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Aus der Klinik für Chirurgie mit Poliklinik
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger
Die Evaluation von Humanem Guanylat-Bindungsprotein-1 als Marker
im Blutserum für Entzündung und Sepsis
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Julia Annette Tonak
aus Erlangen
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger
Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Dr. rer. biol. hum. M. Stürzl
Tag der mündlichen Prüfung: 20.07.2011
Inhaltsverzeichnis
1 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................ 1
2 EINLEITUNG ................................................................................ 3
2.1. Begriffserklärung Entzündung, Sepsis und Sepsis-assoziierte
Erkrankungen ................................................................................ 3
2.2. Epidemiologie der Entzündung und Sepsis ................................... 6
2.3. Pathophysiologie der Entzündung und Sepsis .............................. 7
2.4. Prognostische Scores zur Schweregradeinschätzung und
Verlaufskontrolle einer Entzündung und Sepsis .......................... 11
2.5. Behandlung der Entzündung und Sepsis .................................... 12
2.6. Diagnosestellung und Entzündungs- und Sepsismarker ............. 14
2.6.1. Diagnosestellung und generelle Entzündungs- und
Sepsismarker .............................................................................. 14
2.6.1.1. Leukozyten .................................................................................. 14
2.6.1.2. C-reaktives Protein (CRP) ........................................................... 15
2.6.1.3. Procalcitonin (PCT) ..................................................................... 15
2.6.1.4. Interleukin-6 ................................................................................ 16
2.6.1.5. Der Stellenwert der Entzündungs- und Sepsismarker ................. 17
2.6.2. Humanes Guanylat-Bindungsprotein-1 (hGBP-1) ....................... 18
2.6.2.1. Grundlegende Mechanismen bei Entzündung ............................ 18
2.6.2.2. Molekulare Kennzeichen und Eigenschaften der
hGBP-Familie .............................................................................. 19
2.6.2.3. Funktion von hGBP-1 .................................................................. 20
2.6.2.4. Nachweisbarkeit von hGBP-1 ..................................................... 22
2.6.2.5. Überlegungen zu diagnostischen und therapeutischen
Möglichkeiten von hGBP-1 .......................................................... 23
2.7. Zielsetzung .................................................................................. 25
3 MATERIAL UND METHODEN .................................................... 26
3.1. Das Studienkollektiv .................................................................... 26
3.1.1. Das Patientenkollektiv ................................................................. 26
3.1.2. Der Studienarm: Sepsis-Patienten .............................................. 28
3.1.3. Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten ..................................... 30
3.1.4. Die Studienuntergruppe: Patienten mit Entzündung ................... 33
3.2. Die Methode zur IL-6- und hGBP-1-Messung:
Der Sandwich-ELISA .................................................................. 34
3.2.1. Das allgemeine Prinzip des Sandwich-ELISA ............................. 34
3.2.2. Die hGBP-1-Messung mittels Sandwich-ELISA .......................... 35
3.2.3. Die IL-6-Messung mittels Sandwich-ELISA ................................. 38
3.2.4. Die Kalkulation der ELISA-Ergebnisse ........................................ 39
3.3. Die statistische Auswertung ........................................................ 44
4 ERGEBNISSE ............................................................................. 47
4.1. Die Korrelation von CRP, Leukozyten, PCT und IL-6................ 479
4.1.1. Die Korrelation von CRP und Leukozyten ................................... 49
4.1.2. Die Korrelation von PCT mit anderen Entzündungsmarkern ....... 51
4.1.3. Die Korrelation von IL-6 mit anderen Entzündungsmarkern ........ 51
4.2. Die statistische Auswertung von hGBP-1 .................................... 56
4.2.1. Das Patientenkollektiv ................................................................. 56
4.2.2. Der Studienarm: Sepsis-Patienten .............................................. 57
4.2.3. Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten ..................................... 59
4.2.4. Die Patientengruppe mit Entzündung.......................................... 60
4.3. Zusammenfassung der Ergebnisse............................................. 64
5 DISKUSSION .............................................................................. 65
6 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................ 76
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................... 94
8 ANHANG ..................................................................................... 97
9 DANKSAGUNG........................................................................... 99
10 LEBENSLAUF ......................... Fehler! Textmarke nicht definiert.
1
1 ZUSAMMENFASSUNG
Einleitung: Die frühzeitige Erkennung einer Entzündung und beginnenden
Sepsis bei Patienten ist immens wichtig. Trotz etablierter
Entzündungsmarker im Blut, wie z.B. die Leukozytenzahl und CRP, ist die
Suche nach einem sichereren und spezifischeren Marker immer noch aktuell.
Endothelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei entzündlichen
Prozessen. Untersuchungen haben gezeigt, dass durch inflammatorische
Zytokine aktivierte Endothelzellen insbesondere „Humanes Guanylat-
Bindungsprotein-1“ (hGBP-1) exprimieren. Die Untersuchung von hGBP-1
als potentieller Sepsis- bzw. Entzündungsmarker liegt somit nahe.
Material und Methode: Es wurden Blutserumproben von Patienten der
Chirurgischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg abgenommen und auf
die Expression von hGBP-1 hin untersucht. Die Blutabnahmen wurden bei
unterschiedlichen Entzündungszuständen durchgeführt und die Güte von
hGBP-1 als Sepsis- bzw. Entzündungsmarker geprüft. Des Weiteren wurde
hGBP-1 mit den Entzündungsmarkern Leukozyten, CRP, IL-6 und
Procalcitonin im Serum verglichen.
Ergebnisse: Der Nachweis von hGBP-1 im Blutserum ist möglich. Die
Sensitivität von hGBP-1 als Entzündungsmarker liegt bei 7,5%, die Spezifität
bei 95,8%. HGBP-1 als Sepsismarker hat eine Sensitivität von 66,7% und
eine Spezifität von 97,3%. Im Exakten Fisher-Test wird hier ein signifikanter
Zusammenhang bestätigt. HGBP-1 korreliert im Gesamt-Patientenkollektiv,
bei septischen Patienten und in der Untergruppe der Patienten mit
Entzündung signifikant mit der Leukozytenzahl.
Diskussion: Durch die starke Korrelation mit der Leukozytenzahl als
etablierter Entzündungsmarker wird bestätigt, dass hGBP-1 eine Entzündung
anzeigt. Ein signifikanter Zusammenhang zur Sepsis ist belegt. Eine weitere
Studie kann Aufschluss über die diagnostische Aussagekraft anhand der
prädiktiven Werte von hGBP-1 geben. Zudem sind Blutprodukte in
unterschiedlichen Medien unterschiedlich empfindlich nachweisbar. So ist
eine Analyse von hGBP-1 in einem anderen Medium, wie z.B. Blutplasma,
oder eine Verbesserung des Detektionssystems anzuraten.
2
EXECUTIVE SUMMARY
Background: Early detection of inflammation or beginning sepsis in patients
plays an important role. Although there are some established markers, that
indicate inflammation early, like white blood cells and CRP, the search for a
more reliable and more specific marker is still relevant. Endothelial cells play
an important role in inflammations. Analyses showed, that endothelial cells,
which are activated by inflammatory cytokines, express particularly “human
guanylate binding protein-1”. Here was investigated hGBP-1 as a potential
marker of sepsis respectively of inflammation.
Material and methods: Blood serums of patients of the Department of
Surgery at the University hospital of Erlangen-Nürnberg were taken to
explore the expression of hGBP-1. The collection of blood samples was
accomplished in different states of inflammation. Thus the quality of hGBP-1
as marker of sepsis respectively of inflammation was tested. Furthermore
hGBP-1 was compared to inflammation markers like white blood cells, CRP,
IL-6 and Procalcitonin in blood serum.
Results: Analysis shows, that hGBP-1 in serum is detectable. With a
sensitivity of 7.5% and a specificity of 95.8% hGBP-1 serves as inflammation
marker. The sensitivity for hGBP-1 as sepsis marker is 66.7% and the
specificity is 97.3%. The fisher-yates exact test verifies a significant
coherence. A correlation between hGBP-1 and white blood cell count is
found in total patient population, in septic patient group and in patient group
of inflammation.
Conclusions: Because of the strong correlation between hGBP-1 and white
blood cell count approves as established inflammation marker, hGBP-1 is
certified to identify an inflammation. A significant coherence between hGBP-1
and septicaemia is confirmed. Another clinical trial would allow a better
understanding of diagnostic value by means of predictive values of hGBP-1.
Beyond that, blood products are detectable in different mediums and different
ways. Therefore an exploration of hGBP-1 in another medium, such as
bloodplasma, or by an advanced detection system is recommended.
3
2 EINLEITUNG
2.1. Begriffserklärung Entzündung, Sepsis und Sepsis-assoziierte
Erkrankungen
„Notae vero inflammationis sunt quattuor:
rubor et tumor cum calore et dolore.” [015]
So beschrieb A. C. CELSUS im 1. Jahrhundert n. Chr. die Zeichen der
Entzündung, die noch heute als die vier Kardinalsymptome einer lokalen
Entzündung gelten. Zu Rötung, Schwellung, Überwärmung und Schmerz
fügte C. GALEN im 3. Jahrhundert n. Chr. noch functio laesa (lat.
„eingeschränkte Funktion“) als fünfte Säule der lokalen Entzündung hinzu.
[073]
Im Vergleich zur Entzündung ist die Sepsis (griech. σηπω „Fäulnis“) ein
Krankheitszustand, der schon wesentlich früher beschrieben wurde.
HIPPOKRATES erklärte bereits 400 v. Chr. einen septischen Zustand als ein
durch faulende Materie verursachtes Fieber. [042]
In der Vergangenheit wurde die Beschreibung und Definition einer Sepsis oft
verändert und abgewandelt. Ursache dafür war die große Variabilität in
Ausmaß, Auslöser und Krankheitsbild einer Sepsis. Erst 1914 erklärte H.
SCHOTTMÜLLER, Ordinarius für Innere Medizin in Hamburg:
„Eine Sepsis liegt dann vor, wenn sich innerhalb des Körpers ein Herd
gebildet hat, von dem konstant oder periodisch pathogene Bakterien in den
Blutkreislauf gelangen, und zwar derart, dass durch diese Invasion subjektive
und objektive Krankheitserscheinungen ausgelöst werden.“ [076]
Diese Erläuterung ist nun Vorbild für viele weitere Definitionen einer Sepsis
und wird bis heute in ihrem Kern nicht verändert. 2005 definierten H. P.
SCHUSTER und U. MÜLLER-WERDAN die Sepsis als „die Gesamtheit der
lebensbedrohlichen klinischen Krankheitserscheinungen und
pathophysiologischen Veränderungen als Reaktion auf die Aktion pathogener
Keime und ihrer Produkte, die aus einem Infektionsherd in den Blutstrom
eindringen, die großen biologischen Kaskadensysteme und spezielle
4
Zellsysteme aktivieren und die Bildung und Freisetzung humoraler und
zellulärer Mediatoren auslösen.“ [077]
Vieles in der Pathophysiologie einer Sepsis ist auch in der heutigen Zeit noch
nicht vollständig geklärt und erschwert die Diagnose.
Diese Arbeit befasst sich mit der Suche nach einem neuen möglichen
Entzündungs- und Sepsismarker, der eine Entzündung und Sepsis früher
erkennen, diagnostizieren und damit auch besser behandeln lässt.
Unter den Begriffen „Entzündung, Sepsis und Sepsis-assoziierte
Erkrankungen“ versteht man eine Reihe von verschiedenen
Allgemeinreaktionen des Körpers, deren Unterschiede nun im Folgenden
zusammengefasst werden.
Entzündung
Die fünf Kardinalzeichen einer Entzündung, Rubor, Calor, Tumor, Dolor und
Functio laesa, die die lokalen Zeichen einer Entzündung beschreiben,
werden hervorgerufen durch Abwehrmechanismen des Gefäß- und
Bindegewebes. Sie werden unter anderem verursacht durch Vasodilatation,
erhöhte Gefäßpermeabilität, physikalische und chemische Stimulation der
Nozizeptoren und dem Schmerz selbst. [079] Neben diesen lokalen Zeichen
kann eine Entzündung auch systemische Symptome hervorrufen. Diese
werden dann als Zustand Systemic Inflammatory Response Syndrome
bezeichnet.
Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)
1992 wurde in einer Konferenz des American College of Chest Physicians
(ACCP) und der Society of Critical Care Medicine (SCCM) nicht nur der
Begriff des SIRS, in Abgrenzung zur Sepsis, geprägt, sondern auch der
Zustand eines SIRS bzw. Sepsis definiert. [053]
Ein SIRS liegt dann vor, wenn der Patient mindestens zwei der folgenden
Kriterien erfüllt: Körpertemperatur >38°C oder <36°C, Herzfrequenz >90/min,
Atemfrequenz >20/min oder PaCO2 <32mmHg oder die Notwendigkeit einer
maschinellen Beatmung, Leukozyten >12.000/µl oder <4.000/µl oder >10%
5
unreife Formen. Die Ursache für ein SIRS kann unterschiedlich sein, geht
aber ohne Infektion einher. [025]
Sepsis
Eine Sepsis hingegen ist gekennzeichnet durch eine systemische
Entzündungsreaktion, also ein SIRS, und zusätzlich einer Infektion. Der
Nachweis einer Infektion, und damit die Invasion von Mikroorganismen in
den Körper, kann hierbei optimalerweiser mikrobiologisch belegt oder ohne
mikrobiellen Nachweis als stark verdächtig akzeptiert werden. [046]
Schwere Sepsis
Ein Patient leidet definitionsgemäß unter einer schweren Sepsis, wenn zu
der Sepsis noch eine Organdysfunktion hinzukommt. Dabei kann jedes
Organ betroffen sein und sich unterschiedlich äußern. Beispiele hierfür sind
Depressionen, Hypotonie, Tachykardie, Anstieg der Leberenzyme, Oligurie,
Kreatininanstieg, Thrombozytopenie, Koagulationsstörung, Minderperfusion.
[025]
Septischer Schock
Als septischen Schock bezeichnet man einen Zustand der Sepsis, bei dem
der Patient trotz ausreichender Volumensubstitution unter einem Schock,
Organdysfunktion und einer Hypotonie leidet. Die Hypotonie ist hier definiert
als systolischer Blutdruck <90mmHg, MAP (Mean Arterial Pressure)
<60mmHg oder als Abfall des systolischen Blutdrucks um >40mmHg; dabei
darf keine andere Ursache für die Hypotonie vorliegen. [046]
Multiple Organ Dysfunction Syndrome (MODS)
Gefürchtete Komplikation einer Sepsis ist, wenn ein Patient an einem MODS
erkrankt. Als MODS gilt die Funktionsstörung mindestens zweier Organe
beim akut kranken Patienten, so dass dessen Homöostase nicht ohne
Intervention stabilisiert werden kann. [007]
6
Abb. 1: Grafik zu Entzündung, Sepsis und Sepsis-assoziierten Erkrankungen
MODS
Septischer Schock
Schwere Sepsis
Sepsis
SIRSInfektion
2.2. Epidemiologie der Entzündung und Sepsis
Sepsis ist eine der häufigsten Todesursachen bei kritisch kranken Patienten
in den USA. Jährlich erkranken 750.000 Amerikaner an einer Sepsis und
mehr als 210.000 davon sterben. [036] G. S. MARTIN et al. veröffentlichten
2003 eine Studie, die zeigte, dass auch die Häufigkeit einer schweren Sepsis
über die Jahre zunimmt. 1979 waren es noch 83 Fälle/100.000 Einwohner,
2000 zählten G. S. MARTIN et al. schon 240 Fälle/100.000 Einwohner. [051]
Auch in Europa zählt die Sepsis zu einer sehr häufigen Komplikation. Eine
Studie der Sepsis Occurrence in Acutely Ill Patients (SOAP) aus dem Jahr
2006 berichtete, dass mehr als ein Drittel (35%) der Patienten auf einer
Intensivstation in Europa eine Sepsis entwickeln. Die Mortalität lag hierbei
bei 27%. [096]
Während die Mortalität einer schweren Sepsis ebenfalls zwischen 25% und
30% lag, stieg die Mortalität bei einem septischen Schock auf 40% bis 70%.
[075]
7
G. FRIEDMAN et al. erklärten 1998 in ihrer Veröffentlichung, dass trotz
Zunahme des Auftretens eines septischen Schocks die prozentuale
Sterblichkeit aber zurückgeht. [024]
Aktuelle Studien zeigen, dass die Pneumonie mit 40% die häufigste Ursache
einer Sepsis darstellt. Daneben lösen intraabdominale Infektionen (20%),
katheterbedingte oder primäre Bakteriämien (15%) und Infektionen des
Harntrakt (10%) ebenfalls häufig eine Sepsis aus. Während früher vor allem
gram-negative Erreger für eine Sepsis verantwortlich waren, sind heute
gram-positive und gram-negative Erreger gleichermaßen verursachend.
Wesentlich seltener sind Infektionen durch Pilze oder Parasiten. Bei einem
Drittel der Patienten ist jedoch kein Erreger nachweisbar. Mögliche Gründe
dafür sind eine bereits greifende antimikrobielle Therapie (z.B. in Form von
Antibiotika-Gabe) oder Probleme bei der Probenentnahme (z.B. durch
fehlende Sputumproduktion). [096]
2.3. Pathophysiologie der Entzündung und Sepsis
Pathophysiologisch ist eine Entzündung, insbesondere eine Sepsis, ein
Zusammenspiel aus proinflammatorischen, antiinflammatorischen,
prokoagulativen und antikoagulativen Interaktionen, um den Körper von den
eingedrungenen und in der Blutbahn verbreiteten Erregern zu befreien.
Dabei spielen das angeborene und das erworbene Immunsystem eine
zentrale Rolle.
Das angeborene Immunsystem reagiert zuerst auf eine Infektion. Aktiviert
werden die Zellen des angeborenen Immunsystems (Makrophagen,
Monozyten, Granulozyten) durch Bindung der eingedrungenen
Mikroorganismen an Toll-like Rezeptoren (TLR) auf der Oberfläche der
Immunzellen. Hierbei binden z.B. TLR-2 die Peptidoglykane von gram-
positiven Bakterien und TLR-4 die Lipopolysaccharide von gram-negativen
Bakterien. Die Bindung des Pathogens induziert die Dimerisierung der TLR,
wodurch eine intrazelluläre Signalkaskade aktiviert wird, die dann zu einer
Sezernierung von proinflammatorischen Zytokinen, wie TNF-α und IL-1β u.a.,
und antiinflammatorischen Zytokinen wie IL-10 u.a. führt. [075]
8
Makrophagen und Monozyten gehören aber auch zu den Antigen-
präsentierenden Zellen, wodurch hier eine Verknüpfung mit dem erworbenen
Immunsystem entsteht.
Die erworbene Immunabwehr wird vermittelt durch aktivierte B- und T-Zellen.
Die adaptive Immunantwort unterliegt dem Prinzip der klonalen Selektion.
Dabei löst ein Antigen durch Bindung eine klonale Expansion spezifischer B-
Zellen aus. Ausdifferenzierte B-Zellen, sogenannte Plasmazellen,
produzieren spezifische Antikörper verschiedener Ig-Klassen, die durch
unterschiedliche konstante Teile, bezeichnet als FC-Anteile, gekennzeichnet
sind. Unter anderem können diese Antikörper die für die Immunabwehr
wichtige Komplementkaskade aktivieren. So kommt es z.B., eingeleitet durch
ein einziges IgM-Molekül, zur Lyse der befallenen Zelle.
T-Zellen sind in der Lage intrazelluläre Erreger zu bekämpfen. Mit speziellen
Rezeptoren erkennen sie die körperfremden Antigene, die mittels MHC-
Komplexen auf befallenen Zellen präsentiert werden. CD-8 tragende „Killer-
T-Zellen“ werden dabei durch präsentierte MHC-Klasse-I-Proteine aktiviert
und leiten damit die Apoptose der befallenen Zelle ein. Die CD-4 tragende
„Helfer-T-Zelle“ (TH-Zelle) wird stattdessen von MHC-Klasse-II-Proteinen
aktiviert. MHC-II befindet sich auf Makrophagen, B-Zellen und dendritischen
Zellen. [035] TH1-Zellen und TH2-Zellen produzieren entgegenwirkende
Zytokine. So sezerniert die TH1-Zelle proinflammatorische Mediatoren, wie
z.B. TNF-α, Interferon-γ und IL-2, und die TH2-Zelle antiinflammatorische
Mediatoren, wie z.B. IL-4 und IL-10. Die entscheidenden Faktoren, ob nun
TH1- oder TH2-Zellen aktiviert werden, sind bisher nicht vollständig bekannt.
