bgs stiegler mai2014 - labors.at

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Blutbank-WorkshopUpdate Blutgruppenbestimmung und Blutgruppenserologie

Gabriele StieglerZentrallabor mit Blutbank

Wilhelminenspital der Stadt Wien

Labors.at Fortbildungsakademie

Wien, am 24. Mai 2014

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 2

Ein Streifzugdurch die Blutgruppenserologie

� Blutgruppen� ABO

� Rhesussystem

� Noch mehr Blutgruppen

� Antikörper� Antikörperdifferenzierung

� Serologische Verträglichkeitsprobe

� Schwangerschaft

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Was ist eine Blutgruppe?

� Erbliche Eigenschaftauf der Oberfläche von roten Blutkörperchen

� Definition des Antigens durch spez. Antikörper� Landsteinerregel

� Entstehung durch Immunisierung

� Blutgruppenantigene� Protein

� Glykoprotein

� Kohlehydrat auf Glykoprotein oder Glykolipid

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 333

Blutgruppenantigene

� Chem. Unterschied zwischen den Blutgruppen � 1 Protein – z.B. RhD

� Austausch einer Aminosäure – z.B. Fyaund Fyb; K und k

� 1 Monosaccharid – z.B. A, B

� Herstellung der Blutgruppenantigene� Erythrozyt

� Sek. Adsorption in die Zellmembran� Le, Ch/Rg

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 444

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Funktion derBlutgruppenträgermoleküle

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 55

Funktion der BG Antigene

� Zelladhäsionsmoleküle� Lu, LW

� Chemokinrezeptoren� Fy

� Zelloberflächenenzyme� K

� Komplementkontrolle� Kn, Crom

� Glykokalix� MNS, ABO

� Membrantransporter� RH, Jk, CoG. Daniels et al.: Essential Guide to Blood Groups. 2nd Edition, 2010

NomenklaturBlutgruppen (I)

� ISBT – International Society of Blood Transfusion� Vereinheitlichung der Nomenklatur auf genetischer Basis

� Jährliches update

� 34 Blutgruppensysteme (Stand 10/2013)

� Umfassen 298 Blutgruppenantigene

� 340 Blutgruppenantigene (Stand 10/2013)

� Codierung� Name des BG-Systems (z.B. ABO, Rh,…)

� 3-stellige Nummer, Symbol, CD Nummer

� Genname(n) (z.B. ABO, GYPA, …)

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 666

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NomenklaturBlutgruppen (II)

� Blutgruppensystem� 1 oder mehrere Antigene auf dem gleichen oder

homologen Protein

� 1 oder homologe Gene

� Blutgruppensammlungen� Passen in kein Blutgruppensystem

� Genetischer Code noch nicht bekannt

� Serologisch eindeutig definiert

� Vererbbare Eigenschaft

� 700er Serie der niederfrequenten Antigene

� 901er Serie der hochfrequenten Antigene

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 777

Die Blutgruppe ABO

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WiKliWo 1901;14:1132

Nobelpreis 1930

ABO - Geschichte� 1900: Entdeckung in Wien durch Karl Landsteiner

� „Zur Kenntnis der antifermentativen, lytischen und agglutinierenden Wirkungen des Blutserums und der Lymphe“. ZentrBlBak 1900;27:357-366

� „Über Agglutinationserscheinungen normaler menschlicher Blute“. WiKliWo 1901;14:1132

� 1910: Vererbbarkeit der Blutgruppen

� 1950: Entdeckung der chemischen Struktur der ABO Antigene� Kohlehydrate auf Glykoproteinen/Glykolipiden

� 1990: Entdeckung des ABO Gens� Gen kodiert spezifische Transferasen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 101010

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Biosynthese der ABO AntigeneVoraussetzung: H-Substanz

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 111111

� Fucosyltransferase am H Gen auf Chromosom 19 kodiert

� Blutgruppensystem H� 1 Antigen

� Sehr hochfrequentes Antigen

� H Gen fehlt � Keine H-Substanz

� Keine Antigene A und B auf den Erythrozyten

� Serologisch wie O

� Bombaytypen

Biosynthese der ABO Antigene ABO spezifische Transferasen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 121212

� Transferase auf Chromosom 9 kodiert

� 4 Aminosäuren Unterschied zw. Transferase fürBG A und B

� Transferase => Anlagerung eines BG-spez. Monosaccharids

� Blutgruppe O

� keine Transferaseaktivität

� Nur H Substanz

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24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 13

Antigene und Isoagglutinine

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Anti A Anti B Anti ABCa. 1 Million ABO Motive pro Ery

Isoagglutinintiteranti-A und anti-B (I)

� = Serumgegenprobe

� „Natürlich“ vorkommende Alloantikörper � Neugeborene erst ab 3.-6. Monat

� Getriggert durch Immunisierung via Darmbakterien

� Immer entsprechend dem Antigen

� Titerhöhe variiert� Darminfektionen

� Immunisierung durch (Fehl)transfusionen und Transplantation

� Komplement-aktivierend� => intravasale Hämolyse!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 141414

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Isoagglutinintiteranti-A und anti-B (II)

� Vorwiegend IgM, aber auch IgG und IgA� Komplette Antikörper

� => direkte Agglutination im NaCl Milieu

� Temperaturoptimum 4°C

� Große Temperaturamplitude

� Hohe Titer, hohe Avidität

� BG O� Besonders hohe Titer

� Spezifische anti-AB-Antikörper � Vorwiegend IgG!

