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Einfluss einer mit synthetischem Peptid (P-15)

beschichteten Implantatoberfläche

auf die Osseointegration

in einem diabetischen Tiermodell

Der Medizinischen Fakultät / Dem Fachbereich Mund-, Kiefer- und

Gesichtschirurgie

Der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent.

vorgelegt von:

Hendrik ter Stal

aus Nordhorn

2

Als Dissertation genehmigt

von der Medizinischen Fakultät/ vom Fachbereich Mund-, Kiefer- und

Gesichtschirurgie

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 21.01.2014

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Gutachter: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Karl Andreas Schlegel

Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich W. Neukam

3

Meinem verstorbenen Bruder Jan ter Stal gewidmet.

4

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung …………………………............ 6

1. 1. Hintergrund und Ziele ………………………… 6

1. 2. Material und Methode ………………………… 6

1. 3. Ergebnisse …………………………………………. 6

1. 4. Schlussfolgerung …………………………………. 6

2. Abstract ………………………………………………….. 7

2. 1. Background and aims ………………………… 7

2. 2. Material and methods ………………………… 7

2. 3. Results …………………………………………. 7

2. 4. Conclusion …………………………………………. 7

3. Einleitung …………………………………………. 8

4. Ziel der Arbeit …………………………………………. 11

5. Material und Methode ………………………… 12

5. 1. Das Versuchstier …………………………………. 12

5.1.1. Die Wahl des Versuchstiers ………………… 12

5.1.2. Anzahl der Versuchstiere ………………… 12

5.1.3. Bildung der Versuchsgruppen ……….. 12

5.1.4. Induktion des Diabetes ………………… 12

5.2. Zeitlicher Ablauf mit graphischer Darstellung .. 13

5.3. Implantatsystem …………………………………. 15

5.3.1. Implantateigenschaften ………………… 15

5.3.2. Beschichtung …………………………………. 15

5.4. Art und Durchführung der Eingriffe ………………… 16

5.4.1. Zahnextraktion ………………………… 16

5.4.2. Implantation …………………………………. 16

5.4.3. Sektion …………………………………. 17

5.4.4. Entnahme und Aufbereitung der Prüfkörper .. 17

5.5. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner 18

5.6. Mikroradiographie ………………………………….. 19

5.7. Histomorphometrie ………………………………….. 22

5

5.8. Immunhistochemie ………………………………….. 24

5.8.1. Collagen Typ I ….…………………….. 24

5.8.2. Osteocalcin ………………………………….. 25

5.8.3. Ablauf der Immunhistochemie ………… 26

5.9. Statistik …………………………………………… 30

6. Ergebnisse …………………………………………… 31

6.1. Mikroradiographie ………………………………….. 32

6.1.1. Knochendichte …………………………. 32

6.2. Histomorphometrie ………………………………….. 33

6.2.1. Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) ………… 33

6.3. Immunhistochemie ………………………………….. 34

6.3.1. Collagen I-Expression ...………………. 34

6.3.2. Osteocalcin -Expression ………………… 35

6.4. Zusammenfassung der Ergebnisse ………………… 37

7. Diskussion ………………………………………….. 38

8. Literaturverzeichnis …………………………………. 44

9. Verzeichnis benutzter Abkürzungen ……….. 52

10. Anhang …………………………………………………. .. 53

10.1. Herstellung der Gebrauchslösungen ……….. 53

11. Lebenslauf …………………………………………….. 56

12. Danksagung ……………………………………………. 57

6

1. Zusammenfassung

1.1. Hintergrund und Ziel

In der vorliegenden tierexperimentellen Studie wurden die Auswirkungen

einer mit synthetischem Peptid P-15 beschichteten Oberfläche auf die

Osseoinduktion und Osseointegration von Titanimplantaten in

diabetischen und nicht diabetischen Tieren untersucht. Das Ziel war ein

Vergleich der Ergebnisse mit einer Kontrollgruppe von Implantaten, deren

Oberflächen ausschließlich mit Säure und Korund behandelt wurden.

1.2. Material und Methode

Zur Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen wurde das Minipig

gewählt, da es sich in anderen tierexperimentellen Studien als

Versuchstier bewährt hat. 110 Implantate wurden in 2 Gruppen auf 22

Schweine aufgeteilt. Die Einbringung der Implantate erfolgte im Ober- und

Unterkiefer der Versuchstiere. Postoperativ fanden nach 1 Woche, 2

Wochen, 3 Monaten und 6 Monaten eine mikroradiographische,

histochemische und immunhistochemische Auswertung statt.

1.3. Ergebnisse

Es konnte kein signifikanter Unterschied bei den Parametern

Knochendichte und Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) zwischen den mit

Peptid P-15 beschichteten Implantaten und den unbeschichteten

Implantaten sowohl in der diabetischen als auch in der gesunden Gruppe

festgestellt werden.

1.4. Schlussfolgerung

Die gewonnenen Ergebnisse konnten keine Optimierung und

Verbesserung der Osseointegration bei den mit Peptid P-15 beschichteten

Implantaten gegenüber nicht beschichteten Implantaten aufzeigen.

7

2. Abstract

2.1. Background and aims

In this animal study, the effects were examined with a peptid P-15 coated

on the surface of titanium implants and osseointegration in diabetic and

healthy animals. The aim was to compare the results with a control group

of implants, whose surfaces were treated with acid and corundum.

2.2. Material and method

The transferability of results to humans, the minipig was chosen because it

has proven effective in other animal studies as an experimental animal.

110 implants were divided into 2 groups of 22 pigs. The insertion of the

implants occurred in the maxilla and mandible of test animals. After

surgery took place after 1 week, 2 weeks, 3 months and 6 months a micro-

radiographic, histochemical and immunohistochemical analysis.

2.3. Results

There was no significant difference in the parameters of bone density and

bone-implant contact (KIK) between the observed P-15 with peptid-coated

implants and uncoated implants in both the diabetic and the healthy group.

2.4. Conclusion

The results obtained were able to do not optimize and improve the

osteoinductive properties of peptid P-15 coated implants compared to

uncoated implants.

8

3. Einleitung

Die gegenwärtige Zahnmedizin befindet sich nach wie vor in einem

permanenten Prozess der Veränderung und Weiterentwicklung. In den

vergangenen 20 Jahren hat dabei die implantologische Tätigkeit einen

kontinuierlichen Einzug in die Zahnmedizin gehalten. So ist einem

Patienten die Option eines Zahnimplantats nicht mehr fremd, sondern wird

als Möglichkeit der Behandlung angesehen und ggf. auch eingefordert.

Der Grund hierfür liegt in einem größer werdenden Anspruch der

Patienten an Funktionalität und Ästhetik. Durch die Implantologie haben

sich die Behandlungsoptionen der Art vergrößert, dass einem Patienten im

Rahmen der zahnmedizinischen Behandlung oft unterschiedliche

Lösungsmöglichkeiten für seine persönliche Situation angeboten werden

können. Es ist nun möglich, Zähne einzeln zu ersetzen, ohne die

Nachbarzähne für eine Brückenkonstruktion zu beschleifen. Ferner kann

herausnehmbarer Zahnersatz auf Implantaten befestigt werden und lange

Freiendsituationen können mit festem Zahnersatz versorgt werden. Jedem

Patienten können diese Innovationen jedoch nicht zukommen. Als Grund

sind hier neben finanziellen, zahnmedizinische Gründe und auch

allgemeinmedizinische Faktoren zu nennen, die es verhindern können,

dass ein Patient implantologisch behandelt werden kann. So können

vorangegangene Therapien, ein zu geringes Knochenniveau oder

bestimmte Grunderkrankungen den Erfolg reduzieren oder auch

verhindern [13].

Bei den beeinträchtigenden Grunderkrankungen ist der Diabetes zu

nennen. In der westlichen Welt ist der Diabetes mellitus zahlenmäßig eine

stetig ansteigende endokrine Stoffwechselerkrankung. Studien gehen für

Deutschland von einem Diabetikeranteil von circa 7,5 Millionen Menschen

der Bevölkerung aus [1, 50]. Bei Bundesbürgern im Alter von 45-74

Jahren liegt die Rate bei 8,2%. Gerade diese Personen bilden in der

zahnmedizinischen Behandlung die potentielle Patientengruppe bei einer

zahnimplantologischen Behandlung [53]. Bei Patienten mit einer Diabetes

mellitus Erkrankung sind im Vergleich zu stoffwechselgesunden Patienten

aus der Implantologie geringere Überlebensraten von gesetzten

9

Implantaten dokumentiert [18, 19, 41, 45]. Folglich scheint der Diabetes

den Langzeiterfolg der Osseointegration zu beinträchtigen [12]. Aktuelle

Studien belegen, dass die Erfolgsquote für eine erfolgreiche

Osseointegration bei Diabetikern auf 85%-95% erhöht werden kann. Um

in diesen Prozentbereich zu kommen, ist es jedoch notwendig, dass bei

den diabetischen Patienten entsprechende Störfaktoren reduziert oder

ggf. vollständig beseitigt werden [37, 52]. Als Störfaktoren sind zu

benennen u.a.: Rauchen, schlechte Mundhygiene, schlecht eingestellter

Diabetes, eine Parodontitis und mangelhafte Maßnahmen bei Infektionen

[37, 55, 64].

Der Erfolg eines gesetzten Implantates lässt sich an Parametern wie

Osseointegration, Lokalisation, Funktionalität, Zufriedenheit des

Patienten, Ästhetik, Weichgewebsmanagement, festmachen. Bei der

Vielzahl der Kriterien ist ein Parameter besonders zu gewichten: die

Osseointegration. Diese bildet das Fundament, um andere

Erfolgsfaktoren adäquat beurteilen zu können; denn ohne eine

erfolgreiche Einheilung und ein damit verbundener Implantatverlust sind

andere Bewertungskriterien hinfällig. Eine Definition des Begriffes der

Osseointegration wurde von Branemark et al. vorgenommen. Er

bezeichnet ein Implantat als osseointegriert, wenn ein bewegungsloser

Kontakt zwischen einem gesundem Knochen und einem belastetem

Implantat besteht [8]. Um diesen Idealzustand zu erreichen, findet eine

permanente Implantatoptimierung in Form, Material, Beschichtung und

Verfahren statt.