Vermutet wird ein Zusammenhang mit der Art des Pathogens und der
Infektion. [036] Proinflammatorische Zytokine führen neben einer Aktivierung
von Endothelzellen, welche daraufhin Stickoxide (NO), einen starken
Vasodilatator, bilden, auch zu einer Hochregulation von Adhäsionsmolekülen
(Selektine, Integrine, ICAM-1 und VCAM-1 [035]) in Endothelzellen und
neutrophilen Granulozyten. Neutrophile Granulozyten bekämpfen nicht nur
körperfremde Mikroorganismen, sondern führen am Endothel auch zur
Gewebsschädigung. Dabei erhöhen die ausgeschütteten Mediatoren die
Gefäßpermeabilität, was zu Ödemen in den Organen führt. [075] Am
9
Endothel führen die proinflammatorischen Zytokine zur Leukozytenadhäsion
und damit zur Leukozyten-Extravasation ins entzündete Gewebe. [047]
Neben der pro- und antiinflammatorischen Immunantwort reagiert der Körper
auch mit einer koagulativen Wirkung auf die systemische Infektion.
Lipopolysaccharide stimulieren Endothelzellen zur vermehrten Ausschüttung
von Thromboplastin. Dies führt im Zuge der damit aktivierten
Gerinnungskaskade zu einer katalysierten Umwandlung von Fibrinogen zu
Fibrin, was eine verstärkte Gerinnung zur Folge hat.
Physiologischerweise werden auch Faktoren zur Hemmung und damit zur
Modulation der Gerinnung aktiviert. Neben Protein S, Antithrombin III und
TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) wird auch Protein C aktiviert. Dabei
katalysiert die Bindung von Thrombin an Thrombomodulin wiederum die
Bindung von Protein C an einen endothelialen Protein C Rezeptor. Das so
aktivierte Protein C inaktiviert nun Faktor Va und VIIIa der
Gerinnungskaskade und hemmt die Synthese eines Plasminogenaktivator-
Inhibitors 1. Aktiviertes Protein C senkt darüber hinaus die
Leukozytenadhäsion, Apoptose und Zytokinproduktion.
Während einer Sepsis sinkt der Spiegel an Protein C, Protein S, Antithrombin
III und TFPI-1. Lipopolysaccharide und TNF-α reduzieren die Synthese von
Thrombomodulin und dem endothelialen Protein C Rezeptor, was letztlich zu
einer Störung der Fibrinolyse führt und somit Mikrothromben und
Mikrozirkulationsstörungen verursachen kann. [075]
Diese Verbindung zwischen Entzündung und Mikrothromben führt zu der in
der Sepsis auftretenden Zellhypoxie, zum anaeroben Metabolismus und
letztlich zum Zelltod. [025]
Neben der hoch inflammatorischen Phase ist die Sepsis auch durch eine
auftretende immunsuppressive Phase gekennzeichnet.
Die Theorie einer kompensatorischen antiinflammatorischen Antwort stellten
R. C. BONE et al. im Jahre 1997 auf. Sie nannten diesen Zustand
Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome (CARS) und
definierten ihn als verminderte Expression (<30%) von HLA-DR (Human
Leukocyte Antigene) auf Monozyten und reduzierte Fähigkeit der Monozyten
inflammatorische Zytokine, wie TNF-α oder IL-6, zu bilden. [008]
10
Die Vorstellung einer immunsuppressiven Phase erklärt das bis dahin nicht
erklärbare aber häufige Auftreten sekundärer Infektionen während einer
SIRS oder Sepsis. Solche Sekundärinfektionen können mit verursachend für
die gefürchtete Spätletalität sein. Dabei ist dieses Phänomen eines CARS
aber nicht als globales Defizit, sondern als Anpassung des Immunsystems,
eine überschießende inflammatorische Reaktion des Körpers abzudämpfen,
zu verstehen. [001]
Mögliche Mechanismen der Immunsuppression werden im Folgenden
vorgestellt. Studien zeigten, dass bei Patienten nach Unfällen oder
Verbrennungen erniedrigte TH1-Zytokinspiegel im Blut nachweisbar sind,
während die antiinflammatorischen TH2-Zytokine erhöht sind. Andere Studien
bewiesen, dass das antiinflammatorische IL-10 bei Sepsispatienten nicht nur
erhöht ist, sondern auch als Prognosefaktor für die Mortalität herangezogen
werden kann. Demnach geht man bei einer Sepsis von einer Verschiebung
von der inflammatorischen TH1- zur antiinflammatorischen TH2-Antwort aus.
Ein weiterer Mechanismus der Immunsuppression wird unter dem Begriff der
Anergie zusammengefasst. Anergie bezeichnet dabei den Zustand der T-
Zelle, die nicht funktionstüchtig ist. [036] J. D. PELLEGRINI et al.
beschrieben in ihrer Veröffentlichung aus dem Jahr 2000, dass Patienten, die
ein Trauma oder Verbrennungen erlitten haben, verminderte Spiegel
zirkulierender T-Zellen aufwiesen und die überlebenden T-Zellen anergetisch
waren. [063]
Die Sepsis-induzierte Apoptose von CD4-T-Zellen, B-Zellen und
dendritischen Zellen führt zu einem weiteren immunsuppressiven Effekt. Bei
mehr als 75% der Sepsispatienten liegt der Lymphozytenspiegel unter dem
der Norm eines gesunden Patienten. Ursache dafür mag ein
stressinduzierter endogener Anstieg von Glucocorticoiden sein. Diese
Apoptose führt wiederum zu Anergie und zur Ausschüttung von
antiinflammatorischen Zytokinen.
Die Immunsuppression kann aber auch durch einen Mangel an MHC-Klasse-
II-Komplexen auf Makrophagen auftreten und damit zu einem Mangel an
proinflammatorischer Mediatorbildung führen. [036]
R. C. BONE beschrieb neben der Phase des CARS auch die Möglichkeit
eines Mixed Antagonistic Response Syndrome (MARS). Dabei kommt es
11
abwechselnd zu Schüben eines SIRS und eines CARS. Es kann somit als
unbalancierte Ausschüttung pro- und antiinflammatorischer Mediatoren
betrachtet werden. Ohne eine Antwort in seiner Veröffentlichung aus dem
Jahr 1996 zu geben, warf R. C. BONE damit die Frage auf, welche
Auswirkungen die immunsuppressive Phase wiederum auf die
proinflammatorische Kaskade hat. [006]
2.4. Prognostische Scores zur Schweregradeinschätzung und
Verlaufskontrolle einer Entzündung und Sepsis
Um eine Krankheit und insbesondere die Schwere einer Krankheit
quantifizieren zu können, behilft sich die Medizin mit sogenannten Scoring-
Systemen. Mithilfe dieser Scoring-Systeme läßt sich aber nicht nur die
Schwere und damit verbunden die Prognose eines Patienten objektivieren,
sondern sie unterstützen den behandelnden Arzt auch in seiner
Behandlungsentscheidung. Behandlungsergebnisse können anhand solcher
Scores objektiviert werden und helfen damit bei der Verbesserung der
Therapie. Durch die Möglichkeit der früheren Identifikation schwerkranker
Patienten und Behandlungsentscheidungen wird die klinische Relevanz
solcher Scoring-Systeme weiter ansteigen. [005]
Die richtige Wahl eines Scoring-Systems richtet sich nach dem
Verwendungszweck, Erhebungsaufwand und den entstehenden Kosten.
Modelle zur Erfassung der Morbidität, Mortalität und des therapeutischen
Aufwandes stehen zur Verfügung. Zu den bekanntesten Scores der
Intensivmedizin gehören TISS (Therapeutic Intervention Scoring System),
APACHE (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation), SAPS
(Simplified Acute Physiology Score), MPM (Mortality Predicting Model) und
SOFA (Sequential Organ Failure Assessment). [039]
Diese Scoring-Systeme werden überarbeitet, verbessert und
weiterentwickelt. Aus diesem Grund gibt es einige Modelle bereits in der
zweiten und dritten Generation. S. LEMESHOW und J. R. LE GALL
beschrieben 1994 in ihrer Veröffentlichung, dass die Modelle der dritten
Generation ihren jeweiligen Vorgängerversionen überlegen sind. [044]
12
Die Möglichkeiten solcher Scoring-Systeme sind aber auch begrenzt. Sie
werden nie mit absoluter Sicherheit die Überlebenswahrscheinlichkeit oder
die Irreversibilität einer Krankheit wiedergeben können. [092]
2.5. Behandlung der Entzündung und Sepsis
Über die optimale Behandlung einer Sepsis sind sich führende Gremien nicht
einig. Die Variabilität und vor allem die Komplexität einer Sepsis machen
eine richtige Therapie sehr schwierig. Von entscheidender Bedeutung ist
eine frühe Diagnosestellung. Gerade hier zeigt sich die Schwierigkeit, denn
eine Sepsis zu erkennen, ist oft die größte Herausforderung. Darauf wird im
nächsten Kapitel näher eingegangen.
2008 veröffentlichte die Surviving Sepsis Campaign (SSC) eine überarbeitete
Fassung der International Guidelines For Management Of Severe Sepsis
And Septic Shock aus dem Jahr 2004. Trotz unterschiedlicher Ansichten
erarbeiteten internationale Experten gemeinsame Leitlinien für die
Behandlung einer Sepsis. Um den verschiedenen Meinungen gerecht zu
werden, wurde in den Richtlinien das GRADE (Grades of Recommendation,
Assessment, Development and Evaluation)-System verwendet. Dabei wurde
zwischen starker und schwacher Empfehlung und zudem nach abgestuften
Evidenzgraden unterschieden. [020]
Auf eine ausführliche Erläuterung der Therapie wird an dieser Stelle
verzichtet und lediglich ein Abriss der Behandlung einer Sepsis
wiedergegeben.
Das Management einer Sepsis umfasst zunächst eine initiale Stabilisierung
und Infektionskontrolle. Darin beinhaltet ist die anfängliche Stabilisierung
(innerhalb der ersten sechs Stunden), die Diagnosestellung, eine Antibiotika-
Therapie, die Identifizierung des Infektionsherdes und dessen Sanierung. Als
hämodynamische Unterstützung und adjuvante Therapie empfiehlt sich eine
Flüssigkeitszufuhr, die Gabe von Vasopressoren, eine inotrope Therapie,
Steroidgabe und rekombinantes humanes aktiviertes Protein C (rhAPC). Als
weitere supportive Therapie stehen eine Reihe von Möglichkeiten zur
Verfügung: Blutprodukte, mechanische Beatmung bei sepsis-induziertem ALI
(Acute Lung Injury) / ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome),
13
Sedierung, Analgesie und neuromuskuläre Blockade, Blutzuckerkontrolle,
Nierenersatztherapie, Bikarbonat-Therapie, Stressulkusprophylaxe,
Erwägung einer Therapielimitierung. [020]
Aber der wohl wichtigste Faktor in der Behandlung einer Sepsis ist die Zeit.
A. KUMAR et al. beschrieben 2006, dass bei einem septischen Schock eine
effektive antimikrobielle Therapie innerhalb der ersten Stunde mit einem
ansteigenden Überleben von 79,9% assoziiert ist. Dennoch werden nur 50%
der septischen Patienten mit dokumentierter Hypotonie innerhalb der ersten
sechs Stunden therapiert, die anderen 50% erst nach sechs Stunden. Jede
Stunde der Verzögerung einer antibiotischen Therapie senkt die
Überlebensrate um 7,6%. [043]
Noch deutlicher zeigten E. RIVERS et al. 2001 in ihrer Studie, wie wichtig der
Zeitfaktor in der Behandlung eines septischen Patienten ist. Sie verglichen
hierbei Patienten, die bei der Einlieferung in eine Notaufnahme unter einer
schweren Sepsis oder einem septischen Schock litten und unterschiedliche
Behandlungen erhielten, bevor sie auf eine Intensivstation verlegt wurden.
Patienten, die eine sogenannte „early goal-directed therapy“ innerhalb der
ersten sechs Stunden erhielten, unterlagen einer Mortalität von 30,5%,
während Patienten, die eine Standardtherapie erhielten, eine Mortalität von
46,5% aufwiesen. Die „early goal-directed therapy“ beinhaltete neben der
Standardtherapie, d.h. einer physiologischen Einstellung des CVP (Central
Venous Pressure), Urinausscheidung, MAP und ScvO2 (Central Venous
Oxygen Saturation), auch rasche Flüssigkeitsinfusionen, vasoaktive
Medikamente und Bluttransfusionen innerhalb der ersten sechs Stunden.
[074]
14
2.6. Diagnosestellung und Entzündungs- und Sepsismarker
Das Erkennen eines septischen Zustandes ist nicht einfach. Trotz fester
Kriterien, die eine Entzündung, SIRS und Sepsis beschreiben, sind die
Übergänge fließend. Ein diagnostischer Marker zeigt spezifisch an, ob eine
Erkrankung vorliegt und schließt sie aus, wenn sie nicht vorliegt. Diese
Spezifität liegt vor, wenn der Marker einen einzelnen speziellen biologischen
Aspekt eines gesuchten komplexen Prozesses aufzeigt. Ein Sepsismarker
soll also einen speziellen Schritt, der spezifisch für eine Sepsis ist, anzeigen
und nicht auf die Gesamtheit eines pathologischen Vorgangs reagieren.
2.6.1. Diagnosestellung und generelle Entzündungs- und
Sepsismarker
Derzeitige mutmaßliche Sepsismarker sind eher als prognostische Marker
anzusehen, die das steigende Risiko der Mortalität wiederspiegeln. Beispiele
hierfür sind IL-1 (Interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10, Tumor-Nekrose-Faktor-α
(TNF-α), C-reaktives Protein (CRP), High-Mobility-Group 1 (HMG-1), Laktat,
Nitric oxide, Elastase und viele weitere. [050]
Im Folgenden werden die wichtigsten Mediatoren kurz vorgestellt.
2.6.1.1. Leukozyten
Die Leukozytenzahl im Blut ist, wie bereits der Definition eines SIRS zu
entnehmen ist, ein allgemeiner Entzündungsmarker.
Aktuelle Daten von A. PFÄFFLIN aus dem Jahr 2009 bestätigten, dass die
Leukozytenzahl und besser noch die Neutrophilenzahl die schnelle Diagnose
einer Entzündung und Infektion unterstützen. [066] Neben einer Entzündung
kann ein Anstieg der Leukozytenzahl auch mit einem akuten Myokardinfarkt
einhergehen. Des Weiteren ist die totale Leukozytenzahl auch mit der
Schwere eines akuten Ereignisses assoziiert. [094]
15
2.6.1.2. C-reaktives Protein (CRP)
CRP, ein Akute-Phase-Protein, gilt ebenfalls als allgemeiner
Entzündungsmarker. Während TNF als Inhibitor der CRP-Expression in der
Leber gilt, induzieren IL-1 und IL-6 die Bildung von CRP in Hepatozyten.
[103] 2006 beschrieben D. G. HAIDER et al., dass CRP auch in peripheren
Monozyten gebildet wird. Durch Lipopolysaccharide (LPS), IL-1, IL-6 und
TNF-α wird hier die Expression von CRP induziert, während IL-10 diese
reduziert. [030] 2005 untersuchten P. PÓVOA et al. kritisch kranke Patienten
auf ihren CRP-Wert und fanden heraus, dass CRP ein besserer Marker für
eine Infektion ist als die Körpertemperatur [069] und ein sensiblerer Marker
für eine Sepsis als Körpertemperatur und Leukozyten. [068] Im Jahr zuvor
veröffentlichten R. SIERRA et al. eine Studie, in der sie CRP als frühen
Indikator einer Infektion bei SIRS-Patienten vorstellten. [083] J. SILVESTRE
et al. erklärten 2009, dass CRP als prognostischer Marker einer Sepsis nicht
geeignet ist, da sie in ihrer Studie keine Korrelation zwischen der CRP-
Konzentration und der Schwere der Sepsis nachweisen konnten. [084]
2.6.1.3. Procalcitonin (PCT)
Empfindlicher scheint Procalcitonin (PCT) auf eine Sepsis anzusprechen. Bei
einem Vergleich 2003 berichteten A. LUZZANI et al., dass PCT eine höhere
Korrelation mit dem Grad der Infektion hat und damit ein besserer Marker für
eine Sepsis ist als CRP. [049] Auch eine Veröffentlichung 2004 von Y. L.
CHAN et al. bestätigte, dass PCT mit der Schwere einer Infektion korreliert.
[016] Ebenfalls 2004 veröffentlichten G. P. CASTELLI et al. ihre Ergebnisse,
in denen sie belegten, dass sowohl CRP als auch PCT empfindlich mit dem
SOFA-Score korrelieren. Aber während CRP bereits bei niedrigen SOFA-
Score-Werten ein Maximum erreichte, lag das Maximum von PCT wesentlich
höher und war somit empfindlicher. [012] Zudem fand man heraus, dass PCT
im septischen Schock früher reagiert als CRP. [018] Aus einer Studie im Jahr
2000 von O. SELBERG et al. ging hervor, dass man anhand von PCT eher
zwischen einer Sepsis und einer SIRS unterscheiden kann, als durch CRP.
[080] Auch eine Meta-Analyse 2006 zeigte, dass PCT dem CRP überlegen
16
war und empfahl diesen Marker zur Aufnahme in die Leitlinien der Sepsis-
Diagnostik. [093]
Dagegen zeigte eine Meta-Analyse im Jahr 2007 aus 18 Studien, dass PCT
mit einer Sensitivität und Spezifität von je 71% und einer gemeinsamen Area
under the Curve (AUC) von 0,78 zwischen einer Sepsis und anderen nicht-
infektiösen SIRS nicht sicher unterscheiden kann. Somit wurde die häufige
Verwendung von PCT-Tests auf Intensivstationen infrage gestellt. [088]
Weitere Mediatoren und Zytokine, die im Plasma septischer Patienten
nachweisbar sind, wurden in der Vergangenheit untersucht. So korrelierten,
neben vielen anderen, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 mit einer Entzündung und
Sepsis.
2.6.1.4. Interleukin-6
Bereits 1987 beschrieben A. WAAGE et al., dass eine hohe Konzentration an
TNF-α mit einer erhöhten Sterblichkeit assoziiert ist. So starben bei der
damaligen Studie, in der das Serum von Meningokokken-Meningitis- und
Sepsis-kranken Patienten untersucht wurde, alle Patienten, bei denen eine
TNF-α-Konzentration über 440 U/ml gemessen wurde. [100] In einer
weiteren Studie 1989 bewiesen A. WAAGE et al., dass neben TNF-α auch
IL-1 und IL-6 in der initialen Phase einer lokalen Meningokokken-induzierten
Entzündungsreaktion produziert werden. [101] In einem Meningokokken-
induzierten septischen Schock zeigten IL-1 und IL-6 als prognostische
Marker eine hohe Sterblichkeit an. [099]
IL-6 ist ein wichtiger Mediator in der Entzündungsreaktion. Das bewiesen
bereits C. E. HACK et al. in ihrer Studie aus dem Jahr 1989, in der sie eine
Korrelation zwischen IL-6 und den Laktat-Werten, Herzfrequenz und
umgekehrt mit MAP und der Thrombozytenzahl nachwiesen. IL-6 war
signifikant erhöht bei Patienten mit einer Sepsis oder septischem Schock.
[029] Im Jahr 2002 verglichen T. HRYNIEWIECKI et al. den Verlauf von IL-6
und CRP bei Patienten mit infektiöser Endokarditis. Dabei stellten sie fest,
dass IL-6 unter antimikrobieller Therapie schneller abfällt als CRP und somit
zum Monitoring besser geeignet ist als CRP. [037] M. E. CECCON et al.
