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Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleich der Sensibilisierungskinetik von Effektorzellen der
Typ I-Allergie bei der Katze während wiederholter Exposition
mit Ctenocephalides felis in hoher und geringer Intensität
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Matthias Sydow
Berlin
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Georg von Samson-Himmelstjerna
Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover
Prof. Dr. med. vet., Dr. h.c. Wolfgang Leibold
Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Georg von Samson-Himmelstjerna
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Reinhard Mischke
Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2009
Für meine Mutter
Inhalt
1 Einleitung und Zielsetzung......................... .................................................... 13
2 Literaturübersicht................................. ........................................................... 16
2.1 Allergie ....................................................................................................... 16
2.1.1 Übersicht über die verschiedenen Allergietypen ............................................17
2.1.2 Mechanismus der Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I............................25
2.1.3 Arthropoden als Auslöser von Typ I-Immunantworten....................................28
2.2 Allergiediagnostik ....................................................................................... 30
2.2.1 In vivo-Verfahren ...........................................................................................31
2.2.2 In vitro-Verfahren...........................................................................................32
2.3 Flohallergie-Dermatitis ............................................................................... 36
2.3.1 Allgemeines...................................................................................................36
2.3.2 Biologie des Katzenflohs, Ctenocephalides felis felis.....................................37
2.3.3 Ätiologie und Pathogenese der FAD..............................................................38
2.3.4 Diagnostik......................................................................................................39
2.3.5 Therapie und Parasitenbekämpfung ..............................................................40
3 Geräte, Material und Methoden ...................... ................................................ 49
3.1 Geräte ........................................................................................................ 49
3.2 Material ...................................................................................................... 51
3.2.1 Klinikbedarf....................................................................................................51
3.2.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterial.............................................................52
3.2.3 Reagenzien ...................................................................................................54
3.2.4 Puffer und Lösungen .....................................................................................55
3.2.5 Antikörper und Sera.......................................................................................57
3.2.6 Antigene ........................................................................................................57
3.2.7 Software ........................................................................................................57
3.3 Versuchstiere ............................................................................................. 58
3.3.1 Katzen ...........................................................................................................58
3.3.2 Katzenflöhe ...................................................................................................59
3.4 Methoden ................................................................................................... 59
3.4.1 Verlaufsuntersuchung....................................................................................59
3.4.2 Blutentnahme ................................................................................................60
3.4.3 Herstellung und Aufbereitung der Antigene ...................................................61
3.4.4 Funktioneller in vitro Test (FIT) zum Nachweis Typ I-allergischer Effektorzellen.................................................................................................63
3.4.5 Intrakutantest (IKT)........................................................................................67
3.4.6 Radio Immuno Assay (RIA) ...........................................................................69
3.4.7 Parasitologische Untersuchungen .................................................................73
3.4.8 Statistik..........................................................................................................74
4 Ergebnisse ......................................... .............................................................. 77
4.1 Optimierung des FIT für die Allergiediagnostik bei der Katze..................... 77
4.1.1 Verdünnung der Blutproben...........................................................................78
4.1.2 Optimierung der Ca-Konzentration im Freisetzungspuffer..............................80
4.1.3 Lagerung und Transport von Blutproben........................................................82
4.1.4 Titration der Antikörperkonzentration .............................................................84
4.2 Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung ....................................................... 86
4.2.1 Flohinfestation ...............................................................................................86
4.2.2 Koproskopische Untersuchung ......................................................................92
4.2.3 Funktioneller in vitro-Test (FIT)......................................................................92
4.2.4 Intrakutantest...............................................................................................125
4.2.5 Übereinstimmung der Ergebnisse aus FIT und IKT .....................................134
5 Diskussion ......................................... ............................................................ 137
5.1 Methodik des FIT...................................................................................... 137
5.1.1 Modulation der Spontanfreisetzung von Basophilen der Katze ....................137
5.1.2 Reaktionsbereitschaft von Basophilen im Hinblick auf Lagerungsdauer und Temperatur..................................................................................................139
5.2 Sensibilisierungskinetik von Basophilen und Mastzellen auf C. felis- Antigen ..................................................................................................... 141
5.2.1 Zusammenhang zwischen Intensität der Flohinfestation und Antigenexposition ........................................................................................145
5.2.2 Einfluss der Expositionsintensität auf die Sensibilisierungskinetik................146
5.3 Beurteilung der Reaktion der Basophilen im FIT auf die verwendeten Flohantigen-Präparationen....................................................................... 149
5.4 Vergleich des Reaktionsverhaltens von Basophilen und Mastzellen........ 151
6 Zusammenfassung.................................... .................................................... 154
7 Summary............................................ ............................................................ 156
8 Literaturverzeichnis ............................... ....................................................... 158
Verzeichnis der Abkürzungen und Glossar der Fachtermini ad. us. vet. ad usum veterinarium, (Arzneimittel) zum
veterinärmedizinischen Gebrauch
ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity, antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität
Advantage® Handelsname für ein �spot-on Präparat mit dem Wirkstoff Imidacloprid zur Flohbekämpfung
Ag Antigen
Ag-Freisetzung Antigeninduzierte Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten
Ak Antikörper
Ak-Freisetzung Antikörperinduzierte Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten
Aliquot Teilprobe
APC Antigen presenting cells, antigenpräsentierende Zellen
arithm. arithmetisch(er)
ATP Adenosintriphosphat
Ausgangsquaddel Quaddel, die beim Intrakutantest an der Injektionsstelle allein durch das injizierte Volumen der Antigenlösung hervorgerufen wird
A. dest. Aqua destillata, destilliertes Wasser
A. tridest. Aqua tridestillata, dreifach destilliertes Wasser
B Probe im �RIA, deren Histamingehalt bestimmt werden soll
B0 Vergleichsprobe im �RIA ohne zugesetzten �Histaminstandard, die ausschließlich �125I-Histamintracer enthält
B / B0 Quotient, der die Höhe der Aktivität des �125I-Histamintracer in der zu untersuchenden Probe �B im Verhältnis zur Kontrollprobe �B0 angibt
BCA™ Bicinchoninic Acid, 2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure
Boxplot Diagrammform zur Darstellung der Verteilung numerischer Daten
BSA Bovines Serumalbumin
Bq Becquerel, Einheit für radioaktive Zerfälle pro Sekunde
CaCl2 Calciumchlorid
CDC complement dependent cytotoxicity, komplementabhängige Zytotoxizität
Cf Ctenocephalides felis-Antigen
C. felis Ctenocephalides felis, Katzenfloh
cpm counts per minute, Zählimpulse pro Minute
Da Dalton
DαG Donkey-anti-goat, Esel-anti-Ziege-Ig-Antikörper
DMSO Dimethylsulfoxid
Donkey anti goat Serum Esel-anti-Ziege Ig-Immunserum
early onset Kinetik Sensibilisierungsmuster, bei dem bereits in der Frühphase der Antigenexposition eine funktionelle Sensibilisierung im FIT nachweisbar wird
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay, enzymgekoppelter Immunadsorptionstest
EDTA Ethylendiamintetraacetat
Fc Fragment crystallizable, kristallinisierbares Fragment eines Antikörpers
FcR Fc-Rezeptor, Molekül auf der Zelloberfläche von Immunzellen, welches Antikörper über deren Fc-Teil binden kann.
FIT Funktioneller in vitro-Test zum Nachweis der Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen
Flohinfestation Besiedlung eines Wirtes mit Flöhen
flohnaiv Zustand, wenn ein Tier bisher keiner Flohinfestation ausgesetzt war
Freis. Freisetzung
GABA γ-Amino-Buttersäure
Gαh Goat anti histamine, Ziege-anti-Acylhistamin-Antikörper
generelle Sensibilisierung Fähigkeit der basophilen Granulozyten, durch Vermittlung ihrer membranständigen Antikörper auf eine Antikörperstimulation zu reagieren. Die generelle Sensibilisierung kann mit Hilfe der �Ak-Freisetzung überprüft werden.
geringe Exposition Belastung mit einer geringen Flohantigenmenge
gesaugte Flöhe Flöhe, die eine Blutmahlzeit aufgenommen haben, was sich im Stereomikroskop durch den Nachweis von Erythrozytenhämoglobin im Verdauungstrakt bestimmen lässt
HCl Salzsäure
Histaminstandard Lösung mit definierter Histaminkonzentration zur Anwendung im �RIA
hohe Exposition Belastung mit einer hohen Flohantigenmenge
Ig Immunglobulin
IgG (H+L) Immunglobulin G (heavy + light, schwere und leichte Kette)
125I-Histamintracer 125I-konjugiertes Histamin, welches im �RIA zur kompetitiven Bestimmung des Histamingehaltes einer Probe verwendet wird
IKT Intrakutantest
K Kalium
KCl Kaliumchlorid
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
Kodan® Desinfektionsspray zur Hautdesinfektion
late onset Kinetik Sensibilisierungsmuster, bei dem erst in einer späteren Phase der Antigenexposition eine funktionelle Sensibilisierung im �FIT nachweisbar wird
MAC Membrane attacking complex, Membran attackierender Komplex
Max Maximalfreisetzung: gesamte zur Verfügung stehende Histaminmenge, die durch basophile Granulozyten freigesetzt und nachgewiesen werden kann
MFO mixed function oxidase, Oxidasen, die unter Bildung von H2O 2 Substrate gleichzeitig oxidieren: AH2 + BH + O2 werden unter der Wirkung solcher Oxidasen zu A + BOH + H2O
MgCl2 Magnesiumchlorid
MHC Major Histocompatibility Complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
MW Mittelwert
n.a. nicht auswertbar
NaCl Natriumchlorid
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
(NH4)HCO3 Ammoniumbikarbonat
NaN3 Natriumazid
NaOH Natriumhydroxyd (Natronlauge)
NSB nichtspezifische Bindung: Kontrollansatz für nicht antikörpergebundenes Histamin im �RIA
NHS-Biotin N-Hydroxysuccinimido-Biotin
PBS Phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PEG Polyethylenglykol
Pipes Piperazine-N,N’-bis[2-ethanesulfonic]acid
pH potentia Hydrogenii, negativer dekadischer Logarithmus der H+-Ionenkonzentration einer Lösung
rF relative Feuchte
RαC Rabbit anti Cat, Kaninchen-anti-Katzen-IgG Antikörper
Reaktionsquaddel Quaddel, die sich beim Intrakutantest infolge der Reaktion auf die injizierten Substanzen / Antigene bildet
ROS Reactive oxygen species, freie Sauerstoffradikale
SD standard deviation, Standardabweichung
spezifische Sensibilisierung Vorhandensein von Antikörpern einer bestimmten Spezifität auf der Oberfläche von basophilen Granulozyten oder Mastzellen, die ein Antigen spezifische erkennen und nach ausreichender Bindung (bridging) eine � Ag-induzierte Freisetzung vermitteln können.
Spon Spontane Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten, die ohne eine stimulierende Substanz (wie Antigen oder Antikörper) unter schonenden Inkubationsbedingungen auftritt.
spot on Präparat bzw. Applikationsverfahren, bei dem der Wirkstoff durch Auftropfen auf die Haut angewendet wird
Stamm „G“ Laborstamm von �C. felis, der bei Greer Labs zur Herstellung des Antigenextrakts �WBE-G verwendet wurde
Stamm „H“ Laborstamm von �C. felis, der im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Herstellung des Antigenextrakts �WBE-H verwendet wurde
T Tracer:�hier 125Iod-Histamin-Tracer
t0 Zeitpunkt 0, zu dem im Intrakutantest der Durchmesser der �Ausgangsquaddel ermittelt wird
TiHo Tierärztliche Hochschule Hannover
Triton X 100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trizma® Base Tris[hydroxymethyl]aminomethan
Tween 20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
verd. verdünnt
WBE-G Whole Body Extract-Greer (Ganzkörperextrakt von Flöhen des �“Stammes G” von Greer Laboratories, USA)
WBE-H Whole Body Extract-Hannover (selbsthergestellter Ganzkörperextrakt von Flöhen des �“Stammes H”)
Whisker vertikale Linie in einem �Boxplot
w/v weight per volume, Gewicht pro Volumen
Ziege-anti-Acylhistamin von Ziegen stammende Antikörper mit Spezifität gegen Acylhistamin
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1 Einleitung und Zielsetzung
Das Auftreten von Allergien ist ein Phänomen, welches mit zunehmender Häufigkeit
nicht nur beim Menschen, sondern auch bei Tieren zu beobachten ist. Trotz der
steigenden Relevanz dieses vielfältigen Krankheitsbildes ist eine ursächliche
Therapie bislang nicht gefunden.
Zwar sind wichtige Immunmechanismen bekannt, die zu der klinischen Symptomatik
führen, was aber die über eine schützende Immunantwort hinausgehende Reaktion
eines Individuums gegen ein oder mehrere Antigene auslöst und wie diese
beeinflusst werden kann, ist Gegenstand der Forschung. Die am häufigsten
auftretende Form der Allergie ist die Typ I-Allergie, welche auch als
Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp bezeichnet wird.
Grundvoraussetzung für die Ausprägung einer Typ I-Allergie ist eine ausreichende
Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen (basophilen Granulozyten und Mastzellen)
mit geeigneten Antikörpern gegen eine bestimmte Substanz (Antigen). Um dies zu
erreichen, muss ein Individuum zuerst spezifische Antikörper gegen antigene
Teilstrukturen (Epitope) von Antigenen bilden, die zudem auf Grund ihres konstanten
Teiles (Isotyp) geeignet sind, an membranständige Fc-Rezeptoren von Typ I-
Effektorzellen in ausreichender Dichte zu binden. Derart sensibilisierte Basophile
(vorwiegend im Blut) oder Mastzellen (vorwiegend in Haut und Schleimhaut) können
nun von einem Antigen aktiviert werden, indem dieses gleichzeitig von mindestens
zwei sensibilisierenden Antikörpern, somit an mindestens zwei Epitopen, gebunden
wird und dadurch zur Vernetzung (bridging) von mindestens zwei Fc-Rezeptoren
führt (KNOL 2006). Vernetzte Fc-Rezeptoren lösen in den Zellen Signalkaskaden
aus, die zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren führen können. Abhängig von
der Art und Stärke der Mediatorausschüttung werden von subjektiv nicht spürbaren,
lokalen Entzündungsreaktionen, über deutlich spürbare, meist heftig juckende lokal
überschießende allergische Reaktionen bis hin zu systemisch wirksamen
Symptomen wie dem lebensbedrohlichen anaphylaktischen Schock, verschiedene
Ausprägungen beobachtet. Die Regulationsmechanismen, die entscheiden, ob aus
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der Sensibilisierung gegen ein spezifisches Antigen eine klinisch manifeste Typ I-
Allergie entsteht, sind komplex und bis dato nicht geklärt.
Eine Typ I-Allergie kann zum Beispiel neben Pollen und Futtermittelinhaltsstoffen
auch gegen Antigene von Arthropoden gerichtet sein. Im Bereich der Kleintiermedizin
ist hier vor allem der Katzenfloh, Ctenocephalides felis, als häufigster Ektoparasit von
Hund und Katze zu nennen (REEDY et al. 1997). Neben der direkten Schädigung
des Wirts durch Juckreiz, Verletzung der Haut und Blutverlust wird beim Saugakt
Speichel in die Wunde injiziert, dessen Proteinkomponenten beim Wirt eine Typ I-
Allergie auslösen und die Symptome einer Flohallergie-Dermatitis (FAD), wie
Pruritus, Alopezie, Erytheme, Papeln und Exkoriationen hervorrufen können. Diese
gehen oft mit einer miliaren Dermatitis einher. Die FAD ist eine der häufigsten
dermatologischen Erkrankungen beim Kleintier (DRYDEN u. BLAKEMORE 1989).
Ein Verfahren zur Diagnostik der Flohallergie-Dermatitis ist der Intrakutantest (IKT),
bei dem nach intradermaler Applikation des Antigens die Ödematisierung des
Gewebes als lokale Reaktion der Mastzellen an der Applikationsstelle abgelesen und
hieraus eine Aussage über den Sensibilisierungsstatus abgeleitet wird. Wegen des
erhöhten Aufwands und gelegentlichen Schwierigkeiten bei der Interpretation der
Ergebnisse (VROOM 2000) werden in der Praxis auch serologische Verfahren
eingesetzt, die auf dem Nachweis von spezifischen Antikörpern im Patientenserum
mittels eines ELISA beruhen. Diese sind jedoch klinisch weit weniger relevant als der
Intrakutantest, da nur die auf den Mastzellen (wie auch den Basophilen) gebundenen
sensibilisierenden Antikörper eine Zellaktivierung vermitteln und dadurch eine
klinische Symptomatik auslösen können.
Als weiteres Testverfahren steht seit einigen Jahren der funktionelle in vitro-Test
(FIT) zum Nachweis der Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen zur Verfügung, der
im Gegensatz zu serologischen Tests darauf beruht, die Sensibilisierung der
basophilen Granulozyten aus dem Blut des Patienten generell und gegen spezifische
Antigene zu untersuchen (KAUL 1998; STUKE 2005).
Da das Verständnis über die Regulation der Typ I-Immunantwort noch unzureichend
und der Nutzen einer spezifischen Immuntherapie zur Behandlung der FAD fraglich
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ist (PATERSON 2000; LAFFORT-DASSOT et al. 2004), zielt die gängige
Behandlungsstrategie auf die Eradikation des Flohbefalls und somit auf die
Verminderung oder Vermeidung einer Exposition von Flohantigenen ab (DRYDEN u.
BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997; CARLOTTI u. JACOBS 2000; RUST 2005).
Hierzu steht ein breites Spektrum an Substanzen mit unterschiedlichem
Wirkmechanismus und Applikationsart zur Verfügung.
Über den Einfluss der Antigenmenge auf das Sensibilisierungsverhalten von
Effektorzellen der Typ I-Allergie bei der Katze ist bisher nichts bekannt. Daher sollte
in dieser Arbeit die Entwicklung der spezifischen Sensibilisierung von nicht
sensibilisierten und vorsensibilisierten Katzen gegen Antigene des Flohspeichels von
Ctenocephalides felis mit Hilfe des funktionellen in vitro-Tests (FIT) untersucht
werden, welcher unabhängig von einer klinischen Symptomatik anhand der
membranständigen Antikörper eine funktionelle Sensibilisierung der Basophilen
gegen Flohantigene nachweisen kann.
Dabei standen insbesondere folgende Fragestellungen im Vordergrund:
1. Wie kann der FIT für die Katze methodisch optimiert werden?
2. Welchen Einfluss hat die mehrmonatige, wöchentliche Applikation einer hohen
bzw. einer deutlich geringeren Antigenmenge durch Exposition mit C. felis auf
den Grad und die Kinetik der Sensibilisierung von Basophilen und Mastzellen?
3. Welche Aussagen können anhand des FIT hinsichtlich der benötigten
Antigenmenge zur Induktion einer Sensibilisierung gegen C. felis gemacht
werden?
4. Wie korrelieren die Resultate des funktionellen in vitro-Tests (FIT) mit dem
Intrakutantest (IKT) als in vivo-Testverfahren?
5. Wie unterscheiden sich verschiedene Antigenpräparationen von Ctenocephalides
felis in der Reaktionsbereitschaft der Basophilen im FIT bzw. der Mastzellen im
IKT?
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2 Literaturübersicht
2.1 Allergie
Bei der Interaktion des Organismus mit seiner Umwelt wird dieser mit biotischen und
abiotischen Faktoren konfrontiert. Vom Immunsystem eines Individuums werden von
all diesen Faktoren nur diejenige mit einer Immunreaktion beantwortet, die die vom
Immunsystem zu überwachende genetisch vorgegebene „innere Ordnung“ stören.
Geschieht diese „Störung“ durch körpereigene Strukturen, die der Organismus
eliminieren möchte (falsch ausdifferenzierte, geschädigte oder funktionsgestörte
Zellen bzw. Tumorzellen), so setzt das Immunsystem dazu ein breites Spektrum an
Immunmechanismen ein. Diese wünschenswerten Immunreaktionen werden als
„Autoimmunität“ bezeichnet. Autoimmunität ist somit nicht schädlich, sondern sogar
lebensnotwendig. Sollten jedoch dieselben Immunmechanismen statt unerwünschter
funktionsfähige und deshalb erhaltenswerte Zellen angreifen und zerstören, so wird
diese immunologische Selbstzerstörung als „Autoaggression“ bezeichnet. Es können
klinische Symptome entstehen, die dann als „Autoaggressionserkrankung“ oder
synonym als „Autoimmunerkrankung“ bezeichnet werden. Vergleichbar ist es bei
Störung der inneren Ordnung durch von außen kommende (exogene) Strukturen.
Prinzipiell die gleichen Immunmechanismen, die eine schützende Autoimmunität
oder eine pathogene Autoaggression bewerkstelligen, können gegen störende
exogene Strukturen einerseits schützende Immunantworten („Immunität“) oder
andererseits überschießende pathogene Immunreaktionen entwickeln. Diese können
zu klinischen Symptomen führen, die als „Allergie“ bezeichnet werden. Warum es im
Einzelfall statt einer Autoimmunität zu einer unerwünschten Autoaggression gegen
körpereigene Strukturen kommt, ist ebenso unbekannt wie die Ursachen der
Entstehung einer pathogenen Allergie statt einer schützenden Immunität gegen
körperfremde Strukturen.
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Strukturen, die vom Immunsystem erkannt werden, nennt man „Antigen“. Reagiert
ein Individuum auf ein körperfremdes Antigen mit einer überschießenden
Immunreaktion, die zu klinischen allergischen Symptomen führt, so stellt dieses
Antigen für dieses Individuum ein „Allergen“ dar. Somit macht erst die
überschießende Immunreaktion eines Individuums ein Antigen zum „Allergen“. Es ist
jedoch nicht zu übersehen, dass einige Antigene häufiger und andere seltener mit
überschießenden Immunreaktionen beantwortet werden, also häufiger bzw. seltener
als „Allergene“ in Erscheinung treten. (JANEWAY et al. 2002).
2.1.1 Übersicht über die verschiedenen Allergietype n
Bei schützenden wie überschießenden Immunantworten ist prinzipiell das gleiche
Spektrum an Immunreaktionen beteiligt. Abhängig von der Art der Störung der
„inneren Ordnung“ werden jedoch unterschiedliche Komponenten und Mechanismen
des Immunsystems eingesetzt, was zu sehr verschiedenen Abläufen und klinischen
Symptombildern führen kann.
GELL und COOMBS versuchten im Jahr 1968 unterschiedliche Formen von
allergischen Immunreaktionen mit den beteiligten Komponenten und Mechanismen
zu „ordnen“, indem sie sie in „Reaktionstypen“ einteilten. Da die gleiche Einteilung
sich auch für schützende Immunreaktionen eignete, spricht man heute generell von
Immunreaktionstypen und nicht mehr nur von „Allergietypen“.
Die Immunreaktionstypen I, II und III beschreiben unterschiedliche zelluläre
Immunreaktionen in Interaktion mit Antikörpern und/oder Komplementkomponenten.
Der Immunreaktionstyp IV wird allein von Immunzellen ohne Beteiligung von
Antikörpern oder Komplement durchgeführt. Der nachträglich hinzugekommene
Immunreaktionstyp V wird allein von Antikörpern ohne Beteiligung von Zellen oder
Komplement bewerkstelligt.
Die Typ I-Allergie , die auch als Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp
bezeichnet wird, kann binnen Minuten bis Stunden nach Antigenkontakt zu einer
klinischen Reaktion führen. Diese geht mit Vasodilatation, erhöhter
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Gefäßpermeabilität, und Juckreiz einher und kann bis zum allergischen Schock
führen. Ausgelöst wird dies von Mediatorsubstanzen (Entzündungsmediatoren,
Zytokinen und Chemokinen) aus aktivierten Effektorzellen der Typ I-Immunreaktion,
basophilen Granulozyten und Mastzellen. Diese „Typ I-Effektorzellen“ haben selbst
keine spezifischen Erkennungsmöglichkeiten wie B-Lymphozyten (selbst gebildete
membranständige Antikörper) oder T-Lymphozyten (selbst gebildete
membranständige Antigenrezeptoren). und können deshalb alleine auch keine
Antigenstrukturen spezifisch erkennen. Werden die Typ I-Effektorzellen unspezifisch
aktiviert, z. B. durch die Komplementkomponenten C3a, C5a (auch als
Anaphylatoxine bezeichnet) oder durch eine Reihe von Medikamenten, so spricht
man von einer „allergoiden“ oder pseudoallergischen Reaktion.
Sollen die Typ I-Effektorzellen spezifisch gegen Antigenstrukturen (Epitope)
reagieren können, müssen sie zuvor mit Antikörpern ausgestattet werden, die diese
Epitope mit ausreichender Bindungsstärke (Affinität) erkennen. Um solche Antikörper
wirkungsvoll aufzunehmen, sind Mastzellen und Basophile mit Fc-Rezeptoren
ausgestattet, die besonders stark IgE-Ak (Fcε-Rezeptor I: FcεRI) aber auch
bestimmte IgG-Ak (Fcγ-Rezeptor II und III: FcγRII, FcγRIII) binden können. Unter
immunologischer „Sensibilisierung“ ist die Bindung geeigneter Ak-Isotypen an Fc-
Rezeptoren von Typ I-Effektorzellen zu verstehen. Erst dadurch werden diese Zellen
in die Lage versetzt, eine spezifische Typ I Immunreaktion auszulösen, die im
überschießenden Falle zu den Symptomen einer Typ I-„Allergie“ führt.
Werden beim Erstkontakt mit einem Antigen spezifische Antikörper dagegen
gebildet, so sind es stets zuerst Antikörper vom IgM Isotyp. Da die Typ I-
Effektorzellen keine geeigneten Fc-Rezeptoren für IgM ausbilden, eignen sich IgM-
Ak nicht als sensibilisierende Antikörper für Typ I-Immunreaktionen. Entwickelt ein
Individuum Antikörper mit gleicher Spezifität, jedoch anderen Isotypen als IgM, so hat
es zu diesem Isotypwechsel die Zytokinhilfe von T-Helferzellen in Anspruch
genommen. Wirken dabei überwiegend Zytokine (bevorzugt IL-4) von T-Helferzellen
2 (Th2) auf die Ak-produzierenden B-Lymphozyten ein, so werden sie vom nicht
sensibilisierenden IgM zu den sensibilisierenden Ig-Isotypen IgG4 (beim Menschen)
und IgE wechseln. Dominiert hingegen der Einfluss der T-Helferzelle 1 (Th1) mit
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ihrem Zytokin IFN-γ, so wird ein Wechsel zu sensibilisierenden Isotypen gehemmt,
aber dafür andere, nicht sensibilisierende Isotypen wie IgG1, 2 oder 3 (beim
Menschen) ausgebildet. Somit kann es gegen ein Antigen Antikörper mit gleicher
Epitopspezifität, jedoch unterschiedlichen, sensibilisierenden und nicht
sensibilisierenden Isotypen geben. Dies ist eine Ebene, die darüber entscheidet, ob
ein Individuum gegen ein bestimmtes Antigen Typ I allergisch wird oder nicht, denn
ohne eine ausreichende Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen kann sich keine
Typ I-Allergie entwickeln. Zu weiteren Mechanismen von Typ I-Immunreaktionen und
ihrer Regulation s. 2.1.2.
Es gibt Individuen, die gegen eine Reihe von Antigenen sensibilisiert sind und auf
diese vermehrt mit Typ I-Allergien reagieren. Dieses als Atopie bezeichnete
Krankheitsbild kann bei Hunden bestimmter Rassen häufiger auftreten (TIZARD
2004).
Verbreitete Beispiele für Typ I-Allergien sind die Flohallergie-Dermatitis bei Hund und
Katze, das Sommerekzem (Insektendermatitis) sowie die Pollenallergie bei Pferden
(eine Ursache des Headshakings) und bei Menschen (Heuschnupfen). Insgesamt
sind Typ I-Allergien gegen ein wachsendes Spektrum an Antigenen an einer
zunehmenden Zahl sehr unterschiedlicher Erkrankungen beteiligt.
An Typ II-Immunreaktionen sind als Effektorzellen Natürliche Killerzellen (NK-
Zellen) und Phagozyten (Makrophagen, Monozyten, neutrophile und eosinophile
Granulozyten) beteiligt. Sie sind sowohl mit Fc-Rezeptoren (FcγR I, II, III) für
aktivierte Fc-Teile mehrerer IgG-Isotypen als auch mit Rezeptoren (die
Komplementrezeptoren: CR1, CR3 & CR4) für die aktivierten bzw. inaktivierten C3
Komplementkomponenten C3b bzw. iC3b ausgestattet.
Sobald ein Antikörper, der durch seine spezifische Bindung an ein Epitop auf einer
Zelle, einem Gewebe oder einem Partikel (Zell- oder Gewebsfragment, Virus,
Bakterium, Parasit) seinen Fc-Teil „aktiviert“, d.h. so umstrukturiert, dass er nun
direkt und ausreichend stark an einen der Fc-Rezeptoren dieser Effektorzellen
binden kann, wird er zum „opsonisierenden“ Antikörper: Er markiert seine partikuläre
Zielstruktur für die Typ II Effektorzellen. Binden mindestens zwei opsonisierende
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Antikörper auf einem Partikel an zwei FcR einer Effektorzelle („bridging“), so kann
diese aktiviert werden. Dies führt entweder zur Phagozytose des opsonisierten
Partikels (durch Makro- oder Mikro-Phagen) oder zum Abtöten (zytotoxische
Aktivität) durch NK-Zellen in Form der ADCC (antibody dependent cellular
cytotoxicity = Ak-abhängige zelluläre Zytotoxizität) z. B. von opsonisierten
Tumorzellen. Sehr effizient tragen zu Typ II-Immunreaktionen auch IgM-Ak bei,
obwohl kaum eine dieser Effektorzellen dafür einen Fc-Rezeptor (FcµR) besitzt.
Bindet das meist als Pentamer im Serum vorkommende IgM spezifisch an ein
partikuläres Epitop, aktiviert es seine Fc-Teile und kann nun auf Grund seiner
Pentamerstruktur sehr effizient die Komplementkaskade klassisch aktivieren
(beginnend mit C1q), so dass seine aktivierten Fc-Teile sehr schnell mit C3b-
Molekülen umgeben sind. Damit wird IgM samt C3b zum „opsonisierenden“ Komplex
für das Partikel, auf dem das IgM ein oder mehrere Epitope spezifisch erkannt hat. Er
kann nun an Komplementrezeptoren auf den Typ II-Effektorzellen binden und sie -
bei ausreichendem „bridging“ - zur Phagozytose oder zur zytotoxischen Wirkung
aktivieren.
Sind keine Effektorzellen rechtzeitig am Ort der Opsonisierung (obwohl sie durch
Komplementspaltprodukte, insbesondere C5a, chemotaktisch herangelockt werden),
kann eine Komplementkaskade, ausgelöst durch die primäre spezifische Bindung
eines IgM oder eines komplementbindenden IgG-Isotyps, über C3 hinaus bis zum
Membran-attackierenden Komplex (MAC: C5b-C6-C7-C8-C9) ablaufen und intakte
Partikel (Zellen, Bakterien, Parasiten) dadurch so weit schädigen, dass sie inaktiviert
bzw. abgetötet werden (CDC: complement dependent cytotoxicity =
komplementabhängige Zytotoxizität). In der Frühphase einer Immunreaktion gegen
ein partikuläres Epitop, zu der noch keine oder zu wenige Antikörper gebildet
wurden, kann eine Typ II-Reaktion auch direkt von Komplementkomponenten
ausgelöst werden: Über den „Lektinweg“ oder den „alternativen“
Komplementaktivierungsweg können unspezifische Strukturen auf (meist
körperfremden) Partikel die Komplementkaskade auch ohne initiale Antikörper
auslösen und zu einer C3b- und C5a-vermittelten Aktivierung von Typ II
Effektorzellen oder zur CDC führen (JANEWAY et al. 2002; TIZARD 2004).
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Somit stehen dem Immunsystem mit den Mechanismen der Typ II-Reaktionen
flexible und vielseitige Möglichkeiten zur Kontrolle unerwünschter Zellen und
Gewebe, samt ihrer partikulären Fragmente und Eindringlinge von außen
(Fremdkörper, Viren, Bakterien, Parasiten) für eine permanente und
lebensnotwendige Immunüberwachung seines Organismus (Autoimmunität) zur
Verfügung.
Werden diese Typ II-Mechanismen vom Immunsystem zu nicht erwünschten
„überschießenden“ Reaktionen gegen intakte Zellen und deren Zerstörung
eingesetzt, z. B. gegen autologe Epitope auf intakte Erythrozyten oder intakten
Thrombozyten, so führt diese Autoaggression zur autoimmunhämolytischen Anämie
(AIHA, „primäre“ Anämie) oder autoimmunen Thrombopenie (AITP, „primäre“
Thrombopenie). Setzen sich jedoch auf den Erythrozyten bzw. Thrombozyten
körperfremde (xenogene) Strukturen wie Medikamente (z. B. Penicillin, Sulfonamide,
Chinine) oder Komponenten von Erregern (z. B. Bakterien) ab, gegen die das
Immunsystem Antikörper gebildet hat, so werden diese Zellen über art- und
körperfremde (xenogene) Epitope durch Antikörper und / oder Komplement zur
Phagozytose oder ADCC opsonisiert bzw. durch CDC zerstört. Dies sind Beispiele
einer Typ II-Allergie, die hier zur immunbedingten hämolytischen Anämie (IMHA,
„sekundäre“ Anämie) oder immunbedingten Thrombopenie (ITP, „sekundäre“
Thrombopenie) führen können. Abhängig davon, auf welchen Zellen oder Geweben
autologe Strukturen zu überschießenden Typ II-Autoaggressionsreaktionen oder
abgelagerte xenogene Strukturen zu überschießenden Typ II allergischen
Reaktionen führen, können sehr unterschiedliche Erkrankungsbilder entstehen.
Unter Typ III-Immunreaktionen werden Komponenten und Mechanismen
zusammengefasst, die in vielen Aspekten Typ II-Reaktionen entsprechen: Typ III-
Effektorzellen sind ebenfalls gekennzeichnet durch die konstitutive Expression von
Fcγ- bzw. Fcε-Rezeptoren und / oder Rezeptoren für die Komplementkomponenten
C3b bzw. C3a, C4a, C5a. Somit umfassen sie alle Typ II-Effektorzellen, erweitert um
Basophile, Thrombozyten, dendritische Zellen und B-Lymphozyten. Beteiligt können
alle Ak-Isotypen sein, für die entweder FcR vorhanden sind und / oder die nach
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Aktivierung durch Ag-Bindung Komplement aktivieren können. D. h. alle Ig-Isotypen,
mit Ausnahme des IgA, können sich wirkungsvoll an Typ III Immunreaktionen
beteiligen.
Diese bestehen darin, dass – im Gegensatz zu Typ II – nicht partikulär gebundene
Epitope, sondern Epitope auf löslichen Strukturen im Körper durch freie Antikörper
spezifisch gebunden werden. Diese primär löslichen Immunkomplexe können
sekundär mit den aktivierten Fc-Teilen ihrer Antikörper direkt an Typ III-Effektorzellen
mit geeigneten FcR andocken und diese zu einer Eliminationsreaktion, Auslösung
einer Entzündungsreaktion bzw. Induktion einer spezifischen Immunantwort
aktivieren. Teilweise ist das auch indirekt möglich, indem aktivierte Fc-Teile
komplementbindender Ak-Isotypen in solchen Immunkomplexen die klassische
Komplementkaskade aktivieren und so Zellen mit C3b-Rezeptoren aktivieren. Zum
Repertoire von Typ III-Immunreaktionen gehört zusätzlich, dass - meist xenogene -
lösliche Substanzen auch ohne vorherige Bindung durch Antikörper über den Lektin-
oder alternativen Weg das Komplementsystem aktivieren und so über Zellen mit
geeigneten Komplementrezeptoren eine Eliminations- oder Entzündungsreaktion
auslösen (JANEWAY et al. 2002; TIZARD 2004).
