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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik/Genomik

Prof. Dr. Antje von Schaewen (10.12. und 14.01) [email protected] von Prof. Jörg Kudla (Freisemester)Institut für Biologie und Biotechnologie der PflanzenSchlossplatz 7Email: [email protected]

Schwerpunkte:

1. Werkzeuge der Gentechnologie (Enzyme)

2. Grundlegende Methoden der Gentechnologie

3. Vektoren, Klonieren und finden rekombinanter Klone

4. Reportergene, transgene Organismen und ihre Nutzung

5. Anwendungen der Gentechnologie

Grundlagen der Genomik - Teil Kudla: Scripte

Scripte: auf der Website der AG Kudla unter „teaching“

http://www.uni-muenster.de/Biologie.IBBP/agkudla/lehre/lehre.html

Login: kursPasswort: mars

- Scripte bitte VOR der Vorlesung herunterladen- es stehen für jede Vorlesung drei inhaltlich identische

Versionen im Netz:- 1.) 2 Folien pro Seite bunt (zum Anschauen)- 2.) 2 Folien pro Seite schwarz-weis (zum Ausdrucken)- 3.) 6 Folien pro Seite schwarz-weis (sparsame Druckversion)

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Grundlagen der Gentechnik: Literatur und Scripte

Literatur:

1. D. Nicholl: Gentechnische Methoden, Spektrum Verlag, 324 S., 26 €

2. T.A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum, 35 €

3. C. Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics, Spektrum Verlag, 33 €

4. Lodish et al.: Molecular Cell Biology, Freeman Verlag, Kapitel 9, ca. 72 €

NICHT: Jansohn, Gentechnische Methoden, Spektrum Verlag

Klonierung: Das grundlegende Experiment der Gentechnologie

Amp Selektion

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Enzyme der Gentechnologie

I. Nukleasen1. Restrikonsendonukleasen2. Exonukleasen

II. Modifizierende Enzyme1. Ligasen2. Phosphatasen / Kinasen / Transferasen

III. Polymerasen1. DNA - Polymerasen2. RNA - Polymerasen3. reverse Transkriptasen

Noch einmal:das 5‘ (-P) und das 3‘ (-OH) Ende!

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Restriktionsendonukleasen

- Entdeckt als restringierende Systeme bei Phageninfektionen- bestehen aus einer Nuklease- und einer Methylase-Aktivität

Nomenklatur:Name des Organismus + Nummer des Restriktionsenzyms

z.B.: Escherichia coli Enzym1 = Eco RISerratia marcensens Enzym1 = Sma IHaemophilus influenzae Enzym3 = Hae III

3 Typen von Restriktionsenzymen sind bekannt

Typ I: z. B. Eco B, Eco K, „komplexe Nukleasen“, zugleich Methylase und Nukleasebenötigen ATP, Mg2+ und S-Adenosylmethioninspezifische 15 bp Bindungsstelle, schneiden ca. 1000 bp entfernt

Typ III: z. B. Hga I, Hph Ibenötigen ATP, Mg2+

nicht-palindromische Erkennungssequenz, schneidet ca. 5 bis 15 bp entfernt, bildet distinkte Fragmente


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Typ II: z. B. Bam HI, Eco RIbenötigen Mg2+

palindromische Erkennungssequenz, meist 4 - 8 bpBindungs- und Schnittstelle sind identischhydrolytische Spaltungspezifische Puffer-Anforderungen (an pH und Salze)

Anwendung: physikalische Kartierung (Restriktionskarten)KlonierungSouthern-Blot HybridisierungRFLP Analyse (Genkartierung)


3‘ Überhang

5‘ Überhang

5‘ Überhang

ohne Überhang

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Restriktionsendonukleasen - „sticky ends“

bildet einzelsträngige Enden3‘-Ende OH-Gruppe5‘-Ende PO4-Gruppe

Pst I:5‘-CTGCA/G-3‘ 5‘-CTGCAOH-3‘3‘-G/ACGTC-5‘ 3‘-GP-5‘

Eco RI:5‘-G/AATTC-3‘ 5‘-GOH-3‘3‘-CTTAA/G-5‘ 3‘-CTTAAP-5‘

Restriktionsendonukleasen - „blunt & sticky ends“

glatte Enden: können beliebig kombiniert (ligiert) werdenklebrige Enden: spezifische Basenpaarung nötig

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Kombination gleicher Enden

erlaubt die Ligation von unterschiedlichen Schnittortenmanchmal geht die Erkennungssequenz verloren (Pfeil)

Isoschizomere und „Methylierungspaare“

Isoschizomere: gleiche Erkennungssequenz, schneiden gleich(Sst I, Sac I)

