อกสารประกอบการสอน༛portal5.udru.ac.th/ebook/pdf/upload/171g661256745yj6b7bu.pdf ·...

เอกสารประกอบการสอน

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

(Analytical Instrumentation in Biotechnology) (รหสวชา 5163104)

ปรยา แกวนาร

Ph.D. (Biotechnology)

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏอดรธาน 2556

เอกสารประกอบการสอน

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ (Analytical Instrumentation in Biotechnology)

(รหสวชา 5163104)

ปรยา แกวนาร ปร.ด. (เทคโนโลยชวภาพ)

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏอดรธาน

2556

คานา

เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ (5163104) ใชประกอบการเรยนการสอนตามหลกสตรวทยาศาสตรบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏอดรธาน เนอหาในเอกสารประกอบการสอน ประกอบดวย แผนบรการการสอนทไดจดแบงการสอนออกเปน 9 บทเรยน มลาดบดงน 1) บทนา 2) ความรพนฐานทางการวเคราะห 3) เครองมอพนฐานในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 4) การวเคราะหทาง สเปกโทรสโกป 5) อลตราไวโอเลตและวสเบลสเปกโทรสโกป 6) อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทเมตร 7) ทฤษฎโครมาโทกราฟ 8) โครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง และ 9) แกสโครมาโทกราฟ ในแตละบทเรยนประกอบดวยแผนบรหารการสอนประจาบท เนอหา แบบฝกหด และปฏบตการการวเคราะหใหผเรยนไดฝกปฏบต เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพเปนวชาทมความสาคญมากวชาหนง เนองจากเปนพนฐานของหลายๆ วชาในการเรยนในสาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ และสามารถใชกบการวจยทางเทคโนโลยชวภาพไดเปนอยางด เพอใหการประมวลผลการวจยออกมาเปนรปธรรมชดเจน และจากประสบการณการสอนวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพมาหลายป นกศกษายงขาดทกษะในการวเคราะห การคานวณ และการประมวลผลการวเคราะห ทาใหไมสามารถเรยนใหเขาใจและนาไปใชประโยชนไมได ดงนนในเอกสารประกอบการสอนน จงมงเนนใหนกศกษามความรพนฐานดานสสาร การคานวณ หนวยทใชในการวเคราะห การแสดงผลการวเคราะห การเลอกวธวเคราะหและการแปลขอมลการวเคราะหทไดจากเครองมอวเคราะห ใหเขาใจงายขนโดยใชภาษาและเนอหาทไมซบซอน นอกจากนยงมแบบฝกหดและปฏบตการเพอเพมทกษะและไดวเคราะหจากขอมลจรง ทาให เขาใจไดงาย และยงม เอกสารประกอบการเรยนทม เ นอหาทางเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพทอานเขาใจงายและสามารถนาไปแกปญหาทางเทคโนโลยชวภาพไดดยงขน

ปรยา แกวนาร มกราคม 2556

สารบญ

หนา คานา .............................................................................................................................................. (1) สารบญ ........................................................................................................................................... (2) สารบญรป ...................................................................................................................................... (6) สารบญตาราง .............................................................................................................................. (10) แผนบรหารการสอนประจาวชา................................................................................................ 1 แผนบรหารการสอนประจาบทท 1 ........................................................................................ 19 บทท 1 บทนา ........................................................................................................................... 21 1.1 ความสาคญของการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ................................................ 21 1.2 สสาร ....................................................................................................................... 21 1.3 การวเคราะห ........................................................................................................... 23 1.4 รปแบบการวเคราะห ............................................................................................... 25 1.5 หลกการวเคราะห .................................................................................................... 26 1.6 สรปประจาบท ......................................................................................................... 30 แบบฝกหดทายบท ......................................................................................................... 32 เอกสารอางอง ................................................................................................................ 33 แผนบรหารการสอนประจาบทท 2 ........................................................................................ 35 บทท 2 ความรพนฐานทางการวเคราะห ............................................................................ 37 2.1 การวเคราะหเชงคณภาพและการวเคราะหเชงปรมาณ............................................. 37 2.2 หนวยและความเขมขน ............................................................................................ 39 2.3 การเจอจางสารละลาย ............................................................................................. 42 2.4 สารละลายบฟเฟอร ................................................................................................. 44 2.5 สรปประจาบท ......................................................................................................... 49 แบบฝกหดทายบท ......................................................................................................... 51 เอกสารอางอง ................................................................................................................ 52

(3)

สารบญ(ตอ)

หนา แผนบรหารการสอนประจาบทท 3 ........................................................................................ 53 บทท 3 เครองมอพนฐานในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ................................... 55 3.1 เครองชง .................................................................................................................. 55 3.2 เครองวดพเอช ......................................................................................................... 66 3.3 เครองปนเหวยง ....................................................................................................... 71 3.4 เครองนงฆาเชอความดนไอนา .................................................................................. 83 3.5 สรปประจาบท ......................................................................................................... 90 แบบฝกหดทายบท ......................................................................................................... 91 เอกสารอางอง ................................................................................................................ 93 แผนบรหารการสอนประจาบทท 4 ........................................................................................ 95 บทท 4 การวเคราะหทางสเปกโทรสโกป ............................................................................ 97 4.1 สเปกโทรสโกป ......................................................................................................... 97 4.2 การแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอแสง ............................................................................ 97 4.3 สเปกตรมของคลนแมเหลกไฟฟา ............................................................................. 99 4.4 หนวยของพลงงาน ................................................................................................... 99 4.5 การเกดอนตรกรยาของสสารกบรงส ...................................................................... 101 4.6 ทฤษฎควอนตม ...................................................................................................... 102 4.7 สรปประจาบท ....................................................................................................... 104 แบบฝกหดทายบท ....................................................................................................... 105 เอกสารอางอง .............................................................................................................. 106 แผนบรหารการสอนประจาบทท 5 ...................................................................................... 107 บทท 5 อลตราไวโอเลตและวสเบลสเปกโทรสโกป ......................................................... 109 5.1 หลกการและทฤษฎพนฐานเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร ......................... 111 5.2 สวนประกอบของเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร ........................................ 111 5.3 ชนดของเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร ...................................................... 117

(4)


หนา 5.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห ........................................................................ 119 5.5 ขนการวเคราะหโดยใชยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร .......................................... 120 5.6 ตวอยางงานวเคราะหดวยเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร ........................... 121 5.7 สรปประจาบท ....................................................................................................... 121 แบบฝกหดทายบท ....................................................................................................... 122 เอกสารอางอง .............................................................................................................. 123 แผนบรหารการสอนประจาบทท 6 ...................................................................................... 125 บทท 6 อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรสโกป ............................................................. 127 6.1 หลกการและทฤษฎพนฐานของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร ....... 128 6.2 อปกรณหลกในเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร ...................... 128 6.3 ชนดของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร .......................................... 134 6.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห ........................................................................ 139 6.5 เทคนคในการวเคราะหอะตอมมกแอพซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร .................... 141 6.6 สรปประจาบท ....................................................................................................... 143 แบบฝกหดทายบท ....................................................................................................... 144 เอกสารอางอง .............................................................................................................. 145 แผนบรหารการสอนประจาบทท 7 ...................................................................................... 147 บทท 7 ทฤษฎโครมาโทกราฟ .............................................................................................. 149 7.1 หลกการโครมาโทกราฟ ......................................................................................... 149 7.2 โครมาโทกราฟแบบกระดาษ .................................................................................. 159 7.3 โครมาโทกราฟแบบเยอบาง ................................................................................... 161 7.4 โครมาโทกราฟแบบคอลมน ................................................................................... 162 7.5 สรปประจาบท ....................................................................................................... 163 แบบฝกหดทายบท ....................................................................................................... 165 เอกสารอางอง .............................................................................................................. 166

(5)


หนา แผนบรหารการสอนประจาบทท 8 ...................................................................................... 167 บทท 8 โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ...................................................................... 169 8.1 หลกการและทฤษฏพนฐานของเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ............... 169 8.2 อปกรณหลกในเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ........................................ 170 8.3 การวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ ............................................................... 175 8.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห ........................................................................ 177 8.5 เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง – แมสสเปกโทรเมตร ...................... 179 8.6 สรปประจาบท ....................................................................................................... 183 แบบฝกหดทายบท ....................................................................................................... 184 เอกสารอางอง .............................................................................................................. 186 แผนบรหารการสอนประจาบทท 9 ...................................................................................... 187 บทท 9 แกสโครมาโทกราฟ ................................................................................................. 189 9.1 หลกการและทฤษฎพนฐานของแกสโครมาโทกราฟ ............................................... 189 9.2 อปกรณหลกในเครองแกสโครมาโทกราฟ .............................................................. 190 9.3 การวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ ............................................................... 200 9.4 เทคนคการวเคราะหแกสโครมาโตกราฟ................................................................. 205 9.5 แกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรเมตร ............................................................... 209 9.6 สรปประจาบท ....................................................................................................... 213 แบบฝกหดทายบท ....................................................................................................... 214 เอกสารอางอง .............................................................................................................. 216 บรรณานกรม ................................................................................................................................ 219 ภาคผนวก ก เฉลยคาตอบแบบฝกหดทายบท.............................................................................. 225 ภาคผนวก ข บทปฏบตการ ......................................................................................................... 245

สารบญรป รปท หนา 1.1 โรเบรตบอยล (Robert Boyle)................................................................................................ 22 1.2 จอหน ดาลตน (John Dalton) ................................................................................................ 22 2.1 การไทเทรต.............................................................................................................................. 38 3.1 เครองชง 2 ตาแหนง และเครองชง 4 ตาแหนง ........................................................................ 55 3.2 การชงนาหนกโดยใชระบบคานชงยาวเทากน ........................................................................... 57 3.3 การชงนาหนกโดยใชการแทนทนาหนกบนคานชงทยาวไมเทากน ............................................ 58 3.4 การหานาหนกโดยการเปรยบเทยบแรงทกระทาตอมวลแบบใชสปรง แบบนวมาตก แบบไฮดรอลก และแบบสนามแมเหลกไฟฟา .................................................... 60 3.5 เครองชงแบบคานชงยาวเทากน (Equal beam balance)...................................................... 62 3.6 เครองชงแบบ 3 คานชง (Triple beam balance) ................................................................. 63 3.7 เครองชงแบบแทนทนาหนกมาตรฐาน (Substitution balance) ............................................ 63 3.8 เครองชงแบบอเลกทรอนกส .................................................................................................... 66 3.9 เครองพเอช .............................................................................................................................. 67 3.10 อเลกโทรด (Electrode) ........................................................................................................ 69 3.11 โครงสรางของอเลกโทรดอางองแบบคาโลเมล และแบบซลเวอร/ซลเวรคลอไรดอเลกโทรด ... 70 3.12 เครองปนเหวยง (Centrifuge) ............................................................................................... 71 3.13 โนโมแกรมสาหรบหาคาแรงหนศนยกลาง .............................................................................. 73 3.14 เครองปนเหวยงความเรวรอบตา (Low speed centrifuge) ................................................. 75 3.15 เครองปนเหวยงความเรวรอบสง (High speed centrifuge) ................................................. 76 3.16 เครองหมนเหวยงความเรวรอบสงมาก (Ultra speed centrifuge) ....................................... 76 3.17 สวนประกอบของเครองปนเหวยง .......................................................................................... 77 3.18 หวหมน (Rotor) .................................................................................................................... 78 3.19 เครองนงฆาเชอโรค (Automatic Autoclave) ...................................................................... 84 3.20 ไดอะแกรมการทางานของเครองนงฆาเชอ ............................................................................. 85 3.21 หองนง (Chamber) .............................................................................................................. 87 3.22 ตะแกรง ................................................................................................................................. 87 3.23 ฝาเปด– ปด เครองนงฆาเชอโรค ........................................................................................... 88

(7)

สารบญรป(ตอ) รปท หนา 4.1 แสดงลกษณะของการแผรงสแมเหลกไฟฟา ............................................................................. 98 4.2 สเปกตรมของการแผรงสแมเหลกไฟฟา (The electromagnetic spectrum ......................... 98 4.3 คลนจานวน 1 cycle ............................................................................................................. 100 4.4 แสดงการเกดอนตรกรยาของสสารกบรงส.............................................................................. 101 4.5 แสดงระดบพลงงานของอเลกตรอนในอะตอมทมอเลกตรอนหลายตว .................................... 103 5.1 แสดงการเกดอนตรกรยาของสารเคมกบการแผหรอรงสแสง .................................................. 109 5.2 แสดงกระบวนการเกดการกระตน .......................................................................................... 110 5.3 เครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร ................................................................................... 111 5.4 สวนประกอบของเครองสเปกโตรโฟโทมเตอร ........................................................................ 111 5.5 หลอดไฮโดรเจน (Hydrogen lamp) ..................................................................................... 112 5.6 หลอดทงสเตน (Tungsten filament lamp) ........................................................................ 112 5.7 สวนประกอบของเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร ........................................................................ 114 5.8 ชองใสควเวตตทใชบรรจสารตวอยางและสารละลายอางอง ................................................... 115 5.9 การทากราฟมาตรฐานเพอวเคราะหหาปรมาณของสาร ......................................................... 117 5.10 หลกการทางานสเปกโทรโฟโตมเตอรแบบลาแสงเดยว ......................................................... 118 5.11 หลกการทางานสเปกโทรโฟโตมเตอรแบบลาแสงค .............................................................. 119 5.12 ควเวตตแบบแกว และควเวตตแบบควอซต .......................................................................... 119 6.1 เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร .............................................................. 127 6.2 ไดอะแกรมของเครอง AAS .................................................................................................... 128 6.3 หลอดฮอลโลวคาโทด (Hollow cathode lamp) แหลงกาเนดแสงทเปนแบบเสน ................ 129 6.4 สวนประกอบหลอดฮาโลวแคโทด .......................................................................................... 130 6.5 หลอด Electrodeless Discharge Lamps (EDLs) สวนประกอบชองหลอด EDLs............... 131 6.6 ระบบเบอรเนอร (Burner system) ....................................................................................... 132 6.7 ธาตแตกตวเปนอะตอมอสระโดยเปลวไฟ (Flame Atomization) ......................................... 132 6.8 Pneumatic nebulizer ........................................................................................................ 135 6.9 Graphite tube ลกษณะหลอดแกรไฟท และการตออเลคโทร ทหลอดแกรไฟท หลอดแกรไฟททม Platform ...................................................................... 138 6.10 Carbon rod atomizer ...................................................................................................... 139

(8)

สารบญรป(ตอ)

รปท หนา 6.11 Carbon cup atomizer ..................................................................................................... 139 7.1 รปรางของพค ........................................................................................................................ 151 7.2 โครมาโทแกรม ....................................................................................................................... 152 7.3 โครมาโทแกรมสาหรบคานวณจานวนเพลทของคอลมน (N) .................................................. 156 7.4 โครมาโทแกรมของการแยกสารสองชนด ............................................................................... 158 7.5 การแยกสารผสมโดยโครมาโทกราฟแบบกระดาษ และแถบสารทแยก ................................... 160 7.6 โครมาโทกราฟแบบเยอบาง และแถบสารทแยก .................................................................... 161 7.7 โครมาโทกราฟแบบคอลมน และแถบสารทแยก .................................................................... 163 8.1 เครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง................................................................................ 169 8.2 สวนประกอบทสาคญของเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ........................................ 171 8.3 เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง–แมสสเปกโทรเมตร ........................................ 179 8.4 หลกการทางานของเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง แมสสเปกโทรเมตร- ............................................................................................................... 180 8.5 สวนประกอบพนฐานของแมสสเปกโทรเมตร ......................................................................... 180 9.1 แกสโครมาโทกราฟ (Gas Chromatography, GC) ............................................................... 189 9.2 สวนประกอบพนฐานของ GC................................................................................................. 190 9.3 แพคคอลมน (Packed column) ........................................................................................... 191 9.4 คาปลารคอลมน (Capillary column) มเสนผาศนยกลาง 0.25 มลลเมตร ความยาว 30 เมตร และความหนาของสารเคลอบ 0.25 ไมโครเมตร ..................................... 192 9.5 Hydrogen flame detector (HFD) ..................................................................................... 195 9.6 Flame ionization detector (FID)...................................................................................... 196 9.7 Thermal conductivity detector (TCD) ........................................................................... 197 9.8 Flame photometric detector (FPD) ............................................................................... 198 9.9 Electron Capture Detector (ECD) ................................................................................... 199 9.10 การแพรของสารทสนใจวเคราะหจากตวอยางสบรเวณเฮดสเปซ .......................................... 205 9.11 การแพรของสารทตองการวเคราะหจากบรเวณเฮดสเปซสตวดดซบ ของแขงปรมาณนอย ........................................................................................................... 206 9.12 การคายการดดซบโดยใชความรอนจากหวฉดของเครองแกสโครมาโทกราฟ ........................ 206

(9)

สารบญรป(ตอ)

รปท หนา 9.13 โครงสรางของ SPME ........................................................................................................... 208 9.14 แกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรเมตร ............................................................................. 210 9.15 หลกการทางานในสวนของเครองแกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรเมตร .......................... 211 9.16 สวนประกอบสาคญของ MS ................................................................................................ 211

สารบญตาราง ตารางท หนา 1.1 การจาแนกวธวเคราะหและสญญาณการวเคราะห ................................................................... 29 1.2 ตารางการวเคราะหสาร ........................................................................................................... 31 2.1 หนวยนาหนก ........................................................................................................................... 40 2.2 หนวยปรมาตร ......................................................................................................................... 40 2.3 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมอะซเตทบฟเฟอร ........................................... 45 2.4 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมซเตรทบฟเฟอร .............................................. 46 2.5 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมซเตรท-ฟอสเฟต บฟเฟอร .............................. 47 2.6 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมฟอสเฟตบฟเฟอร ........................................... 48 2.7 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร ............................... 49 4.1 แสดงสเปกตรมของแสงทตามองเหน (Visible spectrum)...................................................... 99 4.2 อนตรกรยาของสสารกบรงส .................................................................................................. 101 4.3 แสดงระดบพลงงาน (Energy state) ทเกดขนจากการดดกลนรงส แลวนามาใชเปนวธวเคราะหทางสเปกโทรสโกป ..................................................................... 102 5.1 คา ความหมาย และสญลกษณทใชในเรองของการการดดกลนแสง........................................ 110 5.2 แสดงตวอยางของตวทาละลายทใชไดในชวงยว-วสเบล .......................................................... 120 6.1 แสดงอณหภมของเปลวไฟ ..................................................................................................... 133 6.2 อณหภมของเปลวไฟ .............................................................................................................. 136 6.3 สารประกอบไฮไดรดและจดเดอดของธาตบางชนด ................................................................ 142 7.1 คาคงท a จากการวดความกวางของพคโดยวธตางๆ .............................................................. 156 8.1 เทคนคไอออนไนเซชนแบบตางๆหลกการทางานและประเภทของสารตวอยาง ...................... 181 9.1 ความเทยงของคา Retention time ของสารตางๆ ทวดไดจากเครองแกสโครมาโทกราฟ ..... 201 9.2 ตวอยางการวเคราะหสารดวยแกสโครมาโทกราฟ .................................................................. 209

รายละเอยดของรายวชา มหาวทยาลยราชภฎอดรธาน

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย

หมวดท 1 ขอมลทวไป

1. รหสและชอรายวชา รหสวชา 5163104 ชอวชา เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

ชอวชา Analytical Instrumentation in Biotechnology

2. จานวนหนวยกต 3 หนวยกต 3 (2-3-5) (จานวนชวโมงบรรยาย-ปฏบตการ-ศกษาดวยตนเอง) 3. หลกสตรและประเภทของรายวชา

ชอหลกสตร วทยาศาสตรบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ ประเภทรายวชา วชาเอกบงคบ

4. อาจารยผรบผดชอบรายวชาและอาจารยผสอน อาจารยผรบผดชอบรายวชา ดร. ปรยา แกวนาร 0810499579 ([email protected])

5. ภาคการศกษา / ชนปทเรยน ภาคการศกษา 2 ชนปทเรยน 3

6. รายวชาทตองเรยนมากอน (Pre-requisite) (ถาม) ไมม

7. รายวชาทตองเรยนพรอมกน (Co-requisites) (ถาม) ไมม

8. สถานทเรยน หองเรยนอาคารศนยวทยาศาสตรและเทคโนโลยฯ อาคาร 14 หอง 14105 มหาวทยาลยราชภฎอดรธาน หองปฏบตสาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ อาคาร 14 หอง 14214 และ 14216

9. วนทจดทาหรอปรบปรงรายละเอยดของรายวชาครงลาสด วน 1 เดอน ธนวาคม พ.ศ. 2557 (หลกสตรปรบปรง พ.ศ. 2554)

2 แผนบรหารการสอนประจาวชา เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

หมวดท 2 จดมงหมายและวตถประสงค

1. จดมงหมายของรายวชา เมอศกษาครบตามแผนบรหารการสอนแลว นกศกษาควรมความรความสามารถดงน 1.1 มความรความเขาใจเกยวกบการการวเคราะหเชงคณภาพและการวเคราะหเชงปรมาณ 1.2 มความรความเขาใจเกยวกบหนวย ความเขมขนของสาร และการคานวณได 1.3 มทกษะในการเตรยมสารละลายและการคานวณ 1.4 มความรความเขาใจเกยวกบเครองมอพนฐานในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 1.5 มทกษะในการใชเครองมอเครองมอพนฐานในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 1.6 มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของสเปกโทรโฟโตมเตอร และสามารถฝกปฏบตการโดยใชเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร 1.7 มทกษะในการใชเครองเครองสเปกโทรโฟโตมเตอรวเคราะหสารในตวอยางได 1.8 มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปคโทรโฟโตเมตร และสามารถฝกปฏบตการโดยใชเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปคโทรโฟโตมเตอร 1.9 มทกษะในการใชเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปคโทรโฟโตมเตอรวเคราะหโลหะในตวอยางได 1.10 มความรความเขาใจเกยวกบทฤษฎโครมาโทกราฟ 1.11 มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของเครองโครมาโทกราฟแบบ ของเหลวแรงดนสง และสามารถฝกปฏบตการโดยใชเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง 1.12 มทกษะในการใชเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงวเคราะหสารในตวอยางได 1.13 มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของแกสโครมาโทกราฟ และสามารถ ฝกปฏบตการโดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ 1.14 มทกษะในการใชเครองแกสโครมาโทกราฟวเคราะหสารทระเหยงายได 1.15 มความร ความเขาใจ ในการนาความรดานการวเคราะหดวยเครองมอไปใชในเรองการวางแผนการวจย การออกแบบการทดลอง การวเคราะหขอมลทางสถตและการแปลผล การวจารณ และสรปผลการทดลอง ในการแกปญหาทางวทยาศาสตรชวภาพไดอยางสรางสรรคและเหมาะสม 1.16 สามารถประยกตใชในการวเคราะหในวชาวจยทางเทคโนโลยชวภาพและในงานทางเทคโนโลยชวภาพได 1.17 สามารถวเคราะหขอมลผลการวเคราะหจากเครองมอวเคราะหเพอนาไปประมวลผลหาคาตอบทงชนดและปรมาณสารทใกลเคยงกบคาจรงได 1.18 แบงประเภทของเครองมอวเคราะห ดแลรกษา และสามารถใชเครองมอวเคราะหแตละประเภทใหเหมาะสมกบชนดของตวอยางและชนดของสารได

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ แผนบรหารการสอนประจาวชา 3

1.19 แปรความหมายเชงชนดและปรมาณจากสญญาทไดจากเครองมอแตละประเภทได ไดแก คาการดดกลนแสง ความยาวคลน ปรมาณไฟฟา พนทใตกราฟ ความสงของกราฟ และเวลา 1.20 มความรบผดชอบตอหนาทและงานทไดรบมอบหมาย ยอมรบในเหตของผอนและเปนผจต วทยาศาสตร 1.21 มความตระหนกในจรรยาบรรณวชาชพ การใชเครองมอวทยาศาสตรในงานวเคราะหเนองจากเปนศาสตรทสามารถนาความรไปใชประโยชนทงเพอการสรางสรรคและการทาลาย 1.22 สามารถทางานรวมกบบคคลอนได มความรบผดชอบในการใชองคความร และรบผดชอบตองานทไดรบมอบหมาย ทงงานรายบคคลและงานกลม 1.23สามารถปรบตวและทางานรวมกบผอนทงในฐานะผนาและผตามไดอยางมประสทธภาพ 1.24 มความสามารถในการอาน แปลความหมาย ประเมนและวเคราะห บทความทางดานงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพได 1.25 สามารถนาเสนองานวเคราะห ใชภาษาในการสอสารอยางถกตองตามมาตรฐาน และเหมาะสมกบโอกาสและวาระ 1.26 สามารถสบคน ศกษา วเคราะห และประยกตใชเทคโนโลยชวภาพเพอการแกไขปญหาไดอยางเหมาะสม 2. วตถประสงคในการพฒนา/ปรบปรงรายวชา 2.1 เพอเพมเตมเนอหาในรายวชาใหมความทนสมย 2.2 เพอเพมเตมเทคนคใหมๆ ในงานดานการวเคราะห เครองมอวเคราะห วธการวเคราะห สามารถนาไปใชประโยชนไดด 2.3 เพอนาความรจากวชาทศกษาน ไปใชในงานวจยและผลตผลงานวจยททนสมยได

หมวดท 3 ลกษณะและการดาเนนการ

1. คาอธบายรายวชา ศกษาหลกการและฝกปฏบตการวเคราะหโดยใชเครองมอชนสง โครมาโทรกราฟแบบแกสโครมาโทรกราฟแบบของเหลวแรงดนสง อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตเมตร


2. จานวนชวโมงทใชตอภาคการศกษา

ทฤษฎ ปฏบต ศกษาดวยตนเอง สอนเสรม

2 x 15 = 30 ชวโมง

ตอภาคการศกษา

3 x 15 = 45 ชวโมง


5 x 15 = 75 ชวโมง


สอนเสรมตามความตองการของนกศกษาเฉพาะ

ราย

3. จานวนชวโมงตอสปดาหทอาจารยใหคาปรกษาและแนะนาทางวชาการแกนกศกษาเปนรายบคคล (นอกชนเรยน) และวธสอสารใหนกศกษาไดทราบกาหนดเวลาลวงหนา

อาจารยประจารายวชาประกาศเวลาใหคาปรกษาในหองเรยนและบนทกไวในเอกสารรายละเอยดของวชา เชน อาจารยประกาศเวลาใหคาปรกษาเมอนกศกษาตองการคาปรกษาไดในเวลาราชการเปนกลมหรอรายบคคลทหองพกหรอทสาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ และสามารถใหคาปรกษาไดทางโทรศพทตดตอไดทโทรสาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ หรอโทรมอถออาจารย หรอทาง E-mail ของอาจารยผสอน

อาจารยประจารายวชาจดเวลาใหคาปรกษาดวยตนเองเปนรายบคคลหรอกลมตามความตองการ 1 ชวโมงตอสปดาห (เฉพาะรายทตองการ) หรอมากกวานในกรณพเศษ

หมวดท 4 การพฒนาผลการเรยนรของนกศกษา

1. คณธรรม จรยธรรม

1.1 มความตระหนกในจรรยาบรรณวชาชพ เนองจากเปนศาสตรทสามารถนาความรไปใชประโยชนทงเพอการสรางสรรคและการทาลาย 1.2 มวนยในการปฏบตตามกฎระเบยบของสงคมและวชาชพ 1.3 ซอสตยสจรตตอตนเองและผอน 1.4 เคารพในสทธ คณคาและศกดศรของความเปนมนษย วธการสอน - สอนทฤษฎ และแบบฝกหด - สอนปฏบตการและอธบายการทาปฏบตการกอนทกครง


- เมอนกศกษาทาปฏบตการเสรจสน อาจารยไดมอบหมายใหนกศกษาสงผลงาน เชน ผลการวเคราะหและใหทารายงานและสงรายงานปฏบตการตามเวลาทกาหนด - ไดเปดโอกาสใหนกศกษาซกถาม อภปราย ออกความคดเหนรวมกน วธการประเมนผล - พฤตกรรมการเขาเรยน การตรงตอเวลาในการเรยน การทางาน และการสงรายงานทไดมอบหมาย - การทาปฏบตการในชวโมงเรยน เชน ความเอาใจใส ความตงใจ การเตรยมตวในการทา ปฏบตการ ความระมดระวง ทางานดวยตนเอง อางองผลงานเมอใชผลงานคนอน เปนตน - ประเมนผลงานทไดจากปฏบตการและจากรายงานปฏบตการและงานตางๆ ทมอบหมาย - สอบกลางภาค สอบปลายภาค ดวยขอสอบทเนนการวดหลกการและทฤษฎ

2. ความร ความรทไดรบ 2.1 มความร ความเขาใจ ทงทฤษฎและหลกการปฏบตในเนอหา สาระทศกษา 2.2 มความร ความเขาใจในนวตกรรมทางเทคโนโลยชวภาพ และกระบวนการทเกยวของ 2.3 มความร ความเขาใจในการใชเครองมอวทยาศาสตร อปกรณอนๆ ทเกยวของกบการปฏบตงานในสาขาอาชพ และสามารถตดตามความกาวหนาทางวชาการและเทคโนโลยของสาขาวชาทศกษา 2.4 มความร ความเขาใจในเรองการวางแผนการวจย การออกแบบการทดลอง การวเคราะหขอมลทางสถตและการแปลผล การวจารณ และสรปผลการทดลอง วธการสอน - สอนทฤษฎ และแบบฝกหด - สอนปฏบตการและอธบายการทาปฏบตการกอนทกครง - เมอนกศกษาทาปฏบตการเสรจสน อาจารยไดมอบหมายใหนกศกษาสงผลงาน เชน ผลการวเคราะหและใหทารายงานและสงรายงานปฏบตการตามเวลาทกาหนด - ไดเปดโอกาสใหนกศกษาซกถาม อภปราย ออกความคดเหนรวมกน วธการประเมนผล - พฤตกรรมการเขาเรยน การตรงตอเวลาในการเรยน การทางาน และการสงรายงานทไดมอบหมาย - การทาปฏบตการในชวโมงเรยน เชน ความเอาใจใส ความตงใจ การเตรยมตวในการทา ปฏบตการ ความระมดระวง เปนตน - ประเมนผลงานทไดจากปฏบตการและจากรายงานปฏบตการและงานตางๆ ทมอบหมาย - สอบกลางภาค สอบปลายภาค ดวยขอสอบทเนนการวดหลกการและทฤษฎ


3. ทกษะทางปญญา ทกษะทางปญญาทตองพฒนา

3.1 สามารถบรณาการความรทางดานเทคโนโลยชวภาพ รวมทงความรทไดจากการฝกปฏบต มาประยกตใชในวชาชพไดอยางเหมาะสม 3.2 สามารถบรณาการความรมาใชในการพฒนางานดานเทคโนโลยชวภาพ การผลตและเพมมลคาทางการเกษตรและอตสาหกรรม การรกษาสงแวดลอม และการบรการไดอยางเหมาะสม

3.3 สามารถใชความร ความเขาใจพนฐานในดานการวางแผนการวจย การออกแบบการทดลอง การวเคราะหขอมลทางสถต และการแปลผล การวจารณ และสรปผลการทดลอง ในการแกปญหาทางวทยาศาสตรชวภาพไดอยางสรางสรรคและเหมาะสม

วธการสอน มการแนะนาใหคนควาดวยตนเอง โดยคนควาจากแหลงขอมลทมการทาวจยในปจจบนทางอนเตอรเนตและแหลงคนควาจากตาราตางๆ วธการประเมนผล - สอบภาคกลาง และภาคปลาย โดยขอสอบนนนกศกษาตองใชความรความสามารถ คบคดและวเคราะหซงรวมถงการแกไขปญหาทเกดขนในการทาปฏบตการดวย - ซกถามในหองเรยน แบบฝกหด และสงเกตจากการตอบคาถามของนกศกษา 4. ทกษะความสมพนธระหวางบคคลและความรบผดชอบ ทกษะความสมพนธระหวางบคคลและความรบผดชอบทตองพฒนา 4.1 มความรบผดชอบในการใชองคความร และรบผดชอบตองานทไดรบมอบหมาย ทงงานรายบคคลและงานกลม 4.2 สามารถปรบตวและทางานรวมกบผอนทงในฐานะผนาและผตามไดอยางมประสทธภาพ 4.3 วางตวไดเหมาะสมกบบทบาท หนาท และความรบผดชอบ 4.4 สามารถวางแผนและรบผดชอบในการเรยนร พฒนาตนเอง และสงคมอยางตอเนอง วธการสอน - มอบหมายงานรายกลม และรายบคคล มอบหมายงานและสงรายงานในเวลาทกาหนด วธการประเมนผล - ประเมนจากผลงานทสงและจากรายงาน - ประเมนจากและพฤตกรรมการทางานรวมกนในหองปฏบตการ 5. ทกษะการวเคราะหเชงตวเลข การสอสาร และการใชเทคโนโลยสารสนเทศ 5.1 มความสามารถในการอาน แปลความหมาย ประเมนและวเคราะห บทความทางวทยาศาสตร


5.2 วเคราะหผลการทดลองโดยอาศยเทคนคทางดานวทยาศาสตร คณตศาสตร และสถต ไดอยางเหมาะสม 5.3 สามารถใชภาษาในการสอสารอยางถกตองตามมาตรฐาน และเหมาะสมกบโอกาสและวาระ สามารถสบคน ศกษา วเคราะห และประยกตใชเทคโนโลยชวภาพเพอการแกไขปญหาไดอยางเหมาะสม วธการสอน แนะนาใหศกษาคนควาดวยตนเอง โดยใชหนงสอ สอทางอนเตอรเนต วารสารวชาการ วธการประเมนผล ประเมนจากการสอบถามขอมลตางๆ การสบคนขอมล รายงาน การนาเสนองาน


หมวดท 5 แผนการสอนและการประเมนผล 1. แผนการสอน

สปดาห ท

หวขอ / รายละเอยด จานวนชวโมง

กจกรรมการเรยนการสอน และสอทใช

ผสอน

1

ชแจงการเรยน การมอบหมายงาน เกณฑการเขาเรยน และการประเมนผล บทท 1 บทนา 1.1 ความสาคญของการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 1.2 สสาร 1.3 การวเคราะห ปฏบตการท 1 เรอง การวดปรมาตร

5 ชวโมง -แจกแนวการจดการเรยนร และชแจง ความรพนฐานทางการวเคราะห - บรรยายความสาคญของ การวเคราะหทางทคโนโลยชวภาพ สสาร และ การวเคราะห - ซกถามเพอทดสอบความเขาใจ - ปฏบตการท 1 และรายงานผล

ดร. ปรยา

2 1.4 รปแบบการวเคราะห 1.5 หลกการวเคราะห 1.6 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 1 ปฏบตการท 1 เรอง การวดปรมาตร (ตอ)

- ซกถามเพอทดสอบความเขาใจ รปแบบการวเคราะห หลกการวเคราะห และสรปประจาบท - แบบฝกหดทายบท บทท 1 - ปฏบตการท 1 และรายงานผล


3 บทท 2 เครองมอพนฐานทางการวเคราะห 2.1 การวเคราะหเชงคณภาพและ การวเคราะหเชงปรมาณ 2.2 หนวย ความเขมขนของสาร 2.3 การเจอจางสารละลาย 2.4 สารละลายบฟเฟอร 2.5 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 2 ปฏบตการท 2 เรอง การไทเทรต หาปรมาณกรด

5 ชวโมง -บรรยาย การวเคราะหเชงคณภาพและการวเคราะหเชงปรมาณ หนวย ความเขมขนของสาร การเจอจางสารละลาย สารละลายบฟเฟอร -สรปประจาบทรวมกน -แบบฝกหดทายบท บทท 2 - ปฏบตการท 2 และรายงานผล



สปดาห ท



ผสอน

4 บทท 3 เครองมอพนฐานในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 3.1 เครองชง 3.2 เครองวดความเปนกรด-ดาง 3.3 เครองปนเหวยง 3.4 เครองนงฆาเชอความดนไอนา 3.5 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 3 ปฏบตการท 3 เรอง การวดคาความเปนกรดดางดวยเครองพเอชมเตอร

5 ชวโมง -บรรยาย เครองชงเครองวดความเปนกรด-ดาง เครองปนเหวยง และเครองนงฆาเชอความดนไอนา -สรปประจาบทรวมกน - แบบฝกหดทายบท บทท 3 - ทาปฏบตการท 3 และ รายงานผล


5

บทท 4 การวเคราะหทางสเปกโทรสโกป4.1 สเปกโทรสโกป 4.2 การแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอแสง 4.3 สเปกตรมของคลนแมเหลกไฟฟา 4.4 หนวยของพลงงาน 4.5 การเกดอนตรกรยาของสสารกบรงส แบบฝกหดทายบท บทท 4 ปฏบตการท 4 เรอง การวเคราะหปรมาณนาตาลทงหมดโดยใชวธฟนอลซลฟวรกดวยเครองสเปกโทรโตมเตอร

5 ชวโมง -บรรยายเรอง สเปกโทรสโกป การแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอแสง สเปกตรมของคลนแมเหลกไฟฟา หนวยของพลงงาน การเกดอนตรกรยาของสสารกบรงส - แบบฝกหดทายบท บทท 4 - ทาปฏบตการท 4 และ รายงานผล


6

บทท 5 อลตราไวโอเลตและวสเบล สเปกโทรสโกป 5.1 หลกการและทฤษฎพนฐานเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 5.2 สวนประกอบของเครองยว-วสเบลสเปกโตรโฟโทมเตอร 5.3 ชนดเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร ปฏบตการท 5 เรอง การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ 3,5 – dinitrosalicylic acid ดวย เครองสเปกโทรโตมเตอร

5 ชวโมง -บรรยาย หลกการและทฤษฎพนฐานเครองยว-วสเบลสเปกโตรโฟโทมเตอร สวนประกอบของเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร และชนดเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร - ทาปฏบตการท 5 เตรยมตวอยางในงานวเคราะห



สปดาห ท



ผสอน

7

5.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห 5.5 ขนการวเคราะหโดยใชยว-วสเบล สเปกโทรโฟโตมเตอร 5.6 ตวอยางงานวเคราะหดวยเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 5.7 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 5 ปฏบตการท 5 เรอง การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ 3,5 – dinitrosalicylic acid ดวย เครองสเปกโทรโตมเตอร (ตอ)

5 ชวโมง - บรรยายการเตรยมตวอยางในงานวเคราะห ขน การวเคราะหโดยใชยว-วสเบล สเปกโทรโฟโตมเตอร และตวอยางงานวเคราะหดวยเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร - สรปประจาบทรวมกน - แบบฝกหดทายบท บทท 5 - ปฏบตการท 5 และ รายงานผล


8 สอบกลางภาคเรยน ปฏบตการท 6 เรอง การวเคราะหปรมาณโซเดยม โพแทสเซยม แคลเซยม และแมกนเซยม โดยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโตมเตอร

5 ชวโมง - สอบ - ปฏบตการท 6 เตรยมตวอยางโดยการยอยสารละลายตวอยาง


9

บทท 6 อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทรสโกป 6.1 หลกการและทฤษฎพนฐานของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 6.2 อปกรณหลกในเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 6.3 ชนดของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร ปฏบตการท 6 เรอง การวเคราะหปรมาณโซเดยม โพแทสเซยม แคลเซยม และแมกนเซยม โดยเครองอะตอมมก แอบซอรพชนสเปกโตรโฟโตมเตอร (ตอ)

5 ชวโมง -บรรยายเรอง .หลกการและทฤษฎพนฐานของอะตอม มกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร อปกรณหลกในเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร และชนดของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร - ปฏบตการท 6 และ รายงานผล



สปดาห ท



ผสอน

10 6.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห 6.5 เทคนคในการวเคราะหอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 6.6 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 6 ปฏบตการท 7 เรอง การวเคราะหชนดและปรมาณนาตาลโดยใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

5 ชวโมง -บรรยายเรอง การเตรยมตวอยาง และเทคนคใน การวเคราะหอะตอมมก แอบซอรพชนสเปกโทรโฟโทมเตอร - สรปประจาบทรวมกน - แบบฝกหดทายบท บทท 6 - ปฏบตการท 7 เตรยมตวอยางปนเหวยง การเกรอง และ การเกบรกษาตวอยางกอน การวเคราะห


11 บทท 7 ทฤษฎโครมาโทกราฟ 7.1 หลกการโครมาโทกราฟ 7.2 โครมาโทกราฟแบบกระดาษ 7.3 โครมาโทกราฟแบบเยอบาง 7.4 โครมาโทกราฟแบบคอลมน 7.5 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท ปฏบตการท 7 เรอง การวเคราะหชนดและปรมาณนาตาลโดยใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง (ตอ)

5 ชวโมง -บรรยายเรอง หลกการ โครมาโทกราฟ โครมาโทกราฟ แบบกระดาษ โครมาโทกราฟแบบเยอบาง และโครมาโท กราฟแบบคอลมน - สรปประจาบทรวมกน -ทาแบบฝกหดทายบทบทท 7 - ปฏบตการท 7 เตรยมทาละลาย เพอใชเปนเฟสเคลอนท


12 บทท 8 เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง 8.1 หลกการและทฤษฏพนฐานของเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง 8.2 อปกรณหลกในเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง 8.3 การวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ ปฏบตการท 7 เรอง การวเคราะหชนดและปรมาณนาตาลโดยใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง (ตอ)

5 ชวโมง -บรรยาย เรอง เครองโครมาโท กราฟแบบของเหลวแรงดนสง หลกการและทฤษฏพนฐานของเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสงอปกรณหลกในเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสงและการวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ - ปฏบตการท 7 และ รายงานผล



สปดาห

ท หวขอ / รายละเอยด

จานวนชวโมง


ผสอน

13 8.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห 8.5 เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง – แมสสเปกโทรโฟโตเมตร 8.6 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท ปฏบตการท 8 เรอง การวเคราะหปรมาณ เอทานอล และบวทานอล โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

5 ชวโมง บรรยาย เรอง การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห และเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง – แมสสเปกโตรโฟโทเมตร - ทาปฏบตการท 8 และ รายงานผล


14

บทท 9 แกสโครมาโตกราฟ 9.1 หลกการและทฤษฎพนฐานของแกสโครมาโตกราฟ 9.2 อปกรณหลกในเครองแกสโครมาโตกราฟ 9.3 การวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ ปฏบตการท 9 เรอง การวเคราะหกรดไขมนทระเหยงายโดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

5 ชวโมง -บรรยาย เรอง หลกการและทฤษฎพนฐานของแกสโครมาโตกราฟ เครองแกสโครมาโท กราฟและการวเคราะหเชงคณภาพและอปกรณหลกใน เชงปรมาณ - ทาปฏบตการท 9 และ รายงานผล


15 9.4 เทคนคในการวเคราะหแกสโครมาโท กราฟ 9.5 แกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรโฟโตเมทร 9.6 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท ปฏบตการท 10 เรอง การวเคราะหแกสไฮโดรเจนโดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

5 ชวโมง -บรรยาย เรอง เทคนคในการวเคราะหแกสโครมาโทกราฟและแกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรโฟโตเมตร - สรปประจาบทรวมกน - แบบฝกหดทายบท บทท 9 - ทาปฏบตการท 10 และ รายงานผล


16-17 สอบปลายภาค 2 ชวโมง สอบ ดร. ปรยา


1. แผนการประเมนผลการเรยนร

ท ผลการเรยนร วธการประเมน สปดาห

ทประเมน สดสวนของ

การประเมนผล 1 คณธรรม จรยธรรม

1.1 การทางานทไดรบมอบหมาย (จรรยาบรรณทางวชาการ)

ทกสปดาห 5%

2 ความร 2.1 2.3 2.4

แบบฝกหด บทปฎบตการ สอบกลางภาค สอบปลายภาค

ทกสปดาห ทกสปดาห สปดาหท 8 สปดาหท 16

5% 15% 20% 30%

3 ทกษะทางปญญา 3.1 3.2

การนาเสนอ งานทมอบหมาย พฤตกรรมการทางาน การตอบคาถาม

ตลอดภาคการศกษา 5%

4 ทกษะความสมพนธระหวางบคคล และ ความรบผดชอบ 4.1 4.2

สงเกตพฤตกรรมการทางานกลม มความรบผดชอบ การสงงาน ตรงตอเวลา


5 ทกษะวเคราะหเชงตวเลข การสอสาร และการใชเทคโนโลยสารสนเทศ 5.1 5.3

ผลงานการสบคนทมอบหมาย การแสดงความคดเหน


เกณฑการประเมนผล

เกณฑการประเมน ประเมนแบบระดบคะแนน 80 -100% A 75-79 % B+ 70-74 % B 65-69 % C+ 60-64 % C 55-59 % D+ 50-54 % D 0-49 % F


หมวดท 6 ทรพยากรประกอบการเรยนการสอน 1. ตาราและเอกสารหลก

ปรยา แกวนาร. ชาญชย ภขาว. รตนา หลกตา. (2555) การใชนาทงจากกระบวนการกลนเอทานอล เพอใชผลตชวมวลของสาหรายคลอเรลลา.วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏอดรธาน. (1). 97-118. ปรยา แกวนาร. ธนากร เยาวพนธ. สนต ปอมสวรรณ. ธวชชย สลาโส และชชวาล เมองผย. 2014. การเปรยบเทยบประสทธภาพดานการประหยดพลงงานของกระบวนการกลนแบบกะและ แบบตอเนองสาหรบการผลตเอทานอลในระดบโรงงานตนแบบ. วารสารวทยาศาสตรและ เทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏอดรธาน. 2. 31-49. ผกาวด นารอง. มปป. กระบวนการหลงการหมก. คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน. พฒนา เหลาไพบลย. (2554). โครมาโทรกราฟแบบของเหลวแรงดนสง: หลกการและการ ประยกตใช. พมพครงท 3. พมพท หจก. ขอนแกนการพมพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน. พฒนา เหลาไพบลย, อรศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวนวชา

เทคโนโลยชวภาพ. คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน. ไพบลย ดานวรทย,พฒนา เหลาไพบลย. (2548). ไวนผลไมและสาโทผลตดวยความมนใจไดอยางไร.

ภาควชาเคม คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน. ภาควชาเคม. (2539) เอกสารประกอบการประชมเชงปฏบตการเคมวเคราะหดวยเครองมอ. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม แมน อมรสทธม อมร เพชรสม. (2535). หลกการและเทคนคการวเคราะหเชงเครองมอ. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณ มหาวทยาลย. กรงเทพฯ. ศภชย ใชเทยมวงศ. (2539). เคมวเคราะห. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณ

มหาวทยาลย. พมพครงท 3. กรงเทพฯ ศนยวจยการหมกเพอเพมมลคาผลตภณฑทางการเกษตร. (2547). เอกสารอบรมกระบวนการ

วเคราะหไวน. คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน. Bhutto M. A., Dahot M. U. (2008). Effect of alternative carbon and nitrogen sources on

production of alpha-amylase by Bacillus megaterium. Journal of Biotechnology. V1-0-073. S293. Xiangyamg G., He Q., weiguo Z. 2008. Ethanol production from soybean sirup by co-cultivation of Aspergillus oryzaeand Saccharomy cescerevisiae. Journal of Biotechnology. V1-Y-043. S297.

Kellner R, Mermet J.-M. Otto M, Vacarcel M, Widmer H.M. (2004). Analytical Chemistry: A modern Approach to Analytical Science Second Edition.


Geramany: PhotoDisc Inc. Mark S. Cracolice, Edward I. Peters. (2013). Introductory Chemistry: An Active Learning Approach. 5th edn. University of Massachusetts, Amherst: Graphic World Inc. Robert de Levie. (2001). How to Exel in Analytical Chemistry and in General Scientific Data Analysis. Press syndicate of the university of Cambridge.

United Kingdom. Stoog D. A, Holler J. F, Nieman T.A. (1998). Principles of Instrumental Analysis. 5th edn. United States of America: Thomson Learning Inc. Stoog D. A., West D. M., Holler J. F, Crouch S. R. (2000). Analytical Chemistry An Introduction. 7th edn. United States of America: Thomson Learning Inc. Stoog D. A., West D. M., Holler J. F, Crouch S. R, Chen S. C. (2011). Introduction to Analytical Chemistry. 9th edn. Singgapore: New Tech Park (Looby H). Stoog Douglas A., West D. M., Holler J. F, Crouch S. R. (2014). Fundamentals of Analytical Chemistry. 7th edn. Singgapore: New Tech Park (Looby H). Scheper T. (1965). Advances In Biochemical Engineering Biotechnology : Modern

Advances in Chromatography. Geramany: Thomson. John H. N. (2003). Nuclear Magnetic Resonance Spectrophotoscopy. United States

of America: Pearson Education Inc. Keawnaree P, Vichitphan K, Klunrit P, SIRI B. (2007). The study of germination

changes and electrolyte leaked from accelerated aging of sweet pepper seeds. Journal of Agricultural Science; 38: 156-159.

Keawnaree P, Vichitphan K, Vichitphan S, Klunrit P, SIRI B. (2010). Effects of accelerated aging and osmopriming process on seed germination and peroxidation

product in sweet pepper seed. Proceeding of the 7th National Seed Conference 2010. May 18th-20th, 2010, Topland and Convention Center Hotel, Phitsanulok, Thailand.44- 49.

Keawnaree P, Vichitphan K, Klunrit P, SIRI B. 2007. The study of germination changes and electrolyte leaked from accelerated aging of sweet pepper seeds. Journal of Agricultural Science; 38: 156-159.

Keawnaree P, Vichitphan K, Vichitphan S, Klunrit P, SIRI B. 2008. The effect of


accelerated aging seed on seed quality and electrolyte leakage in sweet pepper seed. Journal of Agricultural Science; 39: 293-296 Keawnaree P, Vichitphan S, Klunrit P, SIRI B, Vichitphan K. 2008. Electrolyte leakage

and fatty acid changing association in accelerated aging sweet pepper seed. Journal of Biotechnol. 136: S651-S651.

Keawnaree P, Vichitphan S, Klunrit P, SIRI B, Vichitphan K. (2012). The effect of high K Na Ca Mg and DAP conditions on ethanol production from sugar cane by ethanol-tolerant yeast. International Biotechnology Symposium and Exhibition (IBS 2012), September 12-22; Daeju, Korea.

Preeya Kaewnaree. (2014). A Two-Step Sequential Treatment of Ethanol Distillation Bottoms Liquid by Bacterial Fermentation and Subsequent Chlorella vulgaris Culture Under Continuous Illumination of Various Lights. KKU Research Journal Supplement Issue. 19. 98-108.

Preeya Kaewnaree. (2015). The effect of catalyst to increase hydrolysis yield of sugar from sugarcane bagasse. International Journal of Bioscience. 6(8). 71-76.

Siri, Boonmee. Vichitphan, Kanit. Kaewnaree, Preeya. Vichitphan, Sukanda. Klanrit, Preekamol. (2013). Improvement of quality, membrane integrity and

antioxidant systems in sweet pepper ('Capsicum annuum' Linn.) seeds affected by osmopriming, Australian Journal of Crop Science.7(13), 2068- 2073.

หมวดท 7 การประเมนและปรบปรงการดาเนนการของรายวชา

1. กลยทธการประเมนประสทธผลของรายวชาโดยนกศกษา - การประเมนประสทธผลในรายวชาน ทจดทาโดยนกศกษา ไดจดกจกรรมในการนาแนวคดและความเหนจากนกศกษาไดดงน - การสนทนากลมระหวางผสอนและผเรยน - การสงเกตการณจากพฤตกรรมของผเรยน - แบบประเมนผสอน และแบบประเมนรายวชา 2. กลยทธการประเมนการสอน ในการเกบขอมลเพอประเมนการสอน ทาดงน - ศกษาจากผลการเรยนของนกศกษา - การการสงเกตการณในขณะทสอนและทาปฏบตการจากทมผสอน 3. การปรบปรงการสอน


หลงจากผลการประเมนการสอนในขอ 2 จงมการปรบปรงการสอน โดยการจดกจกรรมในการระดมสมอง และหาขอมลเพมเตมในการปรบปรงการสอน 4. การทวนสอบมาตรฐานผลสมฤทธของนกศกษาในรายวชา - การทบทวนสอบการใหคะแนนจากการสมตรวจผลงานของนกศกษาโดยอาจารยทานอน - มการตงคณะกรรมการในสาขาวชา ตรวจสอบผลการประเมนการเรยนรของนกศกษา โดยตรวจสอบขอสอบ รายงาน วธการใหคะแนนสอบ และการใหคะแนนพฤตกรรม 5. การดาเนนการทบทวนและการวางแผนปรบปรงประสทธผลของรายวชา ปรบปรงรายวชาทกปหรอตามขอเสนอแนะและผลการทวนสอบมาตรฐานผลสมฤทธ

แผนบรหารการสอนประจาบทท 1 บทนา

หวขอเนอหา บทท 1 บทนา

1.1 ความสาคญของการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 1.2 สสาร 1.3 การวเคราะห 1.4 รปแบบการวเคราะห 1.5 หลกการวเคราะห 1.6 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 1

เอกสารอางอง วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจเกยวกบสสาร การวเคราะห และรปแบบการวเคราะห 2. อธบายนยามของสสาร อะตอม โมเลกล สารประกอบ สารละลาย และความเขมขนของ

สารละลายได 3. แยกความแตกตางของวธวเคราะหแบบเดมและวธวเคราะหโดยอปกรณได 4. มทกษะในการชง ตวง สาร และเตรยมความเขมขนของสาร 5. เลอกใชวธการเตรยมสารตวอยางไดอยางถกตอง

วธสอนและกจกรรม

1. อธบายนยามของการวเคราะหได 2. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 3. ทบทวนเนอหาดานการวเคราะหทางเคมทเรยนมากอน 4. กลาวนาเนอหาทจะเรยนในสปดาหน 5. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการ

สอนและรปภาพ 6. เปดโอกาสใหผเรยนถามในแตละหวขอและเสนอแนวความคดกอนขามหวขอนน 7. ตรวจสอบคาตอบของผเรยนสอบถามผเรยนถาผเรยนมขอสงสยและสรปเนอหา

ประจาบท 8. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง 9. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา 10. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน

20 แผนบรหารการสอนประจาบทท 1 เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

สอการเรยนการสอน 1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอเอกสารประกอบการสอนอเลกทรอนกส 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 5. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 6. ใบงาน

การวดและการประเมนผล การวดผล

1. ความตรงตอเวลาของนกศกษาในการสงงานและเขาเรยน 2. การซกถาม-ตอบคาถาม 3. การเขารวมกจกรรมในหองเรยน 4. ใบงาน 5. ผลการสอบยอย

การประเมนผล

1. จากการทากจกรรมเสรจตามเวลา 2. ทาใบงานถกตองและครบสมบรณ 3. ทาแบบฝกหดมความถกตองไมนอยกวารอยละ 80

บทท 1 บทนา

ในบทแรกของเอกสารประกอบการสอนเลมนจะกลาวถงบทนา ทเกยวกบความสาคญของการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ สสาร การวเคราะห หลกการการวเคราะห และสรปสาระสาคญทงหมดของการศกษาในบทเรยนน โดยรายละเอยดมดงน

1.1 ความสาคญของการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ การวเคราะหสารมความสาคญในหลายดาน เชน เคม สงแวดลอม เภสช การเกษตร ชววทยา

จลชววทยา รวมถงทางเทคโนโลยชวภาพ ซงกระบวนการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพจะเปนการศกษาเกยวกบสงมชวตปฏกรยาเคมในสงมชวต ผลตภณฑทไดจากสงมชวต เปนตน ผลจาก การวเคราะหสามารถนาไปประเมนผลการเจรญเตบโต การเพมปรมาณผลตภณฑ ตดตามกระบวนการเมแทบอลซมภายในเซลล เซลลสงมชวตมการเจรญเตบโตและการเปลยนแปลงทางดานชวเคม สารทวเคราะหสวนใหญเปนสารทเปนสารอนทรย ทมในสงมชวต หรอเกดจากปฏกรยาเคมในสงมชวต เชน คารโบไฮเดรท โปรตน ไขมน กรดนวคลอก แรธาต วตามน กจกรรมของเอนไซม เปนตน ถาเขาใจการวเคราะห นยามและหลกการวเคราะห สารและคณสมบตของสาร วธการวเคราะห และเครองมอวเคราะหทเหมาะสม จะทาใหผลการวเคราะหถกตองแมนยา สาหรบบทนจะไดกลาวถงนยามพนฐานและหลกการเบองตนของสารและคณสมบตของสาร วธการวเคราะห และเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ เพอใหนกศกษาเขาใจในภาพรวม

1.2 สสาร (Substance) สสารหรอสารทพบทวไปมสมบตแตกตางกนไปมกพบในรป อะตอม โมเลกล ไอออน หรอโมเลกลของสารประกอบ (ประภาณ เกษมศร ณ อยธยา และคณะ, 2539) และเปนองคประกอบในธรรมชาต ทเปนสวนประกอบทงในพช สตว ดน นา อากาศ เปนตน 1.2.1 อะตอม (Atom) อะตอมหรออะตอมของธาต บอยล (Robert Boyle ค.ศ. 1627-1691) นกวทยาศาสตรและนกปรชญาชาวองกฤษ (รปท 1.1) ไดอธบายคาวา ธาต (Element) เปนคนแรกจนในตนครสตศตวรรษท 19 ดาลตน (John Dalton ค.ศ. 1766-1844) (รปท 1.2) ไดพฒนาแนวคดเกยวกบอะตอม และไดทฤษฎอะตอมของดาลตน ทวาเราไมสามารถเปลยนอะตอมของธาตหนงใหเปนอะตอมของอกธาตหนงได และธาตแตละชนดมองคประกอบพนฐาน คอ อเลกตรอน โปรตอน และนวตรอน อยภายในอะตอม ซงอนภาคดงกลาวมสมบตทางไฟฟาเปน ประจลบ ประจบวก และเปนกลาง ตามลาดบ ทาใหธาตแตละชนดมสมบตเฉพาะตว เชน แคลเซยม (Ca) เปนโลหะ คารบอน (C) เปนอโลหะ ซลกอน (Si) เปนธาตกงโลหะ เปนตน อะตอมแตละชนดมมวลตางกน ดงนนการเกดปฏกรยากแตกตางกน ซงธาตทพบในปจจบนทงหมด 110 ธาต แตละชนดสามารถรวมกนดวยพนธะเคมเกดเปนสารชนดใหม ซงมสมบตแตกตางไปจากเดม ซงอยในรปโมเลกลและโมเลกลของสารประกอบ (Mark and Edward, 2013)

22 บทท 1 บทนา เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

1.2.2 สารประกอบ (Compound) ประกอบดวยธาตตงแต 2 ชนดขนไปรวมกนทางเคมเกดเปนสารประกอบซงมสมบตทางเคมและทางกายภาพแตกตางจากเดม การรวมกนทางเคมนน เปนการสรางพนธะเคม คอ การใชอเลกตรอนทเปนองคประกอบภายในอะตอมสรางพนธะเคมเพอใหธาตอยในสภาวะเสถยรมากขน อะตอมของธาตรวมกนดวยพนธะโควาเลนท (Covalent bond) เกดเปนสารประกอบโควาเลนท (Covalent compound) ยกตวอยางเชน นา (H2O) นาตาล (C6H12O6) แกสคารบอนไดออกไซด (CO2) เปนตน และการรวมกนของธาตดวยพนธะไอออนก (Ionic bond) เกดเปนสารประกอบไออนก ไดแก เกลอแกง (NaCl) แคลเซยมคารบอเนต (CaCO3) เปนตน สารประกอบทเกดขนอาจอยในสถานะ ของแขง ของเหลว หรอแกส สารประกอบนนอาจเปนสารประกอบอนทรย (Organic substance) หรอสารประกอบอนนทรย (Inorganic substance) ทเปนองคประกอบในสงมชวต พช สตว จลนทรย หรอเปนองคประกอบใน ดน นา หรออากาศ การวเคราะหสารในตวอยางสารอาจอยในรป สารบรสทธ สารละลาย หรอของผสมกไดซงเลอกใชวธวเคราะหแตกตางกนไป (Mark and Edward, 2013)

1.2.3 สารละลาย (Solution) เปนสารทประกอบดวยตวทาละลาย (Solvent) และตวถก

ละลาย (Solute) ละลายรวมกนผสมกลมกลนเปนเนอเดยวกน ดงนนในการวเคราะหปรมาณหนวยปรมาณ และหนวยความเขมขนของสารละลายจงมความสาคญในงานวเคราะห ปรมาณสารในสารละลายอาจมหนวยนาหนกเปน กรม มลลกรม ไมโครกรม หรอหนวยโมล (Mole) หนวยปรมาตรนยมใชเปนหนวย มลลลตร ไมโครลตร หรอ ลตร และหนวยความเขมขนของสารละลายใชเปน เปอรเซนต (Percentage) โมลาร (Molarity; M) นอรมอล (Normality; N) เปนตน ซงรายละเอยดจะกลาวในบทท 2 ไป (Mark and Edward, 2013)

สารในรป อะตอม ไอออน หรอโมเลกล จะมคณสมบตทมความจาเพาะแตละสาร ดงนนในงานวเคราะหสารจงนาสมบตของสารแตละชนดมาใชในงานวเคราะหทงชนดและปรมาณ สารทตองการวเคราะหอยในรป ธาต ไอออน โมเลกล โมเลกลของสารประกอบ หรอโมเลกลของสารประกอบเชงซอน จะมสมบตแตกตางกนจงนาคณสมบต การการดดกลนแสง การละลาย จดเดอด

รปท 1.1 โรเบรตบอยล (Robert Boyle) (ทมา: Acott, 1999)

รปท 1.2 จอหน ดาลตน (John Dalton) (ทมา: Jhon, 1802)

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 1 บทนา 23

จดหลอมเหลว มวลอะตอม และมวลโมเลกล โครงสรางโมเลกล หรอพลงงานพนธะเคมในโมเลกลของสาร มาใชในงานวเคราะหคณภาพและปรมาณ โดยอาศยสมบตของสารเหลาน เพอเลอกวธวเคราะหและเครองมอวเคราะหใหเหมาะสมกบคณสมบตของสาร การวเคราะหจงจะมถกตองและแมนยามากทสด 1.3 การวเคราะห (Analysis)

การวเคราะหทางเคมสามารถแบงออกเปน 2 แบบ คอ การวเคราะหแบบแผนเดม (Classical method) กบ การวเคราะหดวยอปกรณหรอเครองมอ (Instrumental analysis) ซงการวเคราะหจะใชวธวเคราะหแบบใด ขนอยกบชนดของสารทตองการวเคราะห (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535; Kellner et al., 2004)

1.3.1 การวเคราะหแบบแผนเดม เปนการวเคราะหแบบงายๆ ใชวธการอยางงาย วธการและเครองมอไมซบซอน เชน การชง ตวง วด โดยใช เครองชง ปเปต บวเรต ขวดปรมาตร กระบอกตวง เปนตน หรอการหาปรมาณโดยการไทเทรตและใชการคานวณจากสมการเคม เชน การไทเทรตหาปรมาณกรดในนาผลไม การไทเทรตหาปรมาณ กรดไขมนระเหยงายจากกระบวนการหมกกาซชวภาพ เปนตน (Kellner et al., 2004)

1.3.2 การวเคราะหดวยเครองมอ เปนการวดสมบตทางกายภาพและทางเคมของสารทสนใจแลวเปลยนใหเปนปรมาณสารนนได ซงปจจบนใชเทคนคและสมบตหลายอยางเขามาชวยในงานวเคราะห เชน การวดปรมาณไฟฟาเมอสารแตกตวเปนไอออน การใชเทคนคทางแสง การวดคา การดดกลนแสงแลวคานวณกลบเปนปรมาณสาร การใชสมบตหรอความสามารถในการละลายใน ตวทาละลายเพอแยกสารผสมออกจากกนหรอทเรยกวาเทคนคโครมาโทกราฟ ซงวเคราะหทงชนดและคานวณหาปรมาณสารได หลกการทนยมนามาใชในการสรางเครองมอวเคราะหมดงน

1.3.2.1 การวเคราะหโดยอาศยไฟฟา (Electro analytical method) เปนการวดปรมาณไฟฟาจากนนคานวณกลบเปนปรมาณสาร เชน การวดความเปนกรด-ดางโดยใชเครองพเอช (pH-meter) เปนการวดความเขมขนของไฮโดรเจนไอออน (H+) ในสารละลายทมหนวยเปนโมลาร เครองพเอชวดเปนปรมาณไฟฟา จากนนคานวณกลบเปนคาพเอช ระหวางพเอช 1-14 (ศภชย ใชเทยมวงศ, 2539; Kellner et al., 2004)

1.3.2.2 การวเคราะหโดยเทคนคทางแสง (Optical techniques) เปนการวดพลงงาน (Power) ของคลนแมเหลกไฟฟาทถกดดกลนโดยสาร (Absorption) หรอถกเปลงออกมาจากสาร (Emission) เทคนคทางแสงหรอเทคนคสเปกโทรโฟโตเมตร (Spectrophotometry) ทใชในงานวเคราะหวเคราะหพนฐาน ในชวงแสง เอกซเรย ยว วสเบล หรออนฟาเรด ไดแก เครองสเปกโทรโฟโตมเตอร (Spectrophotometer) ใชหลกการดดกลนแสงของสารตวอยางในรปโมเลกลหรอโมเลกลของสารประกอบไดทงสารทมสและไมมสทดดกลนไดในชวงยวและวสเบล (UV-visible) เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร (Atomic absorption spectrophotometer; AAS) วเคราะหสารในรปอะตอมอสระ โดยเฉพาะอะตอมของโลหะ อะตอมโลหะแตละชนดสามารถดดกลนแสงไดสงสดทความยาวคลนแตกตางกน จงใชหลกการนเพอวเคราะหหาชนดของโลหะ และปรมาณ


ของอะตอมโลหะจากปรมาณการดดกลนแสงของอะตอมในตวอยาง ซงเทคนคนมความถกตองแมนยาสงกบงานวเคราะหอะตอมของโลหะ (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535; Kellner et al., 2004) เครองแมสสเปกโทรโฟโตมเตอร (Mass spectrophotometer; MS) วดมวลโมเลกลของสาร เครองนวเคลยรแมกเนตกเรโซแนนซสเปกโตร สโคป (Nuclear magnetic resonance spectroscopy; NMR) เปนเทคนคทเกยวของกบ การดดกลนคลนแมเหลกไฟฟาในชวงคลนวทยซงมพลงงานอยในชวงทจะทาใหเกดการเปลยนแปลง "สปน"ซงเปนสมบตเฉพาะของนวเคลยสแตละชนดเมออยภายใตสนามแมเหลก (John, 2003, Stoog et al., 2014) เครอง Fourier Transform Infrared Spectrophotometer (FT-IR) เปนเครองมอทใชในการวเคราะห ตรวจสอบ พสจน เกยวกบโมเลกลของสารซงสามารถวเคราะหตวอยางไดทง ของแขง ของเหลว และกาซ โดยการวดคาการดดกลนแสงทอยในชวงอนฟราเรด เครองเอกซเรยดฟแฟรกชน เครองวเคราะหการเลยวเบนรงสเอกซ หรอ X-ray Diffractometer (XRD) เปนเครองมอทใชในการวเคราะหสมบตของวสด อาศยหลกการเลยวเบนของรงสเอกซ สามารถทาการวเคราะหไดทงสารประกอบทมอยในสารตวอยางและนามาใชศกษารายละเอยดเกยวกบโครงสรางผลกของสารตวอยางในผลกของตวอยางแตละชนด จะมขนาดของยนตเซลล (Unit Cell) ทไมเทากน ทาใหรปแบบ (Pattern) ของการเลยวเบนรงสเอกซ ทออกมาไมเทากนทาใหสามารถหาความสมพนธของสารประกอบตางๆ กบรปแบบการเลยวเบนของรงสเอกซได ซงจะทาใหทราบวา ในตวอยางนนๆ มสารประกอบสารใด จากนนคานวณหาปรมาณขององคประกอบตางๆ ทมในตวอยางได (Stoog et al., 1998, Stoog et al., 2014)

1.3.2.3 เทคนคโครมาโทกราฟ (Chromatography) เปนเทคนคหนงทสาคญและนยมใชในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ เปนวธการแยกสารผสมออกจากกนและทาใหสารมความเขมขนสงขน โดยทาใหสารบรสทธกอนนาไปวเคราะหเชงคณภาพหรอเชงปรมาณ โดยการแยกองคประกอบของตวอยางทอยในรปสารละลายโดยอาศยวฏภาค (Phase) 2 วฏภาค คอ วฏภาคอยนง (Stationary phase) ทาหนาทเปนตวหนวงสารโดยการดดซบสารใหเคลอนทชา และวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) อาศยความสามารถการละลายในตวทาละลายทาหนาทพาสารเคลอนท คาวา โครมาโทกราฟ (Chromatography) มาจากคาในภาษากรก 2 คา คอ Chromate แปลวา ส และ Graphy แปลวา เขยนหรอบทบนทก เรมตนโครมาโทกราฟขนพนฐาน คอ เปเปอรโครมาโทกราฟ (Paper chromatography) โดยใชกระดาษเปนตวดดซบหรอวฏภาคอยนง และตวทาละลายเปนตวพาใหสารเคลอนทแยกออกจากกนหรอเปนวฏภาคเคลอนท แตการใชงานไมหลากหลายเนองจากใชแยกสารไดบางชนดเพราะกระดาษมขอจากดเรองความแขงแรงและทนทานตอ ตวทาละลาย จงไดนาทนเลเยอรโครมาโทกราฟ (Tin layer chromatography; TLC) มาแกปญหาดงกลาว โดยใชสารดดซบเปน ซลการเจล (Siligar gel) ทเคลอบบนแผนกระจกหรอปจจบนใชเคลอบบนแผนอลมเนยม ซงนยมใชในงานทางเภสช เคมอนทรย และชวเคม ในการแยกสารผสมทสกดจากยาและผลตภณฑธรรมชาต (พฒนา เหลาไพบลย และอรศรา ศรวฒนา, 2536; Stoog et al., 2014)

ตอจากนนเทคนคโครมาโทกราฟไดพฒนาตอโดย ไมเคล ซวตต ไดศกษาสมบตของคลอโรฟลลโดยใชเทคนคคอลมนโครมาโทกราฟ (Column chromatography) ใชสารดดซบ (Absorbent) บรรจในคอลมน หยดคลอโรฟลล แลวใชตวทาละลายชะ องคประกอบของคลอโรฟลลจะถกแยกออกเปนแถบๆ (Band) ซงแตละแถบจะมสตางกน ปจจบนคอลมนโครมาโทกราฟ ได


พฒนาเพอใหการวเคราะหมประสทธภาพสง ขน ม 2 ชนด คอ แกสโครมาโทกราฟ (Gas chromatography; GC) และโครมาโท กราฟแบบของเหลวแรงดนสง (High performance liquid chromatography; HPLC) (บณฑต สละศาสตร และธรพล วงศชนะพบลย, 2539; Stoog et al., 2014) ซงมประสทธภาพสามารถวเคราะหไดทงชนดและปรมาณสาร นอกจากนยงมความจาเพาะกบกลมสารทตองการวเคราะห เทคนคแกสโครมาโทกราฟ และโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงถกพฒนาใหมประสทธภาพในการวเคราะหสารใหดขน (พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา, 2536). โดยการประยกตใชกบเครองวเคราะหอน เชน เทคนค โฟลอนเจคชน (Flow injection analysis) (บณฑต สละศาสตร และธรพล วงศชนะพบลย, 2539) ใชวเคราะหยาทางเภสช หรอเชอมตอกบแมสเปกโทรโฟโทเมตร (Mass spectrophotometry) เพอวเคราะหสารระดบโครงสรางทางเคมในโมเลกล (Stoog et al., 2014, Kellner et al., 2004). ปจจบนยงพฒนาโปรแกรมคอมพวเตอรเพอใชใน การประมวลผลไดแมนยา ละเอยด และถกตองมากยงขน (Robert, 2001) 1.4 รปแบบการวเคราะห

ไมวาการวเคราะหจะเปนการวเคราะหแบบแผนเดมหรอการวเคราะหโดยใชเครองมอใน การวเคราะห ในการวเคราะหดงกลาวจะตองวเคราะหทงชนดและปรมาณสาร การวเคราะหจงม 2 แบบ คอ การวเคราะหเชงคณภาพ (Qualitative analysis) และการวเคราะหเชงปรมาณ (Quantitative analysis) ซงการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพทาการวเคราะหทง 2 แบบรวมกน (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535, Kellner et al., 2004).

1.4.1 การวเคราะหเชงคณภาพ คอ การวเคราะหหาชนดของสารเคมในสารตวอยางทอยในรปอนภาคตางๆ เชน อะตอม (Atom) โมเลกล (Molecule) ไอออน (Ion) สารประกอบ (Compound) หรอสารประกอบเชงซอน (Complex compound) (Mark and Edward, 2013) ยกตวอยางการวเคราะหคณภาพในสารตวอยาง ไดแก การวเคราะหชนดของนาตาลในนาผลไม ไดแก กลโคส ซโครส ฟรกโตส หรอ กาแลกโตส จากนนจงทาการวเคราะหหาปรมาณนาตาลแตละชนด หรอการวเคราะหชนดของแอลกอฮอลทไดจากกระบวนการหมกแอลกอฮอลวาเปนแอลกอฮอลชนดใด เชน เอทานอล เมทานอล โพรพานอล บวทานอล (Kaewnaree, 2014) หรอแมกระทงการวเคราะหแรธาตในตวอยาง เชน โพแทสเซยม ไนโตรเจน โซเดยม แคลเซยม เปนตน (Kaewnaree et al., 2008, Kaewnaree, 2014).

1.4.2 การวเคราะหเชงปรมาณ เปนการวเคราะหสารโดยนาสมบตของสารแตละชนดทตองการวเคราะห สมบตของสาร เชน จดเดอด จดหลอมเหลว ขนาดหรอมวลโมเลกล การดดกลนแสง การเกดปฏกรยาเคม การละลายในตวทาละลาย สภาพขวของสาร เปนตน (แมน อมรสทธ และ อมร เพชรสม, 2539) ขนอยกบสารทตองการวเคราะหเปนองคประกอบในตวอยางใด เปลยนสมบตของสารเปนปรมาณ ในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ สวนใหญเปนการวเคราะหสารทเปนองคประกอบในสงมชวต สารทเกดจากกระบวนการทางชวเคมหรอกระบวนการเมแทบอลซม ซงสารทตองการวเคราะหอาจอยในรปแบบทแตกตางกน


1.5 หลกการวเคราะห (Concept of analysis) งานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพจงนยมใชเครองมอวเคราะหชนสง ในการวเคราะหชนดและปรมาณแรธาตและสารอาหารตางๆ ในเซลลพชและสตว รวมทงตดตามการเปลยนแปลงของ แรธาตและสารอาหารระหวางกระบวนการหมกของจลนทรย และผลตภณฑทไดจากกระบวนการทางชวภาพทกชนด ซงในบทตอๆ ไปจะกลาวถง ทฤษฎ และหลกการในการวเคราะหชนดและปรมาณ สารตวอยาง การใชเครองมอวเคราะห การวเคราะหเชงคณภาพและการวเคราะหเชงปรมาณโดยใชเครองสเปกโตรโฟโทมเตอร (Spectrophotometer) เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทร โฟโตมเตอร เครองแกสโครมาโทกราฟ และโครมาโทรกราฟแบบของเหลวแรงดนสง แตใน งานวเคราะหดวยเครองมอจะมประสทธภาพมากขนถาตวอยางถกเตรยมกอนการวเคราะหอยางถกตองเหมาะสม การเตรยมสารตวอยางในการวเคราะหเชงปรมาณ การคานวณ หนวยพนฐาน และการประยกตใชในงานทางเทคโนโลยชวภาพ เปนกระบวนการวเคราะหในกระบวนการวเคราะหสาร เพอการวเคราะหทถกตองแมนยาจงตองควบคมการวเคราะหใหเปนขนตอน ซงเปนปจจยสาคญในการวเคราะห อาจแบงขนได 5 ขนดงน (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535, ศภชย ใชเทยมวงศ, 2539) ขนตอนท 1 การเตรยมสารตวอยาง (Sampling) ในการเตรยมสารตวอยางจะตองคานงถง สารตวอยางวาเปนสารประเภทใด เพอใหผลการวเคราะหออกมาเปนตวแทนของตวอยางทตองการวเคราะหไดเปนอยางด ตวอยางทนามาวเคราะหตองเปนตวแทนของตวอยางทงหมด ดงนน จานวนตวอยาง ชนดของตวอยาง สถานะของตวอยาง จงเปนตวแปรสาคญในงานวเคราะห เชน การวเคราะหชนดและปรมาณกรดไขมนระเหยงายในนาหมกกาซชวภาพ ตวอยางทเปนตวแทนของตวอยางตองเปนเนอเดยวกน ปรมาณตวอยางทเกบแตละครงตอปรมาณนาหมกทงหมด จานวนครงทเกบตวอยาง เปนตน

ขนตอนท 2 การเลอกวธวเคราะห (Method of analysis) การเลอกวธวเคราะหนบวาเปนขนตอนทสาคญขนตอนหนง ซงวธวเคราะหมหลายวธ สารแตแตชนดกมวธทเหมาะสมแตกตางกน สารชนดเดยวอาจมวธวเคราะหไดหลายวธ จงตองเลอกวธท ดทสดและเหมาะสมทสด เชน การวเคราะหปรมาณนาตาลในนาออย อาจใชการวเคราะหดวยเครองสเปกโตรโฟโทมเตอรหรอ โครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง ถาใชวธวเคราะหปรมาณนาตาลโดยใชวธฟนอลซลฟวรกแอซดดวยเครองสเปกโทรโฟโทมเตอร จะทราบปรมาณนาตาลทงหมด ขอดของวธนคอ ใชเวลานอยและเปนวธทคาใชจายถกแตไมสามารถหาชนดของนาตาลได แตถาใชวธวเคราะหโดยใชเครอง โครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง สามารถหาชนดและปรมาณนาตาลได สามารถวดปรมาณนาตาลปรมาณนอยๆ ในตวอยางได ความถกตองแมนยา และความจาเพาะเจาะจงสง แตคาใชจายในการวเคราะหสงกวาการวเคราะหดวยเครองสเปกโตรโฟโทมเตอร ดงนนในการวเคราะหจะตองตดสนใจเลอกวธวเคราะหสารตวอยางใดๆ จะตองคานงถงแฟกเตอรท เปนองคประกอบใน การตดสนใจเลอกวธวเคราะห ไดแก ความแมน (Accuracy) ระดบความไว (Sensitivity) ความเลอกเฉพาะ (Selectivity) ระยะเวลาการวเคราะห (Speed) คาใชจายในการวเคราะห (Cost) และ การยอมรบในแงของกฎหมาย (Legality)


ความแมน (Accuracy) ในแงของความถกตองจะตองพยายามเลอกวธทใหผลใกลเคยงกบคาจรงมากทสด แตบางครงกมขอจากดจงไมสามารถเลอกวธทดทสดได จงตองกาหนดระดบความแมนทสามารถยอมรบได และเลอกวธทเหมาะสมกบระดบความแมนนน

ระดบความไว (Sensitivity) ระดบความไวของวธวเคราะหหมายถงปรมาณสารทนอยทสดทวธวเคราะหนนๆ สามารถตรวจวดได ตวอยางทมปรมาณสารทตองการวเคราะหนอย ถาใชการวเคราะหแบบแผนเดม จะไมสามารถใหผลทถกตองได เชน การวเคราะหหาโลหะในตวอยางทอยในระดบสวนในลานสวน (Parts per million, ppm) ความเขมขนทตาระดบนถาใชวธวเคราะหแบบแผนเดมโดยวธไทเทรต อาจไดผลทไกลจากคาจรงหรอวเคราะหไมไดเลย เนองจากวธวเคราะหโดยการไทเทรตเหมาะกบความเขมขนของสารระดบคอนขางสง จงตองเลอกวธทมความไวมากกวา เชน วธอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมตร (Atomic absorption spectrophotometry) ซงถาเปนการหาปรมาณโลหะในระดบ เชน สวนในลานสวน (Parts per million; ppm) หรอ มลลกรมตอลตร (mg/L) สามารถเลอกใชเครอง อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมเตอร แบบเฟลม (Flame) แตถาวเคราะหหาปรมาณทมปรมาณโลหะระดบตามาก สวนในพนลานสวน (Parts per million; ppb) หรอไมโครกรมตอลตร (µg/L) จะตองวเคราะหดวยอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมเตอร แบบแกรไฟต (Graphyte) จงจะสามารถวเคราะหได

ความเลอกเฉพาะ (Selectivity) ในสารตวอยางสารทมสารอนรวมกบสารทตองการวเคราะหอาจจะรบกวนการวเคราะหสารทเราตองการ การวเคราะหดงกลาวอาจกอใหเกดผล การวเคราะหทมคามากกวาทจะเปน การรบกวนแบบนกอใหเกดความคลาดเคลอนไปทางบวก (Positive error) เชนใชวธการวเคราะหกรดในนาตวอยางดวยเครองพเอช ซงอเลคโทรด (Electrode) ของเครองพเอชจะวดประจบวกหนง (+) กรดจะวดความเขมขนของไฮโดรเจนไอออน (H+) ซงเปนไอออนบวก แตถาในนาตวอยางทนามาวเคราะหมไอออนบวกหนงชนดอน เชน โซเดยมไอออน (Na+) หรอ โพแทสเซยมไออน (K+) ซงไอออนทงสองจะไปรบกวนการวดไฮโดรเจนไอออน ทาใหวดคาออกมาปรมาณมากกวาทเปนจรง ในทางตรงกนขาม ถาในสารละลายตวอยางมสารทสามารถทาสญญาณ การวดลดนอยลงจะกอใหเกดความคลาดเคลอนไปในทางลบ (Negative error) เชน ในการหาปรมาณแมงกานสไอออน (Mn2+) ในสารละลายโดยการออกซไดสแมงกานสไอออน (Mn2+) ใหเปนแมงกานสออกไซด (MnO4-) ซงเปนสารสชมพ วเคราะหดวยเครองสเปกโตรโฟโทมเตอร แตถาในสารละลายตวอยางมคลอไรดไอออน (Cl-) ปนอยกบแมงกานสออกไซด (MnO4-) จะทาปฏกรยากบคลอไรดไอออน (Cl-) ทาให แมงกานสออกไซด (MnO4-) ลดนอยลง การรบกวนแบบนจะกอใหเกดความคลาดเคลอนไปในทางลบ

ระยะเวลาการวเคราะห (Speed) นบวาเปนสงทสาคญอกอยางหนงในงานวเคราะหบางวธใหความแมนยาด ระดบความไวในการวเคราะหด ปญหาเนองจากการรบกวนสารอนไมม แตเวลาทใชในการวเคราะหนานมากเพราะมขนตอนการวเคราะหหลายขนตอน เชน การหาการเจรญของยสต ซงม 3 วธ คอ การหานาหนกแหง การนบเซลลดวยฮมาไซโทรมเตอรผานกลองจลทรรศน และการวดความขนของสารละลาย (Optical density; OD) หรอการดดกลนแสง (Absorbance) ดวยเครองสเปกโตรโฟโทมเตอร การวดการเจรญดวยการหานาหนกแหง มหลายขนตอน ไดแก ปนเหวยงเซลล อบเซลล 4 ชวโมง ทงใหเยนในโถดดความชน 2 ชวโมง และชงนาหนก ซงตองใชเวลาในการ


วเคราะหทงหมด 6 ชวโมง สวนวธการนบเซลลดวยฮมาไซโทรมเตอรผานกลองจลทรรศน ใชเวลาเพยง 2 ชวโมง นบเซลลและคานวณหาปรมาณ และ วธการวด OD ดวยเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร ใชเวลาเพยง 3 นาท ซงใชเวลาสนและไดผลวเคราะหรวดเรว แตการหานาหนกแหงใหความถกตองมากกวาแตใชเวลามากกวาวธการนบเซลลและวธการวด OD ในการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ การหาการเจรญของเชอจลนทรยนยมใชการวด OD เพราะมความสะดวกและรวดเรวกวา (Kaewnaree et al., 2008, Kaewnaree, 2014).

คาใชจายในการวเคราะห (Cost) คาใชจายในการวเคราะหตอการวเคราะหหนงครงมความสาคญในการตดสนใจเลอกวธวเคราะหในแงของความประหยด เปรยบเทยบกบแฟกเตอรอนๆ ทตองการและความสาคญของงานทตองวเคราะห เชน การวเคราะหปรมาณนาตาลทไดจากการยอยสลายชานออย ถาตองการเพยงทราบปรมาณนาตาล สามารถเลอกวเคราะหนาตาลทงหมดดวยวธ ฟนอลซลฟวรกดวยเครองสเปกโทรโฟโตมเตอรได คาใชจายในการวเคราะหตอตวอยางเพยง 100 บาท แตถาตองการวเคราะหชนดและปรมาณนาตาลทใหความแมนยาและใหความถกตองสงตองใชเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง แตคาใชจายในการวเคราะหตอตวอยาง 1,000 บาท ซงวเคราะหไดละเอยดและแมนยากวาแตคาใชจายสงกวา

การยอมรบในแงของกฎหมาย (Legality) ผลการวเคราะหตองเปนทยอมรบในแงของกฎหมาย เชน เกยวกบคณภาพของผลตภณฑอตสาหกรรม ประเทศไทยมสานกงานมาตรฐานผลตภณฑอตสาหกรรม (สมอ.) ซงสานกงานจะระบวธวเคราะหผลตภณฑอตสาหกรรมตางๆ ไว เชน การวเคราะหไวน นาผลไมบรรจขวด เปนตน หรอในการวเคราะหในหองปฏบตการตองอางวธวเคราะห เชน การวเคราะหการผลตสารตานอนมลอสระทงหมดในสาหรายคลอเรลลาโดยวธ Diphenyl–1–picrylhydrazyl assay (DPPH) การวเคราะหปรมาณนาตาลทงหมด (Total Sugar) โดยวธ Phenol Sulfuric Total Sugar การวเคราะหปรมาณไนโตรเจนทงหมดโดยใชวธเจลดาหว (Kjeldahl Method) เปนตน

ขนตอนท 3 การขจดสารรบกวนการวเคราะห (Eliminating interference analysis) สารทเปนตวรบกวนงานวเคราะหอาจถกนาออกจากสารตวอยางโดยวธการแยก (Separation) เชน การใชกรวยแยกชนนาและนามน การตกตะกอน (Precipitation) เชน ตกตะกอนโปรตนจากสารสกดจากเซลลเพอนาสารสกดไปวเคราะหแอคตวตของเอนไซม หรอใชเทคนคการสกดออกดวยตวทาละลาย (Solvent extraction) เชน การสกดคลอโรฟลลดวยเมทานอลจากเซลลสาหรายคลอเรลลากอนนาไปวเคราะหชนดและปรมาณของคลอโรฟลล เอและบ โดยใชเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง หรอการแยกสารโดยวธโครมาโทกราฟ เปนวธการแยกสารผสมใหบรสทธกอนนาไปวเคราะห เชน แยกคลอโรฟลลเอ ออกจากคลอโรฟลล บ กอนนาไปวเคราะหชนดและปรมาณโดยใชเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง หรอการแยกสารโดยวธโครมาโทกราฟ แยกองคประกอบในสารสกดจากสมนไพรออกเปนกลมสารกอนนาไปวเคราะหชนดและปรมาณโดยใชเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง

ในทางตรงกนขามสารทตองการวเคราะหอาจถกแยกออกจากสารตวอยางหรอสารทเปน ตวรบกวนการวเคราะหในวธวเคราะห เชน การหาชนดและปรมาณสารในนาสมควนไม ตองใชวธแยกสารท ตองการ ว เคราะหออกจากสารละลายตวอย าง โดยใช เทคนคสปม (Solid-phase


microextraction, SPME) สารทตองการวเคราะหจะถกดดซบออกจากสารตวอยางโดยโพลเมอร แลวนาไปวเคราะหดวยเครองแกสโครมาโทกราฟ หรอการกาจดสารรบกวนอกวธหนงโดยการเปลยนสารทใหเปนสารชนดอน เรยกวา มาสคง (Masking) โดยการเปลยนสารชนดหนงซงไมสามารถทาปฏกรยาแบบเดยวกนกบสารทตองการวเคราะห เชนการวเคราะหหาปรมาณฟลออไรดในนา ทมไอออนของเหลกหรออลมเนยมรบกวนอย ซงไอออนทงสองจะรวมกบฟลออไรดเกดเปนสารประกอบเชงซอน จงทามาสคงโลหะทงสองดวยสารละลายโซเดยมซเตรต ทาใหโลหะทงสองรวมตวกบซเตรตไอออน ฟลออไรดจงไมถกรบกวน

ขนตอนท 4 การแปลความหมายเชงปรมาณ (Quantitation) การแปลสญญาณวเคราะหมาเปนปรมาณของสารทตองการวเคราะห ตองอาศยความรทางทฤษฎ และปฏกรยาทเกดขนระหวางสารทตองการวเคราะหกบสารรเอเจนต (Reagent) ในแงการวดสมบตทางกายภาพ และทางเคมของ สารนนๆ หรอการทากราฟมาตรฐานของสารมาตรฐานมาหาปรมาณสญญาณ เชน ความเขมขนสารกบคาการดดกลนแสง (Absorbance) เปนสญญาณของเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร และเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร สญญาณทแปลจากปรมาณไฟฟาเปนพนทใตพค (Peak area) หรอความสงของพค (High peak) เปนสญญาณของเครองแกสโครมาโทกราฟและโครมาโท กราฟแบบของเหลวแรงดนสง ดงตารางท 1.1

ตารางท 1.1 การจาแนกวธวเคราะหและสญญาณการวเคราะห

วธวเคราะห (Analytical Method)

สญญาณการวเคราะห (Measurement Signal)

Gravimetric Analysis ชงนาหนก (Mass) Volumetric Analysis วดปรมาตร (Volume) Electroanalysis ปรมาณไฟฟา (Electric Quantity) Potentiometry ความตางศกยไฟฟา (Potential) Voltametry ศกยไฟฟาและกระแสไฟฟา (Voltage and Current) Amperometry กระแสไฟฟา (Current) Coulometry ประจไฟฟา (Coulomb) Conductometry คาการนาไฟฟา (Conductance) Spectrophotometry Gas chromatography; GC) High performance liquid chromatography; HPLC)

รงส แมเหลกไฟฟา ดดกลนแสง หรอ ปลอยแสงออกมา (Electromagnetic Radiation Absorbed or Emitted) พนทใตพคและความสงของพค (Peak area or High peak) พนทใตพคและความสงของพค (Peak area or High peak)

ทมา: ศภชย ใชเทยมวงศ, 2539, Kellner et al., 2004.


