interaktionsmessung zwischen antibiotika und antiseptika ... · ii mic minimal inhibitory...

Aus dem Institut für Hygiene und Umweltmedizin

(Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. habil. Axel Kramer)

der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Interaktionsmessung zwischen Antibiotika und Antiseptika anhand der

Methode des Agardiffusions-Dilutions-Kombitests

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der

Medizinischen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

2010

Vorgelegt von: Eva Eckert

Geboren am: 20.10.1983

in Ulm

Dekan: Prof. Dr. Heyo K. Kroemer

1. Gutachter: Prof. Dr. Axel Kramer

2. Gutachter: Prof. Dr. Matthias Trautmann

Tag der Disputation: 25. Mai 2012

Ort, Raum: Greifswald, Klinik für Innere Medizin A, Raum O 0.65

Sauerbruchstraße

I

Abkürzungsverzeichnis

AB Antibiotikum/Antibiotika

Abb. Abbildung

Abschn. Abschnitt

AK 30 Amikacin 30 µg

AS Antiseptikum/Antiseptika

ATCC American Type Culture Collection

Aqua dest. Aqua destillata

CF Cystische Fibrose

CHX Chlorhexidin

CIP 5 Ciprofloxacin 5 µg

CN 200 Gentamicin 200 µg

CSA Casein-Sojamehl-Pepton-Agar

DIN Deutsches Institut für Normung

DNA Desoxyribonukleinsäure

E. coli Escherichia coli

E. faecalis/faecium Enterococcus faecalis/faecium

FIC Fraktionale Inhibitorische Konzentration

H. influenzae Haemophilus influenzae

HBV Hepatitis B Virus

HHD Hemmhofdurchmesser

HIV Humanes Immundefizienz Virus

HNO Hals-Nasen-Ohren

HSV Herpes Simplex Virus

IFIC Index der Fraktionalen Inhibitorischen Konzentration

K(AS) Konzentration des ASs im Agar

KbE Kolonie bildende Einheit

Konz. Konzentration

Lsg. Lösung

LZD 30 Linezolid 30 µg

M. catarrhalis Moraxella catarrhalis

MBK Minimale bakterizide Konzentration

MH Müller-Hinton

MHK Minimale Hemmkonzentration

II

MIC Minimal inhibitory concentration

MRSE koagulasenegative Staphylococcen mit Oxacillinresistenz

MSSE Methicillin-sensitiver Staphylococcus epidermidis

MUP 5 Mupirocin 5 µg

NaCl Natrium-Chlorid

NCCLS National Committee on Clinical Laboratory Standards

NCTC National Collection of Type Cultures

N. gonorrhoe/meningitidis Neisseria gonorrhoe/meningitidis

P. multocida Pasteurella multocida

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

P. vulgaris Proteus vulgaris

RNA Ribonukleinsäure

SK Subkultur

Spp Species pluralis

S. aureus Staphylococcus aureus

Tab. Tabelle

VA 30 Vancomycin 30 µg

Verd.stufe Verdünnungsstufe

VRE Vancomycin-resistente Enterococcen

INHALTSVERZEICHNIS

Seite

1 Einleitung und Problemstellung .............................................................. 1

1.1 Problemstellung.................................................................................... 1

1.2 Abgrenzung der Antiseptika von den Chemotherapeutika ................... 2

1.3 Charakterisierung der für die Arbeit ausgewählten Antiseptika ............ 2

1.4 Charakterisierung der für die Arbeit ausgewählten Antibiotika ............. 5

2 Eigene Untersuchungen ........................................................................... 9

2.1 Entwicklung des Mikroagardilutionstests als Voraussetzung für die

Interaktionstestung im Hauptversuch (Vorversuche) ...................................... 9

