untersuchungen zur funktion des p38ip-gens bei prostatakarzinomzelllinien doreen kunze 20.05.05...
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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei
Prostatakarzinomzelllinien
Doreen Kunze
20.05.05
Institut für Biochemie
Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften
Technische Universität Dresden
Klinik und Poliklinik für Urologie
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus
Technische Universität Dresden
Ziele
1. Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene
2. Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK
3. Hormonabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression
1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung)
Prostatakarzinom (PCa)
• häufigste Krebserkrankung bei Männern
• zweithäufigste Krebs-Todesursache
• Lebenszeitrisiko:– Zu erkranken: 9,6 %– Zu sterben: 3,2 %
• Häufigkeitsgipfel zw. 70 – 75 Lebensjahr
• genetisch sehr heterogen
1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung)
P38IP• C13ORF19, Fam48A
• lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei Tumorsuppressorgenen
• mRNA-Expression im PCa reduziert
• Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe: verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression
Chromosom 13
13RB1
C 13BRCA2
In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP
Schematische Darstellung des längsten offenen Leserahmens im P38IP-Gen und das abgeleitete Proteinmuster.
PEST-RegionKernlokalisierungssignal
Glutamin-Cluster-Helix-Region
733 AA
CN
1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (M & M, Ergebnisse)
• M & M:
• Ergebnisse:
h nach TF-Start
siRNA-D1
siRNA-D2
siRNA-D3
siRNA-D4
siRNA-D5
12 42 % 49 % 22 % 55 % 12 %
24 50 % 58 % 40 % 56 % 16 %
48 45 % 45 % 32 % 67 % 23 %
72 56 % 50 % 36 % 93 % 31 %
020406080
100
0 100 200 300 400 500 600
Konzentration der siRNA in nM
P38I
P-m
RNA
-Ex
pres
sion
/PBG
D no
rmie
rt
auf n
s-si
RNA
siRNA-D3 siRNA-D5
Aussaat(PC-3, BPH-1)
Transfektion(4 h)
24 – 72 h WST-1-Test
ZellzählungRNA-Isolierung + qPCR
ApoptosemessungZellzyklustest
ZellkoloniebildungstestWestern Blot
20 – 68 h
Tf mit 250 nM siRNA:
24 h nach Tf:
1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse)
unbehandelt 48 h
siRNA-D5 48 h
5,5 %
ns-siRNA 48 h
4,9 % 4,3 %
Apoptosemessung (FACS) - Tf mit 125 nM siRNA
ZellkoloniebildungstestWST-Test 48 h nach Tf
0
40
80
120
160
200
ns-s
iRNA
siRN
A-D
5
unbe
hand
elt
Kolo
niez
ahl
100 Zellen/w ell 125 nM
150 Zellen/w ell 125 nM
300 Zellen/w ell 250 nM
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
ns-s
iRN
A
siR
NA-
D3
siR
NA-
D5
ns-s
iRN
A
siR
NA-
D3
siR
NA-
D5
unbe
hand
elt
OD
450
125 nM 250 nM
1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse)
0%
20%
40%
60%
80%
100%ns
-siR
NA
siR
NA
-D5
unbe
hand
elt
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
unbe
hand
elt
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
unbe
hand
elt
G0-G1 S-Phase G2-M
24 h 48 h 72 h
langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression
keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte
1.2 Chemoprotektion (M & M, Ergebnisse)
• M & M:
• Ergebnisse:
CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h)
Aussaat(PC-3)
Transfektion(4 h)
24 – 72 h 20 h WST-1-Test
ZellzählungApoptosemessung
Zellzyklustest
24 – 72 h
WST-1-Test: 96 h nach Tf
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
Eto
posi
d
ns-s
iRN
A +
Eto
posi
d
siR
NA
-D5
+E
topo
sid
Eto
posi
d
ns-s
iRN
A +
Eto
posi
d
siR
NA
-D5
+E
topo
sid
unbe
hand
elt
OD
450
5 µM 20 µM
1.2 Chemoprotektion (Ergebnisse)
0
4
8
12
16
20
ns-siRNA siRNA-D5 Etoposid ns-siRNA +Etoposid
siRNA-D5 +Etoposid
unbehandelt
Apo
ptos
erat
e in
%
0
0,5
1
1,5
2
2,5
ns-siRNA siRNA-D5 Etoposid ns-siRNA +Etoposid
siRNA-D5 +Etoposid
unbehandelt
Zellz
ahl (
x 10
6 )
0%
20%
40%
60%
80%
100%
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
Eto
posi
d
ns-s
iRN
A +
Eto
posi
d
siR
NA
-D5
+E
topo
sid
unbe
hand
elt
G0-G1 S-Phase G2-M
A
B125fache VergrößerungA: PC-3 siRNA-D5B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid
Zellzyklusarrest, keine Apoptoseinduktion
2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Einleitung)
• P38IP = p38MAPK interacting protein
• MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase• intrazelluläre Signalübertragung
(Proteinkinasen-Kaskaden)• streßaktiviert• 4 Isoformen (α, β, γ, δ)
• SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle
2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (M & M, Ergebnisse)
• M & M:
• Ergebnisse:
Aussaat (PC-3, BPH-1)
DMEM ohne FKS
24 – 72 h 24 – 72 h ZellzählungRNA-Isolierung + qPCRWestern Blot (HSP27)
10 – 60 minSB203580(0,5 – 8 µM)
020406080
100120140160
DM
SO
0,5
µM
2 µM
8 µM
unbe
hand
elt
DM
SO
0,5
µM
2 µM
8 µM
unbe
hand
elt
P38I
P-m
RNA-
Expr
essi
on re
lativ
zu
TBP
norm
iert
auf D
MSO
BPH-1 PC-3
kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK erkennbar
2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse, Ausblick)
• Ergebnisse:
HSP 27ß-Actin
HSP27 ist kein geeigneter Nachweis für p38MAPK-Inhibition
• Ausblick:Einfluss von siRNA-D5-Behandlung auf p38MAPK ?
(Western Blot mit AK gegen p38MAPK)
3. Hormonabhängigkeit (M & M, Ergebnisse)
• M & M:
• Ergebnisse:
P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig
Aussaat Hormonfreies Medium
24 h 3 – 48 hAndrogen R1881(+ Casodex)
24 h RNA-Isolierung + qPRC
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
0 10 20 30 40 50
Zeit (in h)
P38I
P-m
RNA
-Ex
pres
sion
/TBP
1 nM R1881 1 nM R1881 + Casodex10 nM R1881 10 nM R1881 + Casodex
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40 50
Zeit (in h)
PSA
-mRN
A-Ex
pres
sion
/TBP
Zusammenfassung
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !
langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression
keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte
kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK
P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig