1 seminar 1 nachweis des proteins nhe-7 in roten blutzellen claudia hahn 25.04.2012
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Seminar 1
Nachweis des Proteins NHE-7 in roten Blutzellen
Claudia Hahn
25.04.2012
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Inhalt
Na+/K+-Transport
Leak-Transport
NHE Familie
Versuchsabläufe
Referenzen
3
K+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
K+
K+
K+
K+K+
K+
K+
K+
http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg
4
K+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
K+
K+
K+
K+H+
K+
K+
K+
NHE Familie
Na+
H+
H+
H+
H+
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5
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
K+
K+
K+
H+K+
K+
K+
NHE Familie
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
K+
H+
H+
Na+-K+-Transport
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K+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+Na+
K+
K+ K+
K+
K+
K+
K+
NHE Familie
Na+
Na+
Na+
Na+Na+
Na+
Na+
K+
Na+-K+-Transport
K+
K+
K+ K+
K+
Leak-Transport
Na+, K+
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Na+/K+-Transport
Natrium-Kalium-Pumpe
3 Natrium raus2 Kalium reinunter ATP Verbrauch (gegen Konzentrationsgefälle)
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Scheme_sodium-potassium_pump-de.svg&filetimestamp=20100611205409
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Leak-Transport
Definition:Unidirektionaler K+ und Na+ Einfluss und Ausfluss während alle bekannten Transportwege (Pumpen, Kanäle, Carrier) inhibiert sind
durch Ouabain + Bumetanide + EGTANa+/K+ Pumpe, der Na+/K+/2Cl- Kotransport und der Ca2+-aktivierte K+ Kanal sind inhibiert
Der "leak" Na+ Fluss ist komplizierter als der "leak" K+ Fluss Größere Anzahl von spezifischen Transportsystemen
Der "leak" K+ und Na+ Transport kann nicht über Elektrodiffusion erklärt werden
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NHE
Transmembrane Antiporter (Na+/H+ Austauscher)
Regulieren den pH-Wert und die Ionenhomöostase
Wird durch verschiedene Signalwege reguliert
Hoch konserviert bei den Säugetieren
Neun Isoformen NHE1 bis NHE9
1010
Zwölf transmembrane Segmentantiporter
Im neutralen pH sind die NHEs inaktiv; Aktivierung erfolgt bei Ansäuerung
Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007
Struktur des Na+/H+ Austauschers
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NHE-Familie
NHE 1in nahezu allen Geweben, Zelltypen und Spezies
Konstanthaltung von pH und ZellvolumenReguliert die ProliferationAktivierung des Na+/H--Austauschs durch intrazelluläre Säurebelastung
NHE 2vor allem im Gastrointestinaltrakt (Magen und Darm)
ähnliche Aufgaben wie NHE1
1212
NHE 3Beim Menschen in Niere und Dünndarm, aber auch in vielen anderen Geweben zu finden
Volumenregulation
NHE 4beim Kaninchen im Magen exprimiert, mittelstark im Dünndarm und Kolon und schwach in Niere, Gehirn, Herz, Uterus, Skelettmuskel und Leber
Könnte an der Volumenregulation beteiligt sein
1313
NHE 5im Gehirn hoch exprimiert
NHE 6nur in den Mitochondrien, Herz, Gehirn, und Skelettmuskel
pH-, Volumen- und Elektrolytregulation
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NHE-7
kommt im Golgi-Netzwerk, Endosomen und Plasmamembran vorreguliert die Ionenhomöostase
Durch intrazelluläre Akkumulation von Ca-Ionen und die Bindung von Calmodulin (CaM) aktiviert (Bindung an IL2)
1515Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007
1616
Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007
1717
NHE-8
Am proximalen Tubulus der Niere entdecktim ER (endoplasmatisches Retikulum) und bis zum trans Golgi nachweisbar
Elektrolyttransport
NHE9
Im späten Endosom
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Versuchsablauf
Gewinnung von Blut
Isolierung der Membranproteine
Trennung der Proteine nach Größe mittels SDS-Page
Anfärben über Coomassie-blau
Western Blot
Detektion mit Antikörpern
1919
http://o.elobot.de/s/bot6/01307.jpg
2020
http://o.elobot.de/s/bot6/01307.jpg
2121http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/sds_page1.gif
2222
Proteine roter Blutkörperchen nach der SDS-Gelektrophorese und Coomassie-Färbung
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
2323
http://www.medizin.uni-greifswald.de/physiol/images/blot.jpg
2424http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotFinal.gif
2525
Western Blot zum Nachweis des NHE 7 mit Antikörpern
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
2626
Ausblick
Weitere Nachweise mittels verschiedener Methoden:
MALDI-ToF
Kapillarelektrophorese
Flüssigchromatographie
Polymerase-Kettenreaktion
2727
Referenzen
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2828
Hoogerwerf WA, Tsao SC, Devuyst O, Levine SA, Yun CH, Yip JW,Cohen ME, Wilson PD, Lazenby AJ, Tse CM and Donowitz M. NHE2and NHE3 are human and rabbit intestinal brush-border proteins. Am JPhysiol 270: G29-41, 1996.Kapus A, Grinstein S, Wasan S, Kandasamy R and Orlowski J.Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchangerstably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence,osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269: 23544-23552, 1994.Lang J, Untersuchungen zur Existenz von NHE-Isoformenin Plasmamembranen humaner Erythrozyten 2012Numata M and Orlowski J. Molecular cloning and characterization of anovel Na+,K+/H+ exchanger localized to the trans-Golgi network. J BiolChem 276: 17387-17394, 2001.Numata M, Petrecca K, Lake N and Orlowski J. Identification of amitochondrial Na+/H+ exchanger. J Biol Chem 273: 6951-6959, 1998.Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu AA, Wu MS, Exner M, Isenring P,Igarashi P and Aronson PS. Immunochemical characterization ofNa+/H+ exchanger isoform NHE4. Am J Physiol 275: F510-F517, 1998.Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007
2929
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
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http://www.zum.de/Faecher/Materialien/beck/bilder/cellm7.jpg