Aus dem Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Rolf Müller des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
„BMI-1 ist ein direktes Zielgen von E2F-1 in primären Neuroblastomen“
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Medizin
dem Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Kornelius Tobias Kerl, geboren in Delmenhorst
Marburg 2007.
Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg am: 06.06.2008 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs für Medizin Dekan: Prof. Dr. Rothmund Referent: Prof. Dr. Eilers 1.Korreferent: Prof. Dr. Grzeschik 2.Korreferent: Prof. Dr. Lührmann
3
1 Einleitung
1.1 Das Neuroblastom.................................................................................................8
1.1.1 Histologie...............................................................................................8
1.1.2 Diagnostik ..............................................................................................9
1.1.3 Inzidenz und Stadieneinteilung............................................................10
1.1.4 Prognose...............................................................................................11
1.1.5 Genetik.................................................................................................11
1.1.6 Therapie ...............................................................................................13
1.2 Die E2F-Familie...........................................................................................14
1.2.1 Die E2F-Transkriptionsfaktoren ..........................................................14
1.2.2 Der RB/E2F-Kontrollpunkt .................................................................16
1.2.3 E2F1 in Neuroblastomen .....................................................................17
1.3 Das Polycombgen BMI1 ..............................................................................18
1.3.1 Polycombproteine ................................................................................18
1.3.2 Polycomb Proteine und “Zellgedächtnis”............................................21
1.3.3 Repressionsmechanismen durch PcG-Komplexe ...............................22
1.3.4 INK4a/ARF..........................................................................................23
1.3.5 BMI1 ist als Onkogen, verantwortlich für die Selbsterneuerung von
Stammzellen........................................................................................................24
1.3.6 Bmi1 und Neuroblastome ....................................................................26
1.4 Ziele und Fragestellungen............................................................................26
2 Material ...............................................................................................................29
2.1 Chemikalien und Reagenzien ......................................................................29
2.2 Lösungen......................................................................................................30
2.3 Puffer............................................................................................................31
2.4 Enzyme ........................................................................................................34
2.5 Proteaseinhibitoren ......................................................................................35
2.6 Proteasominhibitoren ...................................................................................35
2.7 Bakterienstämme..........................................................................................36
2.8 Eukaryontische Zelllinien ............................................................................36
2.9 Kultivierungsmedien....................................................................................37
2.9.1 Bakterienmedium.................................................................................37
2.9.2 Zellkulturmedium ................................................................................38
Inhaltsverzeichnis
4
2.10 Antibiotika ...................................................................................................39
2.11 Antikörper ....................................................................................................39
2.11.1 Primärantikörper ..................................................................................39
2.11.2 Sekundärantikörper ..............................................................................40
2.12 Synthetische Oligonukleotide ......................................................................40
2.12.1 Primer zur Klonierung von cDNA in Plasmid-DNA...........................40
2.12.2 Primer für in vitro-Mutagenese............................................................41
2.12.3 RNA-Oligonukleotide für RNA-Interferenz Experimente ..................41
2.12.4 RNA-Oligonukleotide für RT-PCRs im Echt-Zeit-Gerät ....................42
2.13 Vektoren.......................................................................................................43
2.13.1 Grundvektoren .....................................................................................43
2.13.2 RNAi-Plasmid......................................................................................44
2.13.3 Reporterplasmide .................................................................................44
2.13.4 Expressionsvektor ................................................................................45
2.14 Kitsysteme....................................................................................................45
2.15 Verbrauchsmaterialien .................................................................................46
2.16 Geräte...........................................................................................................46
3 Methoden ............................................................................................................47
3.1 Zellbiologische Methoden ...........................................................................47
3.1.1 Allgemeine Bedingungen für die Kultivierung von Säugerzellen.......47
3.1.2 Passagieren von Zellen ........................................................................47
3.1.3 Zählen von Zellen mit Hilfe von Zählkammern ..................................48
3.1.4 Einfrieren von eukaryontischen Zellen................................................48
3.1.5 Auftauen von eukaryontischen Zellen .................................................49
3.1.6 Transiente Transfektion von Säugerzellen durch
Calciumphosphatpräzipitation für Expressionsstudien.......................................49
3.1.7 Calciumphosphat-Methode für die transiente Transfektion von
Säugerzellen für Reporterstudien........................................................................50
3.1.8 Selektion von antibiotikaresistenten Zellen .........................................50
3.1.9 Induktion von eukaryontischen Zellen.................................................51
3.1.10 Stabile Transfektion von Säugerzellen durch
Calciumphosphatmethode...................................................................................52
3.1.11 Infektion von Säugerzellen mit Virusüberstand ..................................53
5
3.1.12 Durchführung eines Koloniebildungsversuch mit stabil transfizierten
siRNA-BMI Klonen............................................................................................54
3.1.13 Anfärben von fixierten eukaryonten Zellen durch Giemsa-Färbung für
Koloniebildungsversuche....................................................................................54
3.1.14 Durchflußzytometrie (FACS-Analyse)................................................55
3.2 Molekularbiologische Methoden .................................................................56
3.2.1 Kultivierung von Bakterien..................................................................56
3.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien nach
Boiling-Prep-Methode 56
3.2.3 Minipräparation von BAC-Kulturen (bacterial artficial
chromosome).......................................................................................................57
3.2.4 Maxipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien .............................57
3.2.5 Photometrische Bestimmung Nukleinsäure-Konzentration...............58
3.2.6 Sequenzspezifische Hydrolyse von DNA mit
Restriktionsendonukleasen für analytische Zwecke ...........................................58
3.2.7 Sequenzspezifische Hydrolyse von DNA mit
Restriktionsendonukleasen für Klonierungszwecke ...........................................58
3.2.8 Agarose-Geleletrophorese von DNA...................................................59
3.2.9 Kovalente Verknüpfung von DNA-Fragmenten (Ligation) ................59
3.2.10 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien durch Hitzeschock ..60
3.2.11 Verschmelzen von zwei Oligonukleotideinzelsträngen durch
Verknüpfung durch kovalente Bindungen ..........................................................60
3.2.12 Dephosphorylierung von Vektorfragmenten .......................................61
3.2.13 Phosphorylierung von DNA-Fragmenten ............................................61
3.2.14 Klonierungsstrategien ..........................................................................61
3.2.15 Sequenzierungen ..................................................................................62
3.2.16 Generierung von BMI-Punktmutanten mittels in vitro-Mutagenese ...63
3.3 Biochemische Methoden..............................................................................64
3.3.1 Herstellung von Proteinlysaten aus Säugerzellen ................................64
3.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford ........................64
3.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteine..........................65
3.3.4 Transfer von Proteinen auf PVDF-Membranen mittels Western-Blot 65
3.3.5 Detektion von Proteinen auf PVDF-Membranen durch
Chemolumineszenz .............................................................................................66
6
3.3.6 Bewertungskriterien für Western-Blots ...............................................66
3.3.7 Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität ...........................................67
3.3.8 Bestimmung der Luciferaseaktivität ....................................................67
3.3.9 RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen mit Hilfe von Trizol .......68
3.3.10 cDNA –Amplifikation durch reverse Transkription aus RNA ............68
3.3.11 PCR mit spezifischen Primern .............................................................69
3.3.12 RT-PCR mit spezifischen Primern im Echt-Zeit-Gerät .......................69
4 Ergebnisse ...........................................................................................................70
4.1 Experimentelles System: Neuroblastomzelllinien, die ein E2F1-ER-
Fusionsprotein exprimieren .....................................................................................70
4.2 BMI1 ist Zielgen von E2F1..........................................................................70
4.2.1 E2F1 induziert Bmi1 auch auf Proteinebene .......................................70
4.2.2 BMI1 ist ein direktes Zielgen von E2F1 ..............................................71
4.2.3 Die Induktion von Bmi1 durch E2F erfolgt durch eine E2F-
Bindungsstelle im Bmi1-Promotor .....................................................................73
4.3 BMI1 ist kein Regulator des MYCN-Gens in IMR 32-Zellen bei transienter
Transfektion .............................................................................................................75
4.4 Untersuchung der Rolle von BMI1 in der Antwort auf E2F1 in
Neuroblastomen .......................................................................................................76
4.4.1 Hemmung der BMI1-Expression durch RNAi-Interferenz..................76
4.4.2 Folgen der Hemmung von BMI1 in Neuroblastomzellen ....................78
4.4.3 Reduktion der BMI1 Menge durch RNA-Interferenz in stabilen
Zellklonen ...........................................................................................................80
4.4.4 Induzierbare Hemmung der BMI1 Expression ....................................81
4.4.5 Funktionelle Inaktivierung von Bmi1 durch Expression eines
dominant-negativen Allels ..................................................................................84
4.4.6 Die Expression von dnBmi1 in 1A3-Zellen hat keinen Einfluss auf die
Induktion von S-Phase und Apoptose.................................................................86
4.5 HTERT ist kein Zielgen von BMI1 in Neuroblastomzellen .........................88
4.5.1 Die Dereprimierung von Rb führt nicht zur Induktion von E2F1 bzw.
Bmi1 in MEFs.....................................................................................................89
5 Diskussion...........................................................................................................91
5.1 E2F1 induziert Bmi1 durch Bindung an die E2F1 Bindungsstelle im BMI1-
Promotor ..................................................................................................................91
7
5.2 Bedeutung von Bmi1 in der Tumorgenese ..................................................91
6 Literaturliste ........................................................................................................97
7 Abbildungsverzeichnis......................................................................................119
8 Abkürzungsverzeichnis.....................................................................................121
9 Verzeichnis der akademischen Lehrer ..............................................................124
10 Tabellarischer Lebenslauf .................................................................................125
11 Danksagung.......................................................................................................127
12 Ehrenwörtliche Erklärung .................................................................................128
8
Einleitung
1.1 DAS NEUROBLASTOM
Das Neuroblastom ist der dritthäufigste maligne Tumor in der Pädiatrie. Es macht 9%
aller bösartigen Tumore des Kindesalters aus und ist für etwa 15% aller Todesfälle
durch Krebserkrankungen in diesem Alter verantwortlich (Kaatsch und Zambon,
2006). Es handelt sich um einen embryonalen Tumor, ausgehend vom
postganglionären sympathischen Nervensystem mit häufiger Lokalisation im Bereich
der Nebenniere und dem sympathischen Grenzstrang (Brodeur und Castleberry,
1997).
Sowohl klinisch, als auch molekularbiologisch weist das Neuroblastom eine
ausgeprägte Heterogenität auf. Der Krankheitsverlauf hängt wesentlich vom Stadium
der Erkrankung und vom Alter der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ab.
Das durchschnittliche Alter bei Diagnosestellung beträgt zwei Jahre. Im Allgemeinen
zeigen Kinder, bei denen die Erkrankung im ersten Lebensjahr diagnostiziert wird,
lokalisierte Tumorstadien, die durch Operation und minimale adjuvante Therapie
geheilt werden können (Brodeur und Castleberry, 1997). Im Gegensatz hierzu sind die
Tumore älterer Kinder häufig bereits bei Diagnosestellung metastasiert. Diese Kinder
sterben trotz intensiver multimodaler Therapie an einer raschen Tumorprogression
(Maris und Matthay, 1999).
1.1.1 Histologie
Die meisten Neuroblastome weisen sehr undifferenzierte Zellen auf. Der Grad der
Differenzierung kann in einem Tumor stark variieren. Entsprechend werden Tumore,
die sowohl aus undifferenzierten Zellen, als auch aus reifen Ganglionzellen bestehen
von solchen, die undifferenzierte und nur partiell differenzierte Neuroblasten
enthalten und Tumoren, die lediglich unreife, nicht differenzierte Zellen enthalten,
unterschieden (Hughes und Palmer, 1974; Shimada, 1982). Liegen reife neben
unreifen Zellen vor, spricht man von Ganglioneuroblastomen. Bei völliger Ausreifung
heißen die Tumore Ganglioneurome (Peuchmaur, 2004).
9
Undifferenzierte Neuroblastome zeigen kleine, basophile Zellen, die sich zu
Pseudorosetten zusammenlagern. Elektronenmikroskopisch lassen sich
katecholaminhaltige Granula nachweisen. Durch spezifische immunhistochemische
Färbungen kann der Nachweis für die Neuronenspezifische Enolase (NSE) erbracht
werden (Triche und Chandra, 1985). Die Tumore enthalten darüber hinaus einen
Anteil an Schwann-Zellen. Diese Zellen werden als Teil des Ausreifungsprozesses
verstanden (Brodeur und Hedborg, 1993; Ambros, 1996).
1.1.2 Diagnostik
Klinisch fallen die Patienten durch eine Anämie, Oberbauchschmerzen, Erbrechen,
Obstipationen, Diarrhö, Knochenschmerzen, Fieber oder andere unspezifische
Symptome auf. Dabei hängt die Symptomatik sehr stark von der Lokalisation des
Tumors ab (Brodeur, 2003). Nach der deutschen Neuroblastomstudie (NB2004) ist
folgende Diagnostik initial bei Verdacht auf ein Neuroblastom durchzuführen:
Labordiagnostisch sind folgende Parameter zu bestimmen:
Großes Blutbild, Elektrolyte, Leberwerte, Nierenwerte, Gerinnung.
Zusätzlich werden tumorassoziierte Marker bestimmt:
-LDH und Ferritin (erhöht)
-Neuronenspezifische Enolase im Serum (erhöht)
-Katecholaminmetabolite im Urin (Vanillinmandelsäure und
Homovanilinmandelsäure).
Eine bildgebende Diagnostik zur Bestimmung der Tumorausdehnung erfolgt durch:
-Ultraschall des Abdomens und des Lymphknotenstatus
-Kernspintomographie des Abdomens, des Kopfes, des Spinalkanals und des
Thorax
-Knochenszintigraphie
Darüber hinaus besteht durch die Metjodbenzylguanidin (MIBG)-Aufnahme ein
szintigraphischer Nachweis. Bei dieser Methode wird MIBG in neurosekretorischen
Granula chromaffiner Zellen angereichert. Die Diagnose Neuroblastom wird vor
allem histologisch gesichert.
10
1.1.3 Inzidenz und Stadieneinteilung
Die nach Alter standardisierte Inzidenz des Neuroblastoms in Deutschland betrug,
basierend auf Ergebnissen aus den Jahren 1989 bis 1998, 1,2 Fälle per 100.000
Kinder. Das Geschlechterverhältnis war mit 1:1,1 für Mädchen:Jungen annähernd
gleich (Kaatsch und Spix, 1999).
Das Neuroblastom wird in fünf Stadien eingeteilt (NB 2004).
Die wichtigsten Kriterien dieser Einteilung sind:
-der Ausdehnungsgrad des Tumors
-das Metastasierungsmuster und
-die Möglichkeit zum operativen Eingriff:
Stadium I: lokalisierter Tumor mit makroskopischer kompletter Resektion (mit oder
ohne mikroskopisch residualer Resterkrankung; im repräsentativen ipsilateralen
Lymphknoten lässt sich mikroskopisch kein Tumor nachweisen).
Stadium IIa: lokalisierter Tumor mit makroskopischer inkompletter Resektion, mit
mikroskopisch negativem repräsentativem ipsilateralen Lymphknotenbefund
Stadium IIb: lokalisierter Tumor mit inkompletter makroskopischer Resektion, mit
positiven ipsilateralen und negativen kontralateralen Lymphknoten
Stadium III: nicht resektabler unilateraler Tumor, der die Mittellinie überschreitet; mit
oder ohne regionalen Lymphknotenmetastasen
Stadium IV: Primärtumor mit Metastasierung in nicht regionale Lymphknoten, in
Knochen, Knochenmark, Leber, Haut oder andere Organe (Ausnahme: 4S)
Stadium IV S: Dieses Stadium nimmt eine Sonderstellung ein. Diese Patienten weisen
nach ursprünglicher Definition mehrere Fernmetastasen bei lokalisiertem
Primärtumor auf. Die Metastasen treten vor allem in der Haut, der Leber und dem
Knochenmark auf. Definitionsgemäß sind die Patienten bei Diagnosestellung unter
einem Jahr alt.
11
1.1.4 Prognose
In der deutschen Neuroblastomstudie (NB 97) wurden 2151 Patienten nicht selektiv
untersucht. Es ergab sich in dieser Studie eine 10-Jahresüberlebensrate von 61%. Die
wesentlichen Determinanten für die Überlebenszeit sind der Zeitpunkt der
Diagnosestellung und die Amplifikation des MYCN-Gens (Berthold und Zischnag,
1997), welches sich bei etwa 25% der Patienten nachweisen lässt (Brodeur, 1994).
Das Stadium bei Diagnosestellung spielt eine sehr große Rolle für die Überlebenszeit
der Patienten. Kinder im Alter von unter einem Jahr zum Zeitpunkt der
Diagnosestellung, haben selbst bei ausgedehnten Tumorstadien eine deutlich
günstigere Prognose als ältere Kinder (Beckwith und Perrin, 1963; Brodeur, 1994).
Nach der deutschen Neuroblastomstudie (NB`97) bedeutet dies für die einzelnen
Stadien folgendes: Die 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit beträgt für Stadium I
99%, Stadium II 93%, Stadium III 78%, Stadium IV 31% (NB 97).
1.1.5 Genetik
Für eine Untergruppe von Patienten mit Neuroblastomen ist eine familiäre
Prädisposition beschrieben worden, welche autosomal-dominant vererbt wird. Diese
Patienten erkranken im Durchschnitt 9 Monate früher als das
Gesamtpatientenkollektiv (Bordeaut und Delattre, 2005).
Es wurden bisher zahlreiche chromosomale Veränderungen in Neuroblastomen
untersucht. In den Chromosomen 1,-11 und -14 kommt es z.B. zu einem Verlust von
genetischem Material, während für das Chromosom 17 ein Zugewinn im Bereich von
17q charakteristisch ist (Gilbert und Weisband, 1984). CGH-Analysen (comparative
genomic hybridization) konnten in 50-75% aller untersuchten Neuroblastomproben
einen Zugewinn an genetischem Material in 17q21 nachweisen (Brinkschmidt und
Terpe, 1997; Plantaz und Feuerstein, 1997). Für Patienten mit familiärer Häufung von
Neuroblastomen wurde das Chromosom 16p12-13 als Ort der Mutation identifiziert.
Die Veränderungen im Bereich des Chromosoms 1 sind besonders häufig (bis zu 36%
aller Neuroblastome). Dabei handelt es sich um einen monoallelischen Verlust von
genetischem Material im Bereich des kurzen Arms vom Chromosom 1 (Brodeur und
12
Goldstein, 1977). Die Deletion auf Chromosom 1p geht mit einer schlechten Prognose
einher (Maris, 1995 und 2000). Die Konsensus-Verlustregion befindet sich im
Bereich 1p36.2-36.3, wobei kurze interstitielle Deletionen von größeren, terminalen
Deletionen, die generell mit einer Amplifikation von MYCN und entsprechend
schlechterer Prognose assoziiert sind, unterschieden werden (Christiansen und
Lampert,1992; Takeda und Taneko, 1994; White und Beltinger, 1995). Es wird
vermutet, dass im Bereich dieser Verlustregion von Chromosom 1p mehrere
potentielle Tumorsuppressorgene liegen (Schleiermacher und Delattre, 1994; Caron
und Hoeve, 1993; Takeda und Taneko, 1994). Durch den Transfer eines intakten
Chromosoms 1 in eine Neuroblastomzelllinie, die eine Deletion im Bereich des
Chromosoms 1p aufwies, konnte gezeigt werden, dass nach dem Transfer,
Differenzierungsprozesse und Apoptose induziert werden (Bader und Stanbridge,
1991). CHD5 wurde als ein Gen dieser Region identifiziert (Thompson und Brodeur,
2003). Die Mitglieder der CHD-Familie spielen eine große Rolle bei der
posttranslationellen Chromatinmodifikation (CHD: Chromodomain, helicase, DNA-
binding) (Woodage, 1997; Thompson und Brodeur, 2003).
In einem Kollektiv von 295 Neuroblastomen konnte festgestellt werden, dass ein
Verlust von genetischem Material im Bereich des langen Arms des Chromosoms 11
in 44% der Fälle vorlag (Guo und Maris, 1999). Die Konsensusverlustregion lag im
Bereich 11q23. In der Gruppe von Patienten ohne Amplifikation von MYCN ist der
LOH (loss of heterzygosity) des Chromosoms 11q mit einer signifikanten Reduktion
der Überlebenswahrscheinlichkeit assoziiert (Guo und Maris, 1999).
Das Chromosom 14 weist in Neuroblastomen ebenfalls häufig Deletionen auf. Diese
betreffen vor allen den langen Arm des Chromosoms 14 und korrelieren signifikant
mit einem LOH des Chromosoms 11q und invers mit der Amplifikation von MYCN
(Thompson und White, 2001).
Myc ist ein basisches Helix-loop-helix/leucine-zipper-Protein. Es wirkt als
Transkriptionsfaktor und kann in drei Teile unterteilt werden (Brough, 1995):
C-terminal befindet sich das b/HLH/LZ-Motiv. Dieses vermittelt die DNA-Bindung.
N-Terminal befinden sich zwei hoch konservierte Strukturen, die Myc-Box I und die
Myc-Box II, welche im Wesentlichen für die biologische Funktion von Myc
verantwortlich sind (Schwab, 1985; Li, 1994; Brough, 1995; Mac Gregor, 1996).
Grundsätzlich sind drei sehr eng miteinander verwandte Mycs zu unterscheiden: C-
Myc, N-Myc, L-Myc (Schwab, 1985; Schwab, 1988; Zimmermann, 1990).
13
Veränderungen des Expressionslevels von Myc sind die häufigste Ursache von
maligner Entartung von Tumoren. N-Myc ist in die Karzinogenese zahlreicher
Tumore involviert. In Neuroblastomen ist das Expressionslevel von N-Myc
entscheidend, um prognostische Aussagen treffen zu können (Schwab, 1995).
Die Funktionen von Myc sind sehr weitreichend: Blockade der Zelldifferenzierung,
Induktion von Apoptose, maligne Transformation von Zellen und Immortalisierung
(Schwab, 1988).
Ein wesentliches Problem bei der Therapie von Neuroblastomen ist die erworbene
und primäre Resistenz gegenüber Zytostatika. Isolierte Neuroblastomzelllinien aus
Tumorrezidiven weisen dabei wesentlich häufiger eine Resistenz gegenüber
Zytostatika auf, als entsprechende Tumore aus Kontrollzelllinien (Kuroda und
Sawada, 1991; Keshelava und Reynolds, 1997). In diesen Rezidiven konnte eine
Überexpression von MDR1 (multidrug resistance gene 1) nachgewiesen werden. In
einem Patientenkollektiv konnte gezeigt werden, dass ein Zusammenhang zwischen
Expression von MDR-Genen und dem Überleben der Patienten besteht (Norris und
Haber, 1996).
1.1.6 Therapie
Für therapeutische Maßnahmen werden die Neuroblastompatienten in mehrere
Gruppen eingeteilt (NB 2004). Bei dieser Einteilung werden das Tumorstadium, die
klinische Symptomatik und die Amplifikation von MYCN berücksichtigt.
Die erste Gruppe bilden Beobachtungspatienten im Säuglingsalter:
hierzu zählen Säuglinge mit MYCN-negativen Neuroblastomen und Stadium 1 oder
Stadium 4S ohne bedrohliche Symptome, sowie Stadium 2 und 3 ohne Deletion von
Chromosom 1p und einem Alter unter 2 Jahren.
Diese Patienten werden nach der Operation, bzw. Gewebeentnahme sechs bis zwölf
Monate beobachtet. Besteht der Tumor auch noch nach dieser Zeit, wird ein weiteres
operatives Vorgehen angestrebt. Nimmt der Tumor erneut an Größe zu, wird eine
einwöchige Chemotherapie mit Doxorubicin, Vincristin und Cyclophoshamid
durchgeführt (N4-Block). Diese muss bis zum Verschwinden des Tumors wiederholt
14
werden. Bei Übergang des Tumors in Stadium 4 wird der Patient der
Hochrisikogruppe zugeordnet.
Die zweite Gruppe (mittleres Risiko) umfasst Patienten im Stadium 2 und 3, die
MYCN nicht amplifiziert haben, aber eine 1p-Deletion aufweisen; oder Patienten im
Stadium 4 unter einem Jahr ohne MYCN-Amplifikation.
Nach der Operation wird eine Chemotherapie mit 10 Blöcken (3xN5: Cisplatin,
Etoposid, Vindesin; 3xN6: Vindesin, Darcabazin, Ifosfamid, Doxorubicin; 4xN7:
Cyclophophamid) durchgeführt.
Die dritte Gruppe (hohes Risko) besteht aus allen Patienten mit MYCN-Amplifikation
und Patienten im Stadium 4, die über einem Jahr alt sind (unabhängig von MYCN).
Diese Patienten erhalten nach einer primären operativen Tumorreduktion zunächst
2xN8 (Topotecan, Cyclophosphamid und Etoposid), gefolgt von 3xN5-Blöcken und
3xN6-Blöcken. Die zweite Operation und gegebenenfalls eine Bestrahlung werden
zwischengeschaltet. Bei Ansprechen des Tumors wird eine Hochdosischemotherapie
und eine autologe Stammzelltransplantation durchgeführt.
1.2 DIE E2F-FAMILIE
1.2.1 Die E2F-Transkriptionsfaktoren
E2F wurde als zellulärer Transkriptionsfaktor des E2-Adenoviruspromotors
identifiziert (Kovesdi und Nevins, 1986). Fast 5% aller Gene werden durch Mitglieder
der E2F-Familie reguliert. Eine große Anzahl hiervon übernimmt Funktionen bei der
Zellzyklusproliferation oder direkt bei der DNA-Synthese. Hierzu gehören unter
anderem die DNA-Polymeraseα (Pearson und Wang, 1991), die
Dihydrofolatreduktase (Blake, 1989), CDC25A (Vigo und Helin, 1999), die G1-
Cykline A und E (Schulze, 1995; Ohtani, 1995; Geng, 1996) sowie E2F-1 und -2
selbst (Hsiao und Farnham, 1994; Sears und Nevins, 1997).
15
Inzwischen sind acht Mitglieder der E2F-Familie bekannt (Review durch Rowland
und Bernards, 2006). Die verschiedenen Mitglieder der E2F-Familie wirken sowohl
als Transkriptionsaktivatoren als auch als Repressoren der Transkription (Dimova und
Dyson, 2005; Tsantoulis und Gorgoulis, 2005). Fünf Mitglieder der E2F-Familie
(E2F1-E2F5) interagieren mit den Proteine der Rb-Familie (pRB, p107 und p130)
(Weinberg, 1995; Paggi und Giordani, 2001; Hitchens und Robbins, 2003; Dimova
und Dyson, 2005; Tsantoulis und Gorgoulis, 2005). Durch Bindung dieser fünf E2Fs
an „Pocket Proteine“, unterdrücken sie die Transkription von Zielgenen. Diese E2F-
Komplexe bilden dann mit Histondeazetylasen (HDACs), chromatinverändernden
Proteinen, wie BRG-1 und Histonmethyltransferasen, wie SUV39H1, Komplexe
(Attwool, 2004). Durch Dissoziation von E2F1-E2F5 von den Pocket Proteinen wird
hingegen Transkription und damit die Expression von Zielgenen ausgelöst. Dabei
formen diese E2Fs Komplexe mit Histonacetyltransferasen wie p300, CBP, P/CAF
und Tip60 (Attwooll, 2004; Cobrinki, 2005).
Um an die DNA zu binden, bilden E2F1-E2F6 Heterodimere mit den
„Dimerisationspartner Proteinen (Dp1 und Dp2)“, während E2F7 und E2F8 auch
ohne Assoziation mit Dp1 und Dp2 an DNA binden können (Di Stefano und Helin,
2003; Logan und La Thangue, 2004). E2Fs enthalten sowohl Aktivator- als auch
Repressordomänen, wobei E2F1-E2F3 meist als Aktivatoren und E2F4-E2F6 meist
als Repressoren klassifiziert werden. Diese Unterschiede zwischen den beiden E2F-
Hauptgruppen spiegelt sich auch in der Struktur wieder: E2F4 und E2F5 sind primär,
wenn sie an Pocket Proteine gebunden sind, im Nukleus lokalisiert und funktionieren
so als „Repressionskomplex“, während sie sich in ungebundener Form außerhalb des
Nukleus befinden (Attwool, 2004; Frolov und Dyson, 2004).
Eine dominant-negative Mutante (Wu, 1996) und eine siRNA gegen Dp1 (Maehara,
2005), bewirken einen G1-Zellzyklusarrest durch den fehlenden DNA-
Bindungspartner für E2F. Dominant-negative Mutanten gegen E2F1 (Gonzalo, 2005,
Maehara, 2005) und E2F2 (Bargou, 1996) (mit fehlendem carboxyterminalem Ende)
zeigen keinen Zellzyklusarrest, sondern ganz im Gegenteil eine Stimulation der
Zellzyklusproliferation, die sich selbst gegenüber einer p19-Stimulation refraktär
zeigt (Rowland, 2002). Dieser offensichtliche Gegensatz wird folgendermaßen
erklärt: Können E2F1-E2F6 durch das Fehlen von Dp nicht an die DNA binden, so
überwiegt die Repression der Zellproliferation durch die atypisch bindenden (ohne
Dp1) E2F7 und E2F8. Dominant negativ-wirkende Mutanten von E2F besetzen
16
hingegen die E2F-Bindungsstellen und schützen diese so gegen Einflüsse repressiv
wirkender E2Fs (Rowland und Bernards, 2006).
1.2.2 Der RB/E2F-Kontrollpunkt
Bisher konnte nur ein kleiner Teil der genetischen Defekte, die zur Entstehung von
Neuroblastomen beitragen, identifiziert werden. So konnte bei einer Reihe von
Genen, die in vielen anderen Tumoren Mutationen aufweisen, in Neuroblastomen
keine Mutation nachgewiesen werden. Es gibt allerdings Hinweise, dass auch in
Neuroblastomen eine funktionelle Inaktivierung zumindest einiger dieser Gene
vorliegt. Diese weisen allerdings im Vergleich zu anderen Tumorarten andere
Mechanismen der Deregulation auf.
Viele Tumorarten zeigen Mutationen im RB-Gen (Retinoblastom) oder Genen
desselben Kontrollnetzwerkes (CDK2, CDK4, CCNE1)(Braden und Knudsen, 2006).
Das Retinoblastom-Protein ist Mitglied einer nach ihrer Struktur benannten Gruppe
von Proteinen, den „Pocket-Proteinen“. Zu dieser Gruppe gehören auch die Proteine
pRb1/105, p107 und pRb2/p130 (Gallo und Giordano 2005). pRB inhibiert das
Zellwachstum und die Zellproliferation (Balciunaite und Scime, 2005). Das
Retinoblastom-Protein ist eines der am Besten charakterisierten Tumorsupressoren.
Es weist vor allem im Retinoblastom, aber auch in vielen anderen malignen Tumoren,
wie z.B. dem Osteosarkom, dem kleinzelligen Bronchialkarzinom, dem
Prostatakarzinom sehr häufig Mutationen auf (Puri und McCance, 2005).
Ein Mechanismus der transkriptionellen Kontrolle der Cyclin-Untereinheiten ist
neben der Phosphorylierung und Dephosphorylierung, die Aktivierung einer weiteren
Gruppe regulatorischer Proteine, den zyklinabhängigen Kinaseinhibitoren (cyclin
dependend kinase inhibitors-CKI) (Peter und Herskowitz, 1994). Durch Binden der
CKIs an Cdk-Proteine oder Cyclin-Untereinheiten wird eine Inhibition der
Kinaseaktivität erreicht. Dadurch wird eine Phosphorylierung von Rb verhindert
(Peter und Herskowitz, 1994). In Säugerzellen sind zwei verschiedene CKI-Familien
bekannt, die beide die Zellzyklusprogression in der G1-Phase inhibieren: die Kip/Cip-
sowie die Ink4-Familie. Die Kip/Cip-Familie besteht aus den Proteinen p21Waf-1/Cip1,
17
p27Kip1 und p57Kip2. p21 spielt sowohl in dem DNA-Reparaturmechanismus der Zelle
als Zielgen von p53, als auch in der terminalen Differenzierung eine wichtige Rolle
(El-Deiry, 1993; Parker und Elledge, 1995).
Die zweite Familie zellzyklusinhibitorisch wirkender Proteine besteht aus den
Proteinen p14/p15INK4b, p16INK4a, p18INK4c und p19INK4d. Die Ink4-Proteine inhibieren
Cdk-4 und Cdk-6 durch Bindung an die Cdk-Untereinheit. Die Ink4-CKIs regulieren
also im Wesentlichen die Phosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins (Ortega und
Barbacid, 2002). Hypophosphoryliertes pRb1/p105 assoziiert mit E2F-1, E2F-2 und
E2F-3 und wirkt als transkriptioneller Ko-Repressor, der die Expression von E2F-
regulierten Genen inhibiert (Claudio, 2002; Trimarchi und Lees, 2002; Leone, 2000).
Die Phosphorylierung von pRb führt zur Dissoziation des pRb von E2F und in der
Folge zur Aktivierung E2F-regulierter Gene, die den Eintritt der Zellen in die S-Phase
des Zellzyklus bewirken (Muller, 2001; Young, 2003; Attwooll, 2004). Neben der
Inhibierung der E2F-abhängigen Expression wirkt der Rb/E2F-Komplex in
Kombination mit den HDAC (histone deacetylating complexes) selbst als aktiver
Repressor der Transkription. Diese wichtige Funktion als Kontrollpunkt bei der
Zellproliferation wird auch bei der Betrachtung Rb-defizienter Mäuse deutlich. Diese
weisen nämlich im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen einen höheren Anteil von Zellen in
der S-Phase auf. Rb wird auch in Verbindung mit chromatinverändernder Enzyme zur
Kontrolle der Expression von Genen gebracht (La Sala, 2003; Macaluso, 2003, 2005,
2006, Gunawardena, 2004, Parakati und DiMario, 2005). pRb2/p130 und p107 binden
an die repressiv auf die Transkription wirkenden E2Fs (E2F4 und E2F5) (Hijmans,
1995; 1998; Claudio, 2002; Farkas, 2002). E2F7 und E2F8 werden nicht in
Verbindung mit Pocket-Proteinen gebracht (Trimarchi und Lees, 2002; Aslanian,
2004; Ginsberg, 2004).