Treten „überschießende“ Typ III-Reaktionen gegen körpereigene lösliche Strukturen
auf, so kommt es zu Typ III-Autoaggressionsreaktionen wie beim Lupus
erythematodes oder bei rheumatoiden Erkrankungen mit Bildung von
Rheumafaktoren und vermehrt Immunkomplexen. Werden „überschießende“ Typ III-
Immunreaktionen gegen körperfremde lösliche Strukturen von physiologischer,
prophylaktischer oder therapeutischer Bedeutung entwickelt (z. B. schützende
allogene oder xenogene Antikörper in Form einer passiven Immunisierung), so
können diese eine Typ III Allergie bedingen. Sie kann nur lokal ausgeprägt sein
(Arthus-Reaktion) oder systemisch (Serumkrankheit). Bevor geeignete Antibiotika zur
Verfügung standen, wurde zur Therapie von lebensbedrohlichen bakteriellen
Infektionen des Menschen Antiserum von zuvor immunisierten Pferden eingesetzt,
welche gegen die Erreger Antikörper gebildet hatten. Dabei trat als Komplikation
sieben bis zehn Tage nach Behandlung mit dem Antiserum eine
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immunkomplexbedingte Überempfindlichkeitsreaktion mit Fieber, Vaskulitis,
Glomerulonephritis und Arthritis auf.
Während bei Immunreaktionen der Typen I, II und III eine spezifische
Epitoperkennung durch den Fab-Teil des Antikörpers erfolgt und alle nachfolgenden
Funktionen durch den Fc-Teil der Antikörper vermittelt werden, ist dies bei
Immunreaktionen der Typen IV oder V nicht der Fall: Bei Typ IV Immunreaktionen
sind Antikörper nicht beteiligt und bei Typ V spielt allein der Fab-Teil des Antikörpers
die funktionelle Rolle.
Obwohl bei den Typ IV-Immunreaktionen nur Zellen beteiligt sind, wird auch hier
ein Spektrum unterschiedlicher Immunmechanismen zusammengefasst. Ihnen ist
gemeinsam, dass sie lokal reagieren, mit begrenzter systemischer Auswirkung.
Abhängig vom Auslöser und den beteiligten Zellen können sich Typ IV-
Immunreaktionen innerhalb von 24 Stunden oder später entwickeln und über
mehrere Wochen anhalten. Zur Kontrolle bestimmter löslicher Substanzen, die selbst
chemotaktisch wirken oder die Freisetzung chemotaktischer Substanzen induzieren
(z. B. Hautdesinfektionsmittel, Pilz- oder Insektengifte) wandern lokal primär
basophile Granulozyten ein, bald gefolgt von Lymphozyten und Monozyten. Diese
Typ IV-Form wird auch als „Jones-Motes-Reaktion“ bezeichnet.
Bestimmte Antigene (wie Komponenten von Mykobakterien oder metallische
Haptene wie Nickel und Chrom auf körpereigenen oder körperfremden Proteinen als
Träger) werden von dendritischen Zellen aufgenommen und MHC-präsentiert.
Vorwiegend MHC-restringierte T-Helferzellen (CD4+), aber auch zytotoxische T-
Zellen (CD8+) werden dadurch aktiviert und so die Proliferation epitop- bzw.
haptenspezifischer Zellen ausgelöst. Diese Gedächtniszellen können bei erneutem
Auftreten „ihrer“ Epitope innerhalb von 24-72 h lokale Schwellungen in Form von
zellulären Papeln durch Einwanderung, Proliferation sowie mittels Chemokinen
angelockten Lymphozyten und Monozyten ausprägen. Diese Typ IV-Form wird als
Tuberkulin- bzw. Kontaktreaktion bezeichnet.
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Dauert die lokale „Reizung“ der T-Lymphozyten über längere Zeit an, so kann sich
eine als Granulomreaktion bezeichnete Typ IV-Form entwickeln. Sie hält über
Wochen an und ist durch Hinzukommen von Makrophagen, Riesenzellen sowie
Epithelzellen mit anschließender Fibrosierung gekennzeichnet.
Beispiele für Autoaggressionsreaktionen durch „überschießende“ Typ IV-
Mechanismen gegen autologe Epitope sind der insulinabhängige Diabetes mellitus
(zytotoxische T-Zellen gegen ß-Zellen des Pankreas), multiple Sklerose (CD4+ T-
Zellen gegen basisches Myelinprotein) sowie CD4+ T-Zellen gegen Autoantigene die
zur Progression der rheumatoiden Arthritis beitragen. „Überschießende“ Typ IV-
Mechanismen gegen ein weites Spektrum an körperfremden Strukturen wie
Bakterien, Pilze, Parasiten, Pflanzen und als Haptene wirksame chemische
Substanzen (Farbstoffe, Reinigungs- bzw. Desinfektionsmittel, Medikamente und
Repellentien) können zu Typ IV-Allergien führen. Überschießende Typ IV-Reaktionen
können auch bei der Spätform der FAD des Hundes von Bedeutung sein (TIZARD
2004).
Während bei Typ IV-Immunreaktionen die Zerstörung und Elimination von Zellen und
Substanzen im Vordergrund stehen, dominiert bei Typ V-Immunmechanismen die
regulative Wirkung im Sinne einer Ak-bedingten Stimulation oder Hemmung. Bildet
das Immunsystem Antikörper gegen Zelloberflächenrezeptoren, so können diese den
natürlichen Liganden imitieren. Sie aktivieren somit den Rezeptor, unterliegen jedoch
nicht der Feedback-Kontrolle wie der Ligand. So kann es zu einer überschießenden
Ak-bedingten Aktivierung der Rezeptoren für das Thyreoidea stimulierende Hormon
(TSH-R) der Schilddrüsenepithelzellen kommen. Diese produzieren daraufhin
überschießend viel Schilddrüsenhormone (T3, T4), was zur Hyperthyreose (Morbus
Basedow oder Grave´s disease) führen kann. Ein Beispiel für eine hemmende Typ V
Reaktion ist die Myasthenia gravis. Werden Antikörper gegen den
Acetylcholinrezeptor auf Muskelzellen gebildet, die die Anlagerung neurogenen
Acetylcholins blockieren, so kommt es zur schlaffen Muskellähmung, da eine
ausreichende neuromuskuläre Erregung unterbleibt. Am selben Rezeptor kann es
sogar zur Ak-bedingten Hemmung und Stimulation kommen, abhängig von der
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Bindungsstelle (Epitop) des Ak am Rezeptor: So können Antikörper gegen den
Insulinrezeptor derart binden, dass sie die Anlagerung von Insulin blockieren. In
Folge dessen wird keine Glucose in die Zellen aufgenommen und es entwickelt sich
das Bild eines insulinresistenten Diabetes mit Hyperglykämie und Ketoazidose.
Bindet der Antikörper jedoch an einem anderen Epitop desselben Rezeptors, so
imitiert er eine permanente Bindung von Insulin, stimuliert damit eine gesteigerte
Aufnahme von Glucose in die Zelle, was zu einer Hypoglykämie führt. (JANEWAY et
al. 2002)
Werden diese Antikörper direkt gegen autologe funktionsfähige Strukturen gebildet,
so wirken sie mit ihrer Hemmung oder Stimulation autoaggressiv. Sie stellen jedoch
eine Typ V-Allergie dar, wenn sie gegen körperfremde Strukturen (z. B. Epitope auf
Tollwutviren) induziert werden und anschließend gegen autologe Epitope
kreuzreagieren (z. B. mit dem Acteylcholinrezeptor) (JANEWAY et al. 2002).
2.1.2 Mechanismus der Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I
Die Effektorzellen der Typ I-Allergie, Basophile und Mastzellen, entwickeln sich aus
Knochenmarksstammzellen. Während Basophile bereits ausdifferenziert sind, wenn
sie das Knochenmark verlassen, treten Mastzellen im Blutkreislauf nur als
Vorläuferzellen auf, jedoch bereits mit zelltypischen Charakteristika (RODEWALD et
al. 1996). Die endgültige Differenzierung geschieht in der Peripherie (ENERBACK
1997). Basophile und Mastzellen binden freies IgE hochaffin an den Fcε-Rezeptor I
(FcεRI) (ISHIZAKA u. ISHIZAKA 1977). Frei im Serum befindliches IgE hat mit bis zu
zwei Tagen die kürzeste Halbwertszeit aller Antikörper-Isotypen. Das an FcεRI von
Basophilen und Mastzellen gebundene IgE ist über mehrere Wochen bis Monate
stabil. Die Anwesenheit von IgE im Serum fördert zusätzlich die Expression von
FcεRI auf Basophilen und Mastzellen und übt einen stabilisierenden Effekt auf den
Rezeptor aus (SAINI u. MACGLASHAN 2002; KITAURA et al. 2003; KUBO et al.
2003). Zudem konnte gezeigt werden, dass die Immunglobulin-Rezeptor-Komplexe
die Zelle in vitro vor Apoptose schützen (KAWAKAMI u. GALLI 2002). Werden
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mehrere membranständig gebundene spezifische IgE durch das entsprechende
Antigen quervernetzt (bridging), kommt es zu einer Zusammenlagerung der FcεRI
der Zelle. Dies ermöglicht die Phosphorylierung der in den γ-Ketten des FcεRI
befindlichen Immunorezeptor assoziierten tyrosinbasierten Aktivierungsmotive
(ITAMs) durch Protein-Tyrosinkinasen. Diese katalysieren die Phosphorylierung der
Phospholipase C-γ, die durch hydrolytische Spaltung die beiden second messenger
Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) bildet, was zur Freisetzung von
intrazellulärem Ca2+ und der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) und schließlich
zur Degranulation der Mastzelle oder des Basophilen führt (KNOL 2006). Neben der
Aktivierung der Zelle induziert das bridging bei Mastzellen des Menschen auch die
Expression von Bfl-1, einem Survival-Gen, das die Lebensdauer der sensibilisierten
Zelle erhöht und somit zur Aufrechterhaltung der allergischen Reaktionsbereitschaft
beiträgt (XIANG et al. 2006).
Neben aktivierenden Fc-Rezeptoren (FcεRI, FcγR I, IIA & III) spielen inhibierende
FcR, wie die FcγRII-B1 und B2, wichtige regulatorische Rollen: Statt einer ITAM-
Sequenz ist ihr zytoplasmatischer Teil mit einem Immunorezeptor-assoziierten
tyrosinbasierten Inhibierungsmotiv an Aminosäuren (ITIM) ausgestattet. Findet eine
antigenbedingte Quervernetzung von einem aktivierenden FcεRI (vermittelt durch
membranständiges IgE) mit einem inhibierenden FcγRII-B (vermittelt durch ein IgG)
statt, so kommt es nicht zu einer Aktivierung der Typ I Effektorzellen, keiner
Mediatorfreisetzung und somit auch nicht zu einer Typ I Immun- oder
Allergiereaktion, obwohl die Zelle mit antigenspezifischem IgE sensibilisiert ist. Dies
könnte einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Zukunft darstellen (GALLI et
al. 2005).
Neben dem auf Basophilen und Mastzellen exprimierten, hochaffinen Fcε-Rezeptor I
existiert auf B-Zellen ein weiterer, als CD23 oder Fcε-Rezeptor II bezeichneter
Ligand für IgE, der regulatorisch auf die IgE-Produktion wirkt, indem er IgE mit
niedriger Affinität bindet. Es konnte gezeigt werden, dass Mäuse, denen CD23 fehlt,
deutlich höhere IgE-Titer gegen ein spezifisches Antigen bilden als solche mit
normaler CD23-Expression (YU et al. 1994).
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Das Vorhandensein von freiem IgE, einem der sensibilisierenden Ak-Isotypen, im
Serum ist bei weitem nicht ausreichend für eine Aussage, ob das von dem IgE-Ak
erkannte Antigen (z. B. in einem diagnostischen ELISA-Verfahren) zu einer Allergie
gegen dieses Antigen führt. Dazu sind eine Reihe weiterer Voraussetzungen
erforderlich:
• Eine ausreichende Anzahl an Basophilen und / oder Mastzellen, die mit
spezifischen Antikörpern gegen ein Antigen sensibilisiert sind;
• Eine ausreichende Dichte an sensibilisierenden Antikörpern pro Typ I
Effektorzelle, damit ein „bridging“ durch ein Antigen erfolgen kann;
• Eine überwiegende Sensibilisierung von aktivierenden Fc-Rezeptoren mit
spezifischen Antikörpern gegen ein Antigen pro Effektorzelle.
Erst wenn diese Voraussetzungen in Form einer „funktionellen Sensibilisierung“
gegeben sind, kann es zu einer wirkungsvollen Aktivierung von Typ I-Effektorzellen
kommen. Erst dann werden bei Antigenkontakt präformierte und in Granula
gespeicherte Entzündungsmediatoren (Histamin, Heparin, Serotonin, TNF-α) und
Enzyme (Chymase, Tryptase, Carboxypeptidase und Cathepsin) kurzfristig
freigesetzt. Gleichzeitig wird die Neubildung wichtiger Mediatoren induziert. Hierzu
zählen Arachidonsäuremetaboliten, vor allem die Leukotriene B4 und C4 sowie
Prostaglandine D2 und E2, aber auch Chemokine wie CCL3 und Cytokine wie TNF-α,
GM-CSF, IL-3, IL-5 sowie insbesondere IL-4 und IL-13. Letztere wirken verzögert, so
dass sich eine Typ I Immunreaktion von wenigen Minuten (Sofortreaktion) bis zu 24 h
hinziehen kann (Spätreaktionen), abhängig von den beteiligten Mediatoren. Eine
funktionelle Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen ist eine unabdingbare
Voraussetzung zur Entwicklung einer Typ I-Allergie. Sie allein löst jedoch nicht
zwingend – auch in Anwesenheit des „passenden“ Antigens - eine klinische
Symptomatik aus. Ohne funktionelle Sensibilisierung gegen ein spezifisches Antigen
ist die Auslösung Typ I allergischer Symptome durch dieses Antigen sicher
auszuschließen.
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2.1.3 Arthropoden als Auslöser von Typ I-Immunantwo rten
Hämatophagen Insekten kommt in der Veterinärmedizin eine große Bedeutung als
Verursacher von Typ I-Allergien zu. Bei der Blutmahlzeit werden
Speichelkomponenten injiziert, gegen die der Wirt sensibilisierende Antikörper
entwickeln kann.
Flöhe
Von den mehr als 2000 Arten der Ordnung Siphonaptera ist der Katzenfloh
(Ctenocephalides felis felis, Bouché 1835) bei Hund und Katze am weitesten
verbreitet. In mehreren Studien (REEDY et al. 1997) wurde gezeigt, dass im Speichel
des Katzenflohs Antigene Komponenten enthalten sind, die bei befallenen Tieren
eine Sensibilisierung auslösen können. Sensibilisierte Tiere können eine
Flohallergie-Dermatitis (FAD) entwickeln, die durch Juckreiz, Alopezie und
papulokrustöse Hautveränderungen gekennzeichnet ist. Im Intrakutantest kann die
Injektion eines Antigenextraktes aus ganzen Flöhen oder deren Speicheldrüsen bei
sensibilisierten Tieren eine Typ I-Reaktion der Haut auslösen (2.3) .
Milben
Die Ohrmilbe Otodectes cynotis verursacht bei der Katze und seltener auch beim
Hund die sogenannte Ohrräude. Sie ernährt sich von Lymphe und Blut ihres Wirtes.
Ein Otodectes-Befall kann symptomlos bleiben, in einigen Fällen aber auch zu einer
pruriginösen Otitis mit Exsudatbildung führen. Bei Katzen, die von O. cynotis
parasitiert wurden, konnten spezifische Antikörper nachgewiesen und im
Intrakutantest eine Typ I-Reaktion auf einen Otodectes-Extrakt gezeigt werden
(POWELL et al. 1980).
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Mücken
Mücken verursachen bei Pferden eine weltweit verbreitete, saisonal auftretende
Dermatitis, die als Sommerekzem, Queensland itch, sweet itch oder kasen bekannt
ist. Sie ist durch intensiven Juckreiz charakterisiert, in dessen Folge es zu
selbstinduzierten Hautläsionen kommt, die primär an der ventralen Körperseite,
Mähne und Schweif auftreten (ANDERSON et al. 1988). Mithilfe von Intrakutan- und
in vitro-Tests konnten neben anderen saugenden Insekten oft verschiedene
Culicoides-Arten als Hauptverursacher des Sommerekzems identifiziert werden,
deren Antigene zu Typ I-Reaktionen bei betroffenen Tieren führten (FADOK u.
GREINER 1990; ANDERSON et al. 1993; KAUL 1998) Inwieweit Mücken an der
Genese von Typ I-Allergien bei Hund und Katze beteiligt sind, ist wenig erforscht.
MASON und EVANS (1991) berichten über Katzen, die Symptome einer saisonalen
Form des eosinophilen Granuloms zeigten. Zwei von vier untersuchten Tieren
reagierten im Intrakutantest auf Antigene aus einem Mückenextrakt positiv.
Zecken
Bei Hunden und Meerschweinchen sind Typ I- Überempfindlichkeitsreaktionen gegen
einen Antigenextrakt der braunen Hundezecke Rhipicephalus sanguineus (Latreille,
1806) bekannt (SZABO et al. 1995). Anders als die Hunde entwickelten die
Meerschweinchen nach 24 Stunden zusätzlich eine deutliche Reaktion vom
verzögerten Typ, was bei der Immunantwort auf Zeckenbefall der entscheidende
Mechanismus der Resistenzentwicklung ist. Auch bei Rindern sind Typ I-Reaktionen
gegen Zecken nachgewiesen worden. Vorsensibilisierte Tiere zeigten eine Typ I-
Reaktion der Haut nach intrakutaner Applikation eines Extraktes von Rhipicephalus
appendiculatus (BINTA u. CUNNINGHAM 1984).
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2.2 Allergiediagnostik
Die Bezeichnung „Allergietest“ im Sinne des Wortes ist mit Ausnahme des in vivo
Provokationstests für alle heute verfügbaren Testverfahren irreführend, da sie
bestenfalls eine Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen erfassen oder freie
Antikörper gegen verdächtige Antigene oder Epitope nachweisen. Allergietests
sollten aus diesem Grund nicht als Screeningmethode an einem an Pruritus
leidenden Patienten eingesetzt werden (DEBOER u. HILLIER 2001a). Eine Allergie
als Ursache bestimmter klinischer Symptome wird häufig im Ausschlussverfahren
und unter Einbeziehung eines „Allergietests“ diagnostiziert. Falls Antigene als
Ursache für ein Krankheitsbild im Verdacht sind, sollte zunächst gegen bakterielle
Sekundärinfektionen und Parasitenbefall behandelt werden. Ein weiteres
Ausschlusskriterium ist das Füttern einer Eliminationsdiät über mindestens zwei
Monate. Bei Besserung der Symptome kann die verdächtige Futterkomponente
erneut angeboten werden (Provokationstest), um die Diagnose abzusichern (NOLI
2006).
Die zur Diagnostik der Typ I-Allergie zur Verfügung stehenden Testverfahren können
grob unterteilt werden in in vivo und in vitro-Methoden.
In vivo durchgeführte Tests basieren auf der Exposition des Patienten mit dem
verdächtigen Antigen und erfordern in der Veterinärmedizin oft eine Sedierung oder
Narkose des zu untersuchenden Tieres. Zur Diagnosestellung ist die Auslösung
allergischer Symptome am Patienten erforderlich, weshalb diese Verfahren eine
größere Belastung darstellen als in vitro Tests, für deren Durchführung nur eine
Blutprobe benötigt wird.
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2.2.1 In vivo-Verfahren
2.2.1.1 Intrakutantest
Beim Intrakutantest wird eine definierte Menge Antigen intradermal appliziert und zu
unterschiedlichen Zeiten danach die Reaktion der Mastzellen der Haut anhand des
Durchmessers der sich bildenden Quaddel abgelesen.
Wichtig für die diagnostische Aussage des Intrakutantests ist die Verwendung von
Antigenen und Kontrollsubstanzen (Lösungsmittel, Histamin) in
Konzentrationsstufen, in denen eine Hautreaktion auf eine Testsubstanz eindeutig
als Typ I-Reaktion erkannt werden kann. Liegt die Konzentration der Testsubstanz
über dieser sogenannten Schwellenkonzentration, ist eine positive Reaktion auf eine
unspezifische Irritation an der Injektionsstelle zurückzuführen. AUSTEL et al. (2006)
definierten Schwellenkonzentrationen für 48 verschiedene Antigenpräparationen und
Histamin, wobei jedes Antigen in vier Konzentrationsstufen an gesunden Katzen
getestet wurde. Die diagnostische Aussagekraft einer positiven Reaktion auf ein
Arthropodenantigen in einer definierten Konzentrationsstufe kann nach WILLIS et al.
(1996) nur bestimmt werden, wenn die Prävalenz positiver Reagenten bei gesunden
Tieren bekannt ist.
Sowohl in der Veterinär- wie in der Humanmedizin werden Fälle beschrieben, in
denen klinisch unauffällige Probanden auf das entsprechende Antigen eine positive
Reaktion im Intrakutantest zeigten (LINDBLAD u. FARR 1961; CODNER u.
LESSARD 1993). In einer Untersuchung an 65 Hunden, die an Atopie litten,
reagierten 58 positiv auf Antigene von Dermatophagoides farinae, wobei jedoch in
der Kontrollgruppe 22 von 24 Tieren ebenfalls ein positives Ergebnis zeigten (LIAN u.
HALLIWELL 1998).
KRISTENSEN und KIEFFER (1978) verglichen klinische und histologische Befunde
sowie das Vorhandensein von Flohbefall und Eosinophilie bei 143 Hunden und
Katzen, die an pruriginöser Dermatitis litten und testeten die Tiere im Intrakutantest
auf Flohantigen. Sie folgerten, dass die Spezifität des Intrakutantests dessen Einsatz
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bei Verdacht auf Flohallergie rechtfertigt. COLOMBINI et al. (2001) konnten
unterdessen keine Korrelation zwischen klinischer Symptomatik und
Intrakutantestergebnissen feststellen.
Weitere Studien verschiedener Arbeitsgruppen an atopischen Hunden, deren
Reaktionsverhalten auf Pollenextrakte und andere Umweltallergene von
Schimmelpilzen und Hausstaubmilben im Intrakutantest ermittelt wurde, erbrachten
sehr unterschiedliche Ergebnisse in der Prävalenz positiver Reaktionen, die nicht
ausschließlich durch biologische Variation erklärbar sind (HILL u. DEBOER 2001).
Obwohl dies teilweise auf geographische Besonderheiten im Antigenspektrum
zurückzuführen ist, fehlen dennoch standardisierte Verfahren und entsprechende
Antigenextrakte, welche zur Verbesserung von Sensitivität und Spezifität des
Intrakutantests beitragen könnten (DEBOER u. HILLIER 2001b). Ein entsprechender
Grad an Standardisierung könnte den Nutzen des Intrakutantests als quantitatives
Verfahren deutlich erhöhen (NORMAN et al. 1973).
2.2.2 In vitro-Verfahren
2.2.2.1 Serologische Tests (ELISA)
Diese Methoden basieren auf der Detektion von allergenspezifischen freien IgE-
Antikörpern im Serum. Dabei wird Patientenserum mit an eine feste Phase
gebundenem Testantigen inkubiert, so dass sich gebundene Antigen-Antikörper-
Komplexe bilden. Nicht reagierende Antikörper werden weggewaschen und die
Menge an Antigen-Antikörper-Komplexen mithilfe eines möglichst für IgE
spezifischen Bindungspartners (Anti-IgE-Antikörper oder FcεRIα-Kette) quantifiziert,
an den je nach Testverfahren fluoreszierende Farbstoffe, radioaktive Substanzen
oder Enzyme gekoppelt sind. Die Höhe der Farbintensität, Radioaktivität oder die
Menge an enzymatisch umgesetztem Substrat entspricht der Serumkonzentration
der antigenspezifischen Antikörper. Werden für die Detektion dieser Antikörper Anti-
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IgE-Ak verwendet, kann es zu Kreuzkompetition mit Antikörpern anderen Isotyps
ohne klinische Relevanz kommen, wenn die Spezifität dieser Antikörper
unzureichend ist, weil Kreuzreaktionen gegen andere Isotypen ggf. über leichte Ig-
Ketten vorkommen können. LORCH et al. (2001) zeigten in einer Untersuchung an
Pferden, dass die Befunde eines ELISA, der sensibilisierende Antikörper mit Hilfe der
α-Untereinheit des Fcε-Rezeptor I detektiert, eine höhere Übereinstimmung mit den
klinischen Befunden aufwies als ein ELISA auf Basis von Anti-IgE-Antikörpern.
Insgesamt waren jedoch die serologischen Untersuchungsverfahren einem simultan
durchgeführten Intrakutantest unterlegen.
Die erste beschriebene Anwendung in der Kleintiermedizin diente der
Immundiagnostik der atopischen Dermatitis des Hundes (HALLIWELL u. KUNKLE
1978). Eine vergleichende Untersuchung mit drei ELISA-basierten Tests an
gesunden und atopischen Hunden ergab eine sehr geringe Spezifität dieser
Verfahren. Die Autoren zweifelten deren Nutzen für die Diagnostik der Atopie beim
Hund daher an (BOND et al. 1994). Auch bei Hunden mit Flohallergie war der
Median der im ELISA gemessenen spezifischen IgE-Antikörper gegen Flohantigen
nicht signifikant höher als bei nicht allergischen Tieren. Verglichen mit gleichzeitig
durchgeführten Intrakutantests zeigte sich keine signifikante Übereinstimmung
(CODNER u. LESSARD 1993). Die Serumspiegel von allergenspezifischem IgE bei
Katzen korrelierten ebenfalls nicht mit einem Intrakutantest (GILBERT u.
HALLIWELL 1998). In einer Verlaufsstudie zur Flohallergie bei Katzen war zwischen
klinischen Symptomen und den Ergebnissen eines Fcε-Rezeptor-basierten Assays
statistisch kein Zusammenhang erkennbar (COLOMBINI et al. 2001).
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2.2.2.2 Zellbasierte Tests
Während die vorher beschriebenen in vitro Verfahren frei im Serum befindliche
Antikörper detektieren, werden bei zellbasierten Tests Mediatoren bestimmt, die von
Zellen durch Stimulation mit dem Testantigen freigesetzt werden. Im Gegensatz zu
serologischen Tests berücksichtigen zellbasierte Tests nur Antikörper, die auf den
Effektorzellen gebunden und an der Freisetzung der Mediatoren beteiligt sind.
Funktioneller in vitro Test zum Nachweis der Typ I-Sensibilisierung von
Basophilen (FIT)
Der von KAUL (1998) zur Diagnostik von Typ I Allergien beim Pferd entwickelte FIT
basiert auf der Messung von Histamin, welches im Blut unter den hier gewählten
Bedingungen nur von Basophilen freigesetzt wird. Der Test wird mit gewaschenem
Vollblut durchgeführt, so dass freie Antikörper weitgehend entfernt sind und nur auf
den Effektorzellen gebundene, sensibilisierende Antikörper an der Reaktion
teilnehmen. Anschließend erfolgt eine Provokation der mit spezifischen Antikörpern
besetzten Effektorzellen mit Testantigenen über 60 Minuten. Liegt eine funktionelle
Sensibilisierung gegen ein Testantigen vor, kann dies anhand der Höhe der
Histaminfreisetzung festgestellt werden. Setzt man das Antigen in mehreren
Konzentrationsstufen ein, kann die funktionelle Sensibilisierung zudem graduell
quantitativ bewertet werden. Das Verfahren wurde inzwischen auch für die Katze
etabliert (STUKE 2005). Die Befunde des FIT korrelierten in der Untersuchung von
STUKE (2005) weitgehend mit einem Intrakutantest jedoch nicht mit einem FcεRIα-
ELISA.
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Indirekter Histaminfreisetzungstest
Der indirekte Histaminfreisetzungstest ist eine Kombination aus serologischem und
zellbasiertem Test. Dabei werden humane oder equine, nicht vom Patienten
stammende Basophile mit Antikörpern aus dem Patientenserum inkubiert und mit
Antigen stimuliert. Anschließend wird, analog zum Prinzip der direkten Tests wie dem
FIT, die freigesetzte Histaminmenge gemessen. Die diagnostische Relevanz dieses
Tests ist ähnlich wie bei den serologischen Tests fraglich (PRÉLAUD u. GILBERT
2000), da er keine Aussage über die individuelle Reaktionsbereitschaft der
Effektorzellen des zu untersuchenden Probanden erlaubt.
Cellular Allergen Stimulation Test (CAST)
Der CAST wurde von DE WECK et al. (1993) eingeführt. Anders als beim FIT, bei
dem selektiv der gespeicherte Basophilenmediator Histamin als Reaktionsparameter
dient, wird beim CAST die Freisetzung von Sulphidoleukotrienen (sLT) gemessen.
Vor der eigentlichen Antigenprovokation erfolgt eine Vorstimulation der Zellen mit IL-
3. Sulphidoleukotriene sind im Gegensatz zu Histamin, das in präformierten,
intrazellulären Granula gespeichert vorliegt, neu synthetisierte Mediatoren. Die
Korrelation von CAST und klinischer Symptomatik unterscheidet sich je nach
Allergieform und Antigen. Die Ergebnisse von Histamin Release Tests und CAST
korrelieren relativ gut, während Intrakutantest und CAST eine geringere Korrelation
aufweisen (r=0,4-0,6) (DE WECK u. SANZ 2004). Allerdings ist zu beachten, dass
Sulphidoleukotriene außer von Typ I-Effektorzellen auch von anderen Immunzellen
des Blutes wie Monozyten, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten freigesetzt
werden können, die mit einer Typ I-Allergie wenig zu tun haben. Im Gegensatz dazu
stellt Histamin einen für die Effektorzellen der Typ I Immunreaktionen (Basophile und
Mastzellen) spezifischen Mediator dar (TIZARD 2004).
L I T E R A T U R Ü B E R S I C H T
___________________________________________________________________________
36
2.3 Flohallergie-Dermatitis
2.3.1 Allgemeines
Zur Ordnung der Flöhe (Siphonaptera) gehören mehr als 2000 weltweit verbreitete
Arten und Unterarten (REEDY et al. 1997). Die am häufigsten bei Hund und Katze
gefundene Spezies ist der Katzenfloh, Ctenocephalides felis felis (C. felis) (Bouché
1835), wie Studien in Europa und Nordamerika zeigten (HARMAN et al. 1987;
VISSER et al. 2001; AKUCEWICH et al. 2002; RINALDI et al. 2007). In Neuseeland
war der Hundefloh, C. canis bei Hunden häufiger anzutreffen als C. felis (GUZMAN
1984). Neben C. felis als Hauptverursacher der Flohallergie-Dermatitis (FAD) werden
gelegentlich auch C. canis, Archaeopsylla erinacei, Xenopsylla cheopsis, Pulex
irritans sowie Echidnophaga gallinacea auf Hunden und Katzen gefunden.
Obwohl von Juni bis September auf der nördlichen Hemisphäre höhere Prävalenzen
an Flohbefall beobachtet werden, sind jahreszeitliche Schwankungen ansonsten
wenig ausgeprägt vorhanden (AKUCEWICH et al. 2002; BECK et al. 2006; RINALDI
et al. 2007). Dies ist in gemäßigten Klimazonen auf die eng mit dem Menschen
verbundene Lebensweise von als Haustier gehaltenen Hunden und Katzen
zurückzuführen. BECK et al. (2006) konnten auch bei Hunden und Katzen aus
ländlichen oder städtischen Umgebungen in Deutschland keine regionalen
Unterschiede in den Befallsprävalenzen feststellen.
L I T E R A T U R Ü B E R S I C H T
___________________________________________________________________________
37
2.3.2 Biologie des Katzenflohs, Ctenocephalides felis felis
Der Katzenfloh (C. felis) zeigt keine Wirtsspezifität und wird auf vielen Wild- und
Haustierspezies gefunden. Adulte Katzenflöhe haben eine permanente Lebensweise
auf ihrem Wirt entwickelt. Die Lebensdauer auf dem Wirt beträgt mindestens 113
Tage (DRYDEN 1989), wobei diese durch Elimination der Flöhe bei der Fellpflege
eingeschränkt wird. Die im Fell der Tiere präsenten Flöhe stellen etwa ein Prozent
der gesamten Flohpopulation aus Eiern, Larven und Puppen in der Umgebung sowie
Adulten auf dem Tier dar. Die Bedeutung der Wirt-zu-Wirt-Übertragung von adulten
Katzenflöhen ist geringer als die Neu- oder Reinfestation aus der Umgebung durch
frisch aus Puppen geschlüpfte Exemplare. In einer von BECK (2007) durchgeführten
Studie, in der die Übertragung von mit durchschnittlich 43 Flöhen infestierten Katzen
auf nicht infestierte Tiere untersucht wurde, konnten auf den nicht befallenen Tieren
nach drei bis neun Tagen durchschnittlich zwei Flöhe gefunden werden. Als
hämatophage Insekten sind die Weibchen im adulten Stadium auf Blutmahlzeiten zur
Fortpflanzung angewiesen (REEDY et al. 1997; HSU u. WU 2001). Nach
CADIERGUES (2000) saugen nahezu alle Flöhe innerhalb der ersten Stunde nach
Wirtsfindung Blut. Die Eiablage erfolgt ca. 24-48 h nach der Blutmahlzeit auf dem
Wirt, wobei ein Weibchen täglich im Durchschnitt ca. 27 und maximal bis ca. 50 Eier
legt. Nachdem die Eier vom Wirt abfallen, entwickeln sich die Larven in der
Umgebung. Ruhe- und Schlafplätze des Tieres sind dabei besonders betroffen,
Teppiche stellen ebenfalls ein geeignetes Mikrohabitat dar. Die Entwicklungsdauer
der Eier wird maßgeblich durch die klimatischen Bedingungen beeinflusst. Bei einer
relativen Feuchte von über 50% und 16 bis 27 °C Umg ebungstemperatur entwickeln
sich ca. 70-100% der Eier in ein bis sechs Tagen zu Larven (SILVERMAN et al.
1981).
Die larvale Entwicklung verläuft über drei Stadien, die Nahrung in Form von den
Adulten ausgeschiedenem Kot (verdautes Blut) benötigen. Die Dauer der
Entwicklung beträgt abhängig von Umgebungstemperatur, Luftfeuchtigkeit und
Nahrungsangebot acht bis 34 Tage (SILVERMAN et al. 1981). Nach der Verpuppung
L I T E R A T U R Ü B E R S I C H T
___________________________________________________________________________
38
verlassen die Imagines nach fünf Tagen den Kokon, können unter ungünstigen
Umweltbedingungen jedoch bis zu 140 Tage überdauern (REEDY et al. 1997).
2.3.3 Ätiologie und Pathogenese der FAD
Die Flohallergie-Dermatitis ist die klinische Manifestation einer
Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I gegen den Speichel, den der Floh beim
Saugakt in die Wunde injiziert. Flohspeichel ist ein Gemisch aus Peptiden,
Aminosäuren, aromatischen Verbindungen, Phosphor und fluoreszierenden Stoffen
(YOUNG et al. 1963) und besitzt gerinnungshemmende Eigenschaften. Während
Experimente der Arbeitsgruppe um MICHAELI (1966) an Meerschweinchen ein an
Kollagen gebundenes Hapten als Antigen identifizierten, ergaben neuere Versuche,
dass der Flohspeichel komplette Antigene in Form von Proteinen enthält (GREENE
et al. 1993). In Untersuchungen mit aus dem Speichel chromatographisch
aufgetrennten Proteinfraktionen konnte nach intrakutaner Injektion bei Hunden, die
vorher mit Flöhen infestiert wurden, eine Überempfindlichkeitsreaktion ausgelöst
werden (LEE et al. 1999). Dabei reagierten die Hunde auf Proteine mit
Molekülmassen von 12 bzw. 40 kDa besonders empfindlich. MCDERMOTT et al.
(2000) identifizierten, klonierten und charakterisierten mit dem 18 kDa großen Cte f 1
Protein ein Flohspeichelantigen, welches bei flohallergischen Hunden eine
Überempfindlichkeitsreaktion auslöste.
Mithilfe einer zweidimensionalen gelelektrophoretischen Auftrennung von
Flohspeichel und anschließendem Immunoblot konnte NADLER (2001) 38
unterschiedliche Proteinfraktionen mit Molekulargewichten zwischen 21,5 und 95
kDa identifizieren, gegen die an FAD erkrankte Katzen Antikörper gebildet hatten.
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___________________________________________________________________________
39
2.3.4 Diagnostik
Eine gründliche Anamnese ist für die Diagnosestellung der FAD außerordentlich
wichtig. Tiere, die mit der betroffenen Katze Kontakt haben, können zu einer
Reinfestation des allergischen Tieres führen und somit den Krankheitsverlauf negativ
beeinflussen. Die klinischen Symptome einer Flohallergie-Dermatitis bei der Katze
richten sich nach dem Grad der Sensibilisierung, der Befallsintensität und
möglicherweise vorhandenen sekundären Hauterkrankungen (DRYDEN u.
