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DIPLOMARBEIT

Titel der Diplomarbeit

Phytochemische Untersuchung von Eriosema laurentii

verfasst von

Tamara Scherzer

angestrebter akademischer Grad

Magistra der Pharmazie (Mag.pharm.)

Wien, 2014

Studienkennzahl lt. Studienblatt: A 449

Studienrichtung lt. Studienblatt: Diplomstudium Pharmazie

Betreuerin / Betreuer: ao. Univ.-Prof. Mag. Dr. Liselotte Krenn

Danksagung

Ich bedanke mich ganz herzlich bei Frau a.o. Univ.-Prof. Mag. Dr. Liselotte Krenn, für

die Bereitstellung dieses Diplomarbeitsthemas und für ihre hilfsbereite, freundliche

und lehrreiche Unterstützung während meiner gesamten Arbeit.

Bedanken möchte ich mich auch bei Frau Univ.-Prof. Dr. Verena Dirsch, Vorstand

des Departments für Pharmakognosie, für die zur Verfügungstellung eines

Arbeitsplatzes zur Durchführung meiner praktischen Tätigkeiten.

Bei der gesamten Arbeitsgruppe für Pharmakognosie möchte ich mich herzlichst für

die freundliche Aufnahme, die bedingungslose Hilfsbereitschaft und das angenehme

Arbeitsklima bedanken.

Mein Dank richtet sich auch an Herrn Dr. Martin Zehl und an Herrn Ass. Prof. Dr.

Hanspeter Kählig, die mir mit der Durchführung der MS – Analysen sowie der NMR –

Vermessungen dankbarerweise unter die Arme gegriffen haben.

Weiters möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, dass sie mir die Chance,

mittels ihrer finanziellen Unterstützung, boten, dieses Studium absolvieren zu können.

Sie hatten immer ein offenes Ohr für meine Probleme und waren mir in jeder

Lebenslage eine große Hilfe.

Bei all meinen Freunden möchte ich mich auf das Herzlichste für diese wirklich tolle

Studienzeit bedanken.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Zielsetzung 1

2 Material und Methoden 4

2.1 Material 4

2.2 Methoden 6 2.2.1 Säulenchromatographie (SC) 6 2.2.2 Dünnschichtchromatographie (DC) 7 2.2.3 Solid Phase Extraction (SPE) 8 2.2.4 High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 10 2.2.5 Präparative Dünnschichtchromatographie 12 2.2.6 LC-MS 12 2.2.7 Nuclear Magnetic Resonance – Spektroskopie 13

3 Ergebnisse 14

3.1 Säulenchromatographie (SC-1) 14

3.2 Solid Phase Extraction (SPE) 16 3.2.1 SPE-1 16 3.2.2 SPE-2 22 3.2.3 SPE-3 24 3.2.4 SPE-4 29 3.2.5 SPE-5 32 3.2.6 Präparative Dünnschichtchromatographie der Fraktion SPE-5 E 35

3.3 Säulenchromatographie (SC-2) 40

3.4 Identifizierung weiterer Komponenten mittels DC 43

4 Diskussion der Ergebnisse 46

5 Zusammenfassung 48

6 Summary 49

7 Literaturverzeichnis 50

8 Abbildungsverzeichnis 52

9 Tabellenverzeichnis 53

10 Curriculum Vitae 54

11 Anhang 55

1. Einleitung und Zielsetzung

1

1 Einleitung und Zielsetzung

Die Gattung Eriosema gehört zu den Fabaceae/Leguminosae

(Schmetterlingsblütlern) und ist in tropischen Gegenden verbreitet. Es werden

ungefähr 140 verschiedene Species dieser Gattung unterschieden [1,2].

Der in dieser Arbeit behandelte Vertreter der Gattung, Eriosema laurentii De Wild,

kommt ebenfalls aus einem tropischen Gebiet. Das Ausgangsmaterial dieser Arbeit

wurde in Kamerun (Zentralafrika) gesammelt.

Abbildung 1: Eriosema laurentii (Foto, Sylvain B. Ateba)

Verschiedene Vertreter der Gattung Eriosema (E. tuberosum, E. kraussianum, E.

rufum, E. laurentii,..) finden in der afrikanischen, chinesischen und

südamerikanischen traditionellen Medizin Verwendung [1]. In der Regel werden

Dekokte der Wurzeln oder Infusa mit heißer Milch [1,3] gegen


2

Harnwegserkrankungen und Hodenentzündungen, zur Linderung von

Tollwutsymptomen und als Antidiarrhoikum (E. tuberosum) [1,4], bei Unfruchtbarkeit

der Frau (E. rufum) [1], zur Behandlung von Impotenz sowie Harnwegsbeschwerden

(E. kraussianum) [2,5] verwendet.

In ähnlicher Weise wird Eriosema laurentii in der traditionellen afrikanischen Medizin

sowohl als fruchtbarkeitssteigerndes und potenzförderndes pflanzliches Mittel als

auch gegen menopausale Beschwerden und als „Aphrodisiakum“ eingesetzt [6].

In einer Untersuchung der Inhaltsstoffe von Eriosema glomeratum wurden prenylierte

Dihydrocalcone isoliert, die eine hemmende Aktivität gegen Mikroorganismen wie

Bacillus megaterium, Escherichia coli, Chlorella fusca und Microbotryum violaceum

aufwiesen [8].

Abbildung 2: Herbarbeleg von Eriosema laurentii [7]


3

Auch das Dichlormethan-Extrakt von der Wurzel der Eriosema tuberosum zeigte eine

antimykotische Aktivität gegen Cladosporium cucumerinum und Candida albicans [1].

In Untersuchungen von Eriosema kraussianum konnte ein Zusammenhang zwischen

bestimmten Inhaltstoffen und dem positiven Effekt bei Impotenz und erekiler

Dysfunktion nachgewiesen werden. Für den vasodilatierenden Effekt scheinen

Pyranoisoflavonoide (Kraussianone) verantwortlich zu sein [2-3,5].

In neuen Untersuchungen zur Wirkung der Inhaltstoffe aus Eriosema laurentii stellte

man in in vitro Versuchen in einem rekombinanten Hefe-Assay agonistische

Wirkungen am Östrogenrezeptor α und am Arylhydrocarbonrezeptor fest [9].

Bei in vivo Versuchen an ovariektomierten Ratten konnte keine unerwünschte

Proliferation des Endometriums durch ein Extrakt aus Eriosema laurentii

nachgewiesen werden. Sowohl der Verlust an Oberschenkelknochenmasse als auch

die vaginale Atrophie wurden verhindert. Ebenso senkte der methanolische Extrakt

aus den oberirdischen Anteilen der Pflanze die Total-Cholesterin- und LDL-

Cholesterin-Werte und steigerte das HDL-Cholesterin [10].

Zu den Sekundärstoffen von Eriosema laurentii lagen bisher keine Untersuchungen

vor. Dies und die vielfältige traditionelle Anwendung wurden zum Anlass genommen,

in einem Projekt und mehreren Diplomarbeiten methanolische Extrakte aus Eriosema

laurentii De Wild zu untersuchen [6,11].

Die Zielsetzung dieser Arbeit war es, aus schon vorhandenen Fraktionen eines

methanolischen Extraktes einzelne Komponenten zu isolieren und ihre Struktur zu

identifizieren.

2. Material und Methoden

4

2 Material und Methoden

2.1 Material

Das methanolische Extrakt aus den oberirdischen Anteilen von Eriosema laurentii

wurde in vorangegangenen Arbeiten mittels verschiedener Trennverfahren

fraktioniert. Mehrere Fraktionen sollten in dieser Diplomarbeit weiter aufgetrennt

werden.

Abbildung 3: Auftrennungsschema des Extraktes

Die Ausgangsfraktionen AF 1 bis AF 3 boten sich zur weiteren Untersuchung an, da

aufgrund der vorhandenen Menge und ihrer Zusammensetzung die Isolierung von

Einzelkomponenten möglich erschien.


