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VL SoSe 2016 “Zellbiologie und Physiologie der Pflanzen”

Prof. Dr. A. von Schaewen

Pflanzenzelle (Taiz/Zeiger: Kap.1, 3, 6, 15; und Buchanan et al.)

• „Sekretorisches System und Membran-Transport“

• „Zellwand: Struktur, Biosynthese & Dehnungswachstum der Zelle“

• „Cytoskelett“

Literatur:

Taiz & Zeiger „Physiologie der Pflanzen“ (Spektrum Verlag)Buchanan et al. “Biochemistry & Molecular Biology of Plants“ (American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, USA)Heldt & Pichulla “Pflanzenbiochemie” (Spektrum Verlag)Richter “Biochemie der Pflanzen” (Thieme Verlag)

Hauptunterschiede:• Plasmodesmata (ER verbindet alle Pflanzenzellen → Syncytium)• zentrale Vakuole (meist lytisch)• Zellwand (dynamisch)• Plastiden (verschiedene Typen)

Die tierische Zelle

Zellwand

Plasmo-desmata

Vakuole

Die pflanzliche Zelle

Chloroplast

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Primärwandaus Cellulose und Hemi-Cellulosen

Mittel-lamelle

Pektin-reiche Ecke

Die pflanzliche Zellwand

Apoplast

Cytosol

D) Haarzellen(bes. Epidermiszelle)

C) Xylem-Gefäß(ohne Protoplast)

Zellwände bestimmen die Form von PflanzenzellenBeispiele: Aufnahmen mit dem Raster-Elektronenmikroskop (REM)

A) Pollenkörner(einzelne Zellen)

B) Blütenblatt(Epidermiszellen)

Ohne Zellwand nehmen die Protoplasten einekugelige Form an (nach Inkubation mit Zellwand-auflösenden Enzymen in isotonischer Lösung, d.h. 0,5 M Mannitol, Sorbitol, oder künstl. Seewasser).

(ÜN in Pilz Enzym-Lösung)

Mesophyll-Protoplasten

Golgi-Apparat (GA) ER

GA + ER (überlagert) Chlorophyll

(CLSM-AufnahmenStephan Rips 2005, AG von Schaewen)

mit DNA transfizierte Protoplasten

Nach programmiertem

Zelltod

Blatt

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Cellulose-Fibrillen bestimmen die Wandtextur(„Armierung“ der Zellwandmatrix)

Jedes Jahr synthetisieren Pflanzen 1011 Tonnen Cellulose!

Vorlesung 2016

Abb. 15.6, Taiz/Zeiger „Physiologie der Pflanzen“

Struktur einer Cellulose-Mikrofibrille

Cellulose = β1�4 poly-Glucan

O-glykosidische Bindung des anomeren C1-(Aldehyd-) mit dem C4-Atom (OH-Gruppe) der nächsten Glc ⇒ gestrecktes Polymer!

Disaccharid Cellobiose (Wiederholungseinheit)

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Cellulose synthase proteins and their organization into complexes (CSCs)

Cellulose-Synthasen(CeS) bilden in der

Plasmamembran Komplexe aus je 6

Untereinheiten.

In Primärwänden: 2x CeS1, 2x CeS3, und

2x CeS6).

Diese geben nach außen Cellulose ab

(bilden parakristalline

Mikrofibrillen).

Dazu benötigen sie UDP-Glucose, welche

vom Cytosolenzymatisch

bereitgestellt wird (starke Senke für Kohlenhydrate).

Cellulose-Biosynthese an der Plasmamembran

Komplex aus 6 Cellulose-Synthase Untereinheiten

Cellulosefasern (β1→4-Polyglukane)

Kohlenhydrate Hexose- und Triose-Phosphate

(aus Plastiden)

UDP-Glc

Plasma-membran

„innen“

Cytosol

Zellwand

„außen“parakristalline Mikrofibrille

Saccharose-

Synthase

UDP-Glucose-

Pyrophosphorylase

Saccharose-

Phosphat-

Synthase

Import („sink“)

Export („source“)

engl.

