Unterschiede von

Pathogenität und Virulenz in Abhängigkeit vom untersuchten Isolat und legt, da in

den vorliegenden und den in vitro-Untersuchungen von Shaw die Mortalität der

Bienen unter dem Einfluss der Pilze erhöht war, nahe, dass diese möglicherweise

isolatunabhängig nicht spezifisch genug sind, um als Kontrollagens geeignet zu sein.

Im Halbfreilandversuch war eine erhöhte Mortalität der Bienen ebenso wie der

Larvenstadien und der Puppen nicht detektierbar – das widerspricht nicht zwingend

den Ergebnissen des in vitro-Assays: In in vitro-Versuchen an gekäfigten Bienen

kommt es zu Eingriffen wie zum Beispiel dem regelmäßigen Entfernen toter Bienen,

das auch bei vorsichtiger Handhabung unter Rotlicht zu einer stark zunehmenden

Aktivität der Bienen führt; derartige Eingriffe können damit immer als Stressoren

Diskussion

114

wirken. Bienen, die solchen Stressoren ausgesetzt sind, zeigten in anderen

Versuchen eine erhöhte Mortalität, so dass denkbar ist, dass unter diesem Einfluss

durch Immunsuppression ein Agens pathogen werden kann, das unter natürlichen

Bedingungen keine Effekte auslöst (Dustmann et al. 1988; Decourtye et al. 2003).

Die Nichtpathogenität der in dieser Untersuchung getesteten Pilze in Bezug auf

Varroa bestätigte sich in der Infektionsanalyse der im Versuchszeitraum gestorbenen

Milben: Nur für Beauveria bassiana (sieben Tage nach Behandlung) wurde ein

signifikanter Unterschied (p < 0,05) im erzielbaren relativen Pilzwachstum aus Milben

der Pilz- und Kontrollgruppe gefunden – in allen anderen Gruppen zeigten sich keine

Differenzen. Shaw fand in ihrer Untersuchung bei bis zu 100 Prozent der

gestorbenen Milben nach sieben Tagen Mykosen, gibt aber, da die Kontrollgruppe zu

Versuchsbeginn einen zu geringen Milbenfall aufwies, keinen Wert für die Kontrolle

an (Shaw et al. 2002). Das ist insofern problematisch, als vor der Kultur der Milben

keine Oberflächensterilisation stattfand. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen

aber die zentrale Bedeutung einer ausreichenden Sterilisationsdauer für den

Ausschluss oder zumindest die weitestgehende Einschränkung des Wachstums der

Oberfläche anhaftender Konidien der applizierten Spezies oder opportunistischer

Saprobionten: Selbst nach einer sehr langen Sterilisationszeit von 240 Sekunden

kam es noch zu einem (geringen) Pilzwachstum aus nicht mit Pilzen behandelten

Milben, was an ingestierten oder intersegmental überdauerten Stadien vorhandener

Pilze liegen dürfte. Ausgeschlossen werden kann deshalb auch nicht, dass die

signifikante Differenz auf dem 95 Prozent-Niveau auf Residuen zurückzuführen ist.

Zwar unterzieht Kanga die in seinem Versuch gestorbenen Milben einer

Sterilisation, korreliert aber die Absolutbeträge der Zahl gefallener Milben und der

aus ihnen gewachsenen Pilze (Kanga et al. 2003). Meikle findet in seinen

Freilandversuchen in Abhängigkeit von der Versuchsdauer zwischen 100 Prozent

(am Tag der Behandlung) und 30 Prozent (50 Tage nach Behandlung) infizierte

Milben, verzichtet aber wie Shaw auf eine Sterilisation (Shaw et al. 2002; Meikle et

al. 2007, 2008a).

Die vorliegende Untersuchung an zehn Bienenvölkern im Halbfreilandversuch

mit Lecanicillium muscarium bestätigte die eigenen Ergebnisse aus dem Laborassay

für Milben auch im Detail: Über den gesamten Untersuchungszeitraum zeigte sich

keine signifikante Schädigung der Milbenpopulation im Vergleich zu Kontrollvölkern,

was sich nicht nur an der Zahl gestorbener Milben, analog zur Erfassung in den in

Diskussion

115

vitro-Assays feststellen lässt; auch der relative Endbefall adulter Bienen und

verdeckelter Brutzellen belegt keine Wirkung des Pilzes. Im Gegensatz zum

Laborassay wurde auch kein negativer Seiteneffekt gefunden – weder auf die Zahl

adulter Bienen, noch auf die Zahl der Larvenstadien oder verdeckelter Brutzellen.

Der Befund einer Nichtwirksamkeit gegenüber Milben und Bienen wird gestützt durch

die Untersuchungen von Gerritsen, die für den gleichen Lecanicillium muscarium-

Stamm sowie für einen Metarhizium anisopliae-Stamm im Freilandversuch an

allerdings zuvor nicht vereinheitlichten Völkern ebenfalls keinen Effekt belegen

(Gerritsen et al. 2006). Meikle konnte eine Wirkung des von ihm untersuchten

Beauveria bassiana-Stamms, der nach seinen früheren Ergebnissen letal auf Varroa

wirkte, in seiner jüngsten Untersuchung nicht mehr bestätigen (Meikle et al. 2006;

2007; 2008a; 2008b; 2009). Meikle arbeitete im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit

ebenso wie Gerritsen mit einem nicht über eine Supergruppenbildung in Bezug auf

Altersstruktur, Verwandtschaft und Varroabefall homogenisierten Bienenmaterial,

was angesichts einer exponentiellen Vermehrung des Parasiten und einem

Generationenabstand von nur 30 Tagen eine erhebliche Varianz zwischen den

Jahren erklären kann. Zudem waren die Völker beider Gruppen nicht in Flugzelten

untergebracht, was die Gefahr signifikanter Änderungen des Befallsgrades birgt

(Greatti et al. 1992; Goodwin et al. 2006).