1.2.3 E2F1 in Neuroblastomen
E2F ist bei der Regulation der Transkription von MYCN in Neuroblastomen beteiligt
(Strieder und Lutz, 2003). Die Aktivität von E2F-1 steht unter der Kontrolle des Rb-
Weges, der in sehr vielen malignen menschlichen Tumoren dereguliert ist. In-vivo-
Analysen haben gezeigt, dass der MYCN-Promotor zwei überlappende E2F-
18
Bindungsstellen aufweist (La Thangue, 2002; Santoni-Rugui und Lukas, 2002).
Weitere Zielgene vom deregulierten E2F in Neuroblastomzellen wurden durch die
stabile Überexpression von E2F1-ER-Fusionsprotein in SK-N-SH-EP-Zellen
gefunden (Kramps, 2004). Die große Vielfalt an Aufgaben, die von Mitgliedern der
E2F-Familie erfüllt wird, wirft auch sehr viele Fragen auf:
1.) Welches der vielen hundert Zielgene ist verantwortlich für welche der zahlreichen
biologischen Funktionen?
2.) Liegen all diese Zielgene in aktiver Form vor, wenn die entsprechenden E2F-
Mitglieder aktiviert sind; oder ist das Vorliegen der entsprechenden Zielgene an
physiologische Regulationsmechanismen geknüpft?
Die Untersuchung eines dieser E2F-Zielgene, BMI1 und seine Rolle für die Funktion
von E2F1 im Neuroblastom war das Thema meiner Arbeit.
1.3 DAS POLYCOMBGEN BMI1
1.3.1 Polycombproteine
In den letzten Jahren ist durch viele Arbeiten klar geworden, dass entscheidende
Schritte zur Regulation von Genen auf Chromatinebene vollzogen werden. Eine sehr
wichtige Gruppe von Proteinen, die auf Chromatinebene Einfluss nimmt, sind die
Polycomb-Proteine. Die Polycomb-Proteine wurden in Drosophila, als Repressoren
der Homeotic Gene entdeckt. In menschlichen Zellen sind sie an der Regulation der
Homeobox (HOX) Gene beteiligt (Merel und van Lohuizen, 2004).
Es gibt im Wesentlichen zwei verschiedene Polycomb-Komplexe, die 2-5 MDa groß
sind und jeweils mit verschiedenen Korepressoren assoziieren (Jacobs und van
Lohuizen, 2002). In humanen Zellen gibt es offensichtlich einen dritten Komplex
(PRC3) (Kuzmichev und Reinberg, 2004).
Der erste Polycomb-Komplex („initiating complex“; PcGi; PRC 2) besteht unter
anderem aus EeD (embryonic ectoderm development), Enx1/EzH2 und Enx2/EzH1.
Der Kern des zweiten Komplexes („maintenance complex“; PcGm; welcher in
Drosophila auch Polycomb Repressive Complex 1 genannt wird) enthält die Proteine
19
Psc (posterior sex combs), Ph (polyhomeotic), Pc (Polycomb) und Ring (Francis und
Kingston, 2001; Satijn und Otte, 2001). In menschlichen Zellen liegt der
entsprechende „humane Polycomb Repressive Complex“ (hPRC) vor, der im
Wesentlichen die gleichen Proteine, aber auch das Ring-Finger-Protein Bmi (auch
Mel18, Mph1, M33 Mpc2) enthält. Dieses ist als das menschlich homologe Protein zu
Psc anzusehen (Satijn und Otte, 2001).
Die zwei Komplexe haben bei der Kontrolle der HOX-Gene eine redundante Funktion
(van der Lugt und Berns, 1994). HOX-Gene spielen u.a. bei der Differenzierung von
Stammzellen (HOXa5, HOXa9, HOXa10, HOXb3, HOXb4 und HOXb6) (Owens und
Hawley, 2002) und der neuronalen Differenzierung eine wichtige Rolle (Guthrie,
2004). Bei der Proliferation der hämatopoetischen Stammzellen verhalten sich die
beiden Komplexe allerdings antagonistisch; der Eed/Ezh Komplex inhibiert, während
der Bmi-enthaltende Komplex die Proliferation der hämatopoetischen Stammzellen
stimuliert (Franke und Paro, 1992; Alkema und van Lohuizen, 1997; Gunster und
Otte, 1997). Natürlich ist die Vorstellung von nur zwei verschiedenen Polycomb-
Komplexen eine starke Vereinfachung und trifft in einigen Punkten den Sachverhalt
nur ungenau. Die verschiedenen Polycomb-Proteine werden während der
Differenzierung sehr unterschiedlich exprimiert. Diese Eigenschaft lässt sich am
Besten im Knochenmark feststellen. BMI1-, MEL18-, MPH1/RAE28- und M33-
mutierte Mäuse weisen alle sehr weitreichende Defekte im hämatopoetischen System
auf (Reduktion der T-Lymphozytenzahl, Defekte in der Entwicklung von B-
Lymphozyten, vermindertes Ansprechen auf Zytokine v.a. IL-7, u.s.w.) (van der Lugt
und Berns, 1994; Akasaka und Koseki, 1997, 2001; Core und Djabali, 1997;
Takihara, 1997). Im Knochenmark zeigen undifferenzierte Vorläuferzellen die
stärkste Expression von Bmi1 (und MPH1/RAE28) (Ohta und Takihara, 2002; Park
und Clarke, 2003). Während der Differenzierung nimmt die Expression von Bmi1
stark ab. Diese Eigenschaft unterscheidet Bmi1 von den anderen Polycomb-Proteinen
(z.B. M33, Mel18, Hph1, Enx/Ezh2), deren Expression in hämatopoetischen
Vorläuferzellen sehr schwach oder nicht nachweisbar ist und während der
Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen zunimmt (Raaphorst und Meijer,
2001). Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die Zusammensetzung der Polycomb-
Komplexe von den unterschiedlichen physiologischen Bedingungen abhängt. Diese
Schlussfolgerung wird durch andere Beobachtungen unterstützt:
20
In Drosophila konnte gezeigt werden, dass die Zusammensetzung der Komplexe
abhängig von den unterschiedlichen Zielgenen ist. Dieses Bild wird dadurch
kompliziert, dass die eng miteinander verwandten PcG-Gruppen-Proteine Bmi1 und
Mel18 dosisabhängig miteinander kooperieren (Jacobs und van Lohuizen, 2002).
Der Verlust von Bmi1 verursacht neurologische Defekte, die bei Mel18-knock-out
Mäusen nicht beobachtet werden können (van der Lugt, 1994). Die neurologischen
Fehlbildungen bei Bmi-defizienten Mäusen liegen v.a. im Kleinhirn und im
Hippocampus (Molofsky und Morrison, 2003). In Lymphozyten verhält sich BMI1
durch Kollaboration mit CMYC als Onkogen, währenddessen MEL18
Tumorsuppressorfunktion hat (Kanno und Taniguchi, 1995). In Lymphozyten hat die
Überexpression von MEL18 wachstumsunterdrückende Wirkung (Akasaka, 1996;
1997). Diese z.T. entgegengesetzten Effekte von Bmi1 und Mel18 auf die
Zellproliferation sind umso erstaunlicher, wenn man weiß, dass 75% der
Aminosäuren beider Proteine identisch sind, und sie sich nur in der Ring-Finger-
Domäne unterscheiden (Alkema und Berns, 1997; Cohen, 1996; Jacobs und van
Lohuizen, 1999).
Abb.1 (modifiziert nach Jacobs und van Lohuizen; 2002)
Regulation der Proliferation hämatopoetischer Stammzellen. Polycomb Komplexe mit einem hohen Anteil an Bmi1-Protein
regulieren die Zellproliferation positiv, indem sie Ink4a reprimieren.
INK4a/ARF
Rb P53
BMI
BMI
BMI
Mel18
BMI BMI
Myc
ARF
P53
PcG
Cyclin
CDK
21
1.3.2 Polycomb Proteine und “Zellgedächtnis”
Der menschliche Körper besteht aus mehr als 200 unterschiedlichen Zelltypen. Diese
verschiedenen Zelltypen reagieren, obwohl sie alle das gleiche Genom enthalten, auf
intra- oder extrazelluläre Signale sehr unterschiedlich. Diese Zellidentität wird durch
epigenetische Ereignisse, wie Methylierung der DNA und posttranslationelle
Modifizierung der Histone, kontrolliert (Fisher, 2002; Jaenisch und Bird, 2003; Hsieh
und Gage 2004; Valk-Lingbeek und van Lohuizen, 2004). Die Gene der Polycomb-
Gruppe und der Thrithorax-Gruppe sind Teil dieses „Zellgedächtnisses”, welches die
Zellen vor Änderungen der Zellidentität schützt. Die Transkriptionsaktivität von
Genen, die als Ergebnis von regulatorischen Ereignissen in den einzelnen Zellen für
eine bestimmte Zeit anzusehen ist, kann über viele Runden Mitose aufrecht erhalten
werden. Das biochemische Korrelat dieser Konservierung sind epigenetische
Markierungen auf der DNA, die während der Mitose erhalten bleiben oder im
Anschluss an die Mitose wieder aufgebaut werden (Muyrers-Chen und Paro, 2001;
Orlando, 2003). Verantwortlich dafür, ob ein Gen im aktivierten oder reprimierten
Zustand vorliegt, sind regulatorische Sequenzen, so genannte „Polycomb Response
Elemente“ (PREs), „Maintenance Elemente“, oder „Zellgedächtnis-Module“ (CMMs)
(Brock und van Lohuizen, 2001; Lyko und Paro, 1999). In Drosophila bestehen
solche Module aus mehreren hundert Basenpaaren. An die „Maintenance Elemente“
binden einerseits Polycomb-Proteine (PcGs), die den reprimierten Zustand durch die
Blockade der RNA-Synthese konservieren, und zum anderen die antagonistisch
wirkenden Trithorax-Proteine, die den aktiven Zustand stabilisieren (Breiling und
Orlando, 2001; Poux und Pirrotta, 2002).
Die Regulation durch Polycomb-Proteine ist aber keineswegs irreversibel, sondern
wird sehr dynamisch durch Aktivatoren und Repressoren beeinflusst (Orlando, 2003).
Es wird vermutet, dass die Regulation der Polymerase II und die Synthese von nicht-
kodierender RNA erheblichen Anteil am komplexen Zellgedächtnis hat (Francis und
Woodstock, 2004). In humanen Zellen sind die PRC1-Mitglieder nicht nur an
Euchromatinregionen lokalisiert, sondern akkumulieren auch am perizentrischen
Heterochromatin (Saurin und Freemont, 1998; Voncken und van Lohuizen, 1999).
Die Pcg-Proteine bevorzugen dabei v.a. die 1q12-Region und die mit der 1q12-
Region verwandten Sequenz auf Chromosom 9, 15, 16. Die Assoziation zu den
hochrepititiven Regionen lässt eine spezielle Zielstruktur der Pcg-Proteine in diesen
22
Sequenzen vermuten (Hernandez-Munos und van Lohuizen, 2005). Die genaue
Funktion dieser Pcg-Assoziation ist zurzeit noch nicht abschließend geklärt. Es ist
aber bekannt, dass perizentrisches Heterochromatin bei der Genstabilisierung und
beim transkriptionellen Abschalten von Genen eine Rolle spielt (Peters und Jenuwein,
2001; Taddei und Almouzni, 2001).
1.3.3 Repressionsmechanismen durch PcG-Komplexe
Viele Trx-Proteine, die als molekulare Antagonisten der Pcg-Proteine anzusehen sind,
kodieren für eine ATPase-abhängige Untereinheit der Swi/Snf-Protein-Familie
(Mahmoudi und Verrijzer, 2001). PRC1 und PSC können Swi/Snf-abhängige
Nukleosomen reprimieren; dieses zeigt die antagonistische biochemische Aktivität zu
den Polycomb-Proteinen. Es gibt Hinweise, dass trxG-Komplexe Verbindungen zu
histonverändernden Enzymen eingehen, wie z.B. der Histondeacetylase p300
(Yokoyama und Cleary, 2004) und Cbp (Petruk und Mazo, 2001). Viele
Polycombgruppenproteine interagieren mit Koregulatoren, die die Transkription
durch Deazetylierung von Lysinen am N-terminalen Ende der Histone H3 und H4,
bzw. durch Hinzufügen von Methylgruppen, reprimieren (Cao und Zhang, 2002;
Zermin, 2002; Kuzmichev, 2002; Müller und Simon, 2002; Sewalt, 1998). Das
menschliche Eed interagiert mit HDAC1 und 2 (histone deacetylases 1/2) und
reprimiert auf diesem Weg die entsprechenden Zielgene (van der Vlag und Otte,
1999).
In-vitro kann sowohl Prc1, als auch Psc Swi/Snf-abhängige Nukleosomen
reprimieren. Dies bedeutet, dass der nukleosomale Kern oder die DNA weniger die
primären Ziele der PcG- und trxG-Komplexe sind, als die Histonketten. Während der
Esc-E(z)-Komplex in Fliegen und der entsprechende Eed-Ezh2-Komplex in
menschlichen Zellen die H3-K27-Methytransferase aktivieren (Beisel und Sauer,
2002; Cao und Zhang, 2002; Czermin und Pirotta, 2002; Kuzmichev und Reinberg,
2002; Milne, 2002; Muller, 2002; Nakamura, 2002), wurde für den Prc1-Komplex
eine Aktivierung der H2A-K119-Ubiquitin-E3-Ligase nachgewiesen (Wang, 2004).
Beim längerfristigen Abschalten von Genen kooperieren die beiden PcG-Komplexe
über folgende Verbindung miteinander: Die ESC-E(Z)-abhängige H3-K27-
23
Methylierung schafft eine Bindungsstelle für die Rekrutierung des PRC1-Komplexes
(Fischle, 2003; Min, 2003). Es gibt zwei Beweise dafür, dass PcG-Komplexe mit
Zielpromotoren der E2F Proteine und der E2F-Bindungsdomäne assoziieren:
1.) E2F6, eines der repressiven Mitglieder der E2F-Familie gehört zum gleichen PcG-
Komplex wie Bmi1 (Ogawa, 2002; Trimarchi, 2001)
2.) Die Polycomb-Proteine Hpc2 und Ring 1 bilden einen Komplex mit E2F-1, Rb
und CtBP, welcher einen G2/M-Zellzyklusarrest durch Repression von Cyclin A und
Cdc2 verursacht (Dahiya und Dean, 2001).
1.3.4 INK4a/ARF
INK4a/ARF ist ein Tumorsuppressor, welcher Zielgen von BMI1 in
Mausembryofibroblasten ist (siehe auch Abb.1) (Jacobs und van Lohuizen, 1999).
INK4a/ARF kodiert für zwei Gene (Verwendung eines unterschiedlichen Leserasters),
die beide als Tumorsuppressor wirken: P16 und P19. P16 verhindert die Inaktivierung
des Tumorsuppressors RB durch Hemmung des Cyclin D-Cdk4/6-Kinasen-
Komplexes. Hypophosphoryliertes pRb beeinflusst E2F-Transkriptionsfaktoren und
reprimiert die E2F-Zielgene (Sherr, 2001). p19/Arf bindet an Mdm2 und verhindert
die Degradation und Inaktivierung des Tumorsuppressors p53 (Sherr, 2001). Sowohl
p16, als auch p19 unterdrücken die Zellproliferation und sind Teil eines Systems,
welches unregulierte mitogene Stimuli unterdrückt (Sherr, 2001). Die Aktivierung
wird z.B. beim Erreichen hoher Zellteilungsraten ausgelöst. Wenn primäre Zellen den
Expressionsstimuli von Ras oder c-Myc ausgesetzt werden, werden p16 und p19
induziert und bewirken so einen Wachstumsarrest oder induzieren Apoptose (Sherr,
2001). In anderen Gewebetypen, wie z.B. neuronalen und hämatopoetischen
Stammzellen führt das Fehlen von Bmi1 ebenfalls zur Überexpression von p16/Ink4a
und p19/Arf (Molofsky und Morisson, 2003; Park und Clarke, 2003). Die erhöhte
Expression von p16/Ink4a oder p19/Arf in hämatopoetischen Stammzellen führt zum
Wachstumsarrest oder dem p53-abhängigen Zelltod (Park, 2003).
Bmi-defiziente Mäuse weisen mehrere Erscheinungsbilder auf: normale Körpergröße
mit milden skeletalen Veränderungen, Zeichen hämatopoetischer Fehlbildungen und
neuronaler Anormalitäten (van der Lugt, 1994). Die Deletion von Ink4a oder Arf in
24
Bmi-/- Mäusen führt zum Wiedereintreten der, durch das Fehlen von Bmi1
blockierten Erneuerung von neuronalen Stammzellen (Molofsky und Pardee, 2005).
Die Regulation des Wachstums von Stammzellen ist allerdings nicht nur vom
Ink4a/Arf abhängig; so ist das Erscheinungsbild von Ink4a/Arf-defizienten Mäusen
relativ normal. Es wird eine multifaktorielle Beeinflussung vermutet: P21/Cip1 und
P18/Ink4c kontrollieren ebenfalls den Zellzyklus (Cheng und Scadden, 2000;
Miyazawa, 2000). Mel18 und Cbx7 regulieren in bestimmten Zelltypen Ink4a/Arf
(Gil und Beach, 2004); so ist Ink4a/Arf in Mel18-/- Mausembryofibroblasten
hochreguliert (Jacobs und van Lohuizen, 1999). Andere Polycomb-Proteine, wie z.B.
Eed in mutierten Mäusen und Ezh2-defiziente Fibroblasten beeinflussen Ink4a/Arf
nicht (Lessard, 1999; Bracken, 2003).
1.3.5 BMI1 ist als Onkogen, verantwortlich für die Selbsterneuerung von
Stammzellen
Bmi-1 ist sowohl für die Proliferation und die Selbsterneuerung von erwachsenen
hämatopoetischen und neuronalen Stammzellen (Lessard und Sauvageau, 2003; Park
und Clarke, 2003; Molofsky und Morrison, 2003; Iwama, 2004; Leung, 2004; Zencak,
2005), als auch für die Proliferation von Tumorstammzellen notwendig (Valk-
Lingbeek und van Lohuizen, 2004). Bmi-defiziente Mäuse weisen zahlreiche
neurologische Defekte auf (siehe oben): v.a. in der Proliferation der Zellen der
subventrikulären Zone (Molofski, 2003), des Kleinhirns (Bmi wird für die
Entwicklung der Vorläuferzellen benötigt; Leung, 2004), aber auch des peripheren
Nervensystems (Molofsky, 2003). Diese Funktion von Bmi1 wird ebenfalls durch
Fähigkeit den INK4a-Genort zu reprimieren ausgeübt. Die Deletion von INK4a oder
ARF führt in Bmi-/-Mäusen zum Wiedereintreten der Erneuerung von neuronalen
Stammzellen (Molofsky, 2005).
In der Stammzellbiologie unterscheidet sich Bmi1 in einem wesentlichen Punkt von
anderen Polycomb-Proteinen: Die Expression von Bmi1 im Knochenmark ist in
undifferenzierten Vorläuferzellen sehr hoch und sinkt mit jedem Grad höherer
Differenzierung, während die Expression aller anderen Polycomb-Proteine während
der Differenzierung zunimmt (Lessard, 1998).
25
Die Identifizierung von BMI1 als Onkogen erfolgte in B- und T-Zell-Lymphomen
(Haupt und Adams, 1991; van Lohuizen, 1991). Es gibt wesentliche Hinweise dafür,
dass Bmi an der Entstehung von Tumoren beteiligt ist:
1.) Bmi1 kooperiert mit c-Myc in Lymphomen von doppelt-transgenetischen Mäusen
(Haupt und Adam, 1991; van Lohuizen und Berns, 1991; Jacobs, 1999). Bmi1
reguliert dabei Ink4a/Arf negativ, wodurch P16 und P19 aktiviert werden. P16 hemmt
die Zellzyklusprogression durch die Regulation von Cyclin D-abhängigen Kinasen
und verhindert die Phosphorylierung des Tumorsuppressors Rb (Serrano und Lowe,
1993). P19/Arf verhindert die Degradation und Inaktivierung des Tumorsuppressors
p53 durch die Bindung an Mdm2.
2.) Die Überexpression von Bmi1 blockiert die Seneszenz und immortalisiert
Mausembryofibroblasten (allerdings nicht menschliche Fibroblasten). Bmi-/-Mäuse
weisen sowohl in der Hämatopoese, als auch in der neurologischen Entwicklung
verschiedene Defekte auf. In Kombination mit aktiviertem H-Ras führt dieses zu einer
neoplastischen Transformation (Jacobs, 1999). Diese onkogenetische Funktion hängt
ebenfalls von der Fähigkeit von Bmi1 ab, Ink4a zu reprimieren; so zeigte sich in Bmi-
/-, Ink4a-/- Mausembryofibroblasten, die die beschriebenen Defekte aufwiesen, ein
erfolgreicher Rettungsversuch mit Ink4a/Arf (Jacobs, 1999).
3.) Bmi1 wurde in bestimmten Mantelzelllymphomen (9 von 36; 25%) hoch
amplifiziert gefunden (Bea, 2001). Allerdings kann in solchen Mantelzelllymphomen,
welche Bmi1 überexprimiert haben, weder ein Unterschied im Ink4a/Arf-Level, noch
im p16-Level, im Vergleich zu Lymphomen, die Bmi1 nicht überexprimieren,
gefunden werden (Bea, 2001). Bmi1 ist außerdem in einigen Linien des nicht-
kleinzelligen Bronchial-Karzinoms (58% aller NSCLC) (Hentz, unveröffentlichte
Ergebnisse, Ref. Vonlanthen), des Kolonkarzinoms, des Multiplen Myeloms und des
Medulloblastoms überexprimiert zu finden (Molofsky und Morisson, 2003; Kim,
2004; Bea, 2001; Vonlanthen, 2001; De Vos, 2002). Die Überexpression von Bmi1
kann in diesen Tumoren allerdings nicht mit der Tumorcharakteristik oder der
Prognose in Verbindung gebracht werden.
26
1.3.6 Bmi1 und Neuroblastome
In den letzten Jahren gibt es immer mehr Hinweise, dass Bmi-1 zelltypspezifische
Effekte hervorruft. Bmi-1 wird durch Repression von Arf für die Verhinderung von
Seneszenz in Fibroblasten verantwortlich gemacht (Itahana und Dimri, 2003). Es gibt
einige Hinweise, dass Bmi-1 auch bei der Entstehung von Neuroblastomen beteiligt
ist:
1.) Bei der Analyse von Genexpressionsprofilen von 94 Primärtumoren zeigte
sich in jedem dieser Neuroblastome eine starke Überexpression von BMI-1
(Berwanger und Eilers, 2002)
2.) Interessant ist auch die Rolle der HOX-Gene, denen eine große Bedeutung bei
der Entstehung einiger Tumore zugesprochen wird. Es gibt eine Verbindung
zwischen HOX-Genen und BMI1 bei der Entstehung von Tumorzellen im
Knochenmark (Antonchuk, 2002; Thorsteinsdottir, 2002). Es ist bis heute aber
unklar, welche Rolle HOX-Gene in Neuroblastomen tatsächlich spielen.
3.) In Lymphomen ist die Kooperation zwischen BMI1 und CMYC bekannt:
BMI1 kann hier die Induktion der ARF-Gene durch CMYC unterdrücken und
somit Apoptose verhindern (Bea und Campo, 2001; Jacobs und van Lohuizen,
1999). Eine wichtige Rolle nimmt das zu c-Myc in Neuroblastomen homologe
N-Myc ein, welches genau wie Bmi1 durch E2F kontrolliert wird. Bei
Überexpression von E2F1 könnte sowohl MYCN, als auch BMI1 dereguliert
werden, was bei einer möglichen Kooperation dieser beiden Gene eine fatale
Wirkung auf die Proliferation der Tumorzellen hätte.
1.4. ZIELE UND FRAGESTELLUNGEN
Das Neuroblastom ist der häufigste solide Tumor im Kindesalter (Kap. 1.1.1). Die
Prognose ist sehr unterschiedlich (Kap. 1.1.4) und hängt u.a. vom Stadium der
Erkrankung bei Diagnosestellung, vom Erkrankungsalter und auch wesentlich von der
Expression bestimmter Gene (z.B. MYCN) und bestimmten Mutationen ab (z.B. 1p36)
(Kap. 1.1.5). N-Myc wird in Neuroblastomen durch E2F1 reguliert. Überexpression
27
von E2F-1 führt zur Induktion von S-Phase und Apoptose (Kap. 1.2.1 und 1.2.3).
Durch Arbeiten im eigenen Labor wurde gezeigt, dass das Polycomb-Protein und
Onkogen BMI1 (Kap. 1.3) in menschlichen Neuroblastomen, aber auch in
Rattenfibroblasten auf RNA-Ebene durch E2F1 reguliert wird. Diese Beobachtungen
werfen einige Fragen auf:
1.) Lässt sich die Überexpression von BMI1 durch E2F1-Stimulus, die auf RNA-
Ebene beobachtet werden konnte, auch auf Protein-Ebene zeigen?
2.) Ist BMI1 direktes oder indirektes Zielgen von E2F1?
3.) Wird BMI1 über eine vermeintliche E2F-1-Konsensusbindungsstelle im
proximalen Bmi1-Promotor reguliert?
4.) Welche Aufgaben erfüllt BMI1 in Neuroblastomzellen?
Zwei Modelle sind denkbar:
Modell 1
Modell 2
Abb.2: Induziert Bmi-1 nach E2F-1 Stimulation S-Phase und Apoptose?
Modell 1) E2F-1 induziert Apoptose und S-Phase unabhängig von der Stimulation von Bmi-1. Bmi-1 erfüllt in der Zelle andere
Aufgaben.
Modell 2) E2F-1 induziert Bmi-1; dadurch wird Apoptose, S-Phase und weitere Programme in den Zellen ausgelöst
Es gibt viele Gene, die von E2F1 gehemmt werden, aber in Anwesenheit von
Cycloheximid nicht von E2F1 reprimiert werden. Diese Beobachtung spricht dafür,
dass hier ein indirekter Weg der Repression vorliegt. Ein möglicher Kandidat, der
Apoptose
S-Phase
BMI-1
E2F-1
???
E2F-1
Apoptose
S-Phase BMI-1
???
28
diese Aufgaben erfüllen könnte, wäre Bmi1. In beiden Modellen wird Bmi1 durch
E2F1 reguliert. Im ersten Model wird die Induktion von Apoptose und S-Phasen nur
von E2F1 und nicht von Bmi1 beeinflusst. Bmi1 erfüllt dabei andere Aufgaben als S-
Phase- und Apoptoseinduktion. Bmi1 wird auch im zweiten Model durch E2F1
reguliert. Hier induziert Bmi1, die E2F1-zugeschriebenen Programme, nämlich die
Induktion von S-Phase und Apoptose.
29
2 Material
2.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN
Die Reagenzien und Chemikalien, die im höchsten Reinheitsgrad von den Firmen
Merck (Darmstadt), Applichem (Heidelberg) und Sigma-Aldrich (München) bezogen
wurden, werden in alphabetischer Reihenfolge aufgelistet. Materialien, die von
anderen Firmen geliefert wurden, sind mit den entsprechenden Firmennamen in der
Materialliste versehen. In dieser Auflistung werden Standardchemikalien wie z.B.
Ethanol, Glycin oder Natriumchlorid nicht berücksichtigt.
Produkt Firma
Agarose, für Analysezwecke Sekam
Agarose, für präparative Zwecke Invitrogen
Ammoniumperoxodisulfat (APS) Sigma
Adenosin-5’-triphosphat (ATP) Fluka
Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V Applichem
Desoxynukleotidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Sigma
D-Luciferin Applichem
DNA-Längenstandard „1 kb-DNA-ladder“ Invitrogen
Ethidiumbromid Roth
L-Glutamin Bio Whittaker
Magermilchpulver Merck
Ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) Sigma
Propidiumiodid
Proteinlängenstandard „Bench Mark Prestained Protein Ladder“
Invitrogen
Protein-Molekulargewichtmarker “Low Range Rainbowmarker
RPN 755”
Amersham
Protein-Molekulargewichtmarker “Full Range Rainbowmarker
RPN 800”
Amersham
N, N, N, N-tetramethylendiamin (TEMED) Gibco
Trypsin, gebrauchsfertige 1x Trypsin-EDTA-Lösung Invitrogen
30
2.2 LÖSUNGEN
Als Lösungsmittel wurde, soweit es nicht anders erwähnt wird, Aqua dest. verwendet.
Lösungen Menge Einheit Inhaltsstoffe
30 % (w/v) Acrylamid Acrylamid Stammlösung
0,8 % (w/v) N, N’-Methylen-Bisacrylamid
Ammoniumperoxodisulfat-
Lösung (APS)
10 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat
Magermilchpulver Blocklösung
5 % (w/v)
in TBST
4,75 % (v/v) Ethanol
10 % (v/v) ortho-Phosphorsäure
Bradford-Reagenz 0,01 % (w/v) Commassie Brilliant Blue G-250
filtriert und lichtgeschützt
gelagert
BSA Referenz-Stocklösung 1 mg/mL BSA
in jeweiligen Lysepuffer
3,7 % (w/v) Paraformaldehyd
in PBS, pH 7,4
Fixierlösung Jeweils frisch angesetzt oder bei -
20°C als 20 %ige Stammlösung
gelagert
β-Gal-Substratlösung 4 mg/mL ONPG
Glycin Glycin-Waschlösung
0,1 M
In PBS, pH 7,4
Giemsa-Färbelösung Sigma
5 % (v/v) FCS
0,1 % (v/v) NP-40
in PBS, pH 7,4 Inkubationslösung
Jeweils frisch angesetzt
31
0,2 MM D-Luciferin Luciferase-Substratmix
25 MM Gly-Gly pH7,8
NP40-Lyselösung 0,1 % (v/v) NP-40
16 Ml HCl
0,5 ml Triton X-100
2M HCL/0,5% Triton X-100
(für zweidimensionale FACS-
Analyse) 83,5 ml H20
3,814 G Na2BO4O7 0,1M Na2B4O7*10H2O
(für zweidimensionale FACS-
Analyse)
ad 100 ml H2O
1 G BSA
0,5 Ml Tween
5,58 g NaCitrat
PBS/0,5% Tween 20 + 1%
BSA
(für zweidimensionale FACS-
Analyse) ad 100 ml PBS
0,5 ml NP40 PBS/0,1 NP 40 (für
eindimensionale FACS-
Analyse)
500 ml PBS
2.3 PUFFER
Als Lösungsmittel für die Puffer wurde ebenfalls, wenn es nicht anders erwähnt wird,
Aqua dest. verwendet.
Puffer Menge Einheit Inhaltsstoffe
40 % (w/v) Saccharose
0,2 % (w/v) Bromphenolblau
0,2 % (w/v) Xylencyanol DNA-Probenpuffer
10 mM EDTA
60 mM Na2HPO4SO
10 mM KCL2-Mercaptoethanol
50 mM 2-Mercaptoethanol
ß-Galactosidase
Reaktionspuffer
1 mM MgSO
32
50 mM Hepes-KOH
1,5 mM Na2HPO4
280 mM NaCl
2x HBS-Puffer
pH 7,05
100 mM KHPO4
1 mM DTT KPI-Puffer
pH7,8
25 mM Tris-HCl pH 8,3
0,2 mM Glycin Laufpuffer
0,1 % (w/v) SDS
2 mM ATP pH 7,0
10 mM MgSO4 Luciferase-Reaktionspuffer
25 mM Gly-Gly pH 7,8
93,2 mM Na2HPO4 Natriumphosphatpuffer
6,8 mM NaH2PO4
137 mM NaCl
8,2 mM Na2HPO4
2,7 mM KCl 1x PBS
1,5 mM KH2PO4
15 mM Tris-Puffer, pH 8
10 mM EDTA P1-Puffer für BAC-Prep
100 Mg/ml RNAse A
0,2 M NaOH P2-Puffer für BAC-Prep
1 % SDS
P3-Puffer für BAC-Prep 3 M KOAc, pH 5,5
0,5 M Tris-HCl pH 6,8 4x Sammelgelpuffer
0,4 % (w/v) SDS
4,8 ml 4x Trenngelpuffer
0,6 G SDS
0,426 G Dithiotreithol
3,5 ml Glycerol
3x SDS-Probenpuffer
Spatelspitze Bromphenol-blau
33
Ad 10 ml mit Aqua dest.
40 mM Tris-Acetat
1 mM EDTA 1x TAE
pH 8,0
50 mM Tris-HCl
150 mM NaCl TBS
pH 7,4
TBS TBST
0,2 % (v/v) Tween-20
10 mM Tris-HCl
100 mM NaCl TE-Puffer pH 8,0
1 mM EDTA
250 mM NaCl
0,1 % Nonidet P-40
50 mM HEPES (pH 7,0)
5 mM EDTA
0,5 mM Dithiothreitol
ELB Lysepuffer (Satjin)
1 mM Phenylmethylsulfonyl, Fluoride,
Proteaseinhibitoren
192 mM Glycin
25 mM Tris-Base
10 % (v/v) Methanol
Transferpuffer für
Semidryblot
pH 8,3
192 mM Glycin
25 mM Tris-Base
10 % (v/v) Methanol Transferpuffer für Tankblot
0,03 % (v/v) SDS
1,5 M Tris-HCl pH 8,8
0,4 % (w/v) SDS 4x Trenngelpuffer
8 mM EDTA
34
2.4 ENZYME
Die unterschiedlichen Enzyme und die zugehörigen Restriktionspuffer wurden von
den Firmen New England Biolabs, Stratagene und Invitrogen bezogen. Weitere
Enzyme und ihre Bezugsquellen sind nachfolgend aufgeführt:
Enzym Hersteller
BamH I Stratagene
Bgl II Stratagene
EcoR I Stratagene
Hind III Stratagene
NheR I Stratagene
Nhe Stratagene
NOT I Stratagene
Sac I Stratagene
Xba Stratagene
Xho I Stratagene
Dpn I Stratagene
Pfu Turbo Polymerase Stratagene
Pwo Polymerase Hybaid-AGS
Shrimp alkaline phosphatase New England Biolabs
T4 DNA-Ligase New England Biolabs
T4PNK (Kinasierung) New England Biolabs
35
2.5 PROTEASEINHIBITOREN
Alle Proteaseinhibitoren wurden 1:1000 eingesetzt.