5

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)

Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)

Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)

Ausgangsfraktion 1 und 2 wurden wegen ihrer ähnlichen Zusammensetzung

(Abbildung 4) vereinigt und mittels SC-1 weiter aufgetrennt.

Ausgangsfraktion Menge

AF 1 Cis 25-32 1,00g

AF 2 Cis 33-50 0,14g

AF 3 Cis 51-70 1,29g

AF1 AF2 AF3

Abbildung 4: DC verschiedener Fraktionen aus E. laurentii


6

2.2 Methoden

2.2.1 Säulenchromatographie (SC)

Für die Auftrennung der Fraktionen wurde die Säulenchromatographie eingesetzt,

wobei folgende Parameter verwendet wurden:

Tabelle 1: Bedingungen der SC-1

Stationäre Phase Sephadex® LH-20

Mobile Phase Elution mit MeOH-H2O (60:40)

Dimension Länge: 80cm; Ø 1,5cm

Durchflussrate 10ml/30min

Tabelle 2: Bedingungen der SC-2

Stationäre Phase Sephadex® LH-20

Mobile Phase Elution mit MeOH-H2O (50:50)

Dimension Länge:80cm; Ø 1,5cm

Durchflussrate 10ml/30min

Für das Säulenvolumen von ca. 380cm3 (80cm x 1,5cm x π) wurden ca. 190g

Sephadex® LH-20 3-4 Stunden in der mobilen Phase vorgequollen. Auf die gepackte

Säule wurde die Fraktion, gelöst in mobiler Phase, aufgetragen.


7

Die einzelnen Fraktionen wurden mit einem Fraktionssammler aufgefangen und jede

fünfte Fraktion mittels Dünnschichtchromatographie überprüft, um ähnliche

Fraktionen zu Sammelfraktionen vereinigen zu können.

2.2.2 Dünnschichtchromatographie (DC)

Mittels Dünnschichtchromatographie wurden die gesammelten Fraktionen überprüft

und vergleichende Untersuchungen mit Referenzsubstanzen durchgeführt.

2.2.2.1 Stationäre und mobile Phasen


Mobile Phasen: (1) Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)

(2) Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1)

Konzentration der Auftragslösung: 0,1mg der jeweiligen Substanz wurden in 100µl

Methanol gelöst und 10µl bandförmig aufgetragen.

Abbildung 5: Säulenchromatographie an Sephadex® LH-20


8

2.2.2.2 Detektionsverfahren

Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (NP/PEG 400)

Die DC-Platte wird mit einer 1%igen methanolischen Lösung von Naturstoffreagens

A (Diphenylboryloxyethylamin) und anschließend mit einer 5%igen Lösung von PEG

400 in Ethanol besprüht. Die Auswertung der Platte erfolgt unter UV-Licht bei einer

Wellenlänge von 366nm [12].

Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagens (AASS)

Für dieses Sprühreagenz werden 0,5 ml Anisaldehyd mit 10 ml konzentrierter

Essigsäure mit 85 ml Methanol versetzt und anschließend 5 ml konzentrierte

Schwefelsäure hinzugegeben.

Die DC-Platte wird mit dem Sprühreagens besprüht und bei 100°C im

Trockenschrank für 10 min erhitzt. Die DC-Platte wird bei Tageslicht ausgewertet [12].

2.2.3 Solid Phase Extraction (SPE)

Die Fraktionen SC-1 A, B, D+E, G und I wurden mittels Festphasenextraktion weiter

aufgetrennt. Ziel war es, einzelne Substanzen aus dem Komponentengemisch zu

isolieren und zu identifizieren.

Stationäre Phasen: (1) Bond elut® (Varian, Inc.) MEGA BE-C18; 5g; 20ml

(2) Phenomenex® Strata C-18 E; 500mg; 6ml

Mobile Phasen: (1) Methanol – H2O 50%-100%

(2) Methanol – H2O 30%-100%


9

Tabelle 3: Konditionierung und Elution mit mobiler Phase (1)

Elutionsmittel Methanol % H2O %

Konditionierung 2 Bettvolumen 0 100

2 Bettvolumen 100 0

2 Bettvolumen 50 50

Gradientenelution 3 Bettvolumen 50 50

3 Bettvolumen 60 40

3 Bettvolumen 70 30

3 Bettvolumen 80 20

3 Bettvolumen 90 10

3 Bettvolumen 100 0

Tabelle 4: Konditionierung und Elution mit mobiler Phase (2)

Elutionsmittel Methanol % H2O %

Konditionierung 2 Bettvolumen 0 100

2 Bettvolumen 100 0

2 Bettvolumen 30 70

Gradientenelution 3 Bettvolumen 30 70

3 Bettvolumen 40 60

3 Bettvolumen 50 50

3 Bettvolumen 60 40

3 Bettvolumen 70 30

3 Bettvolumen 80 20

3 Bettvolumen 90 10

3 Bettvolumen 100 0


10

2.2.4 High Performance Liquid Chromatographie (HPLC)

Zur Überprüfung der Reinheit der Substanzen wurde die HPLC herangezogen.

System: SHIMADZU

Pumpe: LC-20AD

Detektor: SPD M20A diode array detector

Column oven: CTO-20AC

Auto injector: SIL-20AC HT

Säule: Hypersil® BDS-C18, 5μm, 4.0 x 250mm (Fa. Agilent)

Mobile Phase: A: 0,03M Essigsäure (pH 3)

B: CH3CN/0,03M Essigsäure (pH 3) (80+20)

Konzentration der Analysen-Lösung: 1mg/ml

Abbildung 7: SPE unter vermindertem Druck

Abbildung 6: Bond elut® (Varian, Inc.) MEGA BE-C18;

5g; 20ml

Abbildung 8: Bereitung der mobilen Phase A


11

Gradient 1: 0%B 5min

0% - 100%B 60min

100%B 5min

100% - 0%B 1min


5% - 30%B 25min

30%B 5min

30%-50%B 15min

50%-100%B 5min

100%B 5min

100% - 5%B 1min


20% - 40%B 10min

40%B 3min

40% - 60%B 7min

60% - 100%B 30min

100%B 5min

100% - 20%B 1min


5% - 50%B 10min

50%B 5min

50% - 100%B 40min

100%B 5min

100% - 5%B 1min

Detektion: 254nm

Flussrate: 1,0ml/min

Injektionsvolumen: 10μl

Druck: 120bar

Temperatur: 25°C


12

2.2.5 Präparative Dünnschichtchromatographie

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatten (Merck) 20cmx20cm

Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1)

Die aufgetrennten Substanzen wurden vom Kieselgel mit 50ml 100%igem Methanol

unter 15 Minuten Behandlung im Ultraschallbad eluiert.

Die Lösung wurde durch Zentrifugation vom Kieselgel abgetrennt und der Überstand

unter vermindertem Druck zur Trockene gebracht.

2.2.6 LC-MS

Die Molekülmasse der isolierten Verbindungen wurde zur Aufklärung der Struktur

mittels Massenspektrometrie ermittelt.

Zur Bestimmung der molekularen Massen der einzelnen Substanzen wurden LC-MS-

Analysen auf einem Ultimate 3000 RSLC-Series System (Dionex, Germering,

Deutschland), das an ein 3D-Ionenfallen-Massenspektrometer mit einer orthogonalen

ESI-Quelle (HCT; Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) gekoppelt ist,

durchgeführt.

Der Elutionsfluss wurde ca. 1:4 vor der ESI-Quelle gesplittet, die mit folgenden

Einstellungen durchgeführt wurde: Kapillarspannung -3,7 kV, Vernebelungsgas 26 psi

(N2), Trockengasfluss 9 l/min (N2), und Trockengastemperatur 340°C.

Mehrstufenmassenspektren im Positiv-Ionenmodus bis zu MS4 wurden in einem

Abbildung 9: Banden unter UV 366nm

Abbildung 10: Abkratzen der einzelnen Banden


13

automatischen data-dependent acquisition (DDA) Modus mit Helium als

Kollisionsgas, einem Isolationsfenster von 4 Th und einer Fragmentierungsamplitude

von 1,0 V gemessen.