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Österr. RichtlinienBestimmung Blutgruppe ABO

� Serologischer Nachweis der Antigene� Testreagenzien A, B, (AB)

� Vorzugsweise monoklonale Reagenzien

� Doppelbestimmung mit 2 versch. Reagenzien/Klonen

� Serumgegenprobe� Testerythrozyten A1, A2, B, O

� Jede Diskrepanz ist abzuklären!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 161616

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ABO Antigene und Serumgegenprobe

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Gelzentrifugationstest

Probleme bei der ABO Bestimmung

� Antigenbestimmung

� Irreguläre Reaktionen der Erythrozyten mit den Testreagenzien anti-A, anti-B

� Serumgegenprobe

� Irreguläre Reaktionen des Serums/Plasma mit den Testerythrozyten A1, A2, B und O

� Diskrepanz zw. Antigen und SGP

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 18

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ErythrozytenPartielle, schwache, fehlende Agglutination

� Physiologisch� Neugeborene

� A-Untergruppen

� Angeboren� Seltene A, B und 0 Varianten

� Chimärismus

� Krankheitsbedingt� Blutgruppenungleiche Notfalltransfusion

� Knochenmark- oder Stammzelltransplantation

� Leukämien

� Acquired B (bei A1)

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ErythrozytenIrreguläre positive Agglutination

� Beladung mit Kälte-Wärme-Antikörpern� Direkter Coombstest positiv?

� ev. BG Bestimmung bei 37°C

� Cave: Kontrolle – Ctl.

� Monoklonale Seren/Karten verwenden

� Pseudoagglutination� Geldrollenbildung durch Paraproteine

� Unspezifische Agglutination durch HÄES

� Warthonsche Sulze - Plazentarestblut

� Sehr hohe Leukozytenzahl

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 20

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SerumgegenprobeNachweis Isoagglutinintiter � Methode

� Testzellen A1, A2, B und 0

� Direkte Agglutination bei Raumtemperatur

� Isotiter nicht nachweisbar – was tun?� Verstärkung der Reaktion

� Ansatz im Röhrchen

� Inkubation bei 4°°°°C für ca. 20 Minuten� (Plasmamenge erhöhen)

� (Inkubationszeit erhöhen)� Wechsel der Testzellen

� (Vorinkubation der Testzellen mit Bromelin)

� (Ansatz in der Liss/Coombskarte bei 37°C)

� ABO wiederholen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 212121

SerumgegenprobeSchwache Reaktionen

� Alter des Patienten� Sehr jung oder sehr alt

� Immunglobulinmangel

� Immunsuppressive Therapie

� St.p. Stammzell-, KM-, Nierentransplantation?

� St.p. inkompatible Transfusion

� Chimärismus

� Blutprobe verdünnt� gleichzeitige Infusion bei Blutabnahme

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 222222

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SerumgegenprobeIrreg. positive Reaktionen

� Spez. kältereaktive Alloantikörper� Anti-M, -Le, -P1, -N, Rh-AK, Kell-AK

� „Unspez.“ Kälteagglutinine� Meist anti-I

� Irreg. Anti-A1

� A2 Zelle wichtig

� Irreg. Anti-H

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 23

ABO Diskrepanzen (I)Was tun?� Allgemein

� Anamnese!� Transfusionen, Transplantation, Alter

� Blutprobe!� Hämolyse, Lipämie, geronnen

� Testwiederholung� Neue Zellen, neues Reagenz

� (Neue Probe)

� Weitere Techniken� Patientenzellen waschen

� Längere Inkubation

� Inkubation bei 37°C

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 24

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ABO Diskrepanzen (II)Was tun?

� Schwache/negative Reaktionen� Subgruppen?

� Spezialuntersuchungen – Adsorption, Elution, ev. Molekulargenetik

� Mischfeldreaktionen� Transfusion/Transplantation

� Subgruppen

� Chimärismus

� Unerwartet positive Reaktionen� Monoklonale Sera verwenden

� CTL positiv � Zellen (warm) waschen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 25

Blutgruppe A2

� Nukleotiddeletion am A1 Gen� A2 spezifisches Antigen

� Transferaseaktivität vermindert

� Wenig A-Antigen

� Viel H Substanz

� Irreguläres anti-A1

� Fakultativer Antikörper� 2% der A2 Individuen

� 25% der A2B Individuen

� Transfusionsrelevant bei 37°°°°C

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 262626

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Irreguläres anti-A1

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 2727

Blutgruppenkarte => wie AB positiv

Serumgegenprobe => A1 Zelle positiv!

Blutgruppe A2(B)Reaktion mit anti-H

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 2828

� Anti-A1 und anti-A2(H)� Dolichus biflorus (Reagens aus Pflanzenlectine)

� A1, A2 und O Testerythrozyten als Kontrollen mitführen!

� Cave: Blutgruppe A bzw. AB muss feststehen!

Gehalt an H-Substanz

O > A2 > B > A2B > A1 > Ax

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ABH Gewebsblutgruppe

� Antigene ABH auf fast allen Körperzellen

� ABH Sekretion=> Lösliche Glykoproteine in fast allen Körpersekreten� 80% Sekretor

� 20% non-Sekretor

� Nachweis im Speichel

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 292929

Bombaytypen

� Echter Bombay� H Antigen fehlt + non-Sekretor

=> ABO Blutgruppenmerkmale werden nicht ausgebildet

� Bilden anti-A, anti-B, anti-H=> alle Testerythrozyten positiv!

� Eigenblutvorsorge mit Kryokonserven!

� Pseudobombay� H Antigen nur in den Sekreten vorhanden

=> kein anti-H

� Serologisch wie 0

� Cave: BG wird unterdrückt, aber vererbt!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 303030

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BombayAlle Testzellen positiv!

24. Mai 2014 3131

BombayTestung mit anti-H

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ABOVarianten und Subgruppen

� Extrem selten!!!

