die wirkung von ldl und h2o2 auf den na+/h+ - austauscher ... · ruhr - universität bochum prof....
TRANSCRIPT
Ruhr - Universität Bochum
Prof. Dr. med. B. Sanner
Dienstort: Bethesda Krankenhaus Wuppertal
Abteilung für Innere Medizin
Die Wirkung von LDL und H2O2 auf den
Na+/H+ - Austauscher in humanen Thrombozyten
via p38 MAP Kinase - Kaskade
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr – Universität Bochum
vorgelegt von
Christian Noll
aus Wuppertal
2002
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. B. Sanner Koreferent: Tag der Mündlichen Prüfung:
INHALTSVERZEICHNIS
3
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 3
Abkürzungen 5
1. Einleitung 7
1. 1. Der Na+/H+ - Austauscher 7
1. 2. Die Steuerung des Na+/H+ - Austauscher in Thrombozyten 9
1.3. Die Wirkung von LDL auf Thrombozyten 12
1.4. Die Wirkung von H2O2 auf Thrombozyten 14
1.5. Fragestellung 17
2. Material und Methoden 18
2.1. Fluoreszenz - Spektrophotometrie 18
2.1.1. Präparation der Thrombozyten 18
2.1.2. Färbung mit Fluoreszenz - Farbstoffen 18
2.1.3. Messung des intrazellulären pH (pHi) 19
2.1.4. Messung der intrazellulären Natriumionenkonzentration 21
2.2. Western Blot 22
2.2.1. Bestimmung der Proteinkonzentration 22
2.2.2. Polyacrylamid - Gelelektrophorese 23
2.2.3. Western Blot 23
2.3. Statistik 24
3. Ergebnisse 25
3.1. LDL und H2O2 bewirken einen Abfall des pHi in Thrombozyten 25
3.2. LDL und H2O2 bewirken eine Inhibition
der Na+/H+ - Austauscheraktivität 25
3.3. H2O2 bewirkt eine konzentrationsabhängige Inhibition
der Na+/H+ - Austauscheraktivität 28
3.4. LDL und H2O2 bewirken einen Abfall der intrazellulären
Natriumionenkonzentration 30
3.5. H2O2 bewirkt einen konzentrationsabhängigen Abfall
der intrazellulären Natriumionenkonzentration 32
3.6. Die Aktivierung von MKK 3/6 durch LDL und H2O2 35
3.7. Die Aktivierung der p38 MAP Kinase durch LDL und H2O2 36
3.8. Die Aktivierung des Hitze Schock Proteins 27 durch LDL und H2O2 37
INHALTSVERZEICHNIS
4
4. Diskussion 38
5. Zusammenfassung 43
6. Literatur 45
Danksagung 56
Lebenslauf 57
ABKÜRZUNGEN
5
Abkürzungen ADH Antidiuretisches Hormon
AVP Arginin – Vasopressin
BCECF-AM 2´,7 -́Bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein tetrakis
cAMP cyclisches Adenosin - 3´, 5 -́ Monophosphat
CHP Calcineurin B homologes Protein
cPLA2 cyclische Phospholipase A2
DAG Diacylglycerin
erk1(p44) Extracellular Response Kinase 1
erk2(p42) Extracellular Response Kinase 2
ERM Aktin – bindende Proteine Ezrin, Radixin and Moesin
GP Glykoproteine
H+-ATPase Protonen - Adenosintriphosphatase
HDL High - Density Lipoprotein
HEPES N-2-hydroxyethylpiperazin-N´-2-ethansulfonsäure
hsp 27 Hitze Schock Protein 27
InsP3 Inositol-(1,4,5)-trisphosphat
JNK c - Jun N - terminal Kinase
LDL Low Density Lipoprotein
LRP Low Density Lipoprotein-Rezeptor Related Protein
MAPK Mitogen aktivierte Protein Kinasen
MAPKKAP 2/3 Mitogen aktivierte Protein Kinase aktivierte Protein Kinasen 2/3
MEKK – 1 Mitogen aktivierte Protein extracellular response Kinase Kinase
MKK 3/6 Mitogen aktivierte Protein Kinase Kinase 3/6
Na+/H+-Austauscher Natrium – Protonen – Austauscher
Na+/K+- ATPase Natrium / Kalium Adenosintriphosphatase
NADPH Nicotinamidadenindinucleotid
NHE Na+/H+- Exchanger
NIK Nck – interakting Kinase
p160 ROCK p160 Rho – associated Kinase
p38 MAP Kinase p38 Mitogen aktivierte Protein Kinasen
p90 rsk p90 risbosomale S6 Kinase
PAF Platelet-activating Factor
ABKÜRZUNGEN
6
pHi intrazellulärer pH
PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
PKC Protein Kinase C
PLC Phospholipase C
PTK Protein Tyrosin Kinasen
SAPK Stress – Activated Protein Kinase
SB 202190 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)1H-imidazole
SBFI – AM Sodium Binding Benzofuran Isophthalate – Acetoxymethylester
Ser/Thr- Kinase Serin/Threonin Kinasen
SKF 86002 6-(4-Fluorophenyl)-2,3-dihydro-5-(5-pyridyl)imidazol[2,1-b]thiazole
TRAP thrombin-receptor activating peptide
TRP thrombozytenreiche Plasma
VLDL Very - Low - Density Lipoproteins
vs versus
EINLEITUNG
7
1. Einleitung
1. 1. Der Na+/H+ - Austauscher
Der Na+/H+ - Austauscher ist ein in der Membran gelegener elektronenneutraler
Austauscher, der intrazelluläre Protonen gegen extrazelluläre Natriumionen austauscht.
Dazu wird der Na+ - Gradient genutzt, den die Na+/K+- ATPase aufbaut [Livne et al.,
1987; Wakanayashi et al., 1997]. Anstelle von Natriumionen können ebenso
Lithiumionen transportiert werden [Gende et al., 1993].
Der Na+/H+ - Austauscher wurde erstmals 1967 von Mitchell et al. in Mitochondrien
identifiziert. Im Bakterium Streptokokkus faecalis konnte 1972 von Harold et al. die
Na+/H+ - Austauscheraktivität nachgewiesen werden. Vier Jahre später zeigten Mürer et
al. [1976] die Existenz des Na+/H+ - Austauscher bei Säugetieren. Seitdem konnte der
Na+/H+ - Austauscher (Na+/H+- exchanger: NHE) ubiquitär auf allen Zellen
nachgewiesen werden [Frelin et al., 1989; Wakanayashi et al., 1997].
Mittlerweile werden sechs verschiedene Isoformen des NHE unterschieden. NHE 1 ist
in vielen Zelltypen in der Zellmembran vorhanden und als erster von Sardet et al.
molekular kloniert worden. Er ist an der pH - und der Zellvolumen - Regulation
beteiligt. Da der NHE 1 bei verschiedenen Zelltypen mit Wachstumsfaktor aktiviert
werden konnte, wird dieser Kanal der „growth factor - activatable Na+/H+-exchanger“
genannt [Sardet et al., 1989]. Der NHE 1 ist auch auf Thrombozytenmembranen mit
Hilfe von spezifischen Antikörpern nachgewiesen worden. In
Thrombozytenmembranen findet sich eine höhere Anzahl NHE 1 als in Erythrozyten-
und Lymphozytenmembranen [Livne et al., 1991; Ruther et al., 1997; Rutherford et al.,
1997].
Die NHE 2, 3, 4 kommen in epithelialen Geweben vor und sind für den
Natriumionentransport dieser Zellen wichtig [Wakanayashi et al., 1997]. NHE 5 kommt
insbesondere im Gehirn und Nervengewebe vor und scheint hier spezifische Funktionen
zu haben [Attaphitaya et al., 1999]. NHE 6 ist in Mitochondrien gefunden worden
[Numata et al., 1998].
In Thrombozytenmembranen findet sich hauptsächlich der NHE 1, in Western Blots
konnten keine NHE 3 und NHE 4 – Proteine entdeckt werden [Livne et al., 1991;
Ruther et al., 1997; Rutherford et al., 1997]. Eine der frühesten Reaktionen in
Thrombozyten bei Kontakt mit Agonisten, die eine Aggregation auslösen, ist eine
EINLEITUNG
8
Aktivierung des NHE 1 [Zieve et al., 1996]. Die Aktivierung durch Thrombin oder
Thromboxan beginnt mit einem initialen Anstieg des intrazellulären pH (pHi). Diese
Alkalisation ist durch den Na+/H+ - Austauscher verursacht, der sofort nach der
Plättchenaktivierung stimuliert wird [Clemens et al., 1990; Sage et al., 1990; Siffert et
al., 1987, 1990; Borin et al., 1989; Poch et al., 1993]. Maximale Transportraten werden
bei pHi zwischen 6,3 und 6,5 beschrieben.
Neben dem Na+/H+ - Austauscher bestehen noch andere Mechanismen, die den pHi
beeinflussen. Zu diesen zählen die H+- ATPase, sowie der Na+ - abhängige und
unabhängige Cl-/HCO3- -Austauscher [Hackam et al., 1996; Tonnessen et al., 1990].
Allerdings konnten keine Aktivitätsänderung des Cl-/HCO3- - Austauschers bei
Alkalisation durch Thrombin festgestellt werden, so dass wahrscheinlich der
hauptsächliche Mechanismus der pHi - Änderung durch den NHE 1 erfolgt [Clemens et
al., 1990]. Das Alter der Thrombozyten ist für die Na+/H+ - Austauschaktivität irrelevant
[Marinho et al., 1997].
Der Na+/H+ - Austauscher besteht aus zwei Modulen. Die membranspannende Domäne
regelt den Ionen-Transport und besitzt einen allosterischen H+ - Sensor. Beim
Zusammentreffen mit Agonisten oder Volumenänderungen der Thrombozyten ist das
große C-terminale Ende mit über 300 Aminosäuren an der Aktivierung des NHE1
beteiligt. Die membranspannenden Anteile bestehen aus einer Serie von 12 α - Helices
[Wakanayashi et al. 1992, 1997; Livne et al., 1987; Orlowski et al., 1997 ;Counillon et
al., 1997]. Die Bindungsstellen für Natriumionen und dem Diuretikum Amilorid (einem
Blocker des NHE 1) sind auf der N-terminalen Seite entdeckt worden [Counillon et al.,
1993].
EINLEITUNG
9
1.2. Die Steuerung des Na+/H+ - Austauscher in Thrombozyten
Die Steuerung des NHE1 in Thrombozyten unterliegt einer Vielzahl von Mechanismen,
zu denen die Protein Tyrosin Kinasen, Protein Kinase C, das Ca2+/Calmodulin-bindende
System, die heterotrimeren G – Proteine, die kleinen G-Proteine und die Mitogen-
aktivierten Protein Kinasen (MAP Kinasen) zählen.
Sowohl die Protein Tyrosin Kinasen (PTK) [Grinstein et al., 1989; Moolenaar et al.,
1983] als auch die Protein Kinase C (PKC) können den NHE1 in verschiedenen Zellen
aktivieren [Moolenaar et al., 1994].
Von Sardet et al. [1989] sind verschiedene Serin/Threonin - Kinase (Ser/Thr)
Bindungsstellen bei der Klonierung des NHE 1 gefunden worden. Daraufhin konnte die
Phosphorylierung des NHE 1 - Proteins bei Behandlung mit Thrombin,
Wachstumsfaktor, Phorbol Ester und Okadaicsäure, einem Phosphatase-Inhibitoren,
bewiesen werden. Der Na+/H+ - Austauscher ist allerdings auch in ruhenden
Thrombozyten teilweise phosphoryliert [Sardet et al., 1990; Sardet et al., 1991]. Eine
direkte Phosphorylierung des NHE 1- Proteins durch PKC ist allerdings nicht gezeigt
worden. Außerdem hatten Veränderungen der vermutlichen Bindungsstelle der PKC -
Phosphorylierungsstelle keinen Einfluss auf die Aktivierung des NHE 1 bei Stimulation
mit Thrombin oder Phorbol Ester [Wakanayashi et al., 1997].
Eine Vielzahl von Thrombozyten - Rezeptoren gehören zur Familie der G-Protein
gekoppelten Rezeptoren, an deren Signalweg - Ende unter anderem die Aktivierung von
NHE 1 steht. Zu diesen gehören die Rezeptoren für Thrombin, Thromboxane, AVP
(Argininvasopressin) und PAF (Platelet-activating factor). Die G-Protein Aktivierung
führt zu einer Aktivierung der Phospholipase C (PLC), die durch Spaltung eines
spezifischen Membranphospholipides aus Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2)
Inositol-(1,4,5)-trisphosphat (InsP3) und Diacylglycerin (DAG) bildet. InsP3 ist für eine
Erhöhung der intrazellulären Ca2+ - Konzentration verantwortlich [Löffler et al., 1997].
Gα13 ist ein heterotrimeres G-Protein, welches die NHE 1 - Aktivität ohne Aktivierung
der Adenylatzyklasen und ohne Bildung von InsP3 steigert [Voyno-Yasenetskaya et al.,
1994]. Die Stimulation von Gα13 aktiviert die kleinen GTPasen Cdc42 und Rho A. Die
Steigerung der NHE 1 - Austauschrate wird dann durch Aktivierung der MAP-Erk
EINLEITUNG
10
Kinase Kinase (MEKK - 1) und der p38 MAP Kinase durch Cdc42 vermittelt [Hooley
et al., 1996]. Unabhängig von diesem Weg wird durch Rho A die p160 ROC Kinase
stimuliert. Die p160ROCK ist eine Ser/Thr- Kinase, die den NHE1 aktiviert. Die NHE1
Aktivierung via p160ROCK ist ein wichtiger Schritt in der Actin - Stress - Formation
und somit der Plättchenaggregation [Tominaga et al., 1998; Velerer et al., 1996].
Ein weiterer Weg der Aktivierung des Na+/H+ - Austauschers ist die Phosphorylierung
durch die Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase am C-terminalen Ende des NHE1
Proteins [Fliegel et al., 1992].
Aus der Aktivierung der Rezeptoren von Thrombin, Thromboxane, PAF, AVP und
Endothelin resultiert ein Anstieg des intrazellulären Calciumionengehaltes [Siffert et al.,
1995]. Mit dem Calciumionenanstieg steigt die Aktivität des Na+/H+ - Austauschers.
Auch der alleinige intrazelluläre Calciumionenanstieg führt zu einer Aktivierung des
Na+/H+ - Austauschers [Kimura et al., 1990; Ogawa et al., 1989; Siffert et al., 1984].
Die zytosolische Seite des NHE 1 - Proteins besitzt zwei Calmodulin-bindende Stellen
[Bertrand et al., 1994; Wakabayashi et al., 1994]. Fehlen diese Stellen, so führt dies zu
einer Dauerstimulation des Na+/H+ - Austauschers. Ist an der C - terminalen Seite des
NHE 1 kein Ligand gebunden, so könnte dieses zu einer Selbstinhibierung des
Austauschers führen. Die Ca2+/Calmodulin - Bindung könnte diese Autoinhibition
aufheben und zu einer Stimulation des Na+/H+-Austauschers führen, welche zu einer
Alkalisation führt [Wakabayashi et al., 1997].
Auch die Mitogen - aktivierte Protein Kinasen beeinflussen die Aktivität des Na+/H+ -
Austauschers. Mitogen - aktivierte Protein Kinasen (MAPK) sind eine Familie von
Threonin/Tyrosin aktiverten Serin/Threonin Kinasen, die eine wichtige Rolle im
Wachstum und bei anderen zellulären Funktionen übernimmt und auch die NHE
Funktion beeinflusst. Diese Kinasen - Familie kann eingeteilt werden in die erk1(p44),
erk2(p42) MAP Kinasen und die Stress-aktivierten Kinasen JNK/SAPK sowie die p38
MAP Kinase [Cano et al., 1995; Seger et al., 1995; Lewis et al., 1998].
Die p38 MAP Kinase ist eine Serin/Threonin Kinase. Sie wird stimuliert durch die
simultane zweifache Phosphorylierung der Threonin180 und Tyrosin182 Aminosäuren.
Die beiden Phosphorylierungsstellen sind nur durch eine einzige Aminosäure
voneinander getrennt [Whitemarsh et al., 1996]. Die p38 MAP Kinase kommt in vielen
Zelltypen wie auch in Thrombozyten vor [Kramer et al., 1995; Saklatvala et al., 1996].