Proteaseinhibitoren Stammkonzentration Hersteller
Aprotinin 5 mg/mL in PBS pH 7,4 Roche Biochemica
Dithiothreitol 1 M in Aqua dest. Merck
Leupeptin 5 mg/mL in Aqua dest. Roche Biochemica
N-Ethylmaleimid (NEM) 1 M in Ethanol Sigma
Pepstatin A 1 mg/mL in Methanol Roche Biochemica
Phenylmethylsulfonyl-
Fluorid (PMSF)
0,2 M in Ethanol Sigma
2.6 PROTEASOMINHIBITOREN
Proteasominhibitoren Stammkonzentration Hersteller
N-acetyl-L-leucinyl-L-
leucinyl-L-norleucinal (ALLN)
20 mM in DMSO Sigma
MG 132 20 mM in DMSO Calbiochem
36
2.7 BAKTERIENSTÄMME
In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Bakterienstämme (Escherichia coli)
verwendet:
Stamm Bezeichnung
XL1-Blue E.coli, recA, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1,
F’[pro AB laclq Z∆lacM15, Tn10 (tetr)]
DH5α E.coli, Fα80dlacZ∆M15, ∆(lacZYAaegF)U169, deoR, recA1,
endA1, hsdR17 (rKi,mK
+), phoA, supE44, α-
thi-1, gyrA96, relA1
Der Stamm DH5α wurde für Klonierungszwecke und der Stamm XL-1 Blue für
Retransformationen verwendet.
2.8 EUKARYONTISCHE ZELLLINIEN
Alle verwendeten Zellen waren menschlichen Ursprungs.
Ziellinie Herkunft
SK-N-SH-EP Neuroblastomzelllinie, die N-Myc nicht exprimiert
1A3 SHEP-Zellen mit E2F-ER-Fusionsprotein
TOR-Zellen 1A3-Zellen, die zusätzlich zum E2F-1-ER-Fusionsprotein
eine TET-abhängige siRNA gegen BMI-1 enthalten
HeLa Zervixkarzinomzelllinie
PhoenixECO Embryonale Nierenzellinie; humane Verpackungszellinie
für rekombinante, ekotrope Retroviren (Grignani et al.,
1998)
37
Erläuterung zu 1A3-Zellen:
Dieses Zellsystem beruht auf der Grundlage der Zelllinie SK-N-SH-EP. In diesen
Zellen wird das Fusionsprotein E2F-1-ER, bestehend aus dem E2F-1 und der
Ligandenbindedomäne des Östrogenrezeptors, konstitutiv exprimiert. Dieses
Fusionsprotein kann durch die Zugabe des Östrogenderivats 4-Hydroxytamoxifen
zum Zellkulturmedium reversibel aktiviert werden.
2.9 KULTIVIERUNGSMEDIEN
2.9.1 Bakterienmedium
Bakterienmedium Menge Einheit Inhaltsstoffe
10 g/l Bactorypton (Peptontrypton)
5 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
3 g/l Glucose
LB-Medium
pH 7,0 mit NaOH eingestellt
LB-Medium LB-Agar
1,5 % (w/v) Bacto-Agar
20 G Bactorypton (Peptontrypton)
5 G Hefeextrakt
10 mM NaCl
2,5 mM KCl
10 mM MgCl2
SOB-Medium
10 mM MgSO4
SOB-Medium SOC-Medium
20 mM Glucose
38
2.9.2 Zellkulturmedium
Medien für die Zellkultur wurden von der Firma BioWhittaker (RPMI) (Verviers,
Belgien) und DMEM-Medium von der Firma Invitrogen geliefert. Fetales Kalbserum
(FCS) wurde von der Firma GIBCO bezogen, 1x Trypsin/EDTA Lösung hingegen
von der Firma Invitrogen. Vor der Verwendung wurde FCS-Medium 30min bei 56°C
im Wasserbad deaktiviert. Diese Hitzeinaktivierung dient der Vermeidung möglicher
Komplementreaktionen im Serum.
Zellkulturmedium für: Menge Einheit Inhaltsstoffe
500 mL DMEM (mit Phenolrot)
50 mL FCS
5 mL L-Glutamine (200 mM) IMR-32-Zellen
5 Ml Penicillin (10.000 U/mL)/
Streptomycin (10 mg/mL)
500 Ml DMEM
50 Ml Serum Supreme
5 Ml L-Glutamin Phönix-Zellen
5 Ml Penicillin (10.000 U/ml)
Streptomycin (10mg/ml)
500 Ml RPMI
50 Ml FCS SHEP, 1A3-Zellen, TOR-
Zellen, HELA-Zellen 5 Ml Penicillin (10.000 U/ml)
Streptomycin
DMEM ohne FCS
20 % (v/v) FCS Zell-Einfriermedium
10 % (v/v) DMSO
39
2.10 ANTIBIOTIKA
Antibiotikum Verwendung Endkonzentration Hersteller
Ampicillin Bakterienmedium 100 µg/mL Sigma
Chloramphenicol Bakterienmedium 34 µg/mL Sigma
Hygromycin Selektionsmedium 100 µg/mL Calbiochem
Kanamycin Bakterienmedium 100 µg/mL Gibco
Neomycin (G418) Zellkulturmedium 200 µg/mL Calbiochem
Penicillin Zellkulturmedium 100 U/mL BioWhittaker
Puromycin Selektionsmedium 1µg/mL Invivo Gen
Streptomycin Zellkulturmedium 100 µg/mL BioWhittaker
Zeocin Selektionsmedium 100 µg/mL Calbiochem
2.11 ANTIKÖRPER
2.11.1 Primärantikörper
Antigen Name Ursprung Bezugsquelle
Bmi-1 Maus, monklonal Upstate biotechnology
Bmi-1 K333 Kaninchen, polyklonal Otte
Cdk2 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz
E2F1 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz
E2F2 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz
HA MMS-1011 Maus, monoklonal Babco
HPC 2 M9 Maus, monoklonal Otte
P16/INK 4a 183 Maus, monoklonal Phar Mingen
P16/INK 4a 174 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz
P16/INK 4a 196 Kaninchen, polyklonal D.Parry USA
P19 204 Maus, monoklonal Abcam
P27 C-19 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz
40
RING I M24 Maus, monoklonal Otte
RING I K320 Kaninchen, polyklonal Otte
Anti-BrdU Maus, monoklonal Becton Dickinson
2.11.2 Sekundärantikörper
Antikörper mit
Modifikation
Ursprung Verwendung
anti-Kaninchen-HRP Affinitätsgereinigter Antikörper
(Amersham), Esel-anti-Kaninchen
Immunglobulin
Western-Blot
anti-Maus-HRP Affinitätsgereinigter Antikörper
(Amersham), Schaf-anti-Kaninchen
Immunglobulin
Western-Blot
2.12 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE
2.12.1 Primer zur Klonierung von cDNA in Plasmid-DNA
Die Synthese, der zu Klonierungszwecken benötigten Primern wurde von der Firma
MWG-Biotech in Ebersberg durchgeführt und als Lyophilisat versendet. Dieses
wurde in Aqua dest. aufgenommen, so dass eine Endkonzentration von 100pmol/µl
bestand. Die Primer wurden in dieser Konzentration aliquotiert.
Name Sequenz (5’→→→→3’)
BMI5sacII AAT CCC CGC GGT CGC GCC GGGC TGC TCT TTC
BMI3cloning GGA CGA TAG TCA CAT GTA TTA GCA
Delta
RFBMI5new
CCG GAT CCA GAA ATG CAT TTC TTC TTG ACC AGA ACA
GAT TG
41
2.12.2 Primer für in vitro-Mutagenese
Die nachfolgend aufgeführten Oligonukleotide wurden als Primer zur in vitro-
Mutagenese der potentiellen E2F-Bindungsstelle im Bmi-1-Promoter verwendet.
Name Sequenz (5’→→→→3’)
BMIE2Fmut5 GCA GGG CGG CGC GTG GCT AGC TGT GGA GAA ATG TCT
C
BMIE2Fmut3 GAG ACA TTT CTC CAC AGC TAG CCA AGA GCC GCC CTG
C
2.12.3 RNA-Oligonukleotide für RNA-Interferenz Experimente
RNA-Oligonukleotide wurden von der Firma MWG in Ebersberg synthetisiert, als
Lyophilisat erhalten und in Aqua dest. in einer Konzentration von 100 pmol/µl
aufgenommen. Folgende Oligonukleotide wurden für RNA-Interferenz Versuche
verwendet:
Name Sequenz (5’→→→→3’)
BMIsi56for GAT CCC CAG GAT TAT TAT ACA CTA ATT TCA
AGA GAA TTTA GTG TAT AAT AAT CCT TTT TTG
GAA A
BMIsi56rev AGC TTT TCC AAA AAA GGA TTA TTA TAC ACT
AAT TCT CTT GAA ATT AGT GTA TAA TAA TCC
TGG G
SiRbmi1fw GAT CCC CAA TGG ACA TAC CTA ATA CTT TCA
AGA GAA GTA TTA GGT ATG TCC ATT TTT TTG
GAA A
42
SiRbmi2rev AGC TTT TCC AAA AAA ATG GAC ATA CCT AAT
ACT TCT CTT GAA AGT ATT AGG TAT GTC CAT
TGG G
SiRbmi3fw GAT CCC CAG TGA CTC TGG GAG TGA CAT TCA
AGA GAT GTC ACT CCC AGA GTC ACT TTT TTG
GAA A
SiRbmi4rev AGC TTT TCC AAA AAA GTG ACT CTG GGA GTG
ACA TCT CTT GAA TGT CAC TCC CAG AGT CAC
TGG G
SiRbmi1fwTOR GAT CCC AAT GGA CAT ACC TAA TAC TTT CAA
GAG AAG TAT TAG GTA TGT CCA TTT TTT TGG
AAA
SiRbmi2revTOR AGC TTT TCC AAA AAA ATG GAC ATA CCT AAT
ACT TCT CTT GAA AGT ATT AGG TAT GTC CAT
TGG
BMIsi56forTOR GAT CCC AGG ATT ATT ATA CAC TAA TTT CAA
GAG AAT TAG TGT ATA ATA ATC CTT TTT TGG
AAA
BMIsi56revTOR AGC TTT TCC AAA AAA GGA TTA TTA TAC ACT
AAT TCT CTT GAA ATT AGT GTA TAA TAA TCC
TGG
2.12.4 RNA-Oligonukleotide für RT-PCRs im Echt-Zeit-Gerät
Die Primer für die RT-PCR im Echtzeitgerät (Real-Time-Cycler) wurden ebenfalls
von der Firma MWG synthetisiert.
Folgende Primer wurden für quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät benutzt:
43
Name Sequenz (5`-3`)
ARF5milan CCC TCG TGC TGA TGC TAC TG
ARF3milan ACC TGG TCT TCT AGG AAG CGG
hTertfor GAC TCG ACA CCG TGT CAC CTA CGT
hTertrev TGA CAG GGC TGC TGG TGT CTG CTC TC
HOX3.5for TCC GGC TGC AGA GTG AAG G
HOX3.5rev CTG CGG CGA GTG AGG TAG C
MouseBMI3 TCT TCT CCT CAT CTG CAA CTT CTC
MouseBMI5 AAT TAG TCC CAG GGC TTT TCA A
HBMI RT32 CTT CAT CTG CAA CCT CTC CTC TAT
HBMI RT52 AAT TAG TTC CAG GGC TTT TCA A
Casp3new fw CTG AGC CAT GGT GAA GAA GGA AT
Casp3new rev CAT GGC ACA AAG CGA CTG GAT
2.13 VEKTOREN
2.13.1 Grundvektoren
Vektor Vektoreigenschaften Herkunft
pBluescript KS+ prokaryontischer Vektor zur Klonierung von
DNA-Fragmenten
Stratagene
GenBank#
X5232
pcDNA3 Eukaryontischer Expressionsvektor mit CMV
(Cytomegalievirus)-Promotor und T7-Promoter
Invitrogen
pcDNA3.1 (-) Eukaryontischer Expressionsvektor mit reverser
Orientierung der „multiple cloning site“
Invitrogen
pUHD10.1 Eukaryontischer Expressionsvektor mit CMV
(Cytomegalievirus)-Promotor
pBABE-puro Vektoren für die Herstellung rekombinanter
Retroviren im BOSC/Phoenix-System mit
zusätzlichen Resistenzgenen gegen Puromycin
Morgenstern und
Land, 1990
44
pGl3 basic Vektor mit dem Luciferase-Reportergen ohne
eukaryontischem Promoter
Promega
2.13.2 RNAi-Plasmid
Vektor Vektoreigenschaften Herkunft
pSUPER Vektor für die Expression von „small interfering
RNAs“ siRNA in Säugerzellen mit Polymerase-
III H1-RNA und T7-Promotor; basierend auf
dem pBlueScript-KS-Vektor
Brummelkamp,
2002
pTER Vektor für die Expression von „small interfering
RNAs“ (siRNA) in Säugerzellen mit
Polymerase-III H1-RNA und T7-Promoter,
TET-On-System; basierend auf dem
pBluescript-KS-Vektor
2.13.3 Reporterplasmide
Vektor Vektoreigenschaft Herkunft
pcDNA4TOLuc Vektor mit dem Luciferase-Reportergen in
eukaryontischen Zellen, zur Überprüfung von
dem TET-On-System (pcDNA6.1 in 1A3-
Zellen)
pGL3-BMI-1
Vektor
Vektor mit dem Luciferase-Reportergen mit
SV40 Promoter und Sac I und Xho I kloniertem
BMI-1-Gen mit E2F-1 Bindungsdomäne
Promega,
Mannheim
pcDNA3 MYC-
Vektor
PcDNA3 Vektor mit humaner c-MYC cDNA.
Die cDNA stammt aus dem Bluescript KS MYC
45
2.13.4 Expressionsvektor
Vektor Vektoreigenschaften Herkunft
pcDNA3.1(-)
EGFP
Eukaryontischer Expressionsvektor für das
enhanced green fluorescent protein (EGFP).
NheI/AflII Fragment aus pd2EGFP-N1
(Clontech) in NheI/AflII Schnittstellen von
pcDNA3.1(-).
Clontech
2.14 KITSYSTEME
Bezeichnung Quelle
DNA-Aufreinigung „PCR purification Kit“ Qiagen
DNA-Isolierung “Plasmid Maxi Kit, Qiagen-tip 500“ Qiagen
DNA-Isolierung „Gel Extraction Kit“ Qiagen
DNA-Isolierung „QIAamp DNA Mini Kit“ Qiagen
In vitro Mutagenese “Quick Change site directed mutagenesis”
“Rapid-Ligation-Kit”
Stratagene
Qiagen
Western-Blot Detektion „ECL Western-Blotting Detection System“ Amersham
Western-Blot Detektion „ECL+ Western-Blotting Detection System“ Amersham
46
2.15 VERBRAUCHSMATERIALIEN
Zellkulturmaterialien aus Plastik, sowie andere Einwegartikel für die Zellkultur
wurden über die Firma Nunc und Greiner bezogen.
Produkt Produktbezeichnung Hersteller
Blotting Membran Immobilon-P, PVDF Transfer Membran Millipore
Film ECL Hyperfilm Amersham
2.16 GERÄTE
Gerät Hersteller
Begasungsbrutschränke „BBD 6220“ Heraeus
Kamera CF 1/8 FMC CCD Kappa
Kühlzentrifuge „Centrifuge 5417R“ Eppendorf
Luminometer Lumat LB 9507 Berthold
Mikroskop „DMIRB“ Leica
Minigelanlage
RT-PCR-real-time-cycler
Biorad
Semidryblot Apparatur Trans-blot SD Biorad
Spektrophotometer Pharmacia
Steril-Arbeitsbank „HeraSafe“ Heraeus
Tankblotapparatur Trans-blot Biorad
Thermocycler „Primus“ MWG-Biotech
Tischzentrifuge „Biofuge pico“ Heraeus
Ultraschallgerät „Digital Sonifier W-250D“ Branson
UV-Handlampe (6 Watt Lampe, UVP) Kobe
Zellhomogenisator „Ultra Turrax“ IKA-Analysentechnik
Zentrifuge „Sorvall RC-5B“ Du Pont
47
3 Methoden
3.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
3.1.1 Allgemeine Bedingungen für die Kultivierung von Säugerzellen
Die Versuche in der Zellkultur wurden unter sterilen Versuchsbedingungen
durchgeführt. Dies beinhaltet die Benutzung von Sterilwerkbänken mit laminarem
Luftstrom, von sterilen Polystyrol-Zellkulturschalen (6cm, 10cm, 15cm) und anderen
Zellkulturmaterialien aus Plastik, wie z.B. autoklavierten Pipetten, sowie das
Verwenden von sterilen Zellkulturlösungen. Inkubationbedingungen der Zellen im
Brutschrank waren 37° C, 96% relative Luftfeuchte und 5% CO2-Gehalt.
3.1.2 Passagieren von Zellen
Zellen auf konfluenten Zellschalen wurden durch Kontaktinhibition in ihrer
Teilungsaktivität gehemmt und gerieten so in einen Wachstumsarrest. Dieser
Wachstumsarrest konnte durch rechtzeitiges Passagieren der Zellen verhindert
werden. Dazu wurde das Medium auf den Zellen abgenommen und durch einmaliges
Waschen mit PBS vollständig entfernt. Anschließend erfolgte das Lösen der Zellen
von den Zellkulturschalen durch Zugabe von 1-3ml (je nach Größe der Schalen)
Trypsin-EDTA-Lösung und 1-4minütiger Inkubation im 37°C-Brutschrank. Die
abgelösten Zellen wurden mit Zellkulturmedium resuspendiert und ein bestimmter
Anteil dieser Suspension (1:5 bei IMR32-Zellen bis 1:10 1A3-Zellen) auf eine zuvor
mit frischem Zellkulturmedium versehende Zellkulturschale neu ausplattiert.
48
3.1.3 Zählen von Zellen mit Hilfe von Zählkammern
Die genaue Bestimmung der Ausgangszellzahl war für zahlreiche Versuche von
elementarer Bedeutung. Die Zellzahl wurde mit Hilfe von Neubauer-Zählkammern
bestimmt. Die trypsinisierten Zellen wurden in einem bestimmten Volumen
Zellkulturmedium aufgenommen, mit Trypanblaulösung angefärbt und anschließend
auf die Mikrotiterplatte der Neubauer-Zählkammer gegeben.
Durch die Anfärbung mit Trypanblau konnten abgestorbene von vitalen Zellen
unterschieden werden. Es wurden alle Zellen in einem bestimmten quadratischen Feld
der Zählkammer gezählt und durch die Berechnung der Zelldichte in der Suspension
die Zellzahl bestimmt. Die Zelldichte ließ sich mit der folgenden Formel berechnen:
Zellzahl/Quadrat x 104 x Verdünnungsfaktor = Zellzahl/ml
3.1.4 Einfrieren von eukaryontischen Zellen
Um Zelllinien über lange Zeiträume (bis zu mehreren Jahren) lagern zu können,
wurden die Zellen in flüssigen Stickstoff eingefroren. Dazu wurden Zellen, die sich
im exponentiellen Wachstum befanden, durch die oben beschriebene Trypsinisierung
von der Zellkulturschale abgelöst, in einem großen Volumen PBS resuspendiert und
im 15ml Falcon-Tube bei 1200 Upm für fünf Minuten abzentrifugiert. Der Überstand
wurde abgesaugt und das Zellpellet in einem Einfriermedium, bestehend aus 1ml
DMEM mit 25% (v/v) FCS und 10% (v/v) DMSO resuspendiert. Die Suspension
wurde in ein vorgekühltes Kryoröhrchen überführt. Diese Kryoröhrchen wurden
anschließend für 24h bei –80°C eingefroren, bevor sie dann zur endgültigen Lagerung
in flüssigen Stickstoff überführt wurden.
49
3.1.5 Auftauen von eukaryontischen Zellen
Der Prozess des Auftauens sollte möglichst zügig durchgeführt werden, um die
Exposition der Zellen mit dem im warmen Zustand zellschädigenden Einfriermedium
zu verkürzen und damit mögliche Zellschädigungen zu vermeiden. Die im flüssigen
Stickstoff eingefrorenen Zellen wurden bei 37°C im Wasserbad aufgetaut, mit einem
großen Volumen (z.B.: 10ml) vorgewärmten Zellkulturmedium versetzt und dann bei
1200 Upm für fünf Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das
Zellpellet wurde in 10ml Zellkulturmedium resuspendiert. Diese 10ml
Zellkulturmedium wurden in eine Zellkulturschale gegeben. Die Zellen waren nach 4-
8h adhärend und wurden nach Ablauf dieser Zeit unter dem Mikroskop auf Zelldichte
und Morphologie untersucht.
3.1.6 Transiente Transfektion von Säugerzellen durch
Calciumphosphatpräzipitation für Expressionsstudien
24h vor Beginn der Transfektion wurden je 5x10 5 Zellen auf 10cm-Schalen bzw. je
2x105 Zellen auf 6cm-Schalen ausplattiert. 4h vor der Transfektion wurde das
Medium abgesaugt und die Zellen mit frischem DMEM-Zellkulturmedium versetzt.
Die zu transfizierende DNA (Gesamtmenge 15µg für 6cm Schalen und 30µg für 10cm
Schalen) wurde in 450µl Aqua dest. (bei Transfektionen auf einer 6cm Schale; bei
Transfektionen auf 10cm Schalen sind alle angegebenen Mengen zu verdoppeln)
gelöst und mit weiteren 150µl 2,5M CaCl vermischt. Zu dieser Lösung wurde unter
ständigem Zuführen von Luftblasen über eine Pasteurpipette 500µl 2x HBS langsam
hinzutitriert. Diese Lösung wurde 2min bei Raumtemperatur zur Präzipitatbildung
inkubiert und anschließend gleichmäßig auf den ausplattierten Zellen verteilt. Nach
einer Inkubation von ca. 12h im Brutschrank wurden die Zellen von den nicht in die
Zellen aufgenommenen DNA-Präzipitaten durch 2maliges Waschen mit PBS
gereinigt. Die Transfektionseffizienz konnte nach weiteren 24h unter der UV-Lampe
durch ko-transfiziertes GFP-Plasmid kontrolliert werden. Zu diesem Zeitpunkt war
die Expression von den entsprechenden Proteinen der transfizierten Plasmiden am
50
Größten, so dass die Zellen zu diesem Zeitpunkt für die entsprechenden Analysen
geerntet wurden.
3.1.7 Calciumphosphat-Methode für die transiente Transfektion von
Säugerzellen für Reporterstudien
Die transiente Transfektion wurde, wie im Punkt „Transiente Transfektion von
Säugerzellen durch Calciumpräzipitation für Expressionsstudien“ beschrieben,
durchgeführt. Dabei wurden jeweils Triplikate verwendet. Es wurden 200.000 Hela-
Zellen bzw. 500.000 SHEP-Zellen (auch 1A3-Zellen) ausplattiert. Als interner
Transfektionsstandard wurde zusätzlich zum CMV-GFP-Vektor 1µg β-Galactosidase
Expressionsvektor kotransfiziert.
3.1.8 Selektion von antibiotikaresistenten Zellen
Um transfizierte Zellen auf einer Zellkulturschale gegenüber den nicht durch die
Transfektion getroffenen Zellen anzureichern, wurden 2-5µg eines
Expressionsvektors, der für ein Puromycin-Resistenzgen, Hygromycin-Resistenzgen
oder Zeocin-Resistenzgen kodiert, kotransfiziert. 36-48h Stunden nach
Transfektionsende wurden die Zellen in Selektionsmedium mit einer Puromycin-
Endkonzentration von 1µg/ml überführt. Die Selektion mit Hygromycin erfolgte bei
einer Konzentration 100µg/ml, während die Selektion mit Zeocin bei 150µg/ml
durchgeführt wurde. Das Selektionsmedium wurde bis zum Erreichen, der zur Ernte
der Zellen nötigen Konfluenz, alle drei Tage gewechselt. Die Vollständigkeit der
abgelaufenen Selektion wurde überprüft, indem alle Zellen einer Kontrollplatte, auf
der entsprechende Zellen ohne kotransfizierten Selektionsmarker, aber den gleichen
Selektionsbedingungen, wie auf der Versuchsplatte, durch die Selektion gestorben
waren.
51
1A3-Zellen enthalten das stabil transfizierte E2F-1-ER-Fusionsprotein, welches mit
einem G418-Resistenzplasmid kotransfiziert wurde. Um die Stabilität der
Transfektion des E2F-1-ER-Fusionsprotein in den 1A3-Zellen zu gewährleisten,
musste ein konstanter Selektionsdruck von 10µl/ml G418 aufrechterhalten werden.
Die Konzentration für ein bestimmtes Antibiotikum war von Zelllinie zu Zelllinie
unterschiedlich, so dass vor der Selektion mit einem für die Zelllinie neuem
Antibiotikum, die spezifische Konzentration getestet werden musste. Dazu wurden
mehrere Zellkulturschalen in 20%iger Konfluenz mit dem entsprechenden
Resistenzplasmid transfiziert und anschließend mit dem Antibiotikum in
verschiedenen Konzentrationen selektioniert. Außerdem wurden parallel Zellen ohne
transient transfiziertes Resistenzplasmid mit denselben Konzentrationen des
Antibiotikums selektioniert. Es wurde die Konzentration des Antibiotikums für die
weiteren Versuche ausgewählt, bei der gerade noch alle Zellen auf der
untransfizierten Schale gestorben sind, während bei dieser Konzentration die Zellen
auf der Schale mit transfiziertem Selektionsmarker überlebten.
3.1.9 Induktion von eukaryontischen Zellen
Für die Versuche wurden verschiedene induzierbare Zellsysteme verwendet. Die
Induktion erfolgte durch Zugabe des entsprechend gelösten Stoffes zum
Zellkulturmedium. 1A3-Zellen sind modifizierte SK-N-SH-EP-Zellen, die ein E2F-1-
ER-Fusionsprotein enthalten, welches durch 4-Hydroxytamoxifen induziert werden
kann. Diese Induktion erfolgte mit 1µg/ml Hydroxytamoxifen (4OHT). Außerdem
wurden mehrere Zellsysteme mit tetracyclinabhängiger Induktion verwendet; hier
betrug die Induktionskonzentration 10µg/ml.
Durch Cycloheximid kann die Proteinbiosynthese in Zellen unterdrückt werden: für
die entsprechenden Experimente wurde eine Konzentration von 4µg/ml benutzt.
52
3.1.10 Stabile Transfektion von Säugerzellen durch Calciumphosphatmethode
Die Transfektion wurde nach dem entsprechenden Protokoll für die „transiente
Transfektion nach Calciumphosphatmethode“ durchgeführt. Für die stabile
Transfektion wurde entweder ein Vektor mit enthaltenem Resistenzmarker verwendet
oder ein Resistenzplasmid kotransfiziert. 36-48h nach einer erfolgreichen
Transfektion wurde dem kotransfizierten Resistenzmarker entsprechend, mit der
Selektion begonnen. Für die einzelnen stabilen Transfektionen wurden folgende
Resistenzmarker verwendet:
Stabile Transfektion des ekotropen Rezeptors in Shep-Zellen für die retrovirale
Infektion: Zeocin bzw. Hygromycin.
Stabile Transfektion der siRNA in 1A3 Zellen: Puromycin.
Stabile Transfektion des TET-Repressors in 1A3-Zellen: Puromycin.
Stabile Transfektion des TET-abhängigen Reporterplasmids zur Testung der TOR-
Zellen, sowie des TET-abhängigen siRNA-Plasmids (pcDNA 4/TO): Hyromycin,
bzw. Zeocin.
Als Selektionskonzentrationen wurde Puromycin 1µg/ml, Hygromycin 100µg/ml oder
Zeocin 100µg/ml eingesetzt. Das Medium wurde alle drei Tage gewechselt, wobei
der Selektionsdruck stets aufrechterhalten wurde. Die Selektion wurde solange
durchgeführt, bis nur noch solche Zellen auf der Zellkulturschale erhalten waren, die
das entsprechende Resistenzplasmid enthielten (nach 5 Tagen bei
Puromycinselektion, bis zu 18 Tagen bei Hyromycin- bzw. Zeocinselektion). Nach
weiteren 10 Tagen waren die verbliebenen Zellen zu 2-4mm großen Kolonien
hochgewachsen. Die zuvor im Gegenlicht markierten Klone, wurden nun mit Hilfe
von sterilen Klonierungsringen unter Abdichtung durch Vaseline von den
Zellkulturschalen trypsinisiert und in 1cm Zellschalen überführt. Unter weiterhin
bestehendem Selektionsdruck wurden die Zellen bis zur Konfluenz der Schalen in
Kultur gehalten, um sie dann auf 6cm-Schalen später auf 10cm-Schalen
auszuplattieren. Die expandierten Zellen wurden nun für weiterführende Experimente
verwendet.
53
3.1.11 Infektion von Säugerzellen mit Virusüberstand
Das ∆-Ring-Finger-Plasmid wurde uns mit freundlicher Unterstützung vom Labor van
Lohuisen zur Verfügung gestellt. Hierbei handelte es sich um ein retrovirales Plasmid.
Im Western-Blot war das dominant-negative Allel nach retroviraler Infektion durch
den Bmi-1-Antikörper nachweisbar (van Lohuizen). Um 1A3-Zellen retroviral
infizieren zu können, brauchten die Zellen einen ekotropen Rezeptor. Dieser war
nötig, weil in unserem Labor (S1-Sicherheitsstandard) keine humanpathogenen Viren
benutzt werden durften. Die retrovirale Infektion (mit dem dominant negativen Allel)
verlief in drei wesentlichen Schritten:
1.) Zunächst wurde ein ekotroper Rezeptor transient oder stabil (ekotroper Rezeptor
für die retrovirale Infektion von 1A3-Zellen mit dem dominant-negativen Allel gegen
Bmi-1) in die entsprechenden Zellen transfiziert und dem Selektionsmarker
entsprechend selektioniert (Hygromycin oder Zeocin bei dominant negativen Allel).
2.) Herstellen des retroviralen Überstandes:
Dazu wurden am ersten Tag 5.000.000 Phönixzellen auf einer 10cm-Schale
ausplattiert. 24h später erfolgte die Transfektion der entsprechenden Plasmide nach
Calciumphosphatmethode. Für die retrovirale Infektion des dominant-negativen Allels
gegen das Bmi-1 wurden durch entsprechende Transfektion virale Überstände der
folgenden Plasmide hergestellt:
a) GFP
b) pbabe puro
c) Wildtyp Bmi-1
d) ∆-Ring-Finger Mutante
24h nach Transfektionsbeginn wurden die Phönixzellen mit PBS gewaschen und 7ml
(anstatt den sonstigen 10ml) auf die entsprechenden Zellkulturschalen gegeben. 48h
nach Transfektionsbeginn wurde der Überstand (7ml) als erster viraler Überstand
steril filtriert und als solcher für Infektionen benutzt oder bei –80°C eingefroren.
Außerdem wurde erneut 7ml frisches Zellkulturmedium auf die Zellen gegeben. Nach
weiteren 24h wurde der zweite virale Überstand entsprechend abgenommen und
ebenfalls steril filtriert.
54
3.) Infektion der Säugerzellen durch Virusüberstand
Jeweils 3ml Virusüberstand wurde auf die Säugerzellen (hier: 1A3-Zellen), die den
ekotropen Rezeptor transient oder stabil enthielten, gegeben. Nach 24h wurde das
Medium abgesaugt und die Zellen mit PBS gewaschen. 48h nach Infektion wurde mit
der Selektion gegen das Resistenzplasmid, welches auf den Plasmiden der Infektion
enthalten waren (beim dominant-negativen Allel: Puromycin) begonnen. Nach drei
Tagen Selektion mit Puromycin wurden die Zellen für weiterführende Experimente
geerntet.
3.1.12 Durchführung eines Koloniebildungsversuch mit stabil transfizierten
siRNA-BMI Klonen
Um Unterschiede in der Wachstumsgeschwindigkeit zwischen Zellen mit stabil
transfizierter siRNA gegen BMI-1 und nicht transfizierten Zellen sichtbar zu machen
wurden Koloniebildungsversuche durchgeführt. Dafür wurde zunächst die siRNA
(1/2, 3/4 oder 5/6) bzw. der Leervektor stabil in 1A3-Zellen transfiziert
(Selektiosmarker: Puromycin). Die sich in unterschiedlicher Geschwindigkeit
teilenden Zellen wurden nach 8 Tagen exponentiellen Wachstums durch eine Giemsa-
Färbung makroskopisch sichtbar gemacht.
