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Photosynthetischer Elektronenfluss: Regulationsmechanismen und die zentrale Rolle
der Ferredoxine
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Doktorgrades der Naturwissenschaften
des Fachbereichs Biologie/Chemie an der Universität Osnabrück
vorgelegt von
Ingo Voß
Osnabrück, November 2009
Diese Arbeit ist meinen Eltern gewidmet.
Vielen Dank für alles.
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ............................................................................................... 4
1.1 Die Primärreaktion der Photosynthese ...................................................................... 4 1.2 Ferredoxine ............................................................................................................... 8
1.2.1 Ferredoxine als zentrale Elektronenüberträger ................................................................. 9 1.2.2 Fd‐Isoformen in A. thaliana .............................................................................................. 10
1.3 Posttranslationale Regulation des Chloroplasten‐Metabolismus ............................. 11 1.3.1 Das Fd‐Trx‐System ............................................................................................................ 11 1.3.2 Fine‐tuning und feedback‐Regulation .............................................................................. 13 1.3.3 Regulation des Kohlenstoff‐Metabolismus im Chloroplasten .......................................... 13
1.4 Lichtstress und Lichtakklimation ............................................................................. 16 1.4.1 Poising‐Mechanismen ...................................................................................................... 16 1.4.2 Langzeitakklimation und Signalling .................................................................................. 20 1.4.3 Photoinhibition, ROS und antioxidative Systeme ............................................................. 22
1.5 Ziele der Arbeit ....................................................................................................... 25
2 MATERIAL UND METHODEN ..................................................................... 28
2.1 Chemikalien ............................................................................................................ 28 2.2 Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen ............................................................ 28 2.3 Oligonukleotide ...................................................................................................... 29 2.4 Pigmentbestimmung ............................................................................................... 30 2.5 Bestimmung von Frisch‐ und Trockengewicht .......................................................... 31 2.6 Proteinbestimmung nach Bradford ......................................................................... 31 2.7 Stärkenachweis in Blattscheiben ............................................................................. 31 2.8 Reverse Transkriptase PCR (RT‐PCR) ........................................................................ 32
2.8.1 Isolierung von Gesamt‐RNA ............................................................................................. 32 2.8.2 RNA‐Quantifizierung mittels Absorptionsmessungen ...................................................... 33 2.8.3 DNAse‐Verdau .................................................................................................................. 33 2.8.4 Einzelstrang‐cDNA‐Synthese mittels Reverser Transkriptase (RT) ................................... 33 2.8.5 Amplifikation von cDNA mittels Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) ................................ 33 2.8.6 Auftrennung der Fragmente im Agarosegel ..................................................................... 34 2.8.7 Densiometrische Auswertung .......................................................................................... 35
2.9 Immundetektion ..................................................................................................... 35 2.9.1 SDS‐PAGE .......................................................................................................................... 36 2.9.2 Western‐Blot und Immundetektion ................................................................................. 36
2.10 Auftrennung von Pigment‐Protein‐Komplexen der Thylakoidmembran im Saccharosegradienten ............................................................................................. 38
2.10.1 Isolierung von Thylakoiden aus A. thaliana ...................................................................... 38 2.10.2 Herstellung des Saccharosegradienten ............................................................................ 39 2.10.3 Probenvorbereitung und Auftrennung ............................................................................ 40
2.11 P700‐Absorptionsmessungen .................................................................................. 41 2.11.1 Experimentelles Setup ...................................................................................................... 41 2.11.2 Bestimmung der maximalen P700‐Absorptionsänderung im NIR .................................... 42 2.11.3 Bestimmung von ΔAP700 im NIR an mit Methylviologen behandelten Blattscheiben ...... 42
II Inhaltsverzeichnis
2.12 Chlorophyllfluoreszenz‐Messungen ........................................................................ 42 2.12.1 Experimentelles Setup ...................................................................................................... 42 2.12.2 Bestimmung der Parameter zur photosynthetischen Lichtnutzung ................................. 43 2.12.3 Bestimmung des Parameters FC ........................................................................................ 44
2.13 CO2‐Gaswechselmessungen .................................................................................... 45 2.13.1 Experimentelles Setup ...................................................................................................... 45 2.13.2 Bestimmung des CO2‐Gaswechsels im steady‐state ......................................................... 47 2.13.3 Lichtsättigungskurven und Chlorophyllfluoreszenz‐Messungen ...................................... 47 2.13.4 A/Ci‐Kurven ....................................................................................................................... 48 2.13.5 Berechnung des Parameters APR ....................................................................................... 49
2.14 ROS‐Bestimmung .................................................................................................... 50 2.14.1 Isolierung von Protoplasten aus Blatt‐Gewebe ................................................................ 50 2.14.2 ROS‐Visualisierung ............................................................................................................ 51
2.15 Lokalisationsstudien ............................................................................................... 51 2.15.1 Klonierung des FdC1‐GFP‐Fusionsproteins ....................................................................... 51 2.15.1.1 Transformation von Plasmid‐DNA in kompetente E. Coli Zellen ...................................... 52 2.15.1.2 Minipräparation von Plasmid‐DNA ................................................................................... 53 2.15.1.3 Maxipräparation von Plasmid‐DNA .................................................................................. 53 2.15.2 Transformation isolierter Protoplasten ............................................................................ 54 2.15.3 Fluoreszenzmikroskopie transformierter Protoplasten .................................................... 55
2.16 Bestimmung der Enzymaktivitäten ......................................................................... 55 2.16.1 NADP‐MDH ....................................................................................................................... 56 2.16.2 G6PDH ............................................................................................................................... 56
2.17 Glutathion‐Bestimmung mittels HPLC ..................................................................... 56
3 ERGEBNISSE ............................................................................................. 58
3.1 Fd2‐KO‐Pflanzen als Modellorganismus zur Untersuchung von Regulations‐ und Akklimationsvorgängen .......................................................................................... 58
3.1.1 Phänotyp ........................................................................................................................... 59 3.1.2 Photosynthetischer Elektronentransport und CO2‐Assimilation ...................................... 60 3.1.2.1 Photosystem I ................................................................................................................... 61 3.1.2.2 Photosystem II .................................................................................................................. 68 3.1.2.3 CO2‐Assimilation ............................................................................................................... 74 3.1.2.4 Licht‐ und CO2‐Abhängigkeit der Photosynthese ............................................................. 75 3.1.3 Reduktionsgrad und Redoxregulation im Stroma............................................................. 80 3.1.3.1 Redoxregulierte Stroma‐Enzyme in Fd2‐KO‐Pflanzen ...................................................... 80 3.1.3.2 Akkumulation von ROS ..................................................................................................... 83 3.1.4 NTRC als Fd‐unabhängiges antioxidatives System ............................................................ 87
3.2 Fd2‐KO‐Pflanzen im Hochlicht ................................................................................. 89 3.2.1 Kurzzeitakklimation im Hochlicht ..................................................................................... 90 3.2.1.1 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport ............................................. 90 3.2.1.2 CO2‐Assimilation und Photorespiration ............................................................................ 95 3.2.2 Langzeitakklimation im Hochlicht ..................................................................................... 97 3.2.2.1 Phänotyp ........................................................................................................................... 98 3.2.2.2 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport ............................................. 99 3.2.2.3 CO2‐Assimilation ............................................................................................................. 102
3.3 Charakterisierung der alternativen Fd‐Isoform FdC1 ..............................................104 3.3.1 Bioinformatische Einordnung von FdC1 ......................................................................... 105 3.3.2 Lokalisationsstudien ....................................................................................................... 108 3.3.3 Die Funktion von FdC1 im photosynthetischen Elektronentransport ............................ 109
Inhaltsverzeichnis III
3.4 Fd1‐KO‐Pflanzen als Modell zur Aufklärung unterschiedlicher Funktionen photosynthetischer Fd‐Isoformen ......................................................................... 112
3.4.1 Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Anzuchtbedingungen ............................................. 113 3.4.1.1 Phänotyp ........................................................................................................................ 114 3.4.1.2 Photosynthetischer Elektronenfluss und CO2‐Assimilation ............................................ 116 3.4.2 Induktion des ZET in den Fd1‐KO‐Pflanzen .................................................................... 119 3.4.2.1 Der photosynthetische Elektronenfluss ......................................................................... 120 3.4.2.2 CO2‐Assimilation ............................................................................................................. 123
4 DISKUSSION ............................................................................................ 125
4.1 Fd2‐KO‐Pflanzen – Gleichzeitige Simulation von Hoch‐ und Schwachlicht‐ bedingungen im Chloroplasten .............................................................................. 125
4.1.1 Langzeitakklimation und poising .................................................................................... 125 4.1.2 Signalling ........................................................................................................................ 128 4.1.3 Posttranslationale Regulation ........................................................................................ 132
4.2 Die klassischen Blatt‐Fds Fd1 und Fd2 in A. thaliana – redundant, funktionell differenziert oder beides? ..................................................................................... 134
4.3 Neue FdC1‐Isoform als alternativer Elektronenakzeptor am PSI ............................ 140
5 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................. 144
6 ABSTRACT ............................................................................................... 147
7 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................... 148
8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................... 162
9 DANKSAGUNG ........................................................................................ 166
10 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ................................................................ 168
4 Einleitung
1 Einleitung Die Fähigkeit höherer Pflanzen und anderer photoautotropher Organismen, mittels
Photosynthese über Lichtenergie organische Verbindungen zu synthetisieren, ist von
zentraler Bedeutung im Kreislauf des Lebens. Im Rahmen der Photosynthese wird
Kohlenstoffdioxid (CO2) gebunden und Sauerstoff (O2) freigesetzt. Heterotrophe
Organismen wiederum nutzen O2 zur Energiegewinnung mittels Atmung, CO2 wird dabei
frei. Seit mehr als 200 Jahren wird versucht, mit wissenschaftlichen Methoden die
Prozesse der Photosynthese zu analysieren. Bereits Ende des 18. Jahrhunderts erkannte
Ingenhousz, dass Pflanzen im Licht CO2 aufnehmen und O2 freisetzen (vgl. Ingenhousz,
1779). Wissenschaftler befassen sich seitdem bis zum heutigen Tage mit der
Aufschlüsselung der Mechanismen der Photosynthese.
In den folgenden Kapiteln werden die grundsätzlichen molekularen Abläufe der
Photosynthese aufgezeigt. Hierbei wird der Fokus vor allem auf die Primärreaktion bzw.
Lichtreaktion gelegt. Licht ist hierbei nicht nur die universelle Antriebskraft der
Photosynthesereaktion, sondern kann auch bei hoher Strahlungsbelastung zu
Schädigungen am Photosyntheseapparat führen.
Die Primärreaktion der Photosynthese 1.1
In der Primärreaktion der Photosynthese (häufig auch als Lichtreaktion bezeichnet) wird
in Folge der Anregung von zwei Photosystemen über Elektronentransfer und
Protonenverschiebung aus Lichtenergie ATP als Energieträger und, im Zuge des linearen
Elektronentransportes (LET), NADPH als Reduktionsmittel synthetisiert. Durch
Lichtenergie ausgelöste Ladungstrennung in den Photosystemen und der folgenden
Spaltung von Wasser (H2O) werden Elektronen im photosynthetischen
Elektronentransport (PET) auf Ferredoxin (Fd), die erste lösliche Redoxkomponete
übertragen (siehe Abb. 1.1). Der PET ist in der Thylakoidmembran und den darin
assoziierten Proteinkomplexen Photosystem I (PSI), Photosystem II (PSII), Cytochrom‐
b6f‐Komplex (Cyt‐b6f), F‐ATP Synthase (F‐ATPase) und den Lichtsammelkomplexen (light
harvesting complexes – LHCs) lokalisiert (vgl. Marder und Barber, 1989).
Die Photosynthese beginnt mit der Absorption von Lichtenergie über die LHCs, welche
in Form von Excitonen in die aktiven Zentren von PSI und PSII weitergeleitet wird.
Dieses System ermöglicht eine effiziente und spektral breite Lichtnutzung. Die
Lokalisation verschiedener Pigmente, Carotinoide und Chlorophylle vergrößert das
Absorptionsspektrum der LHCs. Mit LHCI und LHCII sind bislang zwei unterschiedliche
Einleitung 5
LHCs bekannt (vgl. Vassiliev und Bruce, 2008). Am PSI sind vier LHCI‐Monomere
assoziiert, die zusammen mit den am PSI‐Proteinkomplex lokalisierten Pigmenten 167
Chlorophylle aufweisen, wobei das Verhältnis von Chlorophyll a (Chla) zu Chlorophyll b
(Chlb) bei ca. 9 liegt (vgl. Ben‐Shem et al., 2003; Jolley et al., 2005). In diesem
Zusammenhang muss erwähnt werden, dass an den Proteinkomplexen der
Photosysteme neben Chla nur geringe Mengen an Carotinoiden und kein Chlb zu finden
sind. An PSII liegen zwei LHCII‐Trimere und drei LHCII‐Monomere (CP24, CP26 und CP29)
assoziiert vor, die zusammen mit den an PSII‐Proteinkomplex gebundenen Pigmenten
auf 150 Chlorophylle bei einem Chla/Chlb Verhältnis von 2,5 kommen (vgl. Nield et al.,
2000; Barber, 2002). Neben diesen an den Photosystemen fest lokalisierten LHCs
können höhere Pflanzen einen variablen Anteil an LHCII‐Komplexen aufweisen. Diese
zusätzlichen Komplexe sind dynamisch und können sowohl am PSI als auch am PSII
lokalisiert sein, um eine Optimierung der Lichtnutzung über state transitions (vgl. Kruse,
2001; Dekker und Boekama, 2005) zu erreichen.
Abb. 1.1: Schematische Darstellung der Primärreaktion der Photosynthese. Dargestellt sind die Komponenten des PET sowie der Protonen‐ und Elektronentransfer (gestrichelte rote Linie) der Primärreaktion mit den Endprodukten des LET NADPH und ATP.
Über die am PSII lokalisierten LHCs wird Lichtenergie auf das reaktive Zentrum des PSII
(P680) weitergeleitet. Das PSII‐Reaktionszentrum wird im Wesentlichen aus den zwei
Membranproteinen D1 und D2 gebildet (vgl. Zouni et al., 2001; Ferreira et al., 2004), an
welche insgesamt 96 Chla‐Moleküle gebunden sind (vgl. Schubert et. al. 1997; Jordan et
al., 2001). Neben den Chla‐Molekülen sind zusätzlich Carotinoide, Phäophytin und
Plastochinon (PQ) assoziiert. Das P680 ist wahrscheinlich ein Chla‐Dimer, dessen
6 Einleitung
spektrale Eigenschaften mit einem Absorptionsmaximum bei 680 nm die Nomenklatur
begründen. Ist die von den LHCs absorbierte Lichtenergie ausreichend, wird das P680 in
den angeregten Zustand (P680*) überführt. Das hierbei angeregte Elektron wird über
Phaeophytin auf den primären Elektronenakzeptor QA, ein fest am PSII‐Proteinkomplex
gebundenes Plastochinon, übertragen. Die Elektronenlücke am oxidierten P680 (P680+)
wird über die Oxidation von H2O zu O2 unter Abspaltung von Protonen (H+) im
Thylakoidlumen aufgefüllt (vgl. Yachandra et al., 1996). Die Freisetzung von O2 ist
messbar und ein Maß für linear transportierte Elektronen (vgl. Walker, 1988). Das QA
bildet in Folge der Reduktion ein Semichinonradikal, von welchem das Elektron auf ein
weiteres, locker am PSII‐Proteinkomplex assoziiertes PQ, dem QB, übertragen wird. Im
Gegensatz zu QA kann QB zweifach reduziert werden und nimmt nacheinander zwei
Elektronen vom PSII auf. Im Zuge dieser Reduzierung ist QB nicht mehr am PSII‐
Proteinkomplex assoziiert, es bindet zwei Protonen aus dem Stroma, wodurch
Plastohydrochinon (PQH2) entsteht und diffundiert über die Lipidphase der
Thylakoidmembran zum Cyt‐b6f Komplex. Reduziertes QB in Form von PQH2 sowie
oxidiertes QB bilden in ihrer Gesamtheit den Plastochinon‐Pool (PQ‐Pool) in der
Thylakoidmembran.
Am Cyt‐b6f Komplex wird PQH2 oxidiert, wobei die Elektronen auf den Cyt‐b6f Komplex
und die Protonen ins Thylakoidlumen abgegeben werden, so dass ein Protonengradient
über die Thylakoidmembran generiert wird. Über die Bestimmung der
Chlorophyllfluoreszenz‐Emission ist der Protonengradient als qE‐Anteil der nicht‐
photochemischen Fluoreszenzlöschung (NPQ) messbar (vgl. Schreiber et al., 1986, Baker
et al., 2007 und Kapitel 2.12.2 bzw. Kapitel 3.1.2.2). Durch den integralen
transmembranen Proteinkomplex der F‐ATPase (vgl. Cox et al., 1992) wird der
Protonengradient für die ATP‐Synthese genutzt (vgl. Junge, 1989). An der Lumenseite
des Cyt‐b6f Komplexes werden die vom PQH2 kommenden Elektronen auf Plastocyanin
(PC), ein kuperfhaltiges, im Lumen lokalisiertes Protein, übertragen. Reduziertes PC
wandert an der Lumenseite der Thylakoidmembran zum PSI.
Pflanzliches PSI liegt als Superkomplex aus LHCI‐Proteinen und dem PSI‐
Core Proteinkomplex (PSI‐Core) vor und ist nahezu ausschließlich in den Stromalamellen
sowie in den Rändern der Grana‐Stapel der Thylakoidmembran lokalisiert (vgl.
Albertsson, 2001; Anderson, 2002; Kim et al., 2005; Nelson und Yocum, 2006). Der
gesamte PSI‐Superkomplex besteht aus 18 Protein‐Untereinheiten, wobei 14 den PSI‐
Core bilden (vgl. Scheller et al., 2001, Chitnis et al., 2001). Die Nomenklatur der
Untereinheiten von PsaA bis zu PsaO erfolgt nach Goldbeck (1992), angelehnt an die
Bezeichnung der entsprechenden codierenden Gene psaA bis psaO. Hierbei ist zu
Einleitung 7
beachten, dass PsaM nur in Cyanobakterien und PsaG, PsaH, PsaN und PsaO
ausschließlich in Pflanzen und eukaryotischen Algen vorkommen (vgl. Knoetzel et al.,
2002). Insgesamt sind am PSI‐Core 128 Kofaktoren assoziiert (vgl. Krauss, 2003). Die
beiden transmembranen Peptide PsaA und PsaB sind in A. thaliana mit 83,1 kDa bzw.
82,5 kDa die größten Untereinheiten des PSI‐Core. Daran sind 79 Chla‐Moleküle, ein ß‐
Carotinoid, das aktive Zentrum, bestehend aus zwei Chla‐Molekülen (P700), die
Elektronenakzeptoren A0 bzw. A0’ (je ein Chla‐Molekül) und A1 bzw. A1’ (in A. thaliana je
ein Phyllochinon) sowie das 4‐Eisen‐4‐Schwefel‐Zentrum ([4Fe‐4S]‐Zentrum) Fe‐SX (vgl.
Goldbeck, 1992; Krauss et al., 1993; Chitnis, 1996; Jordan et al., 2001; Scheller et al.,
2001; Jensen et al., 2003; Nelson et al., 2006) assoziiert. PsaA und PsaB sind als
Heterodimer in einer zweifach gewundenen virtuellen Achse um P700 und das [4Fe‐4S]‐
Zentrum Fe‐SX angeordnet. Die übrigen Untereinheiten des PSI‐Core sind mit 4 – 18 kDa
deutlich kleiner und zum Teil mit Chla‐Molekülen und ß‐Carotinoiden assoziiert (vgl.
Jensen et al., 2003). PsaC, PsaD und PsaE sind auf der Stromaseite lokalisiert, wobei
PsaD und PsaE für die Bindung von Fd verantwortlich sind (vgl. Merati und Zanetti,
1987; Zilber und Malkin, 1988; Andersen et al., 1992; Pandini et al., 1999; Jordan et al.,
2001), während am PsaC zwei weitere [4Fe‐4S]‐Zentren, Fe‐SA und Fe‐SB, assoziiert
vorliegen. Zusätzlich scheint PsaD für die Orientierung von PsaC und die Stabilisierung
der Interaktionen zwischen Fe‐SA, Fe‐SB und den Fds verantwortlich zu sein. PsaE
hingegen wird eine entscheidende Rolle bei der Interaktion zwischen Fds und der
Ferredoxin‐NADP+‐Reduktase (FNR) (vgl. Shin und Arnon, 1965) sowie im zyklischen
Elektronentransport (ZET) zugeschrieben. An der Lumenseite sind PsaF und PsaN bei der
Bindung von PC an PsaA und PsaB beteiligt (vgl. Farah et al., 1995; Haldrup et al., 1999;
Haldrup et al., 2000). Den übrigen Untereinheiten werden hauptsächlich stabilisierende
Funktionen sowie die Interaktion mit den LHCs zugeschrieben (vgl. Chitnis und Chitnis,
1993; Xu et al., 1994; Xu et al., 1995; Jansson et al., 1996; Fischer et al., 1999; Lunde et
al., 2000; Knoetzel et al., 2002; Jensen et al., 2003; Lunde et al., 2003; Jensen et al.,
2004).
Im PSI verläuft der Elektronentransport über die am PSI‐Core assoziierten Kofaktoren
P700, A0, A1, Fe‐SX, Fe‐SA und Fe‐SB (siehe Abb. 1.2). Über die am PSI lokalisierten LHCs
wird Lichtenergie auf das P700 weitergeleitet. Es kommt zur Ladungstrennung, wobei
P700 oxidiert und der primäre Elektronenakzeptor A0 reduziert wird. Das Elektron wird
von A0 auf das Phyllochinon A1 und darauf folgend auf Fe‐SX übertragen. Vom
reduzierten Fe‐SX geht das Elektron letztendlich auf die am PsaC assoziierten [4Fe‐4S]‐
Zentren Fe‐SA und Fe‐SB über. Oxidiertes P700 (P700+) wird über PC an der Lumenseite
des PSI wiederum reduziert.
8 Einleitung
Die Struktur und Anordnung der am Elektronentransport im PSI beteiligten Moleküle
belegt den oben beschriebenen Weg der Elektronen durch PSI, wirft allerdings auch
Fragen auf, inwieweit abweichende Transportwege über weitere Kofaktoren möglich
sind (vgl. Jordan et al., 2001; Zeng et al., 2002; Gong et al., 2003; Nelson und Yocum,
2006). So ist zu beachten, dass die Elektronentransportkette im PSI aus zwei nahezu
symmetrischen Zweigen an PsaA und PsaB aufgebaut ist, wobei die bereits
beschriebenen Kofaktoren des PSI als „Paare“ am Heterodimer, je ein Molekül an PsaA
bzw. PsaB, assoziiert vorliegen (siehe Abb. 1.2). In Algen und Pflanzen wurden Hinweise
gefunden, die beiden Zweigen eine essentielle Rolle im Elektronentransport in PSI
zuschreiben (vgl. Joliot und Joliot, 1999; Bordreaux et al., 2001; Guergova‐Kuras et al.,
2001; Jordan et al., 2001; Muhiuddin et al., 2001; Purton et al., 2001; Fairclough et al.,
2003; Pushkar et al., 2005), so dass von einer aktiven Funktion sowohl der am PsaA als
auch der am PsaB assoziierten Kofaktoren im Elektronentransport ausgegangen werden
kann (vgl. Ramesh et al., 2004). Trotz dieser Hinweise konnte der genaue Ablauf des
Elektronentransportes in PSI bislang nicht abschließend aufgeklärt werden.
Von den [4Fe‐4S]‐Zentren am PsaC werden Elektronen auf freie stromale Akzeptoren
übertragen. Hierbei nimmt Fd im photosynthetischen Elektronentransport als
Elektronenakzeptor am PSI eine zentrale Rolle ein.
Abb. 1.2: Schematische Darstellung des PSI‐Proteinkomplexes. Dargestellt ist der PSI‐Core mit den assoziierten LHCI‐Komplexen und den am Elektronentransport durch PSI beteiligten Kofaktoren. Der hypothetische Elektronenfluss über PsaA ist durch Pfeile markiert.
Ferredoxine 1.2
Fds sind ubiquitär verbreitete, lösliche Eisen‐Schwefel‐Proteine, die im Metabolismus
von Organismen an zentralen Stellen als Elektronenüberträger lokalisiert sind (vgl.
Einleitung 9
Arnon, 1988). Erstmals wurden Fds in Bakterien als Proteine beschrieben, welche an der
Stickstoff‐Fixierung beteiligt sind (vgl. Mortenson et al., 1962). In Pflanzen sind Fds
kerncodiert, werden als Präproteine im Zytoplasma synthetisiert und über Signalpeptide
in die Plastiden transportiert. Die meisten Pflanzen‐Fds bestehen aus
95 ‐ 98 Aminosäuren (AS) für das native Protein und einer 46 – 54 AS langen
Transitpeptid‐Sequenz am N‐Terminus. Insgesamt weist das native Protein einen hohen
Anteil an sauren AS auf. Vier hoch konservierte Cystein‐Reste sind an der Ausbildung
des charakteristischen 2‐Eisen‐2‐Schwefel‐Zentrums ([2Fe‐2S]‐Zentrums) beteiligt. Fd
nehmen sowohl in photosynthetisch aktiven als auch in heterotrophen Geweben eine
zentrale Rolle als Reduktionsmittel für Fd‐abhängige Enzyme ein. In den Chloroplasten
werden Fds im Licht direkt am PSI über den PET reduziert, während in heterotrophen
Geweben und Zellkompartimenten, z. B. Leukoplasten‐, Amyloplasten‐ und
Chromoplasten‐haltigen Geweben, die Reduzierung von Fd mittels NADPH erfolgt.
1.2.1 Ferredoxine als zentrale Elektronenüberträger
In den Chloroplasten sind Fds elementare Bestandteile der Photosynthesereaktion und
dienen am PSI als zentrale „Verteilerstelle“ für Elektronen (siehe Abb. 1.3). Die
bekannteste Funktion von Fds in Chloroplasten ist die als Elektronendonator zur
Reduktion von NADP+, katalysiert durch FNR. Mit der Reduktion von NADP+ zu NADPH
endet der LET der Photosynthese, der mit der Oxidation von Wasser beginnt (vgl.
Karplus et al., 1991). NADPH wird während der CO2‐Assimilation im reduktiven
Pentosephosphatweg (RPP) bzw. Calvin Zyklus als Reduktionsmittel benötigt. Außer der
Funktion als Elektronendonator im LET besitzt Fd im ZET eine Vermittlerrolle, wenn
Elektronen wieder in den PET der Thylakoidmembran eingeschleust werden
(siehe Kapitel 1.4.1). Weitere plastidäre Enzyme akzeptieren Elektronen direkt von Fd
für anabolische Prozesse. Hier sind u.a. Sulfit‐ und Nitrit‐Reduktase, Fd‐GOGAT und die
Fettsäure‐Desaturase von Bedeutung (vgl. Knaff, 1996). Weiter überträgt Fd Elektronen
auf oxidiertes Thioredoxin (Trx), katalysiert durch die Ferredoxin‐Thioredoxin‐Reduktase
(FTR), wobei der Reduktionszustand der Thylakoidmembran in ein regulatorisches Signal
zur Kontrolle der Aktivität vieler Enzyme, u.a. im Calvin‐Zyklus und oxidativen
Pentosphosphatweg (OPP, siehe Kapitel 1.3.3), umgesetzt wird (vgl. Montrichard et al.,
2009). Die flexible Verteilung der Elektronen über Fd ist von entscheidender Bedeutung
für die Regulation der Photosynthese sowie der assimilatorischen Prozesse im Licht und
unterliegt hierbei einer hierarchischen Ordnung (vgl. Backhausen et al., 2000). Der LET
zur Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten in Form von NADPH sowie die S‐ bzw. N‐
Assimilation besitzen eine hohe Priorität in der Fd‐abhängigen Elektronenverteilung.
10 Einleitung
Abb. 1.3: Fd‐abhängige Elektronenverteilung im Stroma. Schematisch dargestellt ist der photosynthetische Elektronentransfer auf diverse Akzeptoren im Stroma mit Fd als zentraler „Verteilerstelle“ und erstem Elektronenakzeptor am PSI.
1.2.2 Fd‐Isoformen in A. thaliana
In höheren Pflanzen sind verschiedene Fd‐Isoformen im Genom codiert (vgl. Hase et al.,
1991; Hanke et al., 2004; Hanke und Hase, 2008). Alle Pflanzen, für die signifikante EST‐
(expressed sequence tag) bzw. cDNA‐Datenbanken vorliegen, besitzen eine Fd‐Isoform
mit einer hohen Affinität zur FNR in nicht photosynthetisch aktiven Geweben, weshalb
diese Isoform auch als „Wurzel‐Fd“ bezeichnet wird (vgl. Onda et al., 2000; Hanke et al.,
2004) und mindestens zwei photosynthetische Fd‐Isoformen (vgl. Hase et al., 1991;
Hanke und Hase, 2008), welche aus diesem Grund häufig als Blatt‐Fds geführt werden.
In der C4‐Pflanze Mais werden den Blatt‐Fd‐Isoformen unterschiedliche Funktionen im
LET bzw. ZET zugeschrieben (vgl. Kimata und Hase, 1989; Matsumura et al., 1999;
Kimata‐Ariga et al., 2000). In C3‐Pflanzen konnten funktionelle Unterschiede der Blatt‐
Fds bislang nicht eindeutig nachgewiesen werden.
Vier verschiedene Fd‐Isoformen sind für A. thaliana bislang beschrieben. Neben den
Blatt‐Fds, Fd1 (AGI‐Code: At1g10960) und Fd2 (AGI‐Code: At1g60950), kommt das
klassische Wurzel‐Fd (Fd3 – AGI‐Code: At1g27510) und eine Fd3‐ähnliche Fd‐Isoform
(Fd4 – AGI‐Code: At5g10000) vor (Hanke et al., 2004). Zusätzlich sind zwei weitere,
bislang unbekannte Fd‐ähnliche Peptide (AGI‐Code: At4g14890 bzw. At1g32550) codiert
(Hanke et al., 2004). Diese Fd‐ähnlichen Peptide (At1g32550, At4g14890) enthalten die
konservierten Cystein‐Reste für die Bildung des [2Fe‐2S]‐Zentrums, weisen am C‐
Terminus allerdings deutliche Unterschiede zu den übrigen Fd‐Isoformen auf (siehe
Einleitung 11
Kapitel 3.3). Mit 90 % Anteil an den Blatt‐Fds (Fd1 und Fd2) bildet Fd2 in A. thaliana die
vorherrschende photosynthetische Isoform, während Fd1 nur in vergleichweise
geringen Mengen translatiert wird (vgl. Hanke et al., 2004; Voss et al., 2008). Obwohl
Fd1 und Fd2 eine ähnliche Affinität zur FNR besitzen, gibt es erste Hinweise, die auf eine
spezifische Funktion von Fd1 bei A. thaliana im ZET hindeuten (vgl. Hanke und Hase,
2008).
1.3 Posttranslationale Regulation des Chloroplasten‐Metabolismus
Organismen sind in der Lage, die Geschwindigkeit ihrer metabolischen Prozesse zu
regulieren und somit auf veränderte endogene sowie exogene Faktoren zu reagieren.
Dies ist notwendig, um die intrazelluläre Homöostase aufrecht zu erhalten. Dieses
Prinzip ist in besonderer Weise im chloroplastidären Metabolismus von Pflanzen
verwirklicht, wobei eine Anpassung an das wechselnde Angebot von Licht, Wasser und
Substraten erfolgt. Die häufigste Änderung, an welche der chloroplastidäre
Metabolismus angepasst werden muss, ist der natürliche Tag/Nacht‐Wechsel. Der
Metabolismus am Tag mit der Synthese von Kohlenhydraten ist hierbei vom
Metabolismus in der Nacht mit dem Abbau von Kohlenhydraten vollkommen
unterschiedlich. Um das Auftreten nutzloser Verluste (futile cycles) zu vermeiden, ist die
Aktivität von Enzymen beider Stoffwechselwege streng reguliert. Viele Prozesse im
Stroma unterliegen somit einem fine‐tuning, wobei die beteiligten Enzyme u.a. über den
Intermediatspiegel der entsprechenden Stoffwechselwege einer indirekten
lichtabhängigen Kontrolle unterliegen. Zusätzlich ist die Aktivität einiger
Schlüsselenzyme direkt über Licht mittels des Ferredoxin‐Thioredoxin‐System (Fd‐Trx‐
System, siehe Kapitel 1.3.1) reguliert.
1.3.1 Das Fd‐Trx‐System
Das Fd‐Trx‐System ist ein Oxidations‐Reduktions‐Mechanismus, der die
Stoffwechselaktivität im Stroma an den PET koppelt (vgl. Buchanan, 1980; Wolosuik et
al., 1993; Buchanan und Balmer, 2005, Mora‐Gracia et al., 2006; Schürmann und
Buchanan, 2008) und eine direkt posttranslationale Lichtregulation darstellt. Ein Teil der
Elektronen des PET wird von reduzierten Fd, katalysiert durch die FTR, direkt auf die Trx
übertragen. Reduzierte Trx fungieren als Elektronenüberträger und verändern die
katalytische Aktivität diverser Zielenzyme, was zu einer Aktivierung bzw. Deaktivierung
führt (siehe Abb. 1.4). So wird z. B. die RubisCO‐Aktivase über das Fd‐Trx‐System
posttranslational aktiviert (vgl. Zhang und Portis, 1999). Hingegen ist das
12 Einleitung
Schlüsselenzym des OPP, die Glukose‐6‐Phosphat‐Dehydrogenase (G6PDH), im Licht
über das Fd‐Trx‐System inaktiviert (vgl. Buchanan, 1980; Scheibe, 1990; Wenderoth et
al., 1997). Die hierbei vorliegende kovalente Redox‐Modulation wird durch einen Thiol‐
Disulfid‐Austausch regulatorischer Cystein‐Reste in den Proteinen verursacht (vgl.
Buchanan 1980; Droux et al., 1987). In A. thaliana, wie auch in anderen höheren
Pflanzen, kommen die unterschiedlichsten Trx‐Gruppen vor, welche insgesamt von
einer großen Genfamilie codiert werden (vgl. Meyer et al., 2005) und in vielen
verschiedenen Geweben und Zellkompartimenten lokalisiert sind. Das aktive Zentrum
besteht für alle bekannten Trx aus zwei Cystein‐Resten, getrennt durch zwei weitere AS‐
Reste (CxxC). Eine detaillierte Beschreibung der diversen Trx‐Gruppen und ihrer
Eigenschaften bzw. Funktionen ist in Meyer et al. (2005) gegeben. In den Chloroplasten
werden Trx im Licht über die FTR reduziert, während im Cytosol entsprechend eine
NADPH‐Thioredoxin‐Reduktase (NTR) diese Funktion ausfüllt und NADPH als
Elektronendonator fungiert. Zusätzlich ist in A. thaliana ein Gen für eine
chloroplastidäre NTR codiert (NTRC; AGI‐Code: At2g41680), welche zusätzlich außer
einer NTR‐ eine Trx‐Domäne besitzt und NADPH als Elektronendonator nutzt. An den
homologen Proteinen in Reis konnte gezeigt werden, dass NTRC eine Schlüsselfunktion
im Abbau reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) einnimmt und u.a. als Elektronendonator
für darin beteiligte Peroxiredoxine fungiert (vgl. Serrato et al., 2004; Pérez‐Ruíz et al.,
2006 und Kapitel 1.4.3).
Abb. 1.4: Das Fd‐Trx‐System im Stroma. Schematisch dargestellt ist die Aktivierung bzw. Deaktivierung von Zielenzymen über das Fd‐Trx‐System und die Kopplung an die PET.
Es wird angenommen, dass das Spektrum der über das Fd‐Trx‐System kontrollierten
Stoffwechselwege äußerst vielfältig ist (vgl. Buchanan und Balmer, 2005; Mora‐Gracia,
2006). Im Chloroplasten ist es vor allem eine Regulationsschnittstelle, welche die
metabolische Aktivität im Stroma direkt an die Intensität des photosynthetischen
Elektronenflusses im Zuge der Primärreaktion koppelt und somit ein Regulationssystem
Einleitung 13
zur effektiven und schnellen Anpassung auf wechselnde endogene und exogene
Faktoren (z. B. den Tag/Nacht‐Wechsel) darstellt.
1.3.2 Fine‐tuning und feedback‐Regulation
Neben der posttranslationalen Regulation über das Fd‐Trx‐System (siehe Kapitel 1.3.1)
unterliegen viele Enzyme im Chloroplasten einer postranslationalen Feinregulation oder
einem fine‐tuning über die Intermediate des Metabolismus. Das fine‐tuning ist an den
Elektronenfluss in der Primärreaktion gekoppelt und stellt somit eine indirekte
Lichtregulation dar. So ist für die NADP‐abhängige Malatdehydrogenase (NADP‐MDH)
und die Fructose‐1,6‐Bisphosphat‐Phosphatase (FBPase) eine Aktivierung bzw.
Inaktivierung über den Reduktions‐ bzw. Oxidationsgrad stromaler Intermediate
bekannt. Am Beispiel der NADP‐MDH erfolgt eine Deaktivierung über ein geringes
NADPH/(NADPH+NADP+)‐Verhältnis im Stroma (vgl. Scheibe und Jacquot, 1983),
welches sich in Folge eines eingeschränkten oder nicht ablaufenden LET in der
Primärreaktion einstellt. Hingegen unterliegt die G6PDH einer Deaktivierung über ein
erhöhtes NADPH/(NADPH+NADP+)‐Verhältnis (vgl. Scheibe, 1986; Scheibe et al., 1989;
Dennis und Blakeley, 2000). Die RubisCO unterliegt ebenfalls einer solchen
Feinregulation. Dabei fördern z. B. hohe Mg2+‐ und verringerte H+‐Konzentrationen im
Stroma, die in Folge der Protonenverschiebung innerhalb der Primärreaktion auftreten,
die Aktivierung (vgl. Held, 1979; Portis et al., 1992; Salvucci und Ogren, 1996).
Zusätzlich ist die Aktivität vieler Enzyme des Chloroplasten‐Metabolismus über eine
feedback‐Regulation der spezifischen Metabolite kontrolliert und somit auf den
tatsächlichen metabolischen Bedarf angepasst. Die NADP‐MDH ist z. B. über hohe
Konzentrationen an NADP+ inaktiviert (vgl. Scheibe et al., 1991; Faske et al., 1994;
Scheibe et al., 2004). RubisCO ist u.a. über die Konzentration seiner Substrate, Ribulose‐
1,5‐Bisphosphat (RuBP) und CO2, reguliert und die G6PDH unterliegt einer Inaktivierung
über hohe Konzentrationen an NADPH (vgl. Scheibe et al., 1989).
Das fine‐tuning, sowie die feedback‐Regulation vieler Chloroplasten‐Enzyme
ermöglichen somit zusätzlich zur direkten Lichtregulation über das Fd‐Trx‐System eine
effiziente Anpassung der Enzymaktivität an den metabolischen Bedarf.
1.3.3 Regulation des Kohlenstoff‐Metabolismus im Chloroplasten
In der Sekundärreaktion der Photosynthese, dem Calvin‐Zyklus, wird der größte Anteil
der durch die Primärreaktion bereitgestellten Energie (ATP) und Reduktionsäquivalente
(NADPH) zur CO2‐Assimilation benötigt. Im Zuge der reduktiven CO2‐Assimilation
14 Einleitung
werden Triosephosphate synthetisiert, die außer für die Regeneration von RuBP, für die
Synthese von Hexosen zur Verfügung stehen. Hierbei sind Stärke und Saccharose die
Endprodukte der Kohlenhydratsynthese, wobei Stärke im Chloroplasten und Saccharose
im Cytosol synthetisiert werden. Über die Leitbündel wird Saccharose (in vielen Pflanzen
sind neben Saccharose auch Raffinose, Stachyose und Verbascose als Transportformen
vorhanden) in die heterotrophen Gewebe transportiert. Hier werden die aus der
Photosynthese stammenden Kohlenhydrate zur Gewinnung von Energie und
Reduktionsäquivalenten als Kohlenstoffquelle zum Aufbau von Biomasse sowie als
Speicher benötigt.
Die in den Chloroplasten in Folge der Primär‐ und Sekundärreaktion als transitorische
Stärke assimilierten und gespeicherten Kohlenhydrate werden unter nicht‐
photosynthetischen Bedingungen (z. B. bei Dunkelheit) mobilisiert und in Form von
Maltose und Glukose in Cytosol transportiert. Im Licht werden entsprechend direkt
Triosephosphate aus dem Calvin‐Zyklus ins Cytosol gebracht, z. B. für die
Saccharosesynthese. Die Einstellung eines partitioning zwischen Stärkesynthese und der
Mobilisierung transitorischer Stärke im Chloroplasten sowie der Saccharosesynthese im
Cytosol erfolgt über eine komplexe Regulation der Enzymaktivitäten angepasst an die
jeweilige metabolische Situation und beugt somit einem Anstau von Intermediaten
sowie der Verarmung der Intermediatspiegel vor.
Für die metabolischen Prozesse in den Chloroplasten wird ATP und NADPH im Licht
photoautotroph über die Primärreaktion der Photosynthese erzeugt. Unter nicht‐
photosynthetischen Bedingungen hingegen (idR bei Dunkelheit, allerdings auch unter
Stressbedingungen wie Trockenheit oder Lichtstress) werden notwendige
Stoffwechselwege über die Mobilisierung der transitorischen Stärke mit
Reduktionsäquivalenten versorgt. Die Abspaltung von löslichen Glukanen zur
letztendlichen Synthese von Glukose‐1‐Phosphat (G1P) aus den Stärkegranula der
Chloroplasten erfordert die Phosphorylierung der Glycosyl‐Reste des Amylopektins.
Hierbei ist die Glukan‐Wasser‐Dikinase (GWD) das diese Reaktion katalysierende Enzym
und für die Mobilisierung der Stärke im Chloroplasten essentiell (vgl. Yu et al., 2001).
Die GWD unterliegt einer direkten Lichtregulation über das Fd‐Trx‐System (vgl.
Mikkelsen et al., 2005), so dass nur unter nicht‐photosynthetischen Bedingungen ein
Abbau der Stärkegranula im Chloroplasten erfolgen kann. G1P wird in der Nacht über
den OPP abgebaut.
Im OPP werden Reduktionsmittel und metabolische Intermediate für biosynthetische
Prozesse gewonnen. Das Schlüsselenzym dieses Stoffwechselwegs, die G6PDH, ist bei
A. thaliana in sechs verschiedenen Isoformen im Genom codiert, wobei zwei
Einleitung 15
cytosolische (G6PD5‐G6PD6; AGI‐Code: At3g27300 und At5g40760) und vier plastidäre
(G6PD1‐G6PD4; AGI‐Code: At1g09420, At1g24280, At5g13110 und At5g35790)
Isoformen vorliegen (vgl. Kruger und van Schaewen, 2003). Die plastidären Isoformen
werden hierbei in zwei Gruppen unterteilt, wobei die Isoformen im photosynthetisch
aktiven Plastiden als P1‐Formen und die Isoformen in den nicht‐photosynthetisch
aktiven Plastiden als P2‐Formen zusammengefasst werden (vgl. Wendt et al., 1999;
Kruger und van Schaewen, 2003). In A. thaliana werden G6PD1 der P1‐Klasse, G6PD2
und G6PD3 der P2‐Klasse sowie G6PD5 und G6PD6 den cytosolischen Isoformen
zugeordnet (vgl. Wendt et al., 1999; Kruger und van Schaewen, 2003; Wakao und
Benning, 2005). Alle G6PDH‐Isoformen unterliegen einer feedback‐Regulation und
werden über hohe Konzentrationen an NADPH inaktiviert. Zudem ist die in‐vivo‐
Aktivität mittels fine‐tuning über das NADPH/(NADPH+NADP+)‐Verhältnis kontrolliert
(siehe Kapitel 1.3.2). In den nicht‐photosynthetisch aktiven Plastiden ist der OPP ein
essentieller Mechanismus, um Fd‐abhängige Reaktionen mit NADPH zu versorgen. In
den Chlorplasten hingegen geschieht dies im Licht über die Primärreaktion der
Photosynthese, nur unter nicht‐photosynthetischen Bedingungen wird NADPH über den
OPP generiert. Insgesamt ist der OPP in den Chloroplasten gegenläufig zum Calvin‐
Zyklus. Ein zeitgleicher Ablauf dieser beiden Stoffwechselwege würde zu einem
futile cycle führen. Aus diesem Grund unterliegen OPP und Calvin‐Zyklus u.a. einer
Licht/Dunkel‐Regulation, wobei die Aktivität einiger Schlüsselenzyme dieser
Stoffwechselwege an den PET gekoppelt ist. Im Calvin‐Zyklus ist hier zunächst die
RubisCO zu erwähnen, welche auf verschiedenen Ebenen einer komplexen
Lichtregulation unterliegt und somit ausschließlich im Licht aktiv ist. Außerdem sind die
Aktivitäten von vier weiteren Enzymen (FBPase, Sedoheptulose‐1,7‐Bisphosphat‐
Phosphatase (SBPase), Phosphoribulokinase (PRK) und NAD(P)‐Glycerinaldehyd‐3‐
Phosphat‐Dehydrogenase (NAD(P)‐GAPDH)) des Calvin‐Zyklus u.a. über das Fd‐Trx‐
System direkt reguliert. Das Schlüsselenzym des OPP, die G6PDH, ist hingegen zusätzlich
zu den oben beschriebenen Regulationsmechanismen der G6PDH‐Isoformen über das
Fd‐Trx‐System im Licht inaktiviert und somit nur unter nicht‐photosynthetischen
Bedingungen aktiv (vgl. Buchanan, 1980; Scheibe, 1990; Wenderoth et al., 1997). Diese
gegenläufige Regulation des Calvin‐Zyklus und des OPP über das Fd‐Trx‐System
verhindert das Auftreten eines futile cycle bei gleichzeitigem Ablauf beider
Stoffwechselwege.
16 Einleitung
Lichtstress und Lichtakklimation 1.4
Licht ist nicht nur die elementare Energiequelle der Photosynthesereaktion, sondern
kann auch bei erhöhten Strahlungsintensitäten die Kapazität des
Photosyntheseapparates überschreiten und somit zu oxidativem Stress und
irreversiblen Schäden führen. Um dies möglichst zu verhindern, besitzen Pflanzen
diverse Schutzmechanismen. Einige Pflanzen verfügen über Mechanismen, die eine
erhöhte Absorption an Lichtenergie vermeiden, z. B. über die Stellung der Blätter bei
einigen Leguminosen (vgl. Koller, 1990) oder die Veränderung der
Chloroplastenlokalisation, wodurch die Absorptionsrate um bis zu 20 % herabgesetzt
wird (vgl. Kagawa und Wada, 2002). Zusätzlich besitzen Pflanzen diverse
Akklimationsmechanismen, die Schädigungen in Folge erhöhter Strahlungsenergien
verhindern. Hierbei ist zwischen Kurzzeitakklimation (poising), welche über bereits in
der Zelle vorhandene Komponenten erfolgen, und Langzeitakklimation, welche eine
Veränderung der Genexpression nach sich zieht, zu unterscheiden. Das poising ist ein
schneller reversibler Prozess, während Langzeitakklimation häufig irreversible
metabolische und morphologische Veränderungen des Phänotyps nach sich zieht.
1.4.1 Poising‐Mechanismen
Da der photosynthetische Elektronentransport immer mehr Elektronen liefert als für die
biosynthetischen Stoffwechselwege benötigt werden (vgl. Stitt, 1986), fallen
„Überschusselektronen“ an. Hierbei ist zu beachten, dass im Rahmen der Fixierung
eines Moleküls CO2 im Calvin‐Zyklus drei Moleküle ATP und zwei Moleküle NADPH
benötigt werden, woraus sich ein Verhältnis von 1,5 berechnet. Dieser Wert liegt höher
als der Wert, der für die Bereitstellung von ATP/NADPH über die Lichtreaktion in‐vivo
mit 1,1 bis 1,3 bestimmt wurde (vgl. Heber und Kirk, 1975; Ort und Melandri, 1982;
Badger, 1985), wobei sich der Bedarf an ATP über die Stärkesynthese sowie die
Photorespiration nochmals erhöht. Hieraus ergibt sich eine Überkapazität von
mindestens 0,25 µmol NADPH pro freigesetztem Molekül O2. Erhöhte
Strahlungsenergien sowie CO2‐Limitierung erzeugen zusätzlich einen
Elektronenüberschuss und es entsteht ein Mangel an Elektronenakzeptoren, idR in
Form von NADP+, im Stroma. Einem Elektronenüberschuss und der damit
einhergehenden Akzeptorlimitierung kann über poising‐Mechanismen schnell und
effektiv entgegengewirkt werden, um die Akkumulation toxischer Intermediate (z. B.
ROS) und Schädigungen am Photosyntheseapparat (siehe Kapitel 1.4.3) zu vermeiden
und um das Verhältnis von ATP zu NADPH für die biosynthetischen Prozesse im
Chloroplasten zu optimieren. Zu den poising‐Mechanismen zählen u.a. alternative
Einleitung 17
Elektronenakzeptoren im Stroma, wobei bereits absorbierte Lichtenergie in Form von
Elektronen auf diverse Akzeptoren abgeleitet wird. Dabei spielen die nicht‐
photochemische Löschung überschüssiger Lichtenergie (vgl. Horton et al., 1996), state‐
transitions (vgl. Kruse 2001, Dekker und Boekama, 2005), die Verringerung der
Elektronentransportrate über die Inaktivierung von PSII (vgl. Foyer et al., 1990, Krieger
und Weis, 1993) sowie bedingt auch Photoinhibition am PSII bzw. PSI (vgl. Terashima et
al., 1994; Ivanov et al., 1998) wichtige Rollen.
Das Malat‐Ventil gehört zu den alternativen Elektronenakzeptoren im Stroma. Hierbei
wird Oxalacetat (OAA) im Stroma unter Verbrauch von NADPH zu Malat reduziert, das
über einen hochaffinen Malat‐OAA‐Translokator ins Cytosol gebracht wird. Durch den
Verbrauch von NADPH werden überschüssige Elektronen aus dem Stroma entfernt und
oxidiertes NADP+ steht als Elektronenakzeptor im Stroma erneut zur Verfügung. Das
katalysierende Enzym dieser Reaktion, die NADP‐MDH, unterliegt u.a. einer Regulation
über das Fd‐Trx‐System und ist im Licht aktiv (vgl. Scheibe und Jacquot, 1983; Ferté et
al., 1984; Scheibe, 1991). Eine Feinregulation der Enzymaktivität erfolgt über das
NADPH/(NADPH+NADP+)‐Verhältnis im Stroma, wobei hohe Konzentrationen an NADPH
die reduktive Enzymaktivierung erleichtern. Hingegen erfolgt eine Hemmung der
Aktivierung durch NADP+, wobei hier nicht das Verhältnis, sondern die absolute
Konzentration entscheidend ist (siehe Kapitel 1.3.2). Dieser komplexe Mechanismus der
posttranslationalen Regulation führt schon bei geringen Verschiebungen des
Reduktionszustandes im Stroma zu einer veränderten Aktivität der NADP‐MDH, so dass
die in‐vivo‐Aktivität dieses Enzyms als Marker für den Reduktionsgrad des Stromas
herangezogen werden kann (vgl. Scheibe und Jacquot, 1983; Scheibe und Stitt, 1988;
Foyer et al., 1992; Backhausen et al., 1994). Somit kommt der NADP‐MDH auch eine
wichtige Funktion in der Balancierung des ATP/NADPH Verhältnisses zu (vgl. Scheibe,
1987; Backhausen et al., 1994; Backhausen et al., 2000).
