Die Angewandte Makromolekulare Chemie 91 (1981) 179- 187 (Nr. 1530)

Institut fur Angewandte Biophysik und Sektion Biowissenschaften, WB Biochemie der Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberg (DDR)

VEB Chemiekombinat Bitterfeld, Forschungsabt. Ionenaustauscher (DDR)

Zum EinfluS von Ultraschall auf die Oberflachenporositat von Polystyrol-Enzym-Tragern

Peter Schmidt, Jens Fischer, Eike Rosenfeld, Rudolf Millner, Klaus Haupke und Alfred Schellenberger

(Eingegangen am 13. November 1980)

ZUSAMMENFASSUNG: Die Porositat der auBeren Partikeloberflache von makropordsen Polystyrol-

Enzym-Tragern lie0 sich durch Ultraschallbehandlung vergroBern, ohne daR die Kugelgestalt des im Suspensionsverfahren hergestellten Polymeren signifikant veran- dert wurde. Die hderungen in der Oberflachenstruktur des Polymeren wurden durch elektronenmikroskopische Aufnahmen nachgewiesen. Es wurde der EinfluB der Oberflachenporositat sowohl auf das katalytische Verhalten von immobilisierter a-Amylase als auch auf die Proteinadsorption der funktionalisierten Polystyrole untersucht. Die Resultate zeigten, daI3 der Transport von Stake und Protein in das Matrixinnere nach Ultraschallbehandlung der Polymeren begunstigt wird.

SUMMARY: The porosity of the external particle surface of macroreticular functionalized

polystyrenes used for enzyme immobilization could be increased by ultrasonic treatment. The spherical shape of the polymer prepared by suspension polymerization was not significantly changed by this procedure. The alterations of the surface structure of the polymer were detected by electron microscopy studies. The influence of the surface porosity in the catalytic behaviour of polystyrene-bound a-amylase as well as on the protein adsorption of the functionalized polymers was investigated. The results showed that the transport of starch and protein into the interior of the beads was favoured after ultrasonic treatment.

* Postanschrift: A. Schellenberger, Sektion Biowissenschaften, WB Biochemie der Martin-Luther-Universitat, DDR-4020 Halle/S., Domplatz 1.

0 1981 Hiithig& Wepf Verlag, Basel OOO3-3146/81/0097-0179$03.00/0 179

P. Schmidt, J . Fischer, E. Rosenfeld, R. Millner, K. Haupke und A. Schellenberger

Einleitung

Die Immobilisierung von Enzymen an unloslichen polymeren Tragermate- rialien hat sich als wertvolle Bereicherung der praktischen und theoretischen Enzymologie erwiesen. Neben naturlichen organischen Polymeren und anor- ganischen Materialien wurde eine ganze Reihe von synthetischen organi- schen Polymeren als Enzymtrager eingesetzt. Besonders geeignet fur die Darstellung von immobilisierten Enzymen sind reaktive Polymere mit ma- kroporoser Struktur, die aufgrund ihrer grol3en inneren Oberflache ein ho- hes Proteinbindungsvermogen besitzen''2. Allerdings mu13 bei Verwendung poroser Tragermaterialien vielfach eine Effektivitatsminderung des immobi- lisierten Enzymsystems - insbesondere bei hoher Enzymbeladung und gro- 13en Tragerpartikeln - durch Porendiffusionseffekte in Kauf genommen werden3v4. Diffusionseffekte konnen auch dann eine Rolle spielen, wenn der Substrattransport in das Matrixinnere durch die Anzahl und GroBe der Poren an der aul3eren Oberflache eines Tragerpolymeren limitiert wird.

In dieser Arbeit wird uber den Einflun der au13eren Partikelstruktur von funktionalisierten makropordsen Polystyrolen sowohl auf das katalytische Verhalten von immobilisierter Amylase als auch auf die Proteinadsorption der Polymeren berichtet. Am Beispiel eines mit 10% 1,4-Divinylbenzol ver- netzten Polystyrols wird gezeigt, da13 sich die Porositat der Partikelober- flache durch Ultraschallbehandlung erhohen la&, ohne da13 dabei die fur die Anwendung vorteilhafte Kugelgestalt des im Suspensionsverfahren herge- stellten Polymeren signifikant verandert wird.

Experimenteller Teil

Herkunf t der Materialien

a-Amylase aus Asp. oryzae (Novo Industri A/S), Chymotrypsin (Spofa, Prag), Rinderserumalbumin (Serva, Heidelberg), ldsliche Sttirke nach Zulkowsky (Merck).