2.2.7 Nuclear Magnetic Resonance – Spektroskopie

Die NMR - Untersuchungen wurden auf einem Bruker Avance DRX 600 NMR –

Spektrometer mit einem 5mm QNP Probenkopf (1H, 13C, 19F, 31P) mit z –

Gradientenspule und automatischer Matching- und Tuning – Einheit durchgeführt.

Messtemperatur: 298 K

Lösungsmittel: CDCl3

Messfrequenz: 600,13 MHz für 1H – NMR bzw. 150,92 MHZ für 13C – NMR

Es wurden 1D- (1H-NMR, 13C-NMR) und gradient enhanced 2D - Experimente

(COSY, TOCSY, NOESY, HSQC, HMBC) durchgeführt.

3. Ergebnisse

14

3 Ergebnisse

3.1 Säulenchromatographie (SC-1)

Anhand der dünnschichtchromatographischen Darstellung der Ausgangsfraktionen

AF1 bis AF3 (Abbildung 4, Seite 5) war erkennbar, dass AF-1 und AF-2 sehr

ähnliche Zusammensetzungen aufwiesen. Deshalb wurden die Fraktionen vereinigt

(1,1g) und mittels SC-1 (Bedingungen siehe Tab. 1, Seite 6) weiter aufgetrennt.

Ziel der Säulenchromatographie war es, die Komponenten mit Rf-Werten zwischen

0,2 und 0,3 zu isolieren.

Insgesamt wurden 240 Fraktionen gesammelt und jede fünfte Fraktion

dünnschichtchromatographisch überprüft. Die Sammelfraktionen wurden nochmals

mittels Dünnschichtchromatographie analysiert (Abbildung 11).




A B C D E CO F G H I J K L M N O CO

CO=AF1+AF2

Abbildung 11: DC der Sammelfraktionen der SC-1

3. Ergebnisse

15

Tabelle 5: Sammelfraktionen aus SC-1

Die rot gekennzeichneten Sammelfraktionen wurden wie im nächsten Kapitel beschrieben,

mittels SPE weiter aufgetrennt.

Die polaren Komponenten der Sammelfraktionen A,B,D+E mit Rf-Werten zwischen

0,2 und 0,3 (Abbildung 11, S.14) sollten mittels SPE rein dargestellt werden. Auch

die apolareren Komponenten der Sammelfraktionen G mit dem Rf-Wert von ca. 0,45

und I mit den Rf-Werten von ca. 0,4 und 0,8 sollten aufgrund ihrer Konzentration

und der ausreichenden Menge der Fraktionen (Tabelle 5) isoliert werden.

Sammelfraktion Fraktionen Menge in mg

A 1-11 111,5

B 12-16 120,0

C 17-22 131,3

D 23-24 30,3

E 25-28 57,0

F 29 10,9

G 30-36 52,1

H 37-39 18,5

I 40-53 66,2

J 54-66 36,3

K 67-89 33,1

L 90-102 16,2

M 103-124 14,6

N 125-213 28,6

O 214-240 6,6

3. Ergebnisse

16

3.2 Solid Phase Extraction (SPE)

Tabelle 6: Mittels SPE weiter fraktionierte Sammelfraktionen

3.2.1 SPE-1

Ziel der SPE-1 war es, die stark grün fluoreszierende Komponente aus

Sammelfraktion A mit dem Rf-Wert von 0,23 (Abbildung 11, S.14) rein darzustellen.

Die Sammelfraktion A (111,5mg) wurde in 1ml Methanol gelöst und auf die

konditionierte Kartusche (Stationäre Phase (1) siehe Seite 8) aufgetragen. Die Elution

erfolgte unter den in Tabelle 3 auf Seite 9 angegebenen Bedingungen.

Die einzelnen Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie überprüft.

Fraktionen mit ähnlicher Zusammensetzung wurden zu Sammelfraktionen vereinigt

und nochmals dünnschichtchromatographisch dargestellt.

Sammelfraktion Menge in mg SPE

A 111,5 SPE1

B 120,0 SPE-2

D + E 87,3 SPE-3

G 52,1 SPE-4

I 66,2 SPE-5

3. Ergebnisse

17

Abbildung 12: DC der Sammelfraktionen der SPE-1




Tabelle 7: Sammelfraktionen der SPE-1

Sammelfraktionen Menge in mg

1 SPE-1 A 43,0

2 SPE-1 B 27,6

3 SPE-1 C 27,8

4 SPE-1 D 13,1

Die unter UV 366nm grün fluoreszierende Komponente bei Rf 0,23 war in Fraktion

SPE-1 C stark angereichert. Um die Reinheit der Substanz zu überprüfen, wurde

eine HPLC - Analyse durchgeführt.

1 2 3 4 CO

3. Ergebnisse

18

3.2.1.1 HPLC – Analyse der Sammelfraktion SPE-1 C

Durch die HPLC – Analyse (Abbildung 13) wurde festgestellt, dass die stark grün

fluoreszierende Bande (siehe Abbildung 12, S.17) in Sammelfraktion SPE-1 C einen

Hauptpeak bei einer Retentionszeit von 28,97 min in ausreichender Reinheit zeigte,

um weitere Analysen zur Strukturaufklärung durchführen zu können.

Abbildung 13: HPLC - Chromatogramm von SPE-1 C, Detektion bei 254nm, Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)

3. Ergebnisse

19

3.2.1.2 Strukturaufklärung der Substanz TS1 (= 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-methoxyluteolin)

In Sammelfraktion SPE-1 C lag Substanz TS 1 als überwiegende Komponente vor.

Um die Struktur klären zu können, wurden LC-MS-, 1H NMR-, 13C NMR-, HMBC-,

HSQC- und NOESY – Experimente durchgeführt.

Das MS-Spektrum des Positivionen-Modus (Anhang 1, S.55) zeigte den

Molekülionenpeak bei m/z 593,2, der im MS2 ein Fragment mit m/z 447,3 ergab.

Dieses Fragmentierungsmuster mit einer Differenz von 146 Da konnte einer

Abspaltung einer Desoxyhexose zugeordnet werden.

Das MS-Spektrum im Negativionen - Modus (Anhang 2, S.56) zeigte folglich den

Massenpeak bei m/z 591,1. Das Fragmentierungsmuster im MS3 scan

kennzeichnete einen Verlust einer Methylgruppe.

1H NMR-Spektrum: Die Protonen an C-3 und C-8 eines Flavons kamen als Singletts

bei δ = 6,647 ppm und δ = 6,557 ppm zur Resonanz. Daraus konnte eine

Substitution von C-6 des Flavons abgeleitet werden.

Ein weiteres Singulett bei δ = 3,96 ppm war einer Methoxygruppe zuzuordnen. Das

Vorliegen zweier Dubletts und eines Doppeldubletts bei δ = 7,481 ppm, δ = 6,935

ppm und δ = 7,513 ppm zeigte die zweifache Substitution von Ring B des Flavonoids

in Position 3‘ und 4‘.

Die Protonen zweier anomerer Protonen wurden bei δ = 4,927 ppm und δ = 5,189

ppm detektiert. Die Verschiebungen der Protonen an C6“ und C6‘‘‘ δ = 1,295 ppm

und δ = 0,720 ppm bewiesen das Vorliegen zweier Desoxyhexosen (Anhang 3-5,

S.57-59).

Im 13C NMR-Spektrum (Anhang 6, S.60) wurde das Vorliegen eines Flavons, das

an C-6, C-3‘ und C-4‘ Substituenten trägt, bestätigt. Aus dem Crosspeak eines

anomeren Protons mit C-6 im HMBC konnte die Verknüpfung der Zuckerkette über

C-6 gesichert werden. Aus dem Crosspeak der Protonen der Methylgruppe mit C-3‘

ergab sich das Vorliegen einer Methoxygruppe an C-3‘.

Aus den Verschiebungen und Kopplungen der Zuckerprotonen war 2‘‘-O-α-

Rhamnosyl-fucose als Zuckerkomponente zu identifizieren.