EINLEITUNG
11
Eine Aktivierung der p38 MAP Kinase kann durch Mitglieder der Rho – Familie, der
GTPasen Rac und Cdc42 [Minden et al., 1995] und der MAP Kinase Kinase 3 und 6
(MKK 3/6) erfolgen [Zechner et al., 1998; Enslen et al., 1998; Toyoshima et al., 1997].
Wenn die p38 MAP Kinase phosphoryliert worden ist, aktiviert sie die MAP Kinase
aktivierte Protein Kinase 2/3 (MAPKKAP 2/3) und diese phosphoryliert das Hitze
Schock Protein 27 (hsp 27) [Roousseau et al., 1997].
In Thrombozyten wird die p38 MAP Kinase durch α-Thrombin, Kollagen und
Thromboxananaloga stimuliert. Bei Stimulation mit α-Thrombin zeigt sich nur eine
kurze Aktivierung der p38 MAP Kinase. Diese Aktivierung zeigte ihren Höhepunkt
nach einer Minute [Kramer et al., 1995; Saklatvala et al., 1996].
SB 203580 , SB 202190 wie auch SKF 86002 sind spezifische Inhibitoren der p38 MAP
Kinase, die an der ATP-Bindungsstelle der Kinase binden und diese so inaktivieren
[Tong et al., 1997]. Nachdem die p38 MAP Kinase blockiert wurde, zeigte sich keine
Aktivierung der MAPKAPK 2/3 und des hsp 27. Die Plättchenaggregation wird bei
Vorinkubation mit SB 203580 und Stimulierung mit Kollagen oder Thromboxane
Analoga (U46619) reduziert, während die Stimulation mit α-Thrombin keinen Einfluss
auf die Plättchenaggregation hat [Saklatvala et al., 1996].
Eine Rolle in der Aggregation von Blutplättchen spielt auch die cyclische
Phospholipase A2 (cPLA2), die von der p38 MAP Kinase phosphoryliert wird. Diese
Phosphorylierung kann durch SB 203580 inhibiert werden [Börsch-Haubold et al.,
1997, 1998].
In Kollagen-stimulierten Thrombozyten zeigte sich unter Einfluss von SB 203580 eine
Verminderung der cyclische Phospholipase A2 – Aktivität. Außerdem war unter dem
SB 203580 Einfluss die Arachidonsäurefreisetzung inhibiert [Börsch-Haubold et al.,
1997].
Allerdings ist nach Kramer et al. [1996] die Aktivierung von cyclischer Phospholipase
A2 durch α-Thrombin und dem „thrombin-receptor activating peptide“ (TRAP)
vollkommen unabhängig von der p38 MAP Kinase.
Bei einer Arginin-Vasopressin Stimulation von Thrombozyten konnte gezeigt werden,
dass die NHE 1 Aktivierung parallel zur Aktivierung der MAP Kinasen verläuft, sich
allerdings keine Steigerung der NHE 1 - Phosphorylierung zeigen ließ [Aharonovitz et
al., 1996].
EINLEITUNG
12
1.3. Die Wirkung von LDL auf Thrombozyten
Sowohl Thrombozyten als auch Lipoproteine sind in die Pathogenese der
Arteriosklerose involviert [Ross, 1993]. Lipoproteine beeinflussen die
Thrombozytenfunktion direkt, die Reaktivität der Thrombozyten bei Patienten mit
Hypercholesterinämie ist erhöht [Surya et al., 1993].
Supraphysiologische LDL (Low Density Lipoprotein) Konzentrationen haben bewirkt,
dass eine erhöhte Arachidonsäure Mobilisierung in die Thromboxan B2 Formation
vorliegt, so dass eine Beteiligung der Phospholipase A2 angenommen wird [Beitz et al.,
1986]. Durch die LDL-Einwirkung wird die Phospholipase C aktiviert, dadurch konnte
vermehrt DAG und InsP3 nachgewiesen werden [Andresw et al., 1986; Block et al.,
1988]. Des weiteren kommt es zu einer Calciumionen Freisetzung [Nofer et al., 1997;
Dunn et al., 1998]. Die Aktivierung durch Thrombin oder Thrombozyten beginnt mit
einem initialen Anstieg des pHi. Der Na+/H+ - Austauscher, der sofort nach der
Thrombozytenaktivierung stimuliert wird, bewirkt einen pH-Anstieg. [Clemens et al.,
1990; Sage et al., 1990; Siffert et al., 1987, 1990; Borin et al., 1989; Poch et al., 1993].
Nofer et al. zeigten das LDL in physiologischen Konzentrationen den Na+/H+ -
Austauscher inhibiert und dadurch eine intrazelluläre Azifikation stattfindet. Dieser
LDL-assozierte Effekt war konzentrationsabhängig.
Weiter sprechen die Ergebnisse der Studie von Nofer et al. [1997] gegen die Wirkung
von LDL über einen spezifischen LDL Rezeptor. So wurde das LDL mit
Cyclohexanedione verändert, welches die Affinität des LDL zum LDL-Rezeptor so
herabsetzt, dass keine Bindung möglich ist. Trotz dieser Veränderung wurde der Na+/H+
- Austauscher blockiert. Anhand von GPIIb/IIIa und von GPIIIb – freien Plättchen
konnte gezeigt werden, dass LDL nicht über diese Rezeptoren zu einer Blockierung des
Na+/H+ - Austauscher führte [Nofer et al., 1997]. Zu ähnlichen Ergebnissen kam eine
Studie von Hackeng et al., die die frühe Plättchen-Aktivierung durch LDL via p38 MAP
Kinase untersuchte. Hierbei wurden mit Hilfe von Antikörpern folgende Rezeptoren
blockiert : Integrins αIIbβ3 , Integrins α2β1 , FcγRII- Rezeptor, CD 36, CD68 (gp 110)
und Low Density Lipoprotein-Rezeptor Related Protein (LRP). Bei keinem dieser
blockierten Rezeptoren zeigte sich eine wesentliche Änderung der LDL induzierten p38
MAP Kinase Aktivität [Hackeng et al., 1999]. Da, wie die vorliegende Studie zeigt, die
p38 MAP Kinase eine wesentliche Rolle in der Blockierung des Na+/H+ - Austauscher
EINLEITUNG
13
spielt, kann davon ausgegangen werden, dass diese Rezeptoren auch nicht für die
Blockierung des Na+/H+ - Austauschers verantwortlich sind. Eine ältere Studie von
Kochhar et al. [1992] beschreibt, dass die Anreicherung der Thrombozytenmembran mit
Cholesterin zu einer Inhibierung des Na+/H+ - Austauschers führt.
Menschliche Thrombozyten, die in Kontakt mit LDL kommen, zeigen eine duale
Phosphorylierung der p38 MAP Kinase. Die Phosphorylierung konnte 10 Sekunden
nach der Zugabe von LDL beobachtet werden. Die Phosphorylierung der p38 MAP
Kinase scheint eines der ersten Signale bei Kontakt mit LDL zu sein, da sowohl eine
Inhibition der Thromboxan A2 - Formation als auch der Phospholipase C Aktivität,
sowie ein Anstieg der zytosolischen Calciumionenkonzentration und die Inhibition des
ERK1/2 Aktivators MEK die Phosphorylierung nicht beeinträchtigten. Auch die
Inhibition von „outside in signalling“ via Integrin αIIbβ3 hatte keinen Effekt auf die p38
MAP Kinase Phosphorylierung und auch Patienten ohne Integrin αIIbβ3 zeigten eine
normale p38 MAP Kinase Phosphorylierung.
Die p38 MAP Kinase Phosphorylierung nach LDL Kontakt konnte durch die Inhibition
der PKC schwach reduziert werden, während eine Vorinkubation mit cyclischem
Adenosinmonophosphat (cAMP) zu einer starken Phosphorylierung der p38 MAP
Kinase führte. Diese Erkenntnisse könnten dafür sprechen, dass es einen weiteren
Schritt in der Signalkaskade von dem LDL Kontakt zur Phosphorylierung der 38 MAP
Kinase gibt und dieser durch cAMP negativ kontrolliert wird.
Die cyclische Phospholipase A2 wird durch die p38 MAP Kinase phosphoryliert und
somit aktiviert, die Menge Thromboxan A2 steigt nach LDL Kontakt an. [Hackeng et
al., 1999]. Auch die kleinen G-Proteine Rap1 und Ral scheinen durch die p38 MAP
Kinase aktiviert zu werden. Hierbei zeigte die Inhibition der Cyclooxygenase und von
Thromboxan A2 Rezeptoren eine komplette Blockierung der GTPasen, was indiziert,
dass die Rap1 Aktivität ein Ergebnis der Thromboxan A2 Formation ist. Auch hier
waren beide G-Proteine unabhängig von der Bindungsfähigkeit des Integrins αIIbβ3 -
Rezeptors. Rap1 und Ral, aber nicht Ras, scheinen also eine Rolle in der Aktivierung
der Thrombozyten durch LDL zu spielen [Hackeng et al., 2000].
Neben der Aktivierung der cyclische Phospholipase A2 nach Kontakt mit LDL wird die
MAPKAPK 2/3 phosphoryliert und durch die MAPKAPK 2/3 das Hitze Schock
Protein 27, was für mit Kollagen stimuliert Thrombozyten nachgewiesen werden konnte
[Saklatvala et al., 1996; Börsch - Haubold et al., 1997]. Very - Low - Density
EINLEITUNG
14
Lipoproteine (VLDL) hat keinen Effekt auf den NHE, während High - Density
Lipoproteine (HDL) eine entgegengesetzte Wirkung wie LDL hat [Nofer et al., 1996].
1.4. Die Wirkung von H2O2 auf Thrombozyten
Freie Sauerstoffradikale sind hoch reaktive Substanzen, die mit Lipiden, Proteinen und
DNA reagieren und irreversible Änderungen an ihren molekularbiologischen Strukturen
verursachen können. Freie Sauerstoffradikale spielen aber auch eine Rolle in
verschiedenen Enzymreaktionen und bei der zellulären Signalübermittlung.
Thrombozytenadhäsion und -aggregation spielen eine Schlüsselrolle in der
Koronararteriosklerose. [Fitzgerald et al., 1986]. Das Vorhandensein von Leukozyten
bei Patienten mit instabilen Koronarplaques hat das Risiko von thromobotischen
Prozessen erhöht [Libby et al., 1996]. Leukozyten und Thrombozyten sind bei akuten
Koronarsyndromen nebeneinander und bei Patienten mit instabiler Angina pectoris als
Zellhaufen gefunden worden [Spangenberger et al., 1994; Ott et al., 1996; Entman et al.,
1996]. Hierbei scheint es so zu sein, dass Leukozyten und Neutrophile eine große
Menge freier Sauerstoffradikale produzieren, die die Thrombozyten direkt beeinflussen
[Levine et al., 1976]. Eine der ersten Studien von Marcus et al. [1977] zeigte, dass
Thrombozyten selbst freie Sauerstoffradikale produzieren. Diese Produktion war
unabhängig vom Cyclooxygenasesystem, da die Produktion trotz Gabe von Aspirin
nicht blockiert wurde. Die Produktion von Sauerstoffradikalen hatte ein
gleichbleibendes Niveau sowohl in ruhenden als auch in „aktivierten“ Thrombozyten.
Spätere Studien wiesen jedoch einen Anstieg der Produktion von Superoxidradikalen in
„aktivierten“ Thrombozyten nach [Cesbron et al., 1987; Iuliano et al., 1991; Leoncini et
al., 1991; Salvemini et al. 1989]. So konnte H2O2, das während der
Thrombozytenaktivierung freigesetzt wurde, eine Aggregation bei einer Vielzahl von
Agonisten inhibieren [Del Principe et al., 1985].
Für die Produktion von freien Sauerstoffradikalen in Thrombozyten konnten drei Wege
gefunden werden. Der erste sind die Membran - Oxidasen, die wie in Phagozyten
Superoxide aus NADPH als Elektronendonator erzeugen. Für die Existenz dieser
Oxidasen in Thrombozyten gibt es jedoch nur indirekte Hinweise [Salvemini et al.,
1991]. Der zweite Produzent von freien Sauerstoffradikalen ist die Nitroxidsynthethase,
die, wenn kein Arginin und genügend NADPH vorhanden ist, Superoxid und
EINLEITUNG
15
Hydrogenperoxid produziert [Pou et al., 1992]. Eine dritte Quelle für Radikale ist der
Eicosanoidstoffwechsel. Die freien Sauerstoffradikale können auf dem Niveau der
Prostaglandin H – Synthetase produziert werden [Egan et al., 1981; Kontos et al., 1985;
Kulmacz et al., 1987].
Verschiedene Studien haben die Wirkung von H2O2 auf Thrombozyten untersucht und
kamen dabei zu widersprüchlichen Ergebnissen. Ohyashiki et al. [1991] fanden heraus,
dass die mit Hilfe von ADH ausgelöste Thrombozytenaggregation durch H2O2 inhibiert
werden konnte. In dieser Studie wurden sehr hohe Konzentrationen von H2O2 benutzt (2
– 10 mmol/L). Bei diesen hohen Werten kann H2O2 Membranen und Rezeptoren
zerstören. In Studien, in denen eine Steigerung der Aggregation bei Behandlung mit
Agonisten beobachtet worden war, wurden niedrigere H2O2 Konzentrationen benutzt,
die eher an physiologisch vorkommenden Werten orientiert waren (10-12 µmol/L)
[Canoson et al., 1974; Del Principe et al., 1985].
Die Interaktion zwischen H2O2 und die in Thrombozyten aktivierten Signalwegen wird
im folgenden dargestellt. Freie Arachidonsäure ist eine Vorstufe des
Hauptplättchenaktivators Thromboxan A2. Die Verfügbarkeit von Arachidonsäure wird
über zwei Mechanismen gesteuert. Erstens durch die Freisetzung von Phospholipiden
durch die Aktivierung von Phospholipasen und zweitens durch die Arachidonyl - CoA
Reduktase. Es konnte gezeigt werden, dass diese Arachidonyl - CoA Reduktase durch
H2O2 inhibiert wird. Dadurch kommt es zu einem Anstieg von freier Arachidonsäure
und zu einer vermehrte Umwandlung in Thromboxan A2 [Hornberger et al., 1990].
Außerdem haben mehrere Studien gezeigt, dass freie Sauerstoffradikale direkt die
Phospholipase A2 aktivieren [Iuliano et al., 1992, 1994; Hashizume et al., 1991; Miller
et al., 1994]. Die Phospholipase A2 wird durch Calciumionen aktiviert. Allerdings ist
unklar, ob H2O2 die intrazelluläre Calciumionenfreisetzung fördert, wie es Mirabell et
al. [1989] beschrieben haben, oder die Calciumionenmenge gleich bleibt, wie es Iuliano
et al. [1992] beschrieben haben.
Die Stimulation der Phospholipase A2 wird wahrscheinlich indirekt durch die
Aktivierung von Protein Tyrosin Kinasen (PTK) gesteuert. In Thrombozyten führen
viele Agonisten zu einer Aktivierung der Protein Tyrosin Kinasen. In einer Studie
wurden die PTK durch spezifische Inhibitoren blockiert, was selbst bei einer
EINLEITUNG
16
Aktivierung von GP IIb/ IIIa – Rezeptoren zu einer Blockade der Aggregation führte
[Gold et al., 1990]. Hingegen führte die Inhibition von Protein Tyrosin Phosphatasen,
die die Aktivität von PTK inhibieren, zu einer Thrombozytenaggregation. Es konnte
gezeigt werden, dass diese Protein Tyrosin Phosphatasen durch H2O2 inhibiert wurde.
Dadurch wurde die PTK vermehrt aktiviert [Hecht et al., 1992].
Die Phospholipase A2 zeigte einen Anstieg ihrer Aktivität, nachdem die p38 MAP
Kinase aktiviert worden ist [Börsch-Haubold et al., 1997, 1998]. Die MAP Kinase wird
durch die Protein Tyrosin Kinasen aktiviert [Lin et al., 1993]. Ein weitere Mechanismus
der H2O2 Wirkung ist die Aktivierung der Cyclooxgenase Enzyme, so dass vermehrt
Thromboxan A2 gebildet wird [Taylor et al., 1983]. Dieser Effekt konnte durch die
Gabe von Aspirin inhibiert werden [Pratico et al., 1991].