Noch nie zuvor wurde untersucht, ob es letale Auswirkungen

entomopathogener Pilze auf Larven von Honigbienen bereits ab dem L1-Stadium

gibt. Für die untersuchten Stämme im Larven-in-vitro-Assay kann ein solcher Einfluss

der Pilze auf Larven des L1- bis L5-Stadiums und auf Puppen von Apis mellifera

verneint werden. In allen Gruppen kam es innerhalb der ersten sechs bis neun Tage

zu einem Anstieg der kumulierten Mortalität auf etwa 15 Prozent, danach bis zum

Versuchsende nach 21 Tagen nur noch zu einer leichten Zunahme auf etwa 20

Prozent. Diese Rate dürfte den artifiziellen Bedingungen eines in vitro-Versuchs

geschuldet sein und deckt sich in der Kontrolle mit den beobachteten Mortalitätsraten

ähnlicher Versuche an Paenibacillus larvae (Genersch, mdl.). Unter den

nichtartifiziellen Bedingungen des Halbfreilandversuchs an Lecanicillium muscarium

kam es ebenfalls nicht zu Auffälligkeiten – weder für die Larvenstadien noch für das

Puppenstadium gab es signifikante Differenzen zwischen Pilz- und Kontrollgruppe.

Diskussion

116

Auch subletale Effekte entomopathogener Pilze, die unter Umständen

Ausschlusskriterium für ihren Einsatz sein können, sind in bisherigen

Untersuchungen noch nie berücksichtigt worden. Zur Klärung der Frage, ob es nicht-

letale Effekte auf adulte Bienen gab, die der in vitro-Versuch nicht erfassen konnte,

wurden mit Pilzsporen beziehungsweise nur mit einer Kontrolllösung behandelte

Gruppen in Bezug auf ihre Futteraufnahme pro Zeiteinheit als mögliches Indiz zum

Beispiel einer Schädigung des Darmkanals untersucht; in diesem Zusammenhang

wurde auch analysiert, ob das Gewicht der Honigblase über den

Gesamtversuchszeitraum Schwankungen unterworfen war. Klassische PER-

Versuche müssen darauf keine Rücksicht nehmen: Hier werden die Bienen den

Völkern wenige Stunden vor Versuchsbeginn entnommen und sind nach kurzer Zeit

hungrig, was Voraussetzung für eine erfolgreiche Teilnahme der Individuen am

Versuch ist (Bittermann et al. 1983). Bei über einen Versuchszeitraum von 12 Tagen

je Durchgang gekäfigten Bienen aber ist der Sättigungszustand der ad libitum mit

Futter versorgten Tiere nicht kalkulierbar; Langzeit-PER-Versuche mit gekäfigten

Bienen wurden nie zuvor etabliert und in Vorserien zeigte sich, dass es starke

Schwankungen bezüglich der nötigen Dauer der Hungerphase gab: Beobachtet

wurden Hungerphasen von mehr als 12 Stunden, die nötig waren, um Bienen zur

Versuchsteilnahme zu bewegen, aber auch eine Mortalitätsrate von über 50 Prozent

nach einer Hungerphase von nur einer halben Stunde.

Die Ergebnisse zeigen deutlich das signifikant abnehmende

Honigblasengewicht von etwa 10 mg auf etwa 2 mg während des

Versuchszeitraums. Dieses Ergebnis korreliert mit der Beobachtung, dass gekäfigte

Bienen zumindest während des Versuchszeitraums nicht defäkieren und die Menge

retenierter Fäzes permanent zunimmt – offensichtlich auf Kosten des zur Verfügung

stehenden Honigblasenvolumens. Die Replizierbarkeit der Ergebnisse machte in

Kombination mit den Ergebnissen der Messung des Futterverbrauchs ein

passgenaues Timing des Beginns des Futterentzugs möglich, so dass eine

ausreichend große Anzahl teilnahmefähiger Bienen ohne zu große

Präversuchsverluste zur Verfügung stand, und eignet sich damit als Grundlage für

zukünftige PER-Versuche an über lange Zeiträume gekäfigten Bienen.

Eine signifikante Änderung der Futteraufnahme konnte nicht festgestellt

werden: Sie lag über den gesamten Untersuchungszeitraum konstant bei etwa 0,002

Diskussion

117

ml pro Stunde und Biene – dies kann als Indiz dafür gewertet werden, dass es durch

die Applikation der Pilzsporen nicht zu Schädigungen des Verdauungstraktes kam.

Der PER-Versuch sollte klären, ob es zu einer Beeinträchtigung des

Lernvermögens durch Lecanicillium muscarium kam; dieser Aspekt ist gerade bei

Honigbienen besonders wichtig: Arbeiterinnen orientieren sich während des

Fouragierens in einem Umkreis von im Extremfall bis zu zehn Kilometern an

himmlischen und terrestrischen Merkmalen, sie sind in diesem Zusammenhang zu

einer hochdifferenzierten Mustererkennung fähig, verfügen über eine präzise

endogene Chronometrie und eine sensible olfaktorische Wahrnehmung, die auch

zentrales Element der Verwandtenerkennung ist (Lindauer 1963; Dyer et al. 1981;

Arnold et al. 1996; Breed 1998; Moore et al. 1998; Dyer et al. 2008). Eine

Beeinträchtigung dieser Fähigkeit durch ein exogenes Agens könnte einen

erheblichen Einfluss auf das Funktionieren der Summe der Einzeltiere in der

komplexen Sozialstruktur eines Bienenvolkes haben. Angesichts der zahlreichen, am

assoziativen Duftlernen von Honigbienen beteiligten Strukturen kann bereits die

Beeinträchtigung einer Komponente gravierende Folgen haben (Erber et al. 1980;

Hammer et al. 1998). So ist für die systemischen Insektizide Imidacloprid und Fipronil

nachgewiesen worden, dass sie auch weit unterhalb der letalen Konzentration die

Besuchsraten an Futterquellen reduzieren; für Imidacloprid konnte in PER-

Versuchen gezeigt werden, dass es die Fähigkeit zur Duftunterscheidung

beeinträchtigt (Colin et al. 2004; Decourtye et al. 2004). Es bindet nach

Untersuchungen von Nauen an nikotinische Acetylcholinrezeptoren der antennalen

Loben; da nACh-Rezeptoren mit Hilfe von Immunassays auch für andere Regionen

des Bienengehirns, die zentral für Lern- und Erinnerungsprozesse sind, wie die

Alphaloben und die Pilzkörper nachgewiesen wurden, sind prinzipiell auch hier

Beeinträchtigungen zu erwarten (Kreissl et al. 1989; Bicker 1999; Nauen et al. 2001).