Auch die Photorespiration wird als möglicher Mechanismus zur Entfernung von
überschüssigen Reduktionsäquivalenten und ATP aus der Primärreaktion diskutiert (vgl.
Niyogi, 2000; Foyer et al., 2009), um überschüssige Strahlungsenergien abzubauen.
Dadurch werden ebenfalls Akzeptoren in Form von NADP+ und ADP regeneriert. Auch
für das Enzym Fd‐GOGAT, das bei der Reassimilation des photorespiratorisch
freigesetzten Ammoniums eine Rolle spielt, könnte Fd direkt als Elektronenüberträger
fungieren, um einen verstärkten Elektronendruck in der Primärreaktion zu verringern
(siehe Kapitel 4.1.1). Studien an transgenen Pflanzen belegen, dass eine verminderte
Photorespiration einen Anstieg der in‐vivo‐Aktivität der NADP‐MDH zur Folge hat (vgl.
18 Einleitung
Igamberdiev et al., 2001) und auch umgekehrt ein knock‐out im Gen für die NADP‐MDH
eine erhöhte photorespiratorische Aktivität verursacht (Strodtkötter, unpubl.)
Über die Reaktionen des ZET werden ebenfalls überschüssige Elektronen am PSI
abgenommen und zurück in die Thylakoidmembran transportiert. Im Gegensatz zum
LET, wobei NADPH und ATP gebildet werden, wird im Rahmen des ZET ausschließlich
ATP synthetisiert. Dies ermöglicht den Ausgleich der im Rahmen des LET entstehenden
Überkapazitäten an NADPH (s. o.), welche im Calvin‐Zyklus zusammen mit ATP
verbraucht werden und somit wiederum in Form von NADP+ als Elektronenakzeptor am
PSI zur Verfügung stehen (vgl. Allen, 2003). Vor allem in Cyanobakterien und in C4‐
Pflanzen nimmt der ZET eine essentielle metabolische Funktion ein, um das
ATP/NADPH‐Verhältnis im Stroma zu regulieren und die Chloroplasten der
Bündelscheidenzellen mit ausreichend ATP zu versorgen (vgl. Herbert et al., 1990;
Asada et al., 1993; Ravenel et al., 1994; Mi et al., 1995; Finazzi et al., 1999). In C3‐
Pflanzen hingegen wurde lange Zeit eine signifikante Rolle des ZET ausgeschlossen (vgl.
Herbert et al., 1990; Harbinson und Foyer, 1991; Havaux et al., 1991; Bendall und
Manasse, 1995; Joët et al., 2002). Neuere Studien deuten allerdings auf eine wichtige
Funktion unter verschiedenen Stressbedingungen, vor allem bei erhöhten
Lichtintensitäten, hin (vgl. Clarke und Johnson, 2001; Joliot und Joliot, 2002; 2006;
Golding und Johnson; 2003; Golding et al., 2004; Munekage et al., 2004).
Beim ZET um PSI werden Elektronen im Zuge der Ladungstrennung am P700 über die
Kofaktoren im PSI auf Fd im Stroma übertragen (siehe Kapitel 1.1). Die Elektronenlücke
am P700 wird durch Elektronen aus dem PQ‐Pool über den klassischen
photosynthetischen Elektronentransport aufgefüllt. Zur Vervollständigung dieses Zyklus
werden die Elektronen von Fd zurück in den PQ‐Pool transferiert. Dies kann prinzipiell
über zwei bislang bekannte Wege erfolgen, den Fd‐abhängigen und den NAD(P)H‐
Dehydrogenase‐abhängigen (NDH‐abhängigen) ZET (siehe Abb. 1.5). Es wird
angenommen, dass beide möglichen Wege essentiell, aber auch zum Teil redundant
sind (vgl. Munekage et al., 2004). Der NDH‐abhängige ZET transferiert Elektronen über
NADPH mittels einer membranständigen NAD(P)H‐Dehydrogenase (NDH) in den PQ‐
Pool. Dieser Weg des ZET nimmt vor allem in Cyanobakterien und C4‐Pflanzen eine
essentielle Rolle im photosynthetischen Elektronentransport ein (vgl. Mi et al., 1994;
Takabayashi et al., 2005), wohingegen in C3‐Pflanzen die Funktion bislang noch unklar
ist (vgl. Burrows et al., 1998; Havaux et al., 2005; Rumeau et al., 2005; Nandha et al.,
2007).
Der Fd‐abhängige ZET transferiert Elektronen vom PSI über Fd direkt in den PQ‐Pool.
Hierbei ist noch nicht abschließend geklärt, ob Fd den PQ‐Pool über den Cyt‐b6f
Einleitung 19
Komplex (vgl. Zhang et al., 2001; Kurisu et al., 2003; Stroebel et al., 2003; Joliot et al.,
2004; Joliot und Joliot, 2006; Kramer et al., 2004) oder direkt über eine Ferredoxin‐
Plastochinon‐Reduktase (FQR) (vgl. Moss und Bendall, 1984; Cleland und Bendall, 1992;
Okegawa et al., 2005) reduziert. Es wird allgemein angenommen, dass mehrere
Proteine unter Bildung eines Komplexes am Transport beteiligt sind, wobei Fd, FNR, PSI
(PsaD) und Cyt‐b6f in diesem Zusammenhang diskutiert werden (vgl. Dalcorso et al.,
2008). Munekage et al. (2004) konnten eine essentielle Rolle für das Protein PGR5 im
Fd‐abhängigen ZET bei der Übertragung von Elektronen von Fd in den PQ‐Pool
nachweisen, wobei Nandha et al. (2007) diese Rolle als regulatorisch und nicht direkt
beschrieben haben. Das in der Thylakoidmembran lokalisierte Protein PGRL1 interagiert
mit PGR5 und FNR und ist somit auch Bestandteil des Fd‐abhängigen ZET (vgl. Dalcorso
et al., 2008). Die Tatsache, dass bislang kein FQR‐Protein in Pflanzen nachgewiesen
werden konnte, veranlasste Dalcorso et al. (2008) zu der Annahme, dass ein Komplex
aus PGR5, PGRL1 und FNR diese Funktion einnimmt. Insgesamt erlauben die bis dato
erhobenen Daten keine definitive Klärung der molekularen Abläufe des Fd‐abhängigen
ZET.
Abb. 1.5: Schematische Darstellung des ZET. Abgebildet sind die zwei bekannten Wege des ZET, die Elektronen vom PSI zum einen über NADPH und die membranständige NDH (rote durchgezogene Linie) und zum anderen direkt über Fd (rote gestrichelte Linie) in den PQ‐Pool transferieren. Die Abbildung ist stark vereinfacht, da die genauen Mechanismen des ZET noch nicht abschließend geklärt sind (siehe Text).
O2 ist letztendlich ebenfalls ein alternativer Elektronenakzeptor am PSI. Im Zuge dieser
Reaktion, die auch als Mehler‐Reaktion bezeichnet wird, entstehen ROS (vgl. Mehler,
1951), welche über antioxidative Systeme abgebaut werden, um eine übermäßige
20 Einleitung
Akkumulation und daraus resultierende Schädigungen in der Zelle zu vermeiden
(siehe Kapitel 1.4.3).
Die alternativen Elektronenakzeptoren unterliegen ebenso einer Hierarchie der
Elektronenverteilung am PSI wie es auch für die übrigen Elektronenakzeptoren der Fall
ist (vgl. Backhausen et al., 2000). Hierbei haben antioxidative Reaktionen sowie die
Reduktion von Nitrit Vorrang vor der CO2‐Assimilation, während die Abführung von
Elektronen über das Malat‐Ventil oder die Übertragung auf molekularen O2 erst dann
erfolgt, wenn keine freien Akzeptoren vorhanden sind.
Der ZET ist nicht nur ein alternativer Elektronenakzeptor und u.a. ein Mechanismus, um
das Verhältnis von ATP und NADPH im Stroma anzupassen, sondern auch ein
entscheidender Faktor zur Abführung überschüssiger Lichtenergie. Dabei wird diese im
als NPQ in Form von Wärmestrahlung emittiert wird (vgl. Niyogi, 1999; Shikanai, 2007).
Dieser Mechanismus stellt ebenfalls eine schnelle und effiziente Form des poising in
Pflanzen dar. Im Verlauf eines vermehrt ablaufenden ZET kommt es zur Ansäuerung des
Lumens und es stellt sich ein erhöhter Protonengradient über die Thylakoidmembran
ein. Diese Ansäuerung des Lumens wird in C3‐Pflanzen hauptsächlich dem Fd‐
abhängigen ZET zugeschrieben (vgl. Munekage et al., 2002; Munekage et al., 2004). Im
Zuge des erhöhten Protonengradienten über die Thylakoidmembran erfolgt ein
vermehrter Umbau von Violaxanthin zu Zeaxanthin innerhalb des Xanthophyll‐Zyklus,
wobei die Aktivität der katalysierenden Enzyme dieser Reaktion direkt an den pH‐Wert
im Lumen gekoppelt ist (vgl. Hieber et al., 2000). Lichtenergie wird von Zeaxanthin als
Wärme emittiert und nicht auf das PSII‐Reaktionszentrum übertragen, so dass
überschüssige Lichtenergie keine weitere Erhöhung des photosynthetischen
Elektronenflusses nach sich ziehen kann. Letztendlich hat eine signifikante Erhöhung
von NPQ auch eine Verringerung in der Elektronentransportrate am PSII zur Folge, was
ebenfalls ein effizienter Schutz vor zu hoher Strahlungsenergie ist (vgl. Foyer et al.,
1990; Krieger und Weis, 1993) Dieser Effekt wird durch dynamische Photoinhibition am
PSII nochmals verstärkt. Dynamische Photoinhibition am PSII tritt im Zuge erhöhter
Strahlungsenergien dann auf, wenn die übrigen poising‐Mechanismen gesättigt sind
und wird als Mechanismus zur Vermeidung von Photoinhibition am PSI diskutiert
(siehe Kapitel 1.4.3).
1.4.2 Langzeitakklimation und Signalling
Neben den schnellen poising‐Mechanismen ist auch eine Langzeitakklimation von
entscheidender Bedeutung, um das Auftreten von Schäden vor allem in Folge
Einleitung 21
andauernder erhöhter Strahlungsenergien zu vermeiden. Dies ist mit einer Änderung
der Genexpression verbunden. Typische Formen der Langzeitakklimation bezogen auf
erhöhte Strahlungsenergien sind z. B. die Verschiebung der Sättigungsphase der
Photosynthese in Richtung höherer Lichtintensitäten, die Verringerung des Chla/Chlb‐
Verhältnisses durch einen verringerten Anteil an LHCII (vgl. Bailey et al., 2001) sowie ein
verminderter Anteil an Grana‐Thylakoiden (vgl. Anderson und Osmond, 1987).
Eine Änderung der Genexpression im Zuge einer Langzeitakklimation ist auf Redox‐
Signale aus den Chloroplasten zurückzuführen, welche über eine
Signaltransduktionskette bis zum Nukleus weitergeleitet werden (vgl. Scheibe et al.,
2005). Bislang sind allerdings weder der Ursprung dieses Signals noch die Mechanismen
einer Signaltransduktionskette bekannt. Sowohl Komponenten des PET, z. B. der
Cyt‐b6f Komplex oder der PQ‐Pool als auch lösliche Komponenten im Stroma, z. B. ROS
(siehe Kapitel 1.4.3), Trx oder Glutaredoxine, werden u.a. als mögliche Redox‐Sensoren
und Ursprung des Redox‐Signals angenommen.
Die Aufklärung möglicher initialer Redox‐Signale im Chloroplasten gestaltet sich als
äußerst schwierig, da zum einen nicht von einem einzigen Ursprung ausgegangen
werden kann und zum anderen durch poising‐Mechanismen der Redox‐Zustand des
Chloroplasten so effektiv wie möglich in Balance gehalten wird. Selbst eine
Unterscheidung inwieweit Redox‐Signale entweder vom Reduktionsgrad des PET oder
des Stromas abhängig sind, ist auf Grund der in‐vivo gekoppelten Redoxzustände bislang
nicht möglich gewesen.
Nach einer erfolgten initialen Induktion werden unterschiedlichste Moleküle
angenommen, die in der Weiterleitung eines Redox‐Signals eine entscheidende
Funktion einnehmen und letztlich zu einer Änderung der Genexpression im Kern führen.
So ist bekannt, dass z. B. ROS, Stickstoffmonoxid (NO), Ascorbat (Asc) und einige andere
Moleküle als Redox‐Signale an der Regulation der Genexpression diverser Proteine
beteiligt sind (vgl. Wingate et al., 1988; Arrigoni und De Tullio, 2002; Neill et al., 2002;
Mittler, 2002; Wendehenne et al., 2004). Bei der Weiterleitung eines Redox‐Signals in
den Nukleus und der folgenden Induktion bzw. Repression der Genexpression könnten
Trx und Glutaredoxine eine Rolle spielen (vgl. Meyer et al., 1999; Marchand et al.,
2004). Ebenso wird ein direkter Zusammenhang zwischen Kofaktoren und Enzymen des
Metabolismus und der Transkription diskutiert (vgl. Shi und Shi, 2004). Insgesamt gibt es
einige Hinweise, die auf ein hoch komplexes Netzwerk einer Signaltransduktion in Folge
einer Reaktion auf endogene und exogene Faktoren hinweisen (vgl. Takahashi et al.,
2004; Chen und Zhu, 2004; Hameister et al., 2007; Holtgrefe et al., 2008; Hanke et al.,
2009).
22 Einleitung
1.4.3 Photoinhibition, ROS und antioxidative Systeme
Mechanismen der Kurzzeit‐ und Langzeitakklimation treten auf, um Photoinhibition an
den Photosystemen und die Akkumulation von ROS im Zuge überschüssiger
Strahlungsenergien zu vermeiden. Trotz diverser Akklimationsmechanismen kann
Lichtstress letztendlich Photoinhibition am PSII auslösen, wobei die Bildung von
Chlorophyll‐Triplett‐Zuständen sowie die Akkumulation von Singulett‐Sauerstoff
vorausgehen. Oxidative Schäden am PSII sind die Folge. Sie führen zur Degradation der
D1‐Untereinheit. Photoinhibition tritt dann auf, wenn die Rate des Abbaus der D1‐
Untereinheit die der Neusynthese übersteigt. Die Neusynthese des D1‐Proteins
unterliegt hierbei einem sehr hohen turnover, der unter extremen Lichtintensitäten
maximal ist und von diversen endogenen und exogenen Faktoren bestimmt ist (vgl.
Nishiyama et al., 2001; Adir et al., 2003; Nishiyama et al., 2004; Allakhverdiev und
Murata, 2004; Nishiyama et al., 2005; Nishiyama et al., 2006). Die Degradation hingegen
erfolgt linear zur Lichtintensität (vgl. Allakhverdiev und Murata 2004; Nishiyama et al.
2004). Das Ausmaß an Photoinhibition wird durch die Balance des Abbaus der D1‐
Untereinheit zur Neusynthese bestimmt (vgl. Aro et al., 1993; Adir et al., 2003;
Nishiyama et al., 2005; Nishiyama et al., 2006), wobei prinzipiell dynamische
Photoinhibition und chronische Photoinhibition unterschieden werden können. Die
dynamische Photoinhibition stellt einen Schutzmechanismus bei kurzzeitig erhöhten
Lichtintensitäten dar (siehe Kapitel 1.4.1) und ist in Folge der hohen turnover‐Rate des
D1‐Proteins reversibel. Chronische Photoinhibition hingegen ist bei anhaltend hohen
Lichtintensitäten zu beobachten, wobei wahrscheinlich in Folge einer vermehrten ROS‐
Akkumulation die Neusynthese der D1‐Untereinheit inhibiert ist (vgl. Nishiyama et al.,
2001; Nishiyama et al., 2004). Die Schädigungen am PSII mit dem Abbau des D1‐Proteins
sind in diesem Falle nahezu irreversibel, so dass chronische Photoinhibition am PSII
mehrere Wochen und Monate andauern kann.
Im Gegensatz zur Photoinhibition am PSII ist Photoinhibition am PSI für Pflanzen idR mit
schwerwiegenderen Folgen verbunden. Durch akkumulierende ROS am PSI im Zuge
mangelnder Akzeptoren an der PSI‐Akzeptorseite (z. B. in Folge überschüssig
absorbierter Lichtenergie) treten zunächst oxidative Schäden an den [4Fe‐4S]‐Zentren
Fe‐SA und Fe‐SB der PsaC‐Untereinheit und in späteren Stadien an weiteren Akzeptoren
im PSI‐Komplex auf (vgl. Scheller und Haldrup, 2005). Dies führt letztlich zur
Degradation des Proteinkomplexes (vgl. Sonoike, 1996; Jakob und Heber, 1996; Aroca et
al., 2001; Tjus et al., 2001). Studien an A. thaliana und Gurke zeigen, dass der komplette
Proteinkomlex dem Abbau unterliegt und nicht wie bei der Photoinhibition am PSII
lediglich die D1‐Untereinheit (vgl. Kudoh und Sonoike, 2002; Zhang und Scheller, 2004).
Einleitung 23
Die Degradation von PSI ist ein langwieriger Prozess und kann mehrere Stunden dauern.
Dies ist unter anderem Anlass für die Vermutung, dass es sich um einen induzierten und
gesteuerten Prozess handeln könnte und nicht ausschließlich abhängig von der
Akkumulation von ROS ist (vgl. Scheller und Haldrup, 2005). Die Neusynthese des PSI‐
Komplexes in A. thaliana dauert mehrere Tage, da die turnover‐Raten der PSI‐
Untereinheiten signifikant geringer sind als die der D1‐Untereinheit in PSII (vgl. Sonoike
et al., 1996; Zhang und Scheller, 2004). Zusätzlich konnte an A. thaliana gezeigt werden,
dass die Menge an neu synthetisierten PSI‐Komplexen wahrscheinlich geringer ist, als
vor der Degradation (vgl. Zhang und Scheller, 2004). Fortschreitende Photoinhibition am
PSI stellt demnach einen zum Teil irreversiblen Prozess dar und verursacht nachhaltige
Schäden in der Pflanze. Dynamische Photoinhibition am PSII ist unter anderem ein
Mechanismus, der Photoinhibition am PSI vorbeugt, so dass in A. thaliana
Photoinhibition am PSI immer mit Photoinhibition am PSII einhergeht (vgl. Sonoike et
al., 1996; Tjus et al., 1998; Zhang und Scheller, 2004). Die Aufklärung der molekularen
Mechanismen der Photoinhibition am PSI und ihrer mögliche Regulation sowie die
funktionale Einordnung stehen allerdings noch aus.
Letztlich verursachen exogene Stressfaktoren, z. B. erhöhte Strahlungsenergien, die
Akkumulation von ROS, z. B. Superoxid (O2‐) oder Wasserstoffperoxid (H2O2) (vgl.
Mittler, 2002). ROS sind äußerst reaktive Moleküle, welche irreversible Schäden in der
Zelle verursachen können. Neuere Studien belegen allerdings auch, dass ROS nicht nur
als toxischer Faktor in Folge von Stressfaktoren akkumulieren, sondern auch als
Signalling‐ und Regulatormoleküle fungieren (vgl. Mittler et al., 2004; Foyer und Noctor,
2005; Fujita et al., 2006; Bailey‐Sorres und Mittler, 2006). Diese regulatorische Funktion
ist nur im Zusammenhang mit effektiven antioxidativen Systemen möglich, die einer
unkontrollierten Akkumulation entgegenwirken und die ROS‐Homöostase in der Zelle
stabilisieren (vgl. Mittler, 2004; Bailey‐Sorres und Mittler, 2006; Mittler et al., 2008).
In den Chloroplasten entstehen ROS hauptsächlich in Folge der Mehler‐Reaktion (vgl.
Mehler, 1951) am PSI und an den Antennenpigmenten (vgl. Mittler, 2004), wobei in
Folge mangelnder Akzeptoren Elektronen auf O2 übertragen werden und O2‐ entsteht.
Mittels der Superoxiddismutase (SOD) kann O2‐ zu H2O2 detoxifiziert werden. Der Abbau
von H2O2 erfolgt u.a. über den Beck‐Halliwell‐Asada‐Weg (water‐water cycle) (vgl. Foyer
und Halliwell, 1976; Groden und Beck, 1979; Asada, 1999). Hierbei wird H2O2 mittels
Askorbat (Asc) als Elektronendonator zu H2O reduziert, was über eine Askorbat‐
Peroxidase (APX) katalysiert wird (siehe Abb. 1.6). APX stellt das Schlüsselenzym in
diesem Stoffwechselweg dar und ist entweder an der Thylakoidmembran gebunden
oder liegt frei im Stroma vor (vgl. Asada, 2000). Die Regeneration von Asc aus
24 Einleitung
Monodehydroaskorbat (MDA) kann entweder über die Monodehydroaskorbat‐
Reduktase (MDHR), wobei NADPH aus der Primärreaktion als Elektronendonator dient,
oder mittels reduziertem Glutathion (GSH), katalysiert über die Dehydroaskorbat‐
Peroxydase (DHAR), erfolgen. GSH wird durch die Reduktion von oxidiertem Glutathion
(GSSG) mittels NADPH als Elektronendonator wiederum über die Glutathion‐Reduktase
(GR) reduziert. Alternativ wird MDA auch über Fd aus der Primärreaktion direkt
reduziert.
Abb. 1.6: Antioxidative Systeme im Stroma. Dargestellt ist eine vereinfachte Reaktionsabfolge zum Abbau von ROS (O2
‐ und H2O2) im Stroma. Hierbei ist neben dem Beck‐Halliwell‐Asada‐Weg die Reduktion von H2O2 über Prx dargestellt (dunkelgrau unterlegt) und die alternative Möglichkeit, über den OPP Reduktionsäquivalente unter nicht photosynthetischen Bedingungen zu generieren (gestrichelter Rahmen). Neben der Mehler‐Reaktion, bei welcher Elektronen über Fd auf O2 fließen, ist eine alternative Möglichkeit angegeben, wobei Elektronen über einen stromalen Faktor (SF) direkt vom PSI auf O2 übertragen werden (vgl. Asada et al., 1999).
Neben dem Beck‐Halliwell‐Asada‐Weg kann H2O2 über Peroxiredoxine (Prx) reduziert
und detoxifiziert werden (vgl. Dietz et al., 2002). Prx sind übiquitär verbreitete
antioxidative Proteine, welche in die Gruppe der Thiol‐spezifischen Reduktasen bzw.
Einleitung 25
Peroxidasen eingeordnet werden (vgl. Kobayashi et al., 2004), kommen in diversen
Isoformen vor (vgl. Dietz. et al., 2002; Rouhier und Jacquot 2002) und katalysieren die
Reduktion von Peroxiden, z. B. H2O2. Im Chloroplasten von A. thaliana sind drei Prx‐
Klassen lokalisiert (2‐Cys‐Prx; Prx Q und Prx II mit der Unterklasse Prx II E)
(vgl. Dietz et al., 2006). 2‐Cys‐Prx katalysieren einen alternativen Weg zum Beck‐
Halliwell‐Asada‐Weg zur Detoxifizierung von H2O2 (vgl. Baier et al., 2000). Hierbei dient
2‐Cys‐Prx als Elektronendonator und Peroxidase zur Reduktion von H2O2. Die Re‐
Reduzierung von 2‐Cys‐Prx kann über Trx‐x (vgl. Collin et al., 2003), das plastidäre Trx
CDSP32 (vgl. Broin et al., 2002; Rey et al., 2005) oder auch Cyclophiline (vgl. Laxa et al.,
2007) erfolgen. Trx‐x bzw. CDSP32 werden im Licht über das Fd‐Trx‐System reduziert, so
dass reduziertes Fd aus dem PET als Elektronendonator für die Regeneration von Prx
erforderlich ist. Zusätzlich kann die Reduktion von Prx über die NTRC katalysiert werden,
welche eine Doppelfunktion als Trx‐Reduktase sowie als Trx‐x aufweist (vgl. Serrato et
al., 2004; Pérez‐Ruíz et al., 2006) und NADPH als Elektronendonator nutzt. Die
Reduktion von Prx über NTRC ist hierbei deutlich effektiver als über Trx bzw. CDSP32
(vgl. Pérez‐Ruíz et al., 2006). Ebenso konnte in diesem Zusammenhang gezeigt werden,
dass NTRC vor allem im Dunkeln eine entscheidende Funktion einnimmt und NADPH
aus den OPP als Elektronendonator nutzt. Neben ihrer antioxidativen Funktion sind Prx
auch an der Regulation des zellulären Signalling und der Zelldifferenzierung
entscheidend beteiligt (vgl. Hoffmann et al., 2002).
1.5 Ziele der Arbeit
Pflanzen sind sessile Organismen und haben daher im Laufe der Evolution vielfältige
Mechanismen entwickelt, um sich wechselnden externen Bedingungen mit hoher
Effektivität anzupassen. Hierzu zählt auch das Licht, welches nicht nur die Energie für
die Photosynthese liefert, sondern auch bei hohen Strahlungsintensitäten zu einem
schädigenden Faktor werden kann. Um dies zu vermeiden und ein vitales,
photoautotrophes Wachstum zu gewährleisten, besitzen Pflanzen diverse Anpassungs‐
und Schutzmechanismen, welche allerdings nur zum Teil vollständig aufgeklärt sind.
Fd2‐KO‐Pflanzen dienen im Rahmen dieser Arbeit als Modell, um eine extreme
Hochlichtsituation zu simulieren und die Anpassungsmechanismen dieser Pflanzen zu
analysieren. Hier wird der Fokus vor allem auf die molekularen Abläufe des
photosynthetischen Elektronentransportes und der daran geknüpften metabolischen
Reaktionen im Stroma gelegt. Die Bedeutung und das Zusammenspiel von poising‐
Mechanismen zur schnellen Anpassung der Redox‐Homöostase und der
Langzeitakklimation an extreme Lichtintensitäten soll verdeutlicht werden.
26 Einleitung
Eine Langzeitakklimation geht mit einer veränderten Genexpression einher. Der Großteil
der in den Chloroplasten lokalisierten Proteine ist kerncodiert, so dass sich in diesem
Fall die Frage nach einem Signal aus den Chloroplasten zur Änderung der Genexpression
im Kern in Folge erhöhter Strahlungsenergien stellt. Der Ursprung bzw. die Art eines
solchen Signals ist Gegenstand von kontroversen Diskussionen. Im Rahmen dieser
Arbeit soll anhand der Fd2‐KO‐Pflanzen der Ursprung eines solchen Signals zur
Änderung der Genexpression in Folge erhöhter Strahlungsintensitäten genauer
lokalisiert werden.
In diesem Zusammenhang werden die Fd2‐KO‐Pflanzen für eine differenzierte
Betrachtung der Regulation des Chloroplasten‐Metabolismus herangezogen. Die
Aktivität vieler Enzyme im Stroma ist an die Photosynthesereaktion gekoppelt, um
bezogen auf das Angebot der Intermediate und den Bedarf der Pflanze effizient
operieren zu können. Das Zusammenspiel zwischen einer veränderten Genexpression
sowie der posttranslationalen Regulation der Enzymaktivitäten im Zuge extremer
Lichtbedingungen soll anhand von beispielhaften Schlüsselenzymen des Metabolismus
im Mittelpunkt stehen. Fd2‐KO‐Pflanzen sollen daher im Rahmen dieser Arbeit als
Modell herangezogen werden, um folgende Fragestellungen zu untersuchen:
1. Welche Mechanismen sind unter extremen Lichtbedingungen
entscheidend, um die Vitalität einer Pflanze zu gewährleisten?
2. Wo liegt der Ursprung eines chloroplastidären Signals, das die
Änderung der Genexpression im Kern induziert?
3. Wie wird der stromale Metabolismus in den Chloroplasten der Fd2‐
KO‐Pflanzen an diese extreme Situation angepasst?
Ferredoxine dienen in der Photosynthese als zentraler Elektronenverteiler am PSI. In
den Blättern höherer Pflanzen sind verschiedene Isoformen nachgewiesen worden.
Bislang konnte allerdings nicht eindeutig geklärt werden, inwieweit unterschiedliche
Isoformen spezifische Funktionen im photosynthetischen Elektronentransport
einnehmen. In A. thaliana sollen im Rahmen dieser Arbeit anhand von Fd2‐KO‐, Fd1‐KO‐
und Fd1‐RNAi‐Mutanten die spezifischen Funktionen der photosynthetischen Fd‐
Isoformen in C3‐Pflanzen genauer analysiert werden. Hierbei wird der Fokus vor allem
auf die von Hanke und Hase (2008) postulierten Funktionsunterschiede der
photosynthetischen Fd‐Isoformen (Fd1 und Fd2) im linearen und zyklischen
Elektronentransport gelegt. Zusätzlich soll anhand der Fd1‐KO‐Pflanzen auf die
Bedeutung des zyklischen Elektronentransportes in C3‐Pflanzen eingegangen werden.
Folgende Fragestellungen werden demnach im Rahmen dieser Arbeit bearbeitet:
Einleitung 27
1. Sind die Fd‐Isoformen Fd1 und Fd2 im photosynthetischen Gewebe redundant
oder funktionell differenziert?
2. Ist der zyklische Elektronentransport in C3‐Pflanzen nur bei Bedarf von
Bedeutung oder ein obligater Mechanismus im Rahmen der
Photosynthesereaktion?
Neben den bekannten Fd‐Isoformen zeigten Hanke et al. (2004) zwei zusätzliche Fd‐
ähnliche Peptide (FdC1 und FdC2) in A. thaliana auf, für welche bis heute allerdings
keine weitere Charakterisierung vorgenommen wurde. Versuche an den Fd2‐KO‐
Pflanzen deuten auf eine Funktion von FdC1 und FdC2 im photosynthetischen
Elektronentransport hin. Im Rahmen dieser Arbeit wird eine erste Charakterisierung von
FdC1 gegeben. Anhand dieser Charakterisierung soll die Möglichkeit geklärt werden, ob
FdC1 als neue Fd‐Isoform im photosynthetischen Elektronentransport fungieren kann.
In diesem Zusammenhang werden folgende Fragestellungen betrachtet:
1. Ist FdC1 eine neue, in den Chloroplasten lokalisierte und am photosynthetischen
Elektronentransport beteiligte Fd‐Isoform?
2. Welche physiologische Funktion besitzt FdC1 in A. thaliana?
28 Material und Methoden
2 Material und Methoden
Chemikalien 2.1
2.2
Alle verwendeten Chemikalien wurden, soweit nicht anders vermerkt, in pro analysi‐
Qualität von den Firmen AppliChem (Darmstadt), Biomol (Hamburg), Biozym
(Oldendorf), Boehringer (Ingelheim), Duchefa (Haarlem, Niederlande),
Invitrogen (Karlsruhe), Roche (Mannheim), Fermentas (St. Leon‐Rot), Merck
(Darmstadt), New England Biolabs (Frankfurt), Riedel de Haen (Seelze), Roth (Karlsruhe),
Serva (Heidelberg), Sigma‐Aldrich (München), Stratagene (Heidelberg) bezogen.
Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene transgene und entsprechende WT‐
Pflanzen der Art Arabidopsis thaliana L. (Heynh.) verwendet (siehe Tab. 2.1). Hierbei
musste auf Grund der Verfügbarkeit der transgenen Pflanzen mit unterschiedlichen
Ökotypen gearbeitet werden.
Fd2 knock‐out (Fd2‐KO) Pflanzen des Ökotyps Noessen tragen eine homozygote Ds‐
Transposon‐Insertion (Ds‐T‐DNA) im Gen At1g60950, transformiert über das Ac/Ds‐
tagging‐System (vgl. Federoff und Smith, 1993). Saatgut für Pflanzen mit einer
heterozygoten Ds‐T‐DNA‐Insertion und entsprechende Wildtypen(Noe‐WT) wurden
vom RIKEN Institute (RIKEN Genomics Science Center, Yokohama, Japan) bezogen.
Mittels RT‐PCR‐Analysen wurden für das Ds‐T‐DNA‐Insert homozygote Pflanzen
identifiziert. Die hierbei verwendeten Oligonukleotide sind in Tab. 2.2 einzusehen.
Fd1 knock‐out (Fd1‐KO) Pflanzen des Ökotyps Landsberg erecta tragen eine homozygote
Ds‐Transposon‐Insertion im Gen At1g10960, transformiert über das
gene‐trap Transposon tagging‐System (vgl. Sundaresan et al., 1995). Saatgut für
Pflanzen mit einer heterozygoten Ds‐T‐DNA‐Insertion im Gen At1g10960 und
entsprechende Wildtypen (Lae‐WT) wurden vom Cold Spring Harbor Laboratory (Cold
Spring Harbor Laboratory, Long Island, USA) bezogen. Mittels RT‐PCR‐Analysen wurden
für die Ds‐T‐DNA‐Insertion homozygote Pflanzen identifiziert (siehe Abb. 3.41). Die
hierbei verwendeten Oligonukleotide sind in Tab. 2.2 einzusehen.
Die Fd1 RNA‐interference (Fd1‐RNAi) und die FdC1 RNA‐interference (FdC1‐RNAi)
Pflanzen des Ökotyps Columbia tragen eine modifizierte Version des Vektors pB1101
(vgl. Jefferson et al., 1987) im Genom, wobei ca. 200 bp lange Fragmente von Fd1 bzw.
FdC1 in sense und antisense Richtung in diesen Vektor eingebracht wurden (vgl. Hanke
Material und Methoden 29
und Hase, 2008). Die Fd1‐RNAi‐, FdC1‐RNAi‐ und die entsprechenden Wildtypen (Col‐
WT) wurden vom Laboratory of Regulation of Biological Reactions (Laboratory of
Regulation of Biological Reactions, Institute for Protein Research, Universität Osaka,
Japan) entwickelt und für die Versuche im Rahmen dieser Arbeit zur Verfügung gestellt.
Mittels der RNA‐interference‐Methode (vgl. Fire et al., 1998) ist neben der
Transkriptmenge auch der Proteingehalt in den Fd1‐RNAi‐Pflanzen verringert (vgl.
Hanke und Hase, 2008). In den FdC1‐RNAi‐Pflanzen wurde ein deutlich verminderter
FdC1‐mRNA‐Gehalt und verringerte Mengen an FdC1‐Protein nachgewiesen (Hanke,
unpubl.).
Alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Pflanzen wurden im Kurztag (vgl. Becker et
al., 2006) auf Erde (36,4 % Bims, 36,4 % Kompost, 18,2 % Torf, 9,1 % Sand, 1,5 g/l PolyCrescal) in Klimakammern angezogen. Hierbei wurden Töpfe mit einem
Durchmesser von 5 cm verwendet. Die Pflanzen wurden zwei Wochen nach der Aussaat
vereinzelt und entweder unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1, 20 °C; 55 %
Luftfeuchtigkeit; 21 % O2; 0,04 % CO2) oder im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1; 20 °C; 55 %
Luftfeuchtigkeit; 21 % O2; 0,04 % CO2) bis zu zehn Wochen weiter kultiviert. Die
Belichtung in den Klimakammern erfolgte über Hochdruck‐Metallhalogendampfllampen
des Typs SON‐T Agro, 400 W (Philips, Hamburg).
Tab. 2.1: Transgene Linien der Art A. thaliana. Aufgelistet sind die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten transgenen Pflanzen‐Linien mit Hintergrundinformationen zum Ökotyp, AGI‐Code des mutierten Gens sowie Bezugsquellen und Referenzen.
Oligonukleotide 2.3
Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide (siehe Tab. 2.2) wurden von
der MWG‐Biotech AG (Ebersberg) bezogen.
30 Material und Methoden
Tab. 2.2: Liste der verwendeten Oligonukleotide. Aufgelistet sind die verwendeten Oligonukleotide mit der Angabe der spezifischen Annealing‐Temperatur (Annealing‐Temp.) sowie die optimierte Zyklenzahl für das zu amplifizierende Fragment im Rahmen der RT‐PCR‐Analysen.
Pigmentbestimmung 2.4
Die quantitative Bestimmung der Blatt‐Pigmente wurde modifiziert nach Sims und
Gamon (2002) durchgeführt. Zwei Blattscheiben (1,33 cm2) wurden in flüssigem
Material und Methoden 31
Stickstoff pulverisiert, mit Aceton‐Tris‐Puffer homogenisiert und zentrifugiert (1300 x g,
10 min, Raumtemperatur (RT)). Der Pigmentgehalt im Überstand wurde photometrisch
im Cary UV Visible Spectrophotometer (Varian GmbH, Darmstadt) bestimmt und
anschließend bezogen auf die Blattfläche berechnet (vgl. Sims und Gamon, 2002).
Aceton‐Tris‐Puffer: 80 % (v/v) 100 % Aceton 20 % (v/v) 200 mM Tris mit HCl auf pH 7,6 einstellen
2.5
2.6
Bestimmung von Frisch‐ und Trockengewicht
Das Blattfrischgewicht wurde mit einer AB135‐S Analysewaage (Mettler Toledo,
Giessen) an Blattscheiben (1,33 cm2) bestimmt. Die gleichen Blattscheiben wurden zur
Bestimmung des Trockengewichts herangezogen. Hierfür wurden die Blattscheiben
zuvor zwei Tage bei 50 °C getrocknet.
Proteinbestimmung nach Bradford
Die Proteinbestimmungen im Rahmen dieser Arbeit wurden im Blatt‐Rohextrakt nach
Bradford (1976) mit BSA als Referenzprotein durchgeführt.
Für die Gewinnung des Rohextraktes aus A. thaliana wurden fünf in flüssigem Stickstoff
pulverisierte Blattscheiben (1,33 cm2) mit einem Gewicht von ca. 100 mg mit 100 µl
Extraktionspuffer homogenisiert. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert (8000 x g,
5 min, 4 °C) und für die Proteinbestimmung nach Bradford (1976) verwendet.
Extraktionspuffer: 50 mM Tris 100 mM Kaliumacetat 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 1 mM DTTRED (Dithiothreitol) 20% (v/v) Glycerin mit KOH auf pH 7 einstellen
auf 1 ml frisch dazu: 1:2000 (v/v) Plant‐Protease‐Inhibitor‐Cocktail (Sigma‐Aldrich,
München) 1 µl 1 M DTTRED in 1 M Tris‐HCl (pH 7,8)
2.7 Stärkenachweis in Blattscheiben
Die für die Stärkebestimmung verwendeten Blattscheiben (1,33 cm2) wurden direkt
nach der Ernte in 100 % Methanol bei 70 °C inkubiert, bis alle Pigmente ausgewaschen
waren (ca. 20 min). Danach wurden die Blattscheiben für 1 min bei RT in Iod‐
Kaliumiodid‐Lösung angefärbt, mit H2Obidest gewaschen und ca. 5 min auf Whatman‐
Papier (3 mm, Schleicher und Schuell, Dassel) getrocknet und fotografiert.
32 Material und Methoden
Iod‐Kaliumiodid‐Lösung: 6,7 % (w/v) Kaliumiodid 3,3 % (w/v) Iod
Reverse Transkriptase PCR (RT‐PCR) 2.8
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Expressionsanalysen an A. thaliana
wurden mittels RT‐PCR angelehnt an Ahn (2002) durchgeführt. Hierfür wurde aus
Blattmaterial die Gesamt‐RNA isoliert und mittels Reverse Transkriptase in cDNA
umgeschrieben. Mittels spezifischer Oligonukleotide (siehe Tab. 2.2) wurden die zu
untersuchenden Gene amplifiziert und im Agarosegel zur weiteren Auswertung
aufgetrennt.
2.8.1 Isolierung von Gesamt‐RNA
Zur Isolierung der Gesamt‐RNA wurde TRI‐Reagenz (Sigma‐Aldrich, München,
Deutschland) verwendet. Die RNA‐Isolierung mit TRI‐Reagenz ist eine
Weiterentwicklung der Phenol‐Chloroform Extraktion nach Chomczynski und Sacchi
(1987). Alle für die Isolierung verwendeten Materialien wurden zuvor bei trockener
Hitze (100 – 200°C) oder durch Autoklavieren entkeimt. Verwendete Lösungen und
H2Obidest wurden mit 0,1% (v/v) DEPC, einem starken RNAse‐Inhibitor (vgl. Ehrenberg et
al., 1966), versetzt.
Pulverisiertes Blattmaterial (ca. 100 mg) wurde mit 1 ml TRI‐Reagenz homogenisiert und
für 5 min bei RT inkubiert. Nach einer Zentrifugation (12000 x g, 10 min, 4 °C) wurde der
Überstand mit 200 µl Chloroform versetzt, gemischt und 3 min bei RT inkubiert. Nach
einer weiteren Zentrifugation (12000 x g, 10 min, 4 °C) wurde die obere, wässrige Phase
mit 500 µl Isopropanol versetzt und für 10 min bei RT inkubiert. Die Lösung wurde
zentrifugiert (12000 x g, 8 min, 4 °C) und das Pellet mit 1 ml 75 % Ethanol gewaschen
(7500 x g, 10 min, 4 °C). Das Pellet wurde vollständig von Ethanol gesäubert und bei
60 °C sowie 300 upm im Thermomixer comfort 5436 (Eppendorf, Hamburg) resuspendiert. Das in DEPC‐H2O gelöste Pellet wurde mit 0,2 Volumeneinheiten 3 M
Natrium‐Acetat (pH 5) und 2,5 Volumeneinheiten 100 % Ethanol über Nacht bei ‐80 °C
gefällt. Nach einer Zentrifugation (20817 x g, 15 min, RT) wurde das Pellet mit 80 %
Ethanol gewaschen (20817 x g, 10 min, RT). Der Überstand wurde verworfen, das Pellet
wurde sorgfältig von Ethanol‐Resten gereinigt und in 20 µl DEPC‐H2O für 10 min bei
60 °C und 300 upm im Thermomixer comfort 5436 (Eppendorf, Hamburg) resuspendiert.
Nach einer weiteren Zentrifugation (20817 x g, 5 min, RT) wurde der Überstand
bei ‐20 °C gelagert.
Material und Methoden 33
2.8.2 RNA‐Quantifizierung mittels Absorptionsmessungen
Die RNA‐Konzentrationen wurden mittels Absorptionsmessungen im Bio‐Photometer
(Eppendorf, Hamburg) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Eine Extinktion von
1 entspricht hierbei 33 µg/ml RNA (vgl. Lottspeich und Zobras, 1998). Die Messungen
erfolgten bei einer Verdünnung von 1:50 in DEPC‐H2O (0,1 % (v/v) DEPC) in einer
Plastibrand® UV‐Kunststoffküvette (Brand, Wertheim). Um Verunreinigungen der RNA
auszuschließen, wurde zusätzlich die Extinktion bei 230 nm (Absorption von Phenolen
und Kohlenhydraten) und 280 nm (Absorption aromatischer AS) bestimmt. Nach
Lottspeich und Zobras (1998) liegt das Verhältnis 260 nm zu 280 nm für reine RNA bei
2,0.
2.8.3 DNAse‐Verdau
Um die RNA‐Lösungen von möglichen DNA‐Resten zu befreien, wurde ein DNAse‐
Verdau mit DNAse I (1 u / µl, Fermentas, St. Leon‐Rot) durchgeführt. Es wurden 5 µg
Gesamt‐RNA für den Verdau eingesetzt. Zur RNA wurden 5 µl 10 x DNAseI‐Puffer mit
MgCl2 (Fermentas, St. Leon‐Rot) gegeben und die Lösung mit DEPC‐H2O auf ein
Gesamtvolumen von 45 µl aufgefüllt und vorsichtig gemischt. Der Reaktionsansatz
wurde 30 min bei 37 °C inkubiert. Nach der Zugabe von 5 µl 25 mM EDTA wurde der
Reaktionsansatz bei 60 °C für 10 min weiter inkubiert. Durch Einfrieren in flüssigem
Stickstoff bei ‐196 °C wurde die Reaktion gestoppt und die reine RNA‐Lösung bei ‐80 °C
gelagert.
2.8.4 Einzelstrang‐cDNA‐Synthese mittels Reverser Transkriptase (RT)
Zur Synthese von cDNA aus Gesamt‐RNA wurde das RevertAidTM H Minus First strand
cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon‐Rot) mit der RevertAid H Minus M‐Mul V RT
(200 U/ml) verwendet. Es wurde ausschließlich mit Oligo(dT)18‐Primer (0,5 µg/ml) zur
cDNA‐Erststrang‐Synthese gearbeitet. Dieser hybridisiert spezifisch im Bereich des
poly(A)‐Überhangs am 3´‐Ende eukaryotischer mRNA. Die Synthese der cDNA erfolgte
nach Herstellerangaben, wobei 11 µl der Gesamt‐RNA aus dem DNAse‐Verdau
eingesetzt wurde. Die cDNA wurde bei ‐20 °C gelagert.
2.8.5 Amplifikation von cDNA mittels Polymerase‐Kettenreaktion (PCR)
Um bestimmte cDNA‐Fragmente zur Bestimmung des Expressionsniveau ausgewählter
Gene zu bestimmen, wurden für diese Sequenzen spezifische Oligonukleotide in der
PCR‐Reaktion (vgl. Mullis und Faloona, 1987) eingesetzt (siehe Tab. 2.2). Um
34 Material und Methoden
Pipettierfehler zu minimieren, wurde die cDNA für den PCR‐Reaktionsansatz zuvor 1:10
in Merck‐H2O verdünnt. Der PCR‐Reaktionsansatz wurde in zuvor autoklavierten
0,2 ml Eppendorf‐Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg) in einem Gesamtvolumen
von 20 μl angesetzt. Taq‐Polymerase (nativ, ohne BSA), aus dem Bakterium
Thermus aquaticus, MgCl2, Desoxyribonukleotide (dNTP´s) sowie Taq‐Puffer ohne MgCl2
wurden von der Fermentas (St. Leon Rot) bezogen. Der PCR‐Reaktionsansatz setzte sich
wie folgt zusammen:
1,5 mM MgCl2 1 µM forward‐Primer 1 µM reverse‐Primer 0,1 mM dNTPs 1 x Reaktionspuffer 1,25 U Taq‐Polymerase 10 µl 1:10 verdünnte cDNA Auf 20 µl mit Merck‐H2O auffüllen
Für die PCR‐Ampflifikation der cDNA wurde entweder ein Mastercycler® Personal oder
ein Mastercycler® Gradient (beide Eppendorf, Hamburg) verwendet. Um Rückschlüsse
auf das Expressionsniveau verschiedener Gene anhand der cDNA nach der Amplifikation
ziehen zu können, wurde für jedes in dieser Arbeit untersuchte Fragment eine
Optimierung der Zyklenzahl durchgeführt, um zu gewährleisten, dass die Amplifikation
im linearen Bereich abläuft. Hierfür wurde WT‐cDNA als Substrat für die PCR‐Reaktion
eingesetzt. Die Auswertung und die Bestimmung der optimalen Zyklenzahl wurde
anhand einer densiometrischen Auswertung (siehe Kapitel 2.8.7) bestimmt. Die jeweils
optimierte Zyklenzahl sowie die spezifische Annealing‐Temperatur für die eingesetzten
Oligonukleotide sind in Tab. 2.2 zusammengefasst. Folgendes PCR‐Programm wurde für
die Amplifizierung der cDNA verwendet.
5 min 95°C Prä‐Denaturierung 1 min 95°C Denaturierung Optimierte Zyklenzahl 1 min XX°C Annealing 1 min 72°C Extension 5 min 72°C Abschluss‐Extension ∞ 10°C Kühlung
2.8.6 Auftrennung der Fragmente im Agarosegel
Die analytische Auftrennung der zuvor amplifizierten cDNA erfolgte in horizontalen TAE‐
Gelen. Für ein Gel wurden 100 ml 1x TAE‐Puffer mit 1,5 % (w/v) Agarose versetzt und
aufgekocht. Nach dem Abkühlen der Agarose‐TAE‐Lösung auf ca. 50°C wurden 30 µl
0,1 % Ethidiumbromid zugegeben und die Lösung in Gelkammern (10 x 10 x 1 cm) mit
Material und Methoden 35
Taschenformer gegossen. Nach dem Aushärten des Gels wurde der Taschenformer
entfernt und das Gel in einer Laufkammer mit 0,5x TAE‐Puffer überschichtet. Die cDNA‐
Amplifikate aus der PCR‐Reaktion (siehe Kapitel 2.8.5) wurden mit
0,2 Volumeneinheiten 5x TBE‐Ladepuffer versetzt. Die Auftrennung erfolgte bei einer
Spannung von 100 V. Die Agarosegele wurden mit dem
Molecular Imager Gel Doc XR System (BioRad, München) ausgewertet.
TAE‐Puffer: 2 M Tris 100 mM EDTA mit Essigsäure auf pH 8 einstellen
TBE‐Ladepuffer: 90 mM Tris 90 mM Borsäure 2,5 mM EDTA 6 % (v/v) Glycerin 0,04 % (w/v) Bromphenolblau mit NaOH auf pH 7,6 einstellen
2.8.7 Densiometrische Auswertung
Die im Agarosegel aufgetrennten Amplifikate der RT‐PCR‐Analysen wurden einer
densiometrischen Auswertung über das Programm Quantity One (Version 4.6.1, BioRad,
München) nach Herstellerangaben durchgeführt. Hierbei wurde die Dichte der Banden
densiometrisch analysiert. Als Bezugswert diente der GeneRulerTM 100 bp Plus DNA
Ladder, von welchem in jedem Agarosegel als Standardbande 0,33 µg DNA aufgetragen
wurden. Für jedes amplifizierte Fragment wurde auf die gleiche cDNA eine RT‐PCR‐
Analyse für Ubiquitin 10 (UBQ10 – At4g05320) als housekeeping gene durchgeführt, um
die Qualität der isolierten cDNA zu prüfen und um die densiometrisch berechneten
cDNA‐Konzentrationen der einzelnen Fragmente auf den UBQ10‐Gehalt abzugleichen.
Für die Zyklusoptimierungen wurde eine einfache densiometrische Bestimmung der
Dichte der im Agarosegel aufgetrennten Banden durchgeführt. Zur Überprüfung der
Qualität der hierfür eingesetzten cDNA wurde ebenfalls eine RT‐PCR‐Analyse für UBQ10
durchgeführt.