Darstellung des reaktiven Polymeren

Die Darstellung des makropordsen Polymeren aus Styrol und 10 Gew.-Vo 1,4-Di- vinylbenzol in Gegenwart von 45 Gew.-Vo n-Alkanen und 0,3 Gew.-Vo Azoisobut- tersaurenitril im Suspensionspolymerisationsverfahren sowie die Chlormethylierung des Produktes wurden an anderer Stelles beschrieben. Das Poly(chlormethylstyro1) (Cl-Gehalt 18,1070) wurde in 8Oproz. wariger Ethylendiaminlosung 16 h bei 80°C ge-

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EinfluJ von Ultraschall auf die Oberflachenporositat

riihrt und anschlieoend mit Wasser, 1 N HC1, Wasser, 0,5 N NaOH und Wasser ge- waschen. Aminogruppengehalt6 des Poly(ethylendiaminomethylstyro1s): 4,3 mmol/g, haufigster Porenradius: 70 nm, innere Oberfllche: 71 m2/g, Porenvolumen: 0,8 1 cm3/g. Zur Aktivierung wurde 1 g luftgetrocknetes Poly(ethylendiaminomethy1- styrol) rnit 400 mg 1,4-Benzochinon in 10 ml Methanol 1 h bei Raumtemperatur ge- riihrt. Das rotbraune Polymere wurde mit Methanol, Wasser und 0, l M Phosphat- puffer, pH 7,0, gewaschen und anschlienend zur Enzymkupplung eingesetzt.

Immobilisierung von Amylase

200 mg aktivierter Trager (Trockengewicht) wurden mit 7 mg Amylase in 3 ml 0,l M Phosphatpuffer, pH 7,0,3 h bei Raumtemperatur geriihrt. Die Proben wurden unter Riihren auf einer G3-Fritte mit 25 mM Acetatpuffer/l M NaCl, pH 53, und Wasser so lange gewaschen, bis im Waschwasser keine Enzymaktivitat mehr nach- weisbar war. Die Enzymbeladung des Polymeren wurde aus der Differenz der zur Kupplung eingesetzten und der ausgewaschenen Aktivitlt bestimmt.

A ktivitatsmessungen

Die Aktivitatsmessungen wurden in einem tempenerbaren FrittengefaD, das unter- halb des Frittenbodens mit einem Hahn verschlieDbar ist, unter Riihren bei 37°C durchgefiihrt. Um Zeit-Umsatzkurven zu erhalten, wurden 3 - 4 Enzymharzproben (10- 15 mg) mit 20 ml lproz. Stiirkelbsung in 25 mM Acetatpuffer, pH 5,5, 5-30 min inkubiert. Zur Aufnahme der v/S-Charakteristiken variierte die Starkekonzen- tration zwischen 5 und 50 g/l. Die Aktivitaten der Amylasederivate wurden aus der Zunahme der reduzierenden Gruppen (Bestimmung mit 3,5-Dinitrosalicylsaure durch Absorptionsmessung bei 530 nm7) unter Verwendung einer Maltose-Eichkurve ermit- telt. 1 U entspricht der Bildung von 1 pmol Maltose pro min.

Zeitabhangigkeit der Proteinadsorption

Jeweils 50 mg Poly(ethylendiaminomethylstyro1) bzw. Poly(hydroxymethylstyrol)8 wurden bei 25 "C 5 - 200 min mit 10 ml einer 0,02proz. Rinderserumalbumin- bzw. Chymotrypsinlosung in 0,l M Phosphatpuffer, pH 7,0, geriihrt. Die Abnahme der Proteinkonzentration im Uberstand der Proben wurde durch Absorptionsmessung bei 280 nm verfolgt.

Ultraschallbehandlung der Polymeren

100 mg trockenes funktionalisiertes Polystyrol wurden in 10 ml dest. Wasser suspendiert und im Wasserstrahlvakuum entgast. Die Beschallung der Proben erfolg-

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te mit einem Ultraschalldesintegrator, wie er am Institut fur Angewandte Biophysik der Martin-Luther-Universitat entwickelt wurde, in einer temperierbaren Beschal- lungskuvette bei 15 "C. Die Schallfrequenz betrug 22 kHz und die Schallintensitat 320 W/cm2. Nach der Beschallung wurde der uberstand dekantiert, die Proben mit Was- ser gewaschen, luftgetrocknet und gesiebt .