ขนตอนท 5 การประเมนผลการวเคราะห (Evaluation analysis) หลงกระบวนการวเคราะหดาเนนมาสนสดลงในขนตอนท 4 จะไดผลการวเคราะห จากนนจะ

เปนการประเมนผลการวเคราะหทไดมความเชอถอไดมากนอยแคไหน ซงจะตองใชสถตเขามาชวย เชน T-test และ F-test หรอโปรแกรมทชวยประเมนผล เชน SAS (Statistical Analysis System) หรอ SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) เปนโปรแกรมสาเรจรปทางสถต (Statistical package) เปนโปรแกรมสาหรบการวเคราะหขอมลทางสถตโดยตรงในระยะแรกโปรแกรมสาเรจรปทางสถตทใชกบคอมพวเตอรมไมมากนกโปรแกรมทมชอเสยงและเปนทรจกกนดคอ โปรแกรมสาเรจรป SPSS โปรแกรมสาเรจรป SAS และโปรแกรมสาเรจรป BMDP (Biomedical Computer Program) ในปจจบนนไดมความกาวหนาทางเทคโนโลยดานไมโครคอมพวเตอรทาใหการประมวลผลขอมลมประสทธภาพมากขนดงนนนกวจยจงหนมาใชไมโครคอมพวเตอรมากขน เพราะมความสะดวกมากกวา (Robert, 2001)

จะเหนไดวาในงานวเคราะหสารนอกจากคณสมบตสารทตองการวเคราะหเพอทจะนามาเลอกวธวเคราะหใหเหมาะสมแลว ความถกตองในการวเคราะหยงขนอยกบระบบประมวลผล การวเคราะหจงจะสามารถประเมนผลการวเคราะหออกมาไดอยางถกตอง ในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพจงตองใชวธการวเคราะห เครองมอวเคราะหทเหมาะสม และระบบการประมวลผลทดซงจะไดกลาวในบทตอไป

1.6 สรปประจาบท การวเคราะหสารเปนการวเคราะหทงชนดและปรมาณสาร ซงสารอาจอยในรป อะตอม ไอออน

โมเลกล สารประกอบ หรอสารประกอบเชงซอน ในรปของแขง ของเหลว หรอแกส ในการวเคราะหผวเคราะหตองรคณสมบตพนฐานของสาร เชน จดเดอด จดหลอมเหลว มวลโมเลกล การดดกลนแสง การละลาย หรอสภาพขว เพอนาคณสมบตดงกลาวมาใชเลอกวธเกบตวอยาง วธการวเคราะห และเครองมอวเคราะหทเหมาะสม เพอใหการวเคราะหทงชนดและปรมาณมความถกตองแมนยาทสด โดยเฉพาะเครองมอวเคราะหทาใหสะดวก รวดเรว การวเคราะหถกตองแมนยามากขน และนอกจากนยงมความจาเพาะเจาะจงสงกบสารมราตองการวเคราะหดงตารางท 1.2


ตารางท 1.2 ตารางการวเคราะหสาร

เครองมอวเคราะห ความจาเพาะตอสาร สเปกโตรโฟโทมเตอร UV-Visible การดดกลนแสงของสารทอยในรปโมเลกลของ

สารประกอบหรอสารประกอบเชงซอน อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตโฟโทมเตอร การดดกลนแสงของสารทเปนโลหะทอยในรป

อะตอมอสระ เครองแกสโครมาโทกราฟ โม เลก ลของสารจ ด เ ดอดจดหลอม เหลว ต า

โดยเฉพาะแกส เชน แกสคารบอนไดออกไซด ออกซเจน มเทน หรอสารระเหยงาย

โครมาโทรกราฟแบบของเหลวแรงดนสง โมเลกลของสารจดเดอดจดหลอมเหลวสงระเหยกลายเปนไอยาก

ทมา: ศภชย ใชเทยมวงศ, 2539, Kellner et al., 2004.

ซงปจจบนในการวเคราะหสารยงนาหลกประมวลผลดวยโปรแกรมสถตและระบบประมวลผลโดยใชคอมพวเตอรเขามาชวยเพอใหการวเคราะหมความถกตองมากขน หรอการประยกตใชเครองมอวเคราะหหลายชนดรวมกน เชน HPLC-Flow injection analysis ในการวเคราะหยา เครอง GC-MS และ HPLC-MS ในการวเคราะหสารระดบมวลโมเลกลซงสามารถวเคราะหไดทงชนดและปรมาณซงการวเคราะหรวดเรวใชเวลานอยลงหลายเทา


แบบฝกหดทายบท บทท 1

1. จงอธบายการวเคราะหดวยเครองมอคออะไร 2. จงอธบายการวเคราะหเชงคณภาพและการวเคราะหเชงปรมาณคออะไร 3. จงแยกรปของสารทจะวเคราะหในสารตวอยางอยในรปใดบาง 4. จงบอกสมบตของสารทนามาใชในงานวเคราะหมอะไรบาง 5. จงอธบายสารละลายคออะไร 6. จงยกตวอยางหนวยความเขมขนของสารละลายมา 2 หนวยความเขมขน พรอมอธบายความหมาย 7. จงบอกปจจยทสาคญทใชเลอกวธวเคราะหสารทางเทคโนโลยชวภาพ 8. จงอธบายความแมน คออะไร 9. จงบอกเครองมอวเคราะหใดมความจาเพาะกบวเคราะหสารทมจดเดอดจดหลอมเหลวตา 10.จงยกตวอยางเครองมอวเคราะหทใชเทคนคทางแสงมา 3 ชนด


เอกสารอางอง

บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, บรรณาธการ. (2539). เอกสารประกอบการประชมเชงปฏบตการเคมวเคราะหดวยเครองมอ. 6-10 พฤษภาคม 2539; ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม. เชยงใหม.

ประภาณ เกษมศร ณ อยธยา. อาพน เพญโรจน. สอาดศร กาญจนาลย. ศภชย ใชเทยมวงศ. มานตย ปญจมาลา. และสภาพ บญยะรตเวช. (2539). เคมทวไป เลม 1. จฬาลงกรณมหาวทยาลย. พมพครงท 6.

พฒนา เหลาไพบลย. และอลศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวนการวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.

แมน อมรสทธ. และอมร เพชรสม. (2535). หลกการและเทคนคการวเคราะหเชงเครองมอ. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณ มหาวทยาลย. กรงเทพฯ.

ศภชย ใชเทยมวงศ. (2539). เคมวเคราะห. กรงเทพฯ: สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย. Acott C. (1999). The diving "Lawers": A brief resume of their lives. South Pacific

Underwater Medicine Society journal. 29 (1). Jhon Dalton. (1802). Essay IV. On the expansion of elastic fluids by heat. Memoirs of

the Literary and Philosophical Society of Manchester, vol. 5, pt. 2, p 595-602; see p 600.

John H. N. (2003). Nuclear Magnetic Resonance Spectrophotoscopy. United States of America: Pearson Education Inc.

Kaewnaree P, Vichitphan S, Klunrit P, SIRI B and Vichitphan K. 2008. Electrolyte leakage and fatty acid changing association in accelerated aging sweet pepper seed. Journal of Biotechnology. 136: S651-S651.

Kaewnaree P. (2014). A Two-Step Sequential Treatment of Ethanol Distillation Bottoms Liquid by Bacterial Fermentation and Subsequent Chlorella vulgaris Culture Under Continuous Illumination of Various Lights. KKU Research Journal Supplement Issue. 19. 98-108.

Kellner R, Mermet J.-M., Otto M., Vacarcel M. and Widmer H.M. (2004). Analytical Chemistry: A modern Approach to Analytical Science Second Edition. Geramany: PhotoDisc Inc.

Mark S. C. and Edward I. P. (2013). Introductory Chemistry: An Active Learning Approach. 5th ed. University of Massachusetts, Amherst: Graphic World Inc.


Robert de Levie. (2001). How to Exel in Analytical Chemistry and in Genera Scientific Data Analysis. Press syndicate of the University of Cambridge. United Kingdom.

Stoog D. A, Holler J. F and Nieman T.A. (1998). Principles of Instrumental Analysis. 5th ed. United States of America: Thomson Learning Inc.

Stoog Douglas A., West D. M., Holler J. F and Crouch S. R. (2014). Fundamentals of Analytical Chemistry. 7th ed. Singapore: New Tech Park (Looby H).

แผนบรหารการสอนประจาบทท 2 ความรพนฐานทางการวเคราะห

หวขอเนอหา

2.1 การวเคราะหเชงคณภาพและการวเคราะหเชงปรมาณ 2.2 หนวย ความเขมขนของสาร 2.3 การเจอจางสารละลาย 2.4 สารละลายบฟเฟอร 2.5 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 2 เอกสารอางอง

วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจเกยวกบการวเคราะหเชงคณภาพและการวเคราะหเชงปรมาณได 2. บอกหนวยปรมาณและหนวยความเขมขนของสารไดถกตอง 3. คานวณปรมาณสารและความเขมขนของสารละลายในทฤษฎและปฏบตการได 4. วเคราะหเปรยบเทยบปรมาณสารและความเขมขนของสารละลายได 5. สามารถยกตวอยางชนดของสารละลายบฟเฟอรทใชในงานวเคราะหทางเทคโนโลย ชวภาพไดอยางถกตอง


1. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 2. ทบทวนเนอหาทเรยนมาของสปดาหกอน 3. นาเขาสบทเรยนโดยภาพโครงสรางอะตอม โมเลกล และสารประกอบโซเดยมคลอไรด 4. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการ

สอนและรปภาพ 5. เปดโอกาสใหผเรยนถามในแตละหวขอและเสนอแนวความคดกอนขามหวขอนน 6. ตรวจสอบคาตอบของผเรยนสอบถามผเรยนถาผเรยนมขอสงสยและสรปเนอหาประจา

บท 7. แบงกลมผเรยนเพอฝกปฏบตการเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ เปนเครองมอ

วเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพเตรยมอปกรณและเครองมอตางๆ ตามใบงานทไดมอบหมายและกาหนดวนสงรายงาน

8. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง 9. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา


10. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน

สอการเรยนการสอน 1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอ Power point 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 5. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 6. สารและสารละลายของ โซเดยมไฮดรอกไซด โซเดยมคลอไรด กรดอะซตรก นาตาล

กลโคส 7. ภาพเครองชง ปเปต กระบอกตวง บกเกอร แทงคน 8. แบบฝกหดทายบทท 2


1. การตรงตอเวลาของนกศกษาในการสงงานและเขาเรยน 2. การซกถาม-ตอบคาถาม 3. การเขารวมกจกรรมกลม 4. การทาปฏบตการและการรายงานปฏบตการ 5. การทาแบบฝกหดทายบท

การประเมนผล 1. จากการทากจกรรมกลมเสรจตามเวลา 2. ทาใบงานถกตองและครบสมบรณ 3. ทาแบบฝกหดมความถกตองไมนอยกวารอยละ 80

บทท 2 ความรพนฐานทางการวเคราะห

การวเคราะหสารเปนสวนหนงของวชาเคมวเคราะห ซงวชาเคมวเคราะหเปนวทยาศาสตร

ประยกตสาขาหนงทวาดวยการตรวจสอบ (Identification) และหาปรมาณ (Determination) องคประกอบทางเคมของวตถหรอสงมชวต เคมวเคราะหเปนวธทางเคม ทใชในการวเคราะหสวนประกอบของสารทงชนดและปรมาณ การวเคราะหทางเคมจงแบงออกได เปน 2 แบบ คอ การวเคราะหเชงคณภาพ (Qualitative Analysis) และการวเคราะหเชงปรมาณ (Quantitative analysis) (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535; Kellner et al., 2004)

ซงในการวเคราะหเชงคณภาพคอการวเคราะหชนดของสาร และการวเคราะหเชงปรมาณตองมหนวยในการวดปรมาณทงนาหนก ปรมาตร หรอความเขมขน ดงนนในงานวเคราะหตองวเคราะหวามสารชนดใดกอนจงจะทาการวเคราะหปรมาณตอเพอนาไปใชประเมนผลการวเคราะหตอไป 2.1 การวเคราะหเชงคณภาพและการวเคราะหเชงปรมาณ (Qualitative analysis and Quantitative analysis) 2.1.1 การวเคราะหเชงคณภาพ (Qualitative analysis) คอ การวเคราะหหาชนดของสารในตวอยาง เชน การวเคราะหชนดแอลกอฮอลในกระบวนการหมกวาในนากระบวนการหมกเกดแอลกอฮอลชนดใดบาง เชน เมทานอล เอทานอล โพรพานอล บวทานอล (Kaewnaree et al., 2012)

2.1.2 การวเคราะหเชงปรมาณ (Quantitative analysis) การวเคราะหประเภทนตองการทราบวามปรมาณสารเคมทสงสยอยในตวอยางในปรมาณหรอความเขมขนเทาไรวธทใชใน การวเคราะหเชงปรมาณสามารถจาแนกไดเปน 3 ประเภท ดงน

2.1.2.1 การชงนาหนก (Gravimetric analysis) การวเคราะหประเภทนทาโดยนาวตถตวอยางมาแยกสารทตองการทราบปรมาณแลวชงหานาหนกของวตถตวอยางทลดลง เชน การหาความชนในดน การหาอนทรยวตถโดยวธเผา เปนตน หรออาจวเคราะหโดยนาวตถตวอยางมาแยกเอาสารทตองการทราบปรมาณใหอยในรปสารละลายแลวตกตะกอนสารนนและนาไปชงหานาหนก เชน การนาดนมาสกดแคลเซยม (Ca) แลวตกตะกอนแคลเซยมดวยสารละลายแอมโมเนยม ออกซาเลต (Ammonium oxalate) จากนนนาตะกอนแคลเซยมออกซาเลต (Calcium oxalate) ทไดไป ชงนาหนก คานวณหาปรมาณกจะทราบปรมาณ Ca ในดน เปนตน

2.1.2.2 การตวงปรมาตรหรอการไทเทรต (Volumetric analysis หรอ Titrimetric analysis) การวเคราะหประเภทนทาโดยนาวตถตวอยางมาเปลยนใหอยในรปสารละลาย หรอสกด

38 บทท 2 ความรพนฐานทางการวเคราะห เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

สารทตองการวเคราะห สารทตองการวเคราะหกจะอยในรปสารละลาย สารจะอยในรปสารละลายจากนนนาสารละลายทไดนไปทาปฏกรยาเคมกบสารละลายมาตรฐานททราบความเขมขนทแนนอน สามารถนาปรมาตรมาคานวณหาปรมาณสารทตองการวเคราะหได เชน การไทเทรต การทาปฏกรยาทเหมาะสมตอการวเคราะหแบบตวงปรมาตรควรมสมบตดงน

1. เปนปฏกรยาททราบสมการเคมของปฏกรยาทเกดขนอยางแนนอน 2. เปนปฏกรยาทสามารถเกดขนอยางรวดเรว 3. เปนปฏกรยาทสามารถบงชจดสมมลได 4. เปนปฏกรยาทมความเฉพาะเจาะจงตอสารทตองการวเคราะหสง 5. ไมเปนปฏกรยาผนกลบได

การไทเทรต (Titration) กระบวนการทางเคมวเคราะหเพอหาความเขมขนของสารละลายทตองการทราบความเขมขนโดยการเตมสารละลายมาตรฐานททราบความเขมขนทแนนอน ทจดทสารทาปฏกรยาพอดกน เรยกวาจดยต ซงจะทราบหาจดยตไดโดยอาศยการเปลยนสของสารละลาย โดยใชอนดเคเตอร (Indicator) แสดงวาถงจดยต (End Point) โดยการไทเทรตจะบรรจสารละลายมาตรฐานททราบความเขมขนทแนนอนในบวเรต เรยกวา สารไทแทรนต (Tritrant) และอานปรมาตรของไทแทรนตทใชในการไทเทรต คานวณหาปรมาณสาร ดงรปท 2.1 การไทเทรตทนยมใชในปจจบนใชในการวเคราะหหาปรมาณกรดหรอเบสในสารละลายตวอยาง ในการวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพนยมใชหาปรมาณกรดทงหมด ปรมาณกรดไขมนอสระในนามน ปรมาณกรดไขมนระเหยงาย เปนตน ไป (Mark and Edward, 2013)

รปท 2.1 การไทเทรต

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 2 ความรพนฐานทางการวเคราะห 39

2.1.2.3 การวเคราะหโดยใชเครองมอ (Instrumental analysis) การวเคราะหประเภทนอาศยสมบตของสารมาใชจาแนกชนดและระบปรมาณสมบตดงกลาวไดแก การดดกลนคลนแมเหลกไฟฟาการปลดปลอยคลนแมเหลกไฟฟาการเปลยนแปลงคาการนาความรอนการเปลยนแปลงทางไฟฟาเคมและความเรวในการเคลอนทบนตวกลาง เปนตน

ปจจบนเครองมอทใชในการวเคราะหทางเคมมหลายชนด เครองมอวเคราะหอยางงาย เชน ความเปนกรด -ด า ง หรอ พ เอชม เ ตอร (pH meter) เ คร อ ง วดค าการ นาไฟฟ า (Conductometer) และเครองมอทมความซบซอนมากขน ไดแก ยว-วสเบลสเปกโทรโฟโทมเตอร (UV-Vis spectrophotometer) อะตอมมกแอบซอรพชนสเปคโทรโฟโตม เตอร (Atomic absorption spectrophotometer; AAS) เฟลมโฟโตมเตอร (Flame photometer) อนดกทฟคพเพลพลาสมาอะตอมกอมสชนสเปกโตรโฟโทมเตอร (Inductive coupled plasma atomic emission spectrophotometer; ICP-AES) แกสโครมาโทกราฟ (Gas chromatography) โครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง (High performance liquid chromatography; HPLC) ไอออนโครมาโทรกราฟ (Ion chromatography) เอกซสเรย ฟลออเรสเซนสเปกโทรโฟโตมเตอร (X-ray fluorescence spectrometer; XRF) ซงเครองวเคราะหดงกลาวจะมความจาเพาะตอสารแตกตางกน (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535; Kellner et al., 2004) ซงจะไดกลาวรายละเอยดในบทตอไป 2.2 หนวยและความเขมขน (Unit and concentration) การวเคราะหเชงปรมาณนอกจากวธการวเคราะหและเครองมอวเคราะหทดทจะทาใหผล การวเคราะหถกตองนน หนวยปรมาณทจะตองนามาแสดงผลการวเคราะหกมความสาคญเชนกน ดงนนหนวยทใชในการวเคราะหสารแบงออกเปน 2 สวน คอ หนวยปรมาณและหนวยความเขมขน ดงรายละเอยดตอไปน

2.2.1 หนวยปรมาณ

สารอยในรป ของแขง ของเหลว และกาซ สวนนอยทพบสารอยในรปสารบรสทธ การหาปรมาณจงตองมหนวยวด เชน ของแขงหนวยปรมาณเปนนาหนก เชน ไมโครกรม มลลกรม กโลกรม เปนตน สารทเปนของเหลวหนวยปรมาณเปนปรมาตร เชน ไมโครลตร (µl) มลลลตร (ml) ลตร (L) เปนตน สวนแกสจะเปนหนวยปรมาตรทความดนและอณหภมมาตรฐาน และหนวยปรมาณสารทใชในการทาปฏกรยาเคม เชน โมล (Mole) หรอ กรมสมมล (Gram equivalent) (ประภาณ, 2539) (Mark and Edward, 2013)


ตารางท 2.1 หนวยนาหนก

หนวยนาหนก อตราสวน กโลกรม (Kilogram; Kg) 1 Kg = 1,000 g กรม (Gram; g) มลลกรม (Milligram; mg) 1 g = 1,000 mg ไมโครกรม (Microgram; µg) 1 mg = 1,000 µg

ทมา: Mark and Edward, 2013 ตารางท 2.2 หนวยปรมาตร

หนวยปรมาตร อตราสวน ลตร (Liter; L) 1 L = 1,000 ml =1 dm3 = 1,000 cm3 มลลลตร (Milliliter; ml) 1 ml = 1 cm3= 1 CC ไมโครกรม (Microliter; µl) 1 ml = 1,000 µl

ทมา: Mark and Edward, 2013

2.2.2 ปรมาณสมพนธ (Stoichiometry) หมายถง ความสมพนธระหวางมวล หรอนาหนกของธาตตางๆ จากสตรและสมการเคม สตรของสารประกอบทาใหทราบความสมพนธของมวลของธาตตางๆ ทรวมกนเปนสารประกอบนนๆ หนวยทางเคมทบอกปรมาณสารประกอบใชหนวยเปนกรมโมเลกล ปรมาณของธาตใชหนวยเปนกรมอะตอม และปรมาณของไอออนใชหนวยเปนกรมไอออน ปจจบนหนวยทใชบอกปรมาณของสารทางเคมตามระบบเอสไอไมวาจะเปนสารประกอบหรอธาต ใชคาวาโมล (Mole หรอ mol) (Mark and Edward, 2013) เชน H2 1 โมล หมายถง H2 1 กรมโมเลกล H 1 โมล หมายถง H 1 กรมอะตอม H+ 1 โมล หมายถง H 1 กรมไอออน 1 โมล มคาเทากบ 6.02x1023 อนภาค เรยกเลขนวา เลขอาโวกาโดร (Avogadro’ number ; N) คอ จานวนคารบอนทมใน 12C หนก 12 กรม พอด H2 1 โมล แสดงวามไฮโดรเจน 6.02x1023 โมเลกล H 1 โมล แสดงวามไฮโดรเจน 6.02x1023 อะตอม H+ 1 โมล แสดงวามไฮโดรเจน 6.02x1023 ไอออน e- 1 โมล แสดงวามอเลกตรอน 6.02x1023 อเลกตรอน จานวนโมล = มวล = มวล หรอ = มวล มวล/โมล นาหนกโมเลกล นาหนกอะตอม


ตวอยาง โมล (Mole) คอสารใดๆ 1 โมล จะเทากบนาหนกโมเลกลของสารนนทมหนวยเปนกรม เชน โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) 1 โมล (เลขอะตอมของ Na=23, O=16 และ H=1) มนาหนกเทากบนาหนกโมเลกลของโซเดยมไฮดรอกไซดหรอผลรวมของเลขอะตอม คอ 23 +16 +1 = 40 กรม นา (H2O) 1 โมล มนาหนกเทากบนาหนกโมเลกลของนา คอ (1x2) + 16 = 18 กรม หรอแกสใดๆ ทอณหภมและความดนมาตรฐาน 1 โมล จะมปรมาตรเทากบ 22.4 dm3 มนาหนกเทากบนาหนกโมเลกล เชน แกสคารบอนไดออกไซด (CO2) 1 โมล ทอณหภมและความดนมาตรฐานมนาหนกเทากบนาหนกโมเลกลแกสคารบอนไดออกไซด 12 + (16x2) = 44 กรม

2.2.3 ความเขมขนของสารละลาย สารละลาย (Solution) ประกอบดวยตวทาละลาย (Solvent) และตวถกละลาย (Solute) ทละลายรวมกน ตวทาละลายในสารละลายมไดเพยงหนงชนดเทานนโดยสารทเปนตวทาละลาย คอสารทมสถานะเดยวกบสารละลาย หรอถาสารในสารสารละลายมสถานะเดยวกนทงหมด สารทมปรมาณมากทสดจะเปนตวทาละลาย สวนตวถกละลายในสารละลายหนงมตงแตหนงชนดหรอมากกวาหนงชนดกได เชน

สารละลายนาตาลกลโคส มนาเปนตวทาลาย และนาตาลกลโคสเปนตวถกละลาย สารละลายเอทานอล 70% (v/v) มเอทานอลเปนตวทาลายเพราะมปรมาณมากกวา

สวนนาเปนตวถกละลายเนองจากมปรมาณนอยกวา ดงนนความเขมขนของสารละลายจะบอกไดวาสารใดมความเขมขนมากกวาหรอนอย

กวาจงตองใชหนวยความเขมขนเขามาพจารณา ซงในงานวเคราะหสารจะใชหนวยทแตกตางกนขนอยกบงานทตองการนาขอมลไปใช ดงตอไปน

2.2.3.1 เปอรเซนต (Percentage, %) หรอรอยละเปนการระบปรมาณของ ตวถกละลายในสารละลายทงหมด 100 สวน แบงออกเปน 3 ชนด ดงน 1. รอยละโดยมวล (w/w) หมายถง มวลของตวถกละลายตอมวลของสารละลาย 100 หนวย มกใชกบตวถกละลายทเปนของแขง เชน ทองเหลอง เปนโลหะผสมระหวางทองแดงกบสงกะส ในทองเหลองมปรมาณของสงกะสผสมอย 5-45 เปอรเซนต ซงโลหะทงสองมสถานะเดยวกบทองเหลอง ความหมายคอทองเหลอง 100 กรม จะมสงกะสอย 5-45 กรม ทเหลอเปนทองแดง 2. รอยละโดยมวลตอปรมาตร (w/v) หมายถง มวลของตวถกละลายในสารละลายทงหมด 100 หนวยปรมาตร หนวยชนดนมกใชกบสารละลายทตวถกละลายเปนของแขงละลายในตวทาละลายทเปนของเหลว เชน สารละลาย10 % (w/v) NaOH โดยมวลตอปรมาตร หมายความวา ในสารละลายปรมาตร 100 ml ม NaOH ละลายอย 10 กรม 3. รอยละโดยปรมาตร (v/v) หมายถง ปรมาตรของตวถกละลายตอปรมาตรทงหมดของสารละลาย 100 หนวย มกใชกบตวถกละลายและตวทาละลายทเปนของเหลว เชน สารละลายเอทานอลรอยละ 70 หรอ 70% (v/v) หมายถง ในสารละลาย 100 มลลลตร มเอทานอล 70 มลลลตร และนา 30 มลลลตร


2.2.3.2 โมลารต (Molarity) หรอ โมลาร (Molar; M) เปนการระบจานวนโมลของ ตวถกละลายในสารละลายทมปรมาตร 1,000 มลลลตร (หรอ 1 dm3 หรอ 1 ลตร) หนวยความเขมขนของระบบนจงเปน mol.dm-3 หรอ mol.L-1 เชน สารละลาย 1 M HCl หมายความวา ในสารละลายปรมาตร 1,000 มลลลตร มกรดไฮโดรคลอรก (HCl) ละลายอย 1 โมล

สาหรบสารประกอบเชงไอออนซงไมมสตรเชงโมเลกล เชน NaCl เปนสตรของโซเดยมคลอไรด แตไมใชหมายความวา โซเดยมคลอไรด 1 โมเลกล ตางกบสตรเคมของพวกสารประกอบโคเวเลนต เชน CO2 เปนสตรของแกสคารบอนไดออกไซด 1 โมเลกล ดวยเหตนสารละลายของสารประกอบโคเวเลนตทมสตรเชงโมเลกลจงมหนวยความเขมขนเปนโมลาร แตสารละลายของสารประกอบเชงไอออนซงมแตสตรเอมพรคล เชน โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) โซเดยมคลอไรด NaCl และ โพแทสเซยมซลเฟต (K2SO4) เปนตน เปนสตรอยางงายจะตองระบความเขมขนเปนฟอรแมลต (formality) มหนวยเปนฟอรแมล (formal, F) หมายถง จานวนมวล-สตร (Mass-formula) ของตวถกละลายทมหนวยเปนกรมในสารละลาย 1,000 มลลลตร เชน

0.1 F NaCl หมายความวา สารละลายปรมาตร 1,000 มลลลตร ม NaCl ละลายอย 0.1 มวล-สตร 1 มวล-สตร ของ NaCl = 23 + 35.5 = 58.5 กรม

จะเหนวาถาคดวาสตรของสารประกอบเชงไอออนเปนสตรเชงโมเลกลของสารนน หนวยฟอรแมลกบโมลารคอ หนวยเดยวกน สารละลายบางอยางระบความเขมขนเปนรอยละและความหนาแนน สามารถหาความเขมขนของสารละลายนเปนโมลารไดโดยอาศยความหมายของความหนาแนนเชงมวลทวา ความหนาแนนเชงมวล คอ อตราสวนของมวลตอปรมาตร

2.2.3.3 นอรมาลต (Normality) คอ จานวนกรมสมมลของสารละลาย 1 ลตร จานวนกรมสมมล = นาหนกสาร/นาหนกสมมล นาหนกสมมล = นาหนกสตรของสาร/n

1. สาหรบปฏกรยา กรด - เบส n คอ จานวนไฮโดรเจนในโมเลกลของกรดทสามารถให หรอจานวนไฮโดรเจนท

เบสสามารถทาปฏกรยาได 2. สาหรบสารประกอบไอออนก

n คอ จานวนวาเลนซทงหมดของไอออนบวก หรอเทากบ จานวนประจของ แคตไอออน x จานวนโมเลกลแคตไอออน

3. สาหรบปฏกรยารดกชน-ออกซเดชน n คอ จานวนเลขออกซเดชนของอะตอมทเปลยนไปตอ 1 สตร เชน

นาหนกสมมลของกรดซลฟวรก(H2SO4) = นาหนกสตรของ H2SO4/2 นาหนกสมมลของโซเดยมไฮดรอกไซด NaOH = นาหนกสตรของ NaOH/1 นาหนกสมมลของแบเรยมไฮดรอกไซด Ba(OH)2 = นาหนกสตรของ Ba(OH)2/2

2.3 การเจอจางสารละลาย การเจอจางสารละลายใหมความเขมขนตามตองการ จะตองทาการเตมตวทาละลายลงในสารละลายนน แตทงนปรมาณตวถกละลายยงคงเดม อตราสวนของปรมาณตวถกละลายตอปรมาณตวทาละลายเปลยนไป


ตวอยางการคานวณ มสารละลาย HCl ความเขมขน 4 โมลตอลตร ตองการสารละลาย HCl ความเขมขน 1 โมลตอลตร ปรมาตร 50 มลลลตร จะดาเนนการอยางไร วธทา

ตองการสารละลาย HCl ความเขมขน 1 โมลตอลตร จานวน 50 มลลลตร หมายความวาสารละลาย HCl 1000 มลลลตร จะมกรด HCl = 1 โมล

ถาสารละลาย HCl 50 มลลลตร จะมกรด HCl = 1 โมล x50 มลลลตร 1000 มลลลตร = 0.05 โมล สารละลาย HCl มความเขมขน 4 โมลตอลตร หมายความวา ในสารละลายม HCl 4 โมล ในสารละลาย 1000 มลลลตร ตองการ HCl 0.05 โมล จะตองใชสารละลาย HCl 4 โมลตอลตร = 1000 มลลลตร x 0.05 โมล 4 โมล = 12.5 มลลลตร นนคอ ตองนาละลาย HCl ซงมความเขมขน 4 โมลตอลตร มาจานวน 12.5 มลลลตร แลวเตมนาใหไดปรมาตร 50 มลลลตร (เตมนา 37.5 มลลลตร จะไดสารละลาย HCl ความเขมขน 1 โมลตอลตร จานวน 50 มลลลตร) ให M1 = ความเขมขน โมลตอลตร ของสารละลายเขมขนกวา M2 = ความเขมขน โมลตอลตร ของสารละลายเจอจางกวา V1 = ปรมาตร (ลตร) ของสารละลายเขมขนกวา V2 = ปรมาตร (ลตร) ของสารละลายเจอจางกวา ฉะนน M1V1 = M2V2 ซงเปนสตรทใชทาสารละลายใหเจอจาง จากโจทยจะได M1 = 4 โมลตอลตร M2 = 1 โมลตอลตร V2 = 50 มลลลตร = 0.05 ลตร แทนคาในสตร V1 = 1 โมลตอลตร x 0.05 ลตร 4 โมลตอลตร = 0.0125 ลตร = 12.5 มลลลตร


นนคอ ตองนากรด 4 โมลตอลตร มา 12.5 มลลลตร แลวเตมนาลงไปจนไดปรมาตร 50 มลลลตร (เตมนาลงไป 37.5 มลลลตร) จะไดสารละลายเขมขน 1 โมล/ลตร จานวน 50 มลลลตร ตามตองการ

ตวอยางการคานวณ ตองการเตรยมสารละลายกรด H2SO4 เขมขน 1 โมลตอลตร ใหมปรมาตร 14 ลตร โดยเตมกรด H2SO4 15 โมลตอลตร ลงไปในกรด H2SO4 2 โมลตอลตรจานวน 1,250 มลลลตร จะตองใชกรด H2SO415 โมลตอลตร กลตร วธทา

ตองการเตรยมสารละลายกรด H2SO4 เขมขน 1 โมลตอลตร ปรมาตร 14 ลตร จะมเนอกรดอย = 1 โมลตอลตร x 14 ลตร = 14 โมล

กรด H2SO4 เขมขน 2 โมลตอลตร จานวน 1,250 มลลลตร จะมเนอกรดอย = 2 โมลตอลตร x 1,250 มลลลตร = 2.5 โมล ซงจะตองเตมกรด H2SO4 อก 14 โมล = ลงไปในกรด H2SO4 เขมขน 2 โมลตอลตร จานวน 1250 มลลลตร ถาตองการกรด H2SO4 15 โมล ตองใชกรด = 1 ลตร ถาตองการกรด H2SO4 11.5 โมล ตองใชกรด = 1 ลตร x 11.5 โมล 15 โมล = 0.767 ลตร นนคอ ตองเตมกรด H2SO4 เขมขน 15 โมลตอลตร จานวน 0.767 ลตร ลงไปในสารละลาย H2SO4 เขมขน 2 โมลตอลตร จานวน 1250 มลลลตร แลวเตมนาจนไดปรมาตรทงสน 14 ลตร จะไดสารละลายเขมขน 1 โมลตอลตร จานวน 14 ลตร ตามตองการ

2.4 สารละลายบฟเฟอร (Buffer solution) สารละลายบฟเฟอร หมายถง สารละลายของกรดออนกบเกลอของกรดออนหรอคเบสของ

กรดออน หรอหมายถงสารละลายของเบสออน กบเกลอของเบสออน หรอคกรดของเบสออนนนสมบตของสารละลายบฟเฟอร คอ รกษาสภาพ pH ของสารละลายเอาไวโดยจะเกดการเปลยนแปลงนอยมากเมอเตมกรดแกหรอเบสแกจานวนเลกนอยลงไป การเตรยมทาไดโดยการเตมกรดออนลงในสารละลายเกลอของกรดออน หรอการเตมเบสออนลงในสารละลายเกลอของเบสออน (พฒนา เหลาไพบลย และอรศรา เรองแสง, 2536) สารละลายบฟเฟอรทใชในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพมหลายชนด ไดแก อะซเตทบฟเฟอร ซเตรทบฟเฟอร ซเตรท-ฟอสเฟต บฟเฟอร ฟอสเฟตบฟเฟอร และโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร การเลอกใชขนอยกบสภาวะของการทาปฏกรยาของสารตวอยาง สวนใหญใชในงานวเคราะหสารระดบเซลล เชน หากจกรรมของเอนไซม ปรมาณโปรตน หรอชนดและปรมาณของสารแอนตออกซแดนซ เชนใชในกระบวนวเคราะหกจกรรมของเอนไซมคะตะเลส แอสคอรเบส และกลตารไทโอนทรานสเฟอเรส ในเซลลพช (Siri et al., 2013)


2.4.1.อะซเตทบฟเฟอร (Acetate Buffer) เตรยมสารละลาย A: 0.2 M CH3COOH (Acetic acid 11.6 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 1

ลตร ดวยนากลน) เตรยมสารละลาย B: 0.2 M CH3COONa หรอ CH3COONa.3H2O (โดยสารละลาย

CH3COONa หรอ CH3COONa.3H2O จานวน 16.4 กรม หรอ 27.4 กรม ตามลาดบ ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ดวยนากลน) และผสมสารละลาย A และ B ดงตอไปน เพอใหได pH ตามตองการ

ตารางท 2.3 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมอะซเตทบฟเฟอร

สารละลาย A (มลลลตร) สารละลาย B (มลลลตร) คา pH 46.3 3.7 3.6 44.0 6.0 3.8 41.0 9.0 4.0 36.8 13.2 4.2 30.5 19.5 4.4 25.5 24.5 4.6 20.0 30.5 4.8 14.8 35.2 5.0 10.5 39.5 5.2 8.8 41.2 5.4 4.8 45.2 5.6

ทมา: พฒนา เหลาไพบลย และอรศรา เรองแสง, 2536

2.4.2. ซเตรทบฟเฟอร (Citrate Buffer) เตรยมสารละลาย A: 0.1 M Citric acid (21.01 g ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร) เตรยมสารละลาย B: 0.1 M Sodium citrate (29.41 กรม ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร) ผสมสารละลาย A และ B ดงตอไปน เพอใหได pH ตามทตองการ


ตารางท 2.4 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมซเตรทบฟเฟอร

สารละลาย A (มลลลตร) สารละลาย B (มลลลตร) คา pH 46.5 3.5 3.0 43.7 6.3 3.2 40.0 10.0 3.4 37.0 13.0 3.6 35.0 15.0 3.8 33.0 17.0 4.0 31.5 18.5 4.2 28.0 22.0 4.4 25.5 24.5 4.6 23.0 27.0 4.8 20.5 29.5 5.0 18.0 32.0 5.2 16.0 24.0 5.4 13.7 36.3 5.6 11.8 38.2 5.8 9.5 40.5 6.0 7.2 42.8 6.2

ทมา: พฒนา เหลาไพบลย และอรศรา เรองแสง, 2536 2.4.3. ซเตรท-ฟอสเฟต บฟเฟอร (Citrate-Phosphate Buffer) เตรยมสารละลาย A: 0.1 M Citric acid (21.01 g ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ดวยนากลน เตรยมสารละลาย B: 0.2 M dibasic sodium Phosphate (Na2HPO4.7H2O หรอ Na2HPO4.12H2O 53.65 g หรอ 71.7 g ตามลาดบ ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ดวยนากลน) และผสมสารละลาย A และ B ดงตอไปน เพอใหได pH ตามทตองการ


ตารางท 2.5 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมซเตรท-ฟอสเฟต บฟเฟอร

สารละลาย A (มลลลตร) สารละลาย B (มลลลตร) คา pH 44.6 5.4 2.6 42.2 7.8 2.8 39.8 10.2 3.0 37.7 12.3 3.2 35.9 14.1 3.4 33.9 16.1 3.6 32.3 17.7 3.8 30.7 19.3 4.0 29.4 20.6 4.2 27.8 22.2 4.4 26.7 23.3 4.6 25.2 24.8 4.8 24.3 25.7 5.0 23.3 26.7 5.2


2.4.4. ฟอสเฟตบฟเฟอร (Phosphate Buffer) เตรยมสารละลาย A: 0.2 M monobasic sodium Phosphate (ชง NaH2PO4.2H2O 31.2 กรม ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ดวยนากลน) เตรยมสารละลาย B: 0.2 M dibasic sodium Phosphate (Na2HPO4.7H2O หรอ Na2HPO4.12H2O 53.65 กรม หรอ 71.7 กรม ตามลาดบ ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ดวยนากลน) ผสมสารละลาย A และ B ดงตอไปน เพอใหได pH ตามทตองการ


ตารางท 2.6 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมฟอสเฟตบฟเฟอร

สารละลาย A (มลลลตร) สารละลาย B (มลลลตร) คา pH 93.5 6.5 5.7 92.0 8.0 5.8 90.0 10.0 5.9 87.7 12.3 6.0 85.0 15.0 6.1 81.5 18.5 6.2 77.5 22.5 6.3 73.5 26.5 6.4 68.5 31.5 6.5 62.5 37.5 6.6 56.5 43.5 6.7 51.0 49.0 6.8 45.0 55.0 6.9 39.0 61.0 7.0 33.0 67.0 7.2 28.0 72.0 7.3 23.0 77.0 7.3 19.0 81.0 7.4 16.0 84.0 7.5


2.4.5. โซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร (Sodium Phosphate Buffer) เตรยมสารละลาย A: 0.1 M monobasic sodium Phosphate (ชง NaH2PO4.2H2O 15.6 กรม ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ดวยนากลน) เตรยมสารละลาย B: 0.1 M dibasic sodium Phosphate (Na2HPO4.7H2O หรอ Na2HPO4.12H2O 26.825 กรม หรอ 35.85 กรม ตามลาดบ ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ดวยนากลน) ผสมสารละลาย A และ B ดงตอไปน เพอใหได pH ตามทตองการ


ตารางท 2.7 ปรมาตรสารละลาย A และ B ทใชในการเตรยมโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร

สารละลาย A (มลลลตร) สารละลาย B (มลลลตร) คา pH 93.5 6.5 5.7 92.0 8.0 5.8 90.0 10.0 5.9 87.7 12.3 6.0 85.0 15.0 6.1 81.5 18.5 6.2 77.5 22.5 6.3 73.5 26.5 6.4 68.5 31.5 6.5 62.5 37.5 6.6 56.5 43.5 6.7 51.0 49.0 6.8 45.0 55.0 6.9 39.0 61.0 7.0 33.0 67.0 7.1 28.0 72.0 7.2 23.0 77.0 7.3 19.0 81.0 7.4 16.0 84.0 7.5 13.0 87.0 7.6 10.0 90.0 7.7 8.5 91.5 7.8 7.0 93.0 7.9 5.3 94.7 8.0

ทมา: พฒนา เหลาไพบลย และอรศรา เรองแสง, 2536 2.5 สรปประจาบท

การวเคราะหทางเคมประกอบดวยการวเคราะหคณภาพและการวเคราะหปรมาณ ซงหนวยการวดปรมาณขนอยกบสถานะของสารทตองการวเคราะหวาอยในสถานะของแขง ของเหลว หรอ กาซ ซงหนวยทใชวดกจะแตกตางกน ถาเปนของแขงกวเคราะหเปนหนวยนาหนก สวนของเหลวหรอกาซกจะวเคราะหเปนหนวยปรมาตร

2.5.1.หนวย 1.1 หนวยปรมาณ แบงเปน หนวยนาหนก และหนวยปรมาตร


1.2 หนวยความเขมขน เปนหนวยปรมาณสารในสารละลาย สารทตองการวเคราะหปรมาณโดยทวไปไมไดอยในรปสารบรสทธแตสวนใหญอยใน

รปสารละลาย ดงนนการวเคราะหปรมาณจงใชหนวยความเขมขน ซงหนวยความเขมขนมดงน คอ 1.2.1 หนวยรอยละหรอเปอรเซนต (Percentage, %) คอปรมาณตวถกละลายในสารละลาย 100 หนวย ม 3 รปแบบ คอ เปอรเซนตโดยมวล (% w/w) เปอรเซนตโดยมวล ตอปรมาตร (%w/v) และ เปอรเซนตโดยปรมาตร (% v/v) 1.2.2 โมลารต (Molarity; M) คอ จานวนโมลของตวถกละลายในสารละลาย 1 ลตร 1.2.3 นอรมอลต (Normality; N) คอ กรมสมมลของตวถกละลายในสารละลาย 1 ลตร

2.5.2. การเจอจางสารละลาย การเตรยมสารละลายสามารถนาหนวยความเขมขนมาใชในการเตรยมสารละลายในงาน

วเคราะหถาตองการเปลยนแปลงความเขมขนของสารละลายสามารถเตรยมไดจากสตร M1V1= M2V2

เมอ M1 = ความเขมขน โมลตอลตร ของสารละลายเขมขนกวา M2 = ความเขมขน โมลตอลตร ของสารละลายเจอจางกวา V1 = ปรมาตร (ลตร) ของสารละลายเขมขนกวา V2 = ปรมาตร (ลตร) ของสารละลายเจอจางกวา 2.5.3. สารละลายบฟเฟอร

หมายถง สารละลายของกรดออนกบเกลอของกรดออนหรอคเบสของกรดออน หรอหมายถงสารละลายของเบสออนกบเกลอของเบสออนหรอคกรดของเบสออนนนสมบตของสารละลายบฟเฟอร คอ รกษาสภาพ pH ของสารละลายเอาไวโดยจะเกดการเปลยนแปลงนอยมากเมอเตม กรดแกหรอเบสแกจานวนเลกนอยลงไปการเตรยม ซงมหลายชนดเชน อะซเตทบฟเฟอร ซเตรทบฟเฟอร ซเตรท-ฟอสเฟตบฟเฟอร โซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร และฟอสเฟตบฟเฟอร



1. จงอธบายสารละลายเอทานอล 10 % (v/v) หมายความวาอยางไร 2. จงคานวณหาความเขมขนเปนรอยละโดยมวลของสารละลายนาตาลกลโคส เมอละลายนาตาลกลโคส (C6H12O6) 200 มลลกรม ละลายในนากลน 100 มลลลตร 3. จงอธบายกรดไฮโดรคลอรก (HCl) มความเขมขน 30% (w/v) หมายความวาอยางไร 4. จงคานวณหาโมลารตของสารละลาย H2SO4 เขมขน 9.8% (w/v) (เมอกาหนดให มวลอะตอมของ H=1 S=32 และ O=16) 5. จงคานวณความเขมขนของสารละลายโซเดยมคลอไรด (NaCl) 0.5 โมลาร เปนหนวยรอยละโดยมวล (มวลอะตอมของ Na=23 และ Cl=35.5) 6. จงแสดงวธการเตรยมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดใหมความเขมขนเปน 0.1 โมลาร ปรมาตร 500 มลลลตร จากสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดความเขมขนเรมตน 5 โมลาร 7.จงเปรยบเทยบปรมาณของเอทานอลวาสารละลายใดมเอทานอลมากกวา ในสารละลายเอทานอล 10% (v/v) ปรมาตร 1 ลตร และสารละลายเอทานอล 50% (v/v) ปรมาตร 0.5 ลตร 8. สารละลายกรดไนตรก (HNO3) ความเขมขน 1 โมลตอลตร ถาสารละลายจานวน 2,000 มลลลตรจะมเนอกรดไนตรกกกรม (มวลอะตอมของ H=1 N=14 และ O=16) 9. จงเปรยบเทยบความหนาแนนของสารใดมากกวา ระหวางนา 2 มลลลตร หนก 2 กรม และเอทานอล 1 มลลลตร หนก 0.789 กรม 10 จงยกตวอยางสารละลายบฟเฟอรทใชในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพมา 2 ชนด



ประภาณ เกษมศร ณ อยธยา. อาพน เพญโรจน. สะอาด ศรกาญจนาลย. ศภชย ใชเทยมวงศ. และมานตย ปจมาลา. (2539). เคมทวไป เลม 1. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย. กรงเทพฯ: สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย.

พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตบตการในกระบวนการวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.

แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม. (2535). หลกการและเทคนคการวเคราะหเชงเครองมอ. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณ มหาวทยาลย. กรงเทพฯ.

ศภชย ใชเทยมวงศ. (2539). เคมวเคราะห. กรเทพฯ: สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย. Kaewnaree P., Vichitphan S., Klunrit P., SIRI B. and Vichitphan K. (2012). The effect of

high K Na Ca Mg and DAP conditions on ethanol production from sugar cane by ethanol-tolerant yeast. International Biotechnology Symposium and Exhibition (IBS 2012), September 12-22; Daeju, Korea.

Kellner R, Mermet J.-M., Otto M., Vacarcel M. and Widmer H.M. (2004). Analytical Chemistry: A modern Approach to Analytical Science. 2nd ed. Geramany: PhotoDisc Inc.

Mark S. C. and Edward I.P. (2013). Introductory Chemistry: An Active Learning Approach. 5th ed. University of Massachusetts, Amherst: Graphic World Inc.

Siri Boonmee, Vichitphan Kanit, Kaewnaree Preeya, Vichitphan Sukanda and Klanrit Preekamol. (2013). Improvement of quality, membrane integrity and antioxidant systems in sweet pepper ('Capsicum annuum' Linn.) seeds affected by osmopriming, Australian Journal of Crop Science. 7(13), 2068-2073.

แผนบรหารการสอนประจาบทท 3 เครองมอพนฐานในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ


3.1 เครองชง 3.2 เครองวดความเปนกรด-ดาง 3.3 เครองปนเหวยง 3.4 เครองนงฆาเชอความดนไอนา 3.5 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 3 เอกสารอางอง วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจหลกการของเครองชง เครองพเอช เครองปนเหวยง และเครองนงฆาเชอความดนไอนา 2. สามารถใชเครองมอพนฐานทางเทคโนโลยชวภาพในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพไดอยางถกตองเหมาะสม 3. มความรความเขาใจเกยวกบการดแลและเกบรกษาเครองชง เครองพเอช เครองปนเหวยง และเครองนงฆาเชอความดนไอนา 4. บอกไดวาเครองมอพนฐานทางเทคโนโลยชวภาพใชในงานวเคราะหใด 5. สามารถบอกชนดของเครองชงและเครองปนเหวยงได วธสอนและกจกรรม

1. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 2. ทบทวนเนอหาทเรยนมาของสปดาหกอน 3. นาขาสบทเรยนโดยอธบายภาพ เครองชง เครองปนเหวยง และเครองพเอชมเตอรทจะ

เรยนในสปดาหน 4. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการ

สอนและรปภาพ 5. เปดโอกาสใหผเรยนถามในแตละหวขอและเสนอแนวความคดกอนขามหวขอนน 6. ตรวจสอบคาตอบของผเรยนสอบถามผเรยนถาผเรยนมขอสงสยและสรปเนอหาประจาบท 7. แบงกลมผเรยนเพอฝกปฏบตการเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพเปนเครองมอ

พนฐาน การวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพเตรยมอปกรณและเครองมอตางๆ ตามใบงาน ทไดมอบหมายและกาหนดวนสงรายงาน

8. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง


9. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา 10. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน

สอการเรยนการสอน

1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอเอกสารประกอบการสอนอเลกทรอนกส 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 5. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 6. ภาพเครองชง เครองปนเหวยง และเครองพเอชมเตอร 7. สารละลายกรด สารละลายเบส และอนดเคเตอร 8. ใบงาน 9. แบบฝกปฏบตการ


1. การตรงตอเวลาของนกศกษาในการสงงานและเขาเรยน 2. การซกถาม-ตอบคาถาม 3. การเขารวมกจกรรมกลม 4. การปฏบตการในใบงาน 5. รายงานของใบงาน 6. ผลการสอบยอย การประเมนผล 1. จากการทากจกรรมกลมเสรจตามเวลา 2. ทาใบงานถกตองและครบสมบรณ 3. ทาแบบฝกหดมความถกตองไมนอยกวารอยละ 80

บทท 3 เครองมอพนฐานในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

การวเคราะหทถกตองคาทออกมาจากการวเคราะหจะมความถกตองแมนยา นอกจากตอง

คานงถงตวอยาง การเตรยมตวอยางทถกตอง หรอวธการทดทเหมาะสมตอการวเคราะหแลว ยงมปจจยทจาเปนตองานวจย คอ เครองมอพนฐานทนามาใชรวมกบการวเคราะหเพอเพมประสทธภาพการวเคราะห เพอใชการวเคราะหถกตองและแมนยามากทสด ดงเครองมอทจะกลาวตอไปน

3.1 เครองชง (Balance) เครองชงเปนเครองมอทจาเปนชนดหนงของหองปฏบตการวทยาศาสตร เพราะการวเคราะหสวนใหญเปนการวเคราะหเชงปรมาณ (Quantitative analysis) ทตองอาศยเครองชงชวยในการวเคราะหเปรยบเทยบกบสารมาตรฐานทตองทราบปรมาณหรอความเขมขนทแนนอน (ชชาต อารจตรานสรณ, 2539) เครองชงแสดงดงรปท 3.1

(ก) (ข)

รปท 3.1 เครองชง 2 ตาแหนง (ก) และ เครองชง 4 ตาแหนง (ข) (ทมา : https://www.google.co.th/search?q=เครองชง+Mettle)

ในเชงทฤษฎเครองชงเปนอปกรณทใชสาหรบหามวล (Mass) ของวตถ แตในทางปฏบตใชเปนอปกรณสาหรบหานาหนก (Weight) ของวตถ เนองจากมวลมความสมพนธกบนาหนกอยางใกลชด กลาวคอ นาหนก คอ แรงทโลกกระทาตอมวลซงสามารถหาความสมพนธไดจากสตร W = k (Me x Mu)/r2

56 บทท 3 เครองมอพนฐานในงานวเคราะห เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

เมอ W = นาหนก k = Gravitational constant Me = มวลของโลก Mu = มวลของวตถ r = ระยะหางระหวางจกศนยกลางของโลกและจดศนยกลางของวตถ นาหนกจะเทากบแรงโนมถวงของโลก (Gravitation force, Fg ในหนวย g) เมอวตถไมมแรงอนมากระทา แตในสภาพความเปนจรงวตถบนโลกมแรงอนๆ มากระทาอก เชน แรงหนศนยกลางของวตถ (Centrifugal force, Fc) ซงมมากทสดเสนศนยสตรของโลก (Equator line) และมนอยทสดบรเวณขวโลก แรงอกชนดหนงคอ แรงดงดดจากดาวเคราะหตางๆ ทอยใกลโลกโดยเฉพาะดวงจนทร (Fm) (สงเกตจากการขนลงของนาทะเล) แรงดงดดชนดหนงจะเปลยนแปลงไปตามเวลา เพราะระยะหางของทางระหวางมวลกบดวงจนทรเปลยนแปลง แตเนองจากมวลของวตถทชงมกมขนาดเลก เมอคดเฉพาะแรงทกระทาตอมวลดงกลาวแลวขางตน นาหนกจงมคาเทากบ Fg-Fc หรอเทากบ Fc-Fm มคานอยมาก ในอกความหมายหนงนาหนกคอแรงทกระทาตอวตถภายในหนงวนาทแลวทาใหวตถซงอยนงมความเรว 9.81 เมตร/วนาท ดงนน เนองจากความแรง 1 นวตน (Newton) คอ แรงทกระทาตอมวล 1 กโลกรม ภายใน 1 วนาท แลวทาใหมวลมความเรว 1 เมตร/นาท เพราะฉะนนนาหนก 1 กโลกรม จงมคาเทากบแรง 9.81 นวตน ซงความสมพนธของมวลและนาหนกดงกลาวจะเปลยนแปลงไดเลกนอยตามตาแหนงของมวลทอยบนพนโลก เพราะความเรงโนมถวงของโลก (Gravitational acceleration) ทกระทาตอมวลมคาแตกตางกน กลาวคอมคา 9.83 เมตร/วนาท2 9.81เมตร/วนาท2 และ 9.78 เมตร/วนาท2 ทบรเวณขวโลก บรเวณกงกลางระหวางขวโลกกบเสนศนยสตร และบรเวณเสนศนยสตร ตามลาดบ ดงนนทบรเวณเสนศนยสตรนาหนก 1 กโลกรม มคาเทากบมวล 1 กโลกรม พอดแตทบรเวณขวโลกนาหนก 1 กโลกรม จะมากกวามวล 1 กโลกรม 3.1.1 หลกการหานาหนกแหง การหานาหนกของวตถแบงออกเปน 2 วธใหญ คอ การเปรยบเทยบมวลของวตถกบมวลมาตรฐาน (Mass-mass comparison) โดยใชคานชง (Beam) วางบนจดหมน (Falcum) และเปรยบเทยบแรงทกระทาตอมวล (Mass-force comparison) การเปรยบเทยบมวล นยมทาใน 2 ลกษณะ คอ แบบคานชงมความยาวเทากน (Equal beam type) เปนการเปรยบเทยบมวลโดยตรงโดยการแขวนมวลของวตถ (Mu) และมวลททราบนาหนกมาตรฐาน (Ms) ไวทปลายคานชงทงสองขาง

นาหนก (Wu) = มวลของวตถ (Mu) x ความเรง

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 3 เครองมอพนฐานในงานวเคราะห 57

ทยาวเทากน (L1 = L2) ดงรปท 3.2 เมอคานชงอยในแนวระนาบขนานกบพนโลกเหมอนสภาวะ กอวางมวลทงสอง จงสามารถหานาหนกของวตถไดดงน

จากสมการขางตนจะเหนไดวาระบบคานชงยาวเทากนสามารถลดอทธพลจากแรงอนๆ ได

เนองจากมวลทงสองไดรบการกระทาจากภายนอกเทากน แตนาหนกของวตถจะผดพลาดถาคานชงทงสองขางยาวไมเทากน ซงอาจแกไขโดยการชงวตถนนในจานชง (Pan) ขางซาย แลวจงชงในจานชงขางขวา หลงจากนนหาคาเฉลยของนาหนกจากจานชง 2 ครง ดงกลาว (Gauss’s method of double weighing) การชงแบบนถามแรงกดทจดหมนไมเทากนทาใหความไวในการชงเปลยนแปลง กลาวคอ ถามแรงกดมากความไว (Sensitivity) ในการชงจะลดลงมาก

รปท 3.2 การชงนาหนกโดยใชระบบคานชงยาวเทากน (ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)

Mu x g x L1 = Ms x g x L2


การประยกตใชอาจพบในแบบเครองชงจานชงเดยว (Single pan balance) หรอเครองชงจานชงค (Two pan balance) เครองชงชนดจานชงเดยวตองใชนาหนกถวง (Wb) ถวงนาหนกของจานชง (Wp) เพอใหคานอยในแนวระนาบ โดยดจากเขมชอยทขดศนยบนสเกลอานคา เมอใสวตถ (Mu) ลงบนจานชง คานชงจะเอยง เขมชจะชไปบนสเกลอานคานาหนก ทาใหสามารถหานาหนกของวตถไดโดยตรง เพราะสเกลอานคาถกแบงใหถกตองโดยคานวณจากแรงทกระทาตอมวลมาตรฐานททราบนาหนก (Ms) เมอมวลมาตรฐานเคลอนทออกจากแนวจดหมน (L) สวนจานชงแบบจานชงค หานาหนกของวตถ (Mu) โดยการเปรยบเทยบกบมวลมาตรฐาน (Ms1) เมอคานชงอยในแนวระนาบหรอไมอยแนวระนาบได ในกรณหลงตองบวกนาหนกทอานไดจากสเกลอานคาเทากบนาหนกของมวลมาตรฐาน (Ws1) แบบคานชงยาวไมเทากน (unequal beam type) นอกจากจะมหลกการหานาหนกและการประยกตใชเหมอนกบแบบคานชงยาวเทากนแลว ยงมการประยกตใชทแตกตางกนออกไปคอ การแทนทนาหนกมาตรฐาน (Substitution) เพอใหจดหมนรบนาหนกคงทตลอดเวลา (Constant load) วตถและนาหนกมาตรฐานถกเปรยบเทยบบนคานชงขางเดยวกน เปนผลใหลดความผดพลาดอนเนองมาจากความยาวของคานชงทอาจไมเทากนและทาใหเครองชงมความไวมากขน รปท 3.3 แสดงหลกการทางานแบบแทนทนาหนกมาตรฐาน เมอยงไมไดชงนาหนกคานชงจะอยในแนวระนาบขนานกบพนโลก โดยการถวงคานใหสมดลดวยตมนาหนก (Mb) เมอวางวตถลงในจานชง (Mu) คานชงจะเอยง หลงจากนนยกตมนาหนกมาตรฐาน (Ms1, Ms2,…) ทแขวนอยเหนอจานชงออกจนคานอยในสมดลเหมอนสภาวะกอนชง ดงนนนาหนกของวตถบนจานชงจงเทากบนาหนกของตมนาหนกมาตรฐานทถกเอาออกไป

รปท 3.3 การชงนาหนกโดยใชการแทนทนาหนกบนคานชงทยาวไมเทากน

(ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)


ถงแมวาเครองชงชนดนจะมความถกตองและแมนยาในการชงดกตาม แตอทธพลของความหนาแนนของตมนาหนกมาตรฐาน วตถและอากาศ ทาใหการชงนาหนกไดนอยกวาคาจรง ถาตองการหานาหนกสมบรณ (Absolute weight) ตองบวกนาหนกทหายไปกบนาหนกทชงได โดยนาหนกทหายไปสามารถคานวณไดจากสตร

W1 = n (1 x 10-5 - da/ds + da/du)

โดย W1 = นาหนกทหายไปในหนวยกรม n = นาหนกทชงไดในหนวยกรม da = ความหนาแนนของอากาศซงมคาเฉลยประมาณ 0.0012 g/ml

ds = ความหนาแนนของตมนาหนกมาตรฐาน (เหลกกลาไรสนมมคาประมาณ 7.85 g/ml)

du = ความหนาแนนของวตถทนามาชง

แบบเปรยบเทยบแรงทกระทาตอมวลของวตถ อาจใชแบบสปรง (Spring) แบบไฮดรอลก (Hydraulic load cell) แบบนวมาตก (Pneumatic load cell) หรอแบบสนามแมเหลกไฟฟา (Electromagnetic coil) ดงรปท 3.4 แบบสนามแมเหลกไฟฟาอาศยการเคลอนทของสารแมเหลกแลวทาใหเกดการเปลยนแปลงสนามแมเหลกไฟฟาเปนผลใหมกระแสไฟฟาไหลในขดลวด ดงนนจงสามารถหานาหนกไดจากโวลตของกระแสไฟฟาทถกเปลยนใหเปนคานาหนกบนสเกลอานคานาหนก ซงกาหนดสเกลโดยใชตมนาหนกมาตรฐานเปรยบเทยบ เนองจากมความไวสงมากจงเหมาะสาหรบการชงวตถปรมาณนอยๆ สวนแบบสปรงใชสาหรบการชงนาหนกนอยๆ จนถงหลายพนกโลกรม สวนแบบไฮโดรลกสามารถชงนาหนกไดมากถงหลายแสนกโลกรม


รปท 3.4 การหานาหนกโดยการเปรยบเทยบแรงทกระทาตอมวลแบบใชสปรง (ก, ข) แบบนวมาตก

(ค) แบบไฮดรอลก (ง) และแบบสนามแมเหลกไฟฟา (จ) (ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)

3.1.2 ปจจยททาใหการชงนาหนกผดพลาด การชงนาหนกผดพลาดเกดจากสาเหต 3 ประการ คอ วตถมการเปลยนแปลงนาหนก ตมนาหนกมาตรฐานไมถกตอง และมแรงกระทาจากภายนอกทาใหนาหนกผดพลาด ซงจาเปนตองคานงถงปจจยเหลานเสมอเมอทาการชงนาหนก


1. นาหนกของสารมการเปลยนแปลงเนองจาก 1.1 มความชนปนอย โดยเฉพาะวตถทไมมผลกนาอยในโมเลกลการไลความชนกระทาไดโดยการอบวตถในภาชนะ ปลอยใหเยนในหมอดดความชน (Desiccator) หลงจากเยนนามาชงทนท 1.2 มสงสกปรกเจอปน สารเจอปนอาจจะถกชงรวมกบวตถทตองการได อาจมสาเหตมาจากการใชสารเคมทสกปรก ใชสารเคมเสอมคณภาพ ใชชอนตกสารทสกปรก ใชภาชนะชงทสกปรก จานชงสกปรก ฯลฯ 2. ตมนาหนกมาตรฐานมนาหนกไมถกตอง อาจเกดจากการใชตมนาหนกคณภาพตา ตมนาหนกทสกปรกหรอตมนาหนกทถกกดกรอน 3. แรงจากภายนอก แรงททาใหการชงนาหนกไมถกตองมดงน 3.1 แรงยกตวของอากาศ (Dir buoyancy) เกดขนเพราะอากาศมความหนาแนนประมาณ1.2 mg/ml ท 20 ˚C เมอถกแทนทดวยวตถจงเกดแรงตานกระทาตอวตถนน แรงตานจะมมาก เมอวตถนนมปรมาตรมาก การแกไขกระทาไดโดยการบวกนาหนกทชงไดกบนาหนกทเกดจาก ผลคณระหวางเลข 1.2 กบปรมาตรของอากาศทถกแทนท (เทากบปรมาตรของวตถ) 3.2 ลมทเกดจากวตถทนามาชงรอน ความรอนทาใหอากาศรอนลอยตวสงขน และอากาศทเยนกวาจะไหลเขามาแทนท กระแสของอากาศเยนจะดนวตถขน ทาใหชงนาหนกวตถไดนอยกวาคาจรง 3.3 แรงดดหรอแรงผลกระหวางประจ เกดขนเมอวตถมประจไฟฟาและอปกรณหรออากาศรอบๆ มประจไฟฟา ถามประจเหมอนกนจะเกดแรงผลกกน แตถามประจตางกนจะดดกน ดงนนผลของประจไฟฟาจงอาจทาใหชงนาหนกไดนอยหรอมากกวาคาจรง 3.4 แรงหนศนยกลาง การหมนของโลกทาใหวตถเกดแรงหนศนยกลาง ถามแรงดงกลาวมากจะทาใหวตถมนาหนกตากวานาหนกจรง 3.5 แรงดงดดจากดาวเคราะหดวงอน แรงทกระทาตอวตถบนพนโลกจะมการแปรผนตามเวลา (Chronological variation) เพราะแรงดงดดขนอยกบระยะหางระหวางวตถกบดาวเคราะหเหลานนซงไมคงท เนองจากมการโคจรและมการหมนรอบตวเองตลอดเวลา 3.1.3 ชนดและองคประกอบของเครองชง เครองชงในหองปฏบตการอาจแบงตามระบบการชงออกเปน 2 ชนด คอ เครองชงแบบกล (Mechanical balance) ทอาศยคานและจดหมนและแบบอเลกทรอนกส (Electronic balance) ซงอาศยการเปลยนแปลงของสนามแมเหลกไฟฟา แตอยางไรกตามยงสามารถแบงเครองชงโดยอาศยความถกตองในการชงออกเปน 2 ชนด คอ เครองชงหยาบซงมความถกตองอยในชวง 0.1 กรม ถง 0.01 g และเครองชงละเอยดหรอเครองชงวเคราะห (Analytical balance) ซงมความถกตองในการชงอยในชวง 0.001 g ถง 0.00001 g เนองจากเครองชงแตละแบบมโครงสราง องคประกอบและวธใชงานทแตกตางกนในบทนจงกลาวถงเครองชงบางชนดทนยมใชในหองปฏบตการวทยาศาสตร เพอใหครอบคลมหลกการทกลาวมาแลวขางตน ดงน


3.1.3.1 เครองชงแบบคานชงยาวเทากน (Equal beam balance) มความละเอยดในการชงอยในชวง 0.1 ถง 0.0001 g ขนอยกบการออกแบบดงแสดงในรปท 3.5 มองคประกอบทสาคญดงน

รปท 3.5 เครองชงแบบคานชงยาวเทากน (Equal beam balance)

(Donald, 2004)

1) จานชง (Pan) มกทาดวยเหลกกลาไรสนมแขวนอยทตวแขวน (stirrup) ทปลายคานชงทงสองขาง 2) คานชง (Beam) ถกแบงออกเปนสองสวนทมความยาวเทากนดวยจดหมน (Falcum) 3) สกรปรบระดบ (Leveling screw) อยบรเวณฐานเครองชง ใชปรบระดบ เครองชงใหอยในระดบแนวขนานกบพนโลก โดยสงเกตระดบจากฟองอากาศในชองมองบรเวณฐานเครองชง กลาวคอถาเครองชงวางขนานกบพนโลกฟองอากาศจะอยตรงกลางชองวดระดบพอด ถาฟองอากาศเลอนไปอยดานใดดานหนง แสดงวาระดบนนมระดบสงกวาดานอนๆ ควรลดความสงดานนนลงโดยปรบสกรปรบระดบทฐานเครองชงหรอปรบสกรปรบระดบทฐานเครองชงดานอนเพอใหอกดานหนงสงขนจนฟองอากาศเคลอนมาอยตรงกลางชองวดระดบพอด 4) ปมตรงคานและจานชง (Beam and panarrest knob) ใชสาหรบยกคานชงขน (คมมดไมถกกด) และใชหยดการแกวงของจานชงโดยตวตงจานชงทอยใตการชง 5) ตวแขวน (Stirrup) เปนตะขอสาหรบแขวนจานชง ตดตงอยบนคมมด (Knife edge) ทปลายคานชงทงสองขาง 3.1.3.2 เครองชงแบบ 3 คานชง (triple beam balance) มความถกตองในการชงประมาณ0.1 g และเหมาะสาหรบการชงวตถทมนาหนกมากปานกลาง แสดงดงรปท 3.6 มองคประกอบทสาคญดงน


รปท 3.6 เครองชงแบบ 3 คานชง (Triple beam balance)

(ทมา: https://www.google.co.th/search?q=เครองชง+Mettler)

1) จานชงวางอยบนคานชงดานซายซงสนกวาจานวน 1 จาน 2) สกรปรบสมดลซงอยทปลายของคานชงดานสน 3) คานชงดานยาวม 3 คาน (triple beam) แบงสเกลอานคานาหนกออกเปนชวงๆ ตวอยางเชน 0-1 กรม 0-50 g และ 0-100 g เปนตน 4) ตมนาหนกมาตรฐานทเคลอนทได (movable weight) อยบนคานชง คานละ1 อน 5) เขมชอยทปลายคานชงดานยาว ซงจะชเลข 0 บนสเกลเมอคานชงอยในสมดลและ ขนานกบพนโลก 3.1.3.3 เครองชงแบบแทนทนาหนกมาตรฐาน (Substitution balance) เปนเครองชงทมความถกตองสง เพราะสามารถแกความผดพาดอนเนองมาจากคมมดรบนาหนกไมคงทละมความยาวของคานชงทอาจไมเทากนได ดงนนจงเหมาะสาหรบการชงสารทมปรมาณนอยมากแตตองการความถกตองสงมาก แสดงดงรปท 3.7 มองคประกอบทสาคญดงน

รปท 3.7 เครองชงแบบแทนทนาหนกมาตรฐาน (Substitution balance)

(ทมา: https://www.google.co.th/search?q=เครองชง+Mettler)


1) คานชง วางอยบนคมมดซงแบงคานชงออกเปน 2 สวน ทยาวไมเทากน 2) ตมนาหนกปรบความไว (Sensitivity adjustment weight) อยดานบนคานชง 3) ตมนาหนกปรบสมดล (Counter weight) ใชสาหรบถวงนาหนกเพอใหคานทงสองขางซงยาวไมเทากนและมนาหนกไมเทากนอยในสมดลในแนวขนานกบพนโลกเมอยงไมมวตถวางอยบนจานชง ใชเมอปมปรบศนย (Zero adjustment knob) เมอไมสามรถปรบจออานคาใหอยทตาแหนง 00 4) ตวหนวงการเคลอนไหวดวยอากาศ (Air damper) ใชสาหรบหนวงการเคลอนไหวของคานชงโดยใชกระบอกสบและลกสบทาใหเกดแรงตานของอากาศตอตานการเคลอนไหวของคานชงทาใหคานอยในสมดลเรวขน และเคลอนทขนลงนมนวล 5) สเกลอานคาของคาน (Optical scale) ตดทปลายคานชงดานยาว แสงจากหลอดไฟจะหกเหผานสเกลดงกลาว ผานเลนสปรบความชดและหกเหออกไปปรากฏยงจออานคาตวเลขบนสเกลมกเรมจาก 00 ถง 120 mg (สาหรบเครองชงทชงไดละเอยดถง 0.00001 g) หรอเรมจาก 00 ถง 1,000 mg (สาหรบเครองชงทชงไดละเอยดถง 0.0001 g) โดยตาแหนง 00 ทจออานคาหมายถงคานอยในสภาวะสมดลและขนานกบพนโลกตวเลขอน ๆ หมายถงคานชงเอยงไปจากสมดลดวยแรงหรอนาหนกเทาใด ดงนนในการหานาหนกของวตถจงตองบวกตวเลขเหลานเขากบนาหนกของตมนาหนกมาตรฐานทถกยกออกจากคานชงดานสน 6) ตวแขวนสวนบนของตวแขวนวางอย บนคมมด สวนดานลางทเปนแขวนตมนาหนกมาตรฐานขนาดตางๆ 7) ตมนาหนกมาตรฐาน แขวนอยใตคานชงดานสนมหลายขนาด สามารถแยกออกจากคานไดดวยระบบกลผานปมควบคมนาหนก (Weight control knob) ตมนาหนกมาตรฐานมกทาจากโลหะซงทนตอการกดกรอนและไมเปนแมเหลก (Antimagnetic steel) ตวอยางเชน โลหะผสมของนเกลและโครเมยม อาจมรปรางเปนวงแหวนทรงกลมหรอทรงกระบอก 8) จานชง มกเปนเหลกกลาไรสนมรปวงกลม แขวนอยใตตมนาหนกมาตรฐานม เสนผานศนยกลางประมาณ 8-10 cm 9) ตวหยดจาน (Pan brake) เปนแทงโลหะทเลอนขนลงไดอยใตจานชง มหนาทแตะจานชงใหหยดแกวงอยางรวดเรว 10) ปมตรงคานและจานชง

11) ปมควบคมนาหนก (Weight control knob) ใชสาหรบเลอกยกนาหนกมาตรฐานทอยเหนอจานชงออก โดยทวไปม 3 ปม คอ ปมเลอกยกนาหนกชวง 1-9 g10-90 g และ 100 gสาหรบเครองชงทชงไดสงสด 200 g 12) ปมปรบศนย (Zero adjustment knob) ใชสาหรบปรบศนยของสเกลอานคาของคานชง โดยปรบใหเสนช (Index line) ของสเกลอานคาใหอยตรงชองช (Index fork) หรอเสนชของจออานคาพอด เมอหมนปมดงกลาวกลไกภายในจะเปลยนมมของกระจกสะทอนแสง ซงรบแสงมาจากสเกลอานคาของคานชงแลวสะทอนไปยงจออานคา 13) ปมวดละเอยด (Micrometer knob) ใชสาหรบวดสเกลอานคาของคานชงโดยละเอยดเนองจากในการชงนาหนกจรงๆ เสนชของสเกลอานคาของคานชงอาจอยในตาแหนงทไมตรง


กบชองชของจออานคาพอด จงตองปรบใหตรงกน เมอหมนปมนจะเกดการเลอนตาแหนงของชองชของจออานคา 14) ปมหกนาหนกภาชนะชงแบบแสง (Optical tare knob) อาศยระบบกลไกดนหรอดงคานชงดานยาวใหเคลอนทลงเลกนอย เพอใหคานชงอยในสมดลอกครงหนง หลงจากทเสยสมดลเมอวางภาชนะชงสารลงบนจานชง โดยระยะทเคลอนทนถกจากดใหอยในชวงสเกลอานคาของคานชงซงแทนคานาหนกทนอย ดงนนจงหกนาหนกของภาชนะชงทมนาหนกเบา 15) ปมหกนาหนกภาชนะชงแบบกล (Mechanical tare knob) ใชทาใหนาหนกของภาชนะชงเปนศนย ปมดงกลาวจะยกนาหนกมาตรฐานทอยเหนอจานชงออกจนคานชงอยในสมดลวธนมขอดทชวยลดเวลาในการคานวณหานาหนกของวตถแตมขอเสยททาใหนาหนกทชงไดมากทสดลดลง ตวอยางเชน เครองชงทสามารถชงนาหนกไดสงสด 200 g เมอใชปมหกนาหนกภาชนะออกไป 40 g จะสามารถชงนาหนกสงสดเหลอเพยง 160 g 16) ปมเลอกชนดการชง (Changeover knob) ใชสาหรบเลอกชนดการชงแบบปกต (normal, N หรอ ใชสญลกษณในเครองชงยหอ Mettler) หรอการชงแบบหกนาหนกภาชนะชง (Taring, T) 17) สกรปรบระดบของเครองชง มกพบอยบรเวณฐานเครองชงดานหนาทงสอง ขาง แตในเครองชงบางแบบอาจพบทบรเวณฐานดานหลงดวย การปรบเครองชงใหไดระดบตองอาศยการดฟองอากาศทอยในเครองชระดบ (Level indicator) ซงอาจอยทฐานหรอดานบนของเครองชง กลาวคอถาฟองอากาศเคลอนทไปทางดานใด แสดงวาดานนนมความสงกวาอกดานหนง แตถาฟองอากาศอยตรงกลางเครองชระดบพอดแสดงวาเครองชงตงอยในแนวระดบขนานกบพนโลก 18) จออานคา ประกอบดวยตวเลขนาหนกของตมนาหนกมาตรฐานทถกเอาออก คานาหนกของสเกลอานคาของคานชง คานาหนกจากการหมนปมวดละเอยด ชองช เสนช และชองแนะนาการเตมสาร (Filling guide)

3.1.3.4 เครองชงแบบจานชงอยดานบน (Top pan balance หรอ top loading balance) เปนเครองชงทชงสารไดมากปานกลาง (หลายกโลกรม) มความถกตองในการชงในชวง 0.001-1.000 g ใชหลกการชงแบบแทนทนาหนกมาตรฐาน โดยคมมดจะรบนาหนกคงทตลอดเวลาทนาหนกของวตถทนามาชงเปลยนแปลง

3.1.3.5 เครองชงแบบอเลกทรอนกส อาจพบอยในรปของเครองชงแบบจานชงอยดานบน หรอแบบแทนทนาหนกมาตรฐาน ในปจจบนนยมใชมากขนเรอย ๆ เพราะมราคาถกลงเมอเทยบกบเครองชงแบบกล มความถกตองในการชงสงถง 0.00001 g ใชงานงายและมระบบไมโครโพรเซสเซอรชวยเสรมประสทธภาพในการทางาน ตวอยางเชน มระบบนบจานวนวตถทใสลงไปชง มระบบคานวณทสามารถเปลยนหนวยการชง เครองชงอเลกทรอนกสแบบจานชงอยดานบนและใชหลกของแรงชดเชย (Compensating force) แสดงดงรปท 3.8


รปท 3.8 เครองชงแบบอเลกทรอนกส

3.1.4 ขอควรปฏบตในการใชเครองชง มดงน 1. วางเครองชงในบรเวณทแยกจากเครองมออน ๆ บนโตะทมการสนสะเทอนนอยควรอยในบรเวณทไมมการเดนพลกพลาน มแสงสวางพอเพยง (ควรใชหลอดฟลออเรสเซนซใหแสงสวางเพราะใหความรอนนอยกวาหลอดทงสเตน) ไมควรตรงชนหนาตาง เพราะอาจถกฝนหรอความรอนจากแสงแดด 2. ควรตดตงเครองควบคมกระแสไฟฟา (Voltage stabilizer) เพมเตมใหกบเครองชงแบบอเลกทรอนกส 3. เมอไมไดใชงานเปนเวลานานควรใสถงดดความชนในตเกบเครองชงเพอปองกนการเกดสนมและการเกาะของไอนา 4. หามวางวตถทจะชงลงบนจานชงโดยตรง โดยเฉพาะวตถทเปนของเหลวหรอเปยกชน 5. ไมควรใชมอเปลาจบตมนาหนกมาตรฐาน 6. การชงสารเคมทสามารถกดกรอนโลหะตวอยางเชน ผลกไอโอดน (I2) และสารประกอบของไซยาไนดควรใสในขวดชงสารเคมทมฝาปดมดชด 7. ควรตรงคานและจานชงทกครงเมอใสวตถบนจานชง เอาวตถออกจากจานชง การหมนปมควบคมนาหนก การเคลอนยายเครองชง ฯลฯ เพราะถงแมวาคมมดจะแขงเพราะทาจาก แซฟไฟร (Sapphire) หรอโลหะผสมอะลมเนยมกตามแตการถกกระแทกบอย ๆ อาจทาใหเกดการแตกบนซงเปนผลใหความไวของเครองชงลดลง 8. ควรทาความสะอาดทนทเมอเครองชงสกปรก โดยเฉพาะสงสกปรกทเปน ของเหลว 9. หลงจากใชงานเสรจควรตรงคานและจานชง หมนปมควบคมทกปมมาอยทตาแหนง ศนย 3.2 เครองวดพเอช (pH meter) เครองพเอช หรอเครองวดความเปนกรด-ดาง เปนเครองมอทอาศยหลกการวดความตางศกย (Electrical potential) ทเกดขนระหวางอเลกโทรดวด (Indicator electrode) ซงจมอยในสารละลาย แลวเปลยนคาตางศกยไฟฟาเปนคาพเอช โดยการเทยบคากบบฟเฟอรมาตรฐาน


(Standard buffer) การคานวณคาพเอช ดดแปลงมาจากสมการของเนนสต (Nernst,s equation) ซงหาคาแรงเคลอนไฟฟาของเซลลไฟฟา(Electrical cell) ใดๆ โดยการวดเทยบกบไฮโดรเจนอเลกโทรด (Hydrogen electrode) ซงกาหนดใหมแรงเลอนไฟฟาเทากบ 0.0000 โวลล ท 25๐C แสดงดงรปท 3.9

รปท 3.9 เครองพเอช

(ทมา: https://www.google.co.th/search?q=เครองชงพเอชมเตอร+Metler)

ในทางปฏบตไมนยมใชไฮโดรเจนอเลกโทรดเปนอเลกโทรดอางอง สาหรบการหาคาพเอชเพราะไฮโดรเจนอเลกโทรดมขนาดใหญไมสะดวกตอการใชงาน ดงนน National Bureau of Standard (NBS) จงกาหนดคาพเอชของบฟเฟอรมาตรฐานขนมาใช โดยการวดคาพเอชของบฟเฟอรมาตรฐานดวยอเลกโทรดวดชนดซลเวอร/ซลเวอรคลอไรด อเลกโทรด (Ag/AgCl electrode) เปรยบเทยบกบไฮโดรเจนอเลกโทรดเมอใชรอยตอระหวางของเหลว (Liquid junction) การวดพเอชของสารละลายตวอยางทตองการทราบคา เมอเปรยบเทยบกบคาพเอชของบฟเฟอรมาตรฐานจงสามารถคานวณไดจากสตร

PHu = PHs + (Eu-Es) F RT IN10 เมอ PHu = พเอชของสารละลายทตองการทราบคา PHs = พเอชของบฟเฟอรมาตรฐาน Eu = แรงเคลอนไฟฟาของสารละลายทตองการทราบคา Es = แรงเคลอนไฟฟาของบฟเฟอรมาตรฐาน F = คาคงตวของฟรานต = 96,487.0 coulombs/equivalent R = คาคงตวของแกส = 8,3143 Joules/mole/degree


T = องศาเคลวน= องศาเซลเซยส+273.15 IN10 = Natural log ของ 10 = 2.30259 จากสมการดงกลาวสามารถคานวณหาการตอบสนองของอเลกโทรดวดพเอชไดดงกลาว Millivolt (mV) = คาคงตว + 0.198ºK log [H+] ซงจะเหนไดวา ณ ท 0 mV อณหภมไมมผลตอการตอบสนองของอเลกโทรด เมออณหภมของสารละลายเปลยนแปลงไป เรยดจดนวา Isopotential point ในกรณทวดพเอชของสารละลายเทยบกบบฟเฟอรมาตรฐาน โดยอเลกโทรดอางองชนดอนๆ นอกจากไฮโดรเจนอเลกโทรด ตวอยางเชน การใช คาโลเมลอเลกโทรด (Calomel electrode) การวดความตางศกยไฟฟาจะแตกตางกนไป เนองจากจะมความตางศกยไฟฟาพนๆ เขามาเกยวของ ดงนน การวดพเอชจงเปนการประมาณ ซงสามารถคานวณไดจากความสมพนธกนคอ

paH = Et - (Ej + Es,)/0.05916

เมอ paH = Assigned pH value Et = แรงเคลอนไฟฟาแรงทงหมด Ej = แรงเคลอนไฟฟาระหวางรอยตอของอเลกโทรดอางอง Es, = แรงเคลอนไฟฟามาตรฐานของอเลกโทรดทวดพเอชตางๆ จะเหนไดวา paH จะถกตองกตอเมอ Ej และ Es ,มคาคงท แตคา Ej และ Es, มการเปลยนแปลงเลกนอย เนองจากสภาวะของสารละลายทนามาวดคาพเอชแตกตางไปจากสภาวะของบฟเฟอรมาตรฐานทงในดานความแรงของไอออน ความใกลเคยงของคาพเอช ดงนนเทคนคการวด พเอช โดยวดเปรยบเทยบกบบฟเฟอรมาตรฐาน จงไมถกตองประมาณ 0.03 หนวย ซงมาสามารถปรบใหถกตอง โดยเครองวดพเอชทมความละเอยด หรอมความแมนยาในการอานคามากๆ ได 3.2.1 สวนประกอบของเครองพเอช 3.2.1.1. อเลกโทรด (Electrode) ทาหนาทเปนภาคตรวจรบความเขมขนของไฮโดรเจนอออนในสารละลายท pH 7 (Standard pH Buffer) ความตางศกยระหวางอเลกโทรดทง 2 คอ อเลกโทรดอางองกบอเลกโทรดตรวจวดจะมคาความตางศกยเทากบศนยมลลโวลท (0 mV)


รปท 3.10 อเลกโทรด (Electrode)

