neten Spektren treten bei -X- = --NMe--, -S- und -Se- am kurzwelligen Ende noch je ein energiereicher, mittelstarker Elektronenubergang auf. Die groBten Abweichungen zwischen berechneter und gemessener Anregungsenergie betragen bei der Hauptbande - 17 000 cni-l (-X- = -NMe-) und bei der n-Bande+llOO em-l (-X- = -8-). Die berechneten Oszillatorstarken geben den EinfluB des Briickenatoms -X- auf die gemessenen Intensitaten gut wieder: Die Hauptbande ist stets intensiver als die a-Bande, und bei -X- = -NMe- erreichen beideBanden ein relativesMaximum. Der EinfluB des Bruckenatoms auf die Wellenzahlen beider Ban- den wird von den Berechnungen richtig angegeben: Bei der &-

Bande ergibt sich die Reihenfolge VN < YS < Y S ~ < Y O ~ ) ; bei der Hauptbande unterscheidet sich nur die Stellung des N-Methyl- phenyl-cyanamids (gemessen: vSe < IN < YS < YO; berechnet: YN < vse < YS < YO). Alle XCN-Gruppen konnen auf Grund der Verschiebung ins langwelligere Gebiet, die sowohl die Haupt- als auch a-Bande des Benzols durch die Substitution mit ihnen er- fahren, als Donatoren bezeichnet werden [18], wobei die -NMeCN- Gruppe den starksten Donatorcharakter hat.

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Friedrich Ritschl, Zentralinstitut fur Physikalische Chemie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 1199 Berlin, Rudower Chaussee 5

eingegangen am 9. Januar 1978 ZCM 5914

4, Die wBande des Phenylselenocyanats ist nur noch als schwache Erhebung in der Flanke der Hauptbande zu erkennen. Das in Bild 1 gezeigte gemessene Spektrum deckt sich mit dem von Cordella und Paaserini [19] angegebenen.

.-

Zur Wechselwirkung von Proteinen rnit SiOs-Adsorbenzien Als Trager fdr immobilisierte Enzyme lassen sich Kieselgele mit unterschiedlirhen Texturen verwenden [1]-[3]. Wir haben das Adsorptionsverhalten der porosen Xerogele A (haufigstrr Porcndorchmesser 500 8, Porenvolunien > 1 cm3/g, Korndurchmesser 0,2-0,4 mm) und B (200 A; 0,96 cm3/g; 0,2-0,4 mm) [4] bzw. der Derivate B1-B3 (Tab. 1) gegenuber Proteinen untersucht. AuDerdem wurden Glucoamylose und Chymotrypsin kovalent an das reaktive Derivat B 4 gebunden und Aktivitat bzw. Stabilitat der Komplexe getestet.

Tabelle 1 Dnrgestellte Kieselgelderivate Kieselgel- 0-Si- (CH,),-R

Derivat R

B 1 -NH, B2 --NHCOCHa B 3 - NHCONH- (CH,), -NHCONH-p-C,H4-N=

N-CeH, B 4 p-Benzochinoyl- (2) -NH-

Derivat B1 (0,35 mmol NH,-Gruppenlg) wurde durch Umsetzung von B mit y-Aminopropyltriethoxysilan dargestellt [5]. B2, B3 und B4 wurden aus B1 mit Acetanhydrid, Hexamethylendiiso- cyanat und anschlieBend 4-Aminoazobenzol und 1,4-Benzochinon (vgl. [(;I) in Dioxan erhalten. Zur Bestimmung der Proteinadsorption wurden jeweils 100 mg Kieselgel bei 20°C rnit 10 ml 0,04%igen Losungen der Proteine in 0,OG M Phosphatpuffer, pH 7,0, bis zur Einstellung des Adsorp- tionsgleichgewichtes geruhrt. Die adsorbierten Proteinmengen (Tab. 2) wurden aus der Abnahme der Proteinkonzentration im Uberstand zur Absorptionsmessnng bei 280 nm ermittelt.

