Lanthanoide als Marker in der Lanthanoide als Marker in der FluoreszenzspektroskopieFluoreszenzspektroskopie

Jan HoyerNora Schulze

GliederungGliederung

1. Vor- und Nachteile von Lanthanoidenmarkern

2. Allgemeine Vorgehensweise

3. Anwendungen

4. Literatur

Anforderungen an Anforderungen an MarkersubstanzenMarkersubstanzen

gutes Signal/Rausch-Verhältnis kleine Nachweisgrenze

einfache Handhabung; Verfügbarkeit der Substanzen

möglichst geringe Beeinflussung des zu untersuchenden Systems

Vorteile von Vorteile von Ln-FluoreszenzmarkernLn-Fluoreszenzmarkern

keine Strahlenschäden (vgl. radioaktive Marker)

scharfe Banden, geringer Hintergrund gutes S/N geringe Nachweisgrenze (bis fmol-Bereich)

kurze Messdauer (Sekundenbereich)

Nachteil: teurer als herkömmliche Fluoreszenzmarker!

Besonderheiten der Fluoreszenz Besonderheiten der Fluoreszenz bei Lanthanoidenbei Lanthanoiden

Lebensdauer des angeregten Zustandes: 0,1 – 1 ms → zeitaufgelöste Unterscheidung von Hintergrundsignal möglich

Stokes-Verschiebung über 250 nm

geringe Extinktionskoeffizienten → geringes Hintergrundsignal→ Sensibilisierung durch „Antennenliganden”

notwendig

eingesetzte Lanthanoide: Eu, Tb, Sm, Dy

Stokes-VerschiebungStokes-Verschiebung

Abstand zwischen Absorptions- und Emissionsmaximum einerfluoreszierenden Substanz→ je größer die Verschiebung, umso weniger Überlappung von

Absorptions- und Emissionsspektrum

Anregungswellenlänge ex = 360 nm

Antennenliganden - PrinzipAntennenliganden - Prinzip

Chelatligand bindet Marker und absorbiert eingestrahltes Licht

Energie wird auf Lanthanoidion übertragen und als Fluoreszenzsignal emittiert

Antennenliganden - BeispieleAntennenliganden - Beispiele

hohe KoZ verhindert Bindung von Wasser an Ln, da sonst Desaktivierung

AnwendungenAnwendungen

DELFIA („dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay“)Immunoassays ähnlich ELISA oder RIAUntersuchung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen

TR-FRET („time resolved fluorescence resonance energy transfer“)→ z. B. Untersuchung der Oligomerisierung von Rezeptoren in lebenden Zellen

Einführung von Ln-Bindungsstellen in Proteine→ unmittelbare Bestimmung von Expressionsleveln → Visualisierung von Proteinen in SDS-PAGE-Gelen

DELFIADELFIA

Beispiel: Bestimmung von Metallothioneinen → Expression u. a. als Antwort auf Kontamination

mit Schwermetallionen (Komplexierung)

zunächst Inkubation mit MT-Antikörper, an diesen bindet sekündärer Antikörper→markiert mit nicht-fluoreszierendem Chelatkomplex

(z. B. Eu-DTTA, gebunden über Isothiocyanatgruppe an ε-Aminogruppe von Lys)

Erniedrigung des pH führt zu Freisetzung von Ln aus Komplex, Bindung an Antennenliganden

→ Nachweis

Vorteile von DELFIAVorteile von DELFIA

empfindlicher als ELISA und RIA

kostengünstiger und weniger zeitaufwändig als RIA, keine radioaktive Strahlung

Möglichkeit der Automatisierung

Verwendung mehrerer Marker gleichzeitig möglich, da unterschiedliche Lebensdauern des angeregten Zustandes und andere Emissionsprofile von Eu, Tb, Sm, Dy→ Kosten- und Zeiteinsparung

Weitere Möglichkeiten der Weitere Möglichkeiten der Verwendung von LanthanoidenVerwendung von Lanthanoiden

Lanthaniden-Shift-Reagenzien in NMR

Beschleunigung der Proteinstrukturbestimmung mittels RKSA

QuellennachweisQuellennachweis

Life Sciences 77 (2005), 361-371

Analytical Biochemistry 137 (1984), 335-343

Chembiochem 4 (2003), 265-271