ถาความเขมขนของไฮโดรเจนไอออนเพมขนหรอลดลงความตางศกยกจะเพมขนหรอลดลงตามความเขมขนของไฮโดรเจนไอออนในสารละลายนน โดยมอเลกโทรดเปนตวทาหนาทรบสญญาณซงอเลกโทรดปจจบนสวนใหญเปน Combination pH Electrode ซงออกแบบไวใหสะดวกในการใชงานโดยรวมสวนของ Reference Electrode และ Sensing Electrode มาอยดวยกนSensing Electrode หรอ อเลคโทรดตรวจวด ทาดวยแกวชนดพเศษทยอมใหเฉพาะไฮโดรเจนไอออน (H+) ผาน สวนใหญออกแบบเปนรปกระเปาะแสดงดงรปท 3.10 ภายในบรรจ สารละลายบฟเฟอรไวแตมบางประเภทเปนรปแบบอน เชน รปเขม ทกชนดจะเหมอนกนตรงบรเวณทไฮโดรเจนไอออนผานผวแกวจะบางมาก Reference Electrode หรอ อเลกโทรดอางอง หมายถง อเลกโทรดทสามารถสรางความตางศกยไฟฟาทคงท (Fixed potential) ตวอยางเชน ไฮโดรเจนอเลกโทรด (Hydrogen electrode) คาโลเมลอเลกโทรด (Calomel electrode) และซลเวอร/ซลเวอรคลอไรดอเลกโทรด (Ag/AgCl electrode) อเลกโทรดเหลานมโครงสรางและคณสมบตทแตกตางกนดงน 1) คาโลเมลอเลกโทรด (Calomel electrode) โครงสรางสวนกลางของอเลกโทรดเปนแทงแกวปดดานบนมลวดพลาตนม (Pt) หรอตะกว (Pb) จมอยในเมอควร/เมอควรสคลอไรด (Hg/Hg2Cl2) ถดลงมาเปน KCl paste (Calomel) ดานลางของแทงแกวเปนรเปดขนาดเลกๆ เพอใหสารละลายสามารถไหลผานเขาออกได แทงแกวดงกลาวจมอยในสารละลายอมตวของโปแตสเซยมคลอไรด (Saturated KCl) ตอนลางสดของอเลกโทรดเปนรอยตอระหวางของเหลว (Liquid junction) ทมรขนาดเลกจานวนมาก (ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)


2) ซลเวอร/ซลเวรคลอไรดอเลกโทรด (Ag/AgCl electrode) อเลกโทรดชนดนนยมใชในอเลกโทรดรวมมากกวาใชเดยวๆ ภายในอเลกโทรดประกอบดวยธาตภายในซงเปน Ag/AClแชอยในสารละลาย 4 M KCl ดานลางเปนรอยตอระหวางของเหลวใชวดพเอชของสารละลายทมอณหภมสงไดถง 110 ๐C ใชไดในงานทวๆ ไป และงานทไมสามารถใชคาโลเมลอเลกโทรดไดตวอยางเชน การวดปรมาณซลเวอรในนายาในอตสาหกรรมภาพถาย การวดปรมาณซลไฟดในนา เพอปองกนสารละลายตวอยางถกรบกวนจากซลเวอรคลอไรด ตวอยางเชน การวดคลอไรดไอออนดวยอเลกโทรดจาเพาะไอออน (Ion specific electrode) จงไดมการพฒนาอเลกโทรดชนดทมรอยตอระหวางของเหลว 2 ชน (Double liquid junction) โดยการเพมสารละลายของโปแตสเซยมไนเตรต (KNO3) อก 1 ชน ซงนอกจากจะปองกนการรบกวนแลวยงชวยเพมประสทธภาพของสารละลายเกลอภายในอเลกโทรดทมอยแลว เมอวดพเอชคาสงๆ หรอตาๆ โครงสรางของอเลกโทรดอางองแบบคาโลเมล และแบบซลเวอร/ซลเวรคลอไรดอเลกโทรด ดงแสดงในรปท 3.11

รปท 3.11 โครงสรางของอเลกโทรดอางองแบบคาโลเมล และแบบซลเวอร/ซลเวรคลอไรดอเลกโทรด

(ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)

3.2.1.2. ตวเครองพเอช กคอ Potentiometer หรอ Volt Meter ทาหนาทสาคญ คอ ปรบความตางศกยใหกบอเลกโทรดอางอง ใหมคาความตางศกยเปนศนยและคงท แปลงสญญาณจากความตางศกยของไอออนของอเลกโทรด ใหเปนความตางศกยทางไฟฟา และขยายสญญาณคา ความตางศกยทางไฟฟาใหเพมมากขนอยางเพยงพอ ใหแสดงผลทมเตอรแบบเขมหรอตวเลข 3.2.2 วธการวดโดยเครองพเอช กอนการใชงานจะตองปรบเทยบมาตรฐาน (Calibration) โดยการปรบเทยบกบสารละลายบฟเฟอรมาตรฐาน การปรบทนยมใช คอระบบ Two-point calibration ซงจะปรบชวง pH ทตองการวดดวยสารบฟเฟอร 2 คา เชน pH 4 และ pH 7 หรอ pH 7 และ pH 10 ทมคาครอบคลม


ในชวงทตองการวด ทงนเพอใหไดคาทถกตองการวดคาของสารละลาย ลางอเลกโทรดดวยนาปราศจากไอออน (Deionized water) หรอนากลน (Distilled water) และซบดวยกระดาษทชช จมอเลกโทรดลงในสารละลายทตองการเครองจะวดออกมาเปนตวเลข 3.2.3 การดแลรกษาเครองพเอช การเกบอเลกโทรดหามเกบแหง โดยทวไปเกบในสารละลายกรดทมคาพเอชประมาณ 3 และไมเกบหรอแชในนากลน เพราะวาไอออนทอยในอเลกโทรดจะแพรออกมาทาให ความเขมขนของไอออนภายในอเลกโทรดลดลง โดยปกตแลวควรทาความสะอาดอเลกโทรดประมาณเดอนละครง โดยการแชดวยกรดไฮโดรคลอรก (HCl) ความเขมขน 0.1 โมลาร (M) 3.3 เครองปนเหวยง (Centrifuge)

เครองปนเหวยงเปนเครองมอพนฐานทจาเปนสาหรบเรงอตราการตกตะกอนของอนภาค (Particle) ทไมละลายออกจากของเหลวหรอใชแยกของเหลวหลายๆ ชนดทมความถวงจาเพาะ (Specific gravity) ตางกนออกจากกน ใชทาสารละลายใหเขมขนขนฯลฯ ปจจบนเครองปนเหวยงไดมการพฒนาไปจนสามารถทจะวเคราะหชนดของสารหานาหนกโมเลกลของสารไดโดยอาศยคณสมบตของตวกลาง คณสมบตของอนภาคทแตกตางกน และการสรางแรงหนศนยกลางทเกดจากการหมนรอบจดหมน (Center of rotation) ในความเรวรอบทสงมากในดานรปแบบพบวามการพฒนาใหมขนาดเลกลงมประสทธภาพสงขน เนองจากอาศยระบบคอมพวเตอรเขามาชวยควบคมและตรวจสอบการทางานมากขน เนอหาในบทนจะครอบคลมหลกการทางานของเครองปนเหวยงอยางงายไปจนถงเครองปนเหวยงความเรวสงมาก เพราะมลกษณะการทางานคลายกน เพอกอใหเกดแนวคดในการนาเครองปนเหวยงไปประยกตใชในงานทางหองปฏบตการวทยาศาสตรมากขนเครองปนเหวยง แสดงดงรปท 3.12

รปท 3.12 เครองปนเหวยง (Centrifuge)

(ทมา: http://www.merittech.co.th/index.php?lay=show&ac=cat_show_pro_ detail&pid=192696)


3.3.1 หลกการทางานของการปนเหวยงแบบดฟเฟอเรนเทยลเกรเดยนต (Differential gradient centrifugation)

เครองหมนเหวยงสรางแรงหนศนยกลางหรอแรงหมนเหวยง (Centrifugal force, CF) ขน เพอเรงใหอนภาคตกตะกอนเรวขน ดงนนภายใตสนามของแรงเหวยงหนศนยกลาง แรง นอนกนของอนภาคจะเปนสดสวนโดยตรงกบแรงหนศนยกลาง ทาใหอนภาคนอนกนดวยอตราเรวทแตกตางกนซงสามารถคานวณหาอตราเรวในการนอนกนไดดงน (สรนดา ยนฉลาด, 2546)

แรงหนศนยกลาง (CF) = mω2r แรงลอยตว (BF) = mω2rVρ แรงเสยดทาน (FRF) = fv เมอความเรวของอนภาคคงท CF = BF + FRF mω2r = mω2rVρ + fv

ดงนน อตราเรวในการนอนกน (v) = mω2r (1-Vρ)/f เมอ CF = แรงหนศนยกลาง f = สมประสทธของความเสยดทาน v = ความเรวในการนอนกนของอนภาค V = ปรมาตรของอนภาค ρ = ความหนาแนนองสารละลาย Vρ = มวลทแทนทสารละลาย m = มวล (Mass) r = ระยะหางของอนภาคถงจดศนยกลางของการหมน ω = ความเรวเชงมม (Angular velocity) ω2r = ความเรงหนศนยกลาง (Centrifugal acceleration) ของหวหมน (Rotor)

แรงหนศนยกลางนยมวดเปรยบเทยบกบแรงโนมถวงของโลก (Earth's gravitational force, g) โดยคานวณจากจานวนรอบการหมนทสมบรณของหวหมนตอนาท (Revolution per minute, rpm)

RCF (g) = (rpm)2 x (cm) 89,500

= 0.00001117 x r x (rpm)2 = 28.38 x (rpm/1000)2 x r (นว)

= 1.12 x (rpm/1000)2 x r (mm)

เมอ RCF = แรงหนศนยกลางสมพนธ (Relative centrifugal force)

r = รศมสงสดของของเหลวทนามาหมนเหวยง rpm = Revolution per minute


จากสมการความสมพนธดงกลาวขางตน สามารถคานวณหาแรงเหวยงหนศนยกลางไดจาก โนโมแกรม ดงรปท 3.13 เมอทราบความเรวรอบและรศมของหวหมน

รปท 3.13 โนโมแกรมสาหรบหาคาแรงหนศนยกลาง (ทมา: ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)

ภายใตสนามแรงหนศนยอนภาคจะตกตะกอนดวยอตราเรวทไมเทากนการปนแยกตะกอนจง

ตองใชเวลาใหนานพอเพยงทอนภาคขนาดเลกจะนอนกนหมดจนกลายเปนกอนตะกอน (Pellet) และของเหลวเหนอตะกอน (Supernatant) จงนยมใชวธนสาหรบการปนแยกตะกอนทงหมดออกจากของเหลว แตสามารถประยกตใชสาหรบแยกสารแตละชนดออกจากกน

โดยการกาหนดความแรงในการปนแยก และระยะเวลาในการปนแยกทเหมาะสม เพอแยกตะกอนขนาดใหญออกกอนแลวจงนาของเหลวเหนอตะกอนไปปนแยกอกโดยอาจเพมเวลาหรอความแรงในการปนแยก


หลกการทางานของการปน เห วยงแบบเดนซ ต เกร เ ดยนต (Density gradient centrifugation) เปนการแยกอนภาคของสารออกจากกน โดยอาศยความแตกตางของอตราเรวในการนอนกน หรอแยกออกจากกนโดยอาศยความแตกตางของความหนาแนน โดยใชตวกลางทเหมาะสม และมเครองหมนเหวยงความหนาแนนตางๆ กน จงนยมใชสาหรบการแยกสารหลายชนดออกจากกนโดยมความบรสทธสงสามารถแบงยอยออกไดเปน 2 วธตามหลกการแยกคอ

1. การแยกโดยอาศยความแตกตางของอตราเรวในการนอนกน ในกรณทอนภาคหรอสารประกอบทตองการแยกมอตราเรวในการนอนกนแตกตางกนมาก ตวอยางเชน เอนโดพลาสมก เรตกคลม (Endoplasmic Reticulum) ไมโตรคอนเดย (Mitochondria) นวเคลยส (Nucleius) ไลโบโซม (lysosome) เมดเลอดแดง ฯลฯ สามารถแยกออกจากกนโดยใชตวกลางชนดเดยวกนแตมความหนาแนนตางกน ใสลงในหลอดปนโดยใหตวกลางทมความหนาแนนมากกวาอยในชนลาง แลวจงใสสารละลายซงประกอบไปดวยอนภาคทมอตรานอนกนตางกนลงทดานบนของหลอดปนเหวยง หลงจากนาไปปนเหวยง อนภาคทมอตราเรวในการนอนกนเทากนจะเคลอนทลงไปในหลอดปนเหวยงเรอย ๆ เปนแถบของอนภาค สวนอนภาคทมอตรานอนกนชากวาจะอยดานหลง ปลอยใหปนเหวยงเปนเวลานานจะไดแถบอนภาค ทกแถบจะเคลอนทถงกนหลอดปนทงหมด แตการปนแยกวธนจะตองใชเวลาในการปนแยกทเหมาะสมจงจะสามารถทาใหอนภาคชนดตางๆ แยกเปนชน โดยทยงไมมอนภาคเคลอนทถงกนหลอดปน หลงจากหยดหมนจะไดชนของอนภาคตางๆ แยกกนอยางชดเจนซงสามารถแยกอนภาคทบรสทธแตละชนไดโดยการดดออกจากดานบน หรอเจาะออกทางกนหลอดปน เรยกการปนเหวยงชนดนวา Rate zonal centrifugation สาหรบตวกลางทนยมใชไดกบสารละลายซโครสความเขมขน 5-20 % ตวกลางทเขมขนนจะทาใหสารละลายทมอนภาคอยไมไหลผสมกบชนของตวกลางมากเกนไป ซงทาใหสามารถแยกชนของอนภาคไดชดเจนมากยง สวนความแตกตางของความเขมขนของสารละลายซโครสในแตละชน จะทาใหการเคลอนทของอนภาคในแตละชนความเขมขนชาลง โดยการเคลอนทของอนภาคยงชาลงในสารละลายซโครสทมความเขมขนมากขน ซงเปนผลใหมเวลานานขนในการแยกอนภาคขนาดใหญและขนาดเลกออกจากกนไดมากวาการใชตวกลางทมความเขมขนเดยว

2. การแยกโดยอาศยความแตกตางของความหนาแนนของอนภาค ในกรณทอนภาคหรอสารประกอบทตองการแยกมอตราเรวในการนอนกนใกลเคยงกนมาก ตวอยางเชน ไกลโคเจน(Glycogen) ไมโครโซม (Microsomes) ไรโบโซม (Ribosomes) ฯลฯ การแยกสารเหลานออกจากกนตองอาศยความแตกตางของความหนาแนนลอยตว (Buoyant density) โดยใชตวกลางทมชวงความหนาแนนครอบคลมสารทตองการแยกหลงจากทใสสารทตองการปนแยกลงในหลอดปน โดยอาจใสเปนชนอยดานบนหรอผสมลงในตวกลางใหเปนเนอเดยวกน ในขณะทหลอดปนหมนอนภาคตางๆ จะมการเคลอนทหรอลอยตวไปหยดอยในชนของตวกลางทมความหนาแนนหนาเทาความหนาแนนของอนภาคนนๆ ทาใหสามารถแยกสารตางๆ ออกจากกนได จงเรยกวธการแยกแบบนวา Isopycnic centrifugation สาหรบตวกลางทนยมใช ไดแก ซเซยมคลอไรด (CsCl) ความหนาแนนตางๆ ซงอาจเตรยมกอนใสสารตวอยางไดเชนเดยวกบการเตรยมสารละลายซโครส หรอปลอยใหสารละลายซเซยมคลอไรด แยกเปนชนความหนาแนนหนาตางๆ เองในขณะปนเหวยง (Self generating gradient) ตวอยางเชน สารละลายซเซยมคลอไรด ทมความนาแนน 1.60 กรมตอ


มลลลตร เมอนาไปปนเหวยงเหวยงทความเรว 30,000 รอบตอนาท สารละลายจะแยกเครองมอวทยาศาสตร 115 ออกเปนชนทมความหนาแนนตงแต 1.40-1.85 กรมตอมลลลตร การปลอยให ซเซยมคลอไรดสรางชนความแตกตางของความหนาแนนเองตองใชเวลาในการปนเหวยงนานตงแต 4-48 ชวโมง เพราะซเซยมคลอไรด มนาหนกโมเลกลเพยง 168.4 g 3.3.2 ชนดของเครองปนเหวยง เครองปนเหวยงมรปแบบแตกตางกนมทงขนาดเลก ขนาดปานกลางทสามารถตงบนโตะได (Bench model) ตลอดจนขนาดใหญทสามารถปนเหวยงสารละลายไดครงละมากๆ ซงตองตงบนพนในขณะใชงาน (Floor model) แตดวยเทคโนโลยการผลตทาใหขดความสามารถไมไดเพมมากขนตามขนาดของเครองปนเหวยง ดงนนการแบงชนดทคอนขางชดเจนจงแบงตามแรงหนศนยกลางออกไดเปน 3 ชนดดงน 3.3.2.1 เครองปนเหวยงความเรวรอบตา (Low speed centrifuge) เปนเครองปนเหวยงขนาดเลกเปนสวนใหญนยมใชในงานทวๆ ไปในหองปฏบตการมความเรวรอบไมเกน 6,000 รอบตอนาทมแรงหนศนยกลางสงสดในชวง 1,800-7,000 g ดงแสดงในรปท 3.14

รปท 3.14 เครองปนเหวยงความเรวรอบตา (Low speed centrifuge)

3.3.2.2. เครองปนเหวยงความเรวรอบสง (High speed centrifuge) มความเรวรอบไมเกน 28,000 รอบตอนาท มแรงเหวยงหนศนยกลางสงสดถง 80,000 g จงนยมใชงานทตองการความแรงในการปนแยกปานกลาง ตวอยางเชน การแยกอนภาคขนาดเลก ๆ หรอมนาหนกเบาออกจากของเหลวฯลฯ ดงแสดงในรปท 3.15


รปท 3.15 เครองปนเหวยงความเรวรอบสง (High speed centrifuge)

(ทมา: http://th.aliexpress.com/w/wholesale-high-speed-centrifuge.html)

3.3.2.3 เครองหมนเหวยงความเรวรอบสงมาก (Ultra speed centrifuge) เปนเครองปนเหวยงทมกมขนาดใหญ ทมความเรวรอบของการหมนสงถง 150,000 รอบตอนาท สามารถสรางแรงหนศนยกลางไดสงถง 800,000 g (ทมา: VISION SCIENTIFIC. ม.ป.ป.) ดงแสดงในรปท 3.16 เครองหมนเหวยงชนดนสามารถแบงยอยออกไดเปน 2 ชนด คอ

รปท 3.16 เครองหมนเหวยงความเรวรอบสงมาก (Ultra speed centrifuge)

(ทมา: http://www.envision-lab.com/741842/wx-ultracentrifuge)


1. แบบวเคราะห (Analytical type) สรางขนเพอศกษาองคประกอบของสารตางๆในขณะทหมนเหวยง โดยใชตวตรวจหา (Detector) ทหวหมน ซงจะปลอยลาแสงในชวงความยาวคลน 190-800 nm ไปยงหลอดปนแลวจงสงสญญาณใหระบบคอมพวเตอรทาการวเคราะหหาการเคลอนทของชนอนภาค หาอตราเรวในการนอนกน หรอหานาหนกโมเลกล ตวอยางของเครองปนเหวยงชนดนคอเครองยหอ Beckman รน XL-1 หรอรน XL-A 2. แบบเตรยมสาร (Preparative type) สรางขนเพอใชแยกองคประกอบของสาร โดยใชของเหลวชนดเดยวกน แตความหนาแนตางกนใสลงในหลอดปน ตวอยางเชน อลบมน (Albumin) ซเซยมคลอไรด (CsCl) ฟคอล (Ficol) โซเดยมไอโอไดด (NaI) ซโครส (Sucrose) เมตรซาไมด (Metrizamide), คอลลอยดของซลกา (Colloidal silica) เปนตน 3.3.3 องคประกอบและคณสมบต ในทนจะเนนเฉพาะองคประกอบพนฐานทสาคญของเครองปนเหวยงความเรวตอนาท ซงพบไดในหองปฏบตการวทยาศาสตรทวๆ ไป สวนองคประกอบของเครองปนเหวยงความเรวสง และความเรวสงมาก จะมองคประกอบอนๆ อก ซงผใชควรศกษารายละเอยดเพมเตมจากคมอการใชงานของเครองปนเหวยงแตละรน สวนประกอบของเครองปนเหวยงมดงน

รปท 3.17 สวนประกอบของเครองปนเหวยง (ทมา: http://www.biotechsci.in.th)

3.3.3.1 ตวถง (Body) สรางเพอปองกนอนตรายแกผใช ปองกนอปกรณภายในตวถงตวถงมกทาดวยเหลกพนสอนาเมล ซงปองกนสนมและทนตอสารเคมไดด ดงรปท 3.17 มองคประกอบยอยอกคอ 1) ชองใสหวหมน (Chamber) มกทาดวยโลหะททนตอการกดกรอนและทาความสะอาดงาย ไดแก เหลกกลาไรสนมหรออะลมเนยม บางชนดเปนพลาสตกผวเรยบ ชองใส หวหมน บางแบบสามารถถอดออกมาทาความสะอาดได บางแบบถอดไมได โดยทวไปดานลางมกจะปดสนท

ตวถง

ฝาปด/เปด

หวหมน


แตในบางแบบมชองระบายอากาศ หรอชองสาหรบใหเศษสงสกปรกไหลออกทางดานลางทาใหสะดวกตอการทาความสะอาดภายใน และลดความเสยหายทอาจจะเกดจากเศษสงสกปรกเหลานน 2) ฝาปดชองใสหวหมน การผลตในระยะแรกมกทาดวยโลหะทบแสง แตในระยะหลงๆ นยมใชพลาสตกบางชนด ตวอยางเชน อะครลกเรซน (Acrylic resin) ซงมคณสมบตแขง ใส ทนความรอนไดด มาทาเปนฝาปดทาใหมองเหนสภาพภายในชองใสหวหมนไดตลอดเวลา ดงรปท 3.17 3) รระบายอากาศ รระบายอากาศพบไดในเครองปนเหวยงความเรวตา นยมเจาะไวตรงกลางดานบนของฝาปด เพอใหอากาศภายนอกถกดดเขาไปถายเทความรอนภายในชองใสหวหมน เครองปนเหวยงบางแบบไมนยมเจาะรระบายอากาศ เพราะมความรอนทเกดจาก การหมนของหวหมนนอย และไมตองการใหมการแพรกระจายเชอโรคหรอสารพษออกมาจากเครอง สวนเครองปนเหวยงความเรวสง และความเรวสงมาก จะมระบบทาความเยนในตวเองจงไมมรระบายอากาศทฝาปด 4) ยางกนเสยง อยใตฝาปดทาหนาทปดชองใสหวหมนใหสนท ทาใหลดเสยงทเกดจากหวหมนเสยดสกบอากาศ และลดการสนสะเทอนทอาจเกดจากความไมสมดลของนาหนกและยงทาหนาทปดชองใสหวหมนใหสนทดวย 5) ตะขอยด เปนอปกรณทมไวเพอความปลอดภยในการใชงาน จงทาใหเปดฝาปดไมไดจนกวาหวหมนจะหยดหมน ในทางตรงกนขามจะตดการทางานของมอเตอรในขณะทเปดฝาปดถงแมวาจะหมนปมควบคมความเรวใหมอเตอรหมนแลวกตาม

3.3.3.2 หวหมน (Rotor หรอ Head) เปนสวนททาหนาทยดหรอใสกระบอกใสหลอดปน (Bucket, Shield, Carrier) นยมทาดวยโลหะทแขงแตมนาหนกเบาตวอยางเชน อะลมเนยม เหลกกลาไรสนมไททาเนยม โลหะผสม ฯลฯ บางชนดเปนพลาสตกแขง แบงออกไดเปน 4 ชนด ตามองศาในการจบยดกระบอกใสหลอดปนดงน ดงรปท 3.18

รปท 3.18 หวหมน (Rotor) (ทมา: ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)

(1) หวหมนแบบมมแกวง (Swinging out rotor) หวหมนชนดนจบยดกระบอกใสหลอดปนแบบอสระ ทาใหกระบอกใส หลอดปนสามารถทวมมตางๆ กบพนโลกไดในขณะหมนจนกระทงเปนแนวขนานกบพนโลกเมอหมนเหวยงดวยความเรวสง แตในขณะทอยนงกระบอกใสหลอดปนจะตงฉากกบพนโลก หวหมนชนดนมความเสยดทานกบอากาศมาก จงไมสามารถหมนดวยความเรวสงมากได แตมขอดทตะกอนตกเปนแนวขนานกบกนหลอดปนทาให สามารถแยกของเหลวออกจากตะกอนไดด นอกจากนยงเหมาะสาหรบการปนแยกชนอนภาคชนดตางๆ ในเครองปนเหวยง


ความเรวสงมากแบบวเคราะห เนองจากมระยะตกตะกอนยาวทาใหมกาลงแยก (Resolution power) ดและมกระแสหมนวนของของเหลวนอยกวาทพบในหวหมนแบบมมคงท ดงรปท 3.17 (2) หวหมนแบบมมคงท (Fixed angle rotor) สรางขนมาเพอลดขอเสยบางประการของหวหมนแบบมมแกวง โดยออกแบบใหหวหมนจบยดกระบอกใสหลอดปนใหทามมกบพนโลกในองศาทคงทในชวง 10-60 องศา (นยมใช 45 องศา) มมดงกลาวจะเรงใหมการตกตะกอนเรวกวาการตกตะกอนในหวหมนแบบมมแกวง (3) หวหมนแบบแนวดง (Vertical rotor) จบยดกระบอกใสหลอดปนใหตงฉากกบพนโลกตลอดเวลาในขณะปนเหวยงอนภาคจะตกตะกอนทผนงดานนอกของหลอดปนอยางรวดเรวเพราะระยะตกตะกอนสน แตตะกอนอาจฟงกระจายไดงาย ถาตะกอนเกาะกบผนงหลอดปนไมแนน นอกจากนความโคงของผนงหลอดปนยงทาใหเกดกระแสพา จงไมนยมใชปนแยกตะกอนทวๆ ไป (4) หวหมนแบบแนวราบ (Horizontal rotor) ออกแบบใหจบยดกระบอกใสหลอดปนขนานกบพนโลกตลอดเวลาในขณะหมนเหวยงทาใหของเหลวมการไหลวนนอย ประกอบกบระยะตกตะกอนยาว จงเหมาะกบการปนแยกอนภาคออกเปนชนๆ (Rate zonal centrifugation) หวหมนของเครองปนเฮมาโตครท (Hematocrit rotor) มหลกการปนแยกแบบเดยวกบหวหมนแบบแนวราบจงสามารถแยกเลอดรวม (Whole blood) ออกเปนชนเกรดเลอด ชนเมดเลอดขาวและชนเมดเลอดแดง ไดดในระยะเวลาสนๆ หวหมนทกแบบถกออกแบบใหสามารถทนแรงเหวยงไดสงสด ตามนาหนกทผผลตกาหนด ถานาไปใสของเหลวทมความหนาแนนมาก เมอใสของเหลวเตมทนาหนกอาจเกนนาหนกสงสดทเครองปนเหวยงกาหนดไว ถายงคงใชความเรวรอบสงสดเทาเดมอาจทาใหหมนเกดความเสยหาย หรอแตกกระจาย (Explode) ดงนน จงตองลดความเรวสงสดในการปนเหวยงลง โดยคานวณจากสตร

rpm1 = rpm2√M2/M1

เมอ M2 = มวลรวมสงสดของหลอดปนและของเหลวทมความหนาแนนตาทใชกาหนด rpm2 rpm2 = ความเรวรอบสงสดทคานวณจากมวลสงสด M1 = มวลรวมของหลอดปนและของเหลวทมความหนาแนนมากทตองการปนแยกจรง rpm1 = ความเรวทสามารถใชไดเมอใชมวล M1 เพอความปลอดภยในทางปฏบต จงกาหนดใหใชความเรวรอบสงสดทใชงานตากวาความเรวรอบสงสดททาใหหวหมนแตก (Fracture speed) อยางนอย 1 เทา เสมอ โดยกาหนดให แฟคเตอรปลอดภย (Safety factor, S) อยระหวาง 2-2.5 สาหรบหวหมนของเครองเหวยงความเรวรอบสงมาก และมคาอยระหวาง 8-12 สาหรบเครองหมนเหวยงความเรวรอบตาและความเรวรอบสงปานกลาง ซงคา S คานวณไดจากสตร


s = (Fracture speed)2 ความเรวรอบสงสดทสามารถใชไดอยางปลอดภย

3.3.3.3 กระบอกใสหลอดปน ทาดวยเหลกกลาไรสนม หรอพลาสตกแขง กระบอก 1 อนอาจใสหลอดปนไดมากกวา 1 อน ขนอยกบจานวนรทเจาะทกนกระบอกใสหลอดปนมยางกนแตก (Cushion) ซงมรปราง 3 แบบ ตามชนดของกนหลอดปน คอแบบกรวย แบบกลม และแบบแบน มอปกรณบางอยางทอาจตองใชรวมกบกระบอกใสหลอดปนคอยางปรบขนาดจะใชเมอหลอดปนมขนาดเลกกวากระบอกหลอดปนมาก และแหวนทรนเนยน (Trunnion ring) ซงใชสวมกระบอกใสหลอดปนกอนนาไปคลองแขนของหวหมนแบบมมแกวง 3.3.3.4 มอเตอร (Motor) เปนอปกรณสวนทอยถดจากหวหมนลงมาแกนหมนของมอเตอรจะหมนหวหมนโดยตรง ดงนนถาเกดความไมสมดลในการหมนของหวหมนจงทาใหลกปนรอบแกนหมนแตก หรอแกนหมนของมอเตอรคดงอไดงาย ซงสามารถกนและแกไขไดโดยการตดตงตวมอเตอรบนฐานทยดหยนได ซงอาจจะเปนสปรงหรอแทนยาง ระบบดงกลาวอาจเรยกชอวา "ระบบเครองมอวทยาศาสตรปองกนการไมสมดล" (Unbalance protection system) หรอ "ระบบปรบสมดลอตโนมต" (Autobalance system) ถงแมวาระบบดงกลาวมขดจากดในการตอตานไมสมดลในชวงไมเกน 45 g แตชวยลดเวลาในการชงหลอดปนพรอมของเหลวดวยเครองชงได เพราะสามารถกะประมาณนาหนกทใกล 3.3.3.5 ระบบควบคม อาจพบสวนประกอบตางๆ ดงน 1) สวทชจายไฟฟา (Power switch) ทาหนาทปด (OFF) หรอเปด (ON) เพอจายหระแสไฟฟาใหกบวงจรการทางานของเครองปนเหวยง 2) นาฬกาตงเวลาการทางาน (Timer) ใชสาหรบควบคมเวลาในการปนเหวยง เครองหมนเหวยงขนาดเลกมกจะตงเวลาไดในชวง 0-60 นาท สวนเครองปนเหวยงความเรวสงสามารถตงเวลาการปนไดนานมากกวา นาฬกาอาจเปนชนดททางานดวยลาน (Mechanical timer) หรอทางานดวยกระแสไฟฟา (Electrical timer) ปมตงเวลาการทางานมประโยชนในการกาหนดเวลาปนแยกสาหรบงานทวๆ ไป และในกรณทตองการปนแยกอนภาคใหตกตะกอนโดยใชแรงหนศนยกลางมากกวาแรงหนศนยกลางสงสดของเครองหมนเหวยงทมอย 3) ปมควบคมความเรว (Speed control knob) เครองปนเหวยงขนาดเลกราคาถกอาจไมมปมควบคมความเรว ทงนอาจเนองจากตองการลดตนทนการผลต เครองปนเหวยงทออกแบบมาเฉพาะงานทใชแรงหนศนยกลางคงท ตวอยางเชน เครองปนเหวยงเฮมาโตครท(Hematocrit centrifuge) เครองปนเหวยงทใชงานทางนาเหลองวทยา (Serofuge) ไมจาเปนตองมปมควบคมความเรวเชนกน 4) ปมหยดหมนมอเตอร (Braking knob) เนองจากมอเตอรหมนดวยความเรวรอบสงจงเกดแรงเฉอยมากในขณะหยดหมน ซงตองใชเวลานานจงจะหยดหมนสนท จงจาเปนตองมระบบหยดหมนททาใหเครองหมนหวยงหยดหมนในชวงเวลา 1-3 นาท หลงจากตดกระแสไฟฟาออกจากมอเตอร นอกจากนระบบหยดหมนยงชวยลดอนตรายหรอความเสยหายทอาจเกดขนอนเนองจากความไมสมดลของการหมนเหวยง เพราะสามารถหยดการหมนของมอเตอรไดอยางเรวเมอเกดความ


ผดปกต ระบบหยดหมนทดควรหยดการหมนของมอเตอรไดอยางรวดเรว แตนมนวล เพอปองกนการฟงกระจายของตะกอน โดยเฉพาะในหลอดปนขนาดใหญ 5) ระบบทาความเยน สรางขนมาเพอปองกนความรอนทาลายคณสมบตของสารทนามาปนแยกและปองกนความรอนทาลายระบบอเลกทรอนกสของเครองหมนเหวยงในเครองหมนเหวยงทมความเรวรอบสงและความเรวรอบสงมาก เมอใชงานจะเกดความรอนจากการหมนของ มอเตอร และการเสยดสของหวหมนกบอากาศ จงตองมระบบทาความเยนเพอลดความรอนดงกลาวโดยการใชเครองอด (Compressor) เชนเดยวกบเครองทาความเยนทวๆ ไป แตใชสารทาความเยนทปลอดภยกวา การทาความเยนสามารถทาใหอณหภมลดลงตากวา 0 องศาเซลเซยส โดยมความผดพลาดเพยง 1-2 องศาเซลเซยส ขนอยกบ ชนด ขนาด จานวนเครองอด และระบบควบคมทใช 6) เครองวดความเรวรอบ (Revolution counter) สรางขนมาเพอตรวจสอบความเรวรอบของมอเตอรตลอดเวลาทเครองหมนเหวยงทางานความเรวรอบทแสดงจะถกตองตอเมอมการปรบเครองวดใหถกตองกอนใชงานแตอยางไรกตามความเรวรอบอาจเปลยนแปลงขนอยกบสภาพของแปรงถานและมอเตอร จงตองมการตรวจสอบความถกตองดวยเครองวดความเรวรอบภายนอกเครองปนเหวยงเปนระยะๆ เครองวดความเรวรอบภายในเครองหมนเหวยงทางานโดยการรบสญญาณ จาก Tachogenerator ซงจะเปลยนแปลงคาโวลตตามความเรวรอบของมอเตอรแลวเปลยนคาโวลตใหเปนรอบตอนาท (rpm) ในกรณทเครองวดความเรวรอบภายในเครองปนเหวยงแสดงคาไมถกตองเครองหมนเหวยงบางแบบ อาจม ตวตานทานปรบคาไดอยภายในสาหรบปรบชดเชยความคลาดเคลอน 7) ปมสาหรบเปดฝาปดชองใสหวหมน 8) สญญาณเตอน อาจเปนหลอดไฟฟาหรออปกรณสงเสยงเตอนแสดงการทางานทปกต หรอเมอผดปกต ตวอยางเชน การไมสมดลของหวหมน เปนตน 9) เครองแสดงอณหภมภายในชองใสหวหมน พบในเครองหมนเหวยงทมระบบทาความเยน ใชสาหรบตรวจสอบอณหภมกอนใชงานและขณะใชงาน 10) ระบบดดอากาศออก พบในเครองปนเหวยงความเรวสงมาก ระบบดงกลาวมหนาททาใหชองใสหวหมนเปนสญญากาศเพอลดความเสยดทานของอากาศกบหวหมน ซงจะทาใหเกดความรอนนอยลงและหวหมนสามารถหมนไดเรวขน 11) ระบบไมโครโพรเซสเซอร เครองปนเหวยงความเรวสงและความเรวสงมากจะมระบบไมโครโพรเซสเซอรควบคมการทางานของเครองปนเหวยง ใหทางานอยางมประสทธภาพและชวยลดอนตรายในการใชงาน ซงเครองปนเหวยง แตละยหอจะใชระบบไมโครโพรเซสเซอรทซบซอนมากนอยแตกตาง 3.3.4 ขอควรปฏบตในการใชงาน ถงแมวาเครองปนเหวยงจะมองคประกอบและวธใชทแตกตางกนบาง การรและเขาใจในระบบการทางานเครองมอชวยใหสามารถใชเครองไดอยางถกตองและรวดเรว ขอควรปฏบตในการใชงานกวางๆ มดงน


1. ศกษาวธการใชงานและขดจากดตางๆ ในการใชงาน จากคมอใชงาน (Operating manual) โดยเฉพาะความเรวรอบสงสด ชนดและขนาดของหลอดปนและชนดหวหมนทใชอยางปลอดภย 2. ตรวจสภาพความพรอมของเครองปนเหวยงกอนใชงาน เชน ระดบนามนหลอลน แปรงถาน ความสะอาดของกระบอกใสหลอดปน กระบอกใสหลอดปนมยางกนแตกอยครบหรอไม ฯลฯ 3. ไมควรใชหวหมนของเครองปนเหวยงเครองหนงกบเครองปนเหวยงอกเครองหนงเพราะอาจมคณสมบตทางกายภาพทแตกตางกน ควรทาเครองหมายของหวหมนแตละเครองไว 4. การใสนาหนกใหสมดล การสมดลของหวหมนของเครองหมนเหวยงคอการทาใหศนยกลางของการหมนของนาหนกซอนทบจดหมนตาง ๆ พอดความสมดลของนาหนกรอบๆ จดหมนใดๆ ยอมกอให เกดการหมนทราบเรยบและคงท ทาใหอนภาคตกตะกอนแยกชนได ด ลด การสนสะเทอน ลดเสยงดง ลดอนตรายตลอดจนยดอายการใชงาน หวหมนแบบมมคงท มจดหมนจดเดยว คอ ทจดกงกลางของแกนหมนของมอเตอรการสมดลของนาหนกจงมงไปทจดดงกลาวโดยการปฏบตดงน (1) ชงนาหนกของกระบอกใสหลอดปนพรอมยางกนแตกตดนาหนกทชงไดไวเลอกชดทมนาหนกเทาๆ กน ใสในตาแหนงตรงกนขามในแนวเสนตรงผานจดกงกลางของแกนหมน (2) ใสกระบอกใสหลอดปนในหวหมนใหเตมอยเสมอถงแมวาจะไมไดใชหลอดปนอนนนกตาม (3) ใสหลอดปนพรอมของเหลวทมนาหนกเทากน ในชองใสตรงกนขามในแนวเสนตรงผานจดกงกลางของแกนหมน (4) ถามกระบอกหลอดปนวางอยควรกระจายหลอดปนใหอยรอบๆ แกนหมน หวหมนแบบมมแกวง มจดหมน 2 จดคอ ทแกนมอเตอร และทแกนของแหวนทรนเนยน สวนทสมผสกบหวหมนควรปรบความสมดลดงน (1) ชงนาหนกของกระบอกใสหลอดปนแหวนทรนเนยน แลวจงเขยนนาหนกตดไวเลอกชดทมนาหนกเทาๆ กน ใสไวในตาแนงตรงกนขาม (2) ใสกระบอกในหลอดปนใหเตมหวหมนเสมอ (3) ใสหลอดปนพรอมของเหลวทมนาหนกเทาๆ กน ในกระบอกใสหลอดปนทอยตรงขามในแนวเสนตรงผานแกนหมนของหวหมน (4) เพอปรบสมดลของแกนหมนของแหวนทรนเนยน ตองใสหลอดปนจานวนเทาๆ กนทบรเวณ 2 ดานของจดหมนน 5. ใชหลอดปนทมขนาดพอดกบกระบอกใสหลอดปน ถาไมพอดตองใชยางปรบขนาด 6. ตรวจดความยาวของหลอดปนเสมอถาเปนหวหมนแบบมมคงทควรดวาความยาวของหลอดปนวาจะกระทบกบฝาปดชองใสหวหมนหรอไม ความยาวของหลอดปนจะเสยดสกนเองไดหรอไม ถาเปนหวหมนแบบมมแกวง ควรตรวจดระยะทปลายหลอดปนจะกระทบกบแกนหมนเมอ หลอดปนอยในแนวราบ


7. ไมควรปนแยกสารเคมทตดไฟหรอระเบดไดงาย เพราะประกายไฟทมอเตอรอาจทาใหเกดไฟลกขน 8. สาหรบเครองปนเหวยงความเรวสงหรอความเรวสงมาก ควรเปดเครองทาความเยนจนไดความเยนทตองการ และเปดเครองดดอากาศจนเกดสญญากาศภายในชองใสหวหมนกอนเปดสวทชหวหมนใหทางาน 9. ควรตงเวลาปนแยกกอนหมนปมควบคมความเรว 10. เพมความเรวของมอเตอร ดวยการหมนปมควบคมความเรวอยางชาๆ 11. ไมควรเปดฝาปดชองใสหวหมนขณะทหวหมนกาลงหมนดวยความเรวสง เพราะอาจกอใหเกดอนตรายไดงายและชวยทาใหเกดการฟงกระจายของเชอโรคไดดขน 12. เครองหมนเหวยงทไมมระบบหยดหมนของมอเตอร ควรปลอยใหหวหมนหยดหมนเองไมควรใชมอหรอวตถอน ๆ หยดหวหมน 13. ไมควรพยายามดงหลอดปนออกในขณะทหวหมนยงไมหยดสนท 14. ในขณะปนถามความผดปกต หรอเกดความไมสมดลควรปดสวทชหยดการทางานของมอเตอรทนท 15. ทาความสะอาดหวหมนและชองใสหวหมนทกครงหลงจากใชงาน 16. ถาโวลตของกระแสฟาตกมากมากไมควรใชเครองปนเหวยง เพราะทสภาวะนมอเตอรจะดงกระแสไฟฟามากกวาปกต ซงอาจทาใหเกดความรอนมากจนขดลวดทองแดงของมอเตอรไหมนอกจากนยงอาจทาใหวงจรควบคมการทางานตางๆ ทางานผดพลาด

3.4 เครองนงฆาเชอความดนไอนา (Automatic Autoclave) เครองนงฆาเชอความดนไอนา เปนเครองมอทใชสาหรบนงฆาเชอ โดยใชไอนารอนและแรงดนสงทาใหของทผานการนงแลวอยในสภาพปราศจากเชอจงมกใชเครองนในการนงฆาเชอของเสยทางชวภาพเพอกาจดและปองกนการปนเปอน ยงสามารถใชฆาเชอตวอยางกอนจะนามาใชในการทดลองไดอกดวย สวนการใชงานเครองนงฆาเชอความดนไอนา นนควรมการทดสอบเครองอยางสมาเสมอเพอใหสามารถใชงานเครองนงฆาเชอความดนไอนา ไดอยางมประสทธภาพสงสด ในบทความเรองเครองนงฆาเชอความดนไอนา ในตอนทแลวไดกลาวถงหลกการทางาน ประเภทของเครองนงฆาเชอความดนไอนา การนาไปใชประโยชนและเทคโนโลยใหมในปจจบนจะไดกลาวถง เทคนคการใชงานการเตรยมตวอยางและการทดสอบเครองนงฆาเชอความดนไอนา ดงรปท 3.19


รปท 3.19 เครองนงฆาเชอความดนไอนา (Automatic Autoclave)

(ทมา: http://www.taradlab.com/product.detail_155367_th_1631552)

3.4.1 หลกการทางานของเครองนงฆาเชอความดนไอนา

เปนการใชความรอนเพอกาจดเชอ ในปจจบนการใชความรอนสาหรบทาลายจลนทรย ม 2 แบบ คอ ความรอนแบบชน และความรอนแบบแหง สาหรบการใชความรอนแบบชน เชน กาตม การนง เปนตน ไอนาทเกดขนสามารถนาพาความรอนแทรกซมเขาไปในจลนทรยไดรวดเรว ความรอนแบบนจงฆาเชอโรคไดอยางรวดเรว สวนความรอนแบบแหง เชน การเผา การอบ เปนตน เนองจากไมมไอนาชวยนาพาความรอน เวลาทใชเพอการทาลายเชอจงนานกวา เพราะตองรอเวลาใหความรอนผานซมเขาไปในเนอสาร เพอการทาลายเชอภายในดวย อยางไรกดความรอนแบบแหงเหมาะกบผลตภณฑทไอนาไมสามารถเขาถงหรอจะเกดการแยกตวหรอสญเสยคณสมบตเมอถกความชน ระบบการทางานดงแสดงในรปท 3.20


รปท 3.20 ไดอะแกรมการทางานของเครองนงฆาเชอความดนไอนา

(ทมา: รชน อมพรอรามเวทย, ม.ป.ป.) กรรมวธสาคญของการใชความรอนเพอการทาใหปราศจากเชอดงน

1. การใชความรอนแบบชน การทาใหปราศจากเชอโดยไอนาภายใตความดนเพมมากกวา 100 ºC การทาใหปราศจากเชอโรคโดยไอนาทมความดนปกตนอยกวาหรอเทากบ 100 ºC 2. การใชความรอนแบบแหง เปนการทาลายเชอโดยใชความรอนจากเปลวไฟโดยตรง อณหภมทจะใชสงกวาและใชเวลานานกวาการใชความรอนแบบชน เปนการฆาทาลายเชอ โดยใหใชความรอนแหงจากตอบ (Hot Air Oven) อณหภมทใชในการทาใหปราศจากเชอทวๆ ไป เชน อณหภม 170 ºC ใชเวลาอบ 60 นาท หรออณหภม 160 ºC ใชเวลาอบ 120 นาท หรออณหภม 100 ºC ใชเวลาอบ 150 นาท เปนตน การนาไอนาและความดนมาใชในการทาลายและฆาเชอโรค ใหกบเครองมอทใชในการผาตด หรอใชกบเครองมอบางชนดในหองวทยาศาสตร ดงนนจงมการประดษฐเครองมอทเกบไอนาและรกษาความดนไวเพอใชในการนงหรอทาลาย ฆาเชอโรค เรยกวา เครองนงฆาเชอโรค (Autoclave) 3.4.2 ชนดของเครองนงฆาเชอความดนไอนา

อปกรณทใชในการนงฆาเชอกคอ เครองนงฆาเชอโรค ซงม 2 ชนด คอ 3.4.2.1 เครองนงฆาเชอความดนไอนา ระบบ Gravity คอ เครองนงฆาเชอความดนไอนา ขนาดเลกทมความจไมเกน 20 ลตร (มกใชในระดบหองปฏบตการ) มคณสมบตทสาคญดงน 1) หากใชอณหภม 121 ºC แรงดนไอนาจะเปน 15 ปอนดตอตารางนว และหากใชอณหภม 134 ºC แรงดนไอนาจะเปน 30 ปอนด/ตารางนว โดยอตโนมต (เมอนงในความดนบรรยากาศปกต)


2) ไมจาเปนตองมการไลอากาศออกจากหองนงกอนเพมความดนดวยไอนาเพราะแรงดนไอนา 15 ปอนดตอตารางนว เพยงพอทจะไลอากาศออกใหหมดไดอยแลว เครองนงฆาเชอความดนไอนา ระบบ Gravity ทขายกนในทองตลาดปจจบนม 2 แบบ โดยดจากวธการทาใหของทนงแหงเปนหลก ไดแก แบบเกา: ระบบการทาใหแหงใชความรอนทาใหของทนงแลวแหง (Dry Heat) โดยใชเวลาประมาณ 30-60 นาท ดงนนวสดบางอยางอาจมลกษณะมคณสมบตเปลยนไปและทาใหอายการทางานสนลงอนเนองจากไดรบความรอนนาน (ปจจบนไมนยมใชกนแลว) แบบใหม:ระบบการทาใหแหงจะมตวดดอากาศจากภายนอกทเยนกวาเขาสหองนงโดยผานแผนกรอง (Bacterial Filter) ขนาดรพรน 0.2 ไมครอน อากาศทเยนกวาจะไลอากาศและไอนาทรอนกวาซงอยภายในหองนงออกสหมอตมการใชเวลาในการทาใหแหงจงสนกวาแตความชนทเกาะอยกบของทนงจะออกไปไมหมดและจะตองเปลยนแผนกรองอยบอยๆ เพราะแผนกรองอาจจะตนจากอากาศทดดเขาไปได 3.4.2.2 เครองนงฆาเชอความดนไอนาแบบมระบบดดใหเปนสญญากาศกอนและหลงนง (Vacuum): เครองนงฆาเชอความดนไอนาระบบน จะมหมอนงขนาดใหญ (มกใชในโรงงานอตสาหกรรม) จงเกดปญหาจากขนาดของหองนงคอ แรงดนไอนาไมสามารถไลอากาศออกไดหมดทาใหการนงไมถงระดบการฆาเชอตามทตองการดงนนจงตองมระบบดดอากาศออกจากหองนงกอนแลวคอยใชแรงดนไอนารอนในการนงเครองนงฆาเชอความดนไอนา ระบบนจะมหมอตมใหเกดไอนา (Steam Boiler) แยกตางหาก ไมรวมอยภายในหองนง โดยจะฉดไอนาทาใหหองนงมสภาวะความรอนและแรงดนไอนาตามทตองการไดอยางรวดเรวชวยใหอปกรณทผานการนงมอายยาวนานกวาการนงดวยเครองนงฆาเชอความดนไอนา ระบบ Gravity เพราะของทนงแลวจะสมผสความรอนในชวงเวลาทสนกวา อยางไรกดเครองนงฆาเชอความดนไอนา โรคระบบน เมอการนงสนสดลงภายในหองนงจะมสภาพเปนสญญากาศ ดงนนจงตองปลอยใหอากาศภายนอกเขาสหองนงโดยผานแผนกรองกอนจงจะเปดประตได 3.4.3 สวนประกอบหลกของเครองนงฆาเชอความดนไอนา (Autoclaves) 3.4.3.1 หองนง (Chamber) แสดงดงรปท 3.21 และตระกลาบรรจตวอยาง แสดงดงรปท 3.21


รปท 3.21 หองนง (Chamber)

หองนงมลกษณะเปนรปสเหลยมหรอทรงกระบอกผนงชนในทาจากสแตนเลสสตล แบบขดมนเงาดวยไฟฟา (Polished) สามารถทนตอการกดกรอนของกรดและดางมเกรดไมนอยกวา AISI 316 Lหรอ 316 L/W.Nr.1.4404 สามารถทนแรงดนไอนาไดไมตากวา 3 Bar หรอ 40 ปอนดตอตารางนวหองนงใชสาหรบรองรบตะแกรงดงรปท 3.22 ซงบรรจอาหารเลยงเชอจลนทรยหรอเชอจลนทรยเพอฆาเชอโรค

รปท 3.22 ตะแกรง

3.4.3.2 ผนงชนนอก (Jacket) มความหนาไมนอยกวา 4 มลลเมตร ทาจากสแตนเลสสตลทนตอการกดกรอนของกรดและดาง ดานนอก Jacket หมทบดวยใยแกวหนาไมนอยกวา 50 มลลเมตร ปดทบดวยแผนอลมเนยมแขง (Mineral wool + Aluminum sheet) เพอกนความรอนกระจายออกมานอกตโดยวสดทหมทบดานนอกแบบชนดปลอดสาร CFC 3.4.3.3 ฝาเปด– ปด เปนแบบเลอนขนลงในแนวดงผนงดานในทาดวยสแตนเลสม ความหนาไมนอยกวา 5 มลลเมตรทนตอแรงดน ดงรปท 3.23


รปท 3.23 ฝาเปด– ปด เครองนงฆาเชอโรค

3.4.3.4 เครองกาเนดไอนาดวยไฟฟาภายในตวเครองมขนาดไมนอยกวา 60 กโลวตตสามารถทนแรงดนอณหภมไดมากกวา 145 ๐C ทาจากสแตนเลสสตลเกรด AISI 316 L หรอ 316 L/W.Nr. 1.4404 ตามมาตรฐาน Pressure Vessel Code ตวทาความรอน (Heating Element) มเกรดไมนอยกวา ASTM S 31254 3.4.3.5 ขอบยางสาหรบฝา เปด–ปด ทาดวยยางซลโคน (Silicone Rubber) เปนเสนวงกลมมขนาดและตดตงไดพอดกบขอบหองนงฆาเชอซงขอบยางนจะอดกบขอบฝาเปด– ปดอยางแนนหนาเมอเดนเครองทางานโดยใชไอนาหรอลมดนออกมาจากภายในของชองใสยางนไวและเมอเครองทางานเสรจตามโปรแกรมทตงไวแลวขอบยางฝา เปด– ปด นจะถกดดกลบเขาทเดมไปในรองขอบฝา เปด– ปด ดวยระบบสญญากาศ 3.4.3.6 ระบบควบคมเครองเปนระบบ Microprocessor PLC Type พรอมระบบ Software ทสามารถอานโปรแกรมและอานคาตางๆ ไดเชนการคานวณคา F 0 Value หมอแปลงไฟฟาเปนแบบ 24 VAC สาหรบควบคม Solenoid Valves และ Motor Starters 3.4.3.7 แผงรบสญญาณ (Digital Inputs–Outputs) สาหรบควบคมการทางานของเครองและมแผงรบสญญาณ Analog Measuring Inputs 3.4.3.8 ม CPU Process Board พรอม Battery สารองและมสญญาณไฟแสดงขนตอนการทางาน 3.4.3.9 แผงควบคม Operating Panel ดานหนาเครองนงนงฆาเชอโรคแบบ Color Touch Screen ทมความสวางสง (High brightness) โดยในปจจบนการออกแบบแผงควบคมสาหรบเครองนงฆาเชอทมขนาดใหญจะเปนแบบ Fully Automatic ควบคมดวยระบบ Microprocessor พรอมระบบแสดงผลทางหนาจอและกระดาษพมพเพองายตอการตรวจสอบและการบารงรกษา 3.4.4 เทคนคการใชเครองนงฆาเชอความดนไอนา 1. ถาตองการนงฆาเชอโดยใชเวลาสนลง อาจใชความรอน 134 ºC แรงดนไอนา 30 ปอนดตอตารางนว โดยใชเวลานง 7 นาท แตความรอนและความดนทสงเกนไปอาจทาใหผวโลหะเปนสนมและสกกรอนไดจงควรใชความรอนระดบนเฉพาะทจาเปนเทานน


2. สาหรบอาหารเหลวทมนาตาลอยเปนปรมาณมากการนงฆาเชอทความดนสงอาจทาใหนาตาลในอาหารไหม จนอาหารเปลยนสไดดงนนการนงฆาเชออาหารเหลวทมนาตาลปรมาณมากจงควรใชความรอนในระดบทตาลงแตใชเวลาในการนงมากขนเชน ใชความรอน 110 ºC และเวลาในการนง 30 นาท แตใชความดนเทาเดม 3. การบรรจของนงควรใหมชองวางภายในหองนงเหลอประมาณ 1 ใน 3 ไมใสของนงใหแออดจนเกนไป เพราะจะทาใหใหแรงดนไอนาไมสามารถซมผานไดสะดวก และควรตดเทปทดสอบการฆาเชอ (Autoclave tape) ลงไปดวยเพอตรวจสอบสภาวะการฆาเชอวาเปนไปตามทกาหนดหรอไม โดยเมอผานการฆาเชอแลวเทปจะมแถบสเปลยนจากสขาวเปนสนาตาลเขม 4. ในชวงของการนงฆาเชอ สภาวะของหองนงทงอณหภม แรงดนไอนาและระยะเวลาในการนงควรเปนไปตามทกาหนดหรอคงทตลอดระยะเวลาในการนง 5. ในกรณทใชเครองนงฆาเชอโรค ระบบ Gravity แรงดนไอนาตองสามารถไลอากาศภายในหองนงออกไดหมดเพราะหากมอากาศหลงเหลออยจะทาใหใชเวลาในการฆาเชอมากกวาเดมถง 10 เทาและเปนสาเหตหนงททาใหการทดสอบสปอรไมผาน 6. การนงฆาเชอของเสยทตดเชอควรใสของเสยไวใน Biohazard Bag 7. ควรตรวจสอบระดบนาของเครองนงฆาเชอความดนไอนา กอนการนงฆาเชอทกครงเพราะหากระดบนานอยเกนไปขณะทาการนงฆาเชอจะทาใหนาแหงและเปนผลใหเครองเสยหายได 8. อาหารเหลวทนงแลวหากยงเปยกชนอยหามนาออกจากหองนง ควรเปดประตหองนงไว 1/4 นว เพอใหไอนาระเหยออก โดยไมตองกงวลวาอากาศภายนอกจะเขามาในหองนงเพราะไอนาและความรอนจากภายในหองนงจะพงออกมาจงชวยกนไมใหอากาศภายนอกเขาสหองนงไดไอนาและความรอนทระบายออกสภายนอกจะนาความชนจากของทนงออกไปดวยทาใหเมอระบายไอนาออกหมดแลวของทนงกจะแหงดงนนเชอจลนทรยทตดมากบอากาศภายนอกและเขาสหองนงภายหลงจงไมมผลตอของทนงแลว

3.4.5 ประโยชนของเครองนงฆาเชอความดนไอนา นงฆาเชอเครองมออปกรณและของเสยทเกดการปนเปอนหรอตดเชอทางชวภาพ (Biohazard): เครองนงฆาเชอโรคใชสาหรบนงฆาเชอดวยไอนารอนและแรงดนสงโดยสงทสามารถนามานงฆาเชอนนไดแก 1. เครองมอทเกดการปนเปอนหรอเครองมอทนาไปใชเกยวของกบเชอจลนทรย 2. สงเพาะเลยงและหวเชอทเกดการตดเชอหรอปนเปอนจาก แบคทเรย เชอราและไวรส 3. อปกรณอนทเกดการปนเปอนเชน กระดาษผา เสอผาปเปตทปแบบพลาสตก ปเปตแกว หลอดทดลองทงขนาดเลกและใหญ (Tube, vial) ถงมอและจานเพาะเชอทใชแลว


4. ตวอยางเนอเยอสตวทงทเกดและไมเกดการตดเชอ 5. กรงขงสตวตดเชอ 6. ชนตวอยางจากเซลลพชและสตวทมดเอนเอลกผสม สงทไมควรนามานงฆาเชอไดแก สารแผรงส พลาสตก โพลเอทลนชนคตางๆ และสารละลายทระเหยไดหรอสารเคมทมฤทธกดกรอน เชน ฟนอล อเทอรและคลอโรฟอรม ของเสยทนามานงฆาเชอนจะตองใสอยในถงใสของเสยทางชวภาพ (Biohazard bag) กอนจะนามานงฆาเชอเพอปองกนของเสยปะบนอยกบนาในหองนงไมควรใชถงพลาสตกในการใสของเพอนามานงฆาเชอเพราะถงพลาสตกอาจจะละลายตดอยในหองนงและจะทาใหหองนงเสยหาย 3.5 สรปประจาบท เครองมอพนฐานทางเทคโนโลยชวภาพทมความเกยวของตอการวเคราะหเปนการเตรยมตวอยางตอการวเคราะห เพอใชการวเคราะหถกตองและแมนยามากทสดไดแก เครองชงซงเปนเครองมอทจาเปนชนดหนงของหองปฏบตการวทยาศาสตร เพราะการวเคราะหสวนใหญเปน การวเคราะหเชงปรมาณ (Quantitative analysis) ทตองอาศยเครองชงชวยในการวเคราะหเปรยบเทยบกบสารมาตรฐานทตองทราบปรมาณหรอความเขมขนทแนนอน เครองพเอชกมความสาคญในการเตรยมตวอยางซงมอเลกโทรดวดสาหรบจมอยในสารละลาย แลวเปลยนคาตางศกยไฟฟาเปนคาพเอช โดยการเทยบคากบบฟเฟอรมาตรฐาน (Standard buffer) การคานวณคาพเอช ดดแปลงมาจากสมการของเนนสต (Nernst,s equation) ซงหาคาแรงเคลอนไฟฟาของเซลลไฟฟา(Electrical cell) ใดๆ โดยการวดเทยบกบไฮโดรเจนอเลกโทรด (Hydrogen electrode) ซงกาหนดใหมแรงเลอนไฟฟาเทากบ 0.0000 โวลล ท 25๐C เครองปนเหวยงเปนเครองมอพนฐานทจาเปนสาหรบเรงอตราการตกตะกอนของอนภาค (Particle) ทไมละลายออกจากของเหลว หรอใชแยกของเหลวหลายๆ ชนดทมความถวงจาเพาะ (Specific gravity) ตางกนออกจากกน ใชทาสารละลายใหเขมขนขน ฯลฯ เครองนงฆาเชอความดนไอนา เปนเครองมอทใชสาหรบนงฆาเชอ โดยใชไอนารอนและแรงดนสงทาใหของทผานการนงแลวอยในสภาพปราศจากเชอจงมกใชเครองนในการนงฆาเชอของเสยทางชวภาพเพอกาจดและปองกนการปนเปอนและนอกจากนเครองนงฆาเชอความดนไอนายงสามารถใชฆาเชอตวอยางกอนจะนามาใชในการทดลองไดอกดวย



1. จงอธบายหลกการของเครองชง เครองพเอช เครองปนเหวยง และเครองนงฆาเชอความดน

ไอนา 2. จากรปจงบอกสวนประกอบของอเลกโทรดของเครองพเอช

A คอ............................................................................................. B คอ............................................................................................. C คอ............................................................................................. D คอ............................................................................................. E คอ.............................................................................................

3. จงยกตวอยางงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพทใช เครองพเอช เครองปนเหวยง และเครองนงฆาเชอความดนไอนา 4. จงบอกเครองชงแบงออกเปนกชนดโดยอาศยความถกตองในการชง อะไรบาง แตละชนดแตกตางกนอยางไร 5. จงบอกเครองปนเหวยงมกชนด อะไรบาง 6. จงบอกขอปฏบตในการใชเครองชง


7. จงบอกขอปฏบตในการใชเครองปน 8. จงบอกประโยชนของประโยชนของเครองนงฆาเชอโรค 9. การคานวณคาพเอช คานวณจากปรมาณอะไรในสารละลาย และมหนายเปนอะไร 10. เครองมอพนฐานชนดใดทสามารถวเคราะหเชงปรมาณได



ชชาต อารจตรานสรณ. (2539). เครองมอวทยาศาสตร. พมพครงท 2. ขอนแกน: โรงพมพศรภณฑออฟเซท.

พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวนการวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.

รชน อมพรอรามเวทย. (ม.ป.ป). ไดอะแกรมการทางานของเครองนงฆาเชอโรค. คณะ ทนตแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย.

สรนดา ยนฉลาด. (2546). เทคโนโลยชวภาพพนฐาน เลมท 1 (Basic Biotechnology: volume 1). ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.

เอกสารประกอบการเรยน. บทท 5 เครองหมนเหวยง. สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557, จากhttp://home.kku.ac.th/chuare/12/centrifuge.pdf.

เอกสารประกอบการเรยน. (2547). บทท 6 เรองเครองวดพเอช (pH meter). สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557, จาก http://home.kku.ac.th.

Donald E. S. (2004). เครองชงแบบคานชงยาวเทากน (equal beam balance). คนเมอ 22สงหาคม 2557,จากhttps://www.lhup.edu/~dsimanek/museum/roberval.htm

VISION SCIENTIFIC. (ม.ป.ป). เครองหมนเหวยงความเรวรอบสงมาก (Ultra speed centrifuge). คนเมอ 2 สงหาคม 2557, จากhttp://www.tradekorea.com/product/ detail/P148717/Ultra_Speed_Centrifuge.html สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557

https://www.google.co.th/search?q=เครองพเอชมเตอร+Metler. สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557 https://www.google.co.th/search?q=เครองชง+Mettle. สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557 http://www.merittech.co.th/index.php?lay=show&ac=cat_show_pro_detail&pid=1926

96). สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557 http://th.aliexpress.com/w/wholesale-high-speed-centrifuge.html. สบคนเมอ 2 สงหาคม

2557 http://www.envision-lab.com/741842/wx-ultracentrifuge). สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557 http://www.taradlab.com/product.detail_155367_th_1631552. สบคนเมอ 2 สงหาคม

2557 http://www.biotechsci.in.th/. สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557

แผนบรหารการสอนประจาบทท 4 การวเคราะหทางสเปกโทรสโกป

หวขอเนอหา 4.1 สเปกโทรสโกป 4.2 การแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอแสง 4.3 สเปกตรมของคลนแมเหลกไฟฟา 4.4 หนวยของพลงงาน 4.5 การเกดอนตรกรยาของสสารกบรงส 4.6 ทฤษฎควอนตม แบบฝกหดทายบท บทท 4 เอกสารอางอง

วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจทฤษฎสเปกโทรสโกปได 2. มทกษะในการจาแนกชนดสเปกโทรสโกปตามคณสมบตของแสงได 3. บอกความสมพนธของหนวยปรมาณของสารและหนวยของพลงงานจากแสงทใชในงาน วเคราะหสารไดถกตอง 4. เปรยบเทยบแถบสเปกตรมแตละความยาวคลนได 5. อธบายการเปลยนแปลงเมอสสารไดรบพลงงานทแตกตางกนมาใชในงานวเคราะหคณภาพ และปรมาณได 6. มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของสเปกโทรโฟโตมเตอร และ สามารถฝกปฏบตการโดยใชเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร 7. ใชทกษะในการใชเครองเครองสเปกโทรโฟโตมเตอรวเคราะหสารในตวอยางไดอยางถกตอง

วธสอนและกจกรรม 1. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 2. ทบทวนเนอหาทเรยนมาของสปดาหกอน

3. นาเขาสบทเรยนโดยบรรยายเนอหาทเกยวของกบเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร 4. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการสอน และรปภาพ 5. เปดโอกาสใหผเรยนถามในแตละหวขอและเสนอแนวความคดกอนขามหวขอนน

6. ตรวจสอบคาตอบของผเรยนสอบถามผเรยนถาผเรยนมขอสงสยและสรปเนอหาประจาบท


7. แบงกลมผเรยนเพอฝกปฏบตการเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ เปนเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ เตรยมอปกรณและเครองมอตางๆ ตามใบงานทไดมอบหมายและกาหนดวนสงรายงาน

8. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง 9. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา 10. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน


1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอ Power point 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 5. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 6. เครองสเปกโทรโฟโตมเตอร 7. สารละลายตวอยาง 8. แบบฝกหดทายบทท 4


1. การตรงตอเวลาของนกศกษาในการสงงานและเขาเรยน 2. การซกถาม-ตอบคาถาม 3. การเขารวมกจกรรมกลม 4. การปฏบตการในใบงาน 5. การทาแบบฝกหดทายบท การประเมนผล 1. จากการทากจกรรมกลมเสรจตามเวลา 2. ทาใบงานถกตองและครบสมบรณ 3. ทาแบบฝกหดมความถกตองไมนอยกวารอยละ 80

บทท 4 การวเคราะหทางสเปกโทรสโกป

ในธรรมชาตจะพบวาสารสามารถดดกลน (Absorb) รงสหรอแสง (Radiation or Light) ไดแตกตางกน ทาใหวตถตางๆ มสสนแตกตางกนไป คณสมบตการดดกลนแสงของสารนไดนามาใชประโยชนทางงานวเคราะหทางเคม สามารถนาไปประยกตใชไดทงงานวเคราะหเชงคณภาพและ เชงปรมาณ ตวอยางคณสมบตทเกยวของ ไดแก การแผรงสแมเหลกไฟฟา และการเกดอนตรกรยากบสาร ซงเปนจดเรมตนของการนาไปศกษาทางสเปกโทรสโกป 4.1 สเปกโทรสโกป (Spectroscopy Methods) สเปกโทรสโกป เปนคาทใชกนอยางกวางขวาง ซงหมายถง การแยก การตรวจสอบ และการบนทกของพลงงานทเปลยนไปเกยวกบนวเคลยส อะตอม ไอออน หรอโมเลกล (Mark and Edward , 2013) พลงงานทเปลยนไปนนเนองจากการเกดอมสชน (Emission) การกลนแสง (Absorption) การกระเจง (Scattering) ของการแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอของอนภาค เทคนคนจงนาไปใชแกปญหาทาง (John, 2003, Stoog et al., 2014) การวเคราะหไดกวางขวางและหลากหลายดวยหลกการเดยวกน คอ อาศยการเกดอนตรกรยาของสาร (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535, ศภชย ใชเทยมวงศ, 2539, บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, 2539)

4.2 การแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอแสง (Light) การแผรงสแมเหลกไฟฟา เปนพลงงานรปหนงทแผออกมาเปนอนภาค (Particle) หรอทเรยกสนๆ วา โฟตอน (Photon) ซงใชอธบายเกยวกบการเกดการปลอยพลงงานหรอการดดกลนพลงงานของอะตอมหรอโมเลกล ดงรปท 4.1 และ รปท 4.2 (Stoog et al., 2014) จากทฤษฎควอนตม (Quantum theory) พลงงานของโฟตอนจะเปนปฏภาคโดยตรงกบความถ (Frequency) ของการแผรงสนนๆ ซงเขยนเปนสมการไดดงน E = hv E = พลงงานของโฟตอน มหนวยเปน จล (J) h = Plank’s constant = 6.62 x 10-34 J sec V = ความถในหนวยเฮรตซ (Hertz = Hz หรอ sec-1) ถาการแผรงสแมเหลกไฟฟามลกษณะเปนคลนซงใชอธบายปรากฏการณเกยวกบการสะทอน (Refrection) การหกเห (Refraction) การกระเจง (Scattering) ไดอยางด ความเรวของคลนในตวกลาง (Medium) อนหนงจะเปนปฏภาคโดยตรงกบความยาวคลนและความถซงเขยนสมการไดดงน

98 บทท 4 การวเคราะหทางสเปกโทรสโกป เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

vi = iv vi = ความเรวของคลนในตวกลาง i ในหนวย cm/sec i = ความยาวคลนในหนวย cm/cycle v = ความถในหนวย sec-1 ถาตวกลางเปนสญญากาศ (vac) vvac = c = 3 x 1010 cm/sec c = ความเรวของแสงในสญญากาศ ถาจะพจารณาถงความสมพนธระหวางพลงงานของการแผรงสแมเหลกไฟฟากบความยาวคลนจะไดดงสมการ E = hc/ ≈ hcv v = wave number = 1/ = v/v

รปท 4.1 แสดงลกษณะของการแผรงสแมเหลกไฟฟา

(ทมา: Stoog et al., 2014)

รปท 4.2 สเปกตรมของการแผรงสแมเหลกไฟฟา (The electromanetic spectrum) (ทมา: Stoog et al., 1998)

x Z

Y

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 4 การวเคราะหทางสเปกโทรสโกป 99

การแผรงสแม เหลกไฟฟาในลกษณะทเปนคลนจะประกอบดวยสนามแมเหลกและสนามไฟฟาซงเกดจากการแกวงกวด (Oscillate) อยในแนวตงซงกนและกน เมอเวลาเกดอนตรกรยาธรรมดากบสารสนามไฟฟาเทานนทถายเทพลงงานให 4.3 สเปกตรมของคลนแมเหลกไฟฟา ลกษณะสเปกตรมของคลนแมเหลกไฟฟาซงครอบคลมตงแตความยาวคลนนอยถงความยาวคลนมาก (<0.1 ๐A – 30,000 m) หรอจากรงสแกรมมาจนถงคลนวทย ดงแสดงในรปท 4.2 และแสดงความยาวคลนชวงทสายตามองเหน ตารางท 4.1 ตารางท 4.1 แสดงสเปกตรมของแสงทตามองเหน (Visible spectrum)

Wavelength region (nm)

Color (Absorbed)

Complementary Color (Color observed)

<380 Ultraviolet 380-435 Violet Yellow-green 435-480 Blue Yellow 480-490 Green-blue Orange 490-500 Blue-green Red 500-560 Green Purple 560-580 Yellow-green Violet 580-595 Yellow Blue 595-650 Orange Green-blue 650-780 Red Blue-green >780 Near-infrared ทมา: Stoog et al., 2014 4.4 หนวยของพลงงาน (Energy unit) หนวยตางๆ ของพลงงานของการแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอโฟตอนทใชในทางสเปกโทรสโกปมดงน 4.4.1 อเลกตรอนโวลต (Electron volt) ใชตวยอวา eV เปนหนวยของพลงงานทใชกบพวก การแผรงสแมเหลกไฟฟาทมพลงงานคอนขางสง เชน X-Ray หรอ UV พลงงาน 1 eV หมายถงพลงงานทจะทาใหอเลกตรอนเคลอนทผานศกยไฟฟา (Potential) 1 โวลต หรอเปนพลงงานของ โฟตอน ทมคาเทากบ 1.602 x 10-12 erg พลงงาน 1 eV = 1.602 x 10-12 erg = 2.4186 x 1014 erg = 1.2395 x 10-4 erg


ถาเปนรงสทมพลงงานสงขนไปอก เชน รงสแกมมา หรอ เอกซเรย อาจใชหนวยเปน keV (Kilo electron volt) หรอเปน MeV (Million electron volt) 1 KeV = 103 eV 1 MeV = 106 eV 4.4.2 ความถ (Frequency) วดเปนจานวน Oscillation/sec หนวยทใชเปน Hertz (Hz) 1 Hz = 1 cycle/sec โดยมาก Hertz เปนหนวยทใชทางสเปกโทรสโกปทเกยวของกบการเปลยนแปลงพลงงานของโมเลกล หรอองคประกอบของโมเลกลทใชพลงงานไมมากนก รปท 4.3 คลนจานวน 1 cycle (ทมา: Stoog et al., 2014)

4.4.3 ความยาวคลน (Wavelength) ใชสญญลกษณเปน λ หนวยทใชเรยกกนหลายอยางแตท NBS แนะนาใหใชคอ นาโนเมตร (nm) ดงรปท 4.3 1 nm = 10-9 m แตบางครงอาจพบเหนอยในหนวยอน เชน องสตรอม (A ) ไมครอน (µ) หรอมลลไมครอน (mµ) เปนตน 1 A = 10-10 m 1 µ = 10-6 m 1 mµ = 10-9 m = 1 nm 4.4.4 จานวนคลน (Wave number) ใชตวยอเปน v มหนวยเปน cm-1 ซงหมายถงจานวนคลนตอเซนตเมตร เปนหนวยทนยมใชในเรองของ IR spectroscopy v = 1/ เมอ เปน cm v = 104/ cm-1 เมอ เปน ไมครอน (µ)

1 cycle


4.4.5 หนวยของพลงงานอน ซงไดแก จล (Joule) แคลอร (Calory) ในทางสเปกโทรสโกปใชกนนอย แตนยมใชในเรองพลงงานความรอน 1 J = 107 erg = 107 m 1 cal = 4.184 J 4.5 การเกดอนตรกรยาของสสารกบรงส (Radiation) เมอใชลาแสงหรอ Beam of radiation ผานเขาไปยงสารละลายหรอวตถใดวตถหนง จะพบเสมอวาบางสวนของรงสนนถกดดกลน (Absorbed) บางสวนผานทะลออกไป (Transmitted) บางสวนเกดการสะทอนกลบ (Reflected) และบางสวนอาจกระเจง (Scattered) อยางใดอยางหนง หรอเกดขนหลายๆ อยางพรอมๆ กน ดงแสดงอยในรปท 4.4

รปท 4.4 แสดงการเกดอนตรกรยาของสสารกบรงส (ทมา: ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)

สสารเมอมการดดกลนแสงบางสวนในบางชวงจะทาใหเกดการเปลยนแปลงทางพลงงานชองสสารนนขน ซงสรปไดดงแสดงในตารางท 4.2 และทนาไปใชในงานวเคราะหแสดงดงตารางท 4.3

ตารางท 4.2 อนตรกรยาของสสารกบรงส

รงสทถกดดกลน การเปลยนแปลงพลงงานทเกยวของ Visible UV หรอ X-ray Electronic transitions

Vibration or rotational changes Infrared Molecular vibration changes with superimposed

radiation changes Far-infrared or Microwave Rotational changes Radio frequency Too weak to be observed except under and intense

magnetic field ทมา: แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535

Absorbed

Radiation

Incident

Radiation (Po) Radiation (Pt)

Reflected radiation (Pr) Scattering (Ps)

Fluorescence (F)


ตารางท 4.3 แสดงระดบพลงงาน (Energy state) ทเกดขนจากการดดกลนรงสแลวนามาใชเปนวธวเคราะหทางสเปกโทรสโกป

เทคนคทางแสง อนตรกรยา Nuclear Magnetic Resonance Nuclear spin coupling with an applied

magnetic field Microwave Spectroscopy Rotational molecules Electron Spin Resonance Spin coupling of unpaired electrons with an

applied magnetic field Infrared and Raman Spectroscopy Rotation of molecules

Vibration of molecules Electronic transition (Some large molecules only)

UV-Visible Spectroscopy Electronic energy changes Impinging monoenergetic electrons causing Valence-electron excitation

X-Ray Spectroscopy Inner-shell electronic transition Diffraction and reflection of X-Ray radiation form atomic layers

ทมา: แมน อมรสทธ และ อมร เพชรสม, 2535 4.6 ทฤษฎควอนตม (Quantum Theory) กฏของ Classical mechanics สามารถนามาใชอธบายใหเขาใจถงพฤตกรรมเกยวกบปรากฏการณทเกดขนกบวตถทมพลงงานและมขนาดธรรมดาได เชน ขนาดลกปงปอง คอลกปงปองเมอมแรงหรอพลงงานมากระทา ลกปงปองอาจหมนหรอกระเดง หรอเคลอนทดวยความเรวเทาไหรนนขนอยกบลกปงปองนน ซงพลงงานของการหมนหรอความเรวของการกระเดงนนถอวาเปนกระบวนการทตอเนอง แตกฏของ Classical mechanics ไมสามารถทจะนามาใชอธบายเกยวกบพฤตกรรมของวตถทมขนาดเลกระดบไมโครได เชน พวกอะตอม หรออเลกตรอน หรอโมเลกล โมเลกลเมอไดรบพลงงานใชวามนจะสามารถหมนฟร หรอเกดการสนฟรได ทงนขนอยกบขอกาหนดของควอนตม (Quantum restrictions) ซงเปนลมตทเกยวของกบพลงงานและความเรวทไมตอเนอง (Discrete value) เฉพาะบางคาเทานน ความสาคญของขอกาหนดทางควอนตมทมตอการเคลอนทของวตถขนาดเลกนนขนอยกบปรภม (Space) ทจะมให ถามปรภมมากวตถนนจะเคลอนทโดยมขอกาหนดทางควอนตมนอยกวาเมอมปรภมแคบๆ (Christian and O’Reilly, 1986; Skoog, 1985) ในทาง Quantum mechanics ยอมใหโมเลกลหรออะตอมมระดบของพลงงานได และอาจอยไดนานหรออยไดในชวงระยะเวลาอนสน นนคอ โมเลกลหรออะตอมซงมระดบพลงงาน มธยนตร


(Intermediate) จะเกดขนได หรอมอยไดเพยงชวครเทานน เมอมการเปลยนแปลงระดบของพลงงานเพมขนหรอลดลงจากระดบหนงไปอกระดบหนง สารทมอะตอมเดยว (Monoatomic) โดยปกตจะเกดขนไดในสภาวะทเปนแกส และม การดดกลนพลงงานไดตอเมอมการเพมพลงงานใหกบอเลกตรอน (Electronic energy) เทานน จะตองไมลมวา อเลกตรอนของอะตอมนนจะอยทระดบพลงงานตางๆ กน (Discrete energy) และถกทาใหเปนควอนตม (Quantized) อเลกตรอนเหลานจะอยใน Subshell ตางๆ ดงรปท 4.5 ดงนน ถามการดดกลนพลงงานจากรงสพอดเทากบพลงงานทตางกน (ΔE) ของระดบพลงงานทงสองระดบแลวจงจะเกดการเปลยนแปลงระดบพลงงานของอเลกตรอนได (Electronic transition) ΔE1 5s 4p 4d 4s 3d 3d 3s 2p 2s ΔE2 1s ΔE3

รปท 4.5 แสดงระดบพลงงานของอเลกตรอนในอะตอมทมอเลกตรอนหลายตว

(ทมา: Christian and O’Reilly, 1986)

สาหรบอะตอมทมอเลกตรอนหลายตว การดดกลนพลงงานมโอกาสเกดขนไดหลายอยาง พลงงานทจะพอทาใหอเลกตรอนเปลยนระดบพลงงานจาก 3d ไปยง 4p ซงมพลงงานตางกนเทากบ ΔE1 อาจเปนแสงทอยในชวงตามองเหน (Visible region) และถาจะใหอเลกตรอนเปลยนระดบพลงงานจาก 2s ไปยง 2p พลงงานตางกนเทากบ ΔE2 ตองใชแสงทอยในชวง UV หรอถาจะเปลยนระดบพลงงานของอเลกตรอนจาก 1s ไปยง 2s พลงงานตางกนเทากบ ΔE3 จะตองใชแสงเทากบระดบพลงงานของรงสเอกซ (X-Ray) สาหรบโมเลกลทประกอบไปดวยอะตอมหลายๆ อะตอม อเลกตรอนทจะมการเปลยนระดบพลงงานจะเกยวกบอเลกตรอนใน Molecular orbitals ซงตองการพลงงานจากแสงอยในชวง UV เทานน โครงสรางสารมผลตอการดดกลน (Effect of Structure on Absorption) การดดกลนพลงงานซงอยในชวงของสเปกตรมของการแผรงสแมเหลกไฟฟาของโมเลกลของสารนน ขนอยกบโครงสรางของโมเลกลมากกวาทจะเกยวกบพนธะ โฟตอนทมพลงงานนอยระดบ Far-infared หรอ Microwave สามารถทาใหเกดการเปลยนแปลงเฉพาะ Rotation energy ถาโฟตอนมพลงงานมากขนไปอก จะสามารถทาใหพลงงานของ Molecular vibration กบ Molecular rotation เกด การเปลยนแปลงได แตถามการดดกลนแสงในชวง Visible และ UV จะทาให Valence electrons เกดการกระตนได แตจะเกดการเปลยนแปลง Vibration และ Rotation ควบคไปดวย เมอโมเลกลของสารดดกลนพลงงานจากโฟตอนทมพลงงานอยในชวง Far-ultraviolet หรอสงกวา ทจะทาให

Energy


พนธะ (Bond) เกดการแตกออกไดหรออเลกตรอนทอยในเซลลนนๆ เกดการเปลยนแปลงระดบของพลงงานได 4.7 สรปประจาบท สเปกโทรสโกป เปนเครองมอทใชวดปรมาณของสารเคมชวโมเลกลสเปกโทรสโกป เปนคาทใชกนอยางกวางขวาง ซงหมายถง การแยก การตรวจสอบ และการบนทกของพลงงานทเปลยนไปเกยวกบนวเคลยส อะตอม ไอออน หรอโมเลกล พลงงานทเปลยนไปนนเนองจากการเกด

อมสชน (Emission) การกลนแสง (Absorption) การกระเจง (Scattering)

ลกษณะสเปกตรมของคลนแมเหลกไฟฟาซงครอบคลมตงแตความยาวคลนนอยถงความยาวคลนมาก (<0.1 ๐A – 30,000 m) หรอจากรงสแกรมมาจนถงคลนวทย อเลกตรอนโวลต (Electron volt) เปนหนวยของพลงงานทใชกบพวก การแผรงสแมเหลกไฟฟาทมพลงงานคอนขางสง โฟตอนทมพลงงานนอยระดบ Far-infared หรอ Microwave สามารถทาใหเกดการเปลยนแปลงเฉพาะ Rotation energy ถาโฟตอนมพลงงานมากขนไปอก จะสามารถทาใหพลงงานของ Molecular vibration กบ Molecular rotation เกดการเปลยนแปลงได การดดกลนแสงในชวง Visible และ UV จะทาให Valence electrons เกดการกระตนได แตจะเกดการเปลยนแปลง Vibration และ Rotation ควบคไปดวย เมอโมเลกลของสารดดกลนพลงงานจากโฟตอนทมพลงงานอยในชวง Far-ultraviolet หรอสงกวา ทจะทาใหพนธะ (Bond) เกดการแตกออกได



1. จงอธบายทฤษฎสเปกโทรสโกป 2. จงบอกการเกดอนตรกรยาของสสารกบรงสสามารถเกดไดกแบบอะไรบาง 3. จงยกตวอยางรงสทถกดดกลนไดโดยอนภาคของสสาร มา 2 ชนด 4. จงอธบายและยอตวอยางการเกดอนตรกรยาของสสารกบรงส (Radiation) คออะไร มอะไรบาง 5. จงบอกการเกดอนตรกรยามอะไรบางเมอใหรงสกบสสาร ระดบพลงงาน (Energy state) ทเกดขน จากการดดกลนรงสแลวนามาใชเปนวธวเคราะหทางสเปกโทรสโกป 5.1 Microwave Spectroscopy 5.2 UV-Visible Spectroscopy 5.3 Infrared and Raman Spectroscopy 6. จงเรยงลาดบความยาวคลนของคลนแสงตอไปน จากนอยไปมาก Ultraviolet, Visible, Infrared และ X-Ray 7. จงบอกความหมายอเลกตรอนโวลต (Electron volt) คออะไร 8. จงอธบายพลงงาน 1 eV หมายถงอะไร 9. บอกความสมพนธของหนวยปรมาณของและหนวยของพลงงานจากแสงทใชในงานวเคราะห สารไดถกตอง 10. จงยกตวอยางชนดของสารทสามารถวเคราะหโดยเครองเครองสเปกโทรโฟโตมเตอรแตละชนดมา 3 ชนด


เอกสารอางอง ชชาต อารจตรานสรณ. (2539). เครองมอวทยาศาสตร. พมพครงท 2. ขอนแกน: โรงพมพศรภณฑ

ออฟเซท. บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, บรรณาธการ. (2539). เอกสารประกอบการประชม

เชงปฏบตการเคมวเคราะหดวยเครองมอ. 6-10 พฤษภาคม 2539; ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม. เชยงใหม.

พฒนา เหลาไพบลย. และอลศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวนการวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลยมหาวทยาลยขอนแกน.

แมน อมรสทธ. และอมร เพชรสม. (2535). Principles and Techniques of Instrumental Analysis. กรงเทพฯ: ชวนพมพ.

ศภชย ใชเทยมวงศ. (2539). เคมวเคราะห. กรงเทพฯ: สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย. Christian D. D. and J. E. O’Reilly. (1986). Instrumental Analysis. 2nd ed. Allyn and

Bacon. Inc. Jhon Dalton. (1802). Essay IV. On the expansion of elastic fluids by heat. Memoirs

of the Literary and Philosophical Society of Manchester, vol. 5, pt. 2, p 595-602; see p 600.

Skoog D. A.. (1985). Principles of Instrumental Anaslysis. 3rd ed. Holt-Saunders International Editions.

Stoog D. A, Holler J. F. and Nieman T.A. (1998). Principles of Instrumental Analysis. 5th ed. United States of America: Thomson Learning Inc.

Stoog D. A., West D. M., Holler J. F and Crouch S. R. (2014). Fundamentals of Analytical Chemistry. 7th ed. Singapore: New Tech Park (Looby H).