Die Wirkung entomopathogener Pilze beruht wesentlich auf Toxinen wie den

nichtpeptidischen Agentien Oosporin und Bassianin, linearen Peptiden wie

Leuconistin und Efrapeptin sowie zyklischen Peptiden, namentlich Beauvericin und

Destruxin, die für diverse Spezies nachgewiesen worden sind (Khachatourians

1996). Zyklische Enniatine (C31-36H53-63N3O9) aus Fusarium spp. interagierten in

Versuchen mit GABAA-Rezeptoren in Rattengehirnen; für diesen Rezeptor wurden

Gemeinsamkeiten mit GABA-Rezeptoren von Invertebraten beschrieben, so dass

eine mögliche Wirkung pilzlicher Enniatine auch auf Insekten vermutet werden kann

Diskussion

118

(Anthony et al. 1993; Anke et al. 2002). Zunächst unbenommen der Beantwortung

der Frage, ob eine Beeinträchtigung des Lernvermögens durch Lecanicillium

muscarium auf der Wirkung ingestierter Pilztoxine, der Beeinflussung durch erst

innerhalb des Bienenkörpers generierte Metaboliten des Pilzstoffwechsels oder der

Induktion einer Immunantwort beruht, respektive, ob nur einer oder mehrere dieser

Faktoren einen Einfluss haben und welcher physiologische Mechanismus ihm

zugrunde liegt, zeigen die Ergebnisse des PER-Versuchs, dass es einen Einfluss

von Lecanicillium muscarium auf die Fähigkeit zur Duftunterscheidung bei Apis

mellifera gibt. Während die Lernkurve keine Auffälligkeiten zeigte, kam es innerhalb

der ersten zwei Tage nach Behandlung zu einer hochsignifikanten Beeinträchtigung

der Unterscheidungsfähigkeit bei Bienen, die mit Konidien von Lecanicillium

muscarium in Kontakt kamen. Die daraus resultierende Annahme, der Kontakt zu

Konidien könne eine subletale, negative Wirkung haben, wird durch den Befund des

Immunassays gestützt: Lecanicillium muscarium induzierte sowohl in Tests mit

Gramnegativen als auch in Tests mit Grampositiven Organismen eine neunfach

erhöhte Antwort des Immunsystems; das galt mit einer Einschränkung (Paecilomyces

fumosoroseus – Bacillus subtilis) ebenfalls für alle anderen untersuchten

entomopathogenen Pilze. Damit wird die Annahme einer durch Induktion einer

Immunantwort bedingten Reduktion des Lernvermögens des Individuums in den

ersten beiden Tagen nach Kontakt mit dem untersuchten Stamm von Lecanicillium

muscarium als bestätigt angesehen. Ob dieser Effekt tatsächlich Auswirkungen auf

der Ebene des Staats hat, ließe sich nur in Versuchen an einer sehr großen Anzahl

zuvor weitestgehend vereinheitlichter Völker untersuchen: Zu groß sind die

interkolonialen Varianzen zum Beispiel in Bezug auf die Sammelleistung, als dass

diese Fragestellung mit Versuchen an nur wenigen Völkern geklärt werden könnte.

Völlig unabhängig von der Beobachtung einer Beeinträchtigung des Lernvermögens

können natürlich zusätzlich auch pilzassoziierte Effekte, die ohne direkten Einfluss

auf die Sozialstruktur sind und zunächst nur zu einer physiologischen Schädigung

der Einzelbiene führen, durch Verringerung ihrer Vitalität, ohne ihren Tod zu

verursachen, negative Konsequenzen für den Staat haben. Immunassays als Test

für die Induktion einer Immunantwort nach Kontakt zu pathogenen Organismen sind

für Honigbienen etabliert; so wies Randolt nach Injektion von Escherichia coli 682

über einen ähnlichen Ansatz differierende Immunantworten von Bienenlarven und

Adultbienen nach (Randolt et al. 2008). Pilze initiieren nach Untersuchungen von

Diskussion

119

Hultmark und Stenbak an Drosophila melanogaster MEIGEN eine Immunantwort über

die Toll-Kaskade (Hultmark 2003; Stenbak et al. 2004). Für Honigbienen nimmt

Evans Gleiches an, nachdem seit der vollständigen Publikation des Genoms von

Apis mellifera etliche Homologe zu beteiligten Drosophilagenen gefunden wurden

(Evans et al. 2006; Weinstock et al. 2006). Inzwischen sind mit Abaecin, Apidaecin,

zwei Defensinen, Hymenoptaecin und einem Lysozym sechs antimikrobielle

Effektoren identifiziert, die bei Honigbienen nach Stimulation des Immunsystems

exprimiert werden.

Im Zusammenhang mit der Frage einer eventuellen Schädigung des

Lernvermögens nach Induktion einer Immunantwort durch entomopathogene Pilze ist

ein Versuch aber im Rahmen der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal verwendet

worden und konnte zusammen mit den Ergebnissen der PER-Dressur zeigen, das

erst die inklusive Untersuchung subletaler Effekte mit der vorgestellten Methodik eine

Aussage über die potentielle Eignung entomopathogener Pilze, wie sie Kanga, Shaw

und Meikle aufgrund ihrer Versuche treffen, zulässt (Kanga et al. 2002, 2003, 2006;

Meikle et al. 2006, 2007, 2008a, 2008b, 2009; Shaw et al. 2002).