17
untersuchten im Jahr 2006 IL-6 und CRP bei Neugeborenen mit einer late-
onset Sepsis. Eine kombinierte Betrachtung von beiden Markern erfüllte hier
die genaueste Aussagekraft. Dabei ist zu erwähnen, dass IL-6 aber bereits
24 Stunden vor CRP auf eine late-onset Sepsis hinwies. [014] Daraus kann
man schließen, dass IL-6 sowohl früher im Blut nachweisbar, als auch bei
klinischer Besserung des Patienten schneller wieder abfällt und damit als
früherer und zeitnäherer Marker einer Entzündung dem CRP überlegen ist.
O. SELBERG et al. beschrieben im Jahr 2000, dass man sowohl anhand von
PCT, als auch von IL-6 und Protein Komplement 3a eher eine Sepsis von
einem SIRS abgrenzen kann, als durch CRP und die Leukozyten-Elastase.
[080]
2.6.1.5. Der Stellenwert der Entzündungs- und Sepsismarker
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass bereits viele Entzündungs-,
Prognose- und Sepsismarker beschrieben sind. Dennoch ist bisher kein
zuverlässiger Sepsismarker verfügbar. In Bezug auf die Zuverlässigkeit
scheint z.B. die bereits erwähnte immunsuppressive Phase einer
Entzündung und Sepsis zu Problemen zu führen. Der dabei beschriebene
Abfall von inflammatorischen Markern und Mediatoren, wie z.B. IL-6 und
Leukozyten, könnte als mutmaßliche Besserung fehlgedeutet werden und
somit Fehlerquelle in der Interpretation bekannter Entzündungs- und
Sepsismarker sein.
Aus diesen Gründen wird weiterhin versucht, einen geeigneten und
zuverlässigen Sepsismarker zu finden, der eine frühe und sichere Diagnose
bestätigt und damit eine rechtzeitige und richtige Therapie einleitet.
18
2.6.2. Humanes Guanylat-Bindungsprotein-1 (hGBP-1)
Diese Studie evaluiert einen möglicherweise zukünftigen Entzündungs- und
Sepsismarker und untersucht seine Genauigkeit, eine Entzündung und
Sepsis anzuzeigen und ggf. eine Unterscheidung zu ermöglichen. Die
Hoffnung ist, dass Humanes Guanylat-Bindungsprotein-1 (hGBP-1)
spezifisch während einer Entzündung und Sepsis im Blut ansteigt und die
schwer abzugrenzende und vor allem rechtzeitige Diagnose einer Sepsis
stellt.
2.6.2.1. Grundlegende Mechanismen bei Entzündung
Um die Funktion von hGBP-1 erklären können, werden zunächst die
grundlegenden Mechanismen der Endothelzelle während der Entzündung
erläutert.
Die Endothelzelle hat eine wichtige Überwachungsfunktion in vielen
physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. So übernimmt sie
eine zentrale Rolle bei der Regulation der Koagulation, des vasomotorischen
Tonus, des Gefäßmuskelwachstums, der Ischämie und Reperfusion bei
Verletzungen, der Arterioskleroseentstehung und der
Leukozytenextravasation. [082]
Endothelzellen bilden eine Grenzfläche zwischen der Blutbahn und dem
interstitiellen Gewebe. Während einer Entzündung müssen die Leukozyten
aus dem Blut diese endotheliale Barriere überwinden, um ins Gewebe und
damit zum Ort der Entzündung zu gelangen. Die Leukozyten-Extravasation
verläuft in mehreren Schritten. Phase 1 ist das Rolling, Phase 2 die Adhäsion
und Phase 3 die transendotheliale Migration. [072] Um diesen Mechanismus
zu induzieren, muss eine Kaskade von Mediatoren freigesetzt werden. Am
Anfang dieser Kaskade steht die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren,
wie IL-1, Lipopolysaccharide und TNF-α. TNF-α induziert daraufhin
Selektine, die ihrerseits die Leukozyten-Transmigration in ihren Schritten
einleiten. [086]
Entzündungsmediatoren regulieren aber nicht nur die Leukozyten-Adhäsion
am Endothel, sondern führen auch zur Angiogenese. Nach Aktivierung der
19
Signalkaskade führt die Ausschüttung von Wachstumsfaktoren, wie z.B.
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), zur Aktivierung der
Endothelzelle und damit zur Gefäßneubildung. [041] Dies unterstützt die
vermehrte Auswanderung von Leukozyten in das entzündete Gewebe.
Das bedeutet, dass eine Entzündung zur Angiogenese, d.h. zur
Endothelproliferation, und zur Leukozyten-Extravasation führt. Diese beiden
Aktivierungs-Phänotypen einer Endothelzelle werden durch unterschiedliche
Mediatoren zeit- und ortsabhängig koordiniert. [056]
Die potentesten Aktivatoren der Endothelzelle stellen die sogenannten
inflammatorischen Zytokine (IZ) und die angiogenen Wachstumsfaktoren
(AWF) dar. Zu den IZ zählen IL-1β, TNF-α und Interferon-γ (IFN-γ). Zu AWF
zählen VEGF und basic Fibroblast Growth Factor (bFGF). [067]
IZ aktivieren die Endothelzelle zur Leukozyten-Adhäsion [013] und hemmen
deren Proliferation. [023] Im Unterschied dazu aktivieren AWF die
Proliferation [022] und Invasionsfähigkeit von Endothelzellen [021] und
können die Leukozyten-Adhäsion hemmen. [091]
Im Zuge der molekularen Charakterisierung dieses Mechanismus entdeckte
man ein durch IZ induziertes Protein in Endothelzellen, das die
antiangiogenetische Wirkung von IZ vermittelt: hGBP-1.
2.6.2.2. Molekulare Kennzeichen und Eigenschaften der
hGBP-Familie
1979 veröffentlichten S. L. GUPTA et al. die Ergebnisse ihrer Studie über die
Induktion verschiedener Proteine durch Interferone. Dort berichteten sie von
einem interferoninduzierten Protein, dessen Masse 67 kDa beträgt und
beschrieben dabei erstmals das später benannte hGBP-1. [028]
Sowohl α-, β- als auch γ-Interferone induzieren die Bildung von hGBP-1 im
Fibroblasten. Dabei wirkt IFN-γ am stärksten. Darüber hinaus hat hGBP-1 die
Möglichkeit Guanosin-Triphosphat (GTP)-Agarose, Guanosin-Diphosphat
(GDP)-Agarose und Guanosin-Monophosphat (GMP)-Agarose zu binden.
[017] Dieser ungewöhnlichen Eigenschaft verdankt das Protein auch seinen
Namen. Man vermutet, dass die Art und Weise der Bindung einzigartig für
GBP ist. [095]
20
Mittlerweile sind sieben verschiedene humane GBPs mit einem
Molekulargewicht von 67-73 kDa identifiziert (hGBP-1 bis hGBP-7) und elf
GBPs in der Maus, auf die hier nicht weiter eingegangen wird.
Charakterisierend für diese Genfamilien ist die Induktion der Expression
durch verschiedene Interferone. Während in Endothelzellen hGBP-1, hGBP-
2 und hGBP-3 sowohl durch IFN-γ, TNF-α und IL-1β induziert werden, wird
die Expression von hGBP-4 und hGBP-5 lediglich durch IFN-γ aktiviert. [090]
Die Expression von hGBP-6 und hGBP-7 wurde bisher nicht detailliert
untersucht. HGPB-1, hGBP-3 und hGBP-5 werden ausschließlich im
Zytoplasma nachgewiesen.
HGBP-1 ist das am besten untersuchte Protein dieser Familie und
Gegenstand dieser Studie; deshalb wird im Folgenden lediglich hGBP-1
näher erläutert.
2.6.2.3. Funktion von hGBP-1
Aufgrund der Kristallstruktur und biochemischer Experimente ist hGBP-1 der
Gruppe der großen GTP-bindenden Proteine zuzuordnen, so wie auch die
antiviral wirksamen Proteine Mx und Dynamin. Die gemeinsame Eigenschaft
ist die nukleotidabhängige Oligomerisierung und eine
konzentrationsabhängige GTPase-Aktivität. [070] HGBP-1 weist zwei
Domänen auf: Eine langgestreckte C-terminale Domäne, die aus α-Helices
aufgebaut ist, und eine N-terminale globuläre (G-) Domäne, die die GTPase-
Aktivität beinhaltet. [071] M. SCHWEMMLE und P. STAEHELI beschrieben
1994, dass hGBP-1 GTP eher zu GMP als zu GDP hydrolysiert. Diese
Reaktion erfolgt nicht durch die Abspaltung eines Pyro-Phosphat-Moleküls,
sondern durch zwei konsekutive Spaltungen von einzelnen Phosphat-
Molekülen. [078] Die längliche C-terminale Domäne des Proteins besitzt das
CaaX-Motiv, das die posttranslationale Isoprenylation von hGBP-1
ermöglicht. Dabei wird eine C15-Farnesylgruppe oder eine C20-Geranyl-
Geranylgruppe durch eine Thioether-Bindung an das Cystein des CaaX-
Motivs gebunden. [055]
21
Während hGBP-1 in vivo hauptsächlich in vaskulären Endothelzellen gebildet
wird, wird hGBP-1 in vitro in nahezu allen Zellen einschließlich
Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, B-Zellen, T-Zellen und
Monozyten durch IFN-γ induziert. [026]
C. LUBESEDER-MARTELLATO et al. konnten 2002 nachweisen, dass die
Bildung von hGBP-1 in vivo durch IFN-γ, IL-1α, IL-1β und TNF-α induziert
wird. [048]
Bisher ist kein spezifischer Marker verfügbar, der zwischen dem IZ- und
AWF-aktivierten Phänotyp der Endothelzelle unterscheiden kann. 2005
berichteten E. NASCHBERGER et al., dass hGBP-1 selektiv in IZ-aktivierten
Endothelzellen exprimiert wird, so dass möglicherweise die Expression von
hGBP-1 IZ-aktivierte Endothelzellen charakterisieren könnte. [056] Diese
Mechanismen der Expression von hGBP-1 durch IZ konnte 2004 ebenfalls
geklärt werden. Dabei wurde aufgezeigt, dass durch Zusammenwirken eines
Nuclear Factor кB (NF-кB)- binding Motifs und eines IFN-α-Stimulated
Response Elements (ISRE) die Induktion von hGBP-1 durch IL-1β und TNF-
α gesteuert wird. [059]
In zellbiologischen Untersuchungen zur hGBP-1-Wirkung konnte gezeigt
werden, dass hGBP-1 die Proliferation, Invasion und Migration von
Endothelzellen hemmt und somit die antiangiogenetische Wirkung von IZ in
Endothelzellen vermittelt.
M. HAMMON et al. beschrieben 2010, dass hGBP-1 neben der Endothelzelle
auch von Endothelialen Vorläuferzellen (EPC) sezerniert wird. EPC sind
Progenitorzellen von Endothelzellen, die z.B. durch VEGF aus dem
Knochenmark mobilisiert werden und ebenfalls in die Gefäßbildung involviert
sind. HGBP-1 induziert die vorzeitige Differenzierung von unreifen EPC, was
M. HAMMON et al. durch den Nachweis der Hochregulation von fetal liver
kinase 1 (Flk-1), ein Rezeptor von VEGF, und von-Willebrand-Faktor (vWF)
als Marker für die EPC-Ausreifung in hGBP-1-exprimierenden EPC, in ihrer
Studie aufzeigten. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass hGBP-
1 die vaskulogenetische Aktivität von EPC durch Hemmung ihrer Proliferation
und Migration in vitro beeinträchtigt. Anhand eines arteriovenösen-
Gefäßschleifen-Modells an Ratten erhärtete sich ebenfalls der Verdacht,
dass hGBP-1 die Migration von EPC auch in vivo hemmt. [031]
22
Somit kann festgestellt werden, dass die antiangiogenetische Wirkung von
hGBP-1 während einer Entzündung sowohl durch direkte IZ-induzierte
antiangiogenetische Wirkung auf die Endothelzelle und darüber hinaus durch
die Hemmung der VEGF-induzierten vaskulogenetischen Aktivität der EPC
vermittelt wird.
Des Weiteren scheint hGBP-1 auch antiapoptotische Effekte von IFN-α in
Endothelzellen zu regulieren. J. PAMMER et al. untersuchten 2006 die
Unterschiede zwischen einer kurzfristigen und einer kontinuierlichen
Exposition von INF-α auf die Endothelzelle. Dabei beschrieben sie, dass die
kurzfristige Exposition von IFN-α einen antiapoptotischen Effekt hat. Der
begleitenden Induktion von hGBP-1 schrieben sie dabei eine wichtige
Funktion zu. [062]
2.6.2.4. Nachweisbarkeit von hGBP-1
Im Hinblick auf die tumorbedingte Angiogenese und Neovaskularisation
wurde die angiostatische Wirkung von hGBP-1 auch bei Tumorpatienten
untersucht. Bei 32% der kolorektalen Karzinome wurde hGBP-1
nachgewiesen. E. NASCHBERGER et al. publizierten 2008 eine hoch
signifikant höhere 5-Jahres-Überlebensrate von 92,2% bei Patienten mit
hGBP-1-positiven Tumoren. [057]
Des Weiteren wird hGBP-1 eine antivirale Wirkung zugeschrieben. Bereits
1999 veröffentlichten S. L. ANDERSON et al. einen Artikel, in dem
nachgewiesen wurde, dass hGBP-1 einen antiviralen Effekt gegen das
Vesiculare Stomatitis Virus (VSV) und das Enzephalomyokarditis Virus
(EMCV) besitzt. [003]
E. NASCHBERGER et al. wiesen 2006 hGBP-1 in signifikant erhöhten
Konzentrationen im Liquor von Patienten, die an einer bakteriellen Meningitis
litten, nach. Bei 71,9% der erkrankten Patienten war hGBP-1 im Liquor
erhöht und stellte sich als möglicher diagnostischer Marker der bakteriellen
Meningitis dar. [058]
2010 gelang M. HAMMON et al. der Nachweis von hGBP-1 im Blutserum.
Hierbei wurden signifikant erhöhte Konzentrationen von hGBP-1 bei
Patienten mit Autoimmunerkrankungen des rheumatischen Formenkreises,
23
wie rheumatoider Arthritis, systemischer Lupus erythematodes und
systemischer Sklerose, beschrieben. [031]
2.6.2.5. Überlegungen zu diagnostischen und therapeutischen
Möglichkeiten von hGBP-1
Neben der Nachweisbarkeit von hGBP-1 und dem damit verbundenen
besseren Verständnis für physiologische und pathophysiologische Vorgänge
der Adhäsions- und angiogenetischen Fähigkeit der Endothelzelle bietet
hGBP-1 auch Hoffnung zu diagnostischen und therapeutischen
Möglichkeiten.
M. STÜRZL et al. beschrieben 2005 zwei Möglichkeiten des therapeutischen
Einsatzes von hGBP-1. Zum einen ist die therapeutische Antagonisierung
von hGBP-1 zur Verbesserung der Kapillarbildung bei z.B. ischämischen
Zuständen vorstellbar, zum anderen könnte hGBP-1 in der Onkologie zur
Hemmung der Tumorangiogenese einsetzbar sein. [087]
2009 veröffentlichten dazu L. PERSANO et al. ihre Ergebnisse bezüglich der
Wirkung von IFN-α auf die Entwicklung von Prostatakrebs. Im Tiermodel
fanden sie heraus, dass die IFN-α-regulierten Gene hGBP-1, IFI204 und
CXCL10-11 dem ‚angiogenic switch‘ entgegenwirken und die
Tumorzellproliferation beeinträchtigen. Dem Tumorgeschehen wird auf diese
Weise entgegengesteuert. Da bei 40% der humanen Prostatatumore die IFN-
α-induzierten Proteine hGBP-1 und Myxovirus Resistance A nachgewiesen
wurden, gaben L. PERSANO et al. somit Anstoß zu Überlegungen in Hinsicht
auf die Chemoprävention von Prostatakrebs. [065]
Aufgrund verschiedener Hinweise besteht auch die Möglichkeit, dass hGBP-
1 als Entzündungs- und Sepsismarker geeignet sein kann.
Ein dafür wichtiges Kriterium ist die hGBP-1-Nachweisbarkeit im Blut. Dies
scheint durch die Tatsache, dass hGBP-1 von der Endothelzelle
ausgeschüttet wird, gegeben. Wie bereits erwähnt, konnten M. HAMMON et
al. 2010 hGBP-1 bereits in Serum nachweisen und beschreiben nach
genauer Untersuchung den zugrundeliegenden Mechanismus, der zu
signifikant erhöhten Konzentrationen dieses Proteins bei
Autoimmunerkrankungen führt. Des Weiteren erklärt diese Veröffentlichung
24
die Beobachtung der bekannten eingeschränkten Funktion von EPC bei
chronisch entzündlichen Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis,
systemischer Lupus erythematodes und systemischer Sklerose. AWF, wie
z.B. VEGF und IZ sind bei Autoimmunerkrankungen erhöht im Blut
nachweisbar. VEGF führt über Freisetzung von EPC aus dem Knochenmark
zur entzündungsbedingten Vaskulogenese und EPC sezerniert vermehrt
hGBP-1. IZ aktiviert, wie oben bereits beschrieben, die Endothelzelle, Die
Endothelzelle induziert und sezerniert ebenfalls hGBP-1. Durch die hGBP-1-
spezifische Hemmung der EPC-Migration und Proliferation, Invasion und
Migration der Endothelzelle wird die antiangiogenetische Wirkung bedingt. In
diesem Zusammenhang könnte dieser Mechanismus auch an bekannten
kardiovaskulären Dispositionen bei Patienten mit autoimmunentzündlichen
Erkrankungen beteiligt sein. [031]
Der offensichtlichste Grund dafür, dass hGBP-1 als Entzündungs- und
Sepsismarker denkbar ist, liegt somit in der starken Ausschüttung von IZ im
septischen Zustand. Diese erhöhten Konzentrationen an
Entzündungsmediatoren führen entsprechend zu einer vermehrten Bildung
von hGBP-1.
Neben IZ und AWF wird während einer Sepsis auch vermehrt Thrombin
gebildet. Thrombin führt unter anderem zur verstärkten Leukozytenadhäsion.
Diese wird durch die IZ-aktivierte Endothelzelle reguliert. So kommt es durch
die IZ-spezifisch aktivierte Endothelzelle zur verstärkten hGBP-1-Expression.
Ein weiterer Grund dafür, dass hGBP-1 eine Sepsis anzeigen kann, liegt in
der endothelialen Dysfunktion während einer Sepsis. G. C. BECK et al.
beschrieben 2007, dass es aufgrund von Schwellung, Deformierung und
Apoptose der Endothelzelle zur teilweisen Ablösung von der Basalmembran
und damit zur Zirkulation der Endothelzelle im Blut kommt. Diese Schädigung
führt zur Freisetzung endothelialer Abbauprodukte,
Mikrozirkulationsstörungen und Reparaturprozessen. Dazu gehört die
vermehrte Freisetzung von EPC und Endothelzellen aus dem Knochenmark.
[004]
Diese starke Präsenz endothelialer Abbauprodukte, EPC und Endothelzellen
bei Sepsis, wie durch G. C. BECK et al. beschrieben, lässt, basierend auf der
oben bereits aufgeführten Veröffentlichung von M. HAMMON et al., aufgrund
25
des vermehrten Vorhandenseins an hGBP-1-exprimierenden Zellen auch
eine gesteigerte Freisetzung von hGBP-1 vermuten. [004] [031]
2.7. Zielsetzung
Während hGBP-1 nun in Endothelzellen verschiedenster Gewebe, in
Tumoren, in EPC, in erkrankter Haut, im Liquor und im Serum nachgewiesen
wurde, stellte sich die Frage, ob hGBP-1 auch in dieser Studie im Blut
nachweisbar ist. Aufgrund der vorangegangenen Veröffentlichungen
zellbiologischer Untersuchungen sollte eine Messbarkeit von hGBP-1 im
Serum von Patienten mit Entzündungszeichen möglich sein.
Durch die bereits oben aufgeführten Argumente schien auch eine
Nachweisbarkeit von hGBP-1 insbesondere während einer Sepsis denkbar.
In dieser Studie wurden die hGBP-1-Konzentrationen im Serum von 37
Patienten mit Sepsis bestimmt. Dabei wurde untersucht, ob die
Serumkonzentrationen von hGBP-1 mit dem Entzündungsgrad korrelieren.