� A3, Ax, AM, Ael,…� Mutationen im A(B) Gen

� Meist schwächere Exprimierung

� Manchmal irreguläres anti A1

� Nachweis� Adsorption, Elution

� Molekulargenetische Methoden

� Analoges bei Blutgruppe B

� Bisher > 300 ABO Allele bekannt

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 333333

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 34

ABOVarianten und Subgruppen

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Erworbene VeränderungenAquired B

� Schwere Darmkrankheiten� Sepsis, Colonneoplasie

� Enzyme von E. coli � Deazetylase: n-Azetylgruppe (A) => Galaktosamin (B)

� Mischfeld in B� BG A schaut serologisch wie AB aus

� Reagenzienwechsel, Isotiter!

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Erworbene VeränderungenWeak A

� Akute Leukämien� Antigenabschwächung bei ca. 1/3 der Patienten

� Antigenverlust möglich

� Epigenetische Veränderung der ABO Promotorregion

� Serologisch wie BG O Isotiter wie BG A

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Mischfeldagglutination

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 3737

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Mischfeldagglutination

� Blutgruppe/Rhesus (derzeit) nicht bestimmbar� Anamnese

=> Transfusion von BG O RHD negativ?

� Blutabnahmen für Blutgruppenbestimmung immer vor Notfalltransfusionen!!!

� Weitere Vorgangweise� BG Kontrolle in 3 Monaten

� Ev. molekulargenetische Abklärung

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 383838

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Richtlinien ÖGBT Identitätssicherung

� Aktive Patientenidentifikation!!!� Familienname, Vorname, Geburtsdatum

� Blutröhrchen vor der Entnahme des Patientenblutes eindeutig beschriften� Patientenetikette� Name, Vorname� Geburtsdatum� Identifikationscode

� Blutabnahme nur in beschriftete Röhrchen

� Blutabnahme ohne gleichzeitige Infusion� Kann Ergebnis verfälschen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 39

ABO- Vererbung

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 404040

Erbgesetzenach Mendel

A und B sindkodominant

O ist rezessiv gegenüber A und B

Cave! Unterschied zw.Genotyp undPhänotyp

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24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 41

ABO Verteilung

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Aus G. Daniels et al.: Essential Guide to Blood Groups. 2nd Edition, 2010

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 42

ABO Verteilung in Europa

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Klinische Bedeutung AB0

� Hämolytische Transfusionsreaktion bei ABO majorinkompatibler Erythozytentransfusion� Intravasale Hämolyse

� Hämolyse bei inkompatibler Knochenmark/Stammzelltransplantation� Bearbeitung des Knochenmarks notwendig

� Plasma-/Eryaustausch vor Transplantation

� Organabstoßung bei Nieren/Herztransplantation� Plasmaaustausch/Immunadsorption vor Transplantation

� Inkompatibilität Mutter-Kind

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 434343

Transfusionsregeln� BG ABO und RhD gleich!!!

� Ausnahme: irreg. Antikörper => ABO kompatibel

� Frauen < 50 Jahre� C,c,E,e und K beachten => Prävention MHN

� Notfalltransfusion – bei vitaler Indikation� Transfusion vor Abschluss der prätransfusionellen Untersuchungen

� Der transfundierende Arzt trägt die Verantwortung für das erhöhte Transfusionsrisiko

� Der Bedside Test muss durchgeführt werden

� In Ausnahmefällen Transfusion von EK der BG O, RHD negativ, (K negativ) erlaubt

� Die prätransfusionellen Untersuchungen sind unverzüglich durchzuführen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 44

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TransfusionsregelnUniversalspenderschema

majo

rkom

pati

bel

min

ork

om

patib

el

ErythrozytentransfusionNiemals gegen Isoagglutinine des Empfängers!!!

PlasmatransfusionKeine Isoagglutinine gegen ABO Merkmale des Empfängers!!!

Funktionelle Aspekte ABO

� ABH Kohlenhydrate stabilisieren Zellmantel� Schutz vor Zerstörung

� Schutz vor Pathogenen

� BG O aus BG A durch Mutation� Rel. Resistenz gegen Plasm. Falciparum

� Höheres Blutungsrisiko bzw. niedrigeres Thromboserisiko� Konzentration von vWF vermindert

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 464646

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Rhesussystem

Insgesamt 52 Antigene –das komplexeste Blutgruppensystem!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 474747

RhD und RhCEZwei homologe Proteine

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� Zwei homologe RHD- und RHCE-Gene� Eng gekoppelt auf Chromosom 1

� Praktisch immer gemeinsam als Haplotyp vererbt

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Verteilung RhD

� Europa => 85% RhD positiv � Häufigster Phänotyp: Ccee

� genotypisch meist DCe/dce

� Afrika => 95% RhD positiv � Genotypisch meist DCe/Dce

� Ostasien => 99,9% RhD positiv

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 494949

RhD

� Höchst immunogen!� > 50% humorale Immunantwort nach Transfusion

mit RhD positivem Blut

� RhD positiv niemals für RhD negative Frauen < 50 Jahre

� Antikörperscreening 2-3 Monate nach (Notfall)Transfusion mit RhD positivem Blut !

