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Ralf BartenschlagerAbteilung Molekulare Virologie, Hygiene Institut
INF345, 1. OGhttp://molecular-virology.uni-hd.de
Virusaufbau, Replikationszyklus, Klassifikation, Virusnachweisverfahren
Molekulare Mechanismen der Pathogenese bei Infektionskrankheiten
• Viren sind obligat intrazelluläre Parasiten
• Virusgenome können aus DNA oder RNA bestehen
• Das Virusgenom wird in der Wirtszelle repliziert.Es steuert die Synthese der übrigen Virusbestandteile
• Virusnachkommen werden aus neu gebildeten Komponentenzusammengesetzt (Assembly)
• Ein neu gebildetes Virion ist ein Vehikel, mit dem das virale Genomzur nächsten Wirtszelle oder Wirtsorganismus transportiert wird
• Dort beginnt der nächste Replikationszyklus
Definierende Eigenschaften von Viren
Virusaufbau am Beispiel Herpes Simplex Virus
aus: Flint, Principles in Virology, 2nd edition
Sphärische Partikelmeistens ikosaedrisch
Tubuläre Partikelmeistens helikal
Komplexe Partikelz. B. Phagen
Virus Morphologie
Grössenvergleich Eukaryonte Zelle – Bakterium - Virus
LogarithmischePhase
Lag-
Phas
e
1 2 3 4
Stunden
Zellz
ahl
101
102
103
104
Anpassung an die Kulturbedingungen (Lag-Phase)
logarithmische Vermehrung durch Zweiteilung
Verlangsamung der Teilung nach Aufbrauchen der Nährstoffe (Sättigung)
Vergleich der Vermehrungsstrategie von Bakterien und Viren in Kultur
Eklip
se
Late
nzpe
riode
Infektöse Partikel dringen in die Zelle ein und zerfallen (Eklipse)
Bildung und Freisetzung von vielen Virusnachkommen pro Zelle (Latenzperiode)
Ende der Wachstumsphase durch Tod der Wirtszellen
extrazellulär
PFU
/ml
12
102
104
106
108
24 36 48
Stunden
intrazellulär
Bsp: Adenovirus
Grundzüge der Virusvermehrung
Wirtszelle
ViruseintrittSpezifischer Wirt und spezifische ZelleRezeptor-vermittelt
Virusaustrittdurch Knospung oder Lyse der Zelle
UncoatingFreisetzung des Genoms
Replikationdes Genoms
Proteinsynthese
Non-enveloped enveloped
Montage und Freisetzung bei umhüllten und nicht-umhüllten Viren
Virusgenome kodieren Genprodukte und Informationen für
Partikelbildung und Verpackung des GenomsReplikation des VirusgenomsRegulation des Replikationszyklus (z.B. Umprogrammieren der Zellen)Ausschalten zellulärer AbwehrmechanismenVerbreitung auf andere Zellen und Wirtsorganismen
Virusgenome kodieren nicht
Proteinsynthese-Maschinerie (rRNA, Translationsfaktoren etc)Enzyme des EnergiestoffwechselsFaktoren der MembranbiosyntheseTelomere, Zentromere
Eigenschaften von Virusgenomen
Faktoren, die die Genomgrösse begrenzen
• Dauer der Genomreplikation
• Kapsidgrösse
• RNA-Stabilität
• Genauigkeit der viralen Polymerasen
Circoviridae1,7-2,3 kB ssDNA
Coronaviridae, 31 kB RNAMimivirus, 800 kBp DNA
Grösse viraler Genome