BLAKEMORE 1989). Sie reichen von geringgradigem bis schwerem Juckreiz über
Erytheme, Haarausfall bis zu papulokrustösen Veränderungen. Darüber hinaus wird
bei der Katze im Zusammenhang mit FAD häufig eine miliare Dermatitis beobachtet,
die mit eosinophilen Plaques einhergehen kann (GROSS et al. 1986). Hautbioptate,
die histologisch eine perivaskuläre Dermatitis und Infiltrationen von eosinophilen
Granulozyten zeigen, sind weitere Hinweise auf FAD. Obwohl FAD bei der Katze die
häufigste Ursache für eine miliare Dermatitis ist, sind differentialdiagnostisch auch
ein Befall mit Raubmilben (Cheyletiella), durch Notoedres cati verursachte Kopfräude
der Katze, Arzneimittelallergie, Futtermittelallergie und Dermatophytose zu beachten
(DRYDEN u. BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997).
Die größte Wahrscheinlichkeit, Flöhe auf dem betroffenen Tier zu finden, ist im Kopf-
und Nackenbereich sowie entlang der Rückenlinie (HSU et al. 2002). An Schwanz
und Extremitäten sowie am ventralen Rumpf konnten deutlich weniger Flöhe
gefunden werden. Bei einem hochgradig sensibilisierten Tier sind aufgrund
vermehrter Fellpflege jedoch oftmals keine adulten Flöhe auffindbar, so dass nach
schwarzem Flohkot gesucht werden sollte, der auf einem feuchten Papier verteilt,
rote bis bräunliche Flecken hinterlässt (REEDY et al. 1997).
Zur Sicherung der Diagnose kann die funktionelle Sensibilisierung eines Tieres
gegen Antigene von C. felis mithilfe eines Allergietests wie Intrakutantest (2.2.1.1)
(REEDY et al. 1997) oder funktionellem in vitro-Test (2.2.2.2) (STUKE et al. 2003)
ermittelt werden. Im Intrakutantest wird die Reaktionsbereitschaft von Mastzellen in
der Haut geprüft, während der FIT prüft, ob eine funktionelle Sensibilisierung der
Basophilen vorliegt. Mehrere Autoren weisen darauf hin, dass ein positiver
L I T E R A T U R Ü B E R S I C H T
___________________________________________________________________________
40
Intrakutantest nicht in direktem Zusammenhang mit den klinischen Symptomen
stehen muss und ein negatives Testergebnis eine FAD nicht ausschließt (DRYDEN
u. BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997; HILLIER u. DEBOER 2001). Die
Aussagekraft von Allergietests alleine ist nicht ausreichend, um eine Flohallergie-
Dermatitis zu diagnostizieren, da z.B. der Intrakutantest eine eventuell bestehende
Sensibilisierung, nicht aber eine Allergie nachweist (2.2). Außerdem bestehen teils
erhebliche Unterschiede in den Testverfahren hinsichtlich der Korrelation von
klinischen Symptomen und Testbefund. Eine Untersuchung von LAFFORT-DASSOT
et al. (2004) zeigte eine insgesamt höhere Sensitivität und Spezifität des
Intrakutantests gegenüber einem FcεRI-basierten serologischen Testverfahren.
Allerdings variierten Sensitivität und Spezifität des Intrakutantest je nach Art und
Herkunft der eingesetzten Antigenpräparation. Neben zwei Ganzflohextrakten
wurden Flohspeichel und das rekombinante Speichelallergen Cte f 1 miteinander
verglichen, wobei Cte f 1 die niedrigste und die Flohspeichelpräparation die höchste
Sensitivität aufwies.
2.3.5 Therapie und Parasitenbekämpfung
Die Behandlung einer allergisch bedingten Hauterkrankung wie FAD kann auf
verschiedene Arten erfolgen. Der symptomatische Ansatz verfolgt die Linderung von
allergischem Juckreiz und Entzündungserscheinungen. Hierfür sind Kortikosteroide
indiziert, deren Wirkung auf die Dauer der Behandlung beschränkt ist, da sie nicht
die Ursache der Erkrankung bekämpfen, sondern nur die symptomauslösende
Reaktionen abschwächen oder unterdrücken. Eine Kurzzeitbehandlung kann nützlich
sein, sofern keine bakteriellen Sekundärinfektionen vorliegen (CARLOTTI u.
JACOBS 2000; UNGEMACH 2002b). Der ätiologische oder kausale Therapieansatz
hat die Beseitigung der Ursache zum Ziel. Dies kann bei der FAD durch
Immuntherapie oder Elimination des Flohbefalls geschehen. In doppelt blinden
Studien an Hunden (HALLIWELL 1993) und Katzen (KUNKLE u. MILCARSKY 1985)
konnte durch intra- oder subkutane Injektion von Flohantigen keine
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___________________________________________________________________________
41
Desensibilisierung induziert werden. PATERSON (2000) hält den Nutzen einer
„spezifischen Immuntherapie“ (SIT) im Sinne einer Hypo- oder Desensibilisierung bei
FAD für fraglich. Die wichtigste Behandlungsstrategie bleibt daher vorerst die
Flohbekämpfung (DRYDEN u. BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997; CARLOTTI
u. JACOBS 2000; RUST 2005).
2.3.5.1 Antiparasitäre Behandlung der Umgebung
Neben auf dem Wirt anzutreffenden, adulten Katzenflöhen repräsentieren die
Entwicklungsstadien von C. felis den Großteil der Flohpopulation (2.3.2). Da die
Entwicklung des Katzenflohs in der Umgebung des Wirts stattfindet, kann es sinnvoll
sein, dies bei der Bekämpfung der Infestation zu berücksichtigen. Zur
Umgebungsbehandlung stehen sowohl Wirkstoffe zur Verfügung, die auch zur
Anwendung auf dem Tier zugelassen sind, als auch solche, mit denen das Tier nicht
in Kontakt kommen darf.
Für einige der unter 2.3.5.2 genannten Wirkstoffe konnte jedoch gezeigt werden,
dass auch eine alleinige topische Applikation ausreichend ist, um Flohstadien, die
sich in der Umgebung des Tieres befinden, zu eliminieren (DRYDEN et al. 1999;
BENCHAOUI et al. 2000; JACOBS et al. 2001b)
2.3.5.2 Antiparasitäre Behandlung des Tieres
Zur Bekämpfung des Flohbefalls bei Hund und Katze steht eine sehr große Auswahl
an Präparaten mit unterschiedlichen Wirkmechanismen zur Verfügung. Die Vielzahl
der Anwendungsformen reicht von Injektionslösungen und oralen
Darreichungsformen wie Tabletten oder Suspensionen über Spot-ons und Sprays bis
hin zu Shampoos, Lotions und Halsbändern. Der jeweilige Einzelfall sollte im
Gespräch mit dem Besitzer genau analysiert werden, bevor das geeignete
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___________________________________________________________________________
42
Antiparasitikum ausgewählt wird. Ein entscheidender Faktor für den
Behandlungserfolg ist hierbei, dass die Behandlungsstrategie vom Besitzer
verstanden und gemäß den Vorgaben des Tierarztes ausgeführt wird. Dies setzt eine
gewisse Anwenderfreundlichkeit des Produkts voraus, die nicht zuletzt von der
Akzeptanz des zu behandelnden Tieres abhängt (CARLOTTI u. JACOBS 2000).
2.3.5.2.1 Wirkstoffe mit Kontaktwirkung
Adultizide
Imidacloprid
Der Wirkstoff gehört zur Gruppe der Nitromethylene (ARTHER et al. 1997) und ist ein
chloriertes Nikotinderivat. Er wurde in den USA erstmals 1994 als Insektizid in der
Landwirtschaft eingesetzt (RUST 2005). Der Wirkmechanismus beruht auf einer
Aktivierung von nikotinergen postsynaptischen Acetylcholin-Rezeptoren. Dies führt
zu einer Dauerdepolarisation der Neurone und Paralyse der Insekten (UNGEMACH
2002a). Die Acetylcholin-Rezeptoren von Insekten weisen eine deutliche höhere
Empfindlichkeit gegenüber Imidacloprid auf als die Rezeptoren von Säugetieren
(NARAHASHI 1996). Imidacloprid reichert sich nach spot-on Applikation in der
Lipidschicht der Haut sowie in den Haaren an und wird vom Floh über
intersegmentale Membranen aufgenommen (MEHLHORN et al. 1999). Durch die
Dauerdepolarisation kommt es zu einer Schädigung von Ganglien und Muskelzellen
und schließlich zum Tod des Parasiten. Darüber hinaus besitzt Imidacloprid einen
larviziden Effekt, der auf dem gleichen Wirkmechanismus beruht. Imidacloprid wirkt
nicht repellierend (MEHLHORN et al. 2001), ein Residualeffekt besteht noch vier
Wochen nach Behandlung (ARTHER et al. 1997; JACOBS et al. 1997). Außerdem
besteht ein Effekt auf Stadien von C. felis in der unmittelbaren Umgebung des
behandelten Tieres (JACOBS et al. 2000). Von behandelten Katzen benutzte Decken
enthielten 18 Wochen nach dem letzten Kontakt mit dem behandelten Tier noch
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43
ausreichend Wirkstoff, um den Schlupf von mindestens 94,7% der Flöhe zu
verhindern (JACOBS et al. 2001b).
Fipronil
Fipronil gehört zur Gruppe der Phenylpyrazole und besitzt eine insektizide und
akarizide Wirkung (UNGEMACH 2002a). Der Wirkstoff wird nach spot-on Applikation
kaum resorbiert und reichert sich in der Haut und den Talgdrüsen an, wo COCHET et
al. (1997) ihn noch nach 56 Tagen autoradiographisch nachweisen konnten. Der
Wirkmechanismus von Fipronil beruht auf einer Blockierung von GABA (γ-Amino-
Buttersäure)-gesteuerten sowie bei Säugetieren fehlenden, inhibitorischen Glutamat-
aktivierten Chloridkanälen im Nervensystem der Parasiten (ZHAO et al. 2005). Die
selektive Wirkung auf Arthropoden ist ferner auf die höhere Affinität des Wirkstoffs zu
den GABA-gesteuerten Chloridkanälen zurückzuführen (HAINZL u. CASIDA 1996).
Die Blockade der GABA-gesteuerten Chloridkanäle führt zu Hyperexzitationen,
Konvulsionen und Tod (BLOOMQUIST 2003). Fipronil bewirkte bei monatlicher spot-
on Applikation an Katzen über drei Monate eine Reduktion der Flöhe von bis zu 94%
(MEDLEAU et al. 2002). Die Effektivität einer Behandlung mit Fipronil Spray bei
Katzen lag in den ersten zwei Wochen nach Behandlung bei mindestens 98,2%
(PAYNE et al. 2001). Die spot-on Applikation weist jedoch eine höhere
Verträglichkeit als das Spray auf (UNGEMACH 2002a).
Permethrin
Permethrin gehört zu den Pyrethroiden, die sich von den Pyrethrinen ableiten,
gegenüber diesen aber eine größere Stabilität und Wirksamkeit aufweisen
(UNGEMACH 2002a). Permethrin verteilt sich nach Penetration der Kutikula im
gesamten Insekt. Die Wirkung beruht auf der Bindung an spannungsabhängige
Natriumkanäle der Zellmembran von zentralen und peripheren Neuronen (ZERBA
1988). Die Kanäle sind dadurch länger geöffnet und durch die
L I T E R A T U R Ü B E R S I C H T
___________________________________________________________________________
44
Membrandepolarisation entsteht ein Zustand der Übererregung (NARAHASHI 1996).
Bei ausreichender Wirkdauer tritt der Tod ein. Die Wirkdauer wird durch die Fähigkeit
der Arthropoden beeinflusst, Pyrethroide zu metabolisieren. Dies geschieht durch
Oxidation und Hydrolyse sowie durch das System der mixed function oxidase (MFO)
(ZERBA 1988). Für Hunde erhältliche spot-on Präparate, die den Wirkstoff in hoher
Konzentration enthalten, sind für Katzen aufgrund der hohen Empfindlichkeit dieser
Spezies gegenüber Pyrethroiden toxisch. Vergiftungssymptome sind vor allem
neurologische Störungen (VALENTINE 1990; SUTTON et al. 2007). Katzen, die mit
Permethrin behandelten Hunden im selben Haushalt lebten, zeigten keine Symptome
(HELLMANN et al. 2003). Für Permethrin wurde ein antifeeding effect nachgewiesen,
der innerhalb der ersten Stunde nach Infestation die Blutmahlzeit der Flöhe um mehr
als 80% verminderte (FRANC u. CADIERGUES 1998). Pyrethroide haben zusätzlich
eine repellierende Wirkung gegen Arthropoden (UNGEMACH 2002a; MEYER et al.
2003). In Untersuchungen aus den USA zeigten sich einige C. felis-Stämme als
unempfindlich gegen Pyrethroide (LEMKE et al. 1989; BOSSARD et al. 2002).
Metaflumizon
Metaflumizon gehört zur Klasse der Semicarbazone und wurde nach seiner
Entdeckung in den 1990er Jahren zunächst als Insektizid für die Landwirtschaft
entwickelt (TAKAGI et al. 2007). Metaflumizon ist ein Natriumkanalblocker, der bei
Insekten die Erregungsleitung unterbindet und zu einer schlaffen Paralyse führt
(SALGADO u. HAYASHI 2007). Die Substanz verteilt sich bei Katzen nach topischer
Applikation in Haut und Haaren und ist im Blut kaum nachweisbar. Dies deutet darauf
hin, dass zur Aufnahme des Wirkstoffs durch die Parasiten keine Blutmahlzeit
erforderlich ist (DELAY et al. 2007). In einer Studie von DRYDEN et al. (2007) wurde
die Wirksamkeit von Metaflumizon gegen C. felis untersucht. Nach einmaliger spot-
on Applikation reduzierte die Substanz die Anzahl adulter Katzenflöhe von Tag 3 bis
45 nach Behandlung um mindestens 99,6%. Die Eizahlen waren in gleichem Maße
vermindert, es konnte aber keine Wirkung auf Schlupf und larvale Entwicklung
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___________________________________________________________________________
45
nachgewiesen werden. In einer weiteren Untersuchung der selben Arbeitsgruppe
wies Metaflumizon gegen den Flohstamm Kansas 1, welcher gegen eine Reihe von
Substanzen unempfindlich ist, in den ersten fünf Wochen nach Behandlung eine
Wirksamkeit von mindestens 90% auf (DRYDEN et al. 2008).
Pyriprol
Pyriprol ist wie Fipronil (siehe dort) ein Phenylpyrazol-Derivat, dessen
Wirkungsspektrum neben Flöhen auch Zecken umfasst. Phenylpyrazole wirken über
eine Blockade von GABA-gesteuerten Chloridkanälen im Nervensystem der
Parasiten (UNGEMACH 2002a). Bei topischer Applikation verteilt sich der Wirkstoff
innerhalb von 24 h in der Fettschicht der Haut. Er reichert sich in den Talgdrüsen an
und wird von dort aus langsam freigesetzt. Pyriprol ist im Blutkreislauf nicht
nachweisbar, so dass die Arthropoden eher durch direkten Kontakt eliminiert werden
(EMEA 2006). Flöhe werden ca. 24 h, Zecken 36 h nach Infestation abgetötet. Das
Waschen eines Tieres 24 h nach Behandlung mit Pyriprol verminderte die
Wirksamkeit nicht. Insgesamt schützt eine Behandlung mindestens 30 Tage vor
Flohbefall (SCHUELE et al. 2008).
Wachstumsregulatoren
Pyriproxyfen
Pyriproxyfen ist ein Fenoxycarb-Derivat und zählt wie Lufenuron (2.3.5.1.2) zu den
Wachstumsregulatoren. Es entspricht in seiner Wirkung dem Juvenilhormon der
Insekten, welches einen regulierenden Einfluss auf die Individualentwicklung nimmt.
Um eine physiologische Entwicklung der Larven zu ermöglichen, muss der
Juvenilhormonspiegel in späteren Entwicklungsschritten abnehmen. Durch
Pyriproxyfen wird die Entwicklung der Insekten im Larvenstadium beendet
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46
(UNGEMACH 2002a), da die Juvenilhormonwirkung aufrechterhalten wird. Die
Substanz wird vom adulten Floh nach topischer Applikation durch Kontakt mit Haut
und Haaren aufgenommen (STANNECK et al. 2003). Eine Behandlung von Katzen
mit Pyriproxyfen unterbricht den Reproduktionszyklus von C. felis für sieben Wochen.
Außerdem wird die Flohentwicklung in der mit dem behandelten Tier in Kontakt
stehenden Umgebung gehemmt (JACOBS et al. 1996). Pyriproxyfen besitzt auch
eine ovizide Wirkung, wie PALMA et al. (1993) zeigten. Eier von Flöhen, die mit
Pyriproxyfen in Kontakt gebracht wurden, zeigten morphologische Veränderungen
und kollabierten häufig nach Eiablage.
2.3.5.2.2 Wirkstoffe mit systemischem Wirkmechanism us
Adultizide
Selamectin
Selamectin gehört zur Klasse der makrozyklischen Laktone bzw. Avermectine, die
Fermentationsprodukte des in Japan im Boden lebenden Strahlenpilzes
Streptomyces avermitilis darstellen (UNGEMACH 2002a). Der Wirkstoff ist ein
teilsynthetisches Monosaccharidderivat von Doramectin und wird von den adulten
Flöhen bei der Blutmahlzeit aufgenommen. Selamectin wirkt über die Bindung an
Glutamat-aktivierte Chloridkanäle und führt über eine beschleunigte oder vermehrte
Öffnung zu einer Hyperpolarisation der Nervenzellen und verhindert so die
Erregungsleitung. Die Folge sind Ataxie, Paralyse und Tod der Arthropoden
(BLOOMQUIST 2003). Nach topischer Applikation auf die Haut wird der Wirkstoff
über die Haut resorbiert. Bei der Katze sind maximale Plasmaspiegel nach etwa 15 h
erreicht, beim Hund nach etwa 72 h (SARASOLA et al. 2002). Selamectin ist neben
adulten auch gegen Larvenstadien und Eier von C. felis wirksam (MCTIER et al.
2000). Das Wirkungsspektrum umfasst neben Ektoparasiten auch Nematoden,
weshalb Avermectine auch als Endektozide bezeichnet werden. Eine Behandlung mit
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Selamectin führte bei Collies, die sehr sensibel auf Avermectine reagieren, nicht zu
Nebenwirkungen (BISHOP et al. 2000; BOY et al. 2000; NOVOTNY et al. 2000).
Nitenpyram
Nitenpyram ist wie Imidacloprid ein chloriertes Nikotinderivat und gehört zur Klasse
der Nitromethylene. Nach oraler Applikation verteilt sich der Wirkstoff und wird von
den Flöhen mit der Blutmahlzeit aufgenommen. Der Wirkmechanismus beruht auf
einer Blockierung von nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren (2.3.5.1.1). Bis 24 h
nach Applikation war die Wirkung auf adulte Flöhe zu 100% gegeben. Insgesamt
besteht die adultizide Wirkung 48 h (RUST et al. 2003). Im Zusammenhang mit der
Behandlung mit Nitenpyram wird von vermehrtem Juckreiz und Komfortverhalten der
behandelten Tiere berichtet, was auf die Wirkung von Nitenpyram auf die Parasiten
zurückzuführen ist.
Wachstumsregulatoren
Lufenuron
Lufenuron ist ein Benzoylharnstoff-Derivat, welches als Inhibitor der Chitinsynthese
wirkt und seine systemische Wirkung nach oraler Applikation oder Injektion entfaltet
(UNGEMACH 2002a). Der Wirkstoff wird von den adulten Flöhen bei der
Blutmahlzeit aufgenommen und schädigt Eier und Larven (HINK et al. 1991). Die
larvale Entwicklung wird gehemmt, da die Epidermiszellen geschädigt und so die
Häutung nicht vollzogen werden kann (DEAN et al. 1998). Die Kombination mit
einem Adultizid kann die Behandlung unterstützen (FISHER et al. 1996; DRYDEN et
al. 1999; JACOBS et al. 2001a). Die nach Behandlung mit Lufenuron benötigte Zeit,
bis der Flohbefall unter Kontrolle ist, variiert je nach klimatischen Bedingungen und
Länge des Entwicklungszyklus der Flohpopulation (SMITH et al. 1996). Eine
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subkutane Injektion von Lufenuron (10 mg/kg) an Katzen reduzierte die Anzahl
schlüpfender Flöhe über mindestens sechs Monate um 90% (BLAGBURN et al.
1999).
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3 Geräte, Material und Methoden
3.1 Geräte
Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehrosmose-Anlage, Typ RO 50/14SMB Typ I
Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage, SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF
Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel
Autoklav GE406
Getinge AB, Getinge / Schweden
Eismaschine UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen
Gamma-Counter 1272 Clinigamma
Wallac Oy, Kontakt: PerkinElmer LAS, Rodgau
Kühlzentrifuge Varifuge K
Heraeus Instruments, Kontakt: Thermo Electron, Dreieich
Laborfeinwaage B6
Mettler, Zürich / CH
Laborwaage BL310
Sartorius, Göttingen
Magnetrührer mit Heizplatte IKAMAG RH Kontakt: IKA Werke, Staufen
Mikrotiterplatten-Filterphotometer für ELISA-Reader Dynatech 5000
Dynatech, Kontakt: Dynex Technologies, Berlin
Mörser mit Ausguss, 70 ml Haldenwanger, Berlin
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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50
pH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin
Pipetten einstellbar von bis (µl): 1-20, 10-100, 20-200, 100-1000, 1000-5000
Gilson International B.V., Bad Camberg
Pistill Länge 115 mm
Haldenwanger, Berlin
Reinwerkbank Laminair HL2448
Heraeus Instruments, Kontakt: Thermo Electron, Dreieich
Röhrchen-Schüttler IKA MS1 IKA Werke, Staufen
Rüttler für Mikrotiterplatten AM69 Microshaker
Dynatech, Kontakt: Dynex Technologies, Berlin
Rundsieb (Maschengröße 3mm)
Roth, Karlsruhe
Schieblehre, digital Westfalia, Hagen
Stereo-Mikroskop Vergrößerungsbereich 1x – 4x
Olympus, Hamburg
Transportbox für Kleintiere Zoofachhandel
Zentrifuge Megafuge 1.0R
Heraeus Instruments, Kontakt: Thermo Electron, Dreieich
Zählkammer nach McMaster FiBL Österreich, Wien
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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51
3.2 Material
3.2.1 Klinikbedarf
Advantage® Spot-on, Wirkstoff: Imidacloprid Bayer Vital, Leverkusen
Capstar® S ad. us. vet., Tabletten, Wirkstoff: Nitenpyram
Novartis, Eschborn
Einmalkanülen, steril, Fine-ject, 20G, 0,9x25mm
Henke, Sass, Wolf (4710009025), Tuttlingen
Einmalkanülen, steril, Neolus, 26G, 0,45x12mm
Terumo (NN-2613R), Eschborn
Einmalspritzen, steril TBC, 1ml, mit Spardorn
Dispomed (22027), Gelnhausen
Einmalspritzen, steril, 2ml
Henke, Sass, Wolf (4020.000V0), Tuttlingen
Ethanol, 96%, unvergällt, Aqua dest. ad 70% Merck (1.00971.2500), Darmstadt
Flohkamm Zoofachhandel
Ketamin 10% Injektionslösung
Riemser Arzneimittel, Greifswald – Insel Riems
Kodan Tinktur Forte 250 ml
Schülke& Mayr, Norderstedt
Mikro-Probengefäße, K-EDTA, 1,3ml Nennvolumen
Sarstedt (41.1504.005), Nümbrecht
Posifenicol C 1% Augensalbe, Wirkstoff: Chloramphenicol Ursapharm, Saarbrücken
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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3.2.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterial
Combitips, 1,25 ml Eppendorf (0030069.420), Hamburg
Combitips 2,5 ml Eppendorf (0030069.447), Hamburg
Einmal-Filter, 0,2 µm Renner (26146040), Dannstadt
Einmal-Pasteurpipetten Merck (612F1767), Darmstadt
Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96 Vertiefungen Biochrom (P92960), Berlin
Kühlpack, 17x10x2,5 cm Neolab (1-1400), Heidelberg
Laborflaschen mit Gewinde und Deckel, 500 ml VWR International (215-1594), Darmstadt
Universalstift, Lumocolor permanent Staedtler Mars (318-3), Nürnberg
Parafilm M Brand (701605), Wertheim
Schermaschine Moser Arco Harotec (1854-0061), Berlin
Universalstift, Lumocolor permanent Staedtler Mars (318-3), Nürnberg
Xylazin 2% Injektionslösung CP Pharma, Burgdorf
Zellstofftupfer, Pur-Zellin
Paul Hartmann, Heidenheim
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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53
PD-10 Säule (Sephadex G-25) GE Healthcare (17-0851-01), München
Pipettenspitzen, gelb, 2-100 µl Sarstedt (70.760.002), Nümbrecht
Pipettenspitzen, blau, 200-1000 µl Sarstedt (70.762), Nümbrecht
Reaktionsgefäß, 1,5 ml Nerbe plus (04-212-1000), Winsen/Luhe
Rinderblut, getrocknet Institut für Parasitologie, TiHo Hannover
Röhre, 5 ml, 13x75 mm Nerbe plus (02-161-0000), Winsen/Luhe
Röhre, 15 ml, 120x17 mm Sarstedt (62.554.002), Nümbrecht
Röhre, 50 ml, 28x114 mm Sarstedt (62.547.004), Nümbrecht
Quarzsand Baustoffhandel
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54
3.2.3 Reagenzien
Albumin, bovin, Fraktion V, 98%, pulverisiert (BSA, bovines Serumalbumin)
PAA Laboratories GmbH (K41-001- 100), Linz / A
Ammoniumbikarbonat ((NH4)HCO3) Roth (T8711.), Karlsruhe
BCATM Protein Assay Kit (Bicinchoninic Acid) Perbio Science Deutschland (23225), Bonn
Dimethylsufoxid (DMSO) Mallinckrodt Baker B. V. (7033), Deventer, NL
Ethylendiamin-Tetraacetat (EDTA) Sigma-Aldrich (ED2SS), Taufkirchen
Histamin, freie Base, 97% Sigma-Aldrich (H-7125), Taufkirchen
125Jod-Histamin-Tracer, 1 Flasche Lyophilisat in 5,5ml A. dest. gelöst, Aktivität <130 kBq
LDN, Nordhorn
Kaliumchlorid (KCl), kristallin Biochrom (T046-10), Berlin
Natriumazid (NaN3), 1,85 g/ml; als 10%ige Lösung in A. dest. eingesetzt
Sigma-Aldrich (S- 2002), Taufkirchen
Natriumchlorid (NaCl) Roth (9265.2), Karlsruhe
N-Hydroxysuccinimido-Biotin (NHS-Biotin)
LDN, Nordhorn
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, ohne Ca2+/Mg2+, (Trockensubstanz)
Biochrom (L18210), Berlin
Piperazine-N,N’-bis[2-ethanesulfonic]acid (Pipes) Sigma-Aldrich (P6757), Taufkirchen
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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55
Polyethylenglycol (PEG) 8000 Sigma (P-2139) Taufkirchen
Salzsäure (HCl), konzentriert (37 %) J.T. Baker (6081), Deventer, NL
Triton X 100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) Sigma-Aldrich (X100), Taufkirchen
Trizma® Base (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) Sigma-Aldrich (T-1503), Taufkirchen
Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) Sigma-Aldrich (P-1379), Taufkirchen
3.2.4 Puffer und Lösungen
3.2.4.1 Puffer und Lösungen für den Einsatz im FIT
PBS (aus Dulbecco PBS-Trockensubstanz hergestellt)
NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 HCl / NaOH Aqua tridest.
ad ad
8 g 0,2 g
1,24 g 0,2 g
pH 7,4 1000 ml
Pipes A 10x (Puffer-Konzentrat, Lagerung als Stammlösung bei -20°C)
NaCl KCl Pipes NaOH Aqua tridest.
ad
6,42 g 0,373 g
7,56 g 1,6 g
100 ml
Pipes B (Histaminfreisetzungs- puffer)
Pipes A (10x) CaCl2 1mol/l MgCl2 2mol/l HCl / NaOH Aqua tridest.
ad ad
5 ml 100 µl 50 µl
pH 7,4 50 ml
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Abweichend vom oben aufgeführten Pipes B kamen Pipes B-Puffer mit veränderten
CaCl2-Stoffmengen zum Einsatz:
Pipes B0,5 CaCl2 1 mol/l 50 µl
Pipes B2,0 CaCl2 1 mol/l 200 µl
3.2.4.2 Puffer und Lösungen für den Einsatz im RIA
Pipes A Pipes A 10x PBS
ad
5 ml 45 ml
Präzipitationsserum
Donkey-anti-goat Ig-Serum PEG 8000 Triton X 100 (25%) Natriumazid (10%) PBS
6,6 ml 50 g 2 ml 2 ml
1000 ml
Salzsäure 0,1N konz. HCl (37%) Aqua tridest.
ad
3,8 ml 1000 ml
Tris 0,5M
Tris Tween 20 Aqua tridest. HCl Aqua tridest.
ad ad
30 g 0,1 ml
380 ml pH 8,5 500 ml
Ziege-anti-Acylhistamin-Serum
Ziege-anti-Acylhistamin Immunserum (1:100) Ziegenserum, normal Natriumazid, 10% PBS
ad
0,4 ml
1 ml 0,2 ml
100 ml
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57
3.2.5 Antikörper und Sera
Donkey-anti-goat (Esel-anti-Ziege)-IgG, Antiserum (DαG)
Immundiagnostik (G4002), Bensheim
Rabbit-anti-cat (Kaninchen-anti-Katze)-IgG (H+L), (RαC)
Acris Antibodies (R1307P), Hiddenhausen
Goat-anti-Acylhistamin-Serum, Ziege-anti-Acylhistamin (Gαh)
AG Immunologie, TiHo Hannover, verd. Hyperimmunserum
Ziegenserum, normal AG Immunologie, TiHo Hannover
3.2.6 Antigene
C. felis-Ganzflohextrakt WBE-G
Greer Laboratories, Lenoir (USA) 1:100 w/v, Konservierungsstoff Phenol 0,4 %, Proteingehalt: 50 µg/ml
C. felis-Ganzflohextrakt WBE-H Institut für Parasitologie, TiHo Hannover, Proteingehalt: 1160 µg/ml
3.2.7 Software
Die Auswertung der im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten erfolgte mit SAS 9.1
(SAS Institute Inc.), OriginPro 7.5 (OriginLab), Prism 4 (GraphPad Software) sowie
Excel 2003 (Microsoft).
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58
3.3 Versuchstiere
3.3.1 Katzen
Die zur Untersuchung der Sensibilisierungskinetik gegen Antigene des Katzenflohs,
C. felis, eingesetzten Katzen stammten aus der Tierhaltung des Instituts für
Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Alle Tiere mit Ausnahme der
Katze S (HZT 807) wurden vor Beginn der Verlaufsuntersuchung keiner bekannten
Flohexposition unterzogen. Die Katzen E, G und N stammten aus einer Zucht und
Haltung, bei der eine Flohexposition sicher ausgeschlossen werden konnte.
Die nachstehende Tabelle enthält eine Aufstellung der in der Verlaufsuntersuchung
verwendeten Katzen:
Tab. 1: Verzeichnis der in der Untersuchung verwend eten Katzen.
Studien-ID Täto-Nr. Gruppe Geschlecht Alter bei Versuchseintritt
A HZT 512 w 1 J. 10 M.
B HZT 513 w 1 J. 10 M.
C HZT 516 w 1 J. 9 M.
D 3058C mk 4 J. 4 M.
E 1022F w 1 J. 1 M. F HZT 401
hohe Ag-Exposition
mk 2 J. 11 M.
G 1031F w 1 J. 1 M.
H HZT 344 mk 3 J. 2 M.
I HZT 345 mk 3 J. 2 M.
K HZT 424 w 2 J. 5 M.
L 2906 w 4 J. 5 M.
M 3075C mk 4 J. 4 M.
N 1032F w 1 J. 1 M.
O HZT 517 w 1 J. 4 M.
P HZT 518 w 3 J. 2 M.
Q 4E380 mk 2 J. 6 M.
R 4E436 mk 2 J. 6 M.
S HZT 807
geringe Ag-Exposition
mk 8 J. 3 M.
w = weiblich; mk = männlich kastriert; J = Jahre, M = Monate
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59
3.3.2 Katzenflöhe
Für die wöchentlichen Infestationen wurden adulte C. felis aus der Stammhaltung
des Instituts für Parasitologie, TiHo Hannover, verwendet. Zur Aufrechterhaltung der
Flohpopulation wurden zwei bis vier Katzen, die nicht zu den hier geprüften
Versuchkatzen gehörten, zwei Mal pro Woche mit Flöhen infestiert und die Floheier
von Einrichtungsgegenständen und Ruheplätzen der Katzen abgesammelt und mit
einem Rundsieb (3.1) von Schmutzpartikeln getrennt. Die Eier wurden anschließend
bei 27°C und 80% rF auf einem Brutsubstrat aus Quar zsand und getrocknetem
Rinderblut (3.2.2) als Nahrungsquelle für die Larven inkubiert. Nach ca. 14 Tagen
wurden die Puppenstadien zu je 1 g in Plastikdosen abgefüllt, was etwa 100 adulten
Flöhen entsprach. Auf diese Weise erfolgte die erste Blutmahlzeit zum Zeitpunkt der
Infestation der Versuchstiere.
3.4 Methoden
3.4.1 Verlaufsuntersuchung
Die Verlaufsuntersuchung zur Kinetik der Sensibilisierung von basophilen
Granulozyten der Katze gegen Antigene des Katzenflohs wurde mit 18 Katzen über
eine Dauer von 40 Wochen von Dezember 2006 bis September 2007 durchgeführt.
Die unbehandelte, hoch mit C. felis-Antigenen exponierte Gruppe bestand aus sechs
Tieren, während die gering exponierte Gruppe zwölf Tiere umfasste (3.3.1).
Die Katzen wurden während der Untersuchung in Gruppenhaltung untergebracht und
hatten Zugang zu abgetrennten Außengehegen, sofern keine Flohexposition
stattfand. Sie wurden sicher getrennt von den zur Flohzucht eingesetzten Katzen
gehalten.
Über den gesamten Zeitraum wurde wöchentlich eine Infestation mit ca. 100 adulten
Flöhen der Spezies Ctenocephalides felis (3.3.2) durchgeführt. Hierzu wurde die
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___________________________________________________________________________
60
jeweilige Katze in eine Transportbox für Kleintiere mit nach oben zu öffnender Klappe
(3.1) gesetzt und die Flöhe in der Nackenregion auf das Fell aufgebracht. Um einen
ausreichenden Flohbesatz sicherzustellen, wurde die Katze nach dem Aufbringen
der Flöhe noch einige Minuten in der Transportbox belassen.
Nach 24-stündiger Exposition wurden die Flöhe mittels eines Flohkamms (3.2.1)
entfernt. Hierzu wurden systematisch Hals, Ohren, Brust, Vordergliedmaßen, dorsale
Rückenlinie, seitliche Brustwand und Bauchwand, Hintergliedmaßen,
Schwanzansatz und Bauchunterseite der Katze gekämmt, bis über einen Zeitraum
von drei Minuten keine Flöhe mehr im Kamm gefunden wurden.
Zur Reduktion der Exposition mit Flohspeichel wurden die Katzen der gering
exponierten Gruppe in 14-tägigem Abstand mit dem spot-on-Präparat Advantage®
(3.2.1) behandelt, welches den Wirkstoff Imidacloprid in einer Konzentration von 100
mg/ml enthält. Tiere bis zu einem Körpergewicht von 4 kg erhielten eine Dosis von
40 mg Imidacloprid und Katzen mit einem Körpergewicht von >4 und bis zu 8 kg
erhielten pro Behandlung 80 mg Imidacloprid. Die Applikation erfolgte nach Scheiteln
der Haare in der dorsalen Nackenregion auf die Haut. Die Flohexposition erfolgte
frühestens 24 Stunden nach einer Behandlung, um eine möglichst gleichmäßige
Verteilung des Wirkstoffes über die Körperoberfläche des Tieres zu gewährleisten.
