aktuelle entwicklungen bei der gewinnung sekundärer pflanzeninhaltsstoffe aus nebenprodukten der...
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Aktuelle Entwicklungen bei der Gewinnung Aktuelle Entwicklungen bei der Gewinnung sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe aus sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe aus
Nebenprodukten der Obst- und Nebenprodukten der Obst- und Gemüseverarbeitung am Beispiel TraubentresterGemüseverarbeitung am Beispiel Traubentrester
Dietmar R. Kammerer, Thorsten Maier, Andreas Schieber,
Reinhold Carle
Universität HohenheimInstitut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
Lehrstuhl Lebensmittel pflanzlicher HerkunftStuttgart
Nebenprodukte der Obst-und Gemüseverarbeitung
• Zunehmend restriktive Gesetzgebung auf EU-Ebene
• Integrated Pollution Prevention and Control Directive 96/61/EC
• Landfill Directive 99/61/EC
• Animal By-products Regulation 1774/2002
• Incineration of Waste 2000/76/EC
• Ökonomische Motive für die Reststoffverwertung
• Hohe Kosten für Entsorgung (´polluter pays´-Prinzip)
• Verbrauchererwartung (nachhaltige Produktion)
• Möglichkeiten der Wertschöpfung
• Gemäß Bio-Abfallverordnung ist das Ausbringen von Trester auf Dauergrünland-flächen seit 01.10.98 verboten.
Nebenprodukte der Obst-und Gemüseverarbeitung
► Direkte Weiterverarbeitung oder kostenintensive Trocknung nötig
• Lagerungs- und Trocknungsbedingungen beeinflussen die Poly-phenolausbeuten und die antioxidative Aktivität signifikant
• Hoher Wassergehalt der Nebenprodukte aus der Verarbeitung pflanzlicher Lebensmittel
• Rascher mikrobieller Verderb
• Abfallprodukte, die aus Fermentationsprozessen stammen
• Fermentation läuft in den Nebenprodukten weiterhin ab
• Endogene Enzymaktivitäten (z.B. Polyphenoloxidasen, Peroxidasen)
• Oxidativer Verlust phenolischer Antioxidantien
Konventionelle Polyphenolextraktion
• Verwendung organischer Solventien, insbes. von Alkoholen oder wässrig-alkoholischen Lösungen
• Entflammbarkeit
• Hohe Kosten für Lösungsmittel
• Regulatorische Erfordernisse
• Extraktion unter Verwendung von Sulfit, insbes. von Anthocyanen
• Gesundheitliche Bedenken (allergenes Potential)
Konventionelle Polyphenolextraktion
O+
OCH3
OH
OCH3
OH
O-Glc
H
OH O
OCH3
OH
OCH3
OH
O-Glc
OH
H SO3H
HSO3-
∆T
Reversible Bildung von Sulfonsäureaddukten
Allergen-Kennzeichnungsverordnung (i.d.F. vom 09.10.2006, Anlage 3)
Zutaten, die allergische oder andere Unverträglichkeitsreaktionen aus-lösen können:
Schwefeldioxid und Sulfite in einer Konzentration von mehr als 10 mg/kg oder 10 mg/L, als SO2 angegeben
Traditionelle vs. neuartige Extraktionsmethoden
• Hauptsächliche Nachteile traditioneller Extraktionsverfahren:
• Zeitaufwendig
• Arbeitsaufwendig
• Geringe Selektivität und / oder geringe Extraktionsausbeuten
• Verwendung großer Mengen toxischer Solventien
Herrero et al., 2006
• Vorteile der neuartigen Verfahren:
• Höhere Selektivität
• Kürzere Extraktionsdauer
• Keine Verwendung toxischer organischer Solventien
• Umweltfreundlich / keine Umweltgefährdung
Struktur der pflanzlichen Zellwand
Primärwand pflanzlicher Zellen
• Polysaccharide
• 20 – 30 % Cellulose
• 25 – 30 % Hemicellulosen (Xylane, Glucane, Mannane)
• 15 – 30 % Pektin (Polygalacturonsäure, Rhamnogalacturonan, Arabinane, Galactane, etc.)
• Proteine
• 5 % Glycoproteine, Elastin, Extensin
• Phenolische Verbindungen
• < 1 % Lignin
• Enzyme
• Peroxidasen, Glucanasen, etc.