EINLEITUNG
17
1.5. Fragestellung
Die Pathogenese der Arteriosklerose ist ein komplexer Prozess, in dem unter anderem
drei Komponenten eine wichtige Rolle spielen. Dies sind Thrombozyten, Lipoproteine
und freie Sauerstoffradikale [Ross, 1993]. Im Mittelpunkt der Entstehung der
Koronararteriosklerose stehen hierbei die Thrombozytenadhäsion und -aggregation
[Fitzgerald et al., 1986]. Bei Patienten mit instabiler Angina pectoris fanden sich
Zellhaufen, die aus Thrombozyten, Leukozyten und Neutrophilen bestanden. Diese
Zellansammlungen bildeten freie Sauerstoffradikale, die, wie LDL, insbesondere die
Thrombozytenfunktion beeinflussten [Libby et al., 1996; Levine et al., 1976].
Besonders der intrazelluläre pH (pHi) ist in Thrombozyten für deren Funktion wichtig.
Der intrazelluläre pH wird durch ein Na+/H+ - Austauscher System aufrechterhalten und
verändert.
Es stellt sich die Frage, welchen Einfluss LDL auf den pHi, die intrazelluläre
Natriumionenkonzentration [Na+]i und die Na+/H+ - Austauscheraktivität hat. Außerdem
ist der Effekt von H2O2 auf den pHi, die intrazelluläre Natriumionenkonzentration
[Na+]i und die Na+/H+ - Austauscheraktivität zu untersuchen.
Interessant ist auch die Frage der Signaltransduktionwege, die zu einer Veränderung der
Na+/H+ - Austauscheraktivität führen. Welchen Einfluss hat die Aktivität der p38 MAP
Kinase auf die Na+/H+ - Austauscheraktivität in Thrombozyten? Daraus ergibt sich die
Frage, ob auch anderen zur p38 MAP Kinasen Familie gehörenden Kinasen durch die
LDL oder H2O2 Gabe beeinflusst werden. Im einzelnen sind dies die Mitogen aktivierte
Protein Kinase Kinase 3/6 (MKK3/6), die die p38 MAP Kinase aktiviert und das Hitze
Schock Protein 27, welches von der p38 MAP Kinase aktiviert wird. Nach welchen
Zeiten werden diese Signaltransduktionswege aktiviert, kommt es zu einer schnellen
oder eher langsamen Reaktion?
Letztendlich soll die Frage beantwortet werden, wie der Na+/H+ - Austauscher in
Thrombozyten durch LDL und H2O2 via p38 MAP Kinase beeinflusst wird und somit
zur Genese der Arteriosklerose beiträgt.
MATERIAL UND METHODEN
18
2. Material und Methoden
2.1. Fluoreszenz – Spektrophotometrie
2.1.1. Präparation der Thrombozyten
Es wurde gesunden und erwachsenen Probanden, die in den letzten 14 Tage keine
Medikamente eingenommen hatten, venöses Blut entnommen. Die Blutprobe aus
Citratblut (Mischungsverhältnis: 9 Teile Blut : 1 Teil Natrium-Citrat) wurde bei 1500
U/min über 10 Minuten zentrifugiert. Das thrombozytenreiche Plasma (TRP) wurde
dann abpipettiert und im Verhältnis 10 Teile TRP : 1 Teil Acid-Citrat-Dextrose [85
mmol/L Trisodium Citrat, 64 mmol/L Citric Acid, 111mmol/L Glucose] vermischt und
bei 1800 U/min zentrifugiert. Danach folgte das Verwerfen des Überstandes und das
Aufmischen des Thrombozytenpellets mit PRP – Puffer [NaCl 135 mmol/L, KCl 2,7
mmol/L, NaHCO3 10 mmol/L, D-Glucose 6 mmol/L, N-2-hydroxyethylpiperazin-N´-2-
ethansulfonsäure 10mmol/L (HEPES, Calbiochem, Bad Soden), Natrium-HEPES 10
mmol/L (Calbiochem, Bad Soden); pH 7,4] mit Albumin – Lösung (10 Teile PRP : 1
Teil Albumin 6%).
2.1.2. Färbung mit Fluoreszenz - Farbstoffen
Je nach Messung wurden die Thrombozyten mit 10µl des membrangängigen pH-
sensitiven Fluoreszenz – Farbstoffes 2´,7´-Bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-
carboxyfluoresceinacetomethylester (BCECF-AM; Calbiochem, Bad Soden)
Endkonzentration 0,1 µmol/L oder mit 10 µl des membrangängigen Na-sensitiven
Fluoreszenz – Farbstoffes Sodium Binding Benzofuran Isophthalate -
Acetoxymethylester (SBFI – AM; Calbiochem, Bad Soden) Endkonzentration 0,1
µmol/L bei 37° C über 30 Minuten im Wasserbad unter Lichtabschluß inkubiert.
Danach folgte eine Zentrifugation mit 1800 U/min für 15 Minuten und das Verwerfen
des Überstandes zur Entfernung des überschüssigen extrazellulären BCECF oder SBFI -
Farbstoffes. Das Thrombozytenpellet wurde mit PRP – Puffer resuspendiert.
Einigen Proben wurde 20 Minuten vor der fluoreszenzspektrophotometrischen Analyse
10µmol/L SB 202190 (4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)1H-
imidazole; Calbiochem, Bad Soden) oder 10 µmol/L SKF 86002 (6-(4-Fluorophenyl)-
MATERIAL UND METHODEN
19
2,3-dihydro-5-(5-pyridyl)imidazol[2,1-b]thiazole;Calbiochem, Bad Soden) zugegeben.
Je nach Versuch wurden 10 Minuten vor der Analyse 0,5 g/L LDL (freundlicherweise
von Herrn PD Dr. med. Nofer, Institut für Klinische Chemie und
Laboratoriumsmedizin, Universitätsklinik Münster bereitgestellt) oder unterschiedliche
Konzentrationen H2O2 (Calbiochem, Bad Soden) hinzugefügt und bei Raumtemperatur
vorinkubiert.
2.1.3. Messung des intrazellulären pH (pHi)
Bei der Präparation der Thrombozyten in der oben dargestellten Form wurde der
membrangängige Ester Fluoreszenz-Farbstoff (BCECF-AM) intrazellulär durch
Esterasen in den nicht permeablen, pH – sensitiven Fluoreszenz-Farbstoff BCECF
gespalten, der sich intrazellulär anhäufte [Ng et al., 1990; Reusch et al.,1993; Tepel et
al., 1996].
Zur Messung der Änderung des intrazellulären pHi wurde ein Fluoreszenz-
Spektrophotometer F-2000 mit ROM.Board 251-0250 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)
verwendet. Dabei wurde die abgegebene Lichtenergie (Emission) nach Anregung eines
Farbstoff-Moleküls in Abhängigkeit von der eingestrahlten Lichtenergie (Exzitation)
bestimmt.
Als Lichtquelle diente eine 150 W Xenon – Lampe, deren Wellenlängen mit einer
Genauigkeit von ± 5 nm eingeblendet wurden. Sowohl zur Exzitation als auch zur
Messung der Emission wurden konkave, gegitterte Monochromatoren mit 900 lines/mm
verwendet. Wellenlänge und Schlitze wurden per Computer gesteuert. Die Fluoreszenz
von 1000µl der Thrombozyten-Suspension wurde in einer Quarzküvette bei einer
Exzitationswellenlänge von 440 nm (entsprechend der pH-insensitiven
Exzitationswellenlänge von BCECF) und 495 nm (entsprechend der pH-sensitiven
Wellenlänge) gemessen, wobei die Emissionswellenlänge 530nm (Bandbreite 10 nm)
betrug. Der Wechsel erfolgte mit einer Frequenz von 2 Hz. Die Emissionssignale
wurden über einen Analog-Digital-Wandler verarbeitet.
Bei den Messungen mit BCECF – AM wurde jeder Probe die Fluoreszenzintensität
anhand einer Eichkurve dem intrazellulärem pHi zugeordnet. Zur Erstellung der
Eichkurve wurde der Probe 10 µmol/L Nigericin zur Angleichung des extra- und
intrazellulären pH - Wertes zugesetzt [Thomas et al., 1979]. Durch Titration des pH-
MATERIAL UND METHODEN
20
Wertes mittels Fluoreszenzspektrophotometrie konnte eine lineare Kalibrationskurve in
einem pH-Bereich von 6,2 bis 7,4 erstellt werden (Abb. 1).
Die Aktivitätsmessung des Na+/H+ - Austauschers erfolgte durch Stimulation mit 100µl
Propionsäure (Stammlösung 1 mol/L, pH 7,4). Die Aufnahme der undissoziierten
Propionsäure führte zur intrazellulären Ansäuerung, was eine Stimulation des Na+/H+ -
Austauschers hervorrief [Ng et al., 1990; Grinstein et al., 1984; Tepel et al., 1996]. Die
Endkonzentration von 100 mmol/l Propionsäure bewirkte keine osmotisch bedingte
Aktivierung des Na+/H+ - Austauschers [Rosskopf et al., 1992; Tepel et al., 1996].
Ebenso konnte gezeigt werden, dass der Wiederanstieg des intrazellulären pHi durch den
Na+/H+ - Austauscher hervorgerufen wurde [Grinstein et al., 1984].
Abb. 1: Eichkurve. Die Fluoreszenz – Intensität bei einer Exzitationswellenlänge von 495 nm wurde gegen den pH aufgetragen. Die intrazelluläre Eichung des Fluoreszenz-Farbstoffes BCECF ist linear im pH – Bereich zwischen 6,2 und 7,4.
MATERIAL UND METHODEN
21
Der initiale Anstieg des pHi kann mathematisch als ein exponentieller Prozess
bezeichnet werden, welcher durch folgende Gleichung beschrieben werden kann:
pH i,t = pH i,x – (pH i,x –pH i,0) x e –kt
pH i,t ist dabei der pHi zum Zeitpunkt t, pH i,0 ist der pHi zum Zeitpunkt 0, z.B. zum
Zeitpunkt des Wiederanstiegs des pHi, k ist die Austauschkonstante, pH i,x kennzeichnet
den neuen steady state.
Die initiale Geschwindigkeit des Anstiegs von pHi und damit die Austauschaktivität des
Na+/H+ - Austauschers wurde mit der Software GraphPad-Inplot 4.02 (GraphPad
Software Inc., San Diego California) berechnet und in der Einheit pHi/s ausgedrückt.
Der Berechnung lag folgende Gleichung zugrunde:
V = V0 + Vmax/[ 1 + (10 pH0,5 / 10 pHi ) n ]
V0 repräsentiert die Na+/H+ - Austauscheraktivität bei basalem pHi, welche gleich 0
gesetzt wurde. Benutzt man experimentell hergeleitete Datenpaare von initalem pHi und
V, so ergibt diese mathematische Annäherung die maximale Geschwindigkeit des
Na+/H+ - Austauschers (pH0,5). Kalkulationsfehler liegen in einer Spanne von 10-15 %
für Vmax und <3% für pH0,5. Andere mathematische Berechnungen (z.B. lineare,
exponentielle oder logarithmische) zeigen schlechtere Ergebnisse, insbesondere bedingt
durch höhere Kalkulationsfehler [Rosskopf et al., 1992].
2.1.4. Messung der intrazellulären Natriumionenkonzentration
Der Thrombozyten – Suspension wurden 10 µmol/L des membrangängigen
Natriumionen-sensitiven Fluoreszenz-Farbstoff SBFI-AM zugegeben und diese 30
Minuten bei 37° C inkubiert. Der Fluoreszenz – Farbstoff SBFI-AM wurde intrazellulär
durch Esterasen in eine nicht permeable Form gespalten. SBFI stellte den freien
zytosolischen Natriumionenanteil der Thrombozyten dar [Borin et al., 1990;
Harootunian et al. 1989]. Die Messungen mit SBFI-AM wurden bei
Exzitationswellenlängen von 340 nm und 385 nm durchgeführt. Die
Emissionswellenlänge betrug 490 nm (Bandbreite jeweils 10nm). Hierbei ist ein Abfall
der intrazellulären Natriumionenkonzentration mit einem Anstieg der
MATERIAL UND METHODEN
22
Fluoreszenzexzitationsrate F340nm/F385nm beobachtet worden [Tepel et al., 1994;
Borin et al., 1990]. Die Eichkurve für die intrazelluläre Natriumionenbestimmung
wurde freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. med. M. Tepel gestellt.
2.2. Western Blot
Beim Western Blot wurde ein Proteingemisch elektrophoretisch aufgetrennt und von
einem Acrylamidgel auf eine feste Polymerschicht (z.B. Nitrozellulose) transferiert.
Durch Zugabe eines monoklonalen Antikörper oder eines polyklonalen Serums kam es
zu einer Immunreaktion zwischen dem spezifischen Antikörper und dem dazugehörigen
Antigen. Dieser Komplex konnte durch die Bindung eines zweiten enzymkonjugierten
Antikörpers und autoradiographisch durch Auflegen eines Röntgenfilms visuell
dargestellt werden.
2.2.1. Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Thrombozyten wurden wie oben beschrieben gewonnen (s. Abschnitt 2.1.1.), dann
wurden die Plättchen je nach Versuch mit 10µmol/L SB 202190 oder SKF 86002 für 10
Minuten vorinkubiert und dann in jeweils unterschiedlichen Konzentrationen oder
unterschiedlich lange mit H2O2 oder LDL inkubiert.
Der Stop der Reaktion wurde durch Zugabe von 5% iger Formaldehydlösung erreicht,
(100 µL 5% Lösung auf 400 µL Probe, also eine Endkonzentration von 1%). Die
Proben wurden für 15 Minuten auf Eis gestellt und danach für 15 Minuten bei 4° C bei
14000 U/min (~ 10000g) zentrifugiert. Es erfolgte eine Aufnahme in 100 µL Laemmli
Puffer. Dieser bestand aus 3,55 mL Wasser, 2,5 mL Glycerol, 2,0 mL 10 % SDS, 1,25
mL Tris-HCl und 0,2 mL 0,5 % Bromophenol Blau (pH = 6,8). Kurz vor dem
Gebrauch des Puffers wurden 950 µL vom Laemmli Puffer abpipettiert und 50 µL β -
Merkaptoethanol zugegeben.
Mit Hilfe einer Nadel (0,33 mm) und durch wiederholtes Aufnehmen mit der Pipette
wurden die Proben zerkleinert. Die Messung des Proteingehaltes erfolgte nach
Bradford, wobei die Proben in Laemmli Puffer aufgelöst wurden.
Hierbei wurde Coomassie Brilliant Blau an die Proteine gebunden und dabei verschob
sich das Absorptionsmaximum von 465 nach 595 nm. Dazu wurden 100 µL Bradford
Reagenz (Bio-Rad, California, USA) mit 400 µL 0,9 % NaCl Lösung gemischt, die
MATERIAL UND METHODEN
23
Proben (1-2 µL) zugegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung
wurde bei 595 nm durchgeführt.
2.2.2. Polyacrylamid - Gelelektrophorese
Die SDS – Polyacrylamid – Gelelektrophorese wurde nach der Methode von Laemmli
durchgeführt. Zur Trennung der Proteine wurden 12%ige Polyacrylamidgele verwendet.
Das Sammelgel bestand aus 4%ige Acrylamidlösung und enthielt 6,1 mL H2O, 1,3 mL
30%igen Acrylamid, 2,5 mL 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,1 mL 10% w/v SDS, 50µL 10%
APS und 10µL TEMED. Das Trenngel enthielt 3,4 mL H2O, 4,0 mL 30%iges
Acrylamid, 2,5 mL 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 0,1 mL 10%igen w/v SDS, 50µL 10% APS
und 5µL TEMED. Die Proben enthielten denselben Proteingehalt und wurden auf 20µL
aufgefüllt, danach wurden sie für 5 Minuten auf 95° C erhitzt, kurz bei 14000 U/min
zentrifugiert und auf 1 mm dicke Gele bei einer Spannung von 120 Volt für 90 Minuten
elektrophoretisch getrennt. Der Elektrophoresepuffer bestand aus 25mmol/L Tris, 192
mmol/L Glycin und 0,1 % (w/s) SDS. Ein Marker aus einem vorgefärbten
Proteingemisch diente zur Erkennung der molekularen Massen der detektierten Proteine
(Prestained SDS Page Standard, Bio-Rad, California, USA)
2.2.3. Western Blot
Die Western Blots wurden mit Hilfe des Semi-Dry-Blotsystems von Bio-Rad
Laboratories (Californien, USA) durchgeführt. Die Nitrozellulose und die 6
Blotpapiere wurden im Blotpuffer eingeweicht, 3 Blotpapiere wurden auf das Semi-
Dry-Blotsystem gelegt, dann die Nitrozellulosemembran, dann das Gel und oben drauf
noch einmal 3 eingeweichte Blotpapiere. Für 90 Minuten wurde bei einer Stromstärke
von 300mA geblottet. Es folgte die Anfärbung des Gels nach Coomassie Brilliant.