แผนบรหารการสอนประจาบทท 5 อลตราไวโอเลตและวสเบลสเปกโทรสโกป


5.1 หลกการและทฤษฎพนฐานเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 5.2 สวนประกอบของเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 5.3 ชนดเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 5.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห 5.5 ขนการวเคราะหโดยใชยว-วสเบล สเปกโทรโฟโตมเตอร 5.6 ตวอยางงานวเคราะหดวยเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 5.7 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 5 เอกสารอางอง วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโต

มเตอร 2. มทกษะบอกสวนประกอบของของเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร

3. วเคราะหชนดและปรมาณสารโดยใชเครองยววสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 4. ใชทกษะในการใชเครองสเปกโทรโฟโตมเตอรเพอนาไปวเคราะหสารในตวอยางได 5. อธบายความสมพนธระหวางปรมาณสารกบคาการดดกลนแสงตามกฏของเบยรได


1. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 2. ทบทวนเนอหาทเรยนมาของสปดาหกอน 3. นาเขาสบทเรยนโดยภาพ เครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 3. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการ

สอนและรปภาพ 4. เปดโอกาสใหผเรยนถามในแตละหวขอและเสนอแนวความคดกอนขามหวขอนน 5. ตรวจสอบคาตอบของผเรยนสอบถามผเรยนถาผเรยนมขอสงสยและสรปเนอหาประจาบท 6. แบงกลมผเรยนเพอฝกปฏบตการเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพเตรยมอปกรณ

และเครองมอตางๆ ตามใบงานทไดมอบหมายและกาหนดวนสงรายงาน 7. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง 8. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา

108 แผนบรหารการสอนประจา บทท 5 เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

9. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน สอการเรยนการสอน

1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอเอกสารประกอบการสอนอเลกทรอนกส 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. เครองเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 5. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 6. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 7. แบบฝกบทท 5



บทท 5 อลตราไวโอเลตและวสเบลสเปกโทรสโกป

การดดกลนแสงหรอรงสทอยในชวงอลตราไวโอเลตและวสเบล ซงอยในชวงความยาวคลน

ประมาณ 190-800 นาโนเมตร (nm) ของสารเคมนน สวนใหญไดจากพวกสารอนทรย (Organic compound) หรอสารสารอนนทรย (Inorganic compound) ทงทมสและไมมส สมบตของสารดงกลาวนไดนามาใชเปนวธวเคราะหทงในเชงคณภาพและเชงปรมาณอยางกวางขวาง เพราะวธนใหความถกตองแมนยาด และมสภาพไว (Sensitivity) สง โดยอาจทาการวเคราะหอยในรปของธาตหรอโมเลกลกได แตในกรณนจะนาไปพสจนวาสารตวอยางนนเปนสารอะไร มโครงสรางอยางไร อาจจะตองใชเทคนคอยางอนเขามาชวยดวย เพอใหเกดความแนใจ เชน ใชเทคนคอนฟาเรด (Infared; IR) หรอ นวเคลยรแมกเนตกเรโซแนนซ (Nuclear magnetic resonance; NMR) เปนตน (พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา, 2536, พรพมล กองทพย, ม.ป.ป., บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, 2539 ).

โดยทวไป เทคนคการวเคราะหนบางครงนยมเรยกวา ยว-วสเบล สเปกโทรโฟโตเมตร แตถาสารททาการวเคราะหมสหรอทาใหเกดสขน สารทมสนนจะดดกลนแสงในชวงวสเบล อาจเรยกวา คลเลอรเมตร (Colorimetry) ซงในบทนจะกลาวถงเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร (Spectrophotometer) ทใชในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ดงรปท 5.1

รปท 5.1 แสดงการเกดอนตรกรยาของสารเคมกบการแผหรอรงสแสง (ทมา: ชชาต อารจตรนสรณ, 2539)

เมอใหลาแสงทเคลอนทอยางตอเนองกน (Continuous beam of radiation) ผานเขาไปในวตถใสจะพบวาแสงบางสวนถกดดกลน บางสวนเกดการสะทอน บางสวนกระเจง และบางสวนผานทะลออกไป ดงแสดงในรปท 5.1 ถาใหแสงททะลออกไปนนผานเขาเครองกระจายแสง (เชน ปรซม หรอ เกรตตง) จะพบวาสเปกตรมหายไปสวนหนง สวนทหายไปนเรยกวา Absorption spectrum พลงงานทถกดดกลนไปนนจะทาใหโมเลกลหรออะตอมเปลยนระดบของพลงงานจากสถานะพน

Absorbed

Radiation

Incident

Radiation (Po) Radiation (Pt)

Reflected radiation (Pr) Scattering (Ps)

Fluorescence (F)

110 บทท 5 อลตราไวโอเลตและวสเบลสเปกโทรสโกป เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

(Ground state) ไปยงสถานะกระตน (Excited state) (Kellner R, Mermet J.-M. Otto M, Vacarcel M, Widmer H.M., 2004) ดงแสดงในรปท 5.2

รปท 5.2 แสดงกระบวนการเกดการกระตน คา ความหมาย และสญลกษณทใชในเรองของการดดกลนแสง คาและความหมาย ตลอดจนสญลกษณทไดรบการรบรองใหใชจากทางเคมวเคราะหและ ASTM เพอใหเกดความเขาใจทตรงกน ดงตารงท 5.1 ตารางท 5.1 คา ความหมาย และสญลกษณทใชในเรองของการการดดกลนแสง

ชอ สญลกษณ คาจากดความ ชออยางอนทใช Radiant Power P, Po เปนพลงงานของแสงหรอรงสทตก

กระทบในมาตรวดตอตารางเซนตเมตรตอวนาท

ความเขมของแสงหรอรงส I, Io

แอบซอรแบนซ (Absorbance)

A logPo/P Optical density, OD, Extinction, E

ทรานสมตแทนซ (Transmitance)

T P/Po ทรานสมตชน , T (Transmition)

ความกวางเซลล b ระยะทางทแสงผานเปนเซนตเมตร l (length) d (distance)

โมลารแอบซอรพตวต (Molar absorptivity)

£ A/bc (c=โมล/ลตร) Molar extinction coefficient

แอบซอรพตวต (Absorptivity)

a A/bc (c=โมล/ลตร)

ความยาวคลน = he/E (nm, 10-9 m) mµ (Millimicron) ทมา: Stoog et al., 2014

E1 (Excited state)

ΔE = E1 – E0 = hv

E0 (Ground state)

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 5 อลตราไวโอเลตและวสเบลสเปกโทรสโกป 111

5.1 หลกการและทฤษฎพนฐานเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร เครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร (UV-vis Spectrophotometer) เปนเครองมอทใชวดปรมาณของสารเคมชวโมเลกลรวมถงจลชพทงหลายโดยใชหลกการวดปรมาณของแสงทตวอยางดดกลนเขาไปตวเครอง เปนเครองมอทใชในวเคราะหสารโดยอาศยหลกการดดกลนรงสของสารทอยในชวง Ultra violet (UV) และVisible (VIS) ความยาวคลนประมาณ 190-1000 nm สวนใหญเปนสารอนทรย สารประกอบเชงซอน หรอสารอนนทรย ทงทมสและไมมส สารแตละชนดจะดดกลนรงสในชวงความยาวคลนทแตกตางกนและปรมาณการดดกลนรงสกขนอยกบความเขมของสารนน การดดกลนแสงของสารตางๆเปนสดสวนโดยตรงกบความเขมขนของสาร จงสามารถวเคราะหไดในเชงคณภาพและปรมาณ ดงรปท 5.3

รปท 5.3 เครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร (ทมา : http://www.cosmetictestinglabs.com/2013-11-08-16-36-22/52-uv-visible-

spectrophotometer.html)

5.2 สวนประกอบของเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร เครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอรโดยทวไปจะประกอบดวยสวนตางๆ ดงรปท 5.4 และ 5.7

รปท 5.4 สวนประกอบของเครองสเปกโตรโฟโทมเตอร (ทมา: ชชาต อารจตรนสรณ, 2539)


5.2.1 แหลงกาเนดแสง (Light source) แหลงกาเนดแสงทาหนาทใหแสงผานตวอยางแหลงกาเนดแสงทดควรใหแสงทมความเขมสมาเสมอและนงตลอดความยาวคลนทใชงาน ปจจบนแหลงกาเนดแสงทนยมนามาใชมหลากหลายชนดยกตวอยาง เชน Deuterium Arc (190-420 nm) Tungsten (350-2500 nm) และ Xenon Lamp (190-800 nm) ตนกาเนดแสงทใชในเครองยว-วสเบลสเปกโตรโฟโทมเตอรจะตองใหลาแสง (Beam of radiation) ทมกาลงพอทจะวดไดดวยมาตรแสง (Photometer) จะตองใหการแผรงส (Radiation) ออกมาตลอดเวลาในชวงความยาวคลนทตองการ จะตองใหการแผรงสคงทตลอดเวลา นนคอ Po ตองคงท ฉะนนแลวผลการวเคราะหจะไมแมนยาหรอไมมความเทยง

รปท 5.5 หลอดไฮโดรเจน (Hydrogen lamp)

สาหรบตนกาเนดแสงยว คอ หลอดไฮโดรเจน (Hydrogen lamp) หรอหลอดดวเทอเรยม (Deuterium lamp) ดงรปท 5.5 .ใหแสงอยในชวง 190-420 nm ซงเกดจากการคลายพลงงานของไฮโดรเจนหรอ ดวเทอเรยมอะตอมทอยในสถานะกระตน ชองทใหแสงออกจากหลอดจะตองทาดวย ควอรตหรอ fused silica หลอดดวเทอเรยมมราคาแพงกวาแตมอายการใชงานมากกวาและใหความเขมแสงมากกวา (สถาบนนวตกรรมและพฒนากระบวนการเรยนร มหาวทยาลยมหดล, 2528)

รปท 5.6 หลอดทงสเตน (Tungsten filament lamp)


หลอดทงสเตน (Tungsten filament lamp) ดงรปท 5.6 ซงมลกษณะคลายๆ หลอดไฟธรรมดา โดยไสหลอดเปนโลหะทงสเตน เมอใชกระแสไฟฟาผานเขาไป ลวดทงสเตนจะถกเผาใหรอน และเปรงแสงออกมาอยในชวง 320 – 2500 nm ถาใชอณหภมสงขน ลกษณะของสเปกตรมจะเคลอนทไปทางความยาวคลนสนมากขน แตอายของหลอดกสนเขาเชนกน จงไดมการปรบปรงใหหลอดมอายยาวขนโดยใสแกสไอโอดนหรอแกสโบรมนทมความดนตาเขาไปในหลอดททาดวย Fused silica เรยกวา หลอดควอรต– แฮโลเจน (Quartz-halogen lamp) ซงเปนทนยมใชกนในปจจบนน นอกจากนยงมหลอดชนดอนๆ ทใชเปนตนกาเนดแสงอลตราไวโอเลตและวสเบลในบางผลตเครองมอบางชนด หลอดดงกลาวนไดแก หลอดไอปรอท (Mercury – vaper lamp) ทความดนตาใหแสงทมความยาวคลนประมาณ 365 nm (ความจรงสเปกตราม 3 เสน คอ 365.0 365.5 และ 366.3 nm) ซงนยมใชกบเครองยว – วสเบลสเปกโตรโฟโทมเตอร อกชนดหนงคอหลอดซนอน (Xenon arc lamp) หลอดชนดนเปนหลอดทใหความเขมของแสงสง โดยใหกระแสไฟฟาผานบรรยากาศของซนอนจะได Continuous spectrum อยในชวงความยาวคลน 250 – 600 nm แตจะใหความเขมสงทสดทความยาวคลนประมาณ 500 nm หลอดซนอนนนยมใชในเครองยว – วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร แตจะใชเครองมออน 5.2.2 เลนสหรอกระจกรบแสง (Lens or Mirror) เพอใชทาใหแสงเกดการสะทอนไปมาในเครอง บางครงทาใหแสงเกดการรวมกน ทงนเพอชวยลดขนาดของเครองสเปกโทรโฟโตมเตอรลง และบางครงทาใหแสงกลายเปนลาแสงขนาน ดงรปท 5.7 5.2.3 ตวแยกความยาวคลน (Monochromator) โมโนโครเมเตอรเปนสวนประกอบทสาคญของเครองสเปคโทรโฟโทมเตอรโดยทาหนาทควบคมความยาวคลน จะทาใหแสงทมความยาวคลนตางๆ ทออกมาจากแหลงกาเนดแสงเปลยนเปนแสงทมแถบแสงแคบๆ โดยใชอปกรณตางๆ เชน ฟลเตอร (Filter) ปรซม (Prism) และเกรทตง (Grating) ในปจจบนเครองสเปคโทรโฟโตมเตอรใชเกรทตงเปนสวนใหญเปนเกรทตงแบบสะทอนแสง เกรทตงชนดนมการขดเปนรองบนพนผวโลหะทขดจนขนเงา เมอแสงผานสลตเลกๆ จะมความเขมของคลนแสงมากขนเชน ใชอะลมเนยมหรอทองมจานวนรอง 1500-2500 รองตอนว ใชกบคลนแสงอลตราไวโอเลต และแสงทมองเหนได โมโนโครเมเตอรทด จะมแสงปนเปอนนอยสามารถแยกแสงทอยใกลกนออกจากกนไดด แสงทแยกออกมาจากเกรทตงจะสงผานไปทชองแสงออกไปสสารตวอยาง ฟลเตอร และปรซม เลกใชแลว ปจจบนนยมใชเกรทตง


รปท 5.7 สวนประกอบของเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร (ทมา: ชชาต อารจตรนสรณ, 2539)

5.2.4 ตวตรวจจบสญญาณ (Detector) อกสวนประกอบหนงทสาคญนนคอตวตรวจจบสญญาณสาหรบเครองตรวจวดทนยมใชไดแก PMT (Photomultiplier tube) Diode arrays และ CCDs (Charge coupled devices) เครองจะทาการบนทกคาความยาวคลนรวมกบคามมของแตละความยาวคลนทเกดการดดกลนในการวดตวอยางจะใชควเวตตซงลกษณะเปนหลอดสเหลยมเลกทาจากแกว พลาสตกหรอควอตซซงแตละชนดมขอดแตกตางกนคอควเวตตททาจากควอตซจะมราคาแพงแตสามารถวดไดทความยาวคลนไดทงยว-วสเบล ขณะท ควเวตต ททาจากพลาสตกหรอแกวจะวดไดเพยงแสงสขาว 5.2.4.1 สวนทวางสารตวอยางมลกษณะเปนเซลเรยกวา ควเวตต (Cuvettes) ใชบรรจสารตวอยาง และสารเปรยบเทยบในบรเวณนจะเปนทปดเพอปองกนแสงจากภายนอกเขาไป ดงรปท 5.8 ควเวตตม 3 แบบ คอ ควเวตตแบบ แกว พลาสตก และควอตซ ทเปนแกวจะใชกบแสงในชวงทมองเหนได เพราะแกวธรรมดาจะดดกลนแสงอลตราไวโอเลทได สาหรบเซลททาดวยซลกาและควอตซ สามารถใชไดทงในชวงอลตราไวโอเลตและ แสงในชวงทมองเหนไดในชวงความยาวคลน 190- 800 nm เซลทใชตองดแลรกษาความสะอาดอยเสมอ


รปท 5.8 ชองใสควเวตตทใชบรรจสารตวอยางและสารละลายอางอง

5.2.4.2 เครองวดแสง ทาหนาทเปลยนพลงงานแสงใหเปนสญญาณไฟฟา เครองวดแสงทดควรมสภาพไวตอการรบแสงมระดบสญญาณรบกวนนอยและมเสถยรภาพด คาทวดไดไมแปรปรวน ทนยมใชในเครองสเปคโทรโฟโตมเตอร เปนหลอดโฟโตมลตพลายเออร(Photomultiplier tube) ภายในหลอดประกอบดวยแคโทดทฉาบผวดวยสารทสามารถใหอเลกตรอนเมอถกแสง จานวน 9 ชดเรยกวา ไดโนด เมอแสงโฟตอน ตกกระทบทขวแคโทด ทาใหอเลกตรอนอสระหลดออกมาแลววงไปทขวไดโนด ทาใหมอเลกตรอนจานวนมากออกมาทผวของ ไดโนด การขยายสญญาณจะเกดขนมากเมออเลคตรอนออกจากไดโนดอนหนงไปทไดโนดอกชดหนงจนครบ 9 ชด แตละโฟตอนจะทาใหเกดอเลกตรอนจานวนมาก อเลกตรอนเหลานจะไปรวมทแอโนด กระแสไฟฟาทเกดขนจะถกขยายทาใหวดกระแสไฟฟาได 5.2.4.3 เครองรบสญญาณและประมวลผลเครองรบสญญาณ จะแปลผลการวเคราะหไดดงนเครองรบสญญานอาจมลกษณะเปนมเตอรซงมสเกลอานคาเปน Absorbance และ % Transmittance หรออาจมลกษณะเปน ดจตลมเตอร อานคาเปนตวเลข เปน Absorbance และ % Transmittance หรอความเขมขนของสารหรออาจใชเครองไมโครคอมพวเตอร ควบคมการทางานของเครองสเปคโทรโฟโตมเตอรซงสามารถ ใชในการคานวณผล เขยนกราฟผลการทดลอง พมพขอมลและผลการทดลองทงหมดได การวเคราะหดวยเครองสเปคโทรโฟโตมเตอรควรมการศกษาตวแปรตางๆ ทมผลตอคาการดดกลนแสงของสารไดแก


1) พเอชของสารละลายเปนสงสาคญมากเมอมการเปลยนแปลงคาความเปนกรดดางจะมผลตอการเกดปฏกรยาของสารตวอยาง อาจตองมการควบคมพเอช ของสารละลายดวยสารละลายบฟเฟอร 2) ตวรบกวนการวเคราะห ตองหาวธแกไขหรอกาจดใหหมดไปเสยกอนจงจะวดคาการดดกลนแสงของสารตวอยางได มฉะนนผลทไดจะไมถกตอง 3) ความเสถยรของสารทตองการวเคราะห ตองศกษาวาสารตวอยางเมอเกดสแลวมความคงทนนานเทาไร 4) ระยะเวลาทสารเกดปฏกรยาอยางสมบรณนนใชเวลานานเทาใด เพอจะไดทาการตรวจวดหลงจากทสารเกดปฏกรยาสมบรณ 5) สารทใชในการทาใหเกดสารเชงซอนหรอสารททาใหเกดสตองมลกษณะดงน - เปนสารบรสทธหรอปราศจากสารรบกวน - ไมดดกลนแสงในชวงคลนเดยวกบสารทตองการวเคราะห - เกดสไดเรวพอสมควร ทราบปฏกรยาทเกดขนดวย - ทาใหเกดสารเชงซอนทใหคาการดดกลนแสงสงสด max ทความยาวคลนเทาไร

เทคนคของเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร เปนการศกษาดานการกระทารวม (Interaction) ระหวางคลนแมเหลกไฟฟา หรอ คลนแสงกบสสารทอยในรปอะตอม (atom) หรอ โมเลกล (molecule) เปนอนตรกรยาระหวางคลนแสงกบสสาร (ชชาต อารจตรานสรณ, 2539)

1) การดดกลนคลนแสง (Absorption) สสารสามารถดดกลนคลนแสงในชวงคลนเฉพาะ

2) การคลายคลนแสง (Emission) คอ การทสวนหนงของพลงงานภายในของสสารถกเปลยนเปนพลงงาน

3) การกระจาย (Scatter) หรอการสะทอนกลบ (Reflection) เทคนคทางสเปกโทรโฟโตเมตร เกยวของกบกฎของเบยร และแลมเบรต (Beer and

Lambert’s Law) โดยกฎของเบยร และแลมเบรต เกยวกบการดดกลนของแสงกบความหนาของเหลวทมส กลาววาทแตละชนของความหนาทเทากนจะดดกลนแสงทผานในเศษสวนทเทากนนนคอ เมอลาแสงของแสงโมโนโครมาตก (Monocromatic Light) ฉายผานตวกลางทดดกลน (Absorb medium) ซงกคอ สารละลายทมส ความเขมขนของแสงจะลดลงในรปของฟงคชนเอกซโพแนนเชยล ในขณะทความยาวของตวกลางมากขน “อตราของแสงทถกดดกลนไวจะผนแปรเปนสดสวนโดยตรงกบความเขมขน และระยะทางทแสงนนสองผาน” (พฒนา เหลาไพบลย, 2548)

เมอใดทสารละลายทมสเปนไปตามกฎน กถอวาเปนไปตามกฎของแลมเบรต มขอควรสงเกต คอ สารละลายทใชกฎขอนได ตองเปนสารละลายทมเนอเดยวกนตลอด

ความร น เปนประโยชนมากในการใชปรบความหนาของชนท ดดกลนแสง หรอ ความหนาแนนของตวอยาง ซงอยในหลอดแกวใส เรยกวา เซลล (Cell) หรอ ควเวตต (Cuvette) เพอ


ลดสใหถงระดบในชวงทสามารถใชเตรยมอนกรมของสารละลายมาตรฐาน เพอใชทากราฟมาตรฐาน (Standard curve) หรอเพอทจะใชกบสเปกโทรโฟโตมเตอรได

การหาปรมาณของสารจะอาศยกฏของเบยร (Beer’s law)

A = εbc

เมอ A = คาการดดกลนแสง ε = Molar absorptivity (L.mol-1cm.-1)

b = Path length c = ความเขมขนของสารทนามาวเคราะห (mol.L-1)

ในการหาปรมาณของสารจะพลอตกราฟ (Plot graph) ความสมพนธระหวาง ความเขมขนของสารทตองการวเคราะห และคาการดดกลนแสงดงรปท 5.9

รปท 5.9 การทากราฟมาตรฐานเพอวเคราะหหาปรมาณของสาร (ทมา: Stoog et al., 2014)

5.3 ชนดของเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 5.3.1 สเปกโตรโฟโทมเตอรแบบลาแสงเดยว (Single beam spectrophotometer) มหลกการทางาน คอ เมอแสงออกจากแหลงกาเนดแสงจะผานโมโนโครเมเตอรทเปนเกรตตง และ สารตวอยางตามลาดบ แลวจงเขาสตวตรวจจบสญญาณ ตลอดเสนทางของลาแสงนมลาแสงเดยว จงเรยกสเปกโทรโฟโตมเตอรประเภทนวาแบบลาแสงเดยว ดงรปท 5.10 เนองจากสเปกโทรโฟโตมเตอรประเภทนใชลาแสงเพยงลาเดยวผานจากโมโนโครเมเตอรไปสสารละลายทตองการวดและเขาส

y = 3E+06x - 184287R² = 0.9971

0

5000000

10000000

15000000

20000000

0 1 2 3 4 5 6

Peak

area

Conc. (%)


ตวตรวจจบสญญาณเลย ดงนนการวดจงตองวด 2 ครง คอ ครงแรกเซลลบรรจสารละลายอางอง หรอแบลงค ซงเปนตวทาละลายของตวอยางทเราตองการวด เมอลาแสงผานเซลล ปรบเครองใหอยในตาแหนง“ศนย” (Set zero) และสวนครงหลงบรรจสารละลาย (Sample) ทตองการวด แลวจงใหลาแสงผานเซลล ความแตกตางระหวางการดดกลนแสงของทง 2 ครงจะปรากฏบนหนาปดมเตอรจากนนกสามารถวดตวอยางทความเขมขนอนๆ ตอไปไดเลย โดยไมตองกลบไปวดแบลงคอก (การเปลยนความยาวคลนจะตองวดแบลงคใหมทกครง) (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535)

รปท 5.10 หลกการทางานสเปกโทรโฟโตมเตอรแบบลาแสงเดยว (ทมา: ชชาต อารจตรนสรณ, 2539) 5.3.2 สเปกโทรโฟโตมเตอรแบบลาแสงค (Double beam spectrophotometer) สาหรบสเปกโทรโฟโตมเตอรแบบลาแสงคมหลกการทางาน คอ เมอลาแสงจากแหลงกาเนดแสงออกจากชองแสงออก (Exit slit) แลวลาแสงจะไปสอปกรณตดลาแสง (Beam chopper) ซงจะทาหนาทสะทอนลาแสงไปผานสารตวอยาง (Sample) ในขณะตอมาจะสะทอนลาแสงไปผานสารอางอง (Reference) ซงกคอแบลงคนนเองโดยทลาแสงทงสองจะมความเขมแสงเทากนกอนทจะผานสารตวอยางหรอสารอางองเมอลาแสงทงสองนไปตกกระทบบนตวตรวจจบสญญาณ ความแตกตางของความเขมแสงหลงจากผานสารตวอยางหรอสารอางองจะกลายเปนคาการดดกลนแสงของตวอยางดงรปท 5.11


รปท 5.11 หลกการทางานสเปกโทรโฟโตมเตอรแบบลาแสงค (ทมา: ชชาต อารจตรนสรณ, 2539)

5.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห (Sample preparation for quantitative analysis) นน ตวอยางทจะนามาวเคราะหดวยเครองสเปกโตรโฟโทมเตอรจะอยในสถานะของแขง ของเหลว หรอกาซกได โดยสวนใหญจะในรปของสารละลาย บรรจใน ควเวตต ดงแสดงในรปท 5.12 และนาเขาเครองวดคาการดดกลนแสง (Absorbance) ไดเลย

(ก) (ข)

รปท 5.12 ควเวตตแบบแกว (ก) และ ควเวตตแบบควอตซ (ข)


5.5 ขนการวเคราะหโดยใชยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร กอนทาการวเคราะหทงคณภาพและปรมาณ ควรศกษาสภาวะทเหมาะสมทสาคญเสยกอน คอ 1. ศกษาการเตรยมสารละลายตวอยาง โดยเลอกตวทาละลายใหเหมาะสม นนคอ ตวทาละลายจะตองไมมการดดกลนแสงในชวงเดยวกบสารตวอยาง โมเลกลไมควรม Conjugated system ดงตารางท 5.2 เปนตวอยางของตวทาละลายทใชเสมอๆ ใน ยว-วสเบล สเปคโตรโฟโตมเตอร และคาความยาวคลนตาสดทใชได (Cut-off point) ตารางท 5.2 แสดงตวอยางของตวทาละลายทใชไดในชวงยว-วสเบล

ตวทาละลาย Cut-off point (nm) ตวทาละลาย Cut-off point (nm) Water 190 Isopropyl alcohol 210 Acetonitrile 190 Isooctane 220 Cyclohexane 210 Methanol 210 Chloroform 250 Diethyl ether 210 Carbontetrachloride 260 Ethanol 210 1,4 Dioxane 220 n-Hexane 220 (ทมา: Stoog et al., 2014) 2. เลอกใชสภาวะของเครองมอใหถกตอง นนคอ หลอดกาเนดแสง (Light source) ทจะใชอาจเปน Tungsten lamp หรอ UV-lamp หรอ Deuterium lamp ตลอดจนการเลอกใชสลตใหถกตองดวย 3. ศกษาแอบซอรพชนสเปกตรมโดยสแกน (Scan) ทความยาวคลนเทาทสามารถดดกลนสารทตองการวเคราะหไดสงสด 4. ศกษาตวแปรตางๆ ทจะทาใหคาแอบซอรพแบนซเปลยนแปลงได เชน - ตวทาละลาย - พเอชของสารละลาย โดยเฉพาะในชวงการวเคราะหชวงแสงวสเบลบางครงตองควบคมพเอชโดยใชบฟเฟอร - ตวรบกวน (Interference) ถามตองกาจดใหหมดกอนการวเคราะห - ความเสถยรของสารประกอบเชงซอนทเตรยมกอนการวเคราะห ตลอดเวลาทใชในการเกดปฏกรยาสมบรณ 5. เตรยมสารละลายมาตรฐานเพอทากราฟมาตรฐานทความเขมขนทอยในชวงเดยวกบสารทตองการจะวเคราะห สารทจะใชในการทาใหเกดสารเชงซอนเพอใหไดสารละลายทมส ควรจะตองมลกษณะดงน 1. ปราศจากสารรบกวนหรอเปนสารบรสทธ


2. ไมควรมส แตถามส สทเกดขนใหม ควรจะดดกลนแสงทความยาวคลนหางกนพอสมควร 3. การเกดสควรเกดเรวพอสมควร 4. ปฏกรยาควรเปนปรมาณสมพนธ (Stoichiometry) และเฉพาะ (Selective) 5. สทเกดขนไมควรขนกบปรมาณของสารทเตมลงไป แตจะตองขนอยกบปรมาณของสารทจะวเคราะห 6. ให max ทความยาวคลนทตองการ 7. ควรทราบถงปฏกรยาทเกดขนเปนอยางด 8. วธการตางๆ ไมควรยงยาก แตละขนตอนควรใชเวลาไมนานเกนไป 5.6 ตวอยางงานวเคราะหดวยเครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร 1. การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซ วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 470 nm (Preeya Kaewnaree, 2015) 2. นาตาลทงหมด (Total sugar) โดยวธฟนอลซลฟรกโททอลซการ (Phenol sulfuric total sugar) วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 490 nm (Kaewnaree, 2015) 3. วดการเจรญของ ยสต แบคทเรย สาหรายเซลลเดยว ทความยาวคลน 600 660 และ 680 nm ตามลาดบ (Kaewnaree, 2014). 4. วเคราะหปรมาณฟอสฟอรสและไนเตรต (ปรยา แกวนาร และคณะ, 2555) 5. วเคราะหคลอโรฟลเอ และ บ ทความยาวคลน 660 และ 668 nm (Kaewnaree, 2014)

5.7 สรปประจาบท เครองยว-วสเบลสเปกโตรโฟโทมเตอร เปนเครองมอทใชวดปรมาณของสารเคมชวโมเลกลรวมถงจลชพทงหลาย ไดแก สารอนทรย (Organic compound) หรอสารสารออนทรย (Inorganic compound) ทงทมสและไมมส หลกการวดปรมาณของแสงทตวอยางดดกลนเขาไปตวเครองประกอบดวยแหลงกาเนดแสง (Light source) เลนสหรอกระจกรบแสง (Lens or Mirror) ตวแยกความยาวคลน (Monochromator) และตวตรวจจบสญญาณ (Detector) แหลงกาเนดแสงทาหนาทใหแสงผานตวอยางแหลงกาเนดแสง Deuterium Arc (190-420 nm) และTungsten (350-2500 nm) ควเวตตใชบรรจสารละลายในการวเคราะห ซงลกษณะเปนหลอดสเหลยมเลกทาจากวสด 3 ชนด คอ แกว พลาสตก หรอควอตซ ซงแตละชนดมขอดแตกตางกนคอ ควเวตต ททาจากควอซตจะมราคาแพงแตสามารถวดไดทความยาวคลนไดทง ยว-วสเบล ขณะท ควเวตต ททาจากพลาสตกหรอแกวจะวดไดแคแสงสขาวเทานน การวเคราะหปรมาณจะใชกฎของเบยร โดยเมอความเขมขนของสารเพมขนคาการดดกลนทวดไดกจะเพมขนมความสมพนธโดยตรง



1.จากรป จงบอกสวนประกอบของเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร พรอมบอกหนาทของแตละสวนประกอบ

A คอ............................................................................................. B คอ............................................................................................. C คอ............................................................................................. D คอ.............................................................................................

E คอ............................................................................................. F คอ............................................................................................. G คอ............................................................................................. H คอ............................................................................................. I คอ............................................................................................. 2. จงอธบายหลกการทางานของเครองยว-วสเบลสเปกโตรโฟโทมเตอร 3. จงบอกหลกการของสเปกโตรโฟโทมเตอรแบบลาแสงเดยวแบบลาแสงค 4. แหลงกาเนดแสง Deuterium Lamp และTungsten Lamp ใหชวงแสงความยาวคลนใด 5. จงยกตวอยางสารทวเคราะหดวยเครองยว-วสเบล สเปกโตรโฟโทมเตอรมา 3 ชนด 6. จงยกตวอยางตวอยางทสามารถวเคราะหสารในงานทางเทคโนโลยชวภาพมา 3 ชนด 7) จงอธบายตวแยกความยาวคลน (Monochromator) 8) จงบอกควเวตตมกชนด อะไรบาง 9) จงอธบายการวเคราะหสารตามกฎของเบยร และแลมเบรต 10) จงบอกตวอยางของตวทาละลายทใชไดในงานวเคราะหชวงยว-วสเบล มา 3 ชนด





ปรยา แกวนาร. ชาญชย ภขาว. รตนา หลกตา. (2555). การใชนาทงจากกระบวนการกลนเอทานอลเพอใชผลตชวมวลของสาหรายคลอเรลลา.วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลยมหาวทยาลยราชภฏอดรธาน. (1). 97-118

พรพมล กองทพย. (ม.ป.ป.) หนวยท14 การตรวจวเคราะหทางสขศาสตรอตสาหกรรม. ภาควชาอาชวอนามยและความปลอดภยคณะสาธารณสขศาสตร มหาวทยาลยมหดล.


พฒนา เหลาไพบลย. (2548). โครมาโตกราฟฟแบบของเหลวแรงดนสง: หลกการและการประยกตใช. ขอนแกน.การพมพ.ขอนแกน.

แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม. (2535). Principles and Techniques of Instrumental Analysis. ชวนพมพ. กรงเทพฯ.

สถาบนนวตกรรมและพฒนากระบวนการเรยนร มหาวทยาลยมหดล. (2528). หลอดดวเทอเรยมและหลอดทงสเตน. สบคนเมอ 26 มนาคม 2558 จาก http://www.il.mahidol.ac.th /e-media/color-light/page4_2.html.

สรนดา ยนฉลาด. (2546). เทคโนโลยชวภาพพนฐาน เลมท 1 (Basic Biotechnology: volume 1). ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.


Kaewnaree P. (2015). The effect of catalyst to increase hydrolysis yield of sugar from sugarcane bagasse. International Journal of Bioscience. 6(8). 71-76.

Kellner R, Mermet J.-M. Otto M, Vacarcel M and Widmer H.M. (2004). Analytical Chemistry: A modern Approach to Analytical Science Second Edition. Geramany: PhotoDisc Inc.



http://www.cosmetictestinglabs.com/2013-11-08-16-36-22/52-uv-visible- spectrophotometer.html สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

http://www.gibthai.com/services/technical_detail.php?ID=28 สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

แผนบรหารการสอนประจาบทท 6 อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรสโกป


6.1 หลกการและทฤษฎพนฐานของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 6.2 อปกรณหลกในเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 6.3 ชนดของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 6.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห 6.5 เทคนคในการวเคราะหอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 6.6 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 6 เอกสารอางอง วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปก

โทรโฟโตมเตอร 2. อธบายหลกการวเคราะหโลหะหนกดวยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปก

โทรโฟโตมเตอร 3. บอกความแตกตางระหวางการวเคราะหโลหะหนกดวยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปก

โทรโฟโตมเตอรแบบใชเปลวไฟและความรอนจากไฟฟา 4. บอกความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงกบความเขมขนของสาร 5. มทกษะในการเตรยมตวอยางในงานวเคราะหตามแบบฝกปฏบตการและวเคราะหงานโดย

ใชเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 6. นาการวเคราะหโดยใชเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอรไปใชในงาน

วเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพได วธสอนและกจกรรม

1. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 2. ทบทวนเนอหาทเรยนมาของสปดาหกอน 7. นาเขาสบทเรยนโดยภาพ เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 3. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการ

สอนและรปภาพ 4. เปดโอกาสใหผเรยนถามในแตละหวขอและเสนอแนวความคดกอนขามหวขอนน 5. ตรวจสอบคาตอบของผเรยนสอบถามผเรยนถาผเรยนมขอสงสยและสรปเนอหาประจาบท


6. แบงกลมผเรยนเพอฝกปฏบตการเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพเตรยมอปกรณและเครองมอตางๆ ตามใบงานทไดมอบหมายและกาหนดวนสงรายงาน

7. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง 8. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา 9. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน


1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอเอกสารประกอบการสอนอเลกทรอนกส 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 5. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 6. เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร 7. แบบฝกบทท 5



บทท 6 อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรสโกป

เทคนคทาง AAS เปนเทคนคการวเคราะหธาตทวเคราะหไดทงเชงคณภาพและปรมาณ

วเคราะหทไดรบความนยมมากวธหนง เพราะเปนเทคนคทใหความเทยง ความแมน มสภาพไวสง และเปนเทคนคทมความจาเพาะกบอะตอมของธาตทเปนโลหะสง ประกอบกบคาใชจายในการวเคราะหไมสง เปนเทคนคทสามารถวเคราะหธาตไดถง 67 ธาต เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร (Atomic Absorption Spectrophotometer; AAS) เปนเครองมอทใชในการวเคราะหธาต (Metal element) ทอยในตวอยาง ซงเปนกระบวนการทอะตอมอสระ (Free atom) ของธาต ดดกลน (Absorp) แสงทความยาวคลนระดบหนงโดยเฉพาะซงขนอยกบธาตแตละธาตเนองจากธาตแตละชนดมระดบของพลงงานแตกตางกนจงมการดดกลนพลงงานไดแตกตางกน พลงงานทพอดกบคณสมบตเฉพาะของธาตจะทาใหอเลกตรอนของธาตนนๆ เปลยนสถานะจากสถานะพน (Ground state) ไปเปนสถานะกระตน (Exited state) แตเนองจากสภาวะนไมเสถยรอเลกตรอนกจะกลบสสภาวะพน พรอมทงคายพลงงานทรบเขาออกมาในรปคลนแสง ซงจะมความสลบซบซอนของความยาวคลนแสงเพยงใดจะขนกบจานวนเวเลนซอเลกตรอน เทคนคทางอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตสโกป จะอาศยหลกการวดปรมาณพลงงานทถกดดกลนหรอคายออกมา ในการปลยนแปลงระดบพลงงานนนเอง (พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา, 2536; บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, 2539; แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535) เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร แสดงดงรปท 6.1

รปท 6.1 เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร

128 บทท 6 อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรสโกป เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

6.1 หลกการและทฤษฎพนฐานของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร เปนการวเคราะหธาตโดยวดการดดกลนคลนแสงของอะตอมอสระทกลายเปนไอของธาตท

สนใจ อะตอมอสระของธาตจะดดกลนคลนแสงจากแหลงกาเนดคลนแสงเฉพาะของแตละธาต ปรมาณแสงทถกดดกลนจะมความสมพนธกบปรมาณหรอความเขมขนของธาตททาการวเคราะหตามกฎของ แลมเบรต-เบยร (Lambert-Beer’ Law) (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535) คอ

logIo= A = bc I

เมอ Io = ความเขมขนเมอแสงเรมตน I = ความเขมแสงภายหลงการดกลนโดยธาต A = คาการดดกลนแสง (Absorbance)

= molar Absorbtivity เปนคาคงทเฉพาะของแตละธาต b = ความกวางของเซลลหมายถงความกวางของเปลวไฟ c = ความเขมขนหรอปรมาณของธาต

ขนตอนการวเคราะห โดยใชเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร ไดอะแกรมของเครอง AAS ดงรปท 6.2 สารละลายตวอยางทกรองแลวจะถกดดเขาสเครอง AAS โดย Nebulizer สารละลายตวอยางจะถกทาใหแตกเปนละออง (Aerosol) ภายใน Spray chamber ละอองขนาดใหญจะถกกาจด (Drain) ออกจากระบบ ในขณะทละอองทเหมาะสมจะผสมกบแกสทเปนเชอเพลง (Fuel gas) และแกสออกซแดนท (Oxidant) แลวผานเขาสชอง (Slot) ของตะเกยง (Burner) ซงจะถกจดเปนเปลวไฟ (Flame) ความรอนจากเปลวไฟจะกาจดตวทาละลาย (Desolvation) และทาใหละอองของตวอยางแตกเปนอะตอมอสระ และอะตอมอสระจะดดกลนแสงจาก Hollow cathode lamp คลนแสงเมอผานเปลวไฟจะถกตรวจวดโดยหลอดโฟโตมลตพลายเออร (Photomultiplier tube) และประมวลสญญาณออกมาเปนคาการดดกลนแสงตอไป

รปท 6.2 ไดอะแกรมของเครอง AAS (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535) 6.2 อปกรณหลกในเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร

องคประกอบทสาคญตางๆ ของเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร ม 5 สวนดวยกนคอ

6.2.1 แหลงกาเนดแสง (Light source) เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร โดยทวไปแหลงกาเนดแสงใชเปน หลอด

ฮอลโลวคาโทด (Hollow cathode lamp, HCL) และหลอดอดแอล (EDL) เนองจากอะตอมดดกลนแสงทความยาวคลนเฉพาะ ในการทจะวดการดดกลนแสงดวยความไวทสงสด จาเปนตองม

Light source Monochromater Atomizer Detector Data processor

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 6 อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรสโกป 129

แหลงกาเนดแสงทเปนแบบเสนทจะคายแสงทมความยาวคลนทจะถกดดกลนโดยอะตอมดงรปท 6.3 (ข) แหลงกาเนดจะตองมการถกรบกวนนอย จงนยมใชหลอดฮอลโลวคาโทด (Hollow cathode lamp) เปนแหลงกาเนดแสงบนเสน (Line source) ใชเปนแหลงกาเนดแสงของเทคนค โดยหลอดฮอลโลวคาโทดเปนหลอดปดทาดวยแกวภายในบรรจแกสเฉอย เชน อารกอน (Ar) นออน (Ne) ทมความดนประมาณ 1-5 torr ม ขวแอโนด (Anode) ททาดวยทงสเตน (W) และมขวแคโทด (Cathode) ทเปนรปทรงกระบอกหรอถวยททาดวยโลหะหรอเคลอบดวยผงของโลหะทเปนธาตทตองการวเคราะห ซงจะใหสเปกตรมและความยาวคลนแสงทตองการได หนาตางของหลอดฮอลโลวคาโทดอาจทาดวยซลกาหรอ ควอซต (Quartz) ขนอยกบความยาวคลนแสงทโลหะนนๆ คายออกมา ดงรปท 6.3 (ก)

(ก) (ข)

รปท 6.3 หลอดฮอลโลวคาโทด (Hollow cathode lamp) (ก) แหลงกาเนดแสงทเปนแบบเสน (ข) (ทมา: Stoog et al., 1998).

กระบวนการแสงของฮอลโลวแคโธดเกดขน อยางไรกตาม ในการใชงานของหลอดฮอลโลว

คาโธดนน จาเปนตองมการแปลงสภาพ (Modulation) สญญาณ เพอทจะเพมความเขมขนแสง และลดปญหาการคายแสงจากสวนของเปลวไฟ ซงการแปลงสภาพสญญาณอาจทาไดทง วธกล (Mechanical modulation) หรอวธทางอเลกทรอนค (Electronic modulation) แหลงกาเนดแสงโดยทวไปนยมใชหลอดฮาโลวแคโทด (Hallow Cathod Lamp, HCL) เปนแหลงกาเนดแสงสาหรบ Electrodeless Discharge Lamp (EDL) มใชเฉพาะบางธาตเทานน


รปท 6.4 สวนประกอบหลอดฮาโลวแคโทด (ทมา: พรพมล กองทพย, ม.ป.ป.)

หลอดฮาโลวแคโทดประกอบดวยอเลกโทรด 2 ชนด คอ ขวแอโนด และแคโทด ขวแคโทดทาดวยโลหะเปนรปทรงกระบอกฉาบดวยโลหะทตองการวเคราะหเพอจะไดใหสเปกตรมเฉพาะสาหรบโลหะนน สาหรบขวแอโนดทาดวยโลหะนเกลหรอทงสเตนเปนแทงเลกๆภายในหลอดบรรจกาซเฉอยซงอาจเปนอารกอนฮเลยมหรอนออนทความดนตา สวนหนาตางอาจเปนแกวไพเรกหรอ ควอซทเมอใหกระแสไฟฟาผานจะทาใหกาซทบรรจอยไอออไนซและมกระแสไหลระหวางอเลกโทรดไอออนบวกจะไปทธาตทฉาบทแคโทดทาใหอะตอมถกกระตนและปลอยแสงเปนสเปกตรมออกมาปจจบนหลอดฮาโลวแคโทดสามารถใชวเคราะหธาตไดหลายชนดพรอมกนโดยไมตองมการเปลยนหลอด เชน หลอด Ca / Mg , Na / K เปนตน แหลงกาเนดแสงทนยมใชอกชนดหนง คอ Electrodeless Discharge Lamps (EDLs) ใชเปนแหลงกาเนดแสงในการหาปรมาณธาต As Bi Cd Cs Ge Hg K P Pb Rb Sb Se Sn Ti Tl และ Zn ลกษณะของ Electrodeless Discharge lamps เปนหลอดททาดวยควอซตขนาดยาว 3-8 เซนตเมตร และเสนผานศนยกลาง 0.5-1 เซนตเมตร หลอดบรรจดวยโลหะทตองการวเคราะห 2-3 mg หรอเกลอเฮไลดของโลหะนนมกาซเฉอย (อารกอน) บรรจอย เมอใหสนามของไมโครเวฟเขาไป จะทาใหอะตอมของธาตในสภาพกาซถกกระตน เมออะตอมทอยในสถานะกระตนกลบสสถานะพน จะปลอยแสงออกมา ดงรปท 6.5


(ก) (ข) รปท 6.5 หลอด Electrodeless Discharge Lamps (EDLs) (ก) สวนประกอบชองหลอด EDLs (ข)

(ทมา: Stoog et al., 1998).

6.2.2 สวนททาใหธาตกลายเปนอะตอมเสร (The atomization process หรอ atomizer)

การวเคราะหดวยเทคนค AAS นนจะประสบความสาเรจอยางดมากนอยเพยงใดนนขนอยกบปรมาณอะตอมเสร (Free atoms) ของธาต เพราะอะตอมเสรเปนตวดดกลนแสง ดงนนวธทจะทาใหอะตอมในตวอยางเปนอะตอมเสรนนนยมใช ม 2 กระบวนการคอ ทาใหธาตแตกตวเปนอะตอมอสระโดยเปลวไฟ (Flame Atomization) ดงรปท 6.7 และธาตแตกตวเปนอะตอมอสระดวยความรอนจากไฟฟา (Furnace หรอ Electrothermal หรอ Electrothermal หรอ Flameless Atomization)

6.2.2.1 ระบบเบอรเนอร (Burner system) ระบบททาการเปลยนสภาพ ของสารละลายใหกลายเปนอะตอม อปกรณสวนนประกอบดวยอปกรณยอย 2 สวน คอ สวนทเปนเนบวไลเซอร (Nebulizer) และสวนทเปนเบอรเนอร (Burner) ดงรปท 6.6

1. เนบวไลเซอร (Nubulizer) เปนสวนทสารละลายถกทาใหเปนละอองฝอยเลกๆ ผสมกบเชอเพลง และตวออกซไดส

2. เบอรเนอร (Burner) จะเปนสวนททาใหเกดอะตอมของธาตทจะวเคราะห ทจะเกดขนในเปลวไฟดงกระบวนการซงการใชเชอเพลงระบบใดนน จะขนอยกบอณหภมของเปลวไฟทตองการ แตสวนใหญแลวในการวเคราะหทวไป มกจะใชเปลวไฟแบบ Air-acetylene สาหรบเชอเพลงทใชกบเบอรเนอรตางๆ นนมดวยกนหลายระบบ


รปท 6.6 ระบบเบอรเนอร (Burner system) (ทมา: Stoog et al., 1998).

รปท 6.7 ธาตแตกตวเปนอะตอมอสระโดยเปลวไฟ (Flame Atomization) (ทมา: Stoog et al., 1998).


ชนดของเปลวไฟ โดยทวไปเปลวไฟมใหเลอก 4 ชนด เปลวไฟทง 4 ชนดนเปนเปลวไฟทใหสภาพไวด ปลอดภยตอการใช นอกจากนยงใชไดสะดวกตลอดจนราคากไมแพงเกนไป เปลวไฟแตละชนดมอณหภมแตกตางกน ดงแสดงในตารางท 6.1

เบอรเนอร ม 3 ชนด คอ เบอรเนอรทใชกบ air/acetylene, nitrous oxide/acetylene และ hydrogen/entrained air โดยทวไปเบอรเนอรจะทาดวยโลหะททนตอการกดกรอนของกรด เชน ทาดวยโลหะไททาเนยม หรอโลหะผสมไททาเนยม ขนาดของชองททาใหเกดเปลวไฟ (Slot) ม 2 ขนาด คอ 10 และ 5 เซนตเมตร สาหรบเบอรเนอรทมชองเปลวไฟ 5 เซนตเมตร ใชกบ nitrous oxide/acetylene เทานน เพราะเปนการเผาไหมทเรวมาก ถาทาชองยาวอาจทาใหเกดการระเบดได (Flashback) ตารางท 6.1 แสดงอณหภมของเปลวไฟ

ชนดของเปลวไฟ อณหภมสงสด (ºC) Ar-H2 1577 Air-H2 2045 Air-C2H2 2300 N2O-C2H2 2955 (≈3000)

(ทมา: Stoog et al., 1998).

อปกรณวดแสงมอย 2 สวนคอ โมโนโครเมเตอร (Monochromator) และดเทคเตอร (Detector)

6.2.3 โมโนโครเมเตอร (Monochromator) ทาหนาทแยกแสงจากแหลงกาเนดแสงใหไดความยาวคลนทตองการวด

6.2.4 ดเทคเตอร (Detector) ทาหนาทเหมอนกบดวงตา ทจะเปลยนความเขมของแสงใหเปนกระแสไฟฟา ปกตแลวดเทคเตอรจะเปนหลอดโฟโตมลตพลายเออร (Photomultiplier tube, PMT) ทจะปลอยกระแสไฟฟาตอจากนนจงขยายสญญาณเปนสวนทเปนระบบอเลกทรอนคส แลวสญญาณกจะถกแปลงตอใหอานออกมาในหนวยความเขมขนหรอความเขมของแสง

6.2.5 เครองประมวลผล (Data system) เครองจะประมวลผลออกมาในรปของการดดกลนแสงการวเคราะหโดย Flame atomization จะใชสารละลายผานเขาไปในเปลวไฟอยางสมาเสมอในชวงเวลาททาการวดจะออกมาเปนเสนกราฟทเปน Steady state เปนการดดกลนแสงเปนคาแอบซอบแบนซ สวน Graphite atomization ใชสารละลายตวอยางทมปรมาตรแนนอน การวเคราะหจะไดออกมาเปนพค และวดออกมาเปนคาการดดกลนแสงเชนกน ซงจะสามารถสรางเปนกราฟมาตรฐานของคาแอบซอบแบนซและความเขมขนของโลหะในสารตวอยาง เครองสามารถคานวณความเขมขนของโลหะในสารตวอยางได

นอกเหนอจากระบบเครองมอ AAS ทเปนแบบ ระบบลาแสงเดยว (Single beam AAS)แลว การวางรปแบบเครองมอ อาจจะวางไดในลกษณะระบบละแสงค (Double beam AAS) ซงจะชวย


ลดปญหาตางๆ หลายอยางทเกดขนกบระบบ Single beam เชนการกระเพอมขนลงของความเขมขนของแสง ฯลฯ อยางไรกตามธาตทกตวทสามารถวเคราะหโดย AAS ไดไมสามารถทจะใชเปลวไฟเพอทาใหเปนอะตอมอสระไดโดยตรงทกธาต เพราะมบางธาตทสามารถรวมตวกบออกซเจนแลวกลายเปนอะตอมอสระไดยาก จงจาเปนทตองทาใหธาตนนแตกตวในบรรยากาศทปราศจากออกซเจน ซงธาตเหลานไดแก สารหน (Asenic; As) ดบก (Tin; Sn) บสมท (Bismuth; Bi) แอนตโมน (Antimony; Sb) และซลเนยม (Selenium, Se) วธการททาใหธาตเหลานเปนอะตอมอสระในบรรยากาศทปราศจากออกซเจน จะอาศยปฏกรยาการเตรยมใหธาตเหลานเปนสารประกอบไฮไดรด (Hydride) จงเรยกวธการเหลานวาวธทาใหเกดไฮไดรด (Hydride generation) วธการทาใหเกดไฮไดรด จะอาศยการรดวซธาตทตองการวเคราะหดวยโซเดยมโบโรไฮไดรด (Sodium borosybride, NaBH4) ในสารละลายกรด แลวผานแกสเฉอยเขาไปในภาชนะหรอเซลล (Cell) ททาใหเกดปฏกรยา เพอพาสารประกอบไฮไดรดทเกดขนเขาไปใน Chamber ททาดวย ควอซต (Quartz)ซงมอณหภมสงจากเตาเผาหรอเปลวไฟของไฮโดรเจน สารประกอบไฮไดรดจะแตกตวเปนอะตอมอสระอยภายใน chamber ซงจะดดกลนแสงจาก Hollow cathode lamp เชน เดยวกบเทคนคทใชเปลวไฟในการทาใหเกดอะตอมอสระ (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535) 6.3 ชนดของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร

6.3.1 เฟลม (Flame) หรอ Flame Atomization Technique เทคนคนใชกระบวนการทาใหสารตวอยางแตกตวเปนอะตอมดวยเปลวไฟ (Flame) ทเหมาะสม ทาใหเกด atomization process แบงเปน 5 ขนตอน ไดแก

กระบวนการททาใหธาตแตกตวเปนอะตอมเสรโดยเฟลวไฟ ในกรณทใชกระบวนการอะตอมไมเซชนดวยเปลวไฟ สารตวอยางจะตองเปนสารละลายทเปนเนอเดยว ตวทาละลายอาจเปนนาหรอสารอนทรยกได กระบวนการอะตอมไมเซชนดวยเปลวไฟสามารถแบงออกไดเปน 5 ขนตอนดงน

ขนตอนท 1 Nebulization เปนกระบวนการเปลยนของเหลวใหเปนละอองเลกๆ (Mist) ดวยเครอง Nebulizer

ขนตอนท 2 Droplet precipitation เปนกระบวนการทละอองเลกๆ ของสารละลายรวมกนเปนหยดสารละลายโต ไมสามารถจะลอยอยในอากาศได จงตกลงมาแลวออกมาทางทอนาทง (Drain)

ขนตอนท 3 Mixing เปนกระบวนการทละอองเลกๆ ของสารละลายเกดผสมกบแกสเชอเพลง (Fuel) และออกซแดนซ (Oxidant) ใน Spray chamber ของ Nebulizer

ขนตอนท 4 Desolvation เปนกระบวนการทตวทาละลายทอยในละอองเลกนนถกกาจดออกไป ทาใหเกดเปนอนภาคเลกๆ ของสารประกอบ กระบวนการนจะเกดขนตอนลางของเปลวไฟ

ขนตอนท 5 Compound decomposition เปนกระบวนการทเกดขนในเฟลวไฟ โดยทพลงงานความรอนจากเปลวไฟจะไปทาใหสารประกอบเกดการแตกตวเปนออกไซด เปนโมเลกล และเปนอะตอมเสร บางครงอาจเกดการกระตนหรอเกดการไอออไนเซชนตอไปน


หลกการโดยทวไปเมอสารละลายตวอยางถกทาใหเปนละอองเลกๆสารละลายทพนเขาไปชนกบ Glass bead ทาใหละอองทรวมตวกลบเปนของเหลวจะถกทงไปดงรปท 6.8 ละอองทมขนาดเลกผสมกบเชอเพลงและออกซแดนซจะผานเขาไปทเปลวไฟซงจะเผาใหธาตสลายตวเปนอะตอมเสร

รปท 6.8 Pneumatic nebulizer (ทมา: พรพมล กองทพย, ม.ป.ป.)

ขอจาเพาะของ Flame atomizer ของเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโต

มเตอร 1. ชนดของ Burner (Burner type) เปนแบบ Standard burner ซงเปนแบบมาตรฐานทใชสาหรบการวเคราะหธาตโลหะทวไป ทไมใชธาตทตองการพลงงานความรอนสงมาก เชน Alumenum (Al) หรอ Boron (B) หรอ Barium (Ba) หรอ Silicon (Si) เปนตน ซงธาตทตองการพลงงานความรอนสงมากดงกลาว ตองเปลยนไปใชเบอรเนอรอกแบบ (High Temperature burner type) 2. ชนดของเปลวไฟ (Flame type) เปนแบบ Air-Acethylene flame คอ ใชแกส acethylene เปนแกสเชอเพลง และใช ออกซเจนจากอากาศเปน Oxidant gas โดย Burner และ Flame type เปนสงสาคญทผตองการวเคราะหจะตองทราบกอนวาธาตทจะวเคราะห นน ควรใช เฟลมชนดไหนเหมาะสมในการทาใหเกดอะตอมอสระเนองจากเฟลมแตละชนดใหพลงงานความรอนในระดบทแตกตางกนในสวนของเบอรเนอร เนองจากแตละชนดมความทนตอความรอนตางกนดงนนตองตองเหมาะสมกบ ชนดของเฟลมดวย ชนดของเปลวไฟ (Type of flames) เปลวไฟแตละชนดใหอณหภมแตกตางกนสารตางชนดกนตองการพลงในระดบทแตกตางกนเพอใชเปลยนสารตวอยางใหเปนอะตอมอสระ ถาใชพลงงานนอยไป สารจะไมเปลยนเปนอะตอม


อสระ ถาใชพลงงานมากเกนไปสารจะถกเปลยนเปนไอออนมากกวาอะตอม พลงงานทจะเปลยนสารใหเปนอะตอมขนอยกบอณหภมของเปลวไฟ การแตกตวของสารจะเกดขนเมอไดรบพลงงานสงกวาพลงงานในการแตกตวของสารอณหภมของเปลวไฟสามารถเปลยนแปลงไดจากการการปรบสดสวนของออกซแดนซและเชอเพลงในเปลวไฟ ตารางท 6.2 แสดงอณหภมของเปลวไฟเมอใชออกซแดนซและเชอเพลงตางๆ กน ตารางท 6.2 อณหภมของเปลวไฟ

ชนดของเปลวไฟ อณหภม (๐C) เชอเพลง ออกซแดนซ

Acetylene

Hydrogen

Air Nitrous oxide Air Argon

2300 2800 2000 1577


เปลวไฟทเกดจากอากาศและอะเซทลน (Air-C2H2 Flame) นยมใชมากทสด ใชในการวเคราะหไดประมาณ 30 ธาต เปลวไฟทเกดจากไนตรสออกไซดและอะเซทลน (N2O-C2H2Flame) เปนเปลวไฟทใหอณหภมสง ใชวเคราะหธาตไดถง 67 ธาต สามารถใชวเคราะหธาต Al V Si และ Ti รวมทงพวก Rare earth element เปลวไฟทเกดจากอากาศและไฮโดรเจน (Air-H2 Flame) หรอ อารกอนและไฮโดรเจน (Ar-H2 Flame) หรอรยกวา Entrained air flame เปลวไฟนจะใชในกรณ Hydride generation technique หรอใชในการวเคราะหธาต As Se Pb Cd และ Sn ซงใชแสงทมความยาวคลนสน Blackground absorption จะตองตา Ar-H2 Flame จงเหมาะทสด เพราะเปน Reducing flame ดวย คณสมบตของเปลวไฟ (Property of the flame) ขนกบอตราสวนผสมของเชอเพลงและออกซแดนซ (Fuel/oxidant) แบงไดเปน 3 แบบ 1) Oxidizing flame หรอ fuel-lean flame เปนเปลวไฟทใชเชอเพลงนอยหรอใชออกซแดนซมาก 2) Neutral flame หรอ stoichiometric flame เปนเปลวไฟทใชเชอเพลงและใชออกซแดนซพอเหมาะ

3) Reducing flame หรอ fuel-rich flame เปนเปลวไฟทใชเชอเพลงมากกวาปกตและใชออกซแดนซนอย โดย Oxidizing flame จะใหความรอนสงกวา Reducing flame ดงนนการเปลยนแปลงอณหภมใหสงขนสามารถทาโดยการเปลยนสารออกซแดนซ เชอเพลง หรอเปลยนทงออกซแดนซ และเชอเพลง ทางเลอกทเหมาะสมคอ ใชอณหภมตาทสดทใหธาตกลายเปนอะตอมเสรไดมประสทธภาพสงทสด การใชอณหภมสงจะทาใหสญเสยสญญาณจากการแตกตวของสาร


จากตาราง ตวเลขใตสญลกษณเปนคาความยาวคลน สาหรบการวเคราะหตวเลขในแถวลางสดแสดงชนดของเปลวไฟทใชคอ 0 = ไมใชเปลวไฟ 1 = air - acetylene 2 = air - propane หรอ air - natural gas 3 = nitrous oxide - acetylene 1+= fuel - rich air - acetylene เปลวไฟทใชอากาศและกาซอะเซทลนมการนามาใชมากทสดการใช Graphite furnace สามารถใชไดกบสารเกอบทงหมด 6.3.2 แกรไฟต(Graphite) หรอ Electrothermal atomization หรอ Graphite furnaceหรอ Flameless atomization ซงเทคนคนใชกระบวนการทาใหสารตวอยางสลายตวเปนอะตอมไดดวยความรอนจากกระแสไฟฟาทาใหเกด Atomization process แบงเปน 3 ขนตอน ไดแก ขนตอนท 1 Drying stage เปนการคอยๆ ใหความรอนแกสารตวอยาง เพอระเหยตวทาละลายออกไป โดยปกตใชอณหภมตา (ตากวา 100°C) ขนตอนท 2 Ashing stage เปนขนตอนทใหความรอนสงขน (อาจถง 1,500 °C) เพอกาจดสารอนทรยและสารอนนทรย โดยเลกลของสารเหลานนจะแตกตวออกไปเหลอแตสารอนนทรยทเสถยรเทานน โดยทวไปอยในรปของโลหะออกไซด ขนตอนท 3 Atomization stage เปนขนตอนทสารทเหลออยถกเผาทอณหภมสง (อาจถง 3,000 °C) เพอใหสลายเกดเปนอะตอมอสระ ลกษณะของ Graphite furnace แกรไฟตเปนวสดทนาความรอนและไฟฟาไดดมความพรนนอยมความแขงและม การขยายตวนอยเนองจากความรอนสามารถนามาทาเปนรปรางตางๆ ไดการทแกรไฟตมรพรนจงมการลดความพรนของแกรไฟตโดยเคลอบผวดานนอกดวยไพโรไลตกกราไฟตและโลหะคารไบด เมอใชงานไปนานๆ คาการดดกลนแสงจะเรมลดลงเพราะแกรไฟตถกกดกรอนดวยสารเคมในสารตวอยางและถกออกซไดซดวยออกซเจนอาจมการผานกาซเฉอยเขาไปเพอลดการออกซเดชน แกรไฟตทนยมใชม 2 แบบคอ

1. หลอดแกรไฟท (Graphite tube) เตาเผาชนดหลอดแกรไฟท ประกอบดวย ทอกลวงของ แกรไฟทซงเปนทใสสารตวอยาง ดงภาพท 5.6 มการตอกระแสไฟฟาเขาทดานปลายทง 2 ขางของหลอดกราไฟท รงสจากแหลงกาเนดผานไปตามแนวยาวตรงกลางของหลอด ผานไปท สารตวอยาง ปญหาทพบกบหลอดแกรไฟท คอการดดกลนแสงท Background และการเปลยนแปลง Slope ของกราฟมาตรฐานเนองจากการเปลยนองคประกอบของสารตวอยางทปนเปอนจากสงแวดลอม ซงการลด Background อาจทาโดยการใหความรอนทกราไฟททอณหภมคงทการใชหลอดแกรไฟทอาจทาโดยใช Platform graphite ซงมลกษณะเหมอนกบหลอดแกรไฟททวไปแตมการใส Platform เลกๆ เขาไปในเตาเผาสารตวอยางจะอยบน Platform และมการใหความรอนตามปกต เนองจาก Platform จะไดรบความรอนของรงสจากเตาเผา ซงอณหภมจะเพมขนอยางชาๆ


ชากวาอณหภมของผนงเตาเผา ทาใหการกลายเปนอะตอมอสระเกดขนในชวงทอณหภมของเตาเผาคอนขางคงท ซงจะชวยลดผลจาก Background และ Matrix effect ของสารตวอยาง

รปท 6.9 Graphite tube ลกษณะหลอดแกรไฟท (ก) การตออเลคโทรดทหลอดแกรไฟท

หลอดแกรไฟททม Platform (ทมา: พรพมล กองทพย, ม.ป.ป.) 2. Carbon rod ประกอบดวยแทงแกรไฟทของแขงเปนรปทรงกระบอกซงมชองใหใสสารตวอยางลงไปตรงกลาง แทงแกรไฟทจะตอกบสวนทเปนโลหะเพอตอกบกระแสไฟฟา แทงแกรไฟทจะมการปองกนการออกซเดชน โดยใชกาซอารกอนหรอไนโตรเจนไหลผานเขาไป แทงแกรไฟทจะตดตงอยใน Metallic jacket โดยมหนาตางเปนควอทซดงรปท 6.10 และ 6.11 ตรงตาแหนงทใสสารตวอยางจะมถวยสาหรบใสสารตวอยาง (Carbon sample cup)

(ก)

(ข)

(ค)


รปท 6.10 Carbon rod atomizer (ทมา: พรพมล กองทพย, ม.ป.ป.)

รปท 6.11 Carbon cup atomizer (ทมา: พรพมล กองทพย, ม.ป.ป.)

6.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห (Sample preparation for quantitative analysis)

6.4.1 Calibration Method ในกรณทสารตวอยางไมคอยมสงรบกวนและสารเจอจาง อาจจะทาการวเคราะหไดงายๆ โดยเทยบกบสารมาตรฐานททราบความเขมขนแนนอนแลว วธทนยมใชกนทวๆ ไป โดยปรบสญญาณทไดจาก Blank ใหเปนศนย แลวจงคอยแอบซอรแบนซของสารละลายมาตรฐานทมความเขมขนตางๆ กน


(4 -5 ความเขมขน) เมอใช Flameless atomization technique อาจใชวด Peak area หรอความสงของพค (Peak height) แลวนาผลมาเขยนกราฟเพอหาความสมพนธกบความเขมขนของสารละลาย จะได Calibration curve ซงอาจเปนเสนตรงหรอเสนโคงกได ในการาเขยนกราฟ อาจใชเครองคอมพวเตอรหรอเครองคานวณทางานให ถาเปนเสนตรง ใช Least squares fit แตถาเปนเสนโคงอาจใชเครองลากเสนโคงใหได พรอมคานวณความเขมขนใหดวยจากคาทวดไดของสารตวอยางซงสะดวกมาก สงสาคญจะตองไมลมวา Calibration curve ทได ใชไดเฉพาะการวเคราะหแตละครงเทานน เมอจะวเคราะหใหมจะตองทาใหม ทงนเพราะ parameters ตางๆ ได ทใชอาจเปลยนแปลงได

6.4.2 ใช Factor Method วธนจะใชไดเมอ Calibration curve เปนเสนตรง ซงทาใหวธนทาไดงายขน โดยนาสารละลายตวอยางมา 2 สวนเทาๆกน (x และ y) และมปรมาตรเปน VZ นาสวน X มาเตมสารละลายมาตรฐานซงมความเขมขนเปน CS ลงในปรมาตร VS สาหรบสวน Y นามาเตมตวทาละลาย (อาจเปนนาหรอกรด) ลงไปปรมาตร VS แลวนาสารละลายทงสองสวนไปวดคาแอบซอรพแบนซไดเปน AX และ AY ตามลาดบ ถาใหความเขมขนของสารละลายตวอยางเปน CU จะคานวณหาความเขมขนไดสมการ

CU = AY VS CS ……….(6.1) (AX - AY) VZ

เพอใหผลของการวเคราะหโดยวธนดทสด สภาวะตางๆ ทควรคานงถง คอ - calibration curve จะตองเปนเสนตรง

- คาแอบซอรแบนซทวดไดคอ AX ควรจะตองเปนประมาณ 2 เทาของ AY - VS ควรจะตองนอยกวา VZ มากๆ เพอมใหเกดการเจอจางของสารละลายตวอยาง CU มากๆ 4. ความเขมขนของสารมาตรฐาน CSควรจะตองมากกวาความเขมขนของสารตวอยาง CUมากๆ 6.4.3 ใช Stand Addition Method จะเหนวาการทา Calibration curve ในการวเคราะหสารนน สญญาณทวดไดมใชเปนแตเพยงสารททาการวเคราะหเทานน แตมนรวมถงสญญาณตางๆ ทไดจากสารอนๆ ทมอยในสารตวอยาง ดวยเหตนจงทาใหผลการวเคราะหคลาดเคลอนได ดงนน ในการแกปญหาเกยวกบ Matrix effect และ Interference จงควรใช Standard addition method ซงทาไดโดยแบงสารละลายตวอยางออกเปน 4 – 5 สวน นาแตละสวนมาเตมสารมาตรฐานทมความเขมขนตางๆ กนไป (C1, C2, C3 …) จานวนปรมาตรเทากน สวนสารละลายสดทายนามาเตมเฉพาะตวทาละลายใหมปรมาณเทากน นาสารละลายทงหมดไปวดคาแอบซอรแบนซแลวนามาเขยนกราฟกบความเขมขนของสารมาตรฐานทเตมลงไป ดวย Least – square fit คววามเขมขนไดจากการ Extraporating ไปตดแกนความเขมขน การวเคราะหดวยวธนจะเหนวาสารละลายทงหมดทกขวดมลกษณะเหมอนกน (Same matrix) ถาการวเคราะหม Matrix effect กจะม Effect เหมอนกนหมดดวย จงหกลางกนไป และ


การวเคราะหดวยวธนสามารถหาไดวาสารตวอยางม Matrix effect มากนอยเพยงใดไดดวย โดยเทยบคาของ Slopes ของ curve ทงสอง ถาทงสองเสนมคา Slopes เทากน แสดงวาสารละลายทงสองชดไมม Interferences 6.4.4 ใชวธเจอจาง (Dilution Method) วธนจะใชไดดกบการวเคราะหสารตวอยางทม Interference โดยเฉพาะอยางยงในกรณทเกด Enhancement คอ คาแอบซอรแบนซจะไดมากกวาปกต เนองจากเกดไอออไนเซชน วธการนสามารถทาไดโดยการเตมสารละลายทประกอบดวยธาตทไอออไนสงายๆ ลงไปในสารละลายตวอยางและสารละลายมาตรฐานใหมากเกนพอ และมปรมาตรจากดไมควรเตมมากเกนไปจนทาใหสารละลายเจอจางมากจนวดคาไมได 6.4.5 ใชวธ Internal Standard Method วธวเคราะหนอาศยหลกการเตมสารมาตรฐาน (Reference element) ซงเปนคนละธาตกบสารทสารทจะวเคราะหลงไปในสารตวอยาง และ Blank หลงจากวดคาแอบซอรแบนซ แลวหาอตราสวนของแอบซอรแบนซระหวางสารตวอยางและสารมาตรฐาน (AU/AS) จากนนไปเขยนกราฟกบความเขมขนของธาตทจะทาการวเคราะหจะได Calibration curve เพอใชหาความเขมขนของสารละลายตวอยางตอไป สาหรบวธนจะใชไดตอเมอ 1. สารตวอยางจะตองไมมธาตทใชเปนมาตรฐาน (Reference element) 2. ทงสารตวอยางและสารมาตรฐานจะตองมลกษณะและคณสมบตทางเคมเหมอนกนเทคนคนอาจจะคอยขางลาบากในการทา แตสามารถทาได ถาเครอง Atomic absorption spectrophotometer ชนดม 2 channel 6.5 เทคนคในการวเคราะหอะตอมมกแอพซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร

6.5.1 ไฮไดรดเจเนอเรชน (Hydride generation) เนองจากธาตบางชนดจะเปลยนใหเปนอะตอมโดยตรงดวยเทคนค Flam Atomization และ Electrothermal atomization ไมได จาเปนตองใชวธทาใหแตกตวในบรรยากาศทปราศจากออกซเจนเพอปองกนการรวมกบออกซเจน ดงนน จงตองใชวธทาใหธาตเหลานนกลายเปนสารทเปนไอไดงายๆ ทอณหภมหองดวยการรดวซ (Reduce) ใหเปนไฮไดรด (Hydrided) แลวใหไฮไดรด นนผานเขาไปในเปลวไฟไฮโดรเจนจะทาใหธาตกลายเปนอะตอมอสระได เทคนคนใชในการวเคราะหธาต แอรซนก (As) บสมส (Bi) ซลเนยม (Se) เลด (Pb) แอนตโมน (Sb) ทน (Sn) และ เทลลเลยม (Te) โดยทาใหเกดสารประกอบไฮไดรด ดงแสดงในตารางท 6.3


ตารางท 6.3 สารประกอบไฮไดรดและจดเดอดของธาตบางชนด

ธาต ไฮไดรดทระเหยได จดเดอด (°C) As AsH3 - 55 Bi BiH3 - 22 Pb PbH3 Sb SbH3 - 17 Se H2Se - 42 Sn SnH4 - 52 Te H2Te - 4

(ทมา: Stoog et al., 1998) ตามหลกการแลว สารละลายทมธาตเหลานจะถกรดวซไดอยางดดวยโซเดยมบอโรไฮไดรด(NaBH4) หรอบอโรไซยาไนด ในสารละลายทเปนกรด ไฮไดรดของธาตทเกดขนนนถกพาออกจากขวดทใชทาปฏกรยาดวยแกสไฮโดรเจนหรอแกสอารกอนเขาไปส Hydrogen flame ซงอากาศเปนตวชวยใหไฮโดรเจนตดไฟ (Entrained air) ความรอนจาก Flame จะทาใหไฮไดรดสลายตวเกดเปนอะตอมของธาต Atomic absorption signal จะเกดขนไดเปน Sharp peck โดยใช Resonance line จาก Electrodeless discharge lamp ซงให Sensitivity ทสงกวา HCL 6.5.2 โควดเวเปอร (Cold vapour) จดเปนวธ Flameless atomization แบบ Vapor Generation ใชในการวเคราะหธาตบางชนดทเปลยนเปนไอไดงาย ซงไดแก การวเคราะหปรอท โดยใชการ Reduction ของสารประกอบปรอท ซงโดยหลกการแลวใชวธรดกชนสารประกอบของสารประกอบของปรอทดวยสารละลายทนคลอไรด (SnCl2) ในกรดเมอควรไอออน (Hg2+) จะ ถกรดวซออกมาเปนเมอควร (Hg°) แลวปมไอของปรอทผานสารดดความชน (Desiccant) เพอนาไปใน Absorption cell ททาดวยแกว แต Window เปนควอซต วดแอบซอรพแบนซทความยาวคลน 253.6 nm โดยใช Hg – HCL สาหรบการหาปรมาณปรอทโดยวธการนใหความไวดกวาใชแบบเฟลม (Flame AAS) ประมาณ 2,000 เทา คอ สามารถหาปรอทไดถง 0.001 ไมโครกรมตอมลลลตร

ตวอยางงานวเคราะหดวยเครองอะตอมมกแอพซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร เปนการวเคราะหตวอยางไดทงของแขง และของเหลว ซงตวอยางตองผานการเตรยมเพอใหอยในรปสารละลายใส โดยการยอยดวยกรดจงสามารถนาไปวเคราะหได ซงจะมความจาเพาะกบโลหะทกชนดในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพนยมนาไปวเคราะหแรธาตทจาเปนตอการเจรญของจลนทรยของพช และสตว ตวอยางการวเคราะหธาตโพแทสเซยม โซเดยม แคลเซยม และแมกนเซยม ในเมลดพรกหวานและในนาทงจากกระบวนการกลนเอทานอลเพอใชเพาะเลยงสาหราย (Siri et al., 2013;


ปรยา แกวนาร และคณะ, 2555) การวเคราะหสารอเลกโทรไลททรวไหลออกนอกเซลลเมอเซลลเกดการเสอมสภาพ (Kaewnaree et al., 2007)

6.6 สรปประจาบท เครองอะตอมมกแอบซอรบชนสเปกโทรโฟโตมเตอร (Atomic Absorption Spectro-

photometer, AAS) เปนเครองมอทใชในการวเคราะหธาต(metal element) ทอยในตวอยางทดสอบ ดวยเทคนค Atomic Absorption Spectroscopy ซงเปนกระบวนการทอะตอมอสระ (Free atom) ของธาตดดกลน (Absorp) แสงทความยาวคลนระดบหนงโดยเฉพาะซงขนอยกบธาตแตละธาต เนองจากธาตแตละชนดมระดบของพลงงานแตกตางกนจงมการดดกลนพลงงานไดแตกตางกน พลงงานทพอดกบคณสมบตเฉพาะของธาตจะทาใหอเลกตรอนของธาตนนๆ เปลยนสถานะจากสถานะพน (Ground state) ไปเปนสถานะกระตน (Exited state) มความจาเพาะกบธาตโลหะสามารถวเคราะหธาตของโลหะไดถง 67 ธาต

เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร ประกอบดวย 5 สวน คอแหลงกาเนดแสง (Light source) สวนทาใหธาตแตกตวเปนอะตอมอสระ (Atomizer) โมโนโครมาเตอร (Monochromater) ดเทคเตอร (Detector) และระบบประมวลผล (Data processor) สามารถแบงเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมเตอรม 2 ประเภท คอ Flame-AAS และ Graphite-AAS



1.จากรป จงบอกสวนประกอบของแหลงกาเนดแสงของเครองอะตอมมกแอพซอรพชน สเปกโทรโฟโตมเตอร

A คอ............................................................................................. B คอ............................................................................................. C คอ............................................................................................. D คอ.............................................................................................

E คอ............................................................................................. F คอ............................................................................................. G คอ............................................................................................. H คอ............................................................................................. I คอ............................................................................................. 2. จงอธบายหลกการทางานของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร พรอมวาดรปประกอบ 3. จงบอกอปกรณหลกของอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอรประกอบดวยอะไรบางแตละสวนทาหนาทอยางไร 4. จงเปรยบเทยบอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอรแบบใชเปลวไฟและแบบใชความรอนจากไฟฟาแตกตางกนอยางไร 5. จงยกตวอยางธาตในตวอยาง ทวเคราะหดวยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร มา 3 ชนด 6. จงอธบายหลกการใชไฮไดรดเจเนอเรชน (Hydride generation) 7) การวเคราะหโลหะโดยการเตรยมสารละลายมาตรฐานดวยการทา Internal Standard Method คออะไร 8) จงบอกคณสมบตตวอยางกอนนาไปใชวเคราะหดวยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร


เอกสารอางอง บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, บรรณาธการ. (2539). เอกสารประกอบการประชม


ปรยา แกวนาร. ชาญชย ภขาว. และ รตนา หลกตา. (2555) การใชนาทงจากกระบวนการกลน เอทานอลเพอใชผลตชวมวลของสาหรายคลอเรลลา.วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลยมหาวทยาลยราชภฏอดรธาน. (1). 97-118.

พรพมล กองทพย. (ม.ป.ป). หนวยท 14 การตรวจวเคราะหทางสขศาสตรอตสาหกรรม. ภาควชาอาชวอนามยและความปลอดภยคณะสาธารณสขศาสตร มหาวทยาลยมหดล.

พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวนการวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.

แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม. (2535). Principles and Techniques of Instrumental Analysis. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย.

Kaewnaree P., Vichitphan K., Klunrit P. and SIRI B. (2007). The study of germination changes and electrolyte leaked from accelerated aging of sweet pepper seeds. Journal of Agricultural Science; 38: 156-159.

Siri B., Vichitphan K. Kaewnaree P. Vichitphan S. and Klanrit P. (2013). Improvement of quality, membrane integrity and antioxidant systems in sweet pepper (Capsicum annuum' Linn.) seeds affected by osmopriming. Australian Journal of Crop Science.7(13), 2068-2073.

Stoog D. A,, Holler J. F. and Nieman T.A. (1998). Principles of Instrumental Analysis. 5th ed. United States of America: Thomson Learning Inc.

☺

☺

A two step sequential treatment of ethanol distillation bottom liquid bybacterial fermentation and subsequent Chlorella vulgaris culture undercontinuous illumination of various lightsPreeya Kaewnaree1,*

1 Department of Biotechnology, Faculty of Technology, Udon Thani Rajabhat University, Thailand

*Correspondent Author: [email protected]

AbstractBottoms liquid from an ethanol distillation of spent sugarcane juice media was treated using a twostep process.

First, a Clostridium strain isolated from a wastewater treatment pond was grown for 6 days on diluted distillationbottoms liquid. This treatment reduced sugar concentration from 10.7%(w/v) to 2.6%(w/v) and accomplished a CODremoval of 68.58%. It increased concentrations of NO3

-, P, K, Na, Ca and Mg from 183, 2218, 285, 237, 304 and 224mg/L to 616, 2901, 1600, 3863, 389 and 472 mg/L, respectively. Subsequently, mineral removal was accomplishedusing a biotreatment by Chlorella vulgaris. Chlorella vulgaris was cultured in ethanol distillation bottoms liquid diluted1:100 with water. Experimental conditions were an initial pH of 5, incubation at room temperature with continuousillumination using white, red and green light at the intensities of 3,000 and 5,000 Lux for 10 days. It was found thatChlorella vulgaris had the highest biomass (cell dry weight) of 0.94g/day under white light with illumination at theintensity of 5,000 Lux. Chlorella vulgaris grown in Basal Medium under same conditions (control treatment) producedless biomass (0.183 g/day) than the tested conditions. After the Chlorella vulgaris biotreatment, concentrations of NO3,P, K, Na, Ca and Mg were low enough for discharging into the environment. The NO3

-, P and K removal wasespecially pronounced.

Keywords: Chlorella vulgaris, ethanol distillation residue, wastewater, sugarcane

1. Introduction Industrial and agricultural wastewater is primarily

composed of organic substances such as carbohydrates,proteins and fats. If these are released into an environment,they can cause adverse environmental impacts.Sugarcane juice for industrial ethanol production has ahigh level of sugar. Sugarcane juice has become an

important raw material for fuel ethanol production in UdonThani Province (Thailand). Approximately 2.5 tonnes ofsugarcane is needed to produce 1,000 L of juice containing200-230 g/L of total sugar [1]. After fermentation, thedistillation process produces 150 L of ethanol and 750 Lwastewater also known as bottoms liquid [1]. Thebottoms liquid contains organic materials that are harmfulit is released into the environment. It also contains lot of

98 KKU Res. J. 2014; 19(Supplement Issue)

KKU Res. J. 2014; 19(Supplement Issue): 98-108http : //resjournal.kku.ac.th

☺

nutrients including sugar. These can be used as nutrientsto produce biogas. Anaerobic digestion has been utilizedto treat waste water containing high organic matter tosignificantly reduce chemical oxygen demand (COD).Bio-conversion of wastewater sludge to biogas is limited.Anaerobic digestion of wastewater sludge was doneusing a Clostridium strain isolated from the sludge as aninoculum. Anaerobic conversion of biomass has also beendemonstrated as a technically feasible way of generatinghydrogen and methane [2]. Anaerobic digestion of organicmaterials and uptake of some minerals can supportmicroalgae growth.

Carbon, nitrogen and phosphorus are the threemost important nutrients influencing microalgal growth [3].Microalgae have long been used in tertiary sewage treatmentto eliminate N and P compounds after COD removal byconventional secondary treatment [4-5]. Industrialwastewater from olive-oil extraction was used forScenedesmus obliquus biomass production [6]. Chlorellavulgaris can reduce COD of wastewater from cassavaethanol fermentation resulting in increased biomass at pH6.0 at 27 oC under, continuous illumination at 3,000 Lux[7]. Microalgae are photosynthetic organisms withrelatively simple growth requirements. Through theprocess of photosynthesis, microalgae convert water andcarbon dioxide into oxygen and biomass using minerals intheir metabolic pathway. Nutrient requirements for growthof microalgae can be found in many industrial wastes. The current study investigated a sequential twostepwastewater treatment. In the first step, anaerobic fermen-tation of ethanol distillation bottoms liquid by a strain ofClostridium was done to reduce sugar levels. The secondstep involved nutrient removal by Chlorella vulgarisunder continuous illumination of three light colors andintensities. This was done for the purpose of reducing themineral contents of the wastewater.

2. Materials and Methods2.1 Strain and cultivationThe first microorganism used in this study was a

Clostridium strain isolated from sludge collected from awastewater pond at Udon Thani Rajabhat University(UDRU). It was cultivated in 500 ml flasks containing200 ml of culture medium at 35 ๐C for 24 h.

The microalgae used in this study was Chlorellavulgaris from the biotechnology laboratory of theThailand Institute of Scientific and Technology Research(TISTR). It was cultivated in 2,000 ml fermentation flaskscontaining 1,800 ml of culture medium at 25 ๐C undercontinuous illumination by white light at an intensity of3,000 Lux for 7 days. The inoculum concentration wasabout 1010 cells per liter of medium. The biomass washarvested using a centrifuge at 3,000 rpm for 10 min.

The nutrient broth (NB) used in this study consistedof 5 g peptone and 3 g beef extract per liter of distilledwater.

N8Y basal medium (BM) [8], consisted of 1 gKNO3, 0.74 g KH2PO4, 0.207 g Na2HPO4, 0.013 gCaCl2.H2O, 0.01 g FeNaEDTA, 0.025 g MgSO4, 0.1 gyeast extract and 1 ml micronutrient solution per liter ofdistilled water. The micronutrient solution contained 3.58g Al2(SO4)3.18H2O, 12.98 g MnCl2.4H2O, 1.83 gCuSO4.5H2O, 3.2 g ZnSO4.7H2O per liter of distilledwater.

Ethanol distillation bottoms liquid was obtainedfrom an industrial ethanol process (JSP Chemical Plant,Udon Thani Province). It was stored at -20 ๐C prior to use.

2.2 Pre-treatment wastewater and analysisEthanol distillation bottoms liquid was the

substrate in these experiments. The initial pH of the bottomsliquid was 5. The initial reducing sugar concentration wasdetermined by the 3,5 dinitrosalicylic acid method [9].Total sugar was measured using the phenol sulfuric method[10]. Nitrate (NO3

-) [11] and phosphorus (P) [12] concen-

99KKU Res. J. 2014; 19(Supplement Issue)

☺

trations were determined using a spectrophotometer (UV-1800, Shimadzu, Japan). Potassium (K), sodium (Na),calcium (Ca) magnesium (Mg) contents were measuredusing atomic absorption spectroscopy (AAS-3110, Perkin-Elmer, USA) [13] and COD was determined by thetitration method.

2.3 InoculumsThe inoculum was isolated from wastewater

sludge. It was pretreated by heating at 105 บ C for 3 h toinactivate methanogenic bacteria. Ten mg of dried sludgewas added to 200 ml NB and incubated at 35 ๐C for 24 hunder anaerobic conditions. Then microbial cells werecultured on NB agar at 35 ๐C for 24 h to obtain purecultures. Three strains were isolated in pure culture andpreliminary sugar fermentation tests done. The strainconsuming the most sugar was the inoculum used in thisstudy. Morphological examination and biochemical testsindicate that the microorganism was a member of theClostridium species.

2.4 Fermentation and testingOne liter of pretreated substrate was mixed with

50 ml of inoculum suspension of Clostridium andincubated anaerobically at 35 ๐C for 6 days withoutstirring. Samples were collected to determine the concen-trations of reducing sugars, total sugars, nitrate (NO3

-),phosphorus (P), potassium (K), sodium (Na), calcium (Ca)magnesium (Mg) [13] and COD.

2.5 Cultivation of C. vulgaris and analysisChlorella vulgaris was cultured in ethanol

distillation bottoms liquid. Bottoms liquid with an initialpH=5 was diluted 1:100 with water. Chlorella vulgariswas grown aerobically for 6 days at 25 oC. The initial pHwas 5, incubation at room temperature with continuousillumination using white, red and green light at intensitiesof 3,000 and 5,000 Lux for 10 days. Samples werecollected daily for analysis, Biomass, nitrate, phosphorus,potassium and calcium contents were determined.

2.6 Biomass determinationSamples were collected every day. Optical

density was measured at 682 nm. Biomass concentrationwas determined by correlating the optical density (OD682)with the dry weight of biomass in the culture medium. Therelationship between biomass concentration and opticaldensity was found to be the following:

Cb (mg/L) = 216.1OD682 (R2=0.99)

where Cb is the biomass concentration in mg/Land OD682 is optical density at 682 nm. The aboverelationship was derived by measuring OD682 and deter-mining the corresponding biomass concentration. This wasdone for OD682 values over the range of 0.101.00.Biomass concentration was determined by centrifugationat 5,000 rpm for 10 minutes followed by washing withdeionized water. This was repeated and followed bydrying at 80 ๐C for 6 h [14].

