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2012 ASA Spezialenzyme GmbH Dr. Arno Cordes
Dipl.-Ing. Petra Hoferichter
Analytik Synthese Abbau
ASA Spezialenzyme GmbH / ABS:
Eine neue verlässliche Nachweismethode für Pseudomonas aeruginosa
ASA Spezialenzyme GmbHDr. Arno Cordes / Dipl.-Ing. Petra HoferichterAm Exer 19 CD-38302 WolfenbüttelTel.: 05331 8825-30Fax: 05331 8825-32E-mail: [email protected]
2012 ASA Spezialenzyme GmbH Dr. Arno Cordes
Dipl.-Ing. Petra Hoferichter
Gliederung
1. Pseudomonas aeruginosa: Vorkommen, Eigenschaften, Toxizität
2. Herkömmliche Nachweismethode: Cetrimid-Agar
3. Neue spezifische Nachweismethode: Gensonde
4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde
5. Zusammenfassung
2012 ASA Spezialenzyme GmbH Dr. Arno Cordes
Dipl.-Ing. Petra Hoferichter
1. Pseudomonas aeruginosa: Vorkommen, Eigenschaften, Toxizität
Vorkommen
- feuchte Böden- Oberflächengewässern- Leitungswasser, Waschbecken, Duschen,
Toiletten, Spülmaschinen, Dialysegeräten, Medikamenten
- Lebensmittel- destilliertem Wasser- einigen Desinfektionsmitteln - Shampoos
Krankheitserreger
- für immunkompetenten (gesunde) Menschen nicht gefährlich !!
- bei Minderung der Keimabwehr durch eine Grunderkrankung (z.B. AIDS
- bei Störung der Barrierefunktion der Haut und Schleimhäute
- Mehrfachresistenzen gegenüber Antibiotika- Toxinbildner, zahlreiche Virulenzfaktoren
Infektionen
- Krankenhauskeim - ca. 10 % aller Krankenhausinfektionen- Pneumonien bei Mukoviszidose- Harnwegsinfektionen, Blutvergiftung,
Meningitis, Infektionen auf Brandwunden
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2. Herkömmliche Nachweismethode: Cetrimid-Agar
Cetrimid-Agar
- enthält neben Nährstoffen Cetrimid = Quartäre Ammoniumverbindung - Hemmung viele andere Organismen einschließlich vieler anderer
Pseudonomaden-Spezies und verwandter Organismen
- fördert die Produktion von Pyocyanin sowie die Fluoreszenz von P. aeruginosa
unter UV-Licht (254 nm)
- typische P. aeruginosa Kolonien sind grünlich oder gelblich-grün
- DIN EN 12780 (im informativen Anhang, der nicht Teil der Norm war)- Empfehlung des UBA/ der BWK (Bundesgesundheitsblatt 7/2007):
� Bebrütung bei 42 °C zur Abgrenzung von P. aeruginosa von anderen Pseudomonaden, insbesondere von P. fluorescens und P. putida
Cetrimid Pyocyanin
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2. Herkömmliche Nachweismethode: Cetrimid-Agar
B
Abb. 1: P. aeruginosa mit gelbgrünem Pyocyaninpigment auf Cetrimid-Agar
Abb. 2: P. aeruginosa mit fluoreszierenden Pigment unter UV-Licht auf Cetrimidagar
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3. Neue spezifische Nachweismethode: Gensonde
Theoretischer Hintergrund
-die Information zur Herstellung von Proteinen ist in den Chromosomen bzw. der DNA gespeichert
- DNA: Alphabet aus nur vier Buchstaben
- DNA-Sequenz: spezifische Reihenfolge der Buchstaben für jedes Protein (ab ca. 1.000 Buchstaben)
- alle Pseudomonas aeruginosa-Stämme
haben spezifische, identische Abschnitte auf
der DNA!
Abb. 3: DNA-Doppelstrang
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3. Neue spezifische Nachweismethode: Gensonde
Theoretischer Hintergrund
Abb. 4: DNA-Gensonde mit Fluoreszensfarbstoff
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3. Neue spezifische Nachweismethode: Gensonde
Schritt 1: Filtration der Wasserprobe auf den Membran Filter
Schritt 2: Inkubation auf Cetrimid-Agar; Überführung des kultivierten Filters.
Schritt 3: Auftropfen der Gensonde; Inkubation.
Schritt 4:Waschen und inkubieren Schritt 5:Fluoreszensmikroskop, zwei separate Fluoreszensfiltersätze
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4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde
Vorgehensweise
- Anzucht von Ps. aeruginosa PAO1 (Stamm DSMZ 22644) im Schüttelkolben 20-24 h bei 30°C
- Zählen der Keimzahl mittels Thomakammer
- Herstellen einer Verdünnungsreihe bis 10 Keime/ml (Doppelbestimmung)
- Mischkultur ASA T zu den Verdünnungen pipettieren (enthält u.a. Cellulomonas-, Bacillus-,Pseudomonas-Arten; Endkonz. 1,0 x 105
Keime/ml)
- Ausstreichen der letzten sechs Verdünnungsstufen auf Cetrimid-Agar
- Gensondentest (Nachweis unter Fluoreszensmikroskop
- Fotos der grünen und roten Fluoreszens sowie der Platten
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4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde
Stammlösung Ps. aeruginosa (Thomakammer): 5,3 x 108 Keime/ml
Tab. 1: Testvergleich: Cetrimid-Agar / Gensonde
Verdünnung Keimzahl [KBE/ml]
Cetrimid-Agar Gensonde
106 570 -
2 x 106 250 140
107 65 53
2 x 107 35 32
4 x 107 30 14
108 20 6
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0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5
Probennummer
Kei
mza
hl [K
BE
/ml]
Cetrimid-Plattentest
Gensonde /Fluoreszenstest
4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde
Abb. 5: Testvergleich: Cetrimid-Agar / Gensonde
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4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde
ASA T auf
Cetrimid-
Agar
ASA T + Ps.
aeruginosa
auf
Cetrimid-
Agar
Abb. 6:Wachstum von Ps. aeruginosa auf Cetrimid-Agar in Gegenwart anderer Bakterien
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4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde
Abb. 7: Ps. aeruginosa-Zellen unter dem Fluoreszensmikroskop
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4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde
Abb. 8: Wachstum verschiedener Pseudomonas-Arten auf Cetrimid-Agar
Ps. aeruginosa Ps. putida Ps. stutzeri Ps. aeruginosa
DSMZ 22644 DSMZ 33 DSMZ 5064 DSMZ 939
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4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde
Abb. 9: Wachstum verschiedener Pseudomonas-Arten auf Cetrimid-Agar
Ps. aeruginosa Ps. putida Ps. stutzeri Ps. aeruginosa
DSMZ 22644 DSMZ 33 DSMZ 5064 DSMZ 939
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5. Zusammenfassung
1. Der Cetrimid-Agar-Test liefert in Gegenwart anderer Bakterienarten höhere Ergebnisse als der neue Gensonden-Test
2. Die eindeutige Auswertung des Cetrimid-Agar-Tests war nur möglich, da die zugegebenen Keime bekannt waren. So gab es bei Keimen von der ASA T-Bakterienmischkultur ebenfalls gelb-grüne Kolonien auf Cetrimid-Agar
3. Verschiedene Pseudomonadenstämme sind mit dem Cetrimid-Agar-Test nicht eindeutig zu unterscheiden.
4. Die Spezifität des Gensonden-Tests ist wesentlich größer
5. Der Gensonden-Test wird nicht durch die Begleitflora ASA T oder Ps. putida beeinflusst. Die Auswertung ist eindeutig.