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Charakterisierung interagierender
Domänen olfaktorischer Rezeptoren mit
Komponenten der Signalkaskade und dem
Or83b in Drosophila melanogaster
Dissertation zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und
Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der
Ruhr-Universität Bochum
angefertigt in der
Arbeitsgruppe Sinnesphysiologie
vorgelegt von
Robert F. Freyberger
aus
Hannover
Bochum
Oktober 2012
Referent: Prof. Dr. Klemens Störtkuhl
Korreferent: Prof. Dr. Günter Schaub
Characterisation of Interacting Olfactory
Receptor Domains with Components of the
Signal Cascade and Or83b in
Drosophila melanogaster
Dissertation to obtain the degree
Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)
at the Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-University Bochum
International Graduate School of Biosciences
Ruhr-University Bochum
Working Group Sensory Physiology
submitted by
Robert F. Freyberger
from Hannover, Germany
Bochum
October 2012
First supervisor: Prof. Dr. Klemens Störtkuhl
Second supervisor: Prof. Dr. Günter Schaub
3
Mein Dank gilt Professor Dr. Klemens Störtkuhl für das anspruchsvolle Thema, sein
Interesse an meiner Arbeit und seine Diskussionsbereitschaft.
Professor Dr. Günter Schaub danke ich für die Übernahme des Korreferats, die
konstruktiven Diskussionen und die Möglichkeit zur Durchführung der quantitativen
RNA-Analysen.
Danken möchte ich auch Dr. Carsten Balczun für die hilfreiche Zusammenarbeit und
Unterstützung.
Allen Mitgliedern der AG Sinnesphysiologie möchte ich danken für das hervorragende
freundschaftliche Arbeitsklima und die konstruktiven Diskussionen. Besonders
hervorheben möchte ich Anja Martens, Michael Heeck, Angelika Balzer-Ferrai, Dr. Arnd
Richardt, Yvonne Plutta, Nora Haarmann, Alexander Duscha, Sonja Laroussi und Milena
Baumhoff, die mich in besonderer Weise durch Worte und Taten unterstützt haben.
Ein ganz herzliches Dankeschön geht an meine Familie für ihre Unterstützung und ihr
Vertrauen.
4
Für
meinHerz,
meinen Sonnenschein
und
meinen Schatz
5
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen
Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet
habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und
Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen
nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung
vorgenommen wurde.
Bochum, den 31. Oktober 2012
_____________________________
(Robert Freyberger)
6
Inhalt
1 Zusammenfassung/ Summary 9
2 Einleitung 11
2.1 Drosophila melanogaster als Modellorganismus 11
2.2 Morphologie des Geruchssinns von Drosophila 12
2.2.1 Das periphere olfaktorische System 12
2.2.2 Das zentrale olfaktorische System 15
2.3 Neuronale Verarbeitung chemischer Informationen 16
2.4 Signaltransduktion bei Drosophila 17
2.4.1 Signaltransduktion über olfaktorische Rezeptoren (ORs) 18
2.4.2 Signaltransduktion über gustatorische Rezeptoren (GRs) und ionotrope
Rezeptoren (IRs) 20
2.5 Domänen olfaktorischer Rezeptoren 22
2.6 Zielsetzung 24
3 Material und Methoden 25
3.1 Material 25
3.1.1 Fliegenstämme 25
3.1.2 Primer 27
3.1.3 Enzyme und Nukleotide 27
3.1.4 Antikörper und Seren 27
3.1.5 Lösungen, Puffer und Medien 28
3.1.6 Verbrauchsmaterial und Kits 29
3.1.7 Chemikalien 30
3.1.8 Geräte 31
3.1.9 Software 32
3.2 Methoden 33
7
3.2.1 Fliegenhaltung 33
3.2.2 Herstellung transgener Tiere des Gal4-Systems 33
3.2.3 Treiber-Responder-Kreuzungen des Gal4-Systems 33
3.2.4 Isolierung von genomischer DNA 34
3.2.5 Genotypisierung über PCR 35
3.2.6 DNA-Auftrennung durch Gelelektrophorese 35
3.2.7 DNA-Sequenzierung und in silico-Analysen 35
3.2.8 Antikörper-Färbung auf Kryoschnitten 36
3.2.9 Quantitative Expressionskontrolle auf Ebene der mRNA 36
3.2.10 Elektrophysiologie 38
3.2.11 Verhaltenstests (T-Maze) 40
4 Ergebnisse 41
4.1 Expression der Or43a-Domänen 41
4.1.1 Herstellung von Treiberlinien zur Expression der IC2 und IC4 41
4.1.2 Zelluläre Lokalisation der IC2 und IC4 45
4.1.3 Expressionsrate der Domänen am Beispiel der IC4 über quantitative RT-
PCR 48
4.2 Von den extrazellulären Domänen zeigt nur EC4 erhöhte Amplituden im
Elektroantennogramm 51
4.3 Expression der intrazellulären Domäne IC1 führt zu wildtypischen
Elektroantennogramm-Amplituden 54
4.4 Die Elektroantennogramm-Amplituden der intrazellulären Domäne IC3
entsprechen größtenteils dem Wildtyp 55
4.5 Bei Expression der IC4 entsprechen die Elektroantennogramm-Amplituden
teilweise denen des Wildtyps, teilweise variieren sie 57
4.6 Die Expression der Domänen IC2 und IC4 zusammen führt zu erhöhten
Reizantworten 58
4.7 Die Expression der Domänen wirkt sich auf das olfaktorische Verhalten aus 60
8
4.8 Die Elektroantennogramm-Kinetik wird durch die Expression der Domänen
beeinflusst 63
4.9 Expression der EC4 im Auge führt zu verringerten Amplituden im
Elektroretinogramm 67
5 Diskussion 71
5.1 Expressionsmuster der Domänen IC2 und IC4 71
5.2 Kompetitive Hemmung durch Expression der Or43a-Domänen 72
5.2.1 Bei den extrazellulären Domänen bewirkt nur die Expression der EC4
Veränderungen im EAG 73
5.2.2 Die Expression der Domäne IC1 bewirkt einen wildtypischen Phänotyp 76
5.2.3 IC3 als potentielle Verbindung zum G-Protein 76
5.2.4 Bildet die IC4 die Verbindung zum Or83b? 80
5.2.5 IC2 als potentielle Bindungsstelle für Komponenten der Adaptation 81
6 Ausblick 82
7 Literaturverzeichnis 84
8 Anhang 93
8.1 Abkürzungsverzeichnis 93
8.2 Abbildungsverzeichnis 94
8.3 Ergebnisse der RNA-Analysen 96
8.4 Lebenslauf 104
Zusammenfassung/ Summary
9
1 Zusammenfassung/ Summary
Zusammenfassung
Die Wahrnehmung olfaktorischer Reize geschieht bei Vertebraten wie auch bei Insekten
durch heptahelikale Transmembranproteine. Während bei den Vertebraten die
Signaltransduktion dieser Reize über G-Proteine und cyclische Nukleotide abläuft, gibt es bei
Drosophila melanogaster zwei mögliche Übertragungswege: Bei Aktivierung des
olfaktorischen Rezeptors (OR) kann das Signal direkt an den Ionenkanal Or83b
weitergegeben werden, oder der Or83b wird durch eine Enzymkaskade mit G-Protein und
zyklischen Nukleotiden aktiviert (Buck und Axel, 1991; Sato et al., 2008; Wicher et al.,
2008). Für beide Wege der Signalweitergabe ist es notwendig, dass der OR Interaktionen zu
den jeweiligen Komponenten der Signalkaskade eingeht.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob durch die Expression von Fragmenten des
Rezeptors Or43a die Signaltransduktion von Drosophila beeinflusst werden kann. Hierzu
wurden die vier extrazellulären Domänen (EC1, EC2, EC3 und EC4) sowie die vier
intrazellulären Domänen (IC1, IC2, IC3 und IC4) des Or43a jeweils in den olfaktorischen
Rezeptorneuronen exprimiert. Anhand von Elektroantennogrammen (EAG) sowie durch
Verhaltenstests wurden diese Fliegen auf Veränderungen in der olfaktorischen Reizantwort
untersucht.
Die Expression der Domänen EC4, IC2, IC3 und IC4 führte zu Reizantworten, die sich
von wildtypischen Reizantworten unterschieden: Bei Expression der EC4 traten in der
Elektrophysiologie erhöhte Reizantworten auf, während das olfaktorische Verhalten
unverändert war. Die Expression der IC2 bewirkte sowohl eine erhöhte Reizantwort im EAG
als auch eine erhöhte Sensitivität im Verhaltenstest. Bei Expression der IC3 reagierten die
Tiere im Verhaltenstest weniger empfindlich auf den Duftstoff als der Wildtyp; die EAG-
Messungen zeigten größtenteils keine Abweichungen von wildtypischen Amplituden. Die
Kinetik dieser Messungen war allerdings verändert: Sowohl der Anstieg bei der
Depolarisation als auch der Rückgang bei der Repolarisation verliefen langsamer als beim
Wildtyp. Bei Expression der IC4 trat bei den EAG-Messungen eine Kinetik mit einer
verlängerten Zeit bis zum Rückgang bei der Repolarisation auf.
Die Ergebnisse legen nahe, dass die Domänen EC4, IC2 und IC3 sowie wahrscheinlich
auch IC4 für Interaktionen mit Komponenten der Signalkaskade verantwortlich sind. Hierfür
kommen neben dem Or83b vor allem G-Proteine, Proteinkinasen und Arrestine in Frage.
Zusammenfassung/ Summary
10
Summary
The perception of olfactory cues occurs in vertebrates as well as in insects via
heptahelical transmembrane proteins. While in vertebrates olfactory stimuli activate a signal
cascade including G-proteins and cyclic nucleotides, in Drosophila melanogaster two
pathways are possible: in the first pathway odorant activation of the olfactory receptor (OR)
results in direct transfer of the signal to the ion channel Or83b. In the second pathway,
odorant activation of the OR results in indirect transfer of the signal via G-proteins and cyclic
nucleotides to Or83b (Buck und Axel, 1991; Sato et al., 2008; Wicher et al., 2008). In both
pathways interactions of OR and other signal transduction components like Or83b and G-
proteins are necessary.
The aim of this work was to examine whether olfactory responses of Drosophila can be
affected by the expression of Or43a fragments. Therefore the extracellular domains (EC1,
EC2, EC3 and EC4) and the intracellular domains (IC1, IC2, IC3 and IC4) of Or43a have
been misexpressed in odorant receptor neurons, respectively. Using electroantennogram
(EAG) recordings and behavioral tests it was tested whether the flies misexpressing Or43a
domains had altered olfactory responses in comparison to wild type.
The misexpression of the domains EC4, IC2, IC3 and IC4 caused the following effects:
missexpression of EC4 caused increased electrophysiological responses while the olfactory
behavior was unchanged. The expression of IC2 resulted in both, increased EAG amplitudes
and an increased sensitivity in behavioral assay. On expression of IC3 the animals showed
less sensitivity to odorants in behavioral tests. These EAG recordings of IC3 expressing flies
resulted in wild typical amplitudes. However, the kinetic of this measurements was altered:
both, the rise time during depolarization and the decay time during repolarization were slower
compared to wild type. If IC4 was expressed the EAG kinetic showed a prolonged decay time
during repolarisation.
The results suggest that the domains EC4 IC2, IC3 and probably furthermore IC4 are
responsible for the interactions with components of the signal cascade, which might be Or83b
or alternatively G-proteins, protein kinases and arrestins.
Einleitung
11
2 Einleitung
Der Geruchssinn stellt bei vielen Tieren einen der wichtigsten Sinne dar. Neben dem
Sehen und dem Hören ist er oftmals von entscheidender Bedeutung zur Orientierung in der
Umwelt. Viele Tiere setzen den Geruchssinn zur Lokalisation von Fressfeinden, Artgenossen,
potentiellen Fortpflanzungspartnern und Nahrungsquellen ein (Heldmaier und Neuweiler,
2003). Für die präzise Einschätzung der Umgebung muss das Geruchssystem mit sehr hoher
Empfindlichkeit sowohl ein breites Spektrum an flüchtigen chemischen Substanzen
wahrnehmen als auch die Unterscheidung der Duftstoffe gewährleisten (Nichols und Luetje,
2010).
Trotz vielfältiger Forschung am olfaktorischen System gibt es immer noch weite
Bereiche, die noch nicht genau aufgeklärt wurden. Weder die zellulären Abläufe in den
olfaktorischen Rezeptorneuronen noch die zentrale Verarbeitung der Geruchsinformationen
wurde bisher im Detail entschlüsselt. Durch molekulare und neuroanatomische Ansätze
wurden bisher Teile der Neuroanatomie und der Funktion des peripheren Geruchssystems
erforscht. Bei der Taufliege Drosophila melanogaster haben neue Ansätze ein nahezu
komplettes Bild über die periphere Neuroanatomie und Funktion des Geruchssinnes geliefert
(Silbering et al., 2011). Vor allem die Entdeckung der Gene olfaktorischer Rezeptoren (OR)
in Nagetieren (Buck und Axel, 1991) und in D. melanogaster (Clyne et al., 1999; Gao und
Chess, 1999; Vosshall et al., 1999) brachten die Erforschung des Geruchssinnes stark voran.
Drosophila bietet als Versuchstier, neben ethischen Aspekten, weitere Vorteile
gegenüber Säugetieren: Aufgrund einer geringeren Anzahl an Neuronen ist das Riechsystem
von Drosophila sehr übersichtlich. Mit olfaktorischen Sinnesorganen, die an der Oberfläche
des Tieres liegen, ist das Geruchsystem für die Forschung gut zugänglich. Aufgrund eines
kurzen Generationszyklus ist Drosophila für gentechnische Manipulationen gut geeignet
(Gerber und Stocker, 2007; Vosshall und Stocker, 2007).
2.1 Drosophila melanogaster als Modellorganismus
Seit Anfang des 20. Jahrhunderts wird Drosophila in der Wissenschaft eingesetzt. Zuerst
wurde sie nur im Bereich der Evolutionsbiologie genutzt. Später weitete sich ihr Einsatzgebiet
stark aus. Das Hauptargument für die Nutzung der Fliege war die einfache Möglichkeit der
Haltung. Drosophila ist robust, lässt sich bei geringen Kosten halten und besitzt einen
schnellen Generationszyklus mit einer hohen Reproduktionsrate. Bei optimalen Bedingungen
Einleitung
12
durchläuft die Fliege die komplette Entwicklung vom Ei über die drei Larvenstadien und die
Puppe zum geschlechtsreifen, adulten Tier innerhalb von 10 Tagen (siehe Abbildung 1). Mit
der Zeit weitete sich das Feld der Anwendungen weiter aus. An Drosophila wurde
beispielsweise die Natur und Organisation des Erbgutmaterials untersucht, und Details der
Embryogenese wurden aufgeklärt (Arias, 2008).
Neue Methoden, wie die Mutagenese durch Röntgenstrahlen, Herstellung einer
Duplikations-, Deletions- und Klonbibliothek und das chromosome walking, wurden oft an
Drosophila entwickelt oder nach kurzer Zeit bei ihr etabliert (Muller, 1927; Lindsley et al.,
1972; Rubin und Lewis, 2000). Die Drosophila-Forschung gewann durch die Entdeckung und
Aufklärung der Funktion der Riesenchromosomen sowie der vollständigen Sequenzierung des
Genoms noch einmal an Bedeutung (Becker, 1962; Adams et al., 2000; Rubin et al., 2000).
Abbildung 1: Lebenszyklus von D. melanogaster
Modifiziert aus Janning und Knust (2004).
2.2 Morphologie des Geruchssinns von Drosophila
2.2.1 Das periphere olfaktorische System
Der Geruch wird bei adulten D. melanogaster an zwei paarigen Organen
wahrgenommen: Das Hauptgeruchsorgan ist das dritte Antennenglied (Funikulus), das zweite
Geruchsorgan ist der Maxillarpalpus (siehe Abbildung 2a). Die Detektion der Geruchsstoffe
Einleitung
13
erfolgt an den Geruchshaaren, den olfaktorischen Sensillen an der Oberfläche von Funikulus
und Maxillarpalpus. Die Sensillen des Geruchssystems lassen sich morphologisch in drei
Typen einteilen (Abbildung 2b). Sensillum trichodea, Sensillum basiconica und Sensillum
coeloconica, wobei die basikonischen Sensillen in kleine und große basikonische Sensillen
untergliedert werden. Auf dem Funikulus befinden sich alle drei Sensillentypen. Auf dem
Maxillarpalpus finden sich an olfaktorischen Sensillen nur basikonische. Die Sensilla
chaetica, die sich ebenfalls auf dem Maxillarpalpus befinden, dienen der Mechanorezeption.
Von den Sensillentypen gibt es noch Untertypen, die sich morphologisch unterscheiden lassen
(Shanbhag et al., 1999).
Abbildung 2: Olfaktorische Sinnesorgane der adulten Fliege
a) Fliegenkopf mit Antenne (Pfeilspitze) und Maxillarpalpus (Pfeil). Maßstab: 100 µm.
b) Sensillen auf dem dritten Antennenglied von D. melanogaster: i: Sensilla basiconica; ii: Sensilla
coeloconica; iii: Sensilla trichodea. Maßstab: 10 µm. Aus Hallem und Carlson (2004).
Die Geruchsrezeption erfolgt in den Sensillen durch bipolare Neurone. Diese
olfaktorischen Rezeptorneurone (ORNs) erstrecken ihren apikalen Dendriten in den Schaft
eines Sensillums, wobei jedes olfaktorische Sensillum durch zwei bis vier ORNs innerviert
wird (siehe Abbildung 3). Die Dendriten enden in ziliären Fortsätzen. Die Zellkörper der
ORNs werden von Hilfszellen umgeben, die die Lymphflüssigkeit der Sensillen produzieren
und die Sensillen zu ihren Nachbarn hin elektrisch isolieren (Shanbhag et al., 1999, 2000)
Auf den Antennen männlicher Tiere gibt es etwa 20 % weniger große, basikonische
Sensillen und 30 % mehr trichoide Sensillen als bei Weibchen (Stocker, 2001). Am basalen
Einleitung
14
Ende besitzen die ORNs der Antenne ein Axon, das sich entlang des Antennennervs zum
Antennenlobus erstreckt (Strausfeld, 1976; Stocker et al., 1983). Auf dem Maxillarpalpus
liegen ca. 60 olfaktorische Sensillen, die jeweils von zwei ORNs innerviert werden. Hier
wurde kein Sexualdimorphismus beobachtet (de Bruyne et al., 1999). Die Axone der ORNs
des Maxillarpalpus verlaufen entlang des Labialnervs durch das Suboesophagial-Ganglion
zum Antennenlobus (Singh und Nayak, 1985; Stocker et al., 1990).
Abbildung 3: Schema eines olfaktorischen Sensillums
Die verästelten ziliären Fortsätze der ORN-Dendriten stehen über die Lymphflüssigkeit und Poren in
der Sensillenkutikula mit der Außenwelt in Kontakt. Modifiziert aus Vosshall und Stocker (2007).
Das innere Lumen der Sensillen ist mit Lymphe gefüllt, die über Poren mit der
Oberfläche in Verbindung steht. Die Lymphflüssigkeit ist wahrscheinlich wie bei anderen
Insektenarten reich an Kalium. Die Dendriten der ORNs werden von der Lymphe umspült, so
dass Geruchsmoleküle von der Oberfläche zu den Neuronen gelangen können (Kaissling und
Thorson, 1980; Steinbrecht, 1989; Shanbhag et al., 1999). Hierbei könnten Proteine der
Familie der Odor-binding Proteine oder der Chemosensory Proteine eine Rolle spielen. Diese
wasserlöslichen Proteine in der Lymphe können hydrophobe Substanzen binden. Ihre genaue
Funktion wurde bislang nicht geklärt. Möglicherweise dienen sie dem Transport der
Geruchsmoleküle von der Oberfläche der Sensillen zu den ORNs. Möglich ist aber auch, dass
ihre Aufgabe darin besteht, die Duftstoffe von aktivierten Rezeptorneuronen wieder zu
entfernen (Vogt und Riddiford, 1981; Vogt et al., 1985, 1991, 2002; Galindo und Smith,
2001).
Einleitung
15
2.2.2 Das zentrale olfaktorische System
Die ORNs der adulten Fliegen leiten die Geruchsinformationen über ihre Axone zum
Antennenlobus weiter (Abbildung 4). Der Antennenlobus ist eine paarige Struktur im Gehirn,
die aus einzelnen Untereinheiten, den Glomeruli, aufgebaut ist. Alle ORNs, die den gleichen
olfaktorischen Rezeptor (OR) exprimieren, projizieren auf den gleichen Glomerulus oder auf
zwei Glomeruli. Die kontaktierten Glomeruli haben jeweils eine feste Position im
Antennenlobus. Die meisten ORNs projizieren sowohl auf den ipsi- als auch auf den
kontralateralen Antennenlobus (Gao et al., 2000; Vosshall et al., 2000; Couto et al., 2005;
Fishilevich und Vosshall, 2005).
Abbildung 4: Übersicht über die olfaktorische Signalweitergabe von der Antenne
Die olfaktorischen Informationen konvergieren von den ORNs auf die Glomeruli des Antennenlobus.
Dort werden die Informationen verarbeitet und an höhere Hirnregionen, vor allem dem Pilzkörper und
dem lateralen Horn, weitergeleitet. Modifiziert nach Keene und Waddell (2007).
Die Geruchsinformation, die einen Glomerulus erreicht, wird durch die Liganden
bestimmt, welche an den zugehörigen OR binden. Die Verarbeitung der Signale im
Glomerulus erfolgt durch lokale Interneurone und Projektionsneurone. Die hauptsächlich
GABAergen lokalen Interneurone verbinden die einzelnen Glomeruli miteinander. Die
Projektionsneurone sind cholinerge Nervenzellen, die die Signale von den Glomeruli zu zwei
höheren Hirnzentren, dem Pilzkörper und dem lateralen Horn, weiterleiten (Stocker, 1994).
Einleitung
16
Der Calyx des Pilzkörpers ist ein Riechzentrum höherer Ordnung, der als Eingänge
Informationen von den cholinergen Projektionsneuronen erhält. Die Endigungen der
Projektionsneurone bilden in allen Untereinheiten des Calyx große Knopffelder. Außer den
Projektionsneuronen kommen im Calyx noch weitere extrinsische Neurone vor, die
vermutlich GABAerge Neurone sind, und intrinsische Kenyon-Zellen. Die drei Zelltypen
bilden im Calyx hunderte vernetzter Glomeruli aus (Yasuyama et al., 2002).
2.3 Neuronale Verarbeitung chemischer Informationen
Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten zur neuronalen Verarbeitung chemischer
Informationen. Während beim Geschmackssinn der Vertebraten sowohl ionotrope als auch
metabotrope Rezeptoren vorliegen, waren bis vor wenigen Jahren beim Geruchssinn der
Wirbeltiere nur metabotrope Rezeptoren mit einer Signalkaskade über G-Proteine bekannt
(Heldmaier und Neuweiler, 2003). Bei der klassischen olfaktorischen Signaltransduktion der
Vertebraten bindet der Duftstoff an den Rezeptor und das G-Protein Golf wird aktiviert. Golf
wiederum aktiviert die Adenylatzyklase, die ATP in cAMP umwandelt (siehe Abbildung 5).