3.1.13 Anfärben von fixierten eukaryonten Zellen durch Giemsa-Färbung für
Koloniebildungsversuche
Mit der Giemsa-Färbung konnten zuvor auf der Zellkulturschale fixierte Zellen
angefärbt und damit Unterschiede in der Anzahl und Größe von Zellkolonien
verschiedener Zellpopulationen makroskopisch sichtbar gemacht werden. Die zuvor
in Form eines Koloniebildungsversuchs wachsenden Zellen wurden nach 8 Tagen
exponentieller Teilung fixiert. Dazu wurde das Zellkulturmedium von den
Zellkulturplatten abgesaugt. Durch die Zugabe von 5ml Ethanol (abs.) für 10min auf
die Platten wurden die Zellen fixiert. Das Ethanol wurde dann abgesaugt und je 5ml
55
der gebrauchsfertigen Giemsalösung 1:20 mit Wasser verdünnt auf die
Zellkulturschalen gegeben. Diese Lösung wurde für 45min auf den Zellkulturschalen
gelassen. Anschließend wurde die Giemsalösung abgesaugt und die Zellkulturschale
mit Wasser gewaschen. Die Platten wurden umgedreht an der Luft getrocknet.
3.1.14 Durchflußzytometrie (FACS-Analyse)
Durch die Durchflußzytometrie konnten in Zellkulturexperimenten Effekte auf den
Zellzyklus durch prozentuale Quantifizierung der Zellen, die sich in den
verschiedenen Phasen des Zellzyklus befanden, aufgezeigt werden. Zur Fixierung, der
zu untersuchenden Zellen wurden diese durch Trypsinisierung von den
Zellkulturschalen gelöst und in PBS-Puffer aufgenommen. Die Zellen wurden durch
zweiminütiges Zentrifugieren bei 1200 Upm pelletiert. Das Pellet wurde in 0.5ml PBS
aufgenommen und mit 4,5ml EtOH (absolut) versetzt. Dieser Ansatz wurde über
Nacht bei –20°C inkubiert. Zur Vorbereitung auf die FACS-Analyse wurden die
Zellen 5min bei 1500Upm erneut pelletiert und anschließend in 2ml PBS/0,1% NP40
resuspendiert. Diese Suspension wurde erneut 5min bei 1500 Upm zentrifugiert. Die
in 0,5ml PBS aufgenommenen Zellen wurden mit 15µl Propidiumjodid (ab jetzt im
Dunkeln gearbeitet) und 10µl RNAse A (25mg/ml) versetzt und eine Stunde bei
Raumtemperatur inkubiert.
56
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
3.2.1 Kultivierung von Bakterien
Für Klonierungszwecke, Retransformationen und bakterielle Expressionen wurde der
E.coli-Sicherheitsstamm DH5α verwendet. Diese Bakterien amplifizieren die
entsprechend transfizierte Plasmid-DNA. Für Maxipräparationen wurden 300ml LB-
Medium versetzt mit 100µg/ml Ampicilin mit Bakterien oder einer Einzellkolonie von
Bakterien versetzt. Für Minpräparationen wurde analog ein 3ml-Ansatz verwendet.
Die entsprechenden Ansätze wurden bei 37°C 16h im Schüttelinkubator kultiviert.
3.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien nach Boiling-Prep-
Methode
Die 3ml Übernachkultur, der sich in der exponentiellen Wachstumsphase befindenden
Bakterien wurde für 3min bei 12000Upm bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Der
Überstand wurde abgesaugt, das Zellpellet mit 110 µL STETL-Puffer (STET-Puffer
plus 1:100 Lysozym) resuspendiert und dann für 5min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde die Suspension 45sec bei 95°C aufgekocht. Nach dem
Aufkochen wurden die Proben bei 4°C und 12000Upm abzentrifugiert. Das
schleimige Sekret wurde mit einem sterilen Zahnstocher entfernt. Der restliche Teil
der Probe wurde mit 110µl Isopropanol versetzt, invertiert und dann erneut 15min bei
12000 Upm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das erneute
Zellpellet wurde mit 0,5ml 70%igen Ethanol gewaschen. Um die Zellen wieder zu
Pelletieren wurde erneut 5min bei 12000Upm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand
wurde abgekippt und die Eppendorf-Tubes wurden zum Trocknen der Pellets verkehrt
herum auf ein trockenes Tuch gestellt. Die getrockneten Zellpellets wurden in 20-30µl
TE-Puffer resuspendiert.
57
3.2.3 Minipräparation von BAC-Kulturen (bacterial artficial chromosome)
1,5ml Übernachtkultur wurden in einem Eppendorftube 10min bei 3000Upm
abzentrifugiert, der Überstand anschließend verworfen und das Pellet in 0,3ml P1-
Puffer resuspendiert. Es wurden 0,3ml P2-Puffer hinzugefügt, gut geschüttelt und die
Proben 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden 0,3ml
P3-Puffer langsam hinzugefügt und nochmals gut geschüttelt. Die Proben wurden nun
5min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Proben 10min bei 4°C und 10000Upm
zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Eppendorftubes gegeben und je 0,8ml
Isopropanol hinzugefügt. Zum Durchmischen der Proben wurden diese invertiert und
dann 5min auf Eis inkubiert. Durch erneutes Zentrifugieren bei 12000Upm (4°C) für
15min wurde die Nukleinsäure pelletiert. Die Pellets wurden mit 0,5ml Ethanol
gewaschen, erneut abzentrifugiert und an der Luft getrocknet. Die Resuspension
erfolgte in TE Puffer. Ein Kontrollverdau mit NOT I, bei dem die Promotorregionen
aus dem CYPAC2 Vektor geschnitten wurde, war möglich.
3.2.4 Maxipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien
Diese Methode dient zur Gewinnung größerer Mengen Plasmid-DNA. Bei dieser
Methode handelt es sich um ein säulenchromatographisches Verfahren. In unserem
Labor wurde diese Methode mit dem „Maxi-Prep-Kid“ der Firma Genomed anhand
des entsprechenden Handbuchs von 1994 durchgeführt. Die gewonnene DNA wurde
in 200-400µl TE-Puffer gelöst, durch photometrische Methoden die Konzentration
bestimmt und durch anschließende Verdünnung mit TE-Puffer auf eine
Endkonzentration von 1mg/ml eingestellt.
58
3.2.5 Photometrische Bestimmung Nukleinsäure-Konzentration
Die Quantifizierung der Nukleinsäuremenge einer Probe erfolgte durch die
photometrische Bestimmung (bei 260nm) der Optischen Dichte (OD) der Probe an
Nukleinsäure. Dabei ließ sich hieraus die Konzentration der Probe wie folgt
berechnen: C (µg/ml) = OD bei 260 nm x 50 x Verdünnungsfaktor.
Der Reinheitsgehalt konnte durch Bildung des Quotienten OD 260nm/OD280nm
bestimmt werden. Dabei spricht ein Wert zwischen 1,8 und 2,0 für eine relativ
proteinfreie Probe.
3.2.6 Sequenzspezifische Hydrolyse von DNA mit Restriktionsendonukleasen
für analytische Zwecke
1µg des zu untersuchenden DNA-Plasmids wurde in einem Gesamtvolumen von 10µl
und unter den vorgegebenen Pufferbedingungen des Herstellers mit 1U des
entsprechenden Restriktionsenzyms inkubiert. Inkubationslänge und Temperatur
waren dabei vom jeweiligen Restriktionsenzym abhängig. Die verdauten Proben
wurden anschließend mit Hilfe von Gelelektrophorese analysiert.
3.2.7 Sequenzspezifische Hydrolyse von DNA mit Restriktionsendonukleasen
für Klonierungszwecke
Dieses Verfahren erfolgte entsprechend Punkt „Sequenzspezifische Hydrolyse von
DNA mit Restriktionsnukleasen für analytische Zwecke“. Allerdings wurden nur
400ng aufgereinigte DNA eingesetzt. Wurden thermostabile Restriktionsenzyme
verwendet, so mussten diese durch 20minütiges Erhitzen der Probe bei 75°C
inaktiviert werden. Der komplette Ansatz wurde durch Gelelektrophorese auf einem
präparativen Gel aufgetrennt. Die entsprechende Bande wurde aus dem Agarosegel
geschnitten und mit Hilfe „des QIAquick Gel Extraction“ Kit der Firma Qiagen
aufgereinigt.
59
3.2.8 Agarose-Geleletrophorese von DNA
Um verschiedene Größen an DNA-Fragmenten aufzutrennen, wurden Agarosegele
benutzt. Durch das Mitführen eines DNA-Längenstandards konnte die Größe der
einzelnen Fragmente bestimmt werden. Die Agarosekonzentration wurde je nach
erwarteter Fragmentgröße zwischen 0,5-2%ig gewählt. Die Agarose wurde mit
1µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die Proben wurden 5:1 mit DNA-Probenpuffer
gemischt und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei konstanten 90
Volt für mindestens eine Stunde bei Auftrennung für präparative Zwecke und 120
Volt für eine Stunde bei analytischen Gelen. Die DNA-Fragmente wurden durch UV-
Licht durch Fluoreszenz von Ethidiumbromid, welches ein interkalierender Farbstoff
ist, sichtbar gemacht. Für präparative Zwecke wurden die entsprechenden DNA-
Banden mit einen Skalpell ausgeschnitten und mit Hilfe des „QIAquick Gel
Extraction“ Kit der Firma Qiagen aufgereinigt. Die DNA wurde in 30µL TE-Puffer
eluiert.
3.2.9 Kovalente Verknüpfung von DNA-Fragmenten (Ligation)
Der zuvor durch Restriktionsverdau linearisierte Vektor (10-100ng) und die zu
inserierende cDNA (10fache Menge) wurden unter den Pufferbedingungen des
Herstellers mit Hilfe von einer Einheit (1U) T4-DNA-Ligase kovalent verknüpft.
Dazu wurde der Reaktionsansatz 16h bei Raumtemperatur inkubiert und ein Aliquot
in kompetente Bakterien transformiert. Eine Positivkontrolle (linearisierter Vektor)
und Hintergrundskontrollen (Ansatz ohne Ligase, Ansatz ohne Insert) wurden stets
mitgeführt. Für Ligationsansätze, die bei dem ersten Versuch keine Kolonien
hervorbrachten, wurde beim zweiten Ligationsversuch das „DNA Rapid Ligation“ Kit
der Firma Roche verwendet. Dadurch konnte die Ligationseffizienz erhöht werden.
60
3.2.10 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien durch Hitzeschock
Um DNA-Plasmide in kompetente E.coli Bakterien zu transformieren, wurden die
Bakterien zunächst auf Eis aufgetaut, um 100µl der Bakteriensuspension anschließend
mit 100-500ng Plasmid-DNA für 30min in einem 1,5ml Eppendorf-Tube auf Eis zu
inkubieren. Die Suspension wurde dann für 90sec im 42°C Wasserbad erhitzt. Durch
diesen Hitzeschock wurde die Permeabilität der Bakterien transient erhöht, so dass die
Plasmid-DNA besser in die Zellen aufgenommen werden konnte. Der Ansatz wurde
nochmals zwei Minuten auf Eis inkubiert und anschließend mit 500µl LB-Medium
versetzt. Diese Probe wurde nun 45min bei 37°C geschüttelt (Schüttelfrequenz 650
Upm). Die inkubierten Kulturen wurden anschließend 2min bei 1500Upm
abzentrifugiert, mit 100µl LB Medium versetzt und auf ampicillinhaltige
Agaroseplatten mit Hilfe eines Drygalski-Spatels ausplattiert oder direkt für das
Animpfen einer Übernachtkultur benutzt.
In der Regel wurde Ampicilin als Selektionsmedium verwendet. Bei der Anzucht der
Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) wurde Chloramphenicol in einer
Konzentration von 1:1700 verwendet.
3.2.11 Verschmelzen von zwei Oligonukleotideinzelsträngen durch Verknüpfung
durch kovalente Bindungen
Als Gesamtmenge wurde hierfür ein 200µl Ansatz gewählt. Dieser setzte sich aus den
folgenden Komponenten zusammen: je 40µl von beiden Oligonukleotiden (je
20pmol), 50µl 1molarer Tris-Puffer (pH:7,5) und 40µl 25 molare Mgl2. Die restlichen
30µl wurden mit Aqua. dest. aufgefüllt. Diese Probe wurde 3min in einem kochendem
Wasserbad erhitzt und anschließend im sich langsam abkühlenden Wasser über Nacht
inkubiert.
61
3.2.12 Dephosphorylierung von Vektorfragmenten
Vektoren wurden, wenn sie zuvor nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten
worden waren, anschließend dephosphoryliert. Damit wurde bei der folgenden
Ligation eine Religation der beiden Vektorenden verhindert. Die Dephosphorylierung
erfolgte mit der Shrimp-Alkaline-Phophatase der Firma Roche unter den
vorgegebenen Pufferbedingungen für 5h bei 37°C.
3.2.13 Phosphorylierung von DNA-Fragmenten
Um eine Ligation von Oligonukleotiden mit einem dephosphorylierten Vektor zu
ermöglichen, mussten die Oligonukleotide phosphoryliert werden. Dazu wurden 2µl
Oligonukleotide in einem 10µl Gesamtansatz mit 1µl T4 PNK und 1µl 1mM ATP
unter den vorgegebenen Pufferbedingungen 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend
wurde die T4PNK durch 10minütiges Erhitzen auf 70°C hitzeinaktiviert.
3.2.14 Klonierungsstrategien
3.2.14.1 Klonierung des BMI-Fragments mit E2F-Bindungsstelle in den pGl3luc-
Vektor
Schritt 1: Klonierung des BMI-Fragments aus BAC in den Bluescript-Vektor
Dazu wurde sowohl der Bluescript-Vektor, als auch das Bacterial artificial
chromosome mit der Restriktionsenzym NOT1 verdaut. Durch Aufreinigung über das
Agarosegel konnte die linearisierte Form des Bluescript-Vektors und das gewünschte
0,6 kB Fragment des BAC isoliert werden. Um bei der anschließenden Ligation, die
Religation der beiden Enden des geschnittenen Bluescript-Vektors zu verhindern,
wurde der Vektor dephosphoryliert. Für die Dephosphorylierung wurde die Shrimp-
Alkaline-Phosphatase der Firma Roche unter den vorgegebenen Pufferbedingungen
durch 5stündige Inkubation bei 37°C verwendet. Das 0,6 kB große BAC-Fragment
62
wurde mit der T4PNK kinasiert. Die Ligation erfolgte mit dem „Rapid Ligation“ Kit.
Zur Ligationskontrolle wurde das entsprechende Plasmid mit dem Restriktionsenzym
PVU1 verdaut. Die Klone, die das BMI-Fragment in der richtigen Orientierung
enthielten, wiesen nach Auftrennung über ein Agarosegel, folgendes Bandenmuster
auf: 1.Bande 1040 Basen, 2.Bande 460 Basen, 3.Bande 210 Basen
Schritt 2: BMI-NOT1-Fragement aus dem Bluescript-Vektor in den pGl3-luc-basic-
Vektor
Dazu wurde der Bluescript-Vektor, der das BMI-NOT1-Frament enthielt, sowie der
pGL3-basic-Ausgangsvektor mit den Restriktionsenzymen Xho1 und Sac1
geschnitten. Dadurch erhielten wir nach gelelektrophoretischer Auftrennung einen
4,4kB großen pGL3-Vektor und ein 670B großes BMI-Fragment. Diese beiden
Fragmente wurden erneut ligiert.
3.2.14.2 Klonierung der siRNA gegen BMI-1 in den pSuper-Vektor bzw. siRNA
gegen BMI-1 in den pTER-Vektor für das tetracyclinabhängige System
Der pSuper Vektor bzw. pTER-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl II und
Hind III geschnitten. Die Oligonukleotide konnten direkt mit dem verdauten und
aufgereinigten Vektor ligiert werden.
3.2.15 Sequenzierungen
Die Sequenzierungen wurden von der Firma SEQLab in Göttingen durchgeführt.
Dazu wurden generell die Standardprimer der Firma SEQLab benutzt. Für die
Sequenzierung der siRNA in den pTER-Vektor wurde der BGH-Primer (s. Methoden)
benutzt.
63
3.2.16 Generierung von BMI-Punktmutanten mittels in vitro-Mutagenese
Zur Einführung einer Punktmutation in die E2F-1-Bindungsstelle im BMI-1-Gen
wurde das „QuickChange site-directed mutagenesis“ Kit der Firma Stratagene
verwendet. Ausgehend von dem pGL3-Klonierungsvektor wurden zur spezifischen
Mutation bestimmter Nukleotide zwei zueinander komplementäre Primer (siehe
Material) hergestellt. Diese Primer generierten die gewünschte Punkmutation:
Austausch von TGGC gegen GCTA. Durch diesen Basenaustausch wurde eine
zusätzliche Restriktionsschnittstelle für das Restriktionsenzym NHE eingeführt.
Durch eine PCR mit einer DNA-Polymerase mit 3´-5´Exonukleaseaktivität wurde das
komplette Plasmid amplifiziert. Um die Plasmid-DNA der Matrize zu beseitigen,
wurde das PCR-Produkt eine Stunde mit dem Dpn I, einer Restriktionsendonuklease,
die methylierte DNA schneidet, verdaut. Anschließend wurde ein Aliquot direkt in
DH5α-Bakterien transformiert und auf Agarplatten ausplattiert. Aus Einzelkolonien
einer Agarplatte wurden Übernachtkulturen angeimpft und durch Minipräparation
Plasmid-DNA isoliert. Der Erfolg der Mutagenese wurde mit Hilfe eines
Restriktionsverdaus mit dem NHE-Restriktionsenzyms überprüft. Im Promotor, der
durch Mutation verändert wurde, entstand eine neue Schnittstelle für das
Restriktionsenzym NHE, so dass in der folgenden Auftrennung durch
Gelelektrophorese anstatt einer 780kB großen Bande zwei Banden entstanden (460
kB und 320kB). Die entsprechenden erfolgreich veränderten Plasmide wurden zur
Sequenzierung an die Firma SEQLab nach Göttingen geschickt.
64
3.3 BIOCHEMISCHE METHODEN
3.3.1 Herstellung von Proteinlysaten aus Säugerzellen
Die Herstellung von Proteinlysaten aus Säugerzellen für die Analyse im Western Blot
oder für Reporterstudien erfolgte mittels mehrmaligen Schockgefrierens in flüssigem
Stickstoff und jeweiligem Auftauen im Wasserbad (freeze and thaw-Methode). Dazu
wurden die entsprechenden Zellen auf den Zellkulturschalen mit PBS gewaschen, mit
einem Zellkulturschaber von der Platte gekratzt, in 1ml PBS aufgenommen und in
1,5ml-Falcons überführt. Durch Abzentrifugieren bei 4°C und 1200 UpM wurden die
Zellen pelletiert, der Überstand verworfen und die Zellen in 200-300µl KPI-Puffer
plus 1:1000 Proteininhibitoren resuspendiert. Durch anschließend dreimaliges
Schockgefrieren im flüssigen Stickstoff und jeweiligem Wiederauftauen im 37°C
Wasserbad (2min pro Schritt) wurden die Zellwände aufgebrochen. Im folgenden
Zentrifugationsschritt für 15min bei 4°C und 12000Upm wurden die Proteine von
dem Zelldetritus (der erneut ein Pellet im Eppendorf-Tube bildete) getrennt. Der
Überstand mit den darin enthaltenen Proteinen wurde in ein neues Eppendorf-Tube
überführt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte nach der Methode nach Bradford.
3.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford
Zunächst wurde eine Proteinstandardkurve erstellt. Dazu wurde eine BSA-
Verdünnungsreihe (1-10µg/ml im jeweiligen Lysepuffer mit 100µl 150mM NaCl-
Lösung und 1ml Bradford-Lösung versetzt) benutzt. Die jeweiligen Proben wurden
fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption der Proben bei 595nm
wurde durch Abgleich mit einer Leerprobe, bestehend aus 1µl KPI-Puffer, 100µl
NaCl und 1ml Bradford-Reagenz, photometrisch bestimmt. Zur Messung der
Absorption der Proteinproben wurde analog vorgegangen. Die
Konzentrationsbestimmung der Proben erfolgte anhand der BSA-Standard-Kurve.
65
3.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteine
Um Proteinlysate aufzutrennen wurde eine SDS-Gelelektrophorese unter
denaturierenden Bedingungen verwendet. Die Matrix bildeten Gele aus Acrylamid,
die aus niedrigprozentigen Sammelgelen und 7,5-15%igen Trenngelen bestanden. Die
Konzentration des Trenngels wurde je nach gewünschtem Auftrennungsgrad gewählt.
Das Trenngel wurde in Anlehnung an Laemmli (Laemmli, 1970) gegossen (3,83-5, ml
Acrylamidlösung; 3,75ml Trenngelpuffer; 150µl 10 % SDS auf 15ml mit Aqua dest.
aufgefüllt, 12µL TEMED und 150µL 10%iges APS wurden als letztes hinzugefügt, da
hierdurch die Polymerisierung des Gels initialisiert wurde). Das Trenngel wurde
sofort nach dem Gießen mit Isopropanol überschichtet. Nach erfolgter Polymerisation
wurde das Isopropanol abgegossen und das Trenngel mit Hilfe eines Whatman-
Papiers von Isopropanolresten befreit. Das Trenngel wurde nun vom Sammelgel
überschichtet (650µL Acrylamidlösung; 1,2ml Sammelgelpuffer; 50µl 10 % SDS; auf
5ml mit Aqua. dest. aufgefüllt; auch hier wurde die Polymerisation durch Zugabe von
150µL 10% APS und 5µL TEMED gestartet). Sofort nach dem Giessen des
Sammelgels (vor Beginn der Polymerisation) wurden Geltaschen durch das
Verwenden eines geeigneten Kammes gesteckt.
Die Denaturierung der Proteine erfolgte nach Zugabe eines SDS-Ladepuffers durch
5minütiges Erhitzen im 95°C warmen Heizblock. Anschließend wurden die Proteine
auf das im SDS-Puffer stehendem Gel aufgetragen und durch das Anlegen einer
gleichmäßigen Spannung (80 Volt im Sammelgel, 120 Volt im Trenngel) aufgetrennt.
Es erfolgte nun der Transfer auf eine PVDF-Membran.
3.3.4 Transfer von Proteinen auf PVDF-Membranen mittels Western-Blot
Die durch SDS-Page aufgetrennten Proteine wurden bei diesem Schritt auf eine
Polyvinylidenfluor-Membran transferiert. Die entsprechenden Membranen wurden
zunächst äquilibriert. Dazu wurden diese Membranen 5min in Ethanol, 2min in
Wasser und 1min im Blotpuffer inkubiert. Der Transfer der Proteine erfolgte durch
das Tankblotverfahren bei konstanter Spannung von 100V für 1 Stunde. Dabei wurde
eine Tankblotapparatur der Firma Biorad verwendet.
66
3.3.5 Detektion von Proteinen auf PVDF-Membranen durch
Chemolumineszenz
Nachdem die Proteine durch SDS-Page aufgetrennt und durch Nitrocellulose
immobilisiert worden waren, waren die Protein nun zugänglich für eine Detektion
durch Antikörper. Zunächst wurden die PVDF-Membranen mit den transferierten
Proteinen 2h bei Raumtemperatur in einer Blocklösung inkubiert. Dadurch wurde die
Bindungskapazität für unspezifische Antikörper verringert. Anschließend erfolgte
eine ebenfalls 2stündige Inkubation der Membran mit dem Primärantikörper bei
Raumtemperatur. Die Membran wurde dreimal (bei Bmi-1-Antikörper fünfmal) für
jeweils 10min mit TBST-Puffer gewaschen. Die Inkubation mit dem
peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper erfolgte in einer 1:3000-Verdünnung in
Blocklösung bei Raumtemperatur für 2h. Auch der Sekundärantikörper wurde durch
fünfmaliges Inkubieren für je 10min von der Membran gewaschen. Die Detektion der
Proteine erfolgte mittels ECL um überexpremierte Proteine zu detektieren (selber
gemischt: Lösung A: 100µl Luminol-Stammlösung; 44,4µl p-Cumar-Säure; 1ml 1M
Tris-HCL pH 8,5 auf 10ml mit Aqua dest.; Lösung B: 6,12µl 30%ige H2O2, 1ml 1M
Tris-HCL pH 8,5 auf 10ml mit H2O auffüllen) bzw. ECLplus (ECLplus Western-
Blotting Detection System, Amersham) um endogene Proteine nachzuweisen.
3.3.6 Bewertungskriterien für Western-Blots
Die Schwärzung des Films ist in gewissen Grenzen der Menge an gebundenen
Antikörper und damit der Menge an nachzuweisendem Protein proportional. Die
Höhe der nachzuweisenden Proteine wurde dabei in Relation zu der Signalstärke des
jeweils als Ladekontrolle parallel bestimmten CDK2-Signales beurteilt.
67
3.3.7 Bestimmung der ββββ-Galactosidaseaktivität
Die Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität wurde im Rahmen von Reporter-Assays
durchgeführt, um eine interne Kontrolle der Transfektionseffizienz der Zellen zu
bekommen. Dadurch konnte die Reporteraktivität normalisiert werden. Der jeweils in
die Zellen kotransfizierte β-Galactosidase-Expressionsvektor setzte dabei ein
chromogenes Substrat um. Dazu wurden 50µL des Zelllysats zu 750µL
Reaktionspuffer und 100µl Substratlösung gegeben, in einer Halbmikroliter-
Einmalküvette gemischt und bei 37°C inkubiert. Die Inkubation erfolgte so lange, bis
ein gelblicher Farbumschlag sichtbar wurde. Dieser Farbumschlag erfolgte durch die
Umsetzung des chromogenen Substrats ONPG zum gelben o-Nitrophenol durch die
β-Galactosidase. Dieses Spaltprodukt entsteht in proportionaler Menge zur β-
Galactosidaseaktivität. Durch Konzentrationsmessung des entstandenen Produkts
durch Absorptionsbestimmung bei 420nm konnte auf die Aktivität der β-
Galactosidase geschlossen werden.
3.3.8 Bestimmung der Luciferaseaktivität
Die Interaktion von Transkriptionsfaktoren an einem bestimmten Promotor wurde
durch Bestimmung der Luciferaseaktivität sichtbar gemacht. Dazu wurden die
entsprechenden Zellen zunächst auf einer 6cm-Schale ausplattiert und anschließend
transient transfiziert. 36h nach der Transfektion wurden die Zellen mit kaltem PBS
gewaschen, durch Abkratzen geerntet und in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt. Es
wurden Proteinlysate hergestellt. Zur Bestimmung der Luciferaseaktivität wurden
50µl des Proteinlysats mit 350µl Reaktionspuffer versetzt und die Lichtemission in
einem Luminometer (Lumat LB 9507, Berthold) nach automatischer Zugabe von
150µl Substratmix durch die Einspritzpumpe des Luminometers gemessen.
68
3.3.9 RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen mit Hilfe von Trizol
Die durch Isolierung aus eukaryotischen Zellen gewonnene RNA wurde in einem
weiteren Schritt zur cDNA-Synthese verwendet. Die Isolierung der RNA erfolgte mit
Hilfe des Trizol-Reagenz der Firma Invitrogen nach dem entsprechend mitgelieferten
Protokoll. Dazu wurde die Zellen durch Abschaben von der Zellkulturplatte geerntet,
in ein Eppendorftube überführt, abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das
Zellpellet mit 1ml Trizol-Reagenz vermischt. Um eine vollständige Dissoziation der
Nukleoproteine von der Nukleinsäure zu gewährleisten, wurden die homogenisierten
Proben 5min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend 0,2ml Trizol/mlChloroform
hinzugefügt und die Proben vorsichtig 15sec per Hand geschüttelt. Durch
Zentrifugieren bei 12000Upm für 5min bei 4°C wurde die Lösung in eine untere
wässrige rote Phenol-Chloroform-Phase und eine obere farblose wässerige Phase
getrennt. Die RNA befand sich in der wässerigen Phase. Diese Phase wurde in ein
neues Eppendorftube überführt und die RNA durch hinzufügen von 0,5ml
Isopropanol präzipitiert. Die Proben wurden für 10min bei Raumtemperatur inkubiert
und anschließend bei 4°C und 12000Upm 10min zentrifugiert. Durch diesen
Zentrifugationsschritt wurde die RNA pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und
das Pellet mit 1ml 75%igem Ethanol gewaschen und erneut 5min scharf
abzentrifugiert. Die RNA-Pellets wurden an der Luft getrocknet und in einem kleinen
Volumen (15-30µl) TE-Puffer aufgenommen.
3.3.10 cDNA –Amplifikation durch reverse Transkription aus RNA
In ein autoklaviertes 0,2ml PCR-Gefäß wurde in folgender Reihenfolge diese
Agenzien pipettiert: 0,5µl RNAsin, 1,5µl Oligo (dT) und 250ng RNA. Diese Probe
wurde auf 13µl mit H2O aufgefüllt. Im PCR-Cycler wurden die Proben für 10min bei
70°C inkubiert und anschließend 12µl eines Mastermixes bestehend aus 5µl 5xFirst-
Strand-Buffer, 2,5µL DTT, 1,5µl BSA, je 0,5 µl dNTP, 0,25µl RNAsin sowie 1µl
Super-Script hinzugefügt. Daraufhin wurde im PCR-Cycler 10min bei 25°C, 55min
bei 42°C und 15min bei 70°C inkubiert.
69
3.3.11 PCR mit spezifischen Primern
Bei der PCR wurde aus einem cDNA-Einzelstrang durch enzymatische Anlagerung
von freien Desoxynukleosidtriphosphaten ein DNA-Doppelstrang synthetisiert. Die
Primer, die eine Länge von etwa 20 Nukleotiden umfassten, benötigten ein freies
3OH-Ende. Der Reaktionsansatz bestand aus 2µl der synthetisierten cDNA, 5µl
Reaktionspuffer, je 1µl dNTPs, 0,1µl Polymerase, 0,9µl Taq-Verdünnungspuffer. Der
Reaktionsansatz wurde durch H2O auf ein Gesamtvolumen von 50µl aufgefüllt, gut
durchmischt und nach den angegebenen Bedingungen im PCR-Cycler inkubiert.
Thermoprotokoll:
1Zyklus: 95°C für 30 Sekunden
12-18 Zyklen: 95°C für 30 Sekunden; 55°C für 1 Minute; 68°C für 2 Minuten/kb
Plasmid.
3.3.12 RT-PCR mit spezifischen Primern im Echt-Zeit-Gerät
Diese molekularbiologische Methode folgt den Prinzipien der unter Punkt 3.3.11.
beschriebenen Technik. Die Besonderheit dieser Methode besteht darin, dass sie
durch Interkalierung von Cypergreen in die DNA eine Messung der proportional zur
DNA-Amplifikation verlaufenden PCR-Reaktion über eine UV-Lampe und dadurch
eine Quantifizierung der Reaktionsprodukte ermöglicht. Die Amplifikationskurven
der einzelnen Proben kann in Echtzeit über einen Bildschirm abgelesen werden. Der
Reaktionsansatz besteht für eine Probe aus: 18µl H2O; 2,5µl Puffer; 1µl dNTPs;
1,75µl Mg; 0,5µl je Primer (10pmol/ml); 0,75µl SYBR; 0,125µl Polymerase.
70
4 Ergebnisse
4.1 EXPERIMENTELLES SYSTEM: NEUROBLASTOMZELL-
LINIEN, DIE EIN E2F1-ER-FUSIONSPROTEIN EXPRIMIEREN
Grundlage der meisten Experimente war ein Zellklon der humanen
Neuroblastomzelllinie SK-N-SH-EP (1A3-Zellen), der konstitutiv ein E2F1-ER-
Fusionsprotein exprimiert (Kramps, 2004). Dieses Fusionsprotein kann durch Zugabe
des Östrogenderivats 4-Hydroxytamoxifen (4OHT) zum Zellkulturmedium reversibel
aktiviert werden. 1A3-Zellen reagieren auf Stimulation mit 4OHT durch
Überexpression von E2F1-Zielgenen (z.B. CCNE1) (Kramps, 2004). Zudem weisen
12h-16h nach 4OHT-Stimulus geerntete 1A3-Zellen einen höheren Anteil an Zellen in
der S-Phase (E2F induziert den Übergang der Zellen in die S-Phase) gegenüber den
nicht induzierten Zellen auf. Die S-Phasen-Induktion wird 24h nach 4-OHT-Stimulus
von einem weiteren Effekt überlagert: Die stimulierten Zellen weisen gegenüber der
Kontrolle einen größeren Anteil an apoptotischen Zellen auf.
4.2 BMI1 IST ZIELGEN VON E2F1
4.2.1 E2F1 induziert Bmi1 auch auf Proteinebene
Frühere Arbeiten in der Arbeitsgruppe hatten gezeigt, dass das BMI1-Gen in
Neuroblastomen auf RNA-Ebene durch E2F1 induziert wird und das E2F1 in vivo an
den Promotor des endogenen BMI1-Gens bindet (Nowak, 2006). Um zu überprüfen,
ob E2F1 auch die Proteinmenge von Bmi1 erhöht, habe ich mit Hilfe eines Western-
Blot das Bmi-Protein in Lysaten von 1A3-Zellen nachgewiesen:
71
Der Western-Blot zeigt das Bmi1 auch auf Proteinebene von E2F1 induziert wird.
4.2.2 BMI1 ist ein direktes Zielgen von E2F1
Cycloheximid blockiert die Proteinbiosynthese in Zellen. Diese Eigenschaft des
Cycloheximids macht man sich (im ER-System) zu nutze, um direkte Effekte von
einem Gen auf ein Zielgen, von indirekten zu unterscheiden. Cycloheximid wurde
verwendet, um nachzuweisen, ob die Induktion von BMI1 durch E2F1 auf direktem
oder indirektem Weg zustande kommt.
Mögliche Modelle:
Modell 1
Abb. 4: Modelle: Ist die Induktion von Bmi1 durch E2F1 ein direkter oder ein indirekter Effekt?
Abb. 4a: Modell 1 zeigt das Induktionsschema für einen direkten Effekt von E2F1 auf Bmi1. In diesem Fall wäre nach Induktion
durch E2F1 eine hohe BMI-RNA-Expression und ein durch Cycloheximid blockiertes und damit niedriges Bmi-Protein-Level zu
erwarten.