2.9 Immundetektion
Der immunologische Nachweis von Proteinen in A. thaliana wurde in Rohextrakten aus
Blattmaterial durchgeführt Die Proteine im Rohextrakt wurden elektrophoretisch
aufgetrennt, auf eine Membran geblottet und mit spezifischen Antikörpern
(siehe Tab. 2.3) detektiert. Die Isolierung des Rohextraktes und die Bestimmung der
36 Material und Methoden
Gesamt‐Proteinmenge im Rohextrakt wurde wie in Kapitel 2.6 beschrieben durch‐
geführt.
2.9.1 SDS‐PAGE
Die Auftrennung isolierter Proteine aus dem Rohextrakt erfolgte im vertikalen 15 %igen
Natrium‐Dodecylsulfat‐Polyacrylamid‐Gel (SDS‐Gel) nach Laemmli (1970).
Hierfür wurde ein 3 %iges Sammelgel über ein 15 %iges Trenngel gegossen. 25 µg
Protein aus dem Rohextrakt wurden zusammen mit 1/3 Probenvolumen 4 x SDS‐
Gelladepuffer für 10 min im kochenden Wasserbad erhitzt. Durch Zugabe von
0,1 Volumeneinheiten DTTRED wurden Disulfidbrücken zwischen Cystein‐Resten
reduziert und somit aufgebrochen. Nach dem Abkühlen wurde die Proben nochmals mit
0,1 Volumeneinheiten 1 M DTTRED für 10 min reduziert. Die so aufbereiteten Proben
wurden mit einer Hamilton‐Spritze (Techlab, Erkerode) auf das Sammelgel aufgetragen.
15 %iges Trenngel: 2,3 ml 40 % Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1) 1,6 ml 1,5 M Tris‐HCl (pH 8,8), 0,4% SDS 40 µl 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat (APS) 60 µl 5 % (v/v) TEMED 2 ml H2Obidest
3 %iges Sammelgel: 230 µl 40% Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1)
1,5 ml 0,5 M Tris‐HCl (pH 6,8), 0,4% SDS, 20 µl 10 % (w/v) APS 80 µl 5% (v/v) TEMED 1,2 ml H2Obidest
4 x Gelladepuffer: 3 ml 4 M Tris‐HCl (pH 6,8) 2 g SDS 20 ml Glycerin
50 mg Bromphenolblau auf 50 ml mit H2Obidest auffüllen SDS – Laufpuffer : 12 mM Tris 192 mM Glycerin 1 % (w/v) SDS
2.9.2 Western‐Blot und Immundetektion
Nach der Methode von Burnette (1981) wurden die mittels SDS‐PAGE aufgetrennten
Proteine auf eine ImmunblotTM PVDF‐Membran (Porengröße 0,2 µm, BioRad, München)
transferiert. Die PVDF‐Membran wurde 10 s in 100% Methanol, danach 10 s in H2Obidest
gewaschen und 15 min in Transferpuffer inkubiert. Das SDS‐Gel wurde ebenfalls für
15 ‐ 30 min in Transferpuffer vorinkubiert. Der Transfer der Proteine auf die Membran
erfolgte nach Herstellerangaben nass in Transferpuffer in der Mini Trans‐
Blot Electrophoretic Transfer Cell (Biorad, München) bei 90 mA für 12 h. Zur Fixierung
Material und Methoden 37
der Proteine wurde die Membran nach dem Blot kurz in 100 % Methanol geschwenkt
und anschließend getrocknet. Um unspezifische Antikörperbindung an die proteinfreien
Bereiche der Membran zu vermeiden, wurde diese für 1 h in Blocking‐Puffer inkubiert.
Nach dem Blockieren wurde die Membran mit 10 ml des ersten spezifischen
Antikörpers (Verdünnung: siehe Tab. 2.3) für 1 h bei RT bei leichtem Schütteln inkubiert.
Die Antikörper‐Lösung wurde abgegossen und die Membran dreimal für 10 min in
Blocking‐Puffer und einmal für 10 min in TBS‐Puffer gewaschen, um nicht gebundene
Antikörperreste zu entfernen. Als zweiter Antikörper wurde 50 ml (1:25000 verdünnt)
der anti‐Kaninchen‐IgG‐Antikörper (BioRad, München) mit daran gekoppelter
Peroxidase verwendet, wobei die Membran für 1 h bei RT bei leichtem Schütteln
inkubiert wurde. Die Membran wurde dreimal für 10 min in Blocking‐Puffer und einmal
für 10 min in TBS‐Puffer gewaschen. Anschließend folgte die Färbung mit dem
ELC Western blotting detection reagents and analysis system (Amersham Bioscience,
Freiburg), welche nach Herstellerangaben durchgeführt wurde. Der für 10 min
aufgelegte Film (Kodak, Stuttgart) wurde für 3 min im Entwickler (Kodak, Stuttgart)
entwickelt und im Fixierer (Kodak, Stuttgart) 5 min fixiert.
Transferpuffer: 39 mM Glycin 48 mM Tris TBS‐Puffer: 20 mM Tris 0,5 M NaCl
mit HCl auf pH 7,4 einstellen Blocking‐Puffer: 50 mM Tris 150 mM NaCl 0,2 % (v/v) Tween 20 Mit HCl auf pH 7,6 einstellen 0,25 g/l fettfreies BSA frisch zugeben
Tab. 2.3: Liste der verwendeten Antikörper. Aufgelistet sind die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Antikörper, wobei die angegebene Verdünnung für die in Kapitel 2.9.2 beschriebene Immundetektion verwendet wurde. Der Antiköper gegen Fd aus Mais wurde von T. Hase (Universität Osaka), der Antikörper gegen NTRC aus Reis von F.J. Cejudo (Instituto de Bioquimica Vegetal y Fotosintesis, Sevillia, Spanien) und der Antikörper gegen BAS1 von K.J. Dietz (Universität Bielefeld) zur Verfügung gestellt.
38 Material und Methoden
Auftrennung von Pigment‐Protein‐Komplexen der Thylakoidmembran im Saccharosegradienten
2.10
Um die qualitative Zusammensetzung der Thylakoidmembran zu analysieren wurden
isolierte Thylakoide im Saccharosegradienten modifiziert nach der Methode von Ruban
et al. (1999) aufgetrennt.
2.10.1 Isolierung von Thylakoiden aus A. thaliana
Alle im Rahmen der Isolierung verwendeten Geräte und Materialien wurden auf 4 °C
vorgekühlt und die Zentrifugationsschritte wurden, soweit nicht anders vermerkt, in
einer Sorvall‐RC5 ‐Zentrifuge (Kendro, Hanau) mit den SS 34‐Rotor (Kendro, Hanau)
durchgeführt.
Es wurde ca. 10 g Blattmaterial geerntet und direkt in flüssigem Stickstoff gefroren. In
60 ml Homogenisierungspuffer wurde das eingefrorene Blattmaterial viermal 5 s mit
dem Ultra‐Turrax T25 (Janke und Kunkel IKA Labortechnik, Staufen) aufgeschlossen. Die
Suspension wurde durch vier Lagen Verbandsmull (Lohmann, Neuwied) und einer Lage
Miracloth (Calbiochem, Darmstadt) gefiltert, dann gleichmäßig auf
80 ml Zentrifugenröhrchen verteilt und anschließend zentrifugiert (2420 x g, 2 min,
4 °C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 10 ml Sorbitmedium vorsichtig
resuspendiert. Die resuspendierte Lösung wurde in neue 80 ml Zentrifugenröhren
überführt und zunächst mit 3 ml 0,4 x Percoll‐Sorbitmedium sowie darauf mit
3 ml 1 x Percoll‐Sorbitmedium vorsichtig unterschichtet. Es folgte eine Zentrifugation im
HB 4‐Rotor (Kendro, Hanau) (2420 x g, 30 min, 4 °C, ohne Bremse), wobei sich die
Chloroplasten an der Grenzschicht zwischen dem 0,4 x Percoll‐Sorbitmedium und dem
1 x Percoll‐Sorbitmedium absetzten. Die Chloroplasten wurden vorsichtig mit einer
Pasteurpipette abgenommen, mit 10 ml Sorbitmedium in einem
80 ml Zentrifugenröhrchen verdünnt und zentrifugiert (2420 x g, 2 min, 4 °C). Der
Überstand wurde verworfen und das Pellet in 1 ml Sorbitmedium aufgenommen, mit
4 ml 5 mM KH2PO4 (pH 7,6) verdünnt und für 10 min bei RT inkubiert, wobei die
Chloroplasten durch den osmotischen Schock aufbrechen. Es folgte eine Zentrifugation
der aufgeschlossenen Chloroplasten (23426 x g, 30 min, 4 °C) um die Thylakoide zu
sedimentieren. Das Thylakoid‐Pellet wurde in 10 ml 5 mM KH2PO4 (pH 7,6)
resuspendiert und erneut zentrifugiert (20199 x g, 100 min, 4 °C). Das Pellet mit den
Thylakoiden wurde in 500 µl 5 mM KH2PO4 (pH 7,6) aufgenommen und der
Chlorophyllgehalt nach Porra et al. (1989) bestimmt.
Material und Methoden 39
Homogenisierungspuffer: 0,3 mM Sorbit (Lagerung bei ‐20 °C) 20 mM Tricin 5 mM EGTA 5 mM EDTA 10 mM NaHCO3 0,1 % (w/v) BSA auf pH 8,4 einstellen 2 mM Asc frisch hinzugegeben Sorbitmedium: 0,3 mM Sorbit (Lagerung bei ‐20 °C) 20 mM HEPES 5 mM MgCl2 2,5 mM EDTA 10 mM NaHCO3
0,1 % (w/v) BSA auf pH 7,9 einstellen 2 mM Asc frisch hinzugegeben Percoll‐Sorbitmedium: Sorbitmedium angesetzt in 100 % Percoll
2.10.2 Herstellung des Saccharosegradienten
Für die Auftrennung der Pigment‐Protein‐Komplexe wurde ein 8‐Stufen‐
Saccharosegradient direkt in einem Ultrazentrifugenröhrchen erstellt (siehe Abb. 2.1).
Hierbei wurde zunächst über eine fest installierte Glas‐Pasteurpipette 1,5 ml einer
0,16 M Saccharose‐Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführt. Mit 1,5 ml einer
0,26 M Saccharose‐Lösung wurde die 1,6 M Saccharose‐Lösung vorsichtig
unterschichtet. Nach diesem Prinzip wurde der Gradient weiter mit höher
konzentrierten Saccharose‐Lösungen unterschichtet, bis ein 8‐stufiger Gradient nach
dem in Abb. 2.1 dargestellten Schema erstellt war. Die unterschiedlich konzentrierten
Saccharose‐Lösungen wurden hierbei aus einer 0,16 M und einer 1,87 M Saccharose‐
Lösung erstellt, wobei die Lösung mit der geringeren Saccharosekonzentration jeweils
mit der 1,87 M Stammlösung hochkonzentriert wurde.
0,16 M Saccharose‐Lösung: 3,3 g Saccharose 20 mM NaF mit HEPES‐Puffer‐A auf 60 ml auffüllen 600 µl HEPES‐Puffer‐B zugeben 1,87 M Saccharose‐Lösung: 38,4 g Saccharose 20 mM NaF mit HEPES‐Puffer‐A auf 60 ml auffüllen 600 µl HEPES‐Puffer‐B zugeben HEPES‐Puffer‐A: 5 mM HEPES mit KOH auf pH 7,6 einstellen HEPES‐Puffer‐B: 5 mM HEPES 1 % (w/v) n‐Dodecyl‐Maltosid
mit KOH auf pH 7,6 einstellen
40 Material und Methoden
Abb. 2.1: Schematische Aufbau des Saccharosegradienten. Links: Aufbau und Herstellung. Rechts: Fertiger 8‐Stufen‐Saccharosegradient.
2.10.3 Probenvorbereitung und Auftrennung
Für die isolierten Thylakoide wurde der Chlorophyllgehalt nach Porra et al. (1989)
bestimmt. Es wurden 250 µg Thylakoide (bezogen auf den Chlorophyllgehalt) mit
HEPES‐Puffer‐A (siehe Kapitel 2.10.2) auf 500 µl aufgefüllt. Weiter wurden 500 µl
HEPES‐Puffer‐C zugegeben, so dass alle verwendeten Proben ein Gesamtvolumen von
1000 µl bei einem Chlorophyllgehalt von 250 µg/ml aufwiesen. Das Probengemisch
wurde 30 min auf Eis inkubiert, wobei alle 5 min die Proben durch kurzes Schütteln
homogenisiert wurden. Von dem Probenansatz wurden 500 µl auf den
Saccharosegradienten aufgetragen.
Die Saccharosegradienten mit den aufgetragenen Proben wurden in der Optima XL‐80K
Ultrazentrifuge mit dem SW 41 – Rotor (Beckman Instruments Inc., Fullerton ‐ CA, USA)
zentrifugiert (19700 x g, 4 °C, 20 h, Beschleunigung 5, Bremse 5). Nach der
Zentrifugation wurden die Saccharosegradienten gegen einen weißen Hintergrund
fotografiert.
HEPES‐Puffer‐C: 5 mM HEPES 1,4 % (w/v) n‐Dodecyl‐Maltosid mit KOH auf pH 7,6 einstellen
Material und Methoden 41
2.11 P700‐Absorptionsmessungen
Die P700‐Absorptionsmessungen und der experimentelle Aufbau wurden in Anlehnung
an das von Schreiber et al. (1988) entwickelten Puls‐Amplituden‐Modulationsprinzip
durchgeführt. Soweit nicht anders vermerkt wurden die Messungen jeweils nach drei
Stunden in der Lichtphase vorgenommen, um diurnale Verschiebungen auszuschließen.
2.11.1 Experimentelles Setup
Zur Bestimmung der Absorptionsänderungen von P700 (ΔAP700) im Nahen‐Infrarot‐
Bereich (NIR) wurde das Fluorometer PAM‐101 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich)
verwendet Dabei wurden kurze Messlichtimpulse (1 µs, λ = 830 nm) über eine
lichtemittierende Diode (LED) in der Emittor‐Detektor‐Einheit ED‐P700‐DW‐E (Heinz
Walz GmbH, Effeltrich) bei einer Modulation von 100 kHz angelegt. Der Messlichtimpuls
wurde am PAM‐101 auf eine Intensität von zwölf festgelegt (0,07 µE m‐2 s‐1). Über den
2‐Wellenlängen‐Detektor ED P700 DW‐E (Heinz Walz GmbH, Effeltrich) wurden
Emissions‐Messungen bei einer Wellenlänge von 830 nm durchgeführt. Als Referenz
dienten Messungen bei einer Wellenlänge von 860 nm (siehe Kapitel 3.1.2.1). Die
Glasfiberoptik EK‐1 (Euromex, Arnheim) wurde als NIR‐Quelle verwendet, wobei die
Einstellung der Wellenlänge von λ > 700 nm mit dem Filter RG‐716 (Schott, Hochheim)
vorgenommen wurde. Die Datenaufzeichnung für ΔAP700 über WinControl‐
Software (Heinz Walz GmbH, Effeltrich) erfolgte mit dem PAM‐Data‐Acquisition‐System
(PDA‐100, Heinz Walz GmbH, Effeltrich), wobei die Verstärkung (Gain) des Signals nach
voheriger Optimierung auf neun und die Dämpfung (Damping) auf elf festgelegt wurde.
Die Bestimmung von ΔAP700 im NIR wurde direkt an Blattscheiben (1,33 cm2)
durchgeführt. Die Pflanzen wurden zuvor für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten
(siehe Kapitel 3.1.2.1). Die Messungen von ΔAP700 erfolgten zunächst für ca. 3 min im
Dunkeln. Anschliessend erfolgte eine Bestrahlung der Blattscheiben für bis zu 7 min im
NIR. Hierbei wurde alle 0,06 s ein Messpunkt aufgezeichnet, wobei ΔAP700 im Dunkeln
vor der Messung manuell auf 300 – 400 mV am PAM‐101 gesetzt wurde, um ein
Abdriften in negative Werte zu vermeiden, da diese von der WinControl‐Software nicht
aufgezeichnet werden. Die Daten sind als ΔAP700‐Kinetik im Ergebnisteil dargestellt,
wobei die Aufbereitung der Rohdaten mit dem Programm Graphpad Prism (Software
Mackiev, Graphpad Software, Version 4.02) erfolgte.
42 Material und Methoden
2.11.2 Bestimmung der maximalen P700‐Absorptionsänderung im NIR
Aus den ΔAP700‐Kinetiken konnte die maximale Änderung von ΔAP700 im NIR (ΔAP700‐MAX)
bestimmt werden, wobei die arithmetischen Mittelwerte von ΔAP700 im Dunkeln
(ΔAP700‐D) und ΔAP700 im NIR (ΔAP700‐N) mit n > 1000 für die Berechnung herangezogen
wurden (ΔAP700‐MAX = ΔAP700‐N ‐ ΔAP700‐D).
2.12
2.11.3 Bestimmung von ΔAP700 im NIR an mit Methylviologen behandelten Blattscheiben
Die Messungen und Auswertung von ΔAP700 an mit Methylviologen (MV) behandelten
Blattscheiben (1,33 cm2) erfolgte nach dem in Kapitel 2.11.1 und Kapitel 2.11.2
beschriebenen Prinzip. Hierfür wurden die Blattscheiben vor der Messung mit der
Blattoberseite in 10 ml H2O (Referenzwert) bzw. in 10 ml 100 µM Methylviologen für 5 h
im Dunkeln inkubiert. MV wird hierbei über die Epidermiszellen der Blattscheiben
aufgenommen.
Chlorophyllfluoreszenz‐Messungen
Die Messungen der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wurden zur Einordnung der
photosynthetischen Lichtnutzung von Pflanzen durchgeführt und erfolgten nach dem
Puls‐Amplituden‐Modulationsprinzip in Anlehnung an Schreiber (1986). Soweit nicht
anders vermerkt fanden die Messungen nach drei Stunden in der Lichtphase statt, um
diurnale Schwankungen auszuschließen.
2.12.1 Experimentelles Setup
Die Bestimmung der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission am PSII erfolgte mit dem
Fluorometer PAM‐101 mit integriertem PAM‐103 (flash trigger control) (Heinz Walz
GmbH, Effeltrich). Durch eine LED in der Emitter‐Detektor‐Einheit 101 ED(Heinz Walz
GmbH, Effeltrich) wurden kurze Messlichtimpulse (ML ‐ λ = 650 nm) von 1 μs bei einer
Modulation von 1,6 kHz bzw. 100 kHz (siehe Abb. 2.2) abgestrahlt. Der Messlichtimpuls
wurde am PAM‐101 auf eine Intensität von zwölf (0,1 µE m‐2 s‐1) festgelegt. Zwischen
den Lichtpulsen wurde im Detektor‐Teil der Emittor‐Detektor‐Einheit 101 ED (Heinz
Walz GmbH, Effeltrich) die jeweilige Fluoreszenzemission bei λ > 700 nm gemessen. Die
Trennung des Messlichts vom aktinischen Licht (AL ‐ photosynthetisch nutzbares Licht)
macht es möglich, die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission unter verschiedenen
Lichtintensitäten zu messen. Emittiert wurde das aktinische Licht von der Halogenlampe
Material und Methoden 43
KL 1500 (Schott, Hochheim). Die Lichtpulse mit einer Intensität bis zu 5000 μE m‐2 s‐1
wurden durch eine Lichtquelle FL‐103 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich) abgegeben. Die
Datenaufzeichnung der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission über WinControl‐
Software (Heinz Walz GmbH, Effeltrich) erfolgte mit dem PAM‐Data‐Acquisition‐System
(PDA‐100, Heinz Walz GmbH, Effeltrich), wobei die Verstärkung (Gain) des
aufgenommenen Signals am PAM‐101, nach voheriger Optimierung, auf zwölf und die
Dämpfung (Damping) auf elf festgelegt wurde.
2.12.2 Bestimmung der Parameter zur photosynthetischen Lichtnutzung
Die Pflanzen wurden vor jeder Messung 15 – 30 min im Dunkeln gehalten, bevor an
Blattscheiben (1,33 cm2) die Messung der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission erfolgte,
wobei alle 0,02 s ein Datenpunkt aufgezeichnet wurde. Innerhalb der Messung wurde
zunächst an der Dunkel‐adaptierten Blattscheibe die Grundfluoreszenz (F0) im Messlicht
und die maximale Fluoreszenz (FM) durch einen Sättigungspuls (1 s bei ca. 5000 μE)
bestimmt. Anschließend folgte eine kurze Dunkelphase (ca. 10 s), um die Re‐Oxidation
von P680 zu ermöglichen. Weiter wurde die Blattscheibe 15 min mit aktinischem Licht
(150 bzw. 800 μE m‐2 s‐1) und zusätzlich in 30 s‐Intervallen mit SPs bestrahlt
(siehe Abb. 2.2).
Anhand der aufgezeichneten Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wurden in Anlehnung an
Schreiber et al. (1986), Walker (1988) und Genty et al. (1989) Parameter zur Einordnung
der photosynthetischen Lichtnutzung bestimmt bzw. berechnet, wobei die Nomenklatur
nach van Knooten und Snel (1990) erfolgte. Hierbei wurden zunächst die Parameter F0,
FM, F (steady‐state Fluoreszenz im aktinischem Licht), F0’ (Grundfluoreszenz im Licht‐
adaptierten Zustand) und FM’ (maximale Fluoreszenz im Licht‐adaptierten Zustand)
abgeleitet (siehe Abb. 2.2). Aus diesen Parametern wurde anhand der unten
angegebenen Formeln ФII (Quantenausbeute am PSII), qP (photochemische
Fluoreszenzlöschung – photochemical quenching), NPQ (nicht‐photochemische
Fluoreszenzlöschung – non‐photochemical quenching), ETR (Elektronentransportrate)
sowie FV/FM, und qL berechnet.
ФII = 'FF'F
M
M −
'F'FF
NPQM
MM −=
M
0M
M
V FFFF
F −=
'F'FF'F
qP0M
M
−−
= /FFqP
q0
L =
0,5*LI*'FF'F
ETRM
M −= LI = Betrag der anliegenden Lichtintensität in µE m‐2 s‐1
44 Material und Methoden
Abb. 2.2: Schematische Darstellung einer typischen Chlorophyllfluoreszenz‐Messung. Neben der Messkurve sind an der x‐Achse die variierenden Einstellungen während der Messung und an der y‐Achsedie zu bestimmenden Parameter für die Auswertung (siehe Kapitel 2.12.2) angegeben.
2.12.3 Bestimmung des Parameters FC
Zur Bestimmung des Parameters FC, dem Anteil der chlororespiratorischen
Chlorophyllfloureszenz‐Emission eines Licht‐adaptierten Blattes im Dunkeln, bezogen
auf die Chlorophyllfloureszenz‐Emission im Licht (siehe Kapitel 2.12.2), wurde das in
Kapitel 2.12.1 beschriebene experimentelle Setup verwendet. Für die Messung der
Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wurden Blattscheiben herangezogen (1,33 cm2),
welche für 15 min mit aktinischem Licht (150 bzw. 800 μE m‐2 s‐1) bestrahlt und danach
für bis zu 10 min im Dunkeln weiter bemessen wurden (siehe Abb. 2.3). Hierbei wurde
alle 0,02 s ein Datenpunkt aufgezeichnet. Die Berechnung von FC erfolgte anhand der
aufgezeichneten Chlorophyllfluoreszenz‐Emission nach folgender Formel:
'FF'FF
F0
00C
C
−=
−
Die Bestimmung von F und F0’ erfolgte hierbei wie in Kapitel 2.12.2 beschrieben. Für F0C
wurde die maximale Chlororespiration (Chlorophyllfluoreszenz‐Emission im Dunkeln im
Licht‐adaptierten Blatt) bestimmt (siehe Abb. 2.3).
Material und Methoden 45
Abb. 2.3: Schematische Darstellung einer typischen Chlorophyllfluoreszenz‐Messung mit Chlororespiration im Dunkeln. Neben der Messkurve sind an der x‐Achse die variierenden Einstellungen während der Messung und an der y‐Achse die zu bestimmenden Parameter für die Auswertung von FC angegeben. Die Messung muss mindestens 15 min im aktinischen Licht (AL) erfolgen, um den Parameter FC
M im Dunkeln bestimmen zu können.
CO2‐Gaswechselmessungen 2.13 Die in den folgenden Kapiteln beschriebene Methodik befasst sich mit dem Prinzip der
CO2‐Gaswechselmessungen und beschreibt die variablen Parameter für die in dieser
Arbeit durchgeführten Versuche. Die Bedienung des hierbei verwendeten Systems
sowie allgemeine Parameter und Anwendungen sind hierbei, soweit im Rahmen dieses
Kapitels nicht aufgeführt, der Bedienungsanleitung des Herstellers (LI‐6400 Instruction
Manual, Version 6; ftp://ftp.licor.com/perm/env/LI‐6400/Manual/Using_the_LI‐
6400XT‐v6.1.pdf) zu entnehmen.
sich mit dem Prinzip der
CO2‐Gaswechselmessungen und beschreibt die variablen Parameter für die in dieser
Arbeit durchgeführten Versuche. Die Bedienung des hierbei verwendeten Systems
sowie allgemeine Parameter und Anwendungen sind hierbei, soweit im Rahmen dieses
Kapitels nicht aufgeführt, der Bedienungsanleitung des Herstellers (LI‐6400 Instruction
Manual, Version 6; ftp://ftp.licor.com/perm/env/LI‐6400/Manual/Using_the_LI‐
6400XT‐v6.1.pdf) zu entnehmen.
2.13.1 Experimentelles Setup 2.13.1 Experimentelles Setup
Für die Messungen an A. thaliana wurde das LI‐6400XT Portable Photosynthesis System
(LI‐COR Biosciences, Lincoln, USA) verwendet. Zusätzliche für das LI‐6400XT Portable
Photosynthesis System spezifische Geräte und Applikationen wurden ebenfalls von der
Firma LI‐COR Biosciences bezogen und nach Herstellerangaben verwendet.
Für die Messungen an A. thaliana wurde das LI‐6400XT Portable Photosynthesis System
(LI‐COR Biosciences, Lincoln, USA) verwendet. Zusätzliche für das LI‐6400XT Portable
Photosynthesis System spezifische Geräte und Applikationen wurden ebenfalls von der
Firma LI‐COR Biosciences bezogen und nach Herstellerangaben verwendet.
Bei dem LI‐6400XT Portable Photosynthesis System handelt es sich um ein offenes
Gaswechselsystem. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen wurde
dem aufgenommenen Gasgemisch zunächst CO2 mittels Natronkalk (LI‐COR Biosciences,
Lincoln, USA) entzogen und über getrocknetes CaSO4 (Drierite, LI‐COR Biosciences,
Bei dem LI‐6400XT Portable Photosynthesis System handelt es sich um ein offenes
Gaswechselsystem. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen wurde
dem aufgenommenen Gasgemisch zunächst CO2 mittels Natronkalk (LI‐COR Biosciences,
Lincoln, USA) entzogen und über getrocknetes CaSO4 (Drierite, LI‐COR Biosciences,
Lincoln, USA) die relative Luftfeuchtigkeit reguliert. Mittels dem 6400‐01 CO2‐Mixer Lincoln, USA) die relative Luftfeuchtigkeit reguliert. Mittels dem 6400‐01 CO2‐Mixer
46 Material und Methoden
wurden über einen 12 g CO2‐Zylinder (LI‐COR Biosciences, Lincoln, USA) dem nun CO2‐
freien Gasgemisch kontrolliert CO2 zugeführt, um es danach in die Messküvette mit der
Blattprobe zu pumpen. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche an
A. thaliana wurde die Gaswechsel‐Küvette 6400‐40 Leaf Chamber Fluorometer
verwendet. iese Gaswechsel‐Küvette dient hierbei zusätzlich als Lichtquelle und als
Fluorometer. Die Messungen der CO2‐ sowie der H2O‐Konzentration im Gasgemisch
erfolgte über Infrarot‐Gasanalysatoren (IRGA). Hierbei wurde ein Teil des anliegenden
Gasgemisches über die Messküvette mit dem eingespannten Blatt geleitet und die CO2‐
sowie H2O‐Konzentrationen als Sample‐Werte ([CO2S] bzw. [H2OS]) von einem IRGA
direkt hinter der Messküvette aufgezeichnet. Ein Teil des Gasgemisches wurde an der
Messküvette vorbei geleitet und von einem zweiten IRGA analysiert, um die Referenz‐
Werte der CO2‐ sowie H2O‐Konzentrationen ([CO2R] bzw. [H2OR]) zu bestimmen.
Während der Messungen erfolgte vor jeder Aufnahme eines Datenpunktes ein Abgleich
der IRGAs über den Match‐Mode. Die CO2‐Assimilationsrate bzw. Photosyntheserate (A)
wurde nach folgender Beziehung berechnet:
D
S][CO*ES
S])[COR]([CO*u 2A 2T
2−
−=
Hierbei wurde die Flussrate (u) direkt über ein flow‐meter aufgezeichnet. Die Blattfläche
E
(S) wurde über die Fläche der Messküvette (1,8 cm2) abgeleitet und die
Transpirationsrate ( T) über folgende Beziehung bestimmt:
OS])[H(1*SOR])[HOS]([H*u 22
E2
T −−
=
Für alle im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen der Photosyntheseraten
(
ch lie
Beziehungen sind, soweit nicht aufgeführt, den Herstellerangaben zu entnehmen.
wurden zuvor Stabilitätskriterien festgelegt. Die Stabilitätskriterien beschreiben einen
Bereich, in welchem die aufgenommenen Parameter stabil sind und somit die
Aufnahme eines Datenpunktes erlauben. Hierfür wurde ein Bemessenszeitraum von
15 s gesetzt, in welchem [CO2S] und [H2OS] keiner höheren Schwankung als 1 µmol mol ‐
1 unterliegen und Abweichungen in der Flussrate nicht mehr als 1 mol s‐1 betragen
durften. Das LI‐6400XT Portable Photosynthesis System wurde über die für das System
spezifische Software OPEN (Version 5, LI‐COR Biosciences, Lincoln, USA) gesteuert. Die
Datenaufzeichnung wurde automatisiert über die OPEN‐Software durchgeführt, wobei
neben den über die System‐Sensoren direkt gemessenen Parametern (z. B. CO2‐
Konzentrationen, Temperatur oder Lichtintensität) auch die Kalkulation der zu
berechnenden Parameter z. B. Photosyntheserate, Blattleitfähigkeit oder
Transpirationsrate) automatis erfolgte. Die hier zu Grunde genden mathematischen
Material und Methoden 47
2.13.2 Bestimmung des CO2‐Gaswechsels im steady‐state
Die Bestimmung des CO2‐Gaswechsels im steady‐state wurde nach dem in
nisteil nicht anders
d i e
ngen
ie Lichtsättigungskurven mit der simultanen Bestimmung der Chlorophyllfluoreszenz‐
ungen
e
g h 2
g l
kl
Kapitel 2.13.1 beschriebenen Prinzip durchgeführt. Soweit im Ergeb
vermerkt, wurden ie Pflanzen jeweils nach dre Stunden in der Lichtphase bemess n.
Für die Messungen wurden zur Anzucht identische Bedingungen etabliert (150 bzw.
800 µE m‐2 s‐1, 20 °C, 55 % Luftfeuchtigkeit; 21 % O2; 0,04 % CO2). Für jede Pflanze
wurden fünf Messpunkte innerhalb einer fünfminütigen Messung gesetzt.
2.13.3 Lichtsättigungskurven und Chlorophyllfluoreszenz‐Messu
D
Emission wurden unter den in Kapitel 2.13.1 beschriebenen Voraussetz
durchgeführt. Hierbei wurde die jeweilige Photosyntheserate in Abhängigkeit zur
anliegend n Lichtintensität bestimmt. Mittels der Gaswechsel‐Küvette 6400‐
40 Leaf Chamber Fluorometer wurde zusätzlich die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission
nach dem Puls‐Amplituden‐Modulationsprinzip auf ezeic net (siehe Kapitel 2.1 ) und
nach dem in Kapitel 2.12.2 dargestellten System direkt über die OPEN‐Software
ausgewertet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden „schnelle“ Lichtsättigungskurven erstellt,
um die minimale sowie maximale Photosyntheserate in Abhängigkeit von der
Lichtintensität bestimmen zu können. Hierbei wurde in kurzen Abständen von hohen zu
niedrigen Lichtintensitäten emessen, womit das das natür iche Schließen der Stomata
unter niedrigen Lichtintensitäten vermieden wurde. Jede Lichtintensität wurde
höchstens für 2 min angelegt. Die Photosyntheserate bei der jeweilig anliegenden
Lichtintensität wurde frühestens nach 1 min und spätestens nach 2 min, abhängig von
der Erfüllung der Stabilitätskriterien, aufgezeichnet. Innerhalb der Messung über ein
zuvor erstelltes Autoprogramm wurde die Pflanze zunächst für 10 min im Dunkeln
gehalten, um F0 und FM im Dunkel‐adaptierten Blatt zu bestimmen. Nach der
Dunkelinkubation wurden in großen Schritten die Lichtintensität bis auf 2000 µE m‐2 s‐1
erhöht und folgend in einen Schritten verringert (siehe Lichtsättigungskurven‐
Autoprogramm). Für die Auswertung wurden die Daten herangezogen, die zwischen
2000 und 0 µE m‐2 s‐1 aufgenommen wurden. Während der Messung wurden die zur
Anzucht identische Bedingungen (20 °C, 55 % Luftfeuchtigkeit; 21 % O2; 0,04 % CO2)
konstant gehalten.
Lichtsättigungskurve‐Autoprogramm: 0 min – 15 min 0 µE m‐2 s‐1 ‐2 ‐1
15 min – 20 min 150 bzw. 800 µE m s 20 min – 22 min 400 µE m‐2 s‐1
‐1 22 min – 24 min 2000 µE m‐2 s 24 min – 26 min 1500 µE m‐2 s‐1
48 Material und Methoden
26 min – 28 min 1000 µE m‐2 s‐1
28 min – 30 min 500 µE m‐2 s‐1
ie Erstellung von A/Ci‐Kurven wurde unter den in Kapitel 2.13.1 beschriebenen
Voraussetzungen durchgeführt. Hierbei wurde die Photosyntheserate in Abhängigkeit
substomatären Raum (C ) bestimmt. C ist eine berechnete
30 min – 32 min 250 µE m‐2 s‐1
32 min – 34 min 150 µE m‐2 s‐1
34 min – 36 min 120 µE m‐2 s‐1
36 min – 38 min 50 µE m‐2 s‐1 38 min – 40 min 20 µE m‐2 s‐1
40 min – 42 min 10 µE m‐2 s‐1
42 min – 44 min 0 µE m‐2 s‐1
2.13.4 A/Ci‐Kurven
D
zur CO2 i i
Größe und wurde über folgende Beziehung bestimmt:
‐Konzentration im
2E
AS][CO*)2E
(gC
2tw
i
−−=
gtw +
Hierbei ist Ci u.a. vom Öffnungszustand der Stomata abhängig, welcher über die H2O‐
Blattleitfähigkeit (gtw) angezeigt und über folgende Formel berechnet wurde:
OS][H]O[HE
g2ST2
tw−
=
Es wurde davon ausgegangen, dass die H2O‐Konzentration im substomatären Raum
[H2OST] gesättigt und somit ausschließlich von der Temperatur und dem Druck abhängig
ist. Aus dieser Annahme erfolgte die Berechnung von [H O ] über folgende Beziehung: 2 ST
P(T)e
OHsat
ST2 =
Hierbei ist esat(T) die Konstante für den Dampfdruck in Abhängigkeit zur anliegenden
Temperatur und P der anliegende Druck.
i
ng der RubisCO bei geringen Ci zu vermeiden.
Um unterschiedliche C ‐Konzentrationen zu erreichen, wurde innerhalb eines
en wurde
zur
Im Rahmen d eser Arbeit wurden „schnelle“ A/CI‐Kurven erstellt, um ein Schließen der
Stomata bei hohen Ci oder eine Inaktivieru
i
Autoprogramms [CO2R] alle 3 min verändert, wobei zunächst geringe und zum Ende der
Messung ansteigende Konzentrationen angelegt wurden (siehe A/Ci‐Kurve
Autoprogramm). Die Photosyntheserate bei der jeweilig anliegend [CO2R]
frühestens nach 2 min und spätestens nach 3 min, abhängig von der Erfüllung der
Stabilitätskriterien, aufgezeichnet. Während der Messung wurden die Anzucht
Material und Methoden 49
identische Bedingungen konstant gehalten (150 bzw. 800 µE m‐2 s‐1; 20 °C,
55 % Luftfeuchtigkeit; 21 % O2).
A/Ci‐Kurve Autoprogramm: 0 min 3 min [CO2R] = 400 µmol mol‐1
–3 min – 6 min [CO2R] = 300 µmol mol‐1
6 min – 9 min [CO2R] = 200 µmol mol‐1
rve unter iebenen
edingungen wurde am gleichen Blatt eine zweite A/Ci‐Kurve nach dem gleichen Prinzip
2.13.5 Berechnung des Parameters APR
er Parameter APR wurde im Rahmen dieser Arbeit eingeführt, um den apparenten
maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate zu
9 min – 12 min [CO2R] = 100 µmol mol‐1 12 min – 15 min [CO2R] = 50 µmol mol‐1 15 min – 18 min [CO2R] = 200 µmol mol‐1 18 min – 21 min [CO2R] = 400 µmol mol‐1 21 min – 24 min [CO2R] = 500 µmol mol‐1
24 min – 27 min [CO2R] = 600 µmol mol‐1 27 min – 30 min [CO2R] = 700 µmol mol‐1 30 min – 33 min [CO2R] = 800 µmol mol‐1 36 min – 39 min [CO2R] = 1000 µmol mol‐1
39 min – 42 min [CO2R] = 1200 µmol mol‐1
Direkt im Anschluss an die Erstellung einer A/Ci‐Ku den oben beschr
B
gemessen. Hierbei wurde unter Verwendung von N2 als Gasgemisch eine O2‐freie
Atmosphäre in der Messküvette etabliert. Lichtintensität, Temperatur und
Luftfeuchtigkeit entsprachen den Anzuchtbedingungen und wurden während der
Messung konstant gehalten (150 bzw. 800 µE m‐2 s‐1; 20 °C, 55 % Luftfeuchtigkeit;
0 % O2). Die Messungen unter O2‐freier Atmosphäre wurden durchgeführt, um die
maximale RubisCO‐Verbrauchsrate zu bestimmen und den Parameter APR zu berechnen
(siehe Kapitel 2.13.5).
D
prozentualen Anteil der Photorespiration an der
bestimmen (siehe Kapitel 3.1.2.4). Hierfür wurden A/Ci‐Kurven bei 21 % O2 im
Referenzgas und in O2‐freier Atmosphäre erstellt (siehe Kapitel 2.13.4). Die Berechnung
von APR erfolgte für die jeweiligen Ci‐Werte nach folgender Beziehung:
100*AAA
)(CA0
0Ni PR
−=
Hierbei steht AN für die Photosyntheserate in O2 Atmosphäre und AO für die
Photosyntheserate bei 21 % O2 im Referenzgas.
‐freier
50 Material und Methoden
ROS‐Bestimmung 2.14
Die ROS‐Akkumulation im photosynthetisch aktiven Gewebe der im Rahmen dieser
Arbeit verwendeten Pflanzen wurde an isolierten Blatt‐Protoplasten mittels
Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt.
2.14.1 Isolierung von Protoplasten aus Blatt‐Gewebe
Für die Isolierung von Protoplasten wurden mit einer scharfen Rasierklinge abgetrennte
Blätter zunächst mit der Blattoberseite nach unten, in eine mit H2Obidest gefüllte Glas‐
Petrischale gelegt. Unter Wasser wurde die Epidermis der Blattunterseite mit einer
feinen flachen Pinzette entfernt. Die epidermislosen Bereiche der Blätter wurden mit
einer Rasierklinge abgetrennt und in eine weitere Glas‐Petrischale (Ø 94 mm) mit der
Blattunterseite nach unten in Lösung A überführt, bis die Fläche der Petrischale
vollständig mit Blattmaterial ausgefüllt war. Lösung A wurde vorsichtig entfernt und
durch Lösung B ersetzt. In Lösung B wurden die Blattstücke für 40 min bei 24 °C und
30 upm inkubiert. Um die Protoplasten weiter aus den Blättern zu lösen wurde die
Petrischale vorsichtig einige Male geschwenkt. Der Puffer mit den darin enthaltenen
Protoplasten wurde anschließend durch ein Nylonnetz mit einer Maschenweite von
100 µm filtriert. Mit Lösung A wurden die Blattstücke so mehrmals vorsichtig
gewaschen bis sich der Großteil der Protoplasten gelöst hatte. Das gesamte Filtrat
wurde in 50 ml‐Greinerröhrchen (Greiner, Essen) überführt und zentrifugiert (100 x g,
3 min, RT). Das Pellet wurde vorsichtig, ohne es aufzuwirbeln, mit 10 ml W5‐Lösung
gewaschen und wiederum zentrifugiert (100 x g, 3 min, RT). Anschließend wurde das
Pellet in 6 ml W5‐Lösung resuspendiert und in 10 ml‐Greinerröhrchen (Greiner, Essen)
zur weiteren Behandlung in 1 ml Anteile aliquotiert.
Lösung A: 0,4 M Mannitol 20 mM KCl 20 mM MES (pH 5,7) 10 mM CaCl2 0,1 % (w/v) BSA durch 0,45‐µm‐Filter filtrieren
Lösung B: Lösung A 1,5 % (w/v) Cellulase R10 (Serva) 0,4 % (w/v) Macerozyme R10 (Serva)
W5‐Lösung: 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7) 5 mM Glukose
Material und Methoden 51
2.14.2 ROS‐Visualisierung
Die aliquoten Anteile der Protoplasten‐Suspension (siehe Kapitel 2.14.1) wurden für 7 h
unter moderaten Bedingungen inkubiert, danach mit 1 µM des membrandurchlässigen
Färbemittels 5 (und 6)‐Chloromethyl‐2´,7‐dichlorodihydrofluorescein‐Diacetat (CM‐
H2DCFDA, Invitrogen, Karlsruhe) versetzt und weitere 15 min bei RT im Dunkeln
inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert (100 x g, 3 min, RT), drei‐ bis viermal mit W5‐
Lösung (siehe Kapitel 2.14.1) gewaschen und letztlich in ca. 500 µl W5‐Lösung
resuspendiert. Die bildliche Darstellung der Protoplasten erfolgte durch ein konfokales
laser scanning‐Mikroskopsystems (LSM 510 META; Zeiss, Göttingen) mit einem
20 bzw. 40 x EC Plan Neofluor (N.A. 1.3) Öl Objektiv. CM‐H2DCFDA‐Fluoreszenz bzw. die
Autofluoreszenz des Chlorophylls wurden nach Anregung mit Licht der Wellenlänge
488 nm und durch Emission von Licht der Wellenlänge 500 ‐ 530 nm (CM‐H2DCFDA‐
Fluoreszenz) bzw. 650 ‐ 710 nm (Chlorophyll Autofluoreszenz) visualisiert. Um
standardisierte Bedingungen zu schaffen, wurden alle Bilder unter Verwendung
derselben Parameter gescannt.
Die Mitochondrien wurden mit 50 nM MitoTracker Orange CMTMRos (Invitrogen,
Karlsruhe) sichtbar gemacht, wobei die Färbelösung direkt zu den belichteten
Protoplasten zugegeben und weitere 15 min im Dunkeln bei RT inkubiert wurden.
Hierbei erfolgte die Anregung mit Licht der Wellenlänge von 554 nm und die Emission
wurde bei 576 nm detektiert.
2.15 Lokalisationsstudien
Für die Lokalisationsstudien (siehe Kapitel 3.3.2) wurden mit einem FdC1‐GFP‐
Fusionskonstrukt transformierte Protoplasten verwendet. Die Visualisierung erfolge
mittels Fluoreszenzmikroskopie.
2.15.1 Klonierung des FdC1‐GFP‐Fusionsproteins
Alle im Rahmen der Klonierung des FdC1‐GFP‐Fusionsproteins verwendeten Materialien
und Lösungen wurden soweit möglich autoklaviert oder sterilisiert. Mittels spezifischer
Oligonukleotide (siehe Tab. 2.2) wurde ein Volllängenklon von FdC1 mit den
Restriktionsschnittstellen XbaI und KpnI aus isolierter cDNA (siehe Kapitel 2.8) von
A. thaliana mittels PCR (siehe Kapitel 2.8.5) amplifiziert und in den geöffneten Vektor
pGEMTeasy (Promega, Mannheim) mit der T4‐Ligase (Fermentas, St. Leon‐Rot) nach
Herstellerangaben ligiert. Es folgte eine Transformation des Vektors
(siehe Kapitel 2.15.1.1) in chemisch kompetente (vgl. Hanahan, 1983) E. coli‐Zellen
52 Material und Methoden
(E. coli XL1‐Blue; vgl. Bullock et al., 1987). Nach der Vermehrung der Zellen wurden die
Plasmid‐DNA mittels einer Minipräperation isoliert (siehe Kapitel 2.15.1.2) und der
codierende Bereich von FdC1 über die Restriktionsschnittstellen XbaI und KpnI nach
Herstellerangaben (Fermentas, St. Leon‐Rot) ausgeschnitten. Die Visualisierung der
einzelnen DNA‐Fragmente des geschnittenen Vektors erfolgte hierbei im Agarosegel
(siehe Kapitel 2.8.6) im UV‐Licht (λ = 302 nm), aus welchem das FdC1‐Fragment mit den
NucleoSpin Extract‐Kit (Macherey‐Nagel, Düren) nach Herstellerangaben aufgereinigt
wurde. Das aufgereinigte FdC1‐Fragment wurde unter Verwendung der T4‐Ligase
(Fermentas, St. Leon‐Rot) nach Herstellerangaben über die Restriktionsschnittstellen
XbaI und KpnI in Leserichtung in den Vektor pGFP‐2 (vgl. Kost et al., 1998) ligiert, in
kompetente E. coli‐Zellen transformiert (siehe Kapitel 2.15.1.1) und vermehrt. Für die
Transformation der isolierten Protoplasten (siehe Kapitel 2.14.1) wurde das pGFP‐2
Plasmid mit dem enthaltenden FdC1‐Fragment mittels einer Maxipräperation
(siehe Kapitel 2.15.1.3) isoliert.
2.15.1.1 Transformation von Plasmid‐DNA in kompetente E. Coli Zellen
Die Transformation der E. coli‐Zellen erfolgte über eine Hitzeschock‐Transformation
(vgl. Chohen et al., 1972). Ein aliquoter Anteil kompetenter E. coli‐Zellen (200 µl) wurde
auf Eis aufgetaut, dann 1 µl Plasmid‐DNA zugegeben und vorsichtig untergemischt. Der
Transformationsansatz wurde für 30 min auf Eis vorinkubiert. Nach einem kurzen
Hitzeschock (45 s) bei 42 °C wurde der Ansatz weitere 5 min auf Eis inkubiert, mit 1 ml
LB‐Medium versetzt und für 1 h bei 37 °C leicht geschüttelt. Ein aliquoter Anteil von
70 µl des Transformationsansatzes wurde direkt auf YT‐Agarplatten mit den zur
Selektion notwendigen Antibiotika (200 µg/ml Ampicillin für pGEMTeasy sowie pGFP‐2)
ausplattiert. Daraufhin wurde die Restkultur abzentrifugiert (4.000 x g, 2 min, RT),
500 µl des Überstandes verworfen und der restliche Ansatz homogenisiert. Von dieser
Suspension wurden erneut 70 µl auf Selektionsplatten ausgestrichen. Die
Selektionsplatten wurden über Nacht im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. YT‐Agarplatten: 0,8 % (w/v) Pepton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,25 % (w/v) NaCl mit NaOH auf pH 7 einstellen 1,5 % (w/v) Agar
LB‐Medium 1 % (w/v) Pepton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 1 % (w/v) NaCl mit NaOH auf pH 7 einstellen
Material und Methoden 53
2.15.1.2 Minipräparation von Plasmid‐DNA
Zur Isolierung von pGEMTeasy‐Plasmiden aus E. coli‐Zellen wurden aus der
Transformation auf den YT‐Agarplatten gewachsene Kulturen steril abgenommen, in
5 ml LB‐Medium (siehe Kapitel 2.15.1.1) mit 200 µg/ml Ampicillin überimpft und über
Nacht bei 37 °C vermehrt. Von dieser Kultur wurden 3 ml abgenommen, zentrifugiert
(2470 x g, 2 min, RT) und in 200 µl ribonukleasehaltiger Lösung P1 resuspendiert. Mit
der Zugabe von 200 µl Lösung P2 wurden die Bakterienzellen lysiert. Die dabei frei
werdenden Proteine, sowie die chromosomale DNA, wurden durch Natronlauge
denaturiert. Anschließend wurde das Bakterien‐Lysat mit 200 µl Lösung P3 versetzt und
für 10 min auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation (8518 x g, 20 min, 4 °C) wurde
der Überstand mit 0,7 Volumeneinheiten Isopropanol versetzt und zentrifugiert
(8518 x g, 15 min, RT). Das Plasmid‐Pellet wurde mit 250 µl 70 % Ethanol gewaschen
(8518 x g, 10 min, RT), getrocknet und in 30 µl Merck‐H2O aufgenommen. Lösung P1: 50 mM Tris,
10 mM EDTA 0,1 mg/ml RNAse mit HCl auf pH 8 einstellen
Lösung P2: 5 M NaOH
1 % (w/v) SDS Lösung P3: 3 M Kaliumacetat (pH 4,8)
2.15.1.3 Maxipräparation von Plasmid‐DNA
Um ausreichende Mengen an pGFP‐2‐Plasmiden für die Transformation isolierter
Protoplasten zu erhalten wurde eine Maxipräparation durchgeführt. Auf den YT‐
Agarplatten gewachsene, mit pGFP‐2‐Plasmiden transformierte Kulturen wurden steril
abgenommen, in 200 ml LB‐Medium (siehe Kapitel 2.15.1.1) mit 200 µg/ml Ampicillin
überimpft und über Nacht bei 37 °C vermehrt. Die 200 ml Kultur wurden in vier
Schritten nacheinander in einem 50 ml Falcon‐Röhrchen zentrifugiert (3200 x g, 8 min,
RT). Das Pellet wurde daraufhin in 4,5 ml Lösung 1 resuspendiert, mit 450 µl
Lysozymlösung (100 mg/ml) sowie 20 ml Lösung 2 versetzt, einige Male invertiert und
10 min bei RT inkubiert. Nach der Zugabe von 10 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,2) wurde
die Suspension einige Male invertiert, 10 min auf Eis inkubiert und zentrifugiert
(3200 x g, 15 min, 4 °C). Der Überstand wurde durch vier Lagen Miracloth (Calbiochem,
Darmstadt) filtriert und das Filtrat wurde mit Isopropanol auf 50 ml aufgefüllt, 10 min
bei RT inkubiert und zentrifugiert (3200 x g, 20 min, RT). Der Überstand wurde
verworfen, das Pellet in 1,5 ml TE‐Puffer vorsichtig gelöst, mit 1,5 ml 5 M Lithiumchlorid
versetzt und wiederum zentrifugiert (3200 x g, 20 min, 4 °C), Der Überstand wurde in
54 Material und Methoden
ein 15 ml Falcon‐Röhrchen überführt und mit dem gleichen Volumen Isopropanol
versetzt. Das Gemisch wurde zentrifugiert (4000 x g, 20 min, RT) und das Pellet mit 5 ml
70 % Ethanol gewaschen (10 min, 3200 x g, RT). Der Überstand wurde vollständig
entfernt, das Pellet getrocknet und schließlich in 600 µl TE‐Puffer mit 20 µg/ml RNAse
resuspendiert und einer Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Plasmid‐DNA wurde mit 400 µl
PEG‐Lösung über Nacht bei 4 °C gefällt und danach zentrifugiert (16100 x g, 5 min, 4 °C).