Susy

CeS6

CeS3CeS

1

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Abb. 15.9 B, Taiz/Zeiger „Physiologie der Pflanzen“

CeS-Komplexe (CSC) bilden in der PM „Rosetten“ (und Felder)

Cellulose-Synthase

EM-Aufnahmen(Gefrierbruch-

Technik)

engl.

Susy

Die Ausrichtung der Cellulose-Fibrillen in der Zellwand (Textur) wird durch randständige (d.h. kortikale) Mikrotubuli (MT) vorgegeben, zwischen/an denen sich die „Rosetten“-Komplexe vorwärts schieben („Schienen“-Modell).

Vorlesung 2016

Abb. 15.7 u. 15.8, Taiz/Zeiger, „Physiologie der Pflanzen“

Cellulose-Textur und Mikrotubuli (⇒ das Zytoskelett gibt die Richtung vor!)

Aufsicht

Mikrotubulus

Lipid-doppelschicht

Quer-schnitt

Cellulose-Mikrofibrille

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Biosynthese und Assemblierung von CeS-Komplexen

SmaCC/MASC = Small or microtubule-associated cellulose synthase compartments

Originally described in: Desprez et al. (2007) Organization of cellulose synthase complexes involved in primary cell wall synthesis in Arabidopsis thaliana. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 104: 15572-77.

?

Arabidopsis-Mutanten mit Primärwand-Defekten

Typische Primärwand-Defekte zeigen:rsw1 = CeS1, Cellulose Synthase (PM)rsw2 = Kor1, β1,4-endo-Glucanase (PM)cob = Cobra, GPI-verankert (PM & Apoplast)

Aber auch:stt3a = OST-Untereinheit (ER)rsw3 = Glucosidase II (ERQC)cgl1 = GnTI, GlcNAc-Transferase I (Golgi)

⇒ Wie passt das zusammen?

Wildtyp

Mögliche Gemeinsamkeit:Defekt in N-Glykosylierung (einer sekretierten Protein-Komponente).

ABER welcher?!

(CeS nicht N-glykosyliert)

„radially swollen“

rsw-Phänotyp

der Wurzelspitze

rsw-Mutante(n)

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Cytosol

PM

Cellulose-Biosynthese startet an einem membrangebundenen Oligodextrin-Primer (= Sitosterol-β-Glucosid)

Korrigan (Kor1) ist eine β1,4-endo-Glucanase (8 N-Glykane)

Abb. verändert nach Read & Bacic; Peng et al. (2002), Science 295: 59-60 und 147-150.

Apoplast

UDP

UGT

UDP-

Sitosterol

Fru

CeScomplex

UDP

Saccharose + UDP

SuSy

CHO „sink“

Saccharose + UDP

UDP

CesAi

Fru

SuSy

KOR1

?

Typ I Typ II Typ IIITyp I Typ II Typ III

Typ IV Typ V Typ VITyp IV Typ V Typ VI

Sanger-Modell, modifiziert nach: Howell & Crine (1996). Trends in Biochemical Sciences 21: 171.

C

N

innen(Cytosol)

außen

N

C

außen

GPIP

N

Spaltstelle

innen(Cytosol)

Cobra ist ein GPI-verankertes Glykoprotein (9 mögliche N-Glykane)

• in Wurzelstreckungszone (polare Sekretion und Freisetzung?) • parallel zu kortikalen Microtubuli• Rolle bei anisotroper (gerichteter) Zellstreckung

• möglicherweise via Orientierung an Cellulose-Fibrillen

α-COB MT merge

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COBRA soll die Kristallisierung der Cellulose-Mikrofibrillen im Apoplasten erleichtern

From: Sorek et al. (2014) JBC 289(50):34911-34920.

Noch ist unklar, wie und wo Cobra rekrutiert wird

CTL1 (POM1) und CTL2 (je 3 N-Glykane)(Chitinase-like proteins)

CTL1 & CTL2 (funktionaläquivalent, wie KOR1 Typ II) beeinflussen die Cellulose-Biosynthese und sollen einewichtige Rolle für die Microfibrillen-Hemicellulose-Interaktion spielen.