3. Ergebnisse

20

Substanz TS 1 wurde damit als 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-methoxyluteolin

identifiziert. Diese Substanz war schon in Zea mays als 4“-OH-3‘-Methoxymaysin

nachgewiesen worden [13].

3. Ergebnisse

21

Substanz TS 1

1H (ppm) JH.H (Hz) 13C (ppm) 2 C - - 166.11 3 CH 6.647 s 104.35 4 C - - 184.12 4a C - - 105.47 5 C - - 160.69 6 C - - 110.00 7 C - - 164.68 8 CH 6.557 s 96.23 8a C - - 158.87 1‘ C - - 123.61 2‘ CH 7.481 d 2.2, breit 110.57 3‘ C - - 149.50 4‘ C - 152.16 5’ CH 6.935 d 8.4 116.79 6’ CH 7.513 dd 8.4 / d 2.2 121.77 OCH3 3.962 s 56.65

-Fucose 1’’ CH 4.927 d 9.8 73.63 2’’ CH 4.274 d 9.8 / d 9.1 75.79 3’’ CH 3.751 d 9.1 / d 2.7 77.69 4’’ CH 3.698 d 2.7 / d 0.7 73.99 5’’ CH 3.787 d 0.7 / q 6.5 76.21 6’’ CH3 1.295 d 6.5 17.19

-Rhamnose 1’’’ CH 5.189 d 1.6 (1H-13C 172.9 Hz) 102.31 2’’’ CH 3.861 d 1.6 / d 3.2 72.30 3’’’ CH 3.477 d 3.2 / d 9.5 72.07 4’’’ CH 3.105 d 9.5 / d 9.5 73.38 5’’’ CH 2.569 d 9.5 / q 6.2 69.85 6’’’ CH3 0.720 d 6.2 17.97

3. Ergebnisse

22

3.2.2 SPE-2

Sammelfraktion B (120mg) von SC-1 wurde mittels SPE-2 weiter aufgetrennt.

Die Fraktion wurde unter den Bedingungen wie in Tabelle 4 auf Seite 9 beschrieben,

an der stationären Phase (1) (S. 8) aufgetrennt.

Ziel der SPE-2 war es, die grün-blau fluoreszierenden Komponenten aus

Sammelfraktion B mit den Rf-Werten zwischen 0,12 und 0,3 (Abbildung 11, S.14)

zu fraktionieren.

Die einzelnen Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie überprüft,

Fraktionen mit ähnlicher qualitativer Zusammensetzung zu Sammelfraktionen

vereinigt und zur Kontrolle nochmals dünnschichtchromatographisch analysiert

(Abbildung 14).




Abbildung 14: DC der Sammelfraktionen der SPE-2

1 2 3 4 5 6 CO 7 8 9 10 11 12 13 CO 14

3. Ergebnisse

23

Tabelle 8: Sammelfraktionen der SPE-2

Sammelfraktion Menge in mg

1 SPE-2 A 4,7

2 SPE-2 B 5,0

3 SPE-2 C 13,4

4 SPE-2 D 18,0

5 SPE-2 E 10,1

6 SPE-2 F 12,2

7 SPE-2 G 12,0

8 SPE-2 H 16,3

9 SPE-2 I 7,4

10 SPE-2 J 5,6

11 SPE-2 K 4,9

12 SPE-2 L 6,2

13 SPE-2 M 1,9

14 SPE-2 N 2,3

Mit dieser Methode konnte keine zufriedenstellende Auftrennung der Komponenten

erreicht werden (Abbildung 14, S.22). Die Zusammensetzung der einzelnen

Fraktionen war sehr komplex und die Ausbeuten zu gering, um weitere Trennschritte

zur Isolierung von Einzelkomponenten durchzuführen.

3. Ergebnisse

24

3.2.3 SPE-3

Aufgrund der übereinstimmenden Zusammensetzung wurden die beiden

Sammelfraktionen D und E (87,3mg) von SC-1 (Abbildung 11, S. 14) vereinigt und

mittels SPE-3 weiter fraktioniert.




Ziel dieser Auftrennung war es, die unter UV 254nm stark löschende Komponente

bei dem Rf-Wert von ca. 0,26 zu isolieren.

Auf eine konditionierte Kartusche (Stationäre Phase (1) siehe Seite 8) wurde die

Fraktion, die in 1ml MeOH gelöst worden war, aufgetragen.

Die Elution erfolgte entsprechend den Bedingungen der Tabelle 4 auf Seite 9.

Abbildung 15: DC der Sammelfraktionen aus D und E von SC-1

D D+E E D D+E E D D+E E

254 nm vor dem Besprühen

366 nm vor dem Besprühen

366 nm nach dem Besprühen

3. Ergebnisse

25




Abbildung 16: DC der Sammelfraktionen von SPE-3

1 2 CO 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CO 12

Vor dem Besprühen bei UV 254nm

Nach dem Besprühen bei UV 366nm

3. Ergebnisse

26

Tabelle 9: Sammelfraktionen von SPE-3

Die unter UV 254nm stark löschende Komponente war in SPE-3 B (Abbildung 16,

S. 25) weitgehend angereichert. Um die Reinheit der Substanz zu überprüfen, wurde

eine HPLC - Analyse durchgeführt


1 SPE-3 A 2,0

2 SPE-3 B 9,3

3 SPE-3 C 5,8

4 SPE-3 D 6,6

5 SPE-3 E 4,4

6 SPE-3 F 14,3

7 SPE-3 G 6,6

8 SPE-3 H 8,6

9 SPE-3 I 5,4

10 SPE-3 J 2,3

11 SPE-3 K 1,8

12 SPE-3 L 4,8

3. Ergebnisse

27

3.2.3.1 HPLC – Analyse der Sammelfraktion SPE-3 B

Abbildung 17: HPLC - Chromatogramm von SPE-3 B, Detektion bei UV 254 nm, Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (sieheS.10)

Durch die HPLC – Analyse ließ sich feststellen, dass die grün fluoreszierende Bande

in Sammelfraktion SPE-3 B (Abbildung 17) weitgehend in reiner Form vorlag. Bei

der massenspektrometrischen Vermessung (Anhang 11, S.63) zeigte sich aufgrund

des Fragmentierungsmustes, dass es sich bei der Substanz um Genistin mit einem

Massenpeak von 433,1 m/z im Positivionen-Modus handelt. Dies wurde anhand

einer Vergleichs-DC (Abbildung 18, S.28) bestätigt. Diese Komponente war bereits

in einer vorangegangenen Diplomarbeit [6] in Eriosema laurentii nachgewiesen

worden.

3. Ergebnisse

28




Vor dem Besprühen bei 254nm

Nach dem Besprühen bei 366nm

Abbildung 18: Vergleichs-DC von SPE-3 B mit Genistin

3. Ergebnisse

29

3.2.4 SPE-4

Sammelfraktion G (52,1mg) von SC-1 wurde in 1ml Methanol gelöst und auf eine

konditionierte Kartusche (Stationäre Phase (2) siehe Seite 8) aufgetragen.


Ziel der SPE-4 war es, die intensiv blau fluoreszierende Komponente in

Sammelfraktion G (Abbildung 11, S.14) bei dem Rf-Wert von 0,47 rein darzustellen.


Fraktionen mit ähnlicher Zusammensetzung wurden zu Sammelfraktionen vereinigt

und nochmals dünnschichtchromatographisch kontrolliert (Abbildung 19).





1 2 3 4 5 CO 6 7 8 9

3. Ergebnisse

30


Die unter UV 366nm blau fluoreszierende Komponente in SPE-4 B (Abbildung 19,

S.29) schien weitgehend von den Begleitstoffen isoliert worden zu sein. Um die

Reinheit der Substanz zu überprüfen, wurde eine HPLC - Analyse (Abbildung 20,

S.31) durchgeführt.