3. Results and DiscussionThe research investigated a sequential two step

process for wastewater treatment. In the first step, reducingsugar and COD concentrations of ethanol distillationbottoms liquid was reduced by bacterial fermentation. Inthe second step, Chlorella vulgaris was cultured for biomassproduction on the sugar and COD depleted bottoms liquidof step 1. This second culture was done under continuouswhite, red and green lighting at the intensities of 3,000 and5,000 Lux. Medium was reduced of the mineral contents.

3.1 Removal of COD and minerals fromethanol distillation bottoms liquid by Clostridium

Removal of reducing sugars, total sugars, COD,P, NO3

-, Ca, Mg, K and Na from ethanol distillationbottoms liquid was investigated. It was found that theinitial concentration of reducing sugars and total sugarswas 22,000 and 104,000 mg/L respectively. COD, P, NO3

-


☺

, Ca, Mg, K and Na concentrations were found to be380,000, 2,218, 183, 304, 224, 285 and 237 mg/L, respec-tively (Table 1). These values represent high nutrientcontent. This is especially true with regard to total sugars,reducing sugars and COD. Ethanol distillation bottomsliquid was inoculated with a species of Clostridium andanaerobically incubated at 35 ๐C for 6 days. It wasobserved that the concentrations of total sugars, reducingsugars and COD were reduced to 23,000, 2,000 and120,000 mg/L, respectively (Figures 1 and 2). Thesevalues represent 77.9 90.9 and 68.5% removal. However,the concentrations of other nutrients were increased overtheir initial levels. Concentrations of NO3

-, P, K, Na, Caand Mg increased from 183, 2,218, 285, 237, 304 and 224mg/L to 616, 2,901, 1,600, 3,863, 389 and 472 mg/L,respectively (Figures 3 and 4). Microorganism usedcarbon source from COD and released mineral contents

Table 1. Concentration of minerals in basic mediumand ethanol distillation wastewater

Parameter

Concentration (mg/L)

Basic

medium

ethanol distillation

bottoms liquid

Reducing sugar - 22,000

Total sugar - 104,000

COD - 380,000

P 293 2,218

NO3- 620 183

Ca 52 304

Mg 6 224

K 670 285

Na 97 237

during fermentation. This material, with reduced levels oforganic carbon and enhance levels of mineral nutrientswas then used as a substrate to culture algal biomass,Chlorella vulgaris.

Figure 1. Concentration of a) reducing sugars and b) total sugars in ethanol distillation wastewater during fermentation


☺

Figure 2. Concentration of COD in ethanol distillation wastewater during fermentation

3.2 Removal of NO3-, Ca, Mg, P, K and Na from

ethanol distillation bottoms liquid by Chlorella vulgarisunder continuous illumination of various colors

Chlorella vulgaris was cultured under white, redand green light at intensities of 3,000 and 5,000 Lux onBM and sugar and COD depleted ethanol distillationbottoms liquid. As shown in Table 2, concentrations of P,NO3

-, Ca, Mg, K and Na in bottoms liquid decreased tolow values.

Four culture conditions produced high levels ofChlorella vulgaris biomass. These were 1) growth on BMunder white light at an intensity of 3,000 Lux (194 mg/L),2) growth on BM under red light at an intensity of 5,000Lux (162 mg/L), 3) growth on distillation bottoms liquidunder white light at an intensity of 3,000 Lux (867 mg/L),and, 4) growth on BM under white light at an intensity of5,000 Lux (940 mg/L). This is seen in Figures 5(a), 5(b),6(a) and 6(b), respectively. The results indicated that C.vulgaris can grow on ethanol distillation bottom wastewaterbetter than on BM.

Biomass of C. vulgaris grown on BM under white,red and green lighting showed similar patterns. C.vulgaris grown on BM reached peak levels of biomass

after 10 days of culture. Cultures of C. vulgaris showedhigher levels of biomass production when cultivatedunder a light intensity of 3,000 Lux than at 5,000 Lux.Biomass of C.vulgaris grown on distillation bottomsliquid was approximately 5 times that grown on BM.Additionally, peak biomass production on distillationbottoms liquid was seen at 5 days, compared to 10 dayswhen grown on BM. Biomass production in distillation bottoms liquidculture under white and red light showed similar patternsat both intensities. C. vulgaris culture under green lighthad the lowest biomass. The algae did not grow wellunder green light at both light intensities. It was seen thatthe highest biomass was produced under white light. Ithas been reported that there is an optimum light intensityand color for growth of each microalgae species [15].This is referred to as its light saturation point. Light ofexcessive intensity cannot be fully utilized by algae. Inthis case, there would be unnecessary production costs.Inadequate light intensity limits microalgal growth [16].For example, the effect of cultivation conditions on Chlo-rella pyrenoidosa was that light saturation point was closerto 3,000 Lux than 5,000 Lux [6].


☺

Algae photosynthetically convert water andcarbon dioxide into oxygen and biomass and use mineralelements in their metabolism. The mineral requirementsfor growth of Chlorella vulgaris may be available inprocess waste streams. The results of the current studyshow that removal of P, NO3

-, K and Ca is accomplishedin C. vulgaris culture. This was seen under continuousillumination of all colors and intensities (Table 2).However, Na and Mg were not removed by C. vulgarisculture (data not shown).

As can be seen in Table 3, when grown on BM,levels of P, NO3

- and K removal under red light by C.vulgaris were 47.44%, 54.00% and 69.00%, respectively.These values were observed at 3,000 Lux for P and 5,000

Lux for NO3- and K. Ca removal under white light at the

intensity of 3,000 Lux was 38.09%. NO3- levels were

reduced by 36.46% under white light at an intensity of5,000 Lux. P and Ca removal under red light at intensitiesof 3,000 and 5,000 Lux were 21.72% and 27.27%, respec-tively. P, NO3

-, K and Ca are important nutrients influencingChlorella vulgaris growth. These results suggest that atwo-step process can be employed for wastewater treatment.The first step is done to utilize COD, reducing and totalsugars. The second step is done to eliminate P, NO3

-, Kand Ca. Distillation bottoms liquid has the necessarynutrients to support the growth of algal biomass. The optimumlevels of other nutrients for biomass production will befurther investigated in the future.

Table 2. Mineral use by Chlorella vulgaris cultured in basal medium and ethanol distillation bottoms liquid underwhite red and green light at intensities of 3,000 and 5,000 Lux

Mineral

Basal medium (mg/L) Ethanol Distillation Bottoms Liquid (mg/L)

3,000 Lux 5,000 Lux 3,000 Lux 5,000 Lux

Initial Final Initial Final Initial Final Initial Final

P

White 4947 4244 7011 5240 5663 5198 4968 4841

Red 4167 2190 4367 3911 7060 5526 6485 5510

Green 5989 5068 4789 3792 6233 5451 5361 5335

NO3-

White 150 112 150 139 201 129 181 115

Red 150 111 150 99 152 141 162 145

Green 150 60 150 128 190 177 172 154

K

White 123 106 115 101 49 44 67 56

Red 107 47 100 31 60 43 62 44

Green 127 104 113 113 60 40 60 29

Ca

White 21 13 15 14 9 9 11 11

Red 17 15 15 14 10 10 11 8

Green 18 16 17 14 10 9 11 10


☺

Mineral Basal medium (%) Ethanol distillation wastewater (%)

3,000 Lux 5,000 Lux 3,000 Lux 5,000 Lux

PWhite 14.21 25.26 8.21 2.55 Red 47.44 10.44 21.72 15.03 Green 15.37 20.81 12.54 0.48

NO3-

White 25.33 7.33 35.82 36.46 Red 26.00 34.00 7.23 10.49 Green 16.60 14.6 6.84 10.46

KWhite 13.82 12.17 10.20 16.41 Red 56.07 69.00 28.33 29.03 Green 18.11 0.00 33.33 51.66

CaWhite 38.09 6.60 0.00 0.00 Red 11.76 6.60 0.00 27.27 Green 11.11 17.64 10.00 9.09

Figure 3. Concentration of (a) nitrate and (b) phosphorus in ethanol distillation wastewater during fermentation

Table 3. Percentage of mineral removal from basal medium and ethanol distillation bottoms liquid by Chlorellavulgaris


☺

Figure 4. Concentration of (a) potassium, (b) sodium (c) calcium and (d) magnesium in ethanol distillation wastewaterduring fermentation


☺

Figure 5. Biomass of Chlorella vulgaris culture in BM under white red and green light at intensities of (a) 3,000 and(b) 5,000 Lux


☺

Figure 6. Biomass of Chlorella vulgaris culture in distillation bottoms liquid under white red and green light atintensities of (a) 3,000 and (b) 5,000 Lux

4. ConclusionOrganic materials in ethanol distillation bottoms

liquid were treated using bacterial fermentation. Organiccarbon sources in this wastewater were used as substrates.After this primary treatment, the total sugar, reducing sugarand COD were removed at levels of 77.7, 90.9 and 68.5%,respectively. Concurrently, mineral contents increased forphosphorus, nitrate, potassium, sodium, calcium andmagnesium. These minerals were consumed by subsequent

Chlorella vulgaris culture under continuous illuminationof various colors. Chlorella vulgaris used P, NO3

-, K andCa in wastewater for biomass production. White light atan intensity 5,000 Lux exhibited highest response tobiomass production. A wastewater treatment coupling aprocess using a Clostridium ssp. and Chlorella vulgaris isfeasible. Such a process may be used to simultaneouslyreduce pollution, production costs for microalgae, increasebiomass production and reduce costs of wastewater treatment.


☺

5. AcknowledgementThis study was supported by Research and

Development Institute and Faculty of Technology, UdonThani Rajabhat University, National Research Council ofThailand and Office of the Higher Education Commission.The authors acknowledge Thailand Institute of Scientificand Technological Research (TISTR) for Chlorellavulgaris, the Center of Science and Technology forResearch and Community Development and Departmentof Biotechnology, Faculty of Technology, Udon ThaniRajabhat University for laboratory services.

6. References(1) Kaewnaree P. Pookhoa C. Lukta R. Use of waste-

water from ethanol distillation for biomass productionof Chiorella vugaris.Journal of Science andTechnology. 2012; 1:97-117.

(2) Wang CC. Chang CW. Chu CP. Lee DJ. Chang. L.Producing hydrogen from wastewater sludge byClostridium bifermentans. Journal of Biotechnology.2003;102:83-92.

(3) Chen Y. Cheng JJ. Creamer KS. Inhibbition ofanaerobic digestion process: a review. BioresourceTechnology. 2008;99(10):4044-64.

(4) Oswald WJ. Micro-algae and wastewater treatment.In: Borowitzka, MA, Borowitzka, LJ.(Eds.),Microalgal Biotechnology. Cambridge UniversityPress, Cambridge, 1988;pp. 305-328.

(5) Laliberte, G. Proulx, D. De Pauw N. Dela Noue, J.Algal technology in wastewater treatment. In: Rai,L.C., Gaur, J.P., Soeder, C.J. (Eds). Algae and WaterPollution. Archiv fur Hydrobiology 42. Berlin.1994;pp. 283-302.

(6) Gassan H. M.Eugenia M. Sanchez S. Use ofindustrial wastewater from olive-oil extraction forbiomass production of Scenedesmus obliquus.Bioresource Technology (99). 2008:1111-1117.

(7) Cong-fa Y. Zhong-yang D. Ke-chang Z. Growth ofChlorella pyrenoidosa in wastewater from cassavaethanol fermentation. Microbio Biotechnol (24).2008;2919-2925.

(8) Chi XM. Chen F. Yuan JP. Heterotrophic productionof lutein by selected Chlorella strains. Journal ofApplied. Phycology. 1997; 9: 445-450.

(9) Miller GL. Use of dinitro salicylic acid reagent fordetermination of reducing sugar. Analytical chemistry.1959; 31: 426-428.

(10) Laopaiboon P. Sriwatana A. Ehtanol production fromsweet sorghum juice using very high gravitytechnology: Bioresource Technology. 2009; 4176-82.

(11) Armstrong FA. Determination of nitrate in waterultraviolet spectrophotometry. Annal Chemistry.1963;35(9): 1292-1294.

(12) Jastrzebska A. Modifications of spectrophotometricmethods for total phosphorus determination in meatsamples. Chemical paper. 2009; 63(1): 47-54.

(13) Keawnaree P. The Biochemical Changes Duringan Accelerated Aging and priming Processes insweet pepper (Capsicum annuum L.) seed. A Thesisfor the Degree of doctor of philosophy. KhonkaenUniversity. 2010:17-19.

(14) Weiqi F. Olafur G. Adam M. Frist. Maximizingbiomass productivity and cell density of Chlorellavulgaris by using light-emitting diode-basedphotobioreactor. Biotechnology(161).2012;242-249.

(15) Gong X. Chen F. Optimisation of culture medium forgrowth of Haematococcus pluvialis. J Appl Phycol1997:9:437–44.

(16) Myers J. Growth characteristics of algae in relationto the problems of mass culture. In: Burlew JS (ed)Algal culture from laboratory to pilot plant. The KirbyLithographic Company Inc, Washington, D.C.International Biodeterioration & Biodegradation.2011;65:78-84.


แผนบรหารการสอนประจาบทท 7 ทฤษฎโครมาโทกราฟ

หวขอเนอหา 7.1 หลกการโครมาโทกราฟ 7.1.1 กระบวนการโครมาโทกราฟค 7.1.2 การกระจายตวแบบหมนเวยน 7.1.3 โครมาโทแกรม 7.1.4 การกกโครมาโทกราฟแบบของเหลว 7.1.5 การกระจายตวของแถบ 7.1.6 อานาจการแยก 7.1.7 ซเลคตวต 7.2 โครมาโทกราฟแบบกระดาษ 7.2.1 ชนดของกระดาษ 7.2.2 สารละลาย 7.2.3 การตรวจสอบ 7.3 โครมาโทกราฟแบบเยอบาง 7.3.1 ตวดดซบ 7.3.2 สารละลาย 7.3.3 การตรวจสอบ 7.4 โครมาโทกราฟแบบคอลมน 7.4.1 วสดสาหรบบรรจคอลมน 7.4.2 สารละลาย 7.5 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 7 เอกสารอางอง วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจเกยวกบทฤษฎโครมาโทกราฟ 2. อธบายกระบวนการโครมาโทกราฟแยกสารใหบรสทธได 3. บอกความแตกตางของโครมาโทกราฟแบบกระดาษ แบบแผนเยอบาง และแบบคอลมนได 4. ตรวจสอบหรอวเคราะหชนดของสารจากสารตวอยางโดยใชเทคนคโครมาโทรกราฟได 5. ใชตวทาละลายทเหมาะสมในการแยกสารโดยเทคนคโครมาโทรกราฟได


วธสอนและกจกรรม 1. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 2. ทบทวนเนอหาทเรยนมาของสปดาหกอน 3. นาเขาสบทเรยนเรองโครมาโทกราฟพนฐาน 4. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการ

สอนและรปภาพ 5. เปดโอกาสใหผเรยนถามในแตละหวขอและเสนอแนวความคดกอนขามหวขอนน 6. ตรวจสอบคาตอบของผเรยนสอบถามผเรยนถาผเรยนมขอสงสยและสรปเนอหาประจาบท 7. แบงกลมผเรยนเพอฝกปฏบตการทางเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

เตรยมอปกรณและเครองมอตางๆ ตามใบงานทไดมอบหมายและกาหนดวนสงรายงาน 8. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง 9. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา 10. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน


1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอเอกสารประกอบการสอนอเลกทรอนกส 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. โครมาโทกราฟแบบกระดาษ แบบเยอบาง และแบบคอลมน 5. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 6. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 7. ใบงาน 8. แบบฝกปฏบตการ


1. การตรงตอเวลาของนกศกษาในการสงงานและเขาเรยน 2. การซกถาม-ตอบคาถาม 3. การเขารวมกจกรรมกลม 4. การปฏบตการในใบงาน 5. รายงานของใบงาน 6. ผลการสอบยอย การประเมนผล 1. จากการทากจกรรมกลมเสรจตามเวลา 2. ทาใบงานถกตองและครบสมบรณ 3. ทาแบบฝกหดมความถกตองไมนอยกวารอยละ 80

บทท 7 ทฤษฎโครมาโทกราฟ

โครมาโทกราฟเปนเทคนคทใชแยกและวเคราะหสารใหบรสทธกอนนาไปวเคราะหเชง

คณภาพหรอเชงปรมาณหรอเพอกาจดสารทปนเปอนมากบกบสารละลายตวอยาง เทคนคนนยมใชกนอยางแพรหลายในสาขาตางๆ เชน เคม ชวเคม การเกษตร เภสชกรรม การแพทย อตสาหกรรม วศวกรรม และเทคโนโลยชวภาพ เปนตน

โครมาโทกราฟเปนคาทเรยกกนมาตงแตปลายครสตศตวรรษท 19 โดยไมเคล ซวตต (Micheal Tswett) นกพฤษศาสตรชาวรสเซย โครมาโทกราฟ (Chromatography) เปนคามาจากภาษากรก 2 คา คอ Chromato แปลวา ส และ Graphy แปลวาเขยนหรอบนทก งานวจยของ ไมเคล ซวตต คอการศกษาทางฟสกสและเคมของคลอโรฟลล ในการศกษาไมเคล ซวตต ไดใชสารดดซบ (Absorbent) บรรจลงในคอลมน แลวใชตวทาละลายอนทรยเปนตวชะ สารคลอโรฟลลจะถกแยกออกเปนแถบๆ (Band) ซงแตละแถบมสตางกน ปจจบนโครมาโทกราฟไดนามาใชในงานวเคราะหและไดพฒนาไปอยางรวดเรว เพราะสามารถวเคราะหสารไดกวางขวาง หลากหลาย และมความจาเพาะสง ซงสามารถวเคราะหไดทงเชงคณภาพและเชงปรมาณ (พฒนา เหลาไพบลย, 2548) 7.1 หลกการโครมาโทกราฟ

เทคนคโครมาโทกราฟ International Union of Pure and Applied Chemistry ไดใหคาจากดความวา โครมาโทกราฟเปนวธการขนแรกทใชแยกองคประกอบของตวอยางโดยอาศยกระบวนการกระจายตวระหวางสองวฏภาค (Phase) วฏภาคแรกเปน วฏภาคนง (Stationary phase) ซงอาจเปนของแขงหรอของเหลวทเคลอบบนของแขงหรอเจล (Gel) ทบรรจอยในคอลมน หรอกระจายตวเปนชนบางๆ หรอกระจายตวเปนฟลม สวนอกวฏภาคหนงเปนวฏภาคไหล (Mobile phase) ซงอาจเปนแกสหรอของเหลว จากนนจงทาการวเคราะหชนดและปรมาณโดยใชเทคนคอนๆ เขามาตรวจสอบชนดและปรมาณ เทคนคโครมาโทกราฟมหลายแบบจาแนกเทคนคโครมาโทกราฟโดยอาศยลกษณะปรากฏทางกายภาพ ไดแก โครมาโทกราฟแบบกระดาษ (Paper chromatography) โครมาโทกราฟแบบเยอบาง (Thin layer chromatography) โครมาโทกราฟแบบคอลมน (Column chromatography) โครมาโทกราฟแบบแกส (Gas chromatography) และโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง (High performance liquid chromatography) (Hamilton และ Swell, 1977) ปจจบนโครมาโทกราฟไดใชอยางแพรหลาย และยงมการพฒนาเทคนคตางๆ อยางตอเนองทงองคประกอบของการแยกและเทคนคประมวลผล

กระบวนการแยกสารทางโครมาโทกราฟนนสามารถกาหนดไดดวย 2 สถานะ คอ 1. คา partition coefficient หรอ distribution constant (K) ซงแทนดวย distribution

isotherms อาจเปนไดทงแบบเสนตรง (linear) หรอไมเปนเสนตรง (nonlinear) ไอโซเทอรม (isotherms) แสดงดวยกราฟทอณหภมหนงกาหนดไว ทาใหคาทไดจากความสมพนธของตวดดซบในเฟสคงทกบความเขมขนของตวถกดดซบในเฟสเคลอนทหรอแกสเฟสมคาคงท ซงเรยกวา คาคงทการแผกระจาย (distribution constant หรอ partition coefficient, K) มสมการดงน

150 บทท 7 ทฤษฎโครมาโทกราฟ เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

K = CS Cg

CS = ความเขมขนของตวถกดดซบในเฟสเคลอนท Cg = ความเขมขนของตวถกดดซบในแกสเฟส

2. ระบบของโครมาโทกราฟจะเปนระบบอดมคต (ideal) หรอไมเปนระบบอดมคต (non – ideal) กได ถาเปนระบบอดมคตต แสดงวาการแลกเปลยนระหวางเฟส 2 เฟสนนเปน Thermodynamicallly reversible และสมดลระหวางอนภาคทเปนของแขง หรอของแขงทม liquid phase ฉาบผวและแกสเฟสจะเขาสสมดลออยางรวดเรว กระบวนการ diffusion เกดขนนอยมาก แตถาเปน non – ideal การตงสมมตฐานนจะใชไมไดไอโซเทอรมจงมไดทงทเปนเสนตรงและเสนโคง ถาเปนเสนตรง ลกษณะพคของโครมาโตแกรมจะเปนแบบเกาสเชยน แสดงวาการแยกสารไมมปญหา ถาไอโซเทอรมเปนเสนโคง แสดงวาพคของโครมาโทแกรมไมสมมาตรกน (asymmetry) บางทไอโซเทอรมจะเปนเสนตรงบางชวงของความเขมขนเทานนในกรณนจาเปนตองทาการวเคราะหในชวงชวงความเขมขนจากดเพอปองกนการแยกปญหา

ในการอธบายทฤษฎทางโครมาโทกราฟโดยอาศยพนฐานของ discontinuous model จะตองตงสมมตฐานขนหลายอยางดวยกน คอ

1. ความเขมขนของตวถกละลาย (solution) ในเฟสทงสองจะเขาสสมดลอยางรวดเรว 2. การแพรกระจายของตวถกละลายในเฟสเคลอนท (mobile phase) ตลอดคอลมน

จะตองมนอยมาก 3. สารทบรรจในคอลมนหรอ liquid phase ทฉาบ (coated) ในคอลมนจะตองสมาเสมอ

ในการแยกสารทางโครมาโตกราฟนน อาจจะมสภาวะไมครบทง 3 ขอนกไดถาอตราเรวคงท (rate constant) ของกระบวนการดดซบและการคายการดดซบ (sorption – desorption processes) มคานอย สมดลของเฟสทงสองไมจาเปนตองเกดอยางรวดเรว ผลของปรากฏการณ resistance – to – mass – transfer ดงนนตวถกละลายจะมการแพรกระจายจากเฟสหนงไปยงอกเฟสหนงตามธรรมชาต

7.1.1 กระบวนการโครมาโทกราฟค (Chromatographic process) IUPAC ใหคาจากดความของโครมาโทกราฟคเปนวธการขนแรกทใชแยกองคประกอบของตวอยางโดยอาศยการกระจายตวระหวางสองวฏภาค (phase) วฏภาคแรกเปนวฏภาคนงหรออยกบท (stationary phase) ซงอาจเปนของแขงหรอของเหลวทเคลอบอยบนของแขงหรอเจลทบรรจอยในคอลมนหรอกระจายตวเปนชนบางๆ หรอกระจายตวเปนฟลม สวนอกวฏภาคเปนวฏภาคไหล (mobile phase) ซงอาจเปนกาซหรอของเหลวกไดกระบวนการโครมาโตกราฟค (บณฑต สละศาสตร และธรพล วงศชนะพบลย, 2539)

7.1.2 การกระจายตวแบบหมนเวยน (Eddy diffusion) ถานกถงภาพของคอลมนทบรรจดวยอนภาคทมขนาดเทากนตามคอลมนจะมชองวาง (Void space) ระหวางอนภาคตลอดคอลมนอยางสมาเสมอ เมอขนาดของอนภาคเลกลง ทาใหยากตอการควบคมขนาดของอนภาคใหเทากน

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 7 ทฤษฎโครมาโทกราฟ 151

ตลอด และยากตอการปองกนไมใหอนภาคแตกได ดงนนชองวางทเกดขนในคอลมนจะไมสมาเสมอ เมอสารตวอยางเคลอนทเขาไปในคอลมน จะทาใหบางโมเลกลของสารเคลอนทไปไดเรวกวาและไดระยะทางมากกวา บางโมเลกลอาจเคลอนทไปไดชาและไดระยะทางนอยกวาเมอเทยบกบจดศนยกลางของโซน เพราะฉะนน การกระจายตวแบบหมนเวยนเปนผลมาจากการไหลของสารในคอลมนทมชองวางสมาเสมอและอนภาคมขนาดตางๆ กน

7.1.3 โครมาโทแกรม (Chromatogram) กาหนดระยะทางแนนอน ตวอยางการทดลองโดยใชเทคนคน คอ การทาคอลมนโครมาโตกราฟ โดยกาหนดระยะทางเปนความยาว 1 คอลมน ตวถกละลายแตละตวเดนทางจากสวนบนของคอลมนมายงสวนลางสดหรอหลดผานออกจากคอลมนจะใชเวลาเดนทางแตกตางกน ขณะทตวถกละลายทถกปลอยออกจากคอลมน จะถกตรวจพบไดดวยตวดเทคเตอร (Detector) เมอสรางกราฟระหวางผลทไดจากการตรวจพบดวยเทคเตอร (Detector response) กบเวลาทใชในการเคลอนทออกจากคอลมนจะไดกราฟทเรยกวาโครมาโตแกรม (Chromatogram) เวลาทตวถกละลายใชเดนทางจากสวนบนของคอลมน สารตวอยางทเฟสเคลอนทพาผานมาท ดเทคเตอรและบนทกเปนรปกราฟระฆงควา (Gaussian curve) ซงเรยกเปนพคดงรปท 7.1 และพคทออกทงหมดในการวเคราะหแตละครง เรยกวาโครมาโตแกรม พคทปรากฏสามารถใชในการวเคราะหทงทางคณภาพและทางปรมาณของสารผสมทตองการวเคราะห

รปท 7.1 รปรางของพค

(ทมา: บณฑต สละศาสตร และธรพล วงศชนะพบลย, 2539)

7.1.3.1 การวเคราะหทางคณภาพการวเคราะหจะใชคา Retention time ในการบงชชนดของสาร Retention time เปนระยะเวลาตงแตการฉดสารตวอยางและการบนทกคาสญญาณสงทสดคอยอดพคเรยกคานวา Retention time คา Retention time ของสารตองมคาคงทเสมอเมอใชสภาวะในการศกษาเหมอนกนไดแก เสนผาศนยกลางของคอลมน ชนดเฟสคงท องคประกอบของเฟสเคลอนทและอตราการไหล ขนาดตวอยางและอณหภมทใชการบงชชนดของสารสามารถบงชได


จากการทดลองศกษาสารตวอยางและสารมาตรฐานทสภาวะเดยวกนและสารตวอยางม Retention time เทากบสารมาตรฐาน แสดงวาสารตวอยางอาจเปนสารชนดเดยวกบสารมาตรฐาน 7.1.3.2 การวเคราะหทางปรมาณการวเคราะหเชงปรมาณ เนองจากพนทใตกราฟและความสงของพคแปรเปนสดสวนโดยตรงกบปรมาณสารทฉดเขาไป เมอตองการหาปรมาณของ สารตวอยางสามารถทาโดยการสรางกราฟมาตรฐาน จากความสมพนธระหวางพนทใตกราฟหรอ ความสงของพค และความเขมขนทรคาของสารมาตรฐาน และนากราฟมาตรฐานมาใชคานวณหาความเขมขนของสารตวอยางไดโครมาโตแกรมสามารถใหขอมลเกยวกบประสทธภาพในการแยกสารไดดงรปท 7.2

รปท 7.2 โครมาโทแกรม


จากรปท W คอ ความกวางของพคทฐานพค T0 คอ Dead time หรอ Retention time ของตวทาละลายทเดนทางผาน คอลมนหรอระยะเวลาทเฟสเคลอนทผานคอลมน Linear flow velocity, u = L t0 เมอ L = ความยาวคอลมน t0 = ระยะเวลาทเฟสเคลอนทผานคอลมน (Mobile phase residence time) tR = Retention time ชวงเวลาตงแตฉดสารจนกระทงปรากฏพคของสาร t’R = Adjusted retention time (Stationary residence time) Retention time ขนกบอตราการไหลของเฟสเคลอนท และความยาวของคอลมน ถาเฟสเคลอนทวงไปอยางชาๆหรอถาคอลมนยาว t0 จะมคามาก และ tR มคามากดวย ทาให tR ไมเหมาะสม


สาหรบบอกคณลกษณะของสารดงนน Retention factor หรอ คา k จะเหมาสมในการใชบอกคณลกษณะของสาร

7.1.3.3 Retention factor ใชในการบอกคณลกษณะของสารวามการเกดกระบวนการโครมาโตกราฟฟหรอการกระจายตวระหวางเฟสเคลอนทและเฟสคงทดหรอไม คา Retention factor, k ทเหมาะสมสาหรบการแยกสาร อยระหวาง 1-10 ถาคา k มคาตามากๆ ประสทธภาพการแยกสารไมด เพราะสารผานเขาสคอลมนและเดนทางผานคอลมนอยางรวดเรวโดยไมไดเกดการปฏสมพนธกบเฟสคงทเลย ทาใหไมเกดการแยกสาร ถาคา k มคาสงมาก มการกระจายตวระหวางเฟสคงทและเฟสเคลอนทมากทาใหใชเวลาในการวเคราะหนาน

k = t’R = tR – t0 t0 t0 ตวอยางใหหาคา k ของสารท 1 และ 2 กาหนดให t0 = 12.5 mm, tR1 = 33.1 mm, tR2 = 70.5 mm k1 = tR1 – t0 = 33.1 – 12.5 = 1.6 t0 12.5 k2 = tR1 – t0 = 70.5 – 12.5 = 4.6 t0 12.5 คา k ไมขนกบความยาวของคอลมน อตราการไหลของเฟสเคลอนท และอตราสวนของความเขมขนของสารเปนโมลารในเฟสคงทและเฟสเคลอนท

7.1.2.4 Separation factor, สารผสม 2 สารในคอลมนจะสามารถแยกกนไดดหรอไมขนกบ Separation factor, เมอสารมคา k ตางกน เชน k2 k1

= k2 = tR2-t0 k1 tR1-t0

ถา = 1 จะไมมการแยกสารเกดขน เพราะวาสารมคา Retention time เทากน คา ใชแสดงวาระบบโครมาโตกราฟฟสามารถแยกสาร 2 สารออกจากกนไดหรอไมขนอยกบการเลอกใชเฟสเคลอนทและเฟสคงท ตวอยาง ใหคานวณหา ของสารท 1 และ 2 กาหนดให k1 = 1.6 และ k2 = 4.6 ดงนน = 4.6/1.6 = 2.9 Separation factor มคาเปน 2.9


7.1.4 การกกโครมาโทกราฟแบบของเหลว (Retention in liquid chromatography)

7.1.4.1 การวดการกกโดยใชเวลา (Retention time) รเทนชนไทม (Retention Time) คอ เวลาทใชในการทาใหตวถกละลายเคลอนทไดเทากบ 1 คอลมน ซงมคาเทากบความยาวของคอลมนหารดวยอตราเรวของการเคลอนทของตวถกละลาย ในโครมาโตแกรมสามารถหาคาtRไดจากการวดระยะทางตงแตเรมใสสารตวอยางลงในคอลมนจนถงสวนยอดของพค tR = length of column (L) ………….(7.1) travel of rate แคนคาสมการ rate of travel = 1 ลงในสมการท 6.1 1 + k'

tR= L (1 + k') ………….(7.2) U ให tm คอ เวลาทโมเลกลของตวพาเดนทางได 1 คอลมน ซงมคาเทากบความยาวของคอลมนหารดวยความเรวในการเคลอนทของเฟสเคลอนท (u) นนคอ tm= L/U ในกรณทเฟสเคลอนทคอกาซ สามารถวดคา tm ไดจากพคของอากาศ เมออากาศไมเปนตวหนวงในคอลมน ∴tR = tm (1 + k') ...……….(7.3) หรอ k' = tR– tm tm สมการหนง คอ สมการอตราสวนของรเทนชน (Retention ratio) r ซงหมายถงอตราสวนของเวลาทโมเลกลของตวพาเดนทางได 1 คอลมน (tm) ตอรเทนชนไทม(tR) r = tm …………….(7.4) tR แทนคาสมการท (6.3) ลงใน (6.4) r = tm tm (1 + k')


= 1 1 + k' = 1 1 + kd VS Vm = Vm Vm + kdVS ………….(7.5)

7.1.4.2 การวดการกกโดยใชปรมาตร (Retention volume) รเทนชนโวลม (Retention volume) คอ VR ปรมาตรของเฟสเคลอนทหรอตวพาท

ตองการใชสาหรบการอลทสารตวอยางออกจากคอลมน รเทนชนโวลมมความสมพนธกบรเทนชนไทมคอ มคาเทากบเวลาทใชทงหมด หรอรเทนชนไทมคณดวยอตราการไหลของตวพา (ปรมาตร/เวลา) volume = time x flow rate VR = tRF ………….(7.6) แทนคาสมการท 3.8 ลงในสมการท 3.11 VR = tm (1 + k') F …………..(7.7) สาหรบปรมาตรของตวพาทใชเวลาในการเดนทางได 1 คอลมน (tm) มคาเทากบ Vmจะมคาสมพนธกนดงน คอ Vm= tmF .………….(7.8) ปรมาตร Vmตามปกตถกเรยกวา dead volume หรอ interstitial หรอ void volume แทนคาสมการท 7.13 (tm = Vm/F) ลงในสมการท 7.7 VR = Vm (1 + k') F = Vm (1 + k')

7.1.5 การกระจายตวของแถบ (Band - broadening) 7.1.5.1 จานวนเพลททางทฤษฎ (Theoretical plate number) จานวนเพลทสงผลตอประสทธภาพของคอลมน (Column efficiency) กลาวคอ

มความสามารถในการแยกแถบสารทแคบ ซงดไดจากคาความกวางของแถบของสารตวอยางทหางออกไปจากจดกงกลางของแถบสารตวอยาง (Number of theoretical plates, N) โดยคานวณจากสตร


N = 5.54 (Tr/W½)2 เมอ Tr = Retention time = เวลาตงแตฉดสารตวอยางจนถงเวลายอดกราฟสงสดปรากฏ W½ = ความกวางของกราฟทครงหนงของความสงในหนวยมลลเมตร

รปท 7.3 โครมาโทแกรมสาหรบคานวณจานวนเพลทของคอลมน (N)


ตารางท 7.1 คาคงท a จากการวดความกวางของพคโดยวธตางๆ

วธ a ความกวางของพคทครงหนงของความสง 5.54 ความกวางของพคท 4.4 % ของความสง(5σ) 25 Tangent 16

(ทมา: บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, 2539)

7.1.5.2 ความสงของเพลท (Plate height) ความสงของเพลท (Plate height) ความสงของเพลท หรอ HETP (Height equivalent of a theoretical plate) ไดจาก

H = L/N เมอ H = ความสงของเพลท L = ความยาวของคอลมน N = จานวนเพลท


7.1.6 อานาจการแยก (Resolution) การแยกสารออกจากกนไดดหรอไมสามารถกาหนดไดจากอตราสวนระหวางคา Retention

time ระหวาง 2 พคและคาเฉลยของความกวางทฐานพคดงสมการ R = 2[tR2 – tR1] w1 + w2 ตวอยาง ใหคานวณหา Resolution ของสารท 1 และ 2 กาหนดให tR1=33.1 mm, tR2 = 70.5 mm, w1 = 17 mm, w2 = 29 mm R = 2[tR2 – tR1] w1 + w2 = 2(70.5 – 33.1) = 1.6 17 + 29 ดงนน Resolution มคาเปน 1.6 แสดงวาสารทงสองแยกจากกนไดอยางชดเจน

7.1.7 ซเลคตวต (Selectivity) เปนคาทบอกใหทราบวาพกของสารสองชนดทอยแยกออกจากกนดเพยงใดการแยกออกจาก

กนนขนกบคาเวลาการคงไวหรอคา k' เทานนโดยไมคานงถงความกวางของพคและคานเกยวของกบ Relative partition coefficient ของสารสองชนดหาไดจากอตราสวนของ Partition coefficient หรออตราสวนของแฟคเตอรความจของสารสองชนดทมพคตดกนดงน α = k'2 = t'R2 k'1 t'R1 เมอ α = คาซเลคตวต k'1 = คาแฟคเตอรความจของพคแรก k'2 = คาแฟคเตอรความจของพคทสอง t'R1 = Corrected retention time ของพคแรก t'R2 = Corrected retention time ของพคทสอง


รปท 7.4 โครมาโทแกรมของการแยกสารสองชนด (ทมา: บณฑต สละศาสตร และธรพล วงศชนะพบลย, 2539)

คาซเลคตวต (α) เปนคาทมความสาคญมากคอเปนตวบอกใหทราบวาคอลมนหรอเฟสอยกบทนนอยในสภาวะทมการทางานดเพยงใดคานขนกบองคประกอบของเฟสเคลอนทพนทผวของเฟสอยกบทและอณหภมในการแยกสาร α จะตองมคามากกวา 1 จงจะมการแยกเกดขนถาα = 1 แสดงวาพกทงสองทบกนเนองจากพคทงสองมเวลาการคงไวเทากนคา α เหมาะสมคออยในชวง 1.5 - 4.0 การควบคมหรอปรบเปลยนคาซเลคตวต (α) เพอใหสารสองชนดทอยใกลกนแยกออกจากกนไดดขนเทานนทาโดยวธตางๆ ดงน 1. ปรบเปลยนองคประกอบของเฟสเคลอนทเปนการปรบความแรงของเฟสเคลอนทโดยการเปลยนชนดของตวทาละลายทเปนองคประกอบของเฟสเคลอนทคอเปลยนคณสมบตทางเคมของตวทาละลาย 2. เปลยน pH ของเฟสเคลอนทวธนนยมใชกบการแยกสารทมการแตกตวเปนอออนเชนพวกกรดหรอเบสการปรบเปลยน pH ของเฟสเคลอนทมกจะทาใหคา α เปลยนแปลงแตคา k'เปลยนแปลงไมมากนกสวนมากใชในวธการแลกเปลยนไอออน (Ion–exchange),ไอออนแพร (Ion– pair) 3. เปลยนเฟสอยกบททาโดยการเปลยนชนดของคอลมนวธนไมสะดวกเสยคาใชจายสงกวาการปรบเปลยนเฟสเคลอนทจงไมคอยเปนทนยมแตใหผลดมากถามการเปลยนคอลมนใหม เฟสเคลอนทกตองมการปรบเปลยนใหมความแรงพอทจะทาใหไดคา k' ทเหมาะสม 4. เปลยนอณหภมของคอลมนโดยทวๆ ไปการเพมอณหภมจะทาใหคา k' ลดลงดงนนถาตองการเพมอณหภมของคอลมนจาเปนตองลดความแรงของเฟสเคลอนทเพอเปนการชดเชยใหคา k'อยในชวงทเหมาะสมการเพมอณหภมของคอลมนมผลตอการเปลยนแปลงคา α เพยงเลกนอย


5. ใชปฏกรยาพเศษทางเคมปฏกรยาทนยมใชคอคอมแพลกเซชน (Complexation) โดยการเตมซลเวอรไนเตรท (Silver nitrate) ลงในเฟสเคลอนทซงซลเวอรไอออนนจะเปนตวททาใหเกดการเปลยนแปลงของ tR และ α ทาใหการแยกดขน 7.2 โครมาโทกราฟแบบกระดาษ (Paper chromatography, PC)

การใชกระดาษในโครมาโทกราฟจะพจารณาในระบบ Partition ซงวฏภาคนง (Stationary phase) และวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) เปนของเหลวททาหนาทชะสารตวอยางผสมใหแยกจากกน (พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา, 2536) ดงแสดงในรปท 7.5

7.2.1 ชนดของกระดาษ (Type of paper) กระดาษเปนเสนใยเซลลโลส (Cellulose fibers) และแตละเสนใยประกอบไปดวยจานวน

ลกโซประมาณ 2,000 hydroglucose units กระดาษในโครมาโทกราฟมหลายชนด ไดแก 1. Ion-exchange papers เปนเซลลโลสมมหมกรด (Acidic group) มการเปลยนแปลงโตงสรางของหมไฮดรอกซล (-OH) เปนกระดาษทมหมคารบอกซล (Carboxyl) สง เหมาะสาหรบแยก แคทไอออน (Cations), เอมน (amines) และกรดอะมโน (Amino acid) เชน Cellulose phosphate, Carboxymethyl cellulose, Diethylaminoethyl cellulose และ Ecteola cellulose 2. Reversed phase method ซงวฏภาคนง (Stationary phase) มสภาพขวมากกวาวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) สารทเปนวฏภาคนงเชน rubber latex, Olive oil, Silicone oils จะแสดงคณสมบตไมชอบนา และจะดดซบองคประกอบอนทรยของสารละลายผสมซงกลายเปนวฏภาคนงแทนท นา ซงวฏภาคนงทแยกกรดอะมโนออกจากกน ไดแก Cellulose phosphate paper-H+ form และ DEAE cellulose paper-free base form

7.2.2 สารละลาย (Solvent) สารละลายใชเปนวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) ชอบสารประกอบอนทรย นา และมการ

เตมสารบางอยางลงไป เชน กรด เบส สารเชงซอน หรอ สารแอนตออกซแดนท ตวอยางเชน ฟนอล (Phenol) นา (Water) แอมโมเนย (Ammonia) บวทานอล (Butanol) กรดอะซตรก(Acetic acid) ไพรดน (Pyridine) เปนตน

7.2.3 การตรวจสอบ (Detection) ตรวจสอบโดยวธทางกายภาพเชน UV, Fluorescence, Densitometer techniques และ

Radio chemical methods การวเคราะหปรมาณ ใชวธ Photometric method, Radiochemical detection, Visual comparison และการวดพนทของจด


(ก) (ข)

รปท 7.5 การแยกสารผสมโดยโครมาโทกราฟแบบกระดาษ (ก) แถบสารทแยก (ข) (ทมา: http://chemistryquiz.exteen.com/20081212/chromatography)

7.3 โครมาโทกราฟแบบเยอบาง (Thin layer chromatography)

การตรงแผนเยอบางบนของแขงเฉอย ซงเปนวฏภาคนง (Stationary phase) ซงเปนตวดดซบเฉอย (Inert adsorbent) และสารละลาย ทระเหยงายเปนวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) ตรวจสอบการแยกของสารโดยวธทางกายภาพ เชน การมอง ฟลออเรสเซน (Fluorescence) หรอ Radiation หรอสารเคมฉดพน (พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา, 2536) ดงแสดงในรปท 7.6


7.3.1 ตวดดซบ (Adsorbents) ตวดดซบมคณสมบต 2 ประการ คอ ขนาดของวสด (Particle size) และการมลกษณะเดยวกน (Homogeneity) ขนาดของวสดอยในชวง 1-25 ไมโครเมตร การใชขนาดของวสดทเลกและละเอยดจะทาใหอานาจการแยก (Resolution) ด ตวอยางตวดดซบ เชน Silica ใชแยก กรดอะมโน นาตาล กรดไขมน ไขมน นามนหอมระเหย สารอนนทรยไอออนบวกและลบ Alumina ใชแยก อลคาลอยด ฟนอล สเตอรอยด วตามน คาโรทน และกรดอะมโน Kieselguhr ใชแยก นาตาล โอลโกแซคคาไรด กรดไขมน ไตรกลเซอไรด กรดอะมโน กรด-เบส และ สเตอรอยด Celite ใชแยก สเตอรอยด และสารอนนทรยไอออนบวก Cellulose powder ใชแยก อลคาลอยด กรดอะมโน และนวคลโอไทด Polymide powder ใชแยก แอนโทไซยานน กรดอะโรมาตก สารแอนตออกซแดนท ฟลาโนอยด และ โปรตน Ion-exchange cellulose ใชแยก กรดอะมโน เฮไรดไอออน และนวคลโอไทด Sephadex ใชแยก โปรตน สารประกอบเชงซอนของโลหะ และนวคลโอไทด

7.3.2 สารละลาย (Solvents) สารละลายใชเปนตวชะ (Eluant) อาศยสภาพขว (Polarity) ของสารละลายจะตวแสดงถง

อนกรมการถกชะ เชน เฮกเซน เบนซน โทลอน คลอโรฟอรม กรดฟอรมก อะซโตน เอทานอล และนา เปนตน สารละลายทใชตองราคาถก มความบรสทธสง ระเหยไมเรวเกนไป

7.3.3 การตรวจสอบ (Detection) ตรวจสอบโดยวธทางเคม (Chemical method) โดยการพนดวยสารเคม เชน ไอโอดน กรด

ซลฟวรก โรดานน บ และ ฟลออเรสซน ไดไนโตรฟนลดราซน เปนตน ตรวจสอบโดยวธทางกายภาพ (Physical method) แสงยว (UV detection) เดนซโตมเตอร

(Densitometers) และการวดดวยรงสเคม (Radiochemical detection)

(ก) (ข) รปท 7.6 โครมาโทกราฟแบบเยอบาง (ก) แถบสารทแยก (ข)


7.4 โครมาโทกราฟแบบคอลมน (Column chromatography) เปนโครมาโทกราฟทมเปนวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) เปนของเหลว และมสารท

บรรจอยในคอลมนเปนวฏภาคนง (Stationary phase) วฏภาคเคลอนทจะพาสารตวอยางทตองการแยกผานไปบนวฏภาคนง ซงบรรจอยในคอลมน จากนนสารจะถกชะออกจากกนและตรวจวดดวยตวตรวจวด (Detector) แลวบนทกผลดวยเครองบนทกผล (Recoder) สารตวอยางทถกแยกจะถกแยกเกบดวย Fraction collector ปจจบนโครมาโทกราฟแบบคอลมนไดถกพฒนาอยางรวดเรวและมประสทธภาพในการแยกสง เชน แกสโครมาโทกราฟ (Gas Chromatography) และโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรวดนสง (High performance liquid Chromatography) ซงจะไดกลาวตอไปในบทท 8 และบทท 9 ในบทนจะกลาวเพยงพนฐานของคอลมนโครมาโทกราฟเทานน (พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา, 2536; พฒนาเหลา ไพบลย, 2548; แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535; บณฑต สละศาสตร และธรพล วงศชนะพบลย, 2539)

7.4.1 วสดสาหรบบรรจคอลมน (Column packing materials) วสดทใชบรรจในคอลมนมทงทเปนสารอนทรยและสารอนนทรย คณสมบตของวสดทบรรจใน

คอลมน คอ มความเฉอยทางเคม คงทนตอความรอน ตานทานการไหลเพยงเลกนอย (A low resistance flow) สามารถใหอานาจการแยกทด และมราคาไมแพง ตวอยางวสดบรรจคอลมนทเปนเจลฟวเตชน (Gel filtration) เชน Styrene-divinylbenzene gel, Styrene gels, Polyvinylacetate gel, Porous silica beads, Porous glass, Dextran gel, Acrylamide-methylene และ Agarose

7.4.2 สารละลาย (Solvents) การเลอกตวทาละลายจะตองพจารณาจากการละลายของตวอยางทตองการแยก

(Solubility) ถาใชตวทาละลายทมความหนดตาๆ จะทาใหอตราการไหลเรวและมประสทธภาพแยกจะตา ดงนนตองใชคอลมนทมขนาดความยาวขนเพอจะทาใหเกดการลดลงของความดน (Pressure drop) และเปนการเพมประสทธภาพของคอลมนหรอการแยกจะสงขนนนเอง

นอกจากนถาหากใชตวทาละลายผสมจะเปนการชวยเพมการละลาย (Solubility) ใหดขน และเปนการลดการดดซบสารภายในคอลมนได ถาหากใชตววดสญญาณประเภทมาตรดชนหกเหชนดผลตาง (Differential refractometer) ตวทาละลายทใชจะตองมคาดรรชนหกดห (Refractive index) ทแตกตางจากสารทตองการแยกมากๆ เพอใหไดการตอบสนองของตววดสญญาณมคาสง แตเมอใชตองวดสญญาณประเภทสเปกโทรโฟโตมเตอร เชน UV-visible สเปกโทรโฟโตมเตอร ตวทาละลายทใชจะตองไมดดกลนแสง (Non absorbing solvents) โครมาโทกราฟแบบคอลมน ดงแสดงในรปท 7.7


(ก) (ข) รปท 7.7 โครมาโทกราฟแบบคอลมน (ก) แถบสารทแยก (ข) (ทมา: https://www. http://dir.indiamart.com/impcat/chromatography-apparatus.html)

7.5 สรปประจาบท ทฤษฎโครมาโทกราฟ (Chomatographic theory) เกยวของกบคา Partition coefficient

หรอ Distribution constant (K) ซงแทนดวย Distribution isotherms อาจเปนไดทงแบบเสนตรง (Linear) หรอไมเปนเสนตรง (Nonlinear) ไอโซเทอรม (Isotherms) แสดงดวยกราฟทอณหภมหนงกาหนดไว ทาใหคาทไดจากความสมพนธของตวดดซบในเฟสคงทกบความเขมขนของตวถกดดซบในเฟสเคลอนทหรอแกสเฟสมคาคงท ซงเรยกวา คาคงทการแผกระจาย (Distribution constant หรอ Partition coefficient, K) ม

ระบบของโครมาโทกราฟจะเปนระบบอดมคต (Ideal) หรอไมเปนระบบอดมคต (Non – ideal) กได ถาเปนระบบอดมคต แสดงวาการแลกเปลยนระหวางเฟส 2 เฟสนนเปน Thermodynamicallly reversible และสมดลระหวางอนภาคทเปนของแขง หรอของแขงทม liquid phase ฉาบผวและแกสเฟสจะเขาสสมดลออยางรวดเรว กระบวนการ Diffusion เกดขนนอยมาก แตถาเปน Non – ideal การตงสมมตฐานนจะใชไมไดไอโซเทอรม จงมไดทงทเปนเสนตรงและเสนโคง ถาเปนเสนตรง ลกษณะพคของโครมาโตแกรมจะเปนแบบเกาสเชยน แสดงวาการแยกสารไมมปญหา ถาไอโซเทอรมเปนเสนโคง แสดงวาพคของโครมาโทแกรมไมสมมาตรกน (Asymmetry) บางทไอโซเทอรมจะเปนเสนตรงบางชวงของความเขมขนเทานนในกรณนจาเปนตองทาการวเคราะหในชวงชวงความเขมขนจากดเพอปองกนการแยกปญหา

ในการอธบายทฤษฎทางโครมาโทกราฟโดยอาศยพนฐานของ Discontinuous model จะตองตงสมมตฐานขนหลายอยางดวยกน คอความเขมขนของตวถกละลาย (Solution) ในเฟสทงสองจะเขาสสมดลอยางรวดเรวการแพรกระจายของตวถกละลายในเฟสเคลอนท (Mobile phase) ตลอดคอลมนจะตองมนอยมากและสารทบรรจในคอลมนหรอ Liquid phase ทฉาบ (Coated) ในคอลมนจะตองสมาเสมอในการแยกสารทางโครมาโทกราฟนน อาจจะมสภาวะไมครบทง 3 ขอนกได


ถาอตราเรวคงท (Rate constant) ของกระบวนการดดซบและการคายการดดซบ (Sorption – desorption processes) มคานอย สมดลของเฟสทงสองไมจาเปนตองเกดอยางรวดเรว ผลของปรากฏการณ Resistance – to – mass – transfer ดงนนตวถกละลายจะมการแพรกระจายจากเฟสหนงไปยงอกเฟสหนงตามธรรมชาต

เทคนคโครมาโทกราฟมหลายแบบจาแนกเทคนคโครมาโทกราฟโดยอาศยลกษณะปรากฏทางกายภาพ ไดแก 1) โครมาโทกราฟแบบกระดาษ (Paper chromatography; PC) 2) โครมาโทกราฟแบบเยอบาง (Thin layer chromatography; TLC) 3) โครมาโทกราฟแบบคอลมน (Column chromatography) 4) โครมาโทกราฟแบบแกส (Gas chromatography; GC) และ5) โครมาโท กราฟแบบของเหลวแรงดนสง (High performance liquid chromatography; HPLC) (Stoog et al., 2014)



1. จงอธบายหลกการแยกสารใหบรสทธโดยใชเทคนคโครมาโทกราฟ 2 จาแนกเทคนคโครมาโทกราฟโดยอาศยลกษณะปรากฏทางกายภาพไดกแบบ อะไรบาง 3. จงอธบายวฏภาคนง (Stationary phase) คออะไร 4. จงยกตวอยางวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) มา 2 ชนด 5. กระบวนการโครมาโทกราฟคคออะไร 6. จงอธบายซเลคตวต (Selectivity) คออะไร 7. จงอธบายรเทนชนไทม (Retention Time) คออะไร 8. อานาจการแยก (Resolution) ขนอยกบอะไร จงอธบาย 9. ตรวจสอบหรอวเคราะหชนดของสารจากสารตวอยางโดยใชเทคนคโครมาโทรกราฟ 10. จงเปรยบเทยบความแตกตางระหวางโครมาโทกราฟแบบกระดาษและ โครมาโทกราฟแบบเยอบาง



พฒนา เหลาไพบลย. (2548). โครมาโตกราฟฟแบบของเหลวแรงดนสง: หลกการและการประยกตใช. ขอนแกน: ขอนแกนการพมพ.

พฒนา เหลาไพบลย. และอลศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวนการวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.



เอกสารประกอบการเรยน. บทท 6 กาซโครมาโตกราฟ (Gas Chromatography). คนเมอ 2 สงหาคม 2557, จาก http://e-book.ram.edu/e-book/c/CM334/CM334-6.pdf

Hamilton R. J. and Swell P. A. (1977). Introduction to High Performance Liquid Chromatography. London: Academic Press.

Stoog D. A., West D. M., Holler J. F. and Crouch S. R. (2014). Fundamentals of Analytical Chemistry. 7th ed. Singapore: New Tech Park (Looby H).

http://chemistryquiz.exteen.com/20081212/chromatography สบคนเมอ 26 มนาคม 2558 https://www. http://dir.indiamart.com/impcat/chromatography-apparatus.html สบคน

เมอ 26 มนาคม 2558 http://www.coleparmer.com/Product/TLC_developing_thinline_tank_with_lid_capacit

y_two_10_x_10_cm_plates/EW-34105-00 สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

แผนบรหารการสอนประจาบทท 8 เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง

หวขอเนอหา 8.1 หลกการและทฤษฏพนฐานของเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง 8.2 อปกรณหลกในเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง 8.3 การวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ

8.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห 8.5 เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง – แมสสเปกโทรโฟโตเมตร

8.6 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท บทท 8 เอกสารอางอง วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของโครมาโทกราฟแบบของเหลว แรงดนสง และโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง – แมสสเปกโทรโฟโตเมตร 2. บอกความหมายของโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงได 3. มทกษะในการวเคราะหกลมสารดวยโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง

4. บอกกลมสารทวเคราะหดวยเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง และโครมาโท กราฟแบบของเหลวแรงดนสง – แมสสเปกโทรโฟโตเมตร

5. ตรวจสอบชนดและปรมาณของสารโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงได 6. นาหลกการวเคราะหสารดวยโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงไปใชในงานวเคราะห สารในตวอยางทางเทคโนโลยชวภาพได

วธสอนและกจกรรม 1. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 2. ทบทวนเนอหาทเรยนมาของสปดาหกอน 3. นาเขาสบทเรยนเนอหาทจะเรยนในสปดาหน 4. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการ


เตรยมอปกรณและเครองมอตางๆ ตามใบงานทไดมอบหมายและกาหนดวนสงรายงาน


8. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง 9. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา

10. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน สอการเรยนการสอน

1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอเอกสารประกอบการสอนอเลกทรอนกส 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 5. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 6. เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง

7. แบบฝกบทท 8 การวดและการประเมนผล การวดผล


บทท 8 โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง

โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง (High Performance liquid chromatography; HPLC)

หรอทนยมเรยกกนวา HPLC แสดงดงรปท 8.1 เปนโครมาโทกราฟรปแบบหนงทใชแยกสารผสมโดยอาศยวฏภาค (Phase) สองวฏภาค โดยทวฏภาคหนงอยกบท เรยกวาวฏภาคคงท (Stationary phase) ซงอาจจะเปนของแขงหรอของเหลวกได และอกวฏภาคหนงเปนของเหลวททาหนาทพาสารเคลอนทผานวฏภาคคงทในคอลมน เรยกวา วฏภาคเคลอนท (Mobile phase) ซงเคลอนทโดยอาศยแรงดนจากเครองสบแรงดนสง (High pressure pump) ตลอดระยะเวลาทกระบวนการแยกสารดาเนนไปอย (พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา, 2536; พฒนาเหลา ไพบลย, 2548; แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535)

รปท 8.1 เครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง

8.1 หลกการและทฤษฏพนฐานของเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง

โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสงมหลายรปแบบดวยกนและมแบบจาลอง (Mode) ทางทฤษฎทใชอธยากลไกการแยกสารโดยโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ไดหลายรปแบบ แตอยางไรกด ยงมหลายสมการทถอวาเปนสมการรวมอย โดยเฉพาะในกรณทเปนกลไกของของเหลว– ของเหลว (Liquid – liquid interaction) ดงพอจะนาเสนอโดยยอดงน (บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, 2539)

คาสมประสทธการแจกแจง (Distribution coefficient, KD) หาไดจาก

KD = Cstationary/Cmobile ………….(8.1)

170 บทท 8 โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

เมอ Cstationary และ Cmobileเ ปนความเขมขนของสารในวฏภาคคงทและในวฏภาคเคลอนท ตามลาดบ

สาหรบคาแฟกเตอรความจ (Capacity factor, k') ซงมประโยชนอยางยงในระบบโครมาโท กราฟของเหลวแรงดนสง นน เปนคาทสามารถหาไดจากโครมาโทแกรม (Chromatogram) โดยตรงและมสมการทใหนยามไวดงน

k' = [KDVs]/Vm ………….(8.2) โดยท Vs เปนปรมาตรของของเหลวทเปนวฏภาคคงท และ Vm เปนปรมาตรของของเหลวท

เปนวฏภาคเคลอนท ปรมาตรทจาเปนตองใชในการชะเอาสารออกมาจากคอลมนจนปรากฏเปนพค(Peak) บนโครมาโทรแกรม เรยกวา ปรมาตรรเทนชน (Retention volume, VR) ซงเกยวพนกนกบ k' ดงน

VR = Vm (1 + k') = Vm + VsKD ………….(8.3) เนองจากปรมาตรรเทนชนเปนผลคณของเวลารเทนชน (Retention time, tR) กบอตราการ

ไหลของวฏภาคเคลอนทและปรมาตรของวฏภาคเคลอนทในคอลมน (Vm) กเปนอตราการไหลของ วฏภาคเคลอนท คณกบเวลาทโมเลกลของสารทไมถกหนวงในคอลมน (Unretained molecule) ใชในการเคลอนทผานคอลมน (t0) [บางแหงใชสญลกษณ tm] ดงนนจงสามารถทจะเขยนสมการ (3) ใหม ใหอยในรปของเวลาแทนทจะเปนปรมาตรได ดงน

k' = [tR – t0]/t0 ………….(8.4) สาหรบคาความจาเพาะของคอลมน (Column selectivity, α)หาไดจาก α = [KD2]/[KD1] = k'2/k'1 = [tR2 – t0]/[tR1 – t0] ………….(8.5) แฟกเตอรเหลานทงหมดสมพนธกนกบคากาลงการแยก (Resolution, R) ตามสมการ R = (√n/4) [(α - 1)/α] [k'/(k' + 1)] ………….(8.6)

8.2 อปกรณหลกในเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง จากความรในทางทฤษฎเกยวของกบโครมาโทกราฟ วธการทจะปรบปรงใหสมรรถนะของ

คอลมนดขนไดวธหนง กโดยการลดขนาดของอนภาครองรบวฏภาคคงท (dp) แตการลดขนาดของอนภาคในคอลมนกมผลตอทาใหเกดแรงตานทานการเคลอนทของวฏภาคเคลอนท จนจาเปนทจะตองมแรงดนสงมาชดเชยใหได อตราการไหลของวกภาคเคลอนททเหมาะสม จากการทไดมผทตระหนกถงความจรงขอน จงไดมพฒนาการของโครมาโทกราฟของเหลวแบบธรรมดาทอาศยแตเพยง

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 8 โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง 171

แรงโนมถวงของโลก มาเปนโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ทประกอบดวยอนภาคขนาดเลกภายในคอลมน และเครองสบแรงดนสงททาใหวฏภาคเคลอนทสามารถเคลอนทในอตราทเหมาะสม

เทคนคทเรยกกนวาเกรเดยนตอลชน (Gradient elution) ทาใหผใชเครอง HPLC สามารถแปรเปลยนองคประกอบของวฏภาคเคลอนทไดโดยสะดวกและอยางตอเนองได เปนแผนภาพแสดงสวนประกอบของชดโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง กลอปกรณเกรเดยนต (Gradient device) ควบคมการทางานของเครองสบและการผสมตวทาละลายสองอยางหรอมากกวา เพอใหไดวฏภาคเคลอนททเหมาะสม (Suitable mobile phase) วธการนาสารตวอยางททาใหสามารถนา สารตวอยางเขาสคอลมนโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ไดมการพฒนามามากจนถงระดบทม การออกแบบระบบการฉดสารตวอยางททาใหสามารถนาสารตวอยางภายใตความดนบรรยากาศเขาสคอลมนทอาจจะมความดนอยแลวเปนพนปอนดได แมวาการแยกสารโดยโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง มหลายกรณทกระทาทอณหภมหองได แตเ นองจากคาคงทสมดล (Equilibrium constants) และคาการกระจาย (Solubility) ขนอยกบอณหภมดงนนจงอาจจะจาเปนตองมการควบคมอณหภมคอลมนอยเหมอนกน สาหรบดเทคเตอร (Detector) ในโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง กทาหนาทตรวจวดสารทออกมาจากคอลมนเชนเดยวกบดเทคเตอรในแกสโครมาโทกราฟ สญญาณทไดจากดเทคเตอรกมกจะมการขยายสญญาณโดยเครองขยาย (Amplifier) กอนทจะปรากฏสญญาณออกมาเปนเปนพค (Peaks) ในโครมาโทแกรม (Chromatogram) ตรงรคอรเดอร (Recorder) หรออปกรณบนทกสญญาณอนๆ เชน อนทเกรเตอร (Integrator) หรอคอมพวเตอรทเชอมโยงอยกบโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง (Data station) สาหรบสวนประกอบของ โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง แตละสวน จะไดอธบายอยางยนยอในหวขอน ยกเวนดเทคเตอร ซงจะมการอธบายในหวขอทเปนดเทคเตอรโดยเฉพาะตอไป

รปท 8.2 สวนประกอบทสาคญของเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง

(ทมา : ชชาต อารจตรานสรณ, 2534)


8.2.1 เครองสบ (Pumps) อาจจะกลาวไดวาไมมเครองสบใดทดทสดสาหรบโครมาโทกราฟของเหลว แตละชนดมทงขอดและขอเสยแตกตางกนไป แสดงใหเหนลกษณะของเครองสบสามแบบดวยกน คอ เครองสบแบบเขมฉดเคลอนทไดโดยมอเตอร (Motor-driven syringe pump) เครองสบแบบรซพรอเคทงพสตน (Reciprocation piston pump) และเครองสบแบบความดนคงท (Constant pressure pump) เครองสบทดควรทจะทางานในระดบความดน 8,000 ปอนด/ตารางนวได และไมมการขนๆลงๆ (Fluctuations) ของอตราการไหลของวฎภาคเคลอนทและความดน เครองสบทดในแงของการไดอตราการไหลของวฏภาคเคลอนททสมาเสมอ ไดแก เครองสบแบบเขมฉดเคลอนทไดโดยมอเตอร ซงมมอเตอรทคอยๆดนลกสบในอตราทคงท แลวจงไปแทนทวฏภาคเคลอนท แตเครองสบชนดนกมราคาแพงและมปญหาในการบารงรกษามาก เครองสบแบบรซพรอเคทงพสตน มการใชกนแพรหลายเพราะราคาไมแพงเทาเครองสบชนดแรก แตกเปนเครองสบทไมปลอดจากปญหาการขนๆ ลงๆ ของความดนเสยทเดยวโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง รนหลงๆ ทมการผลตออกมา นยมใชเครองสบชนดน โดยตดตงระบบไดอะแฟรม (Diaphragm) และบลลาสต (Ballast) เพอทาใหระดบการขนๆ ลงๆ ของความดนมคานอยมากจนไมมผลตอสมรรถนะของโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง เครองสบทมราคาถกทสดเปนแบบความดนคงท ซงทางานไดกตอเมอมไนโตรเจน หรอแกสอนมาชวยการทางานของลกสบไฮดรอลก (Hydraulic piston) เครองสบชนดนมกจะมกลไกการเพมความดนไดดวย อยางไรกดเครองสบชนดนกอาจทาใหไดฟองอากาศ ซงมผลทาใหเกดการเปลยนแปลงแรงตานภายในคอลมนอนสงผลใหอตราการไหลของวฏภาคเคลอนทเปลยนไป

ไมวาผใชงานโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง จะใชเครองสบแบบไหน แตความสงทไดเครองสบมกจะทาใหเกดปญหาของการมฟองแกสเกดขน เมอตวทาละลายไหลจากยานความดนสง ไปยงยานทความดนตากวา ฟองแกสเหลานเปนตวการททาใหไดโครมาโทแกรมทนาไปใชประโยชนไดไมด เนองจากฟองแกสมผลทาใหดเทคเตอรผลตสญญาณทผดปกตออกมาได ดงนนการกาจดแกส (Degas) ออกจากตวทาละลายทเปนวฏภาคเคลอนทและสารตวอยางเองกอนทจะนาเขาสคอลมน จงมความสาคญอยางยงยวด ทงนอาจจะกระทาไดโดยใชระบบสญญากาศ (Vacuum) การสนสะเทอน (Sonication) การฟอกถาย (Pure) ดวยแกสฮเลยมหรอแมกระทงการตมสาหรบตวทาละลายบางอยางทไมตดไฟ

8.2.2 กลอปกรณสาหรบเกรเดยนตอลชน (Gradient elution devices) อปกรณทใชในเกรเดยนตอลชนมกจะประอกบดวยซงเชมเบอร (Mixing chamber) และ

วาลวทควบคมโดยระบบอเลกทรอนกสซงทาหนาทวดและจดการกบอตราสวนของตวทาละลายทตองการ อปกรณดงกลาวนสามารถทจะเปลยนอตราสวนจาก 100 % ตวทาละลาย A ไปเปน 100 % ตวทาละลาย B ไดและสามารถ “โปรแกรม” อตราสวนของตวทาละลายใหเปนตามทตองการในแตละชวงของการวเคราะหโดยโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ได อปกรณเกรเดยนตในปจจบนมกจะควบคมไดโดยระบบดจตอลอเลกทรอนกส (Digital electronics) บางรนของบรษทกเปน ชดเกรเดยนตทสามารถโปรแกรมการผสมตวทาละลายสอยาง (Ternary systems) พรอมกนไดดวย


8.2.3 ระบบนาสารเขา (Sample introduction systems) ระบบนาสารหรอฉดสาร (Injection systems) เขาสคอลมนในโครมาโทกราฟของเหลว

แรงดนสง อาจจะเปนเพยงเซพทมยางทนความดนสง (High pressure septum) ทฉดสารทะลผานมนไปได ระบบฉดสารแบบนไดแนวคดมาจากเทคโนโลยการฉดสารในแกสโครมาโทกราฟ แตในโครมาโกราฟของเหลว เซพทมดงกลาวทาใหเกดปญหาไดหลายประการ คอ มนไมสามารถกนรวไหลของความดนทสงๆ โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ได ตวทาละลายบางอยางอาจทาลายเซพทมได ตองมการเปลยนเซพทมหลงการฉดสารไปแลวเพยงสามสครงและความดนภายในระบบ โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ทสงกทาใหการฉดผานเซพทมเปนไดยากและทาใหเกดอนตรายกบผใชเองได ระบบฉดแบบนจะตองไมใชงานทใชความดนสงกวา 2,000 บอนด/ตารางนวเปนอนขาด

ดวยเหตผลขางตน จงไดมผคดคนพฒนาระบบการใชวาลวกบสารตวอยาง (Sample valving system) ขนมาเพอแกไขปญหาอนเนองมาจากฉดสารตวอยางดงกลาว ระบบวาลวหกชอง (Six – port loop valve) เปนรปแบบการฉดสารทเปนทนยมกนมากทสดในปจจบน ในการระบบฉดสารอนน สารตวอยางกถกฉดเขาสวงเกบสารททราบปรมาตรแนนอน (Sample loop of known volume) โดยไมรบกวนการไหลของวฏภาคเคลอนทผานคอลมน เมอหมนวาลววฏภาคเคลอนทกกวาดเอาสารตวอยางจากวงเกบสารเขาสคอลมน

8.2.4 คอลมน คอลมนสาหรบ HPLC มกจะทาจากทอเหลกกลาปลอดสนม ทมเสนผานศนยกลางภายในอย

ระหวาง 0.025 – 5 มลลเมตร และความยาวระหวาง 10 –100 เซนตเมตร ทอดงกลาวบรรจดวยอนภาคของวสดสารแขงรองรบ (Particles of solid support material) ทมเสนผานศนยกลาง 5 – 50 ไมโครเมตร สาหรบ “ไมโครบอรคอลมน” (Microbore column) ซงหมายถงคอลมนในโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ทมเสนผานศยนกลางภายในทอเหลกกลาปลอดสนมประมาณ 1 มลลเมตร กเปนทนยมใชกนอยางแพรหลาย สาหรบธรรมชาตของวฏภาคคงทในโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง แตกตางกนไปตามรปแบบของโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ทใชซงจะไดกลาวถงในลาดบตอไป

8.2.5 ดเทคเตอรสาหรบโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง (Detectors for HPLC) วตถประสงคของการใชโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง โดยพนฐานแลว มกจะเพอแยก

สารผสมและหาปรมาณของแตละสารทมอยในของผสมนนๆ ปรมาณสารทฉดเขาไปสคอลมนในโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง อยในระดบไมโครลตร จงเปนปรมาณทนอยเกนไปทจะเกบแฟรคชนทออกมาจากปลายคอลมนแลวนาไปตรวจวดโดยเครองมอวเคราะหอนๆ ดงนนจงมการออกแบบ สรางกลอปกรณอยางหนงขนมาทาหนาทตรวจวดสญญาณของสารทนททมนออกมาจากคอลมน กลอปกรณททาหนาทนเรยกวาดเทคเตอร

8.2.5.1 ดเทคเตอรชนดรแฟรคทฟอนเดกซ (Refractive index detector) ปรมาณแสงทปรซม (Prism) ของของเหลวหกเหไป เปนตววดดชนหกเห (refractiveindex. RI) ของของเหลวนนๆ การเปลยนแปลงคาของ RI จากสารละลายอยางหนงไปเปนอกอยางหนงมคาเพยงเลกนอย แตดวยเทคโนโลยทางดานทศนศาสตรในปจจบน (Optical technology) การเปลยนแปลงแมเพยง 10-8 หนวย กสามารถทจะตรวจวดได


ดเทคเตอรชนด RI ถอไดวาเปนดเทคเตอรทวไป ไมจาเพาะเจาะจงกบสารใด เพราะมนสามารถตรวจวดสารใดๆในตวทาละลาย หรอวฎภาคเคลอนทได แตระดบความวองไวของดเทคเตอรชนดนเมอเทยบกบดเทคเตอร ชนดอนๆแลว ถอวาคอนขางตา โดยสามารถตรวจวดปรมาณตาสดไดราวๆ 10-7 กรม/มลลลตร นอกจากนดเทคเตอรชนด RI ยงถกกระทบกระเทอนโดยอณหภมไดงาย และไมสามารถใชเทคนคเกรเดยนตอลชนได เพราะจะมเสนฐานทขยบตามการเปลยนสภาพวฎภาคเคลอนทโดยตลอด อยางไรกด โครมาโทกราฟของเหลวทใชดเทคเตอรชนด RI ไดแกเอกซคลชนโครมาโทกราฟ และในโครมาโทกราฟ ทแยกสารออกมาเพอเตรยมใชประโยชนอยางอน (Preparative HPLC) ซงไมจาเปนตองมดเทคเตอรทวองไวกตาม

8.2.5.2 ดเทคเตอรชนดยว (UV Detector) ทางเลอกในกรณทไมอยากใชชนด IR กคอการใชดเทคเตอรชนดยว (Ultraviolet detector) ดเทคเตอรชนดยววดคาแอบซอรแบนซของยว (UV absorbance) เนองจากสารประกอบทงหลายมไดสามารถดดกลนรงสในชวง UV ไดหมดดเทคเตอรชนดนจงถอไดวาเปนดเทคเตอรจาเพาะ (Selective detector) ดเทคเตอรชนดนสวนใหญทางานไดทความยาวคลน 254 นาโนเมตร ซงเปนยานทเหมาะกบสารทมวงเบนซน (Benzene rings) และสารประกอบอะโรแมตกสวนมากดดกลนรงสไดแรงตรงความยาวคลนน

ขดความสามารถในการตรวจวดโดยดเทคเตอรชนดยวขนกบคาแอบซอรแบนซ แตสาหรบสารประกอบทดดกลนแสงในชวง UV ไดแลว ขดความสามารถทจะตรวจวดไดจะดกวาดเทคเตอรชนด RI โดยมกจะไดถงระดบ 10-10 กรม/มลลลตร ดเทคเตอรชนดยวมขอดอยในแงทวา มสารประกอบมากมายทนาสนใจไมดดกลนแสงท 254 นาโนเมตร ในขณะทตวทาละลายทนาสนใจจานวนมากดดกลนแสงท 254nm จงทาใหไมสามารถใชเปนวฏภาคเคลอนทได ในปจจบนม ดเทคเตอรชนดทสามารถปรบเปลยนความยาวคลนในชวงยว-วสเบล (Variable wavelength UV-VIS detector) แตราคากยอมแพงกวาชนดความยาวคลนเดยวมาก ดเทคเตอรแบบใหมนทาใหความจาเพาะในการตรวจวด และทสาคญกคอ มนทาใหผใชสามารถวเคราะหสารประกอบไดอกมากทดดกลนแสงในชวงยวไกล (Far UV:190-220 nm) แตไมดดกลนแสงท 254 nm แสดง ดเทคเตอรยวความยาวคลนคงทตาแหนงเดยว (Fixed wavelength UV detector)

8.2.5.3 ดเทคเตอรชนดเคมไฟฟา (Electrochemical detectors) ในโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง มกลมของดเทคเตอรกลมหนงททางานไดโดยอาศยคณสมบตทางไฟฟาเคมของสาร เทคนคทางโพลาโรกราฟ (Polarography), แอมเปอโร เมตร (Amperometry) คลอมเมตร (Coulometry) และอเลกโทรลซส (Electrolysis) ตางกสามารถทจะนามาเปนฐานในการออกแบบดเทคเตอรส าหรบ โครมาโทกราฟของ เหลวแรง ดนส ง ได แอมเปอโร เมตรก ด เทคเตอร (Amperometric)

เปนดเทคเตอรทนยมใชแพรหลายทสดในบรรดากลมของดเทคเตอรชนดเคมไฟฟา พฒนาการของดเทคเตอรชนดเคมไฟฟาทาใหสามารถตรวจวดสารประกอบอนทรยไดหลายประเภท อาทเชน อะโรแมตกเอมน (Aromatic amines) กรดอนทรย (Organic acids) วตามน และแอลคาลอยด (Alkaloids) สาหรบ IC กไดอาศยดเทคเตอรชนดคอนดกทวต (Conductivity detector) เปนระบบหลกในการตรวจวดไอออนทออกมาจากคอลมน


นอกจากดเทคเตอรชนดตางๆทไดกลาวมาแลวนน ยงมดเทคเตอรสาหรบ HPLC ชนดอนๆอกไมนอย ไดแกดเทคเตอรทอาศยคณสมบตของฟลออเรสเซนส (Fluorescence), คอนดกแทนซ (Conductance), การแผรงส (Radiation), ผลของความรอน (Thermal effects), อะตอมกแอบซอรพชนและพลาสมาอมสชน (Atomic absorption and plasma emission) และ เฟลมไอออไนเซซน แตดเทคเตอรทสมบรณแบบทสด บางครงเหมอนกนทมการใชงานโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง รวมกนกบอปกรณ วเคราะหอนๆ เชน อนฟาเรดสเปกโทรม เตอรและแมสสเปกโทรมเตอร ซงอปกรณเหลานมไดเพยงแตทาหนาทเปนดเทคเตอรธรรมดา แตในหลายกรณ สเปกตรมทมนใหออกมาสาหรบแตละพคในโครมาโทแกรม ใหคาตอบในแงของการวเคราะหโดยเฉพาะอยางยงในเชงคณภาพไดอยางถกตอง เปนขอยตไดดยง หากจะมขอเสยกคงเปนเรองของราคาเทานนเอง เพราะเครองมอทมลกษณะเชอมตอกนเขาแลวใหทางานเสมอนหนงเปนอปกรณชดเดยวกนน มราคาแพงอยางมหาศาลทเดยว 8.3 การวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ (Qualitative and quantitative analysis)

8.3.1 การวเคราะหเชงคณภาพ (Qualitative analysis) การวเคราะหเชงคณภาพโดย HPLC อาศยขอเทจจรงทวาเวลารเทนชน (Retention time)

หรอทงปรมาตรรเทนชน (Retention volume) เปนคณลกษณะเฉพาะของแตละสาร ถาหากผวเคราะหผใดตองวเคราะหสารตวอยางประเภทเดยวกนบอยๆ การมพคของสารทสนใจใดๆ อย (เชน กรดอะมโน) กสามารถทจะยนยนไดวาเปนกรดอะมโนทตองการวเคราะหหรอไม กโดยการเทยบปรมาตรรเทนชนของกรดอะมโนมาตรฐานดงกลาวภายใตสภาวะทดลองเดยวกน แตถาไมมขอมลทละเอยดพอของสารตวอยางทวเคราะห กคงจะเปนการปลอดภยกวา ถาจะเทยบเวลารเทนชนหรอปรมาตรรเทนชนกบของสารมาตรฐานเมอใชคอลมนทมสภาพขวแตกตางกนสองคอลมน ถาขอมล รเทนชนตรงกนทงสองคอลมนแลว โอกาสทสารทงสองจะเปนสารเดยวกนมความเปนไปไดกวา 99 % ทเดยว

ในการตดตอรวมมอกนระหวางหองปฏบตการ (หรอแมกระทงภายในหองปฏบตการเดยวกน) การใชเวลารเทนชนสมพทธ (Relative retention time) หรอแฟกเตอรจาเพาะ (selectivity, α) สาหรบการเปรยบเทยบจะดกวา เพราะ α ไมไดขนอยกบความยาวคอลมนหรออตราการไหลของวฏภาคเคลอนท ทงนคา α สามารถหาไดจาก

α= (tR2 – t0)/(tR1 – t0) = tR2'/tR1' = k2'/k1' = KD2/KD1 ………….(8.7) เมอพลอต α เทยบกบจานวนคารบอน จะไดเสนตรงสาหรบสารทอยในอนกรมโฮโมลอก

เดยวกนความจรงขอนในบางครงกสามารถใชในการวเคราะหเชงคณภาพไดอยเหมอนกน การเชอมตอ (Interfaces) ระหวางโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง เขากนกบอปกรณการ

วเคราะห (Analytical instruments) ทางดานอนฟาเรดสเปกโทรเมตร นวเคลยรแมกเนตก เรโซแนนซ และแมสสเปกโทรโฟโตเมตร ไดกลายมาเปนบรรทดฐานของการวเคราะหเชงคณภาพโดยโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ทงนถอไดวา เปนการใหโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ทา


หนาทในการแยกสารแตอยางเดยว แลวใชอปกรณวเคราะหทเชอมตอเขากบโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสงดงกลาว ทาหนาทในการวเคราะหเชงคณภาพเพอยนยนอยางแทจรงวาแตละสารทแยกไดนนเปนอะไร

8.3.2 การวเคราะหเชงปรมาณ (Quantitative analysis) ดเทคเตอรแตละชนดสาหรบโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง ใหสญญาณออกมาเปนโคร

มาโทแกรม ซงความสงของพคหรอพนทใตพคบนโครมาโทแกรมจะแปรผนโดยตรงกนกบปรมาตรของสารททาใหพคนน ไมวาผวเคราะหจะใชความสงหรอพนทใตพคเพอคานวณหาปรมาณของสารทสนใจกตาม สงทจาเปนตองมกคอสารมาตรฐานทบรสทธ เพอทจะไดใชปรบมาตรฐานของสญญาณทมตอสารนน

เทคนคการปรบมาจรฐานทสามญไดแก วธสารมาตรฐานภายนอก (External standard method) วธสารมาตรฐานภายใน (Internal standard method) วธการเตมสารมาตรฐาน (Standard addition method) และวธการปรบพนทใหเปนปกต (Area normalization method)

วธสารมาตรฐานภายนอกกระทาโดยการฉดสารมาตรฐานบรสทธ ทมความเขมขนตางๆ ในปรมาณทเทากนทกครง เมอไดความสงของพคหรอพนทใตพคแลว กนามาพลอตเทยบกบความเขมขนเพอทจะสรางกราฟมาตรฐาน สาหรบใชในการหาปรมาณของสารทสนใจซงวเคราะหภายใตภาวะเดยวกนกบสารมาตรฐานทกประการ

ในวธการวเคราะหสารมาตรฐานภายใน ผวเคราะหเตมสารละลายมาตรฐานททราบปรมาณแนนอนลงไปในของผสมของสารตวอยางทจะวเคราะห โดยทสารมาตรฐานภายในควรจะมลกษณะทางเคมใกลเคยงกบสารตางทตองการวเคราะหอย แตจะตองใหพคทไมไปเหลอมทบพคอนใดในโครมาโทแกรมเปนอนขาด จากนนจงสรางกราฟมาตรฐานโดยการพล อตอตราสวนของพนท “Unknown” ตอสารมาตรฐานเทยบกบความเขมขน และหาความเขมขนของ “Unknown” นอกจากน ยงหาแฟกเตอรตอบสนองของดเทคเตอร (Detector response factor) จากขอมลทไดดงน

Fx = (As/Ax) (Cx/Cs) ………….(8.8) เมอ As และ Cs เปนพนทใตพคและความเขมขนของสารมาตรฐาน ตามลาดบ Ax และ Cx เปนพนทใตพคและความเขมขนของ “Unknown” ตามลาดบ แฟกเตอรตอบสนองของดเทคเตอรตอสารทวเคราะหกสามารถนาไปคานวณ หาความเขมขน

ของสารทวเคราะหในภาวะเดยวกนโดยใชสมการ Cx= (FxAxCs)/As ………….(8.9) วธการสารมาตรฐานภายในน มขอดในแงทเปนอสระจากคาการตอบสนองสมบรณของ

ดเทคเตอร (Absolute detector response) และปรมาตร ดงนนถาหากจากการฉดสารครงหนงไป


ยงการฉดอกครงหนง มการเปลยนแปลงคาความวองไว (Sensitivity changes) หรอ ถาหากปรมาณทฉดไมสมาเสมอกจะสงผลตอการหาปรมาณของ “Unknown” แตอยางใดแฟกเตอรตอบสนองอาจจะเปลยนแปลงไปบางไปตามปรมาณสารทฉดและความเขมขน ดงนนจงเปนการสมควรทจะใหพนทใตพคของ “Unknown” ใกลเคยงกบสารมาตรฐานเขาไวกอน หากทาเชนนแลว กจะไดความแมน (Accuracy) ของการวเคราะหมความคลาดเคลอนเพยง 1 % หรอดกวา นอกจากนแฟกเตอรตอบสนองยงสามารถเกบไวไดในอปกรณประมวลผลขอมลโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง สมยใหม ซงทาใหการอานความเขมขนของสารทวเคราะหโดยตรงเปนไปได

วธการเตมสารมาตรฐานในการวเคราะหโดยโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง กระทาไดในลกษณะเดยวกนกบททากนในกรณของการวเคราะหโดยไอออนอเลกโทรด โพลาโรกราฟและ อะตอมกแอบซอรพชน นนคอ สารละลายของสารทตองการวเคราะหมการเตม (Spiked) สารชนดเดยวกนกบสารทจะวเคราะหลงไปโดยทราบปรมาณและความเขมขนทแนนอน สญญาณทเพมขนมา กสามารถใชในการคานวณหาปรมาณความเขมขนดงเดมของ “Unknown” ได ขอดของวธการนกคอเปนวธการทขจดผลทเกดจากเมทรกซออกไปได

วธการปรบพนทใหเปนปกตใชการไดกบของผสมอยางงายทมองคประกอบของสารไมมากนก เปนวธการททาใหผวเคราะหหารอยละของแตละสารในของผสมได โดยปรบใหผลรวมของพนทใตพค(Sum of the peak area) คณกบแฟกเตอรตอบสนอง (Response factor) มคาเตม 100 %

คาแฟกเตอรตอบสนองไดจากสมการ Fx = (As/Ax) (Wx/Ws)Fs ………….(8.10) ในสมการท (12) น Wxและ Wsเปนนาหนกของสารทวเคราะหและสารอางอง ตามลาดบ Fsเปนแฟกเตอรตอบสนองตอสารอางอง (ปกตคอ 1) นาหนกเปนรอยละของสาร x ในของ

ผสมทมสารอยสามสารคอ x, y และ z หาไดจากสมการ % X = [AxFx (100)]/ [AxFx + AyFy + AzFz] ………….(8.11) (ในกรณทไมมการใชสารอางอง Fx กคอ Wx/Ax) วธสดทายทกลาวถงนมเงอนไขในการใชวา สารทกตวทอยในของผสมจะตองออกมาจาก

คอลมนจนหมด (ไมใหมอะไรตกคางอยในคอลมน) เปนวธการทมขอดตรงทเปนอสระไมขนกบปรมาตรทฉดและการคานวณกงายกวาในวธสารมาตรฐานภายใน 8.4 การเตรยมตวอยางในงานวเคราะห (Sample preparation for quantitative analysis)

8.4.1) ตวอยางแกส ตวอยางแกสอดแนนในถงบรรจอปกรณทตองเตรยมมาดวยคอเขมฉดยาแบบมเขม ตองเลอกเขมทมปลายเขมตรงไมคดงอยางซลโคนแบบออนสาหรบอดปลายเขม