2.1.1 Methode ........................................................................................ 9

2.1.2 Ergebnisse .................................................................................. 23

2.1.3 Diskussion und Schlussfolgerungen ........................................... 26

2.2 Hauptversuche zur Ermittlung von Interaktionen ................................ 30

2.2.1 Methode ...................................................................................... 30

2.2.2 Ergebnisse .................................................................................. 39

3 Diskussion der Ergebnisse .................................................................... 58

4 Zusammenfassung .................................................................................. 67

5 Summary .................................................................................................. 69

6 Literaturverzeichnis ................................................................................ 71

Eidesstattliche Erklärung

Danksagung

1

1 Einleitung und Problemstellung 1.1 Problemstellung

Heutzutage werden akute, wie auch vor allem chronisch infizierte Wunden

therapeutisch häufig parallel systemisch mit Antibiotika (AB) und lokal mit Antiseptika

(AS) behandelt. Während die AB wegen ihrer systemischen Ausbreitung über den

Blutweg vorwiegend für die Eradikation der tieferen Anteile der Wunde eingesetzt

werden, werden die AS zur Oberflächenantiseptik der Wunde verwendet. Diese

Kombinationstherapie sollte im Anschluss an eine gute Diagnostik inklusive

Erregeridentifikation zumindest an den äußeren Randgebieten der Wunde und in

deren Tiefe zur Sanierung führen. Die dazwischen liegende Wundfläche stellt ein

Ausnahmegebiet dar. Durch das gegenläufige Konzentrationsgefälle von AB und AS

treten immer wieder Wundflächenanteile auf, an denen weder das eine noch das

andere Therapeutikum in ausreichender Konzentration vorhanden ist, um dort eine

vollständige Eradikation der Erreger zu erreichen. Dadurch kommt es an diesen

Arealen zum erneuten Aufflammen der Infektion, die häufig in den chronischen

Zustand übergeht. An diesem Punkt stellt sich die Frage, warum bisher kaum

Untersuchungen zu Interaktionen zwischen AB und AS durchgeführt wurden.

Erkenntnisse auf diesem Gebiet könnten zu durchgreifenden Verbesserungen in der

Behandlung chronisch infizierter Wunden führen. Additiv bzw. synergistisch wirkende

Präparate könnten an den Übergangsflächen zur vollständigen Eradikation des

Erregers und somit zur dauerhaften Ausheilung der Infektion führen, wohingegen der

Einsatz von antagonistisch wirkenden Präparaten vermieden werden könnte. Die

Anzahl chronisch infizierter Wunden wie auch die Therapiekosten würden damit

drastisch gesenkt werden. Einen weiteren wichtigen Aspekt hinsichtlich der AB/AS-

Interaktion stellt die zunehmende Resistenzentwicklung (v. a. Multiresistenz) der

Bakterien in Bezug auf antimikrobielle Chemotherapeutika dar. Gerade in den letzten

Jahren steigen die Zahlen der nosokomialen Infektionen, die häufig durch Erreger

wie multiresistente Staphylokokken hervorgerufen werden, rasant an. Zu kurzfristig

angewendete oder zu niedrig dosierte AB führen oftmals zu neuen Resistenzen und

grenzen damit das Spektrum der Therapiemöglichkeiten weiter ein. Auch hier können

zusätzlich verwendete AS mit ihrer schnell einsetzenden, mikrobioziden Wirkung zur

vollständigen Eradikation beitragen und damit Resistenzentwicklungen minimieren

[1]. Da die antimikrobiellen Chemotherapeutika immer noch zu den wertvollsten

2

Medikamenten der Medizin gehören, muss ihr Einsatz stets sorgfältig abgewägt

werden.

1.2 Abgrenzung der Antiseptika von den Chemotherapeutika

Die Betrachtung der Wirkprinzipien lässt die wesentlichen Unterschiede zwischen

AB und AS am deutlichsten hervor treten und schafft dadurch die Abgrenzung der

beiden Medikamentengruppen voneinander. AS sind nur lokal wirksam und rufen

daher auch keine bzw. kaum Nebenwirkungen hervor. Ein für die heutige Medizin

entscheidender Aspekt liegt in der Tatsache begründet, dass durch die speziellen

Wirkmechanismen und den raschen mikrobioziden Wirkeintritt nur in den seltensten

Fällen Resistenzen gegen AS auftreten. AB hingegen weisen weitaus mehr

spezifische Resistenzen auf, wirken erst nach Stunden und nur mikrobiostatisch auf