3.4.2 Blutentnahme
Die Blutentnahme zur Gewinnung der Basophilen erfolgte aus der V. cephalica
antebrachii. Dazu wurde die Katze von einer Hilfsperson fixiert, die entsprechende
Stelle am Unterarm mithilfe einer Schermaschine (3.2.1) geschoren, anschließend
mit Kodan® (3.2.1) desinfiziert und das Blutgefäß gestaut. Die Punktion erfolgte mit
einer sterilen 20 G-Kanüle (0,8*25mm; 3.2.1). Das heraustropfende Blut wurde in ein
Probengefäß (3.2.1) aufgefangen, das als Gerinnungshemmer EDTA enthielt. Nach
Entnahme wurde die Blutung an der Punktionsstelle gestoppt und das Probengefäß
geschwenkt. Es wurden pro Tier und Entnahmezeitpunkt etwa 2-3 ml Blut
entnommen.
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___________________________________________________________________________
61
3.4.3 Herstellung und Aufbereitung der Antigene
3.4.3.1 Extraktion von Antigen aus C. felis
Zusätzlich zu einem kommerziell erhältlichen Ganzflohextrakt von Ctenocephalides
felis (3.2.6) wurde aus dem Flohstamm des Instituts für Parasitologie ein eigener
Antigenextrakt (3.2.6) für den Einsatz im FIT und Intrakutantest (IKT) hergestellt.
Hierzu wurden ca. 1000 junge adulte Katzenflöhe vor ihrer ersten Blutmahlzeit durch
Einfrieren bei -18 °C abgetötet, manuell von ihrem Brutsubstrat befreit und in einer
Reibschale mittels Pistill (3.1) fein zermahlen. Die zerkleinerten Flöhe wurden
anschließend mit 10 ml 0,01 M Ammoniumbikarbonat ((NH4)HCO3; 3.2.3) in ein 15
ml-Röhrchen (3.2.2) überführt. Zur Extraktion des Proteins wurde die wässrige
Lösung ca. 20 Stunden bei Raumtemperatur mithilfe einer Rotationsbank (3.1)
geschwenkt und danach 20 Minuten bei 5000x g zentrifugiert. Der Überstand enthielt
die Proteine, welche nun in gelöster Form vorlagen. Das bei der Zentrifugation
entstandene Pellet wurde bei -18 °C aufbewahrt, um bei Bedarf eine weitere
Extraktion durchführen zu können.
3.4.3.2 Aufreinigung des Antigens
Das für FIT und Intrakutantest benötigte Antigen lag in Form von Ganzflohextrakten
von C. felis vor und musste vor der Verwendung zunächst mittels
Gelfiltrationschromatographie von Histamin und im Fall des Extraktes WBE-G (3.2.6)
vom Konservierungsstoff Phenol befreit werden.
Hierfür wurden PD-10-Säulen (3.2.2) verwendet, die mit Sephadex G-25-Granulat
beladen waren, einem synthetischen Polymer, welches aus porösen Polydextran-
Kügelchen besteht und die höhermolekularen Proteine von kleineren Molekülen wie
Phenol oder Histamin trennt. Dabei durchläuft die Phase der größeren Komponenten
die Säule schneller, da Makromoleküle um das Granulat herumwandern, während
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___________________________________________________________________________
62
kleinere Moleküle mit einem Molekulargewicht unter fünf kDa durch die Polydextran-
Kügelchen hindurchwandern und sich deren Verweilzeit folglich vergrößert.
Zur Aequilibrierung der Säule wurde diese zunächst mit 25 ml PBS (3.2.4) gespült
und das Eluat verworfen. Nach Aufbringen von 2,5 ml des Antigens wurden 3,5 ml
PBS auf die Säule gegeben. Nun konnte der gereinigte, in PBS verdünnte
Antigenextrakt aufgefangen werden. Falls unmittelbar danach eine weitere
Aufreinigung durchgeführt werden sollte, wurde die Säule mit 15 ml PBS gespült.
Andernfalls wurde sie bis zur weiteren Verwendung mit 15 ml einer 0,02%igen
Natriumazid-Lösung (3.2.3) beschickt und bei 4 °C g elagert. Eine Säule wurde für
maximal fünf Aufreinigungsschritte verwendet.
Um die gleich bleibende Beschaffenheit der Antigenlösung zu gewährleisten, wurde
sie nach der Aufreinigung mittels RIA auf den eigenen Histamingehalt geprüft und
nach Bestimmung der Proteinkonzentration aliquotiert bei -18 °C gelagert.
3.4.3.3 Bestimmung der Antigen-Konzentration
Vor Einsatz des jeweiligen Antigens im funktionellen in vitro-Test sowie im
Intrakutantest musste zunächst dessen Proteinkonzentration bestimmt werden, um
es auf die gewünschten Konzentrationsstufen verdünnen zu können. Dies erfolgte
mit Hilfe des BCA-Kits (3.2.3), wobei Cu2+-Ionen mit Protein zu einwertigen
Kupferionen reagieren und mit 2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure einen violett
erscheinenden Komplex bilden. Durch Messung der Lichtabsorption bei 562 nm ließ
sich somit indirekt die Proteinkonzentration photometrisch quantifizieren. Neben
verschiedenen Verdünnungsstufen der Antigenlösung wurde eine BSA-
Verdünnungsreihe (3.2.3) als Standard eingesetzt. Aus diesen Messwerten wurde
eine Standardkurve errechnet, anhand derer die Proteinkonzentrationen der
Antigenverdünnungsstufen ermittelt wurden. Bereinigt um den Verdünnungsfaktor
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
___________________________________________________________________________
63
konnte nun aus diesen Daten die Proteinkonzentration des Antigenextrakts errechnet
werden.
Die BCA-Reaktion wurde auch bei Verwendung der gleichen Antigenlösung nach
jeder Aufreinigung durchgeführt, so dass gleich bleibende Endkonzentrationen des in
den Testverfahren eingesetzten Antigens gesichert waren.
3.4.4 Funktioneller in vitro Test (FIT) zum Nachweis Typ I-allergischer
Effektorzellen
3.4.4.1 Prinzip
Im FIT wurden die im Vollblut enthaltenen basophilen Granulozyten in vitro mit zu
prüfendem Antigen konfrontiert. Im Falle einer bereits vorhandenen, funktionellen
Sensibilisierung auf das Antigen induzieren membranständig überwiegend an
aktivierende Fc-Rezeptoren (FcR) gebundene Antikörper durch Kreuzvernetzung
durch das Antigen eine Freisetzung des in intrazellulären Granula der Basophilen
vorliegenden Histamins sowie weiterer Entzündungsmediatoren (antigeninduzierte
Freisetzung: Ag-Freisetzung, zur Ermittlung der spezifischen Sensibilisierung).
Für eine graduelle Einstufung dieser Reaktion und damit der Stärke der vorliegenden
Sensibilisierung der Basophilen, wurden Aliquots der Blutprobe auf Ansätze mit
verschiedenen Konzentrationsstufen des Antigens verteilt und die Menge des
freigesetzten Histamins für jede Antigenkonzentration mithilfe eines Radio Immuno
Assay (RIA, 3.4.6) bestimmt.
Um die antigeninduzierte Freisetzung für eine Blutprobe richtig bewerten zu können,
musste zusätzlich eine Voraktivierung bzw. Vorschädigung der Basophilen, welche
durch in vivo Maßnahmen bzw. Blutabnahme, Transport und Lagerung der Probe
bedingt sein kann, ermittelt werden.
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___________________________________________________________________________
64
Dazu wurde ein Teil der Blutprobe ohne Antigen inkubiert. Die in diesem Ansatz
enthaltene Menge Histamin, die ohne Provokation durch ein Antigen oder eine
andere zugesetzte Substanz oder Maßnahme freigesetzt wurde, wurde als
Spontanfreisetzung bezeichnet und stellt die minimal freisetzbare Histaminmenge
dar. Außerdem wurde die in den intrazellulären Granula der Basophilen gespeicherte
Gesamtmenge an Histamin bestimmt, in dem ein Ansatz der Blutprobe gekocht
wurde. Durch die Hitzeeinwirkung kam es zu einer Denaturierung der zellulären
Proteine und Zerstörung der Zellmembran, was zu einer Freisetzung des gesamten
intrazellulären Histamins führte. Dies wurde als Maximalfreisetzung (Max) bezeichnet
und als für die Reaktion im FIT zur Verfügung stehende Höchstmenge angenommen.
In einem weiteren Ansatz wurden die Zellen mit Kaninchenantikörpern gegen
schwere und leichte Ketten von Katzen-Immunglobulinen G (Rabbit-α-Cat-IgG (H+L))
inkubiert, welche auf den Basophilen der Katze an aktivierende Fc-Rezeptoren
gebundene IgG-Antikörper bzw. über die leichten Ketten auch IgE-Antikörper binden
und miteinander vernetzen (antikörperinduzierte Freisetzung: Ak-Freisetzung). Die
dadurch freigesetzte Histaminmenge war ein Kriterium für die Fähigkeit der
basophilen Granulozyten, auf eine Fc-Rezeptor-gebundene Antikörpervermittlung mit
einer Degranulation und Ausschüttung von Mediatoren, insbesondere Histamin, zu
reagieren, unabhängig von der Spezifität der membranständigen sensibilisierenden
Antikörper (Ermittlung der generellen Sensibilisierung).
3.4.4.2 Vorbereitung
Zur Durchführung des funktionellen in vitro-Tests wurde Vollblut benötigt. Da im FIT
nur die von membranständig gebundenen Antikörpern vermittelte Reaktion der
Basophilen gemessen werden sollte, wurde das Vollblut zunächst gründlich
gewaschen, um die Zellsuspension von im Serum enthaltenen freien Antikörpern,
bereits freigesetztem Histamin sowie vom Gerinnungshemmer EDTA, der die
Reaktion im FIT beeinflusste, zu befreien. Die gesamte Blutprobe wurde hierzu über
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___________________________________________________________________________
65
10 Minuten bei 700x g zentrifugiert, um die Zellen vom Plasma zu trennen. Dieses
wurde abgenommen und bis zum Originalvolumen der Blutprobe durch PBS ersetzt.
Anschließend wurde die Probe sorgfältig geschwenkt, ein weiteres Mal zentrifugiert
und der zellfreie Überstand durch PBS ersetzt, bevor sie im FIT verwendet wurde.
Außerdem wurden verschiedene Reaktionsansätze vorbereitet, die eine auf Pipes A
basierende Pufferlösung enthielten (Pipes B; 3.2.4), die die zur Degranulation und
somit Freisetzung des Histamins aus den intrazellulären Granula der basophilen
Granulozyten nötigen Ca2+-Ionen enthielt.
3.4.4.3 Durchführung
Zur Feststellung der spontanen Histaminfreisetzung wurden 250 µl gewaschenes
Vollblut mit 250 µl Pipes B-Puffer versetzt.
Die durch Antikörper induzierte Freisetzung wurde mit in PBS gelösten Rabbit-α-Cat-
IgG (3.2.5) meist in einer Endkonzentration von 30 µg/ml durchgeführt. Für diesen
Ansatz wurden 200 µl Blut, 50 µl Antikörperpräparation sowie 250 µl
Freisetzungspuffer verwendet.
Für die antigeninduzierte Freisetzung wurde ebenfalls in PBS gelöster, aufgereinigter
Ganzflohextrakt von C. felis (3.2.6) eingesetzt. Es wurden pro Ansatz 50 µl der
Antigenpräparation in Konzentrationen von 50, 10, 1, 0,1 und 0,01 µg/ml sowie 250
µl Pipes B und 200 µl gewaschenes Vollblut pipettiert, so dass der Extrakt im
Reaktionsansatz in einer Endkonzentration von 5, 1, 0,1, 0,01 und 0,001 µg/ml zum
Einsatz kam.
Die Reaktionsgefäße wurden anschließend gemischt, eine Stunde lang bei 37 °C
inkubiert und danach für 20 Minuten auf Brucheis (4°C) gestellt, um die
Histaminfreisetzung zu stoppen. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 700x g
für 10 Minuten.
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66
Abweichend hiervon wurde der Ansatz zur Ermittlung der maximalen Freisetzung wie
folgt bearbeitet:
200 µl Blut wurden mit 800 µl Freisetzungspuffer vermischt, 10 Minuten im
Wasserbad gekocht und mittels Zentrifugation vom Zelldetritus getrennt.
Die so gewonnenen zell- und partikelfreien Überstände wurden schließlich
abgenommen und bei -20 °C bis zur Auswertung im RIA (3.4.6) gelagert.
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67
3.4.5 Intrakutantest (IKT)
3.4.5.1 Prinzip
Der Intrakutantest beruht auf der Provokation von Hautmastzellen mittels
intradermaler Injektion eines gelösten Antigens, welches in der Lage ist, durch
Quervernetzung von sensibilisierenden, überwiegend an Fc-Rezeptoren gebundenen
Antikörpern eine Degranulation von Mastzellen auszulösen. Da dies hauptsächlich
dann ausgelöst wird, wenn die Mastzelle in ausreichender Dichte spezifische, gegen
das Antigen gerichtete Antikörper gebunden hat, ist das Verfahren geeignet, eine
Sensibilisierung der Mastzellen auf ein Antigen nachzuweisen. Durch die bei der
Degranulation freigesetzten Entzündungsmediatoren erhöht sich die
Gefäßpermeabilität. Dies äußert sich als sichtbare Hautreaktion in Form einer
Quaddel, welche sich meist nach 10 bis 60 Minuten ausbildet.
3.4.5.2 Vorbereitung
Im Intrakutantest wurden die gleichen Testsubstanzen, d.h. Rabbit-α-Cat-IgG (3.2.5.)
sowie Flohantigen-Extrakt (3.2.6), in den gleichen Konzentrationen wie im
funktionellen in vitro-Test (3.4.4) angewandt. Zusätzlich wurden die Substanzen mit
einem 0,2 µm-Filter steril filtriert, um eine bakterielle Kontamination mit Sicherheit
ausschließen zu können.
Es wurde außerdem PBS als Negativkontrolle verwendet, da dies als Lösungsmittel
für alle Testsubstanzen diente. Die Positivkontrolle bildete Histamin (3.2.3) in einer
Konzentration von 50 bzw. 100 µg/ml, welches als Entzündungsmediator direkt sowie
indirekt zur Bildung einer Quaddel führt.
Die Substanzen wurden in 1 ml-Tuberkulinspritzen mit Spardorn (3.2.1) zu je 50 µl
für die Injektion vorbereitet.
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68
Die Katzen wurden nach einer Untersuchung auf klinische Allgemeingesundheit
mittels einer intramuskulären Injektion von 10-15 mg Ketamin (3.2.1) und 2 mg
Xylazin (3.2.1) pro kg Körpergewicht in Narkose gelegt.
Das für die Injektion vorgesehene Areal wurde gründlich geschoren, gereinigt und mit
unvergälltem Ethanol (3.2.3) desinfiziert, so dass adverse Hautreaktionen durch im
Alkohol enthaltene Sulfide weitgehend ausgeschlossen werden konnten. Der
Intrakutantest wurde in einer Körperregion stets nur einmal ausgeführt, um das
Auftreten von falsch positiven Ergebnissen durch eine lokale Mastzellsensibilisierung
zu vermeiden.
3.4.5.3 Durchführung
Die intrakutane Injektion der Testsubstanzen erfolgte an vorher markierten Stellen im
Abstand von ca. 2,5 cm. Es wurde eine Hautfalte aufgezogen und die 26G-Kanüle
(3.2.1) nahezu parallel zur Körperoberfläche geführt. Der korrekte, intradermale Sitz
der Kanüle wurde vor der Injektion überprüft und zusätzlich durch Aspiration mit der
Spritze eine subkutane oder intravaskuläre Injektion ausgeschlossen.
Unmittelbar nach der Injektion (t0) erfolgte die Messung des Durchmessers der allein
durch das Injektionsvolumen entstehenden Ausgangsquaddel mit Hilfe einer digitalen
Schieblehre (3.1). Die weitere Vermessung der Quaddeln, die infolge der lokalen
Reaktion auf die injizierten Substanzen bzw. Flüssigkeiten entstanden
(Reaktionsquaddeln), wurde 15, 30 und 60 Minuten nach der Injektion durchgeführt.
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
___________________________________________________________________________
69
3.4.5.4 Auswertung
Die Reaktion auf eine Substanz wurde als positiv eingestuft, wenn der Durchmesser
einer Reaktionsquaddel zu einem der Messzeitpunkte größer als der Durchmesser
der Ausgangsquaddel plus 0,8 mm war (vgl. 4.2.4). Da die gleichen
Konzentrationsstufen der Testsubstanzen wie im FIT verwendet wurden, war auch
hier eine graduelle Einstufung und so ein direkter Vergleich der Daten zur
Sensibilisierung von Basophilen im FIT und Mastzellen im IKT möglich.
3.4.6 Radio Immuno Assay (RIA)
3.4.6.1 Prinzip
Der RIA ist ein immundiagnostisches Verfahren, welches mittels radioaktivem Marker
geringste Substanzmengen in einer Probe quantitativ nachweisen kann. Zur
Bestimmung der Histaminfreisetzungen aus den Basophilen wurde acyliertes, mit 125Iod markiertes Histamin (3.2.3) verwendet, welches im RIA mit dem
Probenhistamin um eine limitierte Anzahl von Bindungsstellen von Anti-Acylhistamin-
Antikörpern (3.2.5) konkurriert.
Da Histamin als ubiquitärer Mediator im Tierreich vorkommt, ist ein
antikörperbasiertes immunologisches Verfahren zu seiner Detektion per se nicht
geeignet, da es unmöglich ist, gegen Histamin gerichtete Antikörper zu generieren.
Somit musste die Konformation des nativen Histamins zunächst durch Acylierung der
Aminogruppe geändert werden, um es mithilfe eines Anti-Acylhistamin-Antiserums
(3.2.4.2) nachweisbar zu machen.
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
___________________________________________________________________________
70
3.4.6.2 Durchführung
Zur Ermittlung der Histaminkonzentrationen in den Überständen aus dem FIT wurde
ein Histaminstandard in Form einer Verdünnungsreihe im Doppelansatz erstellt
(3.2.3; 3.2.4.2):
Zur Durchführung des Assays musste zusätzlich zu dem bereits acylierten Tracer-
Histamin das im FIT freigesetzte Probenhistamin acyliert werden.
Hierzu wurden den in Doppelansätzen zu je 100µl vorliegenden Proben folgende
Reagenzien (3.2.4.2) hinzugefügt:
Anschließend wurden die Proben gut gemischt und bei Raumtemperatur über 30
Minuten inkubiert.
Histaminstandards in den Konzentrationsstufen:
100ng/ml, 30ng/ml, 10ng/ml, 3ng/ml,
1ng/ml, 0,3ng/ml 0,1 N HCl
je 50µl
Probe ohne zugesetzten Histaminstandard (B0) 50µl
0,1 N HCl
Probe für nichtspezifische Bindung (NSB) 50µl
0,1 N HCl
+ 50µl
Pipes B
Kontrollansatz zur Bestimmung der Traceraktivität (T) 25µl
125I-Histamintracer
Tris-Puffer 50µl
NHS-Biotin (1:25 verd. in Pipes A) 50µl
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
___________________________________________________________________________
71
Allen acylierten Proben wurde nun 25 µl 125I-Histamintracer hinzugefügt. Außer in
den Ansatz für nichtspezifische Bindung (NSB) und die Tracerkontrolle (T) wurden je
50 µl des Ziege-α-Acylhistamin-Antikörpers in einer Endverdünnung von 1: 25.000
pipettiert.
Der Inhalt der Röhrchen wurde gut vermischt und für 20 h bei 4 °C inkubiert. Die in
dieser Zeit gebildeten Histamin-Antikörper-Komplexe wurden daraufhin mithilfe eines
Esel-α-Ziege-Antikörpers (3.2.5) präzipitiert. Hierzu wurde allen Proben außer der
Tracerkontrolle 1 ml eines 1:200 verdünnten Präzipitationsserums (3.2.4.2)
hinzugefügt. Mithilfe der in der NSB-Probe ausfallenden Präzipitate konnte die
Menge des unspezifisch gebundenen 125I-Histamin bestimmt werden, da in diesem
Reaktionsansatz der Bindungspartner fehlte. Nach 15 Minuten Inkubation bei 4 °C
wurden die entstandenen Präzipitate für weitere 15 min bei 2000x g abzentrifugiert.
Zur Entfernung von nicht gebundenem Tracer und Probenhistamin wurden die
Probenröhrchen sorgfältig dekantiert.
3.4.6.3 Messung und Auswertung
Die Radioaktivität der Präzipitate wurde in einem Gammacounter (3.1) ermittelt. Das
Messergebnis wurde in Zählimpulsen pro Minute (counts per minute, cpm)
ausgegeben, wobei die Messdauer einer Probe 60 s betrug. Zur Auswertung wurde
der Aktivitätsmittelwert des Doppelansatzes der jeweiligen Probe herangezogen. Von
allen Proben wurde außerdem die in der Probe für nichtspezifische Bindung (NSB)
(3.4.6.2) gemessene Aktivität subtrahiert.
Zur Ermittlung der Histamingehalte wurde die Aktivität der Proben der
Histaminstandardverdünnungsreihe gemessen. Anhand der Aktivität der
Standardproben wurde mithilfe einer sigmoidalen Anpassungsfunktion ein Graph
erstellt, wobei die Histaminkonzentration des Standards logarithmisch gegen den
Quotient aus der Aktivität der gemessenen Probe (B) und der lediglich
Tracerhistamin enthaltenden Probe (B0) in Prozent aufgetragen wurde (B/B0 [%]).
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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72
Die Histaminkonzentration in den Proben aus dem FIT konnte so aus folgender
Funktion errechnet werden:
f(x) = [(A1-A2) / (1+(x/x0)p)] + A2
mit: A1 untere Asymptote A2 obere Asymptote x Histaminkonzentration x0 Wendepunkt p Ordnungsgrad f(x) B/B0
Abbildung 1 zeigt den Graphen dieser Funktion.
1 10 1000
20
40
60
80
100
B / B
0 (%
)
Histaminkonzentration (ng/ml)
Abb. 1 Graph der sigmoidalen Anpassungsfunktion des Histaminstandards im RIA. Die logarithmisch dargestellten Werte der Konzentration des Histaminstandards (•) sind gegen den linearen Quotienten aus der Aktivität der zu messenden Probe (B) zur ausschließlich Tracerhistamin enthaltenden Probe (B0) aufgetragen, der den Anteil des Tracerhistamins am Gesamthistamin der Probe angibt.
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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73
Da die Blutproben im FIT teilweise in unterschiedlichen Verdünnungen im
Freisetzungspuffer gelöst waren, wurde dies durch Anwendung entsprechender
Korrekturfaktoren berücksichtigt.
3.4.7 Parasitologische Untersuchungen
3.4.7.1 Auswertung der Flohinfestationen
Die nach 24 Stunden Exposition auf den Katzen gefundenen Flöhe wurden zunächst
pro Tier gezählt und anschließend mit Hilfe eines Stereo-Mikroskops (3.1) auf die
Aufnahme einer Blutmahlzeit untersucht. Dazu wurde jeder Floh gequetscht, wobei
eine rote Verfärbung des Magen-Darm-Inhalts als positiv für den Saugakt gewertet
wurde.
3.4.7.2 Kotuntersuchung
Während der Verlaufsuntersuchung wurden in Woche 16 und 41 Sammelkotproben
auf Entwicklungsstadien von Endoparasiten mit Hilfe des Flotationsverfahrens
untersucht. Dabei wurden vier Gramm Kot mit gesättigter Kochsalzlösung (3.2.3) in
eine Mörserschale überführt und gut durchmischt. Die Kotsuspension wurde über ein
Teesieb (3.1) gegossen, um grobe Bestandteile herauszufiltern und anschließend mit
gesättigter NaCl-Lösung bis auf 60 ml Endvolumen aufgefüllt. Anschließend wurde
eine Zählkammer nach McMaster (3.2.2) mit der Suspension befüllt und diese
mikroskopisch auf Helmintheneier untersucht.
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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74
3.4.8 Statistik
Zur Darstellung der Daten der Flohinfestationen wurde der Boxplot gewählt (Abb. 2).
Abb. 2: Aufbau eines Boxplots
Der Boxplot visualisiert die Verteilung von Daten auf einem Zahlenstrahl. Die Box
enthält 50% der Werte, die sog. Whisker schließen 90% der Messwerte ein. Je nach
Lage des Medians in der Box sowie zum arithmetischen Mittelwert lässt sich
abschätzen, ob eine symmetrische Verteilung der Daten vorliegt oder eine Schiefe zu
erwarten ist. Außerdem lässt sich anhand der Größe der Box die Streuung der Werte
erkennen. Die Box wird begrenzt durch das untere bzw. obere Quartil, welches 25%
bzw. 75% der Daten einschließt. Extremwerte werden, wie aus Abb. 2 ersichtlich,
ober- und unterhalb der Whisker eingetragen.
M A T E R I A L U N D M E T H O D E N
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75
Zur Beurteilung der Lage der in dieser Arbeit gesammelten Daten wurden das
arithmetische Mittel, der Median sowie die Standardabweichung berechnet. Die
Standardabweichung ergibt sich als Quadratwurzel aus der Varianz und ist ein Maß
für die Streuung der Messwerte um das arithmetische Mittel (SACHS 2004).
Mithilfe des Shapiro-Wilk-Test (SACHS 2004) wurden die während der
Flohinfestationen gesammelten Daten auf Normalverteilung geprüft.
Der Wilcoxon-Test wurde angewendet, um zu prüfen, ob die Anzahl Flöhe, welche in
der hoch exponierten Gruppe gefunden wurde, signifikant von der Zahl abweicht, die
in der gering exponierten Gruppe zu finden war. Er dient dem Vergleich der
Differenzen gepaarter Beobachtungen, die nicht normalverteilt sind. Dabei wird die
Nullhypothese getestet, dass zwischen den Beobachtungen kein Unterschied besteht
(SACHS 2004).
Der exakte Test nach Fisher wurde benutzt, um das Verhältnis positiver zu negativen
Reagenten im FIT und im IKT zwischen den Gruppen nach Zeitpunkten zu
analysieren. Sein Anwendungsgebiet entspricht dem Chi-Quadrat-Test. Er kommt bei
Beobachtungen zum Einsatz, die eine geringe Häufigkeit aufweisen (SACHS 2004).
Der McNemar-Test zur Prüfung von verbundenen Stichproben mit dichotomen
Merkmalen wurde verwendet, um die beiden Untersuchungsverfahren Intrakutantest
und funktioneller in vitro Test sowie die beiden eingesetzten Flohantigen-Extrakte
hinsichtlich ihrer Testbefunde zu vergleichen. Die Daten werden auf die
Nullhypothese geprüft, dass zwischen den beiden Stichproben kein Unterschied
besteht (SACHS 2004).
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76
Zusätzlich zum McNemar-Test wurde mithilfe des Kappa-Index (SACHS 2004) das
Maß der Übereinstimmung in folgenden Stufen ermittelt:
Kappa Übereinstimmung
< 0,10
0,10 – 0,40
0,41 – 0,60
0,61 – 0,80
0,81 – 1,00
keine
schwach
deutlich
stark
fast vollständig
Die Regressionsanalyse (SACHS 2004) wurde angewendet, um eine differenziertere
Betrachtung der Freisetzungskinetik der Basophilen zu ermöglichen. Mithilfe dieses
Testverfahrens wurde geprüft, ob im Verlauf eine signifikante Zunahme oder
Abnahme der antigenspezifischen Histaminfreisetzung im Zeitverlauf zu verzeichnen
ist, oder ob die Schwankungen in der Freisetzung zufällig sind (Null-Hypothese).
Veränderungen in der Histaminfreisetzung im Zeitverlauf lassen sich am
Regressionskoeffizienten, welcher der Steigung der Regressionsgeraden entspricht,
ablesen. Ist p < 0,05, liegt eine signifikante Änderung vor. Das Bestimmtheitsmaß (r2)
ist das Quadrat des Korrelationskoeffizienten und gibt den Anteil der Variation der y-
Werte, der durch x erklärbar ist, an. Der Achsenabschnitt liefert den genäherten
Ausgangswert, welcher der Histaminfreisetzung zu Beginn der Untersuchung
entspricht.
Die zur Auswertung verwendeten Signifikanzstufen und ihre Bezeichnungen lauten
wie folgt:
p < 0,05
p < 0,01
p < 0,001
signifikant
hochsignifikant
höchstsignifikant
*
**
***
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77
4 Ergebnisse
In der vorliegenden Arbeit wurde die Kinetik der funktionellen Sensibilisierung von
basophilen Granulozyten und Mastzellen der Katze mit Antikörpern gegen Antigene
des Katzenflohs, C. felis, untersucht. Es sollte mit Hilfe eines funktionellen in vitro
Test zum Nachweis der Sensibilisierung Typ I allergischer Effektorzellen (FIT) und
eines Intrakutantest (IKT) überprüft werden, ob die Antigenmenge, mit denen die
Effektorzellen der Typ I-Allergie konfrontiert wurden, einen Einfluss auf die
Sensibilisierung hat. Außerdem sollte der von KAUL (1998) entwickelte und von
STUKE (2005) für die Katze adaptierte funktionelle in vitro-Test (FIT) weiter optimiert
und die Korrelation von FIT-Ergebnissen mit IKT-Reaktionen und der Stärke des
Flohbefall untersucht werden.
4.1 Optimierung des FIT für die Allergiediagnostik bei der Katze
Die entscheidende Voraussetzung für die Auswertbarkeit des FIT sind intakte
Basophile, die an membranständige Fc-Rezeptoren gebundene Antikörper in
ausreichender Dichte besitzen. Nur dann kann ein spezifisch erkanntes Antigen zwei
oder mehrere membranständige Antikörper quervernetzen. Dieses als bridging
bezeichnete Phänomen führt zur Aktivierung von Signalschritten, die eine
Freisetzung von Histamin und anderen Mediatoren bewirken können.
Zur sicheren Beurteilung einer durch Antigen induzierten spezifischen Freisetzung
sind für jede Blutprobe eines Individuums geeignete Kontrollen erforderlich: Werden
die zu prüfenden Zellen unter schonenden Bedingungen ohne irgend eine
Stimulation in vitro kultiviert und setzen dabei Histamin frei (Spontanfreisetzung von
Histamin), so erhält man ein geeignetes Maß für eine Vorschädigung bzw. eine
Voraktivierung der Basophilen. Die Spontanfreisetzung stellt ein wichtiges Kriterium
für die Auswertbarkeit des FIT dar. Die Höhe der Spontanfreisetzung wird von
äußeren Faktoren wie Temperatur und Lagerungsdauer der Blutprobe beeinflusst
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
78
(STUKE 2005). Da die Blutentnahme für Katzen oftmals Stress verursacht, kann
auch dies zu einer Aktivierung der Basophilen und damit erhöhten
Spontanfreisetzung führen. Daher wurde zunächst versucht, die spontane
Histaminfreisetzung durch Basophile der Katze zu optimieren, um die Auswertbarkeit
von FIT-Ergebnissen zu verbessern.
Aufgrund des bei Katzen nur in geringem Umfang abnehmbaren Blutvolumens und
aus technischen Gründen konnten bei diesen Versuchen neben den Messreplikaten
im Radio Immuno Assay (RIA) keine weiteren Replikate angefertigt werden.
4.1.1 Verdünnung der Blutproben
Da Basophile durch Kontakt mit Fremdoberflächen, wie Plastikwandungen, aktiviert
werden können, sollte untersucht werden, ob durch den Transport der Blutprobe in
einem Medium der Oberflächenkontakt der Basophilen vermindert und somit die
spontane Histaminfreisetzung der voraktivierten Zellen herabgesetzt werden kann.
Es wurde eine mit 0,002% EDTA versetzte PBS-Lösung als Verdünnungsmedium
verwendet. Die Endverdünnung der Blutprobe betrug 1:3,5. Verglichen wurden
Spontan- und Maximalfreisetzung der Basophilen ohne und mit Verdünnung der
Blutprobe. Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt.
E R G E B N I S S E
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79
Abb. 3 : Einfluss der Verdünnung von Blutproben der Katze au f die Spontanfreisetzung von Histamin im FIT. Bei der Blutentnahme (3.4.2) von drei Katzen (3.3.1) wurde das tropfende Blut entweder in EDTA-beschichteten Röhrchen (3.2.1) aufgefangen (unverdünntes Blut) oder in einer vorgelegten EDTA-Lösung (3.4.2) 1:3,5 verdünnt (verdünntes Blut). Diese Blutproben wurden innerhalb von 2 h nach Entnahme im FIT auf ihre spontane Histaminfreisetzung untersucht (3.4.4.1). Dargestellt ist die mittlere spontane Histaminfreisetzung und Standardabweichung als Prozentwert der jeweiligen maximalen Freisetzung (3.4.4.1).
Die mittlere Spontanfreisetzung der unverdünnten und verdünnten Blutproben betrug
8,9% bzw. 6,2%. Ein Transport der Blutproben in PBS-EDTA-Medium hat bei den
untersuchten Tieren somit eine Absenkung der Spontanfreisetzung um ca. 30%
gegenüber den aus unverdünnten Blutproben gemessenen Freisetzungswerten
bewirkt. Dies resultierte aus einer verbesserten Messbarkeit der
Gesamthistaminmenge, welche durch Verdünnung der Probe weniger durch
Zelldetritus maskiert wurde und/oder einer verminderten Spontanfreisetzung, was auf
eine geringere Voraktivierung bzw. Schädigung der Basophilen schließen ließ.
E R G E B N I S S E
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80
4.1.2 Optimierung der Ca-Konzentration im Freisetzu ngspuffer
Basophile benötigen für die Degranulation und Histaminfreisetzung extrazellulär
vorhandenes Kalzium. Da dieses durch den im Probengefäß enthaltenen Chelator
EDTA entzogen wurde, musste es für die Reaktion im FIT wieder zur Verfügung
gestellt werden. Dies geschah mit Hilfe des Freisetzungspuffers Pipes B. Die Ca2+-
Konzentration der Pufferlösung nach KAUL (1998) betrug effektiv 1 mmol/l.
Es sollte untersucht werden, wie sich eine erhöhte oder verminderte Ca2+-
Konzentration auf das Degranulationsverhalten der Basophilen auswirkt. Hierfür
wurden Pipes B-Lösungen mit Ca2+-Endkonzentrationen von 0,5 mmol/l (Pipes B0,5)
und 2 mmol/l (Pipes B2,0) sowie der Standardpuffer mit 1 mmol/l Ca2+ (Pipes B)
eingesetzt. Für den Versuch stand Vollblut von drei Katzen (3.3.1) zur Verfügung.
Neben den jeweiligen Spontanfreisetzungen wurde die durch den RaC-Antikörper
induzierte Histaminfreisetzung in den unterschiedlichen Ca2+-Milieus verglichen.
Während in Pipes B0,5 die Spontanfreisetzung zwischen 2,5% und 3,9% der
maximalen Freisetzung betrug, lag er in Pipes B2,0 zwischen 4,6% und 6,2%. In
Pipes B mit 1 mmol/l Ca2+ setzten die Basophilen zwischen 4,2% und 5,6% der
Gesamtmenge Histamin frei.
Die antikörperinduzierte Freisetzung betrug in Pipes B0,5 zwischen 17,8% und 48,7%,
in Standard-Pipes B zwischen 29,1% und 64,2% und in Pipes B2,0 zwischen 32,3%
und 60,6%.
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81
Abb. 4: Mittlere spontane und antikörperinduzierte Histaminfreisetzung in Pipes B-Lösungen unterschiedlicher Ca-Konzentration . Dargestellt sind die Mittelwerte der antikörperinduzierten Histaminfreisetzung sowie Standardfehler in Prozent der maximalen Freisetzung von drei Katzen (3.3.1). Für die antikörperinduzierte Reaktion wurde RaC-IgG 30 µg/ml (3.2.5) eingesetzt. Für die Freisetzungsbehandlung kamen drei Pipes B-Lösungen mit Ca2+-Endkonzentrationen von 0,5, 1,0 und 2,0 mmol/l zum Einsatz (3.2.4.1). Die gestrichelte Linie bezeichnet den Grenzwert für eine akzeptable spontane Freisetzung bei Katzen (4.2.3.1).
Wie aus Abb. 4 ersichtlich ist, lag die Spontanfreisetzung und die durch RaC-
Antikörper induzierte mittlere Histaminfreisetzung der drei Katzen in Pipes B0,5 etwa
ein Drittel unter der Freisetzung in Pipes B mit 1 mmol/l Ca2+-Konzentration bzw.