ตวอยางแกสทไดจากการเตรยมตวอยางแบบ Purge and trap ตองอยในภาชนะปดสนททไมมรรว และตองเกบตวอยางภายในวนทฉดตวอยาง อปกรณทตองเตรยมมาดวยคอ เขมฉดยาแบบมเขม ตองเลอกเขมทมปลายเขมตรงไมคดงอยางซลโคนแบบออนสาหรบอดปลายเขม ตวอยางแกสทไดจากการเตรยมตวอยางแบบ Headspace เนองจากหองปฏบตการมอปกรณสาหรบฉดตวอยางดวยเทคนค SPME ใหบรการ ผใชจะตองทราบชนดของ SPME fiber ทใชและ condition ในการเตรยมตวอยาง 8.4.2) ตวอยางของเหลว ตวอยางเปนสารประกอบทสามารถระเหยได หรอ ถกเปลยนโครงสรางทางเคมใหอยในรปขององคประกอบทสามารถระเหยไดหองปฏบตการไมรบทดสอบตวอยางทเปน Crude extract เนองจากจะทาใหระบบเกดการปนเปอนละลายตวในตวทาละลายทเหมาะสม ตวทาละลายทนามาใชจะตองเลอกอยางระมดระวง โดยตองคานงถงสงตอไปนคอตองไมทาปฏกรยากบสารทตองการวเคราะหและ Stationary phase ตองละลายสารทตองการวเคราะหไดอยางสมบรณเปนเนอเดยวกนตองไมเกดการ Co-elute กบสารทตองการวเคราะห คอ พค (Peak) ของตวทาละลายทไดตองแยกออกจาก peak ของสารทตองการวเคราะหไดอยางสมบรณตองไมตดคางอยในคอลมนปรมาณของตวทาละลายตองไม Overload columnสารละลายตวอยางตองมปรมาตรไมตากวา 1 มลลตร จดมงหมายของการเตรยมตวอยางคอเพอใหตวอยางอยในรปแบบทเหมาะสมทจะทาการวเคราะหตอไป เชน การทาใหอยในรปสารละลาย เปนตน นอกจากนยงเกยวของกบการเพมความเขมขนและแยกสารในตวอยางออกจากกน เพอใหการวเคราะหทาไดอยางถกตอง มความไวและความจาเพาะสง (High sensitivity & selectivity) เชน การแยกสารทสนใจหาปรมาณ (Analyte) ออกจากสารอนๆ ซงอาจรบกวนการวเคราะห (Interferents) หลกการเตรยมตวอยางมกจะเกยวของกบ 2 วฏภาค เชน การละลายเกยวของกบการเปลยนตวอยางของแขงไปเปนของเหลว (สารละลาย) การสะกดดวยตวทาละลายเกยวของกบของเหลวสองชนดทไมผสมเปนเนอเดยวกน เปนตน อยางไรกตามบางกรณอาจเกยวของกบวฏภาค เดยว เชน การเตมสารเคม Masking agent ลงไปบดบงการรบกวนของสารรบกวน การละลายและยอยสลายตวอยาง 1. ตองเลอกตวทาละลายใหเหมาะสม (Like dissolve like) คาการละลายมกเสนอในหนวยกรมของสารตอ 100 กรมตวทาละลาย - สารอนนทรยอาจลองนามาละลายใน นากรดเจอจางกรดเขมขนกรดผสมดาง ตามลาดบ โดยแตละกรณอาจลองละลายทอณหภมหองกอนถาไมละลายหรอละลายชาอาจอนใหรอนขน สาหรบการละลายในนามหลกควรจางายๆคอ เกลอสวนใหญของธาตหม 1 และเกลอแอมโมเนยม (NH4

+) ละลายไดดในนา เกลอของแอนไอออนไนเตรต (NO3-) ไนไตรต (NO2

-) คลอเรต (ClO3

-) ซลเฟต (SO42-) และอะซเตต (CH3COO-) สวนใหญละลายนาไดด สวนเกลอออกไซด (O2

-) ไฮดรอกไซด (OH-) ซลไฟด (S2

-) ฟลออไรด (F-) สวนใหญไมละลายนา เกลอคารบอเนต (CO32-) ซล

ไฟต (SO32-) ฟอสเฟต(PO4

3-) อารเซเนต (AsO3-) อารเซไนต (AsO2

-) บอเรต (BO32-) ออกซาเลต

(C2O42-) ไมละลายนา แตมกละลายในกรด


- สารอนทรยละลายในตวทาละลายอนทรย เชน คลอโรฟอรม (Chloroform) และ ไดคลอโรมเทน (Dichloromethane) เปนตน 8.5 เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง – แมสสเปกโทรเมตร (High Performance liquid Chromatography–Mass Spectrometry, HPLC - MS)

เทคนคโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมตรเปนการเชอมตอเทคนค โครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง เขากบเทคนคแมสสเปกโทรเมตร เพอใหไดเทคนคการวเคราะหทมประสทธภาพขนเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสงจะสามารถแยกองคประกอบของ สารผสมไดในขณะทเทคนคแมสสเปกโทรเมตร มจดเดนในดานความเฉพาะเจาะจงความวองไวและความรวดเรวในการใหขอมลเกยวกบโครงสรางขององคประกอบทแยกโดยเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง ดงรปท 8.3

รปท 8.3 เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง–แมสสเปกโทรเมตร

(ทมา: OSU State University, 2557)

8.5.1 หลกการและทฤษฎของแมสสเปกโทรเมตร เมอทาใหโมเลกลเกดการสญเสยอเลกตรอนโมเลกลจะกลายเปนไอออนและมประจบวกซงถา

โมเลกลทมประจบวกนมพลงงานสงพอจะเกดการแตกตวออกเปนสวนยอยๆซงอาจเปนอนภาคทเปนกลาง (N) อนภาคทเปนแคตไอออนแรดเคล (A•+) หรอแคตไอออน (A+)

ในทานองเดยวกนถาไอออนยอย (A•+หรอ A+) มพลงงานมากพอกจะเกดการแตกตวตอไปอกเปนไอออนยอยตอไปเรอยๆจนเหลอพลงงานนอยสดทไมสามารถแตกตวตอไปไดอกเมอพจารณาแมสสเปกตรมจะบงบอกถงลกษณะการแตกตวของโมเลกลไอออนหรอรวมรปแบบ การแตกตวของแตละไอออนทงหมดเขาดวยกน จะไดรปแบบการแตกตวของโมเลกลทเปนลกษณะเฉพาะของสารแตละชนดสวนแมสสเปกโทรมเตอร จะเปนเครองมอทใชแยกและวดมวลของไอออนดวยการใชอตราสวนมวลตอประจ (m/z) จงมคาเทากบมวลของไอออนโดยตรง ดงรปท 8.4


รปท 8.4 หลกการทางานของเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมตร

(ทมา: John Dolan, 2557) 8.5.2 องคประกอบของเครองแมสสเปกโทรเมตร

โดยทวไปเครองจะมสวนทสาคญอย 3 สวนดงรปท 8.5 1. แหลงททาใหเกดไอออนไนเซชน (Ionization source) 2. สวนทใชในการวเคราะหมวล (Mass analyzer) 3. สวนทใชในการตรวจวดไอออน (Detector)

รปท 8.5 สวนประกอบพนฐานของแมสสเปกโทรเมตร (ทมา: John Dolan, 2557)

1. แหลงผลตไอออน (Ionization source) แหลงผลตไอออนเปนแหลงททาใหโมเลกลของสารตวอยางเกดเปนไอออนและเกดการแตกตวซงถอเปนหวใจสาคญของเครองแมสสเปกโทรมเตอร ปจจบนมเทคนคการผลตไอออนแบบตางๆใหเลอกมากมายแหลงผลตไอออนทใชกบโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงแตละแบบมหลกการทางานแตกตางกนไปดงตาราง 8.1 Electrospray Ionization (ESI) เปนเทคนคการไอออไนเซชนทความดนบรรยากาศการผลตไอออนดวยเทคนคนเหมาะสาหรบการวเคราะหสารตวอยางซงอยในรปของไอออนในตวทาละลายเชนโปรตน (ซงมกจะเกด Protonation ทหมอะมโนเปน Protonated molecular ion, MH+) เปนตนโดยสารละลายจะถกสงผานโพรบซงเปนทอแคปปลารเลกๆดวยอตรา 10-20 ไมโครลตรตอนาท (หรอในบางระบบอาจสามารถไหลไดสงถง 100 ไมโครลตรตอนาท แตอตราการไหลไมควร


เกน 20 ไมโครลตรตอนาท) สารละลายนจะถกสเปรยออกจากปลายโพรบดวยสนามไฟฟาแรงสง (3-6 kV) ทสงผานทอแคปปลารเลกๆทปลายโพรบนนทาใหบรเวณดงกลาวเกดเปนสนามไฟฟาซงจะทาใหไดหยดละอองทละเอยดมขนาดคอนขางสมาเสมอและมประจบวกหรอลบซงขนอยกบขวของศกยไฟฟาทปลายแคปปลารกบสวนของเคานเตอรอเลกโทรด กรณเลอกวเคราะหสารในรปประจบวกบร เวณปลายแคปปลารจะเกดปฏกรยาออกซเดชนใหประจบวกสวนบรเวณเคานเตอรอเลกโทรดแสดงขวทางไฟฟาเปนลบเกดปฏกรยารดกชนเพราะฉะนนบรเวณเคานเตอรอเลกโทรดกจะเหนยวนาใหประจบวกวงเขาหาถาแรงผลกของประจบวกทบรเวณผวแคปปลารและแรงดงของสนามไฟฟาตอประจบวกสามารถเอาชนะแรงตงผวของของเหลวทออกจากแคปปลารทาใหลกษณะของหยดของเหลวทออกจากปลายแคปปลารมลกษณะเปน Taylor Cone ตารางท 8.1 เทคนคไอออนไนเซชนแบบตางๆ หลกการทางานและประเภทของสารตวอยาง

เทคนค หลกการทางาน สารตวอยางทนยมใช FI (Field Ionization) ควอนตมทนเนลลงของอเลกตรอน

อนเ กด จากการท โ ม เ ล กลสารตวอยางถกแรงกระทาจากสนามไฟฟาแรงสง

สารทงายตอการแตกตวนาหนกโมเลกลในชวง 600-1,200 อาทสารมขวเชนเปปไทดโอลโกแซกคาไ ร ด ส า ร ส ก ด จ า ก ผ ล ต ภ ณ ฑธรรมชาตตางๆสารไม มข ว เชนไฮโดรคารบอน

FAB (Fast Atom Bombardment)

อะตอมพลงงานสง เชน Xe หรอ Ar วงเขาชนสารตวอยาง

สารท มความดนไอตางๆนาหนกโมเลกลสงไดถงประมาณ 6,000 เชนโอลโกนวคลโอไทดโอลโกแซกคาไรดเปปไทดและไฮโดรคารบอนโมเลกลใหญๆ

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)

เมทรกซดดกลนพลงงานจากแสงเลเซอรทยงไปแลวถายพลงงานใหกบสารตวอยาง

โปรตนคารโบไฮเดรต DNA RNA พอลเมอรสงเคราะห

ESI (Electrospray Ionization) เกด Ion evaporation จากการทสารละลายของสารตวอยางถกพนเปนละอองฝอยดวยการใหกระแสไฟฟาแรงสงแกปลายโพรบทนาสารละลาย

สารทมขวทแตกตวไดงายนยมใชโปรตนทมนาหนกโมเลกลสงมากๆไดไมจากดเนองจากสารเกดไอออนทมประจสงๆไดด

ทมา: John Dolan, 2557


ตารางท 8.1 เทคนคไอออนไนเซชนแบบตางๆ หลกการทางานและประเภทของสารตวอยาง (ตอ)

เทคนค หลกการทางาน สารตวอยางทนยมใช TS (Thermospray) เกด Ion evaporation จาก

ละอองของสารละลายท ม สารตวอยางอยภายในหองทมความดนตางๆ

สารมขวทสามารถเกดไอออนไดเมออยในรปสารละลาย

PS (Plasmaspray) เชนเดยวกบ TS แตมการใชเขมอเลกโทรดทมศกยไฟฟาสงๆชวยในการไอออไนซสารตวอยาง

สารทมขวและไมมขว

ICP (Inductively Coupled Plasma)

พลงงานความรอนจากพลาสมาทาใหสารตวอยางแตกสลายกลายเปนไอออนของอะตอม (Atomic ion)

ธาตและไอโซโทปวเคราะหสารทปรมาณนอย

Glow Discharge กลมแกสรอนเกดการแตกตวเปนไอออนภายใตสนามไฟฟาแรงสง

โลหะโลหะผสมสารท เปนตวนาไฟฟา

ทมา: John Dolan, 2557 เมอเกด Charged droplets ซงในขนแรกจะไดเปนหยดของเหลวขนาดใหญภายในหยดของเหลวดงกลาวมจานวนประจอยเปนจานวนมากแตเนองจากภายในระบบของโพรบมการผานแกสไนโตรเจนซงทาหนาทเปนแกสเนบไลเซอร ทาใหตวทาละลายระเหยออกไปมผลใหขนาดของ droplets มขนาดเลกลงเรอยๆแตจานวนประจยงคงเทาเดมทาใหเกดการผลกกนของประจทอยกนอยางหนาแนนเพราะขนาดของ Droplets เลกลงซง Coulombic force สามารถเอาชนะ Surface tension ของของเหลวไดกระบวนการนจะเปนวฏจกร จนกระทงภายใน Charged droplets มประจเพยงแคประจเดยวเกดกระบวนการ Ion evaporation อยางรวดเรวจนในทสดไดเปนไอออนของสารตวอยางในสภาวะแกสซงจะถกชกนาดวย Ion optic ใหเขาสสวนวเคราะหมวลตอไป รป ESI จะใชไดผลดกตอเมอสารตวอยางอยในรปไอออนในสารละลายอยแลวการเตรยมสารตวอยางทอยในรปไอออนสามารถทาโดยปฏกรยาทางเคมงายๆเชนการใชตวทาละลายทมกรดแอซตกหรอฟอรมคอยประมาณ 1-5 % เปนตวใหโปรตอนแกสารตวอยางหรอการใชตวทาละลายหรอสารทเปนตวรบอเลกตรอนจะชวยวเคราะหสารทเปนตวจายอเลกตรอนไดดตวอยางเชนการใช 2,3-dicyano-1,4-bezoquinone ชวยเพมประสทธภาพการวเคราะห 2,3-benzanthracene เปนตนการเกด ion evaporation อนจะนาไปส MH+ ในสภาวะแกสจะเกดไดดตอเมอสารละลายสามารถถกสเปรยใหเปนฝอยทละเอยดไดซงนนหมายถงการเลอกใชตวทาละลายทมแรงตงผวตางๆ นาบรสทธทมแรงตงผวคอนขางสงจงไมใชตวทาละลายทดของเทคนค ESI แตหากมการผสมสารละลายอนทรยทมแรงตงผวตาง ๆ อยางเชน เอทานอล เมทานอล ไอโซโพรพานอล อะซโตไนไตรล อะซโตน และอนๆ กบนากจะเปนทนยมในเทคนค ESI มากกวาเนองจากตวทาละลายทมแรงตงผวสง จะถกสเปรยใหเปนละอองฝอยไดยากกวาพวกทมแรงตงผวตางดงนนคาความตางศกย


ทใหระหวางปลายแคปปลารกบเคารเตอรอเลกโทรด จงมกถกปรบใหสงขนในกรณทใชตวทาละลายทมแรงตงผวสงๆเพอเพมความหนาแนนของประจในหยดละอองของสาร 2. สวนวเคราะหมวล (Mass Analyzer) การแยกไอออนกระทาไดโดยอาศยความแตกตางของมวลตอประจจากการใชสนามแมเหลก หรอสนามไฟฟาอยางใดอยางหนง หรอทงสองอยางรวมกนกได เครองแยกไอออนจะมหลายชนด เชน Magnetic-sector analyzer, Electrostatic analyzer, Time-of-flight analyzer, ion cyclotron resonance analyzer ดเทคเตอรทใชในการทดลองน คอ Quadrupole mass spectrometer การแยกไอออนทาไดโดย ใหลาไอออนผานศนยกลางของแทงโลหะกลมทขนานกนสแทงทมการใหความตางศกยทงแบบกระแสตรงและกระแสสลบพรอมๆ กนทาใหไดสนามแมเหลกไฟฟาททาใหไอออนเกดการสน ใหลาไอออนผานศนยกลางของแทงโลหะกลมทงสโดยไอออนทมมวลตอประจอนหนงจะเกดการสนทเสถยรออกไปสตววดสญญาณ สวนไอออนอนทมมวลตอประจตางไปทาใหเกดการชนกบแทงโลหะประจจะถกทาลายไป 3. สวนตรวจวด (Detector) สวนตรวจวดเปนอปกรณททาหนาทตรวจวดไอออน โดยผานกลไกของการทาใหเกดเปนสญญาณในรปแบบใดรปแบบหนง เชน สญญาณไฟฟา ขนจากการตกกระทบของไอออนนนๆ สวนตรวจวดทใชทวไปในเครองแมสสเปกโทรมเตอรมหลายอยาง แตทนยมใชกนมากคออเลกตรอน มลตพลายเออรดเทคเตอร (Electron multiplier detector) ตวอยางงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพดวยเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง การวเคราะหชนดและปรมาณนาตาลในนาตาลทยอยสลายจากชานออยและนาออย เชน กลโครส ซโครส ไซโลส อะราบโนส ฟรกโตส (Kaewnaree, 2014) การวเคราะหชนดและปรมาณกรดอะมโนในกระเพาะทยอยสลายโปรตน เปนตน 8.6 สรปประจาบท

โครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง (High Performance Liquid Chromatography)หรอทนยมเรยกกนวา HPLC เปนโครมาโทกราฟรปแบบหนงทใชแยกสารผสมโดยอาศยวฏภาค ( Phase) สองวฏภาค โดยทวฏภาคหนงอยกบท เรยกวา วฏภาคคงท (Stationary phase) ซงอาจจะเปนของแขงหรอของเหลวกได และอกวฏภาคหนงเปนของเหลวททาหนาทพาสารเคลอนทผาน วฏภาคคงทในคอลมน เรยกวา วฏภาคเคลอนท (Mobile phase) ซงเคลอนทโดยอาศยแรงดนจากเครองสบแรงดนสง (High pressure pump) ตลอดระยะเวลาทกระบวนการแยกสารดาเนนไปอย

เทคนคโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมตร เปนการเชอมตอเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงเขากบเทคนคแมสสเปกโทรเมตร เพอใหไดเทคนคการวเคราะหทมประสทธภาพขนแมนยา เทคนคโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสงจะสามารถแยกองคประกอบของสารผสมได ในขณะทเทคนคแมสสเปกโทรเมทรมจดเดนในดานความเฉพาะเจาะจงความวองไวและความรวดเรวในการใหขอมลเกยวกบโครงสรางขององคประกอบทแยกโดยเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง



1. จากรป จงบอกสวนประกอบของเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงแตละสวนมหนาทอยางไร

A คอ............................................................................................. B คอ............................................................................................. C คอ............................................................................................. D คอ.............................................................................................

E คอ............................................................................................. F คอ............................................................................................. G คอ............................................................................................. 2. จงอธบายหลกการวเคราะหสารดวยเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง 3. เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงมสวนประกอบหลกใดทใชในการแยกสารและตรวจสอบชนดและปรมาณสาร 4. จงยกตงอยางดเทคเตอรสาหรบเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงมา 3 ชนด 5. จงยกตวอยางสารทวเคราะหดวยเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงมา 3 ชนด 6. จากรป จงบอกสวนประกอบของเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมตร


A คอ............................................................................................. B คอ............................................................................................. C คอ............................................................................................. D คอ.............................................................................................

E คอ............................................................................................. 7. จงอธบายหลกการทางานของเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมตร 8. อปกรณหลกของเครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมตรประกอบดวยอะไรบาง 9. จงบอกความหมายของ Electrospray Ionization (ESI) คออะไร 10. วเคราะหชนดและปรมาณสารโดยโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงไดอยางไร

D






พฒนา เหลาไพบลย. และอลศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตบตการในกระบวนการวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.

แมน อมรสทธ. และอมร เพชรสม. (2535). Principles and Techniques of Instrumental Analysis. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย.

John Dolan. (2557). หลกการทางานของเครองเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมตร. http://www.sepscience.com/Techniques/LC/Articles/695-/HPLC-Solutions-5-LC-MS-Calibration-vs-Tuning สบคนเมอ 11 ตลาคม 2557


OSU State University. (2557). เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง–แมสสเปกโตรโฟโตเมตร. คนเมอ 9 ตลาคม 2557. http://fses.oregonstate.edu/HPLCMS

แผนบรหารการสอนประจาบทท 9 แกสโครมาโทกราฟ

หวขอเนอหา 9.1 หลกการและทฤษฎพนฐานของแกสโครมาโทกราฟ 9.2 อปกรณหลกในเครองแกสโครมาโตกราฟ 9.3 การวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ 9.3.1 การใชสารละลายมาตรฐานภายนอก 9.3.2 การใชสารละลายมาตรฐานภายใน 9.4 เทคนคในการวเคราะหแกสโครมาโทกราฟ 9.4.1 Head space 9.4.2 Solid phase microextraction (SPME) 9.5 แกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรเมตร 9.5.1 หลกการทางานในสวนของเครองแกสโครมาโทกราฟ–แมสสเปกโทรเมตร 9.5.2 แมสสเปกโทรมเตอร 9.5.3 องคประกอบสาคญแมสสเปกโทรมเตอร 9.6 สรปประจาบท แบบฝกหดทายบท เอกสารอางอง วตถประสงคเชงพฤตกรรม

เมอเรยนจบบทนแลวผเรยนควรมความรและทกษะดงน 1. มความรความเขาใจเกยวกบหลกการและทฤษฎพนฐานของแกสโครมาโทกราฟ และ แกสโครมาโทกราฟ – แมสสเปกโทรโฟโตเมตร 2. อธบายความหมายของแกสโครมาโทกราฟได 3. มทกษะในการวเคราะหกลมสารดวยแกสโครมาโทกราฟ

4. บอกกลมสารทวเคราะหดวยเครองแกสโครมาโทกราฟ และแกสโครมาโท กราฟ – แมสสเปกโทรโฟโตเมตร

5. ตรวจสอบชนดและปรมาณของสารโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสงได 6. นาหลกการวเคราะหสารดวยแกสโครมาโทกราฟไปใชในงานวเคราะหสารในตวอยางทาง เทคโนโลยชวภาพได


1. ชแจงวตถประสงคและเนอหาประจาบท 2. ทบทวนเนอหาทเรยนมาของสปดาหกอน


3. นาเขาสบทเรยนเนอหาทจะเรยนในสปดาหน 4. บรรยายเนอหาประกอบสออเลกทรอนกสโดยการบรรยายประกอบเอกสารประกอบการ


เตรยมอปกรณและเครองมอตางๆ ตามใบงานทไดมอบหมายและกาหนดวนสงรายงาน 8. มอบหมายใหผเรยนทาแบบฝกหดทายบทเปนการบานและกาหนดวนสง 9. ชแจงหวขอทจะเรยนในครงตอไปเพอใหผเรยนไปศกษากอนลวงหนา 10. เสรมสรางคณธรรมและจรยธรรมใหกบนกศกษากอนเลกเรยน


1. เอกสารประกอบการสอนรายวชาเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 2. สอเอกสารประกอบการสอนอเลกทรอนกส 3. เครองคอมพวเตอรและโปรเจคเตอร 4. แผนโปรงใสและเครองฉายภาพ 5. เครองแกสโครมาโทกราฟ 6. กระดานและปากกาอเลกทรอนกส 7. ใบงาน 8. แบบฝกปฏบตการ



บทท 9 แกสโครมาโทกราฟ

แกสโครมาโทกราฟ (Gas Chromatography; GC) เปนเทคนคอกชนดหนงทใชสาหรบแยก

สารผสม ซงคลายกบลควดโครมาโทกราฟ (LC) แตเทคนคนใชแยกสารทสามารถเปลยนใหแกสไดทเฟสทไดทอณหภมหนง (ไมเกน 450°C) ถาสารใดเปลยนใหเปนแกสยาก กอาจใชเทคนคอนๆ บางอยางเขาชวย เชน อาศยปฏกรยาเคมเปลยนเปนอนพนธอนๆ หรออาจใชหลกการแยกสลายดวยความรอน (Pyrolysis) เมอสารนนถกเปลยนใหอยในเเกสเฟสแลว ใหสารเหลานนเขาไปยงคอลมนทบรรจเฟสคงท (Stationary phase) โดยอาศยการพาไปของเฟสเคลอนท (Mobile phase) หรอ Carrier gas สารผสมเหลานนจะเกดการแยกขน

รปท 9.1 แกสโครมาโทกราฟ (Gas Chromatography, GC)

ทาหนาทในการแยกองคประกอบของสารทสามารถระเหยกลายเปนไอ (Volatile organic

compounds) ไดเมอถกความรอน กลไกทใชในการแยกองคประกอบตางๆ ในสารตวอยางอาศยหลกของความชอบทแตกตางกนขององคประกอบในตวอยางทมตอเฟส 2 คอ Stationary phase และ Mobile phase (พฒนา เหลาไพบลย และอลศรา ศรวฒนา, 2536; บณฑต สละศาสตร และธรพล วงศชนะพบลย, 2539; แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535)

9.1 หลกการและทฤษฎพนฐานของแกสโครมาโทกราฟ หลกการของเครองแกสโครมาโทรกราฟ ใชเทคนคการแยกองคประกอบของสารผสม โดย

อาศยความแตกตางของอตราการเคลอนทของแตละองคประกอบของสารผสมบนเฟสคงท (Stationary phase) ภายใตการพาของเฟสเคลอนท (Mobile phase) สาหรบเครอง GC เฟสคงท คอ สารทอยภายในคอลมน สวนเฟสเคลอนท คอ แกสฮเลยม เมอสารทตองการวเคราะหผานเขาส

190 บทท 9 แกสโครมาโทกราฟ เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

เครอง GC สารดงกลาวจะถกเปลยนสถานะจากของเหลว (Liquid) เปนแกส (Gas) และสวนแกสของสารผสมจะถกพาเขาสคอลมนโดยแกสฮ เลยม ซ งภายในคอลมนจะเกดการแยกสารผสม (Separation) โดยอาศยการทาปฏกรยา (Interaction) ระหวางสารทอยภายในคอลมน (Stationary phase) และสารผสม

รปท 9.2 สวนประกอบพนฐานของ GC (ทมา: พฒนา เหลาไพบลย, 2548)

9.2 อปกรณหลกในเครองแกสโครมาโทกราฟ

1. ชองฉดสาร (Injector) คอ สวนทสารตวอยางจะถกฉดเขาสเครองและระเหยเปนไอกอนทจะเขาสคอลมน อณหภมทเหมาะสมของชองฉดสารควรเปนอณหภมทสงพอทจะทาใหสารตวอยางสามารถระเหยกลายเปนไอได แตตองไมทาใหสารตวอยางเสยสภาพ

2. เตาควบคมอณหภม (Oven) คอ สวนทใชสาหรบบรรจคอลมนและเปนสวนทควบคมอณหภมทเหมาะสมของ คอลมนใหเปลยนไปตามความเหมาะสมกบสารทตองการวเคราะห ซง การควบคมอณหภมของเตาควบคมอณหภม นนม 2 แบบ คอ

- แบบอณหภมเดยว (Isocratic Temperature) - แบบหลายอณหภมหรอแบบโปรแกรมอณหภม (Gradient Temperature) ขอดของการแบบหลายอณหภม คอ สามารถใชกบสารตวอยางทมจดเดอดกวาง (Wide

boiling range) และยงชวยลดเวลาในการวเคราะห 3. คอลมน (Column) ทใชในกาซโครมาโทกราฟม 2 ชนด 1) แพคคอลมน (Packed column) คอลมนชนดนมทงแบบททาดวยแกวและทาดวย

โลหะมลกษณะเปนหลอดทมเสนผาศนยกลางภายในประมาณ 1 ถง 8 mm มความยาวไดตงแต 2 ถง 20 m ถามความยาวมากๆ หลอดคอลมนจะถกขดเปนวงกลม (Coil) เพอใหบรรจภายในเตาควบคมอณหภมได

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บทท 9 แกสโครมาโทกราฟ 191

รปท 9.3 แพคคอลมน (Packed column)

2) คาปลาร (Capillary column) คอลมนชนดนใชไดเฉพาะการวเคราะหแบบแกสลควโครมาโทกราฟ (GLC) เทานน ความยาวของคอลมนมคามากตงแต 10 ถง 100 เมตร หรอมากกวาขนาดเสนผาศนยกลางภายในประมาณ 0.2 ถง 0.5 มลลเมตร คอลมนคาปลลารสวนใหญหรอเกอบทงหมดทาดวยหลอดแกวเหตผลทไมใชโลหะเพราะโลหะสามารถเปนตวเรงปฏกรยาเคมไดหลายชนดและเมอภายในคอลมนตองใชอณหภมสงอาจทาใหโลหะเกดปฏกรยาบางอยางในคอลมนไดตามปกตอณหภมของคอลมนตองสงกวาจดเดอดของสารตวอยาง 10 ถง 25 oC การใชคาปลลารคอลมนในการทา GLC ไมตองใชของแขงซบพอท (Solid support) วธเตรยมคอลมนทาไดโดยใชของเหลวซงเปนเฟสอยกบทใสในคาปลลารคอลมนของเหลวนนจะฉาบทผวของคอลมนเปนฟลมบางๆทมความหนานอยกวา 1 ไมโครเมตร ความหนาของแผนฟลมของเหลวนนจะมผลตอการแยกดวยคอลมนชนดนมประสทธภาพในการแยกสงกวาแพคคอลมน ถง 100 เทา และสามารถใชกบขนาดของสารตวอยางทนอยกวา 0.01 ไมโครเมตร ความจของคอลมนคาปลลารสามารถเพมขนไดโดยฉาบผวของคอลมนแกวดวยวสดทมรพรนเชนแกรไฟต, โลหะออกไซดและซลเกตเสยกอนใหมลกษณะเปนแผนเยอบาง (Thin layer) ซงจะทาใหพนทผวทจะใหของเหลวมาฉาบอยมมากขนเปนการเพมความจของคอลมนการใชคอลมนคาปลลารพบวาผลของการลดลงของความดน (Pressure drop) เกดขนนอยมากจนตดทงไดคอสามารถคดคา j = 1 คาอตราสวน mSV/ V ของคอลมนชนดนมคาในชวง 100 ถง 300 ซงอยในชวงทมประสทธภาพสงสด เพราะมเพลตตามทฤษฎมากมายหลายพนเพลต


รปท 9.4 คาปลารคอลมน (Capillary column) มเสนผาศนยกลาง 0.25 มลลเมตร ความยาว 30 เมตร และความหนาของสารเคลอบ 0.25 ไมโครเมตร

จากการพจารณาชนดของคอลมนทใชในการทดลองและวสดทบรรจภายในคอลมนสรปไดวาวสดทบรรจอยในคอลมนม 3 ชนด คอ ของแขงททาหนาทเปนเฟสอยกบท ของแขงซพพอรท และของเหลว ททาหนาทเปนเฟสอยกบทโดยมรายละเอยดดงน - ของแขงททาหนาทเปนเฟสอยกบท (Stationary solid phase) ของแขงชนดนใชเฉพาะแพคคอลมน เทานนซงนาไปใชกบการวเคราะหทเรยกวา แกสโซลดโครมาโทกราฟ (GSC) คาสมประสทธของการกระจายของกาซสารตวอยางระหวาเฟสของกาซทเคลอนทกบเฟสของแขงทอยกบทมคาสงมากเมอเทยบกบการใชเฟสอยกบทเปนของเหลว - ของแขงซพพอรท (Solid supports) วสดชนดนใชกบการวเคราะหแบบ GLC เทานนมหนาทชวยทาใหของเหลวซงเปนเฟสอยกบทถกยดอยในคอลมนไดและทาใหเฟสอยกบทหรอของเหลวนนมโครงสรางทางกายภาพทเหมาะสม ของแขงซพพอรทตองเปนสารทเสถยร ณ อณหภมของคอลมนทใชในการทดลองจะตองมขนาดทเหมาะสมและสมาเสมอ ของแขงซพพอรททใชสวนใหญไดมาจาก Diatomaceous earths (SiO2) ซงประกอบดวยหมของ Hydrated silica มวธการอยหลายวธทจะทาให Diatomaceous earths กลายเปนของแขงซพพอรททด ถานา Diatomaceous earth มาเผาทอณหภมประมาณ 900 ๐C จะไดสารของแขงสชมพ ซงมชอเรยกกนวา โครโมซอบ พ (Chromosorb P) โครโมซอบ พ สามารถมกลมฟงกชนนอลเปนโพลารไดทาใหสามารถใชเปนของแขงดดซบใน GSC ไดดวย ถาไมนามาฉาบดวยของเหลวแตเนองจากหลงจากทโครโมซอบ ดดซบสารตวอยางแลวความสามารถในการชะ ไมดพอจงตองใชของเหลวฉาบบนโครโมซอบอกทหนงจงจะทาใหการชะเกดไดด ทาใหโครโมซอบมหนาทเพยงเปนของแขงซพพอรท ความสามารถในการดดซบจงขนอยกบของเหลวทมาฉาบ สาหรบชอโครโมซอบชนดตางๆ นนเปนชอทางการคา (Trade name) ของบรษทผผลต ถา Diatomaceous earth ถกนามาเผาโดยมโซเดยมคารบอเนตผสมอย จะไดของแขงสขาวทเรยกวา โครโมซอบดบบลว (Chromosorb W) ถานา Diatomaceous earth มาทาดวยวธการ


อนๆ จะไดของแขงซพพอรทชนดอนๆ อก เชน โครโมซอบ เอ (Chromosorb A) และโครโมซอบ จ (Chromosorb G) โครโมซอบชนดตางๆ ทนามาใชยงมอกหลายเกรดขนอยกบขนาดเมชของมนปกตมคาอยในชวง 30/50 ถง 80/100 เมช ขนาดทนยมใชกนมากทสดคอ 30/60 และ 60/80 เมช - ของเหลวททาหนาทเปนเฟสอยกบท (Stationary liquid phase) ของเหลวนมชอเรยกอกอยางหนงวา ซบสเตรต (Substrate) เปนของเหลวทมจดเดอดสงใชฉาบบนของแขงซพพอรท ซงใชบรรจใน Packed column หรอฉาบทผวของคอลมนคาปลลารในการทา GLC ของเหลวทสามารถใชเปนซบเตรตได มหลายรอยชนดสาหรบตวทนยมใชและใชกนมากได 1. เปนตวทาละลายทมคณสมบตทเหมาะสมสาหรบองคประกอบทตองการวเคราะห เชนมโพลารตเหมอนกบสารตวอยาง 2. ตองทาใหเกดการแบงสวนทแตกตางกนของแตละองคประกอบในสารตวอยางระหวางเฟสทงสอง

3. เสถยรทอณหภมสงๆ 4. มความดนไอทอณหภมภายในคอลมนตา

5. ไมทาปฏกรยาทางเคมกบสารตวอยาง การเตรยมคอลมน (Column preparation) การเตรยมคอลมนสาหรบ GSC ใหใชของแขง ซงเปนตวดดซบบรรจในคอลมนไดเลย แตถาเปนการเตรยมคอลมนสาหรบ GLC ตองนาของแขงซพพอรทมาฉาบดวยเฟสของเหลวกอน โดยมวธการทาดงน คอ ขนแรก ใหเลอกขนาดของของแขงใหมขนาดเหมาะสมและเทากนหมด จากนนนาของเหลวละลายในตวทาละลายทระเหยงาย เมอเตรยมของแขงพรอมทบรรจลงในคอลมนไดแลว (ตวดดซบ หรอของแขงซพพอรท ทมของเหลวอย) ใหบรรจของแขงนนลงในคอลมนทมลกษณะเปนเสนตรง ซงทาดวยแกวหรอเหลกสเตนเลส หรอทองแดง หรออะลมเนยม วธการบรรจใหคอยๆ ใสของแขงอยางชาๆ ลงในคอลมนตองใชเครองเขยาเบาๆ ชวยเพอใหของแขงถกบรรจไดแนน และเปนระเบยบปราศจากฟองอากาศเมอบรรจเสรจเรยบรอยแลว จงคอยขดหลอดคอลมนใหเปนรปวงกลมหรอรปตวย (U) ตามความเหมาะสมเพอใหสามารถใสลงในเตาไดคอลมนทไดรบการเตรยมอยาง ดสามารถใชในการวเคราะหไดหลายรอยครงในทางการคามคอลมนทบรรจสาเรจแลวไวขายหลายชนดสามารถหาซอมาใชใหตรงกบงานได ไมวาจะเปนการเตรยมคอลมนขนใชเอง หรอซอมาใชการพจารณาเลอกใชคอลมนตองคานงถงสงตอไปนคอ 1. ความยาวและเสนผาศนยกลางของคอลมนเพราะการแยกสารจะเกดไดดหรอไมขนอยกบความยาวและเสนผาศนยกลางของคอลมน 2. เฟสอยกบททเปนของแขงหรอของเหลวหลกการของการเลอกใชควรใหสารเคมทเลอกมโครงสรางทางเคมคลายกบสารตวอยาง เชน ถาสารตวอยางเปนโพลาร (Polar) กควรเลอกใชเฟสอยกบทของแขงหรอของเหลวทเปนโพลารเหมอนกน ดงนนในการเลอกใชตองมการศกษาถงคณสมบตของสารตวอยางและเฟสอยกบทใหดกอนดวย 3. อณหภมทใชสาหรบคอลมนคอลมนทใชจะถกบรรจอยในเตาควบคมอณหภม (Oven) ทสามารถควบคมอณหภมไดเพอทาใหคอลมนมความรอนสงพอทจะทาใหสารตวอยางกลายเปนไออย


ตลอดเวลา อณหภมทใชตองไมสงเกนไปจนทาใหเฟสของเหลวกลายเปนไอปกต อณหภมทใชจะตากวาสวนของระบบฉดสารตวอยาง (Sample injection system) ประมาณ 10 ๐C อณหภมของคอลมนจะมผลตอคารเทนชน และการแยกอยางมาก ทอณหภมสงจะมผลทาใหไอของสารตวอยางสวนใหญอยในเฟสของกาซเพราะการเพมอณหภมจะทาใหการละลายของสารตวอยางในเฟสอยกบทลดลงจงทาใหสารตวอยางถกชะไดอยางรวดเรว ถามสารผสมอยหลายตวกจะทาใหสารเหลานนถกชะออกจากคอลมนไดในเวลาไลเลยกน การแยกจะเกดขนไมด (Poor resolution) แตถาใชอณหภมตาสารตวอยางจะใชเวลาสวนใหญอยในเฟสอยกบท วธการควบคมอณหภมของคอลมนทใชไดผลดอกแบบหนง คอ ใชวธการควบคมอณหภมใหคงทชวงหนงสลบกบการโปรแกรมเพมอณหภม ซงมวธการทาดงน คอ เมอเรมตนฉดสารตวอยางเขาไปในคอลมนจะควบคมอณหภมใหคงท ในชวงระยะเวลาหนงตามความเหมาะสมตอจากนนใหโปรแกรมอณหภมใหเพมขน 5 ๐C ทกๆ 1 นาท (อาจใช 4 ๐C ทกๆ 1 นาท หรออนๆ กไดแลวแตความเหมาะสม) จนอณหภมถงคาตามตองการจากนนทาใหอณหภมคงทอกชวงระยะเวลาหนง แลวโปรแกรมอณหภมใหเพมขนอกทาแบบนสลบกนไปเรอยๆ จนสามารถชะสารไดหมดตามตองการวธการนเหมาะสาหรบใชแยกสารผสมหลายๆ แบบทงทมรเทนชนไทม ใกลๆ กน และทหางๆ กนผสมกนเพราะถาใชวธการควบคมอณหภมใหคงท เพยงอยางเดยวจะใชเวลานาน และพคของสาร ตวสดทายทไดจะกวาง หรอถาใชวธโปรแกรมอณหภมเพยงอยางเดยวอาจทาใหสารทมรเทนชนไทมใกลกนมากๆ ออกมาเปนพคเดยวกนได

4. ดเทคเตอร (Detector) ดเทคเตอรเปรยบเสมอนสมองของเครองกาซโครมาโตกราฟทาหนาทตรวจสอบสารทออก

จากคอลมนว ามปรมาณมากนอยเท าไร ดง นนด เทคเตอรท ใชตอง ไวตอสารมาก และม Reproducibility ดวยถาพจารณาการทางานของเครองดเทคเตอรสามารถแบงไดเปน 2 แบบ คอ

1) เมอสารตวอยางออกจากคอลมนแลวเขาเครองดเทคเตอรทสามารถวดปรมาณไดโดยตรง

2) เมอสารตวอยางออกจากคอลมนเขาเครองดเทคเตอรดเทคเตอรจะทาหนาทตรวจวดขนาดแลวเปลยนไปเปนสญญาณไฟฟาสงไปยงเครองบนทก ชนดของดเทคเตอรแบบท 1 ไดแก Automatic Recording Buret เครองดเทคเตอรน คดคนโดย James และ Martin (ค.ศ. 1952) ใชเฉพาะไอสารทเปนกรด หรอเบสไอของสาร ทระเหยออกมาจะดดซมเขาไปในตเตรชนเซลลและถกตเตรตโดยอตโนมต ไนโตรมเตอร (Nitrometer) นามาใชโดย Janak (ค.ศ. 1953) เครองนใชไดเฉพาะการใชกาซคารบอนไดออกไซดเปนตวพาเทานนเมอกาซคารบอนไดออกไซดพาสาร Infrared Analyzer วธนแนะนาโดย Martin และ Smart (ค.ศ. 1955) ไอของสารตวอยางทตองการวเคราะหสามารถดดกลนแสงอนฟราเรดไดแตกตางกนตามปรมาณและชนดของสาร ดง นนไอของสารท ออกจากคอลมนจงสามารถนาไป วเคราะหตอโดยว ธ Infrared Spectrophotometry


แมสสเปกโทรมเตอร (Mass spectrometer) องคประกอบทออกจากคอลมนในการทากาซโครมาโตกราฟสามารถนาไปวเคราะหตอโดยใชเครองมอแมสสเปกโทรมเตอร ซงทาใหสามารถพสจนหรอทานายชนดขององคประกอบตางๆไดดเปนเทคนคทนยมใชกนมากเพราะไดผลดนอกจากนอาจใชเครองมอของทางสเปคโตรสโคปกชนดอนๆเปนดเทคเตอรไดโดยนาเครองมอนนมาตอเขากบคอลมนของกาซโครมาโตกราฟ เชน อะตอมมกแอบซอรพชน (Atomic absorption), อมสชนอนดคทฟพลาสมา (Emission in an inductively coupled plasma (ICP), นวเคลยรแมกเนตก เรโซแนนซ (Neuclear magnetic resonance; NMR) และ เอกซเรยแอบซอรพชน (X-Ray absorption) หรออาจใชเครองดเทคเตอรทวดคณสมบตทางไฟฟาของสารทออกมาจากคอลมน เชนคอนดกโตเมตรกดเทคเตอร (Conductometric detector), คลอมเมตรกดเทคเตอร (Coulometric detector) หรอใชเครองดเทคเตอรท วดกมมนตภาพรงสทเรยกวาเรดโอเคมคลดเทคเตอร (Radiochemical detector) กได ชนดของเครองดเทคเตอรแบบท 2 ไดแก 1) ไฮโดรเจนเฟลมดเทคเตอร (Hydrogen flame detector; HFD) ตองใชกาซไฮโดรเจนหรอสวนผสมของกาซไฮโดรเจนกบกาซอนเปนตวพาดเทคเตอรชนดนเปนชนดทงายและธรรมดาทสด

รปท 9.5 Hydrogen flame detector (HFD)


กาซไฮโดรเจนทเปนตวพาเมอผานออกจากคอลมนจะเปนตวททาใหเกดเปลวไฟขน โดยทไฮโดรเจนจะถกเผาผลาญแลวใหเปลวไฟทไมมส เมอใสสารตวอยางซงเปนสารอนทรยเขาไปในคอลมนจะถกกาซไฮโดรเจนซงใชเปนตวพาเขาไปยงเปลวไฟ จะมผลทาใหเปลวไฟเกดสเหลองเนองจากเกดการเผาผลาญสารอนทรย เมอเกดเปลวไฟสเหลองขนเรากทราบไดทนทวาสารอนทรยถกชะออกจากคอลมนแลว อาจใชนาฬกาจบเวลาเมอเกดเปลวไฟสเหลองขนจะทาใหทราบวา คารเทนชนไทม ไดสาหรบปรมาณของสารอนทรยทถกชะออกมา จะมผลทาใหเปลวไฟสเหลองทเกดขนมขนาดสงหรอตา ถาปรมาณสารมมากเปลวไฟทไดจะสง และถาปรมาณสารมนอยเปลวไฟจะตา หรอใหแสงทโชตชวงตางกน ดงนนถาสามารถวดความรอนแรงของเปลวทเกดขนหรอวด


ความเขมของแสงทเกดขนไดกสามารถหาปรมาณของสารตวอยางอนทรยได เพราะปรมาณของสารจะสมพนธโดยตรงกบความรอนแรงของเปลวไฟหรอความเขมของเปลวไฟดงนนเราสามารถใชเทอรโมคพเพล (Thermocouple) วดความรอนแรงของเปลวไฟ หรอใชโฟโตเซลล (Photo cell) วดความเขมของเปลวไฟ 2) เฟลมไอออไนเซชนดเทคเตอร (Flame ionization detector; FID) เนองจากสารประกอบอนทรยทกตวสามารถเกดการไอออไนซ (Ionization) ไดในเปลวไฟทาใหเกดกระแสของไอออนทสามารถสะสมอยระหวางขวทมประจตรงขาม 2 ขว ไดตามปรมาณของไอออนกระแสทเกดขนนยงมปรมาณนอยตองใชเครองอเลกทรอนกสทซบซอนขน เพอขยายใหมปรมาณกระแสไฟฟามากขนดงนน ดเทคเตอรชนดนจงมราคาแพงพอสมควร

รปท 9.6 Flame ionization detector (FID) (ทมา: Stoog et al., 2014)

เครองดเทคเตอรชนด FID สามารถตรวจวดสารตวอยางอนทรยทระเหยกลายเปนไอไดเกอบทกชนดยกเวนสารประกอบทถกออกซไดซมาแลวเชน Carbonyl และ Carboxyl group สารประกอบอนนทรยไมสามารถตรวจสอบดวยดเทคเตอรชนดนได 3) เทอรมลคอนดกตวตดเทคเตอร (Thermal conductivity detector; TCD) เทอรมลคอนดกตวตดเทคเตอรประกอบดวยใยเสนลวด (Filament) ททนความรอนอยตรงกลางหลอดเลกๆหรอแทงโลหะทกาซตองผานเขาไปใยเสนลวดจะถกทาใหรอนดวยกระแสไฟฟาเมอผานสารทถกแยกพรอมกาซตวพาไปยงเสนลวดมนจะเปนตวนาความรอนออกจากใยเสนลวดทาใหความรอนของใยเสนลวดเปลยนแปลงเมอปรบความรอนของใยเสนลวดใหเทาเดมโดยปรบความตานทานของวงจรไฟฟา


จะทาใหเกดสญญาณสงเขาเครองบนทกผล (Recorder) ซงขนาดของสญญาณจะสมพนธกบปรมาณของสารตวอยางนนเองลกษณะของเทอรมลคอนดกตวตดเทคเตอร ดงรปท 9.7

รปท 9.7 Thermal conductivity detector (TCD) (ทมา: http://www.scimedia.com/chem-ed/sep/gc/detector/tcd.htm, updated 9/12/96)

เนองจากดเทคเตอรชนดนเปนชนดหนงทวดคาการนาความรอนของกาซดงนนจงเปนสงจาเปนอยางยงทตองรกษาใหผนงของเครองดเทคเตอรมอณหภมคงทเสมอ ซงทาใหการวเคราะหทางปรมาณไดผลถกตองควรใชกาซไฮโดรเจนหรอฮเลยมเปนกาซตวพาผานไปในเคร องกอน จนกระทงอณหภมของดเทคเตอรคงท หลงจากชะสารตวอยางตางๆ ทเปนสารอนทรยออกจากคอลมนเขาดเทคเตอร จะปรากฏวาการนาความรอนของแกสออกจากใยเสนลวดจะลดลง ทาให เสนลวดมอณหภมสงขน วงจรไฟฟาจะไมสมดลเกดการปรบใหมเพอทาใหความรอนของใยเสนลวดเทาเดมจงทาใหเกดเปนสญญาณไปยงเครองบนทก แตถาใชไนโตรเจนเปนกาซตวพาจะทาใหความไวลดลง เพราะวาคาการนาความรอนของไนโตรเจนใกลเคยงกบสารตวอยางมาก 4) เฟลมโฟโตเมตรกดเทคเตอร (Flame photometric detector; FPD) ดเทคเตอรชนดนใหกาซไฮโดรเจนทาใหเกดเปลวไฟเชนเดยวกบ FID แทนทจะวดปรมาณไอออนของสารตวอยางทเกดไอออไนซ FPD จะใชหลอดโฟโตมลตไพเออร (Photomultiplier) วดปรมาณแสงทถกปลอยออกมาในเปลวไฟ เมอไอออนของสารตวอยางเขาไปในเปลวไฟตามปกต FPD จะใชในการวเคราะหสารประกอบทมซลเฟอร หรอฟอสฟอรส หรอสารประกอบออรแกโนเมทอลลก (Organometallic) ทมอะตอมของโลหะทสามารถถกกระตน (Excited) ในเปลวไฟของไฮโดรเจนไดหรอสารประกอบทมอะตอมของฮาโลเจน FPD มขอดคอ สามารถเลอกวดแสงทปลอยออกมาไดอยางเฉพาะเจาะจงสาหรบ ดงรปท 9.8


รปท 9.8 Flame photometric detector (FPD) (ทมา: Thomas, 2009)

5) อเลกตรอนแคพเทอรดเทคเตอร (Electron capture detector; ECD) หลกการของดเทคเตอรชนดนคอกาซตวพาทออกจากคอลมนเขาดเทคเตอรจะถกทาใหเกดการไอออไนซดวยรงสเบตา (β) ทเกดจากสารกมมนตภาพรงสเชน 3H หรอ 63Ni หรอ 55Fe จากการไอออไนซ จะทาใหเกดอเลกตรอน และอเลกตรอนทเกดขนนจะวงไปทขวสะสม (Collector electrode) ทาใหเกดความ ตางศกยระหวางขวทงสอง และยงมอเลกตรอนเหลออยอกจานวนหนงเปน Electron cloud ทาใหเกดกระแสไฟฟาขน เมอมสารตวอยางออกจากคอลมนเขาไปในดเทคเตอร โมเลกลของสารตวอยางจะดดกลนอเลกตรอนไวไดจานวนหนง ตามปรมาณของสารตวอยางทาใหกระแสไฟฟาทเกดขนจากอเลกตรอนลดลง ซงการเปลยนแปลงนจะทาใหเกดเปนสญญาณสงไปยงเครองบนทก แกสตวพาทเหมาะสมสาหรบอเลกตรอนแคพเทอรดเทคเตอร คอ ไนโตรเจน หรออารกอน +10% มเทน ความไวของเครองขนอยกบอตราการไหลของกาซตวพาซงทาใหเกด Electron cloud และอณหภมของดเทคเตอร เนองจากกาซออกซเจนและนาเปนสารทดดกลนอเลกตรอนได ดงนน ถากาซตวพามนาหรอออกซเจนปนอยจะทาใหความไวของเครองดเทคเตอรลดลง ลกษณะของดเทคเตอรอเลกตรอนแคพเทอรดเทคเตอร แสดงไวในรปท 9.9


รปท 9.9 Electron Capture Detector (ECD) (ทมา: http://scicalgas.com/specialty-gas/instrument-gases/electron-capture/)

อเลกตรอนแคพเทอรดเทคเตอร เปนดเทคเตอรทไวตอสารประกอบอนทรยทมอะตอมของธาตทมอเลกโทรเนกาทวต (Electronegativity) สง เชน ไนโตรเจน ฟอสฟอรส ออกซเจน และฮาโลเจน อเลกตรอนแคพเทอรดเทคเตอร เปนดเทคเตอรทใชไดดสาหรบงานวเคราะหสารจาพวก ยาฆาแมลง สารประกอบอนทรยทมตะกว และพวก Polychlorinatedbiphenyl; PCBS อเลกตรอนแคพเทอรดเทคเตอร ไมสามารถใชวเคราะหสารไฮโดรคารบอนทอมตวได สารประกอบทไมสามารถใชกบดเทคเตอรขนดเฟลมไออไนดเทคเตอร (FID) และ เทอรมลคอนดกตวตดเทคเตอร (TCD) สามารถนามาใชกบอเลกตรอนแคพเทอรดเทคเตอร (ECD) ไดผล ดเทคเตอรชนดอนๆ ยงมดเทคเตอรชนดอนๆ อกนอกเหนอจากทกลาวมาซงไดผลตขนมาสาหรบใชกบงานเฉพาะอยาง หรอเปนดเทคเตอรทดดแปลงแกไขมาจากดเทคเตอรทกลาวมาแลวเพอใหมความไวสงขนสาหรบงานเฉพาะอยางทตองการ เชน ไนโตรเจน ฟอสฟอรส ดเทคเตอร (Nitrogen-phosphorus detector, NPD) ดเทคเตอรชนดนไดดดแปลงมาจากดเทคเตอรชนด FID เพอใหมความไวตอสารประกอบทมไนโตรเจนและฟอสฟอรสเทานน ดเทคเตอร NPD มเกลออลคาไลเฮไลด (Alkali-halide salt) วางอยเหนอเปลวไฟเกลออลคาไลดจะมผลทาใหความไวของดเทคเตอรทมตอสารประกอบของไนโตรเจน การพจารณาวาควรเลอกใชดเทคเตอรชนดใดนน ขนอยกบชนดของสารและความไวของ ดเทคเตอรดเทคเตอรแตละชนด เหมาะสาหรบวเคราะหสารแตละชนดไมเหมอนกนตองเลอกใชให


ตรงตามความสามารถของมนอยางไรกตาม เราสามารถสรปไดวาดเทคเตอรทดตองมคณสมบตดงตอไปนคอ 1. เสยงรบกวนทเกดขนควรนอยมาก (Low noise level) 2. มความไวสง (High sensitivity) และควรไวตอไอของสารทกชนด 3. มความรสกตอสารอยางรวดเรวแมนวามปรมาณนอย (Rapid response) ในการ ชะสารออกจากคอลมน สารทออกจากคอลมนจะคอยๆ ออกมาทละนอยจนถงมากแลวลดนอยลงอกทาใหเกดเปนพค ดงนนดเทคเตอรตองรสกหรอตดตามการเปลยนแปลงปรมาณของสารไดดจงจะทาใหเกดพค และการแยกขนได 4. ผลทไดจากเครองดเทคเตอรจะตองเหมอนกนทกครงเมอใชสารตวอยางชนดเดยวกน (High reproducibility) 5. ไมไวตอการเปลยนแปลงความดนของกาซตวพาหรออณหภมและไมเกดปฏกรยาตอกาซตวพา 6. ไมทาลายหรอเปลยนแปลงคณสมบตของสารทตองการวเคราะหซงมความสาคญมากถาตองการเกบสารทแยกไดนไปทาการวเคราะหตอไป 7. ราคาถก ยงไมมดเทคเตอรชนดใดทมคณสมบตครบถวนทกขอ ดงทกลาวมาขางตน ดงนนการเลอกใชควรพจารณาดเทคเตอรทมคณสมบตทดมากทสด ซงนยมใชกน 2 ชนดคอ TCD และ FID 9.3 การวเคราะหเชงคณภาพและเชงปรมาณ (Qualitative and quantitative analysis)

แกสโครมาโทกราฟจดวาเปนเทคนคทใชสาหรบแยกสารตวอยางซงเปนของผสมไดอยางมประสทธภาพสงเทคนคหนง แตมขอจากดอยทสารตวนนๆ จะตองสามารถเปลยนใหเปนแกสเฟสทไดอณหภมเหมาะสม อยางไรกตาม นบวาโชคดทสดทขอมลซงไดจากเครองโครมาโทกราฟ คอ สญญาณทไดจากดเทคเตอร จะถกสงเขาไปเครองคอมพวเตอรหรอเครองประมวลผลอยางอนนน นบวาเปนขอมลทสาคญทจะสามารถนาไปใช เพอการตรวจพสจนสารหรอหาปรมาณของสารได ม 3 ประการดวยกนคอ

1. เวลาทสารแตละชนดผานคอลมนจากจกเรมตนถงจดสงสดของพค ซงเรยกวา Relention time (tR) ทไดจากโครมาโทแกรม สามารถนาไปใชในการทาคณภาพวเคราะหได

2. ขนาดของพค ซงอาจเปนพนท หรอความสง สามารถนาไปใชในการทาปรมาณวเคราะหได

3. ลกษณะของพคทไดจากโครมาโทแกรม ใชเปนขอมลสาหรบการวเคราะหทงเชงคณภาพและปรมาณได

อยางไรกตาม การใชเทคนคนเพยงอยางเดยวสาหรบการวเคราะหสาร โดยเฉพาะสารตวอยางทคอนขางซบซอน โครมาโทแกรมทไดจากการการใช Packed column หรอ Capillary column กตามจะยงยากซบซอนมาก การวเคราะหตองทาดวยความระมดระวงรอบคอบอยางมาก แมกระนนอาจเกดขอผดพลาดไดในกรณเชนนจงมความจาเปนตองใชเทคนคอยางอนเขามาประกอบ


ในการวเคราะหดวย เชน ใช IR, NMR หรอ Mass spectroscopy เพอใหการวเคราะหมความถกตองและมนใจยงขน

การวเคราะหเชงคณภาพดวยแกสโครมาโทกราฟ วธการตางๆ ทใชในการวเคราะหเชงคณภาพดวย GC นน มดงตอไปน

1. ใช Retention Data เปนททราบกนดแลววา Retention volume หรอ Retention time นนเปนลกษณะเฉพาะของสารแตละชนด และลควดเฟส หรอเฟสชนดของคอลมนทใช โดยขนอยกบอตราการไหลของแกสพา (Carrier gas) และอณหภมมใชกบคอลมน ดงนน เมอใหภาวะทงหลายคงท คา Retention time ของสารตางๆ ทใชวเคราะหควรจะตองคงทหรอมคาใกลเคยงกนทสด ตารางท 9.1 แสดงถงความเทยง (Precision) ทเครองแกสโครมาโทกราฟ วดคา Retention time ของสารตางๆ ได ซงเปนคาเฉพาะของแตละสาร

ตารางท 9.1 ความเทยงของคา Retention time ของสารตางๆ ทวดไดจากเครองแกสโครมาโทกราฟ

สารประกอบ Retention time, วนาท ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 4 ครงท 6 คาเฉลย

C 7 231 231 232 230 231 231 C 8 302 301 305 300 302 302 C 9 389 389 395 387 390 390 C 10 521 522 528 519 523 523 C 12 863 864 868 864 865 865 C 14 1191 1190 1193 1193 1192 1192

(ทมา: http://e-book.ram.edu/e-book/c/CM334/CM334-6.pdf)

ดงนน ในการตรวจพสจน (Identification) ชนดของสารในของผสมตวอยางจะตองทาการวเคราะหทงตวอยางและสารมาตรฐานทใชในภาวะตางๆ อยางเดยวกน นาคา Retention time หรอ Corrected retention time มาเปรยบเทยบกน กจะสามารถบอกไดวาแตละพคนนเปนของสารใด

จากการเปรยบเทยบโครมาโทแกรมของสารตวอยาง ซงเปนของผสมของแอลกอฮอลกบแอลกอฮอลมาตรฐาน ทาใหสามารถบอกไดวาพคท 2 3 4 7 และ 9 เปน เมทล (Methyl) เอทล(Ethyl) นอรมอลโพรพล (n-propyl) นอรมอลบวทล (n-butyl) และ นอรมอลเอมล (n- amyl alcohols) ถาจะใหแนใจเพมขนตองทาการวเคราะหใหมอกครงหนงโดยการเปลยนคอลมนเปนชนดใหมถาไดผลอยางเดยวกนกนบวาถกตอง

ในการเปรยบเทยบโครมาโทแกรมน มแฟกเตอรหลายอยางทจะตองคานงถง นนคอ การวด Retention time ซงขนอยกบความสามารถของเครองทใชควบคมภาวะตางๆ ถามการควบคมทไมคงทผลทไดรบจะแปรเปลยนไป ทาใหมปญหาเกดขน เชน การควบคมอณภมของคอลมน ถาตองการให Retention time อยในชวง ±1% อณหภมของคอลมนจะตองควบคมใหอยในชวง


±0.3 °C ดวย เปนตน นอกจากนขนาดของสารตวอยางทนาไปฉดเขาเครองแกสโครมาโทกราฟกมความสาคญมาก เพราะถาฉดสารตวอยางเขาไปมากๆ เรยกวา เกด Column overloaded พคทตรวจวดไดจะเปลยนไป ทาใหคา retention time ผดไป

2. ใชวธอานจากกราฟทแสดงความสมพนธระหวาง Retention time กบจานวนอะตอมของคารบอนของสารทอยในพวกเดยวกน (Homologous series) ในการวเคราะหสารตวอยางโดยวธนกอนอนจะตองทราบชนดของสารตวอยางเสยกอน จะดวยวธใดกได เพอจะไดเตรยมสารมาตรฐานไดถกตองแลวจงทาการวเคราะหหา Retention time แสดงลกษณะของกราฟทเขยนไดจากสารแตละพวก และพวกสารสารทสามารถใชวธนวเคราะหได ไดแก พวกอลเคน โอลฟน อลดไฮดคโทน แอลกอฮอล อะซเทตอะซทลเอสเทอรซลฟอกไซด อนพนธของไนโทร อะมน พรดน อเธอรไธออลอลคลไนเตรต และพวก ฟวราน เปนตน วธวเคราะหนสามารถทาไดงาย โดยใช สารมาตรฐาน 2-3 ความเขมขนกพอเพอใชหาความชน (Slope) ของเสนตรงเทานน

3. ใชดรรชน Kovats (KovatsIndex)Wehrli และ Kovats เปนผนาหลกการของRetention index มาใชเพอชวยในการพสจนโครงสรางของโมเลกลสารอนทรย โดยใช n-alkanes เปนสารมาตรฐาน การพสจนสามารถชวยไดโดยการใช Retention index (I)

I = 100 N + 100 log V'R(A) - log V'

R(N) log V'

R(n) - log V'R(N)

เมอ N และ n เปน n - paraffin ทเลกกวาและใหญกวาตวสาร A และ V'

R เปน Retention volume ทปรบแลว Retention index ของ n-alkanes ตางๆ ใหมคาเปน 100 เทาของจานวนอะตอมคารบอนในโมเลกลของสารนนสาหรบทกอณหภม และทกๆ ลควดเฟส เชน ออกเทนมคา Retention index = 800 และของ Decane จะมคา =1000

ในทางปฎบต Retention index สามารถหาไดงายๆ จากกราฟทเขยนระหวาง log t'

R (t'R = Retention time ทปรบแลว) กบจานวนอะตอมคารบอนคณดวย 100 ถาตองการหาคา

ดรรชน Kovats กเพยงแตนาสารนนไปหาคา t'R แลวนาไปอาน

4. การใชคอลมนหลายชนด (Multiple Columns) ในการวเคราะหสารตวอยางโดยการเปรยบเทยบกบสารมาตรฐานนน เมอใชคอลมน 2 ชนด หรอมากกวา จะชวยใหการตรวจพสจนสารตวอยางมความถกตองมนใจยงขนการใชคอลมน 2 ชนดนนจะตองเปนคอลมนทใชลควดเฟส ทมสมบตตางกน จงตองเลอกใชใหถกตองและเหมาะสม เพราะประสทธภาพของคอลมนขนอยกบสภาพขว (Polarities) ของลควดเฟสและของสารตวอยางอนๆ อยาเลอกคอลมนโดยดแตเฉพาะชอเทานน ชอคอลมนแตกตางกนอาจมสมบตเหมอนกนได ดงนน ในการพจารณาวาคอลมนใดสมบตเหมอนกน หรอแตกตางกน อาจจะดไดจากคา McReynolds constant 5. การใชเทคนคอนชวยในการตรวจพสจนสารดงไดกลาวมาแลววา ถาตองการตรวจพสจนสารตวอยางวาเปนสารอะไรจรงๆนน จาเปนอยางยงตองใชเทคนคทางสเปกโทรสโกปเขาชวย แตมวธงายๆทสามารถใชตรวจหาฟงกชนนลกรปของสารตวอยางได ซงสวนใหญเปนเรองของ Microanalysis ทใหผลการวเคราะหทคอยขางเฉพาะเจาะจง


การวเคราะหเชงปรมาณดวยเครองแกสโครมาโทกราฟ ปจจบนน การวเคราะหหาปรมาณของสารบางประเภททเปนแกสของเหลวหรอของแขงปรากฏวาเทคนคทางแกสโครมาโทกราฟ ไดรบความนยมสงมาก เครองมอสมยใหความสะดวกในการวเคราะห ผลการวเคราะหทไดมความแมนและเทยงสง นอกจากน เทคนคทางแกสโครมาโทกราฟ ยงใหสภาพไวสงอกดวย และยงมขอดอนๆ อกหลายประการ อยางไรกตาม ความผดพลาดของการวเคราะหยอมเกดขนไดเสมอ ตอไปนเปนขอผดพลาดทอาจเกดขนจากการวเคราะหดวยเทคนคทาง แกสโครมาโทกราฟทควรจะตองระวง 1. ความผดพลาดเกดจากการเกบตวอยาง 1) สารตวอยางทนาไปวเคราะหมปรมาณแนนอนเพยงใด 2) สารตวอยางทใสเขาไปในเครองวเคราะหมความแนนอนเพยงใดวาสารนนเขาเครองทงหมดโดยไมมการสลายตวกอนระเหยออกไป 2. สารตวอยางอาจดดซบ (Adsorb) หรอสลายตวท Injector port หรอในคอลมน หรอ ดเทคเตอร ถามสงเหลานเกดขนการวเคราะหหาปรมาณอาจผดพลาดได 3. สภาพของเครองฉดแกสโครมาโทกราฟถาสภาพของเครองไมด การควบคม การวดตางๆ ยอมเกดความผดพลาดได 4. การฉดสารตวอยางเขาเครองแกสโครมาโทกราฟ 5. การเลอกใชคอลมน 6. Resolution ของพค 7. การคานวณหาปรมาณของสาร จากโครมาโทแกรมทไดจากเครองบนทก กอนทจะนาไปใชในการหาปรมาณสารจาเปนจะตองหาพนทของพคเสยกอน สาหรบเครองแกสโครมาโทกราฟสมยใหมทมเครองอนทเกรเตอรหรอคอมพวเตอร หรอเครอง Data system อยางอนทใชรวมอยดวย เครองเหลานจะทาหนาทคานวณพนทของแตละพค ตลอดจนพมพคา Retention time ใหดวย แตถาเครองแกสโครมาโทกราฟ ของผวเคราะหมแตเฉพาะเครองบนทกกราฟ ผวเคราะหจะตองควรจะตองสามารถคานวณหาพนทพคเองไดเทคนคตางๆ ทใชในการหาปรมาณของสารนน สามารถหาไดเหมอนกบเทคนคทางลควดโครมาโท กราฟ (LC) 9.3.1 การใชสารละลายมาตรฐานภายนอก (External standard) เทคนคนสาคญอยทการเตรยมสารมาตรฐานและสารตวอยางใหมความเขมขนใกลเคยงกนและจะวเคราะหดวย GC โยใชภาวะเดยวกน โครมาโทแกรมทไดนาไปหาพนทพค หรอความสงของพค แลวนาไปเขยนกราฟแสดงความสมพนธระหวางพนทพคหรอความสงของพคกบความเขมขนจะได Calibration curve สาหรบหาปรมาณของสารตวอยางซงอาจจะเปนการวเคราะหสารเดยวหรอหลายสารกได สงทควรจะตองระวงในการทาวเคราะหดวยเทคนคน คอ 1) ปรมาณของสารทจะวเคราะหตองอยในชวงของ Calibration curve 2) สารทจะวเคราะหจะตองไมฉดเขาไปมากจนกอใหเกดการ Overloaded คอลมน 3) สารมาตรฐานสารละลายสารตวอยางทใชจะตองทราบปรมาณแนนอน


ขอดของ External standardization method พอทจะสรปไดดงน คอ 1) ผลทไดจากการวเคราะหอาจเปนคาปรมาณสมพนธ (Relative) หรอเปนคาสมบรณ (absolute) 2) คาทวดไดจะไมขนอยกบพคอนๆ ทงหมด 3) คาสภาพไวของดแทคเตอร (Detector sensitivity) อาจจะเปลยนแปลงไดในระหวางทาการวเคราะห 4) สารตวอยางทงหมดไมจาเปนตองถกชะออกมาหมด หรอตรวจวดทงหมด 5) จะไมมการเตม Internal standard

ขอเสยของวธน พอจะสรปไดดงน คอ 1. ผลการวเคราะหทไดขนโดยตรงกบสภาพไวของดเทคเตอร ทาใหเสยเวลารอจนกวาดเทคเตอรจะเสถยร นอกจากจะทาการ Calibrate อยเสมอๆ 2. ผลทไดจากการวเคราะหขนอยกบขนาดของสารตวอยางทฉดเขาไปโดยตรง 3. เครองมอควรจะตองมการ Calibrate บอยๆ 4. คาความเทยงและความแมนมขดจากด ซงขนอยกบแฟกเตอรตางๆ ดงไดกลาวมาแลว

External standardization method เหมาะทจะใชวเคราะหสารตวอยางในภาวะดงตอไปนคอ

1. เมอตองการหาความเขมขนหรอปรมาณของสารซง Internal standardization method ใชไมได

2. เมอสารตวอยางทงหมดถกชะออกมาเพยงบางสวน และ Internal standardization method ใชไมได

3. เมอใชขนาดของสารตวอยางและสภาพไวของดเทคเตอรมคาคงท 4. เมอใช Gas หรอ Liquid sampling values นนคอปรมาตรของสารทฉดเขาไปม

คาคงท 9.3.2 การใชสารละลายมาตรฐานภายใน (Internal standard) เปนเทคนคทใชหาปรมาณของสารไดถกตองทสด ทงนขนอยกบการเลอกใช Internal standard หลกการเลอกสารทจะใชเปน Internal standard คอ

1) สารนนจะตองมสมบตคลายกบสารทจะวเคราะห 2) สารนนจะตองถกชะออกมาจากคอลมนหมด 3) สารนนจะตองใหพคทแยกอยตางหาก โดยพคจะตองไมซาหรอเหลอมทบกบพคอนๆ

และอยใกลกบพคทตองการหา 4) สารนนจะตองไมทาปฎกรยากบสารอนๆ ทเกยวของ


9.4 เทคนคการวเคราะหแกสโครมาโตกราฟ การนาสารตวอยางฉดเขาเครองแกสโครมาโทกราฟ เพอวเคราะหนนมวธการแตกตางกนไป

แลวแตชนดของสารตวอยาง เชน แกส ของเหลวหรอของแขง ถาเปนของเหลวหรอของแขงสารนนระเหยยากหรองาย คอลมนทใชเปนอะไร เชน เปนแพคคอลมน หรอแคปปลลารคอลมน ซงสงสาคญในการวเคราะหโดยแกสโครมาโทกราฟตองอาศยเทคนคเพอการวเคราะหไดงายขน โดยมเทคนคสาคญอย 2 วธ ไดแก

9.4.1 Head space เทคนคเฮดสเปซถกนามาใชในขนตอนการเตรยมสารตวอยางโดยเทคนคนจะทาให

สารอนทรยทสามารถระเหยไดระเหยออกจากสารตวอยางและวเคราะหไอระเหยทเกดขนซงทาใหไมมการรบกวนของสารตางๆทมจดเดอดสง

ในกรณทสารตวอยางเปนของแขงหรอของเหลวโดยทมสารทระเหยไดและระเหยไมได ถาตองการหาสวนทระเหยได สามารถทาไดโดยใช Head space technique ซงตางจากเทคนคแกสโครมาโทกราฟทวไป ตรงทวธการใช Sample injector เทานน คอ จะนาสวนทเปนไอซงอยเหนอสวนทไมระเหยทเปนของแขงหรอของเหลวนนไปฉดเขาเครองแกสโครมาโทกราฟ การวเคราะหสารตวอยางทเปนของเหลวนจะไดผลถกตองสมบรณจะตองประกอบกบขนตอนตางๆ ดงตอไปน 1. จะตองรปรมาณของสารตวอยางทใสในขวด (Vial) ททราบขนาด ฝาขวดจะเปน septum ทเปนยางปด ขวดทใสสารตวอยางจะตองแชในอางนาทอณหภมคงท (80-90 C) 2. เมอไดสมดลแลว นาไอของสารตวอยางททราบปรมาณแนนอนไปวเคราะหดวยเครอง GC ตอไป หลกการวเคราะหโดยการสกดผานบรเวณเฮดสเปซ ประกอบดวยสองขนตอนหลกคอการสกดดวยการดดซบและการคายการดดซบเพอวเคราะห ในขนตอนการสกดเรมจากการแพรของสารทสนใจวเคราะหในขวดเฮดสเปซจากตวอยางทมความเขมขนสงไปยงบรเวณเฮดสเปซทมความเขมขนของสารทสนใจวเคราะหตา ดงรปท 9.10

รปท 9.10 การแพรของสารทสนใจวเคราะหจากตวอยางสบรเวณเฮดสเปซ

(ทมา: VCharKarn, ม.ป.ป.)


หลงจากนนสารทตองการวเคราะหจากบรเวณเฮดสเปซจะแพรไปยงตวดดซบของแขงปรมาณนอย ซงอาศยหลกการ การแพรของสารทมความแตกตางของความเขมขนเชนกน ดงรปท

9.11 การแพรของสารจะเกดขนอยางตอเนองจนกระทงเขาสสภาวะสมดล

รปท 9.11 การแพรของสารทตองการวเคราะหจากบรเวณเฮดสเปซสตวดดซบของแขงปรมาณนอย


สาหรบขนตอนการคายการดดซบเพอทาการวเคราะหใชวธคายการดดซบของสารทสกดไดบนตวดดซบของแขงปรมาณนอยดวยความรอนทบรเวณหวฉดสารของเครองแกสโครมาโท กราฟ ดงรปท 9.12

รปท 9.12 การคายการดดซบโดยใชความรอนจากหวฉดของเครองแกสโครมาโทกราฟ



1. ปจจยหลกๆ ทตองคานงถงสาหรบเทคนคนคอ 1) ศกษาอตราสวนเฟสอตราสวนเฟสเปนอตราสวนทเหมาะสมระหวางเฟสของตวอยางทเปนของตวอยางและเฟสของเฮดสเปซทใชในการสกด 2) อณหภมในการสกด อณหภมเปนปจจยสาคญในการศกษาเนองจากอณหภมเปนสวนชวยใหสารทวเคราะหเกดการเคลอนทไดดยงขนทาใหเกดการไดเทมวลไดดจากเฟสของเหลว เฟสของแกสและเฟสของพอลเมอรบนไฟเบอรซงถอเปนการเรงการเกดสมดลของสารทวเคราะหระหวางเฟสทงสาม 3) เวลาในการสกด เปนเวลาทสารเขาสสมดลระหวางเฟสทงสามประกอบดวยเฟสของเหลว เฟสของแกสและเฟสของพอลเมอร 4) ชนดและปรมาณของเกลอทเตม การเตมเกลอลงไปในการสกดเปนการลดการเกดชนไฮเดรตของนาตอสารทวเคราะห เมอเตมเกลอลงไปจะทาใหเกดชนไฮเดรตของเกลอแทนทาใหสารทวเคราะหโดนปลดปลอยและเกดกระบวนการสกดไดมากขน นอกจากนการเตมเกลอยงเพมความแรงไอออนใหกบสารละลาย ทาใหสารทสนใจละลายในตวอยางไดนอยลง 5) เวลาในการคายการดดซบ เปนการใหความรอนในการคายการดดซบของสารจากโพลเมอรบนไฟเบอรเขาสระบบการตรวจวด ขอด

เปนเทคนคทงาย มประสทธภาพสง ใหผลวเคราะหทเชอถอได และทสาคญคอเปนเทคนคทไมตองใชตวทาละลาย ขอดอย เปนอปกรณทนาเขาจากตางประเทศ มราคาสง การใชงานตองมความระมดระวงเพราะไฟเบอรค อนข าง เปราะ แตกหกง าย และอายการใช งานของ ไฟเบอร คอนข าง ต า คอประมาณ 100 ครง/ไฟเบอร ในตวอยางทเปนของแขงผลของสารรบกวน (Matrix effect) จะสงผลตอวธการนคอนขางมาก ดงนนถาจะหาในเชงปรมาณ จาเปนทจะทาหาโดยวธ Standard Addition method ทาใหเพมความยงยากในการวเคราะห การประยกตใช 1) วธการเตรยมตวอยางวธนเหมาะอยางมากกบสารอนทรยระเหยงาย (VOCs) 2) ใชวเคราะหไดทงเชงปรมาณ (มสารมากนอยเพยงใด บอกเปนตวเลข) เชงคณภาพ (มสารทเราสนใจหรอไม อาจจะเทยบกบสารมาตรฐาน

3) มไฟเบอรใหเลอกใชหลายชนดใหเหมาะกบการสกดสารท เราสนใจ เชน PDMS, CAR/PDMS, PA อนๆ

9.4.2 Solid phase microextraction (SPME) สปมส คอ การสกดดวยตวดดซบของแขงปรมาณนอย สาหรบการวเคราะหสไตรนตกคางใน

อาหารบรรจภณฑเนองจากขนตอนการเตรยมตวอยางมความสาคญในกระบวนการวเคราะห ซงมกระบวนการสาคญ ๆ คอ การสกด (Extraction) การเพมความเขมขน (Preconcentration) และ


การกาจดสงรบกวนออกจากตวอยางกอนการวเคราะหนนคอเทคนคการสกดสารดวยตวดดซบของแขงปรมาณนอย ซงมลกษณะการใชงานอยสองรปแบบ แบบแรกคอการสกดสารทสนใจจากตวอยางโดยตรง (Direct-immersion) และแบบทสองคอสกดผานบรเวณเฮดสเปซ (Headspace) โดยมหลกการสกดทเหมอนกนคออาศยการแพรของสารทสนใจวเคราะห จากตวอยางทมความเขมขนสงสตวดดซบของแขงปรมาณนอยทมความเขมขนตาจนการแพรเขาสสภาวะสมดล SPME เปนนวตกรรมทพฒนาขนมาใหมโดยมขอไดเปรยบเหนอกวาวธดงเดมทใชการสกดดวยตวทาละลายตรงทสะดวกรวดเรวกวาไมตองใชตวทาละลายหลกการของเทคนค SPME คอมไฟเบอร (Fiber) ทเคลอบสารดดซบ (Adsorbent) ทมคณสมบตดดซบสารใหกลนสารใหกลนแตละชนดจะมความสามารถในการถกดดซบบนสารดดซบทแตกตางกนซงในการดดซบ (Adsorption) ตองควบคมอณหภมและระยะเวลาใหเหมาะสม

รปท 9.13 โครงสรางของ SPME (ทมา: VCharKarn, ม.ป.ป.)

เมอนาเทคนค Solid phase microextraction (SPME) มาใชคกบเทคนค Headspace เรยกรวมวาเทคนค Headspace solid phase microextraction (HS-SPME) สามารถเพมความเขมขนของสารทาใหวเคราะหไดในระดบความเขมขนตาๆ ได การวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพดวยเครองแกสโครมาโทกราฟเปนวธวเคราะหทไดรบการยอมรบสง เนองจากสามารถวเคราะหสารไดหลากหลาย สารกลมทนยมวเคราะหคอ กลมแอลกอฮอล กลมกรดไขมนระเหยงาย ชนดและปรมาณของกรดไขมน สารทใหกลน แกสชวภาพ หรอสารตวกลางทเกดขนระหวางกระบวนการหมก ดงตารางท 9.2


ตารางท 9.2 ตวอยางการวเคราะหสารดวยแกสโครมาโทกราฟ

สาร ชนดคอลมน ดเทคเตอร อนเจคเตอร งานวจย

เอทานอล Elite – wax column

FID (T 210 °C)

At 180 °C AnujKumer Chandel, 2007

Lignin Elite – wax column

FID (T 210 °C)

At 180 °C AnujKumer Chandel, 2007

เอทานอล Capillary Column (0.25 mmx30 m)

FID (240 °C)

At 220 °C Kaewnaree P, 2011

แกสชวภาพ capillary column (30 m - 0.25 mm - 0.25 mm)

FID (T 240 °C)

At 280 °C Miao He, 2015

(ทมา: http://e-book.ram.edu/e-book/c/CM334/CM334-6.pdf) 9.5 แกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรเมตร (Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC-MS)

เปนเทคนคทสามารถบอกชนดขององคประกอบทมอยในสารไดอยางคอนขางแมนยาโดยอาศยการเปรยบเทยบ Fingerprint ของเลขมวล (Mass Number) ของสารตวอยางนนๆกบขอมลทมอยใน Library นอกจากนยงสามารถใชในการวเคราะหไดทงในเชงปรมาณ (Quantitative Analysis) และเชงคณภาพ (Qualitative Analysis)

GC-MS ประกอบดวย 2 สวนคอสวนของเครอง GC (Gas Chromatography) และสวนของเครอง Mass Spectrometer โดย GC-MS ซงเปนเทคนค 2 เทคนคทมารวมกนซงนามาวเคราะหพวกสารผสมทสามารถระเหยไดในอณหภมไมสงนกโดยท Gas Chromatography เปนสวนทแยกสารผสมออกจากกนสวน Mass Spectrometer เปนสวนทการวเคราะหชนดของสารหรอองคประกอบของสารเมอนาเทคนคทงสองมารวมกนจะสามารถนามาวเคราะหสารผสมทงทางปรมาณวเคราะหและคณภาพวเคราะห GC-MS เปนเทคนคทนาไปประยกตใชในดานการแพทยเภสชศาสตรสงแวดลอมรวมไปถงในดานกฎหมาย


รปท 9.14 แกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรเมตร (ทมา: http://fses.oregonstate.edu/GCMS-2)

9.5.1 หลกการทางานในสวนของเครองแกสโครมาโทกราฟ-แมสสเปกโทรเมตร เทคนคโครมาโทกราฟ–แมสสเปกโทรมเตอร เรมนยมนามาใชกนอยางแพรหลายมากขน

เนองจากเปนวธทสามารถบอกชนดขององคประกอบทมอยในสารไดอยางคอนขางแมนยาโดยอาศยการเปรยบเทยบ Fingerprint ของเลขมวล (Mass number) ของสารตวอยางนน ๆ กบขอมลทมอย นอกจากนเทคนคนยงมความสามารถในการวเคราะหไดทงในเชงปรมาณ (Quantitative analysis) และเชงคณภาพ (Qualitative analysis) ไดอยางถกตอง Mass Spectrometer เปนดเทคเตอรทใชตรวจวดองคประกอบทมอยในสารตวอยาง โดยอาศยกลไกคอโมเลกลขององคประกอบทถกแยกออกมาจากสารตวอยางโดยเครองแกสโครมาโทกราฟ นนจะถกไอออไนซในสภาวะทเปนสญญากาศ แลวตรวจวดออกมาเปนเลขมวล (Mass number) เทยบกบขอมลอางองแลวแปลผลออกมาเปนชอขององคประกอบนน ๆ หลกการทางานของเครอง GC-MS นนเรมจากนาตวอยางฉดเขาเครองเครองแกสโครมาโทกราฟ จากนนสารกจะถกแยกออกเปนองคประกอบตาง ๆ เมอผานเขาสคอลมน ทอยในเตาควบคมอณหภม (Oven) จากนนองคประกอบใดทถกแยกออกมาจากคอลมนกอนกจะผานเขาไปในสวนของเครองแมสสเปกโตรเมตร ซงมสภาวะเปนสญญากาศกอน แลวเขาไปเจอกบ Ion source ซงจะทาหนาทไอออไนซโมเลกลทผานเขามาใหกลายเปนประจ จากนนประจเหลานกจะเดนทางผานเครองคดเลอกและแยกแยะขนาดของประจ (Mass analyzer) เพอดวาประจเหลานนประกอบไปดวยขนาดมวลเทาใดบาง กอนทจะเดนทางเขาสเครองตรวจวด (Detector) เพอทาการตรวจหาปรมาณของประจแลวแปลผลออกมาเปนปรมาณขององคประกอบแตละตวทมอยในสารตวอยาง (เอกสารประกอบการเรยน, 2557)


รปท 9.15 หลกการทางานในสวนของเครองแกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรเมตร

(ทมา: http://www.skz.de/de/forschung/technischeausstattung1/pruefverfahren/ spektroskopie/4498.Gaschromatographie_mit_Massenspektrometrie-

Kopplung_GCMS.html)

9.5.2 แมสสเปกโทรมเตอร (Mass Spectrometer) เปนดเทคเตอรทใชตรวจวดองคประกอบทมอยในสารตวอยางโดยอาศยกลไก คอ โมเลกล

ขององคประกอบทถกแยกออกมาจากสารตวอยางโดยเครองแกสโครมาโทกราฟจะถกทาใหกลายเปนไอออนในสภาวะสญญากาศแลวตรวจวดออกมาเปนมวล (Mass number) เทยบกบฐานขอมลอางอง แลวแปลผลออกมาเปนชอขององคประกอบนนๆ

รปท 9.16 สวนประกอบสาคญของ MS (ทมา: อเทน ทองแดง. 2554)


9.5.3 องคประกอบสาคญแมสสเปกโทรมเตอร (Mass Spectropotometer) 9.5.3.1 Ionization Source แบงออกเปน 2 แบบ คอ

1) Electron Ionization (EI) เปนการทาใหสารเกด Fragment โดยใชลา Electron ซง Ionizationchamber ตองมความดนตาประมาณ 10 – 8 Tor โดย Electron จาก Fragment ทรอนจะถกโฟกสผานหองนและถกดงเขาหา Repeller voltage ทมความแตกศกด 70 V ซงจะใหพลงงานกบ Electron เปน 70 eV ทาใหของผสมทซบซอนของไอออนเกดการแตกหก (Fragmentation ion) ทสามารถใหขอมลเกยวกบโครงสรางและความอดมสมพนธ (Relative abundance) 2) Chemical Ioinzation (CI) เปนการทาใหสารเกดการ Fragment ดวยวธทางเคม โดยผสมสารตวอยาง (ความดน 10-4 Tor) เขากบแกสททาปฏกรยาดวย (ความดน 1 Tor) แลวสารผสมเขาไปใน Ionization chamber โดยการทาใหเกด Fragment ดวยการชน Electron เชนเดยวกนกบแกสทใช ไดแก มเทน (Methane) ไอโซบวเทน (Isobutane) และแอมโมเนย(Ammonia) 3) Mass Analyzer เปนเครองมอวเคราะหมวล ใชหลกการวเคราะหดวยสนามเหลก คอ Path-stability mass spectrometer ซงมแหลงผลต Ion source 2 สวน โดยสวนแรกจะทาใหตวอยางกลายเปนไอออน และสวนท 2 ทาใหสารมาตรฐานกลายเปนลาไอออนทงสองจะถกบงคบใหผานแยกไออนชดเดยวกน ดงนนไอออนทงหมดจะไดรบอทธพลจากสนามแมเหลกในสภาวะเดยวกน แตจะถกตรวจและวดดวยเครองดเทคเตอรแยกกน ซงมขอดคอ สามารถวดมวลไดอยางถกตองแมนยา 4) ดเทคเตอรทใชทวไปมหลายอยาง คอ Faraday cup detector, Electron multiplier detector, Scintillation counter detector และ Photographic plate detector

ขอดของ GC-MS 1. สามารถวเคราะหไดทงแบบทวไปและแบบเฉพาะเจาะจงให มความไวทสง 2. สามารถบงชชนดขององคประกอบทมอยในสารตวอยางได 3. สามารถวเคราะหไดทงในเชงปรมาณและเชงคณภาพ ขอเสยของ GC-MS 1. ราคาแพง และคาใชจายในการบารงรกษาเครองสง 2. ตองใชความชานาญสง


9.6 สรปประจาบท แกสโครมาโตกราฟเปนเทคนคอกชนดหนงทใชสาหรบแยกสารผสม ซงคลายกบลควด โคร

มาโทกราฟ (LD) แตเทคนคนใชแยกสารทสามารถเปลยนใหแกสไดทเฟสทไดทอณหภมหนง (ไมเกน 450๐C) ถาสารใดเปลยนใหเปนแกสยาก กอาจใชเทคนคอนๆ บางอยางเขาชวย เชน อาศยปฏกรยาเคมเปลยนเปนอนพนธอนๆ หรออาจใชหลกการแยกสลายดวยความรอน (Pyrolysis) เมอสารนนถกเปลยนใหอยในเเกสเฟสแลว ใหสารเหลานนเขาไปยงคอลมนทบรรจเฟสคงท (Stationary phase) โดยอาศยการพาไปของเฟสเคลอนท (Mobile phase) หรอ Carrier gas สารผสมเหลานนจะเกดการแยกขน

แกสโครมาโตกราฟ-แมสสเปกโทรมเตอร (GC-MS) เปนเทคนคทสามารถบอกชนดขององคประกอบทมอยในสารไดอยางคอนขางแมนยาโดยอาศยการเปรยบเทยบ Fingerprint ของเลขมวล (Mass Number) ของสารตวอยางนนๆกบขอมลทมอยใน Library นอกจากนยงสามารถใชในการวเคราะหไดทงในเชงปรมาณ (Quantitative Analysis) และเชงคณภาพ (Qualitative Analysis) GC-MS ประกอบดวย 2 สวนคอสวนของเครอง GC (Gas Chromatography) และสวนของเครอง Mass Spectrometer โดย GC-MS ซงเปนเทคนค 2 เทคนคทมารวมกนซงนามาวเคราะหพวก สารผสมทสามารถระเหยไดในอณหภมไมสง โดยท Gas Chromatography เปนสวนทแยกสารผสมออกจากกนสวน Mass Spectrometer เปนสวนทการวเคราะหชนดของสารหรอองคประกอบของสารเมอนาเทคนคทงสองมารวมกนจะสามารถนามาวเคราะหสารผสมทงทางปรมาณวเคราะหและคณภาพวเคราะหอยางมประสทธภาพ



1. จากรป จงบอกสวนประกอบของเครองแกสโครมาโทรกราฟฟ

A คอ............................................................................................. B คอ............................................................................................. C คอ............................................................................................. D คอ.............................................................................................