Die Bildung von cAMP führt zur Öffnung von Ionenkanälen und somit zur Depolarisation der
Zelle. Außerdem aktivieren cAMP sowie das einströmende Ca++
Mechanismen zur
Adaptation der Zelle (Dhallan et al., 1990; Belluscio et al., 1998; Gibson und Garbers, 2000).
Wahrscheinlich gibt es neben der Kaskade über cAMP auch noch eine Signalkaskade
über Inositol-1,4,5-Triphosphat (IP3): Bei Aktivierung des Geruchsrezeptors wird das Signal
über das G-Protein an die Phospholipase C weitergegeben und Phosphatidylinositol-4,5-
bisphosphat in IP3 und Diacylglycerin umgewandelt. IP3 aktiviert den Ionenkanal und die
Zelle depolarisiert (Boekhoff et al., 1990b; Breer et al., 1990; Breer, 1991). Ob es diese
zweite Signalkaskade bei den klassischen Vertebraten-ORs gibt, ist allerdings umstritten
(Gibson und Garbers, 2000).
Erst in den letzten Jahren wurden weitere Signalwege gefunden (Review von Spehr und
Munger, 2009). Neben den klassischen Vertebraten-ORs wurden weitere G-Protein-
gekoppelte Rezeptoren gefunden: In einem kleinen Teil der ORNs der Maus werden TAARs
(Trace amine associated receptors) gebildet. TAARs sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren,
die spezifische Amine in kleinen Konzentrationen binden. Wie die klassischen Vertebraten-
ORs, kommen auch die TAARs in Neuronen vor, die die α-Untereinheit des Golf (Gαo)
exprimieren. Dieses lässt vermuten, dass bei beiden Rezeptoren die Signalweitergabe über die
gleiche Signalkaskade abläuft (Liberles und Buck, 2006).
Einleitung
17
Abbildung 5: Klassische olfaktorische Signaltransduktion bei Vertebraten
Bei Aktivierung des Geruchsrezeptors wird das Signal über das G-Protein an die Adenylatzyklase
weitergegeben und ATP in cAMP umgewandelt. Das cAMP aktiviert den Ionenkanal und die Zelle
depolarisiert. Erstellt entsprechend Heldmaier und Neuweiler (2003).
Zusätzlich zu den klassischen ORs und den TAARs wurden im Riechsystem der Mäuse
noch weitere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren gefunden. Es handelt sich hierbei um zwei
Familien von Rezeptoren des Vomeronasalorgans: Vomeronasal Typ 1 Rezeptor (V1r) und
Vomeronasal Typ 2 Rezeptor (V2r) (Dulac und Axel, 1995; Herrada und Dulac, 1997;
Matsunami und Buck, 1997; Ryba und Tirindelli, 1997). V1r wird in Rezeptorneuronen
zusammen mit Gαi2 exprimiert, V2r zusammen mit Gαo. Obwohl dieses Signalkaskaden über
Gαi2 bzw. Gαo impliziert, steht der Beweis hierfür noch aus (Halpern et al., 1995; Berghard
und Buck, 1996; Mombaerts, 2004).
Außer den G-Protein gekoppelten Rezeptoren fanden sich im olfaktorischen System der
Vertebraten auch noch Rezeptor-Guanylylzyklasen (Gibson und Garbers, 2000). Einer dieser
Rezeptoren (GC-D) reagiert sowohl auf die Peptidhormone Uroguanylin und Guanylin als
auch auf Stimulation mit Urin durch Bildung von cGMP. Das cGMP wiederum kann
Ionenkanäle aktivieren, so dass es zur Depolarisation kommt (Leinders-Zufall et al., 2007).
2.4 Signaltransduktion bei Drosophila
Die Mechanismen der Signaltransduktion beim Riechen der Insekten sind bisher noch
nicht genau aufgeklärt. An der Signaltransduktion sind olfaktorische Rezeptoren (ORs),
gustatorische Rezeptoren (GRs) und wahrscheinlich ionotrope Rezeptoren (IRs) beteiligt
(Benton et al., 2009). Bei den ORs und GRs handelt es sich um zwei Familien von Proteinen
mit sieben Transmembrandomänen, die jedoch nicht mit der Klasse der G-Protein-
Einleitung
18
gekoppelten Rezeptoren von Vertebraten verwandt sind (Clyne et al., 1999; Vosshall et al.,
1999; Störtkuhl und Kettler, 2001; Vosshall und Stocker, 2007). Bei D. melanogaster wurden
bisher 60 Gene identifiziert, die für 62 ORs kodieren und 60 Gene, die für 68 GRs kodieren.
Die abweichende Anzahl von Genen und Proteinen beruht auf alternativem Spleißen
(Robertson et al., 2003). Von den 62 ORs werden 48 in adulten Fliegen exprimiert
(Fishilevich et al., 2005).
2.4.1 Signaltransduktion über olfaktorische Rezeptoren (ORs)
In den meisten ORNs kommen zwei ORs vor: Ein normaler Rezeptor und Or83b. Der
Or83b wird in nahezu allen ORNs exprimiert (Vosshall et al., 1999). Er dimerisiert zusammen
mit einem normalen OR früh im inneren Membransystem. Dabei bindet Or83b den Komplex
in den konservierten, ziliären Transportweg ein und ermöglicht hiermit den Transport des
normalen Rezeptors in die ziliäre Membran des ORNs (Neuhaus et al., 2005; Benton et al.,
2006). Es sind 13 Fälle bekannt, in denen zwei oder drei ORs zusammen mit dem Or83b in
einem ORN coexprimiert werden (Couto et al., 2005; Goldman et al., 2005). Die ORs
besitzen im Vergleich zu den G-Protein-gekoppelten heptahelikalen Transmembranproteinen
der Säuger eine invertierte Anordnung in der Membran, mit dem N-Terminus und den am
meisten konservierten Schlaufen auf der zytoplasmatischen Seite (Benton et al., 2006;
Wistrand et al., 2006).
Für die Signaltransduktion der ORs werden keine zusätzlichen Ionenkanäle zwingend
benötigt, da die OR-Or83b-Komplexe selber einen Ionenkanal bilden. Heterologe Zellen, die
heteromere OR-Or83b-Komplexe exprimieren, zeigen einen Einstrom von extrazellulärem
Kalzium und eine unspezifische Kationenleitfähigkeit bei Stimulation mit Duftstoffen. Dabei
kann der Ionenkanal direkt durch die Bindung des Geruchsstoffes aktiviert werden (Sato et
al., 2008; Wicher et al., 2008).
Seit der Entdeckung der olfaktorischen Rezeptoren von Drosophila 1999 wurde disku-
tiert, ob die ORs in Anlehnung an die olfaktorischen Rezeptoren der Vertebraten und
Nematoden auf Grund ihrer sieben Transmembrandomänen den G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren zuzuordnen sind (Clyne et al., 1999; Gao und Chess, 1999; Vosshall et al., 1999).
Diese Diskussion wurde durch die Publikationen von Sato et al. (2008) und Wicher et al.
(2008) neu entfacht: Während bei Sato et al. festgestellt wird, dass die Komplexe nur eine
Funktion als metabotrope Ionenkanäle besitzen und die Signalübertragung durch eine
Funktion als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ausgeschlossen wird, kommen Wicher et al. zu
dem Ergebnis, dass die OR-Or83b-Komplexe sowohl als metabotrope Ionenkanäle als auch
als G-Protein gekoppelte Rezeptoren fungieren (siehe Abbildung 6): Dabei soll es eine
Einleitung
19
schnelle Übertragung des Signales direkt vom OR zum Or83b geben. Ein zweiter Weg soll
über G-Proteine und zyklische Nukleotide zu einer langsameren Anregung des Or83b führen.
Dieser zweite Weg ist sensitiver und erzeugt ein länger anhaltendes Signal.
Abbildung 6: Model der olfaktorischen Signalkaskade nach Wicher et al. (2008)
Der Duftstoff aktiviert den OR. Dieser gibt das Signal entweder direkt an den Or83b weiter oder über
zyklische Nukleotide. Dies kann über das G-Protein GS und die Adenylatzyklase (AC) erfolgen. Die
Adenylatzyklase wandelt ATP in cAMP um, welches wiederum den Or83b aktiviert. Dieser zweite
Signalweg ist langsamer als der erste, wirkt aber sensitiver und länger anhaltend. Die
Aminosäuresequenz TVVGYLG ist wahrscheinlich an der Ionenpore beteiligt.
Modifiziert nach Wicher et al. (2008).
Viele Faktoren deuten bei Insekten auf eine olfaktorische Signalkaskade über G-Proteine
und sekundäre Botenstoffe hin: Bei verschiedenen Insektenarten wurde bei
Antennenpräparaten ein rascher und anhaltender Anstieg an IP3 als Reaktion auf Duftstoffe
beobachtet (Breer et al., 1990; Boekhoff et al., 1993; Wegener et al., 1993). Dieser Anstieg an
IP3 kann durch Pertussitoxin geblockt werden, was auf eine G-Protein-gekoppelte
Signalkaskade hindeutet (Boekhoff et al., 1990a). Die Phospholipase C ist im Sehsystem von
Drosophila eine essentielle Komponente für die Phototransduktion. Bei norpA-Mutanten,
denen die Phospholipase C fehlt, werden verringerte olfaktorische Antworten am Maxillar-
palpus gemessen. Dies deutet auf eine Beteiligung des IP3-Signalwegs am Riechsystem hin
(Riesgo-Escovar et al., 1995).
Das Genom von Drosophila beinhaltet die Gene für acht α-Untereinheiten der
G-Proteine. Sechs der α-Untereinheiten, Concertina, Gαq, Gαs, Gα73B, Gαo und Gαi, werden
in der Antenne exprimiert (Yao und Carlson, 2010). Dieses legt die Vermutung nahe, dass sie
eine Funktion bei der olfaktorischen Signaltransduktion haben. Außerdem bilden in einem
Einleitung
20
heterologen Zellsystem die ORs Homodimere. Die Signalweitergabe funktioniert hier auch
ohne den Or83b (Wetzel et al., 2001; Neuhaus et al., 2005).
Weitere Hinweise auf eine Signaltransduktion über G-Proteine und zyklische Nukleotide
liefern Messungen von Kain et al. (2008). Bei elektrophysiologischen Messungen an Tieren
mit einer mutierten Alpha-Untereinheit des G-Proteines Gαq wurden sowohl verringerte
Summenpotentiale als auch verringerte Spikeraten bei Single-Sensillum-Ableitungen
gemessen (Kain et al., 2008). Verhaltensversuche mit Tieren, bei denen Gαq durch RNAi
(RNA Interferenz) inaktiviert war, ergaben veränderte Reaktionen auf verschiedene
Duftstoffe: In einem T-Maze reagierten die Fliegen duftstoffabhängig mit normaler
wildtypischer Reaktion, mit einem fehlenden Verhalten oder mit einer zum Wildtyp
unterschiedlichen Reaktionen. Die Art der Antwort hing dabei vom Duftstoff und seiner
Konzentration ab (Kalidas und Smith, 2002). Die Versuche legen nah, dass je nach Duftstoff
die olfaktorische Signaltransduktion teilweise über Gαq und teilweise über andere Wege
bewerkstelligt wird.
Weitere Versuche mit RNAi von Gαq wurden von Yao und Carlson (2010) durchgeführt.
Die Autoren führten Single-Sensillum-Ableitungen an drei einzelnen Typen von ORNs durch,
in denen entweder die Alpha-Untereinheiten von G-Proteinen durch RNAi inaktiviert, die
Untereinheiten durch MARCM-Technik ausgeschaltet oder konstitutiv aktive Untereinheiten
in den Neuronen vorhanden waren. An den drei Klassen von Neuronen konnten dabei keine
oder nur geringe Veränderungen gegenüber der Kontrolle festgestellt werden. Die Autoren
schließen daraus, dass es im olfaktorischen System keine Signalkaskade über G-Proteine gibt
(Yao und Carlson, 2010). Ebenso gut könnte es aber auch sein, dass die geringen
Veränderungen in den Versuchen auf eine Signalkaskade über G-Proteine zurückzuführen ist,
oder dass es je nach OR-Klasse verschiedene Übertragungswege gibt.
Insgesamt sind die Untersuchungen zur Bedeutung von sekundären Botenstoffen und
G-Proteinen in ORs sehr widersprüchlich. Daher sind noch viele Fragen zur
Signaltransduktion der ORs zu klären.
2.4.2 Signaltransduktion über gustatorische Rezeptoren (GRs) und
ionotrope Rezeptoren (IRs)
Die Identifizierung der GRs bei Drosophila erfolgte durch den gleichen
bioinformatischen Algorithmus wie bei der Identifizierung der ORs, bei dem nach sieben-
Transmembranproteinen gesucht wurde (Clyne et al., 2000). Der Mechanismus der
Signaltransduktion über GRs ist bislang noch nicht bekannt. Bei den Vertebraten kommen zur
Einleitung
21
gustatorischen Signaltransduktion verschiedene Mechanismen zum Einsatz. Die Rezeptoren
für sauer und salzig bilden selber den Ionenkanal aus. Die Bindung der Liganden führt hier
zum Schließen (sauer) oder Öffnen (salzig) der Kanäle. Im Gegensatz hierzu verläuft die
Signaltransduktion von süß und bitter über G-Proteine und zyklische Nukleotide (Heldmaier
und Neuweiler, 2003).
Wie bei den Vertebraten sind auch für die Insekten verschiedene Signaltransduktions-
wege möglich. Auf Grund der vorhergesagten sieben Transmembrandomänen der GRs wurde
davon ausgegangen, dass es sich bei ihnen um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren handelt
(Clyne et al., 2000). Da allerdings bei den ORs gezeigt wurde, dass Proteine mit sieben
Transmembrandomänen nicht zwangsläufig die Signalübertragung über G-Proteine
durchführen müssen (Sato et al., 2008; Wicher et al., 2008), ist auch für die GRs die Frage
wieder offen, wie die Signaltransduktion funktioniert.
Im Gegensatz zu den ORs, die alle am Riechsystem beteiligt sind, wurde bei den GRs
nur für die beiden Rezeptoren Gr21a und Gr63a eine Funktion im olfaktorischen System
gefunden. Bei elektrophysiologischen Single-Sensillum-Ableitungen an Or22a-
exprimierenden ORNs, welche die beiden Rezeptoren Gr21a und Gr63a ektopisch expri-
mieren, sind die Zellen sensitiv für CO2. Fliegen, bei denen der Gr63a mutiert ist, reagieren
weder bei elektrophysiologischen Ableitungen noch in Verhaltenstests auf CO2. Es handelt
sich bei den beiden GRs somit um Rezeptoren, die zusammen für die CO2-Detektion
verantwortlich sind (Jones et al., 2007; Kwon et al., 2007).
In Single-Sensillum-Ableitungen, bei denen die Translation verschiedener Alpha-
Untereinheiten potentieller G-Proteine durch RNAi gestört war, zeigten die Gr21a/GR63a
beinhaltenden Neuronen bei RNAi von Gαq verringerte Reizantworten. Diese Effekte traten
auch auf, wenn in diesen Neuronen ein dauerhaft aktives Gαq ektopisch exprimiert wurde.
Auch ein RNAi der Gamma-Untereinheit Gγ30A führte zu einer verringerten Spikerate bei
Single-Sensillum-Ableitungen der Gr21a/GR63a-Neurone. Zusammen deuten diese Versuche
darauf hin, dass die vermittelte CO2-Detektion der Rezeptoren Gr21a und GR63a über eine G-
Protein-vermittelte Signalkaskade abläuft (Yao und Carlson, 2010).
Bei den IRs handelt es sich um Rezeptoren, die mit den ionotropen Glutamatrezeptoren
verwandt sind. Der Neurotransmitter Glutamat bildet zusammen mit den ionotropen
Glutamatrezeptoren einen der am besten charakterisierten Mechanismen zur Übertragung von
Signalen an Synapsen. Im Nervensystem der Säuger resultiert aus dieser synaptischen
Kommunikation in der Regel ein exzitatorisches Signal (Gereau und Swanson, 2008; Abuin et
al., 2011). Im Gegensatz zu den ionotropen Glutamatrezeptoren besitzen die IRs abweichende
Einleitung
22
Liganden-Bindedomänen ohne die charakteristischen Reste, die für die Interaktion mit
Glutamat zuständig sind. Außer dem Ir76b werden die IRs in ORNs exprimiert, die weder
einen normalen OR, den Or83b, noch einen GR bilden. Dabei treten verschiedene
Kombinationen der IRs innerhalb der ORNs auf. Der Ir76b wird zusammen mit dem Or35a
und Or83b in einem ORN gebildet. Neuronen, die IRs exprimieren, sind zur Detektion von
Geruchsstoffen in der Lage. Das Geruchsspektrum dieser ORNs kann durch Missexpression
eines IRs verändert werden. Daher lässt sich davon ausgehen, dass es sich bei den IRs um
Geruchsrezeptoren handelt (Benton et al., 2009).
2.5 Domänen olfaktorischer Rezeptoren
Die ersten ORs von Drosophila wurden unter anderem durch einen
Computeralgorithmus gefunden, der darauf abgestimmt war, Proteine mit sieben
Transmembrandomänen im Genom der Fliege zu finden. Hierzu wurden offene Leserahmen
ausgewählt, die potentiell für ORs kodieren könnten, und nach ihrer Hydropathie und
Polarität ausgewertet (Clyne et al., 1999). Gleichzeitig dazu wurden die ORs auch von zwei
weiteren Gruppen entdeckt, die gestützt auf Computeranalysen sieben
Transmembrandomänen vorhersagten (Gao und Chess, 1999; Vosshall et al., 1999). Ebenso
führten spätere Analysen mit dem HMMTOP Algorithmus zu einer Vorhersage von sieben
Transmembrandomänen (Benton et al., 2006). Daher ist die Wahrscheinlichkeit sehr groß,
dass es sich bei den ORs tatsächlich um heptahelikale Transmembranproteine handelt. Dies
wurde allerdings wieder in Frage gestellt, da die ORs nicht mit den G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren von Vertebraten verwandt sind (Vosshall et al., 1999; Benton et al., 2006). Die
ORs besitzen im Vergleich zu den G-Protein-gekoppelten heptahelikalen
Transmembranproteinen der Säuger eine invertierte Anordnung in der Membran, bei der der
N-Terminus auf der zytoplasmatischen Seite liegt (siehe Abbildung 7). Ausgehend von einem
intrazellulären N-Terminus und sieben Transmembrandomänen liegen die Bereiche, die auf
den ersten, dritten, fünften und siebten Membrandurchgang folgen, jeweils extrazellulär
(Domänen EC1, EC2, EC3 und EC4); die Bereiche vor diesen Membrandurchgängen liegen
entsprechend intrazellulär (IC1, IC2, IC3 und IC4). Für die Domänen IC1 (= N-Terminus),
IC3 und IC4 wurde diese Anordnung beim Or83b bestätigt (Benton et al., 2006).
Über die Bedeutung der einzelnen Domänen der Rezeptoren für die Signaltransduktion
ist bislang nicht viel bekannt. Der Bereich am Übergang zwischen dem dritten
Transmembrandurchgang und der EC2 ist beim Or85b an der Bindung des Duftstoffes
beteiligt: In Versuchen nach der „substituted cysteine accessibility“-Methode wurde durch die
Einleitung
23
Modifikation der Cysteingruppen in diesem Bereich die Reizantwort auf den Agonisten
verringert. Der Effekt konnte durch Mutation der Cysteine verhindert werden. Auf Grund der
Homologien zwischen den ORs ist wahrscheinlich auch bei anderen Rezeptoren die EC2 an
der Agonistenbindung beteiligt (Nichols und Luetje, 2010).
Abbildung 7: Topologie olfaktorischer Rezeptoren von Drosophila
Die ORs sitzen mit dem N-Terminus (IC1) intrazellulär in der Membran, die sie mit sieben
Transmembrandurchgängen durchziehen. Dabei befinden sich vier Domänen intrazellulär (IC1, IC2,
IC3 und IC4) und vier Domänen extrazellulär (EC1, EC2, EC3 und EC4). Die Längen der Domänen
deuten die Größenverhältnisse beim Or43a an. Die EC2 ist wahrscheinlich an der Ligandenbindung
beteiligt, der IC4 wird eine Rolle bei der Bindung an den Or83b zugeordnet.
Erstellt entsprechend der erwarteten Membrantopologie nach Gao und Chess (1999) und Benton et al.
(2006).
In einem Versuch mit einem Chimärenrezeptor aus dem N-terminalen Bereich des
Or83b und dem C-terminalen Bereich des Or43a zeigte Benton et al. (2006), dass die
C-terminale Hälfte des Or43a für die Bindung an den Or83b verantwortlich ist. Über two-
hybrid-Versuche grenzten sie die Bindungsstelle auf die IC4 ein, die bei Benton et al. (2006)
als IC3 bezeichnet wird. Da sie bei den Versuchen allerdings nur die intrazellulären Domänen
IC3 und IC4 untersuchten, könnten auch noch andere Bereiche wie die extrazellulären
Domänen eine Beteiligung an der Or83b Bindung besitzen.
Für weitere Faktoren der Signalkaskade gibt es bislang keine Anhaltspunkte, an welchen
Positionen die Interaktionen ablaufen. So fehlen Informationen über mögliche Bindungen zu
G-Proteinen, Proteinkinasen oder Arrestinen.
Einleitung
24
2.6 Zielsetzung
Obwohl sich viele wissenschaftliche Arbeiten mit dem Geruchssinn der Insekten
beschäftigt haben, sind wesentliche Bereiche des olfaktorischen Systems immer noch
unverstanden. Hierzu zählt unter anderem der genaue Ablauf der Signaltransduktion in den
ORNs. Der Komplex aus OR und Or83b bildet selbst einen Ionenkanal und fungiert damit als
ionotroper Rezeptor. Dennoch weisen viele Arbeiten auf eine metabotrope Signalkaskade
über G-Proteine und zyklische Nukleotide hin (Wicher et al., 2008). Über die Bedeutung der
einzelnen Domänen olfaktorischer Rezeptoren bei diesen Prozessen ist bei beiden
Übertragungswegen fast nichts bekannt.
Ziel dieser Arbeit ist es, mehr über die Bedeutung der einzelnen Domänen der ORs am
Beispiel des Or43a zu ergründen. Hierzu sollen, soweit nicht bereits vorhanden, Fliegenlinien
erzeugt werden, die die vier intrazellulären Domänen IC1, IC2, IC3 und IC4 sowie die vier
extrazellulären Domänen EC1, EC2, EC3 und EC4 unter Verwendung des Gal4-Systems
ektopisch in den ORNs exprimieren. Durch Expression der extrazellulären und intrazellulären
Domänen in den ORNs soll herausgefunden werden, welche Bereiche für die
Signaltransduktion eine Rolle spielen.