Das Pellet wurde in 400 µl TE‐Puffer aufgenommen. Die Lösung wurde mit 400 µl
Phenol‐Chloroform‐Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt, gut gemischt und zentrifugiert
(16100 x g, 5 min, RT). Die obere, wässrige Phase wurde abgenommen, mit 400 µl
Chloroform versetzt und zentrifugiert (16100 x g, 5 min, RT). Die obere, wässrige Phase
wurde wieder abgenommen und mit 0,25 Volumeneinheiten 10 M Ammoniumacetat
sowie 2 Volumeneinheiten 100 % Ethanol versetzt, 10 min bei RT inkubiert und
zentrifugiert (16100 x g, 5 min, 4 °C). Das Pellet wurde mit 1 ml 70 % Ethanol gewaschen
(16100 x g, 5 min, RT). Der Überstand wurde vollständig entfernt, das Pellet an der Luft
getrocknet und in 50 µl Merck‐H2O gelöst. Der Gehalt an Plasmid‐DNA wurde
photometrisch bei 260 nm im Biophotometer (Eppendorf, Hamburg) bestimmt. Eine
Extinktion von 1 entspricht hierbei 40 µg/ml DNA (vgl. Lottspeich und Zobras, 1998). Lösung 1: 50 mM Glukose 25 mM Tris 10 mM EDTA mit HCl auf pH 8 einstellen Lösung 2: 0,2 M NaOH 1 % SDS PEG‐Lösung: 20 % PEG 8000 2,5 M NaCl EB‐Puffer: 10 mM Tris mit HCl auf pH 8 einstellen TE‐Puffer: 10 mM Tris 1 mM EDTA mit HCl auf pH 8 einstellen
2.15.2 Transformation isolierter Protoplasten
Für die Transformation der isolierten Protoplasten, modifiziert nach Seidel et al. (2004),
mit dem GFP‐FdC1‐Fusionsprotein wurden alle verwendeten Materialien zuvor steril
autoklaviert bzw. die Lösungen steril filtriert. In eine Glaspetrischale (Ø = 60 mm)
wurden nacheinander 20 µl Plasmid‐DNA (2,5 µg/µl) aus der Maxipräparation
(siehe Kapitel 2.15.1.3), 200 µl isolierte Protoplasten (siehe Kapitel 2.14.1) und
220 µl PEG‐Lösung durch Zutropfen vermischt und für 15 min bei RT inkubiert. In
Material und Methoden 55
angegebener Reihenfolge wurde dem Ansatz 0,5 ml, 1 ml, 2 ml und 4 ml W5‐Lösung
zugetropft, wobei jeweils eine Inkabation für 15 min bei RT zwischen den einzelnen
Zugaben lag. Nach der letzten Zugabe von 4 ml W5‐Lösung wurde die Suspension in ein
50 ml Falcon‐Röhrchen überführt und bei geöffneten Deckel bei 16 °C über Nacht im
Dunkeln inkubiert.
PEG‐Lösung: 40 % PEG 4000 0,2 M Mannitol 100 mM CaCl2
W5‐Lösung: 154 mM NaCl
125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES 5 mM Glukose auf pH 5,7 einstellen
2.15.3 Fluoreszenzmikroskopie transformierter Protoplasten
Die Lokalisation des GFP‐FdC1‐Fusionsproteins in den damit transformierten
Protoplasten wurde mittels des konfokalen laser scanning‐Mikroskopsystems (LSM 510
META; Zeiss, Göttingen) mit dem 40 x EC Plan Neofluor (N.A. 1.3) Öl Objektiv sichtbar
durchgeführt. Hierfür wurden 30 µl der transformierten Protoplasten
(siehe Kapitel 2.15.2) auf einem speziell erstellten Objektträger so präpariert, dass die
Protoplasten vom Deckglas nicht zerquetscht wurden. Die Visualisierung des GFP‐FdC1‐
Fusionsproteins erfolgte hierbei über die Fluoreszenz‐Emission des GFP (green
fluorescent protein) unter Anregung mit Licht der Wellenlänge von 488 nm. Die
Fluoreszenz‐Emission des GFP‐FdC1‐Fusionsproteins wurde bei 500 – 530 nm
aufgezeichnet, während die Chlorophyll‐Autofluoreszenz bei 650 – 700 nm detektiert
wurde. Um standardisierte Bedingungen zu schaffen, wurden alle Bilder unter
Verwendung derselben Parameter gescannt.
2.16 Bestimmung der Enzymaktivitäten
Die Bestimmung der Enzymaktivitäten der NADP‐MDH und der G6PDH wurde an
Blattextrakten durchgeführt und im SpeCord 50‐Photometer (Analytik Jena, Jena)
anhand der Zu‐ bzw. Abnahme von NADPH im Testansatz bei λ = 340 nm detektiert. Zur
Herstellung der Blattextrakte wurde Blattmaterial direkt nach der Ernte in flüssigem
Stickstoff gefroren und anschließend pulverisiert.
56 Material und Methoden
2.16.1 NADP‐MDH
Die Herstellung des Blattextraktes sowie die photometrische Bestimmung der Kapazität
und der in‐situ‐Aktivität der NADP‐MDH erfolgte nach Scheibe und Stitt (1988). Für die
Bestimmung der Kapazität wurde der Blattextrakt für 15 min mit 20 mM DTT (in
100 mM Tris‐HCl, pH 8) vorreduziert. Die Detektion der in‐situ‐Aktivität erfolgte
hingegen direkt am erstellten Blattextrakt. Es wurde zunächst die in‐situ‐Aktivität und
danach am gleichen Blattextrakt die Kapazität bestimmt. Als Bezugsgröße wurde der
Proteingehalt im isolierten Blattextrakt nach Bradford (1976) ermittelt
(siehe Kapitel 2.6).
2.16.2 G6PDH
Die Herstellung des Blattextraktes und die photometrische Bestimmung der G6PDH‐
Kapazität erfolgte nach der Methode von Hauschild und van Schaewen (2003). Hierbei
wurde zunächst die Gesamtaktivität direkt im Rohextrakt bestimmt. Für die
Bestimmung der Kapazität der cytosolischen G6PDH‐Isoformen wurde der Blattextrakt
vor der Messung für 8 min mit 1 M DTT (in 300 mM Tris‐HCl, pH 8) reduziert. Die
Kapazität der plastidären G6PDH wurde aus der Differenz der ermittelten
Gesamtkapazität und der cytosolischen Kapazität abgeleitet. Die Bestimmung der
Gesamtkapazität sowie der cytosolischen Kapazität erfolgte an dem gleichem
Blattextrakt. Als Bezugsgröße wurde der Proteingehalt im isolierten Blattextrakt nach
Bradford (1976) ermittelt (siehe Kapitel 2.6).
Glutathion‐Bestimmung mittels HPLC 2.17
Der Gehalt an Gesamt‐Glutathion als auch der Gehalt an GSSG wurden modifiziert nach
Schulte et al. (2002) mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) bestimmt.
Die GSH‐Konzentration wurde dabei indirekt aus der Differenz beider Komponenten
ermittelt.
Die Bestimmung wurde an in flüssigem Stickstoff pulverisierten Blattmaterial
(ca. 100 mg) durchgeführt. Das gefrorene Blattpulver wurde in 1 ml
2 %ige Perchlorsäure aufgenommen und homogenisiert. Nach einer Zentrifugation
(7258 x g, 10 min, RT) wurde der Überstand in ein neues Eppendorf‐Reaktionsgefäß
überführt und mittels gesättigter K2CO3‐Lösung neutralisiert (pH 7). Der Überstand aus
einer weiteren Zentrifugation (7258 x g, 10 min, RT) wurde in ein neues Eppendorf‐
Reaktionsgefäß überführt und als Rohextrakt für die HPLC‐Probenvorbereitung
Material und Methoden 57
verwendet, wobei folgende Ansätze für die Gesamt‐Glutathion‐ und die GSSG‐
Bestimmung verwendet wurden:
Gesamt‐Glutathion‐Bestimmung: 160 µl Rohextrakt 240 µl 200 mM CHES‐Puffer pH 9,2
20 µl 5 mM DTT 20 µl H2O
GSSG‐Bestimmung: 160 µl Rohextrakt 240 µl 200 mM CHES‐Puffer pH 9,2 20 µl 5 mM NEM
Inkubation für 10 min bei RT 20 µl 5 mM DTT
Beide Probenansätze wurden jeweils für 1 h bei RT inkubiert. Die reduzierten
Thiolgruppen wurden anschließend durch Zugabe von 20 µl Monochlorobimane
(Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt) zur späteren Detektion derivatisiert. Es folgte
eine weitere Inkubation für 15 min im Dunkeln. Die Proben wurden daraufhin mit 260 µl
10 %ige Essigsäure versetzt. Nach einer Zentrifugation (7258 x g, 10 min, RT) wurden
jeweils 50 µl des Überstandes in 1 ml‐HPLC‐Vials (Supelco, Bad Homburg) überführt.
Die in den Proben enthaltenen Glutathion‐Monochlorobimane‐Derivate wurden mittels
einer SupelcosilTM LC‐18‐Säule (Supelco, Bad Homburg) im HPLC‐System der LC‐10A –
Serie (Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg) aufgetrennt, wobei ein
Laufmittelgemisch aus Puffer A und Puffer B als Eluent diente und innerhalb eines
Laufmittel‐Gradienten bei einer Flussrate von 1 ml / min über die Säule gepumpt wurde.
Bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm erfolgte die Detektion der Glutathion‐
Monochlorobimane‐Derivate, mit einer Fluoreszenz‐Emission bei 480 nm mit dem SPD‐
10AV‐Fluoreszenzdetektor (Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg). Mit der Software
Shimadzu Class‐VP 5.0 (Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg) wurden die
Chromatogramme ausgewertet. Die Eichung der HPLC und die Quantifizierung der für
die Kalkulation benötigten Referenzwerte wurden zuvor anhand geeigneter Glutathion‐
Standards vorgenommen. Die ursprünglich in der Probe enthaltenen GSH‐
Konzentrationen wurden indirekt nach folgender Gleichung berechnet: GSH = Gesamt‐
Glutathion‐Gehalt – 2*GSSG‐Gehalt.
Laufmittel‐Gradient: 0 min – 1 min 100 % Puffer A 1 min – 18 min 80 % Puffer A, 20 % Puffer B 19 min – 30 min 100 % Puffer B 30 min – 40 min 100 % Puffer A Puffer A: 10 % (v/v) Methanol Puffer B: 90 % (v/v) Methanol
0,25 % (v/v) Essigsäure 0,25 % (v/ Essigsäure Mit KOH auf pH 4,3 einstellen Mit KOH auf pH 3,9 einstellen
58 Ergebnisse
3 Ergebnisse
Fd2‐KO‐Pflanzen als Modellorganismus zur Untersuchung von Regulations‐ und Akklimationsvorgängen
3.1
Nach Hanke et al. (2004) nimmt Fd2 (AGI‐Code: At1g60950) mit ca. 90 % Anteil am
gesamten Gehalt der Blatt‐Fds (Fd1 und Fd2) in A. thaliana eine zentrale Rolle in der
photosynthetischen Elektronentransportkette ein. Ein stabiler knock‐out von Fd2 in den
Fd2‐KO‐Pflanzen führt zu einer Akzeptorlimitierung am PSI, da ca. 90 % der Blatt‐Fds im
Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen nicht gebildet werden. Die zweite photosynthetisch
aktive Fd‐Isoform, Fd1 (AGI‐Code: At1g10960), ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen unter
moderaten Bedingungen (siehe Kapitel 2.2) nicht vermehrt akkumuliert (siehe Abb. 3.1).
Abb. 3.1: Gehalt an Blatt‐Fd in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Der Gehalt an Fd1 und Fd2 in Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen wurde mittels RT‐PCR (A) sowie Western‐Blot Analysen (B) bestimmt. Hierfür wurden die Pflanzen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) kultiviert. Für die RT‐PCR Analysen wurden spezifische Primer für Fd1, Fd2 und UBQ10 als housekeeping‐gene verwendet. Für die Western‐Blot Analysen wurde Rohextrakt aus Blattmaterial gewonnen und ein Antikörper gegen Fd I aus Mais (Hanke et al., 2004) eingesetzt, welcher sowohl Fd1 als auch Fd2 aus A. thaliana detektiert. Die dargestellten Ergebnisse sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Die Fd2‐KO‐Pflanzen können demnach als Modellorganismus zur Untersuchung von
Anpassungs‐ und Regulationsmechanismen in Folge einer Akzeptorlimitierung am PSI
heran gezogen werden. In den folgenden Kapiteln (3.1.1 ‐ 3.1.4) werden die
Auswirkungen einer stromalen Akzeptorlimitierung am PSI in den Fd2‐KO‐Pflanzen im
Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen dargestellt. Die in diesem Zusammenhang
aufgeführten Ergebnisse sind zum Teil von Voss et al. (2008) publiziert und werden mit
bislang unveröffentlichten Daten vervollständigt. Soweit nicht anders vermerkt, wurden
Ergebnisse 59
neun bis zehn Wochen unter moderaten Bedingungen (siehe Kapitel 2.2) kultivierte
Pflanzen verwendet, wobei die Versuche jeweils nach einer Stunde in der Lichtphase
durchgeführt wurden.
3.1.1 Phänotyp
Der verringerte Gehalt an Blatt‐Fds in den Fd2‐KO‐Pflanzen führt unter moderaten
Bedingungen zu einer um ca. 14 Tage verzögerten Entwicklung, einer veränderten
Blattmorphologie sowie einer schwächeren Pigmentierung (siehe Abb. 3.2).
Abb. 3.2: Entwicklungsstadien von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Die dargestellten Bilder dokumentieren die Entwicklung von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag ‐ Durchmesser der Töpfe: 5 cm). Die gezeigten Pflanzen sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Anzuchten.
Fd2‐KO‐Pflanzen weisen ein verringertes spezifisches Frischgewicht und Trockengewicht
auf (siehe Tab. 3.1). Anzumerken ist, dass das spezifische Blattfrischgewicht der Fd2‐KO‐
Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen nur um ca. 21 % verringert ist,
wohingegen das spezifische Trockengewicht um ca. 46 % reduziert vorliegt. Der
spezifische Proteingehalt ist ebenfalls um 26 % reduziert, was die deutliche Abnahme
des spezifischen Trockengewichtes neben dem verringerten Gehalt an transitorischer
Stärke (siehe Abb. 3.10‐B) erklärt.
Die signifikant schwächere Pigmentierung der Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den
Noe‐WT‐Pflanzen ist auf einen insgesamt verminderten Gehalt an Chlorophyll und
60 Ergebnisse
Carotinoiden zurückzuführen (siehe Tab. 3.1). Der Gehalt an Carotinoiden ist um 49 %
und der Chlorophyllgehalt um 43 % verringert, wobei sowohl Chla (um 33 % reduziert)
als auch Chlb (um 59 % reduziert) in verminderten Mengen vorkommen. Die geringere
Akkumulation von Chlb in den Fd2‐KO‐Pflanzen, im Vergleich zu Chla, schlägt sich in
einem erhöhten Verhältnis von Chla zu Chlb nieder. Chlb ist hauptsächlich in den LHCs
zu finden (vgl. Buchanan, Gruissem und Jones, 2000). Verringerte Mengen an Chlb
deuten demnach auf eine verminderte Akkumulation von LHCs in den Fd2‐KO‐Pflanzen
hin.
Tab. 3.1: Physiologische P rameter der Noe‐ T‐ und Fd ‐KO‐P lanzen unter mod raten Bedingungen. Die dargestellten Parameter wurden an Blättern von neun Wochen alten Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen bestimmt. Die Mengenangaben der Pigmente sind auf die Blattfläche bezogen. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
a W 2 f e
3.1.2 Photosynthetischer Elektronentransport und CO2‐Assimilation
Photosynthetisch aktive Fds sind die zentrale Verteilerstelle zwischen dem
photosynthetischen Elektronentransport in der Thylakoidmembran und den
verschiedenen Elektronenakzeptoren im Stroma (siehe Kapitel 1.2.1). Ein Mangel an
Blatt‐Fds am PSI sollte sich demnach vor allem auf dem PET der Primärreaktion sowie
die CO2‐Assimilation in der photosynthetischen Sekundärreaktion auswirken. Dies
würde auch das eingeschränkte Wachstum, sowie die verminderten Gehalte an
Proteinen und Pigmenten erklären. Die Auswirkungen einer stromalen
Akzeptorlimitierung am PSI auf den photosynthetischen Elektronentransport und der
Ergebnisse 61
CO2‐Assimilation werden in den folgenden Kapiteln (3.1.2.1 ‐ 3.1.2.4) am Beispiel der
Fd2‐KO‐Pflanzen dargestellt.
3.1.2.1 Photosystem I
PSI ist im photosynthetischen Elektronentransport Elektronendonator für oxidiertes Fd
im Stroma. Durch eingestrahlte Lichtenergie wird das aktive Zentrum des PSI, das P700,
in den angeregten Zustand P700* überführt. P700* ist ein starkes Reduktionsmittel und
reduziert den primären Elektronenakzeptor A0 im PSI. Es entsteht ein stabil reduziertes
A0 (A0‐) sowie oxidiertes P700 (P700+). Vom A0
‐ wird das Elektron über die einzelnen
Elektronenüberträger im PSI auf Fd im Stroma übertragen und P700+ wird durch vom
PSII kommende Elektronen re‐reduziert (für Details zum photosynthetischen
Elektronenfluss siehe Kapitel 1.1). Die Auswirkungen einer Akzeptorlimitierung am PSI
sollte sich demnach zunächst auf den Elektronenfluss im und am PSI auswirken. Um dies
zu zeigen, wird in diesem Kapitel vor allem auf Ergebnisse aus P700‐
Absorptionsmessungen eingegangen, welche ein geeignetes Werkzeug zur
Charakterisierung des Elektronenflusses im und am PSI darstellen (für Details zur
Methodik der P700‐Absorptionsmessungen siehe Kapitel 2.11).
Werden P700‐Moleküle durch Lichtenergie in den oxidierten Zustand P700+ überführt,
so ändert sich das Absorptionsverhalten bei 830 nm. Mittels P700‐
Absorptionsmessungen bei 830 nm (A830 nm) und zusätzlich 860 nm (A860 nm) kann die
lichtinduzierte Oxidation von P700 zu P700+ sichtbar gemacht werden (vgl. Schreiber et
al., 1988; Klughammer und Schreiber, 1994; Backhausen et al., 1998). Die gemessene
P700‐Absorptionsänderung im Licht (ΔAP700) wird aus der Differenz von A830 nm und
A860 nm bestimmt (ΔAP700 = A830 nm ‐ A860 nm). Durch diese Korrektur wird eine
Verfälschung der Ergebnisse durch ebenso bei 830 nm absorbierendes Fd und PC
vermieden. Um ΔAP700 und somit die Menge an P700+ bzw. P700 quantitativ einordnen
zu können, wird die maximale P700‐Absorptionsänderung (ΔAP700‐MAX) ermittelt. Hierbei
wird das P700 ausschließlich mit Licht im nahen Infrarot‐Bereich (NIR, λ > 700 nm –
siehe Kapitel 2.11.1) angeregt. Im PSII erfolgt im NIR keine Ladungstrennung, so dass an
Stelle einer Re‐Reduzierung von P700+ über den linearen photosynthetischen
Elektronentransport eine stabile Oxidation von P700 zu P700+ erfolgt (siehe Abb. 3.3).
62 Ergebnisse
Abb. 3.3: Schematische Darstellung der P700‐Anregung im NIR. Schematisch dargestellt sind die Absorptionskurven für PSI und PSII im Wellenlängenbereich von 690 bis 730 nm (A). Im PSII erfolgt im NIR keine Ladungstrennung und Elektronen aus dem linearen Transport von PSII zu PSI schließen die Elektronenlücke am PSI nicht (B).
Für die exakte Bestimmung von ΔAP700‐MAX ist es erforderlich, zunächst alle P700‐
Moleküle in den reduzierten Zustand zu überführen. Unter moderaten Bedingungen, bei
vollständiger Lichtlimitierung der Photosynthese, bzw. bei Dunkelheit, liegen die P700‐
Moleküle zu 100 % im reduzierten, nicht angeregtem Zustand vor (vgl. Baker et al.,
2007). Bei Pflanzen, die eine Akzeptor‐ bzw. Donorlimitierung am PSI aufweisen, kann
dieser Zusammenhang allerdings abweichen (vgl. Klughammer und Schreiber, 1994;
Holtgrefe et al., 2003). Da es sich bei den Fd2‐KO‐Pflanzen um Pflanzen handelt, die
wahrscheinlich eine starke Akzeptorlimitierung am PSI aufweisen, wurden diese vor
jeder Messung 15 – 30 min im Dunkeln gehalten, um eine vollständige Reduzierung aller
P700‐Moleküle sicher zu stellen. In Fd2‐KO‐Pflanzen ist die durchschnittliche Kapazität
P700‐Moleküle im NIR anzuregen, um 73 % geringer als in Noe‐WT‐Pflanzen
(siehe Abb. 3.4). Wird davon ausgegangen, dass in dunkel‐adaptierten Pflanzen das
P700 zu 100 % reduziert vorliegt (s. o.), würde dies bedeuten, dass in den Fd2‐KO‐
Pflanzen die Menge an P700‐Molekülen, welche im oxidierbaren Zustand vorliegen,
deutlich niedriger ist als in den Noe‐WT‐Pflanzen.
Die verminderte Fähigkeit der Oxidation von P700‐Molekülen im NIR in den Fd2‐KO‐
Pflanzen können verschiedene Ursachen zu Grunde liegen. Endo et al. (2005) zeigten,
dass im Zuge eines stark reduzierten Stromas und der damit einhergehenden
Akzeptorlimitierung am PSI eine Verringerung von ∆AP700‐MAX eintritt. Diese ist auf einen
vermehrten ZET um PSI sowie auf Ladungsrekombination im PSI (vgl. hierzu Brettel,
Ergebnisse 63
1997; Brettel und Setif, 1987) zurückzuführen. Ladungsrekombination im PSI kann als
Folge einer Akzeptorlimitierung im oder am PSI auftreten. Hierbei kommt es in Folge
eines beeinträchtigten Elektronenabtransportes an der Stromaseite von PSI zu einem
Elektronenrückfluss. Daraus resultierend ist der Elektronentransfer von A0‐ auf den
nächsten Akzeptor A1 blockiert, da A1 durch den Elektronenrückfluss bereits in
reduzierter Form vorliegt. In Folge dessen tritt Ladungsrekombination zwischen dem
primären Donor‐Akzeptor‐Paar P700+ und A0‐ auf (vgl. Brettel, 1997). Aus dieser
Situation heraus entstehen Singulett‐ und Triplett‐Zustände von P700 (vgl. Goldbeck
und Bryant, 1991). Eine weitere Ursache für eine Reduzierung von ∆AP700‐MAX könnte
eine verringerte absolute Menge an P700‐Molekülen und damit PSI‐Proteinkomplexen
in den Fd2‐KO‐Pflanzen sein. In Folge einer Langzeitakklimation wäre somit eine
effektiver Schutz vor einer Überreduktion der photosynthetischen
Elektronentransportkette gegeben, indem, angepasst auf an den Akzeptormangel im
Stroma, im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen geringere Mengen an PSI gebildet
werden. ZET, Ladungsrekombination und ein verminderte Menge an P700‐Molekülen
sind Mechanismen, welche vor Photoinhibition am PSI (vgl. Barth, 2001) schützen
können. Allerdings resultieren Photoinhibition und Schädigungen am PSI‐
Proteinkomplex letztendlich ebenso in einen verringerten ∆AP700‐MAX.
Abb. 3.4: ΔAP700‐MAX von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
Analysen der P700‐Oxidationskinetiken im NIR machen es möglich, genauere Aussagen
zur Ursache des verringerten ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu treffen. In Noe‐WT‐
Pflanzen ist eine charakteristische zweiphasige Oxidationskinetik zu beobachten (vgl.
Joliot und Joliot, 2006; Breyton et al., 2006; Joliot und Joliot, 2005; Siebke et al., 1991).
In Phase 1 kommt es in dunkel‐adaptierten Pflanzen im NIR zu einer schnellen P700‐
64 Ergebnisse
Oxidation, während in Phase 2 eine langsame P700 Oxidation unterbrochen von einer
lag‐Phase auftritt (siehe Abb. 3.5).
Abb. 3.5: Schematische Darstellung einer typischen P700‐Oxidationskinetik im NIR. Dargestellt ist eine typische P700‐Oxidationskinetik im NIR (grau unterlegter Bereich) einer WT‐Pflanze der Art A. thaliana. Vor jeder Messung müssen die Pflanzen mind. 15 ‐ 30 im Dunkeln gehalten werden. Der Länge der Phasen kann abhängig von den Anzuchtbedingungen variieren. Dies gilt vor allem für die lag‐Phase sowie für Phase 2.
Die P700‐Oxidation in Phase 1 verläuft vergleichsweise schnell (0,7 ± 0,1 s in Noe‐WT)
und spiegelt die Oxidation von PSI‐Reaktionszentren wieder, die Elektronen im Zuge des
LET auf stromale Akzeptoren übertragen (Joliot und Joliot, 2005; Breyton et al., 2006;
Nandha et al., 2007). In Fd2‐KO‐Pflanzen ist diese erste Phase nicht zu detektieren, was
auf eine Akzeptorlimitierung im initialen LET hindeutet (siehe Abb. 3.6).
Abb. 3.6: P700‐Oxidationskinetik im NIR von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt sind P700‐Oxidationskinetiken im NIR von Noe‐WT‐ bzw. Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Kurven sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse 65
In Phase 2 der P700‐Oxidierung ist kein signifikanter zeitlicher Unterschied zwischen
Fd2‐KO‐ und Noe‐WT‐Pflanzen festzustellen. In dieser Phase erfolgt eine kontinuierliche
P700‐Oxidation bis ∆AP700‐MAX erreicht ist. Im Gegensatz zur Phase 1 verläuft die P700‐
Oxidation langsamer, da zusätzlich PSI‐Reaktionszentren beteiligt sind, die Elektronen
für den ZET donieren (vgl. Joliot et al., 2005; Breyton et al., 2006; Nandha et al., 2007).
Im Zuge des ZET werden angeregte P700‐Moleküle re‐reduziert, was die P700‐Oxidation
im NIR verlangsamt. Ein signifikant erhöhter Anteil an ZET ist demnach als
hauptsächliche Ursache des verringerten ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐Pflanzen
auszuschließen (siehe auch Kapitel 3.1.2.2), da dies auch einen signifikanten
Unterschied im zeitlichen Ablauf der zweiten Phase zur Folge hätte.
Abb. 3.7: P700‐Oxidation im NIR von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen mit Methylviologen als alternativen Elektronenakzeptor. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) und die P700‐Oxidationskinetiken im NIR (B) von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden vor der Messung für fünf Stunden im Dunkeln zum einen in Wasser (‐MV) und zum anderen in 100 µM Methylviologen (+MV) inkubiert. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die P700‐Oxidationskinetiken sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
66 Ergebnisse
Die Daten für ∆AP700‐MAX der Fd2‐KO‐Pflanzen, welche zuvor mit Methylviologen
behandelt wurden, belegen dies zusätzlich. Methylviologen ist ein äußerst effektiver
Elektronenakzeptor am PSI, der Elektronen direkt vom [4Fe‐4S]‐Zentrum auf
molekularen Sauerstoff überträgt (vgl. Izawa et al., 1980, Trebst et al., 1980; Häder,
1999). Eine Verringerung von ∆AP700‐MAX in Folge eines signifikant erhöhten ZET wäre
mit Methylviologen reversibel (vgl. Munekage et al., 2004). Dies ist in den Fd2‐KO‐
Pflanzen nicht der Fall (siehe Abb. 3.7‐A).
Die Dauer der sich an Phase 1 anschließenden lag‐Phase wird als die Zeit beschrieben,
die benötigt wird, um den PSI‐Donor‐Pool (PET vor PSI) zu oxidieren (vgl. Breyton et al.,
2007). Hierbei werden die in Phase 1 angeregten P700‐Moleküle durch Elektronen aus
dem PSI‐Donor‐Pool re‐reduziert. Eine verlängerte lag‐Phase, wie sie in Fd2‐KO‐
(3,48 ± 0,79 s) im Vergleich zu Noe‐WT‐Pflanzen (1,83 ± 0,34 s) zu beobachten ist, weist
in der Regel auf einen verstärkt reduzierten PSI‐Donor‐Pool hin. In den Fd2‐KO‐Pflanzen
ist hingegen eine Blockade des Elektronenflusses vom PSI auf stromale Akzeptoren,
bedingt durch nicht vorhandene oxidierte Akzeptoren (vgl. Siebke et al., 1991), die
Ursache für die verlängerte lag‐Phase, da bereits in Phase 1 keine initiale P700‐
Oxidierung zu detektieren ist. Demnach ist diese verlängerte lag‐Phase ein deutliches
Anzeichen für eine verstärkte Ladungsrekombination im PSI (vgl. Breyton et al., 2007).
Die Kinetiken der P700‐Oxidation im NIR von Pflanzen, welche zuvor mit Methylviologen
behandelt wurden, bestätigen diese Tatsache. Mit Methylviologen als alternativem
Akzeptor am PSI ist eine im PSI auftretende Ladungsrekombination in Folge mangelnder
stromaler Akzeptoren reversibel und sowohl in Noe‐WT‐Pflanzen als auch in Fd2‐KO‐
Pflanzen ist unter diesen Bedingungen keine Phasentrennung der P700‐Oxidation im
NIR zu detektieren (siehe Abb. 3.7‐B). Die vermehrte Ladungsrekombination im PSI der
Fd2‐KO‐Pflanzen kann die Ursache für die Reduzierung von ∆AP700‐MAX in Folge fehlender
Elektronenakzeptoren im und am PSI sein (s. o.). Die Analysen der P700‐Absorption in
den Fd2‐KO‐Pflanzen nach einer Inkubation mit Methylviologen zeigen allerdings, dass
ein alternativer Akzeptor am PSI nicht zur Erhöhung von ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐
Pflanzen führt (siehe Abb. 3.7‐A). Ladungsrekombination ist demnach ebenso wie ZET
nicht die Ursache für die signifikante Reduzierung von ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐
Pflanzen.
Wie bereits oben in diesem Kapitel aufgeführt, könnte auch Photoinhibition am PSI die
Ursache für eine Reduzierung von ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐Pflanzen sein. Endo et al.
(2005) zeigten, dass ein linearer Zusammenhang zwischen Photoinhibition am PSII und
einer Verringerung von ∆AP700‐MAX besteht. Weiter demonstrierten Sonoike et al. (1996),
dass unter anderem dynamische Photoinhibition am PSII sowie ein erhöhter
Ergebnisse 67
Protonengradient über die Thylakoidmembran im Zuge von Photoinhibition am PSI als
„Schutzmechanismus“ auftreten. Demnach könnte eine Reduzierung von ∆AP700‐MAX auf
eine Inaktivierung des PSI‐Proteinkomplexes in Folge gesteigerter Photoinhibition
zurückzuführen sein, um eine unkontrollierte Überreduktion auf Grund fehlender
stromaler Akzeptoren vorzubeugen. In Kapitel 3.1.2.2 wird gezeigt, dass nur sehr geringe
Anzeichen für Photoinhibition am PSII zu beobachten sind. Des Weiteren sind eine
Verringerung des photosynthetischen Elektronenflusses (siehe Kapitel 3.1.2.2) sowie die
qualitative Zusammensetzung der Thylakoidmembran (siehe folgende Absätze)
deutliche Anzeichen, die gegen eine verstärkt auftretende Photoinhibition am PSI
sprechen. Zusätzlich werden verschiedene Mechanismen diskutiert, die effektiv
Photoinhibition am PSI vorbeugen (vgl. Barth et al., 2001). Ein vermehrtes Auftreten von
Photoinhibition am PSI als Ursache für die massive Reduzierung von ∆AP700‐MAX in den
Fd2‐KO‐Pflanzen kann somit ausgeschlossen werden.
Da ZET, Ladungsrekombination und auch Photoinhibition als primäre Ursachen für die
massive Reduktion von ∆AP700‐MAX nicht in Frage kommen, ist ein reduzierter Gehalt an
P700‐Molekülen in den Fd2‐KO‐Pflanzen sehr wahrscheinlich. Die Pigment‐ sowie
Proteinmengen deuten auf einen insgesamt reduzierten Gehalt an Photosystemen und
LHCs hin (siehe Tab. 3.1). Des Weiteren weisen Fd2‐KO‐Pflanzen einen um 30 %
geringeren Thylakoidgehalt in den Chloroplasten auf (Hier ist zu erwähnen, dass im Zuge
der ROS‐Detektion (siehe Kapitel 3.1.3.2) kein signifikant veränderter Gehalt an
Chloroplasten in den Blatt‐Protoplasten von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen festgestellt
werden konnte). Qualitativ zeigt sich die Zusammensetzung der aktiven Thylakoide
hingegen nicht verändert, sowohl LHCs als auch PSI und PSII liegen in vergleichbaren
Mengen in der Membran vor (siehe Abb. 3.8).
Die um ca. 30 % verringerte Thylakoidmenge in den Fd2‐KO‐Pflanzen erklärt demnach
einen um ca. 30 % verringerten Gehalt an Chla, welches das hauptsächlich an den
Photosystemen und LHCs assoziierte Pigment darstellt (vgl. Buchanan, Gruissem und
Jones, 2000). Die in Fd2‐KO‐Pflanzen deutliche Verringerung von Carotinoiden (um ca.
49 %) und Chlb (um ca. 59 %), das nur in den LHCs vorkommt (vgl. Buchanan, Gruissem
und Jones, 2000), ist zudem auf die eine geringere Akkumulation von LHCII im Vergleich
zu den Photosystemen zurückzuführen (vgl. hierzu Ben‐Shem et al., 2003). Dies ist
anhand der Saccharosegradienten allerdings nicht eindeutig zu klären. In Anbetracht
der verringerten Mengen an aktiven Thylakoiden bei nicht signifikant veränderter
qualitativer Zusammensetzung zeigt, dass das deutlich verminderte ∆AP700‐MAX in den
Fd2‐KO‐Pflanzen zu großen Teilen auf eine Reduzierung der Menge an aktiven
Thylakoiden zurückzuführen ist.
68 Ergebnisse
Abb. 3.8: Auftrennung der Protein‐Pigment‐Komplexe der Thylakoidmembran von Noe‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen im Saccharosegradienten. Dargestellt sind die im Saccharosegradienten aufgetrennten aktiven Thylakoide von Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Der Gradient wurde aus acht Stufen von 0,16 M (oben) bis 1,87 M (unten) Saccharose aufgebaut. Aus der Thylakoidisolierung wurden je 250 µg Chlorophyll eingesetzt. Die gezeigten Ergebnisse sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Zusammenfassung – Photosystem I (Kapitel 3.1.2.1)
In den Fd2‐KO‐Pflanzen kommt es in Folge fehlender Fds bereits unter moderaten
Bedingungen zu einer Akzeptorlimitierung am PSI. Eine signifikante Reduzierung von
∆AP700‐MAX ist hauptsächlich auf eine verringerte Menge an aktiven Thylakoiden in
den Chloroplasten zurückzuführen, wobei die qualitative Zusammensetzung der
vorhandenen Membranen nicht signifikant verändert ist. In den Fd2‐KO‐Pflanzen tritt
in Folge der Akzeptorlimitierung zusätzlich Ladungsrekombination im PSI auf. Ein
vermehrter ZET um PSI sowie dynamische Photoinhibition am PSI sind hingegen als
mögliche „Schutzmechanismen“ nicht zu beobachten und für die Reduzierung von
∆AP700‐MAX nicht von Bedeutung.
3.1.2.2 Photosystem II
Fd2‐KO‐Pflanzen sind durch eine Akzeptorlimitierung am PSI, zunehmende
Ladungsrekombination und verringerte Mengen an aktiven Thylakoiden gekennzeichnet
(siehe Kapitel 3.1.2.1). Die Auswirkungen einer Akzeptorlimitierung im Stroma auf den
Redox‐Zustand des PSII und der photosynthetischen Elektronentransportkette in den
vorhandenen aktiven Thylakoiden werden anhand der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission
am PSII im Folgenden charakterisiert.
Ergebnisse 69
Anregungsenergie in Form von Photonen wird im photosynthetischen System entweder
für photochemische Prozesse genutzt oder in Form von Wärme oder Fluoreszenz
emittiert. Diese drei Prozesse konkurrieren um die eingestrahlte Lichtenergie. Für
photochemische Prozesse wird das reaktive Zentrum in den Photosystemen durch
Anregungsenergie in Form von Lichtquanten in den angeregten Zustand überführt und
der primäre Akzeptor wird dabei reduziert. Hierbei ist es erforderlich, dass sowohl das
reaktive Zentrum im reduzierten, nicht angeregten, als auch der primäre Akzeptor im
neutralen, nicht reduzierten Zustand, vorliegen. Dieser Zustand kennzeichnet ein
offenes Reaktionszentrum. Ist hingegen das reaktive Zentrum oder der primäre
Akzeptor im nicht neutralen Zustand, liegt ein geschlossenes Reaktionszentrum vor.
Quantenenergie wird in diesem Falle nicht für photochemische Prozesse genutzt,
sondern in Form von Wärme oder Fluoreszenz emittiert. Die Messung der
Chlorophyllfluoreszenz‐Emission ist demnach eine geeignete Methode zur Bestimmung
des physiologischen Zustandes des Photosyntheseapparates. Erwähnenswert ist die
Tatsache, dass die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission in der Regel im Zusammenhang mit
PSII diskutiert und interpretiert wird, obwohl mehr als die Hälfte der Chla‐Moleküle,
welche für die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission verantwortlich sind, mit PSI assoziiert
sind (vgl. Buchanan, Gruissem und Jones, 2000). Letztendlich ist dies möglich, da die
Chlorophyllfluoreszenz‐Emission bei geschlossenen PSII‐Reaktionszentren ansteigt.
Geschlossene PSI‐Reaktionszentren erhöhen die Fluoreszenz‐Emission hingegen nicht
(vgl. Oxborough, 2004 und Dau, 1994). In den letzten 50 Jahren wurden zahlreiche
Arbeiten zur Methodik und Interpretation von Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen
veröffentlicht (als Beispiel siehe folgende Reviews und darin zitierte Primärliteratur:
Baker, 2008; Baker und Oxborough, 2004; Maxwell und Johnson, 2000). Die in diesem
Kapitel beschriebenen Parameter wurden nach der in Kapitel 2.12.2 erläuterten
Methode aus den Rohdaten der Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen berechnet und
erlauben eine Einordnung des Aktivitätszustandes der photosynthetischen
Elektronentransportkette. Da diese Parameter relative Zusammenhänge darstellen
steht deren Interpretation nicht im Zusammenhang mit der absoluten Menge an aktiven
Thylakoiden. Durch die Tatsache, dass die qualitative Zusammensetzung der aktiven
Thylakoide in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht signifikant verändert ist (siehe Kapitel 3.1.2.1),
ist die Messung der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission am PSII ein geeignetes Mittel zur
Charakterisierung der photosynthetischen Lichtnutzung im Vergleich zu den Noe‐WT‐
Pflanzen.
70 Ergebnisse
Der Reduktionsgrad von QA, dem primären Elektronenakzeptor im PSII, ist in den
Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant erhöht. Dies ist an der im Vergleich zu den Noe‐WT‐
Pflanzen um 30 % geringeren Quantenausbeute am PSII (ΦII) abzulesen (siehe Tab. 3.2).
Der lineare Zusammenhang von ΦII zum Reduktionsgrad des primären Akzeptors QA ist
allerdings nur dann gegeben, wenn Reaktionszentren mit LHCs assoziiert sind, die nur
auf dieses Reaktionszentrum Quantenenergie übertragen (vgl. Baker et al., 2001,
Kramer et al, 2004a). In Blättern von höheren Pflanzen ist dies nicht der Fall und
Anregungsenergie kann von einem Antennenkomplex auf unterschiedliche reaktive
Zentren übertragen werden (vgl. Baker und Oxborough, 2004; Kramer et al., 2004a).
Kramer et al. (2004a) führten aus diesem Grund den Parameter qL ein, der sich
tatsächlich linear zum Redox‐Zustand von QA verhält. In Fd2‐KO‐Pflanzen ist qL um 16 %
niedriger als in den Noe‐WT‐Pflanzen und bestätigt einen erhöhten Reduktionsgrad des
primären Akzeptors QA im PSII (siehe Tab. 3.2).
Tab. 3.2: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer aktinischen Lichtintensität von 150 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
Ebenso ist der Anteil an absorbierter Energie, welcher photochemisch genutzt wird, in
den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant geringer. Dies ist an einer reduzierten
photochemischen Lichtnutzung (qP) festzumachen. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist qP um
28 % geringer als in den Noe‐WT‐Pflanzen. Die Parameter qP, qL und ΦII indizieren, dass
sowohl der QA‐ als auch der PQ‐Pool signifikant stärker reduziert vorliegen als in Noe‐
WT‐Pflanzen. Hieraus ist auf einen erhöhten Reduktionsgrad der photosynthetischen
Elektronentransportkette zwischen PSII und PSI zu schließen. Obwohl ein signifikant
erhöhter Reduktionsgrad von QA sowie des PQ‐Pools in den Fd2‐KO‐Pflanzen vorliegt, ist
am PSII der Fd2‐KO‐Pflanzen keine Photoinhibition zu beobachten. Als Maß für
Photoinhibition am PSII kann die maximale Quantenausbeute FV/FM verwendet werden.
Ergebnisse 71
Für ein nicht photoinhibiertes PSII in höheren Pflanzen nimmt FV/FM Werte um 0,8 an
(vgl. Björkmann und Demmig, 1987; Werner et al., 2002). Fd2‐KO‐Pflanzen zeigen somit
keine Anzeichen von Photoinhibition am PSII, allerdings ist die Elektronentransportrate
(ETR) am PSII in den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant um 30 % geringer als in den
entsprechenden Noe‐WT‐Pflanzen (siehe Tab. 3.2). Dies deutet auf einen insgesamt
verringerten photosynthetischen Elektronenfluss hin. Dies ist wahrscheinlich eine Folge
signifikant verringerter Mengen an LHCs, was aus der deutlichen Reduzierung von Chlb‐
Molekülen in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu schließen ist (siehe Kapitel 3.1.1).
Weiter ist zu beachten, dass NPQ in den Fd2‐KO‐Pflanzen trotz der verminderten qP
nicht signifikant erhöht vorliegt. NPQ wird durch drei Faktoren bestimmt, die
Fluoreszenzlöschung durch Energieabgabe in Form von Wärme (qE), durch
Photoinhibition (qI) und state transitions (qT), wobei vor allem qE, unter hohen
Lichtintensitäten allerdings auch qI, in höheren Pflanzen den größten Anteil an NPQ
ausmachen (vgl. Baker et al., 2007). In der Regel ist qT hauptsächlich unter geringen
Lichtintensitäten und qI vornehmlich unter hohen Lichtintensitäten zu beachten (vgl.
Krause und Jahns, 2004). Photoinhibition ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht zu
beobachten und state transition kann auf Grund des Akzeptormangels am PSI, welche
eine Starklichtsituation simuliert, ebenso ausgeschlossen werden. Unter moderaten
Lichtintensitäten wird NPQ demnach zu großen Teilen von qE bestimmt und steht als
Indikator für den Energetisierungszustand der Thylakoidmembran. Ein gesteigertes qE
zeigt einen erhöhten pH‐Gradienten an (vgl. Krause et al., 1982). Ein Protonengradient
über die Thylakoidmembran stellt sich in Folge des photosynthetischen
Elektronentransportes ein, wobei sowohl der lineare als auch der zyklische Transport
zur Generierung beitragen (vgl. Munekage et al., 2004). In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird
kein signifikant erhöhter Protonengradient generiert. Ein in Folge einer
Akzeptorlimitierung gesteigerter ZET, der für einen erhöhten Anteil an NPQ durch einen
gesteigerten Protonengradienten über die Thylakoidmembran essenziell ist (vgl.
Munekage et al., 2004), ist demnach auszuschließen (siehe auch Kapitel 3.1.2.1). Da
eingestrahlte Lichtenergie entweder für photochemische Prozesse genutzt oder in Form
von Wärme bzw. Fluoreszenz emittiert wird (s. o.), ist den Fd2‐KO‐Pflanzen bei
verringerter qP und nicht signifikant verändertem NPQ eine gesteigerte Fluoreszenz‐
Emission zu erwarten. Dieses Phänomen kann bei den Fd2‐KO‐Pflanzen beobachtet
werden. Die Fluoreszenz‐Emission im Licht bezogen auf die maximale
Fluoreszenzemission (F/FM) liegt mit 0,35 ± 0,02 ca. 34 % höher als in den Noe‐WT‐
Pflanzen (0,23 ± 0,03). Dies verhält sich nahezu linear zur Abnahme von qP, welche bei
ca. 28 % liegt (siehe Tab. 3.2). In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird in Folge mangelnder
72 Ergebnisse
Akzeptoren am PSI überschüssige Lichtenergie in Form von Fluoreszenz emittiert. Eine
photochemische Nutzung sowie die nicht‐photochemische Löschung der
Quantenenergie sind auf Grund des Mangels des zentralen Elektronenakzeptors nicht
möglich.
Dies wird auch durch das Ausmaß an Chlororespiration in den Fd2‐KO‐Pflanzen
bestätigt. Ein Protonengradient zum Schutz der photosynthetischen
Elektronentransportkette vor einer Überreduktion wird in höheren Pflanzen neben den
LET und dem Fd‐abhängigen ZET auch durch den NDH‐abhängigen ZET (siehe
Kapitel 1.4.1) generiert (vgl. Munekage et al., 2004; Qilles, 2006). Der NDH‐abhängige
ZET läuft auch im Dunkeln ab und kann über den transienten Anstieg der Fluoreszenz‐
Emission nach einer Belichtung mit aktinischem Licht sichtbar gemacht werden (vgl.
Shikanai et al., 1998 und für Details zur Methodik siehe Kapitel 2.12.3) und wird als
Chlororespiration bezeichnet. Der Anstieg der Fluoreszenz‐Emission im Dunkeln wird
durch im Licht reduzierte, akkumulierende Elektronendonatoren verursacht (Schreiber
et al., 1986) und führt im Dunkeln zur Reduktion des PQ‐Pools und damit einhergehend
auch des primären Akzeptors QA (vgl. Asada et al., 1998; Quilles, 2006). Für eine
statistische Absicherung der Intensität der Chlororespiration in den Versuchspflanzen
wird mit FC ein neuer Fluoreszenz‐Parameter eingeführt. FC beschreibt den Anteil der
chlororespiratorischen Chlorophyllfluoreszenz‐Emission eines Licht‐adaptierten Blattes
im Dunkeln, bezogen auf die Fluoreszenz‐Emission im Licht. Eine erhöhte Intensität der
Chlororespiration spiegelt sich hierbei in höheren Werten für FC wieder. Die Berechnung
von FC ist in Kapitel 2.12.3 im Detail beschrieben.
In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist FC signifikant geringer als in Noe‐WT‐Pflanzen
(siehe Abb. 3.9‐B). Dies deutet wiederum auf eine verringerte Menge an reduzierten
Elektronendonatoren im Stroma hin, welche im Zuge der Chlororespiration den PQ‐Pool
im Dunkeln reduzieren. Ebenso bestätigen die Werte für FC, dass überschüssige
Quantenenergie in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht über Wärme‐Emission als Folge eines
erhöhten Protonengradienten über die Thylakoidmembran gelöscht, sondern als
Fluoreszenz emittiert wird (s. o.). Auffällig ist, dass in Noe‐WT‐Pflanzen die Steigerung
der Fluoreszenz‐Emission im Dunkeln nach einigen Sekunden wieder auf F0’‐Niveau fällt,
was auf eine Re‐Reduzierung der P700‐Moleküle im PSI und damit einhergehender Re‐
Oxidation des PQ‐Pools zurückzuführen ist (vgl. Shikanai et al., 1998). In den Fd2‐KO‐
Pflanzen hingegen fällt die Fluoreszenz‐Emission im Dunkeln auch nach mehreren
Sekunden nicht und die zunehmende Reduzierung des PQ‐Pools im Zuge der
Chlororespiration bleibt stabil hoch (siehe Abb. 3.9‐A). Dies deutet auf eine verminderte
Ergebnisse 73
Fähigkeit der Re‐Reduktion von P700‐Molekülen auf Grund zunehmender
Ladungsrekombination im PSI sowie Akzeptormangel am PSI hin (siehe Kapitel 3.1.2.1).
Abb. 3.9: Chlororespiration von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen.Dargestellt ist die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission (A) sowie der kalkulierte Fluoreszenz‐Parameter FC (B) von Fd2‐KO‐ und Noe‐WT‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden für 15 min mit aktinischem Licht (AL – Lichtintensität: 150 µE m‐2 s‐1) bestrahlt (in der Abb. sind nur einige Sekunden dargestellt), bevor die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission im Dunkeln aufgezeichnet wurde. Die dargestellten Kinetiken der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die gezeigten Daten für FC sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
Zusammenfassung – Photosystem II (Kapitel 3.1.2.2):
In den Fd2‐KO‐Pflanzen kommt es unter moderaten Bedingungen zu einer
verringerten Nutzung der Lichtenergie sowohl für photochemische als auch für nicht‐
photochemische Prozesse. Dies resultiert in einer höheren Fluoreszenz‐Emission.
Insgesamt ist der photosynthetische Elektronenfluss signifikant verringert, wobei der
PET stärker reduziert vorliegt. Photoinhibition oder Schädigungen in Folge des
erhöhten Reduktionsgrades der photosynthetischen Elektronentransportkette sind
in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht zu beobachten. In Folge stärker auftretender
Ladungsrekombination im PSI ist eine Re‐Reduzierung von P700‐Molekülen auch im
Dunkeln nur bedingt möglich und Elektronen fließen lediglich zum Teil aus dem
photosynthetischen Elektronentransport ab.