Geblockt wurde die Membran mit Blocking – Puffer (5 % Magermilchpulver in TBS-T
oder 5% BSA in TBS-T), bei 4° Celsius über Nacht. Der TBS – T Puffer bestand aus
2,42 g Tris Base, 8g NaCl, die mit H2O auf 1 L aufgefüllt wurden, danach mit HCl auf
pH 7,6 einjustiert, dazu wurde 0,1 % Tween-20 (New England Biolabs; USA) gegeben.
Alternativ zur Blockung über Nacht wurde die Membran 2 Stunden bei
Raumtemperatur geblockt. Für 24 Stunden wurde bei 4° C ein polyklonaler Antikörper
(Rabbit IgG) gegen MKK 3/6 (New England BioLabs, USA) (1:1000 in TBS-T), p38
MATERIAL UND METHODEN
24
MAP Kinase (New England BioLabs, USA) (1:1000 in TBS-T) oder ein polyklonaler
Antikörper gegen hsp27 (New England BioLabs, USA) (1:1000 in TBS-T) auf die
Membran gebracht. Die Membran wurde 3 mal für je 10 Minuten mit TBS-T
gewaschen, ein polyklonaler Kaninchen Antikörper – Goat Anti Rabbit, (1:2000, TBS-T
mit 5% Magermilchpulver) für 2 Stunden bei Raumtemperatur zugegeben. Danach
wurde die Membran 3 mal 10 Minuten mit TBS-T gewaschen.
Zur Detektierung wurde ein Chemiluminiszenzverfahren verwendet. Dazu wurden 1 ml
der Lösungen 1 und 2 (Amersham, USA) in einem Verhältnis von 1:1 gemischt und für
1 Minute auf die Membran gebracht. Danach wurde die Membran in einer Folie
eingeschweißt und für unterschiedliche Zeiten auf den Röntgenfilm gelegt. Im Anschluß
wurde der Röntgenfilm entwickelt, die Banden wurden sichtbar.
Wenn nicht anders angeben, wurden alle Substanzen von Sigma, Deisenhofen bezogen.
2.3. Statistik
Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben.
Zum Vergleich von zwei Gruppen wurde der nicht - parametrische Mann-Whitney-U
Test verwendet. Zur Analyse der Daten und dem Erstellen der Diagramme wurde Prism
2.0 (Software for Science, San Diego, CA, USA) benutzt. Bei p<0,05 im zweiseitigen
Test wurde die Nullhypothese abgelehnt und Unterschiede als signifikant bewertet.
Signifikante Unterschiede (p<0,05) wurden mit (*), p<0,01 wurden mit (**)
gekennzeichnet und hochsignifikante Unterschiede (p<0,001) mit (***) gekennzeichnet.
Sollten Fehlerbalken nicht in der Graphik erscheinen, so liegen die Fehler innerhalb der
Größe der Symbole.
ERGEBNISSE
25
3. Ergebnisse
3.1. LDL und H2O2 bewirken einen Abfall des pHi in Thrombozyten
Nach Vorgabe von 0,5 g/L LDL für 10 Minuten kam es zu einem signifikanten Abfall
des pHi von 7,40 ± 0,02 (n=63) auf 7,31 ± 0,03 (n=18, p<0,05). Thrombozyten wurden
mit den spezifischen Hemmstoffen der p38 MAP Kinase, SB 202190 oder SKF 86002,
für 10 Minuten vorinkubiert und danach wurde 0,5 g/L LDL für 10 Minuten zugegeben.
Nach Vorinkubation mit 10 µmol/L SKF 86002 war der LDL-induzierte Abfall des pHi
blockiert. Gegenüber der Inkubation mit LDL alleine führte die Vorgabe von SKF
86002 zu einem signifikanten Anstieg des pHi auf 7,42 ± 0,04 (n=8, p<0,05).
Eine repräsentative Originalabbildung zeigt Abbildung 2A, in der der LDL-abhängige
pHi - Abfall und der pHi -Anstieg durch die Zugabe von SKF 86002 zu LDL deutlich
werden.
Nach Vorgabe von 20 µmol/L H2O2 für 10 Minuten kam es zu einem signifikanten
Abfall des pHi von 7,40 ± 0,02 (n=63) auf 7,29 ± 0,03 (n=28, p<0,05). Nach
Vorinkubation mit 10 µmol/L SKF 86002 war der H2O2-induzierte Abfall des pHi
blockiert. Gegenüber der Inkubation mit H2O2 alleine führte die Vorgabe von SKF
86002 zu einem signifikanten Anstieg des pHi auf 7,38 ± 0,04 (n=6, p<0,05).
Die Abbildung 2B zeigt eine repräsentative Originalabbildung in der der Abfall des pHi
nach 20 µmol/L H2O2 Zugabe zu sehen ist. Außerdem wird der pHi - Anstieg nach 10-
minütiger Vorinkubation mit 10 µmol/L SKF 86002 und anschließender H2O2 - Gabe
gezeigt. In Tabelle 1 werden die wichtigsten Ergebnisse zur besseren Übersicht kurz
zusammengefasst.
3.2. LDL und H2O2 bewirken eine Inhibition der Na+/H+ - Austauscheraktivität
Abbildung 3A und 3B zeigen eine repräsentative intrazelluläre pHi - Veränderung der
mit BCECF beladenen Thrombozyten nach Azifizierung mit Propionsäure und die
Effekte der Zugabe von LDL, H2O2 und SKF 86002. Nach Zugabe der Propionsäure
kam es zu einem Absinken des basalen pHi. Diese Azifizierung führte zu einer
Aktivierung des Na+/H+ - Austauschers, welcher intrazelluläre Protonen gegen
extrazelluläre Natriumionen austauschte, um den intrazellulären pH auszugleichen. Aus
ERGEBNISSE
26
der Steigung des pHi Anstiegs berechnete sich die maximale Aktivität des Na+/H+ -
Austauscher (Vmax) in pHi/s. Aufgrund von Dosis-Wirkungs-Untersuchungen konnte
gezeigt werden, dass nach Stimulation mit 100 mmol/l Propionsäure die maximale
Na+/H+ - Austauscheraktivität gemessen werden kann.
Abb. 2 : A.): Repräsentative Originalabbildungen, die den Abfall des pHi durch die Gabe von 0,5g/L LDL zeigt. Die Vorgabe des spezifischen Inhibitors der p38 MAP Kinase SKF 86002 blockierte den LDL - induzierten Abfall. B.): Zeigt den Abfall des pHi bei Zugabe von 20µmol/L H2O2. Auch hier führt die Vorgabe des spezifischen Inhibitors SKF 86002 zu einer Blockierung des H2O2 - induzierten pHi - Abfalls. In beiden Versuchen wurden die Fluoreszenzintensität bei 530 nm, bei der pH-sensitiven Wellenlänge von 495 nm und der pH-unsensitiven Wellenlänge von 440 nm der mit BCECF beladenen Thrombozyten über einen Zeitraum von 10 Minuten gemessen.
7 . 2
7 . 3
7 . 4C o n t r o l
L D L
S K F + L D L
2 m i n
pHi
7 . 0
7 . 2
7 . 4 C o n t r o l
H 2O 2
S K F + H 2O 2
2 m i n
pHi
A
B
ERGEBNISSE
27
Tabelle 1: Wirkung von LDL und H2O2 auf den intrazellulären pH (pHi), die maximale Na+/H+ - Austauschaktivität und den intrazellulären Natriumwert (∆[Na+]i) in Thrombozyten. Die Messungen wurden mit BCECF oder SBFI beladenen humanen Thrombozyten durchgeführt. SB 202190 und SKF 86002 wurden jeweils 20 Minuten vor der Messung zugegeben. LDL und H2O2 wurden jeweils 10 Minuten vor der Messung zugegeben (* bedeutet p<0,05 versus Kontrolle, ** p<0,01, *** p<0,001; # bedeutet p<0,05 versus LDL oder H2O2 alleine, ## p<0,01, ### p<0,001).
pHi Na+/H+-Austauscher ∆[Na+]i
x10-3pHi/s mmol/L Kontrolle 7,40±0,02 (n=63) 9,10±0,49 (n=82) 5,51±0,21 (n=55) LDL (0,5g/L) 7,31±0,03 (n=18)* 5,19±0,92 (n=15)** 1,87±0,21 (n=11)***
LDL+SB 15,06±2,84 (n=7)## 3,98±1,06 (n=7)#
LDL+SKF 7,42±0,04 (n=8)# 10,10±1,61 (n=5)## 3,54±0,58 (n=14)##
H2O2(20µM) 7,29±0,03 (n=28)* 2,24±0,46 (n=31)*** 2,78±0,13 (n=7)***
H2O2 +SB 3,48±0,95 (n=8)## 9,51±0,77 (n=7)##
H2O2 +SKF 7,38±0,04 (n=6)# 4,98±1,75 (n=7)# 5,49±1,19 (n=7)##
SB (10µM) 11,05±1,90(n=15) 16,76±2,8 (n=15) SKF (10µM) 11,92±1,31(n=14) 6,21±1,10 (n=9) Nach Vorgabe von 0,5 g/L LDL für 10 Minuten kam es zu einem signifikanten Abfall
der Na+/H+ - Austauschaktivität von 9,10 ± 0,49 x10-3pHi/s (n=82) auf 5,19 ± 0,92 x 10-
3 pHi/s (n=15, p<0,01). Thrombozyten wurden mit den spezifischen Hemmstoffen der
p38 MAP Kinase, SB 202190 oder SKF 86002, für 10 Minuten vorinkubiert und danach
wurde 0,5 g/L LDL für 10 Minuten zugegeben. Nach Vorinkubation mit 10 µmol/L SB
202190 oder 10 µmol/L SKF 86002 war der LDL-induzierte Abfall der Na+/H+ -
Austauschaktivität blockiert. Gegenüber der Inkubation mit LDL alleine führte die
Vorgabe von SB 202190 zu einem signifikanten Anstieg der Na+/H+ -
Austauschaktivität auf 15,06 ± 2,84 x10-3pHi/s (n=7, p<0,01). Gegenüber der
ERGEBNISSE
28
Inkubation mit LDL alleine führte die Vorgabe von SKF 86002 zu einem signifikanten
Anstieg der Na+/H+ - Austauschaktivität auf 10,10 ± 1,61 x 10-3pHi/s (n=5, p<0,01).
Nach Vorgabe von 20 µmol/L H2O2 für 10 Minuten kam es zu einem signifikanten
Abfall der Na+/H+ - Austauschaktivität von 9,10 ± 0,49 x10-3pHi/s (n=82) auf 2,24 ±
0,46 x 10-3 pHi/s (n=31, p<0,001). Nach Vorinkubation mit 10 µmol/L SB 202190 oder
10 µmol/L SKF 86002 war der H2O2 -induzierte Abfall der Na+/H+ - Austauschaktivität
blockiert. Gegenüber der Inkubation mit H2O2 alleine führte die Vorgabe von SB
202190 zu einem signifikanten Anstieg der Na+/H+ - Austauschaktivität auf 3,48 ± 0,95
x 10-3pHi/s (n=8, p<0,01). Gegenüber der Inkubation mit H2O2 alleine führte die
Vorgabe von SKF 86002 zu einem signifikanten Anstieg der Na+/H+ -
Austauschaktivität auf 4,98 ± 1,75 (n=7, p<0,05).
Die alleinige Zugabe von 10 µmol/L SB 202190 führte zu einem nicht signifikanten
Anstieg der Na+/H+ - Austauschaktivität auf 11,05 ± 1,90 x 10-3pHi/s (n=15). Die
alleinige Zugabe von 10 µmol/L SKF 86002 führte zu einem nicht signifikanten Anstieg
der Na+/H+ - Austauschaktivität auf 11,92 ± 1,31 x 10-3pHi/s (n=14).
3.3. H2O2 bewirkt eine konzentrationsabhängige Inhibition der Na+/H+ -
Austauscheraktivität
Wie Abbildung 4 zeigt, ist die Inhibition der Na+/H+ - Austauscheraktivität durch
Zugabe von H2O2 konzentrationsabhängig. Die Werte wurden alle 10 Minuten nach
H2O2 Zugabe bestimmt. So zeigt sich bei den Thrombozyten ohne Zugabe von H2O2
eine Na+/H+ - Austauschaktivität von 9,10 ± 0,49 x 10-3 pHi/s (n=82). Gegenüber der
Inkubation mit H2O2 alleine führte die Zugabe von 1 µmol/L H2O2 zu einem nicht
signifikanten Abfall der Na+/H+ - Austauschaktivität auf 8,52 ± 2,27 x 10-3 pHi/s (n=3).
Bei der Zugabe von 2,5 µmol/L H2O2 zeigte sich ein nicht signifikanter Ansteig der
Na+/H+ -Austauschaktivität gegenüber der Kontrolle auf 9,41 ± 2,71 x 10-3 pHi/s (n=5).
Wurden 5 µmol/L H2O2 zu den Thrombozyten zugegeben, zeigte sich ein signifikanter
Abfall der Na+/H+ - Austauschaktivität auf 4,72 ± 1,73 x 10-3 pHi/s (n=5, p<0,05)
gegenüber der Kontrolle. Gegenüber der Kontrolle kam es zu einem hochsignifikanten
Abfall der Austauschrate auf 0,93 ± 0,20 x 10-3 pHi/s (n=9, p<0,001) bei der Zugabe von
10 µmol/L H2O2 zu den Thrombozyten. Bei der Inkubation mit 20 µmol/L H2O2 zeigte
sich ebenfalls ein hochsignifikanter Abfall der Na+/H+ - Austauschaktivität auf 2,24 ±
0,46 x 10-3 pHi/s (n=31, p<0,001) gegenüber der Kontrolle.
ERGEBNISSE
29
Abb. 3: Diese repräsentativen Originalabbildungen zeigen die charakteristischen Effekte der mit BCECF beladenen Thrombozyten, deren intrazellulärer pHi mit der Gabe von 100 mmol/l Propionsäure (Pfeil) abgesenkt wurde. Dadurch wurde der Na+/H+ - Austauscher aktiviert und die Austauschrate konnte berechnet werden. A.): Die Effekte auf den pHi nach 10-minütiger Zugabe von 0,5 g/L LDL alleine und in Kombination mit 10-minütiger Vorinkubation von 10µmol/L SKF 86002 vor der LDL Gabe. Die Inkubation der Proben mit SKF 86002 und LDL zusammen zeigt den Anstieg der Na+/H+ - Austauscheraktivität im Vergleich zur alleinigen LDL Gabe. B.): Die Zugabe von 20µmol/L H2O2 über 10 Minuten führt zu einer deutlichen Reduktion des pHi – Anstieges im Vergleich zur Kontrolle. Dieser Effekt kann durch eine 10-minütige Vorinkubation mit 10 µmol/L SKF 86002 vermindert werden. Ähnliche Effekte wie in den Abb. 3A und 3B sind bei der Zugabe von 10µmol/L SB 202190 anstelle von SKF 86002 zu sehen.
6.8
7.0
7.2
7.4
10 sec
Control
L D L
S K F + L D LP ropionic acid
pHi
6.6
7.0
7.4
10 sec
Control
H 2O 2
SKF+H 2O 2
P ropionic acid
pHi
A
B
ERGEBNISSE
30
Wurden 40 µmol/L H2O2 zugegeben, zeigte sich ein signifikanter Abfall der Na+/H+ -
Austauschaktivität auf 1,21 ± 0,63 x 10-3 pHi/s (n=3, p<0,05).