Struktur der pflanzlichen Zellwand
Cellulose
Hemicellulose
Pektin
Plasmalemma
Mittellamelle
Pri
märw
and
50 nm
Raven et al., 2000
Enzymatische Extraktion von Polyphenolen
• Hydrolyse der Polysaccharide pflanzlicher Zellwände mittels pektinolyti-scher und cellulolytischer Enzympräparate
• Erhöhte Gesamtphenolausbeuten aus Traubentrester (Meyer et al., 1998)
• Verbesserte Extraktion von Anthocyanen und Gesamtphenolen aus Rückständen der Verarbeitung schwarzer Johannisbeeren (Landbo & Meyer, 2001)
• Generell Zunahme der Extraktionsausbeuten, einige phenolische Komponenten wurden durch Enzymnebenaktivitäten negativ be-einflusst (Kammerer et al., 2005)
Flash Release Treatment
• Studien wurden mit Trauben durchgeführt, um die Polyphenolextraktion in die Moste und Säfte zu forcieren
• Schnelle Erhitzung der Trauben auf Temperaturen > 95 °C bei Atmosphärendruck
• Anschließend anlegen eines starken Vakuums (> 100 mbar)
• Sofortige Verdampfung
• Verdampfung induziert Aufbrechen der Zellwände und Abkühlen der Trauben
Morel-Salmi et al., 2006
Flash Release Treatment
• Die Ergebnisse sind bestimmt durch die Kombination thermischer Effekte mit dem Aufbrechen der Zellwände beim Aufheben des Vakuums
• Inaktivierung qualitätsmindernder Enzyme
• Verbesserte Solubilisierung aller Klassen phenolischer Verbin-dungen
• Verändertes Profil einiger Polyphenolklassen, z.B. der Pro-cyanidine
Morel-Salmi et al., 2006
Supercritical Fluid Extraction (SFE)
fest
flüssig
gasförmig
Überkritisches FluidD
ruck
Temperatur
pc
Tc
Typisches Phasendiagramm eines Reinstoffes
Supercritical Fluid Extraction (SFE)
SFE für die Extraktion von Nebenprodukten der Lebensmittelindustrie
• Traubenkerne:
• Polyphenolausbeuten mit überkritischem CO2 und Methanol als Modifier sind höher im Vergleich zur konventionellen Fest-Flüssig-Extraktion (Palma & Taylor, 1999)
• Fraktionierung phenolischer Verbindungen ist möglich (Murga et al., 2000)
• Traubenhäute / Traubentrester:
• Extrakte werden erhalten, die bestimmte Bioaktivitäten aufweisen, z.B. zytotoxische Effekte auf Tumorzellen (Palenzuela et al., 2004)
Subcritical Water Extraction (SWE)
SWE: Extraktion mit heißem Wasser unter erhöhtem Druck
Parameter: 100 – 374 °C (Tc)
10 – 60 bar
Vorteile: Umweltfreundlich
Hohe Extraktionsausbeuten
Gezielte Variation der Lösungsmittelpolarität möglich
Subcritical Water Extraction (SWE)
Temperatur (°C)
0 100 200 300 400
Die
lekt
risc
he
Ko
nst
an
te
0
20
40
60
80
100
Herrero et al., 2006
Dielektrische Konstante von Wasser
Subcritical Water Extraction (SWE)
Herrero et al., 2006
Schematische Darstellung eines SWE-Systems
Lösungsmittelreservoir
Extraktgefäß
Abfallbehälter
Extraktionszelle
Subcritical Water Extraction (SWE)
Anlage im Labormaßstab für die SWE
Lösungsmittelreservoir
Extraktionszelle
Extraktbehälter
Abfallbehälter
Pulsed Electric Field Treatment
• Zunehmende Beliebtheit als nicht-thermische Prozesstechnologie
• Sofortige Wirkung auf die Zellmembran und kurze Prozesszeiten
• Reduktion der mikrobiellen Belastung durch Zerstörung bakterieller Zellmem-branen
Rastogi, 2003
Behandlungs-kammer
Hochspannungs-quelle
Lade-widerstan
dSchalter