• DNA oder RNA• DNA mit kurzen RNA Segmenten• DNA oder RNA mit kovalent verknüpftem Protein• Einzelstrang DNA• Einzelstrang RNA: minus, plus, ambisense• Doppelstrang DNA oder RNA• Lineare DNA oder RNA• Zirkuläre DNA oder RNA• Segmentierte RNA• Doppelstrang DNA mit Unterbrechungen (gapped)
Variabilität von Virusgenomen
Klassifikation von Virusgenomen
GenomRNA-Viren
Plus-Strang (= mRNA)
Minus-Strang
Doppelstrang
DNA-Viren
Einzelstrang
Doppelstrang
Mit oder ohne Hülle (Envelope)umhüllt oder nackt
Segmentiertes oder nicht segmentiertes Genom
Klassifikation von Animalviren
Umhüllt Nackt
Pockenviren(Vaccinia, Variola, Molluscum contagiosum)
Herpesviren(HSV, VZV, EBV, CMV, HHV-6, -7, -8)
Hepadna-Viren(HBV)Retroviren(HIV, HTLV)
Orthomyxoviren(Influenza)
Paramyxoviren(Masern, Mumps,RSV, Parainfluenza)
Bunyaviren (Hanta)
Togaviren (Röteln)
Flaviviren(Gelbfieber, FSME, HCV, West-Nil-Virus, Dengue-V.)Arenaviren(Lassa)
Rhabdoviren(Tollwut)
Filoviren(Ebola, Marburg)
Coronaviren (SARS)
Adenoviren
Papovaviren(Papillom, JCV, BKV)
Parvoviren(B19, ssDNA)
dsRNAReoviren(Rota)
ssRNAPicornaviren(Polio, Rhino, Coxackie, HAV, FMDV)
Caliciviren (Noroviren: Norwalk)
DNA
RNA
Die Art des Genoms bestimmt den Replikationsweg
Virusgenom
Dient als mRNAPlusstrang RNA Viren
Virale RDRP transkribiert mRNAMinusstrang RNA Viren; dsRNA Viren
Virale RT schreibt Genom in dsDNA umTranskription von mRNA durch zelluläre DDRPRetroviren
Zelluläre DDRP synthetisiert mRNAdsDNA Viren außer Poxviren
Virale DDRP transkribiert mRNAPoxviren
Umschreiben des Genoms in dsDNA und Transkription durch zelluläre PolymerasenssDNA Viren
Klassifikation nach Replikationsstrategie:Unterschiedliche Wege vom Genom zur mRNA
Virale Replikationsstrategien („Baltimore-Schema“)
DNA Viren nutzenzelluläre DNA-Polymerasen
Replikation im Zellkern
Ausnahmen:Orthomyxo-, Bunyaviren: Nutzen splicing
Retroviren: Integration ins Zellgenom
Ausnahme Poxviren: Replikation im Zytoplasma;haben eigene Replikationsenzyme
Die Replikationsstrategie bestimmt den Ort der Replikation
RNA Viren benötigen eigene Polymerasen
Replikation im Zytoplasma
Grundlegende Eigenschaften des Replikationszyklus werden definiert durch:Polarität des RNA-Genoms
+Strang RNA: entspricht der mRNA-Strang RNA: komplementär zur mRNAAmbisense: eine RNA wird in beide Richtungen abgelesen
RNA-Genome können segmentiert vorliegenInfluenzavirus Genom besteht aus 8 -Strang RNA-Molekülen
RNA Viren
AUG.....................................UAA5‘ 3‘+
Plus-Strang: Genom = mRNA
UAC.....................................AUU3‘ 5‘-
Minus-Strang: Antigenom = mRNA
AUG.....................................UAA5‘ 3‘+
AUG..................UAA UUA.................. CAU5‘ 3‘
UAC..................AUU AAU..................GUA3‘ 5‘
Ambisense: Genom und Antigenom = mRNA
Genompolarität von RNA Viren
VIRUSES
Virologische Diagnostik: Was kann ich nachweisen?