die Erreger. Auf Grund der systemischen Anwendung treten unter einer

Antibiotikatherapie weit mehr Nebenwirkungen auf, die sich vor allem systemisch auf

den Körper auswirken [17]. Dennoch gibt es auch AB, wie Gentamicin oder

Mupirocin, die in der lokalen Behandlung Anwendung finden. In den sich

anschließenden Abschnitten 1.3 und 1.4 werden die einzelnen AB und AS erläutert

und Unterschiede herausgearbeitet.

1.3 Charakterisierung der für die Arbeit ausgewählten Antiseptika

Die zur Prüfung ausgewählten AS besitzen in der medizinischen Anwendung einen

unterschiedlichen Stellenwert. Während Chlorhexidindigluconat (Chlorhexidin) vor

allem in den anglo-amerikanischen Gebieten stark zum Einsatz kommt, werden in

den europäischen Ländern Octenidindihydrochlorid (Octenidin) und Polihexanid

bevorzugt. Für die Interaktionsmessung wurden diese drei AS ausgewählt, um einen

Vergleich zwischen Therapeutika zu schaffen, die in der medizinischen Behandlung

am häufigsten Verwendung finden, zugleich sie in ihren Wirkungsmechanismen

Parallelen, in ihren Wirkungen und Eigenschaften dagegen wesentliche Unterschiede

aufweisen. In Tabelle 1 sind die wichtigsten Charakteristika der AS gegenüber

gestellt:

3

Tab. 1: Charakteristik für die Interaktionstestung der ausgewählten AS

Wirkstoff Polihexanid Chlorhexidin Octenidin

Gruppe: Diguanidine Diguanidine Bispyridine

Chemische Eigenschaften:

optimaler pH: 5 - 8

optimaler pH: 5 - 8; ideal: pH 7

optimaler pH: 1,6 - 12,2

stabil unter Licht-einfluss

nicht stabil unter Lichteinfluss; Temperatur >70°C: Abspaltung von Chloranilin

stabil unter Licht- einfluss

Physikalische Eigenschaften:

einwertiges Kation einwertiges Kation zweiwertiges Kation; ober-flächenaktiv

Wirkungs-mechanismus:

selektive Permea-bilitätsbeeinflus-sung der bakt. Zellmembran durch Wechsel-wirkungen mit sauren Lipiden [26; 27; 28]; Blockade des bakt. Attachements [19; 58]

Anlagerung an die negativ geladene [50] Zytoplasma-membran mit eventueller Neutra-lisierung der Ober- flächenladung [71] in niedriger Konzentration Herauslösen von Zellbestandteilen [60] in hoher Konzentration Koagulation von Zytoplasma-bestandteilen, Enzymhemmung [60]

Absorption der positiven Ladungen an der negativ geladenen Zelloberfläche: Reaktion mit Polysacchariden Störung des enzymatischen Systems Aufhebung der Zellfunktionen Leckage der Zellwandmembran [18; 20; 37]

Wirkungs-spektrum:

breit: Gram +/- ; MBK ~ 0,02% [46]; auch intrazellulär

breit: Gram +/- ; MHK ~ 1µg/ml MBK > 20µg/ml mit Speziesdifferenzen [71]; MRSA -Wirkung < MSSA - Wirkung [32]

breit: Gram +/-; MHK/ MBK ~>10fache von Chlorhexidin [65];

-Bakterien:

sich vermehrende Bakterien wie Chlamydien und Neisserien [30]; wirksam gegen Mykobakterien

Wirkung gegen Mykobakterien gering

auch gegen Chlamydien wirksam

4

-Viren Virozidie gegen HIV-1 [47]

Virozidie > 4 log gegen HIV (15 - 30 s), HSV 1+2 (2 min), HBV (< 2 min) [59]