Diese Studie befasste sich mit der möglichen Nachweisbarkeit von hGBP-1
im Serum und dessen mögliche Schwankungen bei unterschiedlichen
immunologischen Reaktionszuständen des Körpers.
Dabei wurde hGBP-1 als Sepsis- bzw. Entzündungsmarker anhand
diagnostischer Tests und Ermittlung deren Güte evaluiert.
Darüber hinaus wurden die hGBP-1-Werte mit anderen Entzündungsmarkern
bei gleichem Blutentnahmezeitpunkt verglichen. Dazu wurden Leukozyten,
CRP, Procalcitonin und IL-6 herangezogen und mit hGBP-1 in eine mögliche
Korrelation gesetzt.
26
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1. Das Studienkollektiv
Es wurde ein Studienkollektiv von 37 Patienten untersucht, darunter 20
Männer und 17 Frauen. Zum Zeitpunkt der Untersuchung waren die
Patienten 18 bis 79 Jahre alt. Das mediane Lebensalter des Kollektivs betrug
63 Jahre und das mittlere Lebensalter 61 Jahre.
3.1.1. Das Patientenkollektiv
Bei jedem Studienteilnehmer wurden Blutabnahmen zu unterschiedlichen
Zeitpunkten durchgeführt und die Konzentration von hGBP-1 gemessen,
sowie mit den bereits etablierten Entzündungsmarkern Leukozyten, CRP und
IL-6 verglichen und korreliert. Bei septischen Patienten wurde zusätzlich
noch Procalcitonin im Serum mitbestimmt.
Alle Parameter wurden jeweils zum gleichen Zeitpunkt gemessen. Im
gesamten Studienkollektiv konnten insgesamt 90 Blutentnahmen gewonnen
werden.
Der Ablauf der Probenentnahme erfolgte im Zeitraum vom 31.01.2007 bis
30.06.2008. Die Blutentnahme umfasste bei jedem Patienten drei
Blutentnahmeröhrchen. Jeweils ein Röhrchen für das Blutbild und ein
Röhrchen für Blutserum wurden zur Auswertung ins Routinelabor der
Chirurgischen Universitätsklinik Erlangen gebracht. Das dort gemessene
CRP, die Zahl der Leukozyten und ggf. Procalcitonin (bei septischen
Patienten) galten zusammen mit IL-6 als Vergleichswerte zu hGBP-1. Das
dritte Serumröhrchen, das dem Patienten abgenommen wurde, diente zur IL-
6- und hGBP-1-Messung. Während Leukozyten, CRP und Procalcitonin vom
Routinelabor gemessen wurden, wurden die Werte für hGBP-1 und IL-6
eigens für diese Studie mittels Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent
Assay (Sandwich-ELISA) in der Abteilung für Molekulare und Experimentelle
Chirurgie ermittelt. Dieses zusätzliche Serumröhrchen wurde zeitnah bei
1800 rpm zentrifugiert und der Überstand bis zur Messung von IL-6 und
27
hGBP-1 bei minus 80 °C eingefroren. Zu den einzelnen Messungen wurde
dieses Serumröhrchen ein- bis maximal zweimal aufgetaut.
Zur Evaluation von hGBP-1 wurde versucht, zu möglichst vielen Zeitpunkten
in unterschiedlichen Entzündungszuständen Entzündungsparameter zu
messen. Aus diesem Grund wurde das Patientenkollektiv in zwei
Studienarme gegliedert.
Der eine Studienarm umfasste elf Patienten. Sie unterlagen zum Zeitpunkt
der Blutentnahme einem septischen Zustand und galten in dieser Studie als
Patientengruppe mit den höchsten Entzündungswerten.
26 Patienten wurden während ihres stationären Aufenthalts im Krankenhaus
zu Studienzwecken begleitet und bildeten den zweiten Studienarm. Als
Patienten einer Allgemein-Chirurgischen Station wurde ihnen vor und an
unterschiedlichen Tagen nach ihrer jeweiligen Operation Blut entnommen
und ausgewertet. Dies ermöglichte einen direkten Vergleich zwischen
Werten eines Patienten vor der Operation ohne Entzündungszustand mit
Werten desselben Patienten nach einer Operation im entzündeten Zustand.
Keiner dieser Patienten litt während des Beobachtungszeitraums und der
Blutentnahmen unter einer Sepsis. So ließen sich diese Werte einer
Entzündung auch mit den Werten septischer Patienten des anderen
Studienarms vergleichen.
Als weitere Studienuntergruppe wurden die Patienten mit Entzündung
zusammengefasst. Dabei wurden alle Blutseren eingeschlossen, die
entweder post operationem oder septisch waren. Das bedeutet, es wurde
hier nicht unterschieden, wie stark die Entzündung war. Es wurden lediglich
die Seren ausgeschlossen, die prae operationem waren und keine erhöhten
Entzündungswerte aufwiesen.
Im Weiteren werden die Studienarme näher beschrieben.
28
3.1.2. Der Studienarm: Sepsis-Patienten
Abb. 2: Der Studienarm: Sepsis-Patienten (grün markiert)
In den Studienarm der septischen Patienten waren elf Patienten
eingeschlossen (Abb. 2). Bei acht Patienten wurde eine einmalige
Blutentnahme für die Studie entnommen, bei einem Sepsis-Patienten wurde
an zwei Tagen Blut entnommen und bei zwei Patienten konnten drei
Blutentnahmen an drei aufeinander folgenden Tagen gewonnen werden.
Somit ergaben sich insgesamt 16 verwertbare Blutwerte im Studienarm der
Sepsis-Patienten (Abb. 3).
29
Abb. 3: Überblick über die Blutentnahmen der Sepsis-Patienten
Die Ursachen und Verläufe der septischen Zustände der einzelnen Patienten
werden im Folgenden kurz zusammengefasst:
Neun Patienten litten unter einer Sepsis aufgrund einer Peritonitis bei einer
Hohlorganperforation. Einer dieser Patienten entwickelte dabei eine
Pneumonie mit respiratorischer Insuffizienz.
Ein Patient war an einer Staphylokokkensepsis erkrankt. Ursächlich dafür
war eine akute Ischämie des rechten Beines mit Nekrose bei einer
peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK IV).
In die Studie mit aufgenommen wurde auch ein Patient, der aufgrund einer
Polytraumatisierung nach Verkehrsunfall ein septisches Multiorganversagen
ausgebildet hat.
30
3.1.3. Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten
Abb. 4: Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten (rot markiert)
Der Studienarm der Nicht-Sepsis Patienten umfasste 26 Patienten (Abb. 4).
Zu Studienzwecken konnten bei vier Patienten jeweils vier Blutentnahmen
entnommen werden. Bei 14 Patienten wurden drei Blutentnahmen und bei
acht Patienten zwei Blutentnahmen im Beobachtungszeitraum durchgeführt
(Abb. 5).
Abb. 5: Überblick über die Blutentnahmen der Nicht-Sepsis-Patienten
31
Somit wurden insgesamt 74 Blutentnahmen von diesem Patientenarm in die
Studie eingeschlossen. 24 Blutentnahmen wurden vor der Operation
abgenommen, 50 Blutentnahmen nach der Operation. Darunter fanden 23
Entnahmen am ersten Tag nach der Operation statt, eine am zweiten Tag
post operationem, 14 Entnahmen erfolgten am dritten Tag, eine am vierten
Tag, am Tag 5 waren es neun Blutentnahmen und am postoperativen Tag 6
und 7 war es jeweils eine Blutentnahme (Abb. 6).
Abb. 6: Überblick über die Blutentnahmezeitpunkte der Nicht-Sepsis-Patienten
Der Grund für den stationären Aufenthalt der 26 Patienten dieses
Studienarms auf einer Allgemein-Chirurgischen Station und damit auch
Anlass für ihre jeweilige Operation war bei sechs Patienten eine benigne
Erkrankung und bei 20 Patienten ein Malignom. Keiner der Patienten litt an
Autoimmun- oder anderen chronisch-entzündlichen Erkrankungen.
Divertikulitis, Pankreatitis, peptische Ösophagusstenose, benigner
Magenwandtumor, parastomale Hernie und Hämorrhoiden waren die
benignen Erkrankungen der sechs Patienten.
Von den 20 Patienten, die von malignen Krankheiten betroffen waren, litten
fünf an einem Rektumkarzinom, ein Patient hiervon wurde zur
Unterlappenresektion bei Lungenmetastasen eines bereits voroperierten und
primär hepatisch metastasierten Rektumkarzinoms aufgenommen.
32
Weitere fünf Patienten wiesen ein Kolonkarzinom auf, davon war ein Patient
von einem Siegelringzellkarzinom des Zökums betroffen. Vier Patienten
waren an einem Sigma-Adenokarzinom erkrankt, davon ein Patient mit
einem Sigma-Frühkarzinom. Bei drei Patienten wurde ein Adenokarzinom
des Magens diagnostiziert, darunter ein Patient mit fortgeschrittenem, wenig
differenzierten und hepatisch sowie peritoneal metastasierenden
Magenkorpuskarzinom, einer mit einem Antrumkarzinom (T2,N0,M0) und ein
Patient mit einem Magenfrühkarzinom. Je ein Patient litt unter einem
Pankreas-Adenokarzinom, einem verhornten Ösophagus-
Plattenepithelkarzinom und einem Ovarial-Adenokarzinom.
Des Weiteren wiesen sechs der Tumorpatienten Lymphknotenmetastasen
auf, ein Patient eine solitäre Lebermetastase und vier Patienten befanden
sich im fortgeschrittenen Zustand einer Tumorerkrankung mit Lymphknoten-
und Fernmetastasen.
Zu erwähnen ist, dass vier Patienten vor ihrer Operation eine neoadjuvante
Radiochemotherapie erhielten. Darunter war ein Patient, der wegen einer
Lungenmetastase in Behandlung war, zur Behandlung des primären Tumors
aber ebenfalls eine Radiochemotherapie erhielt. Ein Patient unterzog sich
einer neoadjuvanten Chemotherapie und ein Patient erhielt in seiner
Vergangenheit schon eine Radiotherapie.
Eine Chemobehandlung kann im Blutbild zu falsch-niedrigen
Leukozytenzahlen führen und somit die Ergebnisse dieser Studie
möglicherweise beeinträchtigen. Um eine derartige Verfälschung des
Blutbildes der Studienteilnehmer sicher auszuschließen, wurden keine
Patienten in die Studie eingeschlossen, deren Chemotherapie weniger als
sechs Wochen zurücklag.
33
3.1.4. Die Studienuntergruppe: Patienten mit Entzündung
Abb. 7: Die Studienuntergruppe: Patienten mit Entzündung (blau markiert)
Eine Untergruppe der Studienarme stellten die Patienten mit Entzündung dar
(Abb. 7). In dieser Gruppe wurden alle Blutseren der Patienten
eingeschlossen, die sich zum Zeitpunkt der Blutentnahme in einem
entzündeten Zustand befanden. Dabei wurde nicht unterschieden, wie stark
die Entzündung war und beinhaltete somit alle post operationem-Seren und
auch die septischen Blutseren. Die Seren von prae operationem wurden
ausgeschlossen.
So umfasste diese Untergruppe 66 Blutentnahmen.
34
3.2. Die Methode zur IL-6- und hGBP-1-Messung:
Der Sandwich-ELISA
Um die Serumproben der Studienpatienten auf ihren IL-6- und hGBP-1-
Gehalt zu messen, wurde der Sandwich-ELISA verwendet.
3.2.1. Das allgemeine Prinzip des Sandwich-ELISA
Ein ELISA ermöglicht den Nachweis verschiedenster Antikörper und
Antigene. 1971 veröffentlichten E. ENGVALL und P. PERLMANN erstmals
einen Artikel zur quantitativen Messung von IgG in Hasenserum mittels
ELISA. Im selben Jahr publizierten B. VAN WEEMEN und A. SCHUURS ihre
Arbeiten am Enzyme Immunoassay (EIA). Während beim damals bereits
bekannten Radioimmunoassay (RIA) Antigene radioaktiv markiert werden
mussten, kann die zu suchende Substanz beim ELISA mittels einer nicht-
radioaktiven Enzymreaktion sichtbar gemacht werden. [045]
Verschiedene Varianten der ELISA-Methode ermöglichen einen quantitativen
Nachweis spezifischer Antikörper und Antigene. Im Folgenden wird lediglich
auf den Sandwich-ELISA näher eingegangen. Der Sandwich-ELISA ist auch
die Methode der IL-6- und hGBP-1-Messung dieser Studie.
Die Idee eines ELISAs besteht darin, eine
gesuchte Substanz durch eine messbare
Farbreaktion zu quantifizieren. Beim Sandwich-
ELISA wird die zu suchende Substanz
(Antigen) an zwei Antikörper gebunden, welche
unterschiedliche Epitope des Antigens binden.
Der eine Antikörper ist an einer soliden
Unterfläche fixiert (1) und dient dazu, das
Antigen zu fixieren und vom Serum zu trennen
(2).
Ein zweiter Antikörper, der an ein Enzym
gekoppelt ist, bindet an ein weiteres Epitop des
bereits fixierten Antigens. Dabei ist es möglich
noch einen weiteren Antikörper zwischen den
Abb. 8: Das Prinzip des
Sandwich-ELISA
(2)
(1)
35
am Antigen fixierten und dem am Enzym
gekoppelten Antikörper zu schalten (3). Dies
erhöht die Spezifität, ist aber für einen
Sandwich-ELISA nicht unbedingt notwendig.
Nachdem man den Ansatz gereinigt hat und
nur noch die fixierte antikörperbeladene
Substanz zurückbleibt, wird nun das passende
Substrat zum gebundenen Enzym gegeben
und so eine Reaktion eingeleitet (4). Diese
Reaktion bedingt einen Farbumschlag, der
proportional zur gebundenen Antikörpermenge
und damit proportional zur gesuchten
Substanzmenge ist. [098]
Durch das Mitführen eines Standards, dessen
Konzentration bekannt ist, gibt der messbare
Farbumschlag eine quantitative Möglichkeit
an, die Menge der gesuchten Substanz
berechnen zu können.
Da für diese Studie sowohl die hGBP-1- als auch die IL-6-Messung nach
dem Prinzip des Sandwich-ELISA durchgeführt wurde, wird im Folgenden auf
die genaue Beschreibung der hGBP-1- und IL-6-Messung der Studie
eingegangen.
3.2.2. Die hGBP-1-Messung mittels Sandwich-ELISA
E. NASCHBERGER et al. wiesen hGBP-1 2006 mittels eines eigens dafür
entwickelten ELISA‘s im Liquor nach [058]. Damit wurde eine Methode
gefunden, hGBP-1 möglicherweise auch im Serum nachzuweisen.
Die bei der Testung verwendete Platte der Firma Nunc hat 96 Vertiefungen
(Wells) für die einzelnen Serumproben und den mitzuführenden Standard.
Zunächst muss die Platte beschichtet werden. Das bedeutet, dass am Boden
jeder Vertiefung in der Platte Antikörper fixiert werden, die später das zu
suchende hGBP-1 im Serum der Patienten binden. Zum Beschichten erstellt
man eine Lösung des Antikörpers 1B1 [gereinigter Ratten anti-GBP-1
(3)
(4)
36
monoklonaler Antikörper (mAB) [058] ] in einer Konzentration von 1 µg/ml in
1 x PBS (Phosphat Buffered Saline) und befüllt die Reaktionsschalen mit je
100 µl. Die Platte wird dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen
gelassen.
Anschließend wird der Standard hergestellt. Dazu wird gereinigtes
rekombinantes His-getaggtes GBP-1 in PBS-1% Skim Milk (Fa. Neuform) mit
Normalserum (Fa. Sigma) in folgenden Konzentrationen hergestellt: 100
ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml, 1,5625 ng/ml,
0 ng/ml. Je 100 µl der Lösungen werden in die Reaktionsschalen gegeben
und bis zum Beginn der Messung auf Eis aufbewahrt.
Bevor die bei -80°C tiefgefrorenen Patientenproben getestet werden, müssen
auch diese aufbereitet werden. Nach dem Auftauen wird jede Serumprobe im
Verhältnis 1:8 mit PBS-1% Skim Milk (Fa. Neuform) verdünnt und auf Eis bis
zur Testung aufbewahrt.
Die beschichtete Platte wird einmal mit 1 x PBS-0.1% Tween (Fa. Sigma)
gewaschen und anschließend wird die Waschlösung ausgeklopft.
Vor der Testung wird die Platte nun noch blockiert. Dazu wird eine
Blockierungslösung aus 1% Skim Milk (Fa. Neuform) und 1 x PBS hergestellt
und jeweils 100 µl davon in die Plattenvertiefungen pipettiert.
Nach einer 30-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird die
Blockierungslösung entfernt.
Nun kann das Patientenserum in die Reaktionsschalen geben werden.
Jeweils 100 µl der Proben- und Standardlösungen werden in Triplikaten in
die Reaktionsschalen pipettiert und für 2 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert. Dabei kann hGBP-1 des Serums an die Antikörper, die zu Beginn
am Boden beschichtet wurden, binden.
Nach der Inkubationszeit wird die Platte viermal mit 1 x PBS-0.1% Tween
(Fa. Sigma) gewaschen. Nun werden die Detektions-Antikörper in die Lösung
gegeben. Dazu verwendet man polyklonale anti-GBP-Antikörper #1 und #3,
die jeweils im Verhältnis 1:2500 mit 1% Skim Milk (Fa. Neuform) und 1 x
PBS-0.1% Tween (Fa. Sigma) vermischt werden. Aus diesem Ansatz gibt
man je 100 µl in die einzelnen Wells der Platte.
Nach einer zweistündigen Inkubationszeit und den darauf folgenden vier
Waschvorgängen mit 1 x PBS-0.1% Tween (Fa. Sigma) wird dem
37
Probenmaterial das Detektionsenzym, eine alkalische Phosphatase (AP),
zugefügt. Die Bindung an den Detektions-Antikörper erfolgt mittels eines am
Enzym fixierten Antikörpers IgG. Das AP-Ziege anti-Kaninchen Conjugate
(Fa. Zymed) vermischt man im Verhältnis 1:2000 mit 1% Skim Milk (Fa.
Neuform) und 1 x PBS-0.1% Tween (Fa. Sigma) und gibt je 100 µl in die
Wells. Während einer Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur
bindet das Detektionsenzym nun an die polyklonalen anti-GBP-Antikörper #1
und #3.
Nach der Inkubationszeit wird die Platte viermal mit 1 x PBS-0.1% Tween
(Fa. Sigma) gewaschen.
Das zum Enzym passende Substrat wird als -20°C tiefgefrorene Tablette (20
mg) in 20 ml Substratpuffer (1M Diethanolamine und 0.5 mM MgCl2) (Fa.
Sigma) gelöst. Als Substrat dient 4-Nitrophenylphosphate-disodium-salt-
hexahydrate und fungiert als Indikator, der, nachdem er mit dem Enzym
reagiert, später gemessen werden kann. Jeweils 100 µl werden in die
Ansätze gegeben.
Die Platte wird nun für eine Stunde lichtgeschützt bei Raumtemperatur
inkubiert. In dieser Zeit bindet das Substrat an das Enzym und wird
verstoffwechselt. Da es als Indikator dient, kann die optische Dichte der
einzelnen Ansätze nun bei 405 nm im ELISA-Reader gemessen werden.
Da der ELISA-Reader die Lichtdurchlässigkeit misst, nicht aber die
Konzentration von hGBP-1 im Serum, müssen die einzelnen
Probenkonzentrationen mittels eines Abgleiches mit der Standardkurve
errechnet werden. Die Standardkurve ergibt sich aus den mitgeführten
Standardproben und steigt bei Auftrag von kaltem Substrat generell nach
einer Stunde von einer optischen Dichte405nm~0.3 (Hintergrund) bis zu einer
optischen Dichte405nm~1.2 für 100 ng/ml hGBP-1.
Anhand dieser Standardkurve können die hGBP-1-Konzentrationen der
einzelnen Patientenseren errechnet und für statistische Auswertungen
weiterverwendet werden. [058]
38
3.2.3. Die IL-6-Messung mittels Sandwich-ELISA
Zur quantitativen Messung von IL-6 wurde der Quantikine® Human IL-6
Immunoassay der Firma R&D Systems verwendet.