Abb.3: Western-Blot: Bmi1 nach E2F1
Induktion
AK gegen Bmi1 (54kDa) und CDK2 (22kDa)
mit zwei jeweils von einander unabhängigen
Versuchen (K1 und K2, (je 30µg
Proteinlysat)) nach 16stündiger Induktion mit
4OHT (K1,4OHT und K2,4OHT) und den
jeweiligen Kontrollen ohne Zugabe von
4OHT (K1minus4OHT und K2minus4OHT).
4OH E2F-ER
BMI
Protein RNA
Proteinsynthese blockiert durch Cycloheximid
BMI
CDK
K1 K1 K2 K2 minus plus minus plus 4OHT 4OHT 4OHT 4OHT
72
Abb. 4b: Modell 2 zeigt die Induktionskaskade zwischen E2F1 und BMI1 unter Zwischenschalten eines weiteren Gens
(Aktivator von BMI1) und somit eines indirekten Effekts von E2F1 auf BMI. In diesem Fall würden wir sowohl ein niedriges
Bmi-Protein, als auch ein niedriges BMI-RNA Level erwarten.
Würde der Induktionsweg indirekt ablaufen, entweder über ein oder mehrere
dazwischen geschaltete Gene, dann würde dieser Weg auf Höhe der Proteinsynthese
des zwischengeschalteten Proteins, durch die proteinbiosyntheseblockierende
Wirkung des Cycloheximids unterbrochen werden. In diesem Fall könnte keine
Induktion von BMI1 auf RNA-Ebene beobachtet werden. Um zu zeigen, dass der
Effekt von E2F1 auf BMI1 direkt war, wurde aus unterschiedlich behandelten Zellen
RNA isoliert und eine RT-PCR im Echtzeitgerät durchgeführt.
a) CyclinE b) BMI1 c) BMI1
Abb.5: RT-PCR: Induziert E2F1 BMI1 direkt oder indirekt?
A.) CyclinE (Induktionskontrolle) 1.) ohne Zugabe 2.) plus 4OHT 3.) plus CHX 4.) plus 4OHT, plus CHX
B.) BMI1-RNA Level in CT-Werten unter den vier verschieden Induktionsbedingungen:
1.) ohne Zugabe (no drug) 2.) plus 4OHT 3.) plus CHX 4.) plus 4OHT, plus CHX
C.) BMI1-RNA Level als X-fache-Aktivierung: 1.) ohne Zugabe 2.) plus 4OHT 3.) plus CHX 4.) plus 4OHT, plus CHX
Proteinsynthese blockiert durch Cycloheximid
4OHT E2F-ER
BMI
Protein RNA RNA Protein
Aktivator d.
BMI1-
Transkription
Induktionkontrolle / CYCLIN E
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
no drug 4OHT CHX 4OHT,
CHX
21
22
23
24
25
26
27
no drug 4OHT CHX 4OHT,
CHX
CT-W
erte
0
1
2
3
4
5
6
no drug 4OHT CHX 4OHT,
CHX
X-fache Aktivierung
X
F
A
C
H
I
N
D
U
K
T
I
O
N
X
F
A
C
H
I
N
D
U
K
T
I
O
N
∆
C
T
-
W
E
R
T
E
73
Als Kontrolle, ob die Induktion durch 4OHT effektiv war, wurde die CyclinE-
Expression durch quantitative RT-PCR untersucht. CyclinE wurde als ein bekanntes
Zielgen von E2F1, in diesem Versuchsansatz induziert. Durch quantitative RT-PCR
konnte gezeigt werden, dass eine Induktion von BMI1 auf RNA-Ebene durch die
alleinige Zugabe von 4OHT (zweiter Fall), aber auch bei Zugabe von 4OHT plus
Cycloheximid (vierter Fall) zu beobachten ist. Die Induktion von BMI1 durch E2F1
erfolgt demnach direkt.
4.2.3 Die Induktion von Bmi1 durch E2F erfolgt durch eine E2F-Bindungsstelle
im Bmi1-Promotor
Der Promotor des humanen BMI-Gens enthält eine Sequenz, die möglicherweise eine
E2F1-Bindungsstelle darstellt:
Abb.6: Der Promotor des BMI1-Gens enthält eine potentielle E2F1 Bindungsstelle (5´-TGTGGCGC-´). Diese Bindungsstelle
wird hoch konserviert auch im Mauspromotor gefunden. Die „E2F consensus site“ hat die Sequenz: TTTSSCGC (Weimann und
Farnham).
Um zu überprüfen, ob diese Sequenz notwendig für die Aktivierung des Bmi1-
Promotors durch E2F1 ist, wurde der Bmi1-Promotor mit der E2F1-Bindungsstelle in
den pGL3-basic-Vektor kloniert (siehe Methoden 3.13.1). Die Sequenzen von Bmi1
mussten aus einem „Bacterial artifcial chromosome“ durch Restriktionsverdau
entnommen werden. Eine Klonierung auf Basis eines PCR-Produkts war nicht
möglich, vermutlich weil der proximale Promotor des BMI1-Gens extrem CG-haltig
ist.
E2F1 induzierte im Reporter-Assay sehr stark Bmi1. Um zu zeigen, dass die
Induktion von Bmi1, die im Reporter-Assay zu beobachten war, von der Bindung des
E2F1 an die bekannte Bindungsstelle des Bmi-Promotors abhängt, wurde die E2F1-
Bindungsstelle im Promotor von Bmi1 durch den Austausch von vier benachbarten
-319 -144 -52 -19 268 458
Sp Sp Sp E2F1 exon1
74
Basen zerstört. Dabei wurde die potentielle E2F1-Bindungsstelle im Bmi1-Promotor
so verändert, dass eine neue Schnittstelle für das Restriktionsenzym NHE (Nhe I)
entstand (Austausch von TGGC gegen GCTA). Die Mutagenese erfolgte im pGL3-
Bmi-Wt-Vektor. Der Erfolg der Mutagenese wurde mit Hilfe eines Kontrollverdaus
mit den Restriktionsenzymen Nhe/Xho und durch Sequenzierung überprüft (siehe
Material und Methoden 3.2.16). Der anschließend durchgeführte Reporter-Assay
zeigte folgendes Ergebnis:
In diesem Experiment aktivierte transfiziertes E2F1 das Reportergen etwa 10fach und
E2F3 etwa 3fach (Abb.7). Im Gegensatz dazu erhöhten weder E2F1 noch E2F3 die
Aktivität des mutierten Reporterkonstrukts. Demnach ist die E2F-Bindungsstelle im
proximalen Promotor des BMI-Gens verantwortlich für die Aktivierung durch E2F.
Abb 7.:Luciferase-Assay in Shep-Zellen: Ist die E2F1-Bindungsstelle im BMI1-Promotor verantwortlich für die Induktion von
Bmi1 nach E2F1 Stimulus?
Die Transfektion erfolgte nach folgendem Schema (jeweils Triplikate):
1.) 6µg pGL3-BMI, 12µg CMV-Leervektor, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal
2.) 6µg pGL3-BMI, 6µg E2F1, 6µg DP1, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal
3.) 6µg pGL3-BMI, 6µg E2F2, 6µg DP1, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal
4.) 6µg pGL3-BMI, 6µg E2F3, 6µg DP1, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal
5.) 6µg pGL3-BMI mit mutierter E2F1-Bindungsstelle, 12µg CMV-Leerwert, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal
6.) 6µg pGL3-BMI mit mutierter E2F1-Bindungsstelle, 6µg E2F1, 6µg DP1, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal
7.) 6µg pGL3-BMI mit mutierter E2F1-Bindungsstelle, 6µg E2F2, 6µg DP1, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal
Lu cife rase/B ra dfo rd
0
2
4
6
8
10
12
LeerwertBMI
BMIE2F1
BMIE2F2
BMIE2F3
MutaLeeerwert
MutaE2F1
MutaE2F2
MutaE2F3
x
-
f
a
c
h
-
a
k
t
i
v
75
4.3 BMI1 IST KEIN REGULATOR DES MYCN-GENS IN IMR 32-
ZELLEN BEI TRANSIENTER TRANSFEKTION
Die Untersuchung der Promotoren von CMYC und MYCN hat überraschende
Parallelen in der transkriptionellen Regulation beider Gene enthüllt (Strieder, 2003).
Die Regulation des MYC-Gens durch PcG-Proteine, die in mehreren Zellsystemen
nachgewiesen wurde (Guo und Dimri, 2006), könnte eine weitere Gemeinsamkeit
darstellen. Analog der Situation in Lymphozyten, könnte durch die Expression von
Bmi1 die funktionellen Eigenschaften des PcG-Komplexes verändert werden, mit der
Folge, dass N-Myc nicht mehr reprimiert wird. Es ist bekannt, dass E2F1 N-Myc in
Neuroblastomzellen induzieren kann (Strieder, 2003). Da außerdem bekannt ist, dass
E2F1 Bmi1 induziert, habe ich überprüft, ob die Überexpression von N-Myc durch
E2F1 ein Effekt ist, der durch Bmi1 verursacht wird. In diesem Fall müsste bei
alleiniger Überexpression von Bmi1 die N-Myc-Expression ansteigen. Dazu wurde im
Anschluss an eine transiente Transfektion von N-Myc in IMR-32-Zellen ein
Luciferase-Assay durchgeführt.
Die Luciferaseaktivität ist bei Kotransfektion des Leervektors erwartungsgemäß
niedrig (Abb. 8; Probe 1). Die dritte Probe mit kotransfizierten E2F3 wurde als
Positivkontrolle mitgeführt, da bekannt ist, dass E2F3 N-Myc induziert. Die Aktivität
des N-Myc Promotors wird durch Bmi1 nicht induziert (niedrige Luciferasewert in
der zweiten Probe; vergleichbar mit dem Leerwert). Das bedeutet, dass zumindest bei
transienter Transfektion Bmi1 nicht die N-Myc-Expression steigern kann.
0
50000
100000
150000
200000
250000
Leerwert (pcDNA3) BMI-1 E2F
Luciferaseaktivität
Abb.8: Lucifersase-Assay: Ist N-Myc in
Neuroblastomzellen durch Bmi1 induzierbar? Transiente Transfektion mit folgendem
Transfektionschema in IMR32-Zellen
1.) 4µg N-Myc-luc; 3µg pcDNA3; 1,5µg LacZ; 1,5µg
CMVeGFP (Vergleichswert;Leerwert)
2.) 4µg N-Myc-luc; 3µg CMV BMI-1; 1,5 µg LacZ;
1,5µg CMVeGFP
3.) 4µg N-Myc-luc; 1,5µg CMV-E2F3 plus 1,5µg DP1;
1,5µg CMVeGFP (Positivkontrolle, denn es ist bekannt,
dass E2F3 N-Myc induziert
76
4.4 UNTERSUCHUNG DER ROLLE VON BMI1 IN DER ANTWORT
AUF E2F1 IN NEUROBLASTOMEN
Die aussagekräftigsten Ergebnisse zur Funktion eines Gens liefern experimentelle
Ansätze, bei denen das Gen funktionell inaktiviert wird. Das Ziel dieser
Versuchansätze war, durch Aktivierung von E2F1 bei gleichzeitiger Hemmung von
Bmi1, die Bedeutung von Bmi1 für die E2F1 Funktion zu untersuchen (siehe
Einleitung Abb.2, Model 1 versus Model 2). Ich habe zwei verschiedene Ansätze zum
Ausschalten des BMI1-Gens benutzt:
Zum einen wurde die BMI1-Expression durch RNA-Interferenz, RNAi, gehemmt
(siehe Kapitel 4.4.1-4.4.4).
Zum anderen wurde ein dominant negatives Allel zur funktionellen Hemmung von
Bmi1 verwendet (siehe Kapitel 4.4.5).
4.4.1 Hemmung der BMI1-Expression durch RNAi-Interferenz
Im ersten Schritt wurde ein sogenannter siRNA-Vektor basierend auf dem pSuper-
Plasmid hergestellt. Der Vektor kodiert für eine kurze RNA, die „short hairpin RNA“
(shRNA), die unter der transkriptionellen Kontrolle eines starken viralen Promotors
steht. Diese RNA faltet zu einem Doppelstrang zurück, der in einen Proteinkomplex
integriert wird. Dieser Komplex zerstört spezifisch diejenigen mRNA-Moleküle,
deren Sequenz mit der siRNA im Komplex übereinstimmt (Leung und Whittaker,
2005; Lenz, 2006). Weil nicht alle Bereiche eines mRNA-Moleküls in gleicher Weise
für RNAi geeignet sind und nur unsichere Kriterien definiert werden können, die eine
Vorhersage über die Eignung einer bestimmten Sequenz als Ziel der RNAi
ermöglichen, habe ich drei verschiedene shRNAs gegen BMI1 konstruiert, die
verschiedene Zielsequenzen innerhalb des BMI1-mRNA-Moleküls erkennen.
Die drei shRNAs gegen BMI1 wurden zunächst durch eine transiente Transfektion
getestet, um zu zeigen, dass die jeweiligen siRNAs überhaupt einen Effekt auf das
Expressionslevel von BMI1 haben. Dazu wurden die drei verschiedenen siRNAs in
verschieden Ansätzen in IMR32-Zellen transient transfiziert.
77
Die Höhe der Expression des BMIs bzw. die Repression durch die verschiedenen
siRNAs wurde auf RNA-Ebene durch RT-PCR im Echtzeit-Gerät geprüft.
0
1
2
3
4
5
6
7
siRNA1/2 siRNA3/4 siRNA5/6
Je höher die ∆-CT-Werte sind, desto effektiver ist die Reduktion von BMI1 durch die
entsprechende siRNA. SiRNA1/2 (∆-CT-Wert:5,2) und siRNA5/6 (∆-CT-Wert:4,8)
weisen sehr hohe ∆-CT-Werte auf (Abb.9) und können deshalb anhand dieses
transienten Versuches als gut funktionierende siRNAs bezeichnet werden.
Aufgrund der Ergebnisse der transienten Transfektion der drei verschiedenen siRNAs
gegen BMI1 in IMR32-Zellen konnte angenommen werden, dass die drei siRNAs
BMI1 in den Zellen reprimieren können. Für die „loss-of-function-Versuche“ müssen
aber exakt reproduzierbare Versuchsbedingungen vorliegen. Deshalb wurde die
siRNA stabil in 1A3-Zellen transfiziert.
Abb.9: RT-PCR im Echtzeitgerät: Austestung der siRNA gegen
BMI1 im transienten Versuchsansatz.
Y-Achse: ∆-CT-Werte des BMIs;
Der ∆-CT-Wert steht für eine Differenz zwischen zwei CT-Werten;
in diesem Fall für die Differenz der BMI-RNA-Werte von Zellen
mit kotransfiziertem Leervektor und Zellen, die nach transienter
Transfektion ein siRNA-Konstrukt enthalten. RNA-Lysat aus
IMR-32-Zellen (BMI1 exprimierende Neuroblastomzelllinie), die
nach dem folgenden Transfektionsschema transfiziert wurden:
1.) 24µg pGl3-Vektor mit siRNA1/2, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP
2.) 24µg pGL3-Vektor mit siRNA3/4, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP
3.) 24µg pGL3-Vektor mit siRNA5/6, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP
4.) 24µg pGL3-Leervektor, 3µg Puromyinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP
Die Zellen wurden 48h nach Transfektionsbeginn für 72h mit 0,8µg/ml Puromycin vollständig selektioniert.
Die BMI-Werte wurden zweifach abgeglichen:
1.) Der Abgleich mit den S14 –Werte erfolgte (wie bei jeder quantitativen RT-PCR), um sicherzustellen, dass man
von gleichen cDNA-Mengen bei der RT-PCR ausgeht;
2.) Durch Quantifizierung des BMIs auf RNA-Ebene in den mit dem Leervektor transfizierten Zellen konnte das
Ausgangslevel des BMIs bestimmt werden. Durch den Vergleich dieses „Normallevels“ mit dem Level des BMIs in
den siRNA-Zellen kann die Effektivität der einzelnen siRNAs festgestellt und miteinander verglichen werden.
∆
-
C
T
-
W
E
R
T
78
4.4.2 Folgen der Hemmung von BMI1 in Neuroblastomzellen
Nach stabiler Transfektion der drei siRNAs in 1A3-Zellen zeigte sich unter Selektion
mit 0,8mg/ml Puromycin folgendes:
1.) Alle 4 Platten (siRNA1/2; siRNA3/4; siRNA 5/6; Kontrollplatte mit pSuper-
Leervektor) hatten eine gleich gute Transfektionseffizienz (durch
kotransfiziertes GFP sichtbar gemacht).
2.) Alle 4 Platten waren nach drei Tagen Selektion mit 0,8 mg/ml Puromycin
vollständig selektioniert.
3.) Nach einigen Tagen stellte sich bereits heraus, dass die Einzelklone auf der
Kontrollplatte, aber auch die Klone mit transfizierter siRNA1/2 und mit
siRNA3/4 wesentlich schneller wieder wuchsen, als die Klone, die mit
siRNA5/6 transfiziert worden waren.
4.) 18 Tage nach Transfektionsbeginn wurde ein Koloniebildungsversuch
gemacht und es stellte sich folgende Situation auf den Zellkulturschalen dar:
Abb.10: Koloniebildungsversuch in 1A3-Zellen 20 Tage nach stabiler Transfektion verschiedener siRNAs gegen Bmi1
(Selektion mit 0,8mg/ml Puromycin). Transfektionsschema:
1.) 24µg pGl3-Vektor mit siRNA1/2, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP
2.) 24µg pGL3-Vektor mit siRNA3/4, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP
3.) 24µg pGL3-Vektor mit siRNA5/6, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP
4.) 24µg pGL3-Leervektor, 3µg Puromyinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP
Der Koloniebildungsversuch zeigte, dass sich zwei der siRNA-Platten (siRNA1/2 und
siRNA3/4) von der Wachstumsgeschwindigkeit und der Zellkoloniedichte nach 18
Tagen nicht von der Kontrollplatte (Leervektor transfiziert) unterschieden. Auf der
Zellkulturschale mit transfizierter siRNA5/6 konnten wesentlich weniger
Einzelzellkulturen erkannt werden. Außerdem zeigte sich auf der Zellkulturplatte der
pSuper siRNA 5/6 siRNA 1/2 siRNA 3/4
79
siRNA5/6-Klone, dass die wenigen Zellen sich morphologisch veränderten. Die
Zellen bildeten längliche Zellkörper mit langen Zellausläufern aus.
Unter zusätzlicher Betrachtung der Testung der drei siRNAs im transienten Assay,
konnte angenommen werden, dass die siRNA5/6 sehr effektiv BMI1 reprimiert. In der
zuvor durchgeführten RT-PCR und transienten Transfektion zur Testung der siRNAs
konnte aber auch für die siRNA1/2 eine starke Reduktion von BMI1 gezeigt werden,
während im Koloniebildungsversuch der siRNA1/2-Klone kein Unterschied in der
Zellmorphologie oder in der Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich zur
Kontrollplatte beobachtet werden konnte. Deshalb wurden alle funktionellen
Analysen der siRNA-Klone nur mit stabil transfizierter siRNA durchgeführt. Nimmt
man also an, dass stabil transfizierte siRNA1/2 und siRNA3/4 nicht die erwünschte
Wirkung erzielen konnte, siRNA5/6 aber im Gegensatz dazu BMI1 supprimieren
konnte, könnte der beobachtete Wachstumsarrest aus verschiedenen Gründen
verursacht werden. Dies könnte bedeuten, dass durch die Suppression von BMI1
(siRNA5/6) die Zellen apoptotisch bzw. seneszent werden oder das Potential der
neuronalen Stammzelle zur Selbsterneuerung verlieren und Ausdifferenzieren (Cui,
2006). Das würde erklären, warum auf der Platte „siRNA5/6“ im Vergleich zur
Kontrollplatte (pSuper) und den anderen beiden siRNA-Platten (siRNA1/2 und
siRNA3/4) viel weniger Klone zu sehen waren.
Es ist allerdings auch bekannt, dass shRNAs so genannte „off-target Effekte“
hervorrufen können. „Off-target Effekte“ sind unspezifische Antworten der Zelle
(z.B. auch Induktion von Apoptose) nach Einbringen von siRNAs in die Zelle. Diese
Effekte können u.a. durch Induktion einer p53-Antwort oder durch
Interferonstimulation erklärt werden (Pebernard und Iggo, 2004; Fedorov und
Khorova, 2006).
Um zu klären, ob der beobachtete Wachstumsarrest der Neuroblastomzellen bei
BMI1-Reduktion durch Änderung des Zellzyklusprofils zustande kommt, wurde eine
Durchflußzytometrie mit Bmi1-reprimierten Zellen durchgeführt (siehe Kapitel 4.4.6).
80
4.4.3 Reduktion der BMI1 Menge durch RNA-Interferenz in stabilen
Zellklonen
Nach stabiler Transfektion der siRNA1/2 und siRNA5/6 in 1A3-Zellen wurde die
Höhe der Expression von Bmi1 in den jeweiligen siRNA-Klonen mit Hilfe von
Western-Blots überprüft. Es sollte die Höhe der Expression von Bmi1 in den
Ausgangszellen analysiert werden. Dazu wurden von den Zellkulturplatten
Einzelklone gepickt, um dann die jeweiligen Einzellklone hochzuziehen und im
Western-Blot zu analysieren. Als Vergleichswert für die Höhe der Bmi1-Expression,
bzw. für die Reduktion durch die siRNA, wurden Einzelklone mit transfiziertem
pSuper-Leervektor analysiert. Der Unterschied der Höhe der Expression von Bmi1
zwischen den pSuper-Klonen und den siRNA-Klonen, sollte sich durch die Wirkung
der jeweiligen siRNA ergeben.
Abb.11: Western-Blot von 1A3-Zellen: Lässt sich Bmi1 durch stabil transfizierte siRNA reduzieren?
Zellklone: pSuper- und siRNA-Klonen (Antikörper: Bmi1 und Cdk2)
Der Nachweis von Cdk (ca 22kDa) zeigt, dass gleiche Proteinmengen auf das Gel geladen wurden. Die pSuper-Klone (pS, K1-
K3) enthalten den pSuper-Vektor als stabil transfizierten Leervektor und sind zum Vergleich der Bmi-Expression (ca 54kDa) mit
den siRNA-Klonen (diese Zellen enthalten entweder stabil transfizierte siRNA1/2 oder siRNA 5/6) notwendig.
Es ließ sich in den Western-Blots beobachten, dass Unterschiede in der Stärke der
Expression von Bmi1 auftraten. PSuper-K1 und siRNA5/6-K1 enthielten im
Vergleich zu den Klonen pSuperK3 und siRNA5/6K2 viel Bmi1. Die Bmi1-
Expression war bei einigen siRNA-Klonen reduziert (siRNA5/6K2). Es musste aber
auch festgestellt werden, dass die Leervektoren (pSuper) eine sehr unterschiedliche
Menge Bmi1 enthielten (vergleiche pSuperK1 mit pSuperK3). Es konnte somit nicht
eindeutig gesagt werden, dass die Reduktion von Bmi1 beim siRNA5/6 K2 aufgrund
der Wirkung der siRNA zustande kam. Diese Schwankungen der Bmi1-Expression
könnte auch durch individuelle Unterschiede in den verschiedenen Zellen oder durch
methodische Schwierigkeiten aufgetreten sein.
pS pS pS si1/2 si1/2 si1/2 si5/6 si5/6
K1 K2 K3 K1 K2 K3 K1 K2
BMI
CDK
81
Außerdem ließ sich die niedrige Expression von Bmi1 bei den siRNA-Klonen, soweit
es zu einem bestimmten Zeitpunkt vorlag, wenige Wochen später nicht mehr im
Western-Blot reproduzieren.
Erklärungsversuche:
Ist die Bmi1-Proteinmenge tatsächlich in einigen Klonen durch die siRNA
herunterreguliert, so führt das vermutlich zum Wachstumsarrest. Zellen aus einigen
„Bmi-knock-out-Klonen“ könnten die siRNA aus verschiedenen Gründen verlieren
und hätten damit einen erheblichen Wachstumsvorteil gegenüber den restlichen
Zellen dieses Klons. Der „Bmi-knock-out-Klon“ würde von revertierten Zellen
überwachsen werden und würde nach wenigen Passagen in der Zellkultur wieder eine
völlig normale Bmi1-Expression aufweisen. Dieser mögliche Erklärungsversuch
wurde durch eine Beobachtung an einigen siRNA5/6 Klonen gestützt, die ein
besonders langsames Wachstum aufwiesen. Diese Zellen wiesen im Vergleich zu den
pSuper-transfizierten Zellen morphologische Veränderungen auf. V.a. konnte
beobachtet werden, wie die Zellen axonale Fortsätze im Sinne einer
Ausdifferenzierung bildeten. An diesen Klonen konnte man regelrecht beobachten,
wie die sehr langsam wachsenden Zellen (fast im Wachstumsarrest) von einem Punkt
der Zellkulturschale, von sehr schnell wachsenden Zellen verdrängt wurden. Nach
wenigen Tagen zeigte sich eine schnelle Wachstumsgeschwindigkeit des Gesamtklons
(„Bmi-knock-out- Zellen“ von revertierten Zellen überwachsen?). Aufgrund dieser
Beobachtungen und den sich daraus ergebenen Problemen wurde eine neue Strategie
zum Herunterregulieren von BMI1 durch siRNA verfolgt:
4.4.4 Induzierbare Hemmung der BMI1 Expression
Um die negative Selektion von Zellen mit reduzierter Bmi1-Expression zu
verhindern, wurden Zellklone hergestellt, bei denen die Expression der siRNA gegen
BMI1 reversibel durch die Zugabe von Tetrazyklin zum Zellkulturmedium reguliert
werden konnte (TET-on-System).
82
Abb.12:
Model: Induzierbare RNA-Interferenz von BMI1. (modifiziert nach: Brummelkamp und Agami, 2002)
TOR-Zellen sind ein Derivat der humanen Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH-EP, die das 4OHT-abhängige E2F1-ER-
Fusionsprotein sowie den Tet-Repressor von E.coli konstitutiv exprimiert. Die siRNA steht unter Kontrolle des TET-Repressors.
Durch tetrazyklinabhängige Induktion löst sich der TET-Repressor vom TET-O-Promotor und somit kommt es zur Expression
der siRNA.
Um Zellen zu erhalten, die eine siRNA tetrazyklinabhängig exprimieren, müssen zwei
Plasmide stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Das eine Plasmid ist der
Tet-Repressor, der den TET-O-Promotor blockiert. Das zweite Plasmid ist die siRNA,
die unter Kontrolle des TET-O-Promotors steht. Das Plasmid, das für den TET-
Repressor kodiert, kann an unterschiedlichen Stellen in das Genom der Zelle integriert
werden. Es ergeben sich daraus verschiedene Aktivitäten des Repressors. Um
Einzelklone zu identifizieren, die eine gute TET-Regulation zeigen, wurde ein
Luciferase-Plasmid transient in die Klone transfiziert, welches ebenso wie die siRNA
vom TET-Repressor abhängig ist. Theoretisch gibt es für jeden Einzelklon je vier
Möglichkeiten die siRNA zu exprimieren, erkennbar an der Luciferaseaktivität: Ein
guter Klon wäre einer, der ohne Induktion durch Tetrazyclin eine niedrige
Luciferaseaktivität aufweist, jedoch durch die Tetrazyclin-Induktion, eine möglichst
hohe Luciferaseaktivität aufzeigt.
pcDNA
4/TO
Nukleus
Endogenes
BMI1
TET O siRN
A P
Tet-R
E2F1-
ER-
Fusions-
Pr.
Prote
in
Kom
pl.
Tet-R
TET
4oht
TOR-Zelle
83
Die folgende Abbildung eines Reporter-Assays zeigt verschiedene Einzelklone, die
das TET-Repressor-Plasmid stabil transfiziert und zum Austesten ihrer
Repressorqualität transient ein Reporterplasmid enthalten.
Abb.13: Luciferase-Assays: Austestung der TET-Repressor-Klone Gezeigt ist hier eine Auswahl an Klonen (TOR5, 7, 13, 23, 24), jeweils links ohne TET-Induktion (m=minus TET) rechts
daneben jeweils nach 18h TET-Induktion (p=plus TET)
Während z.B. Klon 5 eine hohe Repessoraktivität bereits vor Zugabe von TET zeigte
und auf die Zugabe von TET kaum reagierte, wies Klon 7 eine sehr geringe Aktivität
in Abwesenheit von TET auf und wurde durch die Zugabe von TET etwa 150fach
induziert. Nach den oben genannten Kriterien sind die Klone 7; 13; 24; 27; 37 (einige
dieser Klone sind oben nicht abgebildet) gut für die stabile Transfektion von siRNA
geeignet. Die Klone TOR7 und TOR27 wurden für weitere Arbeiten ausgewählt.
In die Klone TOR7 und TOR27 wurde zusätzlich zum TET-Repressor die siRNA5/6
im pTER-Vektor stabil transfiziert.
Abb.14: Western-Blot: Bmi-1 (ca. 54kDa) lässt sich im TET-on-System runterregulieren.
Auswahl von Klonen, die aus TOR7-Zellen hervorgegangen sind und zusätzlich die siRNA5/6 TET-induzierbar enthalten.
Jeweils links (minus Tet) sind die Klone ohne TET-Induktion zu finden, rechts daneben (plus Tet) sind jeweils die Klone nach
24stündiger TET-Induktion zu finden.
K1 K1+ K2- K2+ K3- K3+ K4- K4+ K5- K5+ minus plus minus plus minus plus minus plus minus plus Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet
BMI1
CDK
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
2 0 0
Luciferaseaktivität
R e i h e 1
T5 T5 T7 T7 T13 T13 T23 T23 T24 T24 minus plus minus plus minus plus minus plus minus plus Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet
84
Klon3 weist ohne TET-Induktion eine hohe Bmi1-Expression auf und erfährt nach
Induktion mit TET eine wesentliche Reduktion des Bmi1-Werts. Dieser Klon ist ein
möglicher Kandidat für die funktionelle Analyse von Zellen mit reduzierter Bmi1-
Expression.
4.4.5 Funktionelle Inaktivierung von Bmi1 durch Expression eines dominant-
negativen Allels
Ein Protein wird dann als dominant-negativ bezeichnet, wenn es zum einen unfähig
ist die Funktionen des Ausgangsproteins zu erfüllen und zusätzlich das endogene
Protein funktionell inhibiert. Dadurch kann ebenfalls ein „loss of function“ in den
Zellen erreicht werden. Für das Bmi-1 wurde in der Literatur ein dominant-negatives
Allel beschrieben, das ein aminoterminalverkürztes Protein kodiert, dem die Ring-
Finger Domäne (RF) fehlt (Itahana und Dimri, 2002). Um das dnBmi in 1A3-Zellen
zu exprimieren, wurde in diesen Zellen zuerst der ekotrope Rezeptor exprimiert.
Anschließend wurden diese Zellen mit einem Retrovirus infiziert, der das delta RF
Allel trägt. Das endogene Bmi1 ließ sich durch Western-Blots zwar nachweisen; das
dominant-negative Allel war aber nicht detektierbar.
Mögliche Gründe hierfür sind:
1.) Der Antikörper konnte das dominant negative Allel doch nicht nachweisen
(inzwischen ausgeschlossen).
2.) Die retrovirale Infektion war zu ineffizient, so dass sie unter der
Nachweisgrenze des Western-Blots lag; wobei auch hierfür wieder zwei
Gründe in Frage kämen:
-die stabile Transfektion mit dem ekotropen Rezeptor war ungenügend
(GFP-Kontrolle zeigte etwa 50%-Transfektionserfolg).
-der retrovirale Überstand und damit die Infektion war nicht optimal
Um die Effizienz in diesem System zu erhöhen, wurde die Strategie geändert:
Ich habe auch für das dominant-negative Allel das TET-on-System verwendet. Durch
das Umklonieren des dominant-negativen Allels vom Bmi1-Ausgangsprotein und die
Verwendung eines induzierbaren Systems sollten drei mögliche Fehler- bzw.
Schwachstellen des stabilen Systems umgangen bzw. ausgeschaltet werden:
85
1.) Durch das Zurückgreifen bei der Klonierung auf das Bmi-∆-RF-
Ausgangsplasmid konnte sichergestellt werden, dass das von dem
verwendeten Antikörper detektierbare Bmi1 kloniert wurde.
2.) Durch das TET-Systems konnte eine Induzierbarkeit der Expression der ∆-
Ring-Finger-Mutante und damit eine erleichterte Detektierbarkeit im Western-
Blot erreicht werden.
3.) Der Zeitpunkt der Expression des Systems konnte von mir gewählt werden.
Dadurch konnten Wachstumsnachteile durch den Verlust von Bmi1 auf kurze
Zeiträume reduziert werden.
Für das induzierbare TET-System mit ∆-Ring-Finger Mutante konnten die gleichen
TET-Klone, wie für die TET-induzierbare-siRNA verwendet werden; also die Klone
TOR7 und TOR27. Das ∆-Ring-Finger Protein wurde ebenfalls stabil in die
jeweiligen Klone transfiziert (die Klonierung der ∆-Ring-Finger-Mutante wurde von
Daniel Fehr im eigenen Labor durchgeführt).
Im Western-Blot lässt sich zum einem das endogene Bmi1 (ca. 54kDa) nachweisen.
Auf der anderen Seite ist auch die ∆-Ring-Finger Mutante (36kDa), der etwa ein
Drittel der Aminosäuren des gesamten Bmi1-Proteins fehlt, durch den Bmi-
Antikörper nachweisbar. Im Western-Blot fällt auf, dass einige der TET-induzierten
Klone auf Höhe der ∆-Ring-Finger Mutante (ungefähr 36kDa) eine Doppelbande
aufweisen (z.B. Klon2), während bei anderen Klonen auf dieser Höhe lediglich eine
Einzelbande vorzufinden ist (z.B. Klon12). Die Ursache für das Auftreten dieser
Doppelbande ist unbekannt.