„in“ Cytosol

„out“ Apoplast

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„innen“

GPI-Anker

Cellulose-Bindedomäne

„außen“

CobKOR1CTL1

Mikrotubuli (bedingen)

- Wandtextur

- Dehnungsrichtung

(wachsender Zellen)

cortikale Microtubuli(am Zellrand)

Plasma-Membran

Zell-wand

Cytosol

Cellulose-Mikrofibrillen

„Rosetten“-Komplex

�„guidance“

anisotrope Zellstreckung

Schienenmodell

Interaktion mitHemicellulose

ältere Cellulose-Mikrofibrille

Figure 2. Computational Modeling of CSI1 Protein Structure.A) Model of CSI1 protein colored by regions investigated in this article and specified on the bar.B) Putative interaction mode of CSI1 with CSC complex and microtubule. Within the CSI1 protein, the α-helices are red and the β-sheets are green.

From: Lei et al. (2015) The Plant Cell 27: 2926-2940.

Im Cytosol - CELLULOSE SYNTHASE INTERACTIVE1 (CSI1) (schnelles Recycling der CeS Komplexe an der PM)

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CSI1 verbindet CeS-Komplexe mit cortikalen Microtubuli

Figure 7. A Snapshot of the Localization and Trafficking Pathways of CSCs. The CSCs are believed to be assembled in the Golgi apparatus and then secreted to the PM through the TGN/EE. It is largely unknown how secretory vesicles (SV) containing CSCs fuse to the PM, an exocytosis process that may involve actin. Microtubules are involved in docking the secretory vesicle, as SmaCCs/MASCs were often observed to be associated with microtubules. CSI1 mediates the CSC-microtubule interaction. CSCs are internalized through AP2/CME. Newly endocytosed vesicles containing CSCs are predicted to be recycled to the PM through SmaCC-mediated fast recycling and TGN/EE-mediated slow recycling. From: Lei et al. (2015) The Plant Cell 27: 2926-2940.

?

AP2/CME = Assembly protein 2/ clathrin-mediated endocytosis

CSC = Cellulose synthase complex

PM = Plasma membrane

Wm = Wortmannin (Inhibitor)

Hemi-CellulosenQuervernetzer („crosslinker“) der Cellulose-Fibrillen

Hemi-Cellulosen sind komplexe, z.T. verzweigte Polysaccharide (bestehen überwiegend aus Glucose, Mannose, Xylose und Galaktose)

Hemi-Cellulosen sind direkt mit den Cellulose-Mikrofibrillen assoziiert.

A. (Galakto)-Gluco-Mannan

B. Galakto-MannanHemi-

Cellulose-Fibrillen

Vorlesung 2016

Abb. aus: Taiz/Zeiger, Physiologie der Pflanzen (li.) & Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Mol. Biology of Plants“, ASPP (re.).

Verzweigungen: α1→6

Rückgrad (linear): β1→4

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Vorlesung 2016

Abb. aus: Taiz/Zeiger, Physiologie der Pflanzen (li.) & Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Mol. Biology of Plants“, ASPP (re.).

• Hydratisierung (durch Bindung von Wasser) via nicht-veresterte Carboxyl-Gruppen (saure Polygalakturonane)

• Gel-artige Netzwerke (durch Salzbrücken zwischen benachbarten Carboxyl-Gruppen: -COO-…+Ca+…-OOC-)

• Methyl-veresterte Carboxyl-Gruppen (unpolare Region)

• Seitenketten („Bürstenstruktur“) verhindern auch die Ausbildung von Netzwerken � so entstehen Poren/Kanäle

Pektine bilden die Zellwand-Matrix

sekretierte Strukturproteine (hier: Extensine)interagieren mit

Kohlenhydrat-Komponenten der

Zellwand (wahrscheinlich über

O-Glykane)

Pektine

-CH3

-CH3

-CH3

-CH3

Ca2+

Ca2+

Gel-artige Region

Ca2+

Ca2+

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Am. Soc. of Plant Physiologists.