Kondensator zur Energiespeicheru
ng
Pulsed Electric Field Treatment
Rastogi, 2003
Elektrode
-
-
-
-
--
-+
+
+
+
+
+
+Elektrode
SchalterSpannungs-
quelle
Elektrisches Feld (E0)
Induzierung eines Transmembranpotentials in einer Zelle, die einem externen elektrischen Feld ausgesetzt wird
Pulsed Electric Field Treatment
• Anwendung gepulster elektrischer Felder zur Verlängerung der Produkthalt-barkeit
• Inaktivierung von Mikroorganismen (E. coli, S. typhimurium, S. senftenberg, L. monocytogenes…)
• Inaktivierung qualitätsmindernder Enzyme (nur begrenzt möglich)
• Herstellung von Frucht- und Gemüsesäften
• Apfel (Angersbach & Knorr, 1997; Flaumenbaum, 1986; McLellan et al., 1991; Schilling et al., im Druck)
• Karotte (Knorr et al., 1994)
• Zuckerrübe (Eshtiaghi & Knorr, 2000)
• Kokosnuss (Ade-Omowaye et al., 2001)
Pulsed Electric Field Treatment
• Extraktion pflanzlicher Sekundärmetabolite aus Zellkulturen (Knorr et al., 1994; Dornenburg & Knorr, 1993)
• Extraktion von Pflanzenphenolen aus Abfallprodukten der Obst- und Gemüse-verarbeitung?
Pulsed electric fields for the recovery of pigments from wastes of the food industry (F. De Vito, F. Donsì, G. Ferrari; Università degli Studi di Salerno, Italy)
2006 EFFoST Annual Meeting / Total Food 2006
Sustainability of the Agri-Food Chain
The Hague, The Netherlands, 7-9 November 2006
Membrantrennverfahren
• Ultrafiltration als Mittel zur Aufreinigung von Rohextrakten
• Entfernung hochmolekularer Zellwandbestandteile (Pektine, Cellulose und Hemicellulosen sowie deren Abbauprodukte)
• Entfernung von Proteinen
• Fraktionierung phenolischer Verbindungen nach ihrem Molekulargewicht
• Niedermolekulare Phenole vs. hochmolekulare Tannine
• Fraktionen, die unterschiedliche techno- und biofunktionelle Eigen- schaften aufweisen
Adsorbertechnologie
Adsorbertechnologie als Verfahren zur Gewinnung phenolischer Verbindungen
2. Entfernung nicht-phenolischer
Komponenten
1. Adsorption der Polyphenole 3. Gewinnung der
phenolischen Verbindungen
4. Regenerierung des Harzes
Adsorbertechnologie
Kommerzielle Anwendung der Adsorbertechnologie
• Entbitterung von Zitrussäften (Kimball & Norman, 1990; Shaw & Buslig, 1986)
• Entfärbung, Standardisierung und Stabilisierung von Saftkonzentraten (Lyndon, 1996)
• Entfärbung von Pektin, das aus Apfeltrester extrahiert wurde, und gleichzeitige Gewinnung von Polyphenolen (Carle et al., 2001; Schieber et al., 2003)
• Gewinnung natürlicher Farbstoffe oder von bestimmten wertgebenden Substanzen (z.B. Hesperidin) aus Nebenprodukten der Lebensmittelver-arbeitung (Di Mauro et al., 1999, 2000, 2002; Kammerer et al., 2005)
High-Speed Counter-current Chromatography (HSCCC)
multilayer coil
axis of rotation
axis of revolution stationary sun
gear
planetary gear
Schematischer Aufbau eines HSCCC-Systems
Ito, 2005
High-Speed Counter-current Chromatography (HSCCC)
Mischungszonen Entmischungszonen
Trennprinzip der HSCCC
Ito, 2005
Modi:• Head – Tail obere Phase = stationäre Phase• Tail – Head untere Phase = stationäre Phase
High-Speed Counter-current Chromatography (HSCCC)
HSCCC-System im Labormaßstab
Coils
Hintergrund
Traubentrester als Quelle natürlicher Antioxidantien