Virozidie:0,1%ig gegen f2-Coliph. MS2-Coliph [57]

-Pilze fungizid fungizid: hohe Konzentration nötig

fungizid

-Sporen unwirksam Sporozidie: 0,01 % Chlorhexidin + Hitze (ca. 98 - 100 °C)

unwirksam

Wirkung mit/ohne Belastung:

deutliche Wirkungs- reduktion unter Zugabe von Muzinen (0,25 % Muzin 4-fach höhere Konzentration bei MRSA -/ MSSA - Stämmen) [1]

4,5 % Albumin / 4,5 % Schafsblut + 1 % Muzin: Wirkungs-eintritt gegenüber P. aeruginosa verzögert [55]; Proteine/Tannin: Wirkungsmin-derung

Blut/Albumin: keine Wirkungsmin-derung ( bis 10 % getestet); Muzin keine Wirkungsmin-derung [55]

Zytotoxizität: In vitro geringste Zytotoxizität neben Taurolin [39];

mäßig – hoch [45]

gering [51]

Mutagenität: nicht [43] unklar [67] nicht mutagen [39]

Karzinogenität: nicht karzinogen [43]

Abspaltungsprodukt 2–Chloranilin [5;6] ist karzinogen [4]

nicht karzinogen [40]

Resistenz: keine Resistenz- entwicklung

gegen MRSA und verschiedene Gram-negative Bakterien [2; 8; 68]

keine Resistenz- entwicklung

Einsatzbereich: Wirkstoff in Hände-desinfektionsmit-teln, Haut-, Schleimhaut-, Wund- und Augenantiseptika

Wirkstoff in Hände-desinfektionsmit-teln, Haut-, Schleimhaut- und Augenantiseptika

Wirkstoff in Hände-desinfektionsmit-teln, Haut-, Schleimhaut- und Augenantiseptika [64]

Mittel der Wahl für:

für sehr empfind-liche, schlecht heilende Wunden, 0,04 % zur Reini-gung ver-schmutzter Wunden [52]

Goldstandard zur Plaquehemmung (Mundhöhlen-antiseptik) [54]

0,1 % für infizierte, akute, < 0,05 % für chronische Wunden

5

Chemische Struktur:

Nachfolgend sollen einige Zusatzinformationen im Hinblick auf die Wundbehandlung

gegeben werden. Polihexanid fördert die Wundheilung [44]; nachgewiesen ist in

diesem Zusammenhang die durch die bakterielle Elastase von P. aeruginosa

induzierte Degradation von Proteinen in der Wundflüssigkeit und in der Haut, die

durch Zugabe von Polihexanid aufgehoben wird [62]. Des Weiteren findet

Polihexanid in antiseptischen Wundauflagen Anwendung [61]. Der Grund liegt zum

einen in seiner starken Bindung an Baumwolle und Viskose [53], zum anderen in der

trotz Gegenwart von Proteinen gewährleisteten antimikrobiellen Wirksamkeit [56].

Polihexanid ist mit und ohne Belastung wirksamer als Chlorhexidin [72].

Tierexperimentell wurde nachgewiesen, dass der Einsatz von Chlorhexidin zur

Hemmung der Granulation und Verzögerungen der Wundheilung führen kann [38].

Auf Grund der verschiedenen Einflussfaktoren sind aber auch keine

Wundheilungsverzögerungen bzw. nur zwischenzeitliche Hemmungen ohne Einfluss

auf den weiteren Wundheilungsverlauf beschrieben [38].