Während bei der hGBP-1-Messung die 96 Wells einer Platte noch eigens
gecoatet werden mussten, kann bei der IL-6-Messung auf eine bereits
gecoatete Platte der Firma R&D Systems zurückgegriffen werden.
Bevor die eigentliche Messung beginnt, müssen auch hier einige
Vorbereitungen getroffen werden. So werden die bei -80°C tiefgefrorenen
Patientenseren aufgetaut und die Standardlösungen ähnlich wie bei der
hGBP-1-Messung in unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die IL-6-
Standardlösung mit einer Konzentration von 300 pg/ml wird verdünnt und so
entstehen für die IL-6-Messung folgende Standardkonzentrationen: 300
pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml, 6,25 pg/ml, 3,12 pg/ml und
0 pg/ml.
Die 96 Wells werden nun mit je 100 µl Assay Diluent RD1W, einer
Verdünnungslösung der Firma R&D Systems, befüllt. Diese Lösung enthält
Proteine, die die Platte und damit den ELISA aktivieren. Zusätzlich werden
jeweils 100 µl der Patientenproben und der Standardlösungen in die Wells
pipettiert und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser
Inkubationszeit kann das IL-6 der einzelnen Proben an die Antikörper, die am
Boden der gecoateten Wells fixiert sind, binden. Danach werden die
ungebundenen Interleukine durch vier Wasch- und Absaugvorgänge mit
jeweils 400 µl Diluted Wash Buffer (Fa. R&D Systems) und anschließendem
Ausklopfen aus den Wells entfernt.
Nun werden 200 µl IL-6 Conjugate (Fa. R&D Systems) in jeden Ansatz
zugegeben. Dieses IL-6 Conjugate enthält polyklonale IL-6-Antikörper, an
denen ein Enzym gekoppelt ist. Als Enzym diente hier eine Horseradish
Peroxidase (Fa. R&D Systems). Zwei Stunden Inkubationszeit bei
Raumtemperatur ermöglicht der Konjugatlösung an das bereits fixierte IL-6 in
den Wells zu binden. Danach wird das überschüssige Antikörper-Enzym-
Gemisch wie im Schritt zuvor durch ebenfalls vier Wasch- und
Absaugvorgänge mit jeweils 400 µl Diluted Wash Buffer (Fa. R&D Systems)
und anschließendem Ausklopfen aus den Wells entfernt.
39
Als Substrat des Enzyms wird Substrate Solution (Fa. R&D Systems)
verwendet; darin enthalten sind stabiles Wasserstoffperoxid und Chromogen
(Tetramethylbenzidine). Nachdem 200 µl Substrate Solution in jedes Well
pipettiert werden, wird die Platte bei Raumtemperatur und lichtgeschützt für
20 Minuten inkubiert.
Die dabei enzymatische Umsetzung von Wasserstoffperoxid und Chromogen
wird durch den Zusatz von 50 µl Schwefelsäure-enthaltenden Stop Solution
(Fa. R&D Systems) gestoppt.
Mittels photometrischer Bestimmung der Farbintensität bei 450 nm
Wellenlänge kann die Konzentration von IL-6, die sich proportional zur
Farbintensität verhält, ermittelt werden. Da optische Fehler der Platte die
Ergebnisse fälschlicherweise erhöhen, wird die optische Dichte bei 450 nm
durch eine Wellenlängenkorrektur nachbearbeitet. Die Wellenlängenkorrektur
umfasst die Subtraktion der optischen Dichte von 570 nm Wellenlänge vom
Ergebnis der optischen Dichte bei 450 nm Wellenlänge.
Wie bereits bei der hGBP-1-Messung werden die exakten IL-6-
Konzentrationen anhand eines Abgleiches der Extinktion mit der
Standardkurve ermittelt. Die genaue Berechnung der Konzentrationen wird
im Folgenden dargestellt.
3.2.4. Die Kalkulation der ELISA-Ergebnisse
Zur Kalkulation der ELISA-Ergebnisse wurde die Computersoftware Microsoft
Office Excel von Microsoft Corporation verwendet.
Als Ergebnis der ELISA-Messung erhielt man zunächst die optische Dichte
der einzelnen Proben, die mittels ELISA-Reader erfasst wurden. Wurden die
Patientenseren in Triplikaten pipettiert, wie es bei der hGBP-1-Messung der
Fall war, so musste zunächst der Mittelwert errechnet werden. Die Messung
in Triplikaten und der daraus resultierenden Mittelwerte erhöhte die
Genauigkeit der Testung, da dadurch eventuelle Messungenauigkeiten
ausgeglichen oder gravierende Messfehler entdeckt wurden. Neben dem
Mittelwert wurde auch die Standardabweichung berechnet, die eine Aussage
über die Normalverteilung der Werte trifft.
40
Durch Mitführen des Standards bei der Messung konnte anhand der
bekannten Konzentrationen des Standards und den resultierenden optischen
Dichten eine messspezifische Standardkurve erstellt werden. Bei der hGBP-
1-Messung wurden folgende Standardkonzentrationen verwendet: 100 ng/ml,
50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml, 1,5625 ng/ml, 0
ng/ml. Bei der IL-6-Messung: 300 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5
pg/ml, 6,25 pg/ml, 3,12 pg/ml und 0 pg/ml. Zusammen mit der jeweiligen
optischen Dichte erhielt man so messspezifische Wertepaare (X, Y).
Anhand dieser Wertepaare (X, Y) und ihrer grafischen Darstellung konnte ein
lineares Modell vermutet werden. Die allgemeine Formel der gesuchten
Regressionsfunktion lautet:
Formel 1: Regressionsfunktion
Regressionsfunktionen sind Geraden und sollen die Daten bestmöglichst
repräsentieren. X ist das unabhängige Merkmal und wurde in dieser Studie
definiert entweder als hGBP-1- oder IL-6-Wert. Y stellt das abhängige
Merkmal, hier die optische Dichte, dar. Die entsprechenden Parameter α und
β wurden von der Software nach der Methode der kleinsten Quadrate
bestimmt. α beschreibt die Regressionskonstante und β gibt als
Regressionskoeffizient die Steigung der Regressionsgeraden an.
Zur Prüfung der Güte der Regressionsgeraden wurde das Bestimmtheitsmaß
r² herangezogen. Dieses sagt aus, welcher Anteil der Varianz s des
abhängigen Merkmals (Y) durch das lineare Modell erklärt wird:
Formel 2: Bestimmtheitsmaß
41
r² nimmt Werte zwischen 0 und 1 an. Während ein Wert von r² = 0 als
statistische Unabhängigkeit und damit als Unkorreliertheit gilt, stellt r² = 1
eine vollständige lineare Abhängigkeit dar. Das bedeutet, dass r² die Stärke
der linearen Beziehung misst und möglichst nahe 1 liegen soll. [097]
Nachdem nun die spezifische Regressionsfunktion ermittelt wurde, konnten
die optischen Dichten der Patientenseren in die Funktion eingesetzt und die
genaue Konzentration von hGBP-1 oder IL-6 der einzelnen Seren berechnet
werden.
Im Folgenden wird die Auswertung eines hGBP-1-ELISAs exemplarisch
dargestellt.
Zunächst wurden die optischen Dichten des ELISA-Readers in eine Excel-
Tabelle übernommen. Der Übersichtlichkeit halber wurde die Anordnung
entsprechend der Reihenfolge auf der Messplatte gewählt. Da die hGBP-1-
Messung in Triplikaten gemessen wurde, entsprechen drei
nebeneinanderliegende Kästchen dem Triplikat einer Probe. Die ersten drei
Spalten entsprechen den Standardproben.
Tabelle 1: Optische Dichte der Triplikate
Optische Dichte der Triplikate 0,958 0,926 0,942 0,077 0,395 0,408 0,404 0,387 0,38 0,049 0,053 0,0520,681 0,698 0,666 0,076 0,369 0,38 0,394 0,391 0,38 0,047 0,045 0,0470,573 0,574 0,519 0,075 0,395 0,391 0,392 0,395 0,386 0,045 0,05 0,050,544 0,51 0,492 0,098 0,34 0,353 0,406 0,393 0,416 0,048 0,049 0,050,551 0,493 0,462 0,102 0,386 0,398 0,498 0,46 0,528 0,045 0,049 0,0480,531 0,467 0,462 0,078 0,404 0,416 0,415 0,405 0,393 0,05 0,051 0,0480,511 0,467 0,468 0,079 0,416 0,433 0,41 0,389 0,376 0,04 0,042 0,0450,511 0,449 0,489 0,081 0,44 0,434 0,474 0,445 0,455 0,046 0,056 0,046
Aus den optischen Dichten des Standards wurden die Mittelwerte und deren
Standardabweichungen berechnet. Da die Konzentrationen dieser Proben
bekannt waren, wurden sie den entsprechenden optischen Dichten
zugeordnet.
42
Tabelle 2: Optische Dichte der Standardproben
Standard100 0,942 0,016
50 0,681666667 0,01601041325 0,555333333 0,031469562
12,5 0,515333333 0,026407076,25 0,502 0,045177428
3,125 0,486666667 0,03847511,5625 0,482 0,025119713
0 0,483 0,031432467Konzentration (ng/ml)
Mittelwert Standard-abweichung
Als nächstes erstellte das Softwareprogramm aus den Ergebnissen der
Standardproben die Regressionsgerade und berechnete deren Funktion.
Dabei ist X definiert als hGBP-1-Wert und Y als optische Dichte. Die
Regressionskonstante α und der Regressionskoeffizient β wurden von der
Software anhand der Methode der kleinsten Quadrate berechnet.
Das Bestimmtheitsmaß r² lag hier mit einem Wert von 0,9909 sehr nahe 1
und beweist damit eine starke lineare Abhängigkeit der beiden Parameter
hGBP-1 und optische Dichte.
Des Weiteren waren auch die Standardabweichungen in die Darstellung der
Regressionsgeraden eingetragen. So ermöglichte das Diagramm einen
schnellen Überblick über die wesentlichen Variablen dieser Messreihe.
Abb. 9: Regressionsgerade der Standardproben
43
Durch Einsetzen der optischen Dichten der einzelnen Patientenseren in die
ermittelte spezifische Regressionsfunktion
Formel 3: Studienspezifische Regressionsfunktion
konnten die genauen Konzentrationen von hGBP-1 der einzelnen Seren
berechnet werden. Die Endkonzentrationen wurden noch mit acht
multipliziert, da die Proben zuvor im Verhältnis 1:8 verdünnt worden waren
(siehe Kapitel 3.2.2.). Ergebnisse mit negativem Vorzeichen bedeuten, dass
kein Nachweis von hGBP-1 möglich war. In dieser Messung war demnach
hGBP-1 lediglich in einem Patientenserum positiv.
Tabelle 3: Optische Dichte und Ergebnisse der Messreihe 1 vom 23.12.2008
Proben0,4015 0,009192388 -14,19565217 -0,325011071 -113,5652174 -2,6000885660,3745 0,007778175 -20,06521739 -0,416744363 -160,5217391 -3,3339549080,393 0,002828427 -16,04347826 -0,115465163 -128,3478261 -0,923721305
0,3465 0,009192388 -26,15217391 -0,693797789 -209,2173913 -5,5503823080,392 0,008485281 -16,26086957 -0,351984831 -130,0869565 -2,815878646
0,41 0,008485281 -12,34782609 -0,255548241 -98,7826087 -2,0443859260,4245 0,012020815 -9,195652174 -0,260398672 -73,56521739 -2,0831893740,437 0,004242641 -6,47826087 -0,062894584 -51,82608696 -0,503156671
0,390333333 0,012342339 -16,62318841 -0,525625177 -132,9855072 -4,2050014170,388333333 0,007371115 -17,05797101 -0,323784367 -136,4637681 -2,590274936
0,391 0,004582576 -16,47826087 -0,193127565 -131,826087 -1,5450205170,405 0,011532563 -13,43478261 -0,382561658 -107,4782609 -3,060493262
0,495333333 0,034078341 6,202898551 0,426752004 49,62318841 3,4140160330,404333333 0,011015141 -13,57971014 -0,369948285 -108,6376812 -2,9595862810,391666667 0,017156146 -16,33333333 -0,715447776 -130,6666667 -5,723582206
Mittelwert Standard-abweichung
Konzentration (ng/ml)
Standard-abweichung Konzentration (ng/ml)
Konzentration x 8 (ng/ml)
Standard-abweichung x 8 (ng/ml)
44
3.3. Die statistische Auswertung
Um einen Zusammenhang zwischen positiven hGBP-1-Messergebnissen in
den einzelnen Seren und dem Sepsis- bzw. Entzündungszustand zu
untersuchen, wurde ein statistischer Test angewendet. Dazu diente der
Exakte Fisher-Test, ein Chi-Quadrat-Test, für dichotome Variablen. Dieser
Test ermöglicht es, Beziehungen auch bei kleiner Fallzahl, wie in dieser
Studie, zuverlässig auf Signifikanz zu testen. [033] Das Signifikanzniveau
wurde bei α = 0,05 festgesetzt.
Zur Testung der Güte von hGBP-1 als Sepsis- oder Entzündungsmarker
wurden die Güteparameter Sensitivität und Spezifität herangezogen. Die
Sensitivität beschreibt dabei die Wahrscheinlichkeit, dass das Testergebnis
den tatsächlichen Zustand richtig positiv anzeigt. Im Gegenzug gibt die
Spezifität die Wahrscheinlichkeit an, dass das Testergebnis den
tatsächlichen Zustand richtig negativ aufdeckt. Am Beispiel verdeutlicht, ist
die Sensitivität also der Anteil der positiven Befunde bei kranken Patienten
und die Spezifität der Anteil der negativen Befunde bei gesunden Patienten.
[027]
Zur Ermittlung der Sensitivität und Spezifität wird eine Kreuztabelle
angefertigt, und anhand dieser können die Parameter berechnet werden.
Tabelle 4: Kreuztabelle
Kreuztabelle
tatsächlicher Zustand
Gesamt ja nein
Testergebnis ja richtig positiv falsch positiv positiv
nein falsch negativ richtig negativ negativ
Gesamt krank gesund Gesamt
Formel 4: Sensitivität
45
Formel 5: Spezifität
Neben der Bestimmung des diagnostischen Tests und dessen
Güteparametern, wurde in dieser Arbeit auch besonders mit den genauen
Messwerten der Entzündungsmarker gearbeitet. Mit den Ergebnissen der
ELISA-Messung erhielt man die genauen Konzentrationen der zu
untersuchenden Substanzen hGBP-1 und IL-6 im Serum der Patienten.
Durch die unterschiedlichen Entzündungszustände, in denen sich die
Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme befanden, konnten Vergleiche
ermöglicht und Korrelationen mit anderen bereits etablierten
Entzündungsmarkern erstellt werden. Dazu wurde der Korrelationskoeffizient
nach Pearson r verwendet.
Der Korrelationskoeffizient ist ein Indikator für die Stärke und Richtung
linearer Beziehungen und berechnet sich aus der Kovarianz s(XY) und den
Varianzen s von X und Y bzw. aus dem Bestimmtheitsmaß r2:
Formel 6: Korrelationskoeffizient
Zur Berechnung ist ein linearer Zusammenhang zwischen zwei metrischen
Merkmalen X und Y vorausgesetzt. Der Korrelationskoeffizient liegt im
Wertebereich zwischen - 1 und + 1 und beschreibt dabei die Steigung. Ein
positiver Korrelationskoeffizient liegt bei einer ansteigenden Steigung vor,
d.h. wenn hohe Werte des einen Merkmals mit hohen Werten des anderen
Merkmals einhergehen. Ein negativer Korrelationskoeffizient ergibt sich im
umgekehrten Fall, bei dem hohe Werte des einen, niedrige Werte des
anderen Merkmals bedingen und damit eine fallende Steigung ergeben. Des
Weiteren bedeuten Werte nahe - 1 oder + 1 einen hohen, und Werte, die
gegen 0 gehen, einen geringen Zusammenhang. Ein Korrelationskoeffizient
von 0 besagt eine Unkorreliertheit. [097]
46
F. BROSIUS gab dazu Richtlinien in der folgenden Tabelle zur Interpretation
des Korrelationskoeffizienten an.
Tabelle 5: Interpretation des Korrelationskoeffizienten nach F. BROSIUS [009]
Betrag des Korrelationskoeffizienten Mögliche Interpretation0,0 Keine Korrelationüber 0,0 bis 0,2 Sehr schwache Korrelationüber 0,2 bis 0,4 Schwache Korrelationüber 0,4 bis 0,6 Mittlere Korrelationüber 0,6 bis 0,8 Starke Korrelationüber 0,8 bis unter 1,0 Sehr starke Korrelation1,0 Perfekte Korrelation
Die statistische Auswertung dieser Arbeit wurde mithilfe des statistischen
Softwareprogramms PASW Statistics 18 (Predictive Analytics Software) von
SPSS Inc., eine IBM Company, erarbeitet.
47
4 ERGEBNISSE
Die einzelnen Messergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 24 (Überblick
der Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs) im Anhang aufgelistet.
Darin enthalten sind alle Messresultate von Leukozyten, CRP, PCT, IL-6 und
hGBP-1.
In dieser Auflistung, wie auch in folgenden Tabellen ist die Leukozytenzahl in
103/µl angegeben, die Konzentration von CRP in mg/l, PCT in ng/ml, IL-6 in
pg/ml und hGBP-1 in ng/ml.
Neben den einzeln untersuchten Messkonzentrationen führt Tabelle 24
(Überblick der Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs) auch die
Patientennummer (PatNr) und laufende Nummer (LfdNr) zur genauen
Identifikation der Studienseren auf.
Die Ergebnisse dieser Studie umfassten insbesondere die Berechnung von
Korrelationen nach Pearson. Eine zusammenfassende Tabelle über die
Korrelationsergebnisse, in der alle Blutseren eingeschlossen sind, soll einen
ersten Überblick über die Resultate dieser Studie bieten.
Tabelle 6 (Überblick der Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektiv) zeigt
dabei hoch signifikante (α = 0,01) Korrelationen. So korrelieren CRP und die
Leukozytenzahl mit einem Koeffizienten von 0,313 miteinander, IL-6 und die
Leukozytenzahl mit 0,399 und IL-6 und CRP mit 0,440. Desweiteren zeigt
hGBP-1 und die Leukozytenzahl einen signifikanten (α = 0,01)
Zusammenhang von 0,650.
48
Tabelle 6: Überblick der Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs
Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs
Leukozyten-
zahl CRP PCT IL-6 hGBP-1
Leukozytenzahl Korrelation nach
Pearson
1 ,313** ,033 ,399** ,650**
Signifikanz (2-seitig) ,003 ,904 ,000 ,000
N 90 90 16 90 90
CRP Korrelation nach
Pearson
,313** 1 ,356 ,440** ,170
Signifikanz (2-seitig) ,003 ,176 ,000 ,110
N 90 90 16 90 90
PCT Korrelation nach
Pearson
,033 ,356 1 ,341 -,109
Signifikanz (2-seitig) ,904 ,176 ,196 ,687
N 16 16 16 16 16
IL-6 Korrelation nach
Pearson
,399** ,440** ,341 1 ,119
Signifikanz (2-seitig) ,000 ,000 ,196 ,266
N 90 90 16 90 90
hGBP-1 Korrelation nach
Pearson
,650** ,170 -,109 ,119 1
Signifikanz (2-seitig) ,000 ,110 ,687 ,266
N 90 90 16 90 90
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
49
4.1. Die Korrelation von CRP, Leukozyten, PCT und IL-6
Im Folgenden werden die einzelnen Korrelationsergebnisse von CRP, der
Leukozytenzahl und IL-6 dieser Studie vorgestellt. Die einzelnen
dazugehörigen Messwerte sind der Tabelle 24 (Überblick der
Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs) zu entnehmen.
4.1.1. Die Korrelation von CRP und Leukozyten
Bei der oben aufgeführten Tabelle 6 (Überblick der Korrelationen des
Gesamt-Patientenkollektivs), die eine zusammenfassende
Korrelationstabelle aller Blutentnahmen dieser Studie darstellt, fällt auf, dass
die bereits etablierten Entzündungsmarker CRP und Leukozyten signifikant
miteinander korrelieren. Diese signifikante Korrelation ist im Folgendem
nochmal explizit dargestellt (Tabelle 7).