Die Ergebnisse des vierjährigen Monitorings an 215 Versuchsvölkern

verdeutlichen eine große Varianz des Parasitenbefalls zwischen den Völkern. Zwar

haben zahlreiche Faktoren einen Einfluss auf die Populationsdynamik von

Bienenvölkern und damit auch auf ihre Parasiten, was in Bezug auf unter

Freilandbedingungen kultivierte Völker insbesondere für die Verfügbarkeit von

Nahrungsquellen, die genetische Diversität innerhalb eines Volkes, aber auch die

mikroklimatischen Gegebenheiten am Standort gilt, trotzdem gestattet diese

Beobachtung die Vermutung, bisher unbekannte, interkolonial differierende

intrakoloniale Faktoren wie zum Beispiel die Abundanz von Hyperparasiten, könnten

einen nicht unerheblichen Einfluss auf die Abundanz und Pathogenität auch von

Varroa destructor haben. Die Korrelationsanalyse des Befalls von Apis mellifera-

Völkern mit Varroa destructor und dem Quantum der aus diesen Milben isolierbaren

Pilze ohne Berücksichtigung ihrer Gattungszugehörigkeit für die Jahre 2005 bis 2008

stützt diese These: Es treten sowohl Jahre mit einer vergleichsweise starken

Korrelation als auch praktisch beziehungslose Jahre auf. Ursächlich könnten zum

Beispiel die erwähnten mikroklimatischen beziehungsweise klimatischen

Bedingungen sein: Entomopathogene Pilze sind stenök in Bezug auf die relative

Luftfeuchte. Verticillium lecanii, Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae

Diskussion

120

beispielsweise zeigten in Experimenten von Ekbom und von Riba nur bei sehr hohen

Feuchtewerten eine Infektiösität in Bezug auf ihre Wirte (Ekbom 1981; Riba et al.

1984). Eine Reduktion der relativen Feuchte um etwa 20 Prozent für 80 Stunden

reduzierte in Versuchen von Drummond die Mortalität des vierten Larvenstadiums

von Trialeurodes vaporariorum unter dem Einfluss von Verticillium signifikant

(Drummond et al. 1987). Für die Sporulation entomopathogener Pilze ist eine hohe

Luftfeuchte sogar essentiell und Mycar, ein kommerzielles Produkt auf der Basis von

Hirsutella thompsonii, scheiterte am Markt, weil unter Feldbedingungen die relative

Feuchte zu gering war, um eine Keimung zu ermöglichen (McCoy 1986; Osborne et

al. 1992). Demgegenüber sinkt der Fortpflanzungserfolg von Varroa mit steigender

relativer Luftfeuchte: Eine Zunahme von 59 bis 68 Prozent auf 79 bis 85 Prozent

reduzierte in Versuchen von Kraus die Reproduktionsrate signifikant von 53 auf 2

Prozent (Kraus et al. 1997). Arbeiterinnen von Apis mellifera zeigen zwar gegenüber

zu hohen Feuchtewerten im Brutnest eine geringere Toleranz im Sinn der Induktion

einer regulierenden Antwort im Vergleich zu einer zu niedrigen Luftfeuchte,

gemessen am präferierten Wert, der bevorzugte Bereich liegt mit 90 - 95 Prozent

aber deutlich über dem Level, bei dem Varroa erfolgreich reproduziert (Doull 1976;

Ellis et al. 2008). Da Honigbienen aber auch schon bei einer relativen Luftfeuchte

von 55 Prozent im Brutnest in der Lage sind, erfolgreich zu reproduzieren, ergeben

sich – basierend auf der Annahme, die relative Luftfeuchte sei bestimmender Faktor

– zunächst zwei Erklärungsmuster für die Varianz zwischen den Jahren: Das Klima

des jeweiligen Jahres könnte unmittelbar die Abundanz der Milben und der Pilze

beeinflussen, ohne dass es einen ursächlichen Zusammenhang zwischen beiden

Größen gibt, oder dies mittelbar tun, indem in Jahren mit überdurchschnittlichen

relativen Feuchtewerten die Virulenz der Pilze positiv beeinflusst wird und damit die

Abundanz der Milben sinkt. Weitere, nicht offensichtliche Parameter könnten

stattdessen oder ergänzend natürlich ebenfalls eine Rolle spielen: Da unter den

gefundenen Arten ein großer Anteil saprober Arten auftrat, ist zum Beispiel auch

denkbar, dass diese Pilze von einer durch unbekannte Faktoren verursachten

erhöhten Mortalität innerhalb der Varroapopulationen als Opportunisten profitierten.

Dem steht allerdings entgegen, dass die Funde mutmaßlich milbenpathogener Pilze

in einem Jahr geringen Varroabefalls und sämtlichst in Völkern mit einer individuell

geringen Parasitenlast erfolgten.

Diskussion

121

Die Funde von Simplicillium lamellicola und Meira geulakonigii sind nach den

Funden von Beauveria bassiana in Varroa durch Meikle, Steenberg und Garcia-

Fernández weltweit die bisher einzigen Nachweise pathogener Pilze in Varroa

(Meikle et al. 2006; Garcia-Fernández et al. 2008; Steenberg et al. 2010). Meikle

allerdings fand Beauveria bassiana auf nicht oberflächensterilisierten Milben, Garcia-

Fernández macht dazu keine Angaben – da Beauveria bassiana verbreitet auch aus

Bodenproben isoliert wird, ist die endogene Herkunft möglicherweise nicht sicher.

Die großen Sequenzhomologien des eigenen Isolats von Simplicillium

lamellicola zu den Isolaten von Ilyas und von Lee, insbesondere aber der Versuch

von Polar deuten auf eine mögliche Pathogenität für Varroa hin (Polar et al. 2005;

Lee et al. 2007; Ilyas et al. 2009). Polar fand für Simplicillium lamellicola, der aus

einer unidentifizierten Milbe isoliert wurde, in Tests gegen Boophilus microplus eine

Reduktion der durchschnittlichen Lebensdauer des Wirts um 40 Prozent; Larven von

Boophilus blieben durch den Pilz unbeeinflusst.

Das in dieser Arbeit gefundene Isolat von Meira geulakonigii ist der weltweit

zweite Fund dieses Pilzes in Arthropoden und der dritte nach der Erstbeschreibung

(Boekhout et al. 2003). Die genaue Stellung der Art ist unklar; sie wird von Hibbett

den Exobasidiomycetes zugeordnet (Hibbett et al. 2007). Der Großteil der Vertreter

der Exobasidiomycetes kommt in einer saproben, haploiden Phase und einer

dikaryotischen, parasitischen Phase vor (Begerow et al. 2006). In mehreren

molekularen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Exobasidiomyceten einen

Teil der Ustilaginomyceten darstellen (Begerow ebd.). Die große Mehrheit der Arten

der Ustilaginomycotina sind Parasiten höherer Pflanzen, lediglich Malassezia

parasitiert auf Warmblütern. Arten der Gattung Meira nähmen als

Arthropodenparasiten damit eine Sonderstellung innerhalb der Ustilaginomycotina

ein, auch wenn Tanaka Meira argovae BOEKHOUT, GERSON AND SZTEIJNBERG auf

Bambusschösslingen fand und Meira nach phylogenetischen Analysen neben das

Schwestertaxon Dicellomyces stellt, das mit Dicellomyces gloeosporus OLIVE

ebenfalls einen Parasiten auf Bambusblättern enthält (Tanaka et al. 2008).