Durch die ektopische Expression der Domänen könnten Interaktionen des Or43a mit
anderen Komponenten der Signalkaskade durch kompetitive Hemmung geschwächt werden.
Dieses würde sich in einer veränderten Geruchswahrnehmung auswirken. Solche
Veränderungen sollen über elektrophysiologische Untersuchungen sowie über Verhaltenstests
ermittelt werden. Die Ergebnisse dieser Versuche könnten Hinweise zu den Interaktionen der
einzelnen Or43a-Domänen mit anderen Komponenten der Signalkaskade liefern.
Material und Methoden
25
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Fliegenstämme
Fliegenlinien aus dem Bloomington Drosophila-Stock-Center der Indiana Universität
Bloomington sind mit der Stock-Nummer aufgeführt.
Name Genotyp Eigenschaft (Herkunft)
Doppel-
balancer
Balancer fürs zweite und dritte
Chromosom (Bloomington 7199)
EC1 (15-5)
UAS-Responderlinie zur
Expression der EC1 (Lange, 2007)
EC1 (25-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der EC1 (Lange, 2007)
EC1 (35-3)
UAS-Responderlinie zur
Expression der EC1 (Lange, 2007)
EC2 (9-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der EC2 (Lange, 2007)
EC2 (27-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der EC2 (Lange, 2007)
EC3 (23-5) (unbekannter
Insertionsort in white)
UAS-Responderlinie zur
Expression der EC3 (Lange, 2007)
EC4 (13-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der EC4 (Lange, 2007)
EC4 (62-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der EC4 (Lange, 2007)
Material und Methoden
26
Name Genotyp Eigenschaft (Herkunft)
IC1 (10-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der IC1 (Lange, 2007)
IC1 (27-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der IC1 (Lange, 2007)
IC1 (35-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der IC1 (Lange, 2007)
IC3 (5-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der IC3 (Lange, 2007)
IC3 (45-1)
UAS-Responderlinie zur
Expression der IC3 (Lange, 2007)
Or83b-Gal4
Or83b-Gal4-Treiber (Carlson,
Universität Yale)
Ret.44
Gal4-Expression im Auge in allen
Zellen hinter der morphologischen
Furche (Bloomington 1104)
Ret.53
Gal4-Expression im Auge in allen
Zellen in und hinter der
morphologischen Furche
(Bloomington 8121)
white
Loss-of-function-Mutation des
white-Gens (Bloomington 3605)
Wildtyp
Canton S Wildtyp
(Bloomington 1)
Material und Methoden
27
3.1.2 Primer
5´-pUAST 5´-AAA TCA ACT GCA ACT ACT GAA ATC TGC C-3´
3´-IC2 5´-CTC GAG TTA GTT CCG AGC CTC CCG TTC C-3´
3´-IC4 5´-AGC TCG AGT TAG GTT TTG CGA AAC CGA GTT CC-3´
Primer 607 5´-TGC ATC ACC ATC ACC ATC AC-3´
Primer 608 5´-TTT TGC GAA ACC GAG TTC CT-3´
Primer 609 5´-CGA CGC TTC AAG GGA CAG TA-3´
Primer 610 5´-CAA TCT CCT TGC GCT TCT TG-3´
Primer 612 5´-TCG GGC CAA TGA AAT ATG C-3´
3.1.3 Enzyme und Nukleotide
dATP (Fermentas)
dCTP (Fermentas)
dGTP (Fermentas)
DNA-Polymerase, Dream-Taq (Fermentas)
dTTP (Fermentas)
RNase (Fermentas)
DNase I, RNase-frei (Fermentas)
3.1.4 Antikörper und Seren
Blockserum 1 % Ziegenserum in TBST-100
Kaninchen α His Pierce 6x-His Epitope tag polycl. Ab. (Thermo Fischer
Scientific)
Maus α nc 82 Maus monoklonaler α nc 82 AK (Hofbauer)
Maus α His Maus IgG1 monoklonaler anti His AK (Qiagen)
Ziege α Kaninchen-Cy2 Ziege IgG polyklonaler anti Ziege-AK konjugiert mit Cy2
(Dianova)
Ziege α Maus-AP Ziege IgG polyklonaler anti Ziege AK konjugiert mit
Alkaline-Phosphatase (Sigma)
Ziege α Maus-Cy3 Ziege IgG polyklonaler anti Ziege-AK konjugiert mit Cy3
(Dianova)
Ziegenserum (Sigma)
Material und Methoden
28
3.1.5 Lösungen, Puffer und Medien
Agarosegel 1 % Agarose
0,005 % RedSafe
0,5x TAE
Drosophila-Ringer 7,48 g/l NaCl
0,35 g/l KCl
0,26 g/l CaCl2 * 2 H2O
0,198 g/l Na2HPO4 * 7 H2O
0,048 g/l KH2PO4
Fixierlösung für Kryoschnitte 4 % Paraformaldehyd
25 mM Na2HPO4
12,5 mM KH2PO4
pH 7,2 mit NaOH
Fliegenfutter 9,2 g/l Agar-Agar
50 g/l inaktivierte Hefe
50 g/l Sucrose
50 g/l Maismehl
5 ml/l Propionsäure
7 ml/l 25 % Nipagen in Ethanol
Homogenisierungspuffer zur
Isolierung genomischer DNA
0,1 M Tris (pH 9,0)
0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure
1 % Natriumdodecylsulfat
Probenpuffer zur
Gelelektrophorese, 10x
15 % Ficoll
0,2 % Bromphenolblau
0,2 % Xylenxyanol FF
TAE, 50x 2 M Tris-Acetat (pH 8,0)
50 mM Ethylendiamintetraessigsäure
TBS 100 mM Tris-HCl (pH 7.4)
150 mM NaCl
TBST-100 0,1 % Triton X-100 in TBS
TBST-20 0,2 % Tween 20 in TBS
TE 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)
1 mM Ethylendiamintetraessigsäure
Material und Methoden
29
3.1.6 Verbrauchsmaterial und Kits
Aktivkohle gekörnt, 4 mm (Applichem)
Deckgläser (Menzel-Gläser)
Einbettmedium für Kryoschnitte (Jung)
Filterpapier (Whatman)
Glasfritte (Glasbläserei der Ruhr-Universität Bochum)
Größenstandards O´GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas)
O´GeneRuler 50 bp DNA Ladder (Fermentas)
Heißkleber (UHU)
Kanülen SUPRA, 1,80 x 40 mm (Ehrhardt Medizinprodukte)
SUPRA, 2,00 x 60 mm (Ehrhardt Medizinprodukte)
Kapillaren GB150ETF-10 Kapillaren (Science Products)
Kit zur RNA-Analyse Experion RNA StdSens Analysis Kit (Bio-Rad)
Kit zur RNA-Isolierung ZR Tissue & Indect RNA MicroPrep Kit (Zymo
Research)
Kit zur qRT-PCR iScript qRT-PCR Kit (Bio-Rad)
One step MESA GREEN qRT-PCR MasterMix Plus for
SYBR assay Kit (Eurogentec)
Kunststoffröhrchen zur
Fliegenhaltung
(Oehmen)
Nagellack (Rival de Loop)
Objektträger Superfrost Plus (Menzel-Gläser)
Parafilm (American National Can)
Pasteurpipetten (Sarstedt)
Petrischalen (Sarstedt)
Pipettenspitzen (Sarstedt)
Pipettenspitzen mit Filter (Starlab)
Pistill (VWR)
Reaktionsgefäße 0,2 ml (Sarstedt)
1,5 ml (Sarstedt)
Schaumstoffstopfen (Oehmen)
Silberdraht 0,1 mm (Roth)
Sterilstopfen (Oehmen)
Szintillationsgefäß (Wheaton)
Material und Methoden
30
Watte (Hartmann)
Zahnstocher (Rewe Handelsgruppe)
3.1.7 Chemikalien
Agar Agar-Agar reinst (Applichem)
Agarose NEED Ultra-Qualität (Roth)
Benzaldehyd (BA) ≥ 98 % (Acros Organics)
Bromphenolblau (Roth)
Cyclohexanol (cHOH) ≥ 99 % (J.T. Baker)
Diethylsuccinat (DES) ≥ 99 % (Aldrich)
Ethanol ≥ 98,8 % (Riedel de Haën)
Ethylacetat (EA) ≥ 99,5 % (J.T. Baker)
Ethylcaproat (EC) ≥ 98 % (Fluka)
Ethylendiamintetraessigsäure (Merck)
Ficoll PM 400 (Sigma)
Glycergel (Dako)
Glycerin (J.T. Baker)
Glycin (Applichem)
Hefe (inaktiviert) (Engevita)
Isoamylacetat (IA) ≥ 99 % (Acros Organics)
Isopropanol (VWR)
Kaliumacetat (J.T. Baker)
Kaliumchlorid (J.T. Baker)
Kaliumhydrogenphosphat (J.T. Baker)
Kalziumchlorid (J.T. Baker)
Kalziumchlorid-2-hydrat ≥ 99,5 % (J.T. Baker)
Kohlendioxid (Air Liquide)
Maismehl (Levers)
Methanol (Merck)
Methylacetat (MA) ≥ 99 % (Riedel de Haën)
Natriumchlorid (J.T. Baker)
Natriumdodecylsulfat (Applichem)
Natriumhydrogenphosphat ≥ 99 %, wasserfrei (Roth)
Material und Methoden
31
di-Natriumhydrogenphosphat-7-
hydrat
≥ 99 % (Riedel de Haën)
Natriumhydroxid (J.T. Baker)
n-Butanol (nBuOH) (J.T. Baker)
Nipagen (Sigma)
1-Octanol (OctOH) ≥ 99,5 % (Riedel de Haën)
Octylacetat (OA) ≥ 99 % (Aldrich)
Paraffinöl (Merck)
Paraformaldehyd (VWR)
Propionsäure (Fluka)
Propionsäureethylester (PEE) ≥ 99 % (Aldrich)
RedSafe (Intron Biotechnology)
Methylsalicylat (MeSa) ≥ 99 % (Fluka)
Natriumdodecylsulfat (Applichem)
Salzsäure 1 mol/l (Waldeck)
Sucrose ≥ 99 % (Applichem)
Stickstoff, flüssig (Air Liquide)
Tris Ultrapure (Applichem)
Triton X-100 (Sigma)
Tween 20 (Sigma)
Xylenxyanol FF (Roth)
3.1.8 Geräte
DNA-Gelelektrophorese-
kammer
Mupid-ex (Advance)
Duftapplikator OktopUSB (Eigenbau AG Sinnesphysiologie)
Elektroden-Puller PIP6 (Heka)
Elektroporator Micropulser (Bio-Rad)
Fluoreszenzmikroskop BX51WI Fixed Stage Upright Microscope (Olympus) mit
MPLN5X Objektiv, LMPLFLN50 Objektiv, U-LH100HG
Lampenhaus, USHIO 100W HG-Dampfbrenner, U-MWIBA3
Filterwürfel, U-M31007 CY3 Filterwürfel und U-M31044v2
CYAN GFP Filterwürfel
Fotoapparat Camedia C5060 (Olympus)
Material und Methoden
32
Fotoapparat für ERG MDa (Leica)
Homogenisator Precellys 24 lysis & homogenisation (Bertin Technologies)
Kaltlichtquelle KL 1500 (Schott)
Kryomikrotom CM 3050 S (Leica)
Magnetstativ (Primat)
Mikromanipulator M3301 (World Precision Instruments)
Hydraulischer Mikromanipulator (Navishige)
Oszilloskop für EAG PicoScope 3204 (Pico Technology)
Oszilloskop für ERG DSO-2090 USB (Voltcraft)
Photometer 7315 Spectrophotometer (Jenway)
Stereomikroskop SZ51 (Olympus)
Thermocycler Labcycler (Sensoquest)
StepOnePlus qPCR-Thermocycler (Applied Biosystems)
Thermomixer Thermomixer Comfort (Eppendorf)
UV-Lampe Flächenstrahler NU 72 UV (Benda)
Verstärker DP-311 (Warner Instruments)
Waage EW 1500-2M (Kern)
Zentrifuge RC 5B Plus (Sorvall)
5415 D (Eppendorf)
5430 R (Eppendorf)
3.1.9 Software
Bioinformatik Vector NTI (Invitrogen)
Grafikprogramme Photoshop der Creative Suite 3 (Adobe)
CorelDraw der Graphic Suite X5 (Corel)
Messwerterfassung EAG DuftarayV1.4Max (AG Sinnesphysiologie) und Mesfile-
Fewer (AG Sinnesphysiologie), basierend auf LabVIEW
(National Instruments)
Messwerterfassung ERG DSO-2090 (Voltcraft)
Statistik Excel (Microsoft)
Prism (GraphPad)
SPSS (IBM)
Material und Methoden
33
3.2 Methoden
3.2.1 Fliegenhaltung
Die Fliegen werden, soweit nicht anders erwähnt, entsprechend Ashburner (1989)
gehalten. Die dauerhafte Aufbewahrung der Tiere erfolgt entweder bei 18 °C und einem 12
Stunden Hell-Dunkel-Rhythmus oder bei Raumtemperatur und natürlichem Hell-Dunkel-
Rhythmus. Zum Sortieren der Tiere nach phänotypischen Eigenschaften werden sie auf einer
Glasfritte mit Kohlendioxid betäubt. Das Sortieren geschieht unter optischer Vergrößerung
durch ein Stereomikroskop.
3.2.2 Herstellung transgener Tiere des Gal4-Systems
Die transgenen Fliegen werden entsprechend Rubin und Spradling (1982) hergestellt:
Zur Erzeugung transgener Fliegen wird die gewünschte Plasmid-DNA in Drosophila-Eier von
white-Fliegen injiziert (durchgeführt von Vanedis Drosophila Injection Service, Norwegen).
Die geschlüpften Fliegen werden jungfräulich vereinzelt und mit white Fliegen gekreuzt.
Direkte rotäugige Nachkommen werden wiederum jungfräulich vereinzelt und mit white
Fliegen gekreuzt. Die rotäugigen Nachkommen der zweiten white-Kreuzung werden inter se
gekreuzt. Um das integrierte Genkonstrukt homozygot zu erhalten, werden jungfräuliche
Weibchen mit besonders dunklen Augen mit möglichst dunkeläugigen Männchen verpaart.
Zur stabilen Haltung und zur Bestimmung des Chromosoms, in dem sich das
Genkonstrukt integriert hat, werden Nachkommen der inter se-Kreuzung mit dem
Doppelbalancer ausbalanciert.
3.2.3 Treiber-Responder-Kreuzungen des Gal4-Systems
Bei den Kreuzungen der Treiber- und Responderlinien werden Jungfrauen der einen
Linie mit Männchen der anderen Linie gekreuzt. In der ersten Nachkommengeneration
aktiviert der Transkriptionsfaktor Gal4 die UAS-Sequenz und das Genkonstrukt, das an die
UAS-Sequenz gekoppelt vorliegt, wird exprimiert (Abbildung 8). Die Haltung der Fliegen
erfolgt bei 24 °C. (Elliott und Brand, 2008)
Material und Methoden
34
Abbildung 8: Expression eines Genes mit dem Gal4-System
Die Kreuzung der Treiber- und der Responderlinie führt zur Bindung von Gal4 an die UAS-Sequenz
und die Aktivierung des Zielgens in der ersten Nachkommengeneration (F1). Hierdurch wird die
Transkription des Zielgenes (hier EC3) eingeleitet. Erstellt entsprechend Elliott und Brand (2008).
3.2.4 Isolierung von genomischer DNA
Zur Isolierung genomischer DNA werden 40 Fliegen in kaltem Homogenisierungspuffer
mit einem Pistill zerkleinert. Nach Zugabe weiterer 400 µl Homogenisierungspuffer wird für
30 Minuten bei 75 °C inkubiert. Es werden 70 l 8 M Kaliumacetat zugegeben und der
Ansatz für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation für 15 Minuten bei 16.100 x g
wird der Überstand mit 1 µl RNase versetzt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Zugabe von 300 l Isopropanol wird für weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert und dann für 30 Minuten bei 16.100 x g zentrifugiert. Das Pellet wird mit 70%
Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 l TE aufgenommen.
Material und Methoden
35
3.2.5 Genotypisierung über PCR
Bei der Genotypisierung über PCR (modifiziert nach Saiki et al. (1985)) wird durch
Amplifikation überprüft, ob ein bestimmtes DNA-Fragment im Genom der Fliegen enthalten
ist. Pro PCR-Ansatz werden 1 µl genomischer DNA, 1 l 3´-Primer (10 mM), 1 l 5´-Primer
(10 mM), 1 l dNTP´s (je 10 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 0,5 l DNA-Polymerase, 5
l 10x Puffer und 40,5 l Aqua dest. (Nuclease-frei) in einem 0,2 ml Reaktionsgefäß
vermischt. Die PCR wird im Thermocycler mit dem folgenden Programm durchgeführt:
PCR-Programm
Vorkühlung 4 °C
Vorbehandlung 180 Sekunden bei 95 °C
30 Zyklen 30 Sekunden bei 94 °C (Denaturierung)
30 Sekunden bei 50 bis 65 °C (Annealing)
60 Sekunden bei 68 °C (Elongation)
Nachbehandlung 300 Sekunden bei 72 °C
Nachkühlung 4 °C
Die Kontrolle der PCR geschieht durch Gelelektrophorese.
3.2.6 DNA-Auftrennung durch Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese geschieht in der DNA-Gelelektrophoresekammer entsprechend
den Herstellerangaben: Die DNA-Probe wird mit 10x Probenpuffer versetzt und auf ein
Agarosegel aufgetragen. Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgt bei 135 V für 30
Minuten in einer mit 0,5x TAE-Puffer gefüllten Gelkammer. Die DNA wird durch
Bestrahlung mit UV-Licht detektiert.
3.2.7 DNA-Sequenzierung und in silico-Analysen
Die Sequenzierung einer DNA wird vom Sequenzierservice im Lehrstuhl Biochemie II
der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt. Die in silico-Analyse der DNA-Sequenzen
geschieht am PC mit Vector NTI.
Material und Methoden
36
3.2.8 Antikörper-Färbung auf Kryoschnitten
Die Antikörperfärbung auf Kryoschnitten wird entsprechend Richardt et al. (2002)
durchgeführt:
Anfertigung von Kryoschnitten
Für die Präparation der Fliegenköpfe werden die Fliegen mit dem Rücken an einen mit
Nagellack bestrichenen Zahnstocher geklebt. Unter Drosophila-Ringer werden der Rüssel und
die Luftsäcke im Kopf entfernt. Nach drei Stunden in Fixierlösung bei 4°C entwässern die
Fliegen in Drosophila-Ringer mit 25 % Sucrose über Nacht bei 4°C.
Für die Kryoschnitte werden die Köpfe im Einbettungsmedium ausgerichtet, in
flüssigem Stickstoff eingefroren und in das Mikrotom überführt. Die 10 bis 12 μm dicken
Schnitte werden auf Objektträger aufgenommen und bis zur weiteren Behandlung mit
Antikörpern in einer feuchten Kammer aufbewahrt.
Antikörper-Färbung
Vor der Antikörper-Färbung werden die Schnitte zunächst für 20 Minuten mit TBST-
100 gewaschen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Blockserum geblockt.
Anschließend wird für eine Stunde bei 37°C oder über Nacht bei 4°C mit dem ersten
Antikörper in Blockserum inkubiert. Nach zweimaligem Waschen für 20 Minuten mit TBST-
100 bei 37 °C, einer Stunde Inkubation mit dem zweiten Antikörper und erneutem
zweimaligem Waschen werden die Präparate in Glycergel eingedeckelt.
3.2.9 Quantitative Expressionskontrolle auf Ebene der mRNA
Die quantitative Expressionskontrolle wird in Zusammenarbeit mit Dr. Carsten Balczun,
AG Zoologie und Parasitologie der Ruhr-Universität Bochum, durchgeführt.
Isolierung von RNA aus Antennen
Zur Isolierung der RNA aus Antennen werden Fliegen einzeln in flüssigem Stickstoff
eingetaucht. Danach werden die Antennen mit einer Kanüle angestoßen, so dass sie in ein
stickstoffgekühltes Reaktionsgefäß fallen. Die isolierten Antennen werden bis zur
Weiterverarbeitung bei -80 °C gelagert. Die RNA wird mit dem „ZR Tissue & Indect RNA
MicroPrep“-Kit entsprechend den Herstellerangaben isoliert: Die Antennen werden mit
„BashingBeats“ und Lysepuffer im Homogenisator in drei Durchgängen a 30 Sekunden bei
6800 rpm (je 15 Sekunden Pause) zerkleinert und die RNA über Säulen aufgereinigt.
Material und Methoden
37
Überprüfung der Qualität und Quantität von RNA
Die Qualität und Quantität der isolierten RNA wird mit dem „Experion RNA StdSens
Analysis Kit“ nach Herstellerangaben überprüft, mit der Abweichung, dass die RNA vor dem
Aufbringen auf den Chip nicht bei 70 °C denaturiert wird. Hierdurch wird verhindert, dass es
zu einer Insekten-typischen „Degenerierung“ der ribosomalen RNA kommt (Winnebeck et
al., 2010; Balczun et al., 2012).
DNase-Verdau von RNA-Proben
Der DNase-Verdau erfolgt mit Abweichungen entsprechend den Herstellerangaben: Zur
Beseitigung von DNA-Resten in den RNA-Proben werden pro 50 µl-Ansatz jeweils 0,1 µg
RNA mit 3 U DNase I und 10x-Puffer versetzt und für 90 Minuten bei 37°C inkubiert.
Anschließend werden 3 µl 25 mM Ethylendiamintetraessigsäure zugegeben und die DNase
durch 10 Minuten bei 65°C inaktiviert.
Quantitative Expressionskontrolle
Die vergleichende quantitative Expressionskontrolle erfolgt durch Überprüfung der
Menge an mRNA über RT-PCR entsprechend Balczun et al. (2012): Die Analysen werden in
einem StepOnePlus-Thermocycler mit dem „One step MESA GREEN qRT-PCR MasterMix
Plus for SYBR assay“ Kit oder dem „iScript qRT-PCR“ Kit entsprechend den
Herstellerangaben durchgeführt. Die qRT-PCR-Analysen werden dreifach durchgeführt. Der
DNase I-Verdau wird durch qPCR ohne reverse Transkriptase überprüft. Die qRT-PCR-
Experimente erfolgen jeweils mit drei unabhängigen Proben. Die Primer-Effizienz wird
mittels LinRegPCR berechnet (Ramakers et al., 2003). Von drei identischen
Versuchsansätzen wird jeweils der durchschnittliche Ct-Wert ermittelt. Mit den
durchschnittlichen Ct-Werten werden die relativen Expressionsraten unter Berücksichtigung
der primerspezifischen Effizienz entsprechend Pfaffl (2001) errechnet. Zur Normalisierung
wird die mRNA des ribosomalen Proteins rp49 verwendet, deren Ct-Werte parallel
mitbestimmt werden. Die Ergebnisse werden mit der Excel-basierten Software REST
statistisch ausgewertet (Pfaffl et al., 2002).