� Klinische Bedeutung� Fatale hämolytische Transfusionsreaktion

� Morbus haemolyticus neonatorum

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 505050

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RhD Antigenbestimmung gemäß österr. RL 1996

� Nachweis RHD (Richtlinien)� Zwei verschiedene Testreagenzien

� Kategorie DVI muss erkannt werden� Vorgabe der österr. Richtlinien

� UK: DVI und alle anderen low grade RhDweak => negativ

� Wichtig für Spenderserologie

� Ein Reagenz erkennt DVI nicht

� Ein Reagenz erkennt DVI

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 515151

Rhesusformeln

� 3 Allelpaare – D.,Cc,Ee

� 8 Haplotypen – DCE,DCe,DcE,Dce,.CE,.Ce,.cE,.ce

� 36 Genotypen

� Serologischer Nachweis von 18 Phänotypen� CcDee,CCDee,CcDEe,ccdee,Ccdee,…

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Vererbung RHD

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 535353

RhD negativRhCE positiv

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 545454

� => Dweak Untersuchung� RhD Nachweis im indirekten Coombstest

� Cave: direkter Coombstest muss negativ sein

� Bestimmung der gesamten „Rhesusformel“� Bestimmung von C,c,E,e

� Antigene immer mit 2 verschiedenen Reagenzien bestimmen

� Ceppellinieffekt� D wird durch C in trans abgeschwächt

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BlutgruppenbefundGemischte Rhesusformel

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 555555

O

Agglutination auf der GlasplatteReaktionsmuster

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 5656

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Dweak

RhD - Varianten

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 575757

� weakD und Dpartial sind meist kombiniert

� Punktmutation(en) und/oder Antigenverminderung

� Transfusionsempfehlung� Als Empfänger RHD negativ, als Spender RHD positiv

� Typisierung der RhD Variante� Serologisch nicht möglich

� Molekularbiologische Methoden!

RhDweak Typ 1,2,3

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 585858

� Ca 50% aller Dweaks!

� Bilden kein anti-RhD� Schweizer Richtlinien

� RhD positive Transfusionen möglich!

� Schwangere mit RhDweak Typ 1,2,3

� Keine Rhesusprophylaxe notwendig!

� Nachweis molekularbiologisch!� Doppelbestimmung

� Noch nicht in österreichische Richtlinien

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RhD-VariantenMeist erkennbar verminderte D-Expression

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 59

Anza

hl der

RhD

-Antigene

RhD Varianten

RhD positiv => ca. 15 000 - 25 0000 Antigene

RhDel => <100 AntigeneRhD negativ

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 60

RhDΨ und RhDel

6060

� RhD� 2/3 serologisch der RhD neg. Afrikaner

� RhDel� Japan und China

� RhD ganz schwach exprimiert� Kein Nachweis mit serologischen Methoden möglich!� Molekulargenetischer Nachweis notwendig

� Immunogen� Antikörperbildung möglich!

� Spenderserologie� MHN

� (Rhnull� Erys exprimieren keine Rhesusantigene!

� Versorgung nur mit Rhnull Blut)

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Weitere Blutgruppensysteme

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 61

Das Kell System� 34 Antigene� K (KEL1) und k (KEL2)

� K - polymorph (Europa – 9%, Afrika – 1%)� k - hochfrequent

� Kpa (KEL3) und Kpb (KEL4)� Kpa - niederfrequent (Europa - 2% )� Kpb - hochfrequent

� Jsa (KEL6) und Jsb (KEL7)� Jsa – Afrika 20%, Europa < 1%� Jsb – hochfrequent

� Klinische Bedeutung� Anti-K - 2. häufigster Antikörper� HTR� MHN => Frauen < 50 Jahre - K neg versorgen!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 62

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Das Duffy System

� 5 Antigene

� Fya (FY1) und Fyb (FY2)

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 63

VerteilungPhänotyp

Europa(%)

Afrika(%)

Japan(%)

Fy(a+b-) 20 10 81

Fy(a+b+) 48 3 15

Fy(a-b+) 32 20 4

Fy(a-b-) 0 67 0

Duffy und Malaria

� Rezeptor für Chemokine

� Rezeptor für Plasmodium vivax� Fy(a-b-) resistent gegen Plasmodium vivax

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 64

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Duffy Antikörper

� Kein Nachweis mit enzymbehandelten Zellen� Enzym zerstört Fy

� Dosiseffekt� Bei niedrigem Titer Reaktion nur mit homozygoten Zellen

� Komplementaktivierend� HTR

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 65

Das Kidd System

� 3 Antigene

� Jka (JK1) und Jkb (JK2)

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 66

VerteilungAntigen

Europa(%)

Afrika(%)

Asien(%)

Jka 76 92 73

Jkb 72 49 76

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Kidd Antikörper

� Gefährlich=> Komplementaktivierend

� IgG oder IgG+IgM

� Dosiseffekt

� Nachweis verbessert mit enzymbehandelte Zellen

� AK können unter die Nachweisgrenze sinken

� Boosterung durch Transfusion

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 67

Das MNS System

� 46 Antigene

� MN� Europa: 50% M+N+

� Ss� Europa: 45% S+s+

� S-s-U-Phänotyp� Afrika: 1%

� Anti-U!� HTR!

� Eigenblutvorsorge!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 68

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Antikörper MNS

� Anti-M, anti-N� Anti-M auch „natürlich vorkommend“

� Anti-M >>> anti-N

� Meist nicht bei 37°C aktiv

� Nachweis bei RT oder 4°C, NaCl Milieu besser

� IgM und IgG

� Dosiseffekt

� Kein Nachweis mit enzymbehandelte Zellen

� Anti-S, anti-s� Nachweis bei 37°C

� Kein Nachweis mit enzymbehandelte Zellen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 69

Das Lewis System

� 6 Antigene

� Kohlenhydrate auf Glykolipiden� Produktion im Plasma

� Sekundär in Zellmembran inkorporiert

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 70

PhänotypVerteilung

Europa(%)

Afrika(%)

China(%)

Le(a+b-) 22 20 0

Le(a-b+) 72 55 62

Le(a+b+) 0 0 27

Le(a-b-) 6 25 11

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Antikörper im Lewis System

� Fast nur bei Le(a-b-) Individuen

� Anti-Lea oft begleitet von schwachem anti-Leb

� IgM, IgG

� 37°C, RT

� Verstärkung mit enzymbehandelten Zellen

� Schwangerschaft� Le oft abgeschwächt

� Le AK nur passager

� Le AK für Fetus nicht gefährlich� Le AG noch nicht in Erymembran inkorporiert

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 71

Das Lutheran System

� 20 Antigene

� Lua, Lub

� Antikörper� IgM, IgG

� 37°C, RT

� Verstärkung mit enzymbehandelten Zellen

� Lub

� Hochfrequentes Antigen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 72

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Antikörper gegenhochfrequente Antigene

� Antigenfrequenz > 95%

� Muster� „Alles positiv“

� Eigenkontrolle negativ

� k, Lub, Kpb, Coa, Yta, Vel, Jsb, Jra, Sc1, ….