Begerow ordnet Meira innerhalb der Exobasidiomycetes den Exobasidiales

und dort der Familie Brachybasidiaceae mit den Gattungen

Brachybasidium

Dicellomyces

Exobasidiellum

Diskussion

122

Kordyana

Meira und

Proliferobasidium

zu (Begerow et al. 2006). Allerdings gilt auch für die Brachybasidiaceae, was bereits

für die Exobasidiomycetes galt: In Abhängigkeit von der Auswahl der in die

Untersuchung einbezogenen Spezies und der verwendeten Topologieanalyse

werden sie entweder als Mono- oder als Paraphylum angesprochen. Der Fund des

eigenen Isolats von Meira geulakonigii könnte aufgrund der spezifischen

Besonderheiten der Spezies damit einen wichtigen Beitrag zur Klärung der

phylogenetischen Beziehungen innerhalb der Ustilaginomycotina liefern.

Bisher untersuchte Vertreter der Brachybasidiaceae sind Phytoparasiten auf

Monokotyledonen – auch in dieser Hinsicht nähme Meira eine Sonderstellung ein,

fand Boekhout sein Isolat doch auf Citrus grandis (Boekhout et al. 2003).

In Studien zur möglichen evolutionären Entwicklung der Exobasidiales zeigten

Vertreter der Brachybasidiaceae, dass die komplexen Strukturen, mit deren Hilfe der

Wirt parasitiert wird, nicht innerhalb von Haustorien lokalisiert sind, sondern von

interzellulären Hyphen gebildet werden, die Wirtszellen anliegen (Begerow et al.

2002). Die Sporulation findet auf der Oberfläche der Wirte statt. Die hilaren

Appendizes der Basidiosporen sind bei Brachybasidium und Dicellomyces adaxial

orientiert; probasidiale Verdickungen sind immer vorhanden. Die phylogenetischen

Beziehungen der Subtaxa der Exobasidiales korrelieren mit denen ihrer Wirte, was

als Hinweis auf Cospeziation verstanden wird (Begerow, ebd.).

Die bisher untersuchten Vertreter der Ordnung sind dimorphisch und zeigen zyklisch

ein saprobiontisches, hefeähnliches Stadium sowie parasitisch lebende Myzele

(Bauer et al. 2000). Dieser Umstand könnte sowohl den Fund von Meira geulakonigii

in Varroa klären, als auch das Vorkommen von hyphenartigen Strukturen im

mikroskopischen Bild: Die saprobiontischen Phasen der Schwestertaxa

metabolisieren in diesem Stadium überwiegend Mono- und Disaccharide und damit

einfache Zucker, die zahlreich im Nektar von von Bienen aufgesuchten Blüten und in

der Folge im Honig vorkommen, so dass die saprobe Phase von Meira

möglicherweise in einigen Blüten oder im Stock persistiert (Begerow, mdl.). Die

hyphenähnlichen Strukturen könnten demnach als Bestandteil der parasitischen

Phase angesprochen werden, die sich als Residuen der Ausgangskultur in der

Reinkultur finden; eine Vergleichsmöglichkeit dazu ist aus anderen Quellen allerdings

Diskussion

123

nicht bekannt – bisher ist nur die Anamorphe von Meira identifiziert. Der Fund der

Teleomorphen könnte – wenn sich ein Parasitieren auf Varroa destructor bestätigte –

ein „missing link“ innerhalb der Ustilaginomycotina sein: Innerhalb dieser

Unterabteilung der Basidiomycota mit rund 1800 Arten gibt es bisher mit Malassezia

nur eine einzige Gattung, deren Anamorphe nicht auf Pflanzen sondern auf

homoiothermen Vertebraten parasitiert. Eine Beschreibung auch der Teleomorphen

eines Arthropodenparasiten, der sowohl auf Pflanzen als auch auf Tieren gefunden

wird, könnte demnach einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Frage leisten, wie

innerhalb der Subdivisio ein Interregnumsprung in Bezug auf den Wirt möglich war.

Boekhout fand den Pilz ebenfalls in einer Milbe (Boekhout et al. 2003). Das von

Boekhout gefundene Isolat wurde von Paz gegen Eutetranychus orientalis KLEIN,

Panonychus citri MCGREGOR, Tetranychus cinnabarinus BOISDUVAL und Tetranychus

urticae (alle Tetranychidae), Phyllocoptruta oleivora (Eriophyidae) sowie den Nicht-

Zielorganismus Rhizoglyphus robini CLAPAREDE (Acaridae), und die Raubmilben

Phytoseiulus persimilis ATHIAS-HENRIOT, Iphiseius degenerans BERLESE und

Neoseiulus californicus MCGREGOR (alle Phytoseiidae), getestet; die Applikation von

Konidien reduzierte die Milbenpopulation aller Phytophagen mit Ausnahme von

Rhizoglyphus robini um 60 Prozent, die Applikation pilzlicher Metabolite um 86

Prozent, verglichen mit den Kontrollapplikationen (Paz et al. 2007a). Die Raubmilben

wurden, abgesehen von Iphiseius degenerans, nicht beeinträchtigt, was für eine

hohe Selektivität der untersuchten Spezies spricht. Paz´ Befund (ebd.), dass es mit

konventionellen mykologischen Methoden nicht möglich war, Meira-Isolate von

Citrus-Oberflächen zu gewinnen, legte den Verdacht nahe, es handele sich bei Meira

nicht um einen Epi- sondern um einen Endophyten. In Anlehnung an Stone wies Paz

daraufhin Meira mit klassischen Methoden, sowie rasterelektronenmikroskopisch und

im Rahmen einer quantitativen Real-Time-PCR im Endokarp der Früchte nach

(Stone et al. 2000). In einer weiteren Studie mit ähnlichen Ergebnissen konnte Paz

beobachten, dass Meira nicht in den Körper der Milben eingedrungen war, die ohne

physischen Kontakt zum Pilz gestorben waren; gleichwohl war Meira in der Lage, auf

den Milbenkadavern zu wachsen (Paz et al. 2007b). Sztejnberg untersuchte

ebenfalls Boekhouts Isolat und fand eine hochsignifikante antagonistische Wirkung

gegenüber Phyllocoptruta oleivora, Panonychus citri, Tetranychus cinnabarinus und