Material und Methoden
38
qPCR-Programme
Programm A
(Eurogentec-Kit)
Programm B
(Bio-Rad-Kit)
Reverse Transkription 30 Minuten bei 48 °C
5 Minuten bei 95 °C
10 Minuten bei 50 °C
5 Minuten bei 95 °C
PCR: 40 Zyklen 15 Sekunden bei 95 °C
60 Sekunden bei 60 °C
Auslesen der Fluoreszenz
10 Sekunden bei 95 °C
30 Sekunden bei 60 °C
Auslesen der Fluoreszenz
Aufnahme der
Schmelzkurve
15 Sekunden bei 95 °C
60 Sekunden bei 60 °C
Aufnahme von 60° C bis 95° C
in Schritten von 0,3° C
60 Sekunden bei 95 °C
60 Sekunden bei 55 °C
Aufnahme von 55° C bis 95° C
in Schritten von 0,3° C
Ende 15 °C 15 °C
3.2.10 Elektrophysiologie
Elektroantennogramm (EAG)
Die elektrophysiologischen Messungen werden mit Abweichungen entsprechend Ayer
und Carlson (1991) sowie Störtkuhl und Kettler (2001) durchgeführt: Etwa fünf Tage alte
weibliche Fliegen werden in einer abgeschnittenen Pipettenspitze so fixiert, dass der anteriore
Teil des Kopfes aus der Spitze herausragt. Es werden immer nur weibliche Tiere benutzt, um
auch X-chromosomal liegende genetische Elemente vergleichen zu können. Die Pipetten-
spitze wird in Drosophila-Ringer gestellt und mit Knetmasse fixiert, so dass das Abdomen
Kontakt zur Flüssigkeit hat. Eine Referenzelektrode wird in den Kopf eingestochen und die
Fliege über den Drosophila-Ringer geerdet. Zur Ableitung wird die Messelektrode auf dem
dritten Antennensegment (Funiculus) gegenüber der Arista positioniert. Als Elektroden
werden unter Hitzeeinwirkung dünn ausgezogene, mit Drosophila-Ringer gefüllte
Glaskapillaren benutzt. Die Potentialdifferenz zwischen Messelektrode und Referenzelektrode
wird mittels Verstärker und Oszilloskop abgelesen und am Computer aufgezeichnet und
ausgewertet. Die Antenne wird über ein automatisiertes Applikationssystem stimuliert, bei
dem jeweils ein Luftstrom von 1 Liter pro Minute durch ein Gefäß mit einem der Duftstoffe
geleitet wird. Die angereicherte Luft wird in einen konstanten Luftstrom von 3 Liter pro
Minute geleitet, der auf die Antenne gerichtet ist. Die Dauer der Applikation eines Duftstoffes
Material und Methoden
39
beträgt jeweils eine Sekunde. Zwischen den verschiedenen Duftstoffen wird für jeweils 10
Sekunden Luft ohne Duftstoff in den konstanten Luftstrom geblasen, so dass es keine
Veränderungen im Gesamtvolumen pro Zeiteinheit gibt. Bei verdünnten Duftstoffen erfolgt
die Verdünnung immer in Paraffinöl.
Die Amplituden werden mit „Mesfile-Fewer“ ausgewertet. Dabei werden die Messwerte
manuell ausgelesen. Die Datensammlung erfolgt über Exel. Die statistische Auswertung
geschieht mit SPSS durch den Levene-Test der Varianzgleichheit gefolgt von einem t-Test.
Dabei werden Werte p ≤ 0,05 als „signifikant“, Werte p ≤ 0,01 als „sehr signifikant“ und
Werte p ≤ 0,001 als „hoch signifikant“ gewertet.
Zur Auswertung der Kinetik der EAG-Messungen werden die Zahlenwerte, die den
Stromkurven zu Grunde liegen, aus „Mesfile-Fewer“ exportiert und in Excel ausgewertet:
Anhand der Applikationsdauer werden die Datenbereiche der einzelnen Messungen ermittelt.
Der Bereich eine Sekunde vor der Applikation, während der Applikation und zwei Sekunden
nach der Applikation werden aus den Tabellen isoliert und in eine Kurve umgewandelt. Die
Kurve wird in Photoshop importiert und mit Hilfe von Hilfslinien und Lineal die Nulllinie
und maximale Amplitude abgelesen. Es wird die Zeit ermittelt, die zwischen dem Beginn der
Depolarisation und dem Erreichen von zwei Dritteln der maximalen Amplitude vergeht
(t 2/3). Ebenfalls wird die Zeit t 1/3 bestimmt, die bei Beendigung des Reizes zwischen dem
Beginn der Repolarisation und dem Rückgang auf ein Drittel der maximalen Amplitude
vergeht (siehe Abbildung 27, Kapitel 4.8). Die statistische Auswertung geschieht wie bei den
EAG-Amplituden. Die graphische Auswertung erfolgt in Form eines Box-Whisker-
Diagramms.
Elektroretinogramm (ERG)
Die elektrophysiologischen Ableitungen vom Auge werden modifiziert entsprechend
Kelly und Suzuki (1974) durchgeführt. Die Fliegen werden wie beim EAG fixiert, geerdet
und mit der Referenzelektrode verbunden. Die Messelektrode wird leicht ins Auge
eingestochen, so dass die Spitze innerhalb der Retina liegt. Mittels Kaltlichtquelle und der
Verschlusseinheit eines umfunktionierten Fotoapparates werden die Lichtreize appliziert. Bei
Messungen mit farbigem Licht werden entsprechende Filter in den Strahlengang integriert.
Die Amplituden werden über Verstärker und Oszilloskop an den Computer weitergegeben
und dort aufgezeichnet. Die statistische Auswertung erfolgt entsprechend der EAG-Versuche.
Material und Methoden
40
3.2.11 Verhaltenstests (T-Maze)
Die Verhaltensversuche im T-Maze werden nach dem Aufbau von Tully und Quinn
(1985) und Helfand und Carlson (1989) durchgeführt: Mindestens 24 Stunden vor dem
Versuch werden die Fliegen mit CO2 betäubt, nach Geschlechtern sortiert und die weiblichen
Tiere auf frischem Fliegenfutter bis zum Test aufbewahrt. In eine Kammer eines vertikalen
Schiebers werden jeweils mindestens 30 Fliegen platziert. An der Rückwand der Kammer
wird kontinuierlich Luft abgesaugt. Nach dem Einfüllen der Fliegen wird der Raum komplett
abgedunkelt. Zu Beginn des Versuches wird die Kammer durch Absenken des Schiebers
zwischen zwei Rohre gebracht, an deren Enden sich entweder 100 µl eines verdünnten
Duftstoffes auf Filterpapier befindet oder Paraffinöl. Die verdünnten Duftstoffe sind dabei
jeweils in Paraffinöl gelöst. Die Fliegen haben nun 30 Sekunden Zeit sich zu dem Duftstoff
hin oder von ihm weg in eines der beiden Rohre zu bewegen. Danach wird durch Anheben
des Schiebers der Durchgang zwischen den Rohren verschlossen. Die Fliegen in den beiden
Rohren werden ausgezählt und der Responseindex (RI) nach der folgenden Formel berechnet:
RI = (K-T) / (K+T)
Dabei steht K für die Fliegen auf der Kontrollseite (Paraffinöl) und T für die Fliegen auf
der Testseite mit dem Duftstoff. Die statistische Auswertung erfolgt entsprechend den EAG-
Versuchen.
Ergebnisse
41
4 Ergebnisse
4.1 Expression der Or43a-Domänen
Bereits in Vorversuchen waren die DNA-Sequenzen der extrazellulären Domänen EC1,
EC2, EC3 und EC4 sowie die intrazellulären Domänen IC1 und IC3 in Responderlinien des
Gel4-Systems eingebaut worden (siehe Abbildung 7, Kapitel 2.5). An Nachkommen von
Kreuzungen mit antennenspezifischen Treiberlinien wurde die Expression anhand von
Antikörper-Färbungen für die Domänen EC1, EC2, EC3 und IC3 nachgewiesen (Lange,
2007).
4.1.1 Herstellung von Treiberlinien zur Expression der IC2 und IC4
Die Domänen IC2 und IC4 lagen noch nicht in Responderlinien des Gal4-Systems vor.
Daher wurde die DNA-Sequenz der Domänen, integriert in den Vektor pUAST-N-His, zur
Injektion in Drosophila-Eier eingeschickt. Dabei wurde ein Gemisch der beiden Vektoren
zusammen in die Embryonen injiziert. Von den erhaltenen Tieren wurden sechs unabhängige
Fliegenlinien gewonnen. Über die entsprechenden Kreuzungen wurde für die sechs Linien
bestimmt, welches Chromosom jeweils das eingebaute genetische Konstrukt trägt. Eine der
Linien hatte eine X-chromosomale Insertion und je zwei der Linien hatten eine zweit- bzw.
drittchromosomale Insertion. Bei der sechsten Fliegenlinie war die Letalität nach Kreuzung
mit der Balancerlinie so hoch, dass der Insertionsort nicht bestimmt werden konnte.
Da die Vektoren der beiden Domänen zusammen in die Embryonen injiziert worden
waren, musste nun bestimmt werden, welche der Domänen jeweils in den Fliegenlinien
vorhanden war. Um dieses zu überprüfen, wurde die genomische DNA von jeweils 40 Fliegen
aufgereinigt und eine PCR zur Genotypisierung durchgeführt. Für die PCR wurde jeweils der
5´-pUAST-Primer verwendet sowie entweder der Primer 3´-IC2 oder 3´-IC4. Bei der
Standarddurchführung mit einer Annealing-Temperatur von 50 °C wurden bei mehreren
Fliegenlinien mit beiden Primerpaaren DNA-Fragmente amplifiziert. Um auszuschließen,
dass es sich hierbei um unspezifische Amplifikationen handelt, wurden die PCR-Bedingungen
entsprechend Mülhardt (2009) angepasst. Zur Gewährleistung einer möglichst hohen
Stringenz wurde eine Gradienten-PCR durchgeführt, bei der die Annealing-Temperatur von
60 °C bis 65 °C variierte. Die Spezifität der PCR wurde anhand des Vektors pUAST-N-His-
IC4 überprüft. Das Ergebnis dieser PCR ist in Abbildung 9 dargestellt. Bei positiver
Amplifikation wäre bei beiden Primern eine Bande im Bereich von 200 Basenpaaren (bp) zu
Ergebnisse
42
erwarten gewesen. In dieser Größenordnung trat nur mit dem 3´-IC4-Primer eine Bande auf.
Dieses war unabhängig von der Temperatur im gewählten Bereich. Daher wurde für die
folgenden PCRs mit 60 °C die Temperatur ausgewählt, die am nächsten am theoretischen
Optimum von 57,5 °C liegt.
Abbildung 9: Gelelektrophoretische Kontrolle der PCR-Spezifität zur IC4-Amplifikation
Bei den Spuren 1-6 wurde mit dem 3´-IC2 Primer amplifiziert, bei den Spuren 7-12 mit dem 3´-IC4-
Primer. Annealing-Temperaturen: Spur 1 und 7: 60 °C; Spur 2 und 8: 60,9 °C; Spur 3 und 9: 61,8 °C;
Spur 4 und 10: 62,7 °C; Spur 5 und 11: 63,6 °C; Spur 6 und 12: 65 °C. M =Marker (O´GeneRuler
100 bp Plus DNA Ladder).
Nach der Optimierung der PCR-Bedingungen wurden die Tests auf Integration von IC2
und IC4 in den transgenen Fliegen wiederholt. Auch hier wurden bei vier der sechs
Fliegenlinien beide Domänen gefunden (siehe Abbildung 10). Durch die Anpassungen der
PCR-Bedingungen waren Amplifikationen aufgrund unspezifischer Bindungen eines
3´-Primers an die DNA-Sequenz der falschen Domäne, ausgeschlossen worden. Daher
beruhten die Ergebnisse mit Banden bei beiden Domänen tatsächlich auf Doppelintegrationen.
Bei diesen Fliegen gab es nun die Möglichkeit, dass entweder beide Domänen zusammen auf
einem Chromosom vorhanden waren oder sie unabhängig in verschiedenen Chromosomen
vorlagen. In dem zweiten Fall hätten die Domänen durch Isomerisierungs-Kreuzungen
getrennt werden können. Daher wurden die sechs Fliegenlinien isomerisiert, indem
Ergebnisse
43
jungfräuliche Tiere mit white-Fliegen gekreuzt wurden. Diese Kreuzung wurde in den
folgenden Generationen fünf Mal wiederholt. Bei Integration auf verschiedenen
Chromosomen wären mit einer Wahrscheinlichkeit von 64:1 die beiden Domänen
voneinander getrennt worden.
Abbildung 10: Gelelektrophoretische PCR-Kontrolle zur Integration von IC2 und IC4 in
transgenen Fliegenlinien
In den acht Spuren nach dem ersten Marker (M) wurde mit dem Primer 3´-IC2 auf die Domäne IC2
getestet. In den acht Spuren nach dem zweiten Marker wurde mit dem 3´-IC4 Primer auf die Domäne
IC4 getestet. 1-6 = getestete transgene Fliegenlinie; WT = Kontrolle an wildtypischen Fliegen;
H = H2O-Kontrolle. M = Marker (O´GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder).
Nach der Isomerisierung wurden die Fliegenlinien wieder über PCR auf die Integration
der beiden Domänen überprüft. Auch hier traten wieder doppelte Insertionen auf. Alle
Fliegenlinien enthielten die Domäne IC4. Zusätzlich enthielten einige Linien die IC2. In der
Abbildung 11 sind die gelelektrophoretischen PCR-Kontrollen derjenigen Linien gezeigt,
welche für die nachfolgenden Versuche ausgewählt wurden. Eine Aufstellung dieser
Fliegenlinien ist in der Tabelle 1 zusammengefasst. Drei der Linien enthalten nur die IC4,
fünf der Linien enthalten die IC2 zusammen mit der IC4.
Ergebnisse
44
Abbildung 11: Gelelektrophoretische PCR-Kontrolle zur Integration von IC2 und IC4 in
isomerisierten Fliegenlinien
In den Spuren zwischen den Markern wurde auf Amplifikation der IC2 überprüft, in den Spuren nach
dem zweiten Marker auf Amplifikation der IC4. Überprüft wurden die angezeigten transgenen
Fliegenlinien sowie white-Fliegen und Wasser als Kontrollen.
Marker: O´GeneRuler 50 bp DNA Ladder.
Tabelle 1: Ausgewählte isomerisierte Fliegenlinien
Name Enthaltene Domäne Betroffenes Chromosom
IC2+4 (1-1) IC2 + IC4 X
IC4 (2-1) IC4 3
IC4 (2-3) IC4 3
IC2+4 (2-4) IC2 + IC4 2
IC2+4 (3-1) IC2 + IC4 X
IC4 (4-1) IC4 X
IC2+4 (6-1) IC2 + IC4 3
IC2+4 (6-2) IC2 + IC4 3
Ergebnisse
45
4.1.2 Zelluläre Lokalisation der IC2 und IC4
Im nächsten Schritt wurden Kreuzungen mit der Treiberlinie Or83b-Gal4 durchgeführt,
um die Domänen in den ORNs zu exprimieren. Es sollte nun die Expression der Domänen
überprüft werden. Hierzu wurden Kryoschnitte der Fliegenköpfe angefertigt und Antikörper-
Färbungen durchgeführt. Als primärer Antikörper wurde ein monoklonaler Mäuseantikörper
verwendet, der gegen den N-terminalen His-Tag der Domänen gerichtet ist. Als sekundärer
Antikörper wurde ein gegen Mäuseantikörper gerichteter Ziegenantikörper verwendet, an den
der Fluoreszenzfarbstoff Cy3 gebunden ist. Die Ergebnisse der Antikörper-Färbung an
Fliegen, die nur IC4 exprimieren, sind in Abbildung 12 A-I zu sehen. Bei den drei
Fliegenlinien wurden Bereiche entlang des Randes der Antennen angefärbt, bei denen es sich
wahrscheinlich um die ORNs handelt. Es sind rundliche bis konische Bereiche mit etwa
zellulärer Größe, die teilweise spitz in Richtung der Sensillen ziehen. In den äußeren
Bereichen der Sensillenschäfte ist keine Fluoreszenz detektierbar.
Ein vergleichbares Ergebnis wie bei der Domäne IC4 ist auch bei den Tieren zu sehen,
die zusätzlich noch die Domäne IC2 in den ORNs exprimieren (siehe Abbildung 13).
Teilweise zieht sich hier die Fluoreszenz noch weiter in die Schäfte der Sensillen hinein, aber
auch bei diesen Fliegen reicht die Fluoreszenz nicht bis in die äußeren Bereiche der
Sensillenschäfte.
Zur Überprüfung, ob es sich bei den Antikörper-Färbungen tatsächlich um Färbungen
der Domänen handelt, wurden Färbungen an den Parentallinien durchgeführt. In Abbildung
12 J und K ist die Parentallinie Or83b-Gal4 zu sehen. Hier ist keine Fluoreszenz in den
Antennen auszumachen.
Ergebnisse
46
Abbildung 12: IC4-Expression in der Antenne
A-I: Horizontale Kryoschnitte des dritten Antennengliedes von Fliegen, die IC4 in allen ORNs
exprimieren. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen in der ersten Spalte zeigen die Expression
der antikörpermarkierten Domäne IC4. In der mittleren Spalte sind Durchlichtaufnahmen derselben
Antennenschnitte dargestellt. Die dritte Spalte zeigt Überlagerungen von Durchlicht- und
Fluoreszenzmikroskopie. Die Expression der IC4 wurde jeweils von der Linie Or83b-Gal4 getrieben.
Die Responderlinie ist bei A-C: IC4 (2-1); bei D-F: IC4 (2-3); bei G-I: IC4 (4-1)
J und K: Horizontale Kryoschnitte des dritten Antennengliedes der Treiberlinie Or83b-Gal4 als
Negativkontrolle. Bei der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme (J) nach Antikörper-Färbung ist
keine Fluoreszenz erkennbar. K zeigt denselben Antennenschnitt in einer Durchlichtaufnahme.
Ergebnisse
47
Abbildung 13: Expression der Domänen IC2 und IC4 zusammen in der Antenne
Abgebildet sind horizontale Kryoschnitte des dritten Antennengliedes von Fliegen, die IC2 zusammen
mit IC4 in allen ORNs exprimieren. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen in der ersten Spalte
zeigen die Expression der antikörpermarkierten Domänen IC2 und IC4. In der mittleren Spalte sind
jeweils Durchlichtaufnahmen derselben Antennenschnitte dargestellt. Die dritte Spalte zeigt jeweils
Überlagerungen von Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie. Die Expression der Domänen wurde
jeweils von der Linie Or83b-Gal4 getrieben. Die Responderlinie ist bei A-C: IC2+4 (1-1); bei D-F:
IC2+4 (3-1); bei G-I: IC2+4 (6-1); bei J-L: IC2+4 (6-2).
Ergebnisse
48
4.1.3 Expressionsrate der Domänen am Beispiel der IC4 über
quantitative RT-PCR
Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zeigten, dass die intrazellulären und
extrazellulären Domänen jeweils in Antennen exprimiert werden. Die
Fluoreszenzmikroskopie erlaubte aber keine Aussagen zur Quantität der exprimierten
Domänen. Um am Beispiel der IC4 Aussagen treffen zu können, wie viel der Domänen-DNA
transkribiert wird, wurden die Responderlinien IC4 (2-1), IC4 (2-3) und, IC4 (4-1) mit der
Linie Or83b-Gal4 gekreuzt und von den weiblichen F1-Nachkommen Antennen präpariert.
Als Kontrolle wurden außerdem Antennen von weiblichen white-Fliegen präpariert. Aus den
Antennen wurde jeweils die RNA aufgereinigt. Die Qualität der RNA wurde durch
Elektrophorese im Chipmaßstab überprüft. Das Ergebnis der Elektrophorese ist am Beispiel
der Nachkommen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] in der Abbildung 14 dargestellt. In den
Bereichen von 39 und 40 Sekunden befanden sich die Peaks der 18S und 28S Untereinheiten
der Ribosomen. Die beiden ribosomalen Peaks waren deutlich höher als der Rest der Kurve,
was auf eine nicht degradierte RNA hindeutet. Anhand der Kurve wurde automatisch jeweils
der RQI-Wert errechnet. Dabei besitzt eine völlig intakte RNA einen RQI-Wert von zehn und
eine völlig degradierte RNA einen RQI-Wert von eins. Die RNA der Abbildung 14 besaß
einen RQI-Wert von 9,2. Die Elektrophorese-Diagramme der anderen RNA-Proben sind im
Anhang ab Seite 96 zu finden. Die RNA-Konzentrationen sowie die RQI-Werte der Proben
sind in Tabelle 2 aufgeführt. Mit Ausnahme der Probe C von white-Fliegen, die einen RQI-
Wert von 7,1 besaß, hatten alle Proben einen RQI-Wert größer als acht. Alle Proben konnten
auf Grund der hohen RQI-Werte für die qPCR weiterverwendet werden.
Abbildung 14: RNA-Analyse der Antennen von F1-Tieren aus [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4], Probe A
Ergebnisse
49
Tabelle 2: RQI-Werte und Konzentrationen antennaler RNA-Proben von F1-Nachkommen der
angezeigten Treiberlinien x Or83b-Gal4 und von white-Fliegen
RQI-Wert Konzentration (pg/µl)
Probe A Probe B Probe C Probe A Probe B Probe C
IC4 (2-1) 9,4 8,5 8,1 2667 2748 9850
IC4 (2-3) 9,2 9,1 8,5 37004 3715 4498
IC4 (4-1) 9,2 8,6 8,2 4190 4456 5402
white 8,2 8,2 7,1 5788 6249 5725
Die RNA-Proben wurden nach der Qualitätskontrolle mit DNase I behandelt, um zu
verhindern, dass DNA-Rückstände die anschließenden PCR-Versuche beeinflussen. Der
DNase-Verdau wurde durch eine qPCR entsprechend qPCR-Programm A (siehe Seite 38)
überprüft. Es wurden die RNA-Proben aus Tabelle 2 mit den Primern 609 und 610 zur
Amplifikation des Referenzgens rp49 eingesetzt. Dabei wurde jeweils in einem Ansatz die
PCR mit reverser Transkription durchgeführt, in einem weiteren Ansatz wurde die reverse
Transkriptase jeweils durch Wasser ersetzt. Mit reverser Transkriptase zeigte sich bei der
Schmelzkurve eine Schmelztemperatur von 86,5 °C (siehe Seite 101). Da ohne reverse
Transkriptase keine Amplifikation dieser DNA geschah, war der DNase Verdau erfolgreich
verlaufen. In gleicher Weise wie beim rp49 wurde auch mRNA der Domäne IC4 mit den
Primern 207 und 208 aus den RNA-Proben der drei transgenen Linien amplifiziert.