Pipes B2,0, während sich die Freisetzungswerte in Pipes B und Pipes B2,0 kaum
unterschieden.
Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass bei einer Ca2+-Konzentration von 0,5
mmol/l nur eine suboptimale Degranulation der Basophilen möglich war, während
eine erhöhte Konzentration von 2,0 mmol/l gegenüber einer Konzentration von 1,0
mmol Ca2+/l zu keiner Verbesserung des Freisetzungsverhaltens der Basophilen
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
82
führte. Daher wurden alle weiteren FITs mit Katzenblut mit einer Ca2+-
Endkonzentration von 1,0 mmol/l in Pipes B durchgeführt.
4.1.3 Lagerung und Transport von Blutproben
Aus früheren Untersuchungen (STUKE 2005) ist bekannt, dass die
Spontanfreisetzung der Basophilen der Katze mit zunehmender Lagerungsdauer
ansteigt. Außerdem konnte eine Abhängigkeit zur Umgebungstemperatur festgestellt
werden. Aus diesem Grund wurden FITs mit Basophilen der Katze stets
schnellstmöglich nach Blutentnahme durchgeführt. Um Lagerung und Transport der
Blutproben über einen längeren Zeitraum zu ermöglichen, wurde der Einfluss
verschiedener Lagerungsbedingungen untersucht. Da für eine Bewertung des FIT
neben einer ausreichend niedrigen Spontanfreisetzung bei einer vorhandenen
Sensibilisierung auch eine entsprechend hohe spezifische Histaminfreisetzung
erfolgen muss, wurden für diese Versuche sowohl Blutproben von Katzen verwendet,
die bei sofortiger Untersuchung im FIT positiv reagierten, als auch solche von FIT-
negativen Reagenten.
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83
Abb. 5 A und B: Zeit- und temperaturabhängige Hist aminfreisetzungen von zwei FIT-positiven (A) und zwei FIT-negativen Katzen (B). Dargestellt sind die Spontanfreisetzung, die antikörperinduzierte Freisetzung (RaC-IgG 30 µg/ml) sowie die antigeninduzierte Freisetzung (Floh-Ganzkörperextrakt = WBE: 5 µg/ml) in Prozent der maximalen Freisetzung von zwei FIT-positiven (A) und zwei FIT-negativen Katzen (B) bei FIT-Untersuchung 2 h nach Blutentnahme sowie nach 24 h Lagerung bei Raumtemperatur oder bei 4 °C. Die x-parallele Linie bezeichnet den Grenzwert für die antigeninduzierte Freisetzung (4.2.3.1).
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84
Die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt. Bei sofortiger Untersuchung im FIT zeigten
alle Tiere eine deutliche antikörperinduzierte Freisetzung (RaC 30), die etwa der
physikalischen Freisetzung (100%) entsprach oder diese übertraf. Nach 24 Stunden
Lagerung bei Raumtemperatur war die antikörperinduzierte Freisetzung bei allen
Tieren auf das Niveau der Spontanfreisetzung abgefallen, somit vollständig
verschwunden. Auch die Flohantigen-induzierte Histaminfreisetzung der im Sofort-
Test positiven Katzen (A) war nach 24 h bei Raumtemperatur nicht mehr vorhanden.
Dagegen zeigten die Basophilen aller Tiere nach 24 h Lagerung bei 4 °C eine
deutlich über die Spontanfreisetzung hinausgehende antikörperinduzierte
Histaminfreisetzung. Auch die im Sofort-Test positiven Katzen reagierten nach
Kühlung der Proben mit einer deutlichen Histaminfreisetzung, während bei den
negativen Katzen nach 24 h Lagerung bei 4° C keine falsch-positive Reaktion zu
beobachten war.
Zusätzlich wurde der Einfluss von möglichen transportbedingten Bewegungen der
Blutprobe während der Lagerung untersucht. Blutproben von vier Katzen wurden
hierzu für 24 h bei +4 °C gekühlt auf einen Miktrot iterplattenrüttler gelegt und die FIT-
Ergebnisse mit denen für 24 h unbewegt, gekühlt gelagerter sowie sofort
untersuchter Proben der selben Tiere verglichen. Bei den auf dem Rüttler gelagerten
Proben ergab sich, verglichen mit den unbewegt gelagerten und sofort untersuchten
Proben, durch die permanente Bewegung kein nachteiliger Effekt auf die
antigenvermittelte Reaktion der Basophilen. Es traten im Vergleich zur Sofort-
Reaktion keine falsch-negativen oder falsch-positiven Resultate auf.
4.1.4 Titration der Antikörperkonzentration
Zur Überprüfung der prinzipiellen Reaktionsfähigkeit der Basophilen eines Tieres
kam ein Antiserum aus dem Kaninchen gegen IgG der Katze (RaC-IgG, 3.2.5) zum
Einsatz. Die Konzentration sollte so gewählt werden, dass eine ausreichend hohe
und individuell differenzierbare Freisetzung auf die Provokation mit dem Antikörper
erfolgt. Wie aus Abb. 6 ersichtlich, wurde der Antikörper in den Konzentrationen 100,
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85
30, 10, 3, und 1 µg/ml an Blutproben von drei Tieren geprüft und die
Histaminfreisetzung in Prozent der physikalischen Freisetzung ausgedrückt. Dabei
fiel auf, dass durch RaC in der Konzentration 100 µg/ml die Freisetzung bei allen
Tieren höher war als die nach Hitzedenaturierung der Zellen gemessene
Histaminmenge. Wie KAUL (1998) zeigte, ist dieser Verlust beim Verkochen durch
an Zellproteine gebundenes Histamin bedingt, welches durch Zentrifugation aus dem
Überstand entfernt wird (3.4.4).
Abb. 6: Antikörperinduzierte Histaminfreisetzung. Dargestellt ist die antikörperinduzierte Histaminfreisetzung (3.4.4.1) in Prozent der physikalischen Freisetzung von drei Katzen (3.3.1). Gemessen wurde die auf Stimulation mit Kaninchen-anti-Katze (RaC)-Antikörper (3.2.5) in fünf Konzentrationsstufen freigesetzte Histaminmenge. Die Reaktionen von zwei Katzen auf 30 und 100 µg/ml Antikörperkonzentration
unterschieden sich nur gering, während ein weiteres Tier auf RaC in der
Konzentration 30 µg/ml deutlich schwächer reagierte. Bei Verwendung einer
Antikörperkonzentration von 10 µg/ml war die Histaminfreisetzung bei einer Katze so
stark vermindert, dass eine zuverlässige Überprüfung der generellen Sensibilisierung
nicht mehr gewährleistet war.
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86
Um für die folgenden Untersuchungen eine differenzierte Beurteilung der generellen
Sensibilisierung der Basophilen mit Hilfe des RaC-IgG zu erzielen, wurde 30 µg/ml
als Standardkonzentration festgelegt.
4.2 Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung
Im Rahmen der Untersuchung der Sensibilisierungskinetik auf Antigene von C. felis
sollte der Einfluss der Antigenmenge auf den Verlauf der Sensibilisierung von
Basophilen der Katze unter dem Einfluss kontrollierter Flohexpositionen geprüft
werden. Dazu wurde eine Gruppe von Katzen (n=12: gering exponierte Tiere) mit
dem Kontaktinsektizid Imidacloprid (3.2.1) behandelt. Die hoch exponierte Gruppe
ohne eine medikamentelle Behandlung umfasste sechs Tiere (3.3.1). Alle 18 Katzen
wurden wöchentlich mit der gleichen Anzahl Katzenflöhe infestiert. Der
Sensibilisierungsstatus der Basophilen wurde mit Hilfe des funktionellen in vitro Tests
(FIT) ermittelt, die Sensibilisierung der Mastzellen mit dem Intrakutantest (IKT)
untersucht.
4.2.1 Flohinfestation
Zur Untersuchung der Sensibilisierungskinetik von basophilen Granulozyten bei hoch
und gering mit Flohantigen exponierten Katzen wurden alle Versuchstiere im
wöchentlichen Abstand mit jeweils ca. 100 adulten C. felis infestiert, um eine
regelmäßige Exposition der Katzen mit Ctenocephalides-Antigenen zu
gewährleisten. Nach Infestation wurden die Flöhe für 24 Stunden auf den Katzen
belassen und anschließend mit einem Flohkamm entfernt. Bereits beim Absammeln
wurden tote von lebenden Flöhen differenziert. Bei der folgenden
lichtmikroskopischen Untersuchung wurde kontrolliert, ob und wie viele der Flöhe
während der Exposition eine Blutmahlzeit aufgenommen hatten. Da bei der
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87
Blutmahlzeit Speichelantigene injiziert werden, sollte dadurch die Antigenexposition
kontrolliert, aber auch eine Schätzung über die Antigenmenge ermöglicht werden, mit
der jede einzelne Katze konfrontiert wurde. Um bei gleicher Anzahl infestierter Flöhe
(100 pro Katze) unterschiedliche Antigenexpositionen zu erreichen, wurde das
hochwirksame Kontaktinsektizid Imidacloprid (Advantage®; Bayer Animal Health) im
2-wöchigen Rhythmus jeweils einen Tag vor der Infestation bei den 12 Tieren der
schwach exponierten Gruppe per „spot on“ appliziert, wobei Katzen mit einem
Körpergewicht bis zu 4 kg mit einer Dosis von 40 mg und >4-8 kg schwere Tiere mit
80 mg Imidacloprid behandelt wurden. Die nachfolgenden Daten stammen aus 40
Infestationen, die im Tierhaus des Instituts für Parasitologie im Zeitraum von 40
Wochen (Dezember 2006 bis September 2007) durchgeführt wurden.
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4.2.1.1 Infestationsdaten der hoch exponierten Grup pe
Die Anzahl aller in der Gruppe der unbehandelten, hoch exponierten Tiere nach 24
Stunden wieder gefundenen Flöhe betrug im Gesamtmittel 52 ± 23 (Median: 50,5).
Der Anteil lebender Flöhe über den gesamten Zeitraum betrug 99,8%. Von den
insgesamt wieder gefundenen Flöhen konnte bei 39 ± 17 Flöhen die Aufnahme einer
Blutmahlzeit festgestellt werden, was einem Anteil von 75% entsprach (Abb. 7). Es
konnte daher davon ausgegangen werden, dass die Katzen in der Gruppe mit hoher
C. felis-Ag-Exposition während der Verlaufsuntersuchung wöchentlich innerhalb von
24 Stunden mit einer Menge von etwa 390 ng Ctenocephalides-Speichelprotein
(vergleiche 5.2.1) samt dem darin enthaltenen Antigen konfrontiert wurden.
Abb. 7: Wieder gefundene Flöhe in der Gruppe mit ho her Ag-Exposition. Dargestellt ist die Gesamtzahl, die Zahl lebender und gesaugter Flöhe, die nach 24 h Exposition in der unbehandelten, hoch exponierten Gruppe auf den Katzen wieder gefunden wurden. Die Daten stammen aus 40 Infestationen während der Verlaufsuntersuchung von Dezember 2006 bis September 2007. Pro Tier wurden wöchentlich ca. 100 adulte C. felis eingesetzt.
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4.2.1.2 Infestationsdaten der gering exponierten Gr uppe
Auch die Gruppe der mit Advantage® spot-on (Wirkstoff: Imidacloprid, 3.2.1)
behandelten Tiere (n=12) wurde wöchentlich mit ca. 100 Flöhen infestiert. Sie sind
jedoch als gering exponierte Tiere zu betrachten, da aufgrund der adultiziden
Wirkung von Imidacloprid nach 24 Stunden insgesamt nur 3,8 ± 4,6 Flöhe (Median:
2,5) wieder gefunden werden konnten. Die Anzahl lebender Flöhe betrug
durchschnittlich 0,3 ± 0,7. Von allen wieder gefundenen Flöhen hatten 0,4 ± 0,9
Flöhe Blut gesaugt. Dass dieser Wert höher lag als die Anzahl lebender Flöhe, lässt
sich dadurch erklären, dass auf den Katzen tote Flöhe gefunden wurden, welche vor
Wirkungseintritt eine Blutmahlzeit aufgenommen hatten (Abb. 8).
Abb. 8: Wieder gefundene Flöhe in der Gruppe mit ge ringer Ag-Exposition. Die Boxplots (3.4.8) zeigen die Gesamtzahl sowie die Anzahl lebender und gesaugter Flöhe, die nach 24 h im Fell der mit Imidacloprid (3.2.1) behandelten, gering exponierten Katzen (3.3.1) gefunden wurden. Die Daten stammen aus 40 wöchentlichen Infestationen (3.4.1). Pro Tier wurden wöchentlich ca. 100 adulte C. felis eingesetzt.
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
90
Abb. 9 zeigt für jedes Tier der gering exponierten Gruppe die Menge der wieder
gefundenen Flöhe, die eine Blutmahlzeit aufgenommen hatten. Nur bei einer Katze
(G) lag der Mittelwert der gesaugten Flöhe bei 1,2, während er bei den anderen
Tieren der Gruppe kleiner als 1 war.
Abb. 9: Anzahl der wieder gefundenen Flöhe mit Blut mahlzeit je Tier der gering exponierten Gruppe. Dargestellt ist die Anzahl der Flöhe, die nach 24 h mittels Flohkamm im Fell der mit Imidacloprid behandelten, gering exponierten Katzen (3.3.1) wieder gefunden werden konnten und bei denen die Aufnahme einer Blutmahlzeit lichtmikroskopisch bestätigt wurde (3.4.7.1). Die Daten wurden in 40 Infestationen gesammelt (3.4.1.).
Der Mittelwert der Anzahl lebender Flöhe bei allen zwölf behandelten Tieren lag
zwischen 0,05 und 0,56. Ausgehend von ca. 100 infestierten Flöhen bedeutet dies im
Mittel eine Reduktion der Befallsintensität nach 24 h von mehr als 99%.
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
91
4.2.1.3 Vergleich der Infestationsdaten zwischen de n Gruppen
Es fällt auf, dass auf den gering exponierten Tieren, die mit Imidacloprid behandelt
wurden, nach 24 Stunden gegenüber den Tieren mit hoher Ag-Exposition deutlich
weniger Flöhe gefunden wurden. Einer Gesamtzahl von im Mittel 52 Flöhen auf den
hoch exponierten Tieren stehen in der Gruppe der gering exponierten Tiere
durchschnittlich ca. 4 Flöhe gegenüber (p<0,001).
Vergleicht man die durchschnittliche Anzahl lebender Flöhe zwischen den Gruppen,
wird der Unterschied noch deutlicher. Während in der unbehandelten Gruppe in 40
Infestationen im Mittel ca. 52 Flöhe auf jedem Tier gefunden wurden, war bei den
behandelten Tieren im Gruppenmittel weniger als ein lebender Floh zu finden
(p<0,001).
Tab. 2: Übersicht der Infestationsdaten aus beiden Gruppen.
Die Tabelle enthält nach Gruppen die mittlere Gesamtzahl sowie die mittlere Anzahl lebender und gesaugter C. felis, die nach 24 h Infestation mittels Flohkamm auf den Katzen wieder gefunden wurden, sowie das Verhältnis der Anzahl (hoch exponierte Gruppe : gering exponierte Gruppe).
Das unterschiedliche Verhältnis in der Höhe der C. felis-Ag-Exposition zwischen den
Gruppen ist aus Tab. 2 ersichtlich. Der Mittelwert Flöhe mit Blutmahlzeit der hoch
exponierten Gruppe betrug 39 Flöhe pro Tier und Infestation, bei den durch
Behandlung mit Imidacloprid gering exponierten Tieren saugte im Mittel weniger als
Anzahl Flöhe (ø)
Gruppe
gesamt lebende mit Blutmahlzeit
hoch exponierte
Gruppe 52,29 52,21 38,88
gering exponierte
Gruppe 3,77 0,26 0,42
Verhältnis
hoch : gering ≈ 14 : 1 200 : 1 93 : 1
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
92
ein Floh Blut. Im Verhältnis zu einem auf den gering exponierten Katzen wieder
gefundenen Floh stehen 93 gesaugte Flöhe in der hoch exponierten Kontrollgruppe
(p<0,001). Somit hat die regelmäßige, 14-tägige Behandlung mit Imidacloprid eine
deutliche Reduktion der injizierten Antigenmenge (auf ca. 1 %) auf Grund der
entsprechenden Verminderung des Flohbefalls insgesamt bewirkt (vgl. 4.2.1.1 und
4.2.1.2).
4.2.2 Koproskopische Untersuchung
Während der Verlaufsuntersuchung wurden in Woche 16 und 41 Sammelkotproben
mit Hilfe des Flotationsverfahrens auf Entwicklungsstadien von Helminthen
untersucht. Es konnte zu keinem Zeitpunkt ein Wurmbefall nachgewiesen werden.
4.2.3 Funktioneller in vitro-Test (FIT)
Die Sensibilisierungskinetik der Basophilen gegen Antigene des Katzenflohs
während wiederholter, kontrollierter Flohexpositionen sollte mit Hilfe des FIT (3.4.4)
an Katzen untersucht werden. Dazu wurden zwei verschiedene Ctenocephalides
felis-Ganzkörperextrakte (3.2.6) eingesetzt, mit denen die Basophilen aus dem
Vollblut während einer 60 Minuten dauernden Inkubation konfrontiert wurden. Eine
auf den Stimulus erfolgende spezifische Histaminfreisetzung wurde mit Hilfe des RIA
(3.4.6) quantifiziert. Zur Feststellung des Ausgangsstatus wurden vor Beginn der
Untersuchung bei allen Tieren zwei FITs durchgeführt. Im Verlauf der über 47
Wochen dauernden Untersuchung erfolgten weitere FITs im monatlichen Abstand.
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
93
4.2.3.1 Grundlagen der Auswertung
Um spezifisch freigesetztes Histamin von einer unspezifischen Freisetzung
unterscheiden zu können, mussten geeignete Grenzwerte definiert werden. In
Anlehnung an die Arbeiten von KAUL (1998) und STUKE (2005) wurde zunächst aus
allen auswertbaren FITs auf Basis des 85%-Quantils (250 durchgeführte Tests) die
mittlere Spontanfreisetzung (5,6%) bezogen auf die maximal freisetzbare Menge
Histamin sowie die Standardabweichung (3,7%) berechnet. Die maximal zulässige
Spontanfreisetzung wurde als Summe aus Mittelwert und dreifacher
Standardabweichung festgelegt. Lag die spontane Histaminfreisetzung über dem so
errechneten Wert von 16,7%, wurde der jeweilige Test nicht zur weiteren Auswertung
herangezogen. Als positive Reaktion auf eine Antigenprovokation wurden Werte
klassifiziert, die über 27,8% der maximalen Freisetzung lagen. Dieser Grenzwert
errechnete sich aus der Summe aus dem Mittelwert und der sechsfachen
Standardabweichung aller gemessenen Spontanfreisetzungen (Tab. 3).
Tab. 3: Berechnung der Grenzwerte zur Auswertung de s FIT.
Anzahl ausgewerteter FITs (n) 250
Mittelwert der Spontanfreisetzung [% der maximalen Freisetzung] 5,6 %
Standardabweichung 3,7 %
Grenzwert für Spontanfreisetzung (MW + 3x SD) 16,7 %
Grenzwert für Ag-induzierte Freisetzung (MW + 6x SD) 27,8 %
Spontanfreisetzungen, die über dem Grenzwert lagen, wurden nicht zur Auswertung herangezogen, eine positive FIT-Reaktion im Sinne einer funktionellen Sensibilisierung gegen C. felis-Antigene war bei einer spezifischen Histaminfreisetzung von mindestens 27,8% gegeben. Alle Prozentwerte beziehen sich auf die jeweilige maximale Histaminfreisetzung.
Die im FIT verwendeten Antigenextrakte wurden in mehreren Verdünnungsstufen
eingesetzt. So konnte eine positive Reaktion graduell bewertet werden. In Tab. 4
sind exemplarisch mögliche FIT-Reaktionen sowie deren Interpretation erläutert.
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
94
Tab. 4: Auswertung möglicher FIT-Reaktionstypen.
FIT
Ansatz # 1 # 2 # 3 # 4
Spon 3,2% 10,6% 7,7% 18,7%
Cf 5 16,5% 86,9% 67,4% 30,8%
Cf 1 10,7% 21,3% 32,1% 17,6%
Cf 0,1 4,3% 11,7% 11,3% 15,7%
FIT # 1 FIT # 2 FIT # 3 FIT # 4
Spon erlaubt,
da unterhalb des Grenzwerts von 16,7 % zu hoch
Cf 5 neg. pos. pos. n.a.
Cf 1 neg. neg. pos. n.a.
Cf 0,1 neg. neg. neg. n.a.
Gesamt-
bewertung
(Sensibilisierungs-
grad)
0 1 2 n.a.
Kommentar
Kein Wert über
Positiv-
Grenzwert von
27,8%
Antigeninduzierte
Freisetzung nur
bei 5 µg/ml über
Grenzwert von
27,8%
Antigeninduzierte
Freisetzung bei 5
und 1 µg/ml über
Grenzwert von
27,8%
Auswertung nicht
erfolgt, da
Spontan-
freisetzung über
16,7%
Die Tabelle enthält Daten vier verschiedener FITs unterschiedlicher Tiere, in denen eine C. felis-Antigenpräparation (Cf) in den Endkonzentrationsstufen 5, 1 und 0,1 µg/ml zum Einsatz kam. Der Grenzwert für die zulässige Spontanfreisetzung (Spon) liegt bei 16,7%, der Grenzwert für eine positive antigeninduzierte Reaktion bei 27,8% der maximalen Freisetzung (Tab. 3). Bei einer positiven Reaktion auf eine Konzentrationsstufe der Antigenpräparation liegt ein Sensibilisierungsgrad von 1 vor (FIT #2), eine positive Reaktion in zwei Konzentrationsstufen entspricht dem Sensibilisierungsgrad 2 (FIT #3).
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
95
4.2.3.2 Sensibilisierungskinetik der hoch exponiert en Kontrollgruppe im FIT
Die Sensibilisierung der Basophilen der hoch exponierten Katzen gegen in
Ganzkörperextrakten (3.2.6) von C. felis enthaltene Antigene wurde im monatlichen
Abstand überprüft. Eine Woche vor Beginn der Verlaufsuntersuchung wurde der
Ausgangsstatus der Tiere ermittelt. Danach wiesen zwei der sechs Tiere (C und D)
bereits eine im FIT nachweisbare Vorsensibilisierung der Basophilen auf (Tab. 5).
Die Katzen A, B, E und F reagierten vor der ersten experimentellen Flohexposition im
FIT nicht auf den verwendeten Flohextrakt WBE-G (Greer).
Tab. 5: FIT-Reaktion der unbehandelten, hoch expon ierten Katzen auf WBE-G in Sensibilisierungsgraden.
Woche Tier
- 1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47
A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 1 1 1 0 1 n.a. 0 0 0 0 0 n.a. 0
D 1 2 2 2 2 1 n.a. 1 2 1 2 2 1
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1
F 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
Der Grad der im FIT ermittelten funktionellen Sensibilisierung der Basophilen der Tiere A-F (3.3.1) gegen im Flohextrakt WBE-G (3.2.6) enthaltene Antigene ist chronologisch aufgelistet. Ein Sensibilisierungsgrad von ≥ 1 (fett gedruckt) bedeutet eine über dem Grenzwert (4.2.3.1) liegende Histaminfreisetzung der Basophilen, Freisetzungen unter dem Grenzwert für eine positive Reaktion (4.2.3.1) sind mit 0 bezeichnet. In Woche – 1 wurde der Status der Katzen vor Infestationsbeginn ermittelt. n.a. bedeutet, dass der jeweilige FIT nicht auswertbar war. Im Laufe der Untersuchung waren bei den einzelnen Tieren sehr unterschiedliche
Sensibilisierungskinetiken zu beobachten: Während die Katze D über den gesamten
Zeitraum der Untersuchung im FIT positiv reagierte, war die Sensibilisierung der
anderen vorsensibilisierten Katze C nur bis Woche 14 nachweisbar. Die Katzen A, B
und F, die anfangs nicht sensibilisiert waren, reagierten trotz wöchentlicher
Flohexpositionen im gesamten Verlauf der Untersuchung mit ihren Basophilen nicht
auf Antigene von C. felis. Katze A und B zeigten zu keinem Zeitpunkt eine
E R G E B N I S S E
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96
funktionelle Sensibilisierung, nur Katze F wies in Woche 38 einmalig einen
Sensibilisierungsgrad von 1 auf, blieb ansonsten aber ebenfalls FIT-negativ.
Im Gegensatz dazu stand Katze E, die ab Woche 38 eine bleibende Sensibilisierung
gegen den Antigenextrakt zeigte.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
-1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47
Woche
Mitt
lere
r S
ensi
bilis
ieru
ngsg
rad
late onset, n=1 (E)
konstant neg., n=3 (A, B, F)
konstant pos., n=1 (D)
inhibiert, n=1 (C)
Abb. 10: Sensibilisierungsmuster der unbehandelten, hoch exponierten Katzen. Die Abbildung zeigt den Verlauf der Sensibilisierung der hoch exponierten Tiere (3.3.1) von ihrem Ausgangsstatus vor Infestationsbeginn (Woche – 1) bis Woche 47 (nach insgesamt 40 wöchentlichen Flohinfestationen), zusammengefasst nach Sensibilisierungsmustern. Die horizontale gestrichelte Linie markiert den Sensibilisierungsgrad 1 (FIT-positiv).
Abb. 10 gibt einen Überblick über die in der Gruppe der stark mit C. felis-Antigenen
exponierten Tiere aufgetretenen Sensibilisierungsmuster.
Zusammenfassend waren in der hoch exponierten Kontrollgruppe vier verschiedene
Verlaufsmuster im FIT zu beobachten. Neben drei konstant negativen Tieren (A, B
und F) und der konstant positiven Katze D, trat auch ein Fall einer Gegenregulation
(Katze C) auf. Eine vorhandene funktionelle Sensibilisierung verschwand im Laufe
der wiederholten Flohexpositionen. Außerdem entwickelte die Katze E in den letzten
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
97
Wochen der Untersuchung eine Sensibilisierung gegen im Extrakt WBE-G enthaltene
Antigene von C. felis. Diese Spätsensibilisierung wird im Folgenden auch als late
onset Kinetik bezeichnet.
4.2.3.3 Sensibilisierungskinetik der gering exponie rten Katzen im FIT
Die Überprüfung des Sensibilisierungsstatus der Basophilen erfolgte in der Gruppe
der gering exponierten, mit Imidacloprid behandelten Katzen nach dem gleichen
Protokoll wie bei den hoch exponierten Tieren. Auch hier wurde zunächst der
Ausgangsstatus der Katzen ermittelt. Dabei zeigten zwei Tiere bereits vor Beginn der
Untersuchung eine Sensibilisierung der Basophilen gegen Antigene von C. felis
(Katzen L und M), während die zehn anderen Tiere vor der kontrollierten
Flohexposition im FIT negativ waren. Wie aus Tab. 6 hervorgeht, blieben die beiden
vorsensibilisierten Katzen L und M zu allen auswertbaren Zeitpunkten positiv. Die
Basophilen der Katze M reagierten im Vergleich zu den anderen Tieren am
empfindlichsten auf den Flohantigen-Extrakt. Sie zeigten mehrmals schon bei einer
Konzentrationsstufe von 0,1 µg/ml eine deutliche spezifische Histaminfreisetzung.
Dagegen blieben vier der behandelten Katzen (H, I, O, Q) während des gesamten
Untersuchungszeitraums negativ.
Sechs Katzen (G, K, N, P, R und S) zeigten zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach
Beginn der kontrollierten Flohexpositionen eine Sensibilisierung.
Bei den Tiere K, R und S lag schon früh eine Sensibilisierung vor (early onset), die
bereits drei Wochen nach Beginn der Flohexposition im FIT nachweisbar war.
Während diese bei der Katze K bestehen blieb, waren bei den Katzen R und S, die
zunächst ebenfalls eine early onset Kinetik zeigten, im weiteren Verlauf variable
Sensibilisierungsmuster zu beobachten (Tab. 6, Abb. 11).
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
98
Tab. 6: FIT-Reaktion der gering exponierten Tiere a uf den Flohextrakt WBE-G in Sensibilisierungsgraden.
Woche Tier
- 1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47
G 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 2 2 2
H 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
K 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1
L 2 2 n.a. 2 n.a. n.a. 2 2 2 2 n.a. n.a. n.a.
M 3 3 3 2 3 3 2 2 2 2 2 2 2
N 0 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 2 n.a.
O 0 0 0 0 0 0 0 n.a. 0 0 n.a. n.a. n.a.
P 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 n.a.
Q 0 0 n.a. n.a. 0 0 0 0 0 0 0 0 n.a.
R 0 1 n.a. 0 0 1 2 1 1 0 n.a. 0 n.a.
S 0 1 n.a. 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0
Der Grad der im FIT ermittelten funktionellen Sensibilisierung der Basophilen der Tiere G-S (3.3.1) gegen im Flohextrakt WBE-G (3.2.6) enthaltene Antigene ist chronologisch aufgelistet. Ein Sensibilisierungsgrad von ≥ 1 (fett gedruckt) bedeutet eine über dem Grenzwert (4.2.3.1) liegende Histaminfreisetzung der Basophilen, Freisetzungen unter dem Grenzwert für eine positive Reaktion (4.2.3.1) sind mit 0 bezeichnet. In Woche – 1 wurde der Ausgangsstatus der Katzen vor Infestationsbeginn ermittelt. n.a. bedeutet, dass der jeweilige FIT nicht auswertbar war. Nach anfänglich positiver FIT-Reaktion der Katze R war über ca. 15 Wochen keine
positiv zu bewertende Histaminfreisetzung auf C. felis-Antigene zu beobachten.
Darauf folgte eine Phase von gut 12 Wochen, in der die flohspezifische
Sensibilisierung wieder deutlich nachweisbar war, ab der 34. Woche für die
restlichen drei Monate Untersuchungszeit jedoch wieder unter dem positiven
Grenzwert blieb. Die Katze S zeigte ebenfalls drei Wochen nach Beginn der
Flohexpositionen eine flohspezifische Sensibilisierung ihrer Basophilen, war dann
aber die folgenden drei Monate FIT negativ. Interessant ist, dass dieses Tier erst in
Woche 22 wieder eine positive FIT-Reaktion zeigte, die für die folgenden knapp vier
Monate wieder verschwand, bis sie in der 38. und 43. Woche wieder nachweisbar
war. Wie aus Abb. 11 hervorgeht, liegt bei den Tieren R und S ein zyklisches
Sensibilisierungsmuster vor, welches durch mehrmalig ansteigende und wieder
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
99
abfallende antigeninduzierte Histaminfreisetzungen der Basophilen gekennzeichnet
ist.
0,0%
15,0%
30,0%
45,0%
60,0%
75,0%
90,0%
-1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47
Woche
His
tam
infr
eise
tzun
g (%
von
Max
.)
R S
Abb. 11: Histaminfreisetzung der Katzen R und S auf den Flohextrakt WBE-G (5 µg/ml) im zeitlichen Verlauf der Untersuchung Die im Verhältnis zur maximalen Freisetzung ausgedrückte antigeninduzierte Histaminfreisetzung (3.4.4) der Katzen R und S (3.3.1) ist vom Ausgangsstatus bis zum Abschluss der Untersuchung chronologisch dargestellt. Unterbrechungen im Kurvenverlauf sind auf nicht auswertbare FITs zurückzuführen. Auf oder oberhalb der roten Linie (27,8%) liegende Werte gelten als positive Reaktion (4.2.3.1).
Wie bereits in der Gruppe mit hoher Ag-Exposition beobachtet, entwickelten auch
drei mit Imidacloprid behandelte, gering exponierte Tiere (Tab. 6: G, N, P) im
späteren Verlauf der kontrollierten Flohexpositionen eine funktionelle Sensibilisierung
(late onset Kinetik).
Die Katzen G und N zeigten erst nach 30 bzw. 18 Wochen wiederholter
Flohexpositionen eine Sensibilisierung ihrer Basophilen, die bis zum Ende der
Untersuchung erhalten blieb. Beide Tiere reagierten zunächst nur auf die höchste
Antigenkonzentration von 5 µg/ml (Sensibilisierungsgrad 1), zeigten im weiteren
Verlauf aber auch auf die nächsthöhere Verdünnungsstufe (1 µg/ml) eine deutliche
Histaminfreisetzung der Basophilen. Ein weiteres Tier (P) zeigte in den Wochen 30,
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
100
38 und 43 eine positive FIT-Reaktion (Grad 1), wobei die Sensibilisierung in diesem
Fall nicht ganz kontinuierlich nachzuweisen war.
Insgesamt waren in der Gruppe der gering exponierten Tiere folgende
Sensibilisierungskinetiken gegen C. felis-Antigene festzustellen: vier Katzen (H, I, O,
Q) waren zu keinem Zeitpunkt sensibilisiert (konstant negativ), drei Katzen (K, R, S),
die vor Beginn der Untersuchung im FIT negativ reagiert hatten, zeigten bei der
ersten FIT-Untersuchung drei Wochen nach Beginn der Flohexpositionen eine
positive Reaktion (early onset), drei Katzen (G, N und P) entwickelten im späteren
Verlauf durch die wiederholten Expositionen mit C. felis eine vorher nicht bestehende
Sensibilisierung (late onset) und zwei weitere Katzen (L, M) waren durchgehend
sensibilisiert (konstant positiv). Von den drei Tieren mit early onset Kinetik blieb
jedoch nur eines (K) konstant positiv, während bei den Katzen R und S eine
differenzierte Betrachtung der individuellen Histaminfreisetzungen (Abb. 11) ein
undulierendes Verlaufsmuster offenbart, was zu wechselnden Bewertungen der FIT-
Reaktionen dieser Tiere führt.
Abb. 12 veranschaulicht die in der gering exponierten Gruppe vorkommenden
Sensibilisierungsmuster.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
-1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47
Woche
Mitt
lere
r S
ensi
bilis
ieru
ngsg
rad
early onset, n=3 (K, R, S)
late onset, n=3 (G, N, P)
konstant neg., n=4 (H, I, O, Q)
konstant pos., n=2 (L, M)
Abb. 12: Überblick über die Sensibilisierungsmuster der behandelten, gering exponierten Katzen im zeitlichen Verlauf. Dargestellt ist der Verlauf der Sensibilisierung in der Gruppe mit geringer Ag-Exposition (3.3.1) in Sensibilisierungsgraden. Tiere mit ähnlicher Kinetik sind in Gruppen zusammengefasst und mit ihrem mittleren Sensibilisierungsgrad zum jeweiligen Zeitpunkt dargestellt. Ein Sensibilisierungsgrad ≥ 1 gilt als positiv (auf und oberhalb der horizontalen gestrichelten Linie liegende Werte, 4.2.3.1)
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
101
4.2.3.4 Vergleich der Sensibilisierungskinetik im F IT zwischen Katzen mit
geringer und hoher C. felis - Antigenexposition
Wie in den beiden vorausgehenden Abschnitten beschrieben, traten während der
Verlaufsuntersuchung über 47 Wochen unter dem Einfluss kontrollierter
Flohexpositionen sowohl bei mit Imidacloprid behandelten, dadurch gering mit
Flohspeichel exponierten Tieren als auch bei unbehandelten, hoch exponierten
Tieren vergleichbare Sensibilisierungsmuster auf. In beiden Gruppen entwickelten
einige Tiere nach unterschiedlich langer Zeit eine Sensibilisierung durch die
regelmäßigen Flohexpositionen. Andererseits waren in beiden Gruppen ebenso Tiere
zu finden, die trotz unterschiedlich intensiven Antigenkontakts zu keinem Zeitpunkt
eine Sensibilisierung ihrer Basophilen aufwiesen. Abb. 13 zeigt die mittlere
Sensibilisierung beider Gruppen im Vergleich. Auffällig ist, dass der
Sensibilisierungsstatus der hoch und der gering exponierten Gruppe vor Beginn der
Verlaufsuntersuchung sehr ähnlich und auf einem niedrigen Niveau war. Die mittlere
Sensibilisierung der hoch exponierten Gruppe lag zu Beginn der Untersuchung bei
0,3 und erreichte zu keinem der gemessenen Zeitpunkte einen positiven Wert. Der
Ausgangsstatus der behandelten, gering exponierten Tiere lag bei einem mittleren
Sensibilisierungsgrad von 0,4 und erreichte gegen Ende des untersuchten Zeitraums
den Sensibilisierungsgrad 1. Die scheinbaren Unterschiede ab Woche 22 entstanden
durch die geringen n-Zahlen (insbesondere der hoch exponierten Gruppe: n=6), die
einen starken Einfluss einzelner nicht auswertbarer FIT-Untersuchungen bedingten.