• Traubentrester weist hohe Gehalte an Polyphenolen auf
Phenolgehalte [%]Phenolgehalte [%] BemerkungenBemerkungen
Stiele 1-4
Shrikhande (2000)Shrikhande (2000) Häute 1-2 Trauben; Folin-Ciocalteu
Kerne 5-8
Trester;
Lu & Foo (1999)Lu & Foo (1999) ca. 4 17 phenolische Verbindungen
+ oligomere Procyanidine
Rote Traubenhäute 3,76
Bravo & Saura-Calixto (1998) Bravo & Saura-Calixto (1998) Weiße Traubenhäute 4,48 Trester; Folin-Ciocalteu
„Weiße“ Traubenkerne 5,22
• Einsatz phenolischer Verbindungen aus Traubentrester als natürliche Antioxi-dantien in Lebensmitteln möglich (Bonilla et al., 1999)
• Ausbeute an phenolischen Verbindungen aus Traubentrester kann durch Ein-satz depolymerisierender Enzyme gesteigert werden (Meyer et al., 1998)
Polyphenole in Traubentrester
Detektionswellenlänge: 520 nm
min0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
50
100
150
200
Delphinidin-3-Delphinidin-3-OO--
glucosidglucosid
Cyanidin-3-O-Cyanidin-3-O-
glucosidglucosid
Petunidin-3-O-Petunidin-3-O-
glucosidglucosid
Paeonidin-3-O-Paeonidin-3-O-
glucosidglucosid
Malvidin-3-O-Malvidin-3-O-
glucosidglucosid
Paeonidin-3-O-Paeonidin-3-O-
acetylglucosidacetylglucosid
Paeonidin-3-O-Paeonidin-3-O-
cumaroylglucosicumaroylglucosidd
Malvidin-3-O-Malvidin-3-O-
acetylglucosidacetylglucosid
Malvidin-3-O-Malvidin-3-O-
cumaroylglucosicumaroylglucosidd
Anthocyane
Polyphenole in Traubentrester
Phenolcarbonsäuren
Detektionswellenlänge: 280 nm
min5 10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350
GallussäureGallussäure
HMFHMF
Protocatechu-Protocatechu-säuresäure
CaftarsäureCaftarsäure
pp-Hydroxy--Hydroxy-benzoesäurebenzoesäure
CutarsäureCutarsäure
VanillinsäureVanillinsäure
KaffeesäureKaffeesäure
FertarsäureFertarsäure
SyringasäureSyringasäure
pp-Cumarsäure-Cumarsäure
Polyphenole in Traubentrester
Flavanole und Stilbene
Detektionswellenlänge: 280 nm
min10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
100
200
300
400
500
Procyanidin Procyanidin B1B1
Procyanidin Procyanidin B3B3
CatechinCatechin
Procyanidin Procyanidin B2B2
EpicatechinEpicatechin
PolydatinPolydatin
EpicatechingallatEpicatechingallat
ResveratrolResveratrol
Polyphenole in Traubentrester
min10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
Flavonole
Quercetin-3-O-Quercetin-3-O-galactosidgalactosid
Quercetin-3-O-Quercetin-3-O-glucosidglucosid
Quercetin-3-O-Quercetin-3-O-glucuronidglucuronid
Quercetin-3-O-Quercetin-3-O-rhamnosidrhamnosid
Isorhamnetin-3-O-Isorhamnetin-3-O-glucosidglucosid
MyricetinMyricetin
QuercetinQuercetin
KämpferolKämpferol
IsorhamnetiIsorhamnetinn
Detektionswellenlänge: 370 nm
Enzymatische Tresterextraktion
D-Optimaler Versuchsplan
Einflussparameter:
• pH-Wert• Temperatur• Enzymdosage (Novoferm 106 / Cellubrix L ; 3 / 1)
7500----6
600055--5
45005064
30004553
15004042
03531
Stufenwerte:
Enzymdosage ppm]Temperatur [°C]pH-Wert
CBAFaktoren:
Enzymatische Tresterextraktion
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
35
40
45
50
55
01000
20003000
40005000
6000
pH 3
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
200
300
400
500
600
700
800
35
40
45
50
55
01000
20003000
40005000
6000
pH 5