� Schwierige Identifikation des Antikörpers

� Schwierige Versorgung der Patienten� Eigenblutvorsorge (Kryokonserven)

� Internationale Blutbanken

� Nicht gegen den Antikörper transfundieren!� „Eine hämolytische Transfusionsreaktion ist zu erwarten“

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 73

Nullphänotypen

� Antigene werden nicht exprimiert � Serologisch nicht vorhanden

� Antigene auf Nukleotidebene vorhanden� Blockade im Golgiapparat

� Antikörperbildung möglich!

� Rh, K, Fy, Jk, Lu

� Sehr schwierige Versorgung� Eigenblut

� Kryokonserven

� Internationale Blutbanken

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 74

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Antikörperscreening

I II III

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 76

Antiköpergegen Blutgruppenmerkmale� „Natürliche“ Antikörper

� Isoagglutinine anti-A und anti-B (IgM)

� Erworbene irreguläre Antikörper � Immunisierung

� Schwangerschaft

� Transfusion

� Landsteinerregel� Alloantikörper nur gegen Antigene, die man selbst nicht besitzt

� Vorwiegend IgG� Inkomplette Antikörper

� Agglutination nur mit Verstärkermedien

� Temperaturoptimum 37°C

� Meist extravasale Hämolyse

7676

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Agglutination mitVerstärkermedien

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 77

� Albumin� Abschirmung der negativen Oberflächenladung

=> Agglutination

� LISS = low ionic strength solution� Vermindert negativen Oberflächenladung

=> Agglutination

� Coombs� Antihumanglobulin

� Enzymmilieu� „Andauen“ der Kohlehydrathülle und Freisetzen von

Antigenen=> Rh, Jk, K, Le

� Cave: unspezifische Reaktionen

Indirekter Coombstest (Antiglobulintest)

� 1908: Erstbeschreibung von Carlo Moreschi� Indirekte Agglutination mit Verstärkung

� Polyspezifisches anti-human-Globulin� Nachweis der Bindung von „inkompletten“

IgG Antikörpern an Erythrozyten

� Gelzentrifugationstest� LISS

=> Beschleunigung der Antikörperbdg. => Verkürzung der Inkubationszeit

� Anti-IgG, anti-C3d

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 787878

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Indirekter Coombstest

� Nachweis irreg. IgG-Antikörper im Serum� Anwendung

� Antikörperscreening� Antikörperidentifikation� Serologische Verträglichkeitsprobe� Antigentypisierung mit bekannten Antikörpern

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 797979

Direkter Coombstest

� Nachweis einer Beladung von Erythrozyten mit IgG Antikörpern und/oder Komplement

� Anwendung� Transfusionsreaktion� Autoimmunhämolytische Anämie� Morbus haemolyticus neonatorum

� Zufallsbefund bei lymphatischen Erkrankungen, Antibiotika, auch gesunde Bluspender,...

� Weiterführende Untersuchungen� Monspezifischer direkter Coombstest� Eigenkontrolle� Elution des Antikörpers

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 808080

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24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 81

Irreguläre AntikörperKlinische Bedeutung

� Intravasale Hämolyse� Komplement-aktivierend C5b => C9

IgM > IgG3 > IgG1

� Keine Transfusion gegen einen Alloantikörper� Nur antigenfreie EK transfundieren

� Schwangerschaft� IgG AK passieren die Plazenta

=> Morbus hämolyticus neonatorum et fetalis (MHN)

� Autoimmunhämolytische Anämie� Autoantikörper

8181

Faktoren, die die klinischeBedeutung von AK beeinflussen

� Antikörperspezifität� Konzentration und Avidität� Temperaturamplitude

� <30°C eher ungefährlich

� Immunglobulinklasse und –subklasse� IgM, IgG1 und IgG3 komplementaktivierend

� Antigendichte und –menge� Aktivität des RES� Responder – Nonresponder� Immunogenität des Antigens

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 8282

42

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 8383

� Obligate Methode=> indirekter Coombstest bei 37°°°°C

� Panel mit 3 Testzellen

� Breitgefächerte Verteilung der klinisch wichtigsten Antigene => Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNSs, Lutherian

� Antikörper mit Dosiseffekt=> Duffy, Kidd, MNSs=> Antigene müssen in homozygoter Form vorliegen

83

RichtlinienAntikörpersuchtest

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 8484

RichtlinienAntikörpersuchtest

� Screening positiv � Antikörperdifferenzierung obligat!� Antikörper im ICT bei 37°C sind immer klinisch relevant

� „Gültigkeit“� 72 Stunden ab Blutabnahme

� Wann?� Jede Blutgruppenbestimmung� Jede Kreuzprobe� Schwangerschaft� Nach Transfusionsreaktionen

84

43

AntikörpersuchtestStörfaktoren

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 85

� Autoantikörper� Bindungskapazität der Ery überschritten

� Direkter Coombstest positiv

� Milieu-assozierte Probleme� Enzymaffinität

� LISS-Affinität

� Gelkartenartefakt

� Stabilisatoreffekt der Panelzellen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 8686