BMI-1
BMI-∆RF
CDK
K1 K1 K2 K2 K12 K12 K13 K13 minus plus minus plus minus plus minus plus Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet
Abb.15: Western-Blot: Lässt sich die ∆-RF-
Mutante im TET-induzierbaren System
nachweisen?
Antikörper gegen Bmi-1 (ca 54kDa)- und
Cdk(22kDa). Auswahl einiger Klone: Die
verwendeten Klone enthalten als TOR7-
Zellen sowohl das TET-ON-System, als
auch die TET-induzierbare Bmi-∆-RING-
Mutante (36kDa). Im Western-Blot sind
verschiedene ∆-Ring-Finger Klone
nebeneinander aufgetragen.
Links befinden sich jeweils die nicht-induzierten Klone (minus), während die jeweils rechten Klone 16 h mit TET induziert
wurden (plus TET).
86
4.4.6 Die Expression von dnBmi1 in 1A3-Zellen hat keinen Einfluss auf die
Induktion von S-Phase und Apoptose
Um die ∆-RF-Klone funktionell zu analysieren, wurde eine FACS-Analyse von zwei
Klonen (einer mit Doppelbande bei 36kDa, Klon2; der andere mit einer Einzelbande
an dieser Stelle, Klon12) durchgeführt.
Abb. 16: FACS-Analyse des TET-induzierbaren ∆RF-Klon2.
Vier verschiedene Induktionsbedingungen:
1.) ohne Induktion
2.) nach 18stündiger Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen
3.) nach 12stündiger Induktion mit Cycloheximid
4.) nach 18stündiger Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen und 12stündiger Induktion mit Cycloheximid
1. 2.
3. 4.
87
Abb. 17: FACS-Analyse des TET-induzierbaren ∆-RF-Klon12. Vier verschiedene Induktionsbedingungen:
1.) ohne Induktion
2.) nach 18stündiger Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen
3.) nach 12stündiger Induktion mit Cycloheximid
4.) nach 18stündiger Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen und 12stündiger Induktion mit Cycloheximid
In den FACS-Analysen der zwei Klone lässt sich folgendes erkennen:
1.) E2F-1 induziert in den Zellen (plus 4OHT) Apoptose. Außerdem befindet sich in
den E2F-1 induzierten Zellen ein größerer Anteil in der S-Phase, als in der nicht-
induzierten Population.
2.) Durch die alleinige Zugabe von TET zu den Zellen und der damit verbundenen
Aktivierung des dominant-negativen Allels gegen BMI1, ist weder eine Induktion
von Apoptose, noch eine Induktion der S-Phase zu beobachten.
3.) Durch Induktion der Zellen mit 4OHT und TET, ergibt sich das gleiche Bild, wie
im ersten Fall (Induktion nur mit 4OHT). Es befinden sich mehr Zellen in der S-
Phase und begehen Apoptose, als in den nicht induzierten Populationen
Demnach ist Bmi1 weder an der Induktion der S-Phase, noch der Apoptose beteiligt.
1. 2.
3. 4.
88
4.5 HTERT IST KEIN ZIELGEN VON BMI1 IN
NEUROBLASTOMZELLEN
Nach einer gewissen Anzahl von Zellteilungen geht fast jede Zelle in Seneszenz über
oder begeht Apoptose. Dieser Schritt ist einer der kritischen Schritte im Übergang
einer Körperzelle in eine Tumorzelle (Hahn, 1999; Greider, 1999; Elenbass, 2001).
Einer der wichtigsten Ursachen für den Übergang einer Zelle in Seneszenz ist die von
Zellteilung zu Zellteilung voranschreitende Verkürzung der Telomere (Harley, 1990;
Allsop, 1992; Nugent, 1998), als Konsequenz der DNA-Replikation. In Stammzellen
wird hingegen die Länge der Telomere durch das Enzym Telomerase stabilisiert. Eine
aktivierte Telomerase findet man auch in vielen Tumorzellen (Kim, 1994; Shay,
1997; Shay, 2001), während die Telomerase in menschlichen Körperzellen reprimiert
vorliegt. Das Enzym besteht aus zwei Anteilen: zum einem aus einem Ribonuklein-
Protein-Komplex; zum anderen aus einer katalytischen Untereinheit (hTert) mit einem
reverse Transkriptase-Motiv. Die RNA-Komponente wird in den meisten Zellen
exprimiert. hTERT kommt im Gegensatz dazu nur in sehr wenigen Zellen vor (Kim,
1994; Shay, 1998). In Zellen, in denen hTERT exprimiert wird, werden die Telomere
auch nach mehreren Zellteilungen noch in der ursprünglichen Länge vorgefunden.
Nach neueren Vorstellungen wird hTERT aber nicht generell in menschlichen
Körperzellen reprimiert, sondern wird vielmehr zellzyklusabhängig reguliert.
In einigen Brustkrebszelllinien wird Bmi1 überexprimiert vorgefunden; Bmi1
verlängert die Überlebenszeit von Brustepithelzellen (MECs) und Bmi1 induziert die
Aktivität von Telomerase in MECs (Dimri, 2002). In humanen Fibroblasten konnte
keine Induktion der Telomerase durch Bmi1 nachgewiesen werden. Die Induktion der
Telomerase durch Bmi1 scheint ein zelltypabhängiger Mechanismus zu sein (Dimri,
2002).
Um den Einfluss von Bmi1 auf hTERT in Neuroblastomen zu untersuchen, wurde
die Expression von hTERT nach Stimulation der 1A3-Zellen mit 4-OHT (Induktion
von Bmi1) durch Echtzeitgerät-PCR dargestellt. Würde Bmi1 hTERT induzieren, so
würde ich in der Induktionskinetik in der Echtzeit-PCR absinkende CT-Werte
erwarten.
89
Das Expressionslevel von hTERT sinkt durch längere Induktionszeiten der Zellen mit
4OHT und damit der Induktion von E2F1 und BMI1. Die Expression von Bmi1 führt
im transienten Versuchsansatz in Neuroblastomzellen nicht zu einer Induktion von
hTERT.
4.5.1 Die Dereprimierung von Rb führt nicht zur Induktion von E2F1 bzw.
Bmi1 in MEFs
Die Regulation von pRb erfolgt vor allem über seinen Phosphorylierungsstatus;
Hypophosphoryliertes pRb assoziiert mit E2F1, E2F2 und E2F3 und wirkt als
transkriptioneller Ko-Repressor, der die Expression von E2F-regulierten Genen
inhibiert. Die Phosphorylierung von pRb führt zur Dissoziation des pRb von E2F und
in der Folge zur Aktivierung E2F-regulierter Gene, die den Eintritt der Zellen in die
S-Phase des Zellzyklus bewirken (Leone, 2000; Claudio, 2002; Trimarchi und Lees,
2002). Ein Mechanismus, der zur Inaktivierung des pRb in Neuroblastomen führt,
stellt eine direkte Verbindung zwischen N-Myc und dem pRB/E2F- Kontrollpunkt
her. Nach diesem Modell aktiviert N-Myc direkt die Expression via ID2 (Lasorella
und Iavarone, 2002). Das entsprechende ID2-Protein bindet an pRb und sequestriert
dieses in inaktiven Komplexen. Dadurch geht die negative Kontrolle von Rb auf E2F
verloren (Lasorella und Iavarone, 2002 und 2005).
Da RB E2F1 in vielen Zellen reprimiert, und wir durch unsere eigenen Arbeiten
wissen, dass E2F1 BMI1 induziert, würden wir in Rb-/- MEFs erwarten, dass BMI1
als E2F1 Zielgen dereprimiert wird. Um diesen Zusammenhang darzustellen, wurde
BMI1 in RB-/- im Vergleich zu RB+/+ MEFs (RNA mit freundlicher Unterstützung
Abb.18: Quantitative RT-PCR im
Echtzeitgerät: HTERT-Kinetik nach
Bmi1 Induktion.
Auf der y-Achse sind die CT-Werte
aufgetragen. Alle Werte sind auf die
entsprechenden s-14-Werte
normalisiert. Die Induktion der Zellen
wurde mit 1µg/ml 4-Hydroxytamoxifen
für die auf der X-Achse angegebenen
Zeiten durchgeführt (0h,1h,4h,8h,12h,).
h T E R T K in e t ik
0
0 ,5
1
1 ,5
2
2 ,5
3
3 ,5
4
0 h 1 h 4 h 8 h 1 2 h
delta CT-W
ert
ç
90
der Arbeitsgruppe Gaubartz; eigenes Labor, zur Verfügung gestellt) durch
quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät untersucht:
Der RT-PCR kann entnommen werden, dass sich das BMI1-Level in RB-knock-out
MEFs sich nicht wesentlich vom BMI1-Level in RB+/+MEFs unterscheidet. Eine
mögliche Erklärung hierfür wäre, dass die Dereprimierung von RB in MEFs nicht zur
Induktion von E2F1 und damit von BMI1 führt. Um abschließend die Frage zu klären
wären MEFs nötig, die auch defizient für andere Pocketproteine sind, welche
teilweise redundant mit Rb sind.
Abb.19: Quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät zur
Untersuchung der Expression von BMI-1 in RB-knock-
out MEFs. Die ct-Werte (keine ∆-ct Werte) wurden auf
die entsprechenden s14-Werte normiert.
B M I i n R B - k n o c k - o u t M E F s
2 0
2 1
2 2
2 3
2 4
2 5
2 6
2 7
2 8
2 9
3 0
R B M E F s R B - / - M E F S
CT-W
erteBMI-1
R e ih e 1
91
5 Diskussion
5.1 E2F1 INDUZIERT BMI1 DURCH BINDUNG AN DIE E2F1
BINDUNGSSTELLE IM BMI1-PROMOTOR
Bmi1 spielt in der Embryonalentwicklung, in Stammzellen und bei der Entstehung
von Tumoren eine wichtige Rolle. Es ist deshalb umso erstaunlicher, dass über die
Regulation von Bmi1 in Neuroblastomen bisher sehr wenig bekannt ist. In dieser
Arbeit habe ich zunächst die Regulation von Bmi1 durch E2F1 untersucht. Durch
Vorarbeiten von Verena Strieder und Christoph Kramps war bekannt, dass BMI1 auf
DNA-Ebene Zielgen von E2F1 ist. Mit den 1A3-Zellen stand ein Zellsystem zur
Verfügung, in dem zu jedem beliebigen Zeitpunkt E2F1 überexprimiert werden
konnte. Durch einen Western-Blot mit Zelllysaten aus 1A3-Zellen mit bzw. ohne 4-
Hydroxytamoxifen-Induktion konnte ich zeigen, dass E2F1 Bmi1 auf Proteinebene
induziert. Durch Blockierung der Proteinbiosynthese durch Cycloheximid konnte ich
in 1A3-Zellen mit einen Western-Blot und einen Luciferaseassay nachweisen, dass
E2F1 Bmi1 auf direktem Weg stimuliert.
Um zu untersuchen, ob die E2F1 Bindungsstelle im Bmi1-Promotor verantwortlich
für die Überexpression von Bmi1 nach E2F1-Stimulus ist, habe ich die E2F1-
Bindungsstelle im Bmi1-Promotor punktmutiert. Das Ergebnis dieser Reporterstudien
ist, dass die E2F-Bindungsstelle im Bmi1-Promotor verantwortlich für die Induktion
von Bmi1 nach E2F1 Stimulus ist. Die Überexpression von E2F1 in
Neuroblastomzellen führt zur Induktion von Bmi1 (Nowak, 2006).
5.2 BEDEUTUNG VON BMI1 IN DER TUMORGENESE
BMI1 scheint kein klassisches E2F1 Zielgen zu sein, denn BMI1 wird in vielen
Tumoren nicht zellzyklusabhängig beeinflusst.
Die Induktion von BMI1 durch E2F1 ist an die Deregulation von E2F geknüpft, so
wie es auch bei anderen E2F-Zielgenen (z.B. ARF) beobachtet wird (Aslanian, 2004).
92
Überexprimiertes Bmi1 kann in einer Vielzahl von Tumoren gefunden werden
(Molofsky, 2003; Kim, 2004; Bea, 2001; Vonlanthen, 2001; De Vos, 2002). In
doppel-transgenen Mäusen mit Lymphomen kann eine Kooperation zwischen Bmi1
und Myc gezeigt werden. Bmi1 reprimiert hier die durch Myc-induzierte Apoptose
(Jacobs, 1999). In Neuroblastomen induziert N-Myc durch verschiedene Stimuli die
Apoptose (Lutz, 1998; Fulda, 1999). In Analogie zu der Rolle in Lymphomen wäre
auch in Neuroblastomen eine durch Bmi1 blockierte N-Myc-induzierte Apoptose,
vorstellbar. So wäre die Deregulierung von E2F1 im Hinblick auf seine beiden
direkten Zielgene BMI1 und MYCN in doppelter Hinsicht fatal. Bei der Aktivierung
würden sich zwei positiv verstärkende Aktivierungsschleifen bilden: Zum einem
induziert E2F1 nicht nur MYCN, sondern MYCN ist auch in der Lage E2F1 zu
aktivieren (Leone, 2001; Beier, 2000). Zweitens: BMI1 reprimiert INK4a und
induziert auf diesem Weg die Phosphorylierung vom Retinoblastoma-Protein und die
Aktivierung von E2F (Jacobs, 1999). Im Gegensatz zum PRC2-Komplex (zweiter
Polycomb-Komplex), in dem mehrere Untereinheiten durch E2F1 induzierbar sind,
scheint Bmi1 der einzige Teil des PRC1-Komplexes zu sein (erstes Polycomb-
Komplex), der durch E2F1 reguliert wird. Weder Mel18, noch Hpc2 oder Ring1
werden durch E2F induziert.
Das Verhältnis von Bmi1 zu Hpc2 hat wesentliche Auswirkung auf die biochemische
und biologische Funktion des Komplexes (Dahiya, 2001). Nach diesem Model würde
ein Bmi1-dominanter Komplex Ink4a reprimieren, während das Überwiegen von
Hpc2 im Komplex zum Zellarrest durch Repression von E2F-Zielgenen führen würde.
Nach diesem Model würde also die selektive Induktion von Bmi1 durch E2F1 in
diesem Komplex zu einer Proliferation der Zellen führen.
Bmi1 ist sowohl für die Proliferation und die Selbsterneuerung von erwachsenen
hämatopoetischen und neuronalen Stammzellen (Lessard und Sauvageau, 2003; Park
und Clarke, 2003; Molofsky und Morrison, 2003; Iwama, 2004; Leung, 2004; Zencak,
2005), als auch für die Proliferation von Tumorstammzellen notwendig (Valk-
Lingbeek und van Lohuizen, 2004). Die Deletion von Ink4a oder Arf in Bmi-/-
Mäusen führt zum Wiedereintreten der, durch das Fehlen von Bmi1 blockierten
Erneuerung von neuronalen Stammzellen (Molofsky und Pardee, 2005).
Welche Aufgabe hat die Induktion von Bmi1 durch E2F1 in Neuroblastomen auf die
Zellzyklusregulation?
Um diese Frage beantworten zu können, habe ich zwei Versuchsansätze gewählt.
93
Zum einen habe ich die Reprimierung von BMI1 durch siRNA erreicht. Zunächst
wurde die siRNA stabil in 1A3-Zellen transfiziert. Dieser Ansatz war aufgrund von
einem Wachstumsarrest der Zellen für die weitere funktionelle Analyse von Bmi1
nicht geeignet. Weiterhin konnte ich beobachten, dass in den Zellen, in denen Bmi1
reprimiert vorlag, auch morphologische Veränderungen auftraten. Diese Zellen
zeigten eine Verschmälerung der Zellkörper, sowie eine Ausbildung von axonalen
Ausläufern. Aufgrund des Wachstumsarrests und der damit verbundenen Probleme
für die weitere funktionelle Analyse der Klone, habe ich die siRNA gegen BMI1
tetrazyklininduzierbar in die 1A3-Zellen eingebracht. Im anschließend durchgeführten
Western-Blot konnte eine deutliche Reduktion der Expression von Bmi1 in siRNA-
Klonen im Vergleich zu nicht-induzierten Klonen, beobachtet werden.
Der zweite Ansatz zur Repression von Bmi1 ergab sich durch ein dominant-negatives
Allel gegen Bmi1. Auch in diesem System wiesen die Zellen nach stabiler retroviraler
Infektion mit dem dominant-negativen Allel einen Wachstumsarrest auf, so dass auch
dieses Zellsystem, TET-induzierbar dargestellt wurde. Zwei unterschiedliche
dominant-negative Bmi1-Klone habe ich in der Durchflußzytometrie unter jeweils
vier verschiedenen Induktionsbedingungen analysiert (1. keine Induktion; 2.
Induktion mit 4OHT; 3. Induktion mit TET; 4. Induktion mit 4OHT und TET). Die
Durchflußzytometrie zeigte, dass die Zellen, in denen E2F1 durch 4OHT induziert
wurde, sowohl vermehrt S-Phase, als auch vermehrt Apoptose aufwiesen. In Zellen,
in denen Bmi1 reprimiert vorlag, zeigten die Zellen weder eine Veränderung des
Anteils der Zellen in S-Phase, noch der Zellen, die Apoptose begingen. In den Zellen,
in denen sowohl E2F1 überexprimiert, als auch Bmi1 reprimiert vorlagen, konnten
lediglich die Effekte auf das Zellzyklusprofil beobachtet werden, die auch bei
alleiniger Induktion von E2F1 gesehen werden konnten: Induktion von S-Phase und
Apoptose. Die Repression von Bmi1 hat nach den Ergebnissen der FACS-Analyse
also weder einen Einfluss auf die S-Phase noch auf die Apoptose.
Cui und Mitarbeiter (2006) stellen in Neuroblastomzellen (BE(2)-C-Zellen) bei
Repression von Bmi1 ebenfalls einen Wachstumsarrest fest. Diese Arbeitsgruppe
sieht, genau wie auch in meinen Experimenten gezeigt, keinen Einfluss der Bmi1-
Reprimierung auf das Zellzyklusprofil. Den beobachteten Wachstumarrest wird
durch den Verlust des Potentials der neurologischen Stammzelle zur Selbsterneuerung
begründet (Cui, 2006). In diesem Potential der Stammzelle zur Selbsterneuerung wird
94
ein wesentlicher Grund der Neuroblastomzelle zur malignen Entartung gesehen (Cui,
2006).
Die in der Einleitung diskutierten Modelle zum Einfluss von E2F1 reguliertem Bmi1
auf die Induktion von S-Phase und Apoptose sind also wie folgt zu beurteilen:
Abb.20: Modell 1: Funktion von Bmi1 im Zellzyklus
E2F1 induziert Bmi1. Bmi1 hat aber weder Einfluss auf die Induktion von S-Phase noch auf die Induktion der Apoptose. Die
genaue Funktion von Bmi1 in der Zellzyklusregulation bleibt zunächst weiterhin offen.
Das zweite Modell zeigt einerseits die nachgewiesene Induktion von S-Phase und
Apoptose durch E2F1, aber auch, dass Bmi1 keinen Einfluss auf diese Effekte hat.
Die Aufgaben die Bmi1 im Zellzyklus hat, bleiben damit zunächst ungeklärt.
Abb. 21: Modell 2: Funktion von Bmi-1 im Zellzyklus
E2F1 induziert Apoptose und S-Phase. E2F1 induziert Bmi. Bmi1 scheint aber an der Vermittlung von Apoptose und S-Phase-
Induktion durch E2F1 keinen Anteil zu haben.
Sowohl Model 1 (Abb. 20), als auch Model 2 (Abb.21) zeigen, dass E2F1 Bmi1
induziert. E2F1 induziert dabei sowohl S-Phase, als auch Apoptose. Die Ergebnisse
meiner Arbeit geben einen Hinweis, dass die Reprimierung von Bmi1 zum
Wachstumsarrest führt und offensichtlich keinen Einfluss auf das Zellzyklusprofil, im
speziellen nicht auf S-Phase und Apoptose, hat. Eine mögliche Erklärung des
E2F1
Apoptose
S-Phase Bmi1
??? Potential zur Selbsterneuerung d.
Stammzelle???
Apoptose
S-Phase
Bmi1
E2F1
???Potential zur
Selbsterneuerung d.
Stammzelle???
95
beobachteten Wachstumsarrests bei Bmi1-Reprimierung wäre ein Verlust des
Potentials der Neuroblastomzellen zur Selbsterneuerung (Cui, 2006).
Sowohl das siRNA- als auch das ∆-Ring-Finger-System wiesen allerdings ein
Problem auf: Bei der Austestung der siRNA-Klone im Western-Blot konnte zwar
gezeigt werden, dass nach der Induktion durch Tetracyclin die Bmi1-Proteinmenge in
den entsprechenden Zellen im Vergleich zu den nicht induzierten Zellen drastisch
absank, es musste aber auch festgestellt werden, dass eine Restaktivität an Bmi1
blieb. Da es nicht bekannt ist, welche Menge an Bmi1 in der Zelle notwendig ist, um
die entsprechenden Zielgene von Bmi1 zu induzieren, kann die Frage nicht
abschließend geklärt werden, ob die Reprimierung von Bmi1 doch Auswirkungen auf
den Zellzyklus hat.
Ein ähnliches Problem stellte sich auch in den ∆-Ring-Finger Klonen dar; auch in
diesem System ließ sich eine Überexpression der ∆-RF-Mutante nach
4Hydroxytamoxifen-Stimulus beobachten. Es ließ sich durch den Bmi1 Western-Blot
nur zeigen, dass das dominant negative Allel, in unserem Fall die Bmi1-∆-RF-
Mutante, exprimiert wurde. Es konnte aber nicht nachgewiesen werden, dass die
Funktion vom endogenen Bmi1 reprimiert wurde. Die Wirkung der ∆-RF-Mutante
zeigte sich erst auf der Stufe der Zielgene, in unserem Fall der Bmi1-Zielgene. Es ist
bekannt, dass Bmi1 p16 reprimiert. Würde die ∆-RF-Mutante eine reprimierende
Wirkung auf die Bmi1-Zielgene, wie z.B. p16 haben, dann müsste p16 in den
Tetrazyclin induzierten (Bmi-reprimierten) Zellen dereprimiert vorliegen.
Die Wirkung der ∆-RF-Mutante auf die Zielgene wurde im eigenen Labor anhand
eines p16-Western-Blot mit Zelllysaten von induzierten bzw. nicht induzierten ∆-RF-
Klonen dargestellt. Wie erwartet zeigte sich in den Tetrazyclin-induzierten Zellen
eine Derepression von p16 (Daten aus eigenem Labor). Durch diesen p16-Western-
Blot konnte gezeigt werden, dass die Expression der ∆-RF-Mutante in den
entsprechenden Klonen ausreichte, um Zielgene von Bmi1 zu beeinflussen. Ob eine
vollständige Derepression von p16 erreicht wurde, konnte durch den Western-Blot
nicht gesagt werden. Es kann also auch in diesem Fall nicht sicher gesagt werden, ob
die ∆-RF-Mutante die Wirkung des endogene Bmi1 auf die Zielgene so effektiv
reduzieren kann, dass das endogene Bmi1 faktisch „ausgeschaltet“ wird.
Trotz dieser Unsicherheit bekamen wir zumindest durch diese Versuche einen
Hinweis, dass Bmi1 zwar wahrscheinlich keinen Einfluss auf den Zellzyklus, vor
96
allen nicht auf die Induktion von Apoptose oder S-Phase hat. Durch die gezeigten
Ergebnisse und den oben genannten Verbindungen zu anderen Onkogenen, steht
Bmi1 weiterhin im Verdacht, das Potential zur Selbsterneuerung der neurogenen
Stammzelle aufrechtzuerhalten und damit einen wesentlichen Anteil an der
Entstehung von Neuroblastomen zu haben.
Zur genaueren Untersuchung der Wirkung von Bmi1 wird es nötig sein, mittels eines
cDNA-Microarrays die Genexpressionsänderung zu identifizieren, die aus der
Inaktivierung von Bmi1 resultieren. Dabei werden vier verschiedene
Induktionsbedingungen der Zellen im Microarray untersucht:
1.) nicht induzierte Zellen
2.) Zellen mit überexpremierten E2F1
3.) Zellen mit reprimierten Bmi1
4.) Zellen mit überexpremiertem E2F1 und reprimiertem Bmi1
97
6 Literaturliste
Akasaka, T.; Kanno, M.; Balling, R.; Miesa, M.A.; Taniguchi, M.; Koseki, H. (1996). A role for MEL18, a Polycomb group-related vertebrate gene, during the anteroposterior specification of the axial skeleton. Development 122 (1996), 1513-1522. Akasaka, T.; Tsuji, K.-I.; Kawahira, H.; Kanno, M.; Harigaya, K.-I.; Hu, L.; Ebihara, Y.; Nakahata, T.; Tetsu, O.; Taniguchi, M.; Koseki, H.; The role of MEL18, a mammalian Polycomb group gene, during IL-7 dependent proliferation of lymphocyte precursors. Immunity 7 (1997), 135-146. Akasaka, T.; van Lohuizen, M.; van der Lugt, N.; Mizutani-Koseki, Y.; Kanno, M.; Taniguchi, M.; Vidal, M.; Alkema, M.; Berns, A.; Koseki, H. (2001). Mice doubly deficient for the Polycomb Group genes MEL18 and BMI-1 reveal synergy and requirement for maintenance but not initiation of HOX gene expression. Development 128, 1587-1597. Alkema, M.J.; Jacobs, H.; van Lohuizen, M.; Berns, A. (1997). Pertubation of B and T cell development and predisposition to lymphogenesis in EuBmi transgenic mice require the Bmi1 RINGfinger. Oncogene 15 (1997), 899-910. Alkema, M.J.; Bronk, M.; Verhoeven, E.; Otte, A.; van Veer, L.J.; Berns, A.; van Lohuizen, M.; (1997). Identification of Bmi1-interacting proteins as constitutents of a multimeric mammalian Polycomb complex. Genes Dev., 11, 226-240. Allsop, R.C.; Vaziri, H.; Patterson, C.; Goldstein, S.; Younglai, E.V.; Futcher, A.B.; Greider, C.W.; Harley, C.B. (1992). Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 89: 10114- 10118, 1992. Ambros, I.M.; Zellner, A.; Roald, B.; Amann, G.; Ladenstein, R.; Printz, D.; Gadner, H.; Ambros, P.F.; (1996). Role of ploidy, chromosome 1p, and Schwann cells in the maturation of neuroblastoma. N. Engl. J. Med. 334: 1505-1511, 1996. Antonchuk, J. ; Sauvageau, G. ; Humphries, R.K. ; (2002). Hox4B-induced expansion of adult hematopoietic stem cells ex vivo. Cell 109, 39-45 Aslanian, A.; Iaquinta, P.J.; Verona, R.; Lees, J.A. (2004). Repression of the Arf tumor suppressor by E2F3 is required for normal cell cycle kinetics. Genes Dev. 2004 Jun 15; 18(12):1413-22. Atchinson, L.; Ghias, A.; Wilkinson, F.; Bonini, N.; Atchinson, M.L.; (2003). Transcription factor YY1 functions as a PcG protein in vivo. Embo J 22, 1347-1358 Attwooll, C.; Lazzerini, D.E.; Helin, K. The E2F family: specific functions and overlapping interests. EMBO J. 2004, Dec. 8:23 (24): 4709-16. Bader, S.A.; Fasching, C.; Brodeur, G.M.; Stanbridge, E.J.; (1991). Dissociation of suppression of tumorgeneticity and differentiation in vitro effected by transfer of
98
single human chromosome into human neuroblastoma cells. Cell Growth Differ.:2; 245-255. Balciunaite, E.; Spektor, A.; Lents, N.H.; Cam, H.; Te Riele, H.; Scime, A.; Rudnicki, M.A.; Young, R.; Dynlacht; B.D. (2005). Pocket protein complexes are recruited to distinct targets in quiescent and proliferating cells. Mol. Cell Biol. 2205 Sep.; 25(18): 8166-78. Bargou, R.C.; Wagener, C.; Bommert, K.; Arnold, W.; Daniel, P.T.; Mapara, M.Y.; Grinstein, E.; Royer, H.D.; Dorken, B. (1996). Blocking the transcription factor E2F/DP by dominant-negative mutants in a normal breast epithelial cell line efficiently inhibits apoptosis and induces tumor growth in SCID mice. J. Exp. Med. 1996 Mar. 1; 183(3):1205-13. Bayreuther, K.; Rodemann, H.P.; Hommel, R.; Dittmann, Albiez, M.; Francz, P.I.; (1988). Human skin fibroblasts in vitro differentiate along a terminal cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5112-5116. Bea, S.; Tort, F.; Pinyol, M.; Puig, X.; Hernandez, L.; Hernandez, S.; Fernandez, P.L.; van Lohuizen, M.; Colomer, D.; Campo, E.; (2001). BMI-1 gene amplification and overexpression in hematological malignancies occur mainly in mantle cell lymphomas. Cancer Res., 61, 2409-2412. Beckwith, J.; Perrin, E.; (1963). In situ neuroblastoma: A contribution to the natural history of neural crest tumors. Am. J. Pathol. 43: 1089-1104 Beier, R.; Burgin, A.; Kiermaier, A.; Fero, M.; Karsunsky, H.; Saffrich, R.; Moroy, T.; Ansorge, W.; Roberts, J.; Eilers, M.; (2000). Induction of cyclin e-cdk2 kinase activity, E2F-dependent transcription and cell growth by Myc are genetically separable events. EMBO J.; 19, 5813-5823. Beisel, C.; Imhof, A.; Greene, J.; Kremmer, E.; Sauer, F. (2002). Histone methylation by the drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash1. Nature 419, 857-862. Berthold, F.; Kassenböhmer, R.; Zischnag, J.; (1994). Multivariate evaluation of prognostic factors in localized neuroblastoma. Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 1994 May; 16(2):107-15. Berwanger, B.; Hartmann, O.; Bergmann, S.; Nielsen, D.; Krause, M.; Kartal, A.; Flynn, D.; Wiedemeyer, R.; Schwab, M.; Schafer, H.; Christiansen, H.; Eilers, M. (2002). Loss of a Fyn-regulated differentiation and growth arrest pathway in advanced stage neuroblastoma. Cancer Cell. 2002 Nov; 2(5):377-86. Blake, M.C.; Azizkhan, J.C.; (1989). Transcription factor E2F is required for efficient expression of the hamster dihydrofolate gene in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 1989 Nov., 9(11):4994-5002. Bourdeaut, F.; Trochet, D.; Janoueix-Lerosev, I.; Ribeiro, A.; Deville, D.; Coz, C; Michiels, J-F.; ; Lyonnet, S.; Amiel, J.; Delattre, O. Germline mutations of the
99
paired-like homeobox 2B (PHOX2B) gene in neuroblastoma. Cancer Lett. 2005 Oct. 228:51-8 Bond, J.A.; Wyllie, F.S.; Wynford-Thomas, D. (1994). Escape from senscence in human diploid fibroblasts induced directly by mutant p53 . Oncogene 9: 1885-1889. Braden, W.A; Lenihau, J.M.; Lan, Z.; Luce, K.S.; Zagorski, W.; Bosco, E.; Reed, M.F.; Cook, J.G.; Knudsen, E.S.; Distinct action of retinoblastoma action on the DNA replication defines specific roles for cyclin dependent kinases complexes in prereplication complex assembly and s-phase progression. Mol. Cell. Biol., 2006 Oct. 26 (20); 7667-81 Bracken, A.P.; Pasini, D.; Capra, M.; Prosperini, E.; Colli, E.; Helin, K.; (2003). EZH2 is downstream of the pRB-E2F pathway, essential for proliferation and amplified in cancer. EMBO J 22., 5323-5335. Bracken, A.P.; Ciro, M.; Cocito, A.; Helin, K.; (2004). E2F target genes: unraveling the biology. Trends Biochem. Sci., 29, 409-417. Bracken, A.P.; Helin, K.; (2006). Genome-wide mapping of polycomb target genes unravels their roles in cell fate transitions. Genes and development, 2006 May 1; 20(9): 1123-36. Breiling, A.; Bonte, E.; Ferrari, S.; Becker, P.B.; Paro, R.; (1999). The Drosophila polycomb protein interacts with nucleosomal core particles in vitro via its repression domain. Mol Cell Biol 19, 8451-8460. Breiling, A.; Turner, B.M.; Bianchi, M.E.; Orlando, V.; (2001). General transcription factors bind promotors repressed by Polycomb group proteins, Nature 2001, 412: 651-655. Brinkschmidt, C.; Christiansen, H.; Terpe, H.J.; (1997). Comparative genomic hybridization (CGH) analysis of neuroblastomas: An important methological approach in paediatric tumour pathology. J. Pathol. 181:394.400. Brock, H.W. ; van Lohuizen, M. ; (2001). The Polycomb group - no longer an exclusive club ? Curr Opin Genet Dev, 2001 Apr, 11(2) : 175-81. Brodeur, G.M.; Sekhorn, G.; Goldstein, M.N.; (1977). Chromosomal abberations in human neuroblastoma (1977), Cancer, 1977, Nov. 40(5), 2256-63. Brodeur; G.M.; Prichard, J.; Berthold, F.; Carlsen, N.I.; Castel, V.;Castelberry, R.P.; De Bernardi, B.; Evans, A.E.; Favrot, M.; Hedborg, F.; (1993). Revision of the international criteria for neuroblastoma diagnosis, staging and response to treatment. J.Clin.Oncol. 11: 1466-1477 Brodeur, G.M.; (1994). Molecular pathology of human neuroblastomas. Semin. Diagn. Pathol.11: 118-125
100
Brodeur, G.M.; (2003). Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma. Nat. Rev. Cancer. 2003 Mar; (3): 203-16. Brough, D.E.; Hoffmann, T.J.; Elwood, K.B.; Townley, R.A.; Cole, M.D.; (1995). An essential domain of the C-Myc protein interacts with a nuclear factor that is also required for E1a-mediated transformation. Mol. Cell. Biol.1995 Mar. 15 (3): 1536-44. Bruggemann, S.W.M.; van Lohuizen, M.; (2005). Ink4a and Arf differentially affect cell proliferation and neural stem cell self-renewal in Bmi-1-deficient mice. Genes and development 19: 1438-1443, 2005. Brummelkamp, T.R.; Bernards, R.; Agami, R.; (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science, 296, 550-553 Cam, H.; Dynlacht, B.D.; (2003). Emerging roles for E2F: beyond the G1/S transition and DNA replication. Cancer Cell, 3, 311-316. Campanero, M.R.; Flemington, E.; (1999). Distinct cellular factors regulate the c-myc promoter through its E2F element. Molecular and cellular biology, Dec. 1999, Vol. 19, p. 8442-8450. Campisi, J.; 1996. Replicative senescence: an old lives tale? Cell 84:497-500. Campisi, J.; 1997. Aging and cancer: the double-edged sword of replicative senescence. J. Am. Geriatrics Soc. 45:1-6. Cao, R.; Wang, L.; Wang, H.; Xia, L.; Erdjument-Bromage, H.; Tempst, P.; Jones, R.S.; Zhang, Y. (2002); Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing. Science 298, 1039-1043, 2002. Caron, H.; van Sluis, P.; van Hoeve, M.; (1993). Allelic loss of chromosome 1p36 in neuroblastoma is of preferential maternal origin and correlates with NMYC amplification. Nat.Genet.4: 187-190. Cartwright, P.; Müller, H.; Wagener, C.; Holm, K.; Helin, K.; (1998). E2F-6: a novel member of the E2F family is an inhibitor of the E2F-dependent transcription. Oncogene 17: 611-624. Castleberry, R. (1997). Neuroblastoma, Eur.J.Cancer; 1997, Aug.:33(9); 1430-7. Chen, Q.M.; Bartholomew, J.C.; Campisi, J.; Acosta, M.; Reagan, J.D.; Amen, B.N. (1998). Molecular analysis of H2O2-induced senescent-like growth arrest in normal human fibroblasts: p53 and Rb control G1 arrest but not cell replication. Biochem.J. 332, 43-50. Cheng, T.; Rodrigues, N.; Shen, H.; Yang, Y.; Dombkowski, D.; Stier, S.; Scadden, D.T. (2000). Hematopoietic stem cell quiescence maintained by p21cip1/waf1. Science 287, 1804-1808.