Zur Bestimmung der relativen mRNA Menge der exprimierten Domäne IC4 wurden
weitere qRT-PCRs entsprechend qPCR-Programm B durchgeführt. In jeweils drei identischen
Ansätzen wurden die RNA-Proben aus Tabelle 2 auf IC4-mRNA (Primer 207 und 208) und
auf rp49-mRNA (Primer 609 und 610) getestet. Die Ct-Werte der Amplifikationen sind im
Anhang in Tabelle 5 aufgeführt. Aus den Fluoreszenzdaten der Versuche wurde für die beiden
Primerpaare die Primereffizienz ermittelt: Die Primereffizienz der Referenz rp49 betrug
1,903, diejenige der IC4 betrug 1,993. Aus den Ct-Werten und der Primereffizienz wurde die
relative Expressionsrate der IC4 in den verschiedenen Fliegenlinien ermittelt und in Relation
zu [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4]-F1-Fliegen in Abbildung 15 A aufgetragen. Zwischen den
einzelnen Fliegenlinien traten dabei keine signifikanten Unterschiede auf: Mit Faktoren von
0,95 ± 0,57 bei den F1-Nachkommen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] und 1,14 ± 0,41 bei den
F1-Nachkommen von [IC4 (4-1) x Or83b-Gal4] gab es keine erkennbaren Unterschiede
zwischen den transgenen Tieren.
In einer weiteren qRT-PCR wurde mit den Primeren 612 und 608 entsprechend PCR-
Programm B auf Expression der IC4 getestet. Bei diesem Primerpaar wurde nicht nur das
Ergebnisse
50
exprimierte IC4-Fragment amplifiziert, sondern zusätzlich auch die endogene IC4 des
Rezeptors Or43a. Somit konnte die Menge an IC4 der transgenen Fliegen mit der Menge an
Or43a in white-Fliegen verglichen werden. Dabei besaßen die Primer eine Primereffizienz
von 1,975. Bei den drei IC4-exprimierenden Fliegenlinien konnte im Vergleich zu den white-
Fliegen jeweils ein vielfaches an IC4-mRNA festgestellt werden (Abbildung 15 B). Bei den
Nachkommen von [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4] trat das 29,6-fache (±8,66) auf. Bei den
Abkömmlingen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] und [IC4 (4-1) x Or83b-Gal4] waren es die
Faktoren 23,18 (±8,58) bzw. 27,77 (±9,97). Die IC4-Fragment-exprimierenden Fliegen
bildeten damit alle drei hoch signifikant erhöhte Mengen der Domäne. Innerhalb der trans-
genen Tiere wurde keine große Abweichung in der Expressionsrate festgestellt.
Sowohl der Vergleich der Expression des IC4-Fragmentes als auch der Vergleich der
Gesamtmenge an IC4 zeigte keine großen Unterschiede in der Expressionsrate auf der Ebene
der mRNA.
Abbildung 15: Relative Quantifizierung der IC4 mRNA
A: Quantitativer Vergleich IC4-exprimierender Fliegenlinien untereinander: Die relative Menge an
mRNA der IC4-Fragmente der Nachkommen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] bzw. [IC4 (4-1) x Or83b-
Gal4] in Relation zu F1-Tieren von [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4].
B: Quantitativer Vergleich der Gesamtmenge an IC4 von F1-Nachkommen der angezeigten
Treiberlinien x Or83b-Gal4 in Relation zu white-Fliegen. Die Balken zeigen die Menge an mRNA der
endogenen IC4 des Rezeptors Or43a zusammen mit dem exprimierten IC4-Fragment in Relation zur
endogenen IC4 des Or43a von white-Fliegen.
Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen: *** = p ≤ 0,001.
Ergebnisse
51
4.2 Von den extrazellulären Domänen zeigt nur EC4 erhöhte
Amplituden im Elektroantennogramm
Bereits in Vorversuchen waren Tiere, die die extrazellulären Domänen EC1, EC2, EC3
und EC4 in den ORNs exprimieren, auf eine veränderte Reizantwort im
Elektroantennogramm (EAG) stichprobenartig untersucht worden. Dabei waren keine
auffälligen Veränderungen der olfaktorischen Reizantwort gefunden worden (Lange, 2007).
Dieses sollte in der vorliegenden Arbeit anhand eines erweiterten Spektrums an Duftstoffen
überprüft werden. Dafür wurden EAG-Messungen mit den Standard-Duftstoffen
Propionsäureethylester (PEE), Ethylcaproat (EC), Isoamylacetat (IA), Octylacetat (OA),
Diethylsuccinat (DES), 1-Octanol (OctOH), Cyclohexanol (cHOH), n-Butanol (nBUOH),
Methylsalicylat (MeSa), Ethylacetat (EA), Methylacetat (MA) und Benzaldehyd (BA)
durchgeführt. Dabei wurden PEE, EC, OA, MeSa, EA und MA jeweils in einer 1/100
Verdünnung in Paraffinöl eingesetzt. Zusätzlich wurde immer Paraffinöl als Kontrolle mit
appliziert.
Bei EAG-Messungen an zwei Fliegenlinien, die EC1 in allen ORNs exprimieren, lag
kein Unterschied zum Wildtyp vor (siehe Abbildung 16). Nur bei einem einzigen Duftstoff
trat eine signifikante Veränderung auf und das auch nur bei einer der beiden Fliegenlinien:
Bei Messungen mit EA an den F1-Nachkommen von [EC1 (15-5) x Or83b-Gal4] war die
Amplitude mit 23,92±1,85 mV im Vergleich zum Wildtyp (19,75±0,77 mV) erhöht. Ein
weiterer signifikanter Unterschied wurde bei der Kontrollmessung mit Paraffinöl bei den F1-
Tieren [EC1 (35-3) x Or83b-Gal4] gemessen. Bei der zweiten Fliegenlinie war wiederum
keine signifikante Veränderung gegenüber dem Wildtyp feststellbar.
Bei Expression der EC2 in allen ORNs [EC2 (9-1) x Or83b-Gal4] wurden im EAG
Reizantworten beobachtet, die denen des Wildtyps entsprachen (siehe Abbildung 17).
Lediglich bei cHOH lag mit 7,2±0,33 mV eine signifikante Erniedrigung gegenüber dem
Wildtyp (8,84±0,48 mV) vor. Bei cHOH handelt es sich um einen der beiden getesteten
Or43a-Liganden. Der zweite getestete Ligand, BA, führte im Gegensatz hierzu zu einer leicht
erhöhten Reizantwort ohne signifikante Abweichung vom Wildtyp.
Ein ähnliches Bild wie bei EC2 ergab sich auch bei EC3: Bei den F1-Nachkommen aus
[EC3 (23-5) x Or83b-Gal4] lag kein Unterschied zum Wildtyp vor (siehe Abbildung 18).
Lediglich bei DES trat mit 5,29±0,54 mV eine signifikant erniedrigte Reizantwort auf
(Wildtyp: 6,94±0,35 mV).
Ergebnisse
52
Abbildung 16: EAG bei Expression der EC1
Vergleich wildtypischer Fliegen mit EC1-exprimierenden F1-Nachkommen aus EC1 (15-5) bzw. EC1
(35-3) und Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanz: * = p ≤ 0,05.
Abbildung 17: EAG bei Expression der EC2
Vergleich wildtypischer Fliegen mit EC2-exprimierenden F1-Nachkommen aus [EC2 (9-1) x Or83b-
Gal4]. Fehlerbalken = SEM. Signifikanz: * = p ≤ 0,05.
Ergebnisse
53
Abbildung 18: EAG bei Expression der EC3
Vergleich wildtypischer Fliegen mit EC3-exprimierenden F1-Nachkommen aus [EC3 (23-5) x Or83b-
Gal4]. Fehlerbalken = SEM. Signifikanz: * = p ≤ 0,05.
Im Gegensatz zu den Messungen an EC1, EC2 und EC3 traten bei der Domäne EC4
größere Abweichungen vom Wildtyp auf (siehe Abbildung 19). Bei den F1-Nachkommen von
[EC4 (13-1) x Or83b-Gal4] sowie [EC4 (62-1) x Or83b-Gal4] lagen bei allen Messungen
erhöhte Werte im Vergleich zum Wildtyp vor. Bei den EC4 (62-1) Nachkommen waren mit
OA, DES, OctOH, MeSa, EA und BA die Reizantworten bei sechs der getesteten zwölf
Duftstoffe signifikant erhöht. Bei OctOH (8,92±0,61 mV gegenüber 6,97±0,26 mV beim
Wildtyp) und BA (6,58±0,58 mV gegenüber 5,06±0,23 mV beim Wildtyp) waren die
Abweichungen sogar sehr signifikant. Die EC4 (13-1) Nachkommen zeigten mit PEE, EC,
OA, DES, OctOH, MeSa, EA, MA und BA bei neun der zwölf Duftstoffe eine signifikante
Erhöhung. Bei OA, DES und MA waren die Erhöhungen sehr signifikant. Bei OctOH
(8,85±0,53 mV gegenüber 6,97±0,26 mV beim Wildtyp) MeSa (14,00±0,67 mV gegenüber
11,17±0,45 mV beim Wildtyp) und EA (25,40±1,20 mV gegenüber 19,75±0,77 mV beim
Wildtyp) waren die Erhöhungen hoch signifikant. Bei diesen Fliegen trat auch eine
signifikante Erhöhung bei der Kontrollmessung mit Paraffinöl auf, wodurch die Aussagekraft
der Ergebnisse etwas abgeschwächt wurde. Da aber bei der Hälfte der Duftstoffe die
Unterschiede sehr signifikant oder hoch signifikant waren, fand sich zumindest für diese
Messungen eine veränderte Reizantwort. Die Erhöhung der Reizantworten war bei beiden
Ergebnisse
54
Linien unabhängig von den Agonisten des Rezeptors Or43a, aus dem die exprimierten
Domänen stammten: Weder bei cHOH noch bei BA traten Abweichungen auf, die im
Vergleich mit den anderen Duftstoffen auffällig waren.
Abbildung 19: EAG bei Expression der EC4
Vergleich wildtypischer Fliegen mit EC4-exprimierenden F1-Nachkommen aus [EC4 (13-1) x Or83b-
Gal4] bzw. [EC4 (62-1) x Or83b-Gal4]. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤
0,01; *** = p ≤ 0,001.
4.3 Expression der intrazellulären Domäne IC1 führt zu
wildtypischen Elektroantennogramm-Amplituden
Wie bei den extrazellulären Domänen waren auch die intrazellulären Domänen IC1 und
IC3 in einer Vorarbeit in Responderlinien des Gal4 Systems integriert worden (Lange, 2007).
Es galt nun zu überprüfen, ob die Expression der Domänen einen Einfluss auf das
Riechvermögen der Fliegen besitzt. Hierzu wurden die Tiere mit der Treiberlinie Or83b-Gal4
gekreuzt und die F1-Nachkommen elektrophysiologisch untersucht.
Bei den Fliegen, die die IC1 exprimieren, entsprachen die Amplituden der Messungen in
etwa denen des Wildtyps (siehe Abbildung 20). Bei den Nachkommen der Linie IC1 (10-1)
trat kein signifikanter Unterschied auf. Bei der Linie IC1 (27-1) gab es eine signifikante
Ergebnisse
55
Reduktion der Reizantwort bei nBuOH. Die Amplitude betrug hier 6,55±0,40 mV, während
beim Wildtyp 8,03±0,37 mV gemessen wurden. Bei den Nachkommen der dritten Linie,
IC1 (35-1), gab es beim Duftstoff BA mit 6,00±0,40 mV eine signifikante Erhöhung
(5,06±0,23 mV beim Wildtyp). Zusätzlich lag es hier auch noch eine signifikante Erhöhung
bei der Paraffinkontrolle vor. Bei den Nachkommen der drei Linien traten weder hoch
signifikante noch sehr signifikante Abweichungen vom Wildtyp auf.
Abbildung 20: EAG bei Expression der IC1
Vergleich wildtypischer Fliegen mit IC1-exprimierenden F1-Nachkommen der Responderlinien
IC1 (10-1), IC1 (27-1) und IC1 (35-1) und der Treiberlinie Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM.
Signifikanz: * = p ≤ 0,05.
4.4 Die Elektroantennogramm-Amplituden der intrazellulären
Domäne IC3 entsprechen größtenteils dem Wildtyp
Auch bei den Fliegen, die IC3 exprimieren, fand sich größtenteils im EAG kein
Unterschied zum Wildtyp (siehe Abbildung 21). Die Nachkommen der Kreuzung aus
[IC3 (5-1) x Or83b-Gal4] zeigten nur geringe Abweichungen zu den Kontrollfliegen. Die
Werte lagen mal über und mal unter denen des Wildtyps. Lediglich bei OA und DES gab es
signifikante Abweichungen, wobei bei OA mit 4,40±0,30 mV (3,66±0,17 mV beim Wildtyp)
Ergebnisse
56
eine erhöhte Reizantwort vorlag und bei DES mit 5,45±0,47 mV eine erniedrigte
(6,94±3,6 mV beim Wildtyp). Wie bei den Nachkommen der Linie IC3 (5-1) schwankten
auch bei denen der Linie IC3 (45-1) die Werte um die des Wildtyps. Während bei OA die
Amplitude nahezu identisch mit der Kontrolle war (3,32±0,37 mV gegenüber 3,66±0,17 mV),
gab es bei DES mit 4,27±0,28 mV eine hoch signifikante Erniedrigung. Ebenfalls bei MeSa
trat mit 2,41±0,15 mV eine stärkere, sehr signifikante Abweichung vom Wildtyp
(3,38±0,24 mV) auf. Im Gegensatz hierzu lag bei den Messungen von IC3 (5-1) mit MeSa
eine leicht erhöhte Reizantwort ohne Signifikanz vor (3,74±0,53 mV). Bei den Nachkommen
der Linie IC3 (45-1) trat neben den beiden erwähnten sehr bzw. hoch signifikanten
Verringerungen der Reizantwort bei den Duftstoffen DES und MeSa auch noch eine sehr
signifikante Verringerung beim Paraffinöl auf.
Abbildung 21: EAG bei Expression der IC3
Vergleich wildtypischer Fliegen mit IC3-exprimierenden F1-Nachkommen aus [IC3 (5-1) x Or83b-
Gal4] bzw. [IC3 (45-1) x Or83b-Gal4]. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤
0,01; *** = p ≤ 0,001.
Ergebnisse
57
4.5 Bei Expression der IC4 entsprechen die Elektroantennogramm-
Amplituden teilweise denen des Wildtyps, teilweise variieren
sie
Der nächste Schritt war die elektrophysiologische Charakterisierung der Domänen IC2
und IC4. Die Ergebnisse für die IC4 sind in Abbildung 22 zusammengefasst. Insgesamt lag
keine veränderte Geruchswahrnehmung im EAG vor. Dennoch gab es für jeweils einzelne
Werte der drei gemessenen Linien Abweichungen vom Wildtyp. Bei der Messung mit OA trat
bei den Nachkommen der Kreuzung aus [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4] mit 5,45±0,39 mV im
Vergleich zum Wildtyp (4,02±0,24 mV) eine sehr signifikant erhöhte Reizantwort auf. Bei
den anderen beiden Fliegenlinien, die IC4 exprimieren, war dagegen bei OA keine
signifikante Veränderung festzustellen. Bei den Abkömmlingen von IC4 (2-3) betrug die
durchschnittliche Amplitude 4,76±0,34 mV, bei denen von IC4 (4-1) 3,91±0,18 mV.
Abbildung 22: EAG bei Expression der IC4
Vergleich wildtypischer Fliegen mit IC4-exprimierenden F1-Nachkommen der Responderlinien
IC4 (2-1), IC4 (2-3) bzw. IC4 (4-1) und der Treiberlinie Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM.
Signifikanzen: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01.
Neben der sehr signifikanten Erhöhung bei OA gab es auch noch eine signifikant
vergrößerte Amplitude bei cHOH. Im Vergleich zum Wildtyp (9,23±0,57 mV) war der Wert
Ergebnisse
58
der Fliegen, die von IC4 (2-3) abstammen, mit 12,00±1,16 mV signifikant erhöht. Die
Nachkommen der Linien IC4 (2-1) und IC4 (4-1) zeigten mit 10,59±0,76 mV bzw. 9,33±0,54
mV keine signifikante Abweichung.
Zusätzlich zu beiden Erhöhungen gab es auch eine sehr signifikante Erniedrigung: Bei
den Nachkommen der Linie IC4 (4-1) war die durchschnittliche Amplitude bei DES mit
5,01±0,20 mV kleiner als beim Wildtyp (6,19±0,34 mV) und den beiden anderen Linien
(7,28±0,41 mV bzw. 6,83±0,58 mV).
4.6 Die Expression der Domänen IC2 und IC4 zusammen führt zu
erhöhten Reizantworten
Die Nachkommen der Kreuzungen aus IC2+4 (3-1), IC2+4 (6-1) oder IC2+4 (6-2) und
der Treiberlinie Or83b-Gal4 exprimierten die beiden Domänen IC2 und IC4 zusammen in den
ORNs. Die EAG-Messungen an diesen Tieren zeigten eine generell erhöhte Reizantwort
(siehe Abbildung 23). Es traten 17 signifikant erhöhte Amplituden auf, von denen sieben sehr
signifikant und vier hoch signifikant waren. Bis auf die Messung mit MA bei den
Nachkommen von IC2+4 (3-1), bei der die durchschnittliche Amplitude mit 8,8±0,99 mV
gegenüber dem Wildtyp (10,01±0,61 mV) reduziert war, waren alle Werte höher als beim
Wildtyp. Bei den meisten Duftstoffen waren die Reizantworten deutlich erhöht. Teilweise
traten aber stärkere Schwankungen in den Amplituden der Einzelmessungen auf, so dass z.B.
bei cHOH und EA keine signifikanten Abweichungen vorlagen. Bei anderen Duftstoffen
fanden sich dagegen deutliche Unterschiede. Bei PEE (1/100) und MeSa (1/100) waren bei
den drei Fliegenlinien die Werte sehr signifikant bis hoch signifikant erhöht. Bei OctOH war
die Amplitude bei IC2+4 (3-1) signifikant erhöht (5,86±0,52 mV gegenüber 4,65±0,30 mV
beim Wildtyp), bei den beiden anderen Linien war sie hoch signifikant erhöht (6,52±0,28 mV
bei IC2+4 (6-1); 6,44±0,35 mV bei IC2+4 (6-2)). Weniger eindeutig waren die Ergebnisse bei
IA (1/100), OA, DES, nBuOH, MA (1/100) und BA. Hier waren die Differenzen nicht für alle
drei Fliegenlinien signifikant. Bei EA (1/100) schienen die Werte zwar erhöht, es gab aber
keine signifikanten Abweichungen vom Wildtyp. Der einzige Duftstoff, bei dem die Werte
der drei Linien auf einem Niveau mit dem Wildtyp lagen, war EC.
Ergebnisse
59
Abbildung 23: EAG bei Expression der IC2 zusammen mit der IC4
Vergleich wildtypischer Fliegen mit F1-Nachkommen der Responderlinien IC2+4 (3-1), IC2+4 (6-1)
bzw. IC2+4 (6-2) und der Treiberlinie Or83b-Gal4. Diese F1-Nachkommen exprimieren jeweils IC2
zusammen mit IC4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; *** = p ≤ 0,001.
Die Expression der verschiedenen extra- und intrazellulären Domänen in den ORNs
führte, je nachdem welche Domäne exprimiert wurde, zu unterschiedlichen
elektrophysiologischen Ergebnissen (siehe Abbildung 16-23). Die Unterschiede der EAG-
Amplituden zu wildtypischen Amplituden sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Expression
einer intrazellulären und einer extrazellulären Domäne bewirkte zum Wildtyp erhöhte
Reizantworten; bei Expression zweier intrazellulärer Domänen waren die EAG-Amplituden
teilweise wildtypisch, teilweise unterschieden sie sich von denen des Wildtyps.
Ergebnisse
60
Tabelle 3: Auswirkung der Expression der extra- und intrazellulären Domänen in den ORNs auf
die Amplituden im EAG
Domäne Auswirkung der Expression aufs EAG
Extrazelluläre Domänen EC1 →
EC2 →
EC3 →
EC4 ↑
Intrazelluläre Domänen IC1 →
IC2 ↑
IC3 ↕→
IC4 ↕→
→ = wildtypisch; ↑ = erhöhte Reizantwort; ↕→ = teils wildtypisch, teils abweichend
4.7 Die Expression der Domänen wirkt sich auf das olfaktorische
Verhalten aus
Die EAG-Messungen belegten, dass die Expression der intra- und extrazellulären
Domänen des Or43a teilweise die Stärke der Reizantworten beeinflussten. Es stellte sich die
Frage, ob diese Veränderungen eine Auswirkung auf das Verhalten der Tiere bewirkt.
Deshalb wurde in T-Maze-Versuchen getestet, ob eine Substanz attraktiv oder abstoßend auf
die Tiere wirkt. Bei attraktiven Duftstoffen ergab sich aus dem T-Maze ein negativer
Responseindex (RI), bei abstoßenden Duftstoffen ein positiver. Getestet wurden neben dem
Wildtyp Fliegen, die die verschiedenen Domänen des Or43a exprimieren. Die
durchschnittlichen RI-Werte für Messungen mit dem Or43a-Agonisten BA, in einer
Konzentration von 1:100, sind in Abbildung 24 dargestellt. Der Wildtyp zeigte mit einem RI
von 0,40±0,05 ein repellentes Verhalten auf den Duftstoff. Ähnliche Werte ergaben sich auch
bei Expression der Domänen IC1, EC1, EC2 und EC4. Bei IC1 (0,32±0,09), EC1 (0,31±0,08)
und EC2 (0,33±0,04) lagen die Werte leicht unter denen des Wildtyps, bei EC4 (4,21±0,12)
leicht darüber. Eine stärkere, aber nicht signifikante Erniedrigung zeigten EC3-exprimierende
Fliegen mit einem RI von 0,22±0,11. Bei Expression der IC3 und der IC4 sowie bei
Expression der IC2 zusammen mit der IC4 waren die Werte wesentlich stärker verringert. Bei
den Abkömmlingen von IC2+4 (1-1) lag mit einem RI von 0,03±0,09 ein indifferentes
Verhalten vor. Diese Abweichung war gegenüber dem Wildtyp hoch signifikant.
Ergebnisse
61
Bei den F1-Nachkommen von [IC2+4 (3-1) x Or83b-Gal4] war der RI mit 0,10±0,09
signifikant verringert. Ebenso waren die RIs bei Expression der IC3 (0,19±0,05 ) sowie der
IC4 (0,12±0,11) signifikant verringert.
Abbildung 24: T-Maze mit BA (1:100)
Die Messungen wurden mit wildtypischen Fliegen durchgeführt oder mit F1-Nachkommen der
angezeigten Fliegenlinien x Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen gegenüber dem Wildtyp:
* = p ≤ 0,05; *** = p ≤ 0,001.