E คอ............................................................................................. F คอ............................................................................................. G คอ............................................................................................. 2. จงอธบายหลกการทางานของเครองแกสโครมาโทรกราฟฟ 3. จงบอกชนดคอลมนสาหรบเครองแกสโครมาโทรกราฟฟมกชนด อะไรบาง 4. จงบอกดเทคเตอรเครองแกสโครมาโทรกราฟฟม มา 3 ชนด 5. จงยกตวอยางสารทวเคราะหดวยเครองแกสโครมาโทรกราฟฟ มา 3 ชนด


6. จากรป จงบอกสวนประกอบของแมสสเปกโทรมเตอร (MS) ทาหนาทอยางไร

A คอ............................................................................................. B คอ............................................................................................. C คอ............................................................................................. D คอ.............................................................................................

E คอ............................................................................................. F คอ............................................................................................. G คอ............................................................................................. H คอ............................................................................................. 7. จงอธบายเทคนคเฮดสเปซ (Headspace) 8. จงอธบายเทคนคสปมส (Solid phase microextraction; SPME) 9. จงอธบายหลกการทางานของแกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทรมเตอร

10. ตรวจสอบชนดและปรมาณของสารโดยแกสโครมาโทกราฟไดอยางไร





พฒนาเหลา ไพบลย. (2548). โครมาโตกราฟฟแบบของเหลวแรงดนสง: หลกการและการประยกตใช. ขอนแกนการพมพ.ขอนแกน.


อเทน ทองแดง. (2554). การตรวจวเคราะหสารระเบด RDX ในปรมาณนอยบนมอและวตถของผตองสงสยโดยเทคนค GC –MS. สาขาวชานตวทยาศาสตร. บณฑตวยาลย มหาวทยาลยศลปากร

เอกสารประกอบการเรยน. บทท 6 กาซโครมาโตกราฟ (Gas Chromatography). คนเมอ 2สงหาคม 2557, จาก http://e-book.ram.edu/e-book/c/CM334/CM334-6.pdf

James A.T., Martin, A.J.P. and Smith. G.H. (1952). Gas-liquid partition chromatography: the separation and micro-estimation of ammonia and methyl amines. Ibid. 52, 238-242.

Johannes Ahrens. (2557). หลกการทางานในสวนของเครองแกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทร มเตอร. จาก http://www.skz.de/de/forschung/technischeausstattung1 /pruefverfahren/spektroskopie สบคนเมอ 3 กนยายน 2557

Stoog D. A., West D. M., Holler J. F, Crouch S. R. (2014). Fundamentals of Analytical Chemistry. 7th ed. Singapore: New Tech Park (Looby H).

Thomas G. (2009) Chasteen; Department of Chemistry, Sam Houston State University, Huntsville, Texas 77341. จาก http://www.shsu.edu/~chm_tgc/FPD/FPD.html สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

VCharKarn, (ม.ป.ป). เทคนคการสกดดวยตวดดซบของแขงปรมาณนอย (solid phase microextraction, SPME). คนเมอ 2 สงหาคม 2557, จากhttp://share.psu.ac.th/blog/sci-discus/17227

http://fses.oregonstate.edu/GCMS-2 สบคนเมอ 26 มนาคม 2558 http://scicalgas.com/specialty-gas/instrument-gases/electron-capture/ สบคนเมอ 26

มนาคม 2558 http://www.scimedia.com/chem-ed/sep/gc/detector/tcd.htm, updated 9/12/96 สบคน

เมอ 26 มนาคม 2558


http://www.skz.de/de/forschung/technischeausstattung1/pruefverfahren/ spektroskopie/4498.Gaschromatographie_mit_Massenspektrometrie-Kopplung_GCMS.html) สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

บรรณานกรม จตภรณ สวสดรกษา. (ม.ป.ป). ปรมาณสมพนธ. คนเมอ 14 เมษายน 2558. ชชาต อารจตรานสรณ. (2539). เครองมอวทยาศาสตร. พมพครงท 2. ขอนแกน: โรงพมพศรภณฑ

ออฟเซท. บณฑต สละศาสตร. และธรพล วงศชนะพบลย, บรรณาธการ. (2539). เอกสารประกอบการประชม


ประภาณ เกษมศร ณ อยธยา. อาพน เพญโรจน. สอาดศร กาญจนาลย. ศภชย ใชเทยมวงศ. มานตย ปญจมาลา. และสภาพ บญยะรตเวช. (2539). เคมทวไป เลม 1. พมพครงท 6. กรงเทพฯ: จฬาลงกรณมหาวทยาลย.

เปรมใจ อารยจตรานสรณ. พจน ศรบญลอ. พชรย บญศร. อบล ชาออน. และ ปต ธวจตต. (2548). ตาราชวเคม. พมพครงท 4. ขอนแกน: สานกพมพคลงนานาวทยาขอนแกน.

ปรยา แกวนาร. ชาญชย ภขาว. รตนา หลกตา. (2555). การใชนาทงจากกระบวนการกลนเอทานอลเพอใชผลตชวมวลของสาหรายคลอเรลลา.วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลยมหาวทยาลยราชภฏอดรธาน. (1). 97-118

พรพมล กองทพย. (ม.ป.ป). หนวยท14 การตรวจวเคราะหทางสขศาสตรอตสาหกรรม. ภาควชา อาชวอนามยและความปลอดภยคณะสาธารณสขศาสตร มหาวทยาลยมหดล.


พฒนา เหลาไพบลย. และอลศรา ศรวฒนา. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตบตการในกระบวนการวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.

แมน อมรสทธ. และอมร เพชรสม. (2535). หลกการและเทคนคการวเคราะหเชงเครองมอ. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณ มหาวทยาลย. กรงเทพฯ.

แมน อมรสทธ. และอมร เพชรสม. (2535). Principles and Techniques of Instrumental Analysis. กรงเทพฯ: ชวนพมพ.

รชน อมพรอรามเวทย. (ม.ป.ป). ไดอะแกรมการทางานของเครองนงฆาเชอโรค. คณะ ทนตแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

ศภชย ใชเทยมวงศ. (2539). เคมวเคราะห. พมพครงท 3. กรงเทพฯ: สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย.

สถาบนนวตกรรมและพฒนากระบวนการเรยนร มหาวทยาลยมหดล. (2528). หลอดดวเทอเรยมและหลอดทงสเตน. คนเมอ 26 มนาคม 2558 จาก http://www.il.mahidol.ac.th/e- media/color-light/page4_2. html.

220 บรรณานกรม เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

สรนดา ยนฉลาด. (2546). เทคโนโลยชวภาพพนฐาน เลมท 1 (Basic Biotechnology: volume1). ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยขอนแกน.

สกญญา อดษะ. (2551). ศกษาการผลตกรดอนทรยระเหยจากอนทรยสารความเขมขนสงของขยะ เศษอาหารในระบบถงหมกแบบสองขนตอน. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาวทยาศาสตรศกษามหาวทยาลยราชภฏพระนคร.

อเทน ทองแดง. (2554). การตรวจวเคราะหสารระเบด RDX ในปรมาณนอยบนมอและวตถของผตองสงสยโดยเทคนค GC–MS. สาขาวชานตวทยาศาสตร. บณฑตวยาลย มหาวทยาลยศลปากร.

เอกสารประกอบการเรยน. (2557). บทท 5 เครองหมนเหวยง. คนเมอ 2 สงหาคม 2557, จาก http://home.kku.ac.th/chuare/12/centrifuge. pdf.

เอกสารประกอบการเรยน. (2557). บทท 6 กาซโครมาโตกราฟ (Gas Chromatography). คนเมอ 2 สงหาคม 2557, จาก http://e-book.ram.edu/e-book/c/CM334/CM334-6.pdf

เอกสารประกอบการเรยน. (2557). บทท 6 เรองเครองวดพเอช (pH meter). คนเมอ 2 สงหาคม 2557, จาก http://home.kku.ac.th.

Acott Chris. (1999). The diving "Law-ers": A brief resume of their lives. South Pacific Underwater Medicine Society journal. 29 (1).

Anuj K C. (2014). Multi-scale structural and chemical analysis of sugarcane bagasse in the process of sequential acid–base pretreatment and ethanol production by Scheffersomyces shehatae and Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology for biofuel. 7: 63.

Cazetta M.L. Celligoi M.A.P.C. Buzato J.B. and Sacarmino I.S. (2007). Fermentation of molasses by Zymomonas mobilis: Effect of temperature and sugar concentration on ethanol production. Bioresource Technology 98: 2824-2824

Christian D. D. and O’Reilly J. E. (1986). Instrumental Analysis. 2nd ed. Allyn and Bacon. Inc.

Donald E. S. (2004). เครองชงแบบคานชงยาวเทากน (Equal beam balance). คนเมอ 22 สงหาคม 2557, จาก https://www.lhup.edu/~dsimanek/museum/roberval.htm

Hallenbeck P.C. and Benemann J.R. (2002). Biological hydrogen production; fundamentals and limiting processes. International Journal of Hydrogen Energy. 27(11): 1185-1193.

Hamilton R. J. and Swell P. A. (1977). Introduction to High Performance Liquid Chromatography. London: Academic Press.

James A.T., Martin, A.J.P. and Smith. G.H. (1952). Gas-liquid partition chromatography: the separation and micro-estimation of ammonia and methyl amines. Ibid. 52, 238-242.

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บรรณานกรม 221

Jhon Dalton. (1802). Essay IV. On the expansion of elastic fluids by heat, Memoirs of the Literary and Philosophical Society of Manchester, vol. 5, pt. 2, p 595-602; see p 600.

Johannes Ahrens. (2557). หลกการทางานในสวนของเครองแกสโครมาโทกราฟ– แมสสเปกโทร มเตอร. จาก http://www.skz.de/de/forschung/technischeausstattung1 /pruefver fahren/spektroskopie สบคนเมอ 3 กนยายน 2557

John Dolan. (2557). หลกการทางานของเครองเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมทร. คนเมอ 11 ตลาคม 2557. จากhttp://www.sepscience.com/ Techniques/LC/Articles/695-/HPLC-Solutions-5-LC-MS-Calibration-vs-Tuning

John H. N. (2003). Nuclear Magnetic Resonance Spectrophotoscopy. United States of America: Pearson Education Inc.

Kaewnaree P. (2010). The biochemical changes during an accelerated aging and priming processes in sweet pepper (Capsicum annuum L.) seeds. A thesis for the degree of doctor of Philosophy Khan Khen University.


Kaewnaree P, Vichitphan S, Klunrit P, SIRI B and Vichitphan K. 2008. Electrolyte leakage and fatty acid changing association in accelerated aging sweet pepper seed. Journal of Biotechnology. 136: S651-S651.

Kellner R, Mermet J.-M., Otto M., Vacarcel M. and Widmer H.M. (2004). Analytical Chemistry: A modern Approach to Analytical Science Second Edition. Geramany: PhotoDisc Inc.

Mark S. C. and Edward I. P. (2013). Introductory Chemistry: An Active Learning Approach. 5th ed. University of Massachusetts, Amherst: Graphic World Inc.

Meier P. Lohrum A. and Gareiss J. (1989). Practice and Theory of pH Measurement. Ingold. Messtecknik. AG. Urdorf/Switzerland.

Meloan C. E. and Pomeranz Y. (1980). Food Analysis Laboratory Experiments. The AVI Publishing Company. Westport. Connecticut.

Miller GL. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analysis Chemistry. 31:426-428.

OSU State University. (2557). เครองโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง – แมสสเปกโทร เมทร. คนเมอ 9 ตลาคม 2557. http://fses.oregonstate.edu/HPLCMS.



Robert de Levie. (2001). How to Exel in Analytical Chemistry and in Genera Scientific Data Analysis. Press syndicate of the University of Cambridge. United Kingdom.

Siri Boonmee, Vichitphan Kanit, Kaewnaree Preeya, Vichitphan Sukanda and Klanrit Preekamol. (2013). Improvement of quality, membrane integrity and antioxidant systems in sweet pepper ('Capsicum annuum' Linn.) seeds affected by osmopriming, Australian Journal of Crop Science. 7(13), 2068-2073.

Skoog D. A. (1985). Principles of Instrumental Anaslysis. 3rd ed. Holt-Saunders International Editions.

Stoog D. A, Holler J. F and Nieman T.A. (1998). Principles of Instrumental Analysis. 5th ed. United States of America: Thomson Learning Inc.


Thomas G. (2009) Chasteen; Department of Chemistry, Sam Houston State University, Huntsville, Texas 77341. จาก http://www.shsu.edu/~chm_tgc/FPD/FPD.html สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

VCharKarn. (ม.ป.ป). เทคนคการสกดดวยตวดดซบของแขงปรมาณนอย (solid phase microextraction, SPME). คนเมอ 2 สงหาคม 2557, จากhttp://share.psu.ac.th/blog/sci-discus/17227

VISION SCIENTIFIC. (ม.ป.ป). เครองหมนเหวยงความเรวรอบสงมาก (Ultra speed centrifuge). คนเมอ 2 สงหาคม 2557, จาก http://www.tradekorea.com/product/ detail/P148717/Ultra_Speed_Centrifuge.html.

http://chemistryquiz.exteen.com/20081212/chromatography. สบคนเมอ 26 มนาคม 2558 http://fses.oregonstate.edu/GCMS-2. สบคนเมอ 26 มนาคม 2558 http://scicalgas.com/specialty-gas/instrument-gases/electron-capture. สบคนเมอ 26

มนาคม 2558 http://th.aliexpress.com/w/wholesale-high-speed-centrifuge.html. สบคนเมอ 2 สงหาคม

2557 http://www.biotechsci.in.th. สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ บรรณานกรม 223

http://www.coleparmer.com/Product/TLC_developing_thinline_tank_with_lid_capacity_two_10_x_10_cm_plates/EW-34105-00. สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

http://www.cosmetictestinglabs.com/2013-11-08-16-36-22/52-uv-visible spectrophotometer. html. สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

http://www.envision-lab.com/741842/wx-ultracentrifuge). สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557 http://www.gibthai.com/services/technical_detail.php?ID=28. สบคนเมอ 26 มนาคม 2558 http://www.merittech.co.th/index.php?lay=show&ac=cat_show_pro_detail&pid=1926

96). สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557 http://www.scimedia.com/chem-ed/sep/gc/detector/tcd.htm, updated 9/12/96. สบคน

เมอ 26 มนาคม 2558 http://www.skz.de/de/forschung/technischeausstattung1/pruefverfahren/

spektroskopie/4498.Gaschromatographie_mit_Massenspektrometrie-Kopplung_GCMS.html). สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

http://www.taradlab.com/product.detail_155367_th_1631552. สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557

https://www. http://dir.indiamart.com/impcat/chromatography-apparatus.html. สบคนเมอ 26 มนาคม 2558

https://www.google.co.th/search?q=เครองชง+Mettle. สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557 https://www.google.co.th/search?q=เครองพเอชมเตอร+Metler. สบคนเมอ 2 สงหาคม 2557

ภาคผนวก ก

เฉลยคาตอบแบบฝกหดทายบท

226 เฉลยคาตอบแบบฝกหด เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ เฉลยคาตอบแบบฝกหด 227

บทท 1

1) การวเคราะหดวยเครองมอ เปนการวดสมบตทางกายภาพและทางเคมของสารทสนใจแลวเปลยนใหเปนปรมาณสารนนได ซงปจจบนใชเทคนคและสมบตหลายอยางเขามาชวยในงานวเคราะห เชน การวดปรมาณไฟฟาเมอสารแตกตวเปนไอออน การใชเทคนคทางแสง การวดคาการดดกลนแสงแลวคานวณกลบเปนปรมาณสาร การใชสมบตหรอความสามารถในการละลายในตวทาละลายเพอแยกสารผสมออกจากกนหรอทเรยกวาเทคนคโครมาโทกราฟ ซงวเคราะหทงชนดและคานวณหาปรมาณสารได

2) การวเคราะหเชงคณภาพ คอ การวเคราะหหาชนดของสารเคมในสารตวอยางทอยในรปอนภาคตางๆ เชน อะตอม โมเลกล ไอออน สารประกอบ หรอสารประกอบเชงซอน การวเคราะหเชงปรมาณ เปนการวเคราะหสารโดยนาสมบตของสารแตละชนดทตองการวเคราะห สมบตของสาร เชน จดเดอด จดหลอมเหลว ขนาดหรอมวลโมเลกล การดดกลนแสง การเกดปฏกรยาเคม การละลายในตวทาละลาย สภาพขวของสาร เปนตน ขนอยกบสารทตองการวเคราะหเปนองคประกอบในตวอยางใด เปลยนสมบตของสารเปนปรมาณ

3) อะตอม โมเลกล ไอออน สารประกอบ หรอสารประกอบเชงซอน 4) จดเดอด จดหลอมเหลว ขนาดหรอมวลโมเลกล การดดกลนแสง การเกดปฏกรยาเคม

การละลายในตวทาละลาย สภาพขวของสาร 5) สารละลาย เปนสารทประกอบดวยตวทาละลาย และตวถกละลาย ละลายรวมกนผสม

กลมกลนเปนเนอเดยวกน 6) สารละลายความเขมขน 1 เปอรเซนต หมายถง ในสารละลาย 100 หนวย มตวถกละลาย

ละลายอย 1 หนวย สารละลายความเขมขน 1 โมลาร หมายถง ในสารละลาย 1,000 มลลลตร มตวถกละลายละลายอย 1 โมล

7) ความแมน (Accuracy) ระดบความไว (Sensitivity) ความเลอกเฉพาะ (Selectivity) ระยะเวลาการวเคราะห (Speed) คาใชจายในการวเคราะห (Cost) และการยอมรบในแงของกฎหมาย (Legality)

8) ความแมน คอ ในแงของความถกตองจะตองพยายามเลอกวธทใหผลใกลเคยงกบคาจรงมากทสด แตบางครงกมขอจากดจงไมสามารถเลอกวธทดทสดได จงตองกาหนดระดบความแมนทสามารถยอมรบได และเลอกวธทเหมาะสมกบระดบความแมนนน

9) เครองแกสโครมาโทรกราฟ 10) เครองสเปกโตรโฟโทมเตอร เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอร และ

เครองแมสสเปกโทรมเตอร


บทท 2

1) สารละลายเอทานอล 100 มลลลตร มเอทานอลละลายอย 10 มลลลตร และมนา 90 มลลลตร

2) 0.2 %(w/v) 3) สารละลายกรดไฮโดรคลอรก 100 มลลลตร มเนอของกรดละลายอย 30 g 4) 1 M (1 โมลตอลตร) 5) 2.925 % (w/v)

6) ใชสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดความเขมขนเรมตน 5 โมลาร ปรมาตร 100 มลลลตร เตมนาใหได 500 มลลลตร 7) สารละลายเอทานอล 50% (v/v) ปรมาตร 0.5 ลตร มเอทานอล 250 มลลตา

8) 126 กรม 9) นา 10) โซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร และ ฟอสเฟตบฟเฟอร


บทท 3

1) หลกการ เครองชงเปนเครองมอทจาเปนชนดหนงของหองปฏบตการวทยาศาสตร เพราะ การ

วเคราะหสวนใหญเปนการวเคราะหเชงปรมาณทตองอาศยเครองชงชวยในการวเคราะหเปรยบเทยบกบสารมาตรฐานทตองทราบปรมาณหรอความเขมขนทแนนอน มหนวยเปน มลลกรม กรม แลวแตชนดและความละเอยดของเครองชง

เครองพเอช หรอเครองวดความเปนกรด-ดาง เปนเครองมอทอาศยหลกการวดความตางศกย (Electrical potential) ทเกดขนระหวางอเลกโทรดวด (Indicator electrode) ซงจมอยในสารละลาย แลวเปลยนคาตางศกยไฟฟาเปนคาพเอช โดยการเทยบคากบบฟเฟอรมาตรฐาน (Standard buffer) การคานวณคาพเอชดดแปลงมาจากสมการของเนนสต (Nernst,s equation) ซงหาคาแรงเคลอนไฟฟาของเซลลไฟฟา(Electrical cell) ใดๆ โดยการวดเทยบกบไฮโดรเจนอเลกโทรด (Hydrogen electrode) ซงกาหนดใหมแรงเลอนไฟฟาเทากบ 0.0000 โวลล ท 25๐C

เครองปนเหวยงเปนเครองมอพนฐานทจาเปนสาหรบเรงอตราการตกตะกอนของอนภาค (Particle) ทไมละลายออกจากของเหลวหรอใชแยกของเหลวหลายๆ ชนดทมความถวงจาเพาะ (Specific gravity) ตางกนออกจากกน ใชทาสารละลายใหเขมขนขนฯลฯ ปจจบนเครองปนเหวยงไดมการพฒนาไปจนสามารถทจะวเคราะหชนดของสารหานาหนกโมเลกลของสารไดโดยอาศยคณสมบตของตวกลาง คณสมบตของอนภาคทแตกตางกน และการสรางแรงหนศนยกลางทเกดจากการหมนรอบจดหมน (Center of rotation) ในความเรวรอบทสงมากในดานรปแบบพบวามการพฒนาใหมขนาดเลกลงมประสทธภาพสงขน เนองจากอาศยระบบคอมพวเตอรเขามาชวยควบคมและตรวจสอบการทางานมากขน

เปนการใชความรอนเพอกาจดเชอ ในปจจบนการใชความรอนสาหรบทาลายจลนทรยม 2 แบบ คอ ความรอนแบบชน และความรอนแบบแหง สาหรบการใชความรอนแบบชน เชน กาตม การนง เปนตน ไอนาทเกดขนสามารถนาพาความรอนแทรกซมเขาไปในจลนทรยไดรวดเรว ความรอนแบบนจงฆาเชอโรคไดอยางรวดเรว สวนความรอนแบบแหง เชน การเผา การอบ เปนตน เนองจากไมมไอนาชวยนาพาความรอน เวลาทใชเพอการทาลายเชอจงนานกวา เพราะตองรอเวลาใหความรอนผานซมเขาไปในเนอสาร เพอการทาลายเชอภายในดวย อยางไรกดความรอนแบบแหงเหมาะกบผลตภณฑทไอนาไมสามารถเขาถงหรอจะเกดการแยกตวหรอสญเสยคณสมบตเมอถกความชน

2) A คอ สายไฟ B คอ ชองอากาศ C คอ สารละลายโพแทสเซยมคลอไรด D คอ

อเลกโทรด E คอ เมมเบรน 3) เครองพเอช วดคาความเปนกรด-ดางของนาหมก เครองชง ใชชงนาหนกของสาร เครองปนเหวยง ใชตกตะกอนเซลลเพอหามวลเซลล เครองนงฆาเชอความดนไอนา ใชซาเชอในอาหารเพาะเลยงกอนการตดตามการเจรญของ

เซลลจลนทรย


4) เครองชงแบงออกเปน 2 ชนด คอ แบงเครองชงโดยอาศยความถกตองในการชงออกเปน 2 ชนด คอ เครองชงหยาบซงมความถกตองอยในชวง 0.1 กรม ถง 0.01 g และเครองชงละเอยดหรอเครองชงวเคราะห (Analytical balance) ซงมความถกตองในการชงอยในชวง 0.001 g ถง 0.00001 g

5) 3 ชนด คอ เครองปนเหวยงความเรวรอบตา (Low speed centrifuge) เครองปนเหวยงความเรวรอบสง (High speed centrifuge) และ เครองหมนเหวยงความเรวรอบสงมาก (Ultra speed centrifuge) 6) เครองชง

1. วางเครองชงในบรเวณทแยกจากเครองมออน ๆ บนโตะทมการสนสะเทอนนอยควรอยในบรเวณทไมมการเดนพลกพลาน มแสงสวางพอเพยง (ควรใชหลอดฟลออเรสเซนซใหแสงสวางเพราะใหความรอนนอยกวาหลอดทงสเตน) ไมควรตรงชนหนาตาง เพราะอาจถกฝนหรอความรอนจากแสงแดด 2. ควรตดตงเครองควบคมกระแสไฟฟา (Voltage stabilizer) เพมเตมใหกบเครองชงแบบอเลกทรอนกส 3. เมอไมไดใชงานเปนเวลานานควรใสถงดดความชนในตเกบเครองชงเพอปองกนการเกดสนมและการเกาะของไอนา 4. หามวางวตถทจะชงลงบนจานชงโดยตรง โดยเฉพาะวตถทเปนของเหลวหรอเปยกชน 5. ไมควรใชมอเปลาจบตมนาหนกมาตรฐาน 6. การชงสารเคมทสามารถกดกรอนโลหะตวอยางเชน ผลกไอโอดน (I2) และสารประกอบของไซยาไนด ควรใสในขวดชงสารเคมทมฝาปดมดชด 7. ควรตรงคานและจานชงทกครงเมอใสวตถบนจานชง เอาวตถออกจากจานชง การหมนปมควบคมนาหนก การเคลอนยายเครองชง ฯลฯ เพราะถงแมวาคมมดจะแขงเพราะทาจาก แซฟไฟร (Sapphire) หรอโลหะผสมอะลมเนยมกตามแตการถกกระแทกบอย ๆ อาจทาใหเกดการแตกบนซงเปนผลใหความไวของเครองชงลดลง 8. ควรทาความสะอาดทนทเมอเครองชงสกปรก โดยเฉพาะสงสกปรกทเปน ของเหลว 9. หลงจากใชงานเสรจควรตรงคานและจานชง หมนปมควบคมทกปมมาอยท ตาแหนงศนย 7) เครองปนเหวยง 1. ศกษาวธการใชงานและขดจากดตางๆ ในการใชงาน จากคมอใชงาน (Operating manual) โดยเฉพาะความเรวรอบสงสด ชนดและขนาดของหลอดปนและชนดหวหมนทใชอยางปลอดภย 2. ตรวจสภาพความพรอมของเครองปนเหวยงกอนใชงาน เชน ระดบนามนหลอลน แปรงถาน ความสะอาดของกระบอกใสหลอดปน กระบอกใสหลอดปนมยางกนแตกอยครบหรอไมฯลฯ 3. ไมควรใชหวหมนของเครองปนเหวยงเครองหนงกบเครองปนเหวยงอกเครองหนงเพราะอาจมคณสมบตทางกายภาพทแตกตางกน ควรทาเครองหมายของหวหมนแตละเครองไว


4. การใสนาหนกใหสมดล การสมดลของหวหมนของเครองหมนเหวยงคอการทาใหศนยกลางของการหมนของนาหนกซอนทบจดหมนตาง ๆ พอดความสมดลของนาหนกรอบๆ จดหมนใดๆ ยอมกอให เกดการหมนทราบเรยบและคงท ทาใหอนภาคตกตะกอนแยกชนได ด ลด การสนสะเทอน ลดเสยงดง ลดอนตรายตลอดจนยดอายการใชงาน 5. ใชหลอดปนทมขนาดพอดกบกระบอกใสหลอดปน ถาไมพอดตองใชยางปรบขนาด 6. ตรวจดความยาวของหลอดปนเสมอถาเปนหวหมนแบบมมคงทควรดวาความยาวของหลอดปนวาจะกระทบกบฝาปดชองใสหวหมนหรอไม ความยาวของหลอดปนจะเสยดสกนเองไดหรอไม ถาเปนหวหมนแบบมมแกวง ควรตรวจดระยะทปลายหลอดปนจะกระทบกบแกนหมนเมอ หลอดปนอยในแนวราบ 7. ไมควรปนแยกสารเคมทตดไฟหรอระเบดไดงาย เพราะประกายไฟทมอเตอรอาจทาใหเกดไฟลกขน 8. สาหรบเครองปนเหวยงความเรวสงหรอความเรวสงมาก ควรเปดเครองทาความเยนจนไดความเยนทตองการ และเปดเครองดดอากาศจนเกดสญญากาศภายในชองใสหวหมนกอนเปดสวทชหวหมนใหทางาน 9. ควรตงเวลาปนแยกกอนหมนปมควบคมความเรว 10. เพมความเรวของมอเตอร ดวยการหมนปมควบคมความเรวอยางชาๆ 11. ไมควรเปดฝาปดชองใสหวหมนขณะทหวหมนกาลงหมนดวยความเรวสง เพราะอาจกอใหเกดอนตรายไดงายและชวยทาใหเกดการฟงกระจายของเชอโรคไดดขน 12. เครองหมนเหวยงทไมมระบบหยดหมนของมอเตอร ควรปลอยใหหวหมนหยดหมนเองไมควรใชมอหรอวตถอน ๆ หยดหวหมน 13. ไมควรพยายามดงหลอดปนออกในขณะทหวหมนยงไมหยดสนท 14. ในขณะปนถามความผดปกต หรอเกดความไมสมดลควรปดสวทชหยดการทางานของมอเตอรทนท 15. ทาความสะอาดหวหมนและชองใสหวหมนทกครงหลงจากใชงาน

16. ถาโวลตของกระแสฟาตกมากมากไมควรใชเครองปนเหวยง เพราะทสภาวะนมอเตอรจะดงกระแสไฟฟามากกวาปกต ซงอาจทาใหเกดความรอนมากจนขดลวดทองแดงของมอเตอรไหมนอกจากนยงอาจทาใหวงจรควบคมการทางานตางๆ ทางานผดพลาด

8) 1. เครองมอทเกดการปนเปอนหรอเครองมอทนาไปใชเกยวของกบเชอจลนทรย 2. สงเพาะเลยงและหวเชอทเกดการตดเชอหรอปนเปอนจาก แบคทเรย เชอราและไวรส 3. อปกรณอนทเกดการปนเปอนเชน กระดาษผา เสอผาปเปตทปแบบพลาสตก ปเปตแกว หลอดทดลองทงขนาดเลกและใหญ (Tube, vial) ถงมอและจานเพาะเชอทใชแลว 4. ตวอยางเนอเยอสตวทงทเกดและไมเกดการตดเชอ 5. กรงขงสตวตดเชอ

6. ชนตวอยางจากเซลลพชและสตวทมดเอนเอลกผสม 9) คานวณจากความเขมขนของความเขมขนของไฮโดรเจนไอออน มหนวยเปนโมลาร


10) เครองชง


บทท 4

1) สเปกโทรสโกป หมายถง การแยก การตรวจสอบ และการบนทกของพลงงานทเปลยนไปเกยวกบนวเคลยส อะตอม ไอออน หรอโมเลกล พลงงานทเปลยนไปนนเนองจากการเกดอมสชน (Emission) การกลนแสง (Absorption) การกระเจง (Scattering) ของการแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอของอนภาค เทคนคนจงนาไปใชแกปญหาทางการวเคราะหไดกวางขวางและหลากหลายดวยหลกการเดยวกน คอ อาศยการเกดอตรกรยาของสาร

2) ม 3 แบบ คอ การเกดอมสชน (Emission) การกลนแสง (Absorption) การกระเจง (Scattering) ของการแผรงสแมเหลกไฟฟาหรอของอนภาค

3) Visible UV และ X-ray 4) เมอใชลาแสงหรอ Beam of radiation ผานเขาไปยงสารละลายหรอวตถใดวตถหนง จะพบเสมอวาบางสวนของรงสนนถกดดกลน (Absorbed) บางสวนผานทะลออกไป (Transmitted) บางสวนเกดการสะทอนกลบ (Reflected) และบางสวนอาจกระเจง (Scattered) อยางใดอยางหนง หรอเกดขนหลายๆ อยางพรอมๆ กน

5) 5.1 การหมนของโมเลกล (Rotational molecules) 5.2 อเลกตรอนวงนอกสดอยในภาวะกระตน (Valence-electron excitation)

5.3 เกดการหมนและการสนของโมเลกล (Rotation of molecules and Vibration of molecules) 6) X-Ray Ultraviolet, Visible Infrared และMicrowave 7) อเลกตรอนโวลต (Electron volt) ใชตวยอวา eV เปนหนวยของพลงงานทใชกบพวก การแผรงสแมเหลกไฟฟาทมพลงงานคอนขางสง เชน X-Ray หรอ UV 8) พลงงาน 1 eV หมายถง พลงงานทจะทาใหอเลกตรอนเคลอนทผานศกยไฟฟา (Potential) 1 โวลต หรอเปนพลงงานของ โฟตอน ทมคาเทากบ 1.602 x 10-12 erg 9) คาการดดกลนแสง (Absorbance) มความสมพนธโดยตรงกบปรมาณสารทมหนวยความเขมขนของสารเปน เปอรเซนต มลลกรมตอลตร ไมโครกรมตอลตร หรอกรมตอลตร 10) อนฟราเรด ตรวจสอบ หมฟงชนในโมเลกลของสาร เชน OH- ใน H2O และ ใน CH3OH ยวและวสเบล ตรวจสอบ โมเลกลของสารประกอบหรอสารประกอบเชงซอน เชน นาตาลกลโคส (C6H12O6) เอกซเรย ตรวจสอบ พนธะเคมภายในโมเลกลของสาร เชน พนธะเดยว พนธะค หรอพนธะสาม ในสารประกอบไฮโดรคารบอน


บทท 5

1) A คอ Light source

B คอ Diffraction grating C คอ Slit D คอ Rotating disc

E คอ Minor F คอ Sample cell G คอ Refferent cell H คอ Detector and Computor I คอ Chart recorder

2) เครองยว-วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร (UV-vis Spectrophotometer) เปนเครองมอทใชวดปรมาณของสารเคมชวโมเลกลรวมถงจลชพทงหลายโดยใชหลกการวดปรมาณของแสงทตวอยางดดกลนเขาไปตวเครอง เปนเครองมอทใชในวเคราะหสารโดยอาศยหลกการดดกลนรงสของสารทอยในชวง Ultra violet (UV) และVisible (VIS) ความยาวคลนประมาณ 190-1000 nm สวนใหญเปนสารอนทรย สารประกอบเชงซอน หรอสารอนนทรย ทงทมสและไมมส สารแตละชนดจะดดกลนรงสในชวงความยาวคลนทแตกตางกนและปรมาณการดดกลนรงสกขนอยกบความเขมของสารนน การดดกลนแสงของสารตางๆเปนสดสวนโดยตรงกบความเขมขนของสาร จงสามารถวเคราะหไดในเชงคณภาพและปรมาณ

3) สเปกโทรโฟโตมเตอรแบบลาแสงเดยว (Single beam spectrophotometer) หลกการทางาน คอ เมอแสงออกจากแหลงกาเนดแสงจะผานโมโนโครเมเตอรทเปนเกรตตง และสารตวอยางตามลาดบ แลวจงเขาสตวตรวจจบสญญาณ ตลอดเสนทางของลาแสงนมลาแสงเดยว จงเรยกสเปกโตรโฟโทมเตอรประเภทนวาแบบลาแสงเดยว สเปกโทรโฟโตมเตอรแบบลาแสงค (Double beam spectrophotometer มหลกการทางาน คอ เมอลาแสงจากแหลงกาเนดแสงออกจากชองแสงออก (Exit slit) แลวลาแสงจะไปสอปกรณตดลาแสง (Beam chopper) ซงจะทาหนาทสะทอนลาแสงไปผานสารตวอยาง (Sample) ในขณะตอมาจะสะทอนลาแสงไปผานสารอางอง (Reference) ซงกคอแบลงคนนเองโดยทลาแสงทงสองจะมความเขมแสงเทากนกอนทจะผานสารตวอยางหรอสารอางองเมอลาแสงทงสองนไปตกกระทบบนตวตรวจจบสญญาณ ความแตกตางของความเขมแสงหลงจากผานสารตวอยางหรอสารอางองจะกลายเปนคาการดดกลนแสงของตวอยาง 4) Deuterium Lamp (190-420 nm) Tungsten Lamp (350-2500 nm) 5) นาตาล คลอโรฟลล และความหนาแนนของเซลล 6) ปรมาณไนเตรทในนาทงทเพาะเลยงสาหราย ปรมาณฟอสฟอรสในใบพช และปรมาณสารแอนตออกซแดนซในผลไม


7) โมโนโครเมเตอรเปนสวนประกอบทสาคญของเครองสเปคโทรโฟโตมเตอรโดยทาหนาทควบคมความยาวคลน จะทาใหแสงทมความยาวคลนตางๆ ทออกมาจากแหลงกาเนดแสงเปลยนเปนแสงทมแถบแสงแคบๆ 8) ควเวตตม 3 แบบ คอ ควเวตตแบบ แกว พลาสตก และควอตซ 9) โดยกฎของเบยร และแลมเบรต เกยวกบการดดกลนของแสงกบความหนาของเหลวทมส กลาววาทแตละชนของความหนาทเทากนจะดดกลนแสงทผานในเศษสวนทเทากนนนคอ เมอลาแสงของแสงโมโนโครมาตก (Monocromatic Light) ฉายผานตวกลางทดดกลน (Absorb medium) ซงกคอ สารละลายทมส ความเขมขนของแสงจะลดลงในรปของฟงคชนเอกซโพแนนเชยล ในขณะทความยาวของตวกลางมากขน “อตราของแสงทถกดดกลนไวจะผนแปรเปนสดสวนโดยตรงกบความเขมขน และระยะทางทแสงนนสองผาน” 10) นา อะซโตไนไตรท และคลอโรฟอรม


บทท 6

1) A คอ Octal base plug

B คอ Connecting pins C คอ Supports D คอ Mica shields

E คอ Anode F คอ Cathode G คอ Glass envelope H คอ Graded seal I คอ Silica window 2) เปนการวเคราะหธาตโดยวดการดดกลนคลนแสงของอะตอมอสระทกลายเปนไอของธาตทสนใจ อะตอมอสระของธาตจะดดกลนคลนแสงจากแหลงกาเนดคลนแสงเฉพาะของแตละธาต ปรมาณแสงทถกดดกลนจะมความสมพนธกบปรมาณหรอความเขมขนของธาตททาการวเคราะหตามกฎของแลมเบรต-เบย ไดอะแกรมของเครอง AAS

3) 1. แหลงกาเนดแสง (Light source) นยมใชหลอดฮอลโลวคาโทด (Hollow cathode lamp) เปนแหลงกาเนดแสงบนเสน (Line source) ใชเปนแหลงกาเนดแสงของเทคนค จะใหสเปกตรมและความยาวคลนแสงทตองการได 2. สวนททาใหธาตกลายเปนอะตอมเสร ทาใหอะตอมในตวอยางเปนอะตอมเสรนนนยมใช ม 2 กระบวนการคอ ทาใหธาตแตกตวเปนอะตอมอสระโดยเปลวไฟ (Flame Atomization) และธาตแตกตวเปนอะตอมอสระดวยความรอนจากไฟฟา (Furnace หรอ Electrothermal หรอ Electrothermal หรอ Flameless Atomization) 3. โมโนโครเมเตอร ทาหนาทแยกแสงจากแหลงกาเนดแสงใหไดความยาวคลนทตองการวด 4. ดเทคเตอร ทาหนาทเหมอนกบดวงตา ทจะเปลยนความเขมของแสงใหเปนกระแสไฟฟา ปกตแลวดเทคเตอรจะเปนหลอดโฟโตมลตพลายเออร (Photomultiplier tube, PMT) ทจะปลอยกระแสไฟฟาตอจากนนจงขยายสญญาณเปนสวนทเปนระบบอเลกทรอนคส แลวสญญาณกจะถกแปลงตอใหอานออกมาในหนวยความเขมขนหรอความเขมของแสง 5. เครองประมวลผล ประมวลผลออกมาในรปของการดดกลนแสงการวเคราะหโดย Flame atomization จะใชสารละลายผานเขาไปในเปลวไฟอยางสมาเสมอในชวงเวลาททาการวดจะ

Light source Monochromater Atomizer Detector Data processor


ออกมาเปนเสนกราฟทเปน Steady state เปนการดดกลนแสงเปนคาแอบซอบแบนซ สวน Graphite atomization

4) อะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโทรโฟโตมเตอรแบบ Flame กระบวนการทาใหสารตวอยางแตกตวเปนอะตอมดวยเปลวไฟ (Flame) และแบบ Graphiteกระบวนการทาใหสารตวอยางสลายตวเปนอะตอมไดดวยความรอนจากกระแสไฟฟาทาใหเกด Atomization process

5) ใชหาปรมาณแคลเซยมในนานม ปรมาณโพแทสเซยมในดน และปรมาณเหลกในผก 6) เนองจากธาตบางชนดจะเปลยนใหเปนอะตอมโดยตรงดวยเทคนค Flam Atomization และ Electrothermal atomization ไมได จาเปนตองใชวธทาใหแตกตวในบรรยากาศทปราศจากออกซเจนเพอปองกนการรวมกบออกซเจน ดงนน จงตองใชวธทาใหธาตเหลานนกลายเปนสารทเปนไอไดงายๆ ทอณหภมหองดวยการรดวซ (Reduce) ใหเปนไฮไดรด (Hydrided) แลวใหไฮไดรด นนผานเขาไปในเปลวไฟไฮโดรเจนจะทาใหธาตกลายเปนอะตอมอสระได 7) Internal Standard Method วธวเคราะหนอาศยหลกการเตมสารมาตรฐาน (Reference element) ซงเปนคนละธาตกบสารทสารทจะวเคราะหลงไปในสารตวอยาง และ Blank หลงจากวดคาแอบซอรแบนซ แลวหาอตราสวนของแอบซอรแบนซระหวางสารตวอยางและสารมาตรฐาน (AU/AS) จากนนไปเขยนกราฟกบความเขมขนของธาตทจะทาการวเคราะหจะได Calibration curve เพอใชหาความเขมขนของสารละลายตวอยางตอไป 8) ตวอยางตองผานการยอยดวยกรดไดสารละลายใส สารตวอยางตองอยในสภาวะกรดเพอใหโลหะทตองการวเคราะหเปนสารละลายเนอเดยวและแตกตวเปนอะตอมอสระ


บทท 7

1) โครมาโทกราฟเปนเทคนคทใชแยกและวเคราะหสารใหบรสทธกอนนาไปวเคราะหเชงคณภาพหรอเชงปรมาณหรอเพอกาจดสารทปนเปอนมากบกบสารละลายตวอยาง โดยอาศยวฏภาค 2 วฏภาค คอ วฏภาค นง (Stationary phase) ทาหนาทหนวงสาร และวฏภาคเคลอนท (Stationary phase) ทาหนาทพาสารผสมแยกออกจากกน

2) ทงหมด 5 แบบ ไดแก โครมาโทกราฟแบบกระดาษ (Paper chromatography) โครมาโทกราฟแบบเยอบาง (Thin layer chromatography) โครมาโทกราฟแบบคอลมน (Column chromatography) โครมาโทกราฟแบบแกส (Gas chromatography) และโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง (High performance liquid chromatography)

3) วฏภาคนง (Stationary phase) ซงอาจเปนของแขงหรอของเหลวทเคลอบบนของแขงหรอเจล (Gel) ทบรรจอยในคอลมน หรอกระจายตวเปนชนบางๆ หรอกระจายตวเปนฟลม ทาหนาทหนวงสารใหแยกออกจากกน

4) เอทานอล และนา 5) เปนวธการขนแรกทใชแยกองคประกอบของตวอยางโดยอาศยการกระจายตวระหวาง

สองวฏภาค (Phase) วฏภาคแรกเปนวฏภาคนงหรออยกบท (stationary phase) ซงอาจเปนของแขงหรอของเหลวทเคลอบอยบนของแขงหรอเจลทบรรจอยในคอลมนหรอกระจายตวเปนชนบางๆ หรอกระจายตวเปนฟลม สวนอกวฏภาคเปนวฏภาคไหล (Mobile phase) ซงอาจเปนกาซหรอของเหลวกไดกระบวนการโครมาโตกราฟค

6) เปนคาทบอกใหทราบวาพกของสารสองชนดทอยแยกออกจากกนดเพยงใดการแยกออกจากกนนขนกบคาเวลาการคงไวหรอคา k' เทานนโดยไมคานงถงความกวางของพคและคานเกยวของกบ Relative partition coefficient ของสารสองชนดหาไดจากอตราสวนของ Partition coefficient หรออตราสวนของแฟคเตอรความจของสารสองชนดทมพคตดกน 7) เวลาทใชในการทาใหตวถกละลายเคลอนทไดเทากบ 1 คอลมน ซงมคาเทากบความยาวของคอลมนหารดวยอตราเรวของการเคลอนทของตวถกละลาย ในโครมาโตแกรมสามารถหาคา tR ไดจากการวดระยะทางตงแตเรมใสสารตวอยางลงในคอลมนจนถงสวนยอดของพค 8) อานาจการแยก (Resolution) คอ การแยกสารออกจากกนไดดหรอไมสามารถกาหนดไดจากอตราสวนระหวางคา Retention time ระหวาง 2 พคและคาเฉลยของความกวางทฐานพค 9) อตราสวยระหวางระยะทางทสารเคลอนทไดตอระยะทางตวทาละลายเคลอนทไดของสารแตละชนดเปนคาคงทของสารชนดนนๆ ซงสามารถบอกชนดของสารได หรอเวลาทสารเคลอนทในคอลมนมความจาเพาะตอสภาวะนนๆ บอกชนดของสารได


10) โครมาโทกราฟแบบกระดาษ (Paper chromatography, PC) การใชกระดาษใน โครมาโทกราฟจะพจารณาในระบบ Partition ซงวฏภาคนง (Stationary phase) และวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) เปนของเหลวททาหนาทชะสารตวอยางผสมใหแยกจากกน โครมาโทกราฟแบบเยอบาง (Thin layer chromatography) การตรงแผนเยอบางบนของแขงเฉอย ซงเปนวฏภาคนง (Stationary phase) ซงเปนตวดดซบเฉอย (Inert adsorbent) และสารละลาย ทระเหยงายเปนวฏภาคเคลอนท (Mobile phase) ตรวจสอบการแยกของสารโดยวธ ทางกายภาพ เชน การมอง ฟลออเรสเซนซ (Fluorescence) หรอ Radiation หรอสารเคมฉดพน


บทท 8

1) A คอ Solvent B คอ Pumps C คอ. Mixer D คอ Injector

E คอ Column F คอ Detector G คอ Chromatogram

2) โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง (High Performance Liquid Chromatography; HPLC) หรอทนยมเรยกกนวา HPLC เปนโครมาโทกราฟรปแบบหนงทใชแยกสารผสมโดยอาศยวฏภาค (Phase) สองวฏภาค โดยทวฏภาคหนงอยกบท เรยกวาวฏภาคคงท (Stationary phase) ซงอาจจะเปนของแขงหรอของเหลวกได และอกวฏภาคหนงเปนของเหลวททาหนาทพาสารเคลอนทผานวฏภาคคงทในคอลมน เรยกวา วฏภาคเคลอนท (Mobile phase) ซงเคลอนทโดยอาศยแรงดนจากเครองสบแรงดนสง (High pressure pump) ตลอดระยะเวลาทกระบวนการแยกสารดาเนนไปอย มความจาเพาะกบงานวเคราะหสารทระเหยกลายเปนไอยาก เชน ชนดและปรมาณนาตาล ชนดและปรมาณกรดอนทรย ชนดและปรมาณของกรดอะมโน เปนตน 3) เครองสบ (Pumps) อปกรณสาหรบเกรเดยนตอลชน (Gradient Elution Devices) ระบบนาสารเขา (Sample Introduction Systems) ผานเขาคอลมนซงทาหนาทแยกสารออกจากกน และเขาสดเทคเตอรสาหรบตรวจสอบชนดและปรมาณสาร 4) ม 3 ชนด คอ ดเทคเตอรชนดรแฟรคทฟอนเดกซ (Refractive Index Detector) ดเทคเตอรชนดยว (UV Detector) และดเทคเตอรชนดเคมไฟฟา (Electrochemical Detectors) 5) ชนดและปรมาณนาตาล กรดเบนโซอก และกรดอะมโน 6)

A คอ HPLC optional B คอ Mixing tee C คอ Infusion pump D คอ Interface

E คอ MS 7) เทคนคโครมาโทกราฟแบบของเหลวแรงดนสง-แมสสเปกโทรเมตรเปนการเชอมตอเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงเขากบเทคนคแมสสเปกโทรเมตรเพอใหไดเทคนคการวเคราะหทมประสทธภาพขนเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสงจะสามารถแยกองคประกอบของสารผสมไดในขณะทเทคนคแมสสเปกโทรเมตรมจดเดนในดานความเฉพาะเจาะจงความวองไวและความรวดเรวในการใหขอมลเกยวกบโครงสรางขององคประกอบทแยกโดยเทคนคโครมาโทกราฟของเหลว


สมรรถนะสงเมอทาใหโมเลกลเกดการสญเสยอเลกตรอนโมเลกลจะกลายเปนไอออนและมประจบวกซงถาโมเลกลทมประจบวกนมพลงงานสงพอจะเกดการแตกตวออกเปนสวนยอยๆซงอาจเปนอนภาคทเปนกลาง (N) อนภาคทเปนแคตไอออนแรดเคล (A•+) หรอแคตไอออน (A+) ในทานองเดยวกนถาไอออนยอย (A•+หรอ A+) มพลงงานมากพอกจะเกดการแตกตวตอไปอกเปนไอออนยอยตอไปเรอยๆจนเหลอพลงงานนอยสดทไมสามารถแตกตวตอไปไดอกเมอพจารณา แมสสเปกตรมจะบงบอกถงลกษณะการแตกตวของโมเลกลไอออนหรอรวมรปแบบการแตกตวของแตละไอออนทงหมดเขาดวยกนจะไดรปแบบการแตกตวของโมเลกลทเปนลกษณะเฉพาะของสารแตละชนดสวนแมสสเปกโทมเตอรจะเปนเครองมอทใชแยกและวดมวลของไอออนดวยการใชอตราสวนมวลตอประจ (m/z) จงมคาเทากบมวลของไอออนโดยตรง 8) โดยทวไปเครองจะมสวนทสาคญอย 3 สวน 1) แหลงททาใหเกดไอออนไนเซชน (Ionization source) 2) สวนทใชในการวเคราะหมวล (Mass analyzer) และ3) สวนทใชในการตรวจวดไอออน (Detector) 9) Electrospray Ionization (ESI) เปนเทคนคการไอออไนเซชนทความดนบรรยากาศการผลตไอออนดวยเทคนคนเหมาะสาหรบการวเคราะหสารตวอยางซงอยในรปของไอออนในตวทาละลาย 10) ชนดสามารตรวจสอบไดจากเวลาทสารเคลอนทออกมาจากคอลมนมหนวยเปนนาท ซงสารแตละชนดจะใชเวลาในการเคลอนทออกจากคอลมนคงททสภาวะหนงๆ และปรมาณสารสามารถคานวณไดจากความสงหรอพนทใตกราฟเทยบกบกราฟมาตรฐาน ถาความสงหรอพนทใตกราฟมากแสดงวาปรมาณสารทตองการวเคราะหในตวอยางมาก


บทท 9

1) A คอ Gas cylinder B คอ Bypass valve C คอ Sample injector syring D คอ Injector port

E คอ. Column Oven F คอ Detector G คอ Computer

2) เครองแกสโครมาโทรกราฟ ใชเทคนคการแยกองคประกอบของสารผสม โดยอาศยความแตกตางของอตราการเคลอนทของแตละองคประกอบของสารผสมบนเฟสคงท (Stationary phase) ภายใตการพาของเฟสเคลอนท (Mobile phase) สาหรบเครอง GC เฟสคงท คอ สารทอยภายในคอลมน สวนเฟสเคลอนท คอ แกสฮเลยม เมอสารทตองการวเคราะหผานเขาสเครอง GC สารดงกลาวจะถกเปลยนสถานะจากของเหลว (Liquid) เปนแกส (Gas) และสวนแกสของสารผสมจะถกพาเขาสคอลมนโดยแกสฮเลยม ซงภายในคอลมนจะเกดการแยกสารผสม (Separation) โดยอาศยการทาปฏกรยา (Interaction) ระหวางสารทอยภายในคอลมน (Stationary phase) และสารผสม

3) คอลมนทใชในกาซโครมาโทกราฟม 2 ชนด ไดแก แพคคอลมน (Packed column) และคาปลาร (Capillary column) 4) ไฮโดรเจนเฟลมดเทคเตอรม 5 ชนด คอ (Hydrogen flame detector ;HFD) เฟลมไอออไนเซชนดเทคเตอร (Flame ionization detector; FID) เทอรมลคอนดกตวตดเทคเตอร (Thermal conductivity detector; TCD) เฟลมโฟโตเมตรกดเทคเตอร (Flame photometric detector; FPD) และอเลกตรอนแคพเทอรดเทคเตอร (Electron capture detector; ECD) 5) ชนดและปรมาณ กรดไขมนระเหยงาย แอลกอฮอล และแกสชวภาพ 6) A คอ GC

B คอ Data system C คอ Interface D คอ Ionization source

E คอ. Analyzer F คอ Force pump G คอ Detector

H คอ Vacuum 7) สปมส (Solid phase microextraction; SPME) คอ การสกดดวยตวดดซบของแขง

ปรมาณนอย สาหรบการวเคราะหสไตรนตกคางในอาหารบรรจภณฑเนองจากขนตอนการเตรยมตวอยางมความสาคญในกระบวนการวเคราะห ซงมกระบวนการสาคญ ๆ คอ การสกด (Extraction)


การเพมความเขมขน (Preconcentration) และการกาจดสงรบกวนออกจากตวอยางกอนการวเคราะหนนคอเทคนคการสกดสารดวยตวดดซบของแขงปรมาณนอย ซงมลกษณะการใชงานอยสองรปแบบ แบบแรกคอการสกดสารทสนใจจากตวอยางโดยตรง (Direct-immersion) และแบบทสองคอสกดผานบรเวณเฮดสเปซ (Headspace) 8) เทคนคเฮดสเปซ (Headspace) เทคนคนจะทาใหสารอนทรยทสามารถระเหยไดระเหยออกจากสารตวอยางและวเคราะหไอระเหยทเกดขนซงทาใหไมมการรบกวนของสารตางๆ ทมจดเดอดสงในกรณทสารตวอยางเปนของแขงหรอของเหลวโดยทมสารทระเหยไดและระเหยไมได ถาตองการหาสวนทระเหยได สามารถทาไดโดยใช head space technique ซงตางจากเทคนคแกสโครมาโทกราฟทวไปตรงทวธการใช Sample injector เทานน คอ จะนาสวนทเปนไอซงอยเหนอสวนทไมระเหยทเปนของแขงหรอของเหลวนนไปฉดเขาเครองแกสโครมาโทกราฟ 9) เทคนคแกสโครมาโทกราฟ–แมสสเปกโทรมเตอร เปนวธทสามารถบอกชนดขององคประกอบทมอยในสารไดอยางคอนขางแมนยาโดยอาศยการเปรยบเทยบ Fingerprint ของเลขมวล (Mass number) ของสารตวอยางนน ๆ กบขอมลทมอย นอกจากนเทคนคนยงมความสามารถในการวเคราะหไดทงในเชงปรมาณ (Quantitative analysis) และเชงคณภาพ (Qualitative analysis) ไดอยางถกตอง Mass Spectrometer เปน ดเทคเตอรทใชตรวจวดองคประกอบทมอยในสารตวอยาง โดยอาศยกลไกคอโมเลกลขององคประกอบทถกแยกออกมาจากสารตวอยางโดยเครองแกสโครมาโทกราฟ นนจะถกไอออไนซในสภาวะทเปนสญญากาศ แลวตรวจวดออกมาเปนเลขมวล (Mass number) เทยบกบขอมลอางองแลวแปลผลออกมาเปนชอขององคประกอบนน ๆ 10) ชนดและปรมาณ ชนดของสารสามารถตรวจสอบไดจากเวลาทสารเคลอนทออกมาจากคอลมนมหนวยเปนนาท ซงสารแตละชนดจะใชเวลาในการเคลอนทออกจากคอลมนคงททสภาวะหนงๆ และปรมาณสารสามารถคานวณไดจากความสงหรอพนทใตกราฟเทยบกบกราฟมาตรฐาน ถาความสงหรอพนทใตกราฟมากแสดงวาปรมาณสารทตองการวเคราะหในตวอยางมาก

ภาคผนวก ข

บทปฏบตการ

246 ปฏบตการท 1 การวดปรมาตร เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

ปฏบตการท 1

เรอง การวดปรมาตร

วชา เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ชอ-สกล................................................ ชนป ............................................................... วตถประสงค เพอใหผเรยนมความรและทกษะดงน

1. เขาใจหลกการทางานของอปกรณวดปรมาตรสารเบองตนในเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

2. เปรยบเทยบความแตกตางของอปกรณวดปรมาตรเบองตนได 3. เกดทกษะในการใชเครองมอวดเบองตนของเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ทฤษฎ

ระบบของหนวย (Unit system) ทนยมใชในปจจบน คอหนวยระหวางประเทศหรอระบบสากล (International system) หรอเรยกวา หนวยเอสไอ (SI unit) อยางไรกตาม ระบบองกฤษ (English system) กยงมใชแพรหลาย แตในปฏบตการนจะกลาวถงระบบเอสไอ

หนวยวดระบบเอสไอ (SI Unit) เปนระบบการวดทางวทยาศาสตรทใชกนอยางแพรหลาย ตงแตอดตจนถงปจจบน ซงเปนระบบ การวดแบบเมตรก “SI” ยอมาจากคาวา “The International System of Units” ซงมความสาคญอยางมากตอระบบการวด ทางวทยาศาสตรและเทคโนโลย ปจจบน พบวา ระบบการวดแบบ เมตรก “SI” เปนทยอมรบทางการคาระหวางประเทศทวโลก ดงนนหนวยงาน The American Nation Institute of Standards and Technology (NIST) จงไดจดทา หนงสอ “Guide for the use of the Inter-national System Units (SI)” ซงเปนคมอแนะนาการใชระบบหนวย SI อยางถกตองและเปนสากล เพอเปนการสงเสรมการใชระบบหนวยพนฐาน SI ไดอยางถกตอง เราจาเปนตองเรยนรกฎ กตกา และรปแบบของการใช หนวยอนพนธเอสไอ (SI Derived Units) และคานาหนาหนวย ในระบบเอสไอ (SI Prefixes) ทจะใชรวมกบหนวยพนฐานใน ระบบเอสไอ (SI Base Units) รวมทงการใชสญลกษณตางๆ ของหนวยในระบบการวดซงในบทความนจะอธบายความหมายของหนวยตาง ๆ ดงน หนวยวดระบบเอสไอ (SI) ประกอบดวย

1. หนวยพนฐานในระบบเอสไอ (SI Base Units) เปนหนวยการวดพนฐานของหนวยวดอนๆ ทงหมดซงสามารถ สอบกลบได (Traceability) หนวยพนฐานทง 7 หนวย ดงแสดง ในตารางท 1

2. หนวยอนพนธเอสไอ (SI Derived Units) หนวยอนพนธเกดจากการพสจนทางพชคณตระหวางหนวยพนฐาน หรอระหวางหนวยอนพนธ ดงแสดงในตารางท 2


3. คานาหนาหนวยในระบบเอสไอ (SI Prefixes) คอ สญลกษณทถกนา มาวางไวหนาหนวย มจดประสงคเพอให การแสดงปรมาณมความกะทดรดมากขน สญลกษณเหลาน จะเขาไปคกบหนวย จงมผลเทากบการเพมหรอลดขนาด ของหนวยดงแสดงในตารางท 3

ตารางท 1 หนวยพนฐานในระบบเอสไอ (SI Base Units)

เชงปรมาณ (Quantity) หนวยพนฐาน (Base Units)

สญลกษณ (Symbol)

ความยาว (length) เมตร (meter) m มวล (mass) กโลกรม (kilogram) kg เวลา (time) วนาท (second) s กระแสไฟฟา (electric current) แอมแปร (ampere) A อณหภม (thermodynamic temperature) เคลวน (kelvin) K ปรมาณสาร (amount of substance) โมล (mole) mol ความเขมของการสองสวาง (luminous intensity)

แคนเดลา (candela) cd

ทมา: ศภชย ใชเทยมวงศ, 2539

ตารางท 2 หนวยอนพนธเอสไอ (SI Derived Units)

เชงปรมาณอนพนธ (Derived Units)

หนวยอนพนธ (Derived Units)


พนท (area) ตารางเมตร (square meter) m2 ปรมาตร (Volume) ลกบาศกเมตร (cubic meter) m3 อตราเรว, ความเรว (speed, velocity) เมตรตอวนาท (meter per

second) m·s-1

ความเรง (acceleration) เมตรตอวนาทกาลงสอง (meter per second squared)

m·s-2

ความหนาแนนกระแส (current density)

แอมแปรตอลกบาศกเมตร (ampere per cubic meter)

A·m-3

ความแรงสนามไฟฟา (electric field strength)

โวลตตอเมตร (volt per meter) V·m-1

การซมผานได (permeability) เฮนรตอเมตร (henry per meter) H·m-1 ความเขมขนเชงปรมาณสาร (amount-of-substance concentration)

โมลตอลกบาศกเมตร (mole per cubic meter)

mol·m-3

ทมา: ศภชย ใชเทยมวงศ, 2539

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 1 การวดปรมาตร 249

ตารางท 3 คานาหนาหนวยในระบบเอสไอ (SI Prefixes)

ตวประกอบ (Factor)

ชอคา นา หนาหนวย (Prefix

name)


ตวประกอบ (Factor)

ชอคา นา หนาหนวย (Prefix

name)


101 เดคะ (deka) da 10-1 เดซ (deci) d 102 เฮกโต (hecto) h 10-2 เซนต (centi) c 103 กโล (kilo) k 10-3 มลล (milli) m 106 เมกะ (mega) M 10-6 ไมโคร (micro) µ 109 กกะ (giga) G 10-9 นาโน (nano) n 1012 เทระ (tera) T 10-12 พโก (pico) P 1015 เพตะ (peta) P 10-15 เฟมโต (femto) f 1018 เอกซะ (exa) E 10-18 อตโต (atto) A 1021 เซตตะ (zetta) Z 10-21 เซปโต (zepto) z 1024 ยอตตะ (yotta) Y 10-24 ยอกโต (yocto) y

ทมา: ศภชย ใชเทยมวงศ, 2539 ปรมาตร หมายถง ปรมาณของปรภมหรอรปทรงสามมต ซงยดถอหรอบรรจอยในภาชนะไม

วาจะสถานะใดๆ บอยครงทปรมาตรระบปรมาณเปนตวเลขโดยใชหนวยกากบ เชน ลกบาศกเมตร ซงเปนหนวยอนพนธเอสไอ นอกจากนยงเปนทเขาใจกนโดยทวไปวา ปรมาตรของภาชนะคอ ความจ ของภาชนะ เชนปรมาณของของไหล (ของเหลวหรอแกส) ทภาชนะนนสามารถบรรจได มากกวาจะหมายถงปรมาณเนอวสดของภาชนะ

หนวยวดปรมาตรใชแนวคดทเกยวของกบหนวยวดความยาว โดยเตมคาวา ลกบาศก นาหนาหนวยความยาวทใชวดขนาดในสามมตทงความกวาง ความยาว ความสง ในหนวยเดยวกน เมอเขยนเปนอกษรยอจะเตม ลบ. นาหนาหรอกากบดวย ยกกาลงสาม อยางใดอยางหนง ตวอยางเชน วตถทรงลกบาศกชนหนงมทกดานยาวหนงเซนตเมตร (ซม., cm) จะมปรมาตรเทากบหนงลกบาศกเซนตเมตร (ลบ.ซม., ซม.3, cm3)

ระบบหนวยวดระหวางประเทศกาหนดใหหนวยวดปรมาตรมาตรฐานคอหนวยลกบาศกเมตร (ลบ.ม., ม.3, m3) ระบบเมตรกกมหนวยลตร (ล., L) เปนหนวยวดปรมาตรอกดวย ซงเทากบปรมาตรของทรงลกบาศกขนาดสบเซนตเมตร จงสมพนธกบหนวยลกบาศกเมตรเชนกน นนคอ

1 ลตร = (10 เซนตเมตร)3 = 1000 ลกบาศกเซนตเมตร = 0.001 ลกบาศกเมตร

ดงนน

1 ลกบาศกเมตร = 1000 ลตร


บอยครงทปรมาณของเหลวจานวนเลกนอยถกวดในหนวยมลลลตร นนคอ

1 มลลลตร = 0.001 ลตร = 1 ลกบาศกเซนตเมตร หนวยวดปรมาตรแบบดงเดมอน ๆ ทมหลากหลายกเปนทนยมเชนกน เชน ลกบาศก

นว ลกบาศกฟต ลกบาศกไมล ชอนชา ชอนโตะ ถวยตวง ออนซ แดรม กลล ไพนต ควอรต แกลลอน บารเรล คอรด เพก บเชล ฮอกสเฮด ฯลฯ สวนหนวยวดไทยดงเดมกมอยางเชน ถง (20 ลตร) บน เกวยน เปนตน

หนวยปรมาตรทนยมใช คอ หนวยระบบสากล (International System) หรอเรยกวา หนวยเอสไอ (SI unit) ใน SI unit ปรมาตรมกมหนวยเปนลกบาศกเมตร (m3) ลกบาศกเดซเมตร (dm3) หรอลกบาศกเซนตเมตร(cm3) ลกบาศกมลลลตร (mm3) สวนคาวา cc (cubic centimetre) นนหมายถง ปรมาตร 1 cm3 หนวยปรมาตรทไมใช SI unit คอ ลตร (L) ซงเทากบ 1 dm3 หรอ 1000 cm3

หนวยการวดปรมาตร 1 ลกบาศกเซนตเมตร เทากบ 1,000 หรอ 103

ลกบาศกมลลเมตร 1 ลกบาศกเมตร เทากบ 1,000,000 หรอ 106

ลกบาศกเซนตเมตร 1 ลกบาศกเซนตเมตร เทากบ 1 มลลลตร 1 ลตร เทากบ 1,000 หรอ 103 มลลลตร หรอ 1 ลตร เทากบ 1,000 หรอ 103 ลกบาศกเซนตเมตร 1 ลตร เทากบ 1 ลกบาศกเดซเมตร 1,000 ลตร เทากบ 1 ลกบาศกเมตร 1 มลลลตร เทากบ 1,000 ไมโครลตร

ตวอยางหนวยทนยมใช ไมโครลตร (Microlitre; µl) มลลลตร (Millilitre; ml) ลตร (Littre; L) ลกบาศกเดซเมตร (Cubic decimetre; dm3) ลกบาศกเซนตเมตร และ (Cubic centimetre; cm3)

อปกรณทใชวดปรมาตร อปกรณทนยมใชวดปรมาตรในงานวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ไดแก บกเกอร (Beaker)

ปเปต (Pipette) บวเรต (Burette) กระบอกตวง (Cylinder) ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ไมโครปเปต (Micropipette) ชวดรปชมพ (Erlenmeyer flask) หลอดหยด (Dropper) กระบอกฉดยา (Syringe) เปนตน


รปท 1 บกเกอร (Beaker) รปท 2 ชวดรปชมพ (Erlenmeyer flask)

รปท 3 ไมโครปเปต (Micropipette) รปท 4 บวเรต (Burette)

รปท 5 ปเปต (Pipette) รปท 6 ขวดปรมาตร (Volumetric flask)


งานทมอบหมาย ฝกปฏบตการใชอปกรณวดปรมาตรเบองตนในงานเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

การตวง การอานคา และการแปลงคาการวดปรมาตรของสาร อปกรณทใช 1. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 250 และ 1,000 ml 2. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 10 25 และ 50 ml 3. บวเรต (Burette) ขนาด 25 และ 50 ml 4. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 5. ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 6. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 20 200 1,000 และ 5,000 µl 7. ชวดรปชมพ (Erlenmeyer flask) ขนาด 125 250 500 และ 1,000 ml 8. หลอดหยด (Dropper) 9. กระบอกฉดยา (Syringe) ขนาด 25 50 และ 100 ml สารเคมทใช 1. นากลน 1 L 2. สารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต วธดาเนนการทดลอง 1. เตรยมเครองมอวดปรมาตรเบองตนแตละชนดบนโตะปฏบตการ 2. เทนากลน และสารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต ลงในกระบอกตวง ขนาด 50 ml อานปรมาตรสารละลายทระดบ 50 ml บนทกคาลงในตารางบนทกผลการทดลอง 3. เทนากลน และสารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต ลงในบวเรต ขนาด 25 ml อานปรมาตรสารละลายทระดบ 25 ml บนทกคาลงในตารางบนทกผลการทดลอง

4. ปเปตนากลน และสารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต ปรมาตร 10 ml อานปรมาตรสารละลายทระดบ 10 ml บนทกคาลงในตารางบนทกผลการทดลอง 5. เทนากลน และสารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต ลงในขวดปรมาตรขนาด 25 50 และ 100 ml อานปรมาตรสารละลาย บนทกคาลงในตารางบนทกผลการทดลอง

6. ทาการแปลงหนวยทไดจากอปกรณวดปรมาตรใหเปนหนวยทกาหนดใหตามตารางบนทกผลการทดลอง


ผลการทดลอง ตารางบนทกผลการทดลอง

เครองมอวดปรมาตร

ตวอยางสาร คาทอานไดจากเครองมอวด (ml)

แปลงเปนหนวย

กระบอกตวง นากลน ..........................cm3 สารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต .........................cm3

บวเรต นากลน ...............................L สารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต

ปเปต นากลน ………………………µl สารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต ………………………µl

ขวดปรมาตร นากลน ……………………..dm3 สารละลายโพแทสเซยมเปอรแมงกาเนต ……………………..dm3

วจารณผลการทดลอง......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

สรปผลการทดลอง ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


เอกสารอางอง พฒนา เหลาไพบลย. และอรศรา เรองแสง. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวน

วชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ. คณะเทคโนโลย. มหาวทยาลยขอนแกน. ศภชย ใชเทยมวงศ. (2539). เคมวเคราะห. พมพครงท 3. กรงเทพฯ: สานกพมพจฬาลงกรณ

มหาวทยาลย. Lisa, A., (2008). Basic Laboratory Calculations for Biotechnology. Biotechnology

Laboratory Technician Program Madison Area Technical College: Pearson. P. 29-46.


เรอง การไทเทรตหาปรมาณกรด

วชา เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ชอ-สกล................................................ ชนป ............................................................... วตถประสงค

เพอใหผเรยนมความรและทกษะดงน 1. เขาใจหลกการวเคราะหปรมาณสารโดยวธไทเทรต

2. เปรยบเทยบความแตกตางปรมาณกรดในนาผลไมและนาสมสายชไดได 3. เกดทกษะในการใชเครองมอวดเบองตนของเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ทฤษฎ

การไทเทรตกรด-เบส หมายถง กระบวนการหาปรมาณสาร โดยใชสารละลายททราบความเขมขนแนนอน ใหท าปฏกรยากบสาร ตวอยาง โดยอาศยหลกการ เกดปฏก รยาสะเทน (Neutralization) จดทนามาคานวณหาปรมาณได คอ จดยต (End point) ซงเปนจดทกรดกบเบสทาปฏกรยาสมมลกน โดยหาจดยตไดโดยใชการวดพเอชหรอการเปลยนสของอนดเคเตอร วธทนยมใชมากคอใชอนดเคเตอร (Indicator) ซงทจดยตสารละลายจะเปลยนส เมอพเอชของสารละลายเปลยน เชน การทาปฏกรยาระหวางกรดกบเบส โดยใชฟนอลฟทาลนเปนอนดเคเตอร โดยในสภาวะทสารละลายเปนกรดจะไมมสและเมอสารละลายมสภาพเปนเบสจะเปลยนเปนสชมพ ตวอยางปฏกรยาระหวางกรดไฮโดรคลอรก (HCl) กบเบสโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ทจดยตจะใหสชมพ

HCl(aq) + NaOH(aq) H+(aq) +Cl-(aq) + Na+(aq) + OH-(aq) NaCl(s) + H2O(l)

1 mol 1 mol 1 mol 1 mol

กรดไฮโดรคลอรก 1 mol ทาปฏกรยาพอดกบโซเดยมไฮดรอกไซด 1 mol ไดเกลอโซเดยมคลอไรด (NaCl) 1 mol และนา (H2O) 1 mol เมอทราบความเขมขนทแนนอน และปรมาตรของสารละลายโซเดยม ไฮดรอกไซดทใชในการไทเทรต กสามารถคานวณหาปรมาณของกรดในตวอยางได

1. กรด (Acid) เปนสสารทมรสเปรยว ทาปฏกรยากบโลหะอยางแคลเซยม และเบส กรดทละลายนาม pH นอยกวา 7 โดยทกรดจะแรงขนตามคา pH ทลดลง และเปลยนกระดาษลตมสสนาเงนเปนแดง เชน กรดนาสม กรดซลฟวรก กรดทารทารก และ ไฮโดรเจนคลอรก ซงแบงตามความแรงของกรด

256 ปฏบตการท 2 การไทเทรตหาปรมาณกรด เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ

1.1 ประเภทของกรด กรดแบงเปน 2 ประเภท คอ 1.1.1 กรดอนทรย (Organic acid) เปนกรดทไดจากธรรมชาต เกดขนจากสงมชวต

เชน กรดนาสม (กรดนาสม) กรดซตรก (กรดมะนาว) กรดแอสคอรบก (วตามนซ) และ กรดอะมโน ฯลฯ

1.1.2 กรดอนนทรย (Inorganic acid) เปนกรดทไดจากแรธาต บางครงเรยกวากรดแร เชน กรดซลฟวรก (กรดกามะถน) กรดไฮโดรคลอรก (กรดเกลอ) และ กรดไนตรก (กรดดนประสว) ฯลฯ

แบงตามความสามารถในการแตกตวใหไฮโดรเจนไอออน ม 2 ชนดคอ กรดแกและกรดออน 1.1.2.1 กรดแก (Strong acid) กรดกลมนมคา pKa นอยกวา 1.74 เชน กรด

ไฮโดรคลอรก กรดไนตรก กรดซลฟวรก ฯลฯ กรดแกยงยวด เปนกรดแกเชนกน แตสามารถแตกตวใหไฮโดรเจนไอออนมากกวากรดซลฟวรกเขมขน 100 % จงมคา pH นอยกวา 0 เชน กรดฟลออโรแอนตมอนก

1.1.2.2 กรดออน (Weak acid) กรดกลมนมคา pKa ไมนอยกวา 1.74 แตกไมถงกบเปนกลาง เชน กรดนาสม กรดคารบอนก กรดไฮโดรซลฟวรก ฯลฯ

1.2 นยามของกรด นยามของกรดโดยทวไป ม 3 นยาม ไดแก นยามอารเรเนยส นยามเบรนสเตด-ลาวร

และนยามลวอส (1) กรดตามทฤษฎของอารเรเนยส กรด คอ สสารทเพมความเขมขนของไฮโดรเนยม

ไอออน (H3O+) ในสารละลาย (2) กรดตามทฤษฎของเบรนสเตด-ลาวร เปนการขยายความขน คอ กรดเปนสสาร

ซงสามารถทาหนาทใหโปรตอน กรดสวนมากทพบในชวตประจาวนเปนสารละลายในนา หรอสามารถละลายไดในนา และสองนยามนเกยวเนองทสด สาเหตท pH ของกรดนอยกวา 7 นน เปนเพราะความเขมขนของไฮโดรเนยมไอออนมากกวา 10-7 โมลตอลตร เนองจาก pH นยามเปนลอการทมลบของความเขมขนของไฮโดรเนยมไออน ดงนน กรดจงม pH นอยกวา 7 ตามนยามเบรนสเตด-ลาวร สารประกอบใดซงสามารถใหโปรตอนงายสามารถพจารณาไดวาเปนกรด ตวอยางมแอลกอฮอลและ เอมน ซงมหม O-H หรอ N-H

(3) กรดตามทฤษฎของกรดลวอส เปนนยามทพบมากทสด กรดลวอสเปนตวรบอเลกตรอนคโดดเดยว ตวอยางกรด ลวอส รวมไปถงไอออนลบโลหะทงหมด และโมเลกลอเลกตรอนนอย เชน โบรอนฟลออไรด และอะลมเนยมไตรคลอไรด ไฮโดรเนยมไอออนเปนกรดตามทงสามนยามขางตน ทนาสนใจคอ แมแอลกอฮอลและเอมนสามารถเปนกรดเบรนเสตด-ลาวรไดตามทอธบาย

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 2 การไทเทรตหาปรมาณกรด 257

ขางตน ทงสองยงทาหนาทเปนเบสลวอสได เนองจากอะตอมออกซเจนและไนโตรเจนมอเลกตรอนคโดดเดยว

1.3 การแตกตวของไอออน ในสารละลายกรดทกชนด จะมไอออนทเหมอนกนอยสวนหนงคอไฮโดรเจน

ไอออน H+ เมอรวมกบนาจะไดเปนไฮโดรเนยมไอออน H3O+ ตวอยาง เชน กรดไฮโดรคลอรก (HCl) ซงเกดจากสารประกอบไฮโดรเจนคลอไรด HCl ละลายในนา โมเลกลของ HCl และนาตางกเปนโมเลกลมขว จงเกดแรงดงดดระหวางขวของ HCl กบนา โดยทโปรตอน (H+) ของ HCl ถกดงดดโดยโมเลกลของนาเกดเปนไฮโดรเนยมไอออน

H+ + H2O H3O+ ในบางครงเขยนแทน H3O+ ดวย H+ โดยเปนทเขาใจวา H+ นนจะอยรวมกบโมเลกลของนาในรป H3O+ เสมอ

ไฮโดรเนยมไอออนในนาไมไดอยเปนไอออนเดยว แตจะมนาหลายโมเลกลมาลอมรอบดวย อาจอยในรปของ H5O2

+ H7O3+ และ H9O4

+ เปนตน สวนไอออนลบทเหลอจากการแตกตวกจะมนามาลอมรอบเชนกน หรออาจทาปฏกรยากบสารอนทละลายปนอยดวยกน

ตวอยาง สมการเคมแสดงการแตกตวของไอออนของกรดในนา HNO3(l) + H2O(l) H3O+(aq) + NO3

- (aq)

H2SO4(l) + H2O(l) H3O+(aq) + SO42- (aq)

CH3COOH(l) + H2O(l) H3O+(aq) + CH3COO- (aq)

HClO4(l) + H2O(l) H3O+(aq) + ClO4- (aq)

2. เบส (Base) เบสมความหนดมากกวานาเลกนอย มรสขม คลายสบเมอสมผส ทาปฏกรยากบกรดไดเกลอตามคาจากดความของอารรเนยส (Svante Arrhenius) คอ สารประกอบเคมทดดไฮโดรเนยมไอออน เมอละลายในนา (ผรบโปรตอน) เบสทละลายในนาเรยกวา อลคาไล ในสภาพแวดลอมทเปนนา ไฮดรอกไซดไอออนจะถกใหอเลคตรอน เบสและกรดถกมองวาอยตรงขามกนเพราะวาผลของกรดคอการเพมความเขมขนของไฮโดรเนยมไอออน (H3O+) ในนา ในขณะทเบส เมอละลายนาสารละลายของมนจะม pH มากกวา 7 เสมอ กรดเมอผสมกบเบสจะสะเทนทาใหคา pH มคาเปนกลาง

2.1 ประเภทของเบส กรดแบงเปน 2 ประเภท คอ 2.1.1 เบสทมไฮดรอกไซดไอออน เชน โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) จะแตกตว

เปนไฮดรอกไซดเมอละลายในนา เบสโซเดยมไฮดรอกไซดจะแตกตวเปน ไฮดรอกไซดไอออน (OH-) และ โซเดยมไอออน (Na+)


2.1.2 เบสทไมมโซเดยมไฮดรอกไซด เชน แอมโมเนย (NH3) และโซเดยมคารบอเนต (Na2CO3)

แบงตามความสามารถในการแตกตวใหไฮดรอกไซดไอออน ม 2 ชนดคอ เบสแก และเบสออน

2.1.2.1 เบสแก (Strong base) สามารถแตกตวใหไฮดรอกไซดไอออนมาก ถง 100 % เชน โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) และโพแทสเซยมไฮดรอกไซด (KOH)

2.1.2.2 เบสออน (Weak base) สามารถแตกตวใหไฮดรอกไซดไอออนนอยกวา 100 % เชน แอมโมเนย (NH3)

2.2 นยามของเบส นยามของเบสโดยทวไป ม 3 นยาม ไดแก นยามอารเรเนยส นยามเบรนสเตด-ลาวร

และนยามลวอส (1) เบสตามทฤษฎของอารเรเนยส เบส คอ สสารทเพมความเขมขนของไฮดรอกไซด

ไอออน (OH-) ในสารละลาย (2) เบสตามทฤษฎของเบรนสเตด-ลาวร เปนการขยายความขน คอ เบสเปนสสารซง

สามารถทาหนาทรบโปรตอน เบสสวนมากทพบในชวตประจาวนเปนสารละลายในนา หรอสามารถละลายไดในนา และสองนยามนเกยวเนองทสด สาเหตท pH ของเบสมากกวา 7 นน เปนเพราะความเขมขนของไฮดรอกไซดไอออนนอยกวา 10-7 โมลตอลตร เนองจาก pH เปนลอการทมลบของความเขมขนของไฮดรอกไซดไอออนดงนน เบสจงมคา pH มากกวา 7 ตามนยามเบรนสเตด-ลาวร สารประกอบใดซงสามารถรบโปรตอนงายสามารถพจารณาไดวาเปนเบส

(3) เบสตามทฤษฎของเบสลวอส เปนนยามทพบมากทสด เบสลวอสเปนตวใหอเลกตรอนคโดดเดยว

2.3 การแตกตวของไอออน เบสทเมอละลายในนาแลวแตกตวไดไฮดรอกไซดไอออนเมอละลายในนาเบส

NaOH(s) + H2O(l) Na+(aq) + OH-(aq)

NH3(l) + H2O(l) NH4+(aq) + OH-(aq)

Na2CO3(s) + H2O(l) 2Na+(aq) + HCO3-(aq) + OH-(aq)

งานทมอบหมาย

ฝกปฏบตการใชอปกรณการไทเทรตหาปรมาณกรดในตวอยาง การอานคา และคานวณหาปรมาณกรดในตวอยาง


อปกรณทใช 1. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 และ 1,000 ml 2. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 และ 10 ml 3. บวเรต (Burette) ขนาด 50 ml 4. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 10 และ 25 ml 5. ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 50 และ 100 ml 6. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 200 และ 1,000 µl 7. ชวดรปชมพ (Erlenmeyer flask) ขนาด 125 ml 8. หลอดหยด (Dropper) 9. ขาตงเหลก

สารเคมทใช

1. นากลน 1 L 2. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 0.1 N ปรมาตร 1 L 3. สารละลายกรดไฮโดรคลอรก ความเขมขน 0.1 N ปรมาตร 1 L

4. สารละลายตวอยางกรดในนาผลไม 15 ml 5. ฟนอลฟทาลนอนดเคเตอร

การเตรยมสารละลาย

เตรยมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 0.1 N ปรมาตร 1 L โดยชง โซเดยม ไฮดรอกไซด 4.0000 g ละลายในนากลน ปรบปรมาตรขวดปรมาตรใหได 1 L ดวยนากลน วธดาเนนการทดลอง

1. เตมสารละลายตวอยางนาผลไม 5 ml เตมลงในขวดรปชมพ ขนาด 125 ml เตมนากลน 45 ml เตม และฟนอลฟทาลนอนดเคเตอร 3 หยด นาไปไทเทรต ทาการทดลอง 3 ซา

2. นาสารละลายจากขอ 1 ไปไทเทรตกบ 0.1 N NaOH บนทกปรมาตรสารละลาย 0.1 N NaOH ทใชทาปฏกรยา 3. คานวณหาปรมาณกรดในตวอยาง



ตวอยางท/ชอ การทดลองซาท

ปรมาตรตวอยาง (ml)

ปรมาตรนากลน (ml)

ปรมาตร 0.1 N NaOH (ml)

ปรมาณกรด (mg/l)

1...................... 1 2 3

2............................ 1 2 3

การคานวณปรมาณกรดในตวอยาง ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


สรปผลการทดลอง ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


เอกสารอางอง พฒนา เหลาไพบลย. (2538). ปฏบตการอปกรณในเทคโนโลยชวภาพเพอวเคราะหทางเคม.

ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ. คณะเทคโนโลย. มหาวทยาลยขอนแกน. Meier, P., Lohrum, A., and Gareiss, J., (1989). Practice and Theory of pH

Measurement. Ingold. Messtecknik AG. Urdorf/Switzerland.