Ergebnisse und Diskussion

Fruhere Untersuchungen zur Optimierung von Polystyrolen als Trager fur immobilisierte Enzyme hatten gezeigt, darj makropordse aminomethylierte Polystyrole geeignete Enzymtrager darstellen5. Fur die hier beschriebenen Versuche wurde ein mit 10% Divinylbenzol vernetztes Polystyrol verwendet, das chlormethyliert und anschlierjend mit Ethylendiamin in den entsprechen- den schwach basischen Anionenaustauscher uberfuhrt wurde. Durch Reak- tion des Austauschers mit 1,4-Benzochinon wurde ein reaktives Derivat er- halten, das zur kovalenten Proteinbindung befahigt ist9. lo:

Um moglichst genaue Informationen uber die Struktur des Polymeren zu erhalten, wurden neben Porengrorje, Porenvolumen und Oberflache (s. Ex- perimenteller Teil) auch elektronenmikroskopische Aufnahmen zur Charak- terisierung herangezogen. Abb. 1 zeigt in einer transmissionselektronen- mikroskopischen Aufnahme die Randzone des Tragers, an dem das eisen- haltige Protein Ferritin (MG 445 000 g/mol) kovalent gebunden war. Die Ferritinmolekule sind als schwarze Punkte zu erkennen und ziehen sich so- wohl an der aurjeren Partikeloberflache als auch im Polymereninneren wie Perlenschnure an den Matrixstrukturen entlang. Auffdlig bei diesem aller- dings nur kleinen Ausschnitt der Randzone ist die im Vergleich zur aufge- lockerten Struktur im Polymereninneren relativ geschlossene aul3ere Ober- flache. Die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme (Abb. 2) verdeut- licht, dal3 die aul3ere Oberflache des Polymeren eine kompakte Schicht dar- stellt, die durch Spalten und Risse durchbrochen wird. Mit Durchmessern von 100 - 300 nm sind diese Offnungen fur den Durchtritt der Proteinmole- kule ausreichend grol3.

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Ein flu@ von Ultraschall au f die Oberflachenporositat

Abb. 1. TM-Aufnahme der Randzone von Polystyrol-Ferritin (20000 X).

Abb. 2. REM-Aufnahme der Partikeloberflilche von Poly(ethylendiaminomethy1- styrol) (1 500x).

Durch Behandlung mit Ultraschall gelingt es, die relativ geschlossene AuDenhaut des Polymeren zu entfernen, ohne daD die Kugelgestalt des Poly- styrols signifikant verandert wird. Die erosive Wirkung des Ultraschalls, die zum Aufbruch der Oberfliichenstruktur fuhrt, ist durch die Beschallungszeit und -intensitat steuerbar. Abb. 3a gibt in einer Rasteraufnahme eine Poly- styrolkugel nach 5 min Beschallungszeit wieder. Dabei sind noch Reste der ursprunglich glatten auneren Oberflache zu erkennen. Die Strukturunter- schiede zwischen auaerer Oberflache und Polymereninnerem stellen sich be- sonders deutlich in Abb. 3 b bei sarkerer VergrdDerung dar. Die Auflocke- rung der Polymerenoberflache durch Ultraschallbehandlung (Abb. 4a) im Vergleich zur Oberflachenstruktur des unbeschallten Polymeren (Abb. 4b) werden auch durch die Transmissionsaufnahmen der Randzone wiedergege-

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a) b)

Abb. 3. REM-Aufnahme von Poly(ethylendiaminomethylstyro1) nach 5 min Ultra- schallbehandlung, a) 215 x , b) 5000 x .

ben. Abb. 4a und 4b zeigen weiterhin, dafl das Polymereninnere durch den Ultraschall unter den gewahlten Bedingungen nicht verandert wird. In uber- einstimmung damit sind auch quecksilberporosimetrische Untersuchungen, die keine Unterschiede in der Porengroflenverteilung von beschalltem und unbeschalltem Polymeren ergaben.

a) b)

Abb. 4. TM-Aufnahmen der Randzone von Poly(ethylendiaminomethylstyro1) (3000 x), a) beschallt, b) unbehandelt.

Die Inhomogenitaten der Polystyrolstruktur , die sich in der Ausbildung einer dichten Grenzschicht auflern, werden offenbar durch sekundare Vor-

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EinfluJ von UItraschaN auf die Oberflachenporositiit

gange bei der Suspensionspolymerisation verursacht. iihnliche Unterschiede zwischen auDerer und innerer Struktur beobachteten auch Schliinsen und Manecke2 bei einem Copolymeren aus 4-Isothiocyanatostyrol und Acrylsau- re, das mit 1,4-Divinylbenzol vernetzt war. Allerdings sind die Verhaltnisse bei dem genannten Enzymtrager, der im Blockpolymerisationsverfahren her- gestellt und anschliehend mechanisch zerkleinert wurde, grundsatzlich ande- rer Natur als bei dem von uns verwendeten Trager.