Zellwand-BiosyntheseResultat des Zusammenspielsmehrerer Einzelvorgänge

• Synthese von sekretierten und Membran-ständigen Proteinen erfolgt am „rauen“ ER (N-/O-Glykosylierung, Faltung, Vesikel-Transport), N-Glykan-Modifikationen im Golgi-Apparat.

• Oligosaccharid-Synthese von Pektin-und Hemicellulose-Vorstufen erfolgt im Golgi-Apparat (Verknüpfung erst nach Sekretion, im Apoplasten)

• Synthese von Cellulose-Fibrillen erfolgt DIREKT an der Plasma-membran (via CeS „Rosetten“-Komplexe/Felder, gelenkt durch kortikale Mikrotubuli (�„guidance“)

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Die Textur wird im Wesentlichen durch die Zellwand-Architektur vorgegeben und ändert sich z.B. bei der Fruchtreife

Beispiele:

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biolology of Plants“, ASPP.

Speziell: Änderung der Wand-Textur

• Die mehlige Textur überreifer Äpfel resultiert aus einer „Zementierung“ der Mittellamellen (Pektin-Verfestigung) und gleichzeitigem Verlust von Zell-Zell-Kontakten.

• Die Wände des Pericarps reifender Pfirsiche schwellen an und werden weich (Synthese spezieller Enzyme durch hormonale Umsteuerung), während die der Samenhülle durch Lignin-Einlagerung verfestigt werden (sklerotisieren).

• Die Zellwände im reifenden Tomaten-Pericarp schwellen an und werden weich (desintegrieren enzymatisch).

Phenolisches Makromolekül aus Zimtsäuren und Zimtalkoholen (die im Sekundärmetabolismus gebildet werden). Nach gezielter Radikal-Bildung im Apoplasten (via reaktive Sauerstoff-Spezies, ROS) entsteht Lignin, verknüpft über diverse Ester- und Äther-Bindungen (polymerisiert autokatalytisch).

Lignin (Zellwand-Imprägnierung, u.a. des Xylems � „Holz“)

Sekundär-stoffwechsel

PAL

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Vorlesung 2015

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Lignin wird durch Phloroglucin-HCl „pink“ angefärbt !

Der Polymerisationsgrad der Phenolbausteine (sowie die kovalente Vernetzung des Lignins mit Cellulose und Hemi-Cellulosen) kann sehr unterschiedlich sein.

Dementsprechend variieren Struktur und mechanische Eigenschaften von Holz!

Vorlesung 2015Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Funktion von Zellwänden über den Tod hinaus (vgl. programmierter Zelltod im Xylemgewebe)

Samen-Verbreitung

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• die dicke Zellwand besteht fast ausschließlich aus Cellulose-Fibrillen

• bei Reifung kollabiert die restliche Zellwand (⇒ helikale Baumwollfaser)

Baumwolle ist ein Cellulose-Produkt (wie Papier)

Quelle: Wikipedia

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

AUSNAHME: „polares“ Spitzenwachstum (in Pflanzen selten)(nur bei Pollenschläuchen und Wurzelhaaren)

„Polares“ Wachstum (kaum

Cellulose) beruht auf:

• gerichtetem Vesikel-

Transport (Cytoskelett)

• Vesikel-Fusion am Pol

(lokal begrenzte Region)

• Aushärten der Flanken

(hauptsächlich Pektin)

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Zellstreckung IMMER quer zu den Mikrofibrillen

Vakuolen fusionieren (nehmen aktiv Teilchen

auf), Wasser strömt passiv nach � Osmose (auch bei Schließzellen)

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Interkalares Wachstum nach Zellwand-Dehnung

Spiralmodell:

Pflanzenzellen lassen sich nur quer zur ihrer Wand-Textur dehnen. Das „Ausdünnen“ bestehender Cellulose-Mikrofibrillen wird durch Biosynthese und Einlagerung von neuem Zellwandmaterial ausgeglichen

(Phytohormon gesteuerter Prozess ⇒ Auxin).