200 300 400 500 600 700 800
Phenolcarbonsäuren
Anthocyane
3-D-Liniendiagramme
Maier et al., 2007
Enzymatische Tresterextraktion
0 50 100 150 200 250 300 350
Caftarsäure
Cutarsäure
Fertarsäure
Gallussäure
Protocatechusäure
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Delphinidin 3-O-glucosid
Cyanidin 3-O-glucosid
Petunidin 3-O-glucosid
Päonidin 3-O-glucosid
Malvidin 3-O-glucosid
Delphinidin 3-O-acetylglucosid
Petunidin 3-O-acetylglucosid
Päonidin 3-O-acetylglucosid
Malvidin 3-O-acetylglucosid
Päonidin 3-O-coumaroylglucosid
Malvidin 3-O-coumaroylglucosid
0 50 100 150 200 250
Procyanidin B1
Catechin
Procyanidin B2
Epicatechin
Epicatechin-gallat
Quercetin 3-O-galactosid
Quercetin 3-O-glucosid
C
A B
Maier et al., 2007
Adsorbertechnologie
Aufreinigung und Konzentrierung eines ´Cabernet Mitos´-Tresterextraktes
Säulenbeladung Elution
Alkohol
Adsorbertechnologie
Fraction
2 4 6 8 10 12 14 16 18
% o
f to
tal a
ntho
cyan
ins
0
20
40
60
80
100
Methanol 50 °CMethanol 50 °CMethanol 25 °CMethanol 25 °CEthanol 50 °CEthanol 50 °CEthanol 25 °CEthanol 25 °C2-Propanol 50 °C2-Propanol 50 °C2-Propanol 25 °C2-Propanol 25 °C
4 6 8 10 12 14 16 18
70
75
80
85
90
95
100
Kammerer et al., 2004
Aufreinigung und Konzentrierung eines ´Cabernet Mitos´-Tresterextraktes
Isolierung phenolischer Verbindungen mittels HSCCC
Trennung von Caftar-, Cutar- und Fertarsäure
OH
HO
O
O
HO O
OH
O
OH
HO
O
O
HO O
OH
O
OH
OCH3
HO
H
O
O
HO O
OH
O
OH
• Trennung strukturell sehr ähnlicher Substanzen• hohe Ausbeute• geringer Zeitfaktor
Isolierung phenolischer Verbindungen mittels HSCCC
Vortrennung
• Head-to-Tail-Modus
• Lösungsmittelgemisch: Hexan / Ethylacetat / Methanol / bidest. Wasser / TFA (3 / 7 / 3 / 7 / 0,01; v/v)
• Flussraten: 0,5 mL/min (t = 0-260 min) 1,0 mL/min (t = 260-360 min)
Caftarsäure Cutar- / Fertarsäure
Isolierung phenolischer Verbindungen mittels HSCCC
Isolierung
• Tail-to-Head-Modus
• Lösungsmittelgemisch: TBME / Butanol / ACN / bidest. Wasser / TFA (2 / 1 / 2 / 5 / 0,01; v/v)
• Flussrate: 0,5 mL/min
Caftarsäure Cutarsäure
Fertarsäure
Verwertung von Traubentrester
Trester roter und weißer Trauben
Tresterrohextrakt
Enzymatische Extraktion
Sprühtrocknung Fraktionierung mittels HSCCC
Adsorption
Aufgereinigte Polyphenolfraktionen
Getrockneter Rohextrakt
Isolierte phenolische Verbindungen
Zusammenfassung und Schlussfolgerungen
• Abfallprodukte werden zunehmend zur Gewinnung phenolischer Verbindungen herangezogen
• Konventionelle Extraktionsmethoden weisen einige Nachteile auf, daher werden alternative Technologien benötigt
• Mehrere neuartige Technologien stehen heute zur Verfügung, die Effizienz und Rentabilität muss in den meisten Fällen noch bewertet werden
• Die Bioaktivitäts-geleitete Extraktion pflanzlicher Abfallprodukte oder die Fraktionierung von Rohextrakten ist möglich
► Herstellung maßgeschneiderter Polyphenolpräparate
Danksagung
Achim Claus
Sabine Korhummel
Solveigh Sanzenbacher
Dieses Vorhaben wurde aus Mitteln der industriellen Gemeinschaftsforschung (Bundesministerium für Wirtschaft und
Technologie via AiF) über den Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.V. (FEI) gefördert. Projekt AiF 14039 BG.