3.4. LDL und H2O2 bewirken einen Abfall der intrazellulären Natriumionen -
konzentration
Die intrazelluläre Natriumionenkonzentration wurde in mit SBFI beladenen
Thrombozyten gemessen. Bei den Messungen wurden keine direkten Konzentrationen
gemessen, sondern nur die Unterschiede zur Kontrolle untersucht. Nach Vorgabe von
0,5 g/L LDL für 10 Minuten kam es zu einem signifikanten Abfall der intrazellulären
Natriumionenwerte (∆[Na+]i) von 5,51 ± 0,21 mmol/L (n=55) auf 1,87 ± 0,21 mmol/L
(n=11, p<0,001). Thrombozyten wurden mit den spezifischen Hemmstoffen der p38
MAP Kinase, SB 202190 oder SKF 86002, für 10 Minuten vorinkubiert und danach
wurde 0,5 g/L LDL für 10 Minuten zugegeben. Nach Vorinkubation mit 10 µmol/L SB
202190 oder 10 µmol/L SKF 86002 war der LDL-induzierte Abfall des ∆[Na+]i
blockiert. Gegenüber der Inkubation mit LDL alleine führte die Vorgabe von SB
202190 zu einem signifikanten Anstieg der ∆[Na+]i auf 3,98 ± 1,06 mmol/L (n=7,
p<0,05). Gegenüber der Inkubation mit LDL alleine führte die Vorgabe von SKF 86002
zu einem signifikanten Anstieg der ∆[Na+]i auf 3,54 ± 0,58 mmol/L (n=14, p<0,01).
Tabelle 2: Die Wirkung von H2O2 in unterschiedlichen Konzentrationen nach 10-minütiger Vorinkubation auf den intrazellulären Natriumionenwert (∆[Na]i ) (* bedeutet p<0,05 versus Kontrolle, *** p<0,001).
∆[Na]i Kontrolle 5,51±0,21 mmol/L (n=55) 1 µmol/L H2O2 5,48±0,75 mmol/L (n=3) 2,5 µmol/L H2O2 4,72±0,56 mmol/L (n=3) 5 µmol/L H2O2 4,85±0,56 mmol/L (n=6) 10 µmol/L H2O2 4,36±0,20 mmol/L (n=5)*
20 µmol/L H2O2 2,78±0,13 mmol/L (n=7)***
40 µmol/L H2O2 4,20±0,34 mmol/L (n=3)*
ERGEBNISSE
31
Nach Vorgabe von 20 µmol/L H2O2 für 10 Minuten kam es zu einem signifikanten
Abfall der ∆[Na+]i von 5,51 ± 0,21 mmol/L (n=55) auf 2,78 ± 0,13 (n=7, p<0,001).
Nach Vorinkubation mit 10 µmol/L SB 202190 oder 10 µmol/L SKF 86002 war der
H2O2 - induzierte Abfall des ∆[Na+]i blockiert. Gegenüber der Inkubation mit H2O2
alleine führte die Vorgabe von SB 202190 zu einem signifikanten Anstieg der ∆[Na+]i
auf 9,51 ± 0,77 mmol/L (n=7, p<0,01). Gegenüber der Inkubation mit H2O2 alleine
führte die Vorgabe von SKF 86002 zu einem signifikanten Anstieg der ∆[Na+]i auf 5,49
± 1,19 mmol/L (n=7, p<0,01). Die alleinige Zugabe von 10 µmol/L SB 202190 führte
zu einem nicht signifikanten Anstieg der ∆[Na+]i auf 16,76 ± 2,80 mmol/L (n=15). Die
alleinige Zugabe von 10 µmol/L SKF 86002 führte zu einem nicht signifikanten Anstieg
der ∆[Na+]i auf 6,21 ± 1,10 mmol/L (n=9).
Abb. 4: Diese Abbildung zeigt die Prozentwerte der Na+/H+ - Austauscheraktivität, wobei die Aktivität der Kontrolle = 100 % ist. Deutlich zu erkennen ist die Konzentrationsabhängigkeit der Inhibition des Na+/H+ - Austauschers. Je mehr H2O2 zugegeben wurde, desto geringer ist die Austauschkapazität (* bedeutet p<0,05 vs Kontrolle; *** bedeutet p<0,001 vs Kontrolle). Eine ähnliche Konzentrationsabhängigkeit von der H2O2 - Konzentration zeigten die intrazellulären Natriumionenwerte.
0
50
100
150
Na+ /H
+ ant
ipor
ter
(% o
f con
trol
)
Control 1 2.5 5 10 20 40[H2O2] (mmol/L)
*** *** *
µmol/L
*
ERGEBNISSE
32
In Abbildung 5 werden die wichtigsten Ergebnisse zur besseren Übersicht kurz
zusammengefasst.
3.5. H2O2 bewirkt einen konzentrationsabhängigen Abfall der intrazellulären
Natriumionenkonzentration
Wie Tabelle 2 zeigt, ist die Inhibition der intrazellulären Natriumionenkonzentration
durch Zugabe von H2O2 konzentrationsabhängig. Bei der Messung des intrazellulären
Natriumionenwertes (∆[Na+]i) bei Thrombozyten ohne H2O2-Zugabe zeigte sich ein
Wert von 5,51 ± 0,21 mmol/L (n=55). Bei der Zugabe von 1 µmol/L H2O2 für 10
Minuten kam es zu einem nicht signifikanten Absinken des ∆[Na+]i gegenüber der
Kontrolle auf einen Wert von 5,48 ± 0,75 mmol/L (n=3). Wurden 2,5 µmol/L H2O2
zugegeben, konnte nach 10 Minuten ein ∆[Na+]i von 4,72 ± 0,56 mmol/L (n=3)
gemessen werden. Dieser Wert war nicht signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert.
Die Inkubation von 5 µmol/L H2O2 für 10 Minuten führte zu einem nicht signifikanten
Abfall des ∆[Na+]i auf 4,85 ± 0,56 mmol/L (n=6) gegenüber der Kontrolle. Einen
signifikanten Abfall des ∆[Na+]i auf 4,36 ± 0,20 mmol/L (n=5, p<0,05) gegenüber der
Kontrolle konnte bei der Zugabe von 10 µmol/L H2O2 für 10 Minuten gemessen
werden. Wurden 20 µmol/L H2O2 für 10 Minuten zugegeben, zeigte sich ein
hochsignifikanter Abfall des ∆[Na+]i auf 2,78 ± 0,13 mmol/L (n=7, p<0,001) gegenüber
der Kontrolle. Bei der 10-minütigen Inkubation mit 40 µmol/L H2O2 zeigte sich ein
signifikanter Abfall des ∆[Na+]i auf 4,20 ± 0,34 mmol/L gegenüber der Kontrolle (n=3,
p<0,05).
ERGEBNISSE
33
7.2
7.3
7.4Control
LDL
SKF+LDL
2 min
pHi
6.8
7.0
7.2
7.4
10 sec
Control
LDL
SKF+LDLPropionic acid
pHi
25
30
35
2 min
Control
LDL
SKF+LDL
Propionic acid
[Na+ ] i
(mm
ol/L
)
7.0
7.2
7.4
7.6
Con
trol
LDL
SKF+
LD
L
H2O
2
H2O
2+SK
F
pHi * *
##
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
***
**
##
#
Na+ /H
+ exc
hang
er(x
10-3
pH
i/s)
Con
trol
LDL
SKF+
LD
L
H2O
2
H2O
2+SK
F 0
2
4
6
8
***
##
***
##
Con
trol
LD
L
SKF+
LD
L
H2O
2
H2O
2+SK
F
∆ [N
a+ ] i(m
mol
/L)
A B
C
D E F
ERGEBNISSE
34
Abb. 5: Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse : A.): Zeigt eine repräsentative Originalabbildung, die den Abfall des pHi durch die alleinige Gabe von 0,5g/L LDL und den leichteren Abfall des pHi bei 10-minütiger Vorinkubation mit 10µmol/L SKF 86002 und anschließender 10-minütiger 0,5g/L LDL Gabe zeigt. Der pHi wurde über 10 Minuten gemessen. Eine ähnliche Abbildung ergäbe sich bei der Zugabe von SB 202190 anstelle von SKF 86002. Sowohl SKF 86002 als auch SB 202190 sind spezifische Inhibitoren der p38 MAP Kinase. B.): Hier wird in einer charakteristischen Originalabbildung der Effekt auf die Na+/H+ -
Austauscheraktivität bei der 10-minütigen Alleingabe von 0,5 g/L LDL im Vergleich zur kombinierten Gabe von 10 Minuten 10 µmol/L SKF 86002 vor der 10-minütigen 0,5 g/L LDL Gabe gezeigt. Deutlich zu sehen ist der Abfall der Austauschaktivität bei der alleinigen LDL Gabe und der Anstieg der Austauschrate nach Vorinkubation mit SKF 86002 vor der LDL Gabe. Eine ähnliche Originalabbildung wird in Abbildung 3B für die Effekte bei H2O2 Zugabe gezeigt. C.): In dieser Abbildung wird der Abfall des intrazellulären Natriumionenwertes nach 10-minütiger 0,5 g/L LDL Gabe deutlich. Auch hier kann dieser deutliche Abfall durch die 10-minütige Vorinkubation mit SKF 86002 aufgehoben werden. Die Natriumionenwerte wurden bestimmt, dann prozentual auf den Kontrollwert umgerechnet. In dieser Abbildung werden die Veränderungen über einen Zeitraum von 5 Minuten gezeigt. D.): Zeigt die Effekte auf den pHi von der LDL, SKF 86002 und H2O2 Zugabe. Deutlich zu erkennen ist der pHi - Abfall bei der 10-minütigen 0,5 g/L LDL Alleingabe im Vergleich zur Kontrolle. Bei Vorinkubation mit 10µmol/L SKF 86002 vor der LDL Gabe steigt der pHi - Wert wieder an. Der pHi - Abfall zeigt sich auch bei 10-minütiger 20 µmol/L H2O2 Zugabe. Dieser pHi - Abfall kann auch durch die Vorgabe von 10 Minuten 10µmol/L SKF 86002 vor der H2O2 Zugabe vermindert werden (* bedeutet p<0,05 vs Kontrolle; # bedeutet p<0,05 vs LDL oder H2O2 Alleinzugabe). E.): Die Na+/H+ - Austauscheraktivität bei der 10-minütigen Alleingabe von 0,5 g/L LDL ist im Vergleich zur kombinierten Gabe von 10 Minuten 10µmol/L SKF 86002 vor der 10-minütigen 0,5 g/L LDL Gabe deutlich erniedrigt. Gut zu erkennen ist auch die Inhibition der Austauschrate bei der 10-minütigen Alleingabe von 20 µmol/L H2O2 . Diese Inhibition kann zu mindestens teilweise durch Vorinkubation mit SKF 86002 aufgehoben werden. Ähnliche Effekte zeigen sich bei der SB 202190 Gabe anstelle der SKF 86002 Gabe. (** bedeutet p<0,01 vs Kontrolle; *** bedeutet p<0,001 vs Kontrolle; # bedeutet p<0,05 vs H2O2 alleine; ## bedeutet p<0,01 vs LDL alleine) F.): In dieser Abbildung werden ∆[Na+]i - Wert gezeigt. Hier wird der intrazelluläre Natriumabfall bei 10-minütiger 0,5 g/L LDL Gabe sichtbar. Dieser Abfall ließ sich durch 10-minütige Vorinkubation mit 10 µmol/L SKF 86022 vor der LDL Gabe abschwächen. Auch die 10-minütige 20 µmol/L H2O2 Gabe führte zu einem Abfall des ∆[Na+]i - Werts, der durch vorherige Gabe von SKF 86002 aufgehoben werden konnte (*** bedeutet p<0,001 vs Kontrolle; ## bedeutet p<0,01 vs LDL oder H2O2 alleine).
ERGEBNISSE
35
3.6. Die Aktivierung von MKK 3/6 durch LDL und H2O2
Kontrolle 1 10 30 60 1 10 30 60 Minuten LDL (0,5 g/L) H2O2 (20µmol/L) Abb. 6: Western Blot unter Verwendung des Mitogen aktivierte Protein Kinase Kinase 3/6 (MKK 3/6) Antikörpers. Deutlich zu sehen ist eine Aktivierung der MKK 3/6 bei Inkubation zusammen mit LDL und H2O2 gegenüber der Kontrolle. Die maximale Aktivierung der MKK 3/6 wird sowohl nach LDL als auch nach H2O2 Gabe jeweils nach 10 Minuten erreicht. Der Membran wurde für 24 Stunden bei 4° Celsius ein polyklonaler Kaninchen - Antikörper gegen MKK 3/6 zugegeben. Nach dem Waschen der Membran wurde ein polyklonaler Kaninchen - Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur zugefügt. Zur späteren Detektierung wurde ein Chemiluminiszenzverfahren benutzt, bei dem das zyklischen Luminol in der Gegenwart von Meerrettichperoxidase und Wasserstoffperoxid oxidiert wird. Hierbei findet sich Luminol in einem angeregten Zustand, aus dem es durch Abgabe von Energie in Form von Licht wieder in seinen Grundzustand zurückkehren kann. Das so emittierte Licht kann wiederum dazu genutzt werden, einen Röntgenfilm zu schwärzen. Die folgenden Ergebnisse wurden mit Hilfe der Methode des Western Blots erstellt.
Dabei wird ein Proteingemisch zuerst mittels Gelelektrophorese nach unterschiedlichen
Molekulargewichten aufgetrennt und dann auf eine Nitrozellulosemembran „geblottet“.
Mit spezifischen Antikörpern gegen eines dieser Proteine können diese als Bande
dargestellt werden.
In Abbildung 6 wird die zeitabhängige Wirkung von 0,5 g/L LDL und 20 µmol/L H2O2
auf die Mitogen aktivierte Protein Kinase Kinase 3/6 (MKK 3/6) gezeigt. Die MKK 3/6
ist eine Kinase, die von verschiedenen G-Proteinen aktiviert wird und die p38 MAP
Kinase phosphoryliert. Die erste Band stellt eine Kontrolle dar, die dem Ruhezustand
der Thrombozyten entspricht. Die folgenden vier Banden zeigen die Zeitabhängigkeit
der Aktivierung von 0,5 g/L LDL, wobei sich die maximale Aktivierung nach 10
Minuten zeigt.
Die letzten vier Banden stellen die Aktivität der MKK 3/6 nach 1-, 10-, 30- und 60-
minütiger H2O2 Zugabe dar. Auch hier ist die maximale Aktivierung nach 10 Minuten
erreicht.
⇐ MKK 3/6
ERGEBNISSE
36
3.7. Die Aktivierung der p38 MAP Kinase durch LDL und H2O2
Kontrolle 1 10 30 60 1 10 30 60 Minuten LDL (0,5 g/L) H2O2 (20µmol/L) Abb. 7: Western Blot unter Verwendung des p38 Mitogen aktivierte Protein Kinase (p38 MAPK) Antikörpers. Hier wird die Zeitabhängigkeit der Phosphorylierung der p38 MAP Kinase nach LDL und H2O2 Gabe sichtbar. Die maximale Aktivierung der p38 MAP Kinase erfolgt sowohl bei der LDL - als auch bei der H2O2 - Zugabe nach 30 Minuten. In Abbildung 7 werden die Effekte von 0,5 g/L LDL und 20 µmol/L H2O2 auf die p38
Mitogen aktivierte Protein Kinase (p38 MAP Kinase) gezeigt. Hierbei ist in der ersten
Bande eine leichte Phosphorylation im Ruhezustand der Thrombozyten zu erkennen.
Die nächsten vier Banden zeigen die Zeitabhängigkeit der p38 MAP Kinase
Aktivierung nach Zugabe von 0,5 g/L LDL und dem Stoppen der Reaktion mit
Formaldehyd zu unterschiedlichen Zeiten. Die stärkste Wirkung stellt sich 30 Minuten
nach Kontakt mit LDL ein. Die letzten vier Banden zeigen die Aktivierung der p38
MAP Kinase nach H2O2 - Einwirkung. Auch hier zeigt sich eine Zeitabhängigkeit, die
maximale Aktivierung erfolgte auch hier, wie bei LDL, nach 30 Minuten. In Abbildung
8 wird die Konzentrationsabhängigkeit von der p38 MAP Kinase Aktivierung nach
Gabe von LDL (jeweils 0,05 g/L; 0,1 g/L; 0,25 g/L oder 0,5 g/L zugegeben) sichtbar.