Zusätzlich zu den T-Maze-Messungen mit BA wurden auch Tests mit cHOH, einem
weiteren Liganden des Or43a, bei einer Verdünnung von 1:100 durchgeführt (siehe
Abbildung 25). Wie bei den BA-Messungen bewirkte die Expression der Domänen IC1, EC1,
EC2, EC3 und EC4 auch bei den cHOH-Messungen keine signifikante Abweichung vom
wildtypischen Verhalten. Zusätzlich war die Verringerung des RIs bei Expression der
Domäne IC4 mit 0,33±0,09 im Vergleich zum Wildtyp (0,47±0,04) nicht signifikant. Bei
Expression der Domäne IC3 trat, wie bei den Versuchen mit BA, ein verringerter RI auf. Mit
0,12±0,11 zeigten die Tiere ein fast indifferentes Verhalten, das vom wildtypischen hoch
signifikant abwich.
Während bei den beiden Linien, die IC2 zusammen mit IC4 exprimieren, bei BA eine
signifikante bis hoch signifikante Reduktion des RIs zu beobachten war, wirkte cHOH in der
1:100 Verdünnung wesentlich repellenter auf die Fliegen. Bei den Abkömmlingen von
IC2+4 (1-1) war der RI mit 0,81±0,05 hoch signifikant erhöht. Bei IC2+4 (3-1) war die
Erhöhung mit einem RI von 0,62±0,04 signifikant.
Ergebnisse
62
Abbildung 25: T-Maze mit cHOH (1:100)
Die Messungen wurden mit wildtypischen Fliegen durchgeführt, oder mit F1-Nachkommen der
angezeigten Fliegenlinien x Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen gegenüber dem
Wildtyp: * = p ≤ 0,05; *** = p ≤ 0,001.
Da die Versuche mit BA und cHOH bei jeweils einer 1:100 Verdünnung für die Fliegen,
die IC2 zusammen mit IC4 exprimieren, widersprüchliche Ergebnisse lieferten, wurde im
nächsten Schritt überprüft, ob die Konzentration von cHOH einen Einfluss auf das Verhalten
in den T-Maze-Untersuchungen hat (siehe Abbildung 26).
Beim Wildtyp nahm der RI mit steigender Verdünnung des Duftstoffes ab. Während der
Wildtyp bei einer 1:10 Verdünnung mit einem RI von 0,68±0,08 vom cHOH stark abgestoßen
wurde, sank der RI über 0,50±0,07 bei 5x10-2
, 0,47±0,04 bei 10-2
und 0,20±0,19 bei 5x10-4
auf -0,04±0,07 bei 10-4
, was einem indifferenten Verhalten entspricht. Ein ähnlicher Verlauf
zeigte sich auch bei Expression der IC4. Hier sank der RI von 0,67±0,09 bei 10-1
, über
0,54±0,03 bei 5x10-2
, 0,33±0,09 bei 10-2
und 0,18±0,03 bei 5x10-4
auf -0,16 bei 10-4
. Bei
Expression der IC2 zusammen mit der IC4 gab es bei der 1:10-Verdünnung (RI = 0,72±0,08)
und der 1:20 Verdünnung (RI = 0,61±0,04) keine signifikante Abweichung vom Wildtyp.
Anders verhielt es sich bei der 1:100 Verdünnung, bei der das Verhalten mit einem RI von
0,81±0,05 hoch signifikant repellenter als das des Wildtyps war. Der RI lag hier außerdem
höher als der RI bei der 10-1
-Konzentration. Bei einer Konzentration von 10-4
kehrte sich das
Ganze um. Auch hier lag ein verstärktes Verhalten vor, diesmal aber in die andere Richtung.
Ergebnisse
63
Während beim Wildtyp ein eher indifferentes Verhalten mit einem leicht negativen RI auftrat,
fand sich beim IC2+4 ein attraktives Verhalten mit einem negativen RI von -0,32±0,09.
Anders verhielt es sich bei Expression der IC3. Bei einer Konzentration von 1:10 (RI =
0,90±0,08) und 1:20 (RI = 0,66±0,07) lag der RI über dem des Wildtyps. Diese Erhöhung war
bei der 1:10 Verdünnung signifikant. Bei der 10-2
-Verdünnung kehrte sich das um und der RI
lag mit 0,12±0,11 hoch signifikant unter dem des Wildtyps. Bei weiterer Verdünnung auf
5x10-4
(RI = 0,12±0,04) und 10-4
(RI = 0,05±0,11) veränderte sich der RI kaum und näherte
sich damit dem indifferenten Wert des Wildtyps an.
Abbildung 26: T-Maze mit cHOH verschiedener Konzentrationen
Die Messungen wurden mit wildtypischen Fliegen durchgeführt, oder mit F1-Nachkommen der
angezeigten Fliegenlinien x Or83b-Gal4. Fehlerbalken = SEM. Signifikanzen gegenüber dem
Wildtyp: * = p ≤ 0,05; *** = p ≤ 0,001.
4.8 Die Elektroantennogramm-Kinetik wird durch die Expression
der Domänen beeinflusst
Sowohl die Ergebnisse der EAG-Messungen als auch die Ergebnisse der
Verhaltensversuche zeigen, dass die Expression der Domänen die olfaktorischen Reaktionen
der Tiere verändert. In der Veröffentlichung von Wicher et al. (2008) wurde neben der
direkten schnellen Übertragung des Signales vom OR zum Or83b eine langsamere
Ergebnisse
64
Signalkaskade über G-Proteine und zyklische Nukleotide vermutet, die ein länger
andauerndes Signal auslöst. Bei der Störung dieses Signalweges wäre im EAG eine schnellere
Reizantwort zu erwarten. Andersherum wäre bei der Störung der direkten Signalübertragung
vom OR zum Or83b ein verlangsamtes Signal zu erwarten. Um zu überprüfen, ob eine
zeitliche Veränderung der Signalantwort bei Expression der Domänen in den ORNs auftritt,
wurde die Kinetik der EAG-Messungen untersucht. Anhand des Or43a-Liganden cHOH
wurden die EAG-Messungen bei Expression der intrazellulären Domänen sowie der
extrazellulären Domäne EC4 ausgewertet. Hierzu wurden die Anstiegszeiten zwischen dem
Beginn der Reizantwort und dem Erreichen von zwei Dritteln der maximalen Amplitude
ausgelesen. Weiterhin wurde die Abklingzeit zwischen dem Beginn der Repolarisation und
dem Rückgang bis auf ein Drittel zurück zum Ruhepotential ermittelt. Die Abbildung 27 zeigt
als Beispiel hierfür die EAG-Kurven von IC3-exprimierenden Fliegen [IC3 (45-1) x
Or83b-Gal4] und wildtypischen Fliegen. Die Stromkurven stellen den Durchschnitt aus
jeweils zehn Messungen dar. Bei den IC3-exprimierenden Fliegen ist die Anstiegszeit bis auf
zwei Drittel der Amplitude mit t 2/3 = 0,271±0,019 s (Mittelwert ± SEM) nur 0,060 s
langsamer als beim Wildtyp. Die Abklingzeit bis auf 1/3 der Amplitude ist mit
t 1/3 = 0,569±0,026 s 0,240 s langsamer als bei wildtypischen Fliegen.
Abbildung 27: EAG-Kinetik bei Expression der IC3
Bei Expression der Domäne IC3 (blau) sind sowohl die Anstiegszeit bis 2/3 der Amplitude (t 2/3) als
auch die Abklingzeit nach Applikation von cHOH bis zurück auf 1/3 der Amplitude (t 1/3) im
Vergleich zum Wildtyp (schwarz) verlängert. Die Kurven zeigen Durchschnittswerte von je zehn
Messungen. Die Markierungen zu t 2/3 und t 1/3 beziehen sich auf die IC3-exprimierenden Tiere
[IC3 (45-1) x Or83b-Gal4]. Der Balken oberhalb der Kurven zeigt die Applikationsdauer des cHOH.
Ergebnisse
65
Die Anstiegszeiten t 2/3 der verschiedenen Fliegenlinien sind in Abbildung 28
dargestellt. Die zugehörigen Werte für den Median sowie die Mittelwerte mit SEM sind in
Tabelle 4 zusammengefasst. Bei Expression der IC4 [IC4 (4-1) x Or83b-Gal4] bzw. der EC4
[EC4 (13-1) x Or83b-Gal4] stimmte die Anstiegszeit mit der des Wildtyps (0,211±0,008 s;
Median = 0,205 s) bis auf ≤ 0,01 s überein.
Abbildung 28: Anstiegszeiten bei Stimulation mit cHOH
In dem Boxplot sind die Anstiegszeiten bis zu 2/3 der maximalen Amplitude von je mindestens 10
EAG-Messungen mit cHOH dargestellt. Die verwendeten Fliegen sind der Wildtyp bzw. F1-
Nachkommen der angezeigten Linien x Or83b-Gal4. Signifikanz gegenüber dem Wildtyp: ** = p ≤
0,01.
Tabelle 4: Anstiegszeiten (t 2/3) und Abklingzeiten (t 1/3) von EAG-Messungen wildtypischer
Fliegen oder von F1-Nachkommen verschiedener Fliegenlinien x Or83b-Gal4
Linie Wildtyp IC1
(35-1)
IC2+4
(3-1)
IC2+4
(1-1)
IC3
(45-1)
IC4
(4-1)
EC4
(13-1)
t 2/3
Median 0,205 0,250 0,230 0,225 0,260 0,200 0,215
Mittelwert 0,211 0,246 0,234 0,214 0,271 0,216 0,218
SEM 0,008 0,022 0,016 0,011 0,019 0,013 0,010
t 1/3
Median 0,345 0,300 0,400 0,340 0,570 0,365 0,345
Mittelwert 0,329 0,331 0,427 0,340 0,569 0,385 0,340
SEM 0,015 0,036 0,048 0,029 0,026 0,024 0,014
Ergebnisse
66
Bei den Tieren, die die IC1 exprimierten [IC1 (35-1) x Or83b-Gal4], sowie bei
Expression von IC2 und IC4 zusammen [IC2+4 (3-1) x Or83b-Gal4] und [IC2+4 (1-1) x
Or83b-Gal4], waren die Anstiegszeiten leicht erhöht, es lag aber kein statistischer Unterschied
zum Wildtyp vor. Bei Expression der IC3 [IC3 (45-1) x Or83b-Gal4] war die Anstiegszeit
sehr signifikant erhöht. Der Median betrug hier 0,260 s, der Mittelwert 0,271±0,019 s.
Im Gegensatz zu den Anstiegszeiten traten bei den Abklingzeiten nicht nur bei Fliegen,
die IC3 exprimieren, signifikante Abweichungen vom Wildtyp auf (siehe Abbildung 29 und
Tabelle 4). Bei Expression der IC3 war mit einem Median von 0,570 s ein hoch signifikanter
Unterschied zum Wildtyp (Median t 1/3 = 0,345 s) festzustellen. Bei Expression der IC4 lag
eine signifikant verlängerte Abklingzeit vor (Median t 1/3 = 0,365 s). Die Nachkommen von
IC2+4 (3-1) zeigten ebenfalls eine signifikant verlängerte Abklingzeit (Median t 1/3 =
0,400 s). Bei einer zweiten Linie, welche die zweite und vierte intrazelluläre Domäne
exprimiert, sah das Ergebnis anders aus: Bei den Abkömmlingen von IC2+4 (1-1) entsprach
t 1/3 mit einem Median von 0,340 dem Wildtyp.
Abbildung 29: Abklingzeiten bei Stimulation mit cHOH
In dem Boxplot sind die Abklingzeiten bis zu 1/3 der maximalen Amplitude von je mindestens 10
EAG-Messungen mit cHOH dargestellt. Die verwendeten Fliegen sind der Wildtyp bzw. F1-
Nachkommen der angezeigten Linien x Or83b-Gal4. Signifikanzen gegenüber dem Wildtyp: * = p ≤
0,05; *** = p ≤ 0,001.
Ergebnisse
67
Die Expression der IC1 führte zu keiner signifikanten Abweichung der Abklingzeit. Mit
einem Median von t 1/3 = 0,300 s war sie etwas kürzer als beim Wildtyp. Bei Fliegen,
die EC4 exprimierten, stimmte t 1/3 exakt mit der Zeit wildtypischer Tiere überein (Median
t 1/3 = 0,345)
4.9 Expression der EC4 im Auge führt zu verringerten Amplituden
im Elektroretinogramm
Bei den ORNs ist bislang nicht eindeutig bewiesen, dass G-Proteine einen Anteil an der
Signaltransduktion der olfaktorischen Reize besitzen. Beim Auge dagegen ist eine G-Protein-
vermittelte Signalkaskade nachgewiesen (Fein et al., 1984; Devary et al., 1987; Baer und
Saibil, 1988; Bloomquist et al., 1988; Richardt, 2003). Im Falle einer G-Protein-gekoppelten
Signaltransduktion in der Antenne wäre zu erwarten, dass die Expression der Or43a-Domänen
im Auge eine Auswirkung auf die Reizübermittlung hat. Um dies zu überprüfen, wurde die
Domäne EC4 mit zwei augenspezifischen Treiberlinien (Ret.44 und Ret.53) exprimiert. Bei
den ERG-Ableitungen wurden die Stromlinien aufgezeichnet und sowohl das Rezeptor-
potential als auch die „Ein“- und „Aus“-Transienten ausgemessen (siehe Abbildung 30). Die
Mittelwerte der Rezeptorpotentiale sind in Abbildung 31 dargestellt. Die Amplituden der IC4-
exprimierenden Fliegen waren bei allen Farben, außer bei rot, reduziert. Während die
Abweichungen vom Wildtyp bei weißem, grünem und gelbem Licht nicht statistisch
signifikant waren, lag bei blauem Licht eine signifikante Erniedrigung mit 8,06±0,81 mV
(Ret.44 getrieben) bzw. 8,07±0,69 mV (Ret.53 getrieben) vor. Beim Wildtyp betrug das
Rezeptorpotential bei Blaulicht 12,18±1,57 mV.
Im Gegensatz zu den Rezeptorpotentialen waren die „Ein“- und „Aus“-Transienten
neben Blaulicht auch bei weiteren Lichtqualitäten zum Wildtyp signifikant verändert. Bei den
„Ein“-Transienten (siehe Abbildung 32) gab es bei Rotlicht mit 0,95±0,16 mV bzw.
0,84±0,19 mV jeweils hoch signifikant reduzierte Werte im Vergleich zum Wildtyp
(2,96±0,24 mV). Bei grünem Licht schienen bei den Nachkommen beider Kreuzungen die
„Ein“-Transienten verglichen mit dem Wildtyp (1,27±0,24 mV) reduziert. Diese Reduktion
war allerdings nur bei den Nachkommen der Treiberlinie Ret.53 mit 0,48±0,15 mV
signifikant. Bei blauem Licht waren die Werte bei beiden Linien mit 0,50±0,17 mV und
0,62±0,14 mV sehr signifikant verringert (Wildtyp: 0,82±0,28 mV). Bei weißem und gelbem
Licht fanden sich keine signifikanten Abweichungen der „Ein“-Transienten.
Ergebnisse
68
Abbildung 30: ERG mit Blaulicht bei Expression der EC4
Bei Stimulation mit Blaulicht (blauer Balken) zeigt der Wildtyp (schwarze Kurve) im ERG zunächst
eine „Ein“-Transiente, gefolgt vom Rezeptorpotential. Bei Beendigung des Lichtreizes erscheint eine
kurze „Aus“-Transiente, die in die Repolarisation über geht. Bei Expression der EC4 im Auge (rote
Kurve) sind sowohl das Rezeptorpotential als auch die beiden Transienten verringert. Dargestellt sind
jeweils Messungen an einzelnen Fliegen. Die rote Kurve stammt von einem Tier der F1-Generation der
Kreuzung [EC4 (13-1) x Ret.53].
Abbildung 31: ERG-Rezeptorpotentiale bei Expression der EC4
Dargestellt sind die mittleren Rezeptorpotentiale des Wildtyps bzw. von F1-Nachkommen der
angezeigten Kreuzungen. Diese F1-Nachkommen exprimieren EC4 in der Retina.
Signifikanz gegenüber dem Wildtyp: * = p ≤ 0,05.
Ergebnisse
69
Abbildung 32: „Ein“-Transienten im ERG bei Expression der EC4
Dargestellt sind die mittleren „Ein“-Transienten des Wildtyps bzw. von F1-Nachkommen der
angezeigten Kreuzungen. Signifikanzen gegenüber dem Wildtyp: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; *** =
p≤ 0,001.
Bei den „Aus“-Transienten (siehe Abbildung 33) traten bei allen fünf Lichtqualitäten
signifikant bis hoch signifikant verringerte Werte auf, wobei es hier je nach Treiberlinie
Unterschiede gab. Bei den Nachkommen von Ret.44 lagen bei allen fünf Farben signifikante
Abweichungen vor. Während bei Grün nur eine einfache Signifikanz auftrat (2,01±0,45 mV
gegenüber 3,87±0,56 mV beim Wildtyp), gab es bei weißem Licht mit 2,21±0,47 mV
(Wildtyp: 4,94±0,54 mV) und blauem Licht mit 2,08±0,56 mV (Wildtyp: 4,38±0,45 mV) sehr
signifikant verringerte „Aus“-Transienten. Bei rotem (2,29±0,51 mV gegenüber
4,06±0,52 mV beim Wildtyp) und gelbem Licht (1,83±0,48 mV gegenüber 4,41±0,36 mV
beim Wildtyp) waren die Reduktionen sogar hoch signifikant.
Bei den Nachkommen von [EC4 (13-1) x Ret.53] traten auch bei allen Farben reduzierte
„Aus“-Transienten auf; es gab aber bei weißem und rotem Licht keine Signifikanz. Bei
grünem (2,24±0,38 mV) und gelbem Licht (2,65±0,50 mV) lag eine einfache Signifikanz vor,
während bei blauem Licht mit 2,23±0,27 mV eine hoch signifikante Erniedrigung vorlag.
Ergebnisse
70
Abbildung 33: „Aus“-Transienten im ERG bei Expression der EC4
Dargestellt sind die mittleren „Aus“-Transienten des Wildtyps bzw. von F1-Nachkommen der
angezeigten Kreuzungen. Signifikanzen gegenüber dem Wildtyp: * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; *** =
p≤ 0,001.
Diskussion
71
5 Diskussion
5.1 Expressionsmuster der Domänen IC2 und IC4
Ziel dieser Arbeit war es, zu überprüfen, ob die Expression der intra- und extrazellulären
Domänen des Or43a in den ORNs einen Einfluss auf das Riechvermögen der Tiere besitzt.
Auftretende Veränderungen könnten Rückschlüsse auf eine mögliche Bedeutung der Domäne
für die Signaltransduktion erlauben. Deshalb war es zunächst erforderlich, soweit nicht bereits
in Vorarbeiten geschehen, Fliegenlinien zur Expression der Domänen herzustellen und die
Expression zu überprüfen: Die Domänen IC2 und IC4 wurden in Responderlinien des Gal4-
Systems eingebaut (siehe Kapitel 4.1.1und 4.1.2). Die Aktivierung der Expression erfolgte
durch Kreuzung mit der ORN-spezifischen Treiberlinie Or83b-Gal4. Somit wurde eine ORN-
spezifische Expression der Domänenfragmente erwartet, wie sie auch bei Antikörper-
Reaktionen in der Antenne exprimierter Proteine oder Rezeptor-Fragmente beobachtet wurde
(Benton et al., 2006; Lange, 2007). Eine solche Verteilung der Fluoreszenz trat nach der
Antikörper-Färbung auf (siehe Abbildung 12 und 13). Die Nutzung der Treiberlinie Or83b-
Gal4 sowie die Verteilung der Fluoreszenz innerhalb der Antenne sprechen dafür, dass die
markierten Strukturen die ORNs sind. Ein biochemischer Beweis hierfür steht allerdings noch
aus. Eine Doppelfärbung mit einem alternativen Antikörper führte auf Grund unspezifischer
Färbungen nicht zum Ziel.
Da die exprimierten Rezeptorfragmente keine Transmembran-Sequenz enthalten sollten,
wurde erwartet, dass die Fragmente zunächst zytoplasmatisch gebildet werden. Dieses
bedeutet aber nicht, dass eine zytoplasmatische Lokalisation der Domänen vorliegen musste.
Bei den verschiedenen potentiellen Bindungspartnern waren verschiedene Lokalisationen
innerhalb der Zelle möglich. Durch Bindung der Domänen an membranständige Proteine oder
Transmembranproteine hätten zusätzlich zum Zytoplasma Zellmembranen angefärbt sein
können. Aus den Arbeiten von Neuhaus et al. (2005) und Benton et al. (2006) ist bekannt,
dass der Or43a sowohl Homodimere als auch Heterodimere mit dem Or83b bilden kann.
Dabei werden die Dimere nur bei Anwesenheit des Or83b in die Dendriten der ORNs
transportiert.
Bei Bindung der exprimierten Domänen an den OR oder den Or83b hätten die
Fragmente mit in die Dendriten transportiert werden können und dies zur Anreicherung der
Fluoreszenz in den Schäften der Sensillen geführt. Eine zweite Möglichkeit wäre nach
Diskussion
72
Bindung an den OR oder an den Or83b eine Störung des Transports in die Sensillenschäfte. In
diesem Fall könnte sich der Komplex aus dem exprimierten Fragment und OR und/oder
Or83b in den inneren Membransystemen anreichern.
Bei einer Bindung der Fragmente an zytosolische Komponenten, wie z.B Gα oder
Arrestine könnten diese innerhalb des Zytoplasmas aggregieren. Wahrscheinlicher wäre aber
bei der Bindung an zytosolische Komponenten eine gleichmäßige Verteilung der gebundenen
Fragmente. Solch eine gleichmäßige Verteilung im Zytosol fand sich in der vorliegenden
Arbeit. Deshalb waren eventuell die Fragmente an zytosolische Komponenten gebunden, die
Fragmente ungebunden oder die Menge an gebundenen Fragmenten machte nur einen kleinen
Anteil der exprimierten Domänen aus. Es können daher durch die Expressionsmuster keine
Aussagen über mögliche Interaktionspartner getroffen werden. Hervorzuheben ist aber die
erfolgreiche Expression der Domänen IC2 und IC4.
Die erfolgreiche Expression der Domäne IC4 bestätigt auch die qRT-PCR (siehe Kapitel
4.1.3). Bei dieser quantitativen Analyse war die mRNA der IC4 in einer etwa 25x höheren
Konzentration in der Antenne vorhanden als die Or43a-mRNA (siehe Abbildung 15 B).
5.2 Kompetitive Hemmung durch Expression der Or43a-Domänen
Olfaktorische Rezeptoren müssen verschiedene Bindungen eingehen, um ihre Funktion
ausführen zu können. Zum einen müssen Agonisten an der extrazellulären Seite gebunden
werden, um ein Signal auszulösen, zum anderen muss dieses Signal durch gebundene
Komponenten zu einem intrazellulären Signal umgewandelt werden. Bei den ORs von
Drosophila ist eine dieser Komponenten der Or83b, der mit dem regulären OR zusammen
einen ionotropen Rezeptorkomplex bildet (Sato et al., 2008; Wicher et al., 2008). Weitere
mögliche Komponenten sind die Bestandteile der G-Protein-gekoppelten Signalkaskade
(Breer et al., 1990; Boekhoff et al., 1993; Wegener et al., 1993; Riesgo-Escovar et al., 1995;
Wetzel et al., 2001; Neuhaus et al., 2005; Wicher et al., 2008). Diese Interaktionen geschehen
auf Grund der Topologie mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit an den Domänen der Rezeptoren,
die nicht die Membran durchziehen. Durch die Expression der intrazellulären und
extrazellulären Domänen des Or43a in den ORNs geraten diese in Konkurrenz zu den nativen
Domänen um die Bindungsstellen der verschiedenen Komponenten.