Sphaerothecafusca spec. (Sztejnberg et al. 2004). In Bezug auf Sphaerothecafusca

spec. allerdings könne es sich Sztejnberg zufolge lediglich um einen Sekundäreffekt

Diskussion

124

handeln, da die Milben mutmaßlich als Vektor fungieren. Gerson bestätigte diese

Effekte: Meira geulakonigii tötete in Versuchen 80 – 90 Prozent der Individuen aus

mehreren Spinnmilbenarten; auch die Beobachtung von Paz, dass die Applikation

pilzfreier Extrakte des Kulturmediums signifikant auf die Milbenpopulation wirkte, wird

bei Gerson bestätigt und stützt die Annahme, dass zumindest ein Teil der

pathogenen Wirkung auf Pilztoxine zurückzuführen ist (Gerson et al. 2008). Darüber

hinaus identifizierten quantitative RT-PCR-Untersuchungen Meira geulakonigii in

Blüten und Fruchtschalen von Citrus grandis – ebenda fand Yasuda Meira

geulakonigii und schloss, der Pilz sei verantwortlich für Fruchtschäden (Yasuda et al.

2007). Diese Annahme wird von Gerson nicht bestätigt, sondern im Gegenteil

aufgrund der Assoziation des Pilzes mit Phyllocoptruta oleivora geschlussfolgert, der

Pilz fungiere als „endophytischer Bodyguard“ auf Citrus grandis und möglicherweise

anderen Pflanzen – demnach stünde die Identifikation des eigentlichen Wirtes auf

Pyrus pyrifolia, wo Yasuda den Pilz fand, noch aus. Würde er gefunden, verwunderte

auch der Zusammenhang zwischen der Abundanz von Meira und den beobachteten

Fruchtschäden auf Pyrus nicht, die Yasuda Meira zuschrieb. Die Annahme, der Pilz

sei primär milbenassoziiert und damit als Hyperparasit nur sekundär auf der

Wirtspflanze zu finden, wird durch die vorliegenden Ergebnisse sehr gut gestützt,

fehlt im Fall des Systems Apis mellifera – Varroa destructor – Meira geulakonigii der

pflanzliche Wirt doch völlig. Zumindest theoretisch kann aber auch eine tatsächlich

endophytische Herkunft des Isolats von Yasuda nicht ausgeschlossen werden. Bei

Meira handelt es sich, solange keine Einigung zur phylogenetischen Stellung

besteht, um eine Ordnung incertae sedis; für andere arthropodenpathogene Pilze,

unter anderem Metarhizium anisopliae und drei Verticillium-Spezies, konnte

Spatafora in einer Studie an sechs locis von insgesamt 69 Vertretern hauptsächlich

der Clavicipitaceae zeigen, dass es in mindestens fünf bis acht Fällen zu

Wirtswechseln auf Ebene des Regnums kam (Spatafora et al. 2007). Ausgehend von

einem basalen, tierpathogenen Vorläufer fanden drei bis fünf Wechsel zu Pilzen, ein

bis zwei Wechsel zu anderen Tieren und ein Wechsel zu Pflanzen statt. Die völlige

Übereinstimmung der publizierten Sequenzdaten von Boekhout und Yasuda spricht

allerdings dagegen (Boekhout et al. 2003; Yasuda et al. 2007). Da die Klassifizierung

des eigenen Isolats auf der Basis von Sequenzdaten eines loci erfolgte, dieses Isolat

sich aber von Boekhouts und Yasudas Isolaten – geringfügig – distinkt zeigt, wäre zu

klären, inwiefern ein Vergleich von Daten weiterer locorum sowie physiologischer

Diskussion

125

und morphologischer Daten eine genauere Abgrenzung des eigenen Isolats zuließe.

Denkbar ist, dass es sich beim eigenen Isolat um einen möglicherweise nicht nur

milben- sondern sogar Varroaspezifischen Pilz handeln könnte, der damit ein sehr

aussichtsreicher Kandidat für weitergehende Untersuchungen zu seiner

Einsetzbarkeit als Varroaantagonist wäre. Mit der in der vorliegenden Untersuchung

etablierten Methodik ist dafür eine Grundlage geschaffen worden. Zu prüfen wäre

zunächst in vitro die Hypothese, dass Meira geulakonigii ursächlich für den geringen

Milbenbefall der Völker ist, in denen der Pilz vorkommt, respektive, ob Meira keinen

oder einen vernachlässigbar geringen negativen Einfluss auf alle Stadien von Apis

mellifera hat. Als nächster Schritt schlösse sich eine Untersuchung im

Halbfreilandversuch an, um die artifiziellen Bedingungen von in vitro-Versuchen an

Bienen als Einflussfaktoren auszuschließen. Nicht zuletzt wäre ein Test des

Einflusses auf Nicht-Zielorganismen obligat: Der weitestgehend unkontrollierte Ex-

und Import von Honigbienen, und damit auch von Varroa, bedingt immer auch die

Gefahr der Verschleppung anderer Organismen; in Europa könnte Meira allochthon

sein, so dass eine Abschätzung des Risikopotentials bei einer Freisetzung

angebracht wäre. Vorausgesetzt, Meira erwiese sich als geeignetes Kontrollagens

und ungefährlich für andere Organismen, stünde, wenn der Pilz im technischen

Maßstab kultivierbar ist, ein Antagonist zur Verfügung, der zumindest einen Teil der

derzeitigen Probleme in der Kontrolle von Varroa destructor lösen würde.