Bei diesem Optimierungsprozess können einige Schritte besonders

benannt werden: Bei der Wahl des Materials konnte nachgewiesen

werden, dass Materialien mit einer niedrigen Biokompatibilität wie Silber

und Kupfer nach einer Implantation eine geringe oder gar keine

Osseointegration aufwiesen [2]. Somit fielen diese Materialien aus dem

weiteren Entwicklungsprozess heraus. Branemark et al. konnte in seinen

Studien belegen, dass Titan ein besonders gutes Implantatmaterial

darstellt; der Grund hierfür liegt in den spezifischen Eigenschaften von

Titan. In neueren Untersuchungen konnte verifiziert werden, dass Titan im

10

Vergleich mit Kobalt-Chrom und Stahl signifikant bessere Werte bei der

Osseointegration in den Parametern periimplantäre Knochendichte und

Knochen-Implantat-Kontakt aufweist [7, 49]. Zeichneten sich ferner in der

Anfangszeit der Implantologie die benutzten Implantate durch glatte

Oberflächen aus, so wurden in dem weiteren Entwicklungsprozess die

glatten Implantatoberflächen durch Korund gestrahlte und geätzte

Oberflächen abgelöst. Die Implantatoberfläche scheint dabei auf das

Zellwachstum und die Zelldifferenzierung von Osteoblasten Einfluss zu

nehmen und stellt somit einen wesentlichen Faktor für den

Knochenheilungsprozess dar. Es konnte nachgewiesen werden, dass die

Kombination von sandgestrahlten und geätzten Implantatoberflächen sich

im Gegensatz zu glatten Oberflächen positiv auf den

Knocheneinheilungsprozess auswirkt [9, 49]. Neueste Entwicklungen in

Forschung und Industrie zielen auf Implantatoberflächen hin, die

biofunktionalisiert werden, um eine schnellere Osseointegration zu

erreichen und so die Behandlungsdauer für die Patienten zu verkürzen.

11

4. Ziel der Arbeit

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Thema der Osseointegration

bei oberflächenbeschichteten Implantaten in einem Tiermodell. Es wurde

der Einfluss einer mit Peptid P-15 beschichteten ANKYLOS® Bioplus

Oberfläche auf den Einheilungsprozess im Ober- und Unterkiefer bei

diabetischen Tieren und nicht diabetischen Tieren im Vergleich mit einer

nicht beschichteten Implantatoberfläche untersucht.

Folgenden Fragen wurde in dieser experimentellen Tierstudie nach-

gegangen:

1. Ergeben sich signifikante Unterschiede bei der Verwendung von mit

P-15 beschichteten Implantatoberflächen und unbeschichteten

Oberflächen:

in Bezug auf die Knochendichte,

in Bezug auf den Knochen-Implantat-Kontakt (KIK),

in Bezug auf die immunhistochemische Analyse?

2. Wie wirkt sich die Verwendung einer mit P-15 beschichteten

Implantatoberfläche im Gegenüber zu einer unbeschichteten

Implantatoberfläche bei unbehandelten diabetischen Tieren aus?

12

5. Material und Methoden

5.1. Das Versuchstier

5.1.1. Die Wahl des Versuchstiers

Als Versuchstier wurde das Minipig gewählt. Dieses eignet sich

besonders für Studien der Knochenheilung, da die gewonnenen

Ergebnisse aufgrund der anatomischen und pathologischen Eigenschaften

des Schweines gut auf den Menschen übertragen lassen [24, 54, 56].

Physiologische und biochemische Vorgänge beim Schwein sind mit dem

menschlichen Körper vergleichbar [66]. Des Weiteren ist der

Schweineschädel in seiner anatomischen Struktur und Bezahnung dem

Menschen ähnlich [47, 70]. Somit kann man das Schwein als ein sehr

verlässliches Tiermodell in den Punkten Vergleichbarkeit,

Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit auf den Menschen verwenden.

5.1.2. Anzahl der Versuchstiere

Nach Genehmigung der tierexperimentellen Studie 54-2531.31-24/07

durch die zuständige Tierversuchskommission der Regierung

Mittelfrankens in Ansbach wurden 22 Tiere in das Forschungsprojekt

einbezogen.

5.1.3. Bildung der Versuchsgruppen

Die Tiere unterteilten sich in 14 diabetische und 8 gesunde Schweine.

Diese wurden wiederum in 4 Untergruppen eingeteilt, welche sich durch

den Opferungszeitpunkt bestimmten. Die Opferungszeitpunkte waren

nach 1 Woche, nach 2 Wochen, sowie nach 3 Monaten und 6 Monaten.

5.1.4. Induktion des Diabetes

Entsprechend einer Studie von Wilmowski et al. wurde Streptozotocin

(Pharmacia & Upjohn Co., Kalamazoo, MI, USA) in physiologischer

Kochsalzlösung auf 1g/10ml verdünnt und 90mg/kg Körpergewicht in die

Ohrvene über eine Zeitspanne von 30 Minuten verabreicht [30, 65]. Nach

Medikation mit Midazolam (1mg/kg/KG) (Dormicum®, Roche Deutschland

Holding GmbH, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) und Ketavet®

13

(10mg/kg/KG) (Ketavet®, Pharmacia, Erlangen) fand die Infusionsgabe in

Sedierung statt. Die Durchführung erfolgte 4-5 Stunden nach der

morgendlichen Fütterung.

Die Minipigs erfüllen nach die drei Diabeteskriterien der WHO (World

Health Organisation, 1999) und der ADA (American Diabetes Association,

2006). Diese sind folgende:

1. Blutzuckerwerte von über 200mg/dl in Kombination mit Polyurie,

Polydipsie und einer Polyphagie

2. Nüchternblutzuckerwerte von über 125 mg/ dl

3. Blutzuckerwerte von mehr als 200 mg/dl bei einer genormten

Glucose-Testlösung

Wilmowski et al. konnte nachweisen, dass bereits nach 6 Monaten

histopathologische Veränderungen des Weichgewebes und der Gefäße

eintreten. Ebenfalls vermindert sich die Knochenmineralisationsrate nach

12 Monaten. Diese Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen von

Marshall et al., der in seiner Studie ebenfalls Veränderungen der Gefäße

und des Gewebes nachweisen konnte [38].

5.2. Zeitlicher Ablauf mit graphischer Darstellung

Von der Streptozotocingabe bis zur Implantation verstrich ein Zeitraum

von 180 Tagen, da Wilmowski et al. und Marshall et al. wie oben

beschrieben histologisch nachgeweisen haben, dass bei diabetischen

Schweinen in einem Zeitraum dieser Länge bereits Mikroangiopathien

nach morphologischen Veränderungen entstehen [38, 65].

14

Präoperativ

Implantation:

Abbildung 1: Einteilung der Versuchsgruppen. Angegeben sind die Anzahl der Tiere pro

Versuchsgruppe, gesund (weiß) diabetisch (schwarz) im zeitlichen Verlauf von der Extraktion

über die Implantation bis hin zu den einzelnen Opferungszeitpunkten.

1.Gruppe Opferung: 1. Woche nach Implantation Anzahl: 4 diabetische Schweine 2 gesunde Schweine

2.Gruppe Opferung: 2. Woche nach Implantation Anzahl: 4 diabetische Schweine 2 gesunde Schweine

3.Gruppe Opferung: 3. Monat nach Implantation Anzahl: 3 diabetische Schweine 2 gesunde Schweine

Alle 22 Schweine Implantation der Schweine. Jedes Schwein erhält 12 Implantate.

Alle 22 Schweine Zahnextraktion im Oberkiefer und Unterkiefer. Plastische Deckung der Wunden

1 Woche

2 Wochen

3 Monate

6 Wochen vorher

4.Gruppe Opferung: 6. Monat nach Implantation Anzahl: 3 diabetische Schweine 2 gesunde Schweine

6 Monate

15

5.3. Implantatsystem

5.3.1. Implantateigenschaften

In unserer Studie wurde das Implantatsystem ANKYLOS® der Firma

DENTSPLY Friadent (DENTSPLY Friadent GmbH, Mannheim,

Deutschland) verwendet. Der Implantatkörper ist ein nicht

selbstschneidendes, konusförmiges Schraubenimplantat mit sich nach

apikal vergrößernder Gewindetiefe, welches in vier Durchmessern und

verschiedenen Längen erhältlich ist. In unserem Versuchsaufbau wurden

Implantate mit einer Länge von 11 mm und einem Durchmesser von 3,5

mm verwendet. Das Implantat bestand aus Titan des Grades 2, das nach

Angaben der Firma DENTSPLY Friadent aus mehr als 99% Titan besteht.

Außerdem enthält es geringe Mengen an elementarem Sauerstoff (max.

0,18 %), Kohlenstoff (max. 0,08 %), Stickstoff (max. 0,05 %), Wasserstoff

(max. 0,01 %) und Eisen (max. 0,25 %) [32]. Auch machte der Hersteller

Angaben zu weiteren physikalischen Werten: Das Implantat hat ein

Elastizitätsmodul von 110 GPa, eine Bruchdehnung von 45 % und eine

Zugfestigkeit von 470 N/mm². Ferner erhält die Oberfläche des

Implantates ihre Rauigkeit durch eine gezielte Korund Strahlung, welche

die primäre Mikrostruktur erzeugt. Die gestrahlten Implantate wurden

anschließend durch eine Hochtemperatur-Säureätzung mikrostrukturiert

und somit eine dreidimensionale Struktur geschaffen wird.