74 Ergebnisse
3.1.2.3 CO2‐Assimilation
Um die Auswirkungen einer Akzeptorlimitierung am PSI weiter zu charakterisieren,
wurden Untersuchungen an der Sekundärreaktion der Photosynthese durchgeführt.
Anhand der in den vorherigen Kapiteln dargestellten Daten sollte deutlich werden, dass
in Folge des verminderten photosynthetischen Elektronentransportes auch die CO2‐
Assimilationsraten und somit die Netto‐Photosynthese in den Fd2‐KO‐Pflanzen
beeinflusst sind. Um dies zu zeigen, wurden Messungen zum CO2‐Gaswechsel (siehe
Kapitel 2.13.2) an Blättern von Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen durchgeführt.
Noe‐WT Fd2‐KO0
1
2
3
4
5
6
Noe‐WT Fd2‐KO
1 h Belichtung
6 h Belichtung
CO2‐Assim
ilation
[µmol m
‐2s‐1 ]
Noe‐WT Fd2‐KO
1
3
7
Belichtun
gszeit [h
]
BA
Noe‐WT Fd2‐KO0
1
2
3
4
5
6
Noe‐WT Fd2‐KO
1 h Belichtung
6 h Belichtung
CO2‐Assim
ilation
[µmol m
‐2s‐1 ]
Noe‐WT Fd2‐KO
1
3
7
Belichtun
gszeit [h
]
BA
Abb. 3.10: CO2‐Assimilation und Stärkeakkumulation in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation (A) sowie die Stärkeakkumulation (B) in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach einer Stunde (links) und nach sechs Stunden (rechts) in der Lichtphase bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Um die Stärkeassimilation zu bestimmen wurden Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) mit Iod‐Kaliumiodid Lösung nach einer, drei und sieben Stunden in der Lichtphase angefärbt. Die dargestellten Blattscheiben sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Unter moderaten Bedingungen nach einer Stunde in der Lichtphase ist die
durchschnittliche CO2‐Assimilationsrate in den Fd2‐KO‐Pflanzen um 46 % geringer als in
den Noe‐WT‐Pflanzen (siehe Abb. 3.10‐A). Dies ist zum einen auf den geringeren Gehalt
an aktiven Thylakoiden (siehe Kapitel 3.1.2.1), zum anderen auf einen verminderten
photosynthetischen Elektronenfluss zurückzuführen (siehe Kapitel 3.1.2.2). Nach sechs
Stunden in der Lichtphase ist dieser Effekt noch signifikanter. Die CO2‐Assimilation ist
Ergebnisse 75
sowohl in den Noe‐WT‐Pflanzen als auch in Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zur
Photosyntheserate nach einer Stunde im Licht deutlich reduziert, wobei Fd2‐KO‐
Pflanzen eine signifikant stärkere Abnahme der CO2‐Assimilation um 40 % aufweisen (in
den Noe‐WT‐Pflanzen lediglich um 20 %). Diese Verringerung der Photosyntheserate am
Ende der Lichtphase ist auf dynamische Photoinhibition am PSII zurückzuführen, wie sie
für C3‐Pflanzen im Tagesverlauf unter sättigenden Lichtintensitäten üblicherweise
vorkommt (vgl. Häder, 1999). Die verminderten CO2‐Assimilationsraten in den Fd2‐KO‐
Pflanzen sind auch durch die verringerte Akkumulation von Stärke in den Blättern belegt
(siehe Abb. 3.10‐B). Insgesamt ist die geringe CO2‐Assimilationsrate die Ursache für die
signifikant verlangsamte Entwicklung der Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.1.1).
3.1.2.4 Licht‐ und CO2‐Abhängigkeit der Photosynthese
Die in diesem Kapitel dargestellten Experimente wurden mit dem Ziel durchgeführt,
kurzzeitige Anpassungen und Veränderungen in Folge wechselnder abiotischer
Bedingungen (Lichtintensität, CO2‐Partialdruck) auf die photosynthetische Lichtnutzung
zu testen, sowie die maximale Kapazität der Photosynthesereaktion zu bestimmen.
Hierfür wurden Messungen zur Lichtabhängigkeit (Lichtsättigungskurven) sowie zur
CO2‐Abhängigkeit (A/Ci‐Kurven) der Nettophotosynthese in‐vitro an Blättern von Noe‐
WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen durchgeführt. Zeitgleich aufgezeichnete
Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen dokumentieren zusätzlich kurzzeitige Änderungen
im photosynthetischen Elektronenfluss. Um die tatsächliche minimale sowie maximale
Kapazität der Photosynthese und des photosynthetischen Elektronenflusses in den
Pflanzen zu bestimmen, wurden „schnelle“ Lichtsättigungs‐ bzw. A/Ci‐Kurven erstellt
(eine detaillierte Beschreibung der Experimente und der entscheidenden Parameter für
„schnelle“ Lichtsättigungskurven bzw. A/Ci‐Kurven ist in Kapitel 2.13 aufgeführt).
Hierbei wird vermieden, dass die Stomata auf die veränderten äußeren Bedingungen
reagieren können. Der Öffnungszustand bleibt während der Messungen nahezu
konstant. Dies ist vor allem für die A/Ci‐Kurven von entscheidender Bedeutung, da Ci
eine berechnete Größe darstellt und auf Mess‐ und Aufnahmefehler, die von der
stomatären Leitfähigkeit ausgehen, reagieren (vgl. Häder, 1999).
In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist die maximale CO2‐Assimilationsrate 40 % geringer als in den
Noe‐WT‐Pflanzen. Dies entspricht ungefähr der verringerten CO2‐Assimilation in‐vivo
unter moderaten Bedingungen, welche um 46 % reduziert abläuft (siehe
Kapitel 3.1.2.3). Im Vergleich ist zu beachten, dass in den Noe‐WT‐Pflanzen die
Lichtsättigung der Photosynthese bereits bei einer Lichtintensität von
76 Ergebnisse
ca. 250 ‐ 500 µE m‐2 s‐1 erreicht ist. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist dies erst bei ca.
2000 µE m‐2 s‐1 (siehe Abb. 3.11‐A).
Abb. 3.11: Lichtsättigungskurven der Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation (A) sowie die Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter (B) bei unterschiedlichen Lichtintensitäten von Noe‐WT‐ (durchgezogene Linie, gefüllte Kreise) und Fd2‐KO‐Pflanzen (gestrichelte Linie, offene Kreisen), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Gaswechselmessungen sowie die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wurden zeitgleich an gleichen Blättern durchgeführt. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen zehn Minuten dunkel gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
Die Phase der Lichtsättigung ist charakterisiert durch die „Trägheit“ des Calvin‐Zyklus.
Stitt (1986) sowie Scheibe (1996) zeigten, dass der photosynthetische
Elektronentransport im entkoppelten, isolierten Thylakoid‐System schneller abläuft als
Ergebnisse 77
der Calvin‐Zyklus. Unter hohen Lichtintensitäten kommt es demnach zu einer
Limitierung im Calvin‐Zyklus, bei der es sich in der Regel um eine CO2‐Limitierung
handelt (vgl. Häder, 1999). In den Fd2‐KO‐Pflanzen liegt diese Limitierung bis zu einer
Lichtintensität von 2000 µE m‐2 s‐1 nicht vor, so dass der Calvin‐Zyklus ausreichend
Kapazität aufweist, um NADPH bzw. ATP für die CO2‐Assimilation zu nutzen. In den Fd2‐
KO‐Pflanzen ist in Abhängigkeit der Lichtintensität eine stete Steigerung der CO2‐
Assimilation und der Elektronentransportrate zu detektieren, welche allerdings immer
unter denen der Noe‐WT‐Pflanzen liegen.
Insgesamt sind sowohl für Noe‐WT‐Pflanzen als auch in den Fd2‐KO‐Pflanzen mit
steigenden Lichtintensitäten typische Tendenzen einer Lichtakklimation bezogen auf
den photosynthetischen Elektronentransport zu beobachten (vgl. Kramer et al., 2004;
Nedbal et al., 2003; Holt et al., 2004; Avenson et al., 2005). So verringert sich qP, ΦII,
wobei NPQ und ETR ansteigen. In den Fd2‐KO‐Pflanzen sind diese Tendenzen jedoch
deutlich geringer ausgeprägt als in den Noe‐WT‐Pflanzen (siehe Abb. 3.11‐B). Dies ist
damit zu begründen, dass die Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen
bereits im steady‐state Zustand unter moderaten Bedingungen deutliche Anzeichen
einer Lichtakklimation aufweisen (siehe Kapitel 3.1.2.2).
Es wurde bereits gezeigt, dass Fd2‐KO‐Pflanzen keine Limitierung im Calvin‐Zyklus
aufweisen und ausreichend Kapazitäten vorhanden sind, um CO2 zu fixieren (s. o.).
Anhand von A/Ci‐Kurven, bestimmt bei einem „normalen“ O2‐Gehalt von 21 %, wird
deutlich, dass unter steigendem CO2‐Partialdruck sowohl bei Noe‐WT‐ als auch bei Fd2‐
KO‐Pflanzen eine erhöhte Photosyntheserate bis zum Eintritt der CO2‐Sättigung zu
beobachten ist. Der annähernd gesättigte Bereich der CO2‐Assimilation unter hohem Ci
in den Fd2‐KO‐Pflanzen ist hierbei signifikant geringer als in den Noe‐WT‐Pflanzen
(siehe Abb. 3.12). Dies ist auf die insgesamt verminderte Elektronentransportrate
zurückzuführen (siehe Kapitel 3.1.2.2), die somit die Carboxylierungsrate limitiert (vgl.
Häder, 1999). Unter geringerem Ci (bis ca. 200 µmol mol‐1) reagiert die CO2‐
Assimilationsrate linear zu Ci. In‐vitro‐Untersuchungen zeigten, dass die Steigung in
diesem Bereich überwiegend durch die Aktivität der RubisCO bestimmt ist und somit
den Induktionszustand des Photosyntheseapparates anzeigt (vgl. Craemmerer und
Farquhar, 1981). In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist diese Steigung mit
22 ± 0,57 nmol CO2 m‐2 s‐1 / µmol CO2 mol‐1 um 37 % geringer als in den Noe‐WT‐
Pflanzen mit 35,5 ± 3,1 nmol CO2 m‐2 s‐1 / µmol CO2 mol‐1. Der Induktionszustand des
Photosyntheseapparates ist hier ähnlich signifikant verringert wie auch die CO2‐
Assimilationsrate unter moderaten Bedingungen (siehe Kapitel 3.1.2.3). Das deutet
auch auf eine Anpassung der RubisCO‐Aktivität bezogen auf die Reduktionskraft der
78 Ergebnisse
photosynthetischen Primärreaktion hin, da die Aktivität der RubisCO direkt über das
Fd‐Trx‐System und indirekt über das metabolische fine‐tuning an die Primärreaktion
gekoppelt ist (siehe Kapitel 1.3). Die konstant verringerten CO2‐Assimilationsraten in
den Fd2‐KO‐Pflanzen sowohl unter niedrigen als auch hohen Ci‐Werten belegen eine
Limitierung der Netto‐Photosynthese durch die Primärreaktion, wobei NADPH und ATP
in signifikant geringerem Maße synthetisiert werden. Zudem zeigt der somit verringerte
Induktionszustand der RubisCO ein vermehrt oxidiertes Stroma auf Grund des Mangels
an NADPH aus dem LET in den Fd2‐KO‐Pflanzen an.
Abb. 3.12: A/Ci‐Kurven von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderate Bedingungen. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation in Abhängigkeit zum CO2‐Partialdruck im substomatären Raum (Ci) von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen bei einer Lichtintensität von 150 µE m‐2 s‐1
durchgeführt. An gleichen Blättern wurden zunächst die CO2‐Assimilationsraten bei 21 % O2 und danach ohne O2 im anliegenden Gasgemisch bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
Abgesehen von den insgesamt verringerten CO2‐Assimilationsraten ist der Verlauf der
A/Ci‐Kurven von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen ähnlich. Bei genauer Betrachtung sind
allerdings Abweichungen zu erkennen. In den Fd2‐KO‐Pflanzen sind die CO2‐
Assimilationsraten unter geringen Ci deutlicher reduziert als unter hohen Ci. Diese
Abweichungen sind jedoch nicht konträr zu den oben in diesem Kapitel getroffenen
Aussagen. Sie sind auf einen geringfügig erhöhten Anteil an Photorespiration bezogen
auf die maximale RubisCO‐Verbrauchsrate zurückzuführen. Photorespiration ist vor
allem unter geringem CO2‐Partialdruck bei einer erhöhten RubisCO‐Oxigenierungsrate
Ergebnisse 79
zu beobachten. CO2‐Sättigungskurven in einem O2‐freien Gasgemisch zeigen die
maximale Carboxylierungsrate der RubisCO (siehe Abb. 3.12), welche vor allem in C3‐
Pflanzen bei einem geringem CO2‐Partialdruck höher liegt als die Netto‐Assimilationrate
unter „normalen“ Bedingungen (21 % O2). Unter O2‐freien Bedingungen kann
Photorespiration nahezu komplett ausgeschlossen werden (Ganz auszuschließen ist
Photorespiration auch unter O2‐freien Bedingungen nicht, da im Blatt freiwerdendes O2
einen vermutlich kleinen Anteil an Photorespiration begünstigt). Der Vergleich der
maximalen Carboxylierungsrate (O2‐freie Bedingungen) mit der Netto‐Assimilationsrate
(21 % O2) erlaubt es, den Parameter APR zu bestimmen. Dieser Parameter zeigt den
Anteil der apparenten Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate
(maximale Carboxylierungsrate der RubisCO unter O2‐freien Bedingungen) an (für
Details zur Methodik siehe Kapitel 2.13.5). Demnach ist APR ein Indikator den
photorespiratorischen Anteil am photosynthetischen Elektronenfluss. In den Fd2‐KO‐
Pflanzen ist der photorespiratorische Anteil vor allem unter geringen Ci leicht erhöht
(siehe Abb. 3.13).
Abb. 3.13: Anteil der apparenten Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate in den Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist der photoresipratorische Anteil am photosynthetischen Elektronenfluss in Form des Parameters APR in Noe‐WT‐ (durchgezogenen Linie, gefüllte Kreise) und Fd2‐KO‐Pflanzen (gestrichelte Linie, offene Kreisen), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen durchgeführt und APR wurde aus den A/Ci‐Kurven (siehe Abb. 3.12) kalkuliert. Die Messungen erfolgten bei einer Lichtintensität von 150 µE m‐2 s‐1. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
80 Ergebnisse
In den Fd2‐KO‐Pflanzen tritt im Zuge einer Akzeptorlimitierung am PSI ein reduzierter
Elektronenfluss in der Primärreaktion auf. Unter gesteigerten Lichtintensitäten
hingegen setzt ein erhöhter photosynthetischer Elektronenfluss ein. Ebenso steigen
die CO2‐Assimilationsraten in den Fd2‐KO‐Pflanzen, allerdings in einem signifikant
geringeren Maße als in den Noe‐WT‐Pflanzen. Die reduzierte Photosyntheserate der
Fd2‐KO‐Pflanzen ist auf eine Limitierung der Primärreaktion und auf einen Mangel an
deren Produkten, ATP und NADPH, zurückzuführen. Obwohl der NADPH‐Gehalt im
Stroma limitiert scheint, ist ein erhöhter photorespiratorischer Anteil in den Fd2‐KO‐
Pflanzen zu beobachten.
Zusammenfassung – CO2‐Assimilation (Kapitel 3.1.2.3 und 3.1.2.4)
3.1.3 Reduktionsgrad und Redoxregulation im Stroma
Fd2‐KO‐Pflanzen weisen an den aktiven Thylakoiden eine stromale Akzeptorlimitierung
am PSI auf. Der Reduktionsgrad des PET ist bei einem verringerten Elektronenfluss
erhöht und im PSII tritt Ladungsrekombination auf (siehe Kapitel 3.1.2). In den
vorangegangenen Kapiteln wurde bereits gezeigt, dass ein Mangel an
Reduktionsäquivalenten im Stroma eine Limitierung der CO2‐Assimilation zur Folge hat.
Demnach ist ein zunehmend oxidiertes Stroma zu erwarten, was anhand von NADP‐
MDH Aktivitätsmessungen im folgenden Kapitel (3.1.3.1) weiter belegt wird. Da der PET
verstärkt reduziert vorliegt (siehe Kapitel 3.1.2.2) liegt eine Entkopplung des
Reduktionsgrades der Thylakoidmembran und des Stromas vor, was die Fd2‐KO‐
Pflanzen zu einem optimalen Modell für das Studium der Redoxregulation in den
Chloroplasten macht. In den folgenden Kapiteln (3.1.3.1 – 3.1.3.2) wird gezeigt, wie der
stromale Metabolismus auf diese Situation reagiert und welche metabolischen
Anpassungen auftreten.
3.1.3.1 Redoxregulierte Stroma‐Enzyme in Fd2‐KO‐Pflanzen
Viele im Stroma lokalisierte und in den Chloroplasten‐Metabolismus involvierte Enzyme
sind redox‐reguliert, u.a. einige Enzyme des Calvin‐Zyklus (vgl. Buchanan et al., 1979;
Buchanan, 1980). Ebenso ist gezeigt worden, dass photosynthetische Redox‐Reaktionen
nicht nur wichtig für die Optimierung der Photosynthese‐Reaktion sind, sondern auch
ein Signal für die Zelle darstellen, um auf wechselnde abiotische Bedingungen zu
reagieren (vgl. Kruse, 2001; Dietz et al., 2002; Pfannschmidt et al., 2003). Anhand zweier
Ergebnisse 81
Beispiele, NADP‐MDH sowie G6PDH, wird in diesem Kapitel gezeigt, inwieweit ein
Mangel an Fd als Elektronenakzeptor am PSI Auswirkungen auf den stromalen
Metabolismus und die Redoxregulation hat. Sowohl die chloroplastidäre NADP‐MDH als
auch die plastidäre G6PDH werden u.a. posttranslational über das Fd‐Trx‐System
aktiviert (NADP‐MDH) bzw. inaktiviert (G6PDH) (vgl. Buchanan, 1980; Scheibe und
Jacquot, 1983; Scheibe et al., 1990; Scheibe, 2004; Buchanan und Balmer, 2005). Ein
Mangel an Fd als Elektronendonator im Fd‐Trx‐System sollte regulatorische
Anpassungen im stromalen Metabolismus nach sich ziehen.
Abb. 3.14: Enzymaktivität der NADP‐MDH in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist die Kapazität (A), die in‐situ‐Aktivität (B) sowie der Aktivierungszustand (C) der NADP‐MDH in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Enzymaktivitäten für die Kapazität und in‐situ‐Aktivität wurden an gleichen Blattproben bestimmt und auf den Proteingehalt bezogen. Die Blattproben wurden direkt nach der Dunkelphase (0) und nach drei Stunden in der Lichtphase (3) geerntet. Der Aktivierungszustand der NAD‐MDH ist als prozentualer Anteil der in‐situ‐Aktivierung an der Kapazität angegeben. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
82 Ergebnisse
Becker et al. (2006) zeigten, dass unter erhöhten Lichtintensitäten das
Expressionsniveau der NADP‐MDH steigt. Überschüssige Elektronen aus der
Primärreaktion der Photosynthese werden über das Malat‐Ventil abgeführt (vgl.
Scheibe, 2004). Dementsprechend ist auch in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach drei Stunden in
der Lichtphase eine erhöhte Kapazität der NADP‐MDH zu beobachten
(siehe Abb. 3.14‐A). Die in‐situ‐Aktivität der NADP‐MDH ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen in
der Lichtphase allerdings nur geringfügig erhöht und verbleibt wie in den Noe‐WT‐
Pflanzen auf einem relativ geringen Niveau (siehe Abb. 3.14‐B). Der Aktivierungszustand
hingegen ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen signifikant
verringert (siehe Abb. 3.14‐C). Die Aktivierung der NADP‐MDH durch das Fd‐Trx‐System
unterliegt auch einem fine‐tuning und einer feedback‐Regulation, wobei ein Überschuss
an NADP+ die Inaktivierung fördert, was eine Konkurrenz um NADPH mit dem Calvin‐
Zyklus verhindert (vgl. Scheibe und Jacquot, 1983; Scheibe et al., 1991; Faske et al.,
1994; Scheibe, 2004). Demnach ist der Aktivierungszustand dieses Enzyms auch ein
geeigneter Indikator, um den Reduktionsgrad des Stromas zu bestimmen. Dieser ist
folglich in den Fd2‐KO‐Pflanzen verringert, so dass ein Mangel an
Reduktionsäquivalenten in Form von NADPH anzunehmen ist (siehe hierzu
Kapitel 3.1.2.4 zur Limitierung des Calvin‐Zyklus). Die erhöhte Kapazität der NADP‐MDH
im Licht ist folglich nicht abhängig vom Reduktionsgrad des Stromas. Eine über Redox‐
Signale, die von einer verstärkt reduzierten Elektronentransportkette in der
Thylakoidmembran ausgehen, vermittelte Expressionssteigerung ist wahrscheinlich
(siehe Kapitel 4.1.2).Der verringerte Aktivitätszustand der NADP‐MDH sowie die in
Kapitel 3.1.2.4 dargestellten Daten belegen einen Mangel an Reduktionsäquivalenten
im Stroma der Fd2‐KO‐Pflanzen.
Über den OPP (siehe Kapitel 1.3.3) ist es möglich, im Cytosol und im Stroma bei Bedarf
Reduktionsäquivalente in Form von NADPH bereitzustellen. In WT‐Pflanzen wird hierbei
das Auftreten eines futile cycle vermieden, wobei bei gleichzeitigem Ablauf von OPP und
Calvin‐Zyklus letztlich ATP verbraucht wird. Dies wird durch eine gegenläufige
Aktivierung/Inaktivierung der Schlüsselenzyme des OPP und des Calvin‐Zyklus erreicht.
Das Schlüsselenzym des OPP, die chloroplastidäre G6PDH, wird über das Fd‐Trx‐System,
im Gegensatz zu den Enzymen des Calvin‐Zyklus, inaktiviert (vgl. Buchanan, 1980;
Scheibe, 1990; Wenderoth et al., 1997). In den Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen ist der Fluss
von Elektronen auf Grund des Mangels an Fd über die photosynthetische
Elektronentransportkette ins Stroma limitiert. Die Gesamtkapazität der G6PDH
(plastidäre und cytosolische Isoformen) ist sowohl im Dunkeln (0‐h Wert) als auch im
Licht (nach drei bzw. sieben Stunden) signifikant erhöht (siehe Abb. 3.14‐A). Die erhöhte
Ergebnisse 83
Gesamtkapazität der G6PDH ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu einem großen Anteil auf die
signifikante Kapazitätssteigerung der plastidären G6PDH‐Isoform zurückzuführen
(siehe Abb. 3.14‐C).
Abb. 3.15: Enzymaktivität der G6PDH in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist die Kapazität der G6PDH‐Isoformen in den Blättern von Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Gesamtaktivität (A) sowie die cytosolische (B) und plastidäre (C) Kapazität wurden in denselben Blattproben bestimmt und auf den Proteingehalt bezogen. Die Blattproben wurden direkt nach der Dunkelphase (0) und nach drei (3) bzw. sieben (7) Stunden in der Lichtphase geerntet. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
3.1.3.2 Akkumulation von ROS
Sowohl der Aktivierungszustand der NADP‐MDH als auch Messungen zum
photosynthetischen Gaswechsel (siehe Kapitel 3.1.2.3 und Kapitel 3.1.2.4) belegen, dass
der Elektronenfluss von PSI auf NADP+ in den Fd2‐KO‐Pflanzen in verringertem Maße
abläuft. Das Stroma weist, im Gegensatz zur photosynthetischen
Elektronentransportkette in der Thylakoidmembran, einen erhöhten Oxidationsgrad
84 Ergebnisse
auf. Die verringerte Kapazität, Elektronen mittels Fd auf stromale Akzeptoren zu
übertragen, führt in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu einer vermehrten Akkumulation von ROS.
ROS sind stark reaktive Moleküle, die zu irreversiblen Schädigungen in der Zelle führen,
jedoch auch als Signalstoffe fungieren können (vgl. Mittler et al., 2004). Mittels des
Fluoreszin‐Derivates CM‐H2DCFDA (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) ist es möglich,
isolierte Protoplasten anzufärben und ROS über Laser‐Scanning Mikroskopie sichtbar zu
machen. CM‐H2DCFDA fluoresziert im reduzierten Zustand nicht. Wird über
interzelluläre Esterasen die Acetat‐Gruppe abgespalten und die Chemikalie über ROS
oxidiert, ist eine Fluoreszenz‐Emission zu beobachten, welche indirekt das Vorkommen
von ROS anzeigt. In den Fd2‐KO‐Pflanzen zeigen 46 % der Protoplasten aus grünem
Blattgewebe nach sieben Stunden unter moderaten Lichtbedingungen eine vermehrte
Akkumulation von ROS. In Noe‐WT‐Pflanzen sind lediglich 4 % der Zellen betroffen
(siehe Abb. 3.16). In dunkel‐adaptierten Protoplasten ist in Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen
keine vermehrte ROS‐Akkumulation zu beobachten (Daten nicht gezeigt).
Abb. 3.16: Akkumulation von ROS in Blatt‐Protoplasten von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist die Akkumulation von ROS in Protoplasten von Noe‐WT‐ bzw. Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Protoplasten wurden aus Blättern isoliert und sieben Stunden unter moderaten Bedingungen inkubiert. Vor der Untersuchung im Konfokalen Laser Scanning Mikroskop wurden die Protoplasten 15 min mit 1 µM CM‐H2DCFDA behandelt. Die Chlorophyll‐Autofluoreszenz wird in rot und ROS (sichtbar durch die Fluoreszenz‐Emission von CM‐H2DCFDA) in grün dargestellt. Zusätzlich sind die überlagerten Signale und DIC (differential interference contrast) abgebildet. Die gezeigten Bilder sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Die Akkumulation von ROS ist hauptsächlich in den Chloroplasten der Zellen lokalisiert
(siehe Abb. 3.17‐A). Zum Teil allerdings weisen auch an den Chloroplasten assoziierte
Mitochondrien eine vermehrte ROS‐Akkumulation auf (siehe Abb. 3.17‐B). Die Identität
Ergebnisse 85
der Mitochondrien wurde durch MitoTracker Orange CMTMRos (Invitrogen, Karlsruhe,
Deutschland) sichtbar. MitoTracker Orange CMTMRos fluoresziert im reduzierten
Zustand nicht. Im oxidierten Zustand kann eine Fluoreszenz‐Emission beobachtet
werden. Der MitoTracker Orange CMTMRos ROS akkumuliert in den Mitochondrien
lebender Zellen und wird dort oxidiert.
Abb. 3.17: Lokalisation von ROS in den Protoplasten der Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt sind einzelne Protoplasten von Fd2‐KO‐Pflanzen, welche zum einen eine typische Akkumulation von ROS in den Chloroplasten (A), zum anderen die zum Teil vorkommende Akkumulation von ROS in an Chloroplasten assoziierte Mitochondrien (B) zeigt. Die Protoplasten wurden aus Blättern der Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag), isoliert. Vor der Untersuchung im Konfokalen Laser Scanning Mikroskop wurden die Protoplasten 15 min mit 1 µM CM‐H2DCFDA behandelt. Die Chlorophyll‐Autofluoreszenz wird in rot und ROS (sichtbar durch die Fluoreszenz‐Emission von CM‐H2DCFDA) in grün dargestellt. Zusätzlich wurden die Protoplasten in 50 nM MitoTracker® Orange CMTMRos zur Visualisierung der Mitochondrien inkubiert. Die in (A) gezeigten Bilder sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten, wobei die in B dargestellte ROS‐Akkumulation in den Mitochondrien nur zum Teil zu beobachten war.
Die Atmungskette in den Mitochondrien von Pflanzen ist neben den Chloroplasten und
anderen Organellen mit einer hohen oxidativen, metabolischen Aktivität eine Quelle für
die Entstehung von ROS (vgl. Mittler et al., 2008), wobei hier angenommen wird, dass
unter abiotischen Stressbedingungen Chloroplasten und Peroxysomen die
hauptsächlichen Quellen für die Bildung von ROS sind (vgl. Mittler et al., 2004). Die
Tatsache, dass in den Protoplasten der Fd2‐KO‐Pflanzen ROS in Mitochondrien vor allem
86 Ergebnisse
dann beobachtet werden kann, wenn diese am Chloroplasten assoziiert vorliegen,
deutet in diesem Zusammenhang auf die Funktion von ROS als Signalmolekül hin (vgl.
Mittler et al. 2008) und belegt eine enge Interaktion von Chloroplasten und
Mitochondrien (vgl. Hanke et al., 2009).
ROS entstehen u.a. direkt durch die Reduzierung von molekularem Sauerstoff am PSI,
wobei Superoxid gebildet wird. Dies passiert zunehmend unter hohen Lichtintensitäten
(vgl. Mittler, 2002), sofern am PSI keine alternativen Akzeptoren zur Verfügung stehen.
Fds sind als Elektronendonator für die Reduzierung von O2 am PSI nicht notwendig,
vielmehr erfolgt die Reduzierung direkt oder über einen bislang nicht endgültig
aufgeklärten stromalen Faktor (vgl. Asada, 1999). Superoxide werden durch die
Superoxiddismutase zu Wasserstoffperoxid reduziert, wobei O2 entsteht. Die
Entsorgung von Wasserstoffperoxiden kann in den Chloroplasten über verschiedene
Wege ablaufen. Zur weiteren Reduzierung von H2O2 werden in der Regel
Reduktionsäquivalente in Form von reduziertem Fd oder NADPH aus der
Photosynthesereaktion benötigt (vgl. Mittler, 2002; Asada, 1999). Dies hat den
Nebeneffekt, dass durch die vermehrte Oxidierung von NADPH wieder NADP+ entsteht
und die Bildung von ROS am PSI präventiv verhindert wird. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist
die Generierung von reduziertem Fd sowie NADPH aus der Photosynthesereaktion nur
begrenzt möglich und ROS akkumulieren in den Chloroplasten (s. o.). Zu beachten ist,
dass die Akkumulation von ROS in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht zu sichtbaren Schäden an
den Blättern führt (siehe Kapitel 3.1.1). Demnach sind die Fd2‐KO‐Pflanzen in der Lage,
die Akkumulation von ROS auf ein Ausmaß zu begrenzen, welches die Vitalität der
Pflanzen nicht beeinflusst. In diesem Zusammenhang ist die signifikant geringere Menge
an Glutathion in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen zu
erwähnen (siehe Abb. 3.18), obwohl vermehrt ROS akkumuliert wird.
Glutathion übernimmt abhängig vom Reduktionszustand im pflanzlichen Organismus
die unterschiedlichsten Funktionen (vgl. Rouhier et al., 2008; Noctor und Foyer, 1998
sowie May et al., 1998). Unter anderem spielt Glutathion eine entscheidende Rolle als
Redox‐Puffer, um das intrazelluläre Milieu im reduzierten Zustand zu halten. Ferner ist
Glutathion ein wichtiges Reduktionsmittel für die Detoxifikation von ROS (vgl. Rouhier
et al., 2008; Noctor und Foyer, 1998 sowie May et al., 1998). Zum Beispiel wird
Wasserstoffperoxid mittels Glutathion‐Peroxidase durch GSH reduziert oder reduziertes
Asc wird mittels DHAR über GSH regeneriert. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist auf Grund der
signifikant verringerten Menge an Glutathion davon auszugehen, dass die Funktion von
Glutathion sowohl als Redox‐Puffer als auch zur Detoxifizierung von ROS nicht erfüllt
wird, obwohl durch das oxidierte Stroma bzw. akkumulierende ROS ein gesteigerter
Ergebnisse 87
Bedarf vorhanden ist. Im Gegensatz zu anderen Redox‐Paaren wie NADPH/NADP+ oder
Ascorbat/Dehydroascorbat, ist für das Redoxpotential sowohl die Glutathion‐
Konzentration als auch das Verhältnis von GSH zu GSSG entscheidend (vgl. Gomez et al.,
2006). Dies ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen verglichen mit den Noe‐WT‐Pflanzen nicht
verändert. Die Tatsache eines deutlich verringerten Gehaltes an Glutathion sowie keine
signifikante Veränderung im Verhältnis von GSH zu GSSG belegen wiederum, dass das
Stroma im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen stärker oxidiert vorliegt. Für die
Detoxifizierung von ROS in den Chloroplasten mittels GSH wird NADPH als
Reduktionsäquivalent zur Regenerierung von GSH aus GSSG mittels GR benötigt. In den
Fd2‐KO‐Pflanzen besteht ein Mangel an Reduktionsäquivalenten im Stroma. Dies
könnte der Grund für die signifikante Verringerung des Glutathion‐Gehalts sein.
Noe‐WT Fd2‐KO0
20
40
60
80
100
120GSH
GSSG
A B
Anteil am Noe
‐WT [%
]
Noe‐WT Fd2‐KO0.0
2.5
5.0
7.5GSH
/ GSSG
Noe‐WT Fd2‐KO0
20
40
60
80
100
120GSH
GSSG
A B
Anteil am Noe
‐WT [%
]
Noe‐WT Fd2‐KO0.0
2.5
5.0
7.5GSH
/ GSSG
Noe‐WT Fd2‐KO0.0
2.5
5.0
7.5GSH
/ GSSG
Abb. 3.18: Glutathion‐Gehalt in den Blättern der Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist der Glutathion‐Gehalt (A) sowie das Verhältnis von GSH zu GSSG (B) in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Der Gehalt an Glutathion ist bezogen auf den Gesamtgehalt in den Noe‐WT‐Pflanzen, wobei hierbei das arithmetische Mittel aus den Daten als 100 % angenommen wurde. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
3.1.4 NTRC als Fd‐unabhängiges antioxidatives System
In Kapitel 3.1.3.2 wird gezeigt, dass die Fd2‐KO‐Pflanzen über einen signifikant
verringerten Gehalt an Glutathion verfügen und der Mechanismus zur Entgiftung von
ROS im Stroma daher wahrscheinlich verringert abläuft. In den Fd2‐KO‐Pflanzen werden
auftretende ROS unabhängig vom photosynthetischen Elektronentransport über aus
dem OPP generierten NADPH (siehe Kapitel 3.1.3.1) reduziert und mittels NTRC
abgebaut (siehe Kapitel 1.4.3). Die NTRC hat eine Trx‐Domäne und überträgt Elektronen
von NADPH auf deren Zielenzyme. Ein mögliches Zielenzym ist das 2‐Cys‐Prx
88 Ergebnisse
(vgl. Pérez‐Ruíz et al., 2006), welches als antioxidatives Molekül beschrieben wird (vgl.
Baier und Dietz, 1997; König et al., 2002; Horling et al., 2003; Dietz, 2003). In A. thaliana
sind im Chloroplasten mit 2‐Cys‐Prx‐A und 2‐Cys‐Prx‐B bislang zwei Isoformen
beschrieben (vgl. Dietz et al., 2006).
Abb. 3.19: Expressions‐ sowie Translationsniveau von NTRC und 2‐Cys‐Prx in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Das Transkriptionslevel von NTRC und 2‐Cys‐Prx‐B (A) und der Proteingehalt von NTRC (B) und 2‐Cys‐Prx (C) wurde mittels RT‐PCR bzw. Western‐Blot Analysen in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag), bestimmt. Für die RT‐PCR Analysen wurden spezifische Primer für NTRC, 2‐Cys‐Prx‐B sowie UBQ10 als housekeeping‐gene verwendet. Für die Western‐Blot Analysen wurde 25 µg Protein aus dem Rohextrakt verwendet im SDS‐Gel aufgetrennt und auf eine PVDF‐Membran geblottet. Die Immundetektion erfolgte mit einen Antikörper gegen NTRC aus Reis (Serrato et al., 2004; Pérez‐Ruíz et al., 2006) sowie gegen das 2‐Cys‐Prx BAS1 aus Gerste (Baier und Dietz, 1997). Die dargestellten Daten sind Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Versuchen.
Mittels NTRC und 2‐Cys‐Prx ist der Abbau von ROS heterotroph und nicht direkt
abhängig vom photosynthetischen Elektronentransport. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist
sowohl im Licht als auch nach der Dunkelphase (0‐h) ein signifikant erhöhtes
Expressionsniveau sowohl an NTRC als auch an 2‐Cys‐Prx‐B zu detektieren
Ergebnisse 89
(siehe Abb. 3.19‐A). Ebenso ist der Proteingehalt von NTRC (siehe Abb. 3.19‐B) und
2‐Cys‐Prx (siehe Abb. 3.19‐C) in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐
Pflanzen vor allem nach sieben Stunden unter moderaten Bedingungen signifikant
erhöht. Die simultan erhöhten Mengen an 2‐Cys‐Prx sowie NTRC in den Fd2‐KO‐Pflanzen
belegen, dass akkumulierende ROS über die Fd‐unabhängige NTRC detoxifiziert werden.
Die benötigten Reduktionsäquivalente in Form von NADPH werden bei Bedarf über den
OPP bereitgestellt (siehe Kapitel 3.1.3.1), welcher auf Grund des Mangels an Fd in den
Fd2‐KO‐Pflanzen auch im Licht aktiv ist.
Zusammenfassung – Redoxregulation im Stroma (Kapitel 3.1.3 und 3.1.4)
In den Fd2‐KO‐Pflanzen herrscht ein Mangel an Reduktionsäquivalenten im Stroma.
Die gesteigerte Aktivität der G6PDH weist auf eine Generierung von
Reduktionsäquivalenten über den OPP im Licht hin. Dies ist eine Folge der
veränderten Redoxregulation, die durch den Mangel an Fds als Elektronendonator im
Stroma verursacht wird. Obwohl ein Mangel an NADPH im Stroma vorliegt, ist die
Transkriptmenge der NADP‐MDH erhöht, was auf den erhöhten Reduktionsgrad des
PET zurückzuführen ist. Weiter kommt es zur verstärkten Akkumulation von ROS in
den Chloroplasten. Die Detoxifizierung über antioxidative Systeme in den Fd2‐KO‐
Pflanzen verläuft zusätzlich über NTRC und 2‐Cys‐Prx, wobei hierfür bei Bedarf
benötigte Reduktionsäquivalente in den Chloroplasten heterotroph über den OPP
bereitgestellt werden.
Fd2‐KO‐Pflanzen im Hochlicht 3.2Fd2‐KO‐Pflanzen weisen Anpassungen auf, die Schädigungen am Photosyntheseapparat
in Folge einer unkontrollierten Überreduktion der photosynthetischen
Elektronentransportkette vorbeugen (siehe Kapitel 3.1). Trotz dieser Anpassungen ist
der Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette erhöht,
Ladungsrekombination am PSI tritt ein und ROS entstehen. Unter moderaten
Bedingungen sind in Folge dessen allerdings keine sichtbaren Schäden an den Fd2‐KO‐
Pflanzen zu beobachten. Die unterschiedlichen Anpassungen in den Fd2‐KO‐Pflanzen
gewährleisten somit deren Vitalität. In Folge dieser Ergebnisse stellt sich zum einen die
Frage, inwieweit der Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette
kurzzeitig erhöht werden kann, ohne dass dies zu Schädigungen am
Photosyntheseapparat führt. Um dies zu ermitteln, wurden Fd2‐KO‐Pflanzen, nach einer
Anzucht unter moderaten Bedingungen, einige Stunden im Hochlicht gehalten, um den
photosynthetischen Elektronentransport zu erhöhen und die vorliegende
90 Ergebnisse
Akzeptorlimitierung am PSI zu verschärfen. Zum anderen ist es von Interesse, ob durch
langfristige Anpassungen in den Fd2‐KO‐Pflanzen auch unter extremeren
Anzuchtbedingungen Schädigungen vermieden werden. Hierzu wurden Fd2‐KO‐
Pflanzen im Hochlicht angezogen. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den folgenden
zwei Kapiteln (3.2.1 und 3.2.2) dargestellt.
3.2.1 Kurzzeitakklimation im Hochlicht
Unter moderaten Bedingungen ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐
Pflanzen der Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette bereits
deutlich erhöht (siehe Kapitel 3.1.2.2). Im Folgenden wird gezeigt, welche Auswirkungen
eine kurzzeitig verstärkte Reduktion des PET zur Folge hat und inwieweit eine
Kurzzeitakklimation bzw. poising (siehe Kapitel 1.4.1) in diesen Pflanzen stattfinden
kann. Hierzu werden in diesem Kapitel Studien an Fd2‐KO‐ bzw. Noe‐WT‐Pflanzen
vorgestellt, welche acht bis zehn Wochen unter moderaten Bedingungen angezogen
und für einige Stunden unter Hochlicht‐Bedingungen gehalten wurden.
3.2.1.1 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport
Um den Reduktionsgrad sowie Akklimationsvorgänge am photosynthetischen
Elektronenfluss zu dokumentieren, werden im Folgenden Daten zum
photosynthetischen Elektronenfluss am PSI und PSII sowie CO2‐Assimilationsraten nach
einigen Stunden im Hochlicht vorgestellt. Die hierfür durchgeführten Bestimmungen der
P700‐Absorptionsänderung, der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission und der CO2‐
Assimilationsraten beruhen auf den in Kapitel 3.1.2 beschriebenen Prinzipien.
Detaillierte Angaben zur Methodik dieser Messungen sind in den Kapiteln 2.11, 2.12
sowie 2.13 ausführlich beschrieben.
Unter moderaten Bedingungen ist ΔAP700‐MAX in den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant
reduziert, was im Wesentlichen auf eine verminderte Menge an aktiven Thylakoiden
zurückzuführen ist (siehe Kapitel 3.1.2.1). Nach einer zweistündigen Inkubation im
Hochlicht ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen keine P700‐Absorptionsänderung mehr
festzustellen und ΔAP700‐MAX ist nicht mehr detektierbar (siehe Abb. 3.20).
Im Gegensatz zu den Noe‐WT‐Pflanzen weisen Fd2‐KO‐Pflanzen keine typische
zweiphasige P700‐Oxidationskinetik (siehe Abb. 3.21‐B) auf, sondern ausschließlich eine
verlängerte lag‐Phase, so dass ΔAP700‐MAX prinzipiell negative Werte annehmen würde.
Ergebnisse 91
Abb. 3.20: ΔAP700‐MAX der Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht (HL) und anschließender „Erholung“ unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Für die Messungen wurden die Pflanzen zwei Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) und danach wieder unter moderaten Bedingungen gehalten. Die Messungen wurden vor der Hochlichtphase (0), direkt danach (2) und anschließend wieder unter moderaten Bedingungen (6, 24 und 74) über insgesamt 74 Stunden durchgeführt. Die Versuche erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden vor jeder Messung für 15 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus abhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als treuu gsindikator (n ≥ 3, ± SE). Für Fd2‐KO‐Pflanzen konnte zum Teil (2 und 6 Stunden) kein ΔAP700‐MAX kalkuliert werden (*), hier war keine Oxidation von P700‐Molekülen im NIR zu beobachten.
un S n
Die anhaltende lag‐Phase deutet auf eine verstärkt auftretende Ladungsrekombination
im PSI nach zwei Stunden im Hochlicht hin. Die Oxidation von P700‐Molekülen im NIR
ist allerdings auch nach einer Inkubation mit Methylviologen als alternativem
Elektronenakzeptor am PSI praktisch nicht möglich. Zu erkennen ist lediglich, dass die
lag‐Phase in den Fd2‐KO‐Pflanzen weniger stark ausgeprägt und eine verstärkt
auftretende Ladungsrekombination durch den alternativen Elektronenakzeptor
Methylviologen umkehrbar ist (siehe Abb. 3.21‐B).
In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist ΔAP700‐MAX, nach einer Inkubation für zwei Stunden im
Hochlicht, erst nach 72 Stunden unter moderaten Lichtbedingungen wieder komplett
reversibel (siehe Abb. 3.20). Dies deutet auf eine Neusynthese von PSI‐
Proteinkomplexen hin, welche im Gegensatz zum PSII einige Tage dauert (vgl. Sonoike
et al., 1996). Demnach ist eine Degradation von PSI‐Komplexen, wahrscheinlich in Folge
von Photoinhibition am PSI, die Ursache für die ausbleibende Oxidation der P700‐
Moleküle im NIR nach zwei Stunden im Hochlicht. ZET um PSI sowie
Ladungsrekombination im PSI sind demnach als primäre Ursache auszuschließen.
92 Ergebnisse
In diesem Zusammenhang ist allerdings zu beachten, dass die CO2‐Assimilationsrate in
den Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht nicht signifikant verringert ist
(siehe Abb. 3.22). Trotz des gesteigerten Elektronendrucks in Folge kurzfristig erhöhter
Lichtintensitäten bleibt der Anteil an PSI‐Proteinkomplexen, die Elektronen für die CO2‐
Fixierung im Calvin‐Zyklus liefern, nahezu gleich. Erst nach sechs Stunden im Hochlicht
fällt die CO2‐Assimilationsrate in den Fd2‐KO‐Pflanzen um 41 %.
Abb. 3.21: P700‐Oxidation im NIR von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht mit Methylviologen als alternativem Elektronenakzeptor. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) und die P700‐Oxidationskinetiken im NIR (B) von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Vor der Messung wurden die Pflanzen für zwei Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden vor der Messung für fünf Stunden im Dunkeln zum einen in Wasser (‐MV) und zum anderen in 100 µM Methylviologen (+MV) inkubiert. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Sta dard ehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die P700‐Oxidationskinetiken sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
n f
Ergebnisse 93
Werden darüber hinaus Parameter der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission am PSII
betrachtet, fällt auf, dass im Vergleich zu den Werten unter moderaten Bedingungen
(siehe Tab. 3.2 in Kapitel 3.1.2.2) sowohl qP als auch ΦII in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach
zwei Stunden unter Hochlicht signifikant um 86 % verringert sind (siehe Tab. 3.3). Dies
ist auf einen hohen Reduktionsgrad des PQ‐Pools sowie des primären
Elektronenakzeptor OA im PSII und folglich der kompletten photosynthetischen
Elektronentransportkette zurückzuführen. Ebenso tritt Photoinhibition am PSII auf.
FV/FM ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht mit 0,70 ± 0,01
signifikant geringer als unter moderaten Bedingungen (siehe Tab. 3.3). Photoinhibition
am PSII geht einher mit Photoinhibition am PSI (vgl. Sonoike et al., 1996). Dies bestätigt
die oben beschriebenen Phänomene, wobei die signifikante Reduktion von ΔAP700‐MAX in
den Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht auf Photoinhibition am PSI und
folgende Degradation vom PSI zurückzuführen ist. Nach sechs Stunden im Hochlicht ist
chronische Photoinhibition am PSII zu beobachten, wobei FV/FM auf 0,56 fällt. Ebenso ist
NPQ in den Fd2‐KO‐Pflanzen nun im Vergleich zu moderaten Wachstumsbedingungen
um 79 % erhöht, was auf Photoinhibition am PSII zurückzuführen ist. Da bereits nach
zwei Stunden im Hochlicht der maximale Reduktionsgrad des primären Akzeptors sowie
des PQ‐Pools erreicht ist (sowohl φII als auch qP tendierten gegen Null) ist nach sechs
Stunden chronische Photoinhibition und daraus resultierende Schädigung am PSII‐
Proteinkomplex die Folge. Dies und eine Inaktivierung bzw. Degradation vom PSI führen
zur Verringerung der CO2‐Assimilationsraten in den Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Abb. 3.22).
Abb. 3.22: CO2‐Assimilation von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei bzw. sechs Stunden im Hochlicht. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation in den Blättern von Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern vor (0), nach zwei Stunden (2) und nach sechs Stunden (6) im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C) bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
94 Ergebnisse
In den Noe‐WT‐Pflanzen ist NPQ nach zwei Stunden im Hochlicht signifikant erhöht,
wobei FV/FM mit 0,8 ein nicht photoinhibiertes anzeigt (vgl. Björkmann und Demmig,
1987). Der gesteigerte Anteil NPQ in den Noe‐WT‐Pflanzen ist typisch für eine
kurzzeitige Akklimation im Hochlicht. Es tritt ein erhöhter Protonengradient über die
Thylakoidmembran in Folge eines vermehrten ZETs um PSI auf. Weiter stellt sich eine
zunehmende Reduzierung des primären Akzeptors und des PQ‐Pools ein (ΦII und qP
verringern sich nach zwei Stunden im Hochlicht um 50 bzw. 33 %). Auch dies sind
typische Auswirkungen einer Hochlicht‐Anpassung. Auf Grund der erhöhten
Lichtintensität steigt die CO2‐Assimilationsrate nach zwei Stunden im Hochlicht an.
Demnach werden absolut betrachtet mehr Elektronen für die CO2‐Assimilation
verwendet. Sowohl ZET als auch LET laufen in den Noe‐WT‐Pflanzen unter Hochlicht‐
Bedingungen mit zunehmendem Ausmaß ab. In den Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen ist
weder eine signifikante Steigerung des ZET noch des LET in Folge fehlender Fds als
Elektronenakzeptor am PSI festzustellen. Im Gegensatz zu den Fd2‐KO‐Pflanzen, welche
nach einigen Stunden im Hochlicht signifikante Schädigungen der Photosysteme
aufweisen, sind Noe‐WT‐Pflanzen zu diesem Zeitpunkt an das Hochlicht angepasst.
Tab. 3.3: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter der Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei bzw. sechs Stunden im Hochlicht (HL). Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1
bei 20 °C im Kurztag). Die Pflanzen wurden vor der Messung für zwei bzw. sechs Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer aktinischen Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Ex
perimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
Ergebnisse 95
3.2.1.2 CO2‐Assimilation und Photorespiration
In Kapitel 3.1.2.4 wurde anhand von A/Ci‐Kurven (bei 21 % O2) bereits gezeigt, dass
unter moderaten Lichtbedingungen angezogene Fd2‐KO‐Pflanzen einen in Vergleich zu
Noe‐WT‐Pflanzen geringeren Induktionszustand des Photosyntheseapparates
aufweisen. Des Weiteren ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen eine typische Lichtlimitierung
festzustellen, wobei der Mangel an Produkten der Primärreaktion die CO2‐Assimilation
im Calvin‐Zyklus limitiert. Nach zwei Stunden im Hochlicht ist dieser Effekt in
verstärktem Maße zu beobachten. Anhand von A/Ci‐Kurven (bei 21 % O2) sind typische
Anzeichen einer Lichtlimitierung in der Sättigungsphase unter hohen Ci in den Fd2‐KO‐
Pflanzen zu erkennen (siehe Abb. 3.23).