101
Christiansen, H.; Schestag, J.; Christiansen, N.M.; Grzeschik, K.H.; Lampert, F.; (1992). Clinical impact of chromosome 1 aberation in neuroblastoma: a metaphase and interphase cytogenetic study. Genes Chromosomes Cancer 5: 141-149. Claudio, P.P.; Tonini, T.; Giordano, A.; (2002). The retinoblastoma family: twins or distant cousins? Genome Biol., 2002 Aug. 28; 3(9). Cobrinik, D.; (2005). Pocket proteins and cells cycle control. Oncogene 2005, Apr. 18; 24 (17):2796-809. Cohen, K.J.; Hanna, J.S.; Presott, J.E.; Dang, C.V.; (1996). Transformation by the Bmi-1 oncoprotein correlates with its subnuclear localization but not its transcriptional suppression activity. Mol. Cell. Biol. 16 (1996), 5527-5535. Core, N. ; Bel, S. ; Gaunt, S.J. ; Aurrand-Lions, M. ; Fisher, A. ; Djabali, M. ; (1997). Altered cellular proliferation and mesoderm patterning in Polycomb-M33-deficient mice. Development 124 : 721-729. Cui, H. ; Ma, J. ; Ding, J. ; Li, T. ; Alam, G. ; Ding, H.-F. ; (2006). Bmi-1 regulates the differentiation and clonogenic self-renewal of I-type neuroblastoma cells in concentration-dependent manner. Journal of biological chemistry. Vol 281, N 45, Nov. 10, 2006. Czermin, B.; Melfi, R.; McCabe, D.; Seitz, V.; Imhof, A.; Pirotta, V.; (2002). Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell 111, 185-196 D´Adda di Fagagna, F.; Reaper, P.M.; Clay-Farrace, F.; Fiegler, H.; Carr, P.; von Zglinicki, T.; Saretzki, G.; Carter, N.P.; Jackson, S.P.; (2003). A DNA damage checkpoint response in telomere initiated senesence. Nature 426, 194-198. Dahiya, A.; Wong, S.; Gonzalo, S.; Gavin, M.; Dean, D.C.; (2001). Linking the Rb and polycomb pathways. Mol. Cell; 8, 557-569. DeGregori, J.; Leone, G.; Ohtani, K.; Miron, A.; Nevins, J.R.; (1995). E2F-1 accumulation bypasses a G1 arrest resulting from the inhibition of G1 cyclin dependent kinase activity. Genes Dev.9: 2873-2887 DeGregori, J.; (2002). The genetics of the E2F family of transcription factors: shared functions and unique roles. Biochemin Biophys Acta1602, 131-150 De Vos, J.; Thykjaer, T.; Tarte, T.; Ensslen, M.; Raynaud, P.; Requirand, G.; Pellet, F.; Pantesco, V.; Reme, T.; Jourdan, M.; (2002). Comparison of gene expression profiling between malignant and normal plasma cells with oligonucleotid arrays. Oncogene, 21, 6848-6857. Dimova, D.K.; Dyson, N.J. (2005). The E2F transcriptional network: old acquaintances with new faces. Oncogene 2005 Apr. 18; 24 (17):2810-26. Dimri, G.P.; Campisi, J. (1994). Molecular and cell biology of replicative senescence. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 59: 67-73.
102
Dimri, G.P.; Acosta, M.; Campisi, J.; (2000). Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F-1 transcription factor and p14/ARF tumor suppressor. Molecular and cellular biology, Jan. 2000, p. 273-285. Dimri, G.P.; Martinez, J.L.; Jacobs, J.J.; Keblusek, P.; Itahana, K.; van Lohuizen, M.; Campisi, J.; Wazer, D.E.; Band, V. (2002). The BMI-1 oncogene induces telomerase activity and immortalizes human mammary epithelial cells. Cancer Res 62, 4736-4745 Di Stefano, L.; Jensen, M.R.; Helin, K.; (2003). E2F7, a novel E2F featuring DP-independent repression of a subset of E2F-regulated genes. EMBO J.; 2003 Dec. 1; 22 (23): 6289-98. Dyson, N.; (1998). The regulation of E2F by pRb-family proteins. Genes Dev. 1998 Aug 1 12: 2245-2262. El-Deiry, W.S.; Tokino, T.; Velculesco, V.E.; Levy, D.B.; Parsons, R.; Trent, J.M.; Lin, D.; Mercer, W.E.; Kinzler, K.W.; Vogelstein, B.; (1993). Waf1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 1993 Nov.19; 75(4): 817-25. El-Deiry, W.S.; Kern, S.E.; Pietenpol, J.A.; Kinzler, K.W.; Vogelstein, B. (1992). Definition of a consensus binding site for p53. Nat. Genet. 1992 Apr.1(1):45-9. Elenbaas, B.; Spirio, L.; Koerner, F.; Fleming, M.D.; Zimnjic, D.B.; Donaher, J.L.; Popescu, N.C.; Hahn, W.L.; Weinberg, R.A. (2001). Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary mammary epithelial cells. Genes Dev., 15: 50-65, 2001. Farkas, T.; Hansen, K.; Holm, K.; Lukas, J.; Bartek, J.; (2002). Distinct phosphorylation events regulate p130- and p107-mediated repression of E2F-4. J. Biol. Chem. 2002, Ju. 26; 277(30): 26741-26752. Fedorov, Y.; Anderson, E.M.; Birmingham, A.; Reynolds, A.; Karpilow, J.; Robinson, K.; Leake, D.; Marshall, W.S.; Kvorova, A. (2006). Off target effects by siRNA can induce toxic phenotypes. RNA, 2006 Jul.; 12(7):1188-96. Fisher, A.G. (2002). Cellular identity and lineage choice. Nat. Rev. Immunol. 2: 977-982. Fischle, W.; Wang, Y.; Jacobs, S.A.; Kim, Y.; Allis, C.D.; Khorasanizadeh, S. (2003). Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Dev. 17, 1870-1881. Francis, N.J.; Kingston, R.E. (2001): Mechanisms of transcriptional memory. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001, 2: 409-421. Francis, N.J.; Saurin, A.J.; Shao, Z.; Kingston, R.E.; (2001). Reconstitution of a functional core polycomb repressive complex. Mol Cell 8, 545-556
103
Francis, N.J.; Kingston, R.E.; Woodstock, C.I.; (2004). Chromatin compaction by a polycomb group protein complex. Science 306: 1574-1577. Franke, A.; Decamillis, M.; Zink, D.; Cheng, N.S.; Brock, H.W.; Paro, R.; (1992). Polycomb and polyhomeotic are constitutents of a multimeric protein complex in chromatin of Drosophila melanogaster. EMBO J., (1992), 11, 2941-2950. Frolov, M.V.; Dyson, N.J.; (2004). Molecular mechnisms of E2F-dependent activation and pRb-mediated repression. J. Cell. Sci., 2004, May 1; 117 (Pt 11):2173-81. Fulda, S.; Lutz, W.; Schwab, M.; Debatin, K.M.; (1999). MycN sensitizes neuroblastoma cells for drug-induced apoptosis. Oncogene, 18, 1479-1468. Gallo, G.; Giordano, A.; (2005). Are Rb proteins a potential substrate of Pin 1 in the regulation of the cell cycle? J. Cell. Physiol. 2005 Nov.; 205(2): 176-81. Gaubatz, S.; Eaton, E.N.; Picon, M.; Roberts, J.M.; Lundberg, A.S.; Gifford, A.; Sardet, C.; Weinberg, R.A. (1996). Regulation of cyclin E transcription by E2Fs and retinoblastoma protein. Oncogene 12: 1173-1180. Geng, Y.; Eaton, E.N.; Picon, M.; Roberts, J.M.; Lundberg, A.S.; Gifford, A.; Sardet, C.; Weinberg, R.A. (1996). Regulation of cyclin E transcription by E2Fs and retinoblastoma protein. Oncogene. 1996 Mar 21; 12(6):1173-80. Ginsberg, D.; Vairo, G.; Chittenden, T.; Xiao, Z.; Xu, G.; DeCaprio; J.A.; Livingston, D.; (1994). E2F-4, a new member of transcription factor family, interacts with p107. Genes. Dev. 8: 2665-2679. Ginsberg, D. (2004). E2F3-a novel repressor of the ARF/p53 pathway. Dev. Cell. 2004 Jun; 6(6): 742-3. Gil, J.; Bernard, D.; Martinez, D.; Beach, D.; (2004). Polycomb CBX7 has a unifying role in cellular lifespann. Nature cell biology, Jan 2004, Vol. 6. Gilbert, F; Feder, M.; Balaban, G,; Brankmann, D, Luri, D.K.; Podolski, R.; Rinaldt, V.; Vinikoor, N.; Weisband, J. (1984); Human neuroblastomas and abnormalities of chromosomes 1 and 17. Cancer Res. 1984, Nov.; 44(11), 5444-9. Godfried, M.B.; Veenstra, M.; Valent, A.; Sluis, P.; Voute, P.A.; Versteege, R.; Caron, H.N.; (2002). Europ. J. Cancer, 38, 1513-1519. Goodliffe, J.M.; Cole, M.D.; (2005). Polycomp mediates Myc autorepression and its transcriptional control of many loci in Drosophila. Genes and development 19: 2941-2946, 2005. Greenberg, R.A.; O´Hagan, R.C.; Deng, H.; Xiao, Q.; Hann, S.R.; Adams, R.R.; Lichtsteiner, S.; Chin, L.; Morin, G.B.; DePinho, R.A.; (1999). Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target gene of c-Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation. Oncogene, 18: 1219-1226, 1999.
104
Greider, C.W. (1999). Telomerase activation one step on the road to cancer? Trends Genet., 15; 109-112, 1999. Guo, C.; White, P.S.; Weiss, M.J.; Hogarty, M.D.; Thompson, P.M.; Stram, D.O.; Brodeur, G.M.; Maris, J.M.; (1999). Allelic deletion at 11q23 is common in MYCN single copy neuroblastoma. Oncogene 18: 4948-4957 Guo, W.J.; Datta, S.; Band, V.; Dimri, G.P. (2006). Mel-18, a Polycomb Group Protein regulates cell proliferation and senescence via transcriptional repression of Bmi-1 and c-Myc Oncoproteins. Mol. Biol. Cell. 2006 Gunawardena, R.W.; Siddiqui, H.; Solomon, D.A.; Mayhew, C.N.; Held, J.; Angus, S.P.; Knudsen, E.S. (2004). Hierarchial requirement of SWI/SNF in retinoblastoma tumor suppressor-mediated repression of Plk1. J. Biol.Chem. 2004 Jul 9; 279(28):29278-85. Gunney, I.; Shirley, W.; Sedivy, J.M.; (2006). Reduced c-Myc signaling triggers telomere-independent senscence by regulating Bmi-1 and p16/Ink4a. PNAS, 2006, Vol. 103, no. 10: 3645-3650. Gunster, M.J.; Satijn, D.P.E.; Hamer, K.M.; den Blaauwen, J.L.; de Bruijn, D.; Alkema, M.J.; van Lohuizen, M.; van Driel, R.; Otte, A.P.; (1997). Identification and characterization of interactions between the vertebrate polycomb-group protein Bmi-1 and the human homologs of Polyhomeotic. Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 2326-2335. Guthrie, S. (2004). Neuronal development: putting motor neurons in their place. Curr. Biol. 14, R166-R168. Hahn, W.C.; Counter, C.M.; Lundberg, A.S.; Beijersbergen, R.L.; Brooks, M.W.; Weinberg, R.A.; (1999). Creation of human tumor cells with defined genetic elements. Nature (Lond.), 400: 464-468, 1999. Hara, E.; Tsurui, H.; Shinozaki, A.; Nakada, S.; Oda, K. (1991). Cooperation effect of antisense-Rb and antisense-p53 oligomers on the extension of life span in human diploid fibroblasts, TIG-1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:528-534. Hardy, K.; Jat, P.S.; (2005). Transcriptional networks and cellular senescence in human mammary fibroblasts. Molecular biology of the cell, Vol.16: 943-953, 2005. Harley, C.B.; Futcher, A.B.; Greider, C.W.; Telomeres shorten during aging of human fibroblasts. Nature (Lond.), 345: 458-460, 1990. Haupt, Y.; Alexander, W.S.; Barri, G.; Klinken, S.P.; Adams, J.M. (1991): Novel zinc finger gene implicated as myc collaborator by retrovirally accelerated lymphomagenesis in E mu-myc transgenic mice. Cell, 65, 753-763. Helin, K.; Harlow, E.; Fattaey, A.; (1993). Inhibition of E2F-1 in transactivation by direct binding of the retinoblastoma protein. Mol.Cell.Biol. 13: 6501-6508.
105
Hemenway, C.S.; Levy, S.L.; (1998). The Bmi-1 oncoprotein interacts with dinG and MPh2: the role of Ring finger domains. Oncogene 1998, 16, p. 2541-2547. Hernandez-Munos, I.; van Lohuizen, M.; (2005). Association of Bmi-1 with polycomb bodies is dynamic and requires PRC2/EZH2 and the maintenance DNA methyltransferase DNMT1. Molecular and cellular biology, dec. 2005, vol. 25, no.24: p 11047-11058. Hernando, E.; Nahle, Z.; Juan, G.; Diaz-Rodriguez, E.; Alaminos, M.; Hemann, M.; Michel, L.; Mittal,V.; Gerald, W.; Benezra, R.; (2004). Rb inactivation promotes genomic instability by uncoupling cell cycle progression from mitotic control. Nature, 430, 797-802. Hijmans, E.M.; Voorhoeve, P.M.; Beijersbergen, R.L.; van`t Veer, L.J.; Bernards, R. (1995). E2F-5, a new E2F family member that interacts with p130 in vivo. Mol. Cell. Biol. 1995 Jun; 15(6):3082-9. Hitchens, M.R.; Robbins, P.D.; (2003). The role of the transcription factor DP in apoptosis. Apoptosis. 2003 Oct.; 8(5):461-468. Holmberg, C.; Helin, K.; Sehested, M.; Karlström, O.; (1998). E2F-1 induced p53-independent apoptosis in transgenic mice. Oncogene 17:143-155 Hsiao, K.M.; McMahon, S.L.; Farnham, P.J.; (1994). Multiple DNA are required for growth regulation of the mouse E2F-1 promotor, Genes Dev. 8: 1526-1537. Hsieh, J.; Gage, F.H. (2004). Epigenetic control of neuroal stem cell fate. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 461-469. Hughes, M.; Mardsen, H.B.; Palmer,M. K.; (1974). Histologic patterns of neuroblastoma related to prognosis and clinical staging. Cancer 34: 1706-1711. Humbert, P.O.; Raluca, V.; Trimarchi, J.M.; Rogers, C.; Dandapani, S.; Lees, J.A.; (2000). E2F3 is critical for normal cellular proliferation. Genes Dev. 14:690-703. Ibson, J.M.; Rabbitts, P.H.; (1988). Sequence of a germ-like NMYC gene and amplification as a mechanism of activation. Oncogene 2 (1988) 399-402. Ishida, S.; Huang, E.; Zuzan, H.; Spang, R.; Leone, G.; West, M.; Nevins, J.R.; (2001). Role for E2F in control of both DNA replication and mitotic function as revealed from DNA microarray analysis. Mol. Cell. Biol.; 21, 4684-4699. Ishizaki, J.; Nevin, J.R.; Sullenger, B.; (1996). Inhibition of cell proliferation by an RNA ligand that blocks E2F function. Nat.Med. 2: 1386-1389. Itahana, K.; Dimri, G.; Campisi, J.(2001). Regulation of cellular senescence by p53. Eur. J. Biochem. 268: 2784-2791.
106
Itahana, K.; Zou, Y.; Itahana, Y.; Martinez, J.-L., Beausejour, Ch.; Jacobs, J.J.L; van Lohuizen, M.; Band, V.; Campisi, J.; Dimri, G.P.; (2003). Control of the replicative life span of human fibroblasts by p16 and the Polycomb Protein Bmi-1. MCB, January 2003, p. 389-401, Vol.23, No.1. Itahana, K.; Dimri, G.P.; (2003). Control of the replicative life span of human fibroblasts by p16 and the polycomb protein Bmi-1. Molecular and cellular biology, Jan 2003, p. 389-401. Iwama, A.; Oguro, H.; Negishi, M.; Kato, Y.; Morita, Y.; Tsukui, H.; Ema, H.; Kamijo, T.; Katoh-Fukui, Y.; Koseki, H.; (2004). Enhanced self-renewal of hematopoietic stem cells mediated by the polycomb gene product Bmi-1. Immunity 21: 843-851. Jacobs, J.J.; Scheijen, B.; Voncken, J.W.; Kienboon, K.; Berns, A.; van Lohuizen, M.; (1999). BMI-1 colloborates with CMYC in tumorigenesis by inhibiting CMYC-induced apoptosis via INK4a/ARF. Genes and development 13: 2678-2690. Jacobs, J.J.; Kieboom, K.; Marino, S.; DePinho, R.A.; van Lohuizen, M. (1999). The oncogene and Polycomb-group gene BMI-1 regulates cell proliferation and senescence through the INK4A locus. Nature 397, 164-168. Jacobs, J.J.; van Lohuizen, M.; (2002). Polycomb repression: from cellular memory to cellular proliferation and cancer. Biochem Biophys Acta 1602, 151-161. Jacobs, J.J.; de Lange, T.; (2004). Significant role for p16/INk4a in p53-independent telomere-directed senescence. Current biology Vol. 14, 2302-2308. Jaenisch, R.; Bird, A. (2003). Epigenetic regulation of gene expression: How the genome integrates intrinsic and enviromental signals. Nat. Genet. 33 (suppl.):245-254. Johnson, D.G.; Schwarz, J.K.; Cress, W.D.; Nevin, J.R.; (1993). Expression of transcription factor E2F-1 induces quiescent cells to enter S-phase. Nature 365: 349-352. Kaatsch, P.; Kaletsch, U.; Spix, C.; (1999). Annual report 1998, Germ. Childhood Cancer registry, Mainz:72-88. Kaatsch, P.; Steliarova-Foucher, E.; Crocetti, E; Magnani, C.; Spix, C.; Zambon, P.; (2006). Time trends of cancer incidence in European children (1978-1997): Report from the automated Childhood Cancer Information System project. European Journal of Cancer, Vol. 42 Issue 13, September 2006, pages 1961-1971. Kaelin, W.G.; Krek, W.; Sellers, W.R.; DeCaprio, J.A.; Farnham, P.J.; Blanar, M.A.; (1992). Expression cloning of a cDNA encoding a retinoblastoma-binding protein with E2F-like properties. Cell 70: 351-364. Kamps, M.P.; Murre, C.M.; Sun, X.-H.; Baltimore, D.; (1990). A new homeobox gene contributes the DNA binding domain of the t(1;19) translocation protein in pre-B ALL. Cell 60, 547-555.
107
Kanno, M.; Hasegawa, M.; Ishida, A.; Isons, K.; Taniguchi, M.; (1995). MEL18, a Polycomb group-related mammalian gene, encodes a transcriptional negative regulator with tumor suppressive activity. Embo J 14, 5672-5678. Keshelava, N.; Seeger, R.C.; Reynolds, C.P.; (1997). Drug resistance in human neuroblastoma cell lines correlates with clinical therapy. Eur. J. Cancer; 1997 Oct.; 33(12):2002-6. Kim, N.W.; Piatyszek, M.A.; Prowse, K.R.; Harley, C.B.; West, M.D.; Ho, P.L.; Coviello, G.M.; Wright, W.E.; Weinrich, S.L.; Shay, J.W.; (1994). Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. (Wash. D.C.), 266: 2011-2015, 1994. Kim, J.H.; Yoon, S.Y.; Kim, C.N.; Joo, J.H.; Moon, S.K.; Choe. I.S.; Choe, Y.K.; Kim, J.W.; (2004). The Bmi-1 oncoprotein is overexpressed in human colorectal cancer and correlates with the reduced p16Ink4a/p14ARF proteins. Cancer Lett., 203, 217-224. Kovesdi, I.; Reichel, R.; Nevins, J.R.; (1986). Identification of a cellular transcription factor involved in E1A transactivation. Cell 45: 219-228. Kowalik, T.F.; DeGregori, J.; Schwarz, J.K.; Nevins, J.R.; (1995). E2F-1 overexpression in quiescent fibroblasts leads to induction of cellular DNA synthesis and apoptosis. J.Virol. 69: 2491-2500. Kramps, C.; Strieder, V. ; Sapetschnig, A. ; Suske, G. ; Lutz, W. ; (2004). E2F and Sp1/Sp3 synergize but are not sufficient to activate the MYCN gene in neuroblastomas. J. Biol. Chem., 279, 5110- 5117. Kuroda, H. ; Sugimoto, T. ; Ueda, K. ; Tsuchida, S. ; Horii, H. ; Inazawa, J. ; Sato, K. ; Sawada, T. (1991). Different drug sensivity in two neuroblastoma cell lines established from the same patient before and after chemotherapy. Int. J. Cancer, 1991, Mar 12 ; 47 (5) : 732-7. Kuzmichev, A. ; Nishioka, K. ; Erdjument-Bromage, H. ; Tempst, P. ; Reinberg, D. (2002). Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the Enhancer of Zeste protein. Genes Dev. 16, 2893-2905. Kuzmichev, A. ; Jenuwein, T. ; Tempst, P. ; Reinberg, D. ; (2004). Different EZH2-containing complexes target methylation of histone H1 or nucleosomal histone H3. Mol. Cell 14 : 183-193. La Sala, D. ; Macaluso, M. ; Trimarchi, C. ; Giordano, A. ; Cinti, C. ; (2003). Triggering of p73-dependent apoptosis in osteosarkoma is under the control of E2Fs-pRb2/p130 complexes. Oncogene 2003 Jun 5 ; 22(23) :3518-29. Lasorella, A. ; Boldrini, R. ; Dominici, C. ; Donfrancesco, A. ; Yokota, Y. ; Inserra, A. ; Iavarone, A. (2002). Id2 is critical for cellular proliferation and is the oncogenic effector of NMYC in human neuroblastoma. Cancer Res. 2002 Jan. 1 ; 62(1) :615-20.
108
Lasorella, A. ; Rothschild, G. ; Yokota, Y. ; Russell, R.G. ; Iavarone, A. (2005). Ide mediates tumor initiation, proliferation, and angiogenesis in Rb mutant mice. Mol. Cell. Biol. 2005 May, 25 (9) :3563-74. La Thangue, N.B. (2002). Transcription. Chromatin control-a place for E2F and Myc to meet. Science. 2002 May 10 ; 296 (5570) :1132-6. Lee, T.I. ; Rinaldi, N.J. ; obert, F. ; Odom, D.T. ; Bar-Joseph,Z. ; Gerber, G.K. ; Hannetti, N.M. ; Harbison, C.T. ; Thompson, C.M. ; Simon, I. ; (2002). Transcriptional regulation networks in Saccharomyces cerevisiae. Science, 298, 799-804. Lenz, G. ; (2006). The RNA interference revolution. Braz. J. Med. Biol. Res., December 2006, Vol. 38 ; 1749-1757 Leone, G. ; Sears, R. ; Huang, E. ; Rempel, R. ; Nuckolls, F. ; Park, C.H. ; Giangrande, P. ; Wu, L. ; Saavedra, H.I. ; Field, S.J. ; (2001). Myc requires distinct E2F activities to induce S-phase and apoptosis. Mol. Cell, 8, 105-113. Lessard, J. ; Barban, S. ; Sauvageau, G. ; (1998). Stage-specific expression of polycpmb group genes in human bone marrow cells. Blood, 91, 1216-1224. Lessard, J.; Schumacher, A. ; Thorsteinsdottir, U. ; van Lohuizen, M. ; Magnuson, T. ; Sauvageau, G. ; (1999). Functional antagonism of the Polycomb-group genes EED and BMI-1 in hemopoietic cell proliferation ; Genes Dev. 13 (1999), 2691-2703. Lessard, J.; Sauvageau,G.; (2003). Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells. Nature 423, 255-260. Leung, C. ; Lingbeek, M. ; Shakova, O. ; Liu, J. ; Tanger, E. ; Saremaslani, P. ; van Lohuizen, M. ; Marino, S. ; (2004). Bmi-1 is essential for cerebellar development and is overexpressed in human medulloblastomas. Nature 2004, Vol. 428, march 2004. Leung, R.K.M. ; Whittaker, P.A. ; (2005), RNA interference : From gene silencing to gene-specific therapeutics. Pharmacology and therapeutics, Vol. 107, Issue 2, August 2005, p.222-239. Liu, L. ; Andrews, L.G. ; Tollefsbol, T.O. ; (2006). Loss of the human polycomb protein Bmi-1 promotes cancer-specific cell death. Oncogene 2006 Logan, N. ; Delavaine, L. ; Graham, A. ; Reilly, C. ; Wilson, J. ; Brummelkamp, T.R. ; Hijmans, E.M. ; Bernards, R. ; La Thangue, N.B. ; (2004). E2F-7 : a distinct E2F family member with an unusual organinzation of DNA-binding domains. Oncogene. 2004 Jul 1 ; 23 (30) : 5138-50. Lukas, J. ; Parry, D. ; Aagaard, L. ; Mann, D.J. ; Bartova, J. ; Strauss, M. ; Peters, G. ; Bartek, J. (1995). Retinoblastoma-protein-dependent cell-cycle inhibition by the tumor surpressor p16. Nature. 1995 Jun. 8 ; 375 (6531):503-6.
109
Lund, A.H. ; van Lohuizen, M. ; (2004). Polycomb complexes and silencing mechanisms. Current opinion in cell biology 2004, 16 : 239-246. Lutz, W.; Stohr, M.; Schurmann, J.; Wenzel, A.; Schwab, M.; (1996). Conditional expression of NMYC in human neuroblastoma cells increases of prothymosin and ornithine decarboxylase and accelerate progression into S-phase early after mitogenetic stimulation of quiscent cells. Oncogene 15: 803-812. Lutz, W.; Fulda, S.; Jeremias, I.; Debatin, K.M.; Schwab, M.; (1998) MycN and IFNgamma cooperate in apoptosis of human neuroblastoma cells. Oncogene, 17, 339-346. Lyko, F.; Paro, R. (1999). Chromosomal elements conferring epigenetic inheritance. Bioessays 1999 Oct; 21(10):824-32. Macaluso, M.; Montanari, M.; Giordano, A. (2006). Rb family proteins as modulators of gene expression and new aspects regarding the interaction with chromatin remodeling enzymes. Oncogene 2006 Aug. 28; 25(38):5263-7. Macaluso, M.; Montanari, M.; Giordano, A.; (2005). Modulation of cell cycle components by epigenetic and genetic events. Semin Oncol 2005 Oct; 32(5):452-7. Macaluso, M.; Paggi, M.G.; Giordani, A. (2003). Genetic and epigenetic alterations as hallmarks of the intricate road to cancer. Oncogene. 2003 Sep. 29; 22(42):6472-8. Maehara, K.; Yamakoshi, K.; Ohtani, N.; Kubo, Y.; Takahashi, A.; Arase, S.; Jones, N.; Hara, E.; (2005). Reduction of total E2F/DP activity induces senescence-like cell cycle arrest in arrest in cancer cells lacking functional pRB and p53. J. Cell. Biol. 2005 Feb 14; 168 (4):553-60. Mahmoudi, T.; Verrijzer, C.P.; (2001). Chromatin silencing and activation by Polycomb and thrithorax group proteins. Oncogene, 2001 May 28; 20(24):3055-66. Maris, J.M.; Matthay, K.K.; (1999). Molecular Biology of Neuroblastoma. J.Clin.Oncol.17: 2264-2279. Maris, J.M.; Weiss, M.D.; Guo, C.; Gerbing, R.B.; Stram, D.O.; White, P.S.; Hogarty, M.D.; Sulman, E.P.; Thompson, P.M.; Lukens, J.N.; Matthay, K.K.; Seeger, R.C.; Brodeur, G.M.; (2000). Loss of heterozygosity at 1p36 independently predicts for disease progression but not decreased overall survival probability in neuroblastoma patients: a Children's Cancer Group study. J. Clin. Oncol., 18, 1888-1899. Maris, J.M.; White, P.S.; Beltinger, C.P.; Sulman, E.P.; Castleberry, R.P.; Shuster, J.J.; Look, A.T.; Brodeur, G.M.; (1997). Familial neuroblastoma: a three-generation pedigree and a further association with Hirschsprung disease. Cancer Res.; 55, 4664-4669. Markaki, E.A.; Tsopanomichalou, M.; Dimitriou, H.; Stiakaki, E.; Perikoyanni, C.; Spandidos, D.; Kalumanti, M.; (2001). Muatations of the retinoblastoma gene (RB-1)
110
as a prognostic factor for in children with acute leukemia and neuroblastoma. Pediatr. Hemat. Oncol., 2001 Mar., 18(2), 101-10. Martinez, A-M.; Cavalli, G.; (2006). Polycomb group-dependent CyclinA repression in Drosophila. Genes and development 20: 501-513; 2006. Matsumura, I. ; Tanaka, H. ; Kanakura, Y. (2003). E2F-1 and c-Myc in cell growth and death. Cell cycle. 2003 Jul-Aug, 2(4) :333-8. Mc Ardle, L. ; Mc Dermott, M. ; Purcell, R. ; Grehan, D. ; O`Meara, A. ; Breatnatch, F. ; Catchpoole, D. ; Culhane, A.C. ; Jeffery, I. ; Gallagher, W.M. ; Stallings, R.L. ; Oligonucleotide microarray analysis of gene expression in neuroblastoma displaying loss of chromosome 11q. Carcinogenesis, 2004 ; 25(9) ; 1599-1609 Milne, T.A. ; Briggs, S.D. ; Brock, H.W. ; Martin, M.E. ; Gibbs, D. ; Allis, C.D. ; Hess, J.L. ; (2002). MLL targets SET domain methyltransferase activity to HOX gene promotors. Mol. Cell 10, 1107-1117. Min, J.; Zhang, Y.; Xu, R.M.; (2003). Structural basis for specific binding of Polycomb chromodomaine to histone H3 methylated at Lys 27. Genes Dev. 17, 1823-1828. Mitchinson, J.M.; (1971). The biology of the cell cycle. Cambridge University press, London. Miyazawa, K.; Himi, T.; Garcia, V.; Yamagishi, H.; Sato, S.; Ishizaki, Y. (2000). A role for p27/Kip1 in the control of cerebellar granule cell precursor proliferation. J. Neuroscience 20, 5756-5763. Molofsky, A.V.; Pardal, R.; Iwashita, T.; Park, I.K.; Clarke, M.F.; Morrison, S.J.; (2003). Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature, Vol. 425, Oct. 2003. Molofsky, A.V.; He, S; Pardal, R; (2005); Bmi-1 promotes neural stem cell self-renewal and neural development but not mouse growth and survival by repressing the p16/Ink4a and p19/Arf senescence pathways. Genes and development 19: 1432-1437. Muller, J.; Hart, C.M.; Francis , N.J.; Vargas, M.L.; Sengupta, A.; Wild, B.; Miller, E.L.; O`Connor, M.B.; Kingston, R.E.; Simon, J.A. (2002). Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell 111, 197-208. Muller, H.; Brachen, A.P.; Vernell, R.; Moroni, M.C.; Christians, F.; Grassilli, E.; Prosperini, E.; Vigo, E.; Oliner, J.D.; Helin, K.; (2001). E2Fs regulate the expression of genes involved in differentiation, development, proliferation and apoptosis. Genes Dev., 15, 267-285. Muyrers-Chen,I.; Paro,R.; (2001). Epigenetics: unfore seen regulators in cancer. Biochim Biophys Acta 1552, 15-26.