Ein ähnlicher Ansatz, bei dem durch kompetitive Hemmung nach funktionellen
Bereichen eines Proteins gesucht wurde, erfolgte für die Alpha-Untereinheiten von
G-Proteinen. Die Expression eines C-terminalen Bereiches von Gα beeinflusste die
Signaltransduktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Das exprimierte Peptid
Diskussion
73
interagierte mit dem Rezeptor und verhinderte durch kompetitive Hemmung die
Signalweitergabe (Hamm et al., 1988; Rasenick et al., 1994; Akhter et al., 1998; Gilchrist et
al., 1999; Yao und Carlson, 2010). In gleicher Weise könnten die exprimierten Domänen des
Or43a eine kompetitive Hemmung bewirken und eine veränderte olfaktorische Reizantwort
hervorrufen.
5.2.1 Bei den extrazellulären Domänen bewirkt nur die Expression der
EC4 Veränderungen im EAG
Die Domänen EC1, EC2, EC3 und EC4 des Rezeptors Or43a befinden sich auf der
Außenseite der Zellmembran (Benton et al., 2006). Hiermit sind sie nicht zugänglich für
intrazelluläre Komponenten der Signalkaskade wie G-Proteine, Arrestine und Proteinkinasen.
Es sollten keine Bindungsstellen zu diesen Komponenten bestehen. Nur Bestandteile der
Signalkaskade, wie der Or83b, die auch einen extrazellulären Anteil besitzen, könnten an
diesen Regionen binden: Bei der Expression der extrazellulären Domänen mit Hilfe der
Treiberlinie Or83b, reichern sich die Domänen im Zytoplasma an (Lange, 2007). Somit sind
sie nicht zugänglich für externe Faktoren wie Duftstoffe und Odor-binding Proteine.
Aufgrund fehlender Bindungsstellen können die drei Fragmente also nicht an interne
Komponenten der Signalkaskade binden und aufgrund der intrazellulären Expression nicht an
extrazelluläre Komponenten. Die einzige bekannte Komponente, mit der Wechselwirkungen
erwartet werden könnten, ist der Or83b. Der Or83b bindet bereits früh im inneren
Membransystem an den jeweiligen OR und ermöglicht den Transport des Komplexes in die
ziliäre Membran des ORNs (Benton et al., 2006). Bereits im Membransystem des
endoplasmatischen Retikulums und Golgi-Apparates könnten die exprimierten Domänen an
den Or83b binden und ihn durch kompetitive Hemmung für den OR unzugänglich machen. Es
wäre eine veränderte Reizantwort im EAG zu erwarten, welche sich auch auf olfaktorische
Verhaltensversuche auswirken könnte.
Bei den Domänen EC1, EC2 und EC3 fand sich keine Veränderung im EAG (siehe
Abbildung 16-18). Es traten hier zwar einzelne einfach signifikante Unterschiede zum Wild-
typ auf, aber die Häufigkeit dieser Abweichungen lag im Bereich der Fehlerwahrscheinlich-
keit: Bei einem Signifikanzniveau von p = 0,05 sind bei EC1 ohne Abweichung des Riech-
vermögens 1,95 positive Signifikanzen zu erwarten, aufgetreten sind zwei. Bei Expression der
Domänen EC2 und EC3 sind jeweils 1,3 positive Signifikanzen zu erwarten, aufgetreten ist
jeweils eine. Die unveränderte olfaktorische Wahrnehmung bei Expression der EC1, EC2 und
Diskussion
74
EC3 spiegelt sich auch in den T-Maze-Untersuchungen wieder (siehe Abbildung 24 und 25).
Bei keiner der drei Domänen war das olfaktorische Verhalten verändert.
Die EAG-Ergebnisse sowie die T-Maze-Resultate lassen vermuten, dass es sich bei den
Domänen nicht um Bereiche des Or43a handelt, die an der Signalweitergabe vom Rezeptor an
Komponenten der Signalkaskade beteiligt sind. Für die Domäne EC2 entspricht dieses
Ergebnis den Resultaten von Nichols und Luetje (2010), die beim Or85b der EC2 eine Rolle
bei der Ligandenbindung zuordneten. Obwohl die Ergebnisse auf keinerlei Funktion der drei
Domänen bei der Signalweitergabe vom Rezeptor an nachgeschaltete Komponenten
hindeuten, lassen sich Bindungsstellen zum Or83b nicht ausschließen. Da die Domänen im
Rezeptor extrazellulär liegen, die Domänenfragmente aber intrazellulär exprimiert werden, ist
es möglich, dass die Fragmente nicht an extrazelluläre Bindungsstellen gelangen. Einen
Hinweis, dass sie nicht an den Or83b binden, liefern die Ergebnisse bei Expression der
Domäne EC4 (siehe unten).
Im Gegensatz zu den ersten drei extrazellulären Domänen tritt bei EC4 eine
Veränderung im EAG auf: Die Reizantworten liegen, verglichen mit denen des Wildtyps,
generell höher (siehe Abbildung 19). Die erhöhten Reizantworten treten bei beiden getesteten
Fliegenlinien und bei allen verwendeten Duftstoffen auf, auch wenn sie nicht bei allen
Messungen signifikant sind. Bei einigen Messungen sind die Unterschiede aber sogar sehr
signifikant bis hoch signifikant. Auch wenn bei den EC4-exprimierenden Nachkommen der
Linie EC4 (13-1) eine einfach signifikant erhöhte Reizantwort bei der Applikation von
Paraffin aufgetreten ist, lassen sich die sehr signifikanten bis hoch signifikanten Erhöhungen
bei den Messungen mit Duftstoffen nicht durch einen methodischen Fehler erklären. Da die
exprimierten EC4-Fragmente keine Möglichkeit haben, an extrazelluläre Komponenten zu
binden, wirken sie wahrscheinlich auf den Or83b und die EC4 oder ein Teil der EC4 stellt
eine Or83b-Binderegion dar. Unerwartet ist allerdings, dass die Amplituden der EAG-
Messungen erhöht und nicht erniedrigt sind. Bei einer kompetitiven Hemmung der
Verbindung von OR und Or83b durch das Domänenfragment und somit einer Störung der
direkten Signalübertragung vom OR auf den Or83b wäre eher eine verringerte Reizantwort zu
erwarten. Möglich ist, dass durch die Expression der EC4 die Zusammensetzung der OR-
Or83b Komplexe verändert ist. Sowohl im heterologen Zellsystem als auch bei Protein-
fragment-Komplementationsversuchen in vivo bildeten sich nicht nur OR-Or83b-Komplexe,
sondern auch Komplexe, die nur aus dem OR bestanden (Wetzel et al., 2001; Neuhaus et al.,
2005; Benton et al., 2006). Ebenso zeigten Proteinfragment-Komplementationsversuche, dass
der Or83b selber Homodimere bilden kann. Diese Bildung der Homodimere verhindert nicht
Diskussion
75
den Transport der OR-Or83b-Komplexe in die ziliäre Membran (Benton et al., 2006). Deshalb
dürfte es sich bei den Komplexen wahrscheinlich um Heterodimere aus jeweils mehreren OR-
und Or83b-Einheiten handeln. Durch die zusätzliche Expression der Domäne EC4 könnte die
Stöchiometrie zugunsten des Or83b verändert sein, so dass mehr Ionen durch die Membran
geleitet werden können und die EAG-Amplitude erhöht ist.
Für die erhöhten EAG-Werte könnten aber auch andere Faktoren verantwortlich sein.
Einen Hinweis hierfür liefern die elektrophysiologischen Messungen am Auge bei EC4-
Expression. Auch hier sind die Amplituden verändert. Da im Auge kein Or83b vorkommt,
kann diese Reduktion der Reizantworten nicht auf einer Bindung der Domäne an den Or83b
beruhen. Es gibt zwei mögliche Erklärungen hierfür: Entweder besitzt die EC4 keine
Binderegion für den Or83b oder sie besitzt eine Binderegion für den Or83b, wirkt aber im
Auge auf eine andere Art und Weise. Die These, dass die EC4 im Auge auf eine andere Weise
wirkt als in der Antenne, wird von der Tatsache gestützt, dass im Auge die Reizantworten
reduziert, hingegen in der Antenne erhöht waren.
Im Gegensatz zu den elektrophysiologischen Messungen traten bei den
Verhaltensversuchen mit EC4 sowohl bei BA als auch bei cHOH, jeweils in einer 1:100
Verdünnung, keine signifikanten Differenzen zum Wildtyp auf. Trotz der größeren Amplitude
der Signale von der Antenne war die Verhaltensreaktion nicht verändert. Dennoch stellen die
Ergebnisse keinen Widerspruch dar, da das Verhalten unabhängig von den Signalen der
ORNs ist und aus den verarbeiteten Signalen im Gehirn resultiert. Da die Eingangssignale im
Antennenlobus und den höheren Hirnregionen verrechnet werden, ist neben der Quantität vor
allem auch die Qualität der Signale entscheidend (Silbering et al., 2011).
In Versuchen, bei denen der Or43a zusätzlich in der Antenne exprimiert wurde, erzielte
BA in einer Konzentration von 10-3
ein EAG-Signal, das dem des Wildtyps entsprach. Im
Gegensatz dazu löste die gleiche Konzentration des Duftstoffes im T-Maze ein verändertes
Verhalten aus (Störtkuhl und Kettler, 2001; Störtkuhl et al., 2005). Der Verhaltensversuch ist
bei diesen Bedingungen also sensitiver, als das EAG. Die höhere Sensitivität des Verhaltens
lässt sich dadurch erklären, dass die Eingangssignale im zentralen olfaktorischen System
verarbeitet werden. Selbst kleine Unterschiede in den eingehenden Signalen, die
elektrophysiologisch nicht detektiert werden können, führen eventuell nach Verrechnung der
verschiedenen Eingänge zu einem veränderten Verhalten. In anderen Versuchen, bei denen
der Or43b durch gezielte Genmodifikation ausgeschaltet war, fehlten die Reizantworten in
elektrophysiologischen Messungen; das Verhalten der Tiere war aber nicht beeinflusst
(Elmore et al., 2003). In diesem Fall sind die elektrophysiologischen Messungen sensitiver als
Diskussion
76
der Verhaltensversuch. Bei Expression der EC4 in den ORNs scheint ebenfalls die
Elektrophysiologie sensitiver als der T-Maze zu sein.
Da bei Expression der EC4 das EAG verändert ist, ist es unwahrscheinlich, dass die
anderen extrazellulären Domänen eine Binderegion für den Or83b besitzen, diese aber auf
Grund der Topologie in der Membran nicht zum Greifen kommen. Von den extrazellulären
Domänen scheint somit nur die EC4 eine Bedeutung für die Signalweitergabe vom Rezeptor
an nachgeschaltete Komponenten zu besitzen.
5.2.2 Die Expression der Domäne IC1 bewirkt einen wildtypischen
Phänotyp
Auf Grund der intrazellulären Lage der Domänen IC1, IC2, IC3 und IC4 kommen diese
als Interaktionsstellen mit Komponenten der Signalkaskade in Frage, die sich im Plasma des
ORNs oder an der Membraninnenseite befinden. Diese Interaktionen könnten durch die
Expression der Domänenfragmente gestört werden und die Geruchswahrnehmung verändern.
Bei Expression der IC1 fand sich solch ein Effekt weder beim EAG noch im
Verhaltensversuch: Die Reizantworten beim EAG entsprachen denen des Wildtyps (siehe
Abbildung 20). Mit drei einfach signifikanten Abweichungen vom Wildtyp, einer
Verringerung und zwei Erhöhungen, lag das Ergebnis leicht über den statistisch zu
erwartenden 1,95 signifikanten Werten. Da eine der Erhöhungen dabei noch die Kontrolle mit
Paraffinöl betraf, sind für die Duftstoffe nur noch eine Erhöhung und eine Erniedrigung zu
verzeichnen. Es muss daher davon ausgegangen werden, dass sich die Fliegenlinien nicht vom
Wildtyp unterscheiden.
Beim Verhaltensversuch stimmten die Werte ebenfalls mit denen des Wildtyps überein.
Weder bei BA (1:100) noch beim cHOH (1:100) traten signifikante Abweichungen der RIs
auf (siehe Abbildung 24 bzw. 25). Die Expression der IC1 bewirkte also weder im EAG noch
im Verhaltensversuch eine Veränderung, so dass kein Hinweis auf eine kompetitive
Hemmung durch die IC1 offensichtlich ist. Die IC1 stellt somit wahrscheinlich keine
Binderegion für eine Komponente der Signalkaskade dar.
5.2.3 IC3 als potentielle Verbindung zum G-Protein
Bei Expression der IC3 veränderten sich im EAG die Amplituden nicht eindeutig.
Dennoch traten bei einigen Messungen Auffälligkeiten auf (siehe Abbildung 21): So waren
beim Duftstoff DES bei beiden gemessenen Linien die Amplituden reduziert. Bei [IC3 (5-1) x
Or83b-Gal4] war diese Reduktion signifikant, bei [IC3 (45-1) x Or83b-Gal4] sogar hoch
signifikant. Bei den Nachkommen von IC3 (45-1) trat außerdem noch bei MeSa eine sehr
Diskussion
77
signifikante Verringerung auf. Dies ist aber nicht eindeutig einer verringerten Reizantwort
zuzusprechen, da auch schon bei Paraffinöl eine sehr signifikante Reduktion auftrat.
Insgesamt ergibt sich bei den Messungen ein inhomogenes Bild: Es gibt einige erhöhte und
einige erniedrigte Werte, wobei die Standardfehler oft relativ groß sind. Die Frage dabei ist,
ob die veränderten Amplituden auf einem erhöhten Fehler bei der Versuchsdurchführung
beruhen oder ob die erhöhten Standardfehler auf Veränderungen in der Reizantwort beruhen.
Für die zweite These sprechen die starken Signifikanzen bei den Messungen mit DES und
MeSa. Für die erste These spricht, dass bei [IC3 (45-1) x Or83b-Gal4] auch die Reaktion auf
Paraffinöl sehr signifikant verringert war und dass sich die Veränderungen weder an den
Liganden des Or43a manifestieren ließen noch in der Art der Veränderung eine einheitliche
Linie vorlag: Bei einem generell wirkenden Mechanismus müsste bei allen Duftstoffen eine
Erniedrigung oder eine Erhöhung auftreten. Dieses war aber nicht der Fall.
Trotz der Hinweise, dass es sich bei den veränderten EAG-Amplituden um „Ausreißer“
handelt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass dies der tatsächliche Phänotyp ist. Eventuell
beeinflusst die Expression des IC3-Fragmentes nur einen Teil der ORNs und daher werden
nur einzelne Duftstoffe verändert wahrgenommen. Dies würde in das Bild passen, das die
Kontroverse zu der Bedeutung von G-Proteinen für die Signaltransduktion hinterlassen hat.
Kalidas und Smith (2002) und Kain et al. (2008) betonen, dass bei der Inaktivierung von Gα-
Untereinheiten durch RNAi bzw. Genmutation die elektrophysiologischen Reizantworten auf
verschiedene Duftstoffe herabgesetzt sind. Im Gegensatz dazu finden Yao und Carlson (2010)
keine Veränderung der Geruchswahrnehmung nach Mutagenese oder RNAi der α-
Untereinheiten in einzelnen Neuronen. Möglicherweise liegen, je nach Neuron,
unterschiedliche Übertragungsmechanismen vor. Hiermit könnte erklärt werden, weshalb nur
bei einzelnen Duftstoffen veränderte EAG-Signale auftraten.
Im Verhaltenstest ist das Ergebnis wesentlich eindeutiger als beim EAG. Bei Expression
der IC3 traten sowohl bei BA (1:100) als auch bei cHOH (1:100) jeweils signifikant
reduzierte RIs auf (siehe Abbildung 24 bzw. 25). Beide Duftstoffe wirkten somit in dieser
Konzentration weniger abstoßend auf die IC3 exprimierenden Tiere als auf den Wildtyp. Bei
den T-Maze-Versuchen mit verschiedenen cHOH-Konzentrationen veränderte sich das
Ergebnis mit zunehmender Verdünnung (siehe Abbildung 26). Bei 10-1
war der RI signifikant
höher als beim Wildtyp. Bei 5 x 10-2
näherte sich der RI dem wildtypischen an und sank dann
bei 10-2
auf fast Null ab, was einem indifferenten Verhalten entspricht. Dort blieb der RI auch
bei den größeren Konzentrationen, während er beim Wildtyp erst bei 10-4
den indifferenten
Bereich erreichte. Die Expression der IC3 schien die Empfindlichkeit zu reduzieren. Dies trat
Diskussion
78
auf, obwohl das EAG bei cHOH kaum Unterschiede zum Wildtyp aufwies. Eine mögliche
Ursache dafür, dass der T-Maze bei Expression der IC3 empfindlicher war als das EAG, kann
in der Duftstoffkonzentration gesucht werden. Beim EAG wurde ein Reinstoff verwendet.
Damit könnte sich das System beim EAG in der Sättigung befunden haben und es waren nur
geringe Veränderungen sichtbar. Bei anderen Duftstoffen könnte das System weiter entfernt
von der Sättigung gewesen sein. Dieses wäre ein weiterer Erklärungsansatz für die EAG-
Unterschiede zum Wildtyp, z.B. beim Duftstoff DES.
Eine weitere mögliche Erklärung dafür, dass das Verhalten bei Expression der IC3
verändert war, während beim EAG wildtypische Amplituden auftraten, könnte in der
Applikationszeit zu suchen sein. Während beim EAG der Duftstoff für eine Sekunde
appliziert wurde, waren die Tiere beim T-Maze dem Duftstoff für 30 Sekunden ausgesetzt.
Entscheidend könnte also auch der zeitliche Verlauf der ORN-Aktivierung sein. Nach dem
Model von Wicher et al. (2008) ist für die Signalübertragung direkt vom OR zum Or83b zu
erwarten, dass das Signal sehr schnell weitergegeben wird und nach Beendigung des Reizes
auch schnell wieder beendet wird. Für den zweiten Signalweg über G-Proteine und zyklische
Nukleotide wird eine langsamere Signalweitergabe erwartet, die dafür aber ein länger
andauerndes Signal erzeugt.
Entgegen dem Modell von Wicher et al. (2008) führt der Signalweg über G-Proteine und
zyklische Nukleotide eventuell aber auch zu sehr schnellen Signalen. Das beste Beispiel für
solch eine schnelle Signalweitergabe ist das optische System, in dem das heptahelikale
Transmembranprotein Rhodopsin zusammen mit G-Proteinen und den Komponenten einer
IP3-vermittelten Signalkaskade für eine sehr schnelle Signalweitergabe mit einer Latenzzeit
von 20-100 ms verantwortlich ist (Hardie, 2001). Der Ausfall eines Genes dieser Kaskade,
rdgB, dessen Genprodukt Phosphatidylinositol-Transferprotein benötigt wird, um IP3 für die
Signalkaskade zur Verfügung zu stellen, führt auch im olfaktorischen System zu einem
Phänotyp: Obwohl die Amplituden von EAG-Messungen an rdgB-defizienten Fliegen dem
Wildtyp entsprechen, ist die Kinetik dieser Messungen verändert. Sowohl die Anstiegszeiten
auf 2/3 der Amplitude als auch die Abklingzeiten bis auf 1/3 zurück zum Ruhepotential sind
verlängert. Dabei hängt das Ausmaß dieser Verlängerung von der Konzentration ab: Je kleiner
die Konzentration des Duftstoffes ist, desto mehr sind die Zeiten verlängert (Alcorta, 1991;
Woodard et al., 1992; Hardie, 2001). Bei Expression der IC3 könnte daher die Kinetik der
EAG-Messungen verändert sein, obwohl bei vielen Duftstoffen sich die Amplitude nicht
signifikant verändert hatte.
Diskussion
79
Eine veränderte Kinetik war bei der Expression von IC3 tatsächlich eingetreten
(Abbildung 28 und 29). Sowohl die Anstiegszeit auf 2/3 der Amplitude als auch die
Abklingzeit bis auf 1/3 zurück zum Ruhepotential waren verlängert. Das phänotypische
Erscheinungsbild entspach dem, das bei Knockout des rdgB auftrat (Alcorta, 1991). Sie
untersuchte die Amplituden und Kinetiken von EAG-Messungen bei Verwendung von
Duftstoffen in verschiedenen Konzentrationen und bei unterschiedlichen Applikationsdauern
sowie eine Geruchsmutante, die sich in Verhaltenstests abnormal verhielt. In einem
Auswahltest, ähnlich dem T-Maze, zeigten die Tiere nach 90 Minuten eine höhere
Empfindlichkeit. Bei geringen Konzentrationen von EA bewirkte der Duftstoff ein wesentlich
repellenteres Verhalten als beim Wildtyp. Später wurde diese Mutante als rdgB identifiziert
(Woodard et al., 1992)
Die Ergebnisse von Alcorta (1991) deuten an, dass auch bei den Fliegen, die die IC3
exprimieren, die Signalkaskade über G-Proteine und zyklische Nukleotide gestört ist. In
beiden Fällen waren die EAG-Amplituden unverändert, die Kinetik verlangsamt und das
Verhalten beeinflusst. Es liegt jedoch ein gravierender Unterschied zur vorliegenden Arbeit
vor. Bei Alcorta reagierten die Fliegen sensitiver auf den repellenten Duftstoff, in der
vorliegenden Arbeit weniger empfindlich. Im Gegensatz zu den Versuchen von Alcorta, bei
denen die Verhaltenstests 90 Minuten dauerten, wurden die T-Maze-Untersuchungen an IC3-
exprimierenden Fliegen nach 30 Sekunden beendet. Daher spielen eventuell bei den
Versuchen von Alcorta Adaptationsprozesse eine wesentliche Rolle. Wahrscheinlich werden
die Adaptationsprozesse nach Aktivierung des Rezeptors und der Enzymkaskade durch
Veränderungen in der Kalziumkonzentration ausgelöst, da sowohl Tiere mit einem mutierten
TRP-Kanal als auch einem mutierten IP3-Rezeptor jeweils eine normale
Geruchswahrnehmung besitzen, ihre Adaptation aber gestört ist (Störtkuhl et al., 1999;
Deshpande et al., 2000; Vosshall, 2000).