Zusammenfassung

126

5 Zusammenfassung

Vor etwa 60 Jahren fand in Ostasien ein Wirtswechsel der ektoparasitischen

Milbe Varroa destructor von der östlichen Honigbiene Apis cerana auf die

ursprünglich nicht sympatrisch vorkommende westliche Honigbiene Apis mellifera

nach zuvor erfolgter weltweiter, anthropogen bedingter Verbreitung von Apis

mellifera als Nutztier statt. Unter dem Einfluss des präadaptierten Parasiten kommt

es nahezu im gesamten Verbreitungsgebiet von Apis mellifera angesichts

unbefriedigender verfügbarer Bekämpfungsstrategien zu massiven Verlusten von

Bienenvölkern und damit zu gravierenden wirtschaftlichen Schäden durch Ausfall

dieses wichtigen Bestäubers in landwirtschaftlichen Kulturen entomophiler

Nutzpflanzen. Seit der Jahrtausendwende wurde deshalb auch versucht,

Hyperparasiten, und zwar vor allem Pilze, als einsetzbare Antagonisten von Varroa

zu finden. Die bisher vorliegenden Studien konzentrierten sich vor allem auf die

bereits gegen andere Arthropoden erfolgreich eingesetzten Pilze Lecanicillium

muscarium, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana und Paecilomyces

fumosoroseus. Während einige Untersuchungen die getesteten Stämme als geeignet

klassifizierten, fanden andere, zum Teil auch vom gleichen Autor und mit demselben

Stamm durchgeführt, keine Effekte. Ursächlich dafür ist zum einen die große Varianz

in der Pathogenität der sehr pleomorphen Spezies, die die Vergleichbarkeit der an

verschiedenen Stämmen gewonnenen Ergebnisse erschwert, zum anderen die

Heterogenität der zum Einsatz gekommenen und zum Teil diskutierbaren

Untersuchungsmethodiken.

Die vorliegende Arbeit schafft eine valide, reproduzierbare Basis, um in Frage

kommende Pilze unter vergleichbaren Bedingungen zu testen. Sie führt mit in vitro-

Untersuchungen an Larven ab dem L1-Stadium, PER-Tests zur Identifikation

subletaler Effekte und einem Immunassay drei neue, bisher in diesem

Zusammenhang nicht zum Einsatz gekommene Methoden ein, die die Beantwortung

von mit bisherigen Analysen nicht zugänglichen offenen Fragen erlauben.

Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Stämme von Lecanicillium

muscarium, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana und Paecilomyces

fumosoroseus zeigten sich sowohl in vitro als auch im Halbfreilandversuch

gegenüber Varroa destructor wirkungslos. Larvenstadien und Puppenstadium von

Apis mellifera wurden nicht beeinträchtigt; Lecanicillium muscarium und Beauveria

Zusammenfassung

127

bassiana schädigten in vitro allerdings adulte Bienen signifikant. Zudem wurden für

Lecanicillium muscarium negative subletale Effekte auf Apis mellifera nachgewiesen:

Der Pilz reduzierte die Fähigkeit zu assoziativem Lernen an den ersten beiden Tagen

nach Kontakt mit ihm. Diese Beobachtung korreliert mit dem Nachweis einer

Induktion des Immunsystems durch einen sensitiven Test an Bacillus subtilis und

Escherichia coli: Mit nur einer Ausnahme (Paecilomyces fumosoroseus/Bacillus

subtilis) kam es zu einer starken Antwort, die als Beleg einer physiologischen

Belastung durch diese Pilze angesehen wird.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten auch spezifische, acaripathogene

Pilze gesucht werden, die als Antagonisten einsetzbar sein könnten. Die dabei zum

Einsatz gekommene Methodik ist ebenfalls erstmals in diesem Zusammenhang

angewandt worden und führte mit dem Fund von Simplicillium lamellicola und Meira

geulakonigii zum Erfolg. Die Pilze sind nach den Funden des unspezifischen Pilzes

Beauveria bassiana durch Meikle, der Beauveria aber in unsterilisierten Milben fand,

und Steenberg die ersten Funde entomo- beziehungsweise potentiell

acaripathogener Pilze in Varroa (Meikle et al. 2006; Steenberg et al. 2010). Das in

der vorliegenden Untersuchung gefundene Isolat von Meira geulakonigii ist darüber

hinaus der weltweit zweite Fund dieses Pilzes in Arthropoden und der dritte nach der

Erstbeschreibung. Bei Meira handelt es sich um eine Ordnung incertae sedis. Als

Arthropodenparasit wäre Meira geulakonigii eine große Ausnahme innerhalb der

Ustilaginomycotina und könnte einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von

Cospeziationsprozessen beziehungsweise Wirtswechseln zwischen höheren Taxa

liefern. Möglich ist, dass Meira geulakonigii in einem saprobiontischen, hefeähnlichen

Stadium in Blüten oder in Bienenvölkern vorkommt, in welchem einfache Zucker

metabolisiert werden, und in einem hyphenähnlichen Stadium als Milbenparasit – die

Typusbeschreibung stammt von einem Isolat aus Phyllocoptruta oleivora, das später

auch als Endophyt in deren Wirt Citrus grandis gefunden wurde. Für die Möglichkeit

einer spezifischen Acaripathogenität des eigenen Isolats spricht, dass es in einem

Apis mellifera-Volk gefunden wurde, das zu einem Cluster von Völkern gehörte, die

in Korrelationsuntersuchungen der Varroaabundanz und der Zahl der aus Varroa

isolierbaren Pilze einen deutlichen Zusammenhang von geringem Varroabefall und

einem starken Pilzvorkommen zeigten. Ein aussichtsreicher Kandidat für einen

einsetzbaren Varroaantagonisten könnte mit dem in der vorliegenden Arbeit

beschriebenen Isolat von Meira geulakonigii damit gefunden sein.

Summary

128

6 Summary

60 years ago the ectoparasitic mite Varroa destructor originating from the

eastern honey bee Apis cerana began to infest colonies of the western honey bee

Apis mellifera after its global spread by man. Preadapted, Varroa caused serious

economic damage, since Apis mellifera is an important pollinator of many crops.

Currently available counterstrategies are not satisfying: synthetic acaricides

lead to residues in honey and wax and triggered resistance in Varroa while

biotechnical methods are time-intensive. The use of organic acids is of limited

success if not applied in an exact manner. Great efforts have been made to select

Varroa-resistent honeybees but no success has been reported to date.

Some years ago one started to test already known unspecific

entomopathogenic fungi against Varroa, namely Lecanicillium muscarium,

Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Paecilomyces fumosoroseus.