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___________________________________________________________________________
102
0
0,5
1
1,5
2
-1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47
Woche
Mitt
lere
r Sen
sibi
lisie
rung
sgra
d hohe Exposition
geringe Exposition
Abb. 13: Kinetik der Sensibilisierung der Gruppe mi t hoher und geringer C. felis-Ag-Exposition. Dargestellt ist der mittlere Sensibilisierungsgrad der hoch exponierten Katzen (n=6) und der gering exponieren Tiere (n=12) über einen Zeitraum von 48 Wochen. Die gestrichelte Linie markiert den Sensibilisierungsgrad 1 (4.2.3.1).
Tab. 7: Ergebnisse des Fisher-Test auf Unterschiede in der FIT-Reaktion zwischen den Gruppen.
Angegeben sind die p-Werte, die der Fisher-Test auf Signifikanz liefert (3.4.8). Fettgedruckte Werte bezeichnen Wochen, in denen ein signifikanter Unterschied im Verhältnis von positiven zu negativen FIT-Reagenten zwischen den Gruppen bestand. Für die Berechnung der p-Werte wurden die mit dem WBE-G-Extrakt (3.2.6) erzielten Befunde zugrunde gelegt.
Mit Hilfe des Fisher-Tests wurde überprüft, ob es zu einem Zeitpunkt einen
Unterschied zwischen den Gruppen im Verhältnis von positiven und negativen FIT-
Reagenten gibt. Aus Tab. 7 geht hervor, dass nur in Woche 22 ein signifikanter
Unterschied bestand, möglicherweise bedingt durch eine nicht auswertbare FIT-
Untersuchung eines sonst durchgehend positiven Tieres (D).
Woche
- 1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47
p-Wert 0,57 1,00 1,00 1,00 0,51 1,00 0,04 0,60 0,15 0,60 0,62 0,61 1,00
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
103
Zu allen anderen Zeitpunkten bestand zwischen den Gruppen statistisch Gleichheit
hinsichtlich der FIT-Reaktion. Somit hatte bei ausschließlichem Vergleich der
Entwicklung der Sensibilisierungsgrade die Verminderung der Ag-Exposition
statistisch keinen Einfluss auf die im FIT dokumentierte Entwicklung der
Sensibilisierung gegen C. felis-Antigene in der Ag-Präparation WBE-G.
0
0,5
1
1,5
2
34 38 43 47
Woche
Mitt
lere
r Sen
sibi
lisie
rung
sgra
d hohe Exposition
geringe Exposition
Abb. 14: Kinetik der Sensibilisierung gegen Antigen e der Präparation WBE-H der Gruppe mit hoher und geringer C. felis-Ag-Exposition. Dargestellt ist der mittlere Sensibilisierungsgrad der hoch exponierten Katzen (n=6) und der gering exponieren Tiere (n=12) über einen Zeitraum von 13 Wochen. Die gestrichelte Linie markiert den Sensibilisierungsgrad 1 (4.2.3.1). Die Daten beziehen sich auf Ergebnisse, die mit dem Ag-Extrakt WBE-H erzielt wurden.
Der von der 34. bis zur 47. Woche gleichzeitig eingesetzte, selbst hergestellte
Extrakt WBE-H zeigte ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen den
Gruppen hinsichtlich der FIT-Reaktion (Abb. 14).
Im Gegensatz zu dieser schematischen Klassifizierung der Reaktionsmuster nach
Sensibilisierungsgraden erlaubt die Betrachtung der tatsächlichen,
antigenspezifischen Histaminfreisetzungen genauere Einblicke in die
Sensibilisierungskinetik der Katzen gegen Antigene von C. felis. Im folgenden
Abschnitt sollte mit Hilfe der Regressionsanalyse untersucht werden, ob die
E R G E B N I S S E
___________________________________________________________________________
104
bisherigen Beobachtungen bestätigt und ggf. um zusätzliche Informationen erweitert
werden können.
4.2.3.5 Regressionsanalyse der im FIT beobachteten
Sensibilisierungskinetiken
Die bereits erfolgten Betrachtungen zur Sensibilisierungskinetik der Katzen basierten
auf der graduellen Einstufung der FIT-Reaktion auf den C. felis-Antigenextrakt WBE-
G (3.2.6). Antigeninduzierte Freisetzungen, die über 27,8% der maximalen
Freisetzung lagen, wurden dabei als positiv eingestuft (4.2.3.1). Die absolute
Histaminfreisetzung auf eine Ag-Konzentrationsstufe wurde nur hinsichtlich dieses
Grenzwerts berücksichtigt und die Sensibilisierung eines Tieres zu einem Zeitpunkt
in Stufen ausgedrückt. Katzen, die im Verlauf der Untersuchung eine ähnliche Kinetik
zeigten, wurden zu entsprechenden Gruppen zusammengefasst.
Um eine differenziertere Betrachtung der absoluten Histaminfreisetzungen einzelner
Tiere sowie nach Sensibilisierungsmustern gruppierter Katzen im Zeitverlauf zu
ermöglichen, wurden Regressionsanalysen durchgeführt. Es sollte insbesondere
geprüft werden, inwieweit die Dauer der Untersuchung und die damit verbundene
Anzahl an Flohexpositionen eine Veränderung in der Höhe der spezifischen
Histaminfreisetzungen bewirkt hat.
Tab. 8 enthält die Ergebnisse der Regressionsanalyse für die nicht sensibilisierten
Katzen der hoch exponierten (Tab. 8A) und der gering exponierten Gruppe (Tab.
8B). Der genäherte Wert für die Histaminfreisetzung in Woche 0 (Achsenabschnitt)
lag bei den drei Katzen mit hoher Ag-Exposition etwa zwischen 4 und 8% (Tab. 8A).
Die geschätzte, statistisch nicht signifikante wöchentliche Zunahme in der
Histaminfreisetzung (Regressionskoeffizient) lag bei ca. 0,1%. Eine signifikante,
durch den Faktor Zeit erklärbare Änderung in der Höhe der antigeninduzierten
Freisetzung war weder für ein einzelnes Tier noch für das Gesamtmodell erkennbar.
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Tab. 8A: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik bei konstant FIT-negativen Katzen mit hoher Ag-Exposition als Regressionsmodell.
Tab. 8B: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik bei konstant FIT-negativen Katzen mit geringer Flohantigen-Exposition als Regressionsmode ll.
Tier ID Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert
H -0,02 ± 0,18 9,37 ± 4,84 0,001 0,93
I -0,04 ± 0,10 7,02 ± 2,68 0,01 0,72
O -0,30 ± 0,16 11,79 ± 3,03 0,34 0,10
Q 0,15 ± 0,17 6,44 ± 4,54 0,09 0,40
Gesamt -0,02 ± 0,08 8,39 ± 1,91 0,001 0,83
Erläuterung zu Tabelle 8: Dargestellt sind für die hoch exponierten, nicht sensibilisierten Katzen A, B und F (Tab. 8A, 3.3.1) sowie die gering exponierten Katzen H, I, O und Q (Tab. 8B) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0) und das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch die Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8).
Bei den gering exponierten, nicht sensibilisierten Tieren (Tab. 8B) lag die geschätzte,
durch Flohantigen induzierte Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0 zwischen 6 und
12% und damit auf einem ähnlich niedrigen Niveau wie bei den hoch exponierten
Katzen (Tab. 8A). Für das Gesamtmodell lag die Änderung in der
Histaminfreisetzung nahezu bei null und war ebenfalls nicht durch die fortschreitende
Zeit zu begründen.
Tier ID Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert
A 0,11 ± 0,14 3,82 ± 3,63 0,05 0,45
B 0,17 ± 0,18 4,06 ± 4,78 0,08 0,35
F 0,12 ± 0,15 7,83 ± 4,08 0,06 0,43
Gesamt 0,13 ± 0,09 5,24 ± 2,35 0,06 0,14
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Abb. 15: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der konstant FIT-negativen Katzen nach Gruppen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der im Zeitverlauf nicht sensibilisierten, hoch exponierten Katzen A, B und F (durchgezogene Linie) sowie der gering exponierten Tiere H, I, O und Q (gestrichelte Linie) als Regressionsmodell (3.4.8). Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).
Die Daten der dauerhaft nicht sensibilisierten Katzen sind in Abb. 15 dargestellt. Es
fällt auf, dass die Regressionsgeraden der hoch exponierten (durchgezogene Linie)
und der gering exponierten Tiere (gestrichelte Linie) einen ähnlichen Verlauf
nehmen. Bei den hoch exponierten Katzen ist ein leichter Anstieg der
Regressionsgerade (durchgezogene Linie) erkennbar, der jedoch nicht signifikant ist.
Demnach zeigten diese sieben Tiere auch nach 40 wöchentlichen, kontrollierten
Flohexpositionen und einem zusätzlichen Nachbeobachtungszeitraum von sechs
Wochen keine Tendenz zu einer funktionellen Sensibilisierung ihrer Basophilen
gegen Flohantigene.
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Die Daten der Katzen, die vor Beginn der Flohexpositionen im FIT nicht auf
Flohantigen reagierten, aber bereits in den ersten Wochen nach kontrolliertem
Flohkontakt eine Sensibilisierung zeigten (K, R und S), sind in Tab. 9 dargestellt. Für
Katze K, die im weiteren Untersuchungszeitraum konstant FIT-positiv war, besteht
eine signifikante Steigerung der auf Flohantigen spezifisch freigesetzten
Histaminmenge um ca. 0,8% pro Woche. Aufgrund der großen, durch die
Flohexpositionen über die Zeit nicht erklärbare Varianz in den Messwerten war eine
Änderung in der Histaminfreisetzung für die Katzen R und S im Regressionsmodell
für den gesamten Zeitraum nicht nachweisbar. Ein frühes Einsetzen der funktionellen
Sensibilisierung wie bei den gering exponierten Katzen K, R und S wurde in der
Gruppe mit hoher Ag-Exposition nicht beobachtet.
Tab. 9: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik der früh sensibilisierten Katzen als Regressionsmodell (Woche -1 bis 22).
Tier ID Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert
K 0,79 ± 0,35 27,51 ± 9,52 0,31 0,05
R 0,11 ± 0,66 29,51 ± 15,71 0,004 0,87
S 0,23 ± 0,32 14,58 ± 9,00 0,05 0,49
Gesamt 0,40 ± 0,27 23,93 ± 7,10 0,06 0,15
Dargestellt sind für die frühsensibilisierten Katzen K, R und S (early onset) (3.3.1) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)
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Abb. 16: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der frühsensibilisierten Katzen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der frühsensibilisierten Katzen K, R und S (gering exponierte Gruppe) als Funktion der Zeit in Form einer Regressionsgeraden (y=0,40x + 23,93; r2=0,06, p=0,15). Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).
Abb. 16 zeigt die Regressionsgerade für das Gesamtmodell der frühsensibilisierten
Katzen K, R und S. Der geschätzte Ausgangswert für die spezifische
Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0 betrug ca. 24%. Die wöchentliche Zunahme der
auf Stimulation mit dem Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) freigesetzten Histaminmenge
war nicht signifikant und lag bei ca. 0,4%.
An der gemeinsamen Regressionsgeraden lässt sich ablesen, dass die
frühsensibilisierten Katzen im Modell etwa in der 10. Woche eine im FIT
nachweisbare funktionelle Sensibilisierung aufgebaut haben.
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Abb. 17: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der frühsensibilisierten Katzen R und S in drei Phasen der Verlaufsuntersuchung. Der Verlauf der antigeninduzierten Histaminfreisetzung der frühsensibilisierten Katzen R und S ist in Phasen von Woche 2 bis 14, 14 bis 22 sowie 22 bis 34 dargestellt.
Wie bereits an anderer Stelle erläutert (vergleiche 4.2.2.3, Abb. 11), zeichnete sich
das Reaktionsmuster der frühsensibilisierten Katzen R und S im Gegensatz zum
ebenfalls frühsensibilisierten Tier K durch einen wechselnden Verlauf aus, der auf
eine Modulation der Immunantwort hindeutet. Die antigeninduzierte
Histaminfreisetzung dieser Tiere war zumeist in vergleichbarer Weise von
abwechselnd höheren und niedrigeren Werten geprägt. Dies wird auch bei
Betrachtung der Regressionsgeraden für die Zeiträume von Woche 2 bis 14, Woche
14 bis 22 sowie 22 bis 34 deutlich (Abb. 17).
Bei den spätsensibilisierten Katzen E, G, N und P (late onset) war eine erhöhte
Histaminfreisetzung erst nach mehreren wöchentlichen Flohexpositionen feststellbar.
Vor Beginn der Verlaufsuntersuchung lag die im Regressionsmodell geschätzte
Histaminfreisetzung zwischen 0 (-3) und 4 %. Für die einzelnen Katzen war bis auf
Katze P ebenfalls eine signifikante Steigerung zu verzeichnen (Tab. 10,
Regressionskoeffizient). Auffällig ist, dass die drei Katzen (E, G, N), die eine
signifikante Steigerung zeigten, alle aus einer flohfreien Aufzucht kamen, somit ihre
erste Flohexposition im Rahmen dieser Untersuchungen erlebten.
Katze P hatte mit 0,45 % pro Woche die geringste Änderung zu verzeichnen,
während bei Katze N die Menge des antigenspezifisch freigesetzten Histamins
wöchentlich um ca. 2% zunahm.
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Tab. 10: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik der spätsensibilisierten ( late onset) Katzen als Regressionsmodell.
Tier ID Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert
E 0,70 ± 0,24 2,44 ± 6,51 0,43 0,02 G 1,18 ± 0,31 -3,47 ± 8,34 0,57 0,003 N 2,07 ± 0,44 0,10 ± 10,85 0,68 0,001 P 0,45 ± 0,30 4,19 ± 7,50 0,18 0,17
Gesamt 1,06 ± 0,21 1,40 ± 5,31 0,35 < 0,001
Dargestellt sind für die spätsensibilisierten Katzen mit hoher Antigenexposition (E) sowie mit geringer Antigenexposition (G, N, P) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)
Abb. 18: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der spätsensibilisierten Katzen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der spätsensibilisierten Katzen (late onset) E, G, N und P als Funktion der Zeit in Form einer Regressionsgeraden. Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).
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Im Gesamtmodell der spätsensibilisierten Katzen (Abb. 18) ist am Verlauf der
Regressionsgeraden zu erkennen, dass die funktionelle Sensibilisierung statistisch
etwa ab der 25. Woche vorhanden war (Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit
der x-parallelen positiven Grenzlinie) und somit deutlich später als bei den
frühsensibilisierten Katzen, die bereits in Woche 10 funktionell sensibilisiert waren.
Betrachtet man die Entwicklung der antigeninduzierten Histaminfreisetzung der
Katzen mit late onset Kinetik genauer, so fallen zwei Phasen auf: In den ersten
Wochen der Untersuchung (Woche -1 bis 18) fand bei keinem der vier Tiere eine
signifikante Veränderung im Zeitverlauf stattfand. Das Regressionsmodell für die
zweite Hälfte der Untersuchung (Woche 22 bis 47) zeigt dagegen eine signifikante
Zunahme der Flohantigen-induzierten Freisetzung um ca. 2 % pro Woche (Abb. 19,
Tab. 11).
Abb. 19: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der spätsensibilisierten Katzen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der spätsensibilisierten Katzen E, G, N und P (late onset) als Funktion der Zeit in Form von Regressionsgeraden für den Zeitraum von Woche -1 bis 18 (y=-0,04x + 10,84; r2=0,001, p=0,87) und Woche 22 bis 47 (y=1,86x – 25,8; r2=0,24, p=0,01). Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (gepunktete horizontale Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).
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Tab. 11A: Antigeninduzierte Sensibilisierungskineti k der spätsensibilisierten Katzen in Woche -1 - 18.
Woche
-1 - 18 Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert
hohe Exposition
(n=1) 0,28 ± 0,37 9,18 ± 3,88 0,13 0,49
geringe
Exposition
(n=3) -0,14 ± 0,26 11,40 ± 2,79 0,02 0,60
Gesamt -0,04 ± 0,22 10,84 ± 2,27 0,001 0,87
Tab. 11B: Antigeninduzierte Sensibilisierungskineti k der spätsensibilisierten Katzen in Woche 22 – 47.
Woche
22 - 47 Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert
hohe Exposition
(n=1) 1,95 ± 0,58 -43,31 ± 20,42 0,69 0,02
geringe
Exposition
(n=3) 1,95 ± 0,89 -23,21 ± 30,27 0,22 0,04
Gesamt 1,86 ± 0,68 -25,80 ± 23,34 0,24 0,01
Erläuterung zu Tabelle 11: Dargestellt nach Antigenexposition sind für die spätsensibilisierten Katzen (3.3.1) in Woche -1 bis 18 (Tab. 11A) sowie in Woche 22 – 47 (Tab. 11B) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)
Die im Gesamtmodell (Tab. 10) angenommene Zunahme von ca. 1% in der Woche
ergab sich also hauptsächlich aus der Zunahme der Freisetzung im späteren Verlauf
der Untersuchung, während in den ersten 18 Wochen die Höhe der
Histaminfreisetzung nahezu gleich blieb. Die Zerlegung des Gesamtmodells in zwei
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Zeitabschnitte bestätigte somit, dass bei den Katzen E, G, N und P die funktionelle
Sensibilisierung gegen C. felis-Ag erst zu einem späteren Zeitpunkt eingetreten ist.
Bei den auf Dauer sensibilisierten Katzen D, L und M lag die genäherte
Histaminfreisetzung vor Beginn der Untersuchung zwischen 84 und 98%
(Achsenabschnitt, Tab. 12). Interessanterweise war bei zwei konstant positiven
Tieren sogar eine im Zeitverlauf abnehmende Histaminfreisetzung (negativer
Regressionskoeffizient) zu beobachten. Bei der Katze D (hohe Ag-Exposition) war
diese Abnahme um ca. 1% pro Woche unter dem Einfluss wöchentlicher
Flohexpositionen hochsignifikant.
Tab. 12: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik der konstant FIT-positiven Katzen als Regressionsmodell.
Tier ID Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert
D -0,94± 0,29 98,09 ± 7,86 0,51 0,01
L 0,52 ± 0,45 84,08 ± 9,77 0,21 0,30
M -0,33 ± 0,29 96,66 ± 7,86 0,11 0,28
Gesamt -0,48 ± 0,21 95,73 ± 5,45 0,15 0,03
Dargestellt sind für die durchgehend sensibilisierten Katzen D, L und M (3.3.1) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)
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Abb. 20: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der konstant FIT-positiven Katzen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der dauerhaft sensibilisierten Katzen D, L und M als Funktion der Zeit in Form einer Regressionsgeraden. Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1). Insgesamt wurde im Regressionsmodell bei den konstant positiven Katzen eine
signifikante Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung um ca. 0,5% pro
Woche ermittelt (Abb. 20, Tab. 12). Da dieser Verlauf aber nur bei dem hoch
exponierten Tier D signifikant von der Zeit abhängig war, ist eine nach Gruppen
getrennte Betrachtung interessant.
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Abb. 21: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der konstant FIT-positiven Katzen nach Gruppen Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der dauerhaft sensibilisierten, hoch exponierten Katzen D (durchgezogene Linie) sowie der gering exponierten Katzen L und M (gestrichelte Linie) als Funktion der Zeit in Form von Regressionsgeraden. Über dem Grenzwert liegende Freisetzungen (x-parallele Linie bei 27,8%) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1). Wenn das Gesamtmodell um den Einfluss der Katze D bereinigt wird, verdeutlicht
sich die nach Höhe der Ag-Exposition unterschiedliche Kinetik innerhalb des
Reaktionsmusters der dauerhaft sensibilisierten Katzen. Während die gering
exponierten Katzen über den gesamten Zeitraum nahezu gleich hohe
Histaminfreisetzungen zeigten, fand eine tatsächliche Abnahme der Freisetzung nur
bei der Katze mit hoher Ag-Exposition statt (Abb. 21).
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Ein weiteres Beispiel für eine abnehmende Histaminfreisetzung unter hoher Ag-
Exposition lieferte die Katze C (Abb. 22). Wie Katze D zeigte dieses Tier im Verlauf
der Untersuchung in der Tendenz abnehmende spezifische Histaminfreisetzungen
auf Antigene im Extrakt WBE-G in einer Konzentration von 5 µg/ml.
Bei Katze C führte die um ca. 0,8 % pro Woche sinkende Freisetzung schließlich zu
einer Negativ-Bewertung ihrer FIT-Reaktion ab der 22. Woche. Rechnerisch lag die
geschätzte Histaminfreisetzung bereits ab Woche 18 unter dem Grenzwert von
27,8% (4.2.3.1). Da die antigeninduzierte Freisetzung von Katze D schon vor Beginn
der Untersuchung auf einem hohen Niveau lag (Achsenabschnitt 98,1%, Abb. 21,
Tab. 12), war sie in ihrer FIT-Reaktion konstant positiv, obwohl sich die
antigeninduziert freigesetzte Histaminmenge mit ca. 1% pro Woche stärker
verminderte als bei Katze C.
Abb. 22: Entwicklung der antigeninduzierten Histami nfreisetzung der hoch exponierten Katze C. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der Katze C als Funktion der Zeit in Form einer Regressionsgeraden (y= -0,76x + 40,8; r2=0,51, p=0,01, 3.4.8). Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (gestrichelte Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).
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Da bei verschiedenen Reaktionsmustern abhängig von der Ag-Exposition
unterschiedliche Kinetiken aufgetreten sind, wurde ein Regressionsmodell errechnet,
welches nicht auf Reaktionstypen sondern auf Gruppenzugehörigkeit basiert, um den
Einfluss der Antigenmenge auf das Sensibilisierungsverhalten noch genauer zu
beleuchten.
Tab. 13: Regressionsmodell der antigeninduzierten S ensibilisierungskinetik nach Gruppen.
Gruppe Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert
hohe Ag-Exposition -0,08 ± 0,22 25,22 ± 5,76 0,002 0,71
geringe Ag-
Exposition 0,39 ± 0,19 22,92 ± 5,01 0,03 0,047
Gesamt 0,07 ± 0,15 27,17 ± 3,85 0,001 0,63
Dargestellt sind für die unbehandelten, hoch exponierten Katzen (n=6) sowie die behandelten, gering exponierten Katzen (n=12) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)
Die antigeninduzierte Histaminfreisetzung der gering exponierten Katzen lag zu
Beginn der Verlaufsuntersuchung bei ca. 23% und damit etwa auf dem gleichen
Niveau wie in der Gruppe mit hoher Ag-Exposition (Tab. 13). Ausgehend von diesen
ähnlichen Werten, haben die unterschiedlich hoch exponierten Gruppen im
Zeitverlauf differierende Entwicklungen ihrer funktionellen Sensibilisierung
genommen.
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Abb. 23: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der hoch exponierten Katzen . Dargestellt ist das Regressionsmodell der antigeninduzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der hoch exponierten Tiere (n=6) als Funktion der Zeit. Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (gepunktete Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).
Abb. 23 zeigt die Regressionsgerade sowie die individuellen spezifischen
Histaminfreisetzungen aller sechs Katzen mit hoher Ag-Exposition. Wie bereits
erläutert, zeigten einige Katzen eine deutliche funktionelle Sensibilisierung gegen
Antigene von C. felis. Dennoch liegt das Gesamtmodell zu jeder Zeit unterhalb des
Grenzwerts. Betrachtete man die Kinetiken der einzelnen Tiere gemeinsam, ließ sich
für die Gruppe insgesamt keine Tendenz erkennen. Die Veränderung der
Histaminfreisetzung der hoch exponierten Tiere war nicht signifikant (p>0,05, Tab.
13).
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Das Gesamtmodell der zwölf gering exponierten Katzen (Abb. 24) wies dagegen eine
signifikante Steigerung der Histaminfreisetzung um ca. 0,4% pro Woche auf (p<0,05,
Tab. 13). Der Anteil der durch die Zeit erklärbaren Schwankungen der
Freisetzungswerte (r2=0,03) war gegenüber der Gruppe mit hoher Exposition
(r2=0,002) gut zehnfach erhöht. Das Regressionsmodell zeigt für die gering
exponierten Tiere insgesamt ab ca. Woche 12 statistisch eine funktionelle
Sensibilisierung (Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit der x-parallelen Linie).
Abb. 24: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der gering exponierten Katzen. Dargestellt ist das Regressionsmodell der antigeninduzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der gering exponierten Tiere (n=12) als Funktion der Zeit. Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).
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Zusammenfassend ließ sich feststellen, dass die Regressionsanalyse die
Klassifizierung der Tiere nach FIT-Sensibilisierungsgraden einerseits bestätigt, aber
auch neue Erkenntnisse hinsichtlich des Einflusses der Expositionsintensität auf die
Sensibilisierungskinetik lieferte. Mit Hilfe der Regressionsanalyse konnte gezeigt
werden, dass
1. die Kinetik der durchgehend nicht sensibilisierten Katzen in der gering und in
der hoch exponierten Gruppe sehr ähnlich verliefen, indem sie über einen
Beobachtungszeitraum von insgesamt 47 Wochen keine Tendenz zu einer
sich entwickelnden funktionellen Sensibilisierung zeigten.
2. die Kinetik der frühsensibilisierten (early onset) Katzen im Gesamtmodell
aufgrund sehr unterschiedlicher individueller Reaktionsmuster nur
unzureichend darstellbar war.
3. die spätsensibilisierten (late onset) Katzen im Gesamtmodell erst ab der 26.
Woche eine funktionelle Sensibilisierung zeigten.
4. bei den spätsensibilisierten Katzen sich in den ersten 18 Wochen keine, aber
ab der 22. Woche eine signifikante antigenspezifische funktionelle
Sensibilisierungstendenz mit einer Steigerung um etwa 2 % pro Woche
entwickelte.
5. bei vorsensibilisierten Katzen sich die Reaktionsstärke der Effektorzellen
(Basophilen) unter dem Einfluss einer hohen Antigenexposition signifikant
verminderte, während sie unter geringerer Antigenexposition eher gleich blieb.
Die Gesamtmodelle für die beiden verschieden hoch exponierten Gruppen zeigten,
dass unter dem Einfluss regelmäßiger Flohexpositionen bei einigen Tieren mit
geringer Flohantigenexposition in dieser Untersuchung eine durch die Expositionszeit
erklärbare, signifikante Zunahme der antigenspezifischen Histaminfreisetzung zu
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verzeichnen war, während die Gesamtheit der hoch exponierten Katzen im Rahmen
dieser Arbeit überraschender Weise keine signifikante Veränderung im
Reaktionsverhalten ihrer Basophilen aufwiesen.
4.2.3.6 Untersuchung der Basophilen-Sensibilisierun g mit einem selbst
hergestellten C. felis-Antigenextrakt
Da die Sensibilisierungskinetik im FIT mit einem in den USA kommerziell erhältlichen
Ganzflohextrakt untersucht wurde, stellte sich die Frage, ob ein im FIT angewandter
Extrakt aus dem Flohstamm, der für die wöchentlichen Expositionen verwendet
wurde (3.2.6), ein identisches oder unterschiedliches Abbild der tatsächlichen
Sensibilisierung lieferte. Er kam ab der 34. Woche der Verlaufsuntersuchung zum
Einsatz. Die Anwendung war somit auf die letzten 13 Wochen beschränkt, so dass
vergleichende Befunde zu den beiden Antigenextrakten von vier Zeitpunkten
vorliegen.
Übereinstimmende Reaktionen der Basophilen auf zwei verschiedene C. felis-
Antigen-Extrakte
Drei (A, C, D) der sechs hoch exponierten Tiere zeigten zu allen vier Zeitpunkten ein
übereinstimmendes Ergebnis. Die Katzen A und C reagierten zu keinem der
Vergleichszeitpunkte ab Woche 34 auf einen der beiden Extrakte, Katze D hatte
immer übereinstimmend positive Befunde, wobei in Woche 34 eine etwas stärkere
Reaktion (Sensibilisierungsgrad 2) auf den Extrakt aus dem hauseigenen Flohstamm
zu verzeichnen war.
Katze B, die während des gesamten Untersuchungszeitraums nicht auf im Extrakt
WBE-G enthaltene Antigene reagierte, zeigte zu drei Zeitpunkten eine positive
Reaktion auf den Extrakt WBE-H (3.2.6). Auch bei Katze E war in Woche 43 und 47,
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bei Katze F zu allen Zeitpunkten eine stärkere Reaktion auf die Antigene des
hauseigenen Flohstamms zu beobachten (Tab. 14).
Tab. 14: Vergleich der FIT-Befunde von zwei C. felis-Ag-Präparationen der hoch exponierten Gruppe in Sensibilisierungsgraden.
Woche
34 38 43 47 Tier
WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H
A 0 0 0 0 0 0 0 0
B 0 1 0 1 0 1 0 0
C 0 0 0 0 n.a. n.a. 0 0
D 1 2 2 2 2 2 1 1
E 0 2 1 0 1 2 1 2
F 0 2 1 2 0 2 0 2
Die Ag-Extrakte WBE-G und WBE-H (3.2.6) wurden in den Wochen 34 bis 47 an vier Zeitpunkten gleichzeitig eingesetzt. Die mit diesen Präparationen erzielten FIT-Ergebnisse sind in Sensibilisierungsgraden (4.2.3.1) für jedes hoch exponierte Tier vergleichend dargestellt. Nicht auswertbare FITs sind mit n.a. bezeichnet.
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123
Tab. 15: Vergleich der FIT-Befunde von zwei C. felis-Ag-Präparationen der gering exponierten Gruppe in Sensibilisierungsgraden.
Woche
34 38 43 47 Tier
WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H
G 2 2 2 2 2 2 2 2
H 0 1 0 1 0 1 0 0
I 0 0 0 0 0 0 0 0
K 1 2 1 2 1 2 1 2
L 2 2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
M 2 3 2 3 2 3 2 3
N 2 2 2 2 2 2 n.a. n.a.
O 0 0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
P 0 0 1 1 1 2 n.a. n.a.
Q 0 0 0 1 0 0 n.a. n.a.
R 0 0 n.a. n.a. 0 0 n.a. n.a.
S 0 0 1 2 1 0 0 0
Die Ag-Extrakte WBE-G und WBE-H (3.2.6) wurden in den Wochen 34 bis 47 an vier Zeitpunkten gleichzeitig eingesetzt. Die mit diesen Präparationen erzielten FIT-Ergebnisse sind in Sensibilisierungsgraden (4.2.3.1) für jedes gering exponierte Tier vergleichend dargestellt. Nicht auswertbare FITs sind mit n.a. bezeichnet.
In der Gruppe der gering exponierten Katzen waren die FIT-Reaktionen auf die
beiden Flohantigenpräparationen bei acht von zwölf Tieren gleichartig (Tab. 15). Fünf
Katzen (G, K, L, M, N) reagierten konkordant positiv, wobei bei den Tieren K und M
eine stärkere Reaktion auf den hauseigenen Flohantigenextrakt WBE-H vorhanden
war. Die Katzen H und Q, die zu allen Vergleichszeitpunkten FIT-negativ auf den
Extrakt WBE-G getestet wurden, zeigten dagegen eine positive Reaktion auf den
Extrakt WBE-H.
In den Wochen 34, 38 und 43 reagierten mehr Tiere positiv auf WBE-H als auf den
Extrakt WBE-G.
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124
Die statistische Übereinstimmung der mit den beiden Flohantigenpräparationen
erhobenen FIT-Befunde wurde mit Hilfe des McNemar-Tests ermittelt (3.4.8). Der
Test überprüft, ob Unterschiede in den diskordanten Häufigkeiten zufällig sind oder
tatsächlich ein signifikanter Unterschied in der Reaktion auf die beiden Extrakte
besteht. Außerdem wurde der Kappa-Index berechnet, der hilfreich in der Beurteilung
der Übereinstimmung der Befunde ist.
Die Ergebnisse der Berechnungen für jeden Zeitpunkt sind in Tabelle 16 dargestellt.
Tab. 16: Vierfeldertafel der FIT-Befunde mit den Ag -Extrakten WBE-G und WBE-H.
Woche
34 38 43 47
WBE-H
WBE-G negativ positiv negativ positiv negativ positiv negativ positiv
negativ 8 4 3 3 4 3 6 1
positiv 0 6 1 8 1 7 0 5
Σ 8 10 4 11 5 10 6 6
p-Wert > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Kappa 0,57 0,41 0,45 0,83
Dargestellt sind FIT-Befunde von vier Zeitpunkten, zu denen gleichzeitig beide Antigenextrakte (kommerzieller externer Flohantigen-Extrakt: WBE-G; und hauseigener Flohantigen-Extrakt: WBE-H) getestet wurden. Mit Hilfe des McNemar-Tests wurde geprüft, ob beide Extrakte eine gleiche FIT-Reaktion hervorrufen (Nullhypothese). Der Kappa-Index dient zusätzlich dazu, das Maß der Übereinstimmung darzustellen (3.4.8).
Es existierte zu keinem der Testzeitpunkte ein signifikanter Unterschied hinsichtlich
der FIT-Reaktion auf die verschiedenen C. felis-Antigenpräparationen. Nach dem
Kappa-Index bestand in den getesteten Wochen 34 bis 47 eine deutliche bis nahezu
vollständige Übereinstimmung in der Reaktion der Basophilen auf die beiden
Extrakte (3.4.8). Dennoch waren bei einzelnen Tieren unterschiedliche FIT-
Reaktionen zu beobachten, deren Bedeutung zu diskutieren ist.
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125
4.2.4 Intrakutantest
Die funktionelle Reaktionsbereitschaft der Mastzellen der 18 Katzen wurde mithilfe
des Intrakutantest (IKT) untersucht. Zwei Wochen vor Beginn der
Verlaufsuntersuchung wurde bei allen Katzen ein Hauttest durchgeführt. Weitere
Tests während der Untersuchung erfolgten in Woche 8 und in Woche 24. Sie fanden
in größeren zeitlichen Abständen statt als der FIT, um die Sensibilisierungskinetik der
Mastzellen durch inokuliertes Antigen möglichst wenig zu beeinflussen. Deshalb
wurden bei dem IKT in Woche 8 nur Tiere untersucht, die eine positive FIT-Reaktion
zeigten. Nach Beendigung der Infestationen erfolgte in Woche 46 eine
Abschlussuntersuchung.
Bewertungsverfahren
Traditionell wurde zur Bewertung des Intrakutantest die Reaktion der Mastzellen auf
die Kontrollsubstanzen Histamin (Positivkontrolle) und PBS (Negativkontrolle) mit der
Reaktion auf das Testantigen verglichen. Danach wurde eine Reaktion als positiv
bewertet, wenn der Durchmesser der entstehenden Antigenquaddel zu einem
Ablesezeitpunkt mindestens dem Mittelwert der Summe aus den Durchmessern
beider Kontrollquaddeln entspricht (Referenzverfahren). Daraus ergaben sich einige
Probleme, da die Mastzellreaktion auf ein Testantigen an einer Lokalisation in
Beziehung gesetzt wurde zu einer davon unabhängigen Reaktion auf Histamin und
PBS an zwei anderen Lokalisationen. Aus den Erfahrungen, die HAMPEL (2007) mit
dem Referenzverfahren bei der Auswertung des IKT bei Pferden sammelte, wurde
ein als Kinetikverfahren bezeichnetes Bewertungsschema erarbeitet, welches die
lokale Mastzellreaktion auf ein Antigen unabhängig von Reaktionen auf
Kontrollsubstanzen betrachtet. Dabei wurde unmittelbar nach Injektion der
Antigenlösung (Zeitpunkt t0) der allein durch das Injektionsvolumen verursachte
Quaddeldurchmesser ermittelt (Ausgangsquaddel = Volumenquaddel). Die durch die
Hautreaktion auf das injizierte Antigen an dieser Stelle bedingte Veränderung des
ursprünglichen Durchmessers wurde als Reaktionsquaddel bezeichnet und zu
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126
mehreren Zeitpunkten nach Injektion erfasst. Die anschließende Auswertung erfolgte
unabhängig von der Reaktion auf die Kontrollsubstanzen. Da sich die
Interpretationsschwierigkeiten mit dem Referenzverfahren im Rahmen dieser
Untersuchung bei der Katze bestätigten, wurde zur Auswertung der
Intrakutantestbefunde ein basierend auf dem Kinetikverfahren nach HAMPEL
modifiziertes Schema angewendet. Eine Reaktion wurde als positiv gewertet, wenn
zu einem Ablesezeitpunkt der Quaddeldurchmesser größer als der Durchmesser der
Ursprungsquaddel zuzüglich der Standardabweichung reiner Volumenquaddeln war.