5.3.2. Beschichtung

Bei der Beschichtung der Implantate handelt es sich um das synthetisch

hergestellte Peptid P-15, welches in seiner Struktur durch eine

766GTPGPQGIAGQRGVV780, einer α1-Kette des Collagens Typ I

(Collagen I) entspricht und damit die organische Komponente des

Knochens repräsentiert [34]. Diese zeichnet sich verantwortlich für

Knochenneubildung und der Bindung von Zellen [6, 26]. Das Polypeptid P-

15 wurde an Hydroxylapatit auf der FRIADENT® plus Oberfläche der

Firma DENTSPLY gebunden.

16

5.4. Art und Durchführung der Eingriffe

Alle Eingriffe erfolgten in einer Intubationsnarkose. Den Tieren wurde eine

perioperative Antibiose verabreicht: 1 Stunde präoperativ bis 2 Tage

postoperativ zur Verringerung von Infektionsrisiken (Streptomycin, 0,5g/d,

Grünenthal GmbH, Aachen, Deutschland).

5.4.1. Zahnextraktion

Sechs Wochen vor der Implantation fand bei allen 22 Versuchstieren eine

Zahnextraktion im Ober- und Unterkiefer unter Schonung der umliegenden

Strukturen, vor allem der des Knochens, statt. Dabei wurden die distalen

Wurzeln der dritten und vierten Prämolaren im Ober- und Unterkiefer

entfernt sowie der erste Prämolar im Unterkiefer, an diesen Stellen

erfolgte die spätere Implantation. Die Extraktionsalveolen wurden plastisch

gedeckt, um eine bessere Wundheilung zu erzielen.

5.4.2. Implantation

Bei der Implantation im Ober- und Unterkiefer wurde das ANKYLOS®

System der Firma DENTSPLY Friadent benutzt. Im ersten Schritt wurde

ein Pilotbohrer benutzt, um anschließend die erforderliche Tiefe mit den

entsprechenden Bohrern herzustellen und manuell ein Gewinde zu

schneiden. Nach der Insertion wurde das Innengewinde mit einer

Verschlussschraube versehen.

Oberkiefer Unterkiefer

1x ANKYLOS® A11 plus

Hydroxylapatite surface

2x ANKYLOS® A11 plus

Hydroxylapatite surface

3x ANKYLOS® A11 Bioplus 1x ANKYLOS® A11 Bioplus

2x ANKYLOS® A11 plus 1x ANKYLOS® A11 plus

Tabelle 1: Darstellung der gesetzten ANKYLOS® Implantate im Ober- und

Unterkiefer je Tier. Informationen über die Art der Beschichtungen, die pro Kiefer

gesetzt wurden.

17

Abbildung 2: Darstellung der Anzahl und Implantatverteilung im Ober- und

Unterkiefer und ihre Positionierung auf dem Kieferbogen. Die Positionen 3,6,8,10

stellen den Bereich der distalen Wurzel des vierten Prämolaren da, die

Positionen 2,5,9,7 den Bereich der distalen Wurzel des dritten Prämolaren und

die Positionen 1,4 den Bereich des ersten Prämolaren.

5.4.3. Sektion

Nachdem die geplante Einheilzeit erreicht worden war, wurden die Tiere

geopfert. Die Minipigs erhielten zur Sedation eine i.m. – Injektion in die

Nackenregion mit Azaperone (1mg/kg KG) und Midazolam (1mg/ kg KG).

Anschließend erfolgte die Tötung durch eine intravasale Injektion 20%iger

Pentobarbitallösung in die Ohrvene bis zum Herzstillstand. Die Anzahl der

Tiere hat bei den ersten beiden Opferungszeitpunkten jeweils 6 Tiere

betragen. Bei den zwei folgenden waren es jeweils 5 Tiere. Nach der

Opferung wurden die Proben entnommen und bei -80°C eingefroren.

5.4.4. Entnahme und Aufarbeitung der Prüfkörper

Um sich einen Gesamtüberblick über die Lage der einzelnen Implantate

zu machen, wurden von jedem Schädel ein CT Bild angefertigt (Somaton

Sensation Open™, Siemens AG, Erlangen, Deutschland). Anschließend

wurden die Kiefer abgesetzt und es folgte das Separieren der einzelnen

Zahnimplantate mit einer speziellen Bandsäge (EXAKT Apparatebau,

Advanced Technologies, GmbH, Norderstedt, Deutschland). Um die

biologische Aktivität der Proteine in den Proben zu erhalten und die

organische Matrix zu insolubilisieren, wurden die Gewebeblöcke für drei

bis vier Tage bei 4°C in eine Immersionsfixierung 1,4 % Paraformaldehyd

(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) gelegt. Für eine bessere Wirkung

wurde diese Lösung täglich erneuert. Danach erfolgte bei

18

Raumtemperatur die Dehydration der Proben in einer aufsteigenden

Alkoholreihe.

Fixierung/ Dehydrierung Tage

1,4% Paraformaldehyd 4

70% Alkohol 5

80% Alkohol 5

90% Alkohol 5

96% Alkohol 5

100% Alkohol 5

100% Alkohol 5

Tabelle 2: Darstellung der durchgeführten Dehydrierung mittels einer

Alkoholreihe und ihr zeitlicher Verlauf in Tagen.

Als Intermedium kam Xylol (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland)

zum Einsatz. Die Immersion erfolgte in drei Stufen, wobei die Infiltration im

Kühlschrank bei 4°C unter kontinuierlichem Rühren stattfand. Eine

zeitliche Dauer von einer Woche pro Medium bei einer Probengröße von

1–2 cm hat sich dabei bewährt. Zur Einbettung wurde ein spezieller

Kunststoff verwendet. Es handelte sich um Technovit® 9100 NEU

(Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland). Dieser ermöglicht einen

quantitativen Nachweis von Knochenmatrixproteinen und ist zugleich

geeignet für die Durchführung des Trenn-Dünnschliffverfahren nach

Donath und Breuner [10]. Bei dem Kunststoff Technovit® 9100 NEU

handelt es sich um ein Kaltpolymerisat auf Methylmethacrylatbasis. Dieser

härtet unter Ausschluss von Sauerstoff bei -6°C innerhalb von 4 Tagen

aus.

5.5. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner

Bei der weiteren Verarbeitung der Kunststoffblöcke wurde nach dem

Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner verfahren [15].

Zunächst wurden die Kunststoffüberstände mit einer Säge (EXAKT

19

Apparatebau, Advanced Technologies, GmbH, Norderstedt, Deutschland)

auf einen Probenüberstand von 1-2 cm reduziert. Danach wurden die

Proben mit einem Längsschnitt in zwei Teile geteilt. Dabei wurde darauf

geachtet, dass auf beiden Längsschnitten eine Hälfte des Implantates

sowie randständigem Knochen vorhanden blieb. Der erste Schnitt diente

zur Anfertigung der Mikroradiographie mit anschließender Histologie. Der

zweite Schnitt wurde zum Anfertigen der Immunhistologie verwendet.

Danach wurden die Außenflächen der Knochenproben mit Technovit®

4000 (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) und einer Präzisions-

Klebepresse (EXAKT Apparatebau, Advanced Technologies, GmbH,

Norderstedt, Deutschland) auf angeraute Plexiglasobjektträger (Carl Roth

GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) aufgeklebt. Dann erfolgte eine

Bearbeitung der Proben auf den Objektträgern mit einer

Präzisionsschleifmaschine. Hierzu wurden die Proben eingespannt und

unter Wasserkühlung mit einer rotierenden, oszillierenden Bewegung plan

geschliffen. Dazu bediente man sich einer aufsteigenden Körnung des

Schleifpapieres (Hermes Schleifmittel GmbH & Co. KG, Hamburg,

Deutschland): beginnend mit 320, danach 800 und 1200. Abschließend

wurde die Oberfläche mit einem 4000 Schleifpapier hochglanzpoliert. Auf

die jetzt plane und hochglanzpolierte Probe wurde mit der Präzisions-

Klebepresse ein Plexiglasobjektträger planparallel mit Zyanoarclat

Technovit® 7210 VI-C (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland)

aufgeklebt. Der neu aufgeklebte Objektträger wurde dann mit einem rund

300 μm dicken Anteil der Probe von dem EXAKT-Trennsystem abgesägt.

Anschließend wurde die Schichtdicke der Proben auf ca. 200 μm mit dem

EXAKT-Schleifsystem (EXAKT Apparatebau, Advanced Technologies,

GmbH, Norderstedt, Deutschland) reduziert.

5.6. Mikroradiographie

Zur mikroradiographischen Untersuchung der Proben wurde das

Verfahren nach Freitag gewählt (1980). Dazu wurden die Proben zunächst

mit dem Schleifsystem EXAKT 400CS (EXAKT Apparatebau, Advanced

Technologies, GmbH, Norderstedt, Deutschland) auf eine Schichtdicke

von 90 μm reduziert. Der Röntgenvorgang erfolgte in einem Faxitron®-

20

Tischröntgengerät (Faxitron® R, Faxitron x-ray Corporation, Illinois, USA)

über 2 min 30 sec bei 15kV und 2,5 mA. Um eine hohe und gute

Auflösung zu erreichen, lag der Objekt-Film Abstand bei fast null, da die

Proben auf den Röntgenfilm gelegt wurden.

Abbildung 3: Die Präparate wurden mit dem Tischröntgengerät Faxitron®

geröntgt, um sie anschließend zu digitalisieren und mit einem

Bildbearbeitungsprogramm zuzuschneiden und zu kontrastieren.