Tabelle 7: Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs (1)
Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs
Leukozytenzahl CRP
Leukozytenzahl Korrelation nach Pearson 1 ,313**
Signifikanz (2-seitig) ,003
N 90 90
CRP Korrelation nach Pearson ,313** 1
Signifikanz (2-seitig) ,003
N 90 90
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
Das Signifikanzniveau liegt hier bei α = 0,01. Grafisch stellt sich diese
Korrelation von 0,313 wie folgt dar (Abb. 10).
50
Abb. 10: Streudiagramm der Leukozytenzahl und CRP im Patientenkollektiv
Auch in anderen Untergruppen ist eine signifikante Korrelation zwischen der
Leukozytenzahl und CRP nachweisbar. So besteht im Studienarm der Nicht-
Sepsis-Patienten eine Korrelation von 0,232 bei einem Signifikanzniveau von
α = 0,05 (Tabelle 8).
Tabelle 8: Korrelationen der Nicht-Sepsis-Patienten (1)
Korrelationen der Nicht-Sepsis-Patienten
Leukozytenzahl CRP
Leukozytenzahl Korrelation nach Pearson 1 ,232*
Signifikanz (2-seitig) ,047
N 74 74
CRP Korrelation nach Pearson ,232* 1
Signifikanz (2-seitig) ,047
N 74 74
*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.
51
Des Weiteren ergeben auch die Blutseren der Patienten mit Entzündung eine
signifikante Korrelation von 0,245 (α = 0,05) zwischen der Leukozytenzahl
und CRP (Tabelle 9).
Tabelle 9: Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung (1)
Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung
Leukozytenzahl CRP
Leukozytenzahl Korrelation nach Pearson 1 ,245*
Signifikanz (2-seitig) ,047
N 66 66
*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.
In den Arm „Patienten mit Entzündung“ sind alle Blutseren eingeschlossen,
die entweder post operationem oder septisch sind. Es wurden lediglich die
Seren ausgeschlossen, die prae operationem sind und keine erhöhten
Entzündungswerte aufweisen.
4.1.2. Die Korrelation von PCT mit anderen Entzündungsmarkern
Bei der Untersuchung der PCT-Werte auf Korrelationen mit anderen
Entzündungsmarkern konnten keine signifikanten Ergebnisse erzielt werden.
4.1.3. Die Korrelation von IL-6 mit anderen Entzündungsmarkern
In der Korrelationsberechnung ergeben sich zwei signifikante Ergebnisse.
Tabelle 10: Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs (2)
Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs
Leukozytenzahl CRP PCT hGBP-1
IL-6 Korrelation nach Pearson ,399** ,440** ,341 ,119
Signifikanz (2-seitig) ,000 ,000 ,196 ,266
N 90 90 16 90
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
52
Zum einen zeigt IL-6 mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,399, der auf
einem Niveau von α = 0,01 signifikant ist, einen Zusammenhang mit der
Leukozytenzahl (Tabelle 10).
Des Weiteren besteht eine signifikante (α = 0,01) Korrelation zwischen IL-6
und CRP von 0,440 (Tabelle 10).
Im Studienarm der Nicht-Sepsis-Patienten wurden ebenfalls zwei signifikante
Korrelationen mit IL-6 erzielt. Zwischen IL-6 und CRP besteht hier im
Studienarm der Nicht-Sepsis-Patienten eine signifikante Korrelation von
0,493 auf dem Niveau von α = 0,01 (Tabelle 11).
Neben CRP besteht ebenfalls eine signifikante Korrelation (α = 0,01) von
0,382 zwischen IL-6 und der Leukozytenzahl (Tabelle 11).
Anschließend ist die statistische Auswertung aufgeführt. Da nur bei den
septischen Patienten auf Intensivstation Procalcitonin im Routinelabor der
Chirurgischen Universitätsklinik Erlangen bestimmt wurde, sind für die
statistische Auswertung der Nicht-Sepsis-Patienten keine Procalcitoninwerte
mit berücksichtigt worden.
Tabelle 11: Korrelationen der Nicht-Sepsis-Patienten (2)
Korrelationen der Nicht-Sepsis-Patienten
Leukozytenzahl CRP hGBP-1
IL-6 Korrelation nach Pearson ,382** ,493** ,022
Signifikanz (2-seitig) ,001 ,000 ,851
N 74 74 74
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
Das Streudiagramm der Korrelation zwischen IL-6 und der Leukozytenzahl
im Studienarm der Nicht-Sepsis-Patienten kann das Ergebnis noch
veranschaulichen (Abb. 11).
53
Abb. 11: Streudiagramm der Leukozytenzahl und IL-6 bei Nicht-Sepsis-Patienten
Bei der alleinigen Betrachtung aller Blutseren post operationem ergab die
statistische Auswertung weitere signifikante Korrelationen. Dabei sind alle
Blutseren Tag 1-7 post operationem eingeschlossen, hingegen
ausgeschlossen sind die präoperativ abgenommenen Blutproben.
Mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,358 korreliert IL-6 signifikant (α =
0,05) mit der Leukozytenzahl. Auch zwischen IL-6 und CRP lässt sich hier
eine signifikante Korrelation von 0,333 (α = 0,05) nachweisen (Tabelle 12).
Tabelle 12: Korrelationen der Blutseren post operationem 1-7
Korrelationen der Blutseren post operationem 1-7
Leukozytenzahl CRP hGBP-1
IL-6 Korrelation nach Pearson ,358* ,333* ,028
Signifikanz (2-seitig) ,011 ,018 ,846
N 50 50 50
*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.
54
Die Korrelationsberechnungen der Untergruppen, die sich auf die einzelnen
Tage post operationem beziehen, werden nun im Folgenden erläutert.
Bei der Korrelationstestung am Tag 1 post operationem zeigt sich ein
Zusammenhang von 0,538 zwischen IL-6 und CRP. Das Signifikanzniveau
liegt hier bei α = 0,01 (Tabelle 13).
Tabelle 13: Korrelationen der Blutseren am Tag 1 post operationem
Korrelationen der Blutseren am Tag 1 post operationem
Leukozytenzahl CRP
IL-6 Korrelation nach Pearson ,123 ,538**
Signifikanz (2-seitig) ,577 ,008
N 23 23
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
Da hGBP-1 in den Blutseren dieser Untergruppe des 1. Tages post
operationem nicht nachweisbar war, kann hier keine statistische Beurteilung
mit den anderen Entzündungsmarkern stattfinden.
Der Pearson‘sche Korrelationskoeffizient von 0,661 bei einer Signifikanz von
α = 0,05 zeigt am Tag 3 post operationem einen starken Zusammenhang
zwischen IL-6 und CRP (Tabelle 14).
Tabelle 14: Korrelationen der Blutseren am Tag 3 post operationem
Korrelationen der Blutseren am Tag 3 post operationem
Leukozytenzahl CRP hGBP-1
IL-6 Korrelation nach Pearson ,146 ,661* ,277
Signifikanz (2-seitig) ,617 ,010 ,337
N 14 14 14
*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.
55
Die statistische Beurteilung der Blutseren des 5. Tages post operationem
ergibt einen Korrelationskoeffizienten von 0,851 zwischen IL-6 und der
Leukozytenzahl. Das Signifikanzniveau liegt bei α = 0,01 (Tabelle 15).
Tabelle 15: Korrelationen der Blutseren am Tag 5 post operationem
Korrelationen der Blutseren am Tag 5 post operationem
Leukozytenzahl CRP
IL-6 Korrelation nach Pearson ,851** ,645
Signifikanz (2-seitig) ,004 ,061
N 9 9
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
HGBP-1 war am Tag 5 post operationem nicht nachweisbar und somit
konnte keine statistische Auswertung zwischen IL-6 und hGBP-1 erfolgen.
Wie auch bei vielen anderen Untergruppen korreliert IL-6 auch in der
Patientengruppe mit Entzündung signifikant mit der Leukozytenzahl und
CRP. In dieser Untergruppe sind alle Patientenseren beinhaltet, die sich zum
Abnahmezeitpunkt in einem entzündeten Zustand befanden. Dazu gehören
sowohl alle Blutseren post operationem, wie auch die Seren der Sepsis-
Patienten.
Bei einem Signifikanzniveau von α = 0,01 steht IL-6 mit einem
Korrelationskoeffizienten von 0,379 mit der Leukozytenzahl in Beziehung.
Des Weiteren korreliert IL-6 mit einem signifikanten (α = 0,01) Ergebnis von
0,412 in dieser Untergruppe der Patienten mit Entzündung ebenfalls mit CRP
(Tabelle 16).
Tabelle 16: Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung (2)
Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung
Leukozytenzahl CRP PCT hGBP-1
IL-6 Korrelation nach Pearson ,379** ,412** ,341 ,100
Signifikanz (2-seitig) ,002 ,001 ,196 ,426
N 66 66 16 66
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
56
4.2. Die statistische Auswertung von hGBP-1
Zum Überblick des gesamten Patientenkollektivs in Hinblick auf die einzelnen
Blutwerte, wird auf Tabelle 24 (Überblick der Messergebnisse des Gesamt-
Patientenkollektivs) im Anhang verwiesen.
4.2.1. Das Patientenkollektiv
Zunächst zeigt sich, dass hGBP-1 im Serum nachweisbar ist. Bis auf eine
Ausnahme ist hGBP-1 nur im entzündeten oder septischen Bereich messbar
gewesen.
HGBP-1 war in sechs Fällen von insgesamt 90 Blutentnahmen positiv.
Darunter sind vier Patientenproben, die sich zum Zeitpunkt der Blutentnahme
im septischen Zustand befanden, eine Serumprobe im entzündeten
postoperativen und eine Blutprobe im nicht entzündeten präoperativen
Bereich. Das bedeutet, dass hGBP-1 eine sehr geringe Sensitivität für einen
entzündeten oder septischen Zustand hat, die Spezifität im Gegenzug aber
sehr hoch einzuschätzen ist. Dieses Ergebnis wird in Kapitel 4.2.2. und
Kapitel 4.2.4. noch näher erläutert.
Des Weiteren zeigt sich in der statistischen Auswertung eine signifikante
Korrelation zwischen hGBP-1 und der Leukozytenzahl. Der
Korrelationskoeffizient von 0,650, der auf einem Niveau von α = 0,01
signifikant ist, gibt laut F. BROSIUS (siehe Kapitel 3.3.) eine starke
Korrelation an (Tabelle 17).
Tabelle 17: Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs (3)
Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs
Leukozytenzahl CRP PCT IL-6
hGBP-1 Korrelation nach Pearson ,650** ,170 -,109 ,119
Signifikanz (2-seitig) ,000 ,110 ,687 ,266
N 90 90 16 90
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
57
4.2.2. Der Studienarm: Sepsis-Patienten
Wie bereits erwähnt, waren vier der sechs positiven hGBP-1-Werte im
septischen Bereich. Das bedeutet, dass im Vergleich zu den 90
Blutentnahmen des Gesamtkollektivs nur sehr wenige Blutentnahmen positiv
für hGBP-1 waren. Von diesen sechs positiven hGBP-1-Blutseren lagen aber
66,7% im septischen Bereich. Das folgende Balkendiagramm soll dies
verdeutlichen (Abb.12).
Abb. 12: hGBP-1 * Sepsis Balkendiagramm
58
Tabellarisch lässt sich diese Konstellation in einer Kreuztabelle formulieren.
Dabei wird ebenfalls verdeutlicht, dass vier von sechs positiven hGBP-1-
Ergebnissen im septischen Zustand waren und im Vergleich lediglich bei
zwei von 74 nicht-septischen Patienten hGBP-1 im Blutserum nachgewiesen
wurde (Tabelle 18).
Tabelle 18: hGBP-1 * Sepsis Kreuztabelle
hGBP-1 * Sepsis Kreuztabelle
Sepsis
Gesamt ja nein
hGBP-1 pos 4 2 6
neg 12 72 84
Gesamt 16 74 90
Zur Analyse des Zusammenhangs zwischen positiven hGBP-1-Werten und
einem septischen Zustand wurde der Exakte Fisher-Test, ein Chi-Quadrat-
Test, verwendet. Dabei ergibt sich ein statistisch signifikanter
Zusammenhang (p = 0,008) (Tabelle 19).
Tabelle 19: Chi-Quadrat-Test bezüglich hGBP-1 * Sepsis
Chi-Quadrat-Test
Wert df
Asymptotische
Signifikanz (2-
seitig)
Exakte
Signifikanz (2-
seitig)
Exakte
Signifikanz (1-
seitig)
Chi-Quadrat nach
Pearson
10,512a 1 ,001
Kontinuitätskorrekturb 7,234 1 ,007
Likelihood-Quotient 7,704 1 ,006
Exakter Test nach Fisher ,008 ,008
Zusammenhang linear-
mit-linear
10,395 1 ,001
Anzahl der gültigen Fälle 90
a. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit ist
1,07.
b. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
59
Die Berechnungen von Sensitivität und Spezifität von hGBP-1 als
Sepsismarker werden im Folgenden dargestellt.
Zur Beurteilung der Güte von hGBP-1 eine Sepsis anzuzeigen, ergibt sich
somit eine Sensitivität von 66,7% und eine Spezifität von 97,3%.
In Hinsicht auf die Korrelationskoeffizienten zwischen hGBP-1 und anderen
Entzündungsmarkern ergeben sich weitere Ergebnisse. Der Studienarm der
septischen Patienten zeigt einen signifikant starken Zusammenhang von
0,670 bei α = 0,01 zwischen hGBP-1 und der Leukozytenzahl (Tabelle 20).
Tabelle 20: Korrelationen der Sepsis-Patienten
Korrelationen der Sepsis-Patienten
Leukozytenzahl CRP PCT IL-6
hGBP-1 Korrelation nach Pearson ,670** -,242 -,109 -,193
Signifikanz (2-seitig) ,004 ,366 ,687 ,474
N 16 16 16 16
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
4.2.3. Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten
Der Studienarm der Nicht-Sepsis-Patienten umfasste die Blutseren prae
operationem und alle Blutproben post operationem. Wie bereits erwähnt,
wurde bei den nicht-septischen Patienten kein Procalcitonin bestimmt.
Die statistische Auswertung der Nicht-Sepsis-Patienten zeigt keine
signifikanten Korrelationen.
60
Die Studiengruppe der Nicht-Sepsis-Patienten kann noch weiter unterteilt
werden.
Werden nur die Blutproben prae operationem betrachtet, ergeben sich
ebenfalls keine signifikanten Resultate. Zu erwähnen ist, dass, wie der im
Anhang aufgeführten Tabelle 24 (Überblick der Messergebnisse des
Gesamt-Patientenkollektivs) zu entnehmen ist, ein positiver hGBP-1-Wert
unter den nicht entzündlichen präoperativen Seren ermittelt wurde.
Eine Untergruppe, die ebenfalls auf Korrelationen untersucht wurde, stellt
eine Zusammenstellung aller Patientenseren, die post operationem
abgenommen worden sind, dar. Dazu gehören alle Blutwerte Tag 1-7 post
operationem, in denen also alle Blutproben enthalten sind, die weder prae
operationem noch im septischen Zustand abgenommen wurden. Diese
Zusammenstellung zeigt in der statistischen Auswertung keine signifikanten
Korrelationen.
Des Weiteren wurden einzelne Tage post operationem auf Korrelationen mit
hGBP-1 untersucht.
Bei der alleinigen Betrachtung von jeweils Tag 1, 2, 4, 5, 6 und Tag 7 post
operationem resultieren keine Korrelationen, weil hGBP-1 in diesen Fällen im
Serum nicht nachweisbar war.
Am Tag 3 post operationem wurde ein Patientenserum positiv für hGBP-1
getestet. Die statistische Untersuchung auf Korrelationen ergibt hier keine
signifikanten Ergebnisse.
4.2.4. Die Patientengruppe mit Entzündung
Die Patientengruppe mit Entzündung setzt sich aus allen Patientenseren
zusammen, deren Zustand im entzündeten Bereich lag, unabhängig davon,
wie stark die Entzündung war. Somit gehören alle postoperativen und alle
septischen Blutseren dazu, präoperativ abgenommene Patientenseren sind
dagegen ausgeschlossen.
61
Hier zeigt sich, dass fünf Blutproben positiv auf hGBP-1 waren. Im Hinblick
auf das Gesamt-Patientenkollektiv, bei dem insgesamt sechs positive hGBP-
1-Werte gemessen wurden, zeigt sich somit eine interessante Verteilung der
positiven hGBP-1-Blutseren. 83,3% aller positiven hGBP-1-Werte in
Blutproben lagen im entzündeten Bereich.
Das Balkendiagramm soll dies veranschaulichen (Abb. 13).
Abb. 13: hGBP-1 * Entzündung Balkendiagramm
Die dazugehörige Kreuztabelle ist im Folgenden dargestellt. Dabei wird
verdeutlicht, dass fünf von sechs positiven hGBP-1-Messergebnissen im
entzündeten Zustand nachweisbar waren und im Gegensatz dazu lediglich
eine von 24 Blutproben hGBP-1-postiv im nicht-entzündeten Zustand
getestet wurden (Tabelle 21).
62
Tabelle 21: hGBP-1 * Entzündung Kreuztabelle
hGBP-1 * Entzündung Kreuztabelle
Entzündung
Gesamt ja nein
hGBP-1 pos 5 1 6
neg 61 23 84
Gesamt 66 24 90
Der Exakte Fisher-Test, ein Chi-Quadrat-Test zur Testung des
Zusammenhangs zwischen hGBP-1 und einer Entzündung, ergab keine
signifikanten Resultate (Tabelle 22).
Tabelle 22: Chi-Quadrat-Test bezüglich hGBP-1 * Entzündung
Chi-Quadrat-Test
Wert df
Asymptotische
Signifikanz (2-
seitig)
Exakte
Signifikanz (2-
seitig)
Exakte
Signifikanz (1-
seitig)
Chi-Quadrat nach
Pearson
,329a 1 ,566
Kontinuitätskorrekturb ,009 1 ,924
Likelihood-Quotient ,360 1 ,548
Exakter Test nach Fisher 1,000 ,490
Zusammenhang linear-
mit-linear
,325 1 ,569
Anzahl der gültigen Fälle 90
a. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit ist
1,60.
b. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
Um die Güte von hGBP-1 als Entzündungsmarker festzustellen, wurden die
Sensitivität und Spezifität wie folgt berechnet.
63
Die Sensitivität von hGBP-1 eine Entzündung anzuzeigen beträgt 7,5%. Die
Spezifität liegt im Vergleich bei 95,8%.
In der statistischen Korrelationsanalyse mit anderen Entzündungsmarkern
zeigt die Patientengruppe mit Entzündung signifikante Ergebnisse. Wie
bereits erwähnt, sind darin die Blutseren Tag 1-7 post operationem und die
septischen Blutproben eingeschlossen, Blutseren prae operationem sind
hingegen ausgeschlossen.
HGBP-1 ist hier mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,660 mit der
Leukozytenzahl stark korreliert. Das Signifikanzniveau liegt bei α = 0,01
(Tabelle 23).
Tabelle 23: Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung (3)
Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung
Leukozytenzahl CRP PCT IL-6
hGBP-1 Korrelation nach Pearson ,660** ,129 -,109 ,100
Signifikanz (2-seitig) ,000 ,303 ,687 ,426
N 66 66 16 66
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
64
4.3. Zusammenfassung der Ergebnisse
Anhand der oben aufgeführten Ergebnisse lassen sich einige Schlüsse über
die untersuchten Entzündungsmarker dieser Studie ziehen.
So korrelierten die Leukozytenzahl und CRP sowohl im Bereich des Gesamt-
Patientenkollektivs, der Nicht-Sepsis-Patienten und der Patienten mit
Entzündung miteinander.
PCT zeigte weder im entzündlichen, noch im septischen, noch im
entzündungsfreien Zustand eine Korrelation zu anderen
Entzündungsmarkern.
IL-6 korrelierte im Gesamt-Patientenkollektiv, bei Nicht-Sepsis-Patienten und
in der Untergruppe Patienten mit Entzündung sehr gut mit der
Leukozytenzahl und CRP, jedoch nicht im entzündungsfreien Bereich.