เรอง การวดคาความเปนกรดดางดวยเครองพเอชมเตอร วชา เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ชอ-สกล................................................ ชนป ............................................................... วตถประสงค เพอใหผเรยนมความรและทกษะดงน

1. เขาใจหลกการ วธการใช และดแลรกษาพเอชมเตอร 2. เปรยบเทยบความแตกตางคาความเปนกรดดางในตวอยางได 3. หาคาพเอชในตวอยางและบอกวาเปนกรดหรอเบสได

ทฤษฎ การวดคาความเปนกรดดางหรอพเอช (pH) ในวตถดบกอนการผลตผลตภณฑ เชน การผลต

ไวน นมเปรยว โยเกรต กรดแลคตก การผลตอะซโตน-บวทานอล-เอทานอล และการผลตเครองดมแอลกอฮอล เปนตน ถอวามความสาคญมากเพราะคาพเอชมผลตอกระบวนการผลต สงผลตอปรมาณผลผลตทได โดยเฉพาะอยางยงในการผลตแอลกอฮอล พเอชมผลตอการเจรญของจลนทรย การทางานของเอนไซม ดงนนการวดคาพเอชกอน ระหวางการหมกและหลงกระบวนการหมก จงเปนสงสาคญ การหาคาพเอชหรอการหาปรมาณกรดหรอดางนยมทากน 2 วธ คอ

1. การวดความเขมขนของไฮโดรเจนไอออน (H+) ทมหนวยเปนโมลาร โดยใชพเอชมเตอร คาทวดไดเปนคาของพเอช

2. การไทเทรตกบสารละลายมาตรฐานดางททราบความเขมขนแนนอน เมอทราบปรมาณดางทใชกสามารถนาไปคานวณหาปรมาณกรดทอยในสารละลายตวอยางทงหมดได คาทไดคอ titrable acidity (TA) ดงปฏบตการท 2

พเอชเปนการวดความเขมขนของไฮโดรเจนไอออนทแตกตวออกมาจากกรดทมอยในสารตวอยาง ซงการแตกตวแสดงดงสมการท 1 การแตกตวของกรดขนอยกบคาคงทของการแตกตวของกรด (Ionization constant, KA) แตละชนด คา KA สง แสดงใหเหนวา กรดนนแตกตวให [H+] มาก ทาใหพเอชตาลง แตถาคา KA ตา แสดงใหทราบวากรดนนแตกตวให [H+] นอยทาใหพเอชสง สวน TA นนเปนการวดปรมาณกรดทงหมดทมอยในสารตวอยางโดยทาปฏกรยาสะเทนพอดกบดางททราบความเขมขนทแนนอนจนถงจดยต ดงนนจะเหนวา TA เปนการวดผลรวมของไฮโดรเจนไอออนกบสวนของกรดทไมแตกตว

264 ปฏบตการท 3 การวดคาความเปนกรดดางดวย เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ เครองพเอชมเตอร

[HA] [H+] + [A-] สมการท 1

สมการท 1 การแตกตวของกรดและการหาคาคงทของการแตกตว (KA) กาหนดให [HA] = ความเขมขนของกรด [H+] = ความเขมขนของไฮโดรเจนไอออน [A-] = ความเขมขนของเกลอและกรด KA = คาคงทของการแตกตว = [H+] [A-]

ในการทดลองนใชพเอชมเตอร วดคาความเปนกรดของสารละลายตวอยางความเขมขนของ

ไฮโดรเจนไอออนทแตกตวออกมาจากกรดในสารละลายตวอยางจะบอกในรปของพเอช ทวดได ซงสามารถนาไปคานวณหาความเขมขนของไฮโดรเจนไอออนไดจากสมการท 3 (ในหวขอการคานวณ)


ใหรายงานคาของพเอชของสารละลายตวอยาง และคานวณหาคาความเขมขนของไฮโดรเจนไอออนของสารละลายตวอยาง อปกรณทใช

1. เครองพเอชมเตอร (pH meter) 2. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 และ 1,000 ml 3. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 และ 10 ml 4. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 10 และ 25 ml 5. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 200 และ 1,000 µl 6. หลอดหยด (Dropper) 7. เครองกวนแมเหลก (Magnetic stirrer) 8. แทงแมเหลก (Magnetic bar) สารเคมทใช 1. นากลน 2. สารละลายตวอยางกรดและเบส 3. สารละลายบฟเฟอร (Buffer) มาตรฐานพเอช 4.00 7.00 และ 10.00 วธดาเนนการทดลอง

1. ศกษาวธการใชเครองพเอชมเตอร จากคมอใหเขาใจ

[HA]

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 3 การวดคาความเปนกรดดางดวย 265 เครองพเอชมเตอร

2. ปรบพเอชมเตอรใหพรอมทจะใชงานดวยสารละลายบฟเฟอร พเอช 4.00 และ 7.00 ตามลาดบ สาหรบวดสารละลายทพเอชตากวา 7.00 หรอ สารละลายบฟเฟอร พเอช 7.00 และ 10.00 ตามลาดบ สาหรบวดสารละลายทพเอชสงกวา 7.00

3. ลางหววดพเอช (pH probe) ใหสะอาดดวยนากลน ซบหววดพเอชดวยกระดาษซบชนดนมทสด (หามเชดหรอขดหวพเอชเดดขาด)

4. จมหววดพเอช ลงในสารละลายตวอยางทมการกวนดวยเครองกวนแมเหลกและแทงแมเหลก

5. การอานคาพเอชทวดไดจากขอ 4) แลวคานวณความเขมขนของไฮโดรเจนไอออน [H+] โดยแทนคาในสมการท 2 (ในหวขอการคานวณ) การคานวณ

pH = -log [H+] สมการท 2

[H+] = 10-pH สมการท 3

[H+] = ความเขมขนของไฮโดรเจนไอออนในหนวยของโมลาร (M) หรอ โมลตอลตร (mol/L)


ตวอยางท/ชอ การทดลองซาท

ปรมาตรตวอยาง

(ml)

ปรมาตรนากลน (ml)

ปรมาตร 0.1 N NaOH (ml)

ปรมาณกรด (mg/l)

1...................... 1 2 3

2............................

1 2 3

266 ปฏบตการท 3 การวดคาความเปนกรดดางดวย เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ เครองพเอชมเตอร

การคานวณปรมาณกรดในตวอยาง ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


สรปผลการทดลอง

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................


วชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ. คณะเทคโนโลย. มหาวทยาลยขอนแกน. Meloan, C. E., and Pomeranz, Y., (1980). Food Analysis Laboratory Experiments.

The AVI Publishing Company. Westport. Connecticut.


เรอง การวเคราะหปรมาณนาตาลทงหมดโดยใชวธฟนอลซลฟวรกดวย เครองสเปกโทรโฟโทมเตอร


เพอใหผเรยนมความรและทกษะดงน 1. เขาใจหลกการ วธการใช และดแลรกษาเครองสเปกโทรโฟโทมเตอร 2. เขาใจหลกการวธวเคราะหนาตาลโดยวธฟนอลซลฟวรก 3. สามารถวเคราะหหาปรมาณนาตาลทงหมดและเปรยบเทยบความแตกตางของปรมาณ

นาตาลในตวอยางได ทฤษฎ

1. วธวเคราะหนาตาลโดยวธฟนอลซลฟวรก (Phenol Sulfuric Method) คอ สารตวอยางทเปน นาตาล (Sugar) โอลโกแซกคาไรด (Oligosaccharide) โพลแซคคาไรด (Polysaccharide) และอนพนธ (derivatives) เมอทาปฏกรยากบฟนอลและกรดซลฟวรก จะเกดเปนสารประกอบ เฟอฟวราลได หลกการของวธการน คอ กรดซลฟวรกเขมขนสลายพนธะไกลโคซดกในสารประกอบพวกพอลแซคคารไรดใหแตกออกเปนนาตาลโมเลกลเดยว ซงจะทาปฎกรยาตอไปเปนสารประกอบ เฟอฟวราลและอนพนธตาง ๆ ของสารประกอบเฟอฟวราล สารประกอบทเกดขนเหลานจะสามารถรวมกนกบสารฟนอลเกดเปนอนพนธของเอสเทอร ไดสารประกอบเชงซอนสนาตาล ซงสามารถวเคราะหปฏกรยาของวธการนดวยเทคนค UV-VIS Spectrophotometry ในชวงความยาวคลน 480-490 นาโนเมตร จากนนนาไปคานวณหาปรมาณจากกราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคส

2. นาตาล (Sugar)

นาตาลเปนสารประกอบประเภทคารโบไฮเดรต จาแนกได 3 ชนดใหญๆ ตามโครงสรางของโมเลกล คอ โมโนแซกคาไรด (Monosaccharide) ไดแซกคาไรด (Disaccharide) และโพลแซกคาไรด (Polysaccharide)

2.1 โมโนแซกคาไรด (Monosaccharide) โมโนแซกคาไรด เปนคารโบไฮเดรตทมขนาดโมเลกลเลกมาก ประกอบดวยคารบอน

3–8 อะตอม ไมสามารถเกดปฏกรยาไฮโดรไลซใหเปนคารโบไฮเดรตทเลกลงไปอก จงสามารถจาแนกโมโนแซกคาไรดไดตามจานวนอะตอมคารบอนทเปนองคประกอบได ไรโบส (Ribose) ดออกซไรโบส

268 ปฏบตการท 4 การวเคราะหปรมาณนาตาลทงหมด เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ โดยใชวธฟนอลซลฟวรก เครองสเปกโทรโฟโทมเตอร

(Deoxyribose) นาตาลกลโคส (Glucose) นาตาลซโครส (Sucrose) แลกโทส (Lactose) และมอลโทส (Maltose) ฟรกโทส (Fructose) กาแลกโทส (Galactose)

โมโนแซกคาไรดสามารถจาแนกตามหมฟงกชนทแตกตางกนในโมเลกลไดเปนอลโดส (Aldose) ซงมหมฟงกชนเปนแอลดไฮด และคโทส (Ketose) ซงมหมฟงกชนเปนคโตน เชน กลโคสจดเปนนาตาลอลโดส และฟรกโทสจดเปนนาตาลคโทส

2.2 โอลโกแซกคารไรด (Oligosaccharide) โอลโกแซกคาไรด เปนคารโบไฮเดรตทเกดจากโมโนแซกคาไรด 2–10 หนวย มาเชอ

ตอกนดวยพนธะ C–O–C ซงเรยกวา พนธะไกลโคซดก (Glycosidic bond) ถาประกอบดวย 2 หนวยเรยกวา ไดแซกคาไรด (Disaccharide) ถา 3 หนวย เรยกวา ไตรแซกคาไรด (Trisaccharide)

ไดแซกคาไรดแบงได 2 ประเภท 1) รดวซงชการ (Reducing sugar) เปนไดแซกคาไรดทสามารถเกดปฏกรยากบ

สารละลายเบเนดกตไดเมอใหความรอน จะไดตะกอนสแดงอฐของคอปเปอร (I) ออกไซด Cu2O ไดแก นาตาลมอลโทส (Maltose) และนาตาลแลกโทส (Lactose)

นอกจากมอลโมส แลกโทส และซโครสแลว ยงมไดแซกคาไรดอกหลายชนด เชน เซลโลไบโอส (Cellobiose) เกดจากกลโคสกบกลโคส สวนไตรแซกคาไรด เชน ราฟฟโนส (Raffinose) เกดจากกาแลกโทส กลโคส และฟรกโทส

2) นอนรดวซงชการ (Non–reducing sugar) เปนไดแซกคาไรดทไมสามารถเกดปฏกรยากบสารละลายเบเนดกต ไดแก นาตาลซโครส (Sucrose)

2.3 โพลแซกคารไรด (Polysaccharide) โพลแซกคาไรด เปนคารโบไฮเดรตทเกดจากโมโนแซกคาไรดหลายๆ หนวยมา

เชอมตอกนดวยพนธะไกลโคซดก (Glycosidic bond : – C–O–C–) โพลแซกคาไรดจะมขนาดใหญกวาโอลโกแซกคาไรด สวนใหญจะมโมโนแซกคาไรดเปนรอยถงพนหนวยมาจบตอกน ตวอยางโพลแซกคาไรดอยางงาย ไดแก แปง (Starch) เซลลโลส (Cellulose) ไกลโคเจน (Glycogen) ไคตน (Chitin) เปนตน

3. เครองสเปกโตรโฟโทมเตอร (Spectrophotometer) เปนเครองมอทใชวดปรมาณของสารเคมชวโมเลกล รวมถงจลชพทงหลาย โดยใชหลกการ

วดปรมาณของแสงทตวอยางดดกลนเขาไป ตวเครองประกอบดวยแหลงกาเนดแสง (Light source) เลนสหรอกระจกรบแสง (Lens or Mirror) ตวแยกความยาวคลน (Monochromator) และตวตรวจจบสญญาณ (Detector) ดงรปท 1 แหลงกาเนดแสงทาหนาทใหแสงผานตวอยาง แหลงกาเนดแสงทดควรใหแสงทมความเขมสมาเสมอ และนงตลอดความยาวคลนทใชงาน ปจจบนแหลงกาเนดแสงทนยมนามาใชมหลากหลายชนด ยกตวอยาง เชน Deuterium Arc (190-420 nm) Tungsten (350-2500 nm) และ Xenon Lamp (190-800 nm) อกสวนประกอบหนงทสาคญนน คอ ตวตรวจจบสญญาณ สาหรบเครองตรวจวดทนยมใชไดแก PMT (photomultiplier tube) diode arrays และ CCDs (charge coupled devices) เครองจะทาการบนทกคาความยาวคลนรวมกบคา

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 4 การวเคราะหปรมาณนาตาลทงหมด 269 โดยใชวธฟนอลซลฟวรก เครองสเปกโทรโฟโทมเตอร

มมของแตละความยาวคลนทเกดการดดกลน ในการวดตวอยางจะใช cuvette ซงลกษณะเปนหลอดสเหลยมเลกทาจากแกว พลาสตกหรอควอทซ ซงแตละชนดมขอดแตกตางกนคอ cuvette ททาจากควอทซจะมราคาแพงแตสามารถวดไดทความยาวคลนไดทงชวงยว-วสเบล (UV-Visible) ขณะท cuvette ททาจากพลาสตกหรอแกวจะวดไดแคชวงวสเบล (Visible) เทานน

รปท 1 หลกการทางานของเครอง spectrophotometer

(ทมา: สถาบนนวตกรรมและพฒนากระบวนการเรยนร มหาวทยาลยมหดล, 2528)

เทคนคทาง Spectrophotometer เปนการศกษาดานการกระทารวม ( Interaction) ระหวางคลนแมเหลกไฟฟา หรอ คลนแสงกบสสาร (Atom) (Molecule) Interaction ระหวางคลนแสงกบสสาร (ชชาต อารจตรานสรณ, 2534)

(1) การดดกลนคลนแสง (Absorbtion) สสารสามารถดดกลนคลนแสงในชวงคลนเฉพาะ (2) การคลายคลนแสง (Emission) คอ การทสวนหนงของพลงงานภายในของสสารถก

เปลยนเปนพลงงาน (3) การกระจาย (Scatter) หรอการสะทอนกลบ (Reflection)

เทคนคทาง Spectrophotometer เกยวของกบกฎของเบยร และแลมเบรต (Beer and Lambert’s Law) โดยกฎของเบยร และแลมเบรต เกยวกบการดดกลนของแสงกบความหนาของเหลวทมส กลาววาทแตละชนของความหนาทเทากนจะดดกลนแสงทผานในเศษสวนทเทากนนนคอ เมอลาแสงของแสงโมโนโครมาตก (Monocromatic Light) ฉายผานตวกลางทดดกลน (Absorb medium) ซงกคอ สารละลายทมส ความเขมขนของแสงจะลดลงในรปของฟงคชนเอกซโพแนนเชยล ในขณะทความยาวของตวกลางมากขน “อตราของแสงทถกดดกลนไวจะผนแปรเปนสดสวนโดยตรงกบความเขมขน และระยะทางทแสงนนสองผาน” (ไพบลย ดานวรทย และคณะ, 2548)


ความรนเปนประโยชนมากในการใชปรบความหนาของชนทดดกลนแสง หรอ ความหนาแนนของตวอยาง ซงอยในหลอดแกวใส เรยกวา เซลล (Cell) หรอ ควเวทท (Cuvette) เพอลดสใหถงระดบในชวงทสามารถใชเตรยมอนกรมของสารละลายมาตรฐาน เพอใชทาโคงมาตรฐาน (Standard curve) หรอเพอทจะใชกบสเปคโตรโฟโตมเตอรได


การหาปรมาณของสารจะอาศย Beer’s law A = εbc

เมอ A = คาการดดกลนแสง ε = molar absorptivity (L.mol-1cm.-1)

b = path length c = ความเขมขนของสารทนามาวเคราะห (mol.L-1)

ในการหาปรมาณของสารจะสรางกราฟความสมพนธระหวาง ความเขมขนของสารทตองการวเคราะห และ คาการดดกลนแสง ดงรปท 2

รปท 2 การทากราฟมาตรฐานเพอวเคราะหหาปรมาณของสาร

หลกการเครองชนดนม photoelectric cell เปน sensing element กระแสทเกดโดย photoelectric cell จะถกเปลยนไปเปนเปอรเซนตทรานสมชชน หรอคาการดดกลนแสง (Absorbent) โดยเครองกลวานอมเตอร (Galvanometer) แหลงกาเนดแสงเปนหลอดไฟธรรมดา คอ หลอดทงสเตน (tungsten lamp) และแสงโมโนโครมาตก (Monocromatic Light ) ทไดจากการใหลาแสงสองผานแกวปรซม หรอดฟแฟรกชนเกรตตง (Diffraction grating) อยางใดอยางหนงเพอใหได แสงโมโนโครมาตก (Monocromatic Light ) ทมความยาวคลนในชวงแสงทมองเหนได นอกจากน เครองมอชนดนยงสามารถใหแสงในชวงอลตราไวโอเลต (Ultraviolet) และชวงใกลอนฟาเรด (near infrared) ไดอกดวย

อปกรณหลกในเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร 1) ตนกาเนดแสง (Light source) แหลงกาเนดแสงเปนสวนทใหแสง ในชวงความยาวคลนท

ตองการออกมาอยางตอเนองและคงท รวมทงมความเขมแสงทมากพอ หลอดกาเนดแสง มหลายชนดตามความยาวคลนแสงทเปลงออกมา เชน ชวงยว จะใชหลอดไฮโดรเจน (H2 lamp) และหลอด ด


วเทอเรยม (Deuterium lamp) ใหความยาวคลนอยในชวง 160-380 นาโนเมตรและชวงวสเบล ใชหลอดทงสเตน (Tungsten/halogen) ใหความยาวคลนในชวง 240-2,500 นาโนเมตร เปนตน

2) โมโนโครมาเตอร (Monochromator) เปนสวนทใชควบคมแสงโดยจะทาใหแสงทออกมา จากตนกาเนดแสงซงเปนพอลโครเมตกใหเปนแสงโมโนโครเมตก ซงเปนแถบแสงแคบๆ หรอมความยาวคลนเดยวใชฟลเตอรปรซมหรอเกรตตง 3) เซลลทใสตวอยาง (Cell sample) เซลลทใชบรรจสารละลายตวอยางบางครงอาจเรยกวาควเวทท (Cuvettes) ทใชกนทวไป ไดแก เซลลททาดวยแกวจะใชไดเฉพาะชวงวสเบลเพราะแกวจะดดกลนแสง ในชวงยวไดและเซลลททาดวยซลกาและควอทซซงใชไดทงชวงยวและวสเบล 4) Detector ทาหนาทในการวดความเขมของแสง ทถกดดกลนโดยการแปลงพลงงานคลนแสง เปนพลงงานไฟฟาเครองวดแสงมหลายชนดทนยม ไดแก หลอดโฟโตมลตฟลายเออร (Photomultiplier tube) และเครองวดแสงชนดซลกอนไดโอด (Silicon diode detector) องคประกอบตางๆ ของเครอง UV-Visible spectrophotometer งานทมอบหมาย

ฝกปฏบตการใชอปกรณ บนทกคาการดดกลนแสง สรางกราฟมาตรฐานสารละลายกลโคส และคานวณปรมาณนาตาลจากสมการ อปกรณทใช

1. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 250 และ 1,000 ml 2. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 10 25 และ 50 ml 3. หลอดทดลอง (Test tube) ขนาด 16×180 mm 4. ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 25 50 และ 100 ml 5. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 20 200 1,000 และ 5,000 µl 6. หลอดหยด (Dropper) 7. เครองสเปกโทรโฟโทมเตอร 8. อางนาควบคมอณหภม (Water bath)

สารเคมทใช 1. สารละลายฟนอล (Phenol) ความเขมขน 5% (w/v) 2. กรดซลฟวรกเขมขน (Conc. H2SO4) 3. สารละลายมาตรฐานกลโคสความเขมขน 1,000 mg/l


การเตรยมสารละลายมาตรฐานกลโคส ชงนาตาลกลโคสมา 0.10 g ละลายในนากลน ปรบปรมาตรใหได 100 ml จะไดสารละลายกลโคสความเขมขน 1000 mg/l ทาการเจอจางใหไดความเขมขน 100 mg/l เพอใชเปนความเขมขนตงตนในการเตรยมสารละลายกลโคสมาตรฐานทความเขมขน 20 40 60 80 และ 100 mg/l ดงแสดงในตารางท 1 วธดาเนนการทดลอง

1. ดดตวอยาง 1 ml ลงในหลอดทดลอง เตมสารละลายฟนอล 1.0 ml ผสมใหเขากน ตงทงไวนาน 2-3 นาท

2. เตมกรดซลฟรคเขมขน 5.0 ml ผสมใหเขากน ตงทงไวนาน 10 min เขยาใหเขากน ตงทงไวนาน 20 นาท

3. นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 490 nm โดยวดเทยบกบสารไรตวอยาง (blank) ซงใชนากลนแทนสารตวอยาง

4. อานคาความเขมขนของกลโคสจากกราฟมาตรฐาน ซงไดจากการทาวธการเดยวกน โดยใชสารละลายกลโคสทความเขมขน 20 40 60 80 และ 100 mg/l แทนสารตวอยางคานวณปรมาณนาตาลทงหมดเทยบกบกราฟมาตรฐานกลโคส (ทาการทดลอง 3 ซา) บนทกผลการทดลอง

ตารางท 1 การเตรยมสารละลายกลโคสมาตรฐาน เพอใชในการวเคราะหนาตาลทงหมดดวยวธ โดย

วธฟนอลซลฟรค

หลอดท สารละลายกลโคส 100 mg/l (ml)

นากลน (ml)

ความเขมขนของกลโคส (mg/l)

1 2.0 8.0 20 2 4.0 6.0 40 3 6.0 4.0 60 4 8.0 2.0 80 5 10 0 100



ตารางท 2 คาการดดกลนแสงของสารละลายกลโคสมาตรฐานทความเขมขนตางๆ ทความยาวคลนท 490 nm ดวยวธฟนอลซลฟรค


คาการดดกลนแสงท 490 nm หมายเหต

1 2 เฉลย 0 20 40 60 80 100

ตารางท 3 ตารางบนทกผลการทดลอง

หลอดท คาการดดกลนแสงท 490 nm อตราการเจอจาง

ความเขมขนของนาตาลทงหมด (กรมตอลตร) 1 2 เฉลย

1 2 3 4 5 6


การคานวณปรมาณนาตาลทงหมดในตวอยาง ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

วจารณผลการทดลอง................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

สรปผลการทดลอง ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ เอกสารอางอง ชชาต อารจตรนสรณ. (2544). เครองมอวทยาศาสตร. พมพครงท 3. สานกพมพคลงนานาวทยา

ขอนแกน. เปรมใจ อารยจตรานสรณ. พจน ศรบญลอ. พชรย บญศร. อบล ชาออน. และ ปต ธวจตต. (2548).

ตาราชวเคม. พมพครงท 4. สานกพมพคลงนานาวทยาขอนแกน. พฒนา เหลาไพบลย. และอรศรา เรองแสง. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวน

วชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ. คณะเทคโนโลย. มหาวทยาลยขอนแกน. สถาบนนวตกรรมและพฒนากระบวนการเรยนร มหาวทยาลยมหดล. (2528). หลอดดวเทอเรยมและ

หลอดทงสเตน. คนเมอ 26 มนาคม 2558 จาก http://www.il.mahidol.ac.th/ e-media/color-light/page4_2.html.

Meloan, C. E., and Pomeranz, Y., (1980). Food Analysis Laboratory Experiments. The AVI Publishing Company. Westport. Connecticut.


เรอง การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ 3,5 – dinitrosalicylic acid ดวย เครองสเปกโทรโฟโทมเตอร


เพอใหผเรยนมความรและทกษะดงน 1. เขาใจหลกการ วธการใช และดแลรกษาเครองสเปกโทรโฟโทมเตอร 2. เขาใจหลกการวธวเคราะหนาตาลโดยวธ 3, 5–dinitrosalicylic acid 3. สามารถวเคราะหหาปรมาณนาตาลรดวซและเปรยบเทยบความแตกตางของปรมาณ

นาตาลรดวซในตวอยางได

ทฤษฎ 1. การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ 3, 5–dinitrosalicylic acid

วธนจะวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 520-540 nm เนองจากนาตาลทจะวดไมมการดดกลนแสงไวเลย ฉะนนในการวดปรมาณจะตองนาไปทาปฏกรยากอนเพอใหไดสารทสามารถดดกลนแสงได การใช 3, 5–dinitrosalicylic acid ในการทาปฏกรยากบหมรดวซของนาตาลจะไดสารสนาตาลแดง ซงจะดดกลนแสงทความยาวคลนดงกลาว จากนนนาไปคานวณหาปรมาณจากกราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคส

2. นาตาล (Sugar) นาตาลเปนสารประกอบประเภทคารโบไฮเดรต จาแนกได 3 ชนดใหญๆ ตามโครงสราง

ของโมเลกล คอ โมโนแซกคาไรด (Monosaccharide) ไดแซกคาไรด (Disaccharide) และโพลแซกคาไรด (Polysaccharide)


3–8 อะตอม ไมสามารถเกดปฏกรยาไฮโดรไลซใหเปนคารโบไฮเดรตทเลกลงไปอก จงสามารถจาแนกโมโนแซกคาไรดไดตามจานวนอะตอมคารบอนทเปนองคประกอบได ไรโบส (Ribose) ดออกซไรโบส (Deoxyribose) นาตาลกลโคส (Glucose) นาตาลซโครส (Sucrose) แลกโทส (Lactose) และมอลโทส (Maltose) ฟรกโทส (Fructose) และกาแลกโทส (Galactose)

276 ปฏบตการท 5 การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ 3,5 – dinitrosalicylic acid ดวยเครองสเปกโทรโฟโทมเตอร

โมโนแซกคาไรด สามารถจาแนกตามหมฟงกชนทแตกตางกนในโมเลกลไดเปนอลโดส (Aldose) ซงมหมฟงกชนเปนแอลดไฮด และคโทส (Ketose) ซงมหมฟงกชนเปนคโตน เชน กลโคสจดเปนนาตาลอลโดส และฟรกโทสจดเปนนาตาลคโทส

2.2 โอลโกแซกคารไรด (Oligosaccharide) โอลโกแซกคาไรด เปนคารโบไฮเดรตทเกดจากโมโนแซกคาไรด 2–10 หนวย มา

เชอมตอกน ดวยพนธะ C–O–C ซงเรยกวา พนธะไกลโคซดก (Glycosidic bond) ถาประกอบดวย 2 หนวยเรยกวา ไดแซกคาไรด (Disaccharide) ถา 3 หนวย เรยกวา ไตรแซกคาไรด (Trisaccharide)


สารละลายเบเนดกตไดเมอใหความรอน จะไดตะกอนสแดงอฐของคอปเปอร (I) ออกไซด Cu2O ไดแก นาตาลมอลโทส (Maltose) และนาตาลแลกโทส (Lactose) นอกจากมอลโมส แลกโทส และซโครสแลว ยงมไดแซกคาไรดอกหลายชนด เชน เซลโลไบโอส (Cellobiose) เกดจากกลโคสกบกลโคส สวนไตรแซกคาไรด เชน ราฟฟโนส (Raffinose) เกดจากกาแลกโทส กลโคส และฟรกโทส

2) นอนรดวซงชการ (Non–reducing sugar) เปนไดแซกคาไรดทไมสามารถเกดปฏกรยากบสารละลายเบเนดกต ไดแก นาตาลซโครส (sucrose)


เชอมตอกนดวยพนธะไกลโคซดก (Glycosidic bond: – C–O–C–) โพลแซกคาไรดจะมขนาดใหญกวาโอลโกแซกคาไรด สวนใหญจะมโมโนแซกคาไรดเปนรอยถงพนหนวยมาจบตอกน ตวอยางโพลแซกคาไรดอยางงาย ไดแก แปง (Starch) เซลลโลส (Cellulose) ไกลโคเจน (Glycogen) ไคตน (Chitin) เปนตน

3. เครองสเปกโตรโฟโทมเตอร (Spectrophotometer) เปนเครองมอทใชวดปรมาณของสารเคมชวโมเลกล รวมถงจลชพทงหลาย โดยใชหลกการ

วดปรมาณของแสงทตวอยางดดกลนเขาไป ตวเครองประกอบดวยแหลงกาเนดแสง (Light source) เลนสหรอกระจกรบแสง (Lens or Mirror) ตวแยกความยาวคลน (Monochromator) และตวตรวจจบสญญาณ (Detector) ดงรปท 1 แหลงกาเนดแสงทาหนาทใหแสงผานตวอยาง แหลงกาเนดแสงทดควรใหแสงทมความเขมสมาเสมอ และนงตลอดความยาวคลนทใชงาน ปจจบนแหลงกาเนดแสงทนยมนามาใชมหลากหลายชนด ยกตวอยาง เชน Deuterium Arc (190-420 nm) Tungsten (350-2500 nm) และ Xenon Lamp (190-800 nm) อกสวนประกอบหนงทสาคญนน คอ ตวตรวจจบสญญาณ สาหรบเครองตรวจวดทนยมใชไดแก PMT (Photomultiplier tube) diode arrays และ CCDs (Charge coupled devices) เครองจะทาการบนทกคาความยาวคลนรวมกบคามมของแตละความยาวคลนทเกดการดดกลน ในการวดตวอยางจะใช cuvette ซงลกษณะเปนหลอดสเหลยมเลกทาจากแกว พลาสตกหรอควอทซ ซงแตละชนดมขอดแตกตางกนคอ cuvette ททาจาก

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 5 การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ 277 3,5 – dinitrosalicylic acid ดวยเครองสเปกโทรโฟโทมเตอร

ควอทซจะมราคาแพงแตสามารถวดไดทความยาวคลนไดทงชวงยว-วสเบล (UV-Visible) ขณะท cuvette ททาจากพลาสตกหรอแกวจะวดไดแคชวงวสเบล (Visible) เทานน

รปท 1 หลกการทางานของเครอง spectrophotometer

(ทมา: สถาบนนวตกรรมและพฒนากระบวนการเรยนร มหาวทยาลยมหดล, 2528)

เทคนคทาง Spectrophotometer เปนการศกษาดานการกระทารวม ( Interaction) ระหวางคลนแมเหลกไฟฟา หรอ คลนแสงกบสสาร (Atom) (Molecule) Interaction ระหวางคลนแสงกบสสาร (ชชาต, 2534)

1) การดดกลนคลนแสง (Absorbtion) สสารสามารถดดกลนคลนแสงในชวงคลนเฉพาะ 2) การคลายคลนแสง (Emission) คอ การทสวนหนงของพลงงานภายในของสสารถก

เปลยนเปนพลงงาน 3) การกระจาย (Scatter) หรอการสะทอนกลบ (Reflection) เทคนคทาง Spectrophotometer เกยวของกบกฎของเบยร และแลมเบรต (Beer and

Lambert’s Law) โดยกฎของเบยร และแลมเบรต เกยวกบการดดกลนของแสงกบความหนาของเหลวทมส กลาววาทแตละชนของความหนาทเทากนจะดดกลนแสงทผานในเศษสวนทเทากนนนคอ เมอลาแสงของแสงโมโนโครมาตก (Monocromatic Light) ฉายผานตวกลางทดดกลน (Absorb medium) ซงกคอ สารละลายทมส ความเขมขนของแสงจะลดลงในรปของฟงคชนเอกซโพแนนเชยล ในขณะทความยาวของตวกลางมากขน “อตราของแสงทถกดดกลนไวจะผนแปรเปนสดสวนโดยตรงกบความเขมขน และระยะทางทแสงนนสองผาน” (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535)


ความรนเปนประโยชนมากในการใชปรบความหนาของชนทดดกลนแสง หรอ ความหนาแนนของตวอยาง ซงอยในหลอดแกวใส เรยกวา เซลล (Cell) หรอ ควเวทท (Cuvette) เพอลดสใหถงระดบในชวงทสามารถใชเตรยมอนกรมของสารละลายมาตรฐาน เพอใชทาโคงมาตรฐาน (Standard curve) หรอเพอทจะใชกบสเปคโตรโฟโตมเตอรได


การหาปรมาณของสารจะอาศย Beer’s law

A = εbc

เมอ A = คาการดดกลนแสง ε = molar absorptivity (L.mol-1cm.-1)

b = path length c = ความเขมขนของสารทนามาวเคราะห (mol.L-1)

ในการหาปรมาณของสารจะ plot graph ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทตองการวเคราะหและคาการดดกลนแสงดง รปท 2

รปท 2 การทา calibration curve เพอวเคราะหหาปรมาณของสาร

หลกการเครองชนดนม photoelectric cell เปน sensing element กระแสทเกดโดย photoelectric cell จะถกเปลยนไปเปนเปอรเซนตทรานสมชชน หรอคาการดดกลนแสง (Absorbent) โดยเครองกลวานอมเตอร (Galvanometer) แหลงกาเนดแสงเปนหลอดไฟธรรมดา คอ หลอดทงสเตน (tungsten lamp) และแสงโมโนโครมาตก (Monocromatic Light ) ทไดจากการใหลาแสงสองผานแกวปรซม หรอดฟแฟรกชนเกรตตง (Diffraction grating) อยางใดอยางหนงเพอใหได แสงโมโนโครมาตก (Monocromatic Light) ทมความยาวคลนในชวงแสงทมองเหนได นอกจากน เครองมอชนดนยงสามารถใหแสงในชวงอลตราไวโอเลต (Ultraviolet) และชวงใกลอนฟาเรด (near infrared) ไดอกดวย

อปกรณหลกในเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร 1) ตนกาเนดแสง (Light source) แหลงกาเนดแสงเปนสวนทใหแสง ในชวงความ

ยาวคลนทตองการออกมาอยางตอเนองและคงท รวมทงมความเขมแสงทมากพอ หลอดกาเนดแสง ม


หลายชนดตามความยาวคลนแสงทเปลงออกมา เชน ชวงยว จะใชหลอดไฮโดรเจน (H2 lamp) และหลอดดวเทอเรยม (Deuterium lamp) ใหความยาวคลนอยในชวง 160-380 นาโนเมตรและชวงวสเบล ใชหลอดทงสเตน (Tungsten/halogen) ใหความยาวคลนในชวง 240-2,500 นาโนเมตร เปนตน

2) โมโนโครมาเตอร (Monochromator) เปนสวนทใชควบคมแสงโดยจะทาใหแสงทออกมา จากตนกาเนดแสงซงเปนพอลโครเมตกใหเปนแสงโมโนโครเมตก ซงเปนแถบแสงแคบๆ หรอมความยาวคลนเดยวใชฟลเตอรปรซมหรอเกรตตง

3) เซลลทใสตวอยาง (Cell sample) เซลลทใชบรรจสารละลายตวอยางบางครงอาจเรยกวาควเวทท (Cuvettes) ทใชกนทวไป ไดแก เซลลททาดวยแกวจะใชไดเฉพาะชวงวสเบลเพราะแกวจะดดกลนแสง ในชวงยวไดและเซลลททาดวยซลกาและควอทซซงใชไดทงชวงยวและวสเบล

4) Detector ทาหนาทในการวดความเขมของแสง ทถกดดกลนโดยการแปลงพลงงานคลนแสง เปนพลงงานไฟฟาเครองวดแสงมหลายชนดทนยม ไดแก หลอดโฟโตมลตฟลายเออร (Photomultiplier tube) และเครองวดแสงชนดซลกอนไดโอด (Silicon diode detector) องคประกอบตางๆ ของเครอง UV-Visible spectrophotometer


ฝกปฏบตการใชอปกรณ บนทกคาการดดกลนแสง สรางกราฟมาตรฐานสารละลายกลโคส และคานวณปรมาณนาตาลรดวซจากสมการ อปกรณทใช

1. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 250 และ 1,000 ml 2. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 10 25 และ 50 ml 3. หลอดทดลอง (Test tube) ขนาดกลาง 4. ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 25 50 และ 100 ml 5. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 20 200 1,000 และ 5,000 µl 6. หลอดหยด (Dropper) 7. เครองสเปกโทรโฟโทมเตอร

8. อางนาควบคมอณหภม (Water bath) สารเคมทใช 1. สารละลาย 3, 5 – dinitrosalicylic acid 2. โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) 3. สารละลายมาตรฐานกลโคสความเขมขน 1,000 mg/l


การเตรยมสารละลาย เตรยมสารละลาย 0.1 % (w/v) ของสารละลาย 3, 5 – dinitrosalicylic acid เตรยมโดย 1. ชง 3, 5 – dinitrosalicylic acid 0.1 g ละลายใน NaOH ความเขมขน 2 N ปรมาตร 20 ml (ใหเปนสารละลาย a) 2. ชง Sodium potassium tartrate 30 g ละลายในนากลน 50 ml (ใหเปนสารละลาย b) 3. นาสารละลาย a ผสมสารละลาย b แลวปรบปรมาตรเปน 100 ml จะได 0.1 % (w/v) 3, 5 – dinitrosalicylic acid solution การเตรยมสารละลายมาตรฐานกลโคส ชงนาตาลกลโคสมา 0.10 g ละลายในนากลน ปรบปรมาตรใหได 100 ml จะไดสารละลายกลโคสความเขมขน 1000 mg/l ทาการเจอจางใหไดความเขมขน 0 100 200 300 400 500 และ 600 mg/l ดงแสดงในตารางท 1 ตารางท 1 การเตรยมสารละลายกลโคสมาตรฐาน เพอใชในการวเคราะหนาตาลรดวซดวยวธ DNS หลอดท สารละลายกลโคส

(ml) นากลน (ml)


1 0.0 1.0 0.00 2 1.0 9.0 100 3 2.0 8.0 200 4 3.0 7.0 300 5 4.0 6.0 400 6 5.0 5.0 500 7 6.0 4.0 600

วธดาเนนการทดลอง 1. เตมสารละลายมาตรฐานทเตรยมไดหรอสารละลายตวอยาง 1 ml ลงในหลอดทดลองขนาดกลาง 2. เตมสารละลาย 0.1 % (w/v) 3, 5 – dinitrosalicylic acid 1 ml ลงในหลอดทดลอง เขยา นาไปตม 10 min 3. เตมนากลน 10 ml แชนาเยนทนท 4. นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 520 nm คานวณความเขมขนนาตาลรดวซเทยบกบกราฟมาตรฐานกลโคส (ทาการทดลอง 3 ซา) บนทกการทดลอง


5. ผลการทดลอง

ตารางท 2 คาการดดกลนแสงของสารละลายกลโคสมาตรฐานทความเขมขนตางๆ ทความยาวคลนท 520 nm ดวยวธ DNS

ความเขมขนของกลโคส (mg/l) คาการดดกลนแสงท 520 nm หมายเหต

1 2 เฉลย 100 200 300 400 500 600

ตารางท 3 ตารางบนทกผลการทดลอง หลอดท คาการดดกลนแสงท 520 nm อตราการเจอจาง ความเขมขนของ

กลโคส (g/l) 1 2 เฉลย

1 2 3 4 5 6

การคานวณความเขมขนนาตาลรดวซในตวอยาง

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................


วจารณผลการทดลอง................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................ เอกสารอางอง ชชาต อารจตรนสรณ. (2544). เครองมอวทยาศาสตร. พมพครงท 3. ขอนแกน: สานกพมพคลง

นานาวทยา. เปรมใจ อารยจตรานสรณ. พจน ศรบญลอ. พชรย บญศร. อบล ชาออน. และ ปต ธวจตต. (2548).

ตาราชวเคม. พมพครงท 4. สานกพมพคลงนานาวทยาขอนแกน. (2548). ตาราชวเคม. พมพครงท 4. สานกพมพคลงนานาวทยาขอนแกน.

พฒนา เหลาไพบลย. และอรศรา เรองแสง. (2536). วธวเคราะหสาหรบงานปฏบตการในกระบวนวชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ. คณะเทคโนโลย. มหาวทยาลยขอนแกน.

แมน อมรสทธ. และอมร เพชรสม. (2535). Principles and Techniques of Instrumental Analysis. ชวนพมพ. กรงเทพฯ.

สถาบนนวตกรรมและพฒนากระบวนการเรยนร มหาวทยาลยมหดล. (2528). หลอดดวเทอเรยมและ หลอดทงสเตน. คนเมอ 26 มนาคม 2558 จาก http://www.il.mahidol.ac.th/e- media/color-

light/page4_2.html. Meloan C. E. and Pomeranz Y. (1980). Food Analysis Laboratory Experiments. The

AVI Publishing Company. Westport. Connecticut.


เรอง การวเคราะหปรมาณโซเดยม โพแทสเซยม แคลเซยม และแมกนเซยม โดยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมเตอร


เพอใหผเรยนมความรและทกษะดงน 1. เขาใจหลกการวธการใชและดแลรกษาเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโท

มเตอร 2. สามารถเปรยบเทยบปรมาณแรธาตในตวอยางได 3. สามารถคานวณหาความเขมแรธาตในตวอยางได

ทฤษฎ

1. เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมเตอร (Atomic Absorption spectrophptometer, AAS)

1.1 หลกการทวไป เปนการวเคราะหธาตโดยวดการดดกลนคลนแสงของอะตอมอสระทกลายเปนไอของธาตทสนใจ อะตอมอสระของธาตจะดดกลนคลนแสงจากแหลงกาเนดคลนแสงเฉพาะของแตละธาตปรมาณแสงทถกดดกลนจะมความสมพนธกบปรมาณหรอความเขมขนของธาตททาการวเคราะหตามกฎของแลมเบรต-เบยร (Lambert-Beer’ Law) (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535) คอ

log Io = A = bc I เมอ Io = ความเขมขนเมอแสงเรมตน

I = ความเขมแสงภายหลงการดกลนโดยธาต A = คาการดดกลนแสง (absorbance)

= molar absorptivity เปนคาคงทเฉพาะของแตละธาต b = ความกวางของเซลลหมายถงความกวางของเปลวไฟ c = ความเขมขนหรอปรมาณของธาต

284 ปฏบตการท 6 การวเคราะหปรมาณโซเดยม โพแทสเซยม เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ แคลเซยม และแมกนเซยม โดยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมเตอร

1.2 ขนตอนการวเคราะห โดยใช AAS

ไดอะแกรมของเครอง AAS แสดงดงรปท 1 สารละลายตวอยางทกรองแลวจะถกดดเขาสเครอง AAS โดย nebulizer สารละลายตวอยางจะถกทาใหแตกเปนละออง (Aerosol) ภายใน spray chamber ละอองขนาดใหญจะถกกาจด (Drain) ออกจากระบบ ในขณะทละอองทเหมาะสมจะผสมกบแกสทเปนเชอเพลง (Fuel gas) และแกสออกซแดนท (Oxidant) แลวผานเขาสชอง (Slot) ของตะเกยง (Burner) ซงจะถกจดเปนเปลวไฟ (Flame) ความรอนจากเปลวไฟจะกาจดตวทาละลาย (Desolvation) และทาใหละอองของตวอยางแตกเปนอะตอมอสระ และอะตอมอสระจะดดกลนแสงจาก hollow cathode lamp คลนแสงเมอผานเปลวไฟจะถกตรวจวดโดยหลอดโฟโตมลตพลายเออร (Photomultiplier tube) และประมวลสญญาณออกมาเปนคาการดดกลนแสงตอไป

Light source Atomizer Monochromater Detector Data processor

รปท 1 ไดอะแกรมของเครอง AAS (ทมา: แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535)

Hollow cathode lamp เปนแหลงกาเนดแสงบนเสน (Line source) ใชเปนแหลงกาเนดแสงของเทคนค โดย hollow cathode lamp เปนหลอดปดทาดวยแกวภายในบรรจแกสเฉอย เชน อารกอน (Ar) นออน (Ne) ทมความดนประมาณ 1-5 torr มขวแอโนด (Anode) ททาดวยทงสเตน (W) และมขวแคโทด (Cathode) ทเปนรปทรงกระบอกหรอถวยททาดวยโลหะหรอเคลอบดวยผงของโลหะทเปนธาตทตองการวเคราะห ซงจะใหสเปกตรมและความยาวคลนแสงทตองการได หนาตางของ hollow cathode lamp อาจทาดวยซลกาหรอ ควอทซ (Quartz) ขนอยกบความยาวคลนแสงทโลหะนนๆคายออกมา Light source เนองจาก อะตอมจะดดกลนแสงทความยาวคลนเฉพาะ ในการทจะวดการดดกลนแสงดวยความไวทสงสด จาเปนจะตองมแหลงกาเนนแสงทเปนแบบเสน ทจะคายแสงทมความยาวคลนทจะถกดดกลนโดยอะตอม นอกจากนน แหลงกาเนดแสงชนดน ยงสงผลใหเทคนคอะตอมมคแอบซอรพชนเปนเทคนคการวเคราะหทมการรบกวนนอยมาก แหลงกาเนดแสงดงกลาวน ปกต จะนยมใชหลอดฮอลโลวคาโธด (Hollow cathode lamp) คาโธดของหลอดฮอลโลว จะมลกษณะทรงกระบอกกลวงทาดวยโลหะทจะทาการวเคราะหทงอาโนดและคาโธด จะอยในหลอดแกวปดภายในบรรจดวยกาซนออน (Ne) หรออารกอน (Ar) สวนหนาตาง (Window) ของหลอด อาจจะเปนแกวธรรมดาหรอแกวควอทซ กระบวนการแสงของฮอลโลวแคโธดเกดขน อยางไรกตาม ในการใชงานของหลอดฮอลโลวคาโธดนน จาเปนตองมการแปลงสภาพ (Modulation) สญญาณ

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 6 การวเคราะหปรมาณโซเดยม โพแทสเซยม แคลเซยม 285 และแมกนเซยม โดยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมเตอร

เพอทจะเพมความเขมขนแสง และลดปญหาการคายแสงจากสวนของเปลวไฟ ซงการแปลงสภาพสญญาณอาจทาไดทงวธกล (Mechanical modulation) หรอ วธทางอเลกทรอนค (Electronic modulation)

Atomizer เปนระบบททาการเปลยนสภาพ ของสารละลายใหกลายเปนอะตอม อปกรณสวนนประกอบดวยอปกรณยอย 2 สวน คอ สวนทเปนเนบวไลเซอร (Nebulizer) และสวนทเปนเบอรเนอร (Burner)

(1) เนบวไลเซอร เปนสวนทสารละลายถกทาใหเปนละอองฝอยเลกๆ ผสมกบเชอเพลง และตวออกซไดส

(2) เบอรเนอร จะเปนสวนททาใหเกดอะตอมของธาตทจะวเคราะห ทจะเกดขนในเปลวไฟดงกระบวนการซงการใชเชอเพลงระบบใดนน จะขนอยกบอณหภมของเปลวไฟทตองการ แตสวนใหญแลวในการวเคราะหทวไป มกจะใชเปลวไฟแบบ air-acetylene สาหรบเชอเพลงทใชกบเบอรเนอรตางๆนนมดวยกนหลายระบบ

Detector อปกรณสวนนประกอบดวย โมโนโครเมเตอร (Monochromator) ซงทาหนาทแยกแสงจากแหลงกาเนดแสงใหไดความยาวคลนทตองการวด สวนทสอง จะเปนสวนของดเทคเตอร (Detector) ทาหนาทเหมอนกบดวงตา ทจะเปลยนความเขมของแสงใหเปนกระแสไฟฟา ปกตแลวดเทคเตอรจะเปนหลอดโฟโตมลตพลายเออร (Photomultiplier tube, PMT) ทจะปลอยกระแสไฟฟาตอจากนนจงขยายสญญาณเปนสวนทเปนระบบอเลกทรอนคส แลวสญญาณกจะถกแปลงตอใหอานออกมาในหนวยความเขมขนหรอความเขมของแสง นอกเหนอจากระบบเครองมอ AAS ทเปนแบบ ระบบลาแสงเดยว (Single beam AAS) แลว การวางรปแบบเครองมอ อาจจะวางไดในลกษณะระบบละแสงค (Double beam AAS) ซงจะชวยลดปญหาตางๆ หลายอยางทเกดขนกบระบบ single beam เชนการกระเพอมขนลงของความเขมขนของแสง ฯลฯ อยางไรกตามธาตทกตวทสามารถวเคราะหโดย AAS ไดไมสามารถทจะใชเปลวไฟเพอทาใหเปนอะตอมอสระไดโดยตรงทกธาต เพราะมบางธาตทสามารถรวมตวกบออกซเจนแลวกลายเปนอะตอมอสระไดยาก จงจาเปนทตองทาใหธาตนนแตกตวในบรรยากาศทปราศจากออกซเจน ซงธาตเหลานไดแก สารหน (Asenic, As) ดบก (Tin, Sn) บสมท (Bismuth, Bi) แอนตโมน (Antimony, Sb) และซลเนยม (Selenium, Se) วธการททาใหธาตเหลานเปนอะตอมอสระในบรรยากาศทปราศจากออกซเจน จะอาศยปฏกรยาการเตรยมใหธาตเหลานเปนสารประกอบไฮไดรด (Hydride) จงเรยกวธการเหลานวาวธทาใหเกดไฮไดรด (Hydride generation) วธการทาใหเกดไฮไดรด จะอาศยการรดวซธาตทตองการวเคราะหดวยโซเดยมโบโรไฮไดรด (Sodium borosybride, NaBH4) ในสารละลายกรด แลวผานแกสเฉอยเขาไปในภาชนะหรอเซลล (Cell) ททาใหเกดปฏกรยา เพอพาสารประกอบไฮไดรดทเกดขนเขาไปใน chamber ททาดวย ควอทซ (Quartz) ซงมอณหภมสงจากเตาเผาหรอเปลวไฟของไฮโดรเจน สารประกอบไฮไดรดจะแตกตวเปนอะตอมอสระอยภายใน chamber ซงจะดดกลนแสงจาก hollow cathode lamp เชน เดยวกบเทคนคทใชเปลวไฟในการทาใหเกดอะตอมอสระ (แมน อมรสทธ และอมร เพชรสม, 2535)



ฝกปฏบตการใชอปกรณวดปรมาตรเบองตนในงานเครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ การตวง การอานคา และการแปลงคาการวดปรมาตรของสาร อปกรณทใช

1. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 250 และ 1,000 ml 2. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 10 25 และ 50 ml 3. หลอดหยด (Dropper) 4. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 5. ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 6. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 20 200 1,000 และ 5,000 µl 7. ชวดรปชมพ (Erlenmeyer flask) ขนาด 125 250 500 และ 1,000 ml 8. ขวดเกบตวอยางโพลเอทลน ขนาด 50 ml 9. กระบอกฉดยา (Syringe) ขนาด 25 50 100 500 และ 1,000 ml 10. กระจกนาฬกา 11. กรวยแกว (Funnel) 12. เครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโตมเตอร 13. กระดาษกรองเบอร 42

* อปกรณทเปนเครองแกวและพลาสตกโพลเอทลน ขอ 1-11 กอนนาไปใชในงานวเคราะหตองแชกรดไนตรก 10 % (w/v) เปนเวลา 12 h และลางออกดวยนากลนปราศจากไอออน* สารเคมทใช

1. นากลนปราศจากไอออน 1 L 2. กรดไนตรก (HNO3) ความเขมขน 1% (w/v) 3. สารละลายสตรอนเทรยมคลอไรด (SrCl2) ความเขมขน 5% (w/v) 4. กรดไนตรกเขมขน (Conc. HNO3) 5. สารละลายมาตรฐาน Na K Ca และ Mg สาหรบ AAS ความเขมขน 1,000 mg/l

วธดาเนนการทดลอง

1. การเตรยมสารละลายมาตรฐาน ใชสารละลายมาตรฐาน Na K Ca และ Mg ความเขมขน 1000 mg/l เพอเตรยมสารละลายมาตรฐาน Na ทความเขมขน 2 4 6 8 และ 10 mg/l Ca ทความ

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 6 การวเคราะหปรมาณโซเดยม โพแทสเซยม แคลเซยม 287 และแมกนเซยม โดยเครองอะตอมมกแอบซอรพชนสเปกโตรโฟโทมเตอร

เขมขน 2 4 6 และ 8 mg/l K ทความเขมขน 1 3 และ 4 mg/l และ Mg ทความเขมขน 0.3 0.4 และ 0.5 mg/l เพอใชทากราฟมาตรฐาน Na K Ca และ Mg

2. การเตรยมสารละลายตวอยาง การยอยตวอยาง เตมสารละลายตวอยาง 5 ml ลงในบกเกอรขนาด 250 ml เตมกรดไนตรกเขมขน 20 ml นาไปตมทอณหภม 100 ๐C จนไดสารละลายใส ปรบปรมาตรดวยนากลนปราศจากไอออนใหได 50 ml นาไปกรองดวยกระดาษกรองเบอร 42 เกบตวอยางนาไปวเคราะหปรมาณดวยเครอง AAS 3. การวเคราะหปรมาณแรธาต Na โดยเครอง AAS ใชเครอง AAS ยหอ Perkin Elmer รน AAS-3110 ของบรษท The Perkin –Elmer Corporation นาสารละลายมาตรฐานขอ 1 ของ Na K Ca และ Mg สรางกราฟมาตรฐาน Na โดยวดคาการดดกลนทความยาวคลน 589.0 nm ทากราฟมาตรฐาน จากนนนาสารละลายตวอยางไปวดปรมาณ Na เชนเดยวกบสารละลายมาตรฐาน คานวณปรมาณแรธาตเทยบกบกราฟมาตรฐานของ Na

4. สวนธาต K Ca และ Mg วเคราะหเชนเดยวกนโดยธาต K Ca และ Mg วเคราะหทความยาวคลน 766.5 422.7 และ 285.2 nm ตามลาดบ ผลการทดลอง ตารางบนทกผลการทดลอง

ชนดแรธาต คาการดดกลนแสง ความเขมขน (mg/l)

Na K Ca Mg

การคานวณปรมาณแรธาตในตวอยาง ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................



สรปผลการทดลอง ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


วชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ. คณะเทคโนโลย. มหาวทยาลยขอนแกน. แมน อมรสทธ. และอมร เพชรสม. (2535). Principles and Techniques of Instrumental

Analysis. ชวนพมพ. กรงเทพฯ. Kaewnaree P. (2010). The biochemical changes during an accelerated aging and

priming processes In sweet pepper (Capsicum annuum L.) seeds. A thesis for the degree of doctor of Philosophy Khon Kaen University.

Lisa A. (2008). Basic Laboratory Calculations for Biotechnology. Biotechnology Laboratory Technician Program Madison Area Technical College: Pearson. P. 29-46.


เรอง การวเคราะหชนดและปรมาณนาตาลโดยใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

วชา เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ชอ-สกล................................................ ชนป ............................................................... วตถประสงค เพอใหผเรยนมความรและทกษะดงน 1. เขาใจหลกการ วธการใช และดแลรกษาเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงได

2. สามารถบอกชนดและปรมาณของนาตาลในตวอยางได ทฤษฎ

1. นาตาล (Sugar) นาตาลเปนสารประกอบประเภทคารโบไฮเดรต จาแนกได 3 ชนดใหญๆ ตามโครงสรางของโมเลกล คอ โมโนแซกคาไรด (Monosaccharide) ไดแซกคาไรด (Disaccharide) และโพลแซกคาไรด (Polysaccharide)


3–8 อะตอม ไมสามารถเกดปฏกรยาไฮโดรไลซใหเปนคารโบไฮเดรตทเลกลงไปอก จงสามารถจาแนกโมโนแซกคาไรดไดตามจานวนอะตอมคารบอนทเปนองคประกอบได ไรโบส (Ribose) ดออกซไรโบส (Deoxyribose) นาตาลกลโคส (Glucose) นาตาลซโครส (Sucrose) แลกโทส (Lactose) และมอลโทส (Maltose) ฟรกโทส (Fructose) กาแลกโทส (Galactose)

โมโนแซกคาไรดสามารถจาแนกตามหมฟงกชนทแตกตางกนในโมเลกลไดเปนอลโดส (Aldose) ซงมหมฟงกชนเปนแอลดไฮด และคโทส (Ketose) ซงมหมฟงกชนเปนคโตน เชน กลโคสจดเปนนาตาลอลโดส และฟรกโทสจดเปนนาตาลคโทส

1.2 โอลโกแซกคารไรด (Oligosaccharide) โอลโกแซกคาไรด เปนคารโบไฮเดรตทเกดจากโมโนแซกคาไรด 2–10 หนวย มาเชอ

ตอกนดวยพนธะ C–O–C ซงเรยกวา พนธะไกลโคซดก (Glycosidic bond) ถาประกอบดวย 2 หนวยเรยกวา ไดแซกคาไรด (Disaccharide) ถา 3 หนวย เรยกวา ไตรแซกคาไรด (Trisaccharide)


สารละลายเบเนดกตไดเมอใหความรอน จะไดตะกอนสแดงอฐของคอปเปอร (I) ออกไซด Cu2O ไดแก นาตาลมอลโทส (Maltose) และนาตาลแลกโทส (Lactose)

290 ปฏบตการท 7 การวเคราะหชนดและปรมาณนาตาล เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ โดยใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

นอกจาก มอลโมส แลกโทส และซโครสแลว ยงมไดแซกคาไรดอกหลายชนด เชน เซลโลไบโอส (Cellobiose) เกดจากกลโคสกบกลโคส สวนไตรแซกคาไรด เชน ราฟฟโนส (Raffinose) เกดจากกาแลกโทส กลโคส และฟรกโทส

2) นอนรดวซงชการ (Non–reducing sugar) เปนไดแซกคาไรดทไมสามารถเกดปฏกรยากบสารละลายเบเนดกต ไดแก นาตาลซโครส (Sucrose)


เชอมตอกนดวยพนธะไกลโคซดก (Glycosidic bond: – C–O–C–) โพลแซกคาไรดจะมขนาดใหญกวาโอลโกแซกคาไรด สวนใหญจะมโมโนแซกคาไรดเปนรอยถงพนหนวยมาจบตอกน ตวอยางโพลแซกคาไรดอยางงาย ไดแก แปง (Starch) เซลลโลส (Cellulose) ไกลโคเจน (Glycogen) ไคตน (Chitin) เปนตน

2. โครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง (High Performance Liquid Chromatography) หรอทนยมเรยกกนวา HPLC แสดงดงรปท 1 เปนโครมาโทกราฟรปแบบหนงทใชแยกสารผสมโดยอาศยวฏภาค (Phase) สองวฏภาค โดยทวฏภาคหนงอยกบท เรยกวา วฏภาคคงท (Stationary phase) ซงอาจจะเปนของแขงหรอของเหลวกได และ อกวฏภาคหนงเปนของเหลวททาหนาทพาสารเคลอนทผานวฏภาคคงทในคอลมน เรยกวา วฏภาคเคลอนท (Mobile phase) ซงเคลอนทโดยอาศยแรงดนจากเครองสบแรงดนสง (High pressure pump) ตลอดระยะเวลาทกระบวนการแยกสารดาเนนไปอย

รปท 1 เครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง

2.1 หลกการและทฤษฏพนฐานของเครองโครมาโทกราฟของเหลวแรงดนสง

HPLC มหลายรปแบบดวยกนและมแบบจาลอง (Mode) ทางทฤษฎทใชอธบายกลไกการแยกสารโดย HPLC ไดหลายรปแบบ แตอยางไรกด ยงมหลายสมการทถอวาเปนสมการรวม

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 7 การวเคราะหชนดและปรมาณนาตาล 291 โดยใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

อย โดยเฉพาะในกรณทเปนกลไกของของเหลว – ของเหลว (liquid – liquid interaction) ดงพอจะนาเสนอโดยยอดงน

คาสมประสทธการแจกแจง (distribution coefficient, KD) หาไดจาก

KD = Cstationary/Cmobile ………….(1) เมอ Cstationaryและ Cmobileเปนความเขมขนของสารในวฏภาคคงทและในวฏภาคเคลอนท

ตามลาดบ สาหรบคาแฟกเตอรความจ (Capacity factor, k') ซงมประโยชนอยางยงในระบบ HPLC

นน เปนคาทสามารถหาไดจากโครมาโทแกรม (Chromatogram) โดยตรงและมสมการทใหนยามไวดงน

k' = [KDVs]/Vm ………….(2) โดยท Vs เปนปรมาตรของของเหลวทเปนวฏภาคคงท และ Vm เปนปรมาตรของของเหลวท

เปนวฏภาคเคลอนท ปรมาตรทจาเปนตองใชในการชะเอาสารออกมาจากคอลมนจนปรากฏเปนพค(peak) บนโครมาโทรแกรม เรยกวา ปรมาตรรเทนชน (Retention volume, VR) ซงเกยวพนกนกบ k' ดงน

VR = Vm (1 + k') = Vm + VsKD ………….(3) เนองจากปรมาตรรเทนชนเปนผลคณของเวลารเทนชน (Retention time, tR) กบอตราการ

ไหลของวฏภาคเคลอนทและปรมาตรของวฏภาคเคลอนทในคอลมน (Vm) กเปนอตราการไหลของวฏภาคเคลอนท คณกบเวลาทโมเลกลของสารทไมถกหนวงในคอลมน (Unretained molecule) ใชในการเคลอนทผานคอลมน (t0) [บางแหงใชสญลกษณ tm] ดงนนจงสามารถทจะเขยนสมการ (3) ใหม ใหอยในรปของเวลาแทนทจะเปนปรมาตรได ดงน

k' = [tR – t0]/t0 ………….(4) สาหรบคาความจาเพาะของคอลมน (Column selectivity, α) หาไดจาก α = [KD2]/[KD1] = k'2/k'1 = [tR2 – t0]/[tR1 – t0] ………….(5) แฟกเตอรเหลานทงหมดสมพนธกนกบคากาลงการแยก (Resolution, R) ตามสมการ


R = (√n/4) [(α - 1)/α] [k'/(k' + 1)] ………….(6)

งานทมอบหมาย ฝกปฏบตการใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง บนทกผลการทดลอง สรางกราฟ

มาตรฐาน และคานวณความเขมขนของนาตาล อปกรณทใช

1. เครองปนเหวยง 2. กระดาษกรองขนาด 0.45 µm (0.45 ไมคอน) 3. กระบอกฉดยาขนาด 10 ml 4. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 250 และ 1,000 ml 5. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 10 25 และ 50 ml 6. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 7. ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 8. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 20 200 1,000 และ 5,000 µl 9. เครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

สารเคมทใช

1. นากลน 1 L 2. สารละลายมาตรฐานนาตาลกลโคส อะราบโนส และไซโรส สาหรบ HPLC 3. กรดซลฟวรก (H2SO4)

วธดาเนนการทดลอง 1. เตรยมสารละลายมาตรฐานนาตาลกลโคส อะราบโนส และไซโรส ทความเขมขนเปน 10

20 40 60 80 และ 100 mg/L โดยใชนากลนเปนตวทาละลาย 2. ฉดสารละลายมาตรฐานนาตาลเขาเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงปรมาตร

20 µl ทง 6 ความเขมขน ทแตละความเขมขน 3. ฉดสารตวอยางเขาเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง 20 µl แลวคานวณความ

เขมขนของนาตาลในสารละลายตวอยางจากกราฟมาตรฐาน 4. สภาวะทใชในการวเคราะห เครอง HPLC บรษท Shimadzu ประเทศญปน คอลมน BIO

RAD Aminex รน HPX – 87H ความยาว 7.6 x 300 mm ประเทศอเมรกา ตวตรวจวด RID-6A เฟสเคลอนท 0.005 M H2SO4 อตราการไหล 0.6 ml/min อณหภมคอลมน 65 °C ฉดสารปรมาตร 20 µl

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 7 การวเคราะหชนดและปรมาณนาตาล 293 โดยใชเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง


ตวอยาง ชนดของนาตาล Relation Time (min)

พนทใตพค ความเขมขน (mg/l)

1 2 3

การคานวณความเขมขนของนาตาลในตวอยาง ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................



................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

......................................................................



วชาเทคโนโลยชวภาพ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ. คณะเทคโนโลย. มหาวทยาลยขอนแกน. Anuj K. C. (2014). Multi-scale structural and chemical analysis of sugarcane bagasse in

the process of sequential acid–base pretreatment and ethanol production by Scheffersomyces shehatae and Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology for biofuel. 7: 63.

Lisa A. (2008). Basic Laboratory Calculations for Biotechnology. Biotechnology Laboratory Technician Program Madison Area Technical College: Pearson. P. 29-46

Miller G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analysis Chemistry, 31:426-428.


เรอง การวเคราะหปรมาณเอทานอลและบวทานอลโดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ


1. เขาใจหลกการ วธการใช และดแลรกษาเครองแกสโครมาโทกราฟได 2. สามารถบอกชนดและปรมาณเอทานอลในตวอยางได

ทฤษฎ

1. เอทานอลและบวทานอล 1.1 เอทานอล (Ethanol) หรอ (Ethyl alcohol) เปนสารประกอบอนทรยในกลม

แอลกอฮอลซงมหมฟงกชนเปนหมไฮดรอกไซด (Hydroxide) มสตรโมเลกล C2H5OH มนาหนกโมเลกล เทากบ 46.07 g/mol จดเดอดประมาณ 78 °C เปนของเหลวใสไมมส ตดไฟงาย ใหเปลวไฟสนาเงน ไมมควน โดยปกตสามารถรวมตวกบนา อเทอรหรอคลอโรฟอรม ไดทกสวน

รปท 1 สตรโครงสรางทางเคมของเอทานอล (ทมา: Morrison and Boyd, 1983)

1.2 บวทานอล (Butanol)

บวทานอล หรอ Butyl alcohol หรอ Bio-butanol เปนแอลกอฮอลพนฐานทประกอบดวยคารบอน 4 อะตอม และหมไฮดรอกซล (-OH) มสตรโมเลกล C4H9OH เปนแอลกอฮอลชนดหนงทมสภาพขวออนใชเปนตวทาละลาย มจดเดอดสง จดหลอมเหลวตา ปกตจะอยในสภาวะ ของเหลว ระเหยงาย ตดไฟงาย จงสามารถใชเปนเชอเพลงได

296 ปฏบตการท 8 การวเคราะหปรมาณเอทานอลและบวทานอล เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

รปท 2 แสดงสตรโครงสรางบวทานอล (ทมา: Morrison and Boyd, 1983)

2. แกสโครมาโทรกราฟ (Gas Chromatography, GC) ทาหนาทในการแยกองคประกอบ

ของสารทสามารถระเหยกลายเปนไอ (Volatile organic compounds) ไดเมอถกความรอน กลไกทใชในการแยกองคประกอบตางๆ ในสารตวอยางอาศยหลกของความชอบทแตกตางกนขององคประกอบในตวอยางทมตอเฟส 2 คอ Stationary phase และ Mobile phase

รปท 3 เครองแกสโครมาโทกราฟ

องคประกอบทสาคญของเครอง GC สามารถแบงออกไดเปน 3 สวน คอ ตาแหนงฉดสาร (Injector port) คอลมน (Column) ตวตรวจวด (Detector) และเครองประมวลผล (Integrator) ดงรปท 4

1) ชองฉดสาร (Injector) คอ สวนทสารตวอยางจะถกฉดเขาสเครองและระเหยเปนไอกอนทจะเขาส Column อณหภมทเหมาะสมของ injector ควรเปนอณหภมทสงพอทจะทาใหสาร ตวอยางสามารถระเหยไดแตตองไมทาใหสารตวอยาง ตวอยางของ injector ไดแก Split Splitless และ On column

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 8 การวเคราะหปรมาณเอทานอลและบวทานอล 297 โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

2) ตควบคมอณหภม (Oven) คอ สวนทใชสาหรบบรรจ Column และเปนสวนทควบคมอณหภมทเหมาะสมของ Column ใหเปลยนไปตามความเหมาะสมกบสารทตองการวเคราะห ซงการควบคมอณหภมของ Oven นนม 2 แบบ คอ (1) Isocratic Temperature (2) Gradient Temperature ขอดของการทา Gradient Temperature คอ สามารถใชกบสารตวอยางทมจดเดอดกวาง (Wide boiling range) และยงชวยลดเวลาในการวเคราะห 3) ตวตรวจวด (Detector) คอ สวนทจะใชสาหรบตรวจวดองคประกอบทมอยในสารตวอยางและดวาสารตวอยางชนดทเราสนใจมปรมาณอยเทาใด TEMPERATURE

CONTROLLER

CARRIER GAS REGULATOR INJECTOR PORT SAMPLE

COLUMN

INTERGATOR DETECTOR

WASTE

รปท 4 แผนผงของเครองแกสโครมาโทกราฟ (ทมา: บณฑต สละศาสตร และ ธรพล วงศชนะพบลย, 2539)

งานทมอบหมาย ทาการวเคราะหเอทานอล บนทกผลการทดลอง คานวณหาชนดและปรมาณชนดและปรมาณเอทานอลในตวอยางได


อปกรณทใช 1. เครองปนเหวยง

2. กระดาษกรองขนาด 0.45 µm (0.45 ไมคอน) 3. กระบอกฉดยาขนาด 10 ml

4. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 250 และ 1,000 ml 5. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 10 25 และ 50 ml 6. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 7. ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 8. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 20 200 1,000 และ 5,000 µl

9. แกสโครมาโทกราฟ สารเคมทใช

1. สารละลายเอทานอลมาตรฐานสาหรบเครอง GC ความเขมขน 99.999% 2. สารละลายบวทานอลมาตรฐานสาหรบเครอง GC ความเขมขน 99.999% 3. นากลน

งานทมอบหมาย ฝกปฏบตการใชอปกรณวดปรมาตรเบองตนในงานเครองแกสโครมาโทกราฟ บนทกผลการทดลองและคานวณความเขมขนเอทานอล วธดาเนนการทดลอง

1. เตรยมสารละลายมาตรฐานเอทานอลทความเขมขน 0.1 0.2 0.3 0.4 และ 0.5 % (v/v) และสารละลายมาตรฐานบวทานอลทความเขมขน 5 10 15 20 และ 25 % (v/v) เพอใชทากราฟมาตรฐาน

2. การเตรยมสารละลายตวอยาง นาตวอยาง 100 ml มาเตมนากลน ปรมาตร 100 ml เขยา นาไปกลนทอณหภม 80 ºC และเกบตวอยางปรมาตร 100 ml นาไปวเคราะหปรมาณเอทานอลและบวทานอล โดยเครองแกสโครมาโทกราฟ

3. การวเคราะหปรมาณเอทานอลและบวทานอลโดยใชเครองแกสโครมาโทรกราฟ โดยใชเครอง GC 2014 ยหอ SHIMADZU จากประเทศญปน ใช Column แคปปลารมเสนผาศนยกลาง 0.25 mm ความยาว 30 m และความหนาของสารเคลอบ 0.25 µm ใช Detector ชนดเอฟไอด (FID) ใชอณหภม Column Injector และ Detector ใชอณหภม 200 220 และ 240 ºC ตามลาดบ ฉดสารละลายมาตรฐานเอทานอลและบวทานอลปรมาตร 10 µl เขาเครอง GC โดยใชอณหภมเรมตน

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 8 การวเคราะหปรมาณเอทานอลและบวทานอล 299 โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

ท 200 ºC คงอณหภมนไว 3 min แลวเพมอณหภมจาก 5 ºC /min จนถง 220 ºC คงอณหภมนไว 5 min แลวเพมอณหภมจาก 200 ºC /min จนถง 240 ºC คงอณหภมนไว 20 min ใชเวลาในการวเคราะหทงหมด 28 min สรางเสนกราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐานเอทานอลและบวทานอลแตละชนด จากนนฉดสารละลายตวอยาง 10 µl เขาเครอง GC ซงใชสภาวะเดยวกนกบการวเคราะหสารละลายมาตรฐาน คานวณปรมาณเอทานอลและบวทานอลแตละชนดจากเสนกราฟมาตรฐาน (ทาการทดลอง 3 ซา) บนทกผลการทดลอง ผลการทดลอง ตารางบนทกผลการทดลอง

ชนดแอลกอฮอล Relation Time (min) พนทใตพค ความเขมขน (mg/l) เอทานอล บวทานอล

การคานวณความเขมขนกรดไขมนระเหยงายในตวอยาง

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

......................................................................




................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................

......................................................................




Cazetta M.L. Celligoi M.A.P.C., Buzato J.B., and Sacarmino I.S. (2007). Fermentation of molasses by Zymomonas mobilis : Effect of temperature and sugar concentration

on ethanol production. Bioresource Technology. 98: 2824-2824 Morrison R.T. and Boyd R.N. (1983). In: Organic Chemistry. 4th ed. Allyn and Bacon,

London.


เรอง การวเคราะหกรดไขมนทระเหยงายโดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ


1. เขาใจหลกการ วธการใช และดแลรกษาเครองแกสโครมาโทกราฟได 2. สามารถบอกชนดและปรมาณของกรดไขมนระเหยงายในตวอยางได

ทฤษฎ

1. กรดไขมนระเหยงาย(Volatile fatty acid) เปนสารประกอบอนทรยโครงสรางโมเลกลเลกทละลายนาซงถกสรางโดยกระบวนการไฮโดรไลซสจะถกแบคทเรยทดารงชพอยไดทงสภาพทมและไมมอากาศ (Facultative bacteria) ใชเปนแหลงอาหารและพลงงานโดยในชวงแรกของการยอยสลายขนตอนนผลของปฏกรยาจะไดกรดอนทรยระเหยงาย ซงทโมเลกลมอะตอมของคารบอนไมเกน 5 ตว เชน กรดอะซตก (CH3COOH) กรดโพรพออนก (C2H5COOH) กรดบวทรก (C3H7COOH) เปนตน แบคทเรยกลมนเรยกวาแบคทเรยกลมผลตกรด (Acid forming bacteria) ซงชนดของแบคทเรยจะถกเรยกแตกตางกนไปตามชนดของสารอนทรยนนๆ

2. แกสโครมาโทรกราฟ (Gas Chromatography, GC) ทาหนาทในการแยกองคประกอบของสารทสามารถระเหยกลายเปนไอ (Volatile organic compounds) ไดเมอถกความรอน กลไกทใชในการแยกองคประกอบตางๆ ในสารตวอยางอาศยหลกของความชอบทแตกตางกนขององคประกอบในตวอยางทมตอเฟส 2 คอ Stationary phase และ Mobile phase

302 ปฏบตการท 9 การวเคราะหกรดไขมนทระเหยงาย เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ



1) ชองฉดสาร (Injector) คอ สวนทสารตวอยางจะถกฉดเขาสเครองและระเหยเปนไอกอนทจะเขาส Column อณหภมทเหมาะสมของ injector ควรเปนอณหภมทสงพอทจะทาใหสาร ตวอยางสามารถระเหยไดแตตองไมทาใหสารตวอยาง ตวอยางของ injector ไดแก Split Splitless และ On column

2) ตควบคมอณหภม (Oven) คอ สวนทใชสาหรบบรรจ Column และเปนสวนทควบคมอณหภมทเหมาะสมของ Column ใหเปลยนไปตามความเหมาะสมกบสารทตองการวเคราะห ซงการควบคมอณหภมของ Oven นนม 2 แบบ คอ (1) Isocratic Temperature (2) Gradient Temperature ขอดของการทา Gradient Temperature คอ สามารถใชกบสารตวอยางทมจดเดอดกวาง (Wide boiling range) และยงชวยลดเวลาในการวเคราะห

3) ตวตรวจรบ (Detector) คอ สวนทจะใชสาหรบตรวจวดองคประกอบทมอยในสารตวอยางและดวาสารตวอยางชนดทเราสนใจมปรมาณอยเทาใด

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 9 การวเคราะหกรดไขมนทระเหยงาย 303 โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

TEMPERATURE

CONTROLLER


COLUMN

INTERGATOR DETECTOR

WASTE


งานทมอบหมาย ทาการวเคราะหกรดไขมนระเหยงาย บนทกผลการทดลอง คานวณหาชนดและปรมาณกรด

ไขมนระเหยงาย อปกรณทใช

1. เครองปนเหวยง 2. กระดาษกรองขนาด 0.45 µm (0.45 ไมคอน) 3. กระบอกฉดยาขนาด 10 ml

4. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 250 และ 1,000 ml 5. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 10 25 และ 50 ml 6. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 7. ขวดปรมาตร (Volumetric flask) ขนาด 10 25 50 100 และ 1,000 ml 8. ไมโครปเปต (Micropipette) ขนาด 20 200 1,000 และ 5,000 µl

9. แกสโครมาโทรกราฟ


สารเคมทใช 1. สารละลายมาตรฐานกรดอะซตก (Acetic acid) เกรดสาหรบเครอง GC 2. สารละลายมาตรฐานกรดบวทรก (Butyric acid) เกรดสาหรบเครอง GC

3. นากลน วธดาเนนการทดลอง

1. การเตรยมสารละลายมาตรฐานกรดไขมนระเหยงาย เตรยมสารละลายมาตรฐานกรด อะซตก (Acetic acid) และกรดบวทรก (Butyric acid) จากความเขมขน 100 mg/L ใชเตรยมสารละลายกรดไขมนทระเหยงาย เพอทากราฟมาตรฐานทความเขมขน 0.1 0.5 1.0 2.5 และ 5.0 mg/l ตามลาดบ

2. การเตรยมสารละลายตวอยาง ใชสารละลายตวอยาง 1.5 ml นาไปปนเหวยงทความเรว 6,000 rpm เปนเวลา 10 min ใชสารละลายตวอยาง 1 ml กรองผานกระดาษกรองขนาด 0.45 µm (0.45 ไมคอน) ฉดตวอยางเขาเครอง GC

3. การวเคราะหกรดไขมนทระเหยงายทงหมดดวยเครอง GC ใชเครอง GC ยหอ SHIMADZU รน GC2014 ใชคอลมนแคปปลาร มเสนผาศนยกลาง 0.25 mm ความยาว 30 m และความหนาของสารเคลอบ 0.25 µm ใชตวตรวจวดชนดเอฟไอด (FID) อณหภมของคอลมน อนเจคเตอร และตวตรวจวด ใชอณหภม 200 220 และ 240 °C ตามลาดบ ใชแกสพาเปนแกสฮเลยม อตราการไหล 0.6 ml/min ฉดสารละลายตวอยางจากขอ 2. ปรมาตร 1 µl เขาเครอง GC ใชสภาวะเครองทอณหภมคอลมนเรมตนท 35 °C เปนเวลา 3 min แลวเพมอณหภมจาก 5 °C /min จนถง 80 °C และคงอณหภมนไว 3 min แลวเพมอณหภมจาก 80 °C ตอminจนถง 200 °C ในอตรา 8 °C/min และคงอณหภมนไว 10 min ใชเวลาในการวเคราะหทงหมด 28 min สรางเสนกราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐานกรดไขมนทระเหยงาย และฉดสารละลายตวอยาง 1 µl เขาเครอง GC ซงใชสภาวะเดยวกนกบการวเคราะหสารละลายมาตรฐานกรดไขมนทระเหยงาย คานวณปรมาณกรดไขมนทระเหยงายทงหมด จากกราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐานกรดไขมนทระเหยงาย (ทาการทดลอง 3 ซา) ผลการทดลอง ตารางบนทกผลการทดลอง

ตวอยาง ชนดกรดไขมนระเหยงาย

Relation Time (นาท)

พนทใตพค ความเขมขน (mg/L)

1 2 3

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 9 การวเคราะหกรดไขมนทระเหยงาย 305 โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

การคานวณความเขมขนกรดไขมนระเหยงายในตวอยาง ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


สรปผลการทดลอง ...................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... เอกสารอางอง บณฑต สละศาสตร และ ธรพล วงศชนะพบลย, บรรณาธการ. (2539). เอกสารประกอบการประชม




สกญญา อดษะ. (2551) . ศกษาการผลตกรดอนทรยระเหยจากอนทรยสารความเขมขนสงของขยะเศษอาหารในระบบถงหมกแบบสองขนตอน. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาวทยาศาสตรศกษามหาวทยาลยราชภฏพระนคร

Hallenbeck, P.C. and Benemann, J.R. (2002). Biological hydrogen production; fundamentals and limiting processes. International Journal of Hydrogen Energy.27(11): 1185-1193.


เรอง การวเคราะหแกสไฮโดรเจนโดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ


1. เขาใจหลกการ วธการใช และดแลรกษาเครองแกสโครมาโทกราฟได 2. สามารถบอกชนดและปรมาณของแกสชวภาพในตวอยางได

ทฤษฎ

1. แกสชวภาพ (Biogas) หมายถง แกสทเกดจากการหมกและยอยสลายสารอนทรยทมอยในนาเสยรปแบบตางๆโดยอาศยกลมของจลนทรยชนดทไมใชอากาศทาหนาทหมกและยอยสลายสารอนทรยใหเปลยนรปไปเปนแกสชวภาพโดยจะมสวนผสมของแกสมเทน (CH4) : แกสคารบอนไดออกไซต (CO2) : และแกสไฮโดรเจนในอตราสวนประมาณ 65 : 33 : 2 ตามลาดบ ซงแกสชวภาพทมสดสวนของแกสมเทนทสงกวารอยละ 50 จะสามารถจดตดไฟไดดดงนนแกสชวภาพทไดนจะสามารถนาไปใชทดแทนพลงงานจากเชอเพลงอนๆได ตารางท 1 องคประกอบของแกสชวภาพแบงตามชนด ไดดงน

ชนด ปรมาณ (%) สตรโครงสราง คณสมบต 1. มเทน (CH4) 55 - 65

ไมมส ตดไฟไดด ใชเปนเชอเพลง

2. แกสคารบอนได ออกไซด (CO 2)

35 -45 O=C=O กาซไมมส ไมมกลน ไมตดไฟ

3.แกสไฮโดรเจนซลไฟด (H 2S )

0-1 H - S- H ไมมส มกลนเหมน

4. ไฮโดรเจน (H 2) 0-1 H - H มนาหนกเบา ใหความรอนสง เปนพลงงานสะอาด

ทมา: สานกเทคโนโลยความปลอดภย กรมโรงงานอตสาหกรรม กระทรวงอตสาหกรรม, 2553

2. แกสโครมาโทรกราฟ (Gas Chromatography, GC) ทาหนาทในการแยกองคประกอบของสารทสามารถระเหยกลายเปนไอ (Volatile organic compounds) ไดเมอถกความรอน กลไกท

308 ปฏบตการท 10 การวเคราะหแกสไฮโดรเจน เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

ใชในการแยกองคประกอบตางๆ ในสารตวอยางอาศยหลกของความชอบทแตกตางกนขององคประกอบในตวอยางทมตอเฟส 2 คอ Stationary phase และ Mobile phase



1) ชองฉดสาร (Injector) คอ สวนทสารตวอยางจะถกฉดเขาสเครองและระเหยเปนไอกอนทจะเขาส Column อณหภมทเหมาะสมของ injector ควรเปนอณหภมทสงพอทจะทาใหสาร ตวอยางสามารถระเหยไดแตตองไมทาใหสารตวอยาง ตวอยางของ injector ไดแก Split Splitless และ On column 2) ตควบคมอณหภม (Oven) คอ สวนทใชสาหรบบรรจ Column และเปนสวนทควบคมอณหภมทเหมาะสมของ Column ใหเปลยนไปตามความเหมาะสมกบสารทตองการวเคราะห ซงการควบคมอณหภมของ Oven นนม 2 แบบ คอ (1) Isocratic Temperature (2) Gradient Temperature ขอดของการทา Gradient Temperature คอ สามารถใชกบสารตวอยางทมจดเดอดกวาง (Wide boiling range) และยงชวยลดเวลาในการวเคราะห 3) ตวตรวจรบ (Detector) คอ สวนทจะใชสาหรบตรวจวดองคประกอบทมอยในสารตวอยางและดวาสารตวอยางชนดทเราสนใจมปรมาณอยเทาใด

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 10 การวเคราะหแกสไฮโดรเจน 309 โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

TEMPERATURE

CONTROLLER


COLUMN

INTERGATOR DETECTOR

WASTE


งานทมอบหมาย ทาการวเคราะหกรดไขมนระเหยงาย บนทกผลการทดลอง คานวณหาชนดและปรมาณกรดไขมนระเหยงาย อปกรณทใช

1. กระบอกเกบแกส ขนาด 50 ml 2. ขวดเกบแกส ขนาด 10 30 60 และ 100 ml 3. ขวดหมกแกสชวภาพ ขนาด 60 ml

4. บกเกอร (Beaker) ขนาด 50 100 250 และ 1,000 ml 5. ปเปต (Pipette) ขนาด 1 5 10 25 และ 50 ml 6. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 50 และ 100 ml 7. เครองแกสโครมาโทรกราฟ


สารเคมทใช 1. แกสคารบอนไดออกไซดมาตรฐาน ความเขมขน 99.999% 2. แกสไฮโดรเจนมาตรฐาน ความเขมขน 99.999% 3. แกสมเทนมาตรฐาน ความเขมขน 99.999% 4. แกสไนโตรเจนมาตรฐาน ความเขมขน 99.999%

วธดาเนนการทดลอง

1. การเตรยมแกสมาตรฐานไฮโดรเจนทความเขมขน 0.0 2.5 5.0 10 15 และ 20 % ในขวดขนาด 100 ml ทกาจดแกสอนๆ ออกโดยไลดวยแกสไนโตรเจนเปนเวลา 2 min

2. การเตรยมสารตวอยาง เตรยมสารตวอยางโดยใชกระบอกเกบแกสขนาด 50 ml ดดแกสในขวดหมกปรมาตร 100 ml จากนนฉดแกสลงในขวดเกบตวอยางขนาด 10 ml ทกาจดแกสอนๆ ออกโดยใชแกสไนโตรเจนไลเปนเวลา 2 min ปดดวยแผนพาราฟลม นาไปวเคราะหดวยเครอง GC

3. การวเคราะหแกสชวภาพดวยเครอง GC ใชเครอง GC ยหอ SHIMADZU รน GC 2014 ของบรษท SHIMADZU จากประเทศญปน Column MS-5A มเสนผานศนยกลาง 3.00 mm ความยาว 60 m และความหนาของสารเคลอบ 0.5 mm ใชตวตรวจวดชนดทซด (TCD) อณหภมของคอลมน อนเจคเตอร และตวตรวจวด ใชอณหภม 120 130 และ 140 ๐C ตามลาดบ ใชแกสพาเปนแกสไฮโดรเจน อตราการไหล 30 ml/min ฉดสารละลายตวอยางจากขอ 2. ปรมาตร 1 ml เขาเครอง GC ใชสภาวะเครองทอณหภมคอลมนเรมตนท 35 ๐C เปนเวลา 3 min แลวเพมอณหภมจาก 5 ๐C ตอนาทจนถง 80 ๐C และคงอณหภมน ไว 3 min แลวเพมอณหภมจาก 80 ๐C/min จนถง 200 ๐C ในอตรา 8 ๐C/min และคงอณหภมนไว 10 min ใชเวลาในการรนทงหมด 20 min สรางเสนกราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน และฉดสารละลายตวอยาง 1 ml เขาเครอง GC ซงใชสภาวะเดยวกนกบการวเคราะหสารละลายมาตรฐานแกสไฮโดรเจน คานวณปรมาณแกสแกสไฮโดรเจน จากกราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐานแกสไฮโดรเจน (ทาการทดลอง 3 ซา) ผลการทดลอง ตารางบนทกผลการทดลอง

ตวอยาง ชนดของแกสชวภาพ

Relation Time (นาท)

พนทใตพค ความเขมขน (mg/l)

1 2 3

เครองมอวเคราะหทางเทคโนโลยชวภาพ ปฏบตการท 10 การวเคราะหแกสไฮโดรเจน 311 โดยใชเครองแกสโครมาโทกราฟ

การคานวณความเขมขนแกสไฮโดรเจนในตวอยาง ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


สรปผลการทดลอง ...................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... เอกสารอางอง บณฑต สละศาสตร. และ ธรพล วงศชนะพบลย, บรรณาธการ. (2539). เอกสารประกอบการประชม




สกญญา อดษะ. (2551) .ศกษาการผลตกรดอนทรยระเหยจากอนทรยสารความเขมขนสงของขยะ เศษอาหารในระบบถงหมกแบบสองขนตอน. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาวทยาศาสตรศกษามหาวทยาลยราชภฏพระนคร

สานกเทคโนโลยความปลอดภย กรมโรงงานอตสาหกรรม กระทรวงอตสาหกรรม. (2553). คมอการปฏบตงานเกยวกบการออกแบบ การผลต การควบคมคณภาพ และการใชกาซชวภาพ (Biogas) สาหรบโรงงานอตสาหกรรม. กรงเทพฯ.

Hallenbeck P.C. and Benemann J.R. (2002). Biological hydrogen production; fundamentals and limiting processes. International Journal of Hydrogen Energy. 27 (11): 1185-1193.

อกสารประกอบการสอน༛portal5.udru.ac.th/ebook/pdf/upload/171g661256745yj6b7bu.pdf ·...

Documents