Kontrolle 0,05 g/L 0,1 g/L 0,25 g/L 0,5g/L LDL Abb. 8: Western Blot unter Verwendung des p38 MAP Kinase Antikörpers. Hier wird die Konzentrationsabhängigkeit der p38 MAP Kinase Phosphorylierung nach LDL Gabe sichtbar.
⇐ p38 MAPK
⇐ p38 MAPK
ERGEBNISSE
37
3.8. Die Aktivierung des Hitze Schock Proteins 27 durch LDL und H2O2
Kontrolle H2O2 H2O2+SB LDL LDL+SB
Abb. 9: Western Blot unter Verwendung des Antikörpers gegen das Hitze Schock Protein 27 (hsp 27). Es wurden 20µmol/L H2O2 oder 0,5 g/L LDL für jeweils 30 Minuten zugegeben. Bei den Banden mit SB wurden 10 µmol/L SB 202190 für 10 Minuten vorinkubiert. Deutlich zu sehen ist die Aktivierung des hsp 27 bei der H2O2 oder LDL - Zugabe, während eine fast vollständige Blockade bei SB - Zugabe zu sehen ist. In Abbildung 9 wird die Wirkung von H2O2, LDL und dem p38 MAP Kinase Inhibitor
SB 202190 auf das Hitze Schock Protein 27 (hsp 27) sichtbar. Die erste Bande stellt die
Kontrolle ohne Zugabe einer Substanz dar. Es ist eine leichte Ruheaktivität des Hitze
Schock Proteins 27 zu erkennen. Die zweite Bande zeigt die 20 µmol/L H2O2 - Zugabe
für 30 Minuten. Es ist eine deutliche Aktivierung des hsp 27 zu sehen. In der dritten
Bande wurde mit 10 µmol/L SB 202190 für 10 Minuten vorinkubiert, dann wurden 20
µmol/L H2O2 für 30 Minuten zugegeben. Durch die Blockade der p38 MAP Kinase
durch SB 202190 wird das Hitze Schock Protein 27 nicht mehr aktiviert.
In der vierten Bande ist die Aktivierung des Hitze Schock Proteins 27 durch die 30 -
minütige Zugabe von 0,5 g/L LDL zu sehen. In der fünften Bande wurde 10 Minuten 10
µmol/L SB 202190 vor der 30 - minütigen 0,5 g/L LDL Gabe gegeben. Die Hitze
Schock Protein 27 Aktivierung nach LDL Gabe ist wie die Hitze Schock Protein 27
Aktivierung nach H2O2 Gabe von der Aktivierung der p38 MAP Kinase abhängig.
⇐ hsp 27
DISKUSSION
38
4. Diskussion Bei der Analyse der Wirkung von LDL und H2O2 auf den Na+/H+ - Austauscher in
Thrombozyten konnte eine Inhibition des Na+/H+ - Austauschers festgestellt werden. So
konnte gezeigt werden, dass sich der pHi sofort nach der Gabe von LDL oder H2O2
absenkte. Die Na+/H+ - Austauscheraktivität konnte durch die LDL - oder die H2O2 -
Gabe inhibiert werden. Durch die Inkubation der Thrombozyten mit LDL oder H2O2
konnte eine Senkung der intrazellulären Natriumionenkonzentration nachgewiesen
werden.
Neben dem Na+/H+ - Austauscher bestehen noch andere Mechanismen in
Thrombozyten zur Regulation des pHi, jedoch scheint der Na+/H+ - Austauscher die
Hauptrolle in der Regulation zu spielen [Clemens et al., 1990]. Daher ist die
Azifizierung, der Abfall der Na+/H+ - Austauscheraktivität und der Abfall der
intrazellulären Natriumionenkonzentration auf eine Inhibition des Na+/H+ -
Austauschers durch die LDL - und H2O2 - Zugabe zurückzuführen.
Die Inhibition des Na+/H+ - Austauschers nach LDL Gabe in Thrombozyten konnte
auch von Nofer et al. [1997] nachgewiesen werden. In dieser Studie wurde wie in
unserer gezeigt, dass die Gabe von LDL zu einer Azifizierung, zu einer Blockade des
Na+/H+ - Austauschers und zu einem intrazellulären Natriumionenabfall in
Thrombozyten führte. Die Inhibition durch LDL war in dieser Studie
konzentrationsabhängig.
In dieser Arbeit konnte eine Konzentrationsabhängigkeit sowohl der Inhibition der
Na+/H+ - Austauscheraktivität als auch des Abfalls der intrazellulären
Natriumionenkonzentration nach H2O2 - Zugabe festgestellt werden. Es ist bekannt, dass
mit Kollagen oder Arachnoidonsäure „aktivierte“ Blutplättchen mit H2O2 zur
Aggregation gebracht werden können. Diese Aggregation ausgelöst durch H2O2 konnte
durch die Blockade des Na+/H+ - Austauschers verhindert werden [Iuliano et al., 1993].
Inhibitoren der p38 MAP Kinase sind SB 202190 und SKF 86002 [Tong et al., 1997].
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der p38 MAP Kinase zu
einer Abschwächung der Blockierung des Na+/H+ - Austauschers ausgelöst durch LDL
DISKUSSION
39
oder H2O2 führte. Diese Aufhebung spricht dafür, dass in die Signalkaskade von der
LDL und H2O2 Wirkung die p38 MAP Kinase involviert ist.
Weiter konnte anhand von Western Blots gezeigt werden, dass es nach Kontakt mit
LDL und H2O2 zu einer Aktivierung der MKK 3/6 in menschlichen Thrombozyten
kommt. Diese Aktivierung zeigte ihr Maximum nach 10 Minuten. Die MKK 3/6 scheint
die p38 MAP Kinase zu phosphorylieren. Nach 30 Minuten zeigte sich die maximale
Aktivität der p38 MAP Kinase, also 20 Minuten nach der maximalen Aktivität der
MKK 3/6. Diese Phosphorylierung der p38 MAP Kinase nach der LDL - Einwirkung
war konzentrationsabhängig. Es zeigte sich des Weiteren eine Aktivierung des Hitze
Schock Proteins 27 (hsp 27) nach LDL oder H2O2 Zugabe. Diese Aktivierung war
durch die Vorinkubation mit SB 202190 nahezu vollständig blockiert. Die Hitze Schock
Protein 27 Aktivierung nach Kontakt mit LDL oder H2O2 ist also abhängig von der
Aktivierung der p38 MAP Kinase.
Mit unseren Ergebnissen stimmen die bisher gefundenen Ergebnisse in der Literatur
überein. So kann die Phosphorylierung der p38 MAP Kinase durch Mitglieder der Rho -
Familie Rac und Cdc 42 [Minden et al., 1995] und durch die Mitogen - aktivierte
Protein Kinase Kinase 3/6 (MKK 3/6) erfolgen [Zechner et al., 1998; Enslen et al.,
1998; Toyoshima et al., 1997]. Beschrieben ist auch, dass die p38 MAP Kinase die
MAP Kinase aktivierten Protein Kinasen 2/3 (MAPKKAP 2/3) aktiviert. Diese
MAPKKAP 2/3 phosphoryliert dann das Hitze Schock Protein 27 (hsp 27). Allerdings
sind diese Befunde für menschliche Endothelzellen gefunden worden [Roousseau et al.,
1997], sowie für Thrombozyten die mit Kollagen stimuliert wurden [Saklatvala et al.,
1996; Börsch - Haubold et al.,1997].
Für LDL konnte in anderen Studien eine frühe Aktivierung der p38 MAP Kinase nach
Kontakt mit menschlichen Thrombozyten festgestellt werden. Die duale
Phosphorylierung der p38 MAP Kinase fand bereits nach 10 Sekunden statt. Es scheint,
dass diese p38 MAP Kinase Aktivierung eines der frühesten Signale in Thrombozyten
nach Kontakt mit LDL ist. Die maximale Aktivierung der p38 MAP Kinase wurde hier
früher gefunden als in unserer Arbeit, schon nach 5 bis 10 Minuten war das Maximum
erreicht. Nur die Inhibition der Protein Kinase C zeigte eine Inhibition der p38 MAP
Kinase Phosphorylierung [Hackeng et al., 1999].
DISKUSSION
40
Für H2O2 konnte die Phosphorylierung der p38 MAP Kinase in neonatalen ventrikulären
Myozyten gefunden werden. Diese Phosphorylierung der p38 MAP Kinase bei
Konzentrationen von 0,1 mmol/L H2O2 zeigte ihr Maximum bereits nach 5 Minuten,
also früher als bei Thrombozyten. Auch hier konnte gezeigt werden, dass die
MAPKAPK 2/3 von der p38 MAP Kinase phosphoryliert wurde. Die MAPKAP Kinase
2/3 aktivierte dann das Hitze Schock Protein 27. Die MAPKAPK 2/3 – und hsp 27
Aktivierung nach H2O2 Gabe ließ sich durch Vorinkubation mit SB 203580 inhibieren,
was für die Abhängigkeit dieser Kinasen von der p38 MAP Kinase spricht [Clerk et al.,
1997].
Auf der Suche nach Rezeptoren, die für die Aktivierung der p38 MAP Kinase durch
LDL verantwortlich sein könnten, zeigten folgende keine Änderung der Aktivierung
durch LDL: Integrins αIIbβ3 , Integrins α2β1 , FcγRII- Rezeptor, CD 36, CD68 (gp 110)
und Low Density Lipoprotein-Rezeptor Related Protein (LRP) [Hackeng et al., 1999].
Es zeigte sich auch keine Änderung der Inhibition der Na+/H+ - Austauscheraktivität
nach Behandlung des LDL mit Cyclohexanedionde, welches jede LDL -
Rezeptorbindung verhindert. Auch für GPIIb/IIIa und von GPIIIb - freien Plättchen
konnte keine Aufhebung der Inhibition des Na+/H+ - Austauschers nach LDL Kontakt
gefunden werden [Nofer et al., 1997].
H2O2 inhibierte direkt die Protein Tyrosin Phosphatase, so dass die Protein Tyrosin
Kinase vermehrt aktiviert war [Hecht et al., 1992]. Eine Protein Tyrosin Kinase
Aktivierung führte zu einer vermehrten Phosphorylierung der p38 MAP Kinase in mit
Thrombin behandelten glatten Muskelzellen [Kanda et al., 2001], so dass dieser
Mechanismus möglicherweise auch für die H2O2 Wirkung auf die PTK und dann auf die
p38 MAP Kinase in Thrombozyten gelten könnte.
Unklar ist weiterhin, wie die p38 MAP Kinase Kaskade genau den Na+/H+ -
Austauscher inhibiert. Die in unserer Studie gezeigten Ergebnisse sprechen dafür, dass
die Inhibition des Na+/H+ - Austauschers durch LDL und H2O2 über die Aktivierung der
p38 MAP Kinase - Kaskade gesteuert werden. Wie genau die Mechanismen der
Inhibition am Na+/H+ - Austauscher selbst aussehen, ist ungeklärt. Es konnten jedoch
DISKUSSION
41
unterschiedliche Bindungsstellen am C-terminalen Ende des Na+/H+ - Austauschers
Isoform 1 gefunden werden.
Es sind zwei Calmodulin - Bindungsstellen gefunden worden, die bei Fehlen zu einer
Dauerstimulation des Na+/H+ - Austauschers führen. Ist an den Bindungsstellen kein
Calmodulin gebunden, so führt dieses zu einer Autoinhibition des Austauschers. Die
Calcium/Calmodulin - Bindung kann diese Autoinhibition aufheben [Wakabayashi et al,
1997].
Ein Calcineurin B homologes Protein (CHP) ist ein weiteres calciumbindendes Protein,
das an die C - terminale Seite des Na+/H+ - Austauscher bindet. Es führt hier zu einer
Inhibition des Austauschers. Einige kleine G - Proteine können dieses Protein
phosphorylieren und somit die Aktivität von CHP bestimmen [Lin et al., 1996].
Für die „Nck - interakting Kinase“ (NIK) konnte nachgewiesen werden, dass sie am
Na+/H+ - Austauscher bindet und den Austauscher zusätzlich phosphoryliert. Wenn
sowohl die Kinase als auch die Phosphorylationsbindungsstellen vollständig gebunden
waren, führte dies zu einer Aktivierung des Na+/H+ - Austauscher als Antwort auf den
Wachstumsfaktor [Yan et al., 2001].
Des Weiteren konnte eine Bindungsstelle auf dem Na+/H+ - Austauscher für die Aktin -
bindenden Proteine Ezrin, Radixin and Moesin (ERM) gefunden werden. Diese haben
eine Bedeutung in der Veränderung von dem Zytosklett in Fibroblasten. Die ERM -
Bindungsstellen scheinen keine Veränderung der Na+/H+ - Austauscheraktivität zu
verursachen [Denker et al., 2000].
Der Na+/H+ - Austauscher kann durch die zur Rho - Kinase Familie gehörende p160
ROC Kinase phosphoryliert werden. Diese Phosphorylierung führt zu einer Aktivierung
des Austauschers. Die p160 ROCK konnte durch G - gekoppelten und durch Integrin -
Rezeptoren in Fibroblasten aktiviert werden [Tominaga et al, 1998]. Außerdem konnte
für die p90 ribosomale S6 Kinase (p90 rsk) gezeigt werden, dass sie das C - terminale
Ende des Na+/H+ - Austauschers phosphoryliert. Bei Mutationen, bei denen die
Aminosäure 703 Serin gegen Alanin ausgetauscht war, zeigte sich weiterhin eine
Aktivierung des Austauschers bei Azifizierung der Zellen, während die Aktivierung mit
Wachstumsfaktor ausblieb [Takahashi et al., 1999].
Anhand der Aufzählung der bekannten Bindungsstellen und der unterschiedlichen
Einflüsse auf den Aktivitätszustand des Na+/H+ - Austauschers werden die komplexen
Möglichkeiten der Aktivierung oder der Inhibition des Na+/H+ - Austauschers sichtbar.
DISKUSSION
42
Zusammenfassend ist noch unklar an welchem Rezeptor oder wo genau die LDL
Wirkung beginnt. Jedenfalls kommt es zu einer Aktivierung der MKK 3/6, diese könnte
die p38 MAP Kinase aktivieren. Die p38 MAP Kinase Aktivierung führt dann über die
Aktivierung der MAPKAPK 2/3 zu einer Phosphorylierung des Hitze Schock Protein
27. Das Hitze Schock Protein hat wichtige Funktionen in der Aktin – Stress – Formation
[Rooisseau et al., 1997].
Die H2O2 - Wirkung könnte unter anderem durch die Inhibition der Protein Tyrosin
Phosphatase vermittelt werden [Hecht et al., 1992]. Hierdurch wird die Protein Tyrosin
Kinase vermehrt aktiviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Blockade der Protein
Tyrosin Kinase zu einer Inhibition der p38 MAP Kinase führt [Kanda et al., 2001]. Die
Protein Tyrosin Kinase könnte die MKK 3/6 aktivieren, dies führt zu einer
Phosphorylierung der p38 MAP Kinase, diese phosphoryliert die MAPKAPK 2/3 und
diese das Hitze Schock Protein 27.
Am Ende steht die Inhibition des Na+/H+ - Austauschers sowohl bei der LDL - als auch
bei der H2O2 - Einwirkung auf humane Thrombozyten. Die Inhibition durch LDL oder
H2O2 ließ sich durch die Gabe von Inhibitoren der p38 MAP Kinase aufheben. Daher
steuert wahrscheinlich die p38 MAP Kinase Kaskade die Inhibition des Na+/H+ -
Austauschers.
ZUSAMMENFASSUNG
43
5. Zusammenfassung
In der vorliegenden Untersuchung sollte die Wirkung von Low - Density -
Lipoproteinen (LDL) und Hydrogenperoxid (H2O2) auf den Natrium - Protonen -
Austauscher (Na+/H+ - Austauscher) und die dabei zugrundeliegenden
Signaltransduktionswege untersucht werden.
