Lanthanoide als Marker in der Lanthanoide als Marker in der FluoreszenzspektroskopieFluoreszenzspektroskopie
Jan HoyerNora Schulze
GliederungGliederung
1. Vor- und Nachteile von Lanthanoidenmarkern
2. Allgemeine Vorgehensweise
3. Anwendungen
4. Literatur
Anforderungen an Anforderungen an MarkersubstanzenMarkersubstanzen
gutes Signal/Rausch-Verhältnis kleine Nachweisgrenze
einfache Handhabung; Verfügbarkeit der Substanzen
möglichst geringe Beeinflussung des zu untersuchenden Systems
Vorteile von Vorteile von Ln-FluoreszenzmarkernLn-Fluoreszenzmarkern
keine Strahlenschäden (vgl. radioaktive Marker)
scharfe Banden, geringer Hintergrund gutes S/N geringe Nachweisgrenze (bis fmol-Bereich)
kurze Messdauer (Sekundenbereich)
Nachteil: teurer als herkömmliche Fluoreszenzmarker!
Besonderheiten der Fluoreszenz Besonderheiten der Fluoreszenz bei Lanthanoidenbei Lanthanoiden
Lebensdauer des angeregten Zustandes: 0,1 – 1 ms → zeitaufgelöste Unterscheidung von Hintergrundsignal möglich
Stokes-Verschiebung über 250 nm
geringe Extinktionskoeffizienten → geringes Hintergrundsignal→ Sensibilisierung durch „Antennenliganden”
notwendig
eingesetzte Lanthanoide: Eu, Tb, Sm, Dy
Stokes-VerschiebungStokes-Verschiebung
Abstand zwischen Absorptions- und Emissionsmaximum einerfluoreszierenden Substanz→ je größer die Verschiebung, umso weniger Überlappung von
Absorptions- und Emissionsspektrum
Anregungswellenlänge ex = 360 nm
Antennenliganden - PrinzipAntennenliganden - Prinzip
Chelatligand bindet Marker und absorbiert eingestrahltes Licht
Energie wird auf Lanthanoidion übertragen und als Fluoreszenzsignal emittiert
Antennenliganden - BeispieleAntennenliganden - Beispiele
hohe KoZ verhindert Bindung von Wasser an Ln, da sonst Desaktivierung
AnwendungenAnwendungen
DELFIA („dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay“)Immunoassays ähnlich ELISA oder RIAUntersuchung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen
TR-FRET („time resolved fluorescence resonance energy transfer“)→ z. B. Untersuchung der Oligomerisierung von Rezeptoren in lebenden Zellen
Einführung von Ln-Bindungsstellen in Proteine→ unmittelbare Bestimmung von Expressionsleveln → Visualisierung von Proteinen in SDS-PAGE-Gelen
DELFIADELFIA
Beispiel: Bestimmung von Metallothioneinen → Expression u. a. als Antwort auf Kontamination
mit Schwermetallionen (Komplexierung)
zunächst Inkubation mit MT-Antikörper, an diesen bindet sekündärer Antikörper→markiert mit nicht-fluoreszierendem Chelatkomplex
(z. B. Eu-DTTA, gebunden über Isothiocyanatgruppe an ε-Aminogruppe von Lys)
Erniedrigung des pH führt zu Freisetzung von Ln aus Komplex, Bindung an Antennenliganden
→ Nachweis
Vorteile von DELFIAVorteile von DELFIA
empfindlicher als ELISA und RIA
kostengünstiger und weniger zeitaufwändig als RIA, keine radioaktive Strahlung
Möglichkeit der Automatisierung
Verwendung mehrerer Marker gleichzeitig möglich, da unterschiedliche Lebensdauern des angeregten Zustandes und andere Emissionsprofile von Eu, Tb, Sm, Dy→ Kosten- und Zeiteinsparung
Weitere Möglichkeiten der Weitere Möglichkeiten der Verwendung von LanthanoidenVerwendung von Lanthanoiden
Lanthaniden-Shift-Reagenzien in NMR
Beschleunigung der Proteinstrukturbestimmung mittels RKSA
QuellennachweisQuellennachweis
Life Sciences 77 (2005), 361-371
Analytical Biochemistry 137 (1984), 335-343
Chembiochem 4 (2003), 265-271