111
Nakamura, T., Mori, T.; Tada, S.; Krajewski, W.; Rozovskaia, T.; Wassell, R.; Dubois, G.; Mazo, A.; Croce, C.M.; Canaani, E.; (2002). All-1 is a histone methyltransferase that assembles a super-complex of proteins involved in transcriptional regulation. Mol. Cell 10, 1119-1128. Neo, S.Y.; Leow, C.K.; Vega, V.B.; Long, P.M.; Islam, A.F.; Lai, P.B.; Liu, E.T.; Ren, E.C.; (2004). Identification of discriminators of hepatoma by gene expression profiling using a minimal dataset approach. Hepatology 39, 944-953. Noda, A.; Ning, Y.; Venable, S.F.; Pereira-Smith, O.M.; Smith, J.R. (1994). Cloning a senescent cell-derived inhibitors of DNA synthesis usind an expression screen. Exp. Cell Res. 211:90-98. Norris, M.D.; Bordow, S.B.; Marshall, G.M.; Haber, P.S.; Cohn, S.L.; Haber, M.; (1997). Expression of the gene for multi-drug-resistance-associated protein and outcome with patients with neurolastoma. N. Eng. J. Med., 1996, Jan.; 25; 334 (4): 231-8. Nourse, J.; Mellentin, J.D.; Galili, N.; Wilkinson, J.; Stanbridge, E.; Smith, S.D.; Cleary, M.L.; (1990). Chromosomal translocation t(1;19) results in synthesis of a homeobox fusion mRNA that codes for a potential chimeric transcription factor. Cell 60, 535-546. Nugent, C.I.; Lundblad, V.; (1998). The telomerase reverse transcriptase: components and regulation. Genes Dev., 12: 1073-1085, 1998. Ogawa, H.; Ishiguro, K.; Gaubatz, S.; Livingston, D.M.; Nakatani, Y.; (2002). A complex with chromatin modifiers that occupies E2F-and Myc-responsive genesin G0 cells. Science 296,1132-1136 no.2. O`Hare, M.J.; Jat, P.S.; (2001). Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. PNAS, 2001, vol. 98. Mardsen, H.B.; Misugi, K.;(1984). Histopathologic prognostic factors in neuroblastic tumors: Definition of subtypes of ganglioneuroblastoma and an age-linked classification of neuroblastoma. Journal National Cancer Institute 73: 405-416. Ohta, H.; Sawada, A.; Kim, J.Y.; Tokimasa, S.; Nishiguchi, S.; Humphries, R.K.; Hara, J.; Takihara, Y.; (2002). Polycomb group gene RAE28 is required for substaining activity of hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 195, 759-770. Ohtani, K.; DeGigori, J.; Nevins, J.R.; (1995). Regulation of cyclin E Gene by transcription factor E2F1. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:12146-12150. Orlando,V.; (2003). Polycomb, epigenomes and control of cell identity. Cell 112, 599-606. Ortega, S.; Malumbres, M.; Barbacid, M. (2002). Cyclin D-dependent kinases, INK4 inhibitors and cancer. Biochim. Biophys. Acta. 2002 Mar. 14; 1602(1): 73-87.
112
Otte, A.P.; Kwaks, T.; (2003). Gene repression by polycomb group protein complexes: a distinct complex for every occasion? Current opinion in genetics and development 2003, 13, 448-454. Owens, B.M.; Hawley, R.G.; (2002). HOX and non-HOX homeobox genes in leukemic hematopoiesis. Stem Cells 20, 364-379. Paggi, M.G.; Giordano, A.; (2001). Who is the boss in the retinoblastoma family? The point of view of Rb2/p130, the little brother. Cancer Res. 2001, Jun 15; 61(12): 4651-4. Pardee, A.B.; (1974). A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 71: 1286-1290. Park, I.K.; Qian, D.; Kiel, M.; Becker, M.W.; Pihalja, M.; Weissman, I.L.; Morrison, S.J.; Clarke, M.F. (2003). Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells. Nature 423, 302-305. Parker, S.B.; Eichele, G.; Zhang, P.; Rawls, A.; Sands, A.T.; Bradley, A.; Olson, E.N.; Harper, J.W.; Elledge, S.J. (1995). P53 independent expression of p21Cip1 in muscle and other terminally differentiating cells. Science 1995. Feb. 17, 267: 1024-7. Pearson, B.E.; Nasheuer, H.P.; Wang, T.S.; (1991). Human DNA polymerase a gene: sequences controlling expression in cyclin and serum-stimulated cells. Mol.Cell.Biol.11: 2081-2095. Pebermard, S.; Iggo, R.D.; Determinants of interferon-stimulated gene induction by RNAi vectors; Differentiation, Vol. 72, p 103, March 2004. Peter, M.; Herskowitz, I.; Joining the complex: cyclin-dependent kinase inhibitory proteins and the cell cycle. Cell. 1994 Oct. 21; 79(2): 181-4 Peter, M.; Herskowitz, I. (1994). Direct inhibition of the yeast cyclin-dependent kinase Cdc28-Cln by Far1. Science 1994 Aug. 26; 265 (5176): 1228-31. Peters, A.H.; O´Carrol, D.; Scherthan, H.; Mechtler, K.; Sauer, S.; Schofer, C.; Weipoltshammer, K.; Pagani, M.; Lachner, M.; Kohlmaier, A.; Opravil, S.; Doyle, M.; Sibilia, M.; Jenuwein, T. (2001). Loss of the Suv39h histone methyltransferases impairs mammalian heterochromatin and genome stability. Cell 107: 323-337. Petruk, S.; Sedkov, Y.; Smith, S.; Tillib, S.; Kraevski, V.; Nakamura, T.; Canaani, E.; Croce, C.M.; Mazo, A. Thrithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. Science 2001, Nov. 9; 294 (5545): 1331-4. Peuchmaur, M.; (2004). Peripheral neuroblastic tumors: anatomic pathological classification. Ann. Pathol. 2004 Dec; 24(6): 556-67. Plantaz, D.; Mohapatra, G.; Matthay, K.K.; Pellarin, M.; Seeger, R.C.; Feuerstein, B.G.; (1997). Gain of chromosome 17 is the most frequent abnormality detected by comparative genomic hybridazation. Am. J. Path., 1997, Jan. 150(1):81-90.
113
Poux, S.; Horard, B.; Sigrist, C.J.; Pirrotta, V. (2002). The Drosophila thrithorax protein is a coactivator required to prevent the establishment of polycomb silencing. Development 129, 2483-2493. Raaphorst, F.M. ; Otte, A.P. ; Meijer, C.J. (2001). Polycomb-group genes as regulators of mammalian lymphopoiesis. Trends Immunol. 22 ; 682-690. Ren, B. ; Cam, H. ; Takahashi, Y. ; Volkert, T. ; Terragni, J. ; Young, R.A. ; Dynlacht, B.D. ; (2002). E2F integrates cell cycle progression with DNA repair, replication, and G(2)/M checkpoints. Genes Dev. 2002 Jan 15;16(2):245-56. Robles, S. ; Adami, G.R. ; (1998). Agents that cause DNA double strand breaks lead to p16/Ink4a enrichment and the premature senescence of normal fibroblasts. Oncogene 16, 1113-1123. Rowland, J.M. ; Molecular genetic diagnosis of pediatric cancer : current and emerging methods. Pediatr. Clin North. Am. 2002 Dec, 49(6) : 1415-35. Rowland, B.D. ; Bernards, R. ; (2006). Re-evaluating cell-cycle regulation by E2Fs. Cell 2006, Dec. 1 ; 127(5) :871-4. Santoni-Rugiu, E. ; Lukas, J. ; (2002). E2F activity is essential for survival of Myc-overexpressing human cancer cells. Oncogene (2002), 21, 6498-6509. Sardet, C.; Vidal, M.; Cobrinik, D.; Geng, Y.; Onufryk, C.; Weinberg, R.A.; (1995). E2F-4 and E2F-5, two members of the E2F family, are expressed in the early phases of the cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2403-2407. Satijn, D.P.E.; Hamer, C.M.; Den Blaauween, J.; Otte, A.P. (2001): The Polycomb-group protein Xeed and the YY1 protein interact and both induce neural tissue in Xenopus embryos. Mol.Cell. Biol, 2001, 21: 1360-1369. Satijn, D.P.E.; Otte, A.P.; (1999). Ring-1 interacts with multiple Polycomb-group proteins and displays tumorigenic activity. Mol. Cell. Biol. 1999, 19:57-68. Saurin, A.J.; Shiels, C.; Williamson, J.; Satijn, D.P.; Otte, A.P.; Sheer, D.; Freemont, P.S.; (1998). The human polycomb group complex associates with pericentromeric heterochromatin to form a novel nuclear domain. J. Cell Biol. 142:887-898. Saurin, A.J.; Shao, Z.; Erdjument-Bromage, H.; Tempst, P.; Kingston, R.E.; A drosophila Polycomb complex includes Zeste and dTAFII proteins. Nature 2001, 412: 655-660. Schleiermacher, G.; Peter, M.; Michon, J.; Hugot, J.P.; Vielh, P.; Zucker, J.M.; Magdelenat, H.; Thomas, G.; Delattre, O.; (1994). Two distinct deleted regions on the short arm of chromosome 1 in neuroblastoma. Genes Chromosom. Cancer 10: 275-281.
114
Schmitt, C.A.; Fridman, J.S.; Yang, M.; Lee, S.; Baranov, E.; Hoffman, R.M.; Lowe, S.W. (2002). A senescent program controlled by p53 and p16/Ink4a contributes to an outcome of cancer therapy. Cell 109:335-346. Schulze, E.; Schulze, B.; (1995). The vertebral linker histones H1 zero, H5, and H1M are descendents of invertebrate “orphon” histone H1 genes. J. Mol. Evol. 1995 Dec; 41 (6):833-40. Erratum in J.Mol.Evol. 1997, Apr. 44(4): 466-7. Schwab, M.; (1988). The Myc-box oncogenes. The Oncogene Handbook, p. 381. Schwab, M.; (1985). Amplification of N-myc in human neuroblastoma, Trends Gent.1; 271- 275. Schwab, M.; Bishop, J.M.; (1988). Sustained expression of the human protooncogene MYCN rescues rat embryo cells from senescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988); 9585-9589. Schwab, M.; (2004). MYCN in neuronal tumors. Cancer Lett., 204, 179-187. Serrano, M.; Lin, A.W.; McCurrach, M.E.; Beach, D.; Lowe, S.W. (1997). Oncogenic ras provokes premature cell senescent associated with accumulation of p53 and Ink4a. Cell 88:593-602. Sewalt, R.G.; van der Vlag, J.; Gunster, M.J.; Hamer, K.M.; den Blaauwen, J.L.; Satjin, D.P.; Hendrix, T.; van Driel, R.; Otte, A.P. (1998). Characterization of interactions between the mammalian polycomb-group proteins Enx1/Ezh2 and Eed suggests the existance of different mammalian polycomb-group protein complexes. Mol Cell Biol. 1998 Jun; 18(6):3586-95. Shao, Z..; Raible, F.; Molaghababa, R.; Guyon, J.R.; Wu, C.T.; Bender, W.; Kingston, R.E.; (1999). Stabilization of chromatin structure by PRC1, a Polycômb complex. Cell 98, 37-46. Shay, J.W.; Pereira-Smith, O.M.; Wright, W.E.; (1991). A role for both RB and p53 in the regulation of human cellular senescence. Exp. Cell. Res. 196: 33-39. Shay, J.W.; Bacchetti, S.; (1997). A survey of telomerase activity in human cancer. Eur. J. Cancer, 33: 787-799, 1997. Shay, J.W.; Zou, Y.; Hiyama, E.; Wright, W.E.; (2001). Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet, 10: 677-685, 2001. Sears, R.; Ohtani, K.; Nevins; J.R.; (1997). Identification of positively and negatively acting elements regulating expression of the E2F-2 gene in response to the cell growth signals. Mol. Cell. Biol. 17: 5227-5235. Sheaff, R.J.; Roberts, J.M.; (1998). Regulation of G1 phase. Results. Probl. Cell. Differ. 22: 1-34.
115
Sherr, C.J.; (1998). Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway. GenesDev. 12: 2984-2991. Sherr, C.J.; (2001). The INK4a/ARF network in tumor suppression. Nat.Rev. 2 (2001), 731-737. Shimada, H.; Chatten, J.; Newton, W.A.; Sachs, N.; Hamoudi, A.B.; Chiba, T.; Mardsen, H.B.; Misugi, K.; (1984). Histopathologic prognostic factors in neuroblastic tumors: definition of subtypes of ganglioneuroblastoma and an age-linked clssification of neuroblastomas. Natl. Cancer Inst. 1984 Aug; 73(2):405-16. Stanton, L.W.; Schwab, M.; Bishop, J.M.; (1986). Nucleotide sequence of the human N-MYC gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 1772-1776. Smith, K.S.; Chanda, S.K. ; Lingbeek, M. ; Ross, D.T. ; Botstein, D. ; van Lohuizen, M. ; Cleary, M.L. ; (2003). Bmi-1 regulation of Ink4a-Arf is a downstream requirement for transformation of hematopoietic progenitors by E2a-Pbx1. Molecular Cell, Vol.12, 393-400, 2003. Stannelle, J. ; Stiewe, T. ; Theseling, C.C. ; Peter, M. ; Putzer, B.M. ; (2002). Gene expression changes in response to E2F-1 activation. Nucleic Acids Res. ; 30, 1859- 1867. Strieder, V. ; Lutz, W. ; (2003). E2F proteins regulate MYCN expression in neuroblastomas. J. Biol. Chem., 278, 2983-2989. Taddei, A. ; Maison, C. ; Roche, D. ; Almouzni, G. (2001). Reversible disruption of pericentric heterochromatin and centromere function by inhibiting deacetylases. Nat. Cell Biol. 3 :114-120. Takai, H. ; Smogorzewska, A. ; de Lange, T. ; (2003). DNA damage foci at dysfunctional telomeres. Curr. Biol. 13, 1549-1556. Takihara, Y. ; Tomotsune, D. ; Shirai, M. ; Katoh-Fukui, Y. ; Nishii, K. ; Motaleb, M.A. ; Nomura, M. ; Tsuchiya, R. ; Fujita, Y. ; Shibata, Y. ; (1997). Targeted disruption of the mouse homologue of the Drosphila polymomeotic gene leads to altered anteroposterior pattering and neural crest defects. Development 124, 3673-3682. Takeda, O., Homma, C. ; Maseki, N. ; Sakurai, M. ; Kanda, M. ; Schwab, N. ; Nakamurai, Y. ; Kaneko, Y. ; (1994). There may be two tumor suppressor genes on chromosome 1p closely associated with distinct biological subtypes of neuroblastoma. Genes Chromosomes Cancer, 1994 , May, 10(1) : 30-9. Thompson, P.M. ; Seifried, B.A. ; Kyemba, S.K. ; Jensen, S.J. ; Guo, C. ; Maris, J.M. ; Brodeur, G.M. ; Stram, D.O. ; Seeger, R.C. ; Gerbing, R. ; Matthay, K.K. ; Matise, T.C. ; White, P.S. ; (2001). Loss of heteroygosity for the chromosome 14q in neuroblastoma. Med. Pediatr. Oncol. 2001 Jan ; 36(1): 28-31.
116
Thompson, M. P. ; Gotoh, T. ; Kok, M. ; White, P. ; Brodeur, G.M. ; (2003). CHD5, a new member of the chromodomain gene family, is preferentially expressed in the nervous system. Oncogene (2003), 22 ; p 1002-1011. Thorsteinsdottir, U.; Mamo, A.; Kroon, E.; Jerome, L.; Bijl, J.; Lawrence, H.J., Humphries, K.; Sauvageau, G.; (2002). Overexpession of the myeloid leukemia-associated HOXa9 gene in bone marrow cells induces stem cell expansion. Blood 99, 121-129. Triche, T.J. ; Tsokos, M. ; Linnolla, R.I. ; Marangos, P.J. ; Chandra, R. ; (1985). NSE in neuroblastoma and other round cell tumors of childhood. Prog. Clin. Biol. Res. 1985; 175 : 295-317. Trimarchi, M.J. ; Lees, J.A. ; (2001). The E2F-6 transcription is a component of the mammalian Bmi-1-containing polycomb complex. PNAS, Feb.2001, vol. 98, no.4, 1519-1524. Trimarchi, M.J. ; Lees, J.A. ; (2002). Sibling rivalry in the E2F family. Nature Rev. Mol. Cell Biology, 3, 11-20. Tsai, K.Y.; Ilu, Y.; Macloeod, K.F.; Crowly, D.; Yamasaki, L.; Jacjs, T.; (1998). Mutation of E2F-1 suppresses apoptosis and inappropriate S-phase entry and extends survival of Rb-deficent mouse embryos. Mol.Cell 2:293-304. Tsantoulis, P.K.; Gorgoulis, V.G.; (2005). Involvement of E2F transcription factor family in cancer. Eur. J. Cancer 2005 Nov. 41 (16):2403-14. Valk-Lingbeek, M. E.; Bruggemann, S.W.; van Lohuizen, M.; (2004). Stemm cells and cancer: the polycomb connection. Cell, Vol. 118: 409-418. Van der Lugt, N.M.; Domen, J.; Linders, K.; van Roon, M.; Robanus-Maandag, E.; te Riele, H.; van der Valk, M.; Deschamps, J.; Sofroniew, M.; van Lohuizen, M.; Berns, A.; (1994). Posterior transformation, neurological abnormalities, and severe hematopoietic defects in mice with targeted deletion of the BMI-1 protooncogene. Genes Dev. 8 757-769. Van der Vlag, J.; Otte, A.P.; (1999). Transcriptional repression mediated by the human Polycomb-group protein Eed involves histone deacetylation. Nat. Genet. 1999, 23: 474-478. Van Lohuizen, M.; Verbeek, S.; Scheijen, B.; Wientjens, E.; van der Gulden, H.; Berns, A.; (1991). Identification of cooperating oncogenes in E mu-Myc transgenic mice by provirus tagging. Cell, 63, 737-752. Voncken, J.W.; Schweizer, D.; Aagaard, L.; Sattler, L.; Jantsch, M.F.; van Lohuizen, M.; (1999). Chromatin-association of the Polycomb group protein Bmi-1 is cell cycle-regulated and correlates with ist phosphorylation status. J. Cell Sci. 112:4627-4639. Vonlanthen, S.; Heighway, J.; Altermatt, H.J.; Gugger, M.; Kappeler, A.; Borner, M.M.; van Lohuizen, M.; Betticher, D.C. (2001). The Bmi-1 oncoprotein is
117
differentially expressed in non-small cell lung cancer and correlates with the INK4a-ARF locus expression. Br.J.Cancer, 84, 1372-1376. Vigo, E.; Müller, H.; Prosperini, E.; Hateboer, G.; Cartwright, P.; Moroni, M.C.; Helin,K.; (1999). CDC25A Phosphatase is a target of E2F and required for efficient E2F-induced S-Phase. Mol.Cell.Biol. 19: 6379-6395. Voncken, J.W.; van Lohuizen, M.; (1999). Chromatin-association of the polycomb group protein Bmi-1 is cell cycle-regulated and correlates with ist phosphorylation status. Journal of cell science, vol.112: 4627-4639. Weinberg, R.A.; (1995). The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell 1995; 81:323-330. Weinmann, A.S.; Bartley, S.M.; Zhang, T.; Zhang, M.Q.; Farnham, P.J.; (2001). Use of chromatin immuno-precipitaton to clone novel E2F target promotors. Mol Cell Biol 21, 6820-6832. Weintraub, S.J.; Chow, N.; Luo, R.X.; Zhang; S.H; He, S.; Dean, D.C.; (1995). Mechnism of active transcriptional repression by the retinoblastoma protein. Nature 375:812-815. Wenzel, A.; Schwab, M.; (1995). The n-Myc/max protein complex in neuroblastoma. Short review. Eur. J. Cancer. 1995; 31A (4):516-9. White, P.S.; Maris, J.M.; Beltinger, C.; (1995). A region of consistent deletion in neuroblastoma maps within human chromosome 1p36.2-36.3. Proc. Natl. Acad.Sci.USA 92:5520-5524. White, P.S.; Thompson, P.M.; Gotoh, T.; Okawa, E.R.; Igarashi, J.; Kok, M.; Winter, C.; Gregory, S.G.; Hogarty, M.D.; Maris, J.M.; Brodeur, G.M.; (2005). Definition and characterization of a region of 1P36.3 consistently deleted in neuroblastoma. Oncogene, 2005 Apr, 14:24 (16): 2684-2694. Woodage, T.; Basrai, M.A.; Baxevanis, A.D.; Hieter, P.; Collins, F.S.; (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 11472-11477. Won, J.; Kim, T.K.; (2004). Small-molecular-based identification of dynamic assembly of E2F-pocket protein-histone deacetylase complex for telomerase regulation in human cells. PNAS, 2004, Vol. 101, no. 31. Wu, C.L.; Classon, M.; Dyson, N.; Harlow, E.; (1996). Expression of dominant-negative mutant DP1 blocks cell cycle in G1. Mol. Cell. Biol. (1996) Jul. 16 (7): 3698-706. Wu, K.; Grandoni, C.; Amacker, M.; Simon-Vermont, N.; Polack, A.; Lingner, J.; Dalla-Favera, R.; (1999). Direct activation of TERT transcription by c-Myc. Nat. Genet. 21:220-224. Yokoyama, A.; Wang, Z.; Wysocka, J.; Sanyal, M.; Aufiero, D.J.; Kitabayashi, I.; Herr, W.; Cleary, M.L.; (2004). Leukemia proto-oncoprotein Mll forms a Set1 like
118
histone methyltransferase complex with menin to regulate HOX gene expression. Mol. Cell. Biol., 2004 Jul; 24 (13):5639-49. Zencak, D.; Lingbeek, M.; Kostic, C.; Tekaya, M.; Tanger, E.; Hornfeld, D.; Jaquet, M.; Munier, F.L.; Schorderet, D.F.; van Lohuizen, M. (2005). Bmi-1 loss produces an increase in astroglia cells and a decrease in neuronal stem cell population and proliferation. J. Neuroscience 2005.
Zimmerman, K.A.; Alt, F.W. (1990). Expression and function of MYC family genes. Crit. Rev. Oncogene 2(1), 75-95. Zimmerman, K.A.; Yancopoulos, G.D.; Collum, R.G.; Smith, R.K.; Kohl, N.E.; Denis, K.A.; Nau, M.M.; Witte, O.N.; Toran-Allerand, D.; Gee, C.E.; Minna, J.D., Alt, F.W.; (1986). Differential expression of MYC family genes during murine development. Nature 1986; 319, 780-783.
119
7 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 (modifiziert nach Jacobs und van Lohuizen; 2002): Regulation der
Proliferation hämatopoetischer Stammzellen (Seite 14)
Abbildung 2: Induziert Bmi-1 nach E2F-1 Stimulation S-Phase und Apoptose? (Seite
21)
Abbildung 3: Western-Blot: Bmi-1 nach E2F-1 Induktion (Seite 64)
Abbildung 4: Modelle: Ist die Induktion von Bmi-1 durch E2F-1 ein direkter oder ein
indirekter Effekt? (Seite 66/67)
Abbildung 5: RT-PCR: Induziert E2F-1 BMI-1 direkt oder indirekt? (Seite 68)
Abbildung 6: Der Promotor des BMI-1-Gens enthält eine E2F-1 Bindungsstelle
(Seite 68)
Abbildung 7: Luciferase-Assay in Shep-Zellen: Ist die E2F-1-Bindungsstelle im
BMI-1-Promotor verantwortlich für die Induktion von Bmi-1 nach E2F-1 Stimulus?
(Seite 69)
Abbildung 8: Lucifersase-Assay: Ist N-Myc in Neuroblstomzellen durch Bmi-1
induzierbar? (Seite 70)
Abbildung 9: RT-PCR im Echtzeitgerät: Austestung der siRNA gegen Bmi-1 im
transienten Versuchsansatz (Seite 72)
Abbildung 10: Koloniebildungsversuch in 1A3-Zellen 20 Tage nach stabiler
Transfektion verschiedener siRNAs gegen BMI-1 (Seite 73)
Abbildung 11: Western-Blot von 1A3-Zellen: Lässt sich Bmi-1 durch stabil
transfizierte siRNA reduzieren? (Seite 75)
Abbildung 12: Model: Induzierbare RNA-Interferenz von BMI-1. (modifiziert nach:
Brummelkamp und Agami, 2002). (Seite 77)
Abbildung 13: Luciferase-Assays: Austestung der TET-Repressor-Klone (Seite 78)
Abbildung 14: Western-Blot: Bmi-1 (ca. 54kDa) lässt sich im TET-on-System
runterregulieren (Seite 78)
Abbildung 15: Western-Blot: Lässt sich die –RF-Mutante im TET-induzierbaren
System nachweisen? (Seite 80)
Abbildung 16: FACS-Analyse des TET-induzierbaren siRNA5/6 Klon2 (Seite 81)
Abbildung 17: FACS-Analyse des TET-induzierbaren siRNA5/6 Klon12 (Seite 82)
120
Abbildung 18: Quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät: HTERT-Kinetik nach Bmi-1
Induktion (Seite 84)
Abbildung 19: Quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät zur Untersuchung der
Expression von BMI-1 in RB-knock-out MEFs (Seite 85)
Abbildung 20: Modell 1: Funktion von Bmi-1 im Zellzyklus (Seite 88)
Abbildung 21: Modell 2: Funktion von Bmi-1 im Zellzyklus (Seite 88)
121
8 Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Ak, α Antikörper
ALLN N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal
APS Ammoniumperoxodisulfat
ATP Adenosin-5’-triphosphat
BAC bacterial artficial chromosome
BrdU 5-Bromo-2-Desoxyuridin
BSA bovine serum albumin
CDK cyclin dependent kinase
CGH comparative genomic hybridization
Chx Cycloheximid
CMM cellular memory moduls
CMV Cytomegalievirus
dATP Desoxyadenosintriphosphat
dCTP Desoxycytosintriphosphat
dGTP Desoxyguanidintriphosphat
DNA Desoxyribo Nucleic Acid
dTTP Desoxythymidintriphosphat
DP Dimerisationspartner Proteinen
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGFP enhanced green fluorescent protein
EtOH abs. Ethanol absolut
FACS Fluorescence activated cell sorting
122
FCS Fetales calvserum
HDAC Histondeazetylasen
HOX Homeobox
hPRC humane Polycomb Repressive Complex
IL Interleukin
In Input
IP Immunpräzipitation
kDa KiloDalton
LDH Lactatdehydrogenase
LUC Luciferase
MEF mouse embyonic fibroblast
MIBG Metjodbenzylguanidin
min Minuten
mRNA messanger Ribo Nucleic Acid
mut Mutante
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
NB2004 Neuroblastom2004 (aktuelle deutsche Neuroblastomstudie)
NME N-Ethylmaleimid
NSCLC non small-cell lung cancer
NSE Neuronenspezifische Enolase
OD Optischen Dichte
4-OHT 4-Hydroxytamoxifen
ONPG Ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
Pc Polycomb
PcG Polycomb group
123
PcGm Polycomb group maintenance complex
PcGi Polycomb group initiating complex
PCR polychainreaction
Ph polyhomeotic
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PRE Polycomb Response Elemente
PSC posterior sex combs
PVDF Polyvinylidenfluorid
Rb Retinoblastom
RF Ring finger
RNA ribo nucleic acid
RT-PCR real-time polychain reaction
shRNA short hairpin RNA
siRNA small interfering RNA
TEMED tetramethylendiamin
TET Tetrazyklin
Trk Tyrosinkinase
Trx Thrithorax
UV ultaviollet
WB Western-Blot
Wt Wildtyp
124
9 Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer in Marburg waren folgende Damen und Herren, denen
ich danke:
Dr. J. Adamkiewicz Dr. Jackowski-Dohrmann Prof. Dr. Dr. H.
Remschmidt
Prof. Dr. med. R. Arnold Prof. Dr. H. Junclas Prof. Dr. H. Renz
Prof. Dr. G. Aumüller Prof. Dr. H. F. Kern Prof. Dr. G. Richter
Dr. H. Barth Dr. H.-S. Kim-Berger Prof. Dr. H. Schäfer
Prof. Dr. P.J. Barth
Prof. Dr. G. Klaus Prof. Dr. H. Schmidt
Prof. Dr. Dr. H.D. Basler Prof. Dr. H.D. Klenk PD Dr. Schnabel
Prof. Dr. E. Baum Prof. Dr. J. Koolman T. Schneyer
PD. Dr. H. Becker Prof. Dr. J.C. Krieg Prof. Dr. J. Seitz
Dr. E. Bergmann Prof. Dr. P. Kroll Prof. Dr. B. Steiniger
Prof. Dr. H. Christiansen Prof. Dr. R.E. Lang Dr. S. Stiller
Prof. Dr. F. Czubayko PD Dr. A. Leonhardt Dr. H.W. Vohland
Prof. Dr. M. Eilers Prof. Dr. R. F. Maier Prof. Dr. K. Voigt
Dr. B. Feuser Prof. Dr. B. Maisch Prof. Dr. S. Waldegger
PD Dr. Gerdes Dr. Dr. K. Mandrek Prof. Dr. E. Weihe
Prof. Dr. A. Geus Prof. Dr. R. Moll Prof. Dr. J.A. Werner
Prof. Dr. L. Gotzen Prof. Dr. Dr. U. Mueller Prof. Dr. H. Wulf
Prof. Dr. P. Griss Prof. Dr. R. Mutters Dr. M. Zemlin
Prof. Dr. R. Happle Prof. Dr. B. Neumüller
Prof. Dr. R. Hofmann Prof. Dr. W.H. Oertel
125
10 Tabellarischer Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Kornelius Tobias Kerl
Anschrift: Coerdestr. 52
48147 Münster
Geburtsdatum: 02.01.1979
Geburtsort: Delmenhorst
Schulbildung:
1985 – 1989: Grundschule am grünen Kamp in Delmenhorst
1989 - 1991: Orientierungsstufe Süd in Delmenhorst
1991-1998: Gymnasium an der Max-Planck-Straße
Schulabschluss: Allgemeine Hochschulreife mit der Note 2.4
Hochschulstudium:
Fachrichtung: Humanmedizin
Universität: Philipps-Universität Marburg
Zeitraum: 08/2000-04/2006
Physikum: 03/2002; Note „gut“ (2.0)
1.Staatsexamen: 03/2003; Note „gut“ (2.0)
2.Staatsexamen: 03/2005; Note „gut“ (1.66)
3.Staatsexamen: 06/2006; Note „gut“ (2.0) [Gesamtnote „gut“ (1,8)]
Thema der Doktor-
arbeit:
„BMI-1 ist ein direktes Zielgen von E2F-1 in primären
Neuroblastomen“
am Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung in
Marburg
126
Praktische Tätigkeiten:
07.1998-08.1999 Zivildienst als Rettungssanitäter beim Malteser Hilfsdienst
Delmenhorst
09.1999-11.1999 Pflegepraktikum in der Orthopädischen Klinik Stenum
08.2001-09.2001 Famulatur in der Inneren Medizin am Diakonie Krankenhaus
Werda
03.2002-04.2002 Famulatur in der Chirurgie am Kaiser-Franz-Josef
Krankenhaus Wien
04.2002-05.2002 Famulatur in der Schwerpunktpraxis für Diabetes, Praxis Dr.
Eidenmüller, Marburg
08.2003-09.2003 Famulatur in der Kinderheilkunde in der Prof.-Hess-
Kinderklinik, Bremen
09.2003-07.2004 Doktorarbeit am Institut für Molekularbiologie und
Tumorforschung in Marburg bei Prof. Dr. Martin Eilers;
Thema: „BMI-1 ist ein direktes Zielgen von E2F-1 in primären
Neuroblastomen“
04.2005-08.2005 1.Tertial des Praktischen Jahres: Kinderheilkunde in der
Universitätskinderklinik Marburg
08.2005-12.2005 2. Tertial des Praktischen Jahres: Chirurgie im King-Edward
Hospital in Durban (Südafrika)
12.2005-03.2006 3. Tertial des Praktischen Jahres: Innere Medizin im Salem-
Spital in Bern (Schweiz)
Seit 01.08.2006 Assistenzarzt der Pädiatrie am Universitätsklinikum Münster
127
11 Danksagung
Danken möchte ich allen, die an der wissenschaftlichen Verwirklichung dieser Arbeit
beteiligt waren.
Ganz besonderer Dank gilt:
Martin Eilers, Werner Lutz, Daniel Fehr, Sven Gallinat, Jens-Peter Reese, Sovana
Adhikary, Kathrin Killmer, Kathrin Nowak, Michael Wanzel, Holger Christiansen,
Bernd Berwanger, Eckhard Bergmann.
Weiterhin möchte ich all denen danken, die mich weniger wissenschaftlich, als auf
vielen anderen Wegen immer unterstützt haben:
Renate Kerl-Haevke, Wolf-Dieter Kerl, Katharina Kerl, Kristoff Kerl, Daniela Deppe,
Philipp Engel und Vianca Pillay.
128
12 Ehrenwörtliche Erklärung
„ Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur
Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „BMI-1 ist ein direktes Zielgen
von E2F-1 in primären Neuroblastomen“ im Institut für Molekularbiologie und
Tumorforschung unter der Leitung von Prof. Dr. Rolf Müller mit Unterstützung von
Prof. Dr. Martin Eilers und PD Dr. Werner Lutz ohne sonstige Hilfe selbst
durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der
Dissertation aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keinem in- oder
ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um Zulassung zur Promotion
eingereicht, noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.
Vorliegende Arbeit wurde in folgenden Publikationsorganen:
„Nucleic Acids Research, March 2006; Nowak, K.; Kerl, K.; Fehr, D.; Kramps, C.;
Gessner, C.; Killmer, K.; Samans, B.; Berwanger, B.; Christiansen, H.; Lutz, W.;
mit dem Titel „BMI1 is a target gene of E2F-1 and is strongly expressed in primary
neuroblastomas.“ veröffentlicht.
I