1 SPE-4 A 1,2

2 SPE-4 B 0,3

3 SPE-4 C 9,7

4 SPE-4 D 20,2

5 SPE-4 E 11,2

6 SPE-4 F 2,3

7 SPE-4 G 3,1

8 SPE-4 H 0,9

9 SPE-4 I 1,8

3. Ergebnisse

31

3.2.4.1 HPLC – Analyse der Sammelfraktion SPE-4 B

In der dünnschichtchromatografischen Untersuchung erschien Fraktion SPE-4 B

(Abbildung 19, S.29) unter UV 366nm als stark hellblau fluoreszierende Bande

chromatographisch einheitlich. Jedoch zeigte die HPLC-Analyse (Abbildung 20)

zahlreiche Begleitstoffe. Eine Reindarstellung und eine Strukturaufklärung mittels

MS oder NMR waren aufgrund der geringen Substanzmenge nicht möglich.

Abbildung 20: HPLC - Chromatogramm von SPE-4 B, Detektion bei UV 254nm, Gradient 2

(siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)

3. Ergebnisse

32

3.2.5 SPE-5

Sammelfraktion I (66,2mg) von SC-1 wurde in 1ml Methanol gelöst und auf eine

konditionierte Kartusche (Stationäre Phase (1) siehe Seite 8) aufgetragen.


Ziel der SPE-5 war es, die unter UV 366nm hellgrün fuoreszierende Komponente in

Sammelfraktion I (Abbildung 11, S.14) rein darzustellen.


Fraktionen mit ähnlicher qualitativer Zusammensetzung wurden zu

Sammelfraktionen vereinigt und nochmals dünnschichtchromatographisch

analysiert.





1 2 3 4 CO 5 6 7

3. Ergebnisse

33



1 SPE-5 A 4,2

2 SPE-5 B 9,6

3 SPE-5 C 8,4

4 SPE-5 D 7,8

5 SPE-5 E 25,0

6 SPE-5 F 5,7

7 SPE-5 G 5,5

Die unter UV 366nm hellgrün fluoreszierende Komponente (Abbildung 21, S.32)

schien in Sammelfraktion 5 stark angereichert.

3. Ergebnisse

34

3.2.5.1 HPLC – Analyse der Sammelfraktion SPE-5 E

Um die Reinheit der Sammelfraktion SPE-5 E zu überprüfen, wurde eine HPLC

durchgeführt (Abbildung 22). Der Gradient 1 (siehe Seite 11) und die übrigen

Parameter zur Durchführung der HPLC sind im Kapitel 2.2.4 auf Seite10 bis 11

angegeben.

Aufgrund der HPLC – Analyse konnte man annehmen, dass die stark hellgrün

fluoreszierende Bande in Sammelfraktion SPE-5 E (siehe Abbildung 21, S.32) als

Hauptkomponente vorlag. Bei der massenspektrometischen Vermessung (Anhang

12 und 13, S.64-65) zeigte sich jedoch aufgrund des Fraktionierungsmusters, dass

es sich um mehrere sehr ähnliche Komponenten mit Massenpeaks von m/z 355 und

m/z 325 im Negativionen-Modus handelte. Den Unterschied von 30 m/z könnte eine

Methoxy - Gruppe ausmachen. Aufgrund dieses Resultats und der großen Ausbeute

(25mg) dieser Fraktion, erfolgte eine weitere Auftrennung mittels präparativer

Dünnschichtchromatographie.

Abbildung 22: HPLC - Chromatogramm von SPE-5 E, Detektion bei UV 254nm, Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)

a

b

3. Ergebnisse

35

3.2.6 Präparative Dünnschichtchromatographie der Fraktion SPE-5 E

Ziel dieser Auftrennung war es, die Komponenten der Sammelfraktion SPE-5 E

voneinander zu trennen. In Abbildung 23 ist Sammelfraktion SPE-5 E nochmals

dünnschichtchromatographisch dargestellt. Es sind unter UV 366nm nach dem

Besprühen drei stark fluoreszierende Banden zu sehen, die als Substanz E1 mit Rf

0,59, Substanz E2 mit Rf 0,65 und Substanz E3 mit Rf 0,7 bezeichnet wurden. Weil

die Bande E1 ohne Besprühen unter UV 366 nm oder unter UV 254 nm nicht sichtbar

war, wurde als Marker mit annähernd gleichem Rf-Wert Formononetin, das auch

ohne Besprühen fluoresziert, aufgetragen.



Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2 S.8)

1 = SPE-5 E 2 = Formononetin

Abbildung 23: Vorversuch zur präparativen Dünnschichtchromatographie von

Fraktion SPE-5 E

254 nm ohne

Besprühen

366 nm ohne

Besprühen

366 nm nach dem Besprühen

1 2 1 2 1 2

E3 E2 E1

3. Ergebnisse

36

In Kapitel 2.2.5 auf Seite 12 ist beschrieben, wie diese Auftrennung durchgeführt

wurde.

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte 20cmx20cm (Merck)

Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1) Es wurden auf 5 Kieselgelplatten jeweils 200µl der gelösten Fraktion gleichmäßig

aufgetragen. Nach dem Entwickeln und Markieren der Banden wurden die

Fraktionen abgekratzt und wie in Kapitel 2.2.5 auf Seite 12 beschrieben mit

Methanol extrahiert.

Abbildung 24: Präparative DC von Fraktion SPE-5 E mit Formononetin (F)

F

3. Ergebnisse

37




Tabelle 12: Fraktionen aus SPE-5 E

Da die Fraktion E2 in sehr geringer Menge und chromatographisch nicht einheitlich

vorlag, wurde keine Strukturaufklärung mittels NMR durchgeführt.

Isolierte Fraktionen

Menge in mg

E2 2,0

TS 3 7,9

E1 3,9

Abbildung 25: DC der isolierten Komponenten aus SPE-5 E

E2 TS 3 SPE-5 E E1

3. Ergebnisse

38

3.2.6.1 HPLC- Analyse von E1 und TS 3

Um die Reinheit der Fraktionen E1 und TS 3 zu überprüfen, wurden HPLC –

Analysen durchgeführt.

In der dünnschichtchromatografischen Untersuchung erschien Substanz E1

(Abbildung 25, S.37) unter UV 366nm als hellblau fluoreszierende Bande

chromatographisch einheitlich. Jedoch zeigte die HPLC-Analyse (Abbildung 26)

einige Verunreinigungen. Eine Reindarstellung und eine Strukturaufklärung mittels

MS oder NMR waren aufgrund der geringen Substanzmenge nicht möglich.

Abbildung 26: HPLC-Chromatogramm von E1, Detektion bei UV 254nm,

Gradient 4 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)

3. Ergebnisse

39

Aus dem HPLC - Chromatogramm ließ sich feststellen, dass die hellgrün

fluoreszierende Bande TS 3 (siehe Abbildung 25, S.37) eine Hauptkomponente

enthielt. Das Fragmentierungsmuster der MS – Analyse (Anhang 14 und 15, S.68-69)

zeigte jedoch, dass es sich um zwei sehr ähnliche Komponenten handelte, die

Molekülionenpeaks von 355 m/z und 325 m/z im Negativionen-Modus aufwiesen und

im Verhältnis 3:1 vorlagen. Es wurde vermutet, dass es sich hier um sehr ähnliche

Substanzen handelt, die sich jedoch durch eine Methoxygruppe unterscheiden.

Die genauen Strukturen dieses Gemisches konnten jedoch nicht mittels NMR ermittelt

werden.

Abbildung 27: HPLC-Chromatogramm von TS 3, Detektion bei UV 254nm,

Gradient 4 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)

3. Ergebnisse

40

3.3 Säulenchromatographie (SC-2) Mittels SC-2 sollten 1,29g der Fraktion AF-3 (Abbildung 4, S.5) aufgetrennt werden.

Die Bedingungen für die SC-2 sind in der Tabelle 2 auf Seite 6 beschrieben.

Ziel der SC-2 war es, die komplexe Fraktion AF-3 weiter zu fraktionieren, um danach

einzelne Komponenten isolieren zu können.

Insgesamt wurden 335 Fraktionen gesammelt, jede fünfte Fraktion

dünnschichtchromatographisch überprüft und ähnliche Fraktionen vereinigt. Die

Sammelfraktionen wurden nochmals mittels Dünnschichtchromatographie

analysiert (Abbilidung 28).