Results of studies are contradictory: while some reported a reduction of mites, others

did not find any effect. On the one hand this may be caused by the use of different

strains of pleomorphic fungi, on the other hand studies differ in methods used and

sometimes lack essential techniques like standardization of bee material.

The examinations presented here create a reproducible basis for further

analyses. Three techniques not yet used in honey bee-fungus interaction research

are introduced to investigate potential fungus-induced effects on honey bee larvae

and pupae, learning ability of adult bees and induction of immune system response

of adult bees by contact with fungi.

The strains analyzed in this study did not have any effect on Varroa, neither in

vitro nor in semi-field studies, but harmed adult bees in two cases (Lecanicillium

muscarium, Beauveria bassiana). Furthermore, Lecanicillium muscarium turned out

to reduce learning ability of adult bees significantly within the first two days after

application and induced a strong reaction of the immune system.

A second aim of this study was to find specific acaripathogenic fungi, again

using a new approach. With Simplicillium lamellicola and Meira geulakonigii two new

fungi never found before in Varroa have been isolated. The own isolation of Meira

geulakonigii is the third worldwide after Boekhout´s first description of Meira found in

Israel (Boekhout et al. 2003). Still classified as an order incertae sedis, Meira as a

member of Ustilaginomycotina is assumed to live in a saprobiontic, yeast-like phase

Summary

129

und a parasitic phase with hyphae. While Simplicillium lamellicola is known to be

entomopathogenic, Meira geulakonigii has only been found in mites or in plant

tissues and therefore maybe is solely acaripathogenic. This hypothesis is supported

by correlation analyses between 2005 and 2008: For four years dependence is

shown between occurrence of fungi and frequency of mites in bee hives. Both

Simplicillium and Meira have only been found in a year with such a dependence and

in hives with many fungi while bees and cells are less parasitized by mites.

Therefore, the present results suggest that Meira geulakonigii has the potential to be

the longed for biocontrol agent to control the honey bee devastating mite Varroa

destructor.

Literatur

130

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145

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel

verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um

sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten

und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 26. Februar 2010

(Markus Holt)

146

Markus Holt,

geboren am 27. April 1971

Curriculum vitae

seit 04.2005 Promotion in der Internationalen Graduiertenschule

Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum

Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang H. Kirchner

Prof. Dr. Günter A. Schaub

10.1994 – 11.2004 Studium der Biologie an der Universität Bochum

Abschluss: Diplom

Diplomarbeit in der AG Verhaltensbiologie und Didaktik der

Biologie: „Mikrosatelliten-basierte Untersuchungen zur

Soziogenetik des Europäischen Luchses (Lynx lynx (L.))“

08.1981 – 06.1990 Heisenberg-Gymnasium in Gladbeck

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife, Note 1,4

08.1977 – 06.1981 Käthe-Kollwitz-Grundschule in Gladbeck

seit 10.2009 Studienkoordinator des Fachbereichs Biologie der

Westfälischen Wilhelms-Universität Münster

02.2008 – 09.2009 Leiter des Ausbildungslabors für Biologielaboranten der

Ruhrkohle AG Bildung

03.2007 – 07.2007 Selbständiger Dozent der Ruhrkohle AG Bildung

01.2005 – 09.2006 Wissenschaftlicher Mitarbeiter der AG Verhaltensbiologie und

Didaktik der Biologie

01.2002 – 03.2003 Mitarbeiter des Instituts für Management und Organisation

(IMO) Bochum

05.1995 – 04.2009 Mitarbeiter des Westfälischen Industriemuseums

Henrichshütte Hattingen, Entwicklung und Durchführung des

Programms „Ökologie der Industriebrache“

12.2006 – 01.2008 Organisation des Doktorandenforums der Internationalen

Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität

Bochum

147

Danksagung

Mein Dank gilt zuvorderst Prof. Dr. Wolfgang H. Kirchner für die Entwicklung des

Themas der Arbeit, vor allem aber für seinen immer zielführenden Rat und für sein

Vertrauen, das unabdingbare Basis einer selbständigen Arbeit war.

Für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens, für konstruktive Diskussionen

und die Kooperation im Rahmen des Immunassays möchte ich mich bei Prof. Dr.

Günter A. Schaub bedanken – seiner Mitarbeiterin Dipl.-Biol. Jennifer Pausch sei

herzlich für ihre praktische Unterstützung in der Durchführung des Assays gedankt.

Wissenschaftliche Arbeit profitiert immer von einem Austausch zwischen einzelnen

Disziplinen – für durchweg hilfreiche Hinweise möchte ich mich stellvertretend für alle

bei Jun. Prof. Dr. Julia Bandow, Prof. Dr. Dominik Begerow, PD Dr. Elke Genersch

(Länderinstitut für Bienenkunde Hohen Neuendorf), PD Dr. Minou Nowrousian und

PD Dr. Christine Struck (Universität Rostock) bedanken.

Ein ganz besonderer Dank gilt Dr. Pia Aumeier: Zum einen wären die Labor- und

Halbfreilandversuche an Bienen und Milben genauso wie das Pilzscreening aufgrund

des sehr erheblichen Versuchstierbedarfs ohne den von ihr exzellent geführten,

großen Bestand an Versuchsvölkern schlicht unmöglich gewesen, zum anderen

stand sie immer für einen freundschaftlichen und kompetenten Rat zur Verfügung.

Dem Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg und der Firma Koppert Biological

Systems danke ich für die Zurverfügungstellung von Pilzstämmen für die Labor- und

Halbfreilandversuche.

Meinen Codoktorandinnen Dr. Julia Eggermann, Dr. Christina Heimken und Dr. Nina

Minkley danke ich dafür, dass sie wesentlich zu einem guten Arbeitsklima

beigetragen haben: Nullius boni sine socio iucunda possessio est (Seneca).

Nicht zuletzt möchte ich mich bei meinen Arbeitgebern der Jahre 2007 – 2010, der

Ruhrkohle AG und der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster, bedanken: Für

ihr Entgegenkommen, das insbesondere in der Bereitschaft bestand, mir bis an die

Grenzen des ihnen Möglichen Flexibilität einzuräumen, um neben der Arbeit die

Promotion fortführen zu können.

Finis coronat opus (Ovid)

untersuchungen zur eignung entomopathogener und zur ... · kosmopolit ist, der alle tropischen,...

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