Mittlerer Durchmesser und Standardabweichung wurden aus 470 Messwerten von
Ausgangsquaddeln zum Zeitpunkt t0 berechnet und betrugen 6,7 ± 0,8 mm.
Anhand von Messbeispielen soll im Folgenden dokumentiert werden, wie sich die
beiden Auswertungsverfahren auf die Interpretation von Intrakutantestbefunden
auswirken. Aus Tab. 17 geht hervor, dass die Katze L bereits nach 15 Minuten eine
Hautreaktion an der Injektionsstelle des Flohextrakts zeigte. Diese wurde jedoch
nach den Kriterien des Referenzverfahrens zunächst als negativ bewertet, da der
mittlere Durchmesser der durch die Kontrollsubstanzen hervorgerufenen Quaddeln
(13,5 mm + 6,3 mm = 9,9 mm) über dem Durchmesser der Testquaddel (7,3 mm) lag
und somit eine andere Einstufung verhinderte. Da nach 30 Minuten die Reaktion auf
PBS nicht mehr nachweisbar war (Mittelwert 6,35 mm), wurde die Reaktion als
positiv bewertet, obwohl schon zum Zeitpunkt von 15 Minuten nach Injektion eine
deutliche Zunahme des Quaddeldurchmessers infolge einer Hautreaktion auf die
Testsubstanz zu verzeichnen war.
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127
Tab. 17: IKT-Befund der Katze L und vergleichende B ewertung nach Referenzverfahren und mod. Kinetikverfahren.
Zeit [min]
Tier Substanz (Konz.)
0 15 30 60
Histamin
(100 µg/ml)
Ø [mm] 6,8 13,5 12,7 15,6
PBS
Ø [mm] 6,8 6,3 0 0 L
C. felis-Ag-
Extr. (5 µg/ml)
Ø [mm]
6,4 7,3 7,1 0
Referenz-
verfahren - neg. pos . neg.
Bewertung
nach: Kinetik-
verfahren - pos . neg. neg.
Dargestellt sind die Quaddeldurchmesser (mm) der Injektionslösungen Histamin, PBS und Flohantigen (C. felis-Ag) zu den Ablesezeitpunkten 0, 15, 30 und 60 Minuten p.i. Quaddeldurchmesser, die größer als der Ausgangswert sind, sowie positive Bewertungen sind fett markiert.
Dies veranschaulicht, dass deutliche Hautreaktionen auf eine Testsubstanz teilweise
zu falsch-negativen Bewertungen führen können, wenn sie nach dem
Referenzverfahren ausschließlich im Hinblick auf die Reaktion auf
Kontrollsubstanzen (PBS und Histamin) ausgewertet werden (Tab. 17, Zeitpunkt 15
min.). Umgekehrt können falsch-positive Resultate vermieden werden, indem eine
Bewertung unabhängig von Kontrollsubstanzen nach dem Kinetikverfahren erfolgt
(Tab. 17, Zeitpunkt 30 min.).
Während die Interpretation der Messwerte in diesem Fall nach beiden Verfahren zu
einer positiven Endbewertung führte, dokumentiert Tab. 18 die Abhängigkeit des
Referenzverfahrens von der Reaktion auf die Kontrollsubstanzen noch deutlicher.
Die Histaminquaddel vergrößert sich über den betrachteten Zeitraum nur gering,
während die PBS-Quaddel nach 30 Minuten nicht mehr vorhanden ist. Dies führt
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128
nach dem Referenzverfahren zu einer falsch-positiven Bewertung, obwohl der
Durchmesser der Flohantigen-Quaddel bereits unter dem Wert des durch das
Injektionsvolumen bedingten Durchmessers lag.
Tab. 18: IKT-Befund der Katze B und vergleichende B ewertung nach Referenzverfahren und mod. Kinetikverfahren.
Zeit [min]
Tier Substanz (Konz.)
0 15 30 60
Histamin
(100 µg/ml)
Ø [mm] 6,5 8,0 6,9 6,7
PBS
Ø [mm] 7,3 5,7 0 0 B
C. felis-Ag-
Extr. (5 µg/ml)
Ø [mm] 8,2 5,9 5,9 0
Referenz-
verfahren - neg. pos . neg.
Bewertung
nach: Kinetik-
verfahren - neg. neg. neg.
Dargestellt sind die Quaddeldurchmesser (mm) der Injektionslösungen Histamin, PBS und Flohantigen (C. felis-Ag) zu den Ablesezeitpunkten 0, 15, 30 und 60 Minuten p.i. Quaddeldurchmesser, die größer als der Ausgangswert sind, sowie positive Bewertungen sind fett markiert.
4.2.4.1 Ergebnisse des IKT in der Gruppe mit hoher C. felis-Antigenexposition
Die Reaktionsbereitschaft der Mastzellen wurde zwei Wochen vor Beginn der
Verlaufsuntersuchung getestet. Keines der hoch exponierten Tiere zeigte eine
funktionelle Sensibilisierung auf Antigene in der Präparation von Greer (WBE-G,
3.2.6). Erstaunlich ist, dass auch in den folgenden Untersuchungen in Woche 8, 24
und 46 bei keinem der sechs Tiere eine Reaktion auf diesen Ganzflohextrakt
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129
nachgewiesen werden konnte, obwohl die Mastzellen dieser Katzen über den
gesamten Zeitraum mit großen Mengen Flohantigen konfrontiert wurden (4.2.1.1).
Tab. 19: Übersicht der IKT-Befunde der hoch exponie rten Gruppe in Sensibilisierungsgraden.
Woche
- 2 8 24 46 Tier
WBE-G WBE-G WBE-G WBE-G WBE-H
A 0 - 0 0 0
B 0 - 0 0 0
C 0 0 0 0 0
D 0 0 0 0 2
E 0 - 0 0 2
F 0 - 0 0 2
Für jedes Tier der hoch exponierten Gruppe ist der im IKT ermittelte Sensibilisierungsgrad der Mastzellen dargestellt. Ein Sensibilisierungsgrad von 2 bedeutet eine nach dem Kinetikverfahren (4.2.4) positive Reaktion der Mastzellen auf den Flohantigenextrakt in den Konzentrationsstufen 5 und 1 µg/ml, 0 entspricht einem negativen Testergebnis. Die gestrichelte Linie trennt die in Woche 47 erhobenen Befunde des kommerziellen Extraktes (WBE-G) von den mit dem hauseigenen Extrakt (WBE-H) erzielten Ergebnissen. In Woche 8 nicht getestete Tiere (Vermeidung der Induktion einer Sensibilisierung bei zu diesem Zeitpunkt FIT-negativen Tieren) sind mit (-) bezeichnet.
Wie in Tab. 19 dargestellt, unterschieden sich die Reaktion auf den Extrakt WBE-G
und die in Woche 47 simultan eingesetzte Präparation WBE-H aus dem
institutseigenen Flohstamm deutlich. Drei der sechs Tiere (D, E, F) reagierten in zwei
Konzentrationsstufen (5 und 1 µg/ml) positiv auf WBE-H, jedoch nicht auf WBE-G.
Der IKT in der 46. Woche erfolgte sechs Wochen nach der letzten Flohexposition.
Trotz längerer Antigenkarenz war durch Antigene der für die Expositionen
verwendeten Flöhe eine Mastzellreaktion auslösbar, die nach Konfrontation mit dem
Extrakt WBE-G nicht zu beobachten war.
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130
4.2.4.2 Ergebnisse des IKT in der Gruppe mit gering er C. felis-Antigen-
exposition
Aus Tabelle 20 geht hervor, dass zwei gering exponierte, mit Imidacloprid behandelte
Katzen (L und M) bereits vor Beginn der Untersuchung eine Sensibilisierung
aufwiesen. Bei Tier M war lediglich bei der Abschlussuntersuchung in Woche 46
keine Mastzellreaktion mehr zu beobachten, weder bei dem von extern bezogenen
Extrakt WBE-G, noch beim aus dem institutseigenen Flohstamm hergestellten
Extrakt WBE-H.
Tab. 20: Übersicht der IKT-Befunde der gering expon ierten Gruppe in Sensibilisierungsgraden.
Woche
- 2 8 24 46 Tier
WBE-G WBE-G WBE-G WBE-G WBE-H
G 0 - 0 0 0
H 0 - 0 0 0
I 0 - 0 0 0
K 0 0 0 0 0
L 1 2 1 2 0
M 1 1 2 0 0
N 0 - 0 1 2
O 0 - 0 0 0
P 0 - 1 1 2
Q 0 - 0 0 0
R 0 0 0 0 0
S 0 0 0 0 0
Für jedes Tier der gering exponierten Gruppe ist der im IKT ermittelte Sensibilisierungsgrad der Mastzellen dargestellt. Ein Sensibilisierungsgrad von 1 bedeutet eine nach dem Kinetikverfahren (4.2.4) positive Reaktion der Mastzellen auf den Flohantigenextrakt in einer Konzentration von 5 µg/ml; bei einem Sensibilisierungsgrad von 2 lag zusätzlich eine positive Reaktion auf die Konzentrationsstufe 1 µg/ml vor, 0 entspricht einem negativen Testergebnis. Die gestrichelte Linie trennt die in Woche 46 erhobenen Befunde des kommerziellen Extraktes (WBE-G) von den mit dem hauseigenen Extrakt (WBE-H) erzielten Ergebnissen. In Woche 8 nicht getestete Tiere (Vermeidung der Induktion einer Sensibilisierung bei zu diesem Zeitpunkt FIT-negativen Tieren) sind mit (-) bezeichnet.
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131
Bei acht der übrigen zehn Tiere war eine Mastzellsensibilisierung mit beiden
Antigenpräparationen zu keinem Zeitpunkt nachweisbar.
Zwei anfänglich negative Tiere (N, P) entwickelten unter dem Einfluss der
wöchentlichen Flohexpositionen sowohl eine Sensibilisierung im FIT (Tab. 6) als
auch im IKT (Tab. 20): Sie zeigten in Woche 46 bzw. 24 eine Hautreaktion auf die
injizierten Antigenpräparationen. Beide Tiere reagierten konkordant positiv auf die
zwei eingesetzten Ganzflohextrakte.
Insgesamt waren diese beiden Katzen die einzigen Tiere mit geringer Ag-Exposition,
welche durch die über 40 Wochen andauernden, wöchentlichen Flohexpositionen
eine im Intrakutantest nachweisbare Sensibilisierung ihrer Mastzellen auf
Flohantigen erfahren haben. Bei den übrigen Tieren war eine Beeinflussung der
Mastzellen durch wiederholte Infestationen mit C. felis im IKT nicht erkennbar.
4.2.4.3 Vergleich der Sensibilisierungskinetik der Mastzellen im Hinblick auf
die Intensität der Antigen-Exposition
Der Sensibilisierungsstatus der Mastzellen wurde zu vier Zeitpunkten mit Hilfe des
Intrakutantests untersucht. In Tab. 21 sind die IKT-Befunde nach Gruppen in Form
von Vierfeldertafeln aufgeführt. Eine Reaktion wurde als positiv bewertet, wenn eine
Zunahme des Quaddeldurchmessers nach dem Kinetikverfahren zu verzeichnen
war. Wie bereits dargestellt, reagierte die Mehrzahl der Tiere im betrachteten
Zeitraum nicht auf die in den beiden Präparationen enthaltenen Flohantigene. Ein
Tier zeigte eine konstant positive Reaktion und zwei weitere Katzen aus der gering
exponierten Gruppe entwickelten im Verlauf der Untersuchung eine funktionelle
Sensibilisierung der Mastzellen, die im Intrakutantest nachgewiesen wurde.
Mit dem Fisher-Test sollte ermittelt werden, ob sich das Verhältnis von positiven zu
negativen Befunden in der hoch exponierten Gruppe zu einem der
Erhebungszeitpunkte statistisch von der Gruppe mit geringer C. felis-
Antigenexposition unterschied. Zugrunde gelegt wurden die Hautreaktionen, die nach
Inokulation des Extraktes WBE-G beobachtet wurden.
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132
Tab. 21: Kontingenztafeln der Befunde des IKT
Woche
-2 8 24 46
Befund
Gruppe negativ positiv negativ positiv negativ positiv negativ positiv
Hohe Ag-
Exposition 6 0 2 0 6 0 6 0
Geringe
Ag-Exp- 10 2 3 2 9 3 9 3
Σ 16 2 5 2 15 3 15 3
p-Wert 0,53 1,00 0,51 0,51
Dargestellt sind die Befunde des Intrakutantests zwei Wochen vor Beginn der Verlaufsuntersuchung (-2), sowie in Woche 8, 24 und 46, die nach Injektion des Extrakts WBE-G dokumentiert wurden. Mit dem Fisher-Test wurde geprüft, ob ein signifikanter Unterschied in den Befundhäufigkeiten zwischen den Gruppen vorliegt.
Die in Tab. 21 aufgelisteten p-Werte zeigen, dass sich das Verhältnis der
sensibilisierten zu den nicht sensibilisierten Katzen zwischen den verschieden stark
exponierten Gruppen im Intrakutantest zu keinem Zeitpunkt signifikant unterscheidet.
Für den selbst hergestellten Extrakt WBE-H konnte ebenfalls kein statistischer
Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden, da er nur zur
Abschlussuntersuchung in Woche 46 zum Einsatz kam: Hier waren drei von sechs
hoch exponierten sowie zwei von 12 schwach exponierten Katzen im IKT positiv.
Somit ließ sich mit Hilfe des IKT kein von der Expositionsintensität abhängiger
statistischer Unterschied in der Sensibilisierungskinetik der Mastzellen feststellen.
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133
4.2.4.4 Übereinstimmung der Mastzellreaktion auf zw ei verschiedene Antigen-
Extrakte
Ein Vergleich der beiden C. felis-Extrakte im IKT war nur in der
Abschlussuntersuchung in der 46. Woche durchführbar. Wie aus Tabelle 22
hervorgeht, waren im Vergleich der beiden Antigenextrakte WBE-G und WBE-H 14
von 18 Befunden konkordant. Auf die im Extrakt WBE-H enthaltenen Antigene
zeigten zwei zusätzliche Tiere eine Mastzellsensibilisierung. Nach der Auswertung
mit dem Kinetikverfahren galt eine Reaktion als positiv, wenn eine deutliche
Vergrößerung des Durchmessers der Ausgangsquaddel zu einem der
Messzeitpunkte bestand und diese Reaktion mindestens auf die höchste
Konzentrationsstufe des jeweiligen Antigenextraktes zu beobachten war. Mit Hilfe
des McNemar-Tests sollte festgestellt werden, ob zwischen der Mastzellreaktion auf
die beiden in dieser Arbeit verwendeten Antigenextrakte ein statistischer
Unterschied besteht.
Tab. 22: Vergleich der mit zwei C. felis-Ag-Extrakten im IKT ermittelten Befunde.
WBE-H
WBE-G negativ positiv
negativ 12 3
positiv 1 2
Σ 13 5
p-Wert > 0,05
Kappa 0,37
Konkordant positive bzw. negative Befunde sind fett gedruckt. Der Koinzidenzindex Kappa gibt die Übereinstimmung der mit den beiden Extrakten erhobenen Befunde an, der p-Wert ist ein Maß für das Verhältnis der Unterschiede zwischen den beiden Extrakten. Die Daten wurden in Woche 46 der Verlaufsuntersuchung erhoben.
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134
Die auf Gleichheit lautende Nullhypothese konnte nicht verworfen werden (p>0,05),
d.h., es bestand kein signifikanter Unterschied in der Reaktion der im IKT
untersuchten Katzen auf die beiden Antigenpräparationen. Die durch den
Koinzidenzindex Kappa ausgedrückte Übereinstimmung war als schwach zu
bezeichnen (κ=0,37).
Der prozentuale Anteil positiver Reaktionen der Mastzellen auf den selbst
hergestellten Extrakt WBE-H in Woche 46 der Verlaufsuntersuchung lag mit 38%
höher als dies bei Verwendung des externen Extraktes WBE-G der Fall war (20%).
4.2.5 Übereinstimmung der Ergebnisse aus FIT und IK T
Die im FIT erhobenen Befunde zur Sensibilisierung der Basophilen sollten mit der im
IKT ermittelten Mastzellsensibilisierung verglichen werden. Hierzu wurden alle FIT-
Ergebnisse als positiv klassifiziert, die mindestens einen Sensibilisierungsgrad von 1,
d.h. eine positive Reaktion auf die verwendeten C. felis-Extrakte WBE-G (Greer,
3.2.6) und WBE-H (eigene Herstellung, 3.2.6) in der Konzentrationsstufe 5 µg/ml
zeigten. Ein Intrakutantest wurde als positiv gewertet, wenn nach dem unter 4.2.4
beschriebenen Kinetikverfahren eine entsprechende Vergrößerung des
Durchmessers der Ausgangsquaddel zu einem der drei Messzeitpunkte von 15, 30
und 60 Minuten nach Injektion festzustellen war.
Aus Tab. 23 ist ersichtlich, dass die Unterschiede in den Ergebnissen der beiden
Testverfahren nach dem McNemar-Test nicht signifikant waren. Der Kappa-Test
lieferte für die Voruntersuchung eine deutliche Übereinstimmung, im weiteren Verlauf
wurde diese jedoch zunehmend schwächer.
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135
Tab. 23: Kontingenztafeln von IKT im Vergleich zum FIT über vier Zeitpunkte.
Woche
- 2 8 24 46
FIT
IKT negativ positiv negativ positiv negativ positiv negativ positiv
negativ 14 2 3 2 11 3 7 (5) 6 (5)
positiv 0 2 0 2 1 2 0 (0) 2 (5)
Σ 14 4 3 4 12 5 7 (5) 8 (10)
p-Wert > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Kappa 0,61 0,46 0,36 0,24 (0,40)
Dargestellt sind FIT- und IKT-Befunde aus vier Zeitpunkten der Verlaufsuntersuchung. Der p-Wert gibt an, ob ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Testverfahren vorliegt. Der Kappa-Index dient der Beurteilung der Übereinstimmung zwischen den beiden Tests. Die Daten wurden mit dem Ag-Extrakt WBE-G erhoben, zusätzlich kam in Woche 46 der Extrakt WBE-H zum Einsatz (Werte in Klammern).
Die kleinere Zahl untersuchter Tiere in Woche 8 ist darauf zurückzuführen, dass zu
diesem Zeitpunkt nur die Katzen im Intrakutantest untersucht wurden, die bereits
eine positive FIT-Reaktion gezeigt hatten, um eine Sensibilisierung der Mastzellen
nicht ungewollt durch Injektion von Antigen zu induzieren. In Woche 24 und 46 waren
aus technischen Gründen 17 bzw. 15 von 18 Tests für diesen Vergleich auswertbar.
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136
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
FIT IKT FIT IKT FIT FIT (WBE-H)
IKT IKT (WBE-H)
Woche - 2 Woche 24 Woche 46
negativ positiv
Abb. 25: Vergleich von FIT- und IKT-Befunden währen d der Verlaufsuntersuchung. Der Sensibilisierungsstatus der Mastzellen wurde in den Wochen -2, 24 und 46 bei allen Tieren mit Hilfe des IKT erhoben und mit den entsprechenden, auswertbaren FITs verglichen. Die Darstellung zeigt den prozentualen Anteil positiver und negativer Befunde (Tab. 23). Soweit nicht anders bezeichnet, beziehen sich die Daten auf den Extrakt WBE-G. Zusätzlich wurde in Woche 46 der selbst hergestellte Extrakt WBE-H getestet.
Das Verhältnis positiver zu negativen FIT-Befunden (Abb. 25) änderte sich im Verlauf
der Untersuchung zugunsten der positiven Reaktionen, d. h., dass mehrere Katzen
eine funktionelle Sensibilisierung gegen Flohantigene entwickelt haben (4.2.3).
Dagegen war der Anteil positiver IKT-Befunde gleich bleibend niedrig. Zusätzlich fiel
auf, dass der Anteil positiv getesteter Katzen bei der eigenen Ag-Präparation (WBE-
H) aus dem Flohstamm, mit dem die Infestationen durchgeführt wurden, höher lag
als bei WBE-G.
D I S K U S S I O N
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137
5 Diskussion
Die funktionelle Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen (basophile Granulozyten
und/oder Mastzellen) gegen ein Antigen ist eine unabdingbare Voraussetzung zur
Entwicklung einer Typ I-Allergie gegen dieses Antigen. Über die Kinetik dieser
Sensibilisierung, insbesondere unter dem Einfluss unterschiedlicher Antigenmengen
ist sowohl beim Haustier als auch beim Menschen wenig bekannt. Im Rahmen dieser
Arbeit sollte mit Hilfe von funktionellem in vitro Test (FIT) und Intrakutantest (IKT) der
Einfluss unterschiedlicher Flohspeichelmengen auf die Kinetik der funktionellen
Sensibilisierung von Basophilen und Mastzellen bei Katzen während mehrfach
durchgeführter, kontrollierter Flohexpositionen geprüft werden.
Darüber hinaus wurde nach Möglichkeiten der methodischen Optimierung des
funktionellen in vitro Test (FIT) zur Anwendung bei der Katze gesucht.
5.1 Methodik des FIT
5.1.1 Modulation der Spontanfreisetzung von Basophi len der Katze
Eine wichtige Voraussetzung für die Bewertung der Reaktionsbereitschaft der
Basophilen auf ein Antigen ist eine möglichst geringe Spontanfreisetzung, so dass
unspezifisch freigesetztes Histamin zuverlässig von einer antigenspezifischen
Freisetzung differenzierbar ist. Die mittlere Spontanfreisetzung der felinen
Basophilen, die in dieser Untersuchung mithilfe des FIT ermittelt wurde, betrug 5,4 ±
3,7% (4.2.3.1). Sie lag damit auf einem ähnlichen Niveau wie die
Spontanfreisetzung, die STUKE (2005) im Rahmen der Etablierung des
Testverfahrens für die Katze gemessen hatte (4,2 ± 2,7%). Basophile der Katze
setzen spontan aber deutlich mehr Histamin frei als dies beim Pferd der Fall ist. In
der Untersuchung von KAUL (1998) lag die Spontanfreisetzung bei sofortiger
D I S K U S S I O N
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138
Durchführung des FIT nach Blutentnahme bei keinem Tier über 5% der maximalen
Freisetzung.
Um die Testsicherheit des FIT zu erhöhen, wurden Handhabung und Bearbeitung
der Blutproben modifiziert und der Einfluss auf spontane und antigenvermittelte
Histaminfreisetzung untersucht. Es wurde zunächst vermutet, dass eine technisch
bedingte Voraktivierung der Basophilen bei der Blutentnahme ursächlich für erhöhte
Freisetzungswerte war. Ein Problem stellte das geringe entnehmbare Blutvolumen
bei der Katze dar, das einer vergleichsweise großen Fläche des Probengefäßes
gegenüberstand. Dadurch war ein intensiver Kontakt der Basophilen mit
Fremdoberflächen gegeben, was zu einer Voraktivierung führen könnte. Durch
direktes Eintropfen des Blutes in eine PBS-Lösung sollte daher versucht werden, den
Kontakt der Basophilen mit dem Probengefäß und damit die Spontanfreisetzung zu
minimieren. Durch diese Maßnahme konnte jedoch keine deutliche Verminderung
der Spontanfreisetzung erzielt werden (4.1.1).
Es ist vorstellbar, dass der geringe Durchmesser der für die Punktion in Frage
kommenden Blutgefäße und der dadurch verlangsamte Blutfluss bei schlechtem Sitz
der Kanüle im Gefäß bereits zu einer Schädigung und/oder Voraktivierung der
Basophilen führen.
Ein weiterer Optimierungsansatz bestand darin, die Histaminfreisetzung bei der
Inkubation der Zellen zu verbessern. Es ist bekannt, dass Basophile für eine effektive
Degranulation auf extrazellulär vorhandene Kationen wie Ca2+ und Mg2+ angewiesen
sind. Ausgehend von dem von STUKE (2005) und KAUL (1998) verwendeten
Freisetzungspuffer mit einer Ca2+-Endkonzentration von 1 mmol/l, wurden die
Auswirkungen eines veränderten Ca2+-Milieus auf das Freisetzungsverhalten der
Basophilen untersucht (4.1.2). Eine Ca2+-Konzentration von 0,5 mmol/l verminderte
sowohl die spontane wie die antigenvermittelte Histaminfreisetzung der Basophilen
erkennbar. Eine Erhöhung der Ca2+-Endkonzentration auf 2 mmol/l verstärkte
spontane wie antigenvermittelte Freisetzung gegenüber der Histaminfreisetzung in
einer Ca2+-Konzentration von 1 mmol/l dagegen nur geringfügig. Die
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139
Histaminfreisetzung humaner Basophiler ist ebenso abhängig von Kationen und
reagiert empfindlich auf Änderungen der Osmolarität im extrazellulären Raum
(RIMMER u. BRYANT 1986; AKAGI u. TOWNLEY 1989). Neben einer starken
Abhängigkeit von der Ca2+-Konzentration konnten TEDESCHI et al. (1994)
nachweisen, dass eine erhöhte Na+-Konzentration die Histaminfreisetzung aus
Basophilen des Menschen inhibiert. Ob und inwiefern andere Kationen als Ca2+ das
Freisetzungsverhalten feliner Basophiler beeinflussen, müsste in weiterführenden
Untersuchungen geklärt werden. Dies könnte einen zusätzlichen Ansatzpunkt liefern,
um das Freisetzungsverhalten feliner Basophiler in einem Testverfahren wie dem
funktionellen in vitro-Test zu optimieren.
Inwieweit allergische Vorerkrankungen Einfluss auf die spontane Histaminfreisetzung
bei der Katze nehmen, ist nicht bekannt. Es ist denkbar, dass ein entsprechendes
Zytokinmilieu, das aufgrund einer Sensibilisierung besteht oder tierartlich bedingt ist,
zu einer individuell oder generell erhöhten Reaktionsbereitschaft der Basophilen bei
der Katze beiträgt. Beim Menschen konnte ein Zusammenhang zwischen der Höhe
der Spontanfreisetzung und einer allergischen Erkrankung festgestellt werden.
Basophile von Patienten mit Asthma oder allergischen Symptomen wiesen eine
höhere spontane Freisetzung auf als gesunde Probanden (KAZIMIERCZAK et al.
1980; AKAGI u. TOWNLEY 1989). Aus Mangel an klinischen Fällen konnten in der
vorliegenden Untersuchung keine weiteren Erkenntnisse über die Modulation der
Spontanfreisetzung durch Allergien bei der Katze gewonnen werden.
5.1.2 Reaktionsbereitschaft von Basophilen im Hinbl ick auf Lagerungsdauer
und Temperatur
Zur Erweiterung der diagnostischen Einsatzmöglichkeiten des FIT bei der Katze ist
eine ausreichende Stabilität der Basophilen von der Blutentnahme bis zur
Durchführung des FIT erforderlich. Bei Raumtemperatur gelagerte Blutproben von
Katzen zeigten bereits nach 24 h stark erhöhte Spontanfreisetzungen der
Basophilen, was eine Auswertung der Proben verhinderte. Die Lagerung der Proben
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140
bei 4° C führte zu einer deutlich verminderten Spon tanfreisetzung gegenüber bei
Raumtemperatur gelagerten Proben. Gleichzeitig blieb die generelle
Reaktionsbereitschaft der Basophilen, gemessen an dem Wert nach sofortiger FIT-
Durchführung, erhalten. Die antigenvermittelte Histaminfreisetzung von FIT-positiven
Katzen war bei gekühlter Lagerung nach 24 h in nahezu gleicher Höhe
reproduzierbar, ohne dass FIT-negative Tiere nach Lagerung der Proben eine falsch-
positive Reaktion zeigten. Eine deutliche Erhöhung der Spontanfreisetzung bei
gekühlter Lagerung konnte im Gegensatz zu den Untersuchungen von STUKE
(2005) nicht festgestellt werden. Ebenso war keine relevante Verminderung der Ak-
und Ag-vermittelten Freisetzung zu beobachten. Nach den vorliegenden
Erkenntnissen muss daher von einer höheren Stabilität der Zellen bei gekühlter
Lagerung ausgegangen werden.
Das temperaturabhängige Freisetzungsverhalten der Basophilen lässt sich
möglicherweise durch intrazelluläre Mechanismen erklären. Voraussetzung für die
Degranulation bei Aktivierung der Zelle über FcεRI ist ein Anstieg der intrazellulären
Ca2+-Konzentration in den Basophilen sowie genügend vorhandenes ATP (BEAVEN
et al. 1984). Bei Raumtemperatur gelagerte Zellen könnten aufgrund eines
gegenüber gekühlt aufbewahrten Zellen beschleunigten Zellstoffwechsels während
der Lagerungsdauer so viel ATP verbraucht haben, dass es für die Degranulation
und Histaminfreisetzung nicht mehr in ausreichender Menge zur Verfügung stand.
Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Sauerstoffradikale (ROS) unter anderem
bei der Aktivierung von Mastzellen und Basophilen eine Rolle spielen (YOSHIMARU
et al. 2002; SUZUKI et al. 2005). Superoxide müssen bei der Degranulation neu
synthetisiert werden. Es wäre denkbar, dass Änderungen im Zellstoffwechsel
während der Lagerzeit eine Neusynthese der ROS und anderer, an der
Signaltransduktionskaskade beteiligter Komponenten, die für die Degranulation
essentiell sind, verhinderten.
Alternativ wäre es möglich, dass die spezifischen Antikörper von den Fc-Rezeptoren
bei höheren Temperaturen abdissoziierten und somit keine Kreuzvernetzung mehr
stattfinden konnte. Dies ist jedoch eher unwahrscheinlich, da IgE an FcεRI hochaffin
über mehrere Tage stabil gebunden ist (TIZARD 2004). Um membranständig
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141
gebundene Antikörper für bestimmte Fragestellungen von Basophilen abzulösen
(stripping), sind saure Pufferlösungen nötig (KLEINE BUDDE et al. 2001), die Zellen
wurden in der vorliegenden Untersuchung jedoch bei physiologischem pH gelagert.
5.2 Sensibilisierungskinetik von Basophilen und Mas tzellen auf C.
felis-Antigen
Bei den für die Verlaufsuntersuchung verwendeten Katzen traten verschiedene
Sensibilisierungsmuster auf: Tiere, die vor Beginn der Untersuchung keine
nachweisbare funktionelle Sensibilisierung zeigten, entwickelten zu einem frühen
Zeitpunkt (innerhalb von drei Wochen nach erster Flohexposition) oder im späteren
Verlauf (frühestens 18 Wochen nach erster Flohexposition) eine Sensibilisierung
oder zeigten während der kontrollierten Flohexpositionen keine qualitative
Veränderung im Reaktionsverhalten ihrer Basophilen.
Andere Katzen waren bereits zu einem bestimmten Grad gegen Flohantigene
sensibilisiert und behielten die Sensibilisierung über den gesamten Zeitraum. Weitere
vorsensibilisierte Katzen verminderten ihre Flohantigen-induzierte
Histaminfreisetzung im Zeitverlauf unter dem Einfluss wiederholter Flohexpositionen
oder zeigten ein zyklisches Verlaufsmuster. Im Gegensatz zu der Untersuchung von
STUKE (2005) trat bei vorsensibilisierten Katzen keine wesentliche Verstärkung der
Reaktionsbereitschaft unter dem Einfluss regelmäßiger Flohexpositionen auf.
Die funktionelle Sensibilisierung der Basophilen einiger Katzen könnte durch die
kontrollierten Flohexpositionen induziert worden sein, indem antigenpräsentierende
Zellen (APC) durch den wiederholten Kontakt CD4+ T-Zellen kontinuierlich
Flohantigen präsentiert haben. Diese aktivieren B-Zellen, die große Mengen
Flohantigen-spezifische Antikörper, vornehmlich IgE, bilden können. Sind große
Mengen IgE vorhanden, wird dieses von FcεRI auf Basophilen und Mastzellen
gebunden und führt zur verstärkten Expression des Rezeptors auf der Zelloberfläche
D I S K U S S I O N
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142
(SAINI u. MACGLASHAN 2002). Dies wiederum vergrößert die Bindungskapazität
freier IgE und erhöht die Dichte spezifischer Antikörper. Sind ausreichend viele
Antikörper gleicher Spezifität an FcεRI gebunden, kann das entsprechende Antigen
eine Zusammenlagerung der Rezeptoren und Aktivierung der Zelle auslösen. Eine
Konfrontation der gegen Flohantigen sensibilisierten Basophilen führt so zu einer
Freisetzung von Histamin und weiterer Mediatoren.
Neben neu sensibilisierten Tieren zeigten die wiederholten, über 40 Wochen
durchgeführten Flohexpositionen bei einigen Katzen keine Anzeichen einer
funktionellen Sensibilisierung ihrer Basophilen und Mastzellen. Dies könnte
einerseits dadurch bedingt sein, dass es bei diesen Tieren nicht zu einer T2-
dominierten Immunantwort gegen Flohantigen kam. Bei einer T2-Dominanz werden
überwiegend Zytokine wie IL-4 und IL-10 von Th2-Zellen und auch von Basophilen
selbst (OH et al. 2007) produziert. Besonders IL-4 regt B-Zellen zur Produktion
sensibilisierender Antikörper an, indem es einen Isotypenswitch zu IgE fördert,
welches von den Effektorzellen der Typ I-Allergie, Basophilen und Mastzellen,
gebunden werden kann. Es wäre auch möglich, dass aufgrund unterschiedlich stark
auf den Effektorzellen exprimierter Fc-Rezeptortypen eine Aktivierung der
Basophilen trotz vorhandener sensibilisierender IgE-Antikörper nicht stattgefunden
hat. Neben den aktivierenden, IgE-bindenden FcεRI könnte auch eine überwiegende
Anzahl IgG-bindender Rezeptoren vom Typ FcγRIIB vorhanden gewesen sein, die
durch Zusammenlagerung mit FcεRI einen inhibierenden Effekt auf die Zelle
ausüben (KEPLEY et al. 2004; GALLI et al. 2005). Es ist nicht auszuschließen, dass
durch die periodische Konfrontation mit Flohantigen auch vermehrt
antigenspezifisches IgG gebildet und von Basophilen und Mastzellen an FcγRIIB
gebunden wurde. Dies musste im Rahmen dieser Arbeit jedoch ungeklärt bleiben, da
das Verhältnis von auf Basophilen gebundenem IgG zu IgE mangels nicht
verfügbarer Anti-Katze-IgE-Antikörper nicht bestimmt werden konnte.
Ausreichende Mengen IgG könnten auch als blocking antibodies gewirkt haben und
freies Antigen bereits im Serum neutralisiert haben, bevor dieses an sensibilisierende
IgE-Antikörper auf Basophilen und/oder Mastzellen binden konnte (STRAIT et al.
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143
2006). FOSTER et al. (1997) wiesen nach, dass Katzen, die allergische Symptome
u.a. gegen Hausstaub und Flohantigene zeigten, neben IgE auch erhöhte IgG-Titer
im Serum hatten. Außer durch IgG-abhängige Reaktionen können IgE-vermittelte
Immunantworten auch auf andere Weise abgeschwächt werden. CD23 wird auf B-
Zellen exprimiert und bindet IgE mit niedrigerer Affinität. Dies vermindert die
Produktion von sensibilisierendem IgE und somit die Dichte von antigenspezifischen
Antikörpern auf den Typ I-Effektorzellen (YU et al. 1994). Möglicherweise wurde
durch diese Art der Feedback-Hemmung bei einigen Tieren eine ausreichende
Sensibilisierung der Effektorzellen auf Flohantigen verhindert.
Ein weiterer Grund für eine verminderte Reagibilität der Basophilen könnte in der
Expression verschiedener Phänotypen dieser Zellen liegen. Aus der Forschung an
menschlichen Zellen ist bekannt, dass neben Basophilen, die auf einen Stimulus
Histamin freisetzen, auch nonreleaser basophils existieren (KEPLEY et al. 1999). Die
bei diesem Typ ausbleibende Histaminfreisetzung ist auf einen Defekt in der
Signaltransduktionskaskade zurückzuführen. Nonreleaser basophils fehlen die
Tyrosinkinasen Lyn und Syk, die an der Degranulation beteiligt sind (KUMAR et al.