1.4 Charakterisierung der für die Arbeit ausgewählten Antibiotika

Zur Untersuchung von Interaktionen wurden sechs AB aus fünf folgenden Gruppen

ausgewählt:

1. GlycopeptidAB: Vancomycin

2. AminoglycosidAB: Gentamicin, Amikacin

3. Fluorchinolone: Ciprofloxacin

4. Oxazolidinone: Linezolid

5. LokalAB: Mupirocin

Im Folgenden werden die oben genannten AB stichpunktartig in ihren Eigenschaften,

Wirkungsmechanismen und Wirkungsspektren erläutert:

http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Octenidine.svg

http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Polihexanide.svg

http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Chlorhexidine.png

6

Vancomycin: Reserveantibiotikum bei Staphylococcus-Infektionen;

Wirkmechanismus: Hemmung der Zellwandsynthese von proliferierenden Zellen;

Wirkungsspektrum: nur grampositive Bakterien; Eigenschaften: schlecht

gewebegängig, nicht liquorgängig, v. a. renale Elimination; Nebenwirkungen:

Allergieentwicklung, ototoxisch; Indikation: Strepto-/Staphylokokken, schwere

Infektionen bei Oxacillinresistenz oder Penicillinallergie (Endokarditis etc.),

bevorzugtes Mittel bei AB-assoziierter Clostridium difficile Enterocolitis (orale Gabe),

Corynebacterium spp., MRSA [34];

Amikacin: Amikacin ist Reserveantibiotikum zum Einsatz bei Gentamicin-Resistenz;

Wirkmechanismus: Hemmung der Proteinbiosynthese von Bakterien (30S-

Ribosomen-Untereinheit) und Zellwandschädigung von ruhenden und

proliferierenden Zellen; Breitspektrumantibiotikum; Wirkspektrum: grampositive

(Staphylococcus spp.) und gramnegative (P. aeruginosa, E. coli, Klebsiellen, P.

vulgaris) Bakterien, schwache Wirkung bzw. Resistenz gegenüber Streptococcus

spp., Anaerobier und H. influenzae [33]; Resistenzentwicklung: Kreuzresistenz gegen

Neomycin und Tobramycin; Gentamicin resistente Stämme sind teilweise empfindlich

gegenüber Amikacin [66];

Eigenschaften: unverzichtbare Kombinationspartner der Betalactam-AB bei der

Therapie lebensbedrohlicher Infektionen in Kliniken; gute Verteilung im

Extrazellularraum; minimale Metabolisierung über die glomeruläre Filtrationsrate

(GFR) und tubuläre Rückresorption;

Nebenwirkungen: nephrotoxisch (tubuläre Rückresorption), ototoxisch (Kumulation in

Endo - und Perilymphe), Anreicherung in tiefen Kompartimenten; Indikation:

Kombinationspartner bei schweren Infektionen wie Pneumonie, Sepsis, Endokarditis,

Harnweginfektionen [33];

Gentamicin: zusätzlich eingesetzt als Lokalantibiotikum Indikation: infizierte

Wunden, Augeninfektionen, Infektionen im HNO-Bereich, als Knochenzement bei

infizierten Endoprothesen, Lokalbehandlung von Knochen- und Weichteilinfektionen

[41];

Ciprofloxacin: Standardpräparat der Fluorchinolone; Wirkmechanismus: Hemmung

der Topoisomerase 2 (DNA-Gyrase); Wirkspektrum: gut wirksam gegen

7

gramnegative Erreger: Enterobacteriaceae, H. influenzae; schwach wirksam gegen

grampositive Erreger: Staphylo-, Pneumo-, Enterokokken; wirksam gegen atypische

Erreger: Chlamydien, Legionellen, Mykoplasmen; Wirkstärke: stärkstes gegen

Pseudomonaden wirksames Antibiotikum der Gruppe 2 der Chinolone;

Eigenschaften: renale Elimination, gut gewebe- und liquorgängig (Lunge, Knochen,

Knorpel); Nebenwirkungen: neurotoxisch, nephrotoxisch,

Überempfindlichkeitsreaktionen (Exantheme und Photosensibilisierung),

gastrointestinale Beschwerden; Resistenzentwicklung: primäre Resistenz einiger

Pneumokokken-Stämme, Kreuzresistenz untereinander, keine Resistenz mit anderen

AB; Indikation: Atemweginfektionen, Harnweginfektionen, Diarrhoe, Infektionen der