Antikörperdifferenzierung

8686

44

8787

(Qualitativer) Nachweis der Antikörperspezifität

� Indirekter Coombstest bei 37°°°°C obligat

� Panel� 8 bis 20 Testzellen/Spenderzellen� Möglichst differenziertes Mosaik der wichtigsten

Blutgruppenantigene in homo- und heterozygoter Form

87

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 8888

MethodenAntikörperdifferenzierung

� Verstärkung der Antigen-Antikörperreaktion� Förderung von bekannten Eigenschaften der Antikörper

� Durchführung in verschiedenen Milieus� Enzym behandelte Zellen

� Bromelin, Ficin, Papain

� Legen Antigene frei=> RH, K, Jk

� Zerstörung Antigene => Fy, MNSs

� Temperatur� 4°C, Raumtemperatur, NaCl Milieu

� Verstärkte Reaktion bei Le, M, N, P

� Eigenkontrolle� Ausschluss von Autoantikörpern

8888

45

Beurteilung der ReaktionsstärkeGelfiltrationstest

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 89

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 9090

Ursachen Unterschiedliche Reaktionsstärken

� Mehrere Antikörper� 20% der AK-Patienten haben einen 2. Antikörper� => strenge Indikation zur Transfusion

� „Homozygote –heterozygote“ Zellen� Dosiseffekt bei niedrigtitrigen Antikörpern� Besonders bei Rh, Fy, Jk, MNS

� Cave: Antikörper können auf Suchzellen verschieden stark exprimiert sein� Anti D bei ccDee und ccDEE besonders stark

� => Die Reaktionsstärke muss beurteilt werden

90

46

Panel mit 11 Testerythrozyten

919191

Häufigkeit irregulärer Antikörper

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 9292

Spezifität IgG-Antikörpern (%) AG-Frequenz (%)

Anti - DAnti - KAnti - EAnti - Fy a

Anti - cAnti - Jk a

Anti - CAnti - SAnti - e

33,024,023,07,54,44,01,81,80,5

85,09,7

30,069,080,075,070,052,098,0

92

47

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 93

Klinische Beurteilung einiger Antikörper

9393

Klinisch signifikant

Signifikant nur bei 37°°°°C

Manchmal signifikant

Benigen

ABO

Rh

Kell

Duffy

Kidd

SsU

Vel

Lea

M,N

Lu

A1

Yta

Ge

Co

Xga

KnopsChido/Rogers

Bg

JMH

Aus G. Daniels and I. Bromilow: Essential Guide to Blood Groups. 2nd Edition, 2010

93

VollständigeAntikörperidentifikation� Bestätigung des Antikörpers

� 2 verschiedene Chargen� (keine Antikörper anzüchten)

� Korrespondierendes Antigen bestimmen� +/- Kontrollen� Doppelbestimmung - 2 verschiedene Reagenzien� Cave: direkter Coombstest des Patienten

� Befund� Antikörper, Antigen� Transfusionsempfehlung� Antikörperausweis

� Transfusion� Antigenfreie Konserven suchen!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 949494

48

Überlegungen zur Sucheantigenfreier Konserven

� Berücksichtigung ABO� Bei mehreren Antikörpern und/oder seltener Blutgruppe

Umstieg auf kompatible Konserven nach Universalspenderregel

� Berücksichtigung Rhesusuntergruppen� Vermeidung – wenn möglich - einer weiteren

Immunisierung!

� Ein Antikörper� Z.B. anti-Jka

� Ca. 23% Jka negative Spender => ≈ jede 4. Konserve passt

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 959595

Berechnung antigenfreie Konserven

� 3 Antikörper: anti-c, anti-K, anti-Jka

� Wahrscheinlichkeit c negativ: 20%

� Wahrscheinlichkeit K negativ: 91%

� Wahrscheinlichkeit Jka negativ: 23%

� Multiplikation der Wahrscheinlichkeiten� 0,2x0,91x0,23=0,04 => 4% der Spender geeignet

� Anforderung von 6 Konserven� 0,04xn=6 => n=6:0,04 => 150

� 150 Konserven müssen getestet werden

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 969696

49

Die serologische Verträglichkeitsprobe

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 979797

Serologische Verträglichkeitsprobe„Kreuzprobe“

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 989898

� Obligat: indirekter Coombstest bei 37°°°°C � Obligat: Majortest

� Irreg. IgG Antikörper im Plasma des Patienten (Empfänger) gegen Erythrozyten der Blutkonserve (Spender)

RBC

Plasma

EK

RBC

Plasma

Patient

Major-Test

Minor-Test

50

„Kreuzprobe“

� Ergebnis muss auf dokumentiert werden

� Gültigkeit: 72 Stunden nach Blutabnahme

� Antikörperscreening immer gleichzeitig

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 999999

Freigabe zur Transfusion ?

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 100100

Antikörpersuchtest positiv

Kreuzprobe negativ

100

51

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 101101

Antikörpersuchtest positiv

Kreuzprobe negativ

101

� Alloantikörper!

� Irreguläre Antikörper, die im indirekten Coombstest bei 37°C gefunden werden sind klinisch relevant

� Identifizierung des Antikörpers vor Transfusion

� Transfusion von Antigenfreien EK

� Antigenfreie Konserven suchen

101

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 102102

Antikörpersuchtest negativ

Kreuzprobe positiv

Ursache?

102

52

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 103103

Antikörpersuchtest negativ

Kreuzprobe positiv

� Positiver direkter Coombstest der Konserve?

� Im Screening nicht erfasste Antikörper?� Kpa und/oder Lua im Suchpanel nicht erfasst

� Großes Panel durchführen!

� Antikörper gegen niederfrequente Antigene?� Privatantigen, Familienantigen

� Selten!

� Patientenverwechslung?