In Bezug auf hGBP-1 ließen sich folgende Ergebnisse darstellen:
Der Nachweis von hGBP-1 im Blutserum ist möglich, allerdings bis auf eine
Ausnahme nur im entzündeten oder septischen Bereich.
Je höher der Entzündungszustand war, desto häufiger war hGBP-1
nachweisbar.
83,3% der positiven hGBP-1-Messergebnisse wurden bei Patienten mit
Entzündung gemessen. Bei 5/66 Patientenseren mit Entzündung konnte
hGBP-1 nachgewiesen werden. Die Sensitivität von hGBP-1 als
Entzündungsmarker liegt bei 7,5%, die Spezifität bei 95,8%.
66,7% der positiven hGBP-1-Ergebnisse wurden bei septischen
Patientenseren gemessen. In 4/16 der septischen Blutproben war die hGBP-
1-Testung positiv. HGBP-1 als Sepsismarker hat eine Sensitivität von 66,7%
und eine Spezifität von 97,3%. Im Exakten Fisher-Test wird ein signifikanter
Zusammenhang bestätigt.
Im Gegenzug war in 12/16 der Sepsisfälle kein hGBP-1 nachweisbar.
Man könnte postulieren, dass hGBP-1 in Sepsiszuständen nachweisbar ist,
allerdings sehr unzuverlässig, da bei 75% der Fälle dieser Patientengruppe
kein Nachweis erbracht werden konnte.
HGBP-1 korrelierte im Gesamt-Patientenkollektiv, bei septischen Patienten
und in der Untergruppe der Patienten mit Entzündung mit der
Leukozytenzahl.
65
5 DISKUSSION
A. PFÄFFLIN et al. prüften im Jahr 2009 aktuelle Entzündungsmarker auf
ihre Wertigkeit im Point-Of-Care-Testing (POCT). [066]
Das POCT ist eine patientennahe Sofortdiagnostik, die es ermöglicht,
Diagnosen rasch, zeitig und möglichst direkt am Geschehen zu stellen. Ziel
des POCT ist es, aus schnell gewonnenen Laborwerten direkte
therapeutische Konsequenzen ableiten zu können. Beispiele für POCT, die
bereits heute schon am Patientenbett durchgeführt werden, sind die
Blutglukosemessung und die Blutgasbestimmung. [040]
In der Veröffentlichung aus dem Jahr 2009 legten A. PFÄFFLIN et al. ihre
Ergebnisse bezüglich der Entzündungsmarker im POCT dar. Diese
bestätigten, dass die Leukozytenzahl, CRP und PCT gut geeignet sind, die
schnelle Diagnose einer Entzündung und Infektion bei Kindern und
Erwachsenen zu stellen. Darüber hinaus beschrieben die Autoren, dass im
Vergleich dazu IL-6 und IL-8 besser zur Detektion einer Sepsis bei
Neugeborenen geeignet sind. [066]
H. PELTOLA et al. untersuchten 1986 die diagnostische Bedeutung von CRP
und der Leukozytenzahl bei akuter Appendizitis. Bereits in 88% aller
Appendizitisfälle dieser Studie waren entweder die CRP-Werte oder die
Leukozytenzahl erhöht. Der positive Vorhersagewert für eine akute
Appendizitis bei einem zugleich erhöhten CRP- und Leukozytenwert ergab
sogar 93%. [064]
Auch S. M. SHAFI et al. veröffentlichten 2009 die Ergebnisse ihrer Studie
bezüglich der diagnostischen Hilfestellung von u.a. Leukozyten und CRP bei
akuter Appendizitis. Die Leukozytenzahl hatte hier eine Sensitivität von
97,82%, eine Spezifität von 55,55% und einen positiven Vorhersagewert von
91,8%. CRP schnitt nicht weniger schlecht ab mit einer Sensitivität von
95,6%, einer Spezifität von 77,77% und einem positiven Vorhersagewert von
95,6%. [081]
Solche Studienergebnisse zeigen, dass die Leukozytenzahl und CRP als
Entzündungsmarker häufig Hand-in-Hand gehen.
66
Auch die Korrelationsergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass diese beiden
Entzündungsmarker signifikant miteinander korrelieren. Wie den
Messergebnistabellen zu entnehmen ist, sind die Leukozytenzahlen und
CRP-Werte in Entzündungszuständen erhöht. Die signifikanten
Pearson‘schen Korrelationskoeffizienten von 0,313 (α = 0,01) im Gesamt-
Patientenkollektiv, 0,232 (α = 0,05) bei den Nicht-Sepsis-Patienten und 0,245
(α = 0,05) bei Patienten mit Entzündung deuten daraufhin, dass, wie
erwartet, die Leukozytenzahl und CRP bei unterschiedlichen Zuständen im
entzündeten Bereich in Beziehung zueinander stehen. Die positiven
Korrelationskoeffizienten zeigen, dass bei Zunahme des einen Parameters,
es auch zur Zunahme des anderen kommt. Mit dieser Aussage geht dieses
Studienergebnis konform mit vielen anderen Studien, beispielsweise wie die
oben erwähnten Veröffentlichungen von A. PFÄFFLIN et al. [066], H.
PELTOLA et al. [064] und S. M. SHAFI et al. [081].
Auch U. HELLGREN et al. schilderten bezüglich der Leukozytenzahl und
CRP bereits 1986 ähnliche Ergebnisse bei ihrer Untersuchung von 851
Patienten, die unter einer Sepsis oder einer Endokarditis litten. Die
Leukozytenzahl war in 60% der Fälle positiv (>9 x 109/l) und der CRP-Wert
sogar in 93% positiv (> 10 mg/l). [034]
In einer Meta-Analyse von L. SIMON et al. aus dem Jahr 2004 über 351
Studien wurden PCT und CRP als Marker einer bakteriellen Entzündung
gegenüber gestellt. Sie bekundeten PCT eine höhere Sensitivität von 88%
und eine höhere Spezifität von 81% in Bezug auf die Detektion einer
bakteriellen versus nicht-infektiösen Entzündung. Im Vergleich dazu lag CRP
bei einer Sensitivität von 75% und einer Spezifität von 67%. [085]
M. HATHERILL et al. verglichen 1999 PCT mit anderen
Entzündungsmarkern. Sie kamen ebenfalls zu dem Ergebnis, dass PCT ein
besserer Marker für Entzündung ist als CRP und die Leukozytenzahl. [032]
2004 analysierten G. P. CASTELLI et al. CRP- und PCT-Konzentrationen bei
Patienten mit unterschiedlichen Gesundheitszuständen. Zur Klassifizierung
der Erkrankungsschwere wurde bei jedem Patienten der jeweilige SOFA-
Score ermittelt. Dieser beschreibt objektiv die Organdysfunktion. Die
Resultate der Studie zeigten, dass CRP und PCT mit der Schwere der
Erkrankung ansteigen. Während die PCT-Konzentration bei SIRS über
67
Sepsis zu schwerer Sepsis und septischem Schock, und mit dem SOFA-
Score, anstieg, erschöpfte sich der CRP-Anstieg mit immer höherer
Erkrankungsschwere. Des Weiteren reagierte PCT rascher als CRP und
erlaubte die Diagnose einer Sepsis 24-48 Stunden früher als CRP. Demnach
ist PCT im Vergleich zu CRP der schnellere und sicherere Sepsismarker.
[012]
Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen G. P. CASTELLI et al. auch im Jahr
2006, indem sie die Wertigkeit von PCT, CRP, Leukozyten und dem SOFA-
Score bezüglich der Einschätzung der Schwere der Erkrankung, Prognose
und Verlauf der Patienten auf Intensivstation ermittelten. So beschrieben sie,
dass PCT und der SOFA-Score mit der Erkrankungsschwere stärker
korrelierten als die anderen untersuchten Parameter. Und des Weiteren
erklärten sie, dass PCT ein besserer Parameter zur Diagnostik und zum
Monitoring der septischen und intensivpflichtigen Patienten sei als CRP,
Leukozyten und der SOFA-Score. [011]
Bei der Betrachtung der Ergebnisse von PCT in dieser Studie ergaben sich
keine signifikanten Korrelationen zu anderen Entzündungsmarkern. Das
kann verschiedene Ursachen haben.
Möglicherweise war die Fallzahl der PCT-Werte in dieser Studie zu gering.
Da PCT nur bei septischen Patienten auf Intensivstation routinemäßig
bestimmt wurde, ergaben sich lediglich 16 Blutentnahmen zur PCT-Messung.
Im Vergleich werteten L. SIMON et al. 2004 in der Meta-Analyse [085] 351
Studien, G. P. CASTELLI et al. ebenfalls aus dem Jahr 2004 [012] über 220
Patientendaten aus und im Jahr 2006 analysierten G. P. CASTELLI et al.
[011] 255 Beobachtungszeitpunkte.
Des Weiteren können auch die zeitlich unterschiedlichen An- und Abstiege
der anderen Entzündungsmarker Leukozyten, CRP und IL-6 ursächlich dafür
sein, dass PCT in dieser Studie nicht mit den anderen Entzündungsmarkern
korreliert. Wie bereits in Kapitel 2.6.1. erläutert, sind die einzelnen
Entzündungsmarker unterschiedlich schnell und stark in ihrem Anstieg und
ihrem folgenden Abfall bei Sepsis. Dies bestätigten auch D. MOKART et al.
2005, als sie erklärten, dass IL-6 und PCT bei postoperativ-septischen
Patienten ein früherer Marker ist als CRP [054], und R. CLAEYS et al. im
Jahr 2002, die u.a. ebenfalls veröffentlichten, dass PCT einen septischen
68
Schock früher anzeigt als CRP [018]. P. MARUNA et al. erläuterten 2000 in
Bezug auf die Regulation von PCT, dass PCT nach der Elevation von TNF
und IL-6, aber vor dem Anstieg von CRP, ansteigt. [052]
Auch die Leukozytenzahl unterliegt Schwankungen während einer Sepsis.
So berichteten 2008 auch N. S. WARD et al. von einer kompensatorischen
antiinflammatorischen Immunantwort (CARS) im Verlauf einer Sepsis, wie
auch in Kapitel 2.3. bereits beschrieben. Dieser Zustand CARS zeigte nach
N. S. WARD et al. klinisch neben Hypothermie, Anergie u.a. eine
Leukopenie. [102]
Auf diese Weise lässt sich möglicherweise die fehlende Korrelation von PCT
mit anderen Entzündungsmarkern in dieser Studie erklären.
IL-6 zeigt in dieser Studie sehr gute Korrelationen mit CRP und den
Leukozyten, insbesondere im entzündeten Zustand. Dieses Ergebnis lässt
sich durch viele andere Studien bekräftigen. So wiesen P. DAMAS et al.
1992 eine direkte, signifikante Korrelation zwischen IL-6 und der
Körpertemperatur und zwischen IL-6 und CRP (r = 0,66, p < 0,001) bei akut
kranken und entzündeten Patienten nach. Des Weiteren beschrieben sie
auch eine direkte Korrelation zwischen IL-6 und TNF-α während eines
septischen Schocks. IL-6 korrelierte außerdem mit dem APACHE II Score,
der das Sterberisiko intensivpflichtiger Patienten vorhersagt. Dabei stieg die
Mortalität bei IL-6-Werten über 1000 pg/ml signifikant an. Dementsprechend
folgerten P. DAMAS et al., dass IL-6 ein guter Marker für die Schwere einer
bakteriellen Entzündung ist. [019]
L. C. CASEY et al. veröffentlichten 1993 einen Artikel, in dem sie ebenfalls
beschrieben, dass IL-6 mit der Mortalität des septischen Syndroms korreliert.
[010]
Die signifikanten Korrelationen von IL-6 mit den bereits etablierten
Entzündungsmarkern Leukozyten und CRP in dieser Studie bestätigen die
Aussage, dass IL-6 eine Entzündung anzeigt. Und bei genauerer
Betrachtung der einzelnen Messwerte, die der Tabelle 24 (Überblick der
Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs) zu entnehmen sind, steigt
auch erwartungsgemäß in dieser Studie der IL-6-Wert mit dem
Entzündungszustand. Liegt der Mittelwert von IL-6 prae operationem noch
69
bei einer Konzentration von 6,53 pg/ml, steigt er post operationem auf
gemittelte 78,16 pg/ml an und erreicht bei den Sepsis-Patienten einen
Mittelwert von 2240,95 pg/ml. Da man davon ausgehen kann, dass die
Sterblichkeit bei septischen Patienten höher ist, als bei nicht septischen,
könnte man annehmen, dass IL-6 auch in dieser Studie mit der Mortalität,
wie bei L. C. CASEY et al. beschrieben [010], korreliert.
Im Gegensatz zu den Korrelationen im entzündeten und septischen Bereich,
konnten in der Patientengruppe prae operationem keine signifikanten
Korrelationen zwischen IL-6 mit den anderen Entzündungsmarkern
nachgewiesen werden.
Bei genauerer Betrachtung der statistischen Auswertung der Blutproben
präoperativ zeigt sich, dass zwischen keinem der gemessenen und
ausgewerteten Entzündungsmarker prae operationem Korrelationen
nachweisbar waren. Auch die bereits etablierten Marker Leukozyten und
CRP standen im entzündungsfreien Zustand nicht in signifikanter Beziehung
zueinander. Verschiedene Ursachen sind denkbar.
Ein möglicher Grund dieser allgemeinen fehlenden Korrelation bei
präoperativen Blutproben könnte ganz naheliegend die fehlende Entzündung
sein. Ein Marker kann einen Zustand nur anzeigen, wenn dieser Zustand
auch vorherrscht. Verschiedene Marker desselben Zustandes können nur
miteinander korrelieren, wenn der anzuzeigende Zustand auch gegeben ist.
In einer Publikation aus dem Jahr 2007 befassten J. E. AGUILAR-
NASCIMENTO et al. sich u.a. mit der Frage, ob unterschiedliche
präoperative IL-6-Werte spätere postoperative Infektionen prognostizieren
können. Dazu erklärten sie, dass die IL-6-Werte präoperativ nicht mit einer
postoperativen längeren Liegedauer im Krankenhaus korrelieren. Lediglich
am Tag 5 postoperativ konnte IL-6, anhand eines weiterhin hohen und nicht
abfallenden IL-6-Wertes, eine in etwa sechs Tage längere Krankenhaus-
Verweildauer prognostizieren. [002] Daraus könnte man schließen, dass IL-6
am Tag 5 post operationem deshalb ein vorhersagender Marker ist, weil IL-6
eine Entzündung anzeigte und sich mit einer postoperativen Infektion auch
die Liegedauer in der Regel verlängerte. Dementsprechend prognostizierte
IL-6 prae operationem unter Umständen keine längere Liegedauer, weil zu
70
diesem Zeitpunkt, wie auch in dieser Studie bei präoperativ abgenommenen
Blutproben, keine Entzündung vorherrschte.
Somit könnte man zu dem Schluss kommen, dass IL-6 auch in dieser Studie
als Entzündungsmarker gut einsetzbar ist, da er mit der Schwere der
Entzündung ansteigt und im entzündungsfreien Bereich keine Korrelationen
mit den bereits etablierten Entzündungsmarkern Leukozyten und CRP, wie
diese auch untereinander, bietet.
Hinsichtlich der Ergebnisse der hGBP-1-Untersuchung konnte zunächst
aufgezeigt werden, dass hGBP-1 im Serum nachweisbar ist.
Wie in Kapitel 2.6.2.4. bereits aufgeführt, wurde hGBP-1 schon in einigen
unterschiedlichen Medien nachgewiesen. 2006 wiesen E. NASCHBERGER
et al. anhand eines eigens dafür entwickelten ELISA‘s hGBP-1 im Liquor
nach [058], 2008 erforschten E. NASCHBERGER et al. hGBP-1 in
kolorektalen Karzinomen [057] und L. PERSANO et al. erbrachten 2009 den
Nachweis von hGBP-1 im Prostatakarzinom [065]. C. LUBESEDER-
MARTELLATO et al. konnten 2002 hGBP-1 in den Gefäßen
unterschiedlichster Gewebe, z B. Kolon, Herz, Milz, Gehirn,
immunhistochemisch nachweisen [048]. 2010 gelang M. HAMMON et al.
bereits der Nachweis des Proteins mittels ELISA im Serum. [031] Die
Vorstellung, dass der Nachweis von hGBP-1 dann auch in dieser Studie im
Serum möglich ist, ist demnach naheliegend.
Sechs von 90 Blutseren wurden in dieser Studie positiv auf hGBP-1 getestet.
Somit konnte die Nachweisbarkeit von hGBP-1 im Serum mittels Sandwich-
ELISA belegt werden.
Neben den verschiedensten Geweben, in denen hGBP-1 nachgewiesen
wurde, gelang es C. LUBESEDER-MARTELLATO et al. im Jahr 2002 hGBP-
1, neben den bereits oben Aufgeführten, auch in den Endothelzellen der
Hautgefäße nachzuweisen. Die Expression konnte in kleinen Gefäßen bei
Medikamenten-induzierter Hautreaktion, in mittelgroßen Gefäßen bei Kaposi-
Sarkom und bei Psoriasis-erkrankter Haut in den großen Gefäßen festgestellt
werden. Hingegen konnte hGBP-1 nicht in gesunder Haut nachgewiesen
werden. [048] Auch E. NASCHBERGER et al. wiesen 2006 hGBP-1 in einem
entzündeten Medium nach. Wie bereits oben beschrieben gelang ihnen der
71
Nachweis von hGBP-1 im Liquor. Der dazu untersuchte Liquor stammte von
Patienten mit bakterieller Meningitis. [058] Bei Patienten mit Erkrankungen
des rheumatischen Formenkreises, wie rheumatoider Arthritis, sytemischer
Lupus erythematodes und systemischer Sklerose, bestätigten M. HAMMON
et al. 2010 signifikant erhöhte hGBP-1-Werte im Blutserum. [031] Diese
Erkenntnisse, dass hGBP-1 besonders im entzündeten Zustand nachweisbar
ist, geht konform mit den Resultaten dieser Studie.
Bei der Betrachtung der statistischen Auswertung dieser Studie ergaben sich
interessante Korrelationen. So korrelierte hGBP-1 im Gesamt-
Patientenkollektiv, bei septischen Patienten und in der Untergruppe der
Patienten mit Entzündung, signifikant mit der Leukozytenzahl. Dabei lag der
Korrelationskoeffizient (α = 0,01) bei 0,650, 0,670 und 0,660. Das entspricht
nach F. BROSIUS [009] in allen drei Fällen einer starken Korrelation. Die
Leukozytenzahl ist ein etablierter Entzündungsmarker. Das bestätigt die
Aussage, dass hGBP-1 eine Entzündung anzeigt.
Gründe für die fehlenden Korrelationen im nicht entzündeten Zustand der
präoperativ abgenommenen Blutproben wurden bereits besprochen und
liegen möglicherweise an den generell mangelnden Korrelationen der
präoperativen Entzündungsmarker.
HGBP-1 konnte in sechs von 90 Blutproben entdeckt werden. Vier davon
waren im septischen Zustand, eine Serumprobe im entzündeten
postoperativen Zustand und lediglich eine Probe zum entzündungsfreien
präoperativen Zeitpunkt.
Somit kann die These aufgestellt werden, dass bei steigendem
Entzündungszustand des Patienten sich auch die Wahrscheinlichkeit der
Nachweisbarkeit von hGBP-1 erhöht.
Die hGBP-1-positive Serumprobe (12,73 ng/ml), die präoperativ
abgenommen wurde, zeigt in den Vergleichsblutwerten keine oder allenfalls
aufgrund des leicht erhöhten CRP-Wertes eine geringfügige Entzündung
(Leukozyten 6,13 x 10³/µl, CRP 5 mg/l, IL-6 0 pg/ml). Geht man davon aus,
dass es sich hier um einen statistischen Ausreißer handelt, dessen hGBP-1-
Wert falsch-positiv war, sind alle anderen positiven Ergebnisse im
entzündeten oder septischen Bereich. Das bedeutet, von 90 Blutproben
unterschiedlichster Entzündungs- und entzündungsfreier Zustände ist hGBP-
72
1 nur im entzündeten Zustand positiv. Damit scheint die Sensitivität von
hGBP-1 für eine Entzündung sehr gering zu sein, aber die Spezifität sehr
hoch.