Der intrazelluläre pH (pHi) in Thrombozyten wurde Fluoreszenz - spektrophotometrisch
mit Hilfe des pH - sensitiven Farbstoffes 2´,7´-Bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-
carboxyfluorescein tetrakis (acetoxymethyl) ester (BCECF) untersucht. Die
Bestimmung der Aktivität des Na+/H+ - Austauschers erfolgte über den Wiederanstieg
des pHi nach intrazellulärer Azifizierung. Die intrazelluläre Natriumionenkonzentration
wurde mit dem Natriumionen - sensitiven Fluoreszenz - Farbstoff sodium - binding -
benzofuran – isophthalate - acetoxymethylester (SBFI – AM) untersucht. Der Nachweis
der Aktivierung der Mitogen aktivierten Protein Kinase Kinase 3/6 (MKK 3/6), p38
Mitogen aktivierten Protein Kinase (p38 MAP Kinase) sowie des Hitze Schock Protein
27 (hsp27) erfolgte mittels Western Blots unter Verwendung spezifischer Antikörper.
Der pHi, die intrazelluläre Natriumionenkonzentration und die Na+/H+ -
Austauschaktivität ließen sich sowohl durch LDL als auch durch H2O2 absenken. Die
Vorgabe von 0,5 g/L LDL führte zu einer signifikanten Verminderung der Aktivität des
Na+/H+ - Austauschers in Thrombozyten von 9,10 ± 0,49 x10-3pHi/s (n= 82) auf 5,19 ±
0,92 x10-3pHi/s (n=15, p<0,01). Die Vorgabe von 20 µmol/L H2O2 führte zu einer
signifikanten Verminderung der Aktivität des Na+/H+ - Austauschers in Thrombozyten
von 9,10 ± 0,49 x10-3pHi/s (n=82) auf 2,24 ± 0,46 (n=31, p<0,001). Die Inhibition des
Na+/H+ - Austauschers durch H2O2 war konzentrationsabhängig. Die Vorgabe von
spezifischen Hemmstoffen der p38 MAP Kinase, SB 202190 oder SKF 86002, führte zu
einer Aufhebung des Effektes von LDL oder H2O2 auf den pHi, die intrazelluläre
Natriumionenkonzentration ([Na+]i) oder den Na+/H+ - Austauscher.
Mit Hilfe von Western Blots konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der Mitogen
aktivierten Protein Kinase Kinase 3/6 (MKK 3/6) sowie der p38 MAP Kinase durch die
LDL- oder H2O2- Einwirkung zeitabhängig war. Das Maximum der aktivierten MKK
3/6 zeigte sich nach 10 Minuten, das Maximum der aktivierten p38 MAP Kinase nach
ZUSAMMENFASSUNG
44
30 Minuten nach LDL oder H2O2 Gabe. Die Aktivierung der p38 MAP Kinase durch
LDL war dosisabhängig. Das Hitze Schock Protein 27 wurde durch die LDL oder H2O2
Gabe aktiviert. Diese Aktivierung ließ sich durch die Vorinkubation mit SB 202190
nahezu aufheben.
Die Untersuchung zeigt den hemmenden Einfluss von LDL oder H2O2 auf die Aktivität
des Na+/H+ - Austauschers. Die Hemmung des Na+/H+ - Austauschers durch LDL oder
H2O2 erfolgt über eine Aktivierung des MKK 3/6-p38 MAP Kinase
Signaltransduktionsweges.
LITERATUR
45
6. Literatur
1. Aharonovitz O, Granot Y. Stimulation of mitogen-activated protein kinase
and Na+/H+-exchanger in human platelets. Differential effect of phorbol
ester and vasopressin. J Biol Chem 1996; 271: 16494-16499
2. Andrews He, Aitken JW, Hassal DG, Skinner VO, Bruckdorfer KR.
Intracellular mechanisms in the activation of human platelets by low-
density lipoproteins. Biochem J 1987; 242: 559-564
3. Attaphitaya S, Park K, Melvin JE: Molecular cloning and functional
expression of rat Na+/H+ - exchanger isoform 5 (NHE 5) highly
expressed in brain. J Biol Chem 1999; 274: 4383-4388
4. Beitz J, Block HU, Beitz A, Muller G, Winkler L, Dargel R, Mest HJ.
Endogenous lipoproteins modify the thromboxane formation capacity by
low-density lipoproteins. Atherosclerosis 1986; 06: 95-99
5. Bertrand B, Wakabayashi S, Ikeda T, Pouysségur J, Shigekawa M. The
Na+/H+ exchanger isoform 1 (NHE1) is a novel member of the
calmodulin-binding proteins. Identification and characterization of
calmodulin-binnding sites. J Biol Chem 1994; 269: 13703-13709
6. Block LH, Knorr M, Vogt E, Locher R, Vetter W, Groscurth P, Qiao BY,
Pometta D, James R, Regenass M, Pletscher A. Low density lipoprotein
causes general cellular activation with increased phosphatidylinositol
turnover and lipoprotein carabolism. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:
885-889
7. Borin M, Siffert W: Stimulation by Thrombin Increases the cytosolic free
Na+ concentration in Human Platelets, J Biol Chem 1990; 265 : 19543-
19550
8. Borin ML, Pinelis VG, Azizova OA, Kudinov YV, Markov CM, Cragoe EJ,
Khodorov BI. Na+/H+ exchange in PAF stimulated platelets. J Lipd
Mediat 1989; 258: 521-527
9. Börsch-Haubold AG, Bartoli F, Asselin J, Dudler T, Kramer RM, Apitz-
Castro R, Watson SP, Gelb HM. Identification of the phosphorylation
sites of cytosolic phospholipase A2 in agonist-stimulated human platelets
and HeLa cells. J Biol Chem 1998; 273: 4449-4458
LITERATUR
46
10. Börsch-Haubold Ag, Kramaer RM, Watson SP. Phosphorylation and
activation of cytosolic phospholipase A2 by 38-kDa mitogen-activated
protein kinase in collagen-stimulated human platelets. Eur J Biochem
1997; 139: 1005-1015
11. Cano E, Mahadevan LC. Parallel signal processing among mammalian
MAPKs. Trends Biochem Sci 1995; 20: 117-22.
12. Canoso RT, Rodvien R, Scoon K, Levine PH. Hydrogen peroxide and
platelet function. Blood 1974; 42: 645-655
13. Cesbron JY, Capron A, Vargaftig BB, Lagarde M, pincemail J, Braquet P,
Toelman H, Joseph M. Plateltes mediate the action of
diethylcarbamazine on microfilariae. Nature 1987; 325: 533-536
14. Clemens N, Sieffert W, Scheid P. Thrombin-induced cytosolic alkalinization
in human platelets occurs without an apparent involvment of Cl-/HCO3-
exchange. Pflügers Arch 1990; 416: 68-73
15. Clerk A, Michael A, Sugden PH. Stimulation of multiple mitogen-activated
protein kinase sub-families by oxidative stress and phosphorylation of
the small heat shock protein, HSP25/27, in neonatal ventricular
myocytes. Biochem J 1998; 333: 581-589
16. Counillon L, Franchi A, Pouysségur J. A point mutation of the Na+/H+ -
exchanger gene (NHE1) and amplification of the mutated allele confer
amiloride resistance upon chronic acidosis. Proc Natl Acad Sci USA
1993; 4508-4512
17. Counillon L, Pouysségut J.Structure, function and growth factor activation of
the Na+/H+ - antiporter (NHE1). Cell Physiol Biochem 1992; 2:138-149
18. Del Principe D, Menichelli A, De Matteis W, Di Corpo ML, Di Giulio S,
Finazzi-Agro A. Hydrogen peroxide has a role in the activation of human
platelets. FEBS Lett 1985; 185: 142-146
19. Denker SP, Huang DC, Orlowski J, Furthmayr H, Barber DL. Direct binding
of the Na--H exchanger NHE1 to ERM proteins regulates the cortical
cytoskeleton and cell shape independently of H(+) translocation. Mol
Cell 2000; 6: 1425-1436
20. Dunn RC, Schachter M, Miles CM, Feher MD, Tranter PR, Bruckendorfer
KR, Sever PS Low-density lipoproteins increase intracellular calcium in
aequorin-loaded platelets. FEBS Lett 1998; 238: 357-360
LITERATUR
47
21. Egan RW, Gale PH, Baptista EM, Kennicott KL, Van den Henvel WS,
Waletr RW, Fagerness PE, Kuebl FA Jr., Oxidation reactions by
prostaglandin synthetase cyclooxygenase hydroperoxidase. J Biol Chem
1981; 256: 61-72
22. Enslen H, Raingeaud J, Davis RJ. Selective activation of p38 mitogen-
activated protein (MAP) kinase isoforms by the MAP kinase kinases
MKK3 and MKK6. J Biol Chem1998; 273: 1741-1748
23. Entmann ML, Ballantyne CM. Association of neutrophils with platelet
aggregates in unstable angina : should we alter therapy ? Circulation
1996; 94: 1206-1208
24. Fliegel L, Walsh MP, Sinngh D, Wong C, Barr A. Phosphorylation of the C-
terminal domain of the Na+/H+ exchanger by Ca2+/calmodulin-dependent
protein kinase II.Biochem J 1992; 282: 139-145
25. Frelin C, Vigne P, Ladoux A, Lazdunski M: The regulation of intracellular
pH in cells from vertebartes. Eur J Biochem 1989; 174: 3-14
26. Fritzgerald DJ, Roy L, Catella F, Fritzgerald GA. Platelet activation in
unstable coronary artery disease. N Engl J Med 1986; 315 : 983-989
27. Gende O A, Cingolani HE. Comparsion between sodium-hydrogen ion and
lithium-hydrogen exchanger in human platelets. Biochem Biophys Acta
1993; 1152 :219-224
28. Grinstein S, Goetz JD, Furuya W, Rothstein A, Gelfand EW : Amilorid-
sensitive Na+/H+ -exchange in platelets and leucocytes: detection by
electronic cell sizing. Am J Physiol 1984; 247 : C293-C298
29. Grinstein S, Rotin D, Mason M. Na+/H+ - exchange and growth factor-
induced cytosolic pH changes: Role in cellular proliferation. Biochem
Biophys Acat 1989; 988: 73-97
30. Hackam DJ, Grinstein S, Rotstein OD. Intracellular pH regulation in
leukocyten: Mechanismus and functional significance. Shock 1996; 5:
17-21
31. Hackeng CM, Relou IAM, Pladet MW, Gorter G, van Rijn HJM, Akkerman
JWN. Early Platelet Activation by Low Density Lipoprotein via p38MAP
Kinase. Thromb Haemost 1999; 82: 1749-56
LITERATUR
48
32. Hackeng CM, Franke B, Relou AM, Gorter G, Bos JL, Rijn JM, Akkerman
JWN. Low-density lipoprotein activates the schmall GTPases Rap1 and
Ral in human platelets. Biochem J 2000; 349: 231-238
33. Harold FM, Papineau D: Cationen transport and electrogenenesis by
Streptococcus faecalis. J Membr Biol 1972; 8: 45-62
34. Harootunian AT, Kao JP, Eckert BK, Tsien RY: Fluorescence ratio imaging
of cytosolic free Na+ in individual fibroblasts and lymphocytes. J Biol
Chem 1989; 264: 19458 – 19463
35. Hashizume T, Yamaguchi H, Kawamoto A, Tamra A, Sato T, Fujii T. Lipid
peroxide makes rabbit platelet hyperaggregable to agonist through
phospholipase A2 activation. Arch Biochem Biophys 1991; 289: 47-52
36. Hecht D, Zick Y. Selective inhibiton of protein tyrosine phosphatase
activities by H2O2 and vanadate in vitro. Biochem Ciophys Res Comm
1992; 188: 773-779
37. Hooley R, Yu CY, Symons M, Barber DL. Gα13 stimulates Na+/H+
exchanger through distinct Cdc42-dependent and RhoA-depedent
pathway. J Biol Chem 1996; 271: 6152-6158
38. Hornberger W, Patscheke H. Primary stimuli of icosanoid release inhibit
arachidonyl – Co A synthetase and lysophospholipid acyl transferase.
Eur J Biochem 1990; 187: 175-181
39. Iuliano L, Colavita AR, Leo R, Pratico D, Violi F. Oxgen free radicals and
platelet activation. Free Radical Biology and Medicine 1997; 22: 999-
1006
40. Iuliano L, Pedersen JZ, Pratico D, Rotilio G, Violi F. Role of hydroxyl
radicals in the activation of human platelets. Eur J Biochem 1994; 221:
695-704
41. Iuliano L, Pratic D, Bonavita MS, Viola F. Involvement of Phospholipase A2
in H2O2 - dependent platelet aggergation. Platelets 1992; 2: 87-90
42. Iuliano L, Pratico D, Ghiselli A, Bonavita MS, Violi F. Superoxide dismtase
triggers activation of “primed” platelets. Arch Biochem Biophys 1991;
289: 180-183
43. Kanda Y, Nishio E, Kuroki Y, Mizuno K, Watanabe Y. Thrombin activates
p38 mitogen-activated protein kinase in vascular smooth muscle cells.
Life Sci 2001; 68: 1989-2000
LITERATUR
49
44. Kochhar N, Kaul D. Molekular link between membrane cholesterol and
Na+/H+ - exchange within human platelets. FEBS Lett 1992; 229:19-22
45. Kontos HA, Wei EP, Ellis EF, Jenkins LW, Rowe GT, Hess ML.
Appearance of superoxide anion radical in cerebral extracellular space
during increase prostaglandin synthesis in cats. Circ Res 1985; 57: 142-
151
46. Kramer RM, Roberts EF, Strifler Ba, Johnstone EM. Thrombin induces
activation of p38 MAPkinase in human platelets. J Biol Chem 1995; 270:
27395-27398
47. Kramer RM, Roberts EF, Um SL, Borsch-Haubold AG, Watson SP, Fisher
MJ, Jakubowski JA. P38 mitogen-activated proatein kianse
phosphoryltes cytosolic phospholipas A2 (cPLA2) in thromibn-
stimulated platelets. Evidence that proline-directed phosphorylation is
not required for mobilization of arachidonic acid by cPLA2. J Biol Chem
1996; 271: 27723-27729
48. Kulmacz RJ, Tasi A, Palmer G. Heme spin states and peroxide induced
radical species in prostanglandin H synthetase. J Biol Chem 1987; 262:
10542-10531
49. Leoncini G, Maresca M, Colao C. Oxidative metabolim of human platelets.
Biochem Int 1991; 25: 647-655
50. Levine PH, Weinger RS, Siomon J, Scoon KL, Krinsky NI. Release of
hydrogen peroxide by granulozytes as a modulator of platelet reaction. J
Clin Invest 1976; 57: 955-962
51. Lewis TS, Shapiro PS, Ahn NG. Signal transduction through MAP kinase
cascades. Adv Cancer Res 1998; 74: 49-139
52. Libby P, Geng YJ, Aikawa M, Schoenbeck U, Mach F, Clinton SK, Sukhova
GK, Lee RT. Macrophages and atherosclerotic plaque stability. Curr
Opin Lipidol 1996; 7: 330-335
53. Lin LL, Lin AY, Knopf JL. Cytosolic phospholipase A2 is coupled to
hormonally regulated release of arachidonic acid. Proc Natl Acad Sci
1992; 89: 6147-6151
54. Lin X, Barber DL. A calcineurin homologous protein inhibits GTPase-
stimulated Ha-H exchange. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 12631-
12636
LITERATUR
50
55. Lin X, Barber DL. A calcineurin homologous protein inhibits GTPase-
stimulated Na-H exchange. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 12631–
12636
56. Livne A, Grinstein A, Rothstein A. Characterization of Na+/H+-exchange in
platelets. Thromb Haemost 1987; 58: 971-977
57. Livne AA, Sardet C, Pouysségur J : The Na+/H+-exchanger is
phosphorylated in human platelets in response to activating agents.