Abbildung 28: DC der Sammelfraktionen aus SC-2 vor dem Besprühen unter

UV 254 nm



Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400

Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagens (Kapitel 2.2.2.2, S.8)

A B C D E CO F G H I J K L M N O CO P Q R

3. Ergebnisse

41

Abbildung 29:DC der Sammelfraktionen aus SC-2 besprüht mit NP/PEG400

unter UV 366nm


Abbildung 30: DC der Sammelfraktionen aus SC-2 besprüht mit Anisaldehyd-

Schwefelsäure-Reagens im Tageslicht


3. Ergebnisse

42

Tabelle 13: Sammelfraktionen aus SC-2

Von den Fraktionen B bis F waren zu geringe Mengen vorhanden, sodass man keine

weiteren Auftrennungen zur Isolierung der einzelnen Substanzen durchführen konnte.

Unter UV 254nm (Abbildung 28, S.40) war in den Fraktionen G bis N eine starke

Löschung bei dem Rf-Wert von ca. 0,3 zu erkennen. Diese Substanz wurde als

Genistin (vgl. Startpunkte 1, 4, 6, 7, 11 im Vergleich mit 9 in Abbildung 33 und 34,

S.44) identifiziert, welches schon in einer vorangegangen Diplomarbeit [6]

aufgereinigt und identifiziert worden war. Aufgrund der starken Löschung dieser

Banden wurde darauf geschlossen, dass die anderen unter UV 254nm bzw. 366nm

sichtbaren Komponenten (Abbildung 29, S.41) in einer zu geringen Konzentration

vorlagen, um diese als Reinsubstanzen isolieren zu können.

Deshalb wurden einige dieser Fraktionen mit aus dieser Pflanze schon bekannten

Referenzsubstanzen verglichen (Kap. 3.4, S.43-45)

Sammelfraktion Fraktionen Menge in mg

A 1-27 30,0

B 28-33 6,3

C 34-37 3,5

D 38-42 9,3

E 43-47 15,5

F 48-51 19,3

G 52-58 50,2

H 59-72 115,5

I 73-92 74,7

J 93-117 43,5

K 118-162 148,3

L 163-230 92,3

M 231-268 44,8

N 269-293 113,2

O 294-298 48,0

P 299-310 41,1

Q 311-325 35,3

R 326-335 12,0

3. Ergebnisse

43

3.4 Identifizierung weiterer Komponenten mittels DC

Mittels DC wurden verschiedene Fraktionen mit authentischen Referenzsubstanzen

verglichen. Hierbei handelte es sich um die Isoflavone Formononetin, Biochanin A,

Genistein, 2-OH-Genistein und Daizein. Diese Substanzen wurden mit

Sammelfraktionen aufgetragen, die Banden mit ähnlichen Rf-Werten aufwiesen.



Es war zu erkennen, dass es keine Übereinstimmungen hinsichtlich der Rf-Werte

der Banden sowie der Fluoreszenz gab.

1 SC-2 K 9 Formononetin

2 SPE-5 E 10 Daizein

3 Formononetin 11 SC-2 K

4 Biochanin A 12 2-OH-Genistein

5 SPE-5 E 13 SC-2 I

6 Genistein 14 SC-1 G

7 SC-2 K 15 2 OH- Genistein

8 SC-2 N 16 SPE-5 E

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Abbildung 31: DC-Vergleich von Sammelfraktionen mit Referenzsubstanzen

nach dem Besprühen mit NP/PEG400

UV 366nm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Abbildung 32: DC-Vergleich

Referenzsubstanzen vor dem Besprühen

UV 366nm

3. Ergebnisse

44



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Abbildung 33: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen nach dem Besprühen

mit NP/PEG 400 unter UV 366nm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Abbildung 34: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen vor dem Besprühen bei

UV 254nm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Abbildung 35: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen nach dem Besprühen mit

AASS im Tageslicht

3. Ergebnisse

45

In dieser Vergleichs-DC wurden verschiedene Sammelfraktionen mit authentischen

Referenzsubstanzen sowie mit bereits identifizierten Substanzen aus einer

vorangegangenen Diplomarbeit [11] miteinander verglichen. Hierbei handelte es

sich um die Isoflavone Lupinalbin, Biochanin A, Genistin, und Daizein und KMU/A

(= Eriosemaon D), KMU/B (= 5,7-dihydroxy-2’-methoxy-6’’,6’’-dimethylpyrano (2’’,3’’

: 4’,5’) isoflavanon) und KMU/C (= 2-(2‘,4‘-dihydroxy-3‘-prenyl)-3,5,7-trihydroxy-6,8-

biprenyl-flavanon) [11]. Diese Substanzen wurden mit Sammelfraktionen

aufgetragen, die Banden mit ähnlichen Rf-Werten aufwiesen.

Es war zu erkennen, dass Genistin in allen Sammelfraktionen enthalten war.

Lupinalbin, Daizein sowie Biochanin A konnten nicht in den Sammelfraktionen

nachgewiesen werden. Auch mit den Substanzen KMU/A, KMU/B und KMU/C [11],

die nach dem Besprühen mit AASS bei Tageslicht grün, blau und rot erschienen,

konnte keine Übereinstimmung festgestellt werden (Abbildung 33-35, S.44).

1 SC-2 J 7 SC-2 M

2 Lupinalbin 8 KMU/A

3 Daizein 9 Genistin

4 SC-2 K 10 KMU/B

5 Biochanin A 11 SC-2 N

6 SC-2 L 12 KMU/C

5. Zusammenfassung

46

4 Diskussion der Ergebnisse

Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden Fraktionen eines methanolischen Extraktes

der oberirdischen Pflanzenteile von Eriosema laurentii durch unterschiedliche

Trennverfahren weiter aufgetrennt und bezüglich ihrer Inhaltsstoffe analysiert. Das

Ziel war es, Reinsubstanzen zu isolieren und zu identifizieren.

Es wurden 3 Ausgangsfraktionen in zwei Säulenchromatographien an Sephadex®

LH-20 fraktioniert. Die aus SC-1 entstandenen Sammelfraktionen A, B, D, E, G und I

(Abbildung 11, S.14) wurden mittels SPE-1 bis SPE-5 weiter aufgetrennt.

Die Sammelfraktion SPE-1 C zeigte nach dem Besprühen unter UV 366nm eine stark

grün fluoreszierende Bande bei einem Rf-Wert von 0,23 (Abbildung 12, S.17). Diese

Komponente konnte in einer ausreichenden Menge (27,8mg) und in weitgehend

reiner Form (Abbildung 13, S.18) isoliert werden. Weiterführende Untersuchungen zur

Strukturanalyse mittels LC-MS und NMR wurden durchgeführt.

Die Struktur von Substanz TS 1 konnte als 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-

methoxyluteolin analysiert werden, welches schon in Zea mays als 4“-OH-3‘-

Methoxymaysin identifiziert worden war [13].

In der Sammelfraktion SPE-3 B konnte das bereits in einer vorangegangenen

Diplomarbeit [6] in Eriosema laurentii nachgewiesene Genistin als Reinsubstanz

isoliert und identifiziert werden.

Die Sammelfraktionen aus SPE-2 und SPE-4 ließen aufgrund ihrer komplexen

Zusammensetzung sowie ihrer geringen Ausbeute keine Isolierung von

Reinsubstanzen zu.

Die Sammelfraktion SPE-5 E zeigte auf der DC nach dem Besprühen unter UV 366nm

eine intensiv hellgrün fluoreszierende Komponente (Abbildung 21, S.32). Bei der

Untersuchung dieser Fraktion mittels LC-MS stellte sich heraus, dass es sich um ein

Gemisch mehrerer Komponenten handelte. Es wurde eine präparative

Dünnschichtchromatographie durchgeführt, um die einzelnen Komponenten zu

erhalten.

