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Wirkungsbezogene Analytik –
Neue Konzepte für die Überwachung
und Lebensmittelsicherheit
Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen
Abteilung Lebensmittelsicherheit
Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin
Dr. Gabriele Böhmler
Lebensmittelinstitut Braunschweig
LAVES - Niedersachsen
Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 2
Lebensmittel gelten gemäß Artikel 14 VO (EG) Nr. 178/2002
als nicht sicher, wenn davon auszugehen ist, dass sie:
a) gesundheitsschädlich sind
b) für den Verzehr durch den Menschen ungeeignet sind.
Ziel: Inverkehrbringen von sicheren Lebensmitteln
Prof. Dr. Dr. A. Lampen – 11. Fachgespräch Lebens- und Futtermittelsicherheit, 03.09.2012 Page 3
Überwachung von Lebensmitteln
Aktuelle Untersuchungsstrategie
Planproben
Landeseigene Kontrollpläne
Bundesweiter Kontrollplan
Monitoring-Programme
Koordiniertes Überwachungs- programm der EU
Analyse einzelner, zuvor
ausgewählter Substanzen
Auswahl von Matrix/Stoffkombinationen
z.B. Phthalate in fettreichen Lebensmitteln
Ochratoxin A in Trockenobst
Pharmakologisch-wirksame Stoffe in Aal
Analytik
Einzelstoffanalytik
- physikalisch-chemische Verfahren
- immunchemische Verfahren
Nationaler Rückstandskontrollplan (2010)
55883 Proben untersucht – 0,91 % pos.
z.B. Antibiotikarückstände – 0,1 % pos.
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Ziel: In Verkehr bringen von sicheren Lebensmittel
Pflanzenschutzmittel
Mykotoxine
Bakterientoxine
Dioxine/dl PCBs
Pharmakologisch wirksame Stoffe
Allergene
Migrierende Stoffe
Schwermetalle
Acrylamid/Furane
PAKs
Substanz
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Ansatz der wirkungsbezogenen Analytik
Reproduktions-toxizität
Zytotoxizität
Genotoxizität/Mutagenität
Rezeptorvermittelte Wirkung (estrogen, androgen, dioxinähnlich)
Tumorpromotion
Proben werden auf ihre gesundheitsrelevante Wirkung auf unterschiedliche Organismen (z.B. Zellen, Mikroorganismen) untersucht.
Wirkung Transcriptomics
Proteomics
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Biologische Testsysteme in der Wirkungsbezogenen Analytik
Zellkultur
Rezeptorbasierte Assays
- Estrogenrezeptor
(Brustkrebszellen – E-Screen)
- Ah-Rezeptor
(Rattenhepatomzellen)
Zytotoxizität
- Zelltod
Mikroorganismen
Gentoxizität/Mutagenität
- AMES-Test
Enzyme
Enzymhemmungsassays
- Acetylcholinesterase
(Carbamate/Organophosphate) Extraktion
Analyse mit biologischen Wirkungstests
Fraktionierung
Identifizierung (instrumentelle Analytik)
Untersuchungsweg
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Lebensmittelprobe
Extraktion
Auswahl des biologischen Testsystems
Zytotoxizität Genotoxizität/
Mutagenität
Reproduktionstoxizität/
Teratogenität
Rezeptorver-
mittelte Wirkung
Transkriptomics/
Proteomics
Tumor-
promotion
Work-Flow der Wirkungsbezogenen Analytik
Screening-Ansatz
Negative
Effekte
Positive
Effekte
Fraktionierung
Identifizierung der Substanz
durch klassisch analytische Methoden
Stopp der Analyse
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Vorteile der Wirkungsbezogenen Analytik
Detektion gesundheitsschädlicher Wirkstoffe in komplexen Gemischen
aufgrund deren Wirkung (Mischeffekte werden erkannt)
Bestimmung von Summenparametern (Screening)
Nachweis von Substanzen, die über das originäre chemisch-analytische
Untersuchungsspektrum hinausgehen
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Ah-receptor activation by B[a]P induce CYP1A1/1B1
nucleus
xenobiotic (f.e. PAH, dioxins)
Ah-receptor
ARNT
ARNT
enzyme
CYP1B1 mRNA
DNA
(DRE)
gene transcription enzyme
CYP1A1
AhR/ARNT/xeno-
biotic-complex
nuclear receptor: Aryl-hydrocarbone-receptor, AhR
(DRE = Dioxin response element, promoter)
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Prinzip eines Reportergen-Assays
REPORTERGEN RE
Luciferin LUMINOMETER
Testsubstanz
Luciferase
z. B. AhR, ER, PPAR, ...