Nach Aktivierung des Rezeptors wird dieser von Proteinkinasen phosphoryliert und
damit seine Aktivität herabgesetzt. An den phosphorylierten Rezeptor können nun Arrestine
binden, die eine Anlagerung von G-Proteinen verhindern. Der Rezeptor ist somit komplett
inaktiviert. Dieser Prozess geschieht innerhalb weniger Sekunden bis Minuten. Auf ihn folgt
die Internalisierung der Rezeptoren (Ferguson und Caron, 1998). Die Empfindlichkeit der
ORNs wird hiermit heruntergesetzt. Bei einer gestörten Signalkaskade würde wahrscheinlich
selbst nach 90 Minuten keine Adaptation der ORNs eintreten. Dieses könnte die erhöhte
Sensitivität der rdgB-defizienten Fliegen bei Alcorta erklären. Bei den Verhaltenstests mit
IC3-exprimierenden Fliegen kommen mit der Versuchsdauer von 30 Sekunden diese
Diskussion
80
adaptiven Prozesse noch nicht in dem Umfang zum Tragen. Würde hier tatsächlich durch die
IC3-Fragmente eine Signaltransduktion über G-Proteine gestört, so wäre eine verringerte
Sensitivität zu erwarten, wie sie auch eingetreten ist. Obwohl dieses alles nur Indizien sind,
spricht doch einiges dafür, dass die IC3-Fragmente die Bindung von G-Proteinen durch
kompetitive Hemmung stören und damit die Abweichungen in der Kinetik und im Verhalten
auslösen.
5.2.4 Bildet die IC4 die Verbindung zum Or83b?
Bei den elektrophysiologischen Untersuchungen IC4-exprimierender Fliegen zeigten
sich bei den meisten Duftstoffen Reizantworten, die sich statistisch nicht von wildtypischen
unterscheiden ließen (siehe Abbildung 22). Dennoch waren drei signifikante Abweichungen
vom Wildtyp auffällig. Bei cHOH fand sich eine signifikante Erhöhung, bei OA eine sehr
signifikante Erhöhung und bei DES eine sehr signifikante Erniedrigung. Dabei traten diese
Signifikanzen immer nur bei einer der drei gemessenen Fliegenlinien auf. Weiterhin lagen
teilweise recht hohe Abweichungen der Mittelwerte vom Wildtyp vor, die jedoch auf Grund
einer hohen Streuung nicht signifikant waren. Gerade bei den Fliegen IC4 (2-3) gab es häufig
höhere Werte.
Zu diesem unklaren Bild passen auch die Ergebnisse der Verhaltenstests. Während beim
BA (1:100) ein verringerter Responseindex auftrat, war der Responseindex bei cHOH (1:100)
nur wenig kleiner als der wildtypische und statistisch nicht unterscheidbar. Auch bei den
anderen Konzentrationen erzielte cHOH keine signifikante Abweichung.
Ebenfalls brachten die Kinetiken der EAG-Messungen kein klares Bild: Während die
Anstiegszeit der IC4-exprimierenden Fliegen nahezu identisch zu der des Wildtyps war, war
die durchschnittliche Abklingzeit signifikant verlängert. Entsprechend dem Modell von
Wicher et al. (2008) spricht die verlängerte Abklingzeit für eine Hemmung des Signalweges
vom OR direkt zum Or83b. Nach diesem Modell ließe die Hemmung aber auch erwarten,
dass die Anstiegszeit verlängert ist. Wie schon im Kapitel 5.2.3 diskutiert, könnte aber auch
der Signalweg über G-Proteine für die schnelle Reizantwort verantwortlich sein.
Der Insertionsort eines P-Elements in das Genom von Drosophila kann einen großen
Einfluss auf das Expressionslevel eines im P-Element enthaltenen Gens besitzen (Spradling
und Rubin, 1983). Daher können unterschiedliche Expressionslevel für die Unterschiede im
EAG der IC4-exprimierenden Fliegenlinien verantwortlich sein; das heißt, bei den Fliegen-
linien würde das IC4-Fragment in unterschiedlichen Konzentrationen gebildet werden oder im
Extremfall auch gar nicht. Um dieses zu untersuchen, wurde die mRNA der Antennen IC4-
exprimierender Fliegen mit der qRT-PCR untersucht (siehe Abbildung 15). Dabei wurde kein
Diskussion
81
signifikanter Unterschied zwischen den drei Fliegenlinien festgestellt. Obwohl hiermit noch
nicht ausgeschlossen ist, dass posttranskriptionale oder posttranslationale Abbauprozesse wie
etwa das Gen-Silencing (Hammond et al., 2000) die Menge an IC4-Fragment reduzieren, ist
doch ein vergleichbares Transkriptionsniveau der drei Fliegenlinien belegt. Die
Schwankungen in den Messergebnissen beruhen nicht auf Unterschieden im Expressionslevel.
Insgesamt lässt sich aus den Ergebnissen keine klare Aussage zur Bedeutung der IC4
treffen. Entsprechend den Versuchen von Benton et al. (2006) soll die IC4 für die Bindung
des Or83b zuständig sein. Dieses unterstützen die vorliegenden Untersuchungen nicht,
widersprechen dem aber auch nicht. Verglichen mit den extrazellulären Domänen EC1, EC2
und EC3 erscheinen die Ergebnisse der IC4 sehr auffällig mit gehäuften Abweichungen von
den wildtypischen Resultaten. Daher ist davon auszugehen, dass die IC4 tatsächlich
entsprechend Benton et al. (2006) an der Bindung des Or83b beteiligt ist. Zusätzlich scheint
aber die EC4 auch noch an der Interaktion mit dem Or83b beteiligt zu sein.
5.2.5 IC2 als potentielle Bindungsstelle für Komponenten der Adaptation
Bei den elektrophysiologischen Messungen an Fliegen, die die IC2 zusammen mit der
IC4 exprimierten, waren die Reizantworten fast durchgehend erhöht (siehe Abbildung 23). Da
bei Expression der IC4 alleine nur bei OA und cHOH erhöhte Reizantworten auftraten,
dürften die erhöhten Werte durch Effekte der IC2-Fragmente zustande gekommen sein. Wie
bei den anderen Domänen sind auch hier Effekte durch kompetitive Hemmung zu
berücksichtigen. Dabei wäre eigentlich eher eine Verringerung der Reizantworten zu
erwarten. Bei den Verhaltenstests waren die Fliegen, die IC2 zusammen mit IC4 exprimierten,
deutlich sensitiver. Bei Expression nur der IC4 zeigte sich kein Unterschied zum Wildtyp, so
dass dieser Effekt ebenfalls der IC2 zugeordnet werden kann. Auch im Verhaltenstest wäre
bei kompetitiver Hemmung der Reizweitergabe der gegenteilige Effekt zu erwarten gewesen,
also dass die Fliegen weniger sensitiv reagierten. Daher scheinen die IC2-Fragmente nicht die
Reizweitergabe zu blockieren, sondern eher zu verstärken. Offensichtlich sind Mechanismen
der Rezeptorinaktivierung blockiert. Als Komponenten kommen die Bestandteile in Frage, die
für die Adaptation verantwortlich sind, z.B. Arrestine oder Proteinkinasen. Wahrscheinlich
werden aber nicht die Arrestine selber geblockt, da für die Bindung der Arrestine ein
phosphorylierter Rezeptor benötigt wird. Die Positionen, die phosphoryliert werden, betreffen
die Bindestelle des G-Proteines (Ferguson und Caron, 1998). Wahrscheinlicher ist daher die
Bindung einer anderen Komponente des Adaptationsmechanismus an die IC2. Eventuell
binden Proteinkinasen wie die cAMP-abhängige Proteinkinase A oder eine G-Protein-
gekoppelte Rezeptorkinase an die IC2, um die IC3 zu phosphorylieren.
Ausblick
82
6 Ausblick
In der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, ob sich die Expression der Domänen
des Or43a, die nicht innerhalb der Membran liegen, auf olfaktorische Reizantworten auswirkt.
Für die Untersuchungen wurden die vier extrazellulären Domänen (EC1, EC2, EC3 und EC4)
sowie die vier intrazellulären Domänen (IC1, IC2, IC3 und IC4) jeweils in den ORNs von
Drosophila exprimiert und der Effekt durch EAG-Messungen und Verhaltensversuche
gegenüber dem Wildtyp überprüft.
Bei der Expression der EC4 waren in der Elektrophysiologie die Reizantworten erhöht,
das olfaktorische Verhalten aber unverändert. Die Expression der IC2 bewirkte sowohl eine
erhöhte Reizantwort im EAG als auch eine erhöhte Sensitivität im Verhaltenstest. Bei
Expression der IC3 reagierten die Tiere im Verhaltenstest weniger empfindlich auf den
Duftstoff als der Wildtyp; die EAG-Messungen wichen meistens nicht von wildtypischen
Amplituden ab. Die Kinetik dieser Messungen war allerdings verändert: Sowohl der Anstieg
bei der Depolarisation als auch der Rückgang bei der Repolarisation verliefen langsamer als
beim Wildtyp. Bei Expression der IC4 trat bei den EAG-Messungen eine Kinetik mit einer
verlängerten Zeit bis zum Rückgang bei der Repolarisation auf.
Die Ergebnisse legen nahe, dass die Domänen EC4, IC2 und IC3 sowie wahrscheinlich
auch IC4 für Interaktionen mit Komponenten der Signalkaskade verantwortlich sind. Hierfür
kommen neben dem Or83b vor allem G-Proteine, Proteinkinasen und Arrestine in Frage. Die
Versuche liefern allerdings keine eindeutigen Beweise. Daher bietet es sich an zu überprüfen,
ob die einzelnen Domänen tatsächlich Interaktionen mit den verschiedenen Komponenten der
Signalkaskade eingehen.
Die Hypothesen zu potentiellen Interaktionspartnern der einzelnen Or43a Domänen
(siehe 5.2) könnten durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) überprüft
werden (Hu et al., 2002; Benton et al., 2006). Mit dieser Methode könnte beispielsweise
verifiziert werden, ob der Or43a mit Gα interagiert. Neben der Aussage, ob eine Interaktion
stattfindet, erlaubt diese Methode auch noch Aussagen zu der zellulären Lokalisation dieser
Interaktion (Michnick, 2004). Bei einem positiven Ergebnis könnte versucht werden, die
Interaktion durch zusätzliche Expression der Or43a-Domänen zu unterbinden. Auf diese
Weise ist erfassbar, welche Domäne für die Interaktion verantwortlich ist.
In gleicher Weise wie die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation könnte auch der
Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) eingesetzt werden (Förster, 1948; Marullo und
Ausblick
83
Bouvier, 2007; Lohse et al., 2008). Anhand eines Energietransfers würden Interaktionen
zwischen dem Or43a und Komponenten der Signalkaskade nachgewiesen. Durch Expression
der Or43a-Loops könnte diese Energieübertragung wiederum gestört werden. Somit ist
erkennbar, welche Domänen des Or43a für die Interaktionen verantwortlich sind.
Da der Signaltransduktion über G-Proteine und zyklische Nukleotide bei der
Geruchswahrnehmung von Drosophila eine Rolle in adaptiven Prozessen zugeschrieben wird
(Wicher et al., 2008), bietet es sich an, Adaptationsversuche bei Expression der
Rezeptordomänen durchzuführen. Hierzu eignen sich sowohl elektrophysiologische
Messungen als auch Verhaltenstests, bei denen Tiere nach langzeitiger Stimulation mit einem
Duftstoff getestet werden (Störtkuhl et al., 1999). In Kapitel 5.2.3 wird der IC3 als potentielle
Bindestelle für das G-Protein diskutiert und in Kapitel 5.2.5 der IC2 als potentielle Bindestelle
für Komponenten der Adaptation wie die cAMP-abhängige Proteinkinase A oder eine G-
Protein-gekoppelte Rezeptorkinase. Wenn die Expression der Domänen IC2 bzw. IC3 die
Adaptation im Vergleich zum Wildtyp herabsetzt, würde dies die diskutierten Hypothesen
unterstützen.
Die vorliegende Arbeit beruht auf einem Modell des Or43a, nach dem der Rezeptor als
heptahelikales Transmembranprotein mit vier extrazellulären und vier intrazellulären
Domänen vorliegt. Das Modell basiert vor allem auf Vorhersagen von Computeralgorithmen,
mit denen in der genomischen DNA-Sequenz von Drosophila nach potentiellen
heptahelikalen Transmembranproteinen gesucht wurde (Clyne et al., 1999; Gao und Chess,
1999; Vosshall et al., 1999; Benton et al., 2006). Teilweise wurde dieses Modell bereits durch
Fusionierung des OR mit Fluoreszenzproteinen bzw. durch Antikörper-Färbungen gegen
intrazelluläre und extrazelluläre Domänen bestätigt (Benton et al., 2006). Zur Absicherung
des Or43a-Modells bietet es sich an, eine Röntgenstrukturanalyse des Or43a anzufertigen.
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Anhang
93
8 Anhang
8.1 Abkürzungsverzeichnis
AC Adenylatzyklase
BA Benzaldehyd
bp Basenpaare
cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat
cHOH Cyclohexanol
Ct-Wert PCR-Zyklus, ab dem die Fluoreszenz der Probe über dem Schwellenwert
liegt
D. melanogaster Drosophila melanogaster
DES Diethylsuccinat
EA Ethylacetat
EAG Elektroantennogramm: Elektrophysiologische Ableitung des
Summenpotentials an der Antenne
EC Ethylcaproat
ERG Elektroretinogramm: Elektrophysiologische Ableitung des
Summenpotentials am Auge
g Erdbeschleunigung: 1g = 9,81 m/s2
GABA γ-Aminobuttersäure
Golf wichtigstes olfaktorisches G-Protein der Vertebraten
GR gustatorischer Rezeptor
GRK G-Protein gekoppelte Rezeptorkinase
Gαo α-Untereinheit des Golf
IA Isoamylacetat
IC intrazelluläre Domäne
IP3 Inositol-1,4,5-Triphosphat
IR ionotroper Rezeptor
MA Methylacetat
MeSa Methylsalicylat
nBUOH n-Butanol
OA Octylacetat
OctOH 1-Octanol
Anhang
94
OR olfaktorischer Rezeptor
ORN olfaktorisches Rezeptor-Neuron
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PEE Propionsäureethylester
RI Response-Index
RNAi RNA Interferenz
SEM Standardfehler des Mittelwertes (standard error of mean)
TAAR Trace amine-associated receptor
UAS Upstream activating sequence
V1r Vomeronasal Typ 1 Rezeptor
V2r Vomeronasal Typ 2 Rezeptor
8.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Lebenszyklus von D. melanogaster 12
Abbildung 2: Olfaktorische Sinnesorgane der adulten Fliege 13
Abbildung 3: Schema eines olfaktorischen Sensillums 14
Abbildung 4: Übersicht über die olfaktorische Signalweitergabe von der Antenne 15
Abbildung 5: Klassische olfaktorische Signaltransduktion bei Vertebraten 17
Abbildung 6: Model der olfaktorischen Signalkaskade nach Wicher et al. (2008) 19
Abbildung 7: Topologie olfaktorischer Rezeptoren von Drosophila 23
Abbildung 8: Expression eines Genes mit dem Gal4-System 34
Abbildung 9: Gelelektrophoretische Kontrolle der PCR-Spezifität zur IC4-Amplifikation 42
Abbildung 10: Gelelektrophoretische PCR-Kontrolle zur Integration von IC2 und IC4 in
transgenen Fliegenlinien 43
Abbildung 11: Gelelektrophoretische PCR-Kontrolle zur Integration von IC2 und IC4 in
isomerisierten Fliegenlinien 44
Abbildung 12: IC4-Expression in der Antenne 46
Abbildung 13: Expression der Domänen IC2 und IC4 zusammen in der Antenne 47
Abbildung 14: RNA-Analyse der Antennen von F1-Tieren aus [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4],
Probe A 48
Abbildung 15: Relative Quantifizierung der IC4 mRNA 50
Abbildung 16: EAG bei Expression der EC1 52
Abbildung 17: EAG bei Expression der EC2 52
Anhang
95
Abbildung 18: EAG bei Expression der EC3 53
Abbildung 19: EAG bei Expression der EC4 54
Abbildung 20: EAG bei Expression der IC1 55
Abbildung 21: EAG bei Expression der IC3 56
Abbildung 22: EAG bei Expression der IC4 57
Abbildung 23: EAG bei Expression der IC2 zusammen mit der IC4 59
Abbildung 24: T-Maze mit BA (1:100) 61
Abbildung 25: T-Maze mit cHOH (1:100) 62
Abbildung 26: T-Maze mit cHOH verschiedener Konzentrationen 63
Abbildung 27: EAG-Kinetik bei Expression der IC3 64
Abbildung 28: Anstiegszeiten bei Stimulation mit cHOH 65
Abbildung 29: Abklingzeiten bei Stimulation mit cHOH 66
Abbildung 30: ERG mit Blaulicht bei Expression der EC4 68
Abbildung 31: ERG-Rezeptorpotentiale bei Expression der EC4 68
Abbildung 32: „Ein“-Transienten im ERG bei Expression der EC4 69
Abbildung 33: „Aus“-Transienten im ERG bei Expression der EC4 70
Abbildung 34: RNA-Analyse der Antennen von [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4] 96
Abbildung 35: RNA-Analyse der Antennen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4] 97
Abbildung 36: RNA-Analyse der Antennen von [IC4 (4-1) x Or83b-Gal4] 98
Abbildung 37: RNA-Analyse der Antennen von white-Fliegen 99
Abbildung 38: Referenzmessungen zu den RNA-Analysen 100
Abbildung 39: Schmelzkurve der qRT-PCR von rp49 101
Abbildung 40: Schmelzkurve der qRT-PCR von rp49 ohne reverse Transkriptase 101
Abbildung 41: Schmelzkurve der qRT-PCR der Domäne IC4 102
Anhang
96
8.3 Ergebnisse der RNA-Analysen
Abbildung 34: RNA-Analyse der Antennen von [IC4 (2-1) x Or83b-Gal4]
A-C geben die jeweilige Antennenprobe an, aus der die RNA gewonnen wurde.
Anhang
97
Abbildung 35: RNA-Analyse der Antennen von [IC4 (2-3) x Or83b-Gal4]
A-C geben die jeweilige Antennenprobe an, aus der die RNA gewonnen wurde.
Anhang
98
Abbildung 36: RNA-Analyse der Antennen von [IC4 (4-1) x Or83b-Gal4]
A-C geben die jeweilige Antennenprobe an, aus der die RNA gewonnen wurde.
Anhang
99
Abbildung 37: RNA-Analyse der Antennen von white-Fliegen
A-C geben die jeweilige Antennenprobe an, aus der die RNA gewonnen wurde.
Anhang
100
Abbildung 38: Referenzmessungen zu den RNA-Analysen
A zeigt die Referenzmessung zu Abbildung 35 A. Den anderen elektrophoretischen RNA-Analysen
liegt die Referenzmessung B zugrunde.
Anhang
101
Abbildung 39: Schmelzkurve der qRT-PCR von rp49
Die zugehörigen RNA-Proben sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Abbildung 40: Schmelzkurve der qRT-PCR von rp49 ohne reverse Transkriptase
Die zugehörigen RNA-Proben sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Anhang
102
Abbildung 41: Schmelzkurve der qRT-PCR der Domäne IC4
Die zugehörigen RNA-Proben sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5: Ct-Werte der qRT-PCR des IC4-Fragments
IC4-Fragment rp49
Durchgang 1 2 3
Mittel-
wert 1 2 3
Mittel-
wert
white A / / / 11,25 16,08 16,35 16,22
white B / / / 16,10 16,27 16,74 16,37
white C / / / 15,96 16,97 16,62 16,52
IC4 (2-1) A 15,74 16,10 16,09 15,98 15,03 15,03 15,19 15,08
IC4 (2-1) B 16,06 16,13 16,03 16,07 16,15 16,30 17,10 16,52
IC4 (2-1) C 16,29 16,27 16,14 16,23 15,58 16,37 16,97 16,31
IC4 (2-3) A 16,01 15,27 16,10 15,79 15,14 16,10 16,31 15,85
IC4 (2-3) B 14,72 15,62 15,07 15,14 14,42 14,98 15,48 14,96
IC4 (2-3) C 17,63 17,87 16,07 17,75 16,12 16,78 17,14 16,68
IC4 (4-1) A 16,22 16,85 15,59 16,22 15,38 15,57 15,97 15,64
IC4 (4-1) B 14,98 15,36 15,27 15,20 15,76 15,75 15,67 15,73
IC4 (4-1) C 15,43 15,79 15,36 15,53 15,56 15,37 16,18 15,70
Anhang
103
Tabelle 6: Ct-Werte der qRT-PCR der endogenen Domäne IC4 zusammen mit dem
exprimierten EC4-Fragment
IC4 (endogen + Fragment) rp49
Durchgang 1 2 3
Mittel-
wert 1 2 3
Mittel-
wert
white A 23,74 24,02 23,10 23,62 19,17 20,17 19,63 19,66
white B 23,93 23,37 23,70 23,67 19,28 19,37 19,68 19,45
white C 23,51 23,67 23,49 23,55 19,26 19,85 19,74 19,61
IC4 (2-1) A 19,07 18,94 17,55 18,52 18,36 19,02 18,96 18,78
IC4 (2-1) B 18,88 18,91 18,52 18,77 20,23 19,65 20,10 19,99
IC4 (2-1) C 17,96 17,79 17,90 17,88 19,23 19,16 19,29 19,22
IC4 (2-3) A 18,44 18,61 18,35 18,47 17,72 18,16 18,03 17,97
IC4 (2-3) B 17,49 17,57 16,89 17,32 18,65 18,49 18,78 18,64
IC4 (2-3) C 18,60 18,61 18,34 18,52 18,99 19,49 19,53 19,33
IC4 (4-1) A 18,82 18,78 18,76 18,79 20,06 20,27 20,21 20,18
IC4 (4-1) B 18,34 18,40 18,31 18,35 18,02 19,21 19,81 19,02
IC4 (4-1) C 18,23 18,00 17,81 18,01 18,39 18,08 18,98 18,48
Anhang
104
8.4 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Robert F. Freyberger
Geburtsdatum: 20.6.1976
Geburtsort: Hannover
Familienstand: Verheiratet, zwei Kinder
Schulbildung:
08.1983 – 07.1987 Grundschule Peterstraße, Wuppertal
08.1987 – 07.1997 Gymnasium an der Siegesstraße, Wuppertal
Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife
Zivildienst:
08.1997 – 08.1998 Tätigkeit in der evangelischen Kirchengemeinde in Gladenbach
(Hessen)
Hochschulbildung:
08.1998 – 01.2009 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum
Schwerpunkt: Molekularbiologie und Sinnesphysiologie
Thema der Diplomarbeit: „Aufbau eines neuen Applikationssystems
zur Untersuchung von Drosophila-Larven“, Arbeitsgruppe
Sinnesphysiologie der Fakultät für Biologie und Biotechnologie
Seit 02.2009 Promotion an der Ruhr-Universität Bochum
Thema der Dissertationsschrift: „Charakterisierung interagierender
Domänen olfaktorischer Rezeptoren mit Komponenten der
Signalkaskade und dem Or83b in Drosophila melanogaster“,
Arbeitsgruppe Sinnesphysiologie der Fakultät für Biologie und
Biotechnologie
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