Abb. 3.23: A/Ci‐Kurven von Noe‐WT‐ un Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation in Abhängigkeit zum CO2‐Partialdruck im substomatären Raum (Ci) von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Pflanzen wurden vor der Messung für zwei Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 durchgeführt. An gleichen Blättern wurden zunächst die CO2‐Assimilationsraten bei 21 % O2 und danach ohne O2 im anliegenden Gasgemisch bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimente mit em Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
d
n d
Sowohl unter geringen als auch unter hohen Ci ist die CO2‐Assimilationsrate geringer als
in den Noe‐WT‐Pflanzen. Die Reduzierung der Assimilationsrate ist dabei nach zwei
Stunden im Hochlicht signifikanter als unter moderaten Bedingungen (siehe
Kapitel 3.1.2.4). Hierbei sind zum einen die Assimilationsraten der Noe‐WT‐Pflanzen
deutlich höher und zum anderen sind die CO2‐Assimilationsraten der Fd2‐KO‐Pflanzen,
vor allem in der Sättigungsphase, geringer als unter moderaten Bedingungen. Die
96 Ergebnisse
Steigung der A/Ci‐Kurve im linearen Bereich in den Noe‐WT‐Pflanzen ist mit
50,23 ± 7,86 nmol CO2 m‐2 s‐1 / µmol CO2 mol‐1 signifikant höher als in den Fd2‐KO‐
Pflanzen mit 19,65 ± 1,34 nmol CO2 m‐2 s‐1 / µmol CO2 mol‐1. Demnach ist der
Induktionszustand des Photosyntheseapparates (siehe Kapitel 3.1.2.4) in den Noe‐WT‐
Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht im Vergleich zu moderaten Bedingungen
um 50 % erhöht. In den Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen ist der Induktionszustand nach zwei
Stunden im Hochlicht nicht signifikant verändert. Eine Erhöhung der Lichtintensität
fördert die Steigerung des Induktionszustandes nicht. Es wird deutlich, dass auch nach
zwei Stunden im Hochlicht die Photosyntheserate durch den Mangel an Produkten der
Primärreaktion limitiert bleibt.
Die Erstellung von A/Ci‐Kurven unter O2‐freien Bedingungen (siehe Abb. 3.23)
ermöglicht es, die maximale Carboxylierungsrate der RubisCO zu bestimmen, da
Photorespiration unter diesen Bedingungen nahezu ausgeschlossen werden kann (siehe
Kapitel 3.1.2.4). Der Parameters APR beschreibt den Anteil der apparenten
Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate (siehe Kapitel 2.13.5 und
Kapitel 3.1.2.4) und gibt somit den Anteil der Photorespiration an der
Photosynthesereaktion an.
Abb. 3.24: Anteil der apparenten Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate in den Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach wei Stunden Hochlicht Dargestellt ist der photoresipratorische Anteil am photosynthetischen Elektronenfluss in Form des Parameters APR in Noe‐WT‐ (durchgezogene Linie mit ausgefüllten Kreisen) und Fd2‐KO‐Pflanzen (gestrichelte Linie mit offenen Kreisen), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Pflanzen wurden vor der Messung für zwei Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen durchgeführt und APR wurde aus den A/Ci‐Kurven (siehe Abb. 3.23) kalkuliert. Gemessen wurde bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
z im
Ergebnisse 97
In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist APR nach zwei Stunden im Hochlicht im Vergleich zu den Noe‐
WT‐Pflanzen sowohl unter geringen als auch bei hohen Ci signifikant gesteigert
(siehe. Abb. 3.24). In der Regel ist unter hohen Ci das Auftreten von Photorespiration
minimal. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist jedoch selbst unter einer hohen Ci ein gesteigerter
Anteil an Photorespiration festzustellen.
Die Fd2‐KO‐Pflanzen sind unter moderaten Wachstumsbedingungen gut an den
Mangel an Elektronenakzeptoren angepasst (siehe Kapitel 3.1). Allerdings weist die
PET nach zwei Stunden einen maximalen Reduktionszustand auf. Dies wiederum
führt zu einer nicht mehr detektierbaren P700‐Absorptionsänderung im NIR,
wahrscheinlich in Folge einsetzender Photoinhibition am und Degradation vom PSI.
Die schon unter moderaten Bedingungen signifikant verringerte CO2‐
Assimilationsrate ist zunächst nicht beeinflusst. Hingegen ist die Limitierung der
Photosyntheserate durch den Mangel an Produkten der Primärreaktion signifikant
stärker ausgeprägt als unter moderaten Bedingungen. Vor allem ist der hohe Anteil
an Photorespiration bemerkenswert, obwohl NADPH als Produkt der Primärreaktion
bereits limitierender Faktor in den Fd2‐KO‐Pflanzen ist. Nach sechs Stunden im
Hochlicht verstärken sich die Anzeichen von chronischer Photoinhibition und
Schädigungen vor allem am PSII. Der maximale Reduktionsgrad der
photosynthetischen Elektronentransportkette wird überschritten, Schädigungen an
den Komponenten der Elektronentransportkette treten auf und die
Photosyntheseraten verringern sich signifikant.
Zusammenfassung – Fd2‐KO‐Pflanzen im Hochlicht (Kapitel 3.2)
3.2.2 Langzeitakklimation im Hochlicht
In den vorangegangenen Kapiteln wurden die Anpassungen von Fd2‐KO‐Pflanzen unter
moderaten Bedingungen sowie die kurzzeitigen Auswirkungen im Hochlicht dargestellt.
Hierbei wird deutlich, dass langfristige Anpassungen unter moderaten Bedingungen zu
einer eingeschränkten, aber vitalen Entwicklung führen. Der maximale Reduktionsgrad
der photosynthetischen Elektronentransportkette wird nicht überschritten. Kurze
„Stresssituationen“ (bis zu sechs Stunden im Hochlicht) dagegen führen zu einer
extremen Überreduktion der photosynthetischen Elektronentransportkette (siehe
Kapitel 3.2.1), so dass es zur chronischen Photoinhibition und daraus folgender
Degradation der Photosysteme kommt. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage,
ob eine Langzeitakklimation in der Entwicklung der Pflanzen einer solchen
Überreduktion des PET vorbeugen kann. Zu diesem Zweck wurden Noe‐WT‐ und Fd2‐
98 Ergebnisse
KO‐Pflanzen zunächst zwei Wochen unter moderaten Bedingungen und anschließend
sechs Wochen im Hochlicht angezogen (siehe Kapitel 2.2). In den folgenden Kapiteln
(3.2.2.1 ‐ 3.2.2.3) werden diese Pflanzen charakterisiert und die Auswirkungen einer
Anzucht im Hochlicht auf die Fd2‐KO‐Pflanzen werden analysiert. Soweit nicht anders
vermerkt, erfolgten die Experimente jeweils nach einer Stunde in der Lichtphase.
3.2.2.1 Phänotyp
Im Hochlicht angezogene Fd2‐KO‐Pflanzen weisen einen ähnlichen Phänotyp auf
(siehe Abb. 3.25), wie die unter moderaten Bedingungen angezogenen Fd2‐KO‐Pflanzen
(siehe Kapitel 3.1.1). Hierbei sind auch im Hochlicht an den Fd2‐KO‐Pflanzen ein um ca.
zwei Wochen verzögertes Wachstum sowie eine im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen
geringere Ausbildung von Blattbiomasse zu detektieren.
Abb. 3.25: Phänotyp der im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt sind typische im Hochlicht angezogene (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen (Durchmesser der Töpfe: 5 cm). Die Pflanzen wurden nach der Aussaat zunächst für zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und dann nach der Vereinzelung für weitere sechs Wochen im Hochlicht kultiviert. Die gezeigten Pflanzen sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Anzuchten.
Nach der Anzucht im Hochlicht sind die Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den
entsprechenden Noe‐WT‐Pflanzen weniger stark pigmentiert. Auch in diesem Falle
zeichnen sich ähnliche Tendenzen ab, wie es unter moderaten Bedingungen der Fall ist
(siehe Kapitel 3.1.1). Sowohl der Gehalt an Chlorophyll als auch Carotinoiden ist
signifikant verringert (siehe Tab. 3.4). Insbesondere ist der Gehalt an Chlb in den Fd2‐
KO‐Pflanzen stark verringert, was auf eine verminderte Akkumulation von LHCs
schließen lässt. Zu beachten ist, dass bei der Anzucht im Hochlicht in den Noe‐WT‐
Pflanzen vermehrt Anthocyane akkumulieren. Anthocyane gehören zur Stoffklasse der
Flavonoide und bilden sich vermehrt in Blättern, die abiotischen Stressbedingungen
Ergebnisse 99
(UV‐Licht, vermindertes Nährstoffangebot und Kälte) ausgesetzt sind (vgl. Winkel‐
Shirley, 2001; Teng et al., 2005; Cominelli et al., 2008; Lillo et al., 2008; Olsen et al.,
2009; Rowan et al., 2009). In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird hingegen im Vergleich zu den
Noe‐WT‐Pflanzen ca. 83 % weniger Anthocyan akkumuliert. Die insgesamt verringerte
Pigmentierung in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den WT‐Pflanzen deutet auf
einen verminderten Gehalt an aktiven Thylakoiden hin, was bereits unter moderaten
Bedingungen der Fall war (siehe Kapitel 3.1.2.1).
Tab. 3.4: Physiologische Parameter der im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Die dargestellten Parameter wurden an Blättern von zunächst für zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und danach für sechs Wochen im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) angezogenen Fd2‐KO‐ und Noe‐WT‐Pflanzen bestimmt. Die Mengenangaben der Pigmente beziehen sich auf die Blattfläche. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
3.2.2.2 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport
Unter moderaten Anzuchtbedingungen weisen die Fd2‐KO‐Pflanzen signifikante
Anpassungen in Folge einer Akzeptorlimitierung am PSI auf, welche die Pflanze vor einer
zu starken Überreduktion der photosynthetischen Elektronentransportkette und daraus
resultierenden Schädigungen schützen (siehe Kapitel 3.1.2). Eine kurze Inkubation im
Hochlicht führt hingegen zu einer extremen Überreduktion der photosynthetischen
Elektronentransportkette. Schließlich tritt chronische Photoinhibition an den
Photosystemen und folglich eine Degradation ein (siehe Kapitel 3.2.1). Werden Fd2‐KO‐
Pflanzen hingegen sechs Wochen im Hochlicht kultiviert, sind zunächst keine sichtbaren
Schädigungen an den Blättern zu beobachten (siehe Kapitel 3.2.2.1). Es kann also davon
ausgegangen werden, dass langfristige Hochlicht‐Anpassungen einer schädigenden
100 Ergebnisse
Überreduktion der photosynthetischen Elektronentransportkette vorbeugen. Anhand
von P700‐Absorptionsmessungen sowie von Messungen der Chlorophyllfluoreszenz‐
Emission (zur grundlegenden Theorie siehe Kapitel 3.1.2; für Details zur Methodik siehe
Kapitel 2.11 und Kapitel 2.12) wird im Folgenden der Zustand der photosynthetischen
Elektronentransportkette analysiert.
Im Gegensatz zu den Fd2‐KO‐Pflanzen nach einer kurzen Zeit im Hochlicht ist in den
Fd2‐KO‐Pflanzen, welche im Hochlicht angezogen wurden, eine Oxidierung von P700‐
Molekülen im NIR möglich. Im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen ist ΔAP700‐MAX in den
Fd2‐KO‐Pflanzen um 78 % verringert (siehe Abb. 3.26‐A). Dies ist vergleichbar mit der
Reduzierung von ΔAP700‐MAX, die auch unter moderaten Bedingungen in den Fd2‐KO‐
Pflanzen auftritt (siehe Kapitel 3.1.2.1). Vergleichbar ist ebenso die veränderte Kinetik
der P700‐Oxidation im NIR in den im Hochlicht kultivierten Fd2‐KO‐Pflanzen. Eine
schnelle erste Phase der P700‐Oxidierung ist nicht zu detektieren und eine signifikant
verlängerte lag‐Phase tritt ein (siehe Abb. 3.26‐B). Dies lässt auf eine zunehmende
Ladungsrekombination im PSI im Zuge einer Akzeptorlimitierung am PSI schließen.
Abb. 3.26: P700‐Oxidation im NIR von im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) und die Kinetiken der P700‐Oxidation im NIR (B) von zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und darauf folgend sechs Wochen im Hochlicht angezogenen (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die P700‐Oxidationskinetiken sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse 101
Diese vergleichbaren Ergebnisse für Fd2‐KO‐Pflanzen, zum einen unter moderaten
Bedingungen und zum anderen im Hochlicht kultiviert, lassen auf die gleiche Ursache
für das signifikant verringerte ΔAP700‐MAX schließen: eine Verringerung der absoluten
Menge an aktiven Thylakoiden. Dies erklärt auch, wie bereits für Fd2‐KO‐Pflanzen unter
moderaten Bedingungen gezeigt, die insgesamt verringerte Pigmentierung der Fd2‐KO‐
Pflanzen. Schließlich treten auch bei im Hochlicht kultivierten Fd2‐KO‐Pflanzen, wie
bereits für Fd2‐KO‐Pflanzen moderaten Bedingungen beschrieben (siehe Kapitel 3.1.2),
signifikante Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport auf.
Anhand der Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter sind im Hochlicht sowohl für Noe‐WT‐ als
auch für Fd2‐KO‐Pflanzen typische Anzeichen einer Akklimation an erhöhte
Lichtintensitäten zu beobachten. In den aktiven Thylakoiden ist im Vergleich zu den
unter moderaten Bedingungen angezogenen Pflanzen die Elektronentransportrate
signifikant erhöht (siehe Tab. 3.5). Dies führt zu einer verstärkten Reduktion des
primären Elektronenakzeptors QA im PSII, angezeigt durch eine Verringerung von ΦII.
Ebenso ist ein erhöhter Protonengradient über die Thylakoidmembran, angezeigt durch
gesteigerten NPQ, eine Folge des verstärkten Elektronenflusses. Im Vergleich zu den
Pflanzen unter moderaten Bedingungen belegen die Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter
einen im Hochlicht zunehmenden Reduktionsgrad der photosynthetischen
Elektronentransportkette. Zu beachten ist hierbei, dass die Auswirkung der Anzucht im
Hochlicht auf den photosynthetischen Elektronenfluss in den Fd2‐KO‐Pflanzen
signifikanter ist als unter moderaten Bedingungen. So weisen die Fd2‐KO‐Pflanzen im
Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen eine um 50 % geringere Elektronentransportrate, um
50 % geringere Quantenausbeuten am PSII sowie 50 % weniger photochemische
Fluoreszenzlöschung auf. Bei der Anzucht unter moderaten Bedingungen sind diese
Parameter in den Fd2‐KO‐Pflanzen nur um jeweils ca. 30 % verringert. Dies deutet auf
einen signifikant erhöhten Reduktionsgrad der photosynthetischen
Elektronentransportkette nach einer Anzucht im Hochlicht in den Fd2‐KO‐Pflanzen
verglichen mit den entsprechenden Noe‐WT‐Pflanzen hin. In Folge dessen kommt es
auch verstärkt zur Photoinhibition am PSII, da sich eine signifikante Verringerung von
FV/FM einstellt. Weiter ist sowohl in Noe‐WT‐ als auch in Fd2‐KO‐Pflanzen auch ein
erhöhter Anteil NPQ verglichen mit dem unter moderaten Bedingungen zu detektieren.
Ein im Vergleich zum Noe‐WT‐ unter Hochlicht erhöhten NPQ in den Fd2‐KO‐Pflanzen ist
hingegen nicht der Fall. Wie bereits unter moderaten Anzuchtbedingungen ist in den
Fd2‐KO‐Pflanzen in Folge der stromalen Akzeptorlimitierung kein erhöhter
Protonengradient über die Thylakoidmembran zu detektieren. Da NPQ neben qE auch
signifikant durch qI bestimmt ist (siehe Kapitel 3.1.2.2), ist davon auszugehen, dass bei
102 Ergebnisse
auftretender Photoinhibition am PSII in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach der Anzucht im
Hochlicht ein im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen verringerter Protonengradient
generiert wird. Bei einem vergleichbaren Gradienten würde auftretende
Photoinhibition am PSII NPQ signifikant erhöhen.
Tab. 3.5: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter von im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von zunächst zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und darauf folgend sechs Wochen im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer aktinischen Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
ΦII qP NPQ ETR Fv/Fm qL
Noe‐WT 0,52 ± 0,02 0,95 ± 0,02 0,79 ± 0,03 207 ± 6 0,75 ± 0,01 1,09 ± 0,07
Fd2‐KO 0,23 ± 0,02 0,49 ± 0,05 0,77 ± 0,03 91 ± 8 0,70 ± 0,01 0,58 ± 0,05
ΦII qP NPQ ETR Fv/Fm qL
Noe‐WT 0,52 ± 0,02 0,95 ± 0,02 0,79 ± 0,03 207 ± 6 0,75 ± 0,01 1,09 ± 0,07
Fd2‐KO 0,23 ± 0,02 0,49 ± 0,05 0,77 ± 0,03 91 ± 8 0,70 ± 0,01 0,58 ± 0,05
3.2.2.3 CO2‐Assimilation
Unter moderaten Bedingungen ist die CO2‐Assimilationsrate in den Fd2‐KO‐Pflanzen in
Folge der Akzeptorlimitierung am PSI verringert. Anhand von Lichtsättigungskurven wird
zudem deutlich, dass in Folge erhöhter Lichtintensitäten die Elektronentransportrate
und damit einhergehend die CO2‐Assimilationsrate gesteigert ist (siehe Kapitel 3.1.2.4).
Dies ist zunächst auch bei den unter moderaten Bedingungen angezogenen Fd2‐KO‐
Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht zu beobachten (siehe Kapitel 3.2.1.1). Obwohl
die photosynthetische Elektronentransportkette einen erhöhten Reduktionszustand
aufweist, geht mit kurzfristig erhöhten Lichtintensitäten auch eine gesteigerte CO2‐
Assimilation einher. Dies ist auch bei im Hochlicht angezogenen Fd2‐KO‐Pflanzen der
Fall. Wie in Kapitel 3.2.2.2 beschrieben, ist der Reduktionszustand der
photosynthetischen Elektronentransportkette der im Hochlicht angezogenen Fd2‐KO‐
Pflanzen im Vergleich zu den moderaten Bedingungen signifikant erhöht, so dass erste
Anzeichen von Photoinhibition am PSII auftreten. Die CO2‐Assimilationsrate ist hingegen
in Folge der erhöhten Elektronentransportrate ebenfalls signifikant höher als unter
moderaten Bedingungen (siehe Abb. 3.27).
Ergebnisse 103
Bezogen auf die im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐Pflanzen ist die Photosyntheserate
bei den entsprechenden Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen um 47 % verringert. Dies entspricht
in etwa dem Verhältnis, welches auch unter moderaten Bedingungen zwischen
Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen auftritt (siehe Kapitel 3.1.2.3). Diese Daten belegen die
Aussage, dass die Kapazität der Photosynthesereaktion unter moderaten Bedingungen
nicht ausgeschöpft ist und kurzzeitig erhöhte Lichtintensitäten (siehe
Lichtsättigungskurven in Kapitel 3.1.2.4 sowie die Versuche nach einigen Stunden im
Hochlicht in Kapitel 3.2.1) auch eine erhöhte CO2‐Assimilation zur Folge haben. In
Anbetracht der Tatsache, dass bei im Hochlicht angezogenen Fd2‐KO‐Pflanzen
Photoinhibition am PSII auftritt, ist davon auszugehen, dass unter diesen Bedingungen
der maximale Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette und
damit einhergehend der Photosynthese erreicht ist.
Abb. 3.27: CO2‐Assimilation der im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist die Rate der CO2‐Assimilation von zunächst zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und darauf folgend sechs Wochen im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern nach einer Stunde in der Lichtphase bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
Im Hochlicht angezogene Fd2‐KO‐Pflanzen weisen verringerte Mengen an aktiven
Thylakoiden auf. Der Reduktionsgrad des PET ist signifikant höher als unter
moderaten Bedingungen. Dies und die verringerte Fähigkeit, einen
Protonengradienten über die Thylakoidmembran zu generieren, führen zu ersten
Anzeichen von Photoinhibition am PSII. Im Gegensatz dazu sind die Fd2‐KO‐Pflanzen
im Zuge Ihrer Entwicklung an das Hochlicht akklimatisiert und weisen eine höhere
Photosyntheserate als unter moderaten Bedingungen auf. Dies stellt einen
signifikanten Unterschied zu den Fd2‐KO‐Pflanzen dar, die nur kurze Zeit im Hochlicht
standen (siehe Kapitel 3.2.1), wobei es in Folge des signifikant erhöhten
Reduktionsgrades des PET zur Degradation vom PSI kommt.
Zusammenfassung – Langzeitakklimation im Hochlicht (Kapitel 3.2.2)
104 Ergebnisse
Charakterisierung der alternativen Fd‐Isoform FdC1 3.3
In A. thaliana sind bis dato zwei photosynthetisch aktive Fd‐Isoformen beschrieben, Fd1
und Fd2 (siehe Kapitel 1.2.2) sowie Hanke et al., 2004; Hanke und Hase, 2008). Neben
der Wurzel‐Isoform, Fd3 (AGI‐Code: At2g27510), und einer Fd3‐ähnlichen Isoform, Fd4
(AGI‐Code: At5g10000), sind im Genom von A. thaliana zusätzlich zwei weitere Fd‐
ähnliche Peptide codiert (vgl. Hanke et al., 2004), die bislang nicht genauer
charakterisiert wurden. In unveröffentlichten Untersuchen wird das Genprodukt von
At1g14890 als Ferredoxin C1 (FdC1) und von At1g32550 als Ferredoxin C2 (FdC2)
bezeichnet (Hanke, unpubl.). Diese Bezeichnung beruht auf einer C‐terminalen
Verlängerung der AS‐Sequenz gegenüber den bis dato beschriebenen Fd‐Isoformen in
A. thaliana (siehe Kapitel 3.3.1).
Fd2‐KO Noe‐WT0
5
10
15
Fd2‐KO Noe‐WT0
5
10
15
UBQ10
FdC1
Fd2‐KO Noe‐WT
FdC2
A B
Expression
niveau
[ % UBQ
10]
FdC1
FdC2
Fd2‐KO Noe‐WT0
5
10
15
Fd2‐KO Noe‐WT0
5
10
15
UBQ10
FdC1
Fd2‐KO Noe‐WT
FdC2
A B
Expression
niveau
[ % UBQ
10]
FdC1
FdC2
Abb. 3.28: Expressionsniveau der Fd‐ähnlichen Proteine FdC1 und FdC2 in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Der Gehalt an FdC1 bzw. FdC2 in Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen wurde mittels RT‐PCR bestimmt. Hierfür wurden die Pflanzen neun Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1bei 20 °C im Kurztag) kultiviert. Für die RT‐PCR Analysen wurden spezifische Primer für FdC1, FdC2 und UBQ10 als housekeeping‐gene verwendet. Dargestellt ist ein typisches Beispiele der RT‐PCR Produkte im Agarosegel (A) sowie eine auf UBQ10 bezogenen prozentuale Auswertung der RT‐PCR Produkte (B), wobei UBQ10 jeweils als 100 % festgelegt wurde. Die dargestellten Agarosegele sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei aufgetragenen Proben. Die gezeigte prozentuale Auswertung sind arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird unter moderaten Bedingungen die zweite
photosynthetisch aktive Isoform nicht vermehrt akkumuliert (siehe Kapitel 3.1). Mit
einem knock‐out von Fd2 sind demnach ca. 90 % der photosynthetisch relevanten Fds
im Blatt nicht exprimiert bzw. translatiert. Obwohl diverse Anpassungen in den Fd2‐KO‐
Pflanzen in Folge von fehlenden Elektronenakzeptoren am PSI stattfinden, wirft dieser
Ergebnisse 105
4,1661911,08103Fdc1
3,8452210,4197Fd2
3,9152110,5497Fd1
theoretischerpI
Negativ geladene AS‐Reste
Positiv geladene AS‐Reste
Molekulargewicht[kDA]
AS‐Reste
massive Mangel die Frage nach alternativen Akzeptoren am PSI auf. In den Fd2‐KO‐
Pflanzen sind die Fd‐ähnlichen Peptide FdC1 und FdC2 im Blatt vermehrt exprimiert
(siehe Abb. 3.28). Fastabend (2006) zeigte zudem eine verstärkte Zunahme des
Expressionsniveau von FdC1 im Hochlicht.
In den folgenden Kapiteln werden Teile einer grundsätzlichen Charakterisierung von
FdC1 dargestellt, welche zusammen mit unveröffentlichten Ergebnissen (Hanke,
unpubl.) FdC1 als alternative photosynthetische Fd‐Isoform mit möglicherweise
speziellen Funktionen charakterisieren. Die für die Versuche verwendeten Pflanzen
wurden, soweit nicht anders vermerkt, neun Wochen unter moderaten Bedingungen
(siehe Kapitel 2.2) angezogen.
3.3.1 Bioinformatische Einordnung von FdC1
Das für FdC1 codierende Gen At4g14890 weist in seiner genomischen Sequenz, wie es
auch für At1g10960 (Fd1) und At1g60950 (Fd2) der Fall ist, keine Introns auf (siehe
http://www.arabidospsis.org). Das komplett translatierte Protein hat eine Länge von
154 AS‐Resten. Analysen der Primärstruktur von FdC1 mit dem Programm ChloroP
(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/index.html) deuten mit einer hohen
Wahrscheinlichkeit (Score: 0,570) auf eine Lokalisation im Chloroplasten bei einer Länge
des Transidpeptids von 56 AS hin. Verglichen mit den Primärsequenzen von Fd1 und Fd2
wird deutlich, dass das Transidpeptid wahrscheinlich 51 AS‐Reste lang ist, da die
Positionen 52 – 55 hoch konserviert vorliegen und im nativen Protein für Fd1 und Fd2
vorhanden sind. Das demnach aus 103 AS bestehende native Protein FdC1 weist nahezu
identische theoretische Eigenschaften auf, wie es für Fd1 bzw. Fd2 der Fall ist
(siehe Tab. 3.6).
4,1661911,08103Fdc1
3,8452210,4197Fd2
3,9152110,5497Fd1
theoretischerpI
Negativ geladene AS‐Reste
Positiv geladene AS‐Reste
Molekulargewicht[kDA]
AS‐Reste
Tab. 3.6: Theoretische Peptideigenschaften von Fd1, Fd2 und FdC1. Dargestellt sind die theoretisch anhand der Primärsequenz kalkulierten Eigenschaften der Proteine Fd1, Fd2 und FdC1. Die Simulation wurde anhand der Primärsequenz der nativen Proteine mit dem Programm ProtParam (http://www.expasy.org/cgi‐bin/protparam) durchgeführt.
106 Ergebnisse
Abb. 3.29: Alignment photosynthetischer Fd‐ und FdC1‐Isoformen. Dargestellt sind die Proteinsequenzen ausgewählter Fd‐ und FdC1‐Isoformen aus verschiedenen höheren Pflanzen, Algen und Cyanobakterien. Die Sequenzen stammen aus der NCBI‐Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und wurden mit ClustalW aligned (www.ebi.ac.uk/Tools/clustalW2/index.html). Die AS‐Reste, die zu mehr als 50 % konserviert vorliegen, sind für alle dargestellten Fd‐Isoformen (weiß mit schwarzem Hintergrund), für die dargestellten typischen photosynthetischen Fd‐Isoformen (weiß auf grauem Hintergrund) und für die argestellten FdC1‐Isoformen (schwarz auf grauem Hintergrund) entsprechend hervorgehoben. Abkürzungen: PETF: Fd‐Isoform des PET; AtFd2: Fd2 aus A. thaliana.
d
Ergebnisse 107
Eine Funktion von FdC1 als Elektronenakzeptor am PSI erscheint demnach als möglich.
Die Analyse der Primärsequenz mit ProtParam (http://www.expasy.org/cgi‐
bin/protparam) zeigt allerdings für FdC1 zusätzlich eine Instabilität auf, was für die
übrigen Fd‐Isoformen sowie für FdC2 nicht der Fall ist. Diese Instabilität des Proteins
konnte auch in‐vitro am rekombinanten Protein beobachtet werden (Hanke, unpubl.).
FdC1 zeigt eine ausreichend hohe Sequenzähnlichkeit zu den klassischen Fd‐Isoformen,
so dass von der Bildung eines [2F‐2S]‐Zentrums ausgegangen werden kann
(siehe Abb. 3.29). Zu beachten ist jedoch, dass FdC1 eine höhere Homologie zu Fd‐
Isoformen mit C‐terminaler Sequenzerweiterung in anderen höheren Pflanzen sowie zu
Fd‐ähnlichen Proteinen in Cyanobakterien aufweisen als zu den photosynthetischen
sowie nicht‐photosynthetischen Fd‐Isoformen in A. thaliana (siehe Abb. 3.30).
Abb. 3.30: Phylogenetischer Stammbaum photosynthetischer Fd‐ und FdC1‐Isoformen. Dargestellt ist ein phylogenetischer Stammbaum verschiedener typischer photosynthetischer Fd‐ und FdC1‐Isoformen aus höheren Pflanzen, Algen und Cyanobakterien. Der Stammbaum wurde aus dem Aligment der Proteinsequenzen (siehe Abb. 3.29) mit der Software Phylodendron (http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint‐form.html) erstellt.
108 Ergebnisse
Der phylogenetische Zusammenhang der Fd‐Isoformen in höheren Pflanzen und
Cyanobakterien ist in Abb. 3.30 anhand eines Stammbaums dargestellt. Die hierbei
relevanten konservierten AS‐Reste sind im Alignment in Abb. 3.29 grau hinterlegt. Die
phylogenetisch am engsten mit FdC1 verwandten Fd‐Isoformen anderer höherer
Pflanzen sowie Fd‐ähnliche Proteine aus Cyanobakterien weisen ausnahmslos eine
C‐terminale Sequenzerweiterung auf. Diese C‐terminale Sequenzerweiterung, welche
auf Struktur sowie Funktion eines Proteins großen Einfluss hat (vgl. Bertini et al., 2002),
ist der Anlass die zwei Fd‐ähnlichen Proteine in A. thaliana als FdC1 sowie FdC2 zu
bezeichnen (s. o.).
3.3.2 Lokalisationsstudien
Aus einem Abgleich der Internet‐Datenbanken Genevestigator
(http://www.genevestigator.com) und Weigelworld (http://www.weigelworld.org)
resultiert die vorrangige Expression von FdC1 in photosynthetischem Gewebe,
allerdings in deutlich geringerem Ausmaß als dies für die klassischen
photosynthetischen Fd‐Isoformen Fd1 und Fd2 der Fall ist. Zusätzliche bioinformatische
Analysen der Sequenz des Präproteins von FdC1 und die Homologie zu den Fd‐ähnlichen
Proteinen in Cyanobakterien machen eine Lokalisation im Chloroplasten sehr
wahrscheinlich (siehe Kapitel 3.3.1).
Abb. 3.31: FdC1‐Lokalisationsstudien mittels GFP‐Fluoreszenzmikroskopie. Dargestellt sind Protoplasten aus A. thaliana, welche zuvor mit dem FdC1‐GFP Fusionsprotein transformiert wurden. Die Lokalisation von FdC1 wurde anhand der GFP‐Fluoreszenz im konfokalen Laser Scanning Mikroskop sichtbar gemacht. Die Chlorophyll‐Autofluoreszenz wird in rot und die FdC1‐GFP Fluoreszenz in grün dargestellt. Zusätzlich wurden die Signale der Chlorophyll‐Autofluoreszenz mit denen der FdC1‐GFP Fluoreszenz überlagert und der DIC (differential interference contrast) dargestellt. Die gezeigten Bilder sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Um die vermutete Lokalisation in den Chloroplasten abzusichern, wurden FdC1‐GFP
Fusionsproteine erstellt und über einen Vektor in isolierte Protoplasten von A. thaliana
transformiert (siehe Kapitel 2.15.1). In Abb. 3.31 ist zu sehen, dass das Fusionsprotein
Ergebnisse 109
eindeutig in den Chlorplasten lokalisiert ist. Die Chlorophyll‐Autofluoreszenz und das
GFP‐Signal überlagern sich. Diese Tatsache beweist die chloroplastidären Lokalisation
von FdC1 und stützt die These, dass FdC1 eine alternative photosynthetisch aktive Fd‐
Isoform darstellen und als Elektronenakzeptor am PSI fungieren kann.
3.3.3 Die Funktion von FdC1 im photosynthetischen Elektronentransport
In den vorangegangenen Kapiteln wurde gezeigt, dass FdC1 als möglicher
Elektronenakzeptor am PSI wahrscheinlich ist. Die signifikant gesteigerte Expression von
FdC1 im photosynthetisch aktiven Gewebe der Fd2‐KO‐Pflanzen ist ein Hinweis auf eine
wichtige Funktion von FdC1 im photosynthetischen Elektronentransport bei
auftretender stromaler Akzeptorlimitierung. Bis dato unveröffentlichte in‐vitro
Untersuchungen belegen, dass natives FdC1 Elektronen von PSI akzeptiert, allerdings
nicht mittels FNR auf NADP+ übertragen kann (Hanke, unpubl.). Dies schließt FdC1 als
alternativen Elektronenakzeptor am PSI für den linearen Transport von Elektronen auf
NADP+ aus. Im Folgenden sind Ergebnisse dargestellt, die eine Funktion von FdC1 im ZET
um PSI sowie in der Photorespiration aufklären sollen. Hierzu wurden zwei FdC1‐RNAi‐
Linien (A. thaliana, Ökotyp Columbia – siehe Kapitel 2.2) verwendet, die eine im
Vergleich zu den entsprechenden WT‐Pflanzen (Col‐WT) um mehr als 50 % verringerte
Transkript‐ sowie Proteinmenge an FdC1 aufweisen (Hanke, unpubl.).
In den Fd2‐KO‐Pflanzen könnte Fd1 den Mangel an Fd2 zum Teil kompensieren und den
LET auf NADP+ gewährleisten. In diesem Falle könnte postuliert werden, dass FdC1 im
Fd‐abhängigen ZET um PSI als Elektronenakzeptor bzw. ‐donor fungiert (siehe hierzu
auch Kapitel 3.4). Die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten
Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter (siehe Kapitel 3.1.2.2 für eine theoretische und
Kapitel 2.12 für eine methodische Beschreibung) zeigen auf, dass in den
unterschiedlichen Linien der FdC1‐RNAi‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen NPQ
geringfügig erhöht ist (siehe Tab. 3.7). Dies ist auch im Experiment unter kurzzeitig
erhöhten Lichtbedingungen (800 µE m‐2 s‐1 aktinisches Licht) zu beobachten. Gleichzeitig
ist weder Photoinhibition am PSII (FV/FM ist in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen im Vergleich zu
den Col‐WT‐Pflanzen nicht signifikant verändert) noch ein erhöhter Reduktionsgrad des
PQ‐Pools festzustellen (qP ist in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen im Vergleich zu den Col‐WT‐
Pflanzen nicht signifikant verändert). In den FdC1‐RNAi‐Pflanzen ist demnach kein
signifikant verringerter ZET, auch nach kurzer Zeit im Hochlicht, zu detektieren. Der
leicht erhöhte Protonengradient über die Thylakoidmembran, angezeigt durch eine
110 Ergebnisse
Erhöhung von NPQ in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen, deutet vielmehr auf eine zunehmende
Induktion des ZET hin.
Die Ergebnisse der Messungen zur Chlorophyllfluoreszenz‐Emission belegen allerdings,
dass ein Mangel an FdC1 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport zur
Folge hat. Es treten Anzeichen einer Lichtakklimation im Zuge einer Akzeptorlimitierung
auf, welche in einem erhöhten Protonengradienten über die Thylakoidmembran sowie
einer Verringerung des Elektronenflusses und geringfügig erhöhten Reduktionsgrad des
primären Elektronenakzeptors resultieren. Diese Anpassungen indizieren demnach eine
wichtige Funktion von FdC1 als stromaler Elektronenakzeptor im photosynthetischen
Elektronentransport.
Tab. 3.7: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter von Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐Pflanzen. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer aktinischen Lichtintensität von zunächst 150 µE m‐2 s‐1 und darauf folgend von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 ‐ 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
ΦII qP NPQ ETR Fv/Fm qL
150 µEm‐2 s‐1
Col‐WT 0,61 ± 0,04 0,91 ± 0,03 0,34 ± 0,05 46 ± 3 0,75 ± 0,02 0,94 ± 0,01
FdC1‐RNAi‐1 0,56 ± 0,03 0,89 ± 0,02 0,4 ± 0,02 42 ± 2 0,74 ± 0,02 0,96 ± 0,01
FdC1‐RNAi‐2 0,57 ± 0,01 0,91 ± 0,02 0,44 ± 0 43 ± 0 0,74 ± 0,01 0,96 ± 0,01
800 µEm‐2 s‐1
Col‐WT 0,39 ± 0,03 0,76 ± 0,02 0,94 ± 0,08 157 ± 11 0,75 ± 0,02 0,96 ± 0,03
FdC1‐RNAi‐1 0,34 ± 0,04 0,71 ± 0,03 1,01 ± 0,04 137 ± 15 0,74 ± 0,02 0,9 ± 0,04
FdC1‐RNAi‐2 0,37 ± 0,01 0,76 ± 0,04 0,99 ± 0,08 148 ± 5 0,74 ± 0,01 0,93 ± 0,02
ΦII qP NPQ ETR Fv/Fm qL
150 µEm‐2 s‐1
Col‐WT 0,61 ± 0,04 0,91 ± 0,03 0,34 ± 0,05 46 ± 3 0,75 ± 0,02 0,94 ± 0,01
FdC1‐RNAi‐1 0,56 ± 0,03 0,89 ± 0,02 0,4 ± 0,02 42 ± 2 0,74 ± 0,02 0,96 ± 0,01
FdC1‐RNAi‐2 0,57 ± 0,01 0,91 ± 0,02 0,44 ± 0 43 ± 0 0,74 ± 0,01 0,96 ± 0,01
800 µEm‐2 s‐1
Col‐WT 0,39 ± 0,03 0,76 ± 0,02 0,94 ± 0,08 157 ± 11 0,75 ± 0,02 0,96 ± 0,03
FdC1‐RNAi‐1 0,34 ± 0,04 0,71 ± 0,03 1,01 ± 0,04 137 ± 15 0,74 ± 0,02 0,9 ± 0,04
FdC1‐RNAi‐2 0,37 ± 0,01 0,76 ± 0,04 0,99 ± 0,08 148 ± 5 0,74 ± 0,01 0,93 ± 0,02
In den Fd2‐KO‐Pflanzen tritt vor allem nach zwei Stunden im Hochlicht ein signifikant
erhöhter Anteil an Photorespiration auf (siehe Kapitel 3.2.1.1). Zusammen mit der
erhöhten Expression von FdC1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen, vor allem im Hochlicht (vgl.
Fastabend, 2006), scheint eine Funktion von FdC1 im Metabolismus der
Photorespiration möglich. Hierbei könnte FdC1 Elektronendonator für die Fd‐abhängige
Glutamat‐Synthase in den Chloroplasten sein. Bei dieser in den Chloroplasten
Ergebnisse 111
lokalisierten Reaktion des photorespiratorischen Metabolismus wird Glutamat aus α‐
Ketogluterat und Glutamin regeneriert.
Abb. 3.32: A/Ci‐Kurven von Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐1‐Pflanzen. Dargestellt ist die Rate der CO2‐Assimilation in Abhängigkeit vom CO2‐Partialdruck im substomatären Raum (Ci) von Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐1‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 durchgeführt. An gleichen Blättern wurden zunächst die CO2‐Assimilationsraten bei 21 % O2 und danach ohne O2 im anliegenden Gasgemisch bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
Die Anzeichen einer Akzeptorlimitierung in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen und ein
möglicherweise erhöhter ZET (s. o.) könnten in Folge einer verringerten
photorespiratorischen Aktivität auftreten.
Abb. 3.33: Anteil der apparenten Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate in den Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐1‐Pflanzen. Dargestellt ist der photoresipratorische Anteil am photosynthetischen Elektronenfluss in Form des Parameters APR in Col‐WT‐ (gefüllte Kreise) und Fd1‐RNAi‐1 Pflanzen (offene Kreise), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen durchgeführt und APR wurde aus den A/Ci‐Kurven (siehe Abb. 3.32) nach in Kapitel 2.13.5 dargestellter Methode kalkuliert. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
112 Ergebnisse
Anhand von A/Ci‐Kurven (siehe Abb. 3.32) unter „normalen“ (21 % O2) sowie unter
nicht‐photorespiratorischen Bedingungen (ohne O2) sind keine signifikanten
Unterschiede in den CO2‐Assimilationsraten der FdC1‐RNAi‐ und der entsprechenden
Col‐WT‐Pflanzen zu detektieren. Der photorespiratorische Anteil, gemessen in APR
(siehe Kapitel 2.13.5 und Kapitel 3.1.2.4), ist in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen sogar leicht
erhöht (siehe Abb. 3.33).
Die in den Chloroplasten lokalisierte alternative Fd‐Isoform FdC1 kommt als
Elektronendonator im LET auf Grund der verringerten Affinität zur FNR nicht in Frage.
In den FdC1‐RNAi‐Pflanzen ist weder ein verringerter Anteil an ZET noch ein
verringerter Anteil an Photorespiration zu beobachten. Eine photosynthetische Rolle
von FdC1 in diesen Stoffwechselwegen scheint demnach unwahrscheinlich. Auch auf
Grund der möglichen Redundanz der Fd‐Isoformen in A. thaliana ist eine klare
Aussage in Bezug auf eine Funktion von FdC1 im ZET bzw. der Photorespiration
schwierig (siehe Kapitel 4.3).
Zusammenfassung – Die alternative Fd‐Isoform FdC1 (Kapitel 3.3)
Fd1‐KO‐Pflanzen als Modell zur Aufklärung unterschiedlicher Funktionen photosynthetischer Fd‐Isoformen
3.4
In den Fd2‐KO‐Pflanzen werden ca. 90 % der Blatt‐Fds nicht exprimiert bzw. translatiert.
Eine vermehrte Synthese von Fd1 in Folge dessen tritt nicht ein (siehe Kapitel 3.1). Trotz
des massiven Mangels an Blatt‐Fds sind die Pflanzen vital und können photoautotroph
wachsen. Dies deutet auf eine redundante Funktion von Fd1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen
hin, wobei Fd1 als Elektronenakzeptor am PSI fungiert und Elektronen auf FNR
überträgt. Die hierbei geringen Mengen an Fd1 führen zu einer Akzeptorlimitierung am
PSI und dem daraus resultierenden Phänotyp der Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.1.1).
Die Ergebnisse von Hanke et al. (2004) stützen die Hypothese der Redundanz von Fd1
und Fd2, wobei beide Fd‐Isoformen eine vergleichbare Affinität zur FNR besitzen. In
diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, warum mit Fd1 eine redundante Blatt‐Fd
Isoform existiert, welche einen Mangel an Fd als Elektronenakzeptor jedoch nur zum
Teil ausgleichen kann. Eine zusätzliche, spezifische Funktion der unterschiedlichen Blatt‐
Fd Isoformen im PET ist daher anzunehmen. In A. thaliana wurden anhand von Fd1‐
RNAi‐Pflanzen Hinweise gefunden, die eine spezifische Funktion von Fd1 als
Elektronendonator bzw. ‐akzeptor im Fd‐abhängigen ZET um PSI aufzeigen (vgl. Hanke
und Hase, 2008).
Ergebnisse 113
Abb. 3.34: Knock‐Out Screening homozygoter Fd1‐KO‐Pflanzen. Mittels RT‐PCR‐Analyse wurden putative homozygote Fd1‐KO‐Pflanzen (GT150) auf ein Fd1‐Transkript überprüft. Die Pflanzen wurden für neun Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) angezogen. Für die RT‐PCR Analysen wurden spezifische Primer für Fd1 verwendet. Als Kontrollen wurde zusätzlich mit spezifischen Primern für Fd2 und UBQ10 gearbeitet. Als zusätzliche Positiv‐Kontrolle wurde cDNA einer Col‐WT‐Pflanze verwendet. Die Linien GT150‐8.1 sowie GT150‐8.2 wurden als Fd1‐KO‐Pflanzen identifiziert.
In den folgenden Kapiteln werden Ergebnisse dargestellt, die eine spezifische Funktion
von Fd1 im Fd‐abhängigen ZET um PSI belegen und weiter verdeutlichen. Hierzu wurden
knock‐out Mutanten der Art A. thaliana Ökotyp Landsberg erecta mit einer
homozygoten T‐DNA‐Insertion (Fd1‐KO) im Gen At1g10960, codierend für Fd1
(siehe Abb. 3.34), als Modellorganismen im Vergleich zu den entsprechenden Lae‐WT‐
Pflanzen verwendet (siehe Kapitel 2.2).
3.4.1 Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Anzuchtbedingungen
In C3‐Pflanzen nimmt der ZET vor allem unter Stressbedingungen eine wichtige Funktion
ein (vgl. Johnson, 2005). Um eine möglichst umfassende funktionelle Einordnung von
Fd1 in diesem Zusammenhang vornehmen zu können, wird im Rahmen dieses Kapitels
zunächst die Charakterisierung der Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen
vorgestellt. Soweit nicht anders vermerkt, wurden die Pflanzen für acht Wochen unter
moderaten Bedingungen (siehe Kapitel 2.2) angezogen. Die Messungen erfolgten
jeweils nach drei Stunden in der Lichtphase.
114 Ergebnisse
3.4.1.1 Phänotyp
Fd1‐KO‐Pflanzen weisen in den ersten drei Wochen nach der Aussaat unter moderaten
Bedingungen kein signifikant beeinträchtigtes Wachstum auf. Ebenso ist die
Morphologie der Blätter unverändert (siehe Abb. 3.35‐A). Ältere Fd1‐KO‐Pflanzen (fünf
Wochen nach der Aussaat) sind im Gegensatz zu den Lae‐WT‐Pflanzen im Wachstum
inhibiert (siehe Abb. 3.35‐B). In späteren Stadien (acht bis zehn Wochen nach der
Aussaat) kommt es zu Nekrosenbildung und schließlich zum Absterben der betroffenen
Blätter (siehe Abb. 3.35‐C). Detaillierte Pigmentanalysen (siehe Tab. 3.8) belegen eine
insgesamt verringerte Pigmentierung der Fd1‐KO‐Pflanzen, wobei der Chlorophyllgehalt
um 37 %, der Carotinoidgehalt um 36 % und der Gehalt an Anthocyanen um 38 %
gleichermaßen reduziert sind. Diese Tatsache deutet auf einen verminderten Gehalt an
Elementen des Photosyntheseapparates, wie Photosysteme und LHCs, hin. Möglich ist
auch ein verminderter Gehalt an aktiven Thylakoiden, wie es in den Fd2‐KO‐Pflanzen
der Fall ist (siehe Kapitel 3.1.2.1).
Insgesamt wird anhand der verminderten Pigmentierung sowie des eingeschränkten
Wachstums der Fd1‐KO‐Pflanzen deutlich, dass ein knock‐out von Fd1 signifikante
Einschränkungen im photoautotrophen Wachstum der Fd1‐KO‐Pflanzen nach sich zieht.
Tab. 3.8: Physiologische Parameter der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Die dargestellten Parameter wurden an Blättern von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag), bestimmt. Die Mengenangaben der Pigmente sind auf die Blattfläche bezogen. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
Ergebnisse 115
Abb. 3.35: Entwicklungsstadien der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen.Dargestellt ist der Phänotyp der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen in den ersten drei Wochen (A), nach fünf Wochen (B) und nach neun Wochen (C), Bildung von ersten Nekrosen (links) bis zum Absterben ganzer Blätter (rechts), unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag – Durchmesser der Töpfe: 5 cm). Die gezeigten Bilder sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Anzuchten.
116 Ergebnisse
3.4.1.2 Photosynthetischer Elektronenfluss und CO2‐Assimilation
Der reduzierte Pigmentgehalt sowie das leicht eingeschränkte Wachstum der Fd1‐KO‐
Pflanzen deuten auf Anpassungen im photosynthetischen Elektronenfluss und in der
CO2‐Assimilation im Zuge fehlender Fd1‐Moleküle am PSI hin. Im Folgenden werden
Ergebnisse dargestellt, welche den photosynthetischen Elektronenfluss am PSI und PSII
sowie die CO2‐Assimilation im Calvin‐Zyklus in den Fd1‐KO‐Pflanzen detailliert
charakterisieren. Hierbei werden Messungen zur P700‐Absorptionsänderung, zur
Chlorophyllfluoreszenz‐Emission sowie CO2‐Gaswechselanalysen zur Einordnung der
photosynthetischen Lichtnutzung der Fd1‐KO‐Pflanzen herangezogen
(siehe Kapitel 3.1.2 und Kapitel 2.13).
Abb. 3.36: P700‐Oxidation im NIR von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) sowie die Kinetiken der P700‐Oxidation im NIR (B) von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 ‐ 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die P700‐Oxidationkinetiken sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
In den Fd2‐KO‐Pflanzen kommt es im Zuge fehlender Elektronenakzeptoren zu
verstärkter Ladungsrekombination im PSI, nachdem bereits der absolute Gehalt an
aktiven Thylakoiden, und somit auch Photosystemen, deutlich verringert vorliegt (siehe
Kapitel 3.1.2.1). Ein Mangel an Fd1 hingegen führt unter moderaten Bedingungen zu
keinem signifikant veränderten Elektronenfluss im und am PSI. Sowohl ΔAP700‐MAX als
auch die Kinetiken der P700‐Oxidation im NIR sind in den Fd1‐KO‐Pflanzen, bezogen auf
Ergebnisse 117
die Lae‐WT‐Pflanzen, unverändert (siehe Abb. 3.36). Obwohl ein Mangel an Fd1 am PSI
vorliegt, sind keine Anzeichen einer Akzeptorlimitierung mit einhergehender
Ladungsrekombination im PSI oder ein verringerter Gehalt an PSI, wie es bei den
Fd2‐KO‐Pflanzen der Fall ist, detektierbar.
Anhand der kalkulierten Parameter der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wird deutlich,
dass die photosynthetische Lichtnutzung der Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten
Bedingungen nicht signifikant verändert ist, abgesehen von einem verringerten
Protonengradienten über die Thylakoidmembran, angezeigt durch um ca. 31 %
geringere Werte für NPQ (siehe Tab. 3.9). Kurzzeitig für die Messungen erhöhte
aktinische Lichtintensitäten von 800 µE m‐2 s‐1 bestätigen diese Tendenz. Hanke und
Hase (2008) zeigten eine mögliche spezifische Funktion für Fd1 im Fd‐abhängigen ZET,
welcher unter anderem an der Generierung eines Protonengradienten über die
Thylakoidmembran u.a. beteiligt ist (vgl. Munekage et al., 2004). In Anbetracht der
Tatsache, dass weder qP, qL, ΦII und ETR in den Fd1‐KO‐Pflanzen signifikant von denen
der Lae‐WT‐Pflanzen abweichen (siehe Tab. 3.9) sowie dass keine Anzeichen
gesteigerter Photoinhibition am PSII zu beobachten sind, da FV/FM bei ca. 0,8 liegt (vgl.
Björkmann und Demmig, 1991), ist davon auszugehen, dass der vermindert generierte
Protonengradient im Zuge einer Beeinträchtigung des ZETs um PSI zustande kommt.