103

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 104104

Antikörpersuchtest positiv

Kreuzprobe positiv

???104

53

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 105105

� => Autoantikörper!

� Cave: darunterliegende Alloantikörper!� Transfusionsanamnese

� Elution des Antikörpers

� Serumverdünnung

� Aussage über serologische Verträglichkeit nicht möglich!� Vitalindikation!

� Transfusionsempfehlung: Biologische Vorprobe nach Öhlecker

105

Antikörpersuchtest positiv, Kreuzprobe positiv

Eigenkontrolle und DCT positiv

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 106106

Antikörpersuchtest positiv, Kreuzprobe positiv

Eigenkontrolle negativ

� => Alloantikörper gegen ein hochfrequentes Antigen

� k, Lub, Kpb, Coa, Yta, Vel, Jsb, Jra, ….� Schwierige Identifikation des Antikörpers

� Alle verfügbaren Panels durchführen

� SGP?

� Schwierige Versorgung des Patienten

� Ev. Kryokonserven

� Ev. Bestellung von Konserven in internat. Blutzentralen

� Nicht gegen einen Antikörper transfundieren!

�Kommentar –„eine hämolytische Transfusionsreaktion ist zu erwarten“

106

54

Blutgruppenserologie in der Schwangerschaft

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 107107

Warum Untersuchungen in der Schwangerschaft?

PräventionMorbus haemolyticus neonatorum

=> Alloimmunhämolytische Anämie des Fetus und Neugeborenen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 108108108

55

Voraussetzungen zur Entstehung des MHN1. Irreguläre Antikörper der Mutter gegen

fetales Blutgruppenmerkmal� Schwangerschaft und/oder� Transfusion

2. Fetus besitzt ein Blutgruppenantigen, das die Mutter nicht hat� Blutgruppenmerkmal vom Kindesvater� Blutgruppenmerkmal im Fetus heterozygot

3. Antikörper gelangen über Plazenta zum Fetus� Nur IgG Antikörper!� Aktiver Transport von Mutter zu Kind

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 109109109

Pathogenese MHN

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 110110110

56

Symptome des MHN

� Leicht - Anaemia neonatorum� Hämatokrit 35-45%

� Retikulozytose, Erythroblastose

� Mäßig – Icterus gravis� Hyperbilirubinämie - Bilirubin steigt post partum

� Risiko des Kernikterus ab 20-25mg/dL Bilrubin

� Schwer – Anaemia gravis� Hämatokrit <28%

� Keine Ödeme, Hepatosplenomegalie

� Sehr schwer – Hydrops fetalis� Ödeme, Ascites, Pleura- und Pericarderguss

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 111111111

Pränatale Ultraschalldiagnostik

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 112

57

Welche erythrozytäre Antikörper sind involviert?

� Prinzipiell jeder IgG AK!

� Nachweis im=> Indirekten Coombstest bei 37°C

� RhD > Rhc > K

� Klinisch signifikante Antikörper� ca. 0,5% der Schwangeren

� Klinisch nicht relevante Antikörper� Antikörper, die nur im Enzymmilieu nachweisbar sind

� Antikörper, die nur bei Raumtemperatur nachweisbar sind

� Antikörper gegen Antigene, die der Fetus noch nicht hat

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 113113113

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 114

Rhesusantikörper

114114114

� Anti-D� RhD ist höchst immunogen!

Mindestens 30% bilden anti-D nach Transfusion mit RhD positivem Blut

� Richtlinien TFM&BGS=> Transfusion nur RhD ident!

� Anti-c � Vorsicht bei Notfalltransfusionen

=> Transfusion von O RhD neg = ccddee

� Anti-C, anti-E

114

58

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 115

WeitereAntikörperspezifitäten

� Kell (K)� Hemmung der Erythropoese

� => Retikulozyten nicht stark vermehrt

� => Bilirubin nicht stark erhöht

� Schwere MHN auch bei niedrigen Titern

� Untersuchung des Kindesvaters!

� Anti-Fya, -Jka, -M, -S,…� Selten

� Milde bis schwere MHN beschrieben

115115115

Einschätzung des Risikos für den Fetus

� Quantifizierung des Antikörpers => Titerbestimmung � 4-wöchig bis 20. SSW

� 2-(4)-wöchig ab 20. SSW

� „Heterozygote“ Testerythrozyten

� Testung Kindesvater

� Antigenbestimmung des Feten� Kindesvater heterozygot

� Fetale Blutabnahme – Nebenwirkungen

� Nicht invasive fetale Diagnostik aus mütterlichem Blut!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 116116116

59

Nicht-invasive pränatale Bestimmung des kindlichen RHD

� Zellfreie fetale DNA im mütterlichen Blut� Von Chorionzotten in den mütterlichem Kreislauf

� Nachweis ab 12. SSW

� Methode=> PCR-SSP

� Indikation� MHN Risikopatientinnen - Antikörperträgerinnen

� Gezielte Anwendung der präpartalen Rhesusprophylaxe� ≈ 30% der Schwangeren erhalten eine

RhD Prophylaxe, obwohl Kind RhD negativ

� Rhesusprophylaxe ist ein Blutprodukt - Nebenwirkungen!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 117117117

Die Rolle der Antikörperstärke/Titerhöhe

� Titerhöhe korreliert nicht mit Schweregrad des MHN� Auch niedrige Titer können schwere MHN verursachen

� Titerhöhe gibt einen Anhaltspunkt� > 1:32 wahrscheinlich signifikant

� Titeranstieg >2 Titerstufen relevant

� Beurteilung der Titerdynamik� Vergleichsmessungen

� Paralleluntersuchung => Serum von Vorvisite und aktuelles Serum

� (Quantitative Bestimmung mittels Flowzytometrie)

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 118118118

60

Vorgehen bei AntikörperTiteranstieg/hoher Titer

� Spezialambulanz für Pränataldiagnostik� Ultraschall

� Dopplerultraschall� Flussgeschwindigkeit der A. cerebri media

� Intrauterine Transfusion

� Ev. Intrauterine Austauschtransfusion

� Sehr selten!