Die entstandenen Röntgenbilder (Kodak GmbH, Stuttgart) wurden

entwickelt und mit einem Epson Scanner (Epson Perfection 4900 Photo)

mit 2400dpi und 8-bit-Grauskala gescannt und im Tiff-Format gespeichert.

Anschließend fand eine Auswertung der Bilder mittels BIOQUANT®

(BIOQUANT Image Analysis Corporation, Nashville, TN, USA) statt.

Dieses Programm kann den Anteil einer einzelnen Graustufe in dem Bild

bestimmen, so dass der prozentuale Anteil an Hartgewebe und die damit

verbundene Knochendichte ermittelt werden kann. Es wurden an 4

Stellen, den sogenannten Regions of Interest (ROI), eine jede Probe

vermessen, der Screenshot gespeichert und die Werte tabellarisch

erfasst.

21

Abbildung 4: Darstellung der Regions of Interest (ROI) zur Auswertung der

Mikroradiographien. Auf einer Implantatseite finden sich 2 Auswertungsbereiche

gleicher Größe.

Abbildung 5: Auswertung einer ROI mit Bioquant Osteo®. Nach der Markierung

der ROI (grünes Rechteck) werden der Knochen (rotgefärbter Bereich) und die

Implantatfläche innerhalb der ROI (weißgefärbter Bereich) markiert. Bioquant

Osteo errechnet daraus den prozentualen Anteil des markierten Knochens an der

Gesamtfläche in der ROI abzüglich der Implantatfläche.

1

2 3

4

22

5.7. Histomorphometrie

Die Toluidinblauschliffe wurden zur Ermittlung des Knochen-Implantat-

Kontaktes (KIK) verwendet. Um eine optimale Auswertung vornehmen zu

können, war es zunächst wichtig, die Proben auf eine Dicke von 30 μm zu

reduzieren, dadurch wurde eine Zellüberlagerung auf den Objektträgern

vermieden. Nach der letzten Politur wurden die Proben für 5 Minuten in

einem 10%igem H202 Bad behandelt. Anschließend wurden unter

laufendem Wasser die Proben gespült und danach getrocknet. Danach

erfolgte die Färbung in Toluidinblau-O-Lösung für 12 Minuten. Um die

überschüssige Farbe zu entfernen, wurden die Proben erneut unter

fließendem Wasser gespült. Die Auswertung des Knochen-Implantat-

Kontaktes fand mit einem Zeiss Lichtmikroskop - ausgestattet mit einer

Digitalkamera - (Axioskop, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland)

statt, welches ermöglichte, die Schliffe mittels des Programmes

BIOQUANT® Osteo Software V7.10.10 (BIOQUANT Image Analysis

Corporation, Nashville, TN, USA) einzulesen und auszuwerten. Das

Programm ermöglicht es, in einem Bildausschnitt die Implantatoberfläche

zu kennzeichnen und manuell zuzuweisen, an welcher Stelle ein KIK

besteht; der KIK ist dann prozentual errechenbar. Für die Auswertung der

Proben wurden 6 Regions of Interest (ROI) festgelegt.

23

Abbildung 6: Darstellung der ROI zur Auswertung der Toluidinblauschliffe. Auf

einer Implantatseite finden sich 4 Auswertungsbereiche gleicher Größe zur

Bestimmung des Knochen-Implantat-Kontaktes (KIK).

Abbildung 7: Exemplarische Darstellung des Auswertverfahrens der

Dünnschliffpräparate in Toluidinblau O Färbung mit dem Computerprogramm

BIOQUANT®. Hierdurch wird der prozentuale Anteil des Knochens mit der rot

dargestellten Implantatfläche berechnet.

2 3

1 4

5 6

7 8

24

5.8. Immunhistochemie

Bei der Immunhistochemie wurde mittels einer Komplexbildung durch

Antikörperzugabe die Gewebsantigene für das menschliche Auge sichtbar

gemacht. Da Knochenmatrixproteine beim Knochenumbau und der

Knochenregeneration eine entscheidende Rolle spielen, ist deren

Nachweis ein Kriterium zur Beurteilung des zeitlichen Prozesses der

Knochenregeneration. Deshalb wurden in dieser Studie folgende

Färbungen durchgeführt.

5.8.1. Collagen Typ I

Collagen ist ein Strukturprotein, das im menschlichen Organismus in der

extrazellulären Matrix vorkommt. Der prozentuale Anteil der Collagene am

Gesamtgewicht aller Proteine im Organismus beträgt 30%. Collagen ist

somit das am häufigsten vorkommende Protein im menschlichen Körper:

Es findet sich in Sehnen, Haut, Knorpel, Gefäßen und hat einen Anteil von

95 Prozent im Knochen [17]. Die extrazelluläre Matrix und damit auch das

Collagen sind für die biochemischen und mechanischen Eigenschaften

von Geweben verantwortlich und zeichnen diese aus. Collagen steht in

seiner Bedeutung nicht für ein einzelnes Protein, sondern ist der

Oberbegriff für eine ganze Gruppe von über 20 verschiedenen

Collagenen.

Allen Vertretern der Collagenfamilie ist ein Strukturmerkmal gemeinsam:

Sie besitzen eine charakteristische Tripelhelix, die aus drei

Polypeptidketten besteht [20]. Beim Collagen vom Typ I (Collagen I),

welches das häufigste Collagen darstellt, besteht die Tripelhelix aus zwei

identischen α1 (I)-Ketten und einer α2 (I)-Kette. Die Peptidketten teilen die

Eigenschaft, dass sie eine regelmäßig wiederholende Abfolge von Gly-X-Y

besitzen, dabei steht das X oft für Prolin und Y häufig für Hydroxyprolin

[68].

Die Biosynthese von Collagen I wird von bestimmten Zellen

übernommen: den Osteoblasten und Fibroblasten. Sie beginnt am rauen

endoplasmatischen Retikulum. Diese Vorläufermoleküle, die sogenannten

Pro-α-Ketten, die dort produziert werden, besitzen am N- und C-terminus

25

ein Propeptid. Anschließend werden am Golgi-Apparat die Prolin und

Lysin Reste hydroxyliert und glycolysiert. Mit der beginnenden Ausbildung

von Disulfidbrücken zwischen den C-terminalen Propetiden beginnt die

Tripelhelixbildung, diese wird fortgesetzt durch die Vernetzung mit

Wasserstoffbrücken der drei Pro-α-Ketten. Diese Vorläuferstufen werden

dann durch Exocytose in den extrazellulären Raum abgegeben. Dort

findet eine Abspaltung der Propeptide durch sogenannte Procollagen-

Peptidasen statt; es entstehen Tropocollagene, die sich zu Fibrillen

zusammenlagern. Mehrere Collagenfasern lagern sich zu

Collagenbündeln zusammen, womit die Synthese endet.

Bei der Osteoneogenese wirkt das Collagen wie folgt: Zunächst ist die

Bildung der extrazellulären Collagen I Matrix zu nennen; dieser Schritt

nimmt ungefähr 10 Tage in Anspruch [17]. Danach folgt die Mineralisation

dieser Matrix, wo sich Apatitkristalle entlang der Längsachse der

Collagenfasern anlagern und die Fasern als Kristallisationskeime wirken.

Dieser Vorgang erstreckt sich über eine Dauer von 2-3 Monaten [17] [67].

Mittlerweile konnte nachgewiesen werden, dass Collagen nicht nur eine

Leitstruktur ist, sondern auch andere aktivere Funktionen wahrnimmt. Es

konnte in Studien belegt werden, dass Collagen I einen Speicher für

Wachstumsfaktoren wie IGF-I und IGF–II und Cytokinen bildet. Diese

werden in der Struktur des Collagen gespeichert [4]. Dadurch ist das

Collagen an der Osteoblasten-Differenzierung beteiligt und induziert

dieselbe [39]. Auch wirkt das Collagen an der Apotose und Proliferation

der Osteoblasten mit [23, 69]. Daher kann man resümierend sagen, dass

Collagen I und seine Vorstufen bei der Knochenbildung und den

Umbauprozessen des Knochens eine wichtige Rolle spielen und sich

somit gut als Marker der frühen Knochenentwicklung eignet [58].

5.8.2. Osteocalcin

Osteocalcin, auch "bone γ-carboxylglutamic acid-containing protein"

(BGP) genannt, gehört zu den nicht collagenen Bestandteilen der

Knochenmatrix. Die Grundstruktur besteht aus 49 Aminosäuren und ist

mengenmäßig mit 1-2% in der nicht collagenen Matrix vorhanden. Der

26

Syntheseort ist im Knochen der Osteoblast und im Zahn der Odontoblast

und sie läuft während der Mineralisation ab. Es konnte nachgewiesen

werden, dass das Vorhandensein von Vitamin K die γ-Carboxylierung von

Osteocalcin fördert und sich somit positiv auf die Anheftung von

Hydroxyapatit an das Osteocalcin auswirkt. Durch diese Reaktion

verändert sich auch die Qualität der Knochenmatrix. Die nun veränderte

Knochenmatrix scheint einen Einfluss auf die Reifung der Knochendichte

zu haben [3]. Eine endgültige Funktionsbeschreibung von Osteocalcin im

Knochen und im Glucosestoffwechsel kann bis zum gegenwärtigen

Zeitpunkt nicht gemacht werden [25]. Nachgewiesen wurde bisher unter

anderem, dass bei ansteigenden Serumspiegeln von Calcium und

Phosphat und einer erhöhten Mineralisation des Knochens die Expression

von Osteocalcin ebenfalls linear ansteigt [27]. Durch diese erhöhte

Expression und der oben erwähnten Synthese im Osteoblasten kann

Osteocalcin als wichtiger Marker der Osteoblastenaktivität und der späten

Knochenreifung dienen [10].