FEBS Lett 1991; 284: 219-222
58. Löffler, Petrides . Biochemie und Pathobiochemie 1997: 777
59. Marinho CF, Costa-Maia J, Pinto de Barros J, Oliveira CR: Correlation
between human platelet cytoplasmic outer leaflet fluidity, Na+/H+ -
excahnger activity and aging. Eur Arch Psychiatry Clin Neuroscience
1997; 247: 275-277
60. Markus AJ, Silk ST, Safier LB, Ullmann HL. Superoxid production and
reducing activity in human platelets. J Clin Invest 1977; 59:149-158
61. Miller CC, Hale P, Pentland AP. Ultraviolet B injury increase prostaglandin
synthesis through a tyrosin kinase dependent pathway. J Biol Chem
1994; 269: 3523-3529
62. Minden A, Lin A, Claret FX, Abo A, Karin M. Selective activation of the
JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small
GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell 1995; 81: 1147-1157
63. Mirabelli F, Salis A, Vairetti M, Bellomo G, Thor H, Orrenius S.
Cytoskeletal alterations in human platelets exposed to oxidativ stress and
Ca2+ dependent mechanism. Arch Biochem Biophys 1989; 270: 478-488
64. Mitchell P, Moyle J: Respitration-driven protontranslocatin In rat liver
mitochondria. Biochem J 1967; 105: 1147 – 1162
65. Moolenaar WH, Tertoolen LGJ, de Laat SW. Phorbol ester and
diacylglycerol mimic growth factors in raising cytoplasmic pH. Nature
1984; 312: 371-374
66. Moolenaar WH, Tsien RY, van der Saag PT, de Laat SW. Na+/H+ - exchange
and cytoplasmatic pH in the action of growth factors in human
fibroblasts. Nature 1983; 304: 645-648
LITERATUR
51
67. Mürer H, Hopfer V, Kinne R: Sodium/protonen antiporter in brush border
membrane vesicles isolated from rat small intestine and kidney. Biochem
1976, 154: 597-604
68. Ng LL, Fennell DA, Dudley C: Kinetics of the human leucocyte Na+/H+
antiport in essential hypertension. J Hypertens 1990; 344: 541-544
69. Nofer JR, Tepel M, Kehrel B, Wierwille S, Walter M, Seedorf U, Zidek W,
Assmann G. Low-Density Lipoproteins Inhibit the Na+/H+ Antiporter in
Human Platelets. Circulation 1997; 95: 1370-1377
70. Nofer JR, Walter M, Seedorf U, Assmann G. HDL3 activates phospholipase
D in normal but not in glycoprotein IIb/IIIa – deficient platelets.
Biochem Biophys Res Commun 1995; 207: 148-154
71. Numata M, Petrecca K, Lake N, Orlowski J: Identification of a
mitochondrial Na+/H+ - exchanger. J Biol Chem 1998; 273: 6951-6959.
72. Ogawa A, Ishikawa Y, Sasakawa S. Cytoplasmic pH dependency of Na+/H+
exchange in human platelets activated with thrombin, arachidonic acid,
A23187 and TPA. Thromb Res 1989; 55: 683-693
73. Ohyashiki T, Kobayashi M, Matsui K. Oxygen-radical-mediated lipid
peroxidation and inhibition of ADP-induced platelet aggregation. Arch
Biochem Biophys 1991; 288: 282-286
74. Orlowski J, Grinstein S. Na+/H+ - exchanger of mammalian cells. J Biol
Chem 1997; 272: 22373-22376
75. Ott I, Neumann FJ, Gawaz M, Schmitt M, Schoming A. Increased
neutrophil-platelet adhesion in patients with unstable angina. Circulation
1996; 94: 1239 - 1246
76. Poch E, Botey A, Gaya J, Cases A, Rivera F, Revert L. Intracellular calcium
mobilization and activation of the Na+/H+ exchanger in platelets.
Biochem J 1993; 290: 617 – 622
77. Pou S, Pou WS, Bredt D, Snyder SH, Rosen GM. Generation of superoxide
by purified brain nitric oxide synthetase. J Biol Chem 1992; 267: 24173-
24176
78. Pratico D, Iuliano L, Ghiselli A, Alessandri C, Violo F. Hydrogen peroxid as
trigger of platelet aggregation. Haemostasis 1991; 21: 169-174
LITERATUR
52
79. Reusch HP, Reusch R, Rosskopf D, Siffert W, Mann JFA, Luft FC: Na+/H+ -
exchange in human lymphoctes and platelets in chronic and subacute
m,etabolic acidosis. J Clin Invest 1993; 92: 858-865
80. Roousseau S, Houle F, Landry J, Huot J. p38 Map kinase activation by
vascular endothelial growth factor mediates actin reogranization and cell
migration in human endothelial cells. Oncogene 1997; 15: 2169-2177
81. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s.
Nature. 1993; 362: 801-809
82. Rosskopf D, Siffert G, Osswald G, Witte K, Düsing R, Akkermann JWN,
Siffert W: Platelet Na+/H+ - exchanger activity in normotensive and
hypertensive subjects: effect of enalapril therapy upon antiport activity. J
Hypertens 1992; 10: 839-847
83. Rosskopf D, Siffert G, Osswald U, Witte K, Düsing R, Akkermann JWN,
Siffert W. Platelet Na+/H+ -exchange activity in normotensive and
hypertensive subjekts: Effect of enalapril therapy upon antiport activity.
J Hypertens 1992; 10: 839-847
84. Ruther PA, Pizzona JH, Biemesderfer D, Abu-Alfa A, Reilly R, Aronson PS.
Expression of Na+/H+-exchanger isoforms NHE1 and NHE3 in kidney
and blood cells of rabbit and rat. Exp Nephrol 1997; 5: 490-497
85. Rutherford P, Pizzona J, Abu-Alfa A, Biermesderfer D, Reilly R, Aronson P.
Sodium-hydrogen exchange isoform expression in blood cells:
Implications for studies in diabetes mellitus. Exp Clin Endocrinol
Diabetes 1997; 105: 13-16
86. Sage SO, Jobson TM, Rink TJ. Agonist-evoked changes in cytosolic pH and
calcium concentration in human platelets: Studies in physiological
bicarbonate. J Physiol (Lond) 1990; 420: 31-45
87. Saklatvala J, Rawlinson L, Waller RJ, Sarsfield S, Lee JC, Morton LF,
Barnes MJ, Farndale RW. Role of p38 mitogen-activated protein kinase
in platelet aggregation caused by collagen or a thromboxane analogue. J
Biol Chem 1996; 271:6586-6589
88. Salvemini D, De Nucci G, Sneddon JM, Vane JR. Superoxide anions
enhance platelet adhaesion and aggregation. Br J Pharmacol 1989; 97:
1145-1150
LITERATUR
53
89. Salvemini D, Radziszewski W, Mollace V, Moore A, Willoughby D, Vane J.
Diphenylene iodonium, an inhibitor of free radical formation , inhibits
platelet aggregation. Eur J Pharmacol 1991; 199: 15-18
90. Sardet C, Counillon L, Franchi A, Pouysségur J. Growth factor induced
phoshorylation of the Na+/H+ antiporter, a glycoprotein of 110-kD.
Science 1990; 247: 723-726.
91. Sardet C, Fafournoux P, -pouysségur J.α-thrombin, EGF and okadaic acid
activate the Na+/H+ exchanger, NHE1, by phosphorylating a set of
common sites. J Biol Chem 1991; 29: 19166-19171
92. Sardet C, Franchi A, Pouysségur J: Molecular cloning, primary structure and
expression of human growth factor-activatable Na+/H+ - antiporter. Cell
1989; 65: 271-280
93. Seger R, Krebs EG. The MAPK signalling cascade. FASEB J 1995: 726-35
94. Siffert W, Mückennhoff K, Scheid P. Evidence for a role of Na+/H+
exchanger in platelets activated with calcium ionophore A23187.
Biochem Ciophys Res Commun 1984; 125: 1123-1128
95. Siffert W, Sieffert G, Scheid P, Akkermann JWN. Na+/H+ exchange
modulates Ca2+ mobilisation in human platelets stimuklated by ADP
and thrmboxane mimetic U 46619. J Biol Chem 1990; 254: 719-725
96. Siffert W, Siffert G, Scheid P. Activation of the Na+/H+ exchange in human
plateltes stimulated by thrombin and a phorbol ester. Biochem J 1987;
241: 301-303
97. Siffert W. Regulation of platelet function by sodium-hydrogen exchange.
Cardiovasc Res 1995; 29: 160-166
98. Spangenberg P. Adhesion of activates platelets to polymorphonuclear
leukoctes. Thromb Res 1994; 74: S34-S44
99. Surya I, Akkerman J-W. The influence of lipoproteins on blood platelets.
Am Heart J 1993; 125: 272-275
100. Takahashi E, Abe J, Gallis B, Aebersold R, Spring DJ, Krebs EG, Berk BC.
p90 RSK Is a Serum-stimulated Na/H Exchanger Isoform-1 Kinase. J
Biol Chem 1999; 274: 20206 – 20214
101. Taylor L, Menconi MJ, Polgar P. The participation of hydroperoxides and
oxygen radicals in the control of prostaglandin synthesis. J Biol Chem
1983; 258: 6855-6857
LITERATUR
54
102. Tepel M, Bauer S, Kegel M, Raffelsiefer A, Wischniowski H, Zidek W:
Increased lymphocytic Na+/H+-exchange activity after hemodialysis:
evidence for an endogenous inhibitor of the Na+/H+ -exchanger in
patients with end stage renal failure. Life Sciences 1996; 59: 1545-1552
103. Tepel M, Kühnapfel S, Theilmeier G, Teupe C, Schlotmann R, Zidek W:
Filling state of intracellular Ca2+ pools triggers trans plasma menbrane
Na+ and Ca2+ influx by a tyrosine kinase-dependent pathway. J Biol
Chem 1994; 296: 26239-26242
104. Thomas JU, Buchsbaum RN, Zimniak A, Racker E: Intracellular pH
measurments in Ehrlich ascites cells utilizing spectroscopic probes
generated in situ. Biochemistry 1979; 81: 2210-2218
105. Tominaga T, Barber DL. Na-H exchange acts downstream of Rho A to
regulate integrin-induced cell adhesion and spreading. Mol Biol Cell
1998; 9: 2287-2303
106. Tominaga T, Ishizaki T, Narumiya S and Barber DS. p160ROCK mediates
RhoA activation of Na-H exchange. EMBO J 1998; 17: 4712 – 4722.
107. Tong L, Pav S, White DM, Rogers S, Crane KM, Cywin CL, Brown ML,
Pargellis CA. A highly specific inhibitor of human p38 MAP kinase
binds in the ATP packet. Nat Struct Biol 1997; 4: 311-316
108. Tonnessen TI, Sandvig K, Olsnes S. Role of Na+-H+ and Cl--HCO3- antiports
in the regulation of cytosolic pH near neutrality. Am J Physiol 1990;
258: C1117-C1126
109. Toyoshima F, Moriguchi T, Nishida E. Fas induces cytoplasmic apoptotic
resonses and activation of the MKK7-JNK/SAPK and MKK6-p38
pathway independent of CPP32-like proteases. J Cell Biol 1997; 139:
1005-1015
110. Velerer ZS, Symons M, Barber DL. Activation of Na+/H+ exchanger is
necessary of Rho A induced stress fiber formation. J Biol Chem 1996;
271: 22281-22284
111. Voyno-Yasenetskaya T, Conklin BR, Gilbert R, Hooley HR, Bourne HR,
Barber DL. Gα13 stimulates Na-H exchange. J Biol Chem 1994; 269:
4721-4724
112. Wakabayashi S, Bertrand B, Ikeda T, Pouysségur J, Shigekawa M. Mutation
of calmodulin-binding site renders the Na+/H+ exchanger (NHE1) highly
LITERATUR
55
H+-sensitive and Ca2+ regulation-defective. J Biol Chem 1994; 269:
13710-13715
113. Wakabayashi S, Ikeda T, Iwamto T, Pouysségur J, Shigekawa M.
Calmodulin-binding autoinhibitory domain controls „pH-sensing“ in the
Na+/H+-exchanger NHE1 through sequence-specific interaction.
Biochemistry 1997; 36: 12854-12861
114. Wakabayashi S, Sardet C, Fafournoux P, Counillon L, Meloche S, Pagés G
Pouysségur J. Structure function of the growth factor-activatable Na+/H+
- exchanger (NHE1). Rev Physiol Biochem Pharmacol 1992;119:157-
186
115. Wakanayashi S, Shigekawa M, Pouyssegur J: Molecular Physiologie of
vertebarte Na+/H+ - exchangers. Physiol Rev 1997; 77: 51-74
116. Whitemarsh AJ, Davis RJ. Transcription factoer AP-1 regulation by
mitogen-activated protein kinase signal transductions pathways. J Mol
Med 1996; 74: 589-607
117. Yan W, Nehrke K, Choi J, Barber DL. The Nck-interacting Kinase (NIK)
phosphorylates the NaH Exchanger NHE1 and Regulates NHE1
Activation by Platelet-derived Growth Factor. J Biol Chem 2001; 276:
31349-31356
118. Zavoico GB, Cragoe EJ, Feinstein MB. Regulation of intracellular pH in
human platelets. J Biol Chem 1986; 261: 13160-13167
119. Zechner D, Craig R, Hanford DS, McDonough PM, Sabbadini RA,
Glembotski CC. MKK6 activates mayocardial cell NF-kappaB and
inhibits apoptosis in a p38 mitogen-activated protein kinase-dependent
manner. J Biol Chem 1998; 273: 8232-8239
120. Zieve PD, Solomon HM. The intracellular pH of the human platelet. J Clin
Invest 1996; 45: 1251-125
DANKSAGUNG
56
Danksagung
Die vorliegende Arbeit konnte nur fertiggestellt werden, weil ich während der dazu
notwendigen Untersuchungen auf vielfältige Art und Weise unterstützt worden bin.
Daher möchte ich mich an dieser Stelle bei allen sehr herzlich bedanken, ohne die die
Erstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Im einzelnen möchte ich danken:
- Herr Prof. Dr. med. M. Tepel der mir freundlicherweise das Thema überlassen hat. Er
war jederzeit für mich ansprechbar und hat mir alle erforderliche Unterstützung
großzügig gewährt. Die Betreuung durch ihn erfolgte in hervorragender Art und Weise.
- Herr PD Dr. med. J.-R. Nofer hat mich ebenfalls zu jeder Zeit tatkräftig unterstützt. Er
hat mich insbesondere bei der Einführung und Durchführung der Blotting Technik
hervorragend unterstützt.
- Herr Prof. Dr. med. B. Sanner für die freundliche Übernahme der weiteren Betreuung
meiner Promotionsarbeit.
- Frau Renata Feuerbor für ihre freundliche Anleitung und Unterstützung bei der
Durchführung von den Western Blots.
- allen, die mir für meine Versuche Blut gespendet haben.
- meinen Eltern und meinem Bruder Matthias für ihre Unterstützung, meiner Tante
Gretel Wagner für die Unterkunft und ihr „Daumendrücken“ während meines
Studiums, Anna und Frank Wördehoff sowie Christoph Becker und Thomas
Splittgerber für ihre motivierenden Worte, meinen Freunden, insbesondere Oliver Lieth,
Markus und Bettina Köhler für das Korrekturlesen.
- und ganz besonders meiner Freundin Nadine Wördehoff für ihr Verständnis und ihre
liebevolle Unterstützung.
LEBENSLAUF
57
Lebenslauf
Name: Noll
Vorname: Christian
Geburtstag: 15. Juni 1976
Geburtsort: Wuppertal
Staatsangehörigkeit: deutsch
Anschrift: Böswipper 7a
51688 Wipperfürth
Eltern: Elisabeth Noll, geborene Brendel
geb. am 7. Juni 1950
Industriekauffrau, Hausfrau
Andreas Noll
geb. am 22. August 1948
technischer Betriebswirt
Geschwister: Matthias Noll
geb. am 29. Juni 1983
Ausbildung zum Informationstechnischen Assistenten
LEBENSLAUF
58
Werdegang: 1982 - 1986 Gemeinschaftsgrundschule Hückeswagen
1986 - 1992 Städt. Realschule Hückeswagen
1992 - 1995 Städt. Engelbert von Berg Gymnasium
Wipperfürth
1995 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife
1995 - 1996 Zivildienst als Rettungssanitäter auf der
Rettungswache Wipperfürth
seit 1996 Studium der Humanmedizin an der Ruhr -
Universität Bochum
1998 Bestehen der ärztlichen Vorprüfung
1999 Bestehen des ersten Abschnitts der
Ärztlichen Prüfung
2001 Bestehen des zweiten Abschnitts der
Ärztlichen Prüfung