2007). Ob dieser Phänotyp bei Katzen ebenfalls eine Rolle spielt oder in einem
Individuum neben intakten Basophilen gleichzeitig exprimiert werden kann, ist nicht
bekannt. Beim Menschen ist der nonreleaser Phänotyp kein permanenter Defekt,
sondern es ist beobachtet worden, dass nonreleaser basophils einiger Probanden
langfristig wieder eine normale Reagibilität aufbauen können. Diese als cycler
bezeichneten Zellen könnten in vivo einen großen Einfluss auf den Verlauf
allergischer Erkrankungen haben (KEPLEY et al. 2000; YOUSSEF et al. 2007).
Nonreleaser basophils sind bei der vorliegenden Untersuchung weitgehend
auszuschließen, da die stets durchgeführte Prüfung der generellen Sensibilisierung
durch Anti-Katzen-IgG-Antikörper auch bei den Tieren meist positive Zellreaktionen
hervorriefen, die auf Flohantigen stets negativ reagierten.
In dieser Studie sind auch Sensibilisierungsmuster aufgetreten, die durch einen
wechselnden Verlauf geprägt waren. Tiere, die bereits eine funktionelle
Sensibilisierung gegen Antigene von C. felis entwickelt hatten, zeigten nach
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anfänglich positiven FIT-Resultaten zwischenzeitlich keine Reaktion ihrer
Basophilen, um danach erneut positiv zu reagieren.
Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass phasenweise keine sensibilisierenden
Antikörper auf den Basophilen gebunden oder aber deren Dichte auf der Einzelzelle
zu gering war, um eine Aktivierung der Zelle zu bewirken. Bezogen auf die
Zellpopulation wäre es auch möglich, dass zwar ausreichend sensibilisierte
Basophile vorhanden waren, deren Zahl aber insgesamt zu gering war, um eine über
der positiven Nachweisgrenze liegende Menge Histamin freizusetzen. Außerdem
könnten inhibierende Fc-Rezeptoren auf den Basophilen trotz in ausreichender Zahl
vorhandener, membranständiger sensibilisierender Antikörper eine Zellaktivierung
und somit Histaminfreisetzung verhindert haben, was ebenfalls zu einem negativen
FIT-Befund geführt haben könnte.
In einer weiteren Untersuchung zum Sensibilisierungsverhalten von Basophilen bei
der Katze (STUKE 2005) reagierte eine Katze bei der Eingangsuntersuchung im FIT
zunächst negativ, jedoch schon kurz nach der ersten Flohexposition eindeutig
positiv. Dieses Reaktionsmuster hat sich bei drei Katzen in der vorliegenden
Untersuchung wiederholt. Diese frühsensibilisierten Katzen waren zwar im FIT vor
der ersten Flohexposition negativ, jedoch bereits vermutlich vorsensibilisiert. Sie
zeigten vermutlich aus regulativen Gründen keine messbare Reaktion in der
Vorprüfung. Während Katze K von nun an fast durchgehend im FIT positiv reagierte,
zeigten die Katzen R und S gegenläufige Schwankungen zwischen positiven und
negativen FIT-Reaktionen.
Diese Modulation der funktionellen Sensibilisierung ist am ehesten durch regulative
Mechanismen erklärbar, die im Laufe wiederholter Antigenexpositionen zum Tragen
kommen. Besonders effizient könnte dabei die Modulation der FcγRIIB-Expression
durch Immunkomplexe zwischen Flohantigen und IgG sein (SAMUELSSON et al.
2001).
D I S K U S S I O N
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145
5.2.1 Zusammenhang zwischen Intensität der Flohinfe station und
Antigenexposition
Ziel dieser Untersuchung war es, die Sensibilisierungskinetik der Basophilen von
Katzen, die während regelmäßiger Flohexpositionen durch das Kontaktinsektizid
Imidacloprid geschützt waren, mit der Kinetik von unbehandelten Katzen zu
vergleichen. Es wurden 24 h andauernde Infestationen im wöchentlichen Rhythmus
durchgeführt, die Behandlung mit Imidacloprid erfolgte im Abstand von 14 d.
Das Absammeln der Flöhe vom Wirt nach 24 oder 48 h ist eine gängige Praxis, um
die Wirksamkeit einer Flohbehandlung zu ermitteln (ARTHER et al. 1997;
CADIERGUES et al. 2001). Im Rahmen der Verlaufsuntersuchung von STUKE
(2005) wurden ebenfalls 24 h dauernde Expositionen durchgeführt.
Ctenocephalides felis beginnt unmittelbar nach Wirtsfindung mit der Blutmahlzeit
(DRYDEN u. RUST 1994). CADIERGUES et al. (2000) zeigten, dass nahezu alle frei
auf dem Wirt beweglichen Flöhe innerhalb der ersten Stunde der Exposition eine
Blutmahlzeit aufnehmen. Daher entscheidet die Geschwindigkeit, mit der
Imidacloprid die Flöhe abtötet (antifeeding effect) darüber, ob ein Floh Gelegenheit
zu einer Blutmahlzeit und somit die APC des Wirts Antigenkontakt haben. DRYDEN
et al. (2005) zeigten, dass sich der Wirkungseintritt von spot-on Präparaten wie
Imidacloprid 21 d nach Behandlung deutlich verlangsamt. Das Behandlungsintervall
in der vorliegenden Untersuchung betrug 14 d, um einen maximalen Schutz der
Katzen während der Infestationen mit C. felis zu gewährleisten.
Die mit Imidacloprid behandelten Katzen (n=12) waren, gemessen an den nach 24 h
Exposition wieder gefundenen Flöhen, mit einer signifikant geringeren Anzahl C. felis
belastet als die unbehandelten Tiere (4.2.1.3). Die Anzahl lebender Flöhe war in der
unbehandelten, hoch exponierten Gruppe im Mittel aller Infestationen 200fach höher
als in der gering exponierten Gruppe (p<0,001). Dies entspricht bei einem
Ausgangswert von 100 lebenden Flöhen, die pro Tier infestiert wurden, einer
Reduktion von > 99%. Dieser Wert liegt geringfügig über dem Prozentsatz der
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146
maximalen Reduktion, die in Wirksamkeitsstudien nach Einmalbehandlung erreicht
wurde (RUST 2005).
Die für die Intensität der Antigenexposition entscheidende Größe, nämlich die Anzahl
Flöhe, die eine Blutmahlzeit aufgenommen hatten, war in der hoch exponierten
gegenüber der behandelten, gering exponierten Gruppe 93-mal so hoch. Basierend
auf den Ergebnissen der Arbeitsgruppe von FRANK (1996) kann davon
ausgegangen werden, dass ein Floh beim Saugakt über den Speichel eine Menge
von ca. 10 ng Protein während der Expositionsdauer von 24 h in den Wirt inokuliert.
Dies bedeutet, dass die hoch exponierten Katzen während der wöchentlich
durchgeführten Flohexposition einer Antigenmenge von ca. 390 ng (arithm.
Mittelwert) und die gering exponierten Tiere ca. 4 ng (arithm. Mittelwert) ausgesetzt
waren.
5.2.2 Einfluss der Expositionsintensität auf die Se nsibilisierungskinetik
Die mit Imidacloprid behandelten Katzen wiesen eine signifikant geringere Anzahl
Flöhe mit Blutmahlzeit auf als die nicht behandelten Tiere (p<0,001). Analog hierzu
lässt dies auf einen deutlichen Unterschied in der Antigenmenge schließen, der die
beiden Gruppen ausgesetzt waren (5.2.1). Einige der während der
Verlaufsuntersuchung beobachteten Reaktionsmuster sind ungeachtet der Höhe der
Antigenexposition dennoch in beiden Gruppen aufgetreten. Andererseits unterschied
sich die Reaktion der spätsensibilisierten sowie der dauerhaft sensibilisierten Katzen
nach der Antigenmenge, der die Tiere ausgesetzt waren. Es ist nicht bekannt,
welche Antigenmenge zur Ausprägung einer Sensibilisierung oder klinisch
manifesten Allergie erforderlich ist. DRYDEN und BLAKEMORE (1989) weisen
darauf hin, dass der Schweregrad einer FAD u.a. von der Häufigkeit des
Antigenkontakts abhängt, Angaben über den Einfluss der Expositionsintensität gibt
es nach derzeitigem Kenntnisstand nicht. Während in der Veterinärmedizin derartige
Untersuchungen bis dato nicht durchgeführt wurden, existieren einzelne Berichte aus
der Humanmedizin. CUSTOVIC et al. (2001) verglichen die Sensibilisierung von
D I S K U S S I O N
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147
Mastzellen auf Katzenantigene von Personen mit der Antigenmenge, der diese
ausgesetzt waren. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass Probanden mit einer mittleren
Antigenbelastung öfter eine Sensibilisierung aufwiesen als solche Personen, die mit
extrem geringen oder hohen Mengen Antigen konfrontiert waren. Die gleiche
Schlussfolgerung zogen auch SCHRAM-BIJKERK et al. (2006), die die Höhe der
Milben-Antigenexposition im Hausstaub mit dem Auftreten einer Sensibilisierung
verglichen. Eine weitere Studie zeigte, dass Kinder, die mit Katzen in einem Haushalt
lebten, ein vermindertes Risiko aufwiesen, an Asthma zu erkranken (HESSELMAR et
al. 2003). Die Kinder reagierten mit deutlich erhöhten IgG-Titern auf die
Antigenexposition, ohne jedoch allergische Symptome oder Asthma zu entwickeln.
Eine Modifikation der bei Asthma und Typ I-Allergien vorliegenden Th2-
Immunantwort, durch die während des kontinuierlichen Antigenkontakts nicht wie
normalerweise IgE- sondern vornehmlich IgG-Antikörper gebildet werden (PLATTS-
MILLS et al. 2001), könnte in ähnlicher Weise auch die Sensibilisierungskinetik der
hoch exponierten Katzen beeinflusst haben. FOSTER et al. (1997) fanden, dass
Katzen, die mit Flöhen infestiert wurden, neben IgE auch antigenspezifische IgG
bildeten. Unterdessen konnte die Arbeitsgruppe nicht klären, wie das Vorhandensein
von IgG bei Katzen die klinische Symptomatik beeinflusst.
Wenn die Flohexpositionen bei den Tieren in der vorliegenden Untersuchung eine
Th2-Immunantwort induziert hätten, bei der statt IgE IgG der vorherrschende Ak-
Isotyp war, so wäre dies im FIT eventuell nicht nachweisbar gewesen, da aufgrund
überwiegender IgG-Bindung an FcγRIIB eine Histaminfreisetzung ausblieb.
Ferner ist nicht auszuschließen, dass die im Serum der Katzen zirkulierende
Antigenmenge von im Zeitverlauf ansteigenden Mengen IgG-Antikörpern zu größer
werdenden Teilen neutralisiert wurde oder eine zu geringe Dichte sensibilisierender
IgE-Antikörper bestand. Somit könnten Basophile und Mastzellen nicht mehr aktiviert
worden sein (STRAIT et al. 2006).
Bei zwei mit einer hohen Antigenexposition belasteten Tieren verminderte sich die
bereits vor Untersuchungsbeginn bestehende Sensibilisierung während der
Expositionen signifikant (p=0,01, 4.2.2.5). Ausgehend von den genannten
D I S K U S S I O N
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148
Erkenntnissen aus der Humanmedizin wäre es denkbar, dass eine Gegenregulation
auch noch bei einer bereits bestehenden Sensibilisierung erfolgen kann. KOMIYA
und Mitarbeiter (2003) demonstrierten, dass Basophile, die mit Antigen oder Anti-IgE
in unterschwelligen Konzentrationen in physiologischem, Ca2+-haltigem Medium
inkubiert wurden, ihre Reagibilität verloren. Nach 24 h Inkubation war, trotz gleich
bleibender Rezeptor- und Antikörperdichte auf den Basophilen, durch Stimulation mit
Antigen oder Anti-IgE keine Histaminfreisetzung zu induzieren. In der vorliegenden
Untersuchung hat sich die Reaktionsbereitschaft in erster Linie bei hoch exponierten
Tieren verringert. Die bei diesen Katzen beobachtete abnehmende Sensibilisierung
könnte im Hinblick auf die Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe dadurch bedingt sein,
dass die in vivo effektiv wirksame Flohantigen-Konzentration die
Reaktionsbereitschaft der Basophilen herunterreguliert hat. Verantwortliche
Mechanismen hierfür könnten in einer Umverteilung an sensibilisierenden
Antikörpern auf den Basophilen oder einer vermehrten Expression inhibitorischer
FcγRIIB zu suchen sein. Letzteres könnte durch vermehrt vorhandene
Immunkomplexe aus Flohantigen und spezifischem IgG dagegen ausgelöst werden.
Ebenso traten neu induzierte Sensibilisierungen („late onset“) häufiger in der gering
mit C. felis-Antigenen belasteten Gruppe auf. Dies wirft wiederum die Frage auf, ob
eine intensive Flohinfestation mit ca. 52 Flöhen pro Woche (4.2.1.3), wie sie bei gut
gepflegten Katzen aus privater Haltung eher selten auftreten dürfte, bei einigen der
Versuchskatzen durch die gleich bleibend hohe Antigenmenge sogar in Richtung
einer Toleranz gegenüber Flohantigenen führte.
Unabhängig von der Expositionsintensität waren bestimmte Sensibilisierungsmuster
in beiden Gruppen zu beobachten. Sowohl drei von sechs hoch exponierten Tieren
als auch vier von zwölf gering exponierten Katzen entwickelten im Verlauf keine
beständig nachweisbare funktionelle Sensibilisierung gegen Antigene von C. felis
(4.2.3). Der höhere Prozentsatz nicht sensibilisierter Tiere in der hoch exponierten
Gruppe könnte ein weiterer Hinweis darauf sein, dass es durch höhere
Antigenmengen zur Induktion einer Toleranz kommen kann. Der Einfluss der
Antigenexposition auf eine Sensibilisierung und das Auftreten allergischer Symptome
wurde in der Humanmedizin intensiv - meist epidemiologisch - erforscht. Aus
D I S K U S S I O N
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149
mehreren europäischen Studien (BRAUN-FAHRLANDER 2000; KILPELAINEN et al.
2000) ist bekannt, dass Kinder, die auf Bauernhöfen aufwachsen, ein vermindertes
Risiko haben, an allergischer Rhinitis (Heuschnupfen) zu erkranken. Es ist daher
denkbar, dass der intensive Antigenkontakt, dem einige Katzen im Rahmen dieser
Arbeit ausgesetzt waren, einen ähnlichen Einfluss auf deren
Sensibilisierungsverhalten hatte, wie dies beim Menschen gezeigt wurde.
Die in dieser Untersuchung gemachten Beobachtungen zeigen Zusammenhänge
zwischen Expositionsintensität und Sensibilisierung, die von Arbeitsgruppen aus der
Humanmedizin in ähnlicher Form bestätigt werden. Letztlich muss die
Übertragbarkeit der Ergebnisse dieser Studien auf die vorliegende Arbeit unter
Vorbehalt betrachtet werden, da unbekannt ist, inwieweit unterschiedliche
Eintrittswege der Antigene in den Organismus die Entwicklung einer Sensibilisierung
beeinflussen.
Ob eine Toleranzbildung durch eine hohe Antigenexposition im Rahmen dieser
Arbeit von Bedeutung war, konnte nicht abschließend geklärt werden. Zukünftige
Studien könnten darauf abzielen, die Rolle unterschiedlicher Ak-Isotypen,
insbesondere IgG-Isotypen für die Sensibilisierung bei der Katze zu klären. Zudem
sind die Mechanismen der Toleranzinduktion bei der Katze noch weitgehend
unerforscht. Eine wichtige Aufgabe künftiger Untersuchungen wird es zudem sein,
individuelle Variabilitäten im Sensibilisierungsmuster mithilfe größerer Tierzahlen zu
überprüfen.
5.3 Beurteilung der Reaktion der Basophilen im FIT auf die
verwendeten Flohantigen-Präparationen
Zur Untersuchung der Reaktionsbereitschaft der Basophilen auf Antigene von C. felis
wurden zwei verschiedene Antigenextrakte eingesetzt. Zum einen wurde die
funktionelle Sensibilisierung mithilfe eines Floh-Ganzkörperextraktes von Greer
D I S K U S S I O N
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150
getestet, zum anderen wurde aus dem für die Flohexpositionen verwendeten
Flohstamm eine eigene Ganzkörperpräparation zum Einsatz im FIT hergestellt. Die
aus ganzen Flöhen hergestellten Extrakte enthalten die vornehmlich im Flohspeichel
vorkommenden Antigene in deutlich geringerem Ausmaß als eine
Speichelpräparation. Zwar liegt die Spezifität von Ganzflohextrakten unter der von
Flohspeichel, aus früheren Untersuchungen ist jedoch bekannt, dass deren Spezifität
ausreicht, um eine Sensibilisierung von Mastzellen festzustellen (KRISTENSEN u.
KIEFFER 1978; LAFFORT-DASSOT et al. 2004). Die Ergebnisse von STOLPER und
OPDEBEECK (1994) zeigten, dass einzelne Fraktionen eines von ihnen getesteten
Ganzflohextrakts eine geringere Spezifität hatten als der gesamte Extrakt. Auch
STUKE (2005) konnte mit dem Ganzflohextrakt von Greer deutliche Reaktionen der
Basophilen auf im Extrakt enthaltene Antigene provozieren und unterschiedliche
Reaktionsmuster identifizieren, was im Rahmen der selbst durchgeführten
Experimente bestätigt wurde.
Die eigenen Ergebnisse haben darüber hinaus Unterschiede in der Reaktion der
Basophilen auf zwei verschiedene Flohantigenextrakte gezeigt. Dass sich mit
Antigenpräparationen verschiedener Herkunft sehr unterschiedliche Testergebnisse
erzielen lassen, beobachteten auch LAFFORT-DASSOT et al. (2004). Obwohl die
Provokation mit den beiden Extrakten statistisch deutlich bis fast vollständig
übereinstimmte, rief der selbst hergestellte Ganzflohextrakt (WBE-H) dennoch mehr
positive Reaktionen im FIT hervor als der Greer-Extrakt WBE-G (4.2.3.6). Da der
Extrakt WBE-G im Gegensatz zur eigenen Präparation vor der Verwendung mittels
Gelfiltration aufgereinigt werden musste, ist eine methodisch bedingte Retention
bestimmter Komponenten denkbar, die dann bei der Provokation der Basophilen
fehlten. Eine weitere Ursache könnte in der unterschiedlichen geographischen
Herkunft der Präparationen liegen, wobei die genaue Identität der bei der Herstellung
verwendeten Flohstämme nicht geklärt werden konnte. Die mit WBE-H beobachtete
höhere Prävalenz positiv getesteter Katzen könnte ferner dadurch erklärbar sein,
dass durch die Flohexpositionen sensibilisierende Antikörper gegen Antigene
gebildet wurden, die nur der institutseigene Flohstamm besitzt. Des Weiteren wäre
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es auch denkbar, dass bei gleicher Antigenzusammensetzung in den beiden
Präparationen unterschiedlich hohe Konzentrationen bestimmter Proteine vorhanden
waren, gegen die die exponierten Katzen spezifische Antikörper gebildet hatten. Von
den Flöhen beim Saugakt inokuliertes Antigen könnte zu einer funktionellen
Sensibilisierung gegen Proteine geführt haben, die im Extrakt WBE-G im Vergleich
zu WBE-H nur in geringer Menge vorhanden waren, was folglich bei der Provokation
der Basophilen im FIT mit WBE-G keine bzw. mit WBE-H deutliche Reaktionen
auslöste.
5.4 Vergleich des Reaktionsverhaltens von Basophile n und
Mastzellen
In der vorliegenden Arbeit wurde neben der Sensibilisierungskinetik der Basophilen
im FIT im gleichen Zeitraum auch die funktionelle Sensibilisierung der Mastzellen im
IKT untersucht. Vor Beginn der Flohexpositionen zeigten die beobachteten Tiere eine
stark übereinstimmende Reaktion von Basophilen und Mastzellen (4.2.5). Während
der regelmäßig durchgeführten Infestationen nahm die Übereinstimmung deutlich ab.
Diese Beobachtung bestätigt die Ergebnisse von STUKE (2005). Im Gegensatz zu
der Arbeit von STUKE wurden in der eigenen Untersuchung jedoch mehr Tiere FIT-
positiv getestet als IKT-positiv. In beiden Untersuchungen kam der Extrakt WBE-G
zum Einsatz, jedoch wurde er in der vorliegenden Arbeit zusätzlich in einer höheren
Konzentrationsstufe eingesetzt (5 µg/ml), was möglicherweise durch stärkere
Stimulation der Effektorzellen vermehrt zu positiven Resultaten, insbesondere im
FIT, geführt haben könnte.
Eine weitere mögliche Erklärung wäre eine unterschiedliche Sensitivität der beiden
Testverfahren. In einer kürzlich publizierten Studie über das Verhalten von
Basophilen und Mastzellen bei Pferden mit Sommerekzem erbrachte der FIT eine
höhere Sensitivität als der IKT (LANGNER et al. 2007). Pferde mit klinisch
diagnostiziertem Sommerekzem, die nur sehr milde Symptome zeigten, reagierten im
D I S K U S S I O N
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152
IKT teilweise negativ, im FIT jedoch positiv. Dies deutet darauf hin, dass eine nur
schwach ausgeprägte allergische Symptomatik, wie sie in der hier untersuchten
Katzenpopulation generell zu beobachten war, im IKT zu falsch-negativen Resultaten
führen kann.
Ob die ausbleibende Hautreaktion einiger FIT-positiver Katzen in ähnlicher Weise auf
ein falsch-negatives Ergebnis des IKT zurückzuführen ist, lässt sich nur schwer
beurteilen, da keine der untersuchten Katzen deutliche Symptome einer Flohallergie
aufwies. Es liegen ferner Hinweise vor, dass die Verteilung der Mastzellen in der
Haut nicht homogen ist und/oder deren Histamingehalt variiert (HAMPEL et al. 2008).
Die Ergebnisse von an Pferden durchgeführten, vergleichenden Hauttests fielen
daher je nach verwendetem Hautareal sehr unterschiedlich aus. Falls dies auch bei
der Katze zutreffend ist, würde es die ohnehin diffizile Interpretation von
Hautreaktionen bei dieser Tierart (VROOM 2000) noch zusätzlich erschweren.
Einen weiteren, möglichen Einflussfaktor auf die IKT-Befunde könnten die für die
Narkose verwendeten Wirkstoffe Ketamin und Xylazin darstellen. Deren Bedeutung
ist jedoch nur schwer abzuschätzen, da entsprechende Untersuchungen an Katzen
bis dato nicht durchgeführt wurden. BEALE et al. (1990) empfehlen Xylazin als
Sedativum für den Intrakutantest bei Hunden, da es die Reaktionsfähigkeit der
Mastzellen nicht herabsetzte. In einer Studie von MORIELLO u. EICKER (1991) an
Hunden beeinflusste eine Kombination aus Ketamin und Diazepam die objektiven
Messwerte des Intrakutantest nicht. Da es im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich
war, Vergleichsmessungen in Narkose und im Wachzustand durchzuführen, kann
eine Beeinflussung der Messwerte durch die Ketamin/Xylazin-Narkose nicht gänzlich
ausgeschlossen werden.
Dass bei fehlender Klinik eine funktionelle Sensibilisierung nachweisbar ist, wurde
bereits von anderen Autoren bei Katzen (MORIELLO u. MCMURDY 1989; STUKE
2005), Hunden (KUNKLE et al. 2000; LAFFORT-DASSOT et al. 2004) und Pferden
(LANGNER et al. 2007) beschrieben und stellt ein häufiges Phänomen dar. Ein
weiterer Aspekt, der bereits diskutiert wurde, ist die Induktion einer Toleranz gegen
die verwendeten Antigene (5.2.2).
D I S K U S S I O N
___________________________________________________________________________
153
Dass auf den Typ I-Effektorzellen vorhandene, sensibilisierende Antikörper nicht
zwingend mit einer klinisch ausgeprägten Allergie einhergehen müssen, wirft die
Frage nach den Regulationsmechanismen auf, die die klinisch manifeste Erkrankung
verhindern. In den letzten Jahren hat sich das Bild der basophilen Granulozyten als
reine Effektorzellen gewandelt. Neuere Forschungen zeigen, dass Basophile IL-4
produzieren und so naive CD4+ T-Zellen zu Th2 Zellen differenzieren können (OH et
al. 2007). Weiterhin wies die Arbeitsgruppe um OH nach, dass Basophile über
direkten Kontakt mit T-Zellen die Ausprägung des Th1-Phänotyps inhibieren. MIN et
al. (2004) konnten zeigen, dass Basophile bei Mäusen, die mit Nippostrongylus
brasiliensis infiziert waren, die wichtigste Quelle von IL-4 zur Induktion der Th2-
Antwort waren. Außerdem fanden sie Basophile vornehmlich in peripheren und nicht
in lymphatischen Geweben. Diese Ergebnisse weisen den Basophilen eine
entscheidende Rolle bei der Modulation der Immunantwort zu und liefern einen
möglichen Erklärungsansatz für die in dieser Arbeit beschriebene Diskrepanz
zwischen der Sensibilisierung von Mastzellen und Basophilen. So könnten Basophile
zwar sensibilisierende Antikörper tragen, deren Produktion von Th2-Zellen induziert
wurde, aber in vivo nicht aktiviert werden, weil das korrespondierende Antigen nicht
in ausreichenden Mengen vorhanden ist. Die Konsequenz wäre eine möglicherweise
unzureichende IL-4-Produktion, wodurch Mastzellen nicht genügend FcεRI
exprimierten (PRUSSIN u. METCALFE 2006). Dies könnte eine
Mastzellsensibilisierung, die der Sensibilisierung der Basophilen eventuell
nachgeordnet ist, verzögert eintreten lassen oder sogar verhindern.
Basophile Granulozyten und Mastzellen differenzieren aus CD34+ Vorläuferzellen.
Während Basophile bereits im Knochenmark reifen und erst dann auswandern,
vollenden Mastzellen ihre Differenzierung in der Peripherie (ENERBACK 1997;
PRUSSIN u. METCALFE 2006). Menschliche Basophile und Mastzellen verhalten
sich klinisch als unabhängige Zelllinien. Trotz dieser Unterschiede wird ihr Verhalten
als Effektorzellen der Typ I-Allergie in der Forschung oft gleichgesetzt. Die
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit über das unterschiedliche Reaktionsverhalten
von Basophilen und Mastzellen könnten nicht zuletzt auf der Heterogenität dieser
beiden Zellpopulationen beruhen:
Z U S A M M E N F A S S U N G
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154
6 Zusammenfassung
Matthias Sydow: Vergleich der Sensibilisierungskine tik von Effektorzellen der
Typ I-Allergie bei der Katze während periodischer E xposition mit
Ctenocephalides felis in hoher und geringer Intensität
Eine Überempfindlichkeit gegen Speichelproteine des Katzenflohs, C. felis, und die
daraus resultierende Flohallergie-Dermatitis ist bei der Katze ein häufiges
dermatologisches Krankheitsbild. Ausgelöst wird es von Mastzellen und basophilen
Granulozyten, die an ihren membranständigen aktivierenden Fc-Rezeptoren (FcR)
ausreichend mit sensibilisierenden Antikörpern gegen Flohantigene besetzt sind, so
dass sie bei genügend Antigenkontakt zur Freisetzung ihrer Mediatoren angeregt
werden. Eine derartige funktionelle Sensibilisierung lässt sich nicht durch
serologische, sondern nur durch geeignete zelluläre Testverfahren nachweisen. Für
die Mastzellen ist dies der Intrakutantest (IKT), für die Basophilen der funktionelle in
vitro Test (FIT).
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss einer hohen und einer sehr geringen C. felis-
Antigenexposition auf das Sensibilisierungsverhalten von felinen Basophilen und
Mastzellen mithilfe des FIT und des IKT zu untersuchen. Hierzu wurden 18 Katzen
über einen Zeitraum von 10 Monaten wöchentlich für 24 h mit ca. 100 Flöhen
infestiert, wobei eine Gruppe von Katzen (n=12) zur Verminderung der
Antigenexposition gleichzeitig mit dem Kontaktinsektizid Imidacloprid behandelt
wurde. Eine weitere Gruppe (n=6) blieb unbehandelt (hoch exponiert). Die mittlere
Anzahl Flöhe mit Blutmahlzeit betrug in der hoch exponierten Gruppe 39 ± 17, in der
gering exponierten Gruppe 0,4 ± 0,9. Über insgesamt 47 Wochen wurde die
funktionelle Sensibilisierung der Basophilen und Mastzellen vor, während und nach
der Flohexpositionsphase mittels FIT und IKT geprüft. Dazu wurde ein kommerzieller
Flohantigen-Ganzkörperextrakt und in der Schlussphase der Untersuchung
zusätzlich ein selbst hergestellter Extrakt aus dem gleichen Flohstamm benutzt, mit
dem die Katzen infestiert wurden.
Z U S A M M E N F A S S U N G
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155
Neben einer technischen Verbesserung des FIT für die Katze wurden folgende
wesentliche Ergebnisse erzielt:
In der hoch und in der gering exponierten Gruppe zeigten sich je drei Katzen als
„resistent“ gegenüber einer Sensibilisierung gegen Flohantigene. Weder vor noch
während oder nach der 40-wöchigen Expositionsphase war eine Tendenz zur
funktionellen Sensibilisierung ihrer Basophilen oder Mastzellen erkennbar.
In der hoch und in der gering exponierten Gruppe zeigten je zwei Tiere bereits vor
dem Beginn der Flohexposition eine funktionelle Sensibilisierung ihrer Basophilen
gegen Flohantigen. Während die beiden Katzen in der gering exponierten Gruppe
über die gesamte Untersuchungszeit etwa gleichbleibend sensibilisiert blieben, nahm
die Stärke der Basophilensensibilisierung bei den beiden hoch exponierten Katzen
mit fortschreitender Zeit signifikant ab. Nur in der gering exponierten Gruppe zeigten
drei zuvor FIT-negative Katzen kurz nach Beginn der Flohexpositionen eine deutliche
funktionelle Sensibilisierung im FIT („early onset“ Reaktion). Diese Tiere waren
vermutlich bereits vorsensibilisiert, reagierten jedoch aus regulativen Gründen im
Vortest negativ und wurden durch Flohantigenexposition bald positiv. Eine dieser
Katzen blieb auch weiterhin positiv, während die beiden anderen in ihrer
Basophilensensibilisierung schwankten. Ihre Verlaufskinetik liefert Hinweise auf
Regulationsmechanismen auf der Ebene der Basophilen. Ein weiteres, bisher für
Haustiere noch nicht dokumentiertes Sensibilisierungsmuster zeigten vier Katzen aus
beiden Gruppen: eine „late onset“ Reaktion. Vor und während der ersten 18 Wochen
wiederholter Flohexpositionen zeigten sie keine Anzeichen einer Sensibilisierung
ihrer Basophilen. Ab der 22. Expositionswoche entwickelten sie eine von nun an
deutlich zunehmende und bleibende Sensibilisierung ihrer Basophilen.
Desweiteren konnten sowohl im FIT als auch im IKT grundsätzlich übereinstimmende
Befunde auf die beiden Extrakte dokumentiert werden, wobei die selbst hergestellte
Präparation mehr positive Reaktionen hervorrief. Zu Beginn der Untersuchungen
bestand eine Übereinstimmung von Basophilen- (FIT) und Mastzellsensibilisierung
(IKT) (kappa 0,61), die durch die zunehmende Sensibilisierung der Basophilen im
weiteren Verlauf geringer wurde (kappa 0,24). Das stimmt damit überein, dass die
Basophilensensiblisierung vor der Mastzellsensibilisierung stattfindet.
S U M M A R Y
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156
7 Summary Matthias Sydow: Sensitization kinetics of type I hy persensitivity effector cells
in the cat during periodical exposure to Ctenocephalides felis in high and low
intensity
Hypersensitivity to saliva components of the cat flea, C. felis, and the resulting flea
allergic dermatitis (FAD) is a commonly seen dermatologic disorder in the cat. It is
caused by mast cells and basophils with sufficient amounts of sensitizing antibodies
bound to their Fc receptors (FcR), communicating the release of inflammatory
mediators upon bridging by a recognized antigen. Such a functional sensitization
cannot be comprised by any serological testing. It requires complex cellular reactions
such as those of mast cells via intradermal test (IDT) or of basophils monitored by
the functional in vitro test for basophil sensitisation (FIT).
The objective of this study was to investigate the influence of controlled high and low
exposure of cats to C. felis by monitoring the sensitization kinetics of their basophils
and mast cells using FIT and IDT, respectively. Over a period of 10 months, a 24h
infestation with 100 fleas per cat was repeated weekly on 18 cats. One group (n=12)
was treated with the insecticide imidacloprid to reduce the number of blood sucking
fleas and, thus, the antigen exposure (low exposure group). The other group (n=6)
remained untreated (high exposure group). Mean count of fleas with bloodmeal was
39 ± 17 in the high exposure group and 0.4 ± 0.9 in the low exposure group. During a
time span of 47 weeks, functional sensitization of basophils and mast cells was
monitored by using a commercially available whole body extract of C. felis. Moreover,
a self-made extract of the flea strain used for infestation was tested in the final stage
of investigation.
In addition to technical improvements of the FIT for cats, the following major results
were achieved:
Three cats in each of the high and low exposure group proved to be “resistant” to
sensitization to flea antigens. No tendency of sensitization was observed neither
before nor during and after the 40-week exposure period.
S U M M A R Y
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157
The basophils of two cats in each of the high and low exposure group, were
functionally sensitized to flea antigen already before the experimental exposure
started. While the two cats in the low exposure group remained constantly sensitized
throughout the investigation period, the degree of basophil sensitization in the two
highly exposed cats decreased significantly with time. Exclusively in the low
exposure group, three previously FIT-negative cats clearly displayed a functional
sensitization soon after initial flea infestations (“early onset” reaction). These animals
were presumably pre-sensitized but reacted negative before flea exposure probably
for regulatory reasons and became positive due to a boost with flea antigen. One of
these cats remained positive further on while basophil sensitization of the two others
went subsequently up and down. Their sensitization kinetics points towards
regulatory mechanisms on the basophil level.
One more yet undescribed sensitization pattern in domestic animals was seen in four
cats in both groups: a “late onset” reaction. Before and during the first 18 weeks of
repeated flea infestation they showed no sign of basophil sensitization. From week
22 on, however, they developed a functional sensitization of their basophils with a
remarkable increase.
Furthermore, in both FIT and intradermal test (IDT), results were basically consistent,
though more positive reactions were seen with the self-made antigen preparation.
Before exposure there was a correlation between FIT and IDT (kappa 0.61). With
increasing sensitization of basophils during the exposure period, however, the
correlation lowered (kappa 0.24). These results are in agreement with previous
findings that functional basophil sensitization occurs before mast cell sensitization.
L I T E R A T U R V E R Z E I C H N I S
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Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. vet. G. von Samson-Himmelstjerna möchte ich danken für die
Überlassung des interessanten Themas und die wissenschaftliche Betreuung sowie die
Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der für die Durchführung der Studie benötigten
Materialien.
Herrn Prof. Dr. med. vet. Dr. h.c. W. Leibold gilt mein besonderer Dank für die
wissenschaftliche Betreuung und ausführliche Beratung bei der Auswertung des
umfangreichen Datenmaterials sowie die freundliche Bereitstellung eines Arbeitsplatzes in
der Arbeitsgruppe Immunologie.
Herrn Dr. med. vet. N. Mencke (Bayer Animal Health) danke ich für die finanzielle
Unterstützung.
Herrn Udo Rabe, Frau Silke Schöneberg und Frau Sonja Kordex danke ich sehr für die
Hilfestellungen im Laboralltag und die nette Zusammenarbeit in angenehmer Atmosphäre.
Den Tierpflegern am Institut für Parasitologie danke ich für die gute Zusammenarbeit und
Rücksicht auf die besonderen Anforderungen während der Durchführung der
Verlaufsuntersuchung.
Außerdem danke ich allen Doktoranden und Mitarbeitern, die mich bei der praktischen
Durchführung der Arbeit, insbesondere der Blutentnahmen, tatkräftig unterstützt haben, ganz
besonders denen, die immer ein offenes Ohr und ein aufmunterndes Wort hatten.
Meiner Mutter danke ich von Herzen für unendlichen Rückhalt, Verständnis und
Unterstützung, die Grundpfeiler, auf denen diese Arbeit steht und die mich dahin haben
kommen lassen, wo ich heute bin.
Tomoyo, die immer für mich da war und ohne die diese Arbeit so nicht denkbar gewesen
wäre - ich danke dir.