Neoschizomere: gleiche Erkennungssequenz, schneiden unterschiedlich

z.B.: Sma I Xma ICCC/GGG C/CCGGGGGG/CCC GGGCC/C

Methylierungspaare: Enzyme mit gleicher Erkennungssequenz aberunterschiedlicher Methylierungsabhängigkeit

z.B.: Sau 3A spaltet GATC und GAmTC

Mbo I spaltet nur GATC

Dpn I spaltet nur GAmTC

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Schnittfrequenz von Enzymen

hängt vom GC-Gehalt ab - 50%:Tetranukleotid 1/44 256 bpHexanukleotid 1/46 4096 bpOktanukleotid 1/48 65536 bp

aber: Frequenz eines Schnittortes (bei nur C+G)GC-Gehalt 50%Sma I, CCC/GGG 1/(46 x 42) 65536 bp

GC-Gehalt 25%Sma I, CCC/GGG 1/(46 x 82) 262144 bp

Aktivität von Restriktionsenzymen

1 Einheit (1 Unit, U):

Eine Einheit eines Restriktionsenzyms ist die Menge Enzym, die 1 g DNA des Phagen in einer Stunde in speziellem Puffer bei 37°C vollständig verdaut.

ABER: Zahl der Schnittstellen (Sal I: 2, Bcl I: 8, Cla I: 14)-DNA ist linear!Temperatur?

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Wie pipettiere ich einen Restriktionsverdau ?

Reihenfolge (Nr.):x l DNA (3.)2 l 10fach Puffer (2.)x l BSA ? (4.)x l Enzym (5.)x l H20 (1.)

20 l (total)

Volumen ?DNA-Menge ?Methylierung ?Puffer ?Temperatur ?Besonderheiten ?Enzymmenge ?

II Modifizierende Enzyme - Ligasen -

T4-DNA-Ligase (Bacteriophage T4):

Eigenschaften:- verknüpft das 5‘-Phosphatende mit der 3‘-OH-Gruppe zweier DNA-Stränge (oder DNA + doppelsträngige RNA, oder zwei doppelsträngige RNAs)

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Anwendung:- Ligation von DNA-Enden (z.B. PCR-Produkte in Vektor)- Verknüpfung von Bruchstellen („Nicks“) in DNA

Bedingungen:- Mg2+, ATP

Ablauf:„sticky-end“ Ligation: 10 min – 1h, RT

„blunt-end“ Ligation: ÜN, 15°C

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-Ablauf:„sticky-end“ Ligation:

10 min – 1h, RT

„blunt-end“ Ligation:ÜN, 15°C

II Modifizierende Enzyme - RNA Ligasen -

T4-RNA-Ligase (Bacteriophage T4): single strand ligase

Eigenschaften:- verknüpft das 5‘-Phosphatende mit der 3‘-OH-Gruppe einzelsträngiger DNA oder RNA

Anwendung:- Ligation einzelsträngiger Nukleinsäuren - radioaktive 3‘ Markierung von RNA

Bedingungen: - ATP

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II Modifizierende Enzyme - Phosphatasen -

Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP, aus B. taurus):

Eigenschaften:- Hydrolysiert die 5‘-Phosphatgruppe von DNA, RNA, rNTPs, dNTPs

Anwendung:- Dephosphorylierung von Vektorenden, um die Religationsrate zu reduzieren

Bedingungen: - Mg2+

II Modifizierende Enzyme - Kinasen -

T4-Polynucleotid-Kinase (PNK, T4 Bacteriophage):

Eigenschaften:- Überträgt das -Phosphat von ATP auf das 5‘-Ende von Nukleotiden

Anwendung:- Phosphorylierung von PCR-Produkten- 5‘-End Markierung von DNA, RNA und Oligonukleotiden

Bedingungen: - Mg2+, ATP, reduzierendes Milieu (DTT, -ME =-Mercaptoethanol)

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II Modifizierende Enzyme - Transferasen -

Terminale Desoxynucleotidyltransferase (B. taurus):

Eigenschaften:- hängt Nukleotide an freie 3‘-OH Gruppen an

Anwendung:- Homopolymerschwänze (die dadurch an DNA gekoppelt werden)- 3‘-End Markierung von DNA

Bedingungen: - Mg2+, dNTPs,

III Polymerasen- DNA Polymerasen -

DNA-Polymerase I, Holoenzym (E. coli):

Eigenschaften:- DNA-abhängige DNA-Polymerase, 3‘-Exonuclease (für doppel- und einzelsträngige DNA), 5‘-Exonuclease (für doppelsträngige DNA)

Anwendung:- Auffüllen von 5‘-Überhängen, entfernen von 3‘-Überhängen- Markierungen („nick“-Translation)

Bedingungen: - Mg2+, Primer (bzw. freies 3‘-OH)dNTPs (ohne dNTPs überwiegtdie 3‘-Exonucleaseaktivität !)