5.8.3. Ablauf der Immunhistochemie

Zunächst wurde die zweite Hälfte des Probenblocks genommen und das

halbierte Implantat herausgelöst. Anschließend wurde diese Probenhälfte

erneut mit Technovit® 9100 NEU eingebettet und bei -6 °C 4 Tage

ausgehärtet. Nach dieser Zeit wurden zu große Probenüberstände mit

einer Säge (EXAKT Apparatebau, Advanced Technologies, GmbH,

Norderstedt, Deutschland) reduziert und die Ecken der Proben

abgerundet, um das spätere Schneiden zu erleichtern. Im Anschluss

wurden die Proben mit dem Kaltpolymerisat (Technovit® 3040; Heraeus

Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) auf spezielle Formen (Simport

Plastics Ltd., Beloein, QC, Kanada) geklebt. Es wurden Schnitte mit einer

Dicke von 5 μm angefertigt und auf einen Superfrost Ultra Plus

Objektträger (Menzel GmbH & Co. KG, Braunschweig, Deutschland)

mittels Ethanols gezogen. Nach dem Abdrücken des restlichen Ethanols

und dem Abdecken der Probe mit einer Polyethylenfolie (Heraeus Kulzer

GmbH, Hanau, Deutschland) wurden die Schnitte bei 58°C unter Druck in

einer Spindelpresse für eine Nacht im Wärmeschrank (Memmert GmbH &

27

Co. KG, Schwabach, Deutschland) aufbewahrt. Am nächsten Tag erfolgte

die Entfernung der Polyetylenfolie von den Proben.

Die Färbung

Zum Starten des Färbeverfahrens mit einem Antigen-Antikörpernachweis

mussten die Probenschnitte vorbehandelt werden. Diese Vorbehandlung

wurde bei allen zu färbenden Proben durchgeführt und bestand aus zwei

Abschnitten: Der Entacrylierung und einer anschließenden Rehydrierung.

Zur Entacrylierung wurden die Proben 60 Minuten unter Bewegung in 2

Methoxyethylacetat (MEA, Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn,

Deutschland) gegeben. Nach der Entacrylierung startete die Rehydrierung

in einer absteigenden Alkoholreihe. Danach wurden die Proben in 10%iger

Ethylendiamintetraessisäure-Lösung (DakoTM, Glostrup, Dänemark)

entkalkt. Zum Schluss fand ein Spülen der Proben unter fließendem

Leitungswasser statt. Die Proben kamen zuerst in ein aqua destillata (aq.

dest.) Bad und anschließend in einen Waschpuffer (Dako Wash Buffer

х10, Code S3006, DakoTM, Glostrup, Dänemark). Danach wurden die

Proben 22 Minuten in einem 95°C Citrat Bad (DakoCytomation Target

Retrieval Solution Citrate pH 6, х10, Code S2369) gestellt, um die

Zielantigene bei einem pH-Wert von 6,0 zu demaskieren. Ebenfalls

wurden noch bestehende Proteinvernetzungen, die durch die

Formalinfixierung entstanden waren, gelöst. Nach dem Abkühlen im

Waschpuffer konnte der eigentliche Färbevorgang gestartet werden.

Dieser fand in einem Dako Cytomation Autostainer Plus (DakoTM,

Glostrup, Dänemark) vollautomatisch statt. Bei jeder Färbung wurden zwei

Negativkontrollen angefertigt, die mit denselben Flüssigkeiten behandelt

wurden wie die zu färbenden Proben (ausgenommen dem

Primärantikörper). Als nächstes wurden die zu färbenden Proben mit einer

3%igen Wasserstoffperoxid/TBS-Pufferlösung behandelt, um die

Peroxidase zu blockieren. Um unerwünschte Reaktionen zu verhindern,

wurde der Proteinblock (Dako Protein Block Serum-Free, Code X0909,

DakoTM, Glostrup, Dänemark) aufgebracht. Zur Lokalisation der

spezifischen Gewebsantigene wurde die Labelled (Strept-)Avidin-Biotin-

Methode (LSAB) benutzt.

28

Zur Durchführung der LSAB-Methode ist das System der Firma Dako

(Dako REALTM Detection System, Alkaline Phosphatase RED, Rabbit

Mouse, DakoTM, Glostrup, Dänemark) benutzt worden. Dieses hatte sich in

vorherigen Studien als sehr zuverlässig erwiesen. Die LSAB-Methode

zeichnet sich durch folgende charakteristische Schritte aus (Abbildung 8):

1.Schritt:

Als erstes werden die zu färbenden Proben mit einem unkonjugiertem

Antikörper behandelt. Dieser bindet an das spezifische Antigen und lässt

ein Antigen-Antikörperkomplex entstehen.

2.Schritt:

Die Antikörper aus dem zweiten Schritt werden mit Antibodydiluent (Dako

REALTM Antibody Diluent, Code S2022, DakoTM, Glostrup, Dänemark) auf

die benötigte Konzentration verdünnt (Tabelle 3). Der nun biotinilierter

Antikörper bindet an den Primärantikörper.

3.Schritt:

Im dritten Schritt wird die Dako Streptavidin-Peroxidase (HRP) (DakoTM,

Glostrup, Dänemark) aufgetragen; sie bindet an den biotinilierten

Sekundärantikörper.

4.Schritt:

Im letzten Schritt wird das Substrat hinzugefügt. Bei diesem handelt es

sich um eine wasserstoffperoxidhaltige Substratlösung mit 3-Amino-9-

Ethylcarbazol (AEC). Das Substrat reagiert am Enzym und es entsteht ein

rotbraunes Produkt am Ort des nachzuweisenden Antigens.

29

Abbildung 8: Schematische Darstellung der Labelled-(Strept)-Avidin-Biotin-

Methode (LSAB-Methode).

Nachdem die Arbeitsschritte im Dako Cytomation Autostainer Plus

abgeschlossen worden waren, wurden die Proben entnommen und in

einem destillierten Wasserbad gespült. Der letzte Arbeitsschritt bestand in

einer Hämalaun-Färbung (Microscopy Mayers Hämalaunlösung, Merck

1.) Primärantikörper bindet an das Antigen

2.) Biotiylierter Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper

3.)Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (HRP) bindet an Biotin

4.) AEC und Wasserstoff werden unter der katalytischen Wirkung der Peroxidase zu einem rotbraunem Farbstoff umgesetzt

30

KGaA, Darmstadt, Deutschland). Um überschüssige Farbe zu entfernen,

fand eine erneute Spülung unter fließendem Wasser statt und ein

abschließendes Bad in destilliertem Wasser. Zum Schluss wurden die

Proben mit einem Deckglas und einem Einschlussmedium (Microscopy

Aquatex®, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) versiegelt.

Antikörper Hersteller Typ Gewonnen

aus

Konzentration

Collagen I

(Col-I)

Abcam,

Monoklonal Maus 1:10000

Osteocalcin

(OC 4-30)

Takara Monoklona Maus 1:10000

Tabelle 3: Darstellung verwendeter Antikörper und deren Konzentration zur

Herstellung der immunhistochemischen Färbungen.

5.9. Statistik

Die Proben wurden von zwei Untersuchern ausgewertet und die

gewonnen Ergebnisse in das Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2007®

(Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) übertragen. Zur graphischen

Darstellung wurden die arithmetischen Mittelwerte ermittelt und die

Standardabweichung errechnet. Zur Darstellung wurde die

Standardabweichung den Graphen der Mittelwerte additiv aufgesetzt. Zur

Bestimmung etwaiger Signifikanzen wurde der Wilcoxon-Vorzeichen-

Rank-Test mit dem Programm AXUM® (Math Software, Cambridge, USA)

benutzt, dabei wurde ein Signifikanzniveau (p-value) von p≤0,05 zu

Grunde gelegt.

31

6. Ergebnisse

Grundlage dieser Tierstudie sind die bei diabetischen und

stoffwechselgesunden Tieren (Minipigs) im Ober- und Unterkiefer

eingebrachten Implantate (mit Peptid P-15 beschichtete Implantate

ANKYLOS® A11 Bioplus und unbeschichtete Implantate ANKYLOS® A11

plus).

Ausgangspunkt der Ergebnisdarstellung sind die mikroradiographischen,

histochemischen und immunhistochemischen Resulate der postoperativen

Auswertung nach 1 und 2 Wochen. Bei der postoperativen Untersuchung

nach 3 bzw. 6 Monaten konnte kein belastbares und aussagekräftiges

Datenmaterial ermittelt werden, da die in die Auswertung einbezogenen

Tiere keinen komplikationslosen postoperativen Heilungsverlauf

aufzeigten. Es stellte sich zu diesen Zeitpunkten ein fast vollständiger

Verlust der zur Verfügung stehenden Implantate bei den Tieren ein, so

dass keine hinreichenden Prüfkörper für eine Analyse, eine Darstellung

von Resultaten und der daraus resultierenden Folgerungen vorhanden

waren.

Die vergleichende Darstellung der beiden Implantatsysteme (mit Peptid P-

15 beschichtete Implantate ANKYLOS® Bioplus und unbeschichtete

Implantate ANKYLOS® plus) erfolgte zum einen unter dem Aspekt der

stoffwechselgesunden Tiere im Gegenüber zu (unbehandelten)

diabetischen Tieren. Zum anderen wurde in die Beschreibung die Dauer

der Implantateinheilung mit einbezogen. Die unterschiedlichen Regions of

Interest (ROI) der Minipigs wurden schließlich in der Darstellung zu einer

Datenbasis summiert, da signifikate Differenzen bei der Analyse der zur

Verfügung stehenden Daten einen Vergleich der einzelnen ROI´s nicht

möglich machten.

32

6.1. Mikroradiographie

6.1.1. Knochendichte

Abbildung 9: Periimplantäre Knochendichte [%], nach der 1.Woche und

2.Woche im diabetischen und gesunden Stoffwechsel. Ankylos Bioplus entspricht

den Implantaten mit der P-15 Beschichtung, Ankylos Plus den geätzten und

Korund gestrahlten Implantaten. Fehlerindikatoren stellen die

Standardabweichung dar.