Tabelle 2 Proteinadsorption a n Kieselgel

adsorbierte Proteinmenge in mg/g Kieselgel Kieselgel Rinderserumalbumin Trypsin Chymotrypsin

A 27,6 B 8,6 B 1 5,l B2 0 B3 4,0

~~

28,3 27,8 17,4 18,8

0 0 l9,8 18,2

0 0,4

Die unsubstituierten Kieselgele A und B binden alle verwendeten Proteine. Das differenzierte Verhalten von B (Porendurchmesser 200 A) gegenuber Trypsin (MG 23 500) bzw. Chymotrypsin (MG 25000) einerseits und Rinderserumalbumin (MG 67 000) mde- rerseits hat sterische Ursachen. Eine Abhangigkeit der Adsorption von der Bruttoladung der Proteine wurde im Gegensatz zu poro- sem Glas [7] bei dem verwendeten Kieselgel nicht gefunden (vgl. A, Tab. 2). Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf der Chymu- trypsin-Adsorption a n A und B zeigten, daB das Protein nach einem Geschwindigkeitsgesetz 1. Ordnung adsorbiert wird. Die Halbwertszeit fur die Adsorption an A betragt 3,3 Min. und an B 14,5 Min., das Adsorptionsgleichgewicht stellt sich nach etwa 1 Stunde (A) bzw. 2 Stunden (B) ein. An das Derivat B 1 wird nur das anionische Rinderserumalbumin uber Wechselwirkungen rnit den NH,+-Gruppen am Kieselgel in signifikantem AusmaB gebunden, wahrend das ungeladene B 2 kein Protein adsorbiert (Tab. 2). Der Ruckgang der Adsorption bei B l und B2 ist mit der Blockierung der SiOH-Gruppen an der Kieselgeloberflache durch die Reaktion mit dem Silan er- klarbar. I m Unterschied zum silanisierten Kieselgel bleibt das Proteinadsorptionsvermogen bei entsprechend substituierten po- rosen Gliisern auf Grund der hoheren Oberfl5chenpolaritat (Rest- borgehalt) erhalten [8], [9]. Derivat B 3 sollte die Proteine bevorzugt uber hydrophobe Wech- selwirkungen adsorbieren [lo]. Durch den Raumbedarf des Li- ganden in B 3 wird Rinderserumalbumin trotz ausgepragter hy- drophober Bereiche an der Proteinoberfllche nur in geringem AusmaD gebunden - (Tab. 2).

413

Reaktionszyklus

Bild 1 Operationsstabilitat von B-Glucoamylase - o -, B-Glucoamylase/Glutaraldehyd -0 - nnd B 4-Glucoamylase - A -

Am Beispiel der enzymatischen Hydrolyse von Starke in Glucose mit adsorptiv an Kieselgel B gebundener Glucoamylose (MG 50000) wurde die Stabilitat solcher Konjugate unter Reaktions- bedingungen (45°C; 1% Stiirke; pH 4,5; 20 Min. Inkubations- dauer) getestet. Die Werte in Bild 1 zeigen, daR die Aktivitat des Konjugates bei wiederholter Verwendung durch Desorption des Enzyms von Kieselgel rasch abnimmt. Ein stabileres Produkt wurde durch intermolekulare Vernetzung der adsorptiv an B ge- bundenen Glucoamylose mit Glutaraldehyd erhalten (Bild l, Tab. 3).

Tabelle 3 von Kieselgel-Enzymen

Gebundene Proteinmengen und relative Aktivitaten

Kieselgel-Euzym geb. Proteinmenge wirksame Alrtivitat in mg/g Trlger gebundene Aktivitat

in yo B-Glucoamylase 51 (Glut) B4-Glucoamylase 46 B 4-Chymotrypsin 31

31

45 33

Stabil und enzymatisch aktiv waren auch kovalent an B 4 ge- bundene Glucoamylose und Chymotrypsin (Substrat: N-Glut- aryl-phenylalanin-4-nitroanilid), die durch Umsetzung der En- zyme mit B 4 bei pH 7,O dargestellt wurden (Bild 1, Tab. 3).

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eingegangen am 10. Januar 1978 ZCM 5927