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DNA-Polymerase I, „Klenow Fragment“ (E. coli):

Eigenschaften:- entspricht der DNA-Polymerase I, jedoch ohne 5‘-Exonucleaseaktivität

Anwendung:- auffüllen von 5‘-Überhängen, entfernen von 3‘-Überhängen- radioaktive Sequenzierung- cDNA-Synthese (Zweitstrang)

Bedingungen: - Mg2+, Primer (bzw. freies 3‘-OH)dNTPs (ohne dNTPs überwiegtdie 3‘-Exonucleaseaktivität)

T4-DNA-Polymerase (T4 Bacteriophage):

Eigenschaften:- DNA abhängige DNA Polymerase, 3‘-Exonuclease

Anwendung:- auffüllen von 5‘-Überhängen- bevorzugt für das entfernen von 3‘-Überhängen verwendet, aufgrund hoher Exonucleaseaktivität

Bedingungen: - Mg2+, Primer (bzw. freies 3‘-OH), dNTPs (ohne dNTPs überwiegtauch hier die 3‘-Exonucleaseaktivität !)


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III Polymerasen- Thermostabile DNA Polymerasen -

DNA-abhängige Polymerasen, tolerant gegenüber hohen Temperaturen besonders geeignet für PCR Reaktionen, Sequenzierungen

Eigenschaften:

Bedingungen:- Mg2+, dNTPs, Primer (3‘-OH Ende)

Name Organismus 5’-Exonuclease 3’-Exonuclease

(„Proofreading“)

Produkt-Enden

Taq Pol. Thermus aquaticus ja nein 3’A

Pfu Pol. Pyrococcus furiusus ja ja glatt

Pwo Pol. Pyrococcus woesei ja ja glatt

Phusion, Q5, etc.

High fidelity & fast (recombinant)

ja ja glatt

III Polymerasen- RNA Polymerasen -

DNA-abhängige RNA-Polymerasen (T3, T7 Bacteriophage)

Eigenschaften:- Synthetisieren RNA von einem DNA Template ohne Primer, distinkte Promotor Erkennungssequenzen

Anwendung:- radioaktive Markierung von RNA (für Prozessierungsstudien)

- Synthese von RNA (für in vitroTranslationen)

Bedingungen:- Mg2+, DTT oder -Mercaptoethanol,

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III Polymerasen- Reverse Transkriptasen -

M-MLV Reverse Trancriptase (Moloney Murine Leukemia Virus)

Eigenschaften:- RNA-abhängige DNA-Polymerasen, 5‘-Exoribonuclease (RNase H) - gibt es auch ohne RNase H, 3‘-Exoribonuclease

Anwendung:- Erststrangsynthese von cDNA (RT-PCR Anwendungen)- Degradierung von RNA in RNA/DNA-Hybriden

Bedingungen:- Mg2+, Primer

Nukleasen

Phosphodiesterasen = spalten Phosphodiester-Bindungen innerhalb von Nukleinsäuren

Exonukleasen = spalten vom Ende (entweder 5‘ oder 3‘) einzelne Nukleotide ab

Endonukleasen = spalten beliebig innerhalb der Nukleinsäure, bis nurkurze Oligonukleotide übrig sind

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Nukleasen- DNA Exonukleasen -

Nuklease Bal31 (Alteromonas espejiani):

Eigenschaften:- doppel- und einzelsträngige 5‘- bzw. 3‘-Exonuklease

Anwendung:- Schrittweise Verkürzung von DNA (z.B. wenn man Promotoren oder Bereiche, die von Proteinen gebunden werden analysieren will)

Bedingungen: - Ca2+ und Mg2+

Nukleasen- DNA Exonukleasen -

Exonuklease III (E. coli):

Eigenschaften:- doppelsträngige 3‘-Exonuklease, besitzt auch RNAse H-Aktivität

Anwendung:- Unidirektionale Deletionen (da 3‘-Überhänge nicht angegriffen werden)- Herstellung von einzelsträngiger DNA

Bedingungen: - Mn2+ und Mg2+

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Nukleasen- DNA Endonukleasen -

Nuklease SI (Aspergillus oryzae):

Eigenschaften:- einzelsträngige DNA und RNA Endonuklease-aktivität

Anwendung:- „transcript mapping“- glätten von DNA-Enden- generieren von „Nicks“ in doppelsträngiger DNA- spalten von Hairpin-Strukturen

Bedingungen: - Zn2+ und pH 4,5

Nukleasen- DNA Endonukleasen -

DNase I (B. taurus):

Eigenschaften:- einzel- und doppelsträngige DNA-Endonuklease, als auch RNA/DNA-Hybride

Anwendung:- Degradation von DNA aus RNA Proben- „DNase I footprinting“ (Proteine schützen)- „Nick“ Translation

Bedingungen:- Mg2+ für „random nicks“, in Anwesenheit von Mn2+ wird auf beidseitig geschnitten

bioinformatik i: grundlagen der gentechnik/genomik · 3 enzyme der gentechnologie i. nukleasen 1....

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