Gesunde Stoffwechsellage: Nach 1 Woche ließ sich bei den Proben mit

P-15 beschichteten Implantaten eine Knochenmineralisationsrate von

50,2% ± 21,0% und in der unbeschichteten Implantatgruppe von 41,7% ±

16,1% nachweisen. Nach 2 Wochen zeigte die P-15-Gruppe eine

periimplantäre Knochendichte von 50,4% ± 22,4% und die Kontrollgruppe

71,9% ± 25,4%.

Diabetische Stoffwechsellage: Nach 1 Woche betrug die periimplantäre

Knochendichte der P-15-Gruppe 61,9% ± 22,8% und die der

Kontrollproben 55,6% ± 25,2%. Nach 2 Wochen fiel die Knochenmine-

ralisationsrate in der P-15-Gruppe auf 57,6% ± 23,8% und stieg in der

Kontrollgruppe auf 69,3% ± 20,3% an.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ankylos Bioplus Ankylos Plus Ankylos Bioplus Ankylos Plus

Kn

och

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) [%

]

1.Woche

Gesund

Diabetisch

2.Woche

1

2 3

4

33

6.2. Histomorphometrie

6.2.1. Knochen-Implantat-Kontakt (KIK)

Abbildung 10: Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) in [%], nach der 1.Woche und

2.Woche im diabetischen und gesunden Stoffwechsel. Ankylos Bioplus entspricht

den Implantaten mit der P-15 Beschichtung, Ankylos Plus den nur geätzten und

Korund gestrahlten Implantaten. Fehlerindikatoren stellen die Standardab-

weichung dar.

Gesunde Stoffwechsellage: Nach 1 Woche zeigten die Proben mit Bioplus

beschichteten Implantaten eine KIK-Rate von 41,3% ± 25,7% und die mit

Plus beschichtete Implantatgruppe von 39,7% ± 22,7%. Nach 2 Wochen

ließ sich in der Bioplus-Gruppe eine KIK-Rate von 27,4% ± 25,7% und in

der Plus-Gruppe von 40,7% ± 13,2% nachweisen.

Diabetische Stoffwechsellage: Nach 1 Woche betrug die KIK-Rate der

Bioplus-Gruppe 30,3% ± 24,0% und die der Plus-Proben 26,0% ± 19,9%.

Nach 2 Wochen betrug die KIK-Rate bei der Bioplus-Gruppe 29,4% ±

24,1% und in der Plus-Gruppe 30,6% ± 25,2%.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ankylos Bioplus Ankylos Plus Ankylos Bioplus Ankylos Plus

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%

1.Woche

Gesund

Diabetisch

2.Woche

34

6.3. Immunhistologie

6.3.1. Collagen I-Expression

Abbildung 11: Periimplantäre Collagen-Typ I- Expression/Fläche [%], nach der

1. Woche und 2.Woche im diabetischen und gesunden Stoffwechsel. Ankylos

Bioplus entspricht den Implantaten mit der P-15 Beschichtung, Ankylos Plus den

nur geätzten und Korund gestrahlten Implantaten. Fehlerindikatoren stellen die

Standardabweichung dar.

Gesunde Stoffwechsellage: Nach 1 Woche zeigten die Proben mit Bioplus

beschichteten Implantaten eine periimplantäre Collagen I-Expression von

48,0% ± 24,8%. In der Plus beschichteten Gruppe belief sich der Wert für

die Collagen I-Expression auf 51,3% ± 14,7%. Nach 2 Wochen lag die

periimplantäre Collagen I-Expression bei den Bioplus beschichteten

Implantaten bei 31,3% ± 19,8%. Bei den Plus beschichteten Implantaten

lagen folgende Werte vor 35,3% ± 24,7%.

Diabetische Stoffwechsellage: Nach 1 Woche betrug die periimplantäre

Collagen I-Expression der Bioplus-Gruppe 35,9% ± 22,6% und die der

Plus-Proben 29,0% ± 22,8%. Nach 2 Wochen betrug periimplantäre

Collagen I-Expression bei der Bioplus-Gruppe 38,6% ± 24,9% und in der

Plus-Gruppe 34,3% ± 25,7%.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ankylos Bioplus Ankylos Plus Ankylos Bioplus Ankylos Plus

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(B

V/T

V)[

%]

1.Woche

Gesund

Diabetisch

2.Woche

35

6.3.2. Osteocalcin-Expression

Abbildung 12: Periimplantäre Osteocalcin-Expression/Fläche [%] nach der 1.

Woche und 2.Woche im diabetischen und gesunden Stoffwechsel. Ankylos

Bioplus entspricht den Implantaten mit der P-15 Beschichtung, Ankylos Plus den

nur geätzten und Korund gestrahlten Implantaten. Fehlerindikatoren stellen die

Standardabweichung dar.

Gesunde Stoffwechsellage: Nach 1 Woche zeigten die Proben mit Bioplus

beschichteten Implantaten eine periimplantäre Osteocalcin-Expression

von 29,1% ± 22,9% und die mit Plus beschichtete Implantatgruppe von

35,2% ± 25,5%. Nach 2 Wochen ließ sich in der Bioplus-Gruppe eine

periimplantäre Osteocalcin-Expression von 29,7% ± 23,2% und in der

Plus-Gruppe von 31,7% ± 21,7% nachweisen.

Diabetische Stoffwechsellage: Nach 1 Woche betrug die periimplantäre

Osteocalcin-Expression der Bioplus-Gruppe 34,4% ± 20,1% und die der

Plus-Proben 27,8% ± 18,7%. Nach 2 Wochen betrug die periimplantäre

Osteocalcin-Expression bei der Bioplus-Gruppe 35,5% ± 25,7% und in der

Plus-Gruppe 33,0% ± 23,5%.

0

10

20

30

40

50

60

70

Ankylos Bioplus Ankylos Plus Ankylos Bioplus Ankylos Plus

Oste

oca

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r./F

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V/T

V) [%

}

1.Woche

Gesund

Diabetisch

2.Woche

36

Abbildung 13: Darstellung eines Toluidinblauschliffes zur Ermittlung des

Knochen-Implantat-Kontaktes von einem ANKYLOS ® Bioplus Implantat mit der

P-15 Beschichtung zum Auswertungszeitpunkt nach 1 Woche.

Abbildung 14: Darstellung eines Toluidinblauschliffes zur Ermittlung des

Knochen-Implantat-Kontaktes von einem ANKYLOS ® Bioplus Implantat mit der

P-15 Beschichtung zum Auswertungszeitpunkt nach 2 Wochen.

37

6.4. Zusammenfassung der Ergebnisse Wertetabelle 1: Chronologische Gliederung

Knochendichte%

Knochen-Impl.-Kontakt(KIK)%

Osteocalcin– Expression%

Collagen I– Expression%

1.Woche Gesund

Bioplus Plus

Diabetisch Bioplus Plus

50,2±21,0 41,7±16,1 61,9±22,8 55,6±25,2

41,3±25,7 39,7±22,7 30,3±24,0 26,0±19,9

29,1±22,9 35,2±25,5 34,4±20,1 27,8±18,7

48,0±24,8 51,3±14,7 35,9±22,6 29,0±22,8

2.Woche Gesund

Bioplus Plus

Diabetisch Bioplus Plus

50,4±22,4 71,9±25,4 57,6±23,8 69,3±20,3

27,4±25,7 40,7±13,2 29,4±24,1 30,6±25,2

29,7±23,2 31,7±21,7 35,5±25,7 33,0±23,5

31,3±19,8 35,3±24,7 38,6±24,9 34,3±25,7

Wertetabelle 2: Gliederung nach Stoffwechsellage

Knochendichte%

Knochen-Impl.-Kontakt(KIK)%

Osteocalcin– Expression%

Collagen I– Expression%

Gesund Bioplus

1.Woche 2.Woche

Plus 1.Woche 2.Woche

50,2±21,0 50,4±22,4 41,7±16,1 71,9±25,4

41,3±25,7 27,4±25,7 39,7±22,7 40,7±13,2

29,1±22,9 29,7±23,2 35,2±25,5 31,7±21,7

48,0±24,8 31,3±19,8 51,3±14,7 35,3±24,7

Diabetisch Bioplus

1.Woche 2.Woche

Plus 1.Woche 2.Woche

61,9±22,8 57,6±23,8 55,6±25,2 69,3±20,3

30,3±24,0 29,4±24,1 26,0±19,9 30,6±25,2

34,6±20,1 35,5±25,7 27,8±18,7 33,0±23,5

35,9±22,6 38,6±24,9 29,0±22,8 34,3±25,7

38

7. Diskussion

In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss einer mit synthetischem

Peptid (P-15) beschichteten Implantatoberfläche auf die frühe

Osseointegration in einem diabetischen Tier untersucht (FRIADENT®

bioplus Oberfläche). Dazu wurden die Ergebnisse in Korrelation zu einer

Tiergruppe mit unbeschichteten Implantaten gestellt, deren Oberflächen

nur mit Säure und Korund behandelt wurden (FRIADENT® plus

Oberfläche). In wissenschaftlichen Studien konnte bereits die positive

Wirkung dieser FRIADENT® plus Oberfläche bei der Osseointegration

nachgewiesen werden [14, 16, 43, 44, 51]. Zur Gewinnung von

Vergleichsdaten erfolgte in dieser Studie die Implantation der

beschichteten und unbeschichteten Implantate sowohl beim diabetischen

als auch beim stoffwechselgesunden Schwein (Minipig). Als Implantatort

wurde der Ober- und Unterkiefer der Schweine gewählt. Die Analyse der

gewonnenen Daten erbrachte keinen signifikanten Unterschied zwischen

beschichteten und unbeschichteten Implantaten sowohl bei der

stoffwechselgesunden als auch bei der diabetischen Tiergruppe. Eine

Optimierung der Osseointegration durch mit P-15 beschichteten

Implantaten gegenüber unbeschichteten Implantaten konnte nicht belegt

werden. Dieses Ergebnis ist in einen kritischen Diskurs mit anderen

Studien zu stellen, die bei der Verwendung von P-15 beschichteten

Implantatoberflächen im Tiermodell eine Optimierung der

Osseointegration im stoffwechselgesunden Tiermodell nachweisen

konnten [36].