Zur Reinigung der Di-(2-ethylhexy1)-phosphorsaure Die Di(2-ethylhexy1)-phosphorsaure (HDEHP) enthalt abhangig von den angewandten Darstellungs- und Reinigungsverfahren variable bIengen an bIono-(2-ethylhexyl)-phosphorsiiure, 2-Ethyl- hexanol, anderen Alkoholen, Phosphnten, Polyphospha.t,en, Pyro- phosphaten, nbcr auch andere organische Verunreinigungen sowie FeIII-Ionen als weitere anorganische Verunreinigung. Der beson- ders starke EinfluB der Verunreinigungen anf die Eigenschaften der HDEHP bei ihrer Verwendung als Extraktionsmittel 11Bt uns eine zusatzliche Reinigungsoperation auch bei reinen Handels- produkten als notig erscheinen. Fur die Laborpraxis wird daruber hinaus eine Methode benotigt, die generell fur die Reindarstellung der Skure einsetzbar ist. Von den zahlreichen Methoden zur Entfernung der in der HDEHP vorhandenen kleinen Mengen an Verunreinigungen [1]-[3] hat sich in den letzten Jahren eine Methode, bei der Cu(DEHP), aus- f l l l t [3], besonders bewahrt [4], [5]. In der vorliegenden Arbeit wird iiber die Reinigung von stark ver- unreinigter HDEHP berichtet. Das Extraktionsmittel hatte eine intensiv braune Farbe infolge der enthaltenen FeIII-Mengen und bestand gemal) einer potentiometrischen Titration mit 0,05 M NaOH in Gegenwart von Ethanol-Wasser (80 Gew.-% Ethanol) aus ungefahr 75% HDEHP und 5yo H,MEHP (diese Daten sind wegen des hohen Gehaltes an Fe1I1-Ionen nur von orientierendem Wert). Die Anwendung der Methoden, die in [I] und [2] beschrieben wer- den, basierend auf der Verteilung der Stoffe zwischen nichtmisch- baren flussigen Phasen, war wegen der Menge und der Natur der Verunreinigungen nicht erfolgreich. Bei der Reinigung der Siiure nach dem in [3] beschriebenen ur- spriinglichen Verfahren entstand nach der Sattigung des Pro- dukts in Diethylether rnit CdI-Ionen und bei der nachfolgenden Vorarbeitung der organischen Phase mit Aceton statt eines Nie- derschlnges von Cu(DEHP), eine zweite, schwerere dunkelblaue Phase, bei deren Beseitigung und Verarbeitung Schwierigkeiten auftraten. AuBerdem war die erhaltene HDEHP mit FelI1-Ionen, H,MEHP u.a. stark verunreinigt, so daB eine Wiederholung der Reinigung nach [3] erforderlich war. Ein Arbeiten nach der in [3] gegebenen Vorschrift erfordert natur- lich die Anwendung von reinen Reagenzien. Insbesondere mussen sie frei von Eisen(II1) sein. Besonders mu13 darauf bei dem fur den ProzeB: HDEHP 7 Cu(DEHP), verwendeten Cu-Salz (in der Regel CuSO,) geachtet werden. Erfolgreich wurde von uns die folgende Modifikation der Vor- schrift nach [3] angewandt : Das Extraktionsmittel wurde jeweils mit gleichen Volumina der folgenden Medien gewaschen : 2 M HCI, Wasser, 0,3 M KI, 2 M HCI, Wasser. AnschlieBend wurden etwa 0,5 M HDEHP in Diethyl- ether mit Kupfer(I1) in Form einer gesattigten waSrigen Losung von CuSO, [man nimmt 20% UberschuR, bezogen auf die Herstel- lung von Cu(DEHP),] bei gleichzeitigem langsamem Zusatz von 5 M NaOH unter Ruhren der wadrigen Phase gesattigt. Am Ende sol1 die Losung einen pH-Wert von etwa 5,5 erreichen. Falls dabei eine groBe Menge bestandiger Flocken von Cu(OH), entsteht, wird unter vorsichtigem tropfenweisem Zusntz von 1 M HCI wieder gelost. Aus der isolierten organischen Phase fallt man unter Ruhren durch Zusatz von Aceton das Cu(DEHP), aus. Gegebenenfalls wird im Wasserstrahlpumpenvakuum etwas eingeengt. Man dekantiert die flussige Phase, wascht den Niederschlag 2- bis 3mal mit Aceton, filtriert und wascht abschlieBend nochmals mit Aceton. Der trockene Niederschlag wird in G M HCI gelost und die ent- stehende Saurephase mehrmals mit 6 M HC1 bis zur volligen Ent- fernung von CulI-Ionen gewaschen. Diese Operation wird dann noch einige Male rnit Wasser wiederholt. I m Scheidetrichter werden Wasser und Saurephase voneinander getrennt. Das reatliche Wasser kann dann im Wasserstrahlpumpenvakuum entfernt werden. Das entstandene Produkt (Ausbeute 55 bis 60%) ist eine klare farblose Flussigkeit. Die potentiometrische Titration mit 0,05 M NaOH zeigte fur die gereinigte HDEHP ein Molekulargewicht yon 323 2 an und deutete auf das Fehlen von Verunreinigun- gen hin. Die so erhaltene HDEHP wurde erfolgreich fur extraktionschro- matographische Untersuchungen der Seltenen Erden benutzt [6], [7]. Es konnte gezeigt werden, daB dasverfahren nach[3], aus-

414 Z. Clicrn., 18. Jg. (137s) IZr[t 11