War das Messergebnis der präoperativen Blutprobe richtig-positiv, muss ein
Teil der mutmaßlichen Spezifität von hGBP-1 als Entzündungsmarker
eingebüßt werden. Dennoch liegt die berechnete Spezifität für hGBP-1 als
Entzündungsmarker noch bei hohen 95,8%. Wie bereits vermutet, ist die
Sensitivität im Gegensatz dazu sehr gering. Lediglich bei 5/66 der
Patientenseren mit Entzündung konnte hGBP-1 nachgewiesen werden, das
entspricht einer Sensitivität von 7,5%. Dies ist bei der Betrachtung der
relativen Häufigkeit von hGBP-1 bezüglich des Entzündungszustandes der
Patienten zum Abnahmezeitpunkt auch zu erwarten, denn 83,3% der
positiven hGBP-1-Messergebnisse wurden bei Patienten mit Entzündung
gemessen.
Des Weiteren wird die Vermutung, dass hGBP-1 eine Entzündung anzeigt
und es sich bei der besagten positiven Blutprobe im präoperativen Zustand
um einen Ausreißer handelt, durch andere Erkenntnisse über hGBP-1
gestützt. Der Nachweis von hGBP-1 im Liquor bei Meningitis [058], der
alleinige Nachweis von hGBP-1 in Gefäßen erkrankter Haut [048], erhöhte
hGBP-1-Serumwerte bei rheumatischen Erkrankungen [031] und das
Wissen, dass hGBP-1 durch inflammatorische Zytokine induziert wird [026],
lässt vermuten, dass hGBP-1 während einer Entzündung eher nachweisbar
ist als im Blutserum im nicht entzündeten Zustand.
Die erheblich vermehrte Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen bei
Sepsis, die ihrerseits eine vermehrte Expression von hGBP-1 induzieren
[026], die mikrovaskuläre Schädigung bei Sepsis, die zu einer erhöhten Zahl
zirkulierender endothelialer Zellen mit relevanter Endothelzellschädigung
führt und damit die verstärkte Freisetzung endothelialer Abbauprodukte im
Blut bedingt [004] und die verstärkte AWF-induzierte Sekretion von ebenfalls
hGBP-1-exprimierenden EPC [031] lassen erhöhte hGBP-1-Werte bei Sepsis
vermuten.
Diese Studie kann dies bestätigen. 66,7% der positiven hGBP-1-Ergebnisse
wurden bei septischen Patientenseren gemessen. Demnach kann hGBP-1
eher als möglicher Sepsis- anstatt Entzündungsmarker gesehen werden.
73
Allerdings waren lediglich vier von 16 der septischen Blutproben in der
hGBP-1-Testung positiv. Dementsprechend war in 75% der Sepsisfälle
hGBP-1 negativ. Diesen Umstand spiegeln auch die Güteparameter von
hGBP-1 als Sepsismarker wieder. So liegt die Sensitivität bei 66,7% und die
Spezifität bei 97,3%. Auch im Exakten Fisher-Test wird ein signifikanter
Zusammenhang zwischen positivem hGBP-1-Wert und dem septischen
Zustand eines Patienten bestätigt.
Zusammenfassend zeigt hGBP-1 damit nur sehr unzuverlässig eine Sepsis
an, dies aber sehr spezifisch. Dies verdeutlicht ein Vergleich mit dem bereits
etablierten Entzündungsmarker CRP in der Studie von J. E. AGUILAR-
NASCIMENTO et al. aus dem Jahr 2007. Dort wurde der Vorhersagewert
einzelner Entzündungsmarker vor und nach einer Operation bezüglich des
postoperativen Infektionsrisikos untersucht. Unabhängig von den
Ergebnissen ihrer Studie, beschrieben sie einen signifikanten Anstieg aller
CRP-Werte nach der Operation. [002] Das bedeutet, der anerkannte
Entzündungsmarker CRP war bei allen Patienten nach einer Operation und
damit im entzündeten Zustand erhöht. Somit ist die Sensitivität von CRP,
eine Entzündung anzuzeigen, sehr hoch.
In dieser Studie war die Sensitivität von hGBP-1 eine Sepsis anzuzeigen
gering. Wird ein Sepsismarker gesucht, der eine Sepsis so sensitiv anzeigt,
wie CRP eine Entzündung, muss man anhand dieser Studie annehmen, dass
hGBP-1 als Sepsismarker nicht geeignet ist.
Als Ergebnis dieser Arbeit kann festgehalten werden, dass hGBP-1 im
Serum nachweisbar ist und mit dem Entzündungszustand ansteigt, jedoch
als sensitiver Entzündungs- oder Sepsismarker versagt.
Allerdings ist zu beachten, dass die Güteparameter des diagnostischen
Tests, wie die Sensitivität und Spezifität, die Wahrscheinlichkeit beschreiben,
einen positiven Befund bei einem kranken Patienten zu finden. Im klinischen
Alltag ist allerdings interessanter, wie wahrscheinlich die Krankheit bei einem
positivem Befund ist. Anhand der Kreuztabelle lassen sich die prädiktiven
Werte ableiten. Diese sind Maßzahlen der diagnostischen Aussagekraft. Im
Gegensatz zur Sensitivität und Spezifität sind sie von der Prävalenz der
Krankheit in der untersuchten Stichprobe abhängig. Um direkt
74
aussagekräftige positive und negative prädiktive Werte zu erhalten, muss die
zu untersuchende Stichprobe der reellen Prävalenz einer Krankheit
entsprechen. [027]
In dieser Arbeit wurden prävalenzunabhängig Blutseren der
unterschiedlichen Entzündungszustände abgenommen, um zunächst einmal
zu ermitteln, ob hGBP-1 überhaupt als Entzündungs- oder Sepsismarker
infrage kommt. Eine weitere Studie könnte zusätzlichen Aufschluss über die
diagnostische Aussagekraft anhand der prädiktiven Werte von hGBP-1
erreichen und damit anhand unverfälschter prädiktiver Werte eine
zuverlässige Aussage von hGBP-1 als Entzündungs- oder Sepsismarker im
klinischen Alltag ermöglichen.
Des Weiteren sind die Ergebnisse der Messung im Serum dieser Studie nicht
allumfassend für hGBP-1 zu sehen. Zur vollständigen Vorstellung bezüglich
des Nachweises und Verhaltens von hGBP-1 bezüglich unterschiedlicher
Entzündungszustände könnten ebenfalls weitere Untersuchungen Aufschluss
geben. So ist bekannt, dass Blutprodukte in unterschiedlichen Medien
unterschiedlich stark nachweisbar sind.
G. NORDIN et al. beschrieben 1996, dass CRP in niedrigen
Konzentrationsbereichen bis 20 mg/l in Blutserum geringere Werte anzeigt
als in EDTA-Plasma. Im Gegenzug dazu zeigt CRP im hohen
Konzentrationsbereich über 20 mg/l höhere Werte in Serum als in EDTA-
Plasma. [061] T. K. NILSSON et al. veröffentlichten im Jahr 2005 ihre
Ergebnisse hinsichtlich der unterschiedlichen CRP-Konzentrationen in
unterschiedlichen Medien nach acht bis elf eingefrorenen Jahren. Diese
Untersuchung ergab, dass der CRP-Wert im Serum höher ist als im Citrat-
Plasma, aber eine gute Übereinstimmung der CRP-Konzentration bezüglich
dem EDTA-Plasma- und Serum-CRP besteht. [060]
Diese Beispiele zeigen, wie empfindlich Blutprodukte auf die
Lagerungsdauer, Lagerungsart, aber vor allem auch auf das zu messende
Medium reagieren.
Demnach könnte eine Untersuchung von hGBP-1 in einem anderen Medium,
wie z.B. EDTA- oder Citrat-Plasma, neue Ergebnisse aufzeigen.
Auch könnte das in dieser Studie verwendete Detektionssystem von hGBP-1
im Blutserum zu ungenau gewesen sein. Der hier angewendete ELISA zum
75
Nachweis und zur Konzentrationsmessung des Proteins könnte Ursache für
die geringe Güte von hGBP-1 als Entzündungs- und Sepsismarker sein. So
erscheint ein Marker als ungeeignet, obwohl der Marker selbst vielleicht sehr
zuverlässig einen Zustand anzeigt, aber durch seine Detektion mangelhaft
ist. Durch eine mögliche Verbesserung der Empfindlichkeit des ELISAs
könnte die Detektionsrate von hGBP-1 im Serum erhöht werden. Diese
Erhöhung der Sensitivität des Detektionssystems könnte so auch zu einer
damit verbundenen Erhöhung der Sensitivität von hGBP-1 als Entzündungs-
und Sepsismarker führen. So ist es möglich, dass hGBP-1 trotz der
Ergebnisse dieser Studie ein exakter und zuverlässiger Entzündungs- und
Sepsismarker ist. Durch Verwendung eines verbesserten oder anderen
Detektionssystems könnte diese Möglichkeit anhand einer weiteren Studie
untersucht werden.
HGBP-1 zeigt auch in neuesten Studien viel Potential in der medizinischen
Forschung.
Neben der bereits angesprochenen denkbaren Möglichkeit bezüglich der
Chemoprävention von Prostatakrebs [065], untersuchten I. TIETZEL et al. im
Jahr 2009 die antimikrobiellen Effekte der GBP-Familie gegen Chlamydia
trachomatis. Dabei zeigten sie, dass hGBP-1 und hGBP-2 eine
wachstumshemmende Wirkung auf Chlamydia trachomatis haben. Wissend,
dass hGBP-1 und hGBP-2 durch IFN-γ induziert werden, zeigten hGBP-1
und hGBP-2 in Verbindung mit IFN-γ eine noch potentere Hemmung auf das
Chlamydienwachstum und verstärkten damit die IFN-γ-bedingte Bekämpfung
von Chlamydia trachomatis. [089] Auch Y. ITSUI et al. beschrieben 2009,
dass die Interferon-induzierte Expression von hGBP-1 einen antiviralen
Effekt auf die HCV-Replikation hat. Dabei bindet hGBP-1 das Hepatitis C –
NS5B Protein und hemmt die virale GTPase-Aktivität. [038]
HGBP-1 birgt somit noch viel Potential für klinische und experimentelle
Forschung.
Abschließend ist zu sagen, dass hGBP-1 ein vielversprechendes Protein zu
sein scheint, welches in vielen Bereichen wie Diagnostik, Therapie und
Prävention zu medizinischen Fortschritten führen kann.
76
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7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
°C Grad Celsius
Abb. Abbildung
ACCP American College of Chest Physicians
ALI Acute Lung Injury
AP alkalische Phosphatase
ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome
AUC Area Under The Curve
AWF Angiogene Wachstumsfaktoren
bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
bzw. beziehungsweise
CARS Compensatory Anti-Inflammatory Response Syndrome
CRP C-reaktives Protein
CVP Central Venous Pressure
d.h. das heißt
EIA Enzyme Immunoassay
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EMCV Enzephalomyokarditis Virus
EPC Endotheliale Vorläuferzellen
et al. et alii (Maskulinum), et aliae (Femininum) oder et alia
(Neutrum); lateinisch „und andere“
Fa. Firma
Flk-1 Fetal liver kinase 1
GDP Guanosin-Diphosphat
ggf. gegebenenfalls
GMP Guanosin-Monophosphat
GRADE Grades of Recommendation, Assessment, Development
griech. griechisch
GTP Guanosin-Triphosphat
hGBP-1 humanes Guanylat-Bindungsprotein-1
HLA Human Leukocyte Antigene
HMG-1 High-Mobility-Group 1
95
HUVEC Human Umbilical-Vein Endothelial Cells
ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecules 1
IFN-γ Interferon-γ
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
inf. infolge
ISRE IFN-Α-Stimulated Response Element
IZ Inflammatorische Zytokine
lat. lateinisch
Leukoz. Leukozyten
LfdNr Laufende Nummer
LPS Lipopolysaccharide
mAB monoklonaler Antikörper
MAP Mean Arterial Pressure
MARS Mixed Antagonistic Response Syndrome
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex
MMP-1 Matrix Metalloproteinase-1
MODS Multiple Organ Dysfunction Syndrome
n. Chr. nach Christus
NF-кB Nuclear Factor кB
od. oder
PASW Predictive Analytics Software
PatNr Patienten Nummer
pAVK periphere Arterielle Verschlusskrankheit
PBS Phosphat Buffered Saline
PCT Procalcitonin
POCT Point-Of-Care-Testing
R² Bestimmtheitsmaß
rhAPC Rekombinantes humanes aktiviertes Protein C
RIA Radioimmunoassay
Rpm Revolutions per minute
SCCM Society of Critical Care Medicine
ScvO2 Central Venous Oxygen Saturation
SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome
96
SOAP Sepsis Occurrence in Acutely Ill Patients
SSC Surviving Sepsis Campain
TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
TLR Toll-like Rezeptoren
TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α
u.a. unter anderem / und andere
USA United States of America
v. Chr. vor Christus
VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule 1
VEGF Vascular Endothelium Growth Factor
VSV Vesicular Stomatitis Virus
vWF von-Willebrand-Faktor
z.B. zum Beispiel
Z.n. Zustand nach
97
8 ANHANG
Tabelle 24: Überblick der Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs
LfdNr PatNr Geschlecht Messzeitpunkt Leukozyten CRP PCT IL-6 hGBP-1
1 1 männlich Sepsiszeitpunkt 1 14,3 342 290,12 4962,07 0
2 2 männlich Sepsiszeitpunkt 1 19,8 106 3,67 9056,9 0
3 3 männlich Sepsiszeitpunkt 1 8,8 322 11,16 5022,41 0
4 4 weiblich Sepsiszeitpunkt 1 28,8 223 0,37 61,46 51,82
5 5 männlich Sepsiszeitpunkt 1 10,1 290 3,04 3703,45 0
32 32 weiblich Sepsiszeitpunkt 1 8,02 282 0,79 179,93 0
33 33 männlich Sepsiszeitpunkt 1 19,65 68 1,28 18,06 51,82
34 34 männlich Sepsiszeitpunkt 1 11,8 226 35,93 4289,66 0
35 35 männlich Sepsiszeitpunkt 1 79,71 314 46,48 4858,62 49,62
36 36 männlich Sepsiszeitpunkt 1 8,84 128 3,81 614,83 0
37 37 weiblich Sepsiszeitpunkt 1 17,81 216 1,06 70,07 0
69 32 weiblich Sepsiszeitpunkt 2 9,99 237 0,39 961,38 0
70 33 männlich Sepsiszeitpunkt 2 26,04 54 1,2 73,96 30,91
71 34 männlich Sepsiszeitpunkt 2 11,01 446 24,77 997,59 0
106 32 weiblich Sepsiszeitpunkt 3 13,06 275 0,88 344,14 0
107 33 männlich Sepsiszeitpunkt 3 24,29 47 1,36 640,69 0
6 6 männlich präop 11,32 1,9 0 0
7 7 weiblich präop 7,42 1,9 0 0
8 8 weiblich präop 9,15 59 18,96 0
9 9 weiblich präop 13,26 31 0,49 0
10 10 weiblich präop 7,97 1,9 0 0
11 11 männlich präop 11,8 57 3,26 0
12 12 männlich präop 10,25 1,9 89,93 0
13 13 weiblich präop 4,55 1,9 29,51 0
14 14 weiblich präop 7,05 11 6,46 0
15 15 männlich präop 6,82 8 1,6 0
16 16 männlich präop 8 5 1,04 0
17 17 weiblich präop 6,31 1,9 0 0
18 18 männlich präop 6,88 30 3,13 0
19 19 weiblich präop 8,58 1,9 1,18 0
20 20 weiblich präop 13,29 2 0 0
21 21 männlich präop 6,75 1,9 0 0
22 22 männlich präop 8,09 5 0 0
23 23 weiblich präop 8,1 3 0 0
24 24 weiblich präop 5,63 4 0 0
27 27 weiblich präop 5,36 1,9 0 0
28 28 männlich präop 5,59 1,9 0 0
29 29 weiblich präop 6,13 6 0 12,73
30 30 weiblich präop 6,49 1,9 0 0
31 31 männlich präop 7,99 1,9 1,15 0
26 26 männlich postop Zeitpunkt 1 9,12 80 254,48 0
43 6 männlich postop Zeitpunkt 1 19,61 141 34,65 0
44 7 weiblich postop Zeitpunkt 1 10,26 99 148,26 0
45 8 weiblich postop Zeitpunkt 1 13,88 133 292,71 0
46 9 weiblich postop Zeitpunkt 1 10,47 80 16,46 0
47 10 weiblich postop Zeitpunkt 1 19,24 22 36,46 0
48 11 männlich postop Zeitpunkt 1 11,03 113 118,82 0
49 12 männlich postop Zeitpunkt 1 10,81 75 96,7 0
50 13 weiblich postop Zeitpunkt 1 11 76 192,99 0
51 14 weiblich postop Zeitpunkt 1 13,01 90 75,9 0
52 15 männlich postop Zeitpunkt 1 12,2 141 323,45 0
53 16 männlich postop Zeitpunkt 1 6,72 74 85,07 0
54 17 weiblich postop Zeitpunkt 1 14,24 51 11,04 0
55 18 männlich postop Zeitpunkt 1 10,65 230 147,01 0
56 19 weiblich postop Zeitpunkt 1 5,26 50 32,85 0
57 20 weiblich postop Zeitpunkt 1 11,31 57 39,93 0
58 21 männlich postop Zeitpunkt 1 8,08 63 59,65 0
60 23 weiblich postop Zeitpunkt 1 13,95 135 413,1 0
98
LfdNr PatNr Geschlecht Messzeitpunkt Leukozyten CRP PCT IL-6 hGBP-1
62 25 männlich postop Zeitpunkt 1 8,41 61 24,51 0
64 27 weiblich postop Zeitpunkt 1 6,62 3 0 0
67 30 weiblich postop Zeitpunkt 1 7,89 39 69,51 0
68 31 männlich postop Zeitpunkt 1 8,72 152 149,51 0
96 22 männlich postop Zeitpunkt 1 16,36 111 105,76 0
65 28 männlich postop Zeitpunkt 2 10,68 250 59,38 0
63 26 männlich postop Zeitpunkt 3 7,88 120 115,35 0
80 6 männlich postop Zeitpunkt 3 11,21 79 4,24 0
82 8 weiblich postop Zeitpunkt 3 8,35 177 95,63 29,09
88 14 weiblich postop Zeitpunkt 3 9,68 81 24,51 0
89 15 männlich postop Zeitpunkt 3 6,11 240 27,15 0
91 17 weiblich postop Zeitpunkt 3 10,96 84 19,1 0
92 18 männlich postop Zeitpunkt 3 8,25 198 102,29 0
97 23 weiblich postop Zeitpunkt 3 9,41 212 111,46 0
98 24 weiblich postop Zeitpunkt 3 5,11 42 2,29 0
99 25 männlich postop Zeitpunkt 3 7,7 73 40,76 0
101 27 weiblich postop Zeitpunkt 3 4,17 2 0 0
103 29 weiblich postop Zeitpunkt 3 6,81 182 117,01 0
104 30 weiblich postop Zeitpunkt 3 6,29 60 8,96 0
133 22 männlich postop Zeitpunkt 3 9,08 192 41,74 0
119 8 weiblich postop Zeitpunkt 4 5,99 97 44,1 0
117 6 männlich postop Zeitpunkt 5 10,26 32 5,76 0
118 7 weiblich postop Zeitpunkt 5 11,97 117 88,13 0
121 10 weiblich postop Zeitpunkt 5 6,11 11 8,96 0
123 12 männlich postop Zeitpunkt 5 15,08 149 151,04 0
124 13 weiblich postop Zeitpunkt 5 3,91 48 4,65 0
126 15 männlich postop Zeitpunkt 5 6,69 80 23,96 0
127 16 männlich postop Zeitpunkt 5 8,11 41 3,96 0
129 18 männlich postop Zeitpunkt 5 8,82 163 53,26 0
130 19 weiblich postop Zeitpunkt 5 6,54 154 17,43 0
122 11 männlich postop Zeitpunkt 6 8,83 33 0,07 0
102 28 männlich postop Zeitpunkt 7 4,67 180 7,99 0