� MHN in der Anamnese� Immer Betreuung in einer Spezialambulanz!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 119119119

Doppler Ultraschalldiagnostik

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 120

61

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 121

RhesusprophylaxeGeschichte

� Ab 1960 – Versuche mit „Freiwilligen“� Transfusion von RHD positiven Erythrozyten

� Danach Transfusion von Plasma mit anti-D

� Resultat:=> anti-D Bildung wurde verhindert!

� Mechanismus bis heute nicht restlos geklärt� Maskierung der D-Antigene durch anti-D

� Unterdrückung antigenspez. B-Lymphozyten

121121

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 122

Warum Gabe innerhalb von 72 Stunden nach der Geburt?

� VJ Vreda et al. „Prevention of Rh hemolytic Disease – Ten Year‘s Clinical Experience with Rh Immune Globulin.“ NEJM,1975, May8,1014-6

� Studiendesign wurde von Gefängnisleitung beeinsprucht� Visiten nur alle 3 Tage erlaubt

=> anti-D Bildung zu 100% verhindert=> Zulassung der Rhesusprophylaxe

� Behörde fordert Empfehlung im Beipacktext=> Gabe innerhalb von 72 Stunden nach der Geburt!

122122

62

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 123123

NEJM,1975, May8,1014-6

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 124

RhesusprophylaxeSensibilisierungsrate

� Ohne RHD Prophylaxe => 8%� 60% therapiebedürftig

� 12% Totgeburten

� Postpartale RHD Prophylaxe => 0,8%� Innerhalb von 72 Stunden nach der Geburt

� Kombinierte prä/postpartaler RHD Prophylaxe => 0,08%� 28. Schwangerschaftswoche

124124

63

Unterscheidung anti-DProphylaktisch - immunogen

� Prophylaktisches anti-D� Höchste Werte 3-7

Tage nach Applikation� T/2 = 3 Wochen� 11 Wochen und

länger nachweisbar!� Titer fallen!

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 125

� Immun anti-D� Höchste Werte 6-8

Wochen nach Immunisierung

� Titer steigen oder bleiben gleich!

125

Serologisch nicht möglich!Anamnese!

=> Im Zweifelsfalle Zweituntersuchung notwendig

125

ABO Inkompatibilität Mutter - Kind

� Voraussetzung: Mutter Blutgruppe O � Hohe IgG-Titer möglich

� Konstellation: Mutter O, Kind A oder B� 15% der Schwangerschaften

� Neugeborenes� IgG Isotiter nachweisbar – Immun anti-A(B)

� Antikörperbeladung der Erythrozyten nachweisbar – DCT positiv

� Meist keine Therapie notwendig!� Kindliche Antigene nicht vollständig entwickelt

� Neutralisation der Antikörper durch lösliche kindliche Antigene

� „Schutz“ vor RHD Immunisierung� Fetale Erythrozyten werden neutralisiert

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 126126126

64

Österreichische Richtlinien in der BGS und TFM 2000

� Frühschwangerschaft bis 16. SSW� ABO, RhD inklusive Dweak

� Antikörpersuchtest

� => Antikörpersuchtest negativ� Wiederholung Antikörpersuchtest in der 25.-28. SSW

� => Antikörpersuchtest positiv� Spezifizierung des Antikörpers

� Titration - Antikörperquantifikation

� Kontrolluntersuchungen

� Untersuchung des Kindesvaters

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 127127127

Richtlinien BGS & TFM 2000 zur Rhesusprophylaxe

� Für RhD negative und Dweak Frauen

� Wann?Innerhalb von 72 Stunden nach� Jeder Geburt eines RhD positiven und Dweak Kindes

� Fehlgeburten

� Extrauteringravidität

� Schwangerschaftsabbruch

� Amniozentese

� Chorionzottenpunktion

� Schweren (Bauch)Traumen

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 128128128

65

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 129

Dweak Typ 1,2,3

129

� Ca. 50% aller Dweaks!

� Nicht immunogen => keine anti-D Bildung!� Keine Rhesusprophylaxe notwendig!

� RhD positive Transfusionen möglich!

� Nachweis nur molekularbiologisch!

� Schweizer Richtlinien 2009� Keine Rhesusprophylaxe

� Fetus genotypisch RhD negativ

� Schwangere mit Dweak Typ 1,2,3

� Noch nicht in österreichische Richtlinien

129

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 130

Richtlinien BGS & TFM 2000 Neugeborene

� Alle Neugeborene� Blutgruppe

� Nur Antigene

� Keine Serumgegenprobe

� Direkter Coombstest

66

24. Mai 2014 Gabriele Stiegler 131

Wo erfahre ich mehr? Weiterführende Literatur

� G. Daniels, I. Bromilow: Essential Guide to Blood Groups (2. Auflage 2010)

� V. Kiefel: Transfusionsmedizin und Immunhämatologie(4. Auflage 2010)

� M.E. Reid, C. Lomas-Francis, M.L. Olsson: The Blood Group Antigen FactsBook. (3. Auflage 2012)

� H.G. Klein, D.J. Anstee: Mollison’s Blood Transfusion in Clinical Medicine(12. Auflage 2013)

� G. Daniels: Human Blood Groups (3. Auflage 2013)

� D. Schönitzer: PrätransfusionelleUntersuchungen (2. Auflage 1998)

131131

Danke für Ihre Aufmerksamkeit!

Bei Fragen:gabriele.stiegler@wienkav.at