Erregernachweis
Virus• Virusanzucht: infektiöses Agens• Elektronenmikroskopie: Partikel
Virusbestandteile
Proteine• Immunfluoreszenz• Antigen-ELISA (EIA)• Western-Blot (Immunblot)
Nukleinsäure• PCR• RT-PCR
Immunantwort auf Virusinfektion
Antikörper gegen virale Proteine• Komplement-Bindungsreaktion• Hämagglutinations-Hemmtest• Antikörper-ELISA• Westernblot• Immunfluoreszenz
=> IgG, IgM, IgA
Antikörpernachweis
Direkter Virusnachweis
Elektronenmikroskop
Anzucht des Virus• im Tier• in embryonierten Hühnereiern• in Zellkultur: cytopathischer Effekt, CPE
Bestimmung des Virustiters• Plaque-Test• Endpunkt-Verdünnung
Virologische Diagnostik: Virusnachweis
Methoden zur Analyse der Partikelmorphologie
Electron Microscopy
isolated HIV cores
Negative stainParticles are fixed andstained;simple method, revealingfew structural details
mature HIV particle
Thin sectionParticles are fixed, embedded in plastic,stained and sectioned;only section of particlevisible
mature HIV particle
Cryo-EMUnfixed and unstained particles invitreous ice;little contrast, superimposition of3D structure, signal results directlyfrom density, computer-aidedanalysis gives high resolution
X-ray crystallographyVery high resolution (atomic details), butvery regular organization required polio virus
Cytopathogener (Zellschädigender) Effekt von Viren
Infektion von epithelialen HeLa-Zellen mit Poliovirus (Picornavirus)
Aufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion (in Stunden)
fortschreitende Lyse der Zellen
0 5,5
8 24Bildung von Riesenzellen (= Syncytien)nach retroviraler Infektion
Plaque-Test: Titrierung von Viren
Serielle Verdünnung desAusgangsmaterials
Ausbringen der Virus-Verdünnungen auf suszeptible Zellen
Überschichten mit zähem Methylcellulose-Medium, um die freie Diffusion der Viren zu verhindern.
Kreisförmige „Löcher“ (= Plaques) im Zellrasendurch lokal beschränkte Ausbreitung der Viren und Zellzerstörung
1:1061:104 1:105
Plaque-Test: Titration von Viren
Nachweis der Anzahl infektiöser Partikel in einer Lösung
Phänotypische Analyse von Virusmutanten (Plaque Morphologie)
Serologische Nachweismethoden
Nachweis antiviraler Antikörper
Enzym-Immunassay (ELISA, EIA)
Westernblot (Immunblot)
Immunfluoreszenz (direkt oder indirekt)
Hämagglutinations-Hemmtest
Komplement-Bindungsreaktion (KBR)
Antikörper-Nachweis: ELISA
Antikörper-ELISA
z.B.HIV-Suchtestanti-HBsanti-HBc etc.
Antikörper gegen einvirales Antigen
Virusnachweis: Immunfluoreszenz
Direkt an Patientenmaterial, z.B.:Influenza (Rachenabstich)CMV (Granulozyten)
Nach Kurzkultur, z.B.:Adenovirus in Fibroblasten-Zellinie MRC-5
Vor- und Nachteile verschiedener diagnostischer Verfahren
Diagnostisches FensterNicht quantitativ, nicht automatisierbar
Hohe Spezifität, Differenzierung möglich; Bestätigungstest
Western Blot
Diagnostisches Fenster bei akuten Infektionen; ‚Serumnarben‘
Automatisierbar; sensitiv; weitverbreitet; QualitätssicherungEtabliert; Suchtest
Ak-ELISA
Falsch Positive durch Kontamination möglich
Schnell; quantifizierbarPCRRT-PCR
Wenig sensitivSchnell; quantitativ; gut standardisierbar
Ag-ELISA
Auswertung schwer objektivierbar; nur für manche Erreger möglich
Schnell; Differenzierung möglichIF
Sehr insensitivTeure Ausstattung benötigt
‚Catch all‘, auch nicht kultivierbare Viren; keine virusspezifischen Reagentien benötigt
EM
Sehr langsam, teuer, schwierigAuch für unbekannte VirenBeweist Infektiösität
Virusanzucht
NachteileVorteile
Nächste Woche
Verlaufsformen viraler Infektionen
Virus-vermittelte Zellschädigung (CPE)