Den EinfluD der durch Ultraschall veranderten Partikeloberflache von vernetztem Poly(ethylendiaminomethylstyro1) auf das katalytische Verhal- ten von immobilisierter Amylase sollen die folgenden Beispiele dokumentie- ren. Tab. 1 gibt die Abhangigkeit der Aktivitat von immobilisierter Amylase

Tab. 1 . Abhangigkeit der Aktivitat von Polystyrol-Amylase von der Beschallungs- zeit des Tragers. (Bedingungen: lproz. St&rkelosung in 25 mM Acetat- puffer, pH 5 , 5 , 37°C; Partikelgrone jeweils 0,3-0,s mm).

Beschallungs- zeit (min)

Enzym- beladung ( U * g - ' )

spezifische Aktivitat ( U * g - ' )

relative Aktivitat (Yo)

0 5

10 15 20

815 828 81 1 806 840

114 127 146 163 168

14,O 15,3 18,O 20,2 20,o

von der Beschallungszeit des Tragers wieder. Das funktionalisierte Polymere wurde unterschiedliche Zeiten beschallt, gesiebt, mit 1,4-Benzochinon akti- viert und anschlieDend mit dem Enzym umgesetzt. Da gleiche Korngrorjen (0,3 - 0,5 mm) verwendet wurden und die Enzymbeladung der Proben anna- hernd iibereinstimmt, kann der Anstieg der Enzymaktivitilt mit steigender Beschallungsdauer auf die zunehmend giinstigen Bedingungen beim Trans- port des makromolekularen Substrates in das Polymereninnere zuriickge- fiihrt werden.

Die im Vergleich zum unbeschallten Polymeren veranderten Diffusions- verhatnisse bei beschallten Proben spiegeln sich auch in der Abnahme der scheinbaren Michaeliskonstante Km,app wider. Aus der Lineweaver-Burk- Auftragung der experimentellen Daten (Abb. 5 ) wurde fur das unbehandelte

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Abb. 5 . Abhangigkeit der Maltosebildungsgeschwindigkeit v von der Stiirke- konzentration S fiir Polystyrol-Amylase (Lineweaver-Burk-Darstellung). ( o ) Trager mit Ultraschall behandelt (Enzymbeladung 865 U * g- I ) , ( 0 ) unbehandelte Probe (Enzymbeladung 880 U - ggl). Die PartikelgroBe be- trug 0,6-0,8 mm.

0 sb 120 180

zeit I mid

Abb. 6. Zeitabh~gigkeit der Adsorption von Chymotrypsin an unbehandeltem ( 0 ) und beschalltem Poly(hydroxymethylstyro1) (0) und von Rinder- serumalbumin an unbehandeltem Poly(ethylendiaminomethylstyro1) (A). Die Partikelgr6lJe betrug 0,3 - 0,s mm.

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EinfIuJ von UItraschaN auf die Oberfachenporositat

Enzymharz ein K,,,app-Wert von 23,8 g Starke/l, fiir das beschallte Derivat ein K,, ,,-Wert von 13,7 g/l ermittelt. Die theoretischen Maximalgeschwin- digkeiten betrugen fur die unbeschallte bzw. beschallte Probe 280 bzw. 276 pmol - min-I - g-l. Verglichen mit der Michaeliskonstante der loslichen Amylase (Km = 1,9 g/l) ist der &,app-Wert der beschallten Enzymharzprobe immer noch um den Faktor 7 erhoht. Dieses Verhalten deutet darauf hin, darj neben der Limitierung des Substrattransportes durch die Porenanzahl an der aul3eren Partikeloberflache weitere Faktoren wie Porendiffusion und sterische Effekte den heterogen katalysierten Starkeabbau beeinflussen.

h n l i c h wie der StQketransport wird auch der Transport von Proteinen in das Polymereninnere durch die Oberflachenporositat der verwendeten Poly- styrolderivate beeinfluat. Abb. 6 zeigt, dalj sich das Quasigleichgewicht der Adsorption von Rinderserumalbumin und Chymotrypsin an unbeschalltem Poly(ethylendiaminomethylstyro1) bzw . Poly(hydroxymethylstyro1) nach etwa 2 - 3 h, von Chymotrypsin am beschallten Poly(hydroxymethylstyro1) dagegen schon nach 30 min einstellt.

Wir danken Frau G . Trudschel und Herrn Dr. H. Kodderitsch (VEB Che- miekombinat Bitterfeld) fur die Anfertigung der TM-Aufnahmen sowie Herrn Dr. J. Vetter (Institut fur Festkorperphysik und Elektronenmikrosko- pie der AdW, Halle) fur die Anfertigung der REM-Aufnahmen.

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