Betrachten wir zunächst die Ergebnisse der stoffwechselgesunden

Tiergruppe und setzen dann die Daten der diabetischen Tiergruppe dazu

in Korrelation. Zur Beurteilung der Implantatoberfläche wurden der

Knochen-Implantat-Kontakt (KIK), die Knochendichte, als auch die

Expression des Knochenmatrixmoleküls Collagen I und Osteocalcin

untersucht.

In der stoffwechselgesunden Tiergruppe konnten im untersuchten

Zeitraum beim Knochen-Implantat-Kontakt (KIK)-Wert keine signifikanten

Differenzen zwischen den Werten bei den unbeschichteten und

39

beschichteten Implantaten festgestellt werden. Die Werte lagen fast auf

gleicher Höhe. Bei den unbeschichteten Implantaten betrugen sie (39,7%

und 40,7%) und bei den beschichteten Implantaten (41,3% und 27,4%). In

anderen Tierstudien, die sich mit oberflächenmodifizierten Implantaten

beschäftigten, konnte dagegen eine signifikante Optimierung der initialen

Osseointegration durch die Verwendung von biochemisch behandelten

Implantatoberflächen nachgewiesen werden. [59] Es muss auch

berücksichtigt werden, dass die Versuchsparameter der einzelnen

Studien nicht genormt waren und so ein direkter Vergleich

Differenzierungen nötig macht und Interpretationsspielräume bietet. So

gibt es Unterschiede im Studiendesign, in der Lokalisation der Implantate

bei der Wahl der Versuchstiere, der Auswertungsmethoden und der

Untersuchungszeitpunkte. Bezieht man diese Fakten in unsere

Betrachtung mit ein, so wird verständlich, dass sich in vergleichbaren

Studien bei den Ergebnissen gegenüber dieser Studie Differenzen und

Unterschiede einstellen. Schliephake et al. verglichen biofunktionalisiert

Oberflächen mit glatten Titanoberfächen. Als Versuchstier wurde der Hund

gewählt. Sie konnten in ihrer Studie einen Vorteil der modifizierten

Oberflächen gegenüber glatten Oberflächen nachweisen. Der KIK-Wert

erhöhte sich im ausgewerteten Untersuchungszeitraum. Ein Vorteil der

biofunktionalisierten Implantate zeigte sich dabei im Vergleich zu glatten

Oberflächen. Ein signifikanter Vorteil im Vergleich mit geätzten

Oberflächen konnte dagegen von ihnen nicht ermittelt werden [57]. Lutz

et al. und Tima untersuchten in ihren jeweiligen Studien am Minipig mit P-

15 behandelte Implantatoberflächen und verglichen diese mit

unbeschichteten Oberflächen, als Implantatort wurde die Schädelkalotte

des Schweines gewählt [62] . Das Ergebnis ihrer Untersuchungen bestand

im Aufweis eines erhöhten KIK-Wertes und eines damit verbundenen

signifikanten Vorteils der mit P-15 beschichteten Implantate [36] . Die

Knochen-Implantat-Kontakt (KIK)-Werte dieser Studie belegen dagegen in

der stoffwechselgesunden Tiergruppe keinen signifikanten Vorteil der

beschichteten Implantate gegenüber den unbeschichteten Implantaten.

Dieses Ergebnis bestätigt sich auch in der Darstellung der

mikroradiographischen Messdaten.

40

Zur Beurteilung des Osseointegration bei Implantaten diente in dieser

Studie neben der Ermittlung des KIK-Wertes die mikroradiographische

Bestimmung der periimplantären Knochendichte. Lutz et al. hatten in

ihrer Studie am Schwein bei den mit P-15 beschichteten Implantaten eine

Optimierung der Knochen-mineralisationsrate nachweisen können [36]. In

dieser Studie konnte im untersuchten Zeitraum bei den

stoffwechselgesunden Tieren ein differenzierter Verlauf ermittelt werden.

Die Werte stiegen unwesentlich bei den beschichteten Implantaten (50,2%

auf 50,4%) und erzielten damit keine signifikant höheren Werte gegenüber

den unbeschichteten Implantaten (41,7% auf 71,9%).

Zur weiteren Beurteilung der Osseointegration der unbeschichteten und

beschichteten Implantate wurden immunhistologischen Untersuchungen

vorgenommen. Als Parameter dienten die Collagen I -Expression und die

Osteocalcin-Expression. Beide Parameter stehen für einen anderen

Zeitpunkt in der Knochenbildungsphase.

Collagen I ist ein Indikator in der frühen Phase der Knochenentwicklung

und kann als Frühindikator bei der Knochensynthese angesehen werden.

Die Bildung eines Knochens beginnt mit der Genese eines

Collagengerüstes, das primär aus Collagen I-Fasern besteht. Diese

Phase dauert ca. 10 Tage [17]. Daran schließt sich ein ca. 3-4 Monate

dauernder Mineralisationsvorgang an [17, 61]. Thorwarth et al. konnten in

ihrer Studien nachweisen, das Collagen I ein Frühindikator der

Knochenbildung ist. Nach zwei Wochen wird das Maximum in der

Collagen I-Expression erreicht. Nach 1 Monat fallen diese Werte im

gesunden Organismus ab [61]. In dieser Studie konnten in der gesunden

Tiergruppe sowohl bei den unbeschichteten als auch bei den

beschichteten Implantaten nach einer Woche ein erhöhter Wert bei der

ersten Messung festgestellt werden, der dann bei der zweiten Messung

absank (unbeschichtete Implantate 51,3% auf 35,3%, beschichtete

Implantate 48,0% auf 31,3%). Diese Daten werden durch Erkenntnisse

der Studie von Thorwarth et al. unterlegt und deuten auf eine früh

einsetzende Knochenbildung hin. Zum anderen zeigt der Vergleich der

Werte, dass auch bei diesem Parameter, der Collagen I-Expression, kein

41

Vorteil der beschichteten Implantate gegenüber den unbeschichteten

Implantaten festgestellt werden kann.

Daneben wurde in der immunhistologischen Untersuchung die

Osteocalcin-Expression als zweiter Parameter zur Bestimmung der

Osseointegration von Implantaten verwendet. Osteocalcin ist ein Marker

der späten Osteoblastenentwicklung, das in der späteren Phase der

Osteointegration gebildet wird [5]. Untersuchungen haben ergeben, dass

Osteocalcin am Anfang der Mineralisationsphase induziert wird und somit

deutlich nach der Expression zeitlich vorhergehender Marker wie Collagen

I [46]. Thorwarth et al. hat in seiner Studie beschrieben, dass das die

Mineralisation steuernde Protein Osteocalcin nach 3 Monaten sein

Expressionsmaximum erreicht und in den ersten Wochen nur in geringen

Mengen synthetisiert [61]. Die Analyse der Osteocalcin-Expression in

dieser Studie konnte in den stoffwechselgesunden Tieren weder bei den

unbeschichteten Implantaten (35,2% und 31,7%) noch bei den

beschichteten Implantaten (29,1% und 29,7%) entscheidende

Veränderung konstatieren. Dieses durfte auch auf Grund der zur

Verfügung stehenden Datenbasis der ersten 2 Wochen nicht erwartet

werden, da Osteocalcin ein später Marker der Osseointegration ist. Auch

im direkten Vergleich zwischen unbeschichteten und beschichteten

Implantaten kann kein signifikanter Vorteil aus Seiten der chemisch

modifizierten Implantate ermittelt werden.

Die immunhistologische Untersuchung dieser Studie unterlegen somit

beim Marker Collagen I-Expression die Resultate der Knochen-Implantat-

Kontakt-Wertebestimmung und der Knochendichtemessung. In

vergleichbaren wissenschaftlichen Studien bietet sich ein differenziertes

Bild. In den Studien von Lutz et al. [36, 62] konnten diese Parametern

ebenfalls keine eindeutig signifikanten Ergebnisse erbringen. Dagegen

untermauerten die beiden Marker in anderen Studien den Vorteil chemisch

modifizierter Implantatoberflächen bei der Osseointegration [40, 48]. Die

Zusammenschau der Untersuchungsparameter dieser Studie kann

dagegen mit den ermittelten Vergleichsdaten nicht belegen, dass bei der

Osseointegration ein Vorteil beschichteter gegenüber unbeschichteter

Implantate besteht.

42

Primäres Ziel dieser Studie war die Beschreibung des Einflusses einer mit

P-15 beschichteten Implantatoberfläche auf die Osseointegration im

diabetischen Tiermodell. Die Resultate der stoffwechselgesunden

Tiergruppe gilt es nun mit der Datenbasis der diabetischen Tiergruppe in

Korrelation zu stellen.

Bei der Bewertung der verschiedenen Parameter der diabetischen

Tiergruppe ist von der Beobachtung auszugehen, dass ein unbehandelter

Diabetes die Osseointegration von Implantaten negativ beeinflusst [29].