Plasma-membran

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Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

1. Aufbrechen der Quervernetzungen:

H+-ATPasen an der Plasmamembran werden aktiviert ⇒ pH-Abfall im Apoplasten:

• Expansine werden aktiv (Optimum im stark Sauren!) und brechen die Verbindungen zwischen Hemi- und Cellulose-Mikrofibrillen auf.

• XET (Xyloglucan-endo-Transglykosylase) spaltet Hemicellulose-Polymere hydrolytisch, bleibt danach gebunden und speichert einen Teil der frei werdenden Energie zwecks Verknüpfung nach dem Auseinanderweichen (fibrillar creep).

2. Neusynthese von Wandmaterial:

Verstärkte sekretorische Aktivität führt zur Neusynthese von Wandmaterial: Bildung von Cellulose-Synthase („Rosetten“-Komplexe) sowie Hemi-Cellulose- und Pektin-Vorstufen.

Mechanismus der Zellwand-Dehnung

„Triebkraft“ der Wanddehnung ist der Zell-Innendruck (Turgor)

Pflanzenhormone beeinflussen:

1. Richtung der Wanddehnung (Richtungsänderungen) durch Re-Orientierung von kortikalen Mikrotubuli (z.B. durch Ethylen)

2. Rate und Beginn der Wanddehnung durch Aufbrechen der Quervernetzungen (z.B. vermittelt durch Auxine, Gibberelline)

Phytohormone steuern die Zellwand-Dehnung

Auxine

• induzieren Zellstreckung (in bestimmten Zonen)

• Wachstumsbewegungen (von Pflanzenorganen)

z.B. bei Phototropismus, Gravitropismus, Suchbewegungen (Ranken)

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Vorlesung 2016 Abb. aus: Campbell „Biologie“, Spektrum-Verlag.

Protonen-Pumpen an der PM (H+-ATPasen) werden aktiviert.

Expansine arbeiten erst nach lokal starker Ansäuerung der Zellwand.

„Säure“-Streckungshypothese: Auxin-induzierte H+-Pumpen an der PM

„langsame“ Auxin-Wirkung

� induzierte Gen-Expression

Expansine

„schnelle“

Auxin-Wirkung

Zusammenfassung:

Stationen der Zellstreckung

• Initiation hormonelles Signal (Auxin)

• Ansäuerung des Apoplasten (Aktivierung von H+-ATPasen an der PM)

• Lösen von Quervernetzungen (zwischen Mikrofibrillen & Hemicellulosen)

• Zellstreckung quer zu den Mikrofibrillen (mehr Ionenpumpen ⇒ Osmose, auch Vakuolenfusion)

• Neusynthese von Wandmaterial (Einlagerung zwischen Mikrofibrillen)

Vorlesung 2016

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Zellwand-Bruchstücke als Signalmoleküle Bei der Infektion von Pflanzen mit pathogenen Pilzen lösen Hydrolasen (Cellulasen, Pektinasen) einen partiellen Abbau der Zellwände aus.

• Diese Wandfragmente werden von der Pflanze als Signalmoleküle (Elicitoren) wahrgenommen und lösen Abwehrprozesse aus (u.a. stimuliert dies die sekretorische Aktivität).

• Elicitoren werden durch spezielle Rezeptoren in der PM registriert und mithilfe von Signal-

kaskaden in den Zellkern weitergeleitet (spezifische Erkennung auf beiden Seiten).

Vorlesung 2016

Abb. 15.27 aus: Taiz/Zeiger „Physiologie der Pflanzen“, Spektrum Verlag.

Pilz-

zellwand

Pflanzen-

Zellwand

Cellulasen,

Pektinasen

Chitinasen &

Glukanasen„Plant wars“

fremder

Elicitor

eigener

Elicitor

WICHTIG:

Zeitliche Komponente

der Freisetzung/

Wahrnehmung