5. Zusammenfassung

47

Obwohl die dabei isolierte Substanz TS 3 im HPLC - Spektrum (Abbildung 27, S.39)

eine Hauptkomponente enthielt, konnte mittels NMR die Struktur nicht aufgeklärt

werden.

Aus der SC-2 wurden weitgehend Sammelfraktionen gewonnen, die eine sehr

komplexe Zusammensetzung aufwiesen. Es wurde festgestellt, dass im Großteil der

Fraktionen Genistin als Hauptkomponente enthalten war und zu geringe Mengen zur

Verfügung standen, um weitere Arbeiten an diesen Fraktionen durchzuführen (Kapitel

3.3, S.40-42).

5. Zusammenfassung

48

5 Zusammenfassung

Vertreter der Gattung Eriosema werden in der traditionellen chinesischen,

afrikanischen sowie in der südamerikanischen Medizin in Form von Dekokten der

Wurzel gegen Harnwegserkrankungen, Diarrhoe, bei Unfruchtbarkeit der Frau und

zur Behandlung von Impotenz verwendet.

Eriosema laurentii aus der Familie der Fabaceae ist in tropischen Gegenden Afrikas

heimisch und findet in ähnlicher Weise in der traditionellen afrikanischen Medizin

sowohl als fruchtbarkeitssteigerndes und potenzförderndes pflanzliches Mittel als

auch gegen menopausale Beschwerden Verwendung.

In in vitro Versuchen stellte man agonistische Wirkungen der Inhaltstoffe aus

Eriosema laurentii am Östrogenrezeptor α und am Arylhydrocarbonrezeptor fest.

Bei in vivo Versuchen an ovariektomierten Ratten konnte keine unerwünschte

Proliferation des Endometriums nachgewiesen werden. Sowohl der Verlust an

Oberschenkelknochenmasse als auch die vaginale Atrophie wurden durch ein Extrakt

aus Eriosema laurentii verhindert. Damit konnten im Tierversuch positive Effekte des

Extraktes gegenüber durch Östrogenmangel bedingten Gesundheitsproblemen

bestätigt werden.

Diese Diplomarbeit stellt einen Teil eines Forschungsprojektes dar, das sich mit der

Identifizierung und Reindarstellung der Wirkstoffe dieser Pflanze beschäftigt.

Drei Fraktionen wurden mittels Säulenchromatographie an Sephadex® LH-20 weiter

aufgetrennt. Mehrere Sammelfraktionen aus SC-1 wurden mittels SPE weiter

fraktioniert, auf ihre Inhaltsstoffe dünnschichtchromatographisch überprüft und

angereicherte Substanzen mittels LC-MS und NMR-Spektrometrie untersucht.

Es konnte Substanz TS 1 rein dargestellt und als 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-

methoxyluteolin identifiziert werden.

6. Summary

49

6 Summary

Members of the genus Eriosema are used in traditional Chinese, African and South

American medicine in the form of decoctions of the roots against urinary disorders,

diarrhoea and to treat sterility in women and impotence.

Eriosema laurentii, a Fabaceae, is a common plant in the tropical areas of Africa and

is used in a similar way in traditional African medicine to increase fertility and virility

and to treat menopausal complaints.

In vitro analysis had shown agonistic effects of the extract and of compounds from

Eriosema laurentii at the estrogenreceptor α and the arylhydrocarbon receptor.

In in vivo tests in ovariectomized rats no maligne endometrial proliferation was

detected. The extract of Eriosema laurentii decreased the loss of femoral bone mass

and vaginal atrophy. Thus, in the animal studies positive effects of the extracts in

health problems occuring due to estrogen deficiency were confirmed.

This thesis represents a part of a research project which focussed on the identification

of active compounds of this plant.

Three fractions were further separated by column chromatography on Sephadex® LH

– 20. The resulting fractions of SC-1 were further separated by SPE, analysed by thin

layer chromatography and enriched fractions analysed by LC-MS and NMR

spectrometry.

Substance TS 1 was identified as 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-methoxyluteolin.

Literaturverzeichnis

50

7 Literaturverzeichnis [1] Ma WG, Fuzzati N, Li QS, Yang CR, Stoeckli-Evans H, Hostettmann K (1995)

Polyphenols from Eriosema tuberosum. Phytochemistry 39, 1049-1061

[2] Drewes SE, Horn MM, Munro OQ, Dhlamini JTB, Meyer JJM, Rakuambo NC

(2002) Pyrano-isoflavones with erectile-dysfunction activity from Eriosema

kraussianum. Phytochemistry 59, 739-747

[3] Ojewole JAO, Drewes SE, Khan F (2006) Vasodilatory and hypoglycaemic

effects of two pyrano-isoflavone extractives from Eriosema kraussianum N. E.

Br. [Fabaceae] rootstock in experimental rat models. Phytochemistry 67, 610-

617

[4] Ma WG, Fukushi Y, Hostettmann K, Tahara S (1998) Isoflavonoid glycosides

from Eriosema tuberosum. Phytochemistry 49, 251-254

[5] Drewes SE, Horn MM, Khan F, Munro OQ, Dhlamini JTB, Rakuambo C, Meyer

JJM (2004) Minor pyrano-isoflavones from Eriosema kraussianum: activity-,

structure-, and chemical reaction studies. Phytochemistry 65, 1955-1961

[6] Pichler G. Chemische Untersuchung von Eriosema laurentii. Diplomarbeit,

Universität Wien, 2013

[7] http://collections.mnh.si.edu/search/botany/

[8] Awouafack MD, Kouam SF, Hussain H, Ngama D, Tane P, Schulz B, Green IR,

Krohn K (2008) Antimicrobial prenylated dihydrochalcones from Eriosema

glomerata. Planta Medica 74, 50-54

[9] Ateba SB, Njamen D, Medjakovic S, Zehl M, Kaehlig H, Jungbauer A, Krenn L

(2014 Publikation in Vorbereitung) Lupinalbin A as the most potent estrogene

receptor α and arylhydrocarbon receptor agonist in Eriosema laurentii De Wild

(Leguminosae).

http://collections.mnh.si.edu/search/botany/

Literaturverzeichnis

51

[10] Ateba SB, Njamen D, Medjakovic S, Hobiger S, Mbanya JC, Jungbauer A,

Krenn L (2013) Eriosema laurentii De Wild (Leguminosae) methanol extract

has estrogenic properties and prevents menopausal symptoms in

ovarieectomized wistar rats. Journal of Ethnopharmacology 150, 298-307

[11] Ukowitz K. Isolierung von Sekundärstoffen aus Eriosema laurentii.

Diplomarbeit, Universität Wien 2013

[12] Wagner H, Bladt S, Zgainski EM, Drogenanalyse,

Dünnschichtchromatographische Analyse von Arzneidrogen. Spinger-

Verlag Berlin, 1983.

[13] Snook ME, Widstrom NW, Wiseman BR, Byme PF, Harwood JS, Costello CE

(1995) New C-4”-hydroxy derivatives of maysin and 3’ methoxymaysin

isolated from corn silks (Zea mays). Journal of Agricultural and Food

Chemistry 43, 2740-2745

Tabellenverzeichnis

52

8 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Eriosema laurentii (Foto, Sylvain B. Ateba) .......................................... 1 Abbildung 2: Herbarbeleg von Eriosema laurentii [7] ................................................ 2 Abbildung 3: Auftrennungsschema des Extraktes..................................................... 4 Abbildung 4: DC verschiedener Fraktionen aus E. laurentii ...................................... 5 Abbildung 5: Säulenchromatographie an Sephadex® LH-20 .................................... 7 Abbildung 6: Bond elut® (Varian, Inc.) MEGA BE-C18; 5g; 20ml ........................... 10 Abbildung 7: SPE unter vermindertem Druck ......................................................... 10 Abbildung 8: Bereitung der mobilen Phase A ......................................................... 10 Abbildung 9: Banden unter UV 366nm ................................................................... 12 Abbildung 10: Abkratzen der einzelnen Banden ..................................................... 12 Abbildung 11: DC der Sammelfraktionen der SC-1 ................................................. 14 Abbildung 12: DC der Sammelfraktionen der SPE-1 .............................................. 17 Abbildung 13: HPLC - Chromatogramm von SPE-1 C, Detektion bei UV 254nm,

Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10) ......................................... 18 Abbildung 14: DC der Sammelfraktionen der SPE-2 .............................................. 22 Abbildung 15: DC der Sammelfraktionen aus D und E von SC-1 ............................ 24 Abbildung 16: DC der Sammelfraktionen von SPE-3 .............................................. 25 Abbildung 17: HPLC - Chromatogramm von SPE-3 B, Detektion bei UV 254 nm,

Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (sieheS.10) .......................................... 27 Abbildung 18: Vergleichs-DC von SPE-3 B mit Genistin ......................................... 28 Abbildung 19: DC der Sammelfraktionen von SPE-4 .............................................. 29 Abbildung 20: HPLC - Chromatogramm von SPE-4 B, Detektion bei UV 254nm,

Gradient 2 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10) ......................................... 31 Abbildung 21: DC der Sammelfraktionen von SPE-5 .............................................. 32 Abbildung 22: HPLC - Chromatogramm von SPE-5 E, Detektion bei UV 254nm,

Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10) ......................................... 34 Abbildung 23: Vorversuch zur präparativen Dünnschichtchromatographie von

Fraktion SPE-5 E ............................................................................................. 35 Abbildung 24: Präparative DC von Fraktion SPE-5 E mit Formononetin (F) ........... 36 Abbildung 25: DC der isolierten Komponenten aus SPE-5 E .................................. 37 Abbildung 26: HPLC-Chromatogramm von E1, Detektion bei UV 254nm, .............. 38 Abbildung 27: HPLC-Chromatogramm von TS 3, Detektion bei UV 254nm, ........... 39 Abbildung 28: DC der Sammelfraktionen aus SC-2 vor dem Besprühen unter UV

254 nm ............................................................................................................. 40 Abbildung 29:DC der Sammelfraktionen aus SC-2 besprüht mit NP/PEG400 ........ 41 Abbildung 30: DC der Sammelfraktionen aus SC-2 besprüht mit Anisaldehyd- ...... 41 Abbildung 31: DC-Vergleich von Sammelfraktionen mit Referenzsubstanzen nach

dem Besprühen mit NP/PEG400 ...................................................................... 43 Abbildung 32:DC-Vergleivch Referenzsubstanzen vor dem Besprühen ................. 43 Abbildung 33: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen nach dem Besprühen mit

NP/PEG 400 unter UV 366nm.......................................................................... 44 Abbildung 34: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen vor dem Besprühen mit unter

UV 254nm ........................................................................................................ 44 Abbildung 35: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen nach dem Besprühen mit

AASS im Tageslicht ......................................................................................... 44

Abbildungsverzeichnis

53

9 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Bedingungen der SC-1 ............................................................................ 6 Tabelle 2: Bedingungen der SC-2 ............................................................................ 6 Tabelle 3: Konditionierung und Elution mit mobiler Phase (1) .................................. 9 Tabelle 4: Konditionierung und Elution mit mobiler Phase (2) .................................. 9 Tabelle 5: Sammelfraktionen aus SC-1 ...................................................................15 Tabelle 6: Mittels SPE weiter fraktionierte Sammelfraktionen .................................16 Tabelle 7: Sammelfraktionen der SPE-1 .................................................................17 Tabelle 8: Sammelfraktionen der SPE-2 .................................................................23 Tabelle 9: Sammelfraktionen von SPE-3 ................................................................26 Tabelle 10: Sammelfraktionen von SPE-4 ..............................................................30 Tabelle 11: Sammelfraktionen von SPE-5 ..............................................................33 Tabelle 12: Fraktionen aus SPE-5 E .......................................................................37 Tabelle 13: Sammelfraktionen aus SC-2 .................................................................42

54

10 Curriculum Vitae Name: Tamara Scherzer

Geburtsdatum: 9.11.1986

Geburtsort: Waidhofen an der Thaya

Staatsangehörigkeit: Österreich

Eltern: Franz Scherzer

Gabriele Scherzer

Ausbildung

1993-1997 Volksschule, 3862 Eisgarn

1997-2001 Johann Böhm-Hauptschule für Knaben und

Mädchen, 3860 Heidenreichstein

2001-2003 Bundesbildungsanstalt für Kindergartenpädagogik,

2130 Mistelbach

2003-2007 Bundesaufbaugymnasium, 3580 Horn

Reifeprüfung absolviert am 18. Mai 2007

Oktober 2007 Beginn des Studiums der Pharmazie an der

Universität Wien

März bis Juni 2013 Praktische Arbeiten an der Diplomarbeit am

Department für Pharmakognosie der Universität

Wien

Praktika

August 2008 Apotheke zur Heiligen Margarethe, 3860

Heidenreichstein

Sommer 08/09/10/11 STAL Stadt-Apotheke-Litschau, 3874 Litschau

2011-2014 Apotheke Regenwald, 1220 Wien

Ab 2014 Sonnenapotheke, 1210 Wien

Anhang

55

11 Anhang

Anhang 1: MS-Spektrum von Substanz TS 1 im Positivionen-Modus

Anhang

56

Anhang 2: MS-Spektrum von Substanz TS 1 im Negativionen-Modus

591.1

3. -MS, 18.9-19.8min #1843-#1903

323.2

371.2 487.2

427.2

3. -MS2(591.1), 18.9-19.8min #1844-#1904

365.2

412.2

323.2

3. -MS3(591.1->427.4), 18.9-19.8min #1845-#1905

308.1

3. -MS4(591.1->427.4->323.4), 19.0-19.8min #1846-#1906

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

6x10

Intens.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

6x10

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

6x10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z

Anhang

57

Anhang 3: 1H NMR-Spektrum von Substanz TS 1 (1) Bereich von 0,5 ppm-7,5ppm

H-6‘‘‘

H-5‘

H-5‘‘‘

H-1‘‘

H-2‘‘

-OCH3

H-3

H-6‘‘

H-8

H-1‘‘‘

H-2‘ H-6‘

Zucker-H

Anhang

58

Anhang 4: 1H NMR-Spektrum von Substanz TS 1 (2) Bereich von 0,5 ppm bis 4,0 ppm

H-6‘‘‘

H-6‘‘

Zucker-H

-OCH3

H-5‘‘

Anhang

59

Anhang 5: 1H NMR-Spektrum von Substanz TS 1 (2) Bereich von 4,0 ppm bis 7,5 ppm

H-5‘

H-3

H-8

H-1‘‘‘

H-1‘‘

H-2‘‘

H-2‘ H-6‘

Anhang

60

Anhang 6: 13C-NMR-Spektrum der Substanz TS 1

C-6‘‘

C-8a

C-4‘

C-3‘

C-6‘

C-5‘

C-2‘

C-1‘

C-6

C-4a C-3 C-1‘‘‘

C-8

Zucker-C

C-5‘‘‘

-OCH3

C-6‘‘‘

C-5

C-2 C-7

C-4

Anhang

61

HBMC

Anhang 7: HBMC-Spektrum der Substanz TS 1

Anhang 8: HSQC-Spektrum der Substanz TS 1

Anhang

62

Anhang 9: COSY-Spektrum der Substanz TS 1

Anhang 10: NOESY-Spektrum der Substanz TS 1

Anhang

63

Anhang 11: MS-Spektrum von Genistin im Positivionen-Modus

Anhang

64

Anhang 12: MS-Spektrum von SPE-5 E a im Negativionen-Modus

Anhang

65

Anhang 13: MS-Spektrum von SPE-5 E b im Negativionen-Modus

Anhang

66

Anhang 14: MS-Spektrum von SPE-5 E a im Positivionen-Modus

Anhang

67

Anhang 15: MS-Spektrum von SPE-5 E b im Positivionen-Modus

Anhang

68


Anhang

69


Anhang

70


Anhang

71


1 einleitung und zielsetzung - univie.ac.atothes.univie.ac.at/31647/1/2014-02-13_0703129.pdf · 10...

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