Tab. 3.9: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) zunächst bei einer Lichtintensität von 150 µE m‐2 s‐1 und darauf folgend von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
ΦII qP NPQ ETR Fv/Fm qL
150 µEm‐2 s‐1
Lae‐WT 0,65 ± 0,02 0,87 ± 0,02 0,35 ± 0,05 49 ± 1 0,82 ± 0,01 0,93 ± 0,01
Fd1‐KO 0,6 ± 0,02 0,85 ± 0,02 0,24 ± 0,06 45 ± 1 0,77 ± 0,01 0,91 ± 0,02
800 µEm‐2 s‐1
Lae‐WT 0,37 ± 0,02 0,64 ± 0,02 1,32 ± 0,05 148 ± 1 0,82 ± 0,01 0,85 ± 0,01
Fd1KO 0,4 ± 0,02 0,72 ± 0,04 0,9 ± 0,08 162 ± 8 0,77 ± 0,01 0,91 ± 0,04
ΦII qP NPQ ETR Fv/Fm qL
150 µEm‐2 s‐1
Lae‐WT 0,65 ± 0,02 0,87 ± 0,02 0,35 ± 0,05 49 ± 1 0,82 ± 0,01 0,93 ± 0,01
Fd1‐KO 0,6 ± 0,02 0,85 ± 0,02 0,24 ± 0,06 45 ± 1 0,77 ± 0,01 0,91 ± 0,02
800 µEm‐2 s‐1
Lae‐WT 0,37 ± 0,02 0,64 ± 0,02 1,32 ± 0,05 148 ± 1 0,82 ± 0,01 0,85 ± 0,01
Fd1KO 0,4 ± 0,02 0,72 ± 0,04 0,9 ± 0,08 162 ± 8 0,77 ± 0,01 0,91 ± 0,04
118 Ergebnisse
Eine Analyse der Chlororespiration in Fd1‐KO‐ sowie Lae‐WT‐Pflanzen, welche dem
NDH‐abhängigen ZET zugeschrieben wird (vgl. Munekage et al., 2004), macht deutlich,
dass diese in den Fd1‐KO‐Pflanzen nicht signifikant verändert ist. Der Parameter FC, ein
Indikator für Chlororespiration (siehe Kapitel 3.1.2.2), ist in Fd1‐KO‐Pflanzen im
Vergleich zu den Lae‐WT‐Pflanzen nicht signifikant verändert (siehe Abb. 3.37). Der
geringere Protonengradient in den Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen
scheint demnach in einem gestörten Fd‐abhängigen ZET um PSI begründet zu liegen.
Abb. 3.37: Chlororespiration der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission (A) sowie der kalkulierte Fluoreszenz‐Parameter FC (B) von Fd1‐KO‐ und Lae‐WT‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden für 15 min mit aktinischem Licht (AL) von 150 µE m‐2 s‐1 bestrahlt (in der Abb. sind nur einige Sekunden dargestellt) bevor die Fluoreszenzemission im Dunkeln aufgezeichnet wurde. Die dargestellten Kinetiken der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhän igen Experimenten. Die gezeigten Daten für FC sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
g
0 100 200 300100
150
200
250
Lae‐WT Fd1‐KO0
1
2
3
4
0 100 200 300
Fd1‐KOLae‐WT
AL aus AL aus
F C
A
Chloroph
yllfluo
reszen
z‐Em
ission
[mV]
Zeit [s] Zeit [s]
B
0 100 200 300100
150
200
250
Lae‐WT Fd1‐KO0
1
2
3
4
0 100 200 300
Fd1‐KOLae‐WT
AL aus AL ausAL aus
F C
A
Chloroph
yllfluo
reszen
z‐Em
ission
[mV]
Zeit [s] Zeit [s]
B
Der knock‐out von Fd1 führt in den Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen zu
einer leicht verringerten CO2‐Assimilationsrate, welche im Vergleich zu den Lae‐WT‐
Pflanzen bei ca. 91 % liegt (siehe Abb. 3.38). Dies geht einher mit der Beobachtung der
verringerten Fähigkeit zum photoautotrophen Wachstum bei dem Fd1‐KO‐Pflanzen
(siehe Kapitel 3.4.1.1).
Ergebnisse 119
Abb. 3.38: CO2‐Assimilation der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen.Dargestellt ist die CO2‐Assimilation der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern nach einer Stunde in der Lichtphase bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
Die Ergebnisse deuten auf einen inhibierten Fd‐abhängigen ZET in den Fd1‐KO‐
Pflanzen hin. Fd1‐KO‐Pflanzen zeigen unter moderaten Bedingungen ein
beeinträchtigtes photoautotrophes Wachstum. Ältere Blätter weisen Nekrosen auf,
was schließlich zum Absterben führt. Die photosynthetische Lichtnutzung ist nahezu
unverändert, allerdings wird in den Fd1‐KO‐Pflanzen ein signifikant geringerer
Protonengradient über die Thylakoidmembran generiert. Dies lässt auf eine
Inhibierung des Fd‐abhängigen ZET schließen. Da angenommen wird, dass der ZET in
C3‐Pflanzen nur einen geringen Faktor zur Regulation der Photosynthese darstellt
(vgl. Johnson et al, 2005; Joët et al., 2002) sind die Auswirkungen des knock‐outs von
Fd1 unter diesen Bedingungen zunächst gering.
Zusammenfassung – Fd1‐KO‐Pflanzen (Kapitel 3.4.1)
3.4.2 Induktion des ZET in den Fd1‐KO‐Pflanzen
Der ZET ist in C3‐Pflanzen vor allem unter Stressbedingungen ein entscheidender Faktor
zur Regulation der Photosynthesereaktion sowie zum Schutz vor Überreduktion und
Schädigung der Komponenten des photosynthetischen Elektronentransports (vgl.
Johnson, 2005). Um die Auswirkungen eines knock‐outs von Fd1 in A. thaliana unter
solchen Bedingungen in Bezug auf den ZET zu dokumentieren, wurden Fd1‐KO‐ sowie
Lae‐WT‐Pflanzen, soweit nicht anders vermerkt, acht Wochen unter moderaten
Bedingungen angezogen (siehe Kapitel 2.2) und vor jedem Versuch eine Stunde im
Hochlicht einer „Stresssituation“ ausgesetzt. Zusätzlich zu den Fd1‐KO‐Pflanzen werden
zum Teil Messdaten von Fd1‐RNAi‐Pflanzen (folgende Fd1‐RNAi‐Linien wurden
120 Ergebnisse
verwendet: Fd1‐RNAi‐2, Fd1‐RNAi‐5 und Fd1‐RNAi‐6) als Vergleichswerte herangezogen.
Eine exakte Quantifizierung des verbleibenden Fd1‐Proteingehaltes in den Fd1‐RNAi‐
Pflanzen ist auf Grund des nahezu gleichen Trennungsverhaltens der
photosynthetischen Fd‐Isoformen nicht möglich, da die vielfach höhere Menge an Fd2
im Blattextrakt die Bande für Fd1 überlagert (vgl. Hanke und Hase, 2008). Alle Fd1‐RNAi‐
Pflanzen weisen sich allerdings durch eine signifikant reduzierte Menge an Fd1 bei
unveränderten Mengen an Fd2 aus (vgl. Hanke und Hase, 2008). Eine grundlegende
Charakterisierung der Fd1‐RNAi‐Pflanzen ist in Hanke und Hase (2008) gegeben.
3.4.2.1 Der photosynthetische Elektronenfluss
Nach einer Stunde im Hochlicht ist ∆AP700‐MAX (siehe Kapitel 3.1.2.1 und Kapitel 2.11.2)
der Fd1‐KO‐ im Vergleich zu den Lae‐WT‐Pflanzen nicht signifikant abweichend
(siehe Abb. 3.39‐A). Ein Mangel an Fd1 wirkt sich demnach auch im Hochlicht nicht auf
die Kapazität von PSI bzw. der Anregbarkeit von P700‐Molekülen im NIR aus. Zu
beachten ist, dass die Kinetik der P700‐Oxidation im NIR in den Fd1‐KO‐Pflanzen
signifikante Abweichungen aufweist (siehe Abb. 3.39‐B).
aus. Zu
beachten ist, dass die Kinetik der P700‐Oxidation im NIR in den Fd1‐KO‐Pflanzen
signifikante Abweichungen aufweist (siehe Abb. 3.39‐B).
Abb. 3.39: P700‐Oxidation im NIR von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen im Hochlicht. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) sowie die Kinetik der P700‐Oxidation im NIR (B) von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen zunächst für eine Stunde im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1) und darauf folgend für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die Kinetiken der P700‐Oxidation sind typische Beispiele von mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse 121
In den Lae‐WT‐Pflanzen ist nach einer Stunde im Hochlicht die in Kapitel 3.1.2.1
beschriebene typische zweiphasige Kinetik zu beobachten. In den Fd1‐KO‐Pflanzen tritt
hingegen eine direkte, nicht in unterschiedlichen Phasen ablaufende P700‐Oxidation im
NIR auf. Sowohl die lag‐Phase als auch die zweite, langsame Phase der P700‐Oxidation
sind nicht zu detektieren. Wie in Kapitel 3.1.2.1 dargestellt, ist die zweite Phase der
P700‐Oxidation neben den PSI‐Reaktionszentren, welche Elektronen für den LET
donieren, von PSI‐Reaktionszentren geprägt, welche Elektronen für den ZET donieren.
Vielmehr erfolgt die komplette Oxidation bis zum Erreichen von ∆AP700‐MAX in Phase 1 in
nur 1,21 ± 0,34 s (n = 3), während die komplette Oxidation der P700‐Moleküle im NIR
der Lae‐WT‐Pflanzen zweiphasig, unterbrochen durch die lag‐Phase, in 4,95 ± 0,28 s
(n = 3) abläuft. Die P700‐Oxidation im NIR ist demnach in den Fd1‐KO‐Pflanzen nach
einer Stunde im Hochlicht nicht durch einsetzenden ZET verlangsamt.
Die kalkulierten Parameter der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission zeigen nach einer
Stunde im Hochlicht für die Fd1‐KO‐Pflanzen ebenfalls ein deutliches Bild. Wie schon
unter moderaten Bedingungen ist ein verringerter Protonengradient über die
Thylakoidmembran in den Fd1‐KO‐Pflanzen verglichen mit den entsprechenden Lae‐
WT‐Pflanzen auch nach einer Stunde im Hochlicht zu detektieren (siehe Tab. 3.10). Im
Gegensatz zu den moderaten Bedingungen zeichnet sich in den Fd1‐KO‐Pflanzen ein
verringerter Elektronentransport ab. Der Reduktionsgrad der photosynthetischen
Elektronentransportkette bleibt hingegen unverändert (ΦII und qP zeigen im Vergleich
zu den Lae‐WT‐Pflanzen keine signifikanten Veränderungen auf), allerdings sind erste
Anzeichen von Photoinhibition zu erkennen (FV/FM ist signifikant verringert). Obwohl
Photoinhibition am PSII auftritt ist NPQ in den Fd1‐KO‐ gegenüber den Lae‐WT‐Pflanzen
um 12 % verringert (verstärkte Photoinhibition am PSII erhöht die Werte für NPQ in
Form von qI signifikant – siehe Kapitel 3.1.2.2). Zusätzlich zeigt sich in den Fd1‐KO‐
Pflanzen sich ein erhöhter Anteil an Chlororespiration (siehe Abb. 3.40).
Chlororespiration ist zu großen Teilen auf den NDH‐abhängigen ZET zurückzuführen (vgl.
Munekage et al., 2004) und trägt zur Erhöhung des Protonengradienten über die
Thylakoidmembran bei. Ein im Vergleich zu den Lae‐WT‐Pflanzen erhöhter Anteil an
Chlororespiration hätte demnach ebenso wie Photoinhibition am PSII einen Anstieg von
NPQ zur Folge. Dies ist in den Fd1‐KO‐Pflanzen nicht der Fall (s. o.), so dass davon
ausgegangen werden kann, dass ein verringertes NPQ nach einer Stunde im Hochlicht
bei gesteigerter Photoinhibition und erhöhtem chlororespiratorischen Anteil auf einen
signifikant gestörten Fd‐abhängigen ZET in Folge eines Mangels an Fd1 zurückzuführen
ist.
122 Ergebnisse
Tab. 3.10: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter der Fd1‐KO‐ und Fd1‐RNAi‐Pflanzen im Hochlicht. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter der Lae‐WT, Fd1‐KO, Col‐WT‐ und Fd1‐RNAi‐Pflanzen (Linie 2,5 und 6), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für eine Stunde im Hochlicht und anschließend für 15 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).
In den Fd1‐RNAi‐Pflanzen sind nach einer Stunde im Hochlicht im Vergleich zu den
entsprechenden Col‐WT‐Pflanzen ähnliche Tendenzen zu beobachten. Es wird ein
verringerter Protonengradient über die Thylakoidmembran generiert, allerdings sind
keine Anzeichen von Photoinhibition zu detektieren (FV/FM liegt bei Werten um 0,8).
Abweichend zu den Fd1‐KO‐Pflanzen sind allerdings ETR, ФII sowie qP signifikant
erhöht. Dies zeigt, dass ein verringerter Gehalt an Fd1 in den Fd1‐RNAi‐Pflanzen zu
einem erhöhten linearen photosynthetischen Transport von Elektronen bei
verringertem Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette führt.
Dies kann die Folge eines vermindert ablaufenden Fd‐abhängigen ZET sein, wobei
Elektronen nicht in die photosynthetische Elektronentransportkette zurückgeschleust
werden und eine zunehmende Reduzierung selbiger ausbleibt. Werden Fd1‐KO‐Pflanzen
unter moderaten Bedingungen angezogen und wird die Chlorophyllfluoreszenzemission
bei einer aktinischen Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 bestimmt, ohne vorher für eine
0,97 ± 0,050,8 ± 0,02200 ± 90,8 ± 0,010,79 ± 00,5 ± 0,02Ai‐6
0,96 ± 0,050,79 ± 0200 ± 40,8 ± 0,040,8 ± 0,010,5 ± 0,01Ai‐5
0,96 ± 0,060,8 ± 0,01209 ± 80,83 ± 0,030,82 ± 00,52 ± 0,02Ai‐2
0,9 ± 0,020,77 ± 0,02154 ± 30,9 ± 0,140,68 ± 0,010,39 ± 0,01
0,9 ± 0,030,71 ± 0,05137 ± 140,87 ± 0,120,74 ± 0,020,34 ± 0,04
0,92 ± 0,040,78 ± 0,01152 ± 160,99 ± 0,110,68 ± 0,050,38 ± 0,04
qLFv/FmETRNPQqPΦII
Fd1‐RN
Fd1‐RN
Fd1‐RN
Col‐WT
Fd1‐KO
Lae‐WT
0,97 ± 0,050,8 ± 0,02200 ± 90,8 ± 0,010,79 ± 00,5 ± 0,02Ai‐6
0,96 ± 0,050,79 ± 0200 ± 40,8 ± 0,040,8 ± 0,010,5 ± 0,01Ai‐5
0,96 ± 0,060,8 ± 0,01209 ± 80,83 ± 0,030,82 ± 00,52 ± 0,02Ai‐2
0,9 ± 0,020,77 ± 0,02154 ± 30,9 ± 0,140,68 ± 0,010,39 ± 0,01
0,9 ± 0,030,71 ± 0,05137 ± 140,87 ± 0,120,74 ± 0,020,34 ± 0,04
0,92 ± 0,040,78 ± 0,01152 ± 160,99 ± 0,110,68 ± 0,050,38 ± 0,04
qLFv/FmETRNPQqPΦII
Fd1‐RN
Fd1‐RN
Fd1‐RN
Col‐WT
Fd1‐KO
Lae‐WT
Ergebnisse 123
Stunde im Hochlicht zu inkubieren, sind ähnliche Tendenzen wie in den Fd1‐RNAi‐
Pflanzen nach einer Stunde im Hochlicht zu beobachten (siehe Tab. 3.10).
Abb. 3.40: Chlororespiration in den Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen im Hochlicht. Dargestellt ist die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission (A) sowie der kalkulierte Fluoreszenz‐Parameter FC (B) von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Vor den Messungen wurden die Pflanzen für eine Stunde im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden für 15 min mit aktinischem Licht (AL) von 800 µE m‐2 s‐1 bestrahlt (in der Abb. sind nur einige Sekunden dargestellt) bevor die Fluoreszenzemission im Dunkeln aufgezeichnet wurde. Die dargestellten Kinetiken der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die gezeigten Daten für FC sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
3.4.2.2 CO2‐Assimilation
Unter moderaten Bedingungen ist die CO2‐Assimilation in den Fd1‐KO‐Pflanzen bereits
leicht verringert. Nach einer Stunde im Hochlicht ist diese Tendenz im Vergleich zu den
Lae‐WT‐Pflanzen noch deutlicher, wobei die CO2‐Assimilationsrate der Fd1‐KO‐Pflanzen
bei nur noch 72 % bezogen auf die Lae‐WT‐Pflanzen liegt (siehe Abb. 3.41). Im Vergleich
zu den moderaten Bedingungen (siehe Abb. 3.41) ist bei den Fd1‐KO‐Pflanzen nach
einer Stunde im Hochlicht lediglich eine Erhöhung der CO2‐Assimilation um 21 % zu
detektieren. In Lae‐WT‐Pflanzen hingegen ist die Co2‐Assimilationsrate um 53 %
gesteigert. Dieses Ergebnis belegt die Tatsache, dass in den Fd1‐KO‐Pflanzen ein Mangel
an Fd1 vor allem im Hochlicht entscheidende Auswirkungen hat und wahrscheinlich auf
einen stark beeinträchtigten Fd‐abhängigen ZET zurückzuführen ist.
124 Ergebnisse
Zusammenfassung – Induktion des ZET in Fd1‐KO‐Pflanzen (Kapitel 3.4.2)
Ein Mangel an Fd1 führt zu einem vermindert ablaufenden Fd‐abhängigen ZET. Dies
ist vor allem im Hochlicht zu beobachten. Je nach Ausprägung des Fd1‐Mangels
kommt es zu signifikanten Anpassungen im photosynthetischen Elektronenfluss. In
Folge eines vermindert ablaufenden Fd‐abhängigen ZET ist der LET in den Fd1‐RNAi‐
Pflanzen erhöht. In den Fd1‐KO‐Pflanzen hingegen tritt in Folge des knock‐outs von
Fd1 nach einer Stunde im Hochlicht bereits Photoinhibition am PSII auf und
verringerte Elektronentransport‐ und Photosyntheseraten sind die Folge. Insgesamt
zeigt sich, dass Fd1 eine wichtige Funktion im Fd‐abhängigen ZET einnimmt.
Abb. 3.41: CO2‐Assimilation der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen im Hochlicht. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation der Lae‐WT‐ sowie Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern nach einer Stunde im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).
L ae‐WT Fd1‐KO0
2
4
6
8
10
12
CO2‐Assim
ilation
[µmol m
‐2s‐1 ] 10
8
6
4
2
12
CO2‐Assim
ilation
[µmol m
‐2s‐1 ]
0L ae‐WT Fd1‐KO
Diskussion 125
4 Diskussion
4.1 Fd2‐KO‐Pflanzen – Gleichzeitige Simulation von Hoch‐ und Schwachlichtbedingungen im Chloroplasten
Fd2‐KO‐Pflanzen weisen einen um ca. 90 % verringerten Gehalt an Blatt‐Fd auf (siehe
Kapitel 3.1). Damit ist die zentrale Schaltstelle zwischen dem PET in der
Thylakoidmembran und den stromalen Akzeptoren zu großen Teilen unterbrochen. Dies
führt zu einem stark reduzierten PET, was anhand der Chlorophyllfluoreszenz‐
Parameter deutlich belegt ist (siehe Kapitel 3.1.2.2). Außerdem ist das Stroma
zunehmend oxidiert, was sich u.a. am niedrigen Aktivierungszustand der NADP‐MDH
(siehe Kapitel 3.1.3.1), der verringerten Chlororespiration (siehe Kapitel 3.1.2.2) sowie
der verringerten Aktivität der RubisCO (siehe Kapitel 3.1.2.4) dokumentiert. Diese
gegenläufigen Redoxzustände des thylakoidären PET und des Stromas signalisieren zum
einen ein Lichtüberangebot, zum anderen allerdings einen Lichtmangel. Dadurch eignen
sich die Fd2‐KO‐Pflanzen als Modell, um neue Erkenntnisse in der lichtabhängigen
Regulation und Akklimation zu erlangen.
4.1.1 Langzeitakklimation und poising
Im Palisadenparenchym von Spinatblättern konnte gezeigt werden, dass der Blatt‐Fd‐
Gehalt den PSI‐Gehalt um das zwei‐ bis dreifache übersteigt (vgl. Terashima und Inoue,
1985). Holtgrefe et al. (2003) legten an transgenen Kartoffeln (Fd‐antisense‐Kartoffeln)
dar, dass ein um 60 % verringerter Gehalt an Blatt‐Fds letal ist und dass das Fd/PSI‐
Verhältnis mindestens eins betragen muss. Diese Tatsache macht es umso
erstaunlicher, dass die Fd2‐KO‐Pflanzen vital sind und zudem photoautotroph wachsen
(siehe Kapitel 3.1.1). An Fd2‐RNAi‐Pflanzen konnte ebenfalls ein signifikant geringerer
Gehalt an Blatt‐Fd beobachtet werden (vgl. Hanke und Hase, 2008). In diesem
Zusammenhang ist zu beachten, dass Fd2‐KO‐Pflanzen bei dem um 90 % verringerten
Gehalt an Blatt‐Fds auch einen um ca. 30 % reduzierten Anteil an aktiven Thylakoiden
und somit auch an PSI aufweisen (siehe Kapitel 3.1.2.1). Das Fd/PSI‐Verhältnis beträgt
somit wahrscheinlich mindestens eins, so dass ein vitales und photoautotrophes
Wachstum gewährleistet ist. Diese Anpassung ist die Folge einer Langzeitakklimation an
erhöhte Lichtintensitäten in den Fd2‐KO‐Pflanzen, die von der Keimung an bereits unter
moderaten Bedingungen auftritt und signifikante phänotypische Anpassungen nach sich
zieht. So ist neben der reduzierten Menge aktiver Thylakoide vor allem ein verringerter
Anteil LHCs auffällig (siehe Kapitel 3.1.1). Diese phänotypischen Anpassungen in den
Fd2‐KO‐Pflanzen sind vergleichbar mit einer Langzeitakklimation an erhöhte
126 Diskussion
Lichtintensitäten, welche bereits in den Fd‐antisense‐Kartoffeln beobachtet wurde (vgl.
Holtgrefe et al., 2003). Hierbei setzen im Hochlicht zunächst die klassischen poising‐
Mechanismen ein; nach einigen Tagen allerdings erfolgt ein kontrollierter Abbau aktiver
Thylakoide und eine Verringerung der LHCs (vgl. Voss, 2005). Langzeitakklimation in
Folge erhöhter Strahlungsenergien tritt dann auf, wenn der PET in der
Thylakoidmembran zunehmend reduziert vorliegt und die Redox‐Homöostase über
poising‐Mechanismen nicht aufrecht erhalten werden kann (vgl. Scheibe et al., 2005;
Hanke et al., 2009). Es kommt zu einem kontrollierten Abbau der Komponenten des
PET, was in den Fd2‐KO‐Pflanzen folglich zu einer signifikant verringerten
Photosyntheserate führt (siehe Kapitel 3.1.2.3). In ähnlicher Weise ist dies auch an
weiteren transgenen Pflanzen der Art A. thaliana mit Mutationen in den Genen für
NTRC, plastidäre ATP‐ADP‐Transporter, der Stärkesynthese und den Triosephosphat‐
Translokatoren gezeigt worden, wobei der Reduktionsgrad der PET jeweils signifikant
erhöht war (vgl. Reiser et al., 2004; Pérez‐Ruíz et al., 2006; Häusler et al., 2009).
Es wird demnach deutlich, dass die Fd2‐KO‐Pflanzen unter anhaltend erhöhtem
Elektronendruck im PET die Absorption von Lichtenergie im Zuge einer
Langzeitakklimation minimieren, um oxidativen Stress und eine vollständige Blockierung
des PET zu vermeiden. Das Ausmaß der Überreduktion im PET in den Fd2‐KO‐Pflanzen
ist allerdings nicht maximal, da anhand von schnellen Lichtsättigungskurven ein Anstieg
der Elektronentransportrate sowie der CO2‐Assimilationsrate zu beobachten ist (siehe
Kapitel 3.1.2.4). Hierbei treten poising‐Mechanismen auf, die im Vergleich zu den Noe‐
WT‐Pflanzen allerdings signifikant schwächer ausgeprägt sind. Ein schnelles und
effizientes poising ist somit nach eingesetzter Langzeitakklimation in den Fd2‐KO‐
Pflanzen nur bedingt möglich, da der PET weiter einen hohen Reduktionsgrad aufweist
und eine Limitierung an freien Elektronenakzeptoren am PSI vorliegt.
Nach zwei Stunden im Hochlicht zeigen die Fd2‐KO‐Pflanzen bereits einen stark
überreduzierten und blockierten PET. In Folge dessen kommt es zur Photoinhibition am
PSII und der Elektronenfluss ist signifikant herabgesetzt, während dagegen in den Noe‐
WT‐Pflanzen z. B. ZET und NPQ für eine effektive Ableitung überschüssiger Lichtenergie
sorgen (siehe Kapitel 3.2.1.1). Hingegen kommt es in den Fd2‐KO‐Pflanzen bereits nach
kurzer Zeit in Folge eingesetzter Photoinhibition am PSI zur Degradation gesamter PSI‐
Komplexe (siehe Kapitel 3.2.1.1). Scheller und Haldrup (2005) gehen hierbei von einem
Prozess aus, der nicht in Folge akkumulierender ROS als toxische Intermediate abläuft,
sondern kontrolliert gesteuert ist und somit auch eine Art extremen poisings darstellt,
um die Pflanze vor Schädigungen zu schützen. Dies kann anhand der Fd2‐KO‐Pflanzen
bestätigt werden, da die PSI‐Degradation bereits nach kurzer Erholungsphase unter
Diskussion 127
moderaten Bedingungen reversibel ist (siehe Kapitel 3.2.1.1). Dieses Phänomen der
Photoinhibition und Degradation vom PSI als kontrollierter Schutzmechanismus ist auch
an den Fd‐antisense‐Kartoffeln beobachtet worden (vgl. Voss, 2005), wobei dieser
Effekt ebenso unter moderaten Bedingungen reversibel ist.
In diesem Zusammenhang zeigt sich zudem, dass der photorespiratorische Anteil an der
Photosynthesereaktion in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach kurzer Zeit im Hochlicht signifikant
erhöht ist, während dies unter moderaten Bedingungen im Vergleich zu den Noe‐WT‐
Pflanzen nicht der Fall ist. Dies belegt, dass die Photorespiration ein alternativer
Mechanismus sein kann, um freie stromale Elektronenüberträger zu generieren (vgl.
Niyogi, 2000; Igamberdiev et al., 2001; Foyer et al., 2009; Strodtkötter, unpubl.). Zu
beachten ist, dass die Primärreaktion unter optimalen Bedingungen in WT‐Pflanzen
einen NADPH‐Überschuss generiert, welcher im Calvin‐Zyklus nicht verbraucht wird (vgl.
Heber und Kirk, 1975; Ort und Melandri, 1982; Badger, 1985), und poising‐
Mechanismen wie der ZET oder die NADP‐MDH für die Optimierung des ATP/NADPH‐
Verhältnisses essentiell sind (siehe Kapitel 1.4.1). In der Photorespiration hingegen
werden mehr ATP‐Moleküle als Reduktionsäquivalente benötigt. Dies bestätigt die
These, dass die Photorespiration einen Überlaufmechanismus darstellt, der unter
extremsten Bedingungen einer Akzeptorlimitierung sowohl ATP als auch NADPH
verbraucht, um freie Akzeptoren zu generieren. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist davon
auszugehen, dass das ATP/NADPH‐Verhältnis auf Grund des Mangels von Fd als
Elektronenüberträger am PSI höher liegt als in den Noe‐WT‐Pflanzen. Demnach wäre
die Photorespiration als Überlaufmechanismus zum Abbau von ATP und NADPH absolut
sinnvoll, um freie Akzeptoren in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu generieren. Ebenso könnte hier
auch reduziertes Fd direkt als Elektronendonator für Fd‐GOGAT für die Refixierung von
Ammonium fungieren und somit wiederum oxidiert als Elektronenakzeptor am PSI zur
Verfügung zu stehen.
Erfolgt die Anzucht der Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen nach der Keimung direkt im
Hochlicht, so findet eine Langzeitakklimation statt, die den Pflanzen ein vitales,
photoautotrophes Wachstum ermöglicht (siehe Kapitel 3.2.2), ähnlich wie dies auch
schon unter moderaten Bedingungen der Fall ist (siehe Kapitel 3.1). Allerdings weist der
PET einen signifikant erhöhten Reduktionsgrad auf und es sind erste Anzeichen von
Photoinhibition am PSII, im abgeschwächten Ausmaß auch in den entsprechenden Noe‐
WT‐Pflanzen, zu erkennen (siehe Kapitel 3.2.1.1). In diesem Fall ist der maximale
Reduktionsgrad des PET erreicht, bei welchem noch ein photoautotrophes und vitales
Wachstum gewährleistet ist. Dies macht deutlich, dass Pflanzen in der Lage sind, sich im
Zuge einer Langzeitakklimation an extremste externe Bedingungen anzupassen. Die
128 Diskussion
Redox‐Homöostase bei kurzzeitig erhöhten Lichtintensitäten in den Fd2‐KO‐Pflanzen
kann hingegen nicht über die klassischen poising‐Mechanismen, wie z. B. ZET und NPQ,
aufrechterhalten werden; vielmehr kommt es zum Schutz der Pflanze dann bereits zur
Degradation von Photosystemen (s. o.).
Abschließend sind folgende Aussagen bezüglich der Langzeitakklimation und des poising
in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu treffen:
1. Eine Langzeitakklimation ermöglicht den Fd2‐KO‐Pflanzen auch unter extremer
Akzeptorlimitierung am PSI ein vitales und photoautotrophes Wachstum, wobei
es bezogen auf die Akzeptorverfügbarkeit am PSI zu einer Verringerung der
Komponenten des Photosyntheseapparates kommt.
2. Klassische poising‐Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Redox‐Homöostase
sind auf Grund des stark reduzierten PET nicht ausreichend, vielmehr ist eine
extreme Form des poising mit einem erhöhten Anteil an Photorespiration und
der Degradation von PSI zu beobachten.
4.1.2 Signalling
In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist der Reduktionszustand des PET in der Thylakoidmembran
von dem des Stromas entkoppelt (siehe Kapitel 3.1). Diese Tatsache macht die Fd2‐KO‐
Pflanzen zu einem idealen Modell, um Signale zu lokalisieren, welche im Zuge erhöhter
Strahlungsenergien eine Änderung der Genexpression im Kern und somit eine
Lichtakklimation auslösen. Der Ursprung solcher Signale ist Mittelpunkt einer
kontroversen Diskussion (vgl. Kleine et al., 2009), wobei Scheibe et al. (2005) ein Redox‐
Signal aus dem Chloroplasten zur Induktion einer Lichtakklimation annehmen.
Die Fd2‐KO‐Pflanzen zeigen eine Langzeitakklimation an erhöhte Strahlungsenergien
(siehe Kapitel 4.1.1). Die hierfür erforderlichen Änderungen der Genexpression (siehe
Kapitel 1.4.2) scheinen vom Reduktionsgrad des PET abzuhängen. Am Beispiel der
NADP‐MDH wird diese Verknüpfung deutlich. Obwohl der metabolische Bedarf auf
Grund des vermehrt oxidierten Stromas nicht vorliegt, ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen eine
deutliche Steigerung der Kapazität in Folge einer Anpassung des Expressionsniveaus der
NADP‐MDH zu beobachten (siehe Kapitel 3.1.3.1). Dies ist auf den erhöhten
Reduktionszustand des PET in der Thylakoidmembran zurückzuführen, wodurch ein
Elektronenüberschuss signalisiert wird. Ähnliche Tendenzen konnten bereits an
Tabakpflanzen mit einem verringerten Gehalt an FNR (vgl. Palatnik et al., 2003)
beobachtet werden, wobei trotz des oxidierten Stromas die Kapazität der NADP‐MDH
Diskussion 129
unter moderaten Wachstumsbedingungen signifikant erhöht ist (vgl. Hajirezaei und
Scheibe, unpubliziert).
Im Falle der NADP‐MDH deutet somit einiges darauf hin, dass eine Änderung der
Genexpression durch den Redox‐Zustand des PET in der Thylakoidmembran kontrolliert
wird. Ebenso scheint die Langzeitakklimation in Folge erhöhter Lichtintensitäten in den
Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.2.2) über den Reduktionsgrad des PET induziert zu
sein. Eine Kontrolle der Genexpression zur Induktion einer Langzeitakklimation an
erhöhte Lichtintensitäten aus dem Metabolismus des Stromas heraus hätte einen
gegenteiligen Effekt zur Folge haben müssen, da das Stroma eher oxidiert vorliegt und
somit ein Mangel an Produkten der Primärreaktion signalisiert (siehe Kapitel 3.1.2.4).
Somit sind die häufig für ein Signalling aus dem Stroma der Chloroplasten
angenommenen Prozesse, wie z. B. die Tetrapyrrolbiosynthese (vgl. Johanningmeier
und Howell, 1984; Kropat et al., 1995; Strand et al., 2003; Ankele et al., 2007) oder die
Proteinbiosynthese (vgl. Gray et al., 2003; Pesaresi et al., 2006) als Redox‐Sensor in der
Langzeitakklimation auf erhöhte Lichtintensitäten zunächst auszuschließen. Ebenso
erscheint auf Grund des oxidiert vorliegenden Stromas eine Beteiligung von stromalen
Redoxüberträgern, wie Trx, Glutaredoxinen (vgl. Meyer et al., 1999; Marchand et al.,
2004) oder Glutathion (vgl. Wingate et al., 1988), an der Signalweiterleitung als fraglich.
So ist z. B. der Gesamtgehalt an Glutathion (GSH + GSSG) in den Fd2‐KO‐Pflanzen
signifikant verringert, wobei das Verhältnis von GSH/GSSG kaum verändert ist (siehe
Kapitel 3.1.3.2). Der Reduktionsgrad des Glutathion‐Pools ist aus diesem Grund als
Redox‐Sensor wahrscheinlich nicht entscheidend.
Eine exakte Lokalisation des Signalursprungs aus dem PET ist allerdings auch weiterhin
schwierig. Zum einen wird der PQ‐Pool als Redox‐Sensor angenommen (vgl. Pogson et
al., 2008), zum anderen könnte die Verfügbarkeit von stromalen Akzeptoren am PSI
ausschlaggebend sein (vgl. Baier et al., 2004; Piippo et al., 2006), wobei auch die
Akkumulation von ROS als Signal diskutiert wird (vgl. Mittler et al., 2004; Foyer und
Noctor, 2005; Fujita et al., 2006; Bailey‐Serres und Mittler, 2006). In den Fd2‐KO‐
Pflanzen geben akkumulierende ROS den Redox‐Zustand des PET ins Stroma weiter, so
dass ROS ein mögliches Signalmolekül an der PSI‐Akzeptorseite darstellt, welches eine
Änderung der Genexpression induzieren könnte. Die Rolle von ROS als Signal‐Molekül
und Faktor in der Expression diverser Gene konnte anhand von Microarray‐Analysen an
transgenen Pflanzen mit inhibierten antioxidativen Systemen bereits gezeigt werden
(vgl. Pnueli et al., 2003; Rizhsky et al., 2003; Vandenabeele et al., 2004; Davletova et al.,
2005; Vanderauwera et al., 2005; Lee et al., 2007). Hierbei ist allerdings zu beachten,
dass akkumulierende ROS als sehr unspezifisches Signal eingeordnet werden müssen, da
130 Diskussion
ROS in Folge von exogenem Stress an vielen Stellen des Metabolismus auftreten und die
Spezifität für die Stressantwort somit nicht gewährleistet erscheint (vgl. Kleine et al.,
2009). In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist hingegen eine verstärkte ROS‐Akkumulation zu
beobachten (siehe Kapitel 3.1.3.2), die keine sichtbaren Schäden nach sich zieht. Aus
diesem Grund kann ROS als mögliches Signal nicht ausgeschlossen werden.
An der Akzeptorseite vom PSI könnte außer der ROS‐Akkumulation auch die neue Fd‐
Isoform FdC1 (siehe Kapitel 4.3) als Redox‐Signal fungieren. FdC1 wird in den Fd2‐KO‐
Pflanzen stärker exprimiert und ist in den Chloroplasten lokalisiert (siehe Kapitel 3.3).
FdC1 kann als Elektronenakzeptor am PSI fungieren (Hanke, unpubl.) und könnte daher
eine Rolle beim Redox‐Signalling spielen.
Neben ROS und FdC1 als mögliche Redox‐Signale an der Akzeptorseite des PSI wird der
Reduktionsgrad des PQ‐Pools häufig als Redox‐Sensor angenommen, wobei gezeigt
werden konnte, dass das Expressionsniveau verschiedener Gene vom Reduktionsgrad
des PQ‐Pools abhängig ist (vgl. Maiwald et al., 2003). Der PQ‐Pool ist in den Fd2‐KO‐
Pflanzen stärker reduziert (siehe Kapitel 3.1.2.2) und käme somit als Redox‐Sensor für
die Induktion einer Langzeitakklimation an erhöhte Lichtintensitäten in Frage. Sind die
poising‐Mechanismen für eine Abführung überschüssiger Lichtenergie nicht
ausreichend, verbleibt der PQ‐Pool in Folge des erhöhten photosynthetischen
Elektronenflusses (LET und ZET) stärker reduziert und wäre somit ein idealer Redox‐
Sensor für die dann notwendige Induktion einer Langzeitakklimation an erhöhte
Lichtintensitäten.
Neben der Reduktion von O2 am PSI im Zuge der Mehler‐Reaktion kommt es auch zur
Bildung von ROS direkt im bzw. am PQ‐Pool (vgl. Khorobrykh und Ivanov, 2002;
Khorobrykh et al., 2004). Somit könnte ROS als Folge eines vermehrt reduzierten PQ‐
Pools eine zentrale Rolle in der Weiterleitung eines Redox‐Signals vom PET einnehmen
(vgl. Escoubas et al., 1995; Durnford und Falkowski, 1997). Hierfür spricht auch die
Tatsache, dass vor allem unter erhöhten Lichtintensitäten sowohl O2‐ aus dem PQ‐Pool,
als auch O2‐ von der Akzeptorseite des PSI mittels PQH2 als Reduktionsmittel zu H2O2
reduziert werden kann (vgl. Khorobrykh und Ivanov, 2002; Khorobrykh et al., 2004;
Ivanov et al., 2008). Entstehendes H2O2 könnte somit ein kombiniertes Signal sowohl
aus dem PQ‐Pool als auch von der Akzeptorseite des PSI in Folge eines zunehmend
reduzierten PET weiterleiten.
Die Induktion der Langzeitakklimation an erhöhte Lichtintensitäten ist in den Fd2‐KO‐
Pflanzen eindeutig auf den erhöhten Reduktionsgrad des PET zurückzuführen. Ebenso
ist dies z. B. auch für die Regulation der Genexpression der NADP‐MDH, welche einen
Diskussion 131
wichtigen poising‐Mechanismus darstellt (vgl. Scheibe et al., 2005), der Fall. Für eine
Änderung der Genexpression bezogen auf den „Dunkel‐Metabolismus“ in den
Chloroplasten hingegen scheint eine gegenteilige Situation vorzuliegen. So ist zum
Beispiel das Schlüsselenzym des OPP, die chloroplastidäre G6PDH, in den Fd2‐KO‐
Pflanzen vermehrt exprimiert (vgl. Koelmann, 2008; Fastabend, 2009) und auch eine
Aktivitätssteigerung kann eindeutig nachgewiesen werden (siehe Kapitel 3.1.3.1). Auch
die NTRC, welche vor allem im Dunkeln eine essentielle Rolle in der Detoxifizierung von
ROS einnimmt (vgl. Pérez‐Ruíz et al., 2006), unterliegt in den Fd2‐KO‐Pflanzen einer
erhöhten Expression (siehe Kapitel 3.1.4). In diesem Zusammenhang scheint eine
Änderung der Genexpression über Komponenten des oxidierten Stromas reguliert zu
sein, wobei hier nun wieder u.a. Trx, Glutaredoxine oder Glutathion (vgl. Wingate et al.,
1988; Meyer et al., 1999; Marchand et al., 2004) sowie die Intermediate stromaler
Stoffwechselwege in Frage kommen, z. B. die Tetrapyrrolbiosynthese (vgl.
Johanningmeier und Howell, 1984; Kropat et al., 1995; Strand et al., 2003; Ankele et al.,
2007) oder die plastidäre Proteinbiosynthese (vgl. Gray et al., 2003; Pesaresi et al.,
2006). Für die Kapazitätssteigerung der NTRC wäre allerdings auch eine direkte Rolle
von H2O2 als Ursprung und Transportform des Signals denkbar (vgl. Mittler et al., 2004;
Foyer und Noctor, 2005; Fujita et al., 2006; Bailey‐Sorres und Mittler, 2006). Das hierbei
gerade in den Fd2‐KO‐Pflanzen beteiligte 2‐Cys‐Prx hingegen scheint wiederum einer
Regulation abhängig von der Akzeptorverfügbarkeit am PSI zu unterliegen. Dies konnte
zwar nicht für das in dieser Arbeit getestete 2‐Cys‐Prx‐B, aber für die verwandte Isoform
2‐Cys‐Prx‐A gezeigt werden, wobei die Promotoraktivität abhängig von Signalen aus
dem PET an der Akzeptorseite des PSI ist (vgl. Baier et al., 2004).
Insgesamt lassen sich anhand der Fd2‐KO‐Pflanzen folgende Aussagen zum Signalling
treffen:
1. Der Auslöser für die Induktion einer Langzeitakklimation bzw. einer Anpassung
des chloroplastidären Stoffwechsels an erhöhte Lichtintensitäten liegt im
erhöhten Reduktionsgrad des PET.
2. Eine Änderung der Genexpression zur Optimierung der in den Chloroplasten im
Dunkeln ablaufenden Prozesse ist an den metabolischen Bedarf im Stroma
gekoppelt.
132 Diskussion
4.1.3 Posttranslationale Regulation
Außer auf der Ebene der Genexpression wird der Metabolismus im Chloroplasten auch
durch schnelle und effektive posttranslationale Regulation angepasst, wobei die
Aktivität bestimmter Enzyme über das Fd‐Trx‐System (vgl. Buchanan, 1980) und
spezifisch in jedem Fall über das metabolische fine‐tuning gesteuert wird (siehe
Kapitel 1.3.2). Dies verhindert u.a. das Auftreten von futile cycles, wobei z. B. ein
Abschalten des OPP im Licht gewährleistet ist, so dass kein zum Calvin‐Zyklus
gegenläufiger Prozess abläuft (vgl. Kapitel 1.3.3). Diese Situation ist in den Fd2‐KO‐
Pflanzen auf Grund des gegenläufigen Reduktionsgrades des PET in der
Thylakoidmembran und im Stroma (siehe Kapitel 4.1.2) differenzierter zu betrachten.
Das oxidiert vorliegende Stroma, wobei ein Mangel an NADPH anzunehmen ist (siehe
Kapitel 3.1.2.4 und Kapitel 3.1.3), führt in den Fd2‐KO‐Pflanzen bereits im Licht zum
Anschalten des OPP (siehe Kapitel 3.1.3.1), wodurch NADPH über den Abbau
transitorischer Stärke generiert wird. Hierbei handelt es sich nicht um einen pleiotropen
Effekt, sondern um eine an die Bedarfssituation des Stromas angepasste
posttranslationale Regulation. So kommt es in Folge des Fd‐Mangels am PSI weder zu
einer lichtabhängigen Inaktivierung des OPP über das Fd‐Trx‐System noch zu einer
Inaktivierung über Intermediate mittels fine‐tuning oder feedback‐Regulation, da
NADPH nur in geringen Mengen akkumuliert und das Stroma vermehrt oxidiert vorliegt.
Die ROS‐Akkumulation in den Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.1.3.2) fördert den
erhöhten Oxidationsgrad des Stromas. Eine Aktivierung des OPP und die damit
verbundene Generierung von NADPH sind demnach zur Detoxifikation von ROS in den
Chloroplasten absolut erforderlich. Hierbei erfolgt der Abbau wahrscheinlich über NTRC
und 2‐Cys‐Prx (siehe Kapitel 1.4.3), die in den Fd2‐KO‐Pflanzen vermehrt akkumulieren
(siehe Kapitel 3.1.4). Pérez‐Ruís et al. (2006) zeigten, dass der ROS‐Abbau über NTRC
und Prx vor allem im Dunkeln, also bei oxidiertem Stroma, in WT‐Pflanzen ein
entscheidender Faktor zur Detoxifizierung ist. In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird demnach
bestätigt, dass außer über den Beck‐Halliwell‐Asada‐Weg (siehe Kapitel 1.4.3) die
Detoxifizierung von ROS bei oxidiertem Stroma hauptsächlich über den OPP, sowie
NTRC und Prx abläuft. In diesem Zusammenhang muss allerdings beachtet werden, dass
die Aktivierung des OPP im Licht bei den Fd2‐KO‐Pflanzen nur phasenweise nach Bedarf
erfolgt. Ein ständig aktiver OPP in den Chloroplasten der Fd2‐KO‐Pflanzen würde ein
photoautotrophes Wachstum unmöglich machen. Es ist davon auszugehen, dass eine
gesteigerte NADPH‐Konzentration, im Zuge des im Licht aktiven OPP auch eine
Inaktivierung des OPP und eine Aktivierung des Calvin‐Zyklus fördert. Die Aktivierung
bzw. Inaktivierung erfolgt hierbei allerdings nicht ausschließlich über die Intermediate
Diskussion 133
im Stroma, sondern ebenso über das Fd‐Trx‐System. Die Elektronenverteilung am PSI
unterliegt einer strengen Hierarchie (vgl. Backhausen et al., 2000) und resultiert somit
bei verringerter Konzentration an Akzeptoren im Stroma (NADP+) in einem verstärkten
Elektronenfluss auf Trx, soweit die stark verringerte Menge an Fds dies möglich macht.
Demnach könnte im Licht ein ständiger Wechsel zwischen Calvin‐Zyklus und OPP
vorliegen, um die Vitalität zum einen und das photoautotrophe Wachstum zum anderen
sicher zu stellen. In der Gesamtbilanz liegt hierbei die Netto‐Aktivität des Calvin‐Zyklus
über der des OPP, was u.a. durch die Akkumulation von transitorischer Stärke im Licht in
den Fd2‐KO‐Pflanzen dokumentiert wird (siehe Kapitel 3.1.2.3). Die Teilaktivierung des
OPP im Licht ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen bei geringen NADPH‐Konzentrationen im
Stroma demnach eine Folge des metabolischen Bedarfs und vor allem zur Generierung
von NADPH für die Detoxifizierung von ROS erforderlich. Hierbei gewährleistet die
posttranslationale Regulation der Schlüsselenzyme des Calvin‐Zyklus und des OPP eine
sehr schnelle und effektive Inaktivierung bzw. Aktivierung je nach aktuellem Bedarf und
Redox‐Zustand des stromalen Metabolismus.
Sowohl RubisCO als auch NADP‐MDH sind gute Beispiele für eine posttranslationale
Regulation, die an den metabolischen Bedarf angepasst ist. Hierbei ist die Aktivität der
RubisCO in den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant geringer als in den entsprechenden WT‐
Pflanzen (siehe Kapitel 3.1.2.4), obwohl der Reduktionsgrad des PET in den Fd2‐KO‐
Pflanzen erhöhte Strahlungsintensitäten signalisiert und dies in WT‐Pflanzen zu einer
gesteigerten RubisCO‐Kapazität führt (vgl. Bailey et al., 2001). Ebenso ist der im
Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen verringerte Aktivierungszustand der NADP‐MDH in
den Fd2‐KO‐Pflanzen an das oxidierte Stroma angepasst, obwohl in den Fd2‐KO‐
Pflanzen in Folge des vermehrt reduzierten PET eine signifikant erhöhte Kapazität
vorliegt (siehe Kapitel 3.1.3.1). Ähnliche Ergebnisse konnten auch an transgenen
Pflanzen der Art A. thaliana beobachtet werden, wobei der Aktivierungszustand der
NADP‐MDH auch an das oxidiert vorliegende Stroma angepasst ist, obwohl der
Reduktionsgrad des PET einen erhöhten Elektronendruck signalisiert (vgl. Haldrup et al.,
2003; Lintala et al., 2007). Die NADP‐MDH und die RubisCO sind demnach gute Beispiele
einer gekoppelten Kontrolle, da sie zum einen einer Regulation der Genexpression über
den Reduktionsgrad des PET in der Thylakoidmembran unterliegen und zum anderen
die Aktivität in‐vivo mittels einer übergeordneten posttranslationalen Regulation über
den metabolischen Bedarf im Stroma kontrolliert ist.
Insgesamt lassen sich folgende Aussagen zur posttranslationalen Lichtregulation in den
Fd2‐KO‐Pflanzen treffen:
134 Diskussion
1. Viele Enzyme des Chloroplasten‐Metabolismus (z. B. die NADP‐MDH)
unterliegen einer lichtabhängigen Regulation über die Genexpression, werden
aber posttranslational abhängig vom metabolischen Bedarf über Intermediate
und das lichtabhängige Fd‐Trx‐System aktiviert bzw. inaktiviert.
2. Die lichtabhängige Regulation der Genexpression der NADP‐MDH erfolgt über
den Reduktionszustand des PET, während der Aktivierungszustand einer
metabolischen Kontrolle aus dem Stroma unterliegt.
3. Der OPP ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen auch im Licht bei Bedarf zur Generierung von
NADPH aktiv.
4. OPP und Calvin‐Zyklus unterliegen einer schnellen und effizienten gegenläufigen
posttranslationalen Regulation, die zum einen die Vitalität und zum anderen das
photoautotrophe Wachstum in den Fd2‐KO‐Pflanzen gewährleistet, wobei die
Netto‐Aktivität des Calvin‐Zyklus höher ist als die des OPP.
Die klassischen Blatt‐Fds Fd1 und Fd2 in A. thaliana – redundant, funktionell differenziert oder beides?