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20
TCDD
B[k]F
x-f
old
in
du
ctio
n
Concentration in pM (log)
ungeräuchert 0,47
1,26
1,35
0,80
geräuchert, Rand 19,84 0,577
12,89
15,30
geräuchert, Mitte 8,85 0,251
10,52
CALUX-TEQ
(µg/kg
Frischfleisch)
B[a]P Gehalt
(µg/kg
Frischfleisch)
< Nachweis-
grenze
Konzentration von B[k]F in pM (log)
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6
x-f
ach
e I
nd
ukti
on
0
1
2
3
4
5
6
7
Quantifizierungs-grenze
EC50
min --> 0,8356 max --> 6,1809 logEC50 --> 3,0456 EC50 --> 1111 R2 --> 0,9981
R2 = 0,9192
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 5 10 15 20 25
CALUX-TEQ
B[a
]P-G
eh
alt
(G
C/M
S)
Detektion von PAK in Fleisch mittels Reportergen-Assay (AhR) X
-fa
ch
e In
du
kti
on
Konzentration in pM (log)
Konzentration von B[k]F in pM (log)
X-f
ac
he In
du
kti
on
Kuhn et al., Journal of Food Protection 2008
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ungeräuchert
n = 5
3 Std kalt
n = 6
6 Std kalt
n = 5
1 Std heiß
n = 7
3 Std heiß
n = 3
Sum
me d
er
16 E
FS
A-P
AK
(µ
g/k
g)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
ungeräuchert
n = 5 3 Std kalt
n = 6 6 Std kalt
n = 5 1 Std heiß
n = 7 3 Std heiß
n = 3
TC
DD
IE
Q (
ng/k
g)
Detektion von PAK in geräuchertem Schweinebauch
Kuhn et al.,
Journal of Food
Protection, 2009
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E2 Genistein Daidzein
concentration (log M)
x - fo
ld
ind
ucti
on
0
100
200
300
400
500
0 100 200 300 400 500 600
Gen
iste
in a
nd D
aidze
in
conte
nt
in
feed
(m
g/k
g)
estrogenic activity (EEQ µ g/kg feed )
alpha HEK
r 2 = 0.9488
p<0.05
beta HEK
r 2 = 0.9427
p<0.05
Aktivierung des Östrogenrezeptors (ER) X
-fach
e In
du
kti
on
Konzentration (log M)
Gen
iste
in-
un
d D
aid
zein
-Geh
alt
in F
utt
er
[mg
/kg
]
östrogene Aktivität [EEQ µg/kg Futter]
Winter et al., J Anim Physiol Anim Nutr (Berl). 2008
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Zusammenfassung und Ausblick
Lebensmittel müssen sicher sein (EU-Verordnung (EG) Nr. 178/2002)
• erfordert Lebensmittelmonitoring mit hohem Niveau an Sicherheit.
• effiziente und moderne biotechnologische Techniken können dazu beitragen
• Detektion bekannter und unbekannter Substanzgruppen mit potentiell
toxikologischer Wirkung durch Wirkungsbezogene Analytik möglich
• Validierungsstudien sind notwendig
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Extraktionsmethoden (Rohextrakte; gereinigte Extrakte) Matrixeffekte auf das Textsystem
- Maskierung der Effekte → Fraktionierung
- Zytotoxizität Sensitivität
Offene Fragen
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Zusammenfassung und Ausblick
Kommunikation bei der Anwendung und Entwicklung neuer biologischer
Teststrategien ist sinnvoll und erforderlich
Internationaler Workshop
Wirkungsbezogene Analytik
am 18.10.2012 in Berlin am BfR
EU Projekt BIOCOP (Prof. Elliot, Queens Univ.)
EU Projekt Conffidence (Dr. S. Weigel, RIKILT)
u.a.
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ISK
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SE
SS
ME
NT
Vielen Dank für Ihre
Aufmerksamkeit
Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen
Abteilung Lebensmittelsicherheit
Bundesinstitut für Risikobewertung
Thielallee 88-92 D-14195 Berlin
Tel. 0 30 - 84 12 - 0 Fax 0 30 - 84 12 - 47 41
[email protected] www.bfr.bund.de
Danksagung: Dr. Anke Ehlers,
Dr. Stefanie Hessel,
Dr. Torsten Buhrke