Wissenschaftliche Studien belegen, dass Diabetes den

Knochenheilungsprozess später eintreten lässt [22, 28]. Dieses zeigt sich

auch bei den mikroradiographischen Werten der Knochendichte [21]. Die

verschlechterte Osseointegration von Implantaten zeigt sich ebenso in

niedrigeren Werten der Knochen-Implantat-Kontakt-Bestimmung (KIK-

Wert) [40]. Ferner haben Studien aufgezeigt, dass eine eingeschränkte

Expression von Osteocalcin bei Diabetserkrankung eintritt [33, 35, 42, 60].

Studien von Colombo et al. haben aufgezeigt, dass im diabetischen

Organismus eine verspätete Knochenformation aufgewiesen werden kann

[11]. Zwar verzögert sich der Einheilungsprozess eines Implantates bei

einem diabetischen Tiermodell, aber am Ende des Prozesses können

keine Differenzen zwischen gesunden und diabetischen Tiermodellen im

Knochen-Implantat-Resultat ausgemacht werden [31]. Der Einfluss des

Implantatortes wird in verschiedenen Studien hervorgehoben. Neben der

Schädelkalotte wurde auch der Ober- und/oder Unterkiefer des Schweines

gewählt, was sich auf die Parameterwerte bei Bestimmung der

Osseointegration auswirkte. Es zeigte sich, dass in diabetischen

Tiermodellen die Kalotte eine Osseointegration gegenüber dem Ober- und

Unterkiefer befördert [40]. Eine Erklärung findet dieser Sachverhalt in der

sich differierenden Knochenbeschaffenheit von Schädelkalotte und Ober-

und Unterkiefer [63]. Stellen wir die ermittelten Werte dieser Studien in

diesen wissenschaftlichen Kontext, so unterlegen und verdeutlichen die

anderen Studien die hier ermittelten Resultate. In der

mikroradiographischen Analyse zur Bestimmung des Knochen-Implantat-

Kontaktes liegt die diabetische Tiergruppe sowohl bei den beschichteten

Implantaten als auch bei den unbeschichteten Implantaten hinter den

43

Werten der stoffwechselgesunden Tiergruppe (Bioplus: 30,3% und 29,4%

gegenüber 41,3% und 27,4%; Plus: 26,0% und 30,6% gegenüber 39,7%

und 40,7%). Ebenso können bei der Betrachtung der immunhistologischen

Werte, insbesondere der Bestimmung der Collagen I-Expression,

niedrigere Werte bei allen Implantatoberflächen der diabetischen

Tiergruppe beschrieben werden (Bioplus: 35,9% und 38,6% gegenüber

48,0% und 31,3%; Plus: 29,0% und 34,3% gegenüber 51,3% und 35,3%)

Bei der Osteocalcin-Expression, einem späten Parameter in der

Osseointegration, und der Knochendichtebestimmung bieten die

ermittelten Daten keine interpretierbare Wertegrundlage. In der

Zusammenschau der verschiedenen Parameter spiegelt diese Studie die

Ergebnisse anderer Studien wieder, dass Diabetes die Osseointegration

negativ beeinflusst. Der direkte Vergleich der einzelnen Werte im

Gegenüber von unbeschichteten und beschichteten Implantaten belegt

auch bei der diabetischen Tiergruppe keinen ausweisbaren Vorteil der

beschichteten Implantate. Sowohl in der gesunden als auch in der

diabetischen Tiergruppe konnten in dieser Untersuchung die beschichten

Implantate keinen signifikanten Vorteil erzielen.

Zusammenfassend lässt sich konstatieren, dass die Analyse und der

Vergleich von wesentlichen Parametern der Osseointegration die

wissenschaftlichen Ergebnisse einer negativen Beeinflussung von

unbehandelter Diabetes auf die Einheilung von Implantaten bestätigen.

Daneben konnte in dieser Studie auf der vorhandenen Datenbasis im

Vergleich von unbeschichteten und mit synthetischem Peptid (P-15)

beschichteten Implantatoberflächen, sowohl in der stoffwechselgesunden

als auch in der diabetischen Tiergruppe, kein signifikanter Unterschied bei

der Osseointegration ermittelt werden. Unter Berücksichtigung der

Übertragbarkeit der in dieser Tierstudie gewonnenen Erkenntnisse auf den

Menschen lässt sich konstatieren: Die mit P-15 beschichteten Implantate

bieten gegenüber den unbeschichteten Implantaten in der Verwendung

bei Diabetikern keinen Vorteil.

44

8. Literaturverzeichnis

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52

9. Verzeichnis benutzter Abkürzungen

AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol

aq. dest. aqua destillata

BGP bone γ-carboxylglutamic acid-containing protein

Bit binary digit

BV/TV bone volume / tissue volume ratio

dpi dots per inch

i.m. intramuskulär

KIK Knochen-Implantat-Kontakt

LSAB-Methode Labelled-(Strept-)Avidin-Biotin-Methode

OC Osteocalcin

ROI Region of Interest

Tiff Tagged Image File Format

53

10. Anhang

10.1. Herstellung der Gebrauchslösungen

Färbeprotokoll Toluidinblau-O: Zeitdauer Arbeitsschritte

Objektträger in Glasküvetten einlegen

15 min Präparate in 30%iger H202 Lösung

5 min Unter fließendem Leitungswasser

Trocknen der Präparate mit Papiertüchern

12 min Färbung in Toluidinblau-O

5 min Unter fließendem Leitungswasser

Lichtgeschützte Lagerung der Proben

Rezept Toluidinblau-O

Ansatz A

800 ml aq. dest.

8 g Di-Natrium-Tetraborat Borax (Merck 106306)

8 g Toluidinblau-O (Chroma 1B481)

15 min rührend mischen

Ansatz B

200ml aq. dest.

2 g Pyronin G (Merck 107518)

Ansatz A + B

15 min rührend mischen

15 min Ansatz A und B vermischen und 2-mal filtrieren

14 Tage Lichtgeschützt reifen lassen

54

Färbeprotokoll für Osteocalcin

Osteocalcin (Takara M041, OC4-30)

Zeit Temperatur Arbeitsschritt

3x20 min RT MEA Entacrylierung

RT Alkoholreihe und aq. dest. Bad

20 min RT EDTA 10%

10 min RT Fließendes Wasser

3x2 min RT aq. dest.

3x2 min RT Dako Waschpuffer pH7,4 (Dako S3006)

25 min 100°C Citratpuffer pH 6,0 (Dako S2369)

25 min RT auskühlen

3x2 min RT Dako Waschpuffer pH 7,4 (Dako S3006)

15 min RT Avidin (Dako X0590)

15 min RT Biotin (Dako X0909)

1 h RT Osteocalcin, 1:10.000 Primärer Antikörper

15 min RT Sekundärer Antikörper

15 min RT Streptavidin-AP-Komplex

8 min RT Chromogen Red K5005

6 min RT Chromogen Red 2 K5005

10 min RT aq. dest.

5 min RT Hämalaun (Dako S3301)

5 min RT Fließendes Wasser

5 min RT aq. dest.

55

Färbeprotokoll für Collagen

Collagen I (Abcam ab6308)

Zeit Temperatur Arbeitsschritt

3x20 min RT MEA Entacrylierung

RT Alkoholreihe und aq. dest. Bad

20 min RT EDTA 10%

10 min RT Fließendes Wasser

3x2 min RT aq. dest.

3x2 min RT Dako Waschpuffer pH 7,4 (Dako S3006)

25 min 100°C Citratpuffer pH 6,0 (Dako S2369)

25 min RT auskühlen

3x2 min RT Dako Waschpuffer pH 7,4 (Dako S3006)

15 min RT Avidin (Dako X0590)

15 min RT Biotin (Dako X0909)

1 h RT Collagen 1, 1:10.000 Primärer Antikörper

15 min RT Sekundärer Antikörper

15 min RT Streptavidin-AP-Komplex

8 min RT Chromogen Red K5005

6 min RT Chromogen Red 2 K5005

10 min RT aq. dest.

5 min RT Hämalaun (Dako S3301)

5 min RT Fließendes Wasser

5 min RT aq. dest.

56

11. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Hendrik ter Stal

Wohnort: Frohsinnstraße 9, 63739, Aschaffenburg

Geburtsdatum: 09.02.1986

Eltern: Günther ter Stal und Fenna ter Stal

Familienstand: ledig

Staatsangehörigkeit: deutsch

Konfession: evangelisch-reformiert

Schulbildung:

1992 - 1996 Besuch der Primarstufe in Hoogstede

1996 - 1998 Besuch der Orientierungsstufe in Emlichheim

1998 - 2002 Besuch der Sekundarstufe 1 in Emlichheim

2002 - 2005 Besuch der Sekundarstufe 2 in Neuenhaus

07.05.2005 Abitur am Lise-Meitner-Gymnasium in Neuenhaus

Wehrdienst:

07 - 10.2005 Grundausbildung im 2./VAZ 163 in Lingen (Ems).

10 - 03.2006 Dienstzeit in der Stab & Stabskompanie Log Brig 1 EK in

Delmenhorst

Hochschulstudium:

04.2006 Beginn des Studiums der Zahnmedizin an der Friedrich-

Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)

2007 Naturwissenschaftliche Vorprüfung

2009 Zahnärztliche Vorprüfung

2012 Zahnärztliche Prüfung

Beruf:

09.2012 Beginn der zahnärztlichen Tätigkeit in Aschaffenburg

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12. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Karl

Andreas Schlegel für die freundliche Überlassung des Themas und Herrn

Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich Wilhelm Neukam für die

Möglichkeit danken, die Dissertation in der Mund-, Kiefer- und

Gesichtschirurgie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

durchführen zu können.

Ferner gilt ein besonderer Dank meinem Betreuer, Herrn Dr.med. dent. Dr.

med. Rainer Lutz, für die engagierte Betreuung und fachliche

Unterstützung.

Abschließend danke ich meinen Eltern, meiner Freundin und meinen

studentischen Freunden für ihre motivierende Anteilnahme.