4.2
Die meisten höheren Pflanzen enthalten zwei Blatt‐Fd, so auch A. thaliana (siehe
Kapitel 1.2.2). Ungeklärt ist, welche Funktionen die Blatt‐Fds im photosynthetischen
Elektronentransport übernehmen. In der C4‐Pflanze Mais konnte für FdII eine
verminderte Affinität für die Bindung von FNR nachgewiesen werden (vgl. Matsumura
et al., 1999). FdII wird demnach in Mais eine Rolle als Elektronenüberträger im Fd‐
abhängigen ZET zugeschrieben, während FdI im LET eine essentielle Funktion besitzt
(vgl. Kimata‐Ariga et al., 2000). Die verminderte Bindefähigkeit von FdII an FNR ist auf
einen fehlenden Asparaginsäure‐Rest am C‐Terminus zurückzuführen (vgl. Kimata‐Ariga
et al., 2000; Hanke et al., 2004). In A. thaliana ist dieser Asparaginsäure‐Rest in der AS‐
Sequenz beider Blatt‐Fds konserviert, so dass eine vergleichbare Affinität zur FNR
besteht (vgl. Hanke et al., 2004). Der C‐Terminus der Fd‐Isoformen ist entscheidend für
ihre Bindung an PsaD (vgl. Pizzitutti et al., 2003), da die AS‐Sequenz und folglich die
Struktur am C‐Terminus die Fähigkeit des Fd, Elektronen von PSI aufzunehmen,
beeinflussen (vgl. Gou et al., 2006). In A. thaliana weisen die C‐Termini von Fd1 und Fd2
eine hohe Sequenzähnlichkeit auf, die bei ca. 77 % liegt. (Hierbei wurden für den
C‐Terminus nach Gou et al. (2006) 30 AS‐Reste angenommen und für das Alignment
verwendet). Insgesamt sind die physikalischen Eigenschaften von Fd1 und Fd2
vergleichbar, so auch die Fähigkeit, Elektronen am PSI zu akzeptieren (vgl. Hanke et al.,
2004). Die Tatsache, dass der ZET in C3‐Pflanzen maximal bei 15 % des LET liegt (vgl.
Diskussion 135
Genty et al., 1990; Herbert et al., 1990; Klughammer und Schreiber, 1994; Kramer und
Crofts, 1994; Sacksteder und Kramer, 2000; Joët et al., 2001; Ort und Baker, 2002) und
somit der hauptsächliche Anteil der absorbierten Lichtenergie für den LET genutzt wird,
macht die essentielle Rolle von Fd2, welches mit einen Anteil von ca. 90 % die
dominierende Fd‐Isoform im Chloroplasten ist (vgl. Hanke et al., 2004 und Kapitel 3.1),
für den LET deutlich. In den Fd2‐KO‐Pflanzen, welche trotz des knock‐outs von Fd2
photoautotroph wachsen (siehe Kapitel 3.1), übernimmt wahrscheinlich die
verbleibende Blatt‐Fd‐Isoform Fd1 diese Funktion. Demnach kann sowohl Fd1 als auch
Fd2 in A. thaliana Elektronen im LET übertragen, so dass in diesem Fall die beiden Blatt‐
Fd‐Isoformen redundant sind. Die im Vergleich zu Fd2 geringen Mengen an Fd1, sowie
die Tatsache, dass Fd1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen keiner erhöhten Expression unterliegt
(siehe Kapitel 3.1) und eine Akzeptorlimitierung am PSI phänotypische Anpassungen
nach sich zieht, verdeutlichen hingegen, dass Fd1 einen Ausfall von Fd2 nicht
kompensieret. Aus diesem Grund wird für Fd1 eine spezifische Funktion in der
photosynthetischen Elektronenverteilung angenommen.
Hanke und Hase (2008) zeigten erste Hinweise auf, die für Fd1 eine essentielle Rolle im
Fd‐abhängigen ZET indizieren. Die geringen Raten an ZET in C3‐Pflanzen gehen einher
mit dem ebenso geringeren Anteil von Fd1 an den Blatt‐Fds in A. thaliana und deuten
somit auf Fd1 als spezifischen Elektronendonator im Fd‐abhängigen ZET hin. In
Bündelscheidenzellen von C4‐Pflanzen, in welchem dem ZET eine essentielle Funktion in
der Energieversorgung zugeschrieben wird (vgl. Anderson et al., 1971; Chapman et al.,
1980; Woo et al., 1983, Asada et al., 1993; Kubicki et al., 1996; Ivanov et al., 2001), liegt
der Anteil von FdII, welches dem ZET zugeschrieben wird (s. o.), an den Blatt‐Fds mit
ca. 60 % entsprechend hoch, während in den Mesophyllzellen, in welchen hauptsächlich
der LET abläuft, der Anteil an FdII mit ca. 3 % vergleichsweise gering ist (vgl. Kimata und
Hase, 1989). Dieser geringe Anteil an FdII in den Chloroplasten der Mesophyllzellen
entspricht dem geringen Fd1‐Anteil in den Chloroplasten von A. thaliana und
verdeutlicht, dass dem ZET in C3‐Pflanzen nicht die essentielle Funktion zukommt, wie
es für C4‐Pflanzen in den Bündelscheidenzellen der Fall ist.
Werden in den Fd2‐KO‐Pflanzen die geringen Mengen an Fd1 für den LET genutzt, ist
trotz des zunehmend reduzierten PET ein nicht signifikant erhöhter Anteil des ZET (siehe
Kapitel 3.1.2.2, Kapitel 3.2.1.1 und Kapitel 3.2.2.2) auch durch den Mangel an Fd für
diesen Elektronentransportweg zu begründen. Dies verdeutlicht zum einen, dass die
Raten des ZET und des LET über die Verfügbarkeit und den Reduktionsgrad von
Elektronenakzeptoren am PSI reguliert sind (vgl. Bendall und Manasse, 1995; Joët et al.,
136 Diskussion
2001; Joliot und Joliot, 2002), und zum anderen, dass der LET mit einer höheren
Priorität abläuft als der ZET (vgl. Backhausen et al., 2000).
Untersuchungen an Fd1‐KO‐ (siehe Kapitel 3.4) sowie Fd1‐RNAi‐Pflanzen (vgl. Hanke
und Hase, 2008) verdeutlichen zudem die essentielle Rolle von Fd1 im Fd‐abhängigen
ZET in A. thaliana. Ein knock‐out bzw. eine Verringerung des Gehaltes von Fd1 führt
bereits unter moderaten Bedingungen zu signifikanten phänotypischen Anpassungen,
Wachstumsinhibierung und Nekrosenbildung in älteren Blättern (siehe Kapitel 3.4.1.1).
Unter Hochlichtbedingungen kommt es nach kurzer Zeit zur Photoinhibition am PSII und
einer deutlich verringerten Elektronentransporte, was letztlich die CO2‐
Assimilationsraten deutlich herabsetzt (siehe Kapitel 3.4.2.1). Diese Auswirkungen in
den Fd1‐KO‐Pflanzen sind die Folge der verringerten Fähigkeit, einen
Protonengradienten über die Thylakoidmembran zu generieren (siehe Kapitel 3.4.1.2
und Kapitel 3.4.2.1). Allerdings ist dies vor allem im Hochlicht für das poising essentiell
und wird zu großen Teilen dem Fd‐abhängigen ZET zugeschrieben (vgl. Munekage et al.,
2002; Munekage et al., 2004). In den Fd1‐KO‐Pflanzen ist somit von einem inhibierten
bzw. blockierten Fd‐abhängigen ZET auszugehen. Unter moderaten Bedingungen
angezogene transgene Pflanzen der Art A. thaliana mit vollständig blockiertem Fd‐
abhängigen ZET (PGR5‐KO‐Pflanzen) weisen einen ähnlichen Phänotyp auf, wie es für
die Fd1‐KO‐Pflanzen der Fall ist (vgl. Munekage et. al., 2008). Diese signifikant
veränderten Phänotypen der Fd1‐KO‐ und PGR5‐KO‐Pflanzen machen in C3‐Pflanzen
insgesamt die essentielle Funktion des ZETs und im Besonderen die des Fd‐abhängigen
ZETs sowohl unter moderaten Bedingungen als auch im Hochlicht deutlich. Zu beachten
ist hierbei allerdings, dass die Inhibierung im Wachstum in den PGR5‐KO‐ stärker als in
den Fd1‐KO‐Pflanzen ausgeprägt ist. Auch sind die CO2‐Assimilationsraten in den Fd1‐
KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen nicht signifikant von denen der
entsprechenden Lae‐WT‐Pflanzen abweichend (siehe Kapitel 3.4.1.2), während sie in
den PGR5‐KO‐Pflanzen deutlich verringert sind. Erst im Hochlicht ist dies auch in den
Fd1‐KO‐Pflanzen der Fall (siehe Kapitel 3.4.2.2). Dies macht deutlich, dass in den Fd1‐
KO‐Pflanzen auf Grund des beschriebenen Phänotyps davon ausgegangen werden muss,
dass der Fd‐abhängige ZET unter moderaten Bedingungen zum Teil noch ablaufen kann,
und somit die Auswirkungen im Vergleich zu den PGR5‐KO‐Pflanzen mit vollständig
blockiertem Fd‐abhängigen ZET vergleichsweise weniger ausgeprägt sind. Hierfür
spricht auch die im Vergleich zu den Lae‐WT‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen
unveränderte Kinetik der P700‐Oxidation im NIR (siehe Kapitel 3.4.1.2), wobei die
zweite Phase der P700‐Oxidation im NIR durch den ZET verlangsamt ist (vgl. Joliot et al.,
2005; Breyton et al., 2006; Nandha et al., 2007). Eine redundante Funktion des
Diskussion 137
NDH‐abhängigen ZET wurde bereits von Munekage et al. (2008) als nicht signifikant
postuliert. Dies ist auch in den Fd1‐KO‐Pflanzen zu beobachten, wobei weder unter
moderaten Bedingungen noch im Hochlicht eine signifikant verstärkte Aktivität des
NDH‐abhängigen ZET zu beobachten ist (siehe Kapitel 3.4.1.2 und Kapitel 3.4.2.1). Eine
Redundanz zum Fd‐abhängigen ZET liegt demnach nicht vor. Vielmehr ist der
NDH‐abhängige ZET in C4‐Pflanzen vor allem in den Bündelscheidenzellen zur
Bereitstellung von ATP erforderlich und in den Mesophyllzellen kaum vorhanden (vgl.
Kubicki et al., 1996; Takabayashi et al., 2005; Darie et al., 2006). Demnach kann in den
Fd1‐KO‐Pflanzen trotz des knock‐outs von Fd1 nur von einer Teilinhibierung des Fd‐
abhängigen ZET ausgegangen werden. Somit stellt sich die Frage nach einem zu Fd1
alternativen Elektronenüberträger im Fd‐abhängigen ZET. Es konnte bereits gezeigt
werden, dass Fd1 eine funktionelle Ähnlichkeit zu Fd2 aufzeigt und partiell redundant
im LET fungiert (s. o.), daher ist eine mögliche Funktion von Fd2 und eine Redundanz
der beiden Blatt‐Fds im Fd‐abhängigen ZET sehr wahrscheinlich. So scheint Fd2 unter
moderaten Bedingungen zum Teil die Funktion von Fd1 im Fd‐abhängigen ZET zu
übernehmen, so dass die Folgen eines knock‐outs von Fd1 im Vergleich zu den PGR5‐
KO‐Pflanzen weniger ausgeprägt sind.
Im Hochlicht liegt jedoch eine andere Situation vor. So ist die P700‐Oxidationskinetik im
NIR in Phase 2 nicht, wie in den Lae‐WT‐Pflanzen, durch den ZET verlangsamt (siehe
Kapitel 3.4.2.1). In Folge der signifikant verminderten Fähigkeit der Fd1‐KO‐Pflanzen,
gerade nach kurzer Zeit im Hochlicht einen erhöhten Protonengradienten über die
Thylakoidmembran im Zuge des poising zu generieren, ist der Reduktionsgrad der
Elektronentransportkette deutlich erhöht, was zur Photoinhibition am PSII, signifikant
verringerten Elektronentransport‐ und letztlich verminderten CO2‐Assimilationsraten
führt (siehe Kapitel 3.4.2.2). Die deutlichen Auswirkungen auf den photosynthetischen
Elektronenfluss sind durch den im Hochlicht entstandenen erhöhten Bedarf an ZET (vgl.
Johnson et al., 2005) zu erklären. Wenn das Verhältnis von ZET zu LET über die
Verfügbarkeit an freien Elektronenakzeptoren am PSI bestimmt wird (vgl. Bendall und
Manasse, 1995; Joët et al., 2001; Joliot und Joliot, 2002) und der LET in der
Elektronenverteilung hierarchisch über dem ZET eingeordnet ist (vgl. Backhausen et al.,
2000), so fungiert Fd2 bei erhöhtem Elektronenfluss im Hochlicht nicht mehr bzw. nur in
signifikant geringerem Ausmaß als Elektronendonator für den Fd‐abhängigen ZET.
An älteren Blättern sind die Auswirkungen eines inhibierten ZET bereits unter
moderaten Bedingungen extrem und es kommt in den Fd1‐KO‐Pflanzen zur Bildung von
Nekrosen (siehe Kapitel 3.4.1.1). Es ist bekannt, dass der ATP‐Bedarf in älteren
photosynthetischen Geweben erhöht ist. So fallen z. B. beim Abbau des Chlorophylls
138 Diskussion
Katabolite an, welche aktiv in die Vakuole transportiert werden (vgl. Hörtensteiner und
Kräutler, 2000; Hörtensteiner, 2009). Demnach deuten die Ergebnisse aus den Fd1‐KO‐
Pflanzen darauf hin, dass dem Fd‐abhängigen ZET in A. thaliana in älteren
photosynthetischen Gewebe eine essentielle Funktion zur Einstellung des ATP/NADPH‐
Verhältnisses zukommt und eine Inhibierung des Fd‐abhängigen ZET nicht kompensiert
werden kann.
Die elementare Rolle des Fd‐abhängigen ZET in der Generierung eines erhöhten
Protonengradienten und somit für das poising wird anhand eines Vergleichs der
Fd1‐KO‐ mit den Fd1‐RNAi‐Pflanzen (vgl. Hanke und Hase, 2008) deutlich. Im Gegensatz
zu den Fd1‐KO‐Pflanzen weisen Fd1‐RNAi‐Pflanzen noch restliche Mengen an Fd1 auf
(vgl. Hanke und Hase, 2008), welche somit für den Fd‐abhängigen ZET zur Verfügung
stehen. In Folge dessen kommt es im Hochlicht nicht direkt zur Photoinhibition am PSII,
sondern zunächst zu signifikant erhöhten Elektronentransportraten (siehe
Kapitel 3.4.2.1). Dies ist für die Fd1‐KO‐Pflanzen in ähnlicher Weise nach sehr kurzen
Zeiten im Hochlicht zu beobachten (siehe Kapitel 3.4.1.2). Aus diesem Zusammenhang
wird deutlich, dass die Generierung eines erhöhten Protonengradienten mittels des Fd‐
abhängigen ZET bereits vor einer auftretenden Akzeptorlimitierung am PSI einsetzt. So
kommt es in den Fd1‐RNAi‐Pflanzen im Zuge vermehrt absorbierter Lichtenergie,
welche nicht über poising‐Mechanismen abgeführt wird, zunächst zu erhöhten
Elektronentransportraten, die in den LET fließen. Photoinhibition am PSII tritt vorerst
nicht auf. Hingegen könnten der erhöhte Elektronenfluss und die verminderte Fähigkeit
zum poising zur Bildung von ROS am PSI führen. In den Fd1‐KO‐Pflanzen setzt auf Grund
der Akzeptorlimitierung am PSI sehr schnell Photoinhibition am PSII ein und die
Elektronentransportraten sinken (siehe Kapitel 3.4.2.1). Der Fd‐abhängige ZET ist
demnach für die Herabsetzung der Elektronentransportraten im Zuge einer
Akzeptorlimitierung am PSI essentiell, um frühzeitig Photoinhibition am PSII und die
Akkumulation von ROS zu vermeiden.
Es zeigt sich, dass Fd1 und Fd2 spezifische Funktionen im ZET bzw. LET einnehmen,
allerdings unter bestimmten Bedingungen zum Teil redundant fungieren können, so
lange am PSI keine Akzeptorlimitierung auftritt. Dies begründet auch das Verhältnis von
Fd1 zu Fd2 in den Chloroplasten von A. thaliana, da der Bedarf an Fd1 für den
Fd‐abhängigen ZET weit unter dem Bedarf an Fd2 für den LET liegt. Ein Überschuss an
Fd1 im Chloroplasten könnte einen unkontrolliert hohen Anteil an Fd‐abhängigem ZET
nach sich ziehen und somit einen hohen Protonengradienten über die
Thylakoidmembran generieren, was poising und somit einen verringerten LET nach sich
zieht (vgl. Kramer et al., 1996). Letztlich sind allerdings Verfügbarkeit und der
Diskussion 139
Reduktionsgrad der stromalen Elektronenakzeptoren für das Verhältnis von ZET zu LET
entscheidend (vgl. Bendall und Manasse, 1995; Joët et al., 2001; Joliot und Joliot, 2002).
Insgesamt lassen sich demnach folgende Aussagen in Bezug auf die Funktion der
klassischen Blatt‐Fd Isoformen in A. thaliana treffen (siehe Abb. 4.1):
1. Fd1 nimmt eine essentielle Rolle im Fd‐abhängigen ZET ein.
2. Fd2 ist hauptsächlich Elektronenüberträger im LET der Photosynthese.
3. Fd1 und Fd2 sind in ihren Funktionen zum Teil redundant.
Zusätzlich konnte bestätigt werden, dass der Fd‐abhängige ZET in C3‐Pflanzen unter
moderaten Bedingungen, vor allem aber im Hochlicht, essentiell ist und der NDH‐
abhängige ZET nur sehr bedingt eine redundante Funktion besitzt. Zudem scheint der
Fd‐abhängige ZET auch in älteren photosynthetischen Geweben eine entscheidende
Rolle in der Abdeckung des erhöhten ATP‐Bedarfs einzunehmen.
Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Funktionen der klassischen Blatt‐Fds in A. thaliana. Es sind die hypothetischen Funktionen von Fd1 und Fd2 im LET und ZET aufgezeigt, wobei Fd2 hauptsächlich im LET und Fd1 im ZET involviert ist. Die gestrichelten Linien kennzeichnen die redundanten Funktionen von Fd1 und Fd2 im ZET und LET (siehe Text).
140 Diskussion
Neue FdC1‐Isoform als alternativer Elektronenakzeptor am PSI 4.3
Mit FdC1 konnte im Rahmen dieser Arbeit eine neue Fd‐Isoform identifiziert werden,
welche im Vergleich zu den klassischen Fds eine C‐terminale Sequenzerweiterung um
acht AS aufweist (siehe Kapitel 3.3.1). Diese neue Fd‐Isoform ist im Chloroplasten
lokalisiert (siehe Kapitel 3.3.2) und zeigt signifikante Homologien zu Fd‐Isoformen in
Cyanobakterien und Algen auf, welche ebenfalls durch eine C‐terminale
Sequenzerweiterung charakterisiert sind (siehe Kapitel 3.3.1). Frühere Studien am
Proteom der Chloroplasten bestätigen die Existenz von FdC1‐Peptiden (vgl. Zybailov et
al., 2008).
Die Tatsache, dass FdC1 in vielen Pflanzen konserviert ist (siehe Kapitel 3.3.1) sowie das
Vorkommen homologer Proteine in Algen und Cyanobakterien weist auf eine
konservierte, essentielle Funktion von FdC1 hin. Hierbei ist die C‐terminale
Sequenzerweiterung zwar nicht vollständig konserviert von Cyanobakterien zu höheren
Pflanzen, allerdings innerhalb der höheren Pflanzen hoch konserviert (siehe
Kapitel 3.3.1). Diese C‐terminale Sequenzerweiterung verursacht im Vergleich zu den
klassischen Blatt‐Fds eine Einschränkung in der Interaktion mit PSI (vgl. Pizzitutti et al.,
2003). Demnach scheint eine Funktion von FdC1 als Elektronenakzeptor im
photosynthetischen Elektronentransport zunächst als unwahrscheinlich. In‐vitro‐
Untersuchungen machten allerdings deutlich, dass FdC1 als Elektronenakzeptor am PSI
fungieren kann (Hanke, unpubl.) und somit eine Alternative zu den klassischen Blatt‐Fds
in A. thaliana darstellen könnte.
In A. thaliana ist der photosynthetische Elektronentransport nicht allein abhängig von
einer zentralen Fd‐Isoform, vielmehr können beide bis dato beschriebenen Blatt‐Fd‐
Isoformen als Elektronenverteiler am PSI zum Teil redundant fungieren
(siehe Kapitel 4.2). Erst diese Tatsache ermöglicht das photoautotrophe Wachstum der
Fd2‐KO‐Pflanzen, wobei auf Grund des Fehlens von Fd2 eine Akzeptorlimitierung am PSI
auftritt und es in Folge dessen zur Lichtakklimation kommt (siehe Kapitel 3.1). Gerade
bei der auftretenden Akzeptorlimitierung am PSI in Folge des knock‐outs von Fd2 wäre
eine erhöhte Expression der redundanten Fd‐Isoform Fd1 zu erwarten gewesen. Dies
erfolgt in den Fd2‐KO‐Pflanzen allerdings nicht (siehe Kapitel 3.1). Hingegen ist die
Transkriptmenge der FdC1‐Isoform in den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant erhöht (siehe
Kapitel 3.3). Die Tatsache, dass die Genexpression diverser Proteine, welche in der
Lichtreaktion involviert sind, über den Reduktionsgrad des PET in der
Thylakoidmembran kontrolliert werden (vgl. Maiwald et al., 2003 und Kapitel 4.1.2), legt
für die erhöhte Transkriptmenge von FdC1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen ein Signal aus dem
verstärkt reduzierten PET nahe. Pflanzen mit einer Mutation in der у‐Untereinheit der
Diskussion 141
plastidären ATPase (DPA‐Mutanten), in denen kein funktionierender ATPase‐Komplex
gebildet wird, wachsen dagegen nicht photoautotroph (vgl. dal Bosco et al., 2004).
Diese Pflanzen sind nicht in der Lage, den Protonengradienten über die
Thylakoidmembran abzubauen, so dass ein signifikant gesteigerter Anteil an NPQ
eintritt. Das Expressionsniveau vieler photosynthetischer Gene ist in Folge dessen
signifikant verändert, z. B. sind einige PSI‐ und PSII‐Untereinheiten verstärkt bzw.
schwächer exprimiert. Des Weiteren ist das Transkript von FdC1 in diesen Pflanzen um
60 % verringert, obwohl der Reduktionsgrad des PET signifikant erhöht vorliegt. Wie in
Kapitel 4.1.2 beschrieben, kommt als Signalursprung für die Änderung des
Expressionsniveaus von Genen, die über den Reduktionsgrad des PET reguliert werden,
der PQ‐Pool in Frage (vgl. Pogson et al., 2008). Sowohl die Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe
Kapitel 3.1.2.2) als auch die DPA‐Mutanten weisen einen signifikant erhöhten
Reduktionsgrad des PQ‐Pools auf. Allerdings ist die Regulation der Genexpression
gegenläufig (s. o.), so dass im Fall von FdC1 ein Signalursprung am PQ‐Pool
unwahrscheinlich ist. Ist FdC1 ein ebenfalls über den Reduktionsgrad des PET reguliertes
Protein, so könnte die Kontrolle in diesem Fall über die Verfügbarkeit von
Elektronenakzeptoren am PSI erfolgen (vgl. Baier et al., 2004; Piippo et al., 2006).
FdC1 kann Elektronen vom PSI akzeptieren, zeigt allerdings eine leicht verringerte
Affinität zum PSI und eine signifikant schwächere Bindungsfähigkeit zur FNR im
Vergleich zu den klassischen Blatt‐Fds auf (s. o.). Die Elektronenverteilung am PSI
unterliegt einer hierarchischen Ordnung, wobei Elektronen zunächst auf Blatt‐Fds für
assimilatorische Prozesse doniert werden und zuletzt, im Falle einer starken
Akzeptorlimitierung, Elektronen auf O2 übertragen werden (vgl. Backhausen et al.,
2000). FdC1 könnte als alternativer Elektronenakzeptor am PSI in dieser Hierarchie eine
Rolle spielen, wobei die leicht geringere Affinität zum PSI gewährleistet, dass FdC1 als
Elektronenakzeptor nicht in Konkurrenz zu den klassischen Blatt‐Fds steht. Sind Fd1 und
Fd2 unter bestimmten Bedingungen vollständig reduziert, z. B. in Folge eines Mangels
an stromalen Akzeptoren oder durch einen erhöhten Elektronenfluss im PET in Folge
extrem gesteigerter Lichtintensitäten, wäre eine Interaktion von FdC1 mit PSI
vorstellbar, um überschüssige Elektronen aus dem PET abzuführen. Eine Rolle von FdC1
im Fd‐abhängigen ZET kann anhand der Untersuchungen an den FdC1‐RNAi‐ (siehe
Kapitel 3.3.3) und der Fd1‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.4) wahrscheinlich
ausgeschlossen werden. Ebenso zeigen die Analysen an den FdC1‐RNAi‐Pflanzen, dass
eine Funktion von FdC1 in der Photorespiration unwahrscheinlich ist. Die erhöhte
Transkriptmenge von FdC1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen bei gleich bleibender
Photorespiration unter moderaten Bedingungen ist hierfür ein weiterer Hinweis. Es ist
142 Diskussion
allerdings zu beachten, dass auf Grund der möglichen Redundanz der Fd‐Isoformen
weitere Untersuchungen notwendig sind, um klare Aussagen treffen zu können.
Alternativ wäre auch denkbar, dass FdC1 einen schnellen Elektronentransfer von PSI auf
O2 im Zuge der Mehler‐Reaktion fördert. Die Generierung von ROS im Stroma in Folge
eines überschüssigen Elektronentransportes würde in diesem Fall einer völligen
Blockierung des PET vorbeugen und den Elektronendruck verringern. ROS kann effektiv
über antioxidative Systeme detoxifiziert werden (siehe Kapitel 1.4.3). In den Fd2‐KO‐
Pflanzen ist sowohl eine erhöhte Bildung von ROS als auch eine verstärkte Aktivität
alternativer antioxidativer Systeme zu beobachten (siehe Kapitel 3.1.4), was mit der
verstärkten Expression von FdC1 einhergeht. Zudem ist in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen vor
allem im Hochlicht eine verringerte Elektronentransportrate und ein erhöhter Anteil
NPQ zu detektieren (siehe Kapitel 3.3.3). Dies sind diesem Falle im Zuge des Mangels an
Elektronenakzeptoren und speziell FdC1 erste Anzeichen einer Blockierung des PET
durch Überreduktion. ROS nicht nur ein toxisches Intermediat dar, sondern wird auch
als regulatorischer Faktor in der Genexpression vieler Proteine, z. B. auch
photosynthetischer Gene, diskutiert (vgl. Mittler et al., 2004; Foyer und Noctor, 2005;
Fujita et al., 2006 und Kapitel 4.1.2). Eine durch FdC1 erhöhte und schnellere
Akkumulation von ROS würde zu einem veränderten Signalling in den Chloroplasten
führen, so dass FdC1 als möglicher Ursprung eines Redox‐Signals aus dem PET an der
Akzeptorseite des PSI in Frage kommt (siehe Kapitel 4.1.2). Hierbei ist anzunehmen,
dass sowohl der Redoxzustand von FdC1 als auch die Menge an reduzierten FdC1 für
eine Signalweiterleitung entscheidende Faktoren sind.
Insgesamt lassen sich folgende Aussagen über die neue FdC1‐Isoform treffen
(siehe Abb. 4.2):
1. FdC1 ist in den Chloroplasten lokalisiert.
2. FdC1 kann als Elektronenakzeptor am PSI Elektronen aufnehmen, allerdings
nicht zur Reduktion von NADP+ auf FNR übertragen.
3. Die Bindungsaffinität der klassischen Blatt‐Fds zum PSI liegt höher als die von
FdC1, so dass keine Konkurrenz entstehen kann.
4. Es erscheint möglich, dass FdC1 im Falle einer Akzeptorlimitierung am PSI
Elektronen auf O2 überträgt und somit einer Überreduktion und Blockierung des
PET vorbeugt oder auch als Redox‐Signal dient.
Diskussion 143
Abb. 4.2: Hypothetische Funktion von FdC1 als Elektronenakzeptor am PSI. Schematisch dargestellt ist die mögliche Funktion von FdC1 im PET. Auf Grund der geringeren Affinität zum PSI ist dies vor allem bei einer Akzeptorlimitierung am PSI, z. B. bei extremen Strahlungsintensitäten, gegeben.
144 Zusammenfassung
5 Zusammenfassung In Rahmen dieser Arbeit sollten an transgenen Pflanzen der Art A. thaliana die
Mechanismen zur Anpassung an stark erhöhte Strahlungsintensitäten und die Funktion
unterschiedlicher Fd‐Isoformen aufgeklärt werden. Fd2‐KO‐Pflanzen stellen im Zuge der
drastischen Akzeptorlimitierung am PSI ein ideales Modell zur Simulation der Situation
unter extremen Strahlungsintensitäten dar. Hierbei konnte gezeigt werden, dass
Pflanzen in der Lage sind, normales und photoautotrophes Wachstum selbst unter
extremsten Bedingungen zu ermöglichen. Dies geschieht im Zuge einer
Langzeitakklimation, wobei Komponenten des Photosyntheseapparates zur
Aufrechterhaltung der Redox‐Homöostase kontrolliert abgebaut werden. Eine solche
Langzeitakklimation, welche sich bereits in der Entwicklung der Pflanzen zeigt, stellt
einen effektiven Schutz‐Mechanismus bei extremen Strahlungsintensitäten dar, sobald
die Kapazität der klassischen poising‐Mechanismen ausgeschöpft ist. Hierbei zeigte sich,
dass in diesen akklimatisierten Pflanzen eine kurzfristige Justierung der Redox‐
Homöostase über die klassischen poising‐Mechanismen nur begrenzt funktioniert.
Stattdessen setzen extreme Formen des poisings ein, wie z. B. eine erhöhte Rate an
Photorespiration oder die kontrollierte Degradation des PSI. Die Regulation dieser
Mechanismen und die Induktion einer Langzeitakklimation sind hierbei abhängig vom
Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette, der als Indikator für
die Kapazität der Photosynthese herangezogen werden kann. Der Reduktionsgrad des
photosynthetischen Elektronentransportes kann hierbei als Signal für die Änderung der
Genexpression im Kern gesehen werden, was zu einer Langzeitakklimation an erhöhte
Lichtintensitäten führt. Ebenso wird die Kapazität von im Licht bedeutenden Enzymen,
z. B. die Expression von RubisCO als Schlüsselenzym im Calvin‐Zyklus oder von NADP‐
MDH als poising‐Mechanismus, über den Reduktionsgrad des photosynthetischen
Elektronentransportes kontrolliert. Hingegen ist eine Änderung der Genexpression zur
Optimierung der in den Chloroplasten im Dunkeln ablaufenden Prozesse an den
metabolischen Bedarf im Stroma gekoppelt.
Die Fd2‐KO‐Pflanzen weisen einen gegenläufigen Reduktionszustand vom
photosynthetischen Elektronentransport und Stroma auf, wobei die photosynthetische
Elektronentransportkette stark reduziert und das Stroma oxidiert vorliegt. Diese
Tatsache ermöglichte eine weitergehende Untersuchung der Regulationsvorgänge von
Enzymen im Stroma. Die Schlüsselenzyme des stromalen Metabolismus unterliegen
einer lichtabhängigen Regulation ihrer Kapazität und gleichzeitig einer
posttranslationalen Regulation über Intermediate und das lichtabhängige Fd‐Trx‐
System, welche übergeordnet die Aktivität der Enzyme an den metabolischen Bedarf
Zusammenfassung 145
anpassen. So war in den Fd2‐KO‐Pflanzen auf Grund des oxidiert vorliegenden Stromas
G6PDH, ein lichtinaktiviertes Enzym des oxidativen Pentosephosphatwegs, im Licht
aktiv. Dies dient der Generierung von NADPH zum Abbau von ROS, das vermehrt im
Zuge der stark reduzierten photosynthetischen Elektronentransportkette in den Fd2‐
KO‐Pflanzen gebildet wird und auf Grund des Mangels an Fd am PSI nicht mit der
Reduktionskraft aus der Photosynthese abgebaut werden kann. Oxidativer
Pentosephosphatweg und Calvin‐Zyklus unterliegen einer sehr schnellen, gegenläufigen,
posttranslationalen Regulation, um zum einen die Vitalität und zum anderen das
photoautotrophe Wachstum zu gewährleisten. Die Aktivität des Calvin‐Zyklus ist hierbei
allerdings insgesamt größer als die des oxidativen Pentosephosphatwegs, was daher
dennoch in einem Nettogewinn an Assimilaten resultiert.
Neben der Aufklärung regulatorischer Prozesse in den Chloroplasten stand im Rahmen
dieser Arbeit die Funktionsanalyse unterschiedlicher Fd‐Isoformen im Fokus. Anhand
von Fd1‐KO‐, Fd2‐KO‐ und Fd1‐RNAi‐Pflanzen wurde für Fd1 eine spezifische Funktion
im Fd‐abhängigen zyklischen Elektronentransport und für Fd2 eine spezifische Funktion
im linearen Elektronentransport aufgezeigt. Fd1 und Fd2 sind jedoch zum Teil
redundant, wobei die Verfügbarkeit an freien Akzeptoren am PSI entscheidend ist und
der lineare Transport mit höherer Priorität abläuft. In diesem Zusammenhang konnte
gezeigt werden, dass der zyklische Elektronentransport in C3‐Pflanzen kein Artefakt ist,
sondern auch unter moderaten Bedingungen eine essentielle Funktion zur
Aufrechterhaltung der Redox‐Homöostase besitzt.
Mit FdC1 wurde eine alternative Fd‐Isoform charakterisiert, welche in den
Chloroplasten lokalisiert ist und im photosynthetischen Elektronentransport involviert
ist. Bei einer Akzeptorlimitierung kann FdC1 Elektronen am PSI aufnehmen, allerdings
nicht auf FNR zur Generierung von NADPH übertragen. Ebenso konnte eine Funktion
von FdC1 im zyklischen Elektronentransport und in der Photorespiration ausgeschlossen
werden. Es ist allerdings wahrscheinlich, dass FdC1 Elektronen vom PSI auf O2 überträgt,
um eine Blockade des photosynthetischen Elektronentransportes zu vermeiden.
Außerdem kann der Redoxzustand bzw. die Menge an FdC1 als Signal für eine
veränderte Genexpression im Zuge eines stark reduzierten photosynthetischen
Elektronentransportes postuliert werden.
Um ein detailliertes Bild über die Regulationsvorgänge und Anpassungsmechanismen in
den Chloroplasten bezogen auf erhöhte Lichtintensitäten zu bekommen, sind weitere
Untersuchungen notwendig. Die im Rahmen dieser Arbeit gesammelten Erkenntnisse
bieten eine gute Grundlage, um anhand der Fd2‐KO‐Pflanzen die photosynthetischen
Regulationsmechanismen als Modell weiter aufzuklären. Dies trifft ebenso auf die
146 Zusammenfassung
Funktionen der Fd‐Isoformen im photosynthetischen Elektronentransport zu.
Aufbauend auf die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse bieten die
verwendeten transgenen Pflanzen ein perfektes Tool zur weiteren Funktionsaufklärung
der photosynthetischen Fd‐Isoformen. Hierbei sollte vor allem die Charakterisierung der
zweiten neuen Fd‐Isoform FdC2 und die Einordnung der Funktionen von FdC1 und FdC2
im photosynthetischen Elektronentransport eine Rolle spielen. Erkenntnisse in diesem
Zusammenhang würden zum besseren Verständnis der molekularen Abläufe der
Photosynthesereaktion beitragen und letztlich deren Optimierung ermöglichen.
Abstract 147
6 Abstract Ferredoxins are the major distributors for electrons to the various acceptor systems in
plastids. In green tissues, ferredoxins are reduced by photosynthetic electron flow in
the light, while in heterotrophic tissues, NADPH, generated in the oxidative pentose
phosphate pathway, is the reductant. In higher plants different ferredoxin isoforms,
containing two leaf‐type ferredoxins involved in photosynthetic electron flow, are
currently known. In this work Ds‐T‐DNA‐insertion line of Arabidopsis thaliana for the
coding region of the major leaf ferredoxin (Fd2, At1g60950) is used to create a situation
of high electron pressure in the thylakoids. Although these plants possess only the
second, minor photosynthetic ferredoxin isoform (Fd1, At1g10960), they grow
photoautotrophically on soil, but with a lower growth rate and less chlorophyll. The
highly reduced photosynthetic electron transport chain causes an extreme form of
acclimation to high light, while the oxidized stroma leads to a re‐adjustment of the
chloroplast metabolism helping the plants to survive under these light‐stress conditions.
Redox homeostasis is achieved by regulation at both, the post‐transcriptional and the
transcriptional level. Alterations in gene expression due to acclimation steps and also
the expression of NADP‐dependent malate dehydrogenase, on of the poising
mechanisms, via retrograte signalling are caused by a signal originating from the
reduced photosynthetic electron flow.
Using additionally Ds‐T‐DNA‐insertion lines of A. thaliana for the coding region of Fd1
and transgenic approaches for gene silencing of Fd1, different functions of the two
photosynthetic isoforms in A. thaliana are observed. Thereby Fd1 plays a significant role
in Fd‐dependent cyclic electron flow, and Fd2 predominantly drives the linear elelctron
flow to generate NADPH. However, these specific functions are partly redundant. Using
these transgenic lines of A. thaliana the essential function of ferredoxin‐dependent
cyclic electron flow in C3‐plants became clear. In addition to the known ferredoxin
isoforms in A. thaliana, the genome contains sequences coding for novel, unstudied
ferredoxin‐like proteins (FdC1 and FdC2) with extended C‐termini, for which there are
homologues in other photosynthetic organisms. In the Ds‐T‐DNA‐insertion line of
A. thaliana for the coding region of Fd2, the transcript level of FdC1 is increased.
Moreover, FdC1 is located in the chloroplasts and able to accept electrons from PSI. This
implies an important role for FdC1 under conditions of high‐electron pressure in the
photosynthetic electron transport chain. An involvement of FdC1 in linear and cyclic
flow or photorespiration is not likely, but FdC1 might act as electron carrier for
reduction of O2 and/or as a signalling molecule.
148 Literaturverzeichnis
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162 Abkürzungsverzeichnis
8 Abkürzungsverzeichnis ΔAP700‐D arithmetische Mittelwerte von ΔAP700 im Dunkeln ΔAP700‐MAX maximale Änderung von ΔAP700 im NIR ΔAP700‐N arithmetische Mittelwerte von ΔAP700 im NIR °C Grad Celsius [2Fe‐2S]‐Zentrum 2‐Eisen‐2‐Schwefel‐Zentrum [4Fe‐4S]‐Zentrum 4‐Eisen‐4‐Schwefel‐Zentrum [CO2R] Referenz‐Wert der CO2‐Konzentration [CO2S] Sample‐Wert der CO2‐Konzentration [H2OR] Referenz‐Wert der H2O‐Konzentration [H2OS] Sample‐Wert der H2O‐Konzentration A Photosyntheserate A0 primärer Elektronenakzeptor im PSI A830 nm P700‐Absorption bei 830 nm A860 nm P700‐Absorption bei 860 nm Abb. Abbildung AL aktinisches Licht AN Photosyntheserate in O2‐freier Atmosphäre AO Photosyntheserate bei 21 % O2 im Referenzgas APR apparenter prozentualer Anteil der Photorespiration an der maximalen
RubisCO‐Verbrauchsrate APX Askorbat‐Peroxidase AS Aminosäure Asc Askorbat bzw. beziehungsweise BSA Rinderserumalbumin ca. circa cDNA copy‐DNA Chla Chlorophyll a Chlb Chlorophyll b Ci CO2‐Konzentration im substomatären Raum cm Zentimeter CM‐H2DCFDA 5 (und 6)‐Chloromethyl‐2´,7‐dichlorodihydrofluorescein‐Diacetat CO2 Kohlenstoffdioxid Col‐WT Columbia‐Wildtyp Cyt‐b6f Cytochrom‐b6f‐Komplex d Tag DEPC Diethylpyrocarbonat dNTP 2`‐Desoxynukleotidtriphosphat DTT Dithiothreitol E Einstein ET Transpirationsrate EST expressed sequence tag ETR Elektronentransportrate F steady‐state Fluoreszenz im AL F/FM Fluoreszenz‐Emission im Licht bezogen auf die maximale Fluoreszenzemission
im Dunkeln F0 Grundfluoreszenz im Dunkel‐adaptierten Blatt F0’ Grundfluoreszenz im Licht‐adaptierten Zustand F‐ATPase F‐ATP Synthase FBPase Fructose‐1,6‐Bisphosphat‐Phosphatase FC Anteil der chlororespiratorischen Chlorophyllfloureszenz‐Emission eines Licht‐
adaptierten Blattes im Dunkeln, bezogen auf die Chlorophyllfloureszenz‐Emission im Licht
Fd Ferredoxin
Abkürzungsverzeichnis 163
Fd1 Ferredoxin 1 aus A. thaliana Fd1‐KO Fd1 knock‐out Fd1‐RNAi Fd1 RNA‐inteference Fd2 Ferredoxin 2 aus A. thaliana Fd2‐KO Fd2 knock‐out Fd3 Ferredoxin 3 aus A. thaliana Fd4 Ferredoxin 4 aus A. thaliana FdC1 Ferredoxin C1 aus A. thaliana FdC1‐RNAi FdC1 RNA‐inteference FdC2 Ferredoxin C2 aus A. thaliana FdI Ferredoxin I aus Mais FdII Ferredoxin II aus Mais FdOX oxidiertes Ferredoxin FdRED reduziertes Ferredoxin Fd‐Trx‐System Ferredoxin‐Thioredoxin‐System FM maximale Fluoreszenz im Dunkel‐adaptierten Blatt FM’ maximale Fluoreszenz im Licht‐adaptierten Zustand FNR Ferredoxin‐NADP+‐Reduktase FV/FM Maximale Quantenausbeute des PSII g Erdbeschleunigung g Gramm G1P Glukose‐1‐Phosphat G6PDH Glukose‐6‐Phosphat‐Dehydrogenase GFP green fluorescent protein GR Glutathion‐Reduktase GSH reduziertes Glutathion GSSG oxidiertes Glutathion gtw Blattleitfähigkeit GWD Glukan‐Wasser‐Dikinase h Stunde H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid H2Obidest doppelt destilliertes Wasser HCl Chlorwasserstoff (Salzsäure) HEPES 4‐(2‐Hydroxyethyl)‐piperazin‐1‐ethan‐sulfonsäure HL Hochlicht HPLC High Performance Liquid Chromatography i.d.R. in der Regel kDa Kilodalton KO knock‐out Lae‐WT Landsberg erecta‐Wildtyp LED lichtemittierende Diode LET linearer Elektronentransport LHC Lichtsammelkomplex LHCII Lichtsammelkomplex‐II LHCs Lichtsammelkomplexe M Molar MDA Monodehydroaskorbat MDHR Monodehydroaskorbat‐Reduktase MES Morpholinoethansulfonat min Minute mind. mindestens ML Messlichtimpuls mRNA messengerRNA MV Methylviologen MW Molekulargewicht NAD(P)‐GAPDH NAD(P)‐Glycerinaldehyd‐3‐Phosphat‐Dehydrogenase
164 Abkürzungsverzeichnis
NADP(H) (reduziertes) Nicotinamidadenindinukleotid NADP‐MDH NADP‐abhängige Malatdehydrogenase Noe‐WT Noessen‐Wildtyp NPQ nicht‐photochemische Fluoreszenzlöschung NTR NADPH‐Thioredoxin‐Reduktase NTRC chloroplastidäre NTR O2
‐ Superoxid O2 Sauerstoff OAA Oxalacetat OPP oxidativer Pentosphophatweg P(T7) T7‐Promotor P680 reaktives Zentrum des PSII P680* angeregtes reaktives Zentrum des PSII P680+ oxidiertes reaktives Zentrum des PSII P700 reaktives Zentrum des PSI P700+ oxidiertes reaktives Zentrum des PSI PAGE Polyacrylamid‐Gelelektrophorese PC Plastocyanin PCR Polymerase‐Kettenreaktion PET photosythetischer Elektronentransport PQ Plastochinon PQH2 Plastohydrochinon PQ‐Pool Plastochinon‐Pool PRK Phosphoribulokinase Prx Peroxiredoxine PsaA‐PsaO Proteinuntereinheiten von PSI PSI Photosystem I PSI‐Core PSI‐Core Proteinkomplex PSII Photosystem II PVDF Polyvinylidenfluorid PVP Polyvinylpyrrolidon QA primärer Akzeptor im PSII QB sekundärer Elektronenakzeptor qE Fluoreszenzlöschung durch Energieabgabe in Form von Wärme qI Fluoreszenzlöschung durch Photoinhibition qL Fluoreszenzparameter linear zum Redox‐Zustand von QA qP photochemische Fluoreszenzlöschung qT Fluoreszenzlöschung durch state transitions (LHCII) RNAi RNA‐interference ROS reaktive Sauerstoffspezies RPP reduktiver Pentosephosphatweg RT Raumtemperatur RT‐PCR Reverse‐Transkriptase‐PCR RubisCO Ribulose‐1,5‐Bisphosphat‐Carboxylase/Oxygenase s Sekunde S Blattfläche s.o. siehe oben s.u. siehe unten SBPase Sedoheptulose‐1,7‐Bisphosphat‐Phosphatase SD standard diviation SDS Natriumdodecylsulfat SDS‐PAGE Natriumdodecylsulfat‐Polyacrylamid‐Gelelektrophorese SE standard error SF stromaler Faktor SOD Superoxid‐Dismutase SP Sättigungspuls T‐DNA Transfer‐DNA
Abkürzungsverzeichnis 165
Tab. Tabelle Tris Tris‐Hydroxymethylaminomethan Trx Thioredoxin TrxOX oxidiertes Thioredoxin TrxRED reduziertes Thioredoxin u Flussrate unpubl. unpubliziert UV‐Licht ultraviolettes Licht vgl. vergleiche WT Wildtyp ZET zyklischer Elektronentransport ΔAP700 P700‐Absorptionsänderung ΔpH Protonengradient фII Quantenausbeute am PSII
166 Danksagung
9 Danksagung
Mein großer Dank gilt Prof. Renate Scheibe für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe, die
Bereitstellung des interessanten Themas und die stets kompetente Betreuung während
meiner Promotionszeit. Zusätzlich bin ich Prof. Dr. Renate Scheibe sehr dankbar für die
vielen interessanten Diskussionen und Hilfestellungen während meiner gesamten
Studienzeit.
Für die Übernahme des Koreferates möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr.‐Ing.
Richard Wagner bedanken.
Ein besonderer Dank gilt Dr. Jan Backhausen, der mich in die Geheimnisse der
Chlorophyllfluoreszenz‐Analytik einweihte. Vor allem möchte ich Dr. Jan Backhausen
aber für seine Freundlichkeit und Hilfsbereitschaft danken, auf die ich jederzeit
ausnahmslos bauen konnte.
Dr. Simone Holtgrefe möchte ich ganz herzlich für unendlich viele Hilfestellungen
sowohl im inhaltlichen als auch in praktischen Teilen meiner Arbeit danken. Die
jederzeit kritischen und konstruktiven Diskussionen waren eine große Hilfe und haben
maßgeblich zu einer erfolgreichen Entwicklung der Thematik beigetragen. Zusätzlich gilt
ihr ein ganz besonderer Dank für die schöne und freundschaftliche Zusammenarbeit in
den letzten Jahren.
Für die gute Zusammenarbeit möchte ich mich auch bei Dr. Guy Thomas Hanke
bedanken. Der stete Austausch und die fachlichen Diskussionen waren eine große
Bereicherung und haben mich immer ein Stück weiter gebracht. Mit seiner
unkomplizierten und freundlichen Art hat er immer zu einer tollen Arbeitsatmosphäre
beigetragen (Guy, thank you for everything!).
Einen besonderen Dank für ein immer absolut freundschaftliches und kollegiales
Verhältnis verdienen Inga Strodtkoetter (für die tolle Studienzeit und vor allem für die
Doktorandenzeit, in der ich mich immer absolut auf sie verlassen konnte und sie mir ein
großer Halt war), Joanna Wojtera (für eine schöne freundschaftliche Zeit und die vielen
wunderbaren sprachlichen Missverständnisse), Nikolas König (für seine Hilfe immer und
überall, für die ich mich nicht genug bedanken kann) und Hans‐Martin Leffers (für
Buddy!).
Bei Silke Walter möchte ich mich für die Hilfe im Rahmen der Glutathion‐Bestimmung
herzlich bedanken.
Danksagung 167
Der gesamten Arbeitsgruppe, vor allem Heike Schwiderski (für die vielen Hilfestellungen
und die Versorgung mit Nahrung über die letzten Jahre ☺), den Gärtnerinnen Heike
Wolf‐Wibbelmann, Kirsten Jäger und Sabine Steinbach (für die Anzucht von optimalem
Pflanzenmaterial) und allen Studenten, die ich betreut oder mit denen ich
zusammengearbeitet habe (Patricia Lehmkuhl, Katharina Bollig, Meike Koehlmann,
Wiebke Hansen und Mike Fastabend) möchte ich herzlich für die schönen letzten Jahre
danken.
Meinen Freunden und Bekannten, die ich in letzter Zeit häufig vernachlässigt habe, gilt
ein besonderer Dank für Ihr Verständnis.
Das größte Dankeschön gilt meiner Familie und ganz besonders meinen Eltern. Ohne
ihre ständige Unterstützung, Hilfe, Anteilnahme und ihr Verständnis wäre dies alles
niemals möglich gewesen. Aus diesem Grund widme ich ihnen diese Arbeit.
Am meisten unter der Situation zu leiden hatte sicherlich meine Freundin Rahel. Ich
kann nicht ausdrücken wie dankbar ich ihr bin. Die Geduld, das Verständnis und die
Hilfe und Unterstützung in so vielen Bereichen, die sie mir entgegengebracht hat, waren
unglaublich. In all der Zeit war sie Stütze und Motivation gleichermaßen. Vielen lieben
Dank dafür.
168 Eidesstattliche Erklärung
10 Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus
anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter
Angabe der Quelle gekennzeichnet.
Bei der Auswahl und Auswertung folgenden Materials haben mir die nachstehend
aufgeführten Personen in der jeweils beschriebenen Weise unentgeltlich geholfen.
1. Dr. Guy Thomas Hanke half bei der Erstellung des Alignments und des
phyllogenetischen Stammbaums in Kapitel 3.3.1.
2. Joanna Wojtera half bei der Erstellung der Bilder mit dem konfokalen
laser scanning‐Mikroskop im Rahmen der ROS‐Bestimmung (siehe
Kapitel 3.1.3.2) und den Lokalisationsstudien (siehe Kapitel 3.3.2)
3. Silke Walter half bei der Glutathion‐Bestimmung mittels HPLC (3.1.3.2).
Weitere Personen waren an der inhaltlichen materiellen Erstellung der vorliegenden
Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von
Vermittlungs‐ bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder andere Personen) in
Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten
Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde bisher weder im In‐ noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form
einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
_______________________ ________________________ (Ort. Datum) (Unterschrift)
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