Geschlechtsorgane, im Bauchraum und HNO-Bereich, Milzbrand, Sepsis, Haut- und

Weichteilinfektionen [35]; Einsatz als Lokalantibiose am Auge: topische Anwendung

zur präoperativen Endophtalmitisprophylaxe [29];

Linezolid: neueres Präparat der Oxazolidinone; Wirkungsmechanismus: reversibler,

nichtselektiver Monoaminooxidase-Hemmer (MA0), bakteriozid gegen

Streptokokken, bakteriostatisch gegen Staphylo- und Enterokokken;

Wirkungsspektrum: gegen grampositive Kokken einschließlich MRSA, MRSE und

VRE; Nebenwirkungen: selten Thrombopenie; Indikation: Pneumonien (ambulant

erworben, nosokomial), schwere Haut- und Weichteilinfektionen [36];

Mupirocin: Lokalantibiotikum; Wirkstoff: Pseudomoninsäure aus Pseudomonas

fluorescens [42]; Wirkungsmechanismus: Hemmung der Isoleucyl-t-RNA-Synthetase

[25]; Zugabe von Exsudat oder Serum führt zur Wirkungsminderung wegen 95 %-

iger Proteingebundenheit [49]; Wirkungsspektrum: gegen Gram - positive Erreger:

Staphylococcus spp., Streptococcus spp., zusätzlich in vitro wirksam gegen H.

influenzae, N. gonorrhoe, N. meningitidis, M. catarrhalis, P. multocida, resistente

Erreger: Enterobacteriaceae, Anaerobier, gramnegative Nonfermenter, Micrococcus

spp., Corynebakterien [49]; Resistenzentwicklung: auf Grund des einzigartigen

Hemmmechanismus keine Kreuzresistenz zu anderen AB möglich [21]; MRSA: bis

zu 73 % resistent (Plasmid-kodiert, Mutationen) [31]; Eigenschaften: Förderung der

Reepithelialisierung bei gleichzeitiger Hemmung der Wundkontraktion [69];

Indikation: Mittel der Wahl bei Eradikation von intranasalen S. aureus - Stämmen

inclusive MRSA [42];

8

Bei den für die Arbeit ausgewählten AB handelt es sich zum einen um

Referenzpräparate (Ciprofloxacin, Gentamicin), die im Klinikalltag therapeutisch

eingesetzt werden, zum anderen um Reservepräparate (Amikacin bei Gentamicin-

Resistenz; Vancomycin bei Oxacillin-Resistenz), die verstärkt bei den immer häufiger

durch multiresistente Erreger auftretenden nosokomialen Infektionen benötigt

werden. Darüber hinaus decken die gewählten AB mit ihrem Wirkspektrum

Staphylokokken, E. coli und Pseudomonaden ab, die zu den häufigsten

Verursachern von nosokomialen Infektionen zählen [17].

9

2 Eigene Untersuchungen

2.1 Entwicklung des Mikroagardilutionstests als Voraussetzung für die

Interaktionstestung im Hauptversuch (Vorversuche)

2.1.1 Methode

2.1.1.1 Testprinzip

Mit dem Mikroagardilutionstest wird die Minimale Hemmkonzentration (MHK) für die

Testbakterien unter Berücksichtigung des jeweiligen Antiseptikums und Agars

bestimmt. Es handelt sich dabei um eine neue Methode, die erstmals in 2007

beschrieben wurde [24]. Während die MHK-Bestimmung bisher auf der Grundlagen

der DIN 58940 „Empfindlichkeitsprüfung von mikrobiellen Krankheitserregern gegen

Chemotherapeutika“ erfolgt, stellt der Mikroagardilutionstest eine miniaturisierte

Version der Agardilutionsmethode dar, die mit der Mikrodilutionsmethode, einem so

genannten Reihenverdünnungstest, kombiniert wird [13]. Wie bei der

Agardilutionsmethode wird der jeweilige Agar über 49 °C erhitzt und dadurch

verflüssigt. Dem flüssigen Nährmedium wird das AS zugefügt, das im Voraus in einer

geometrischen Verdünnungsreihe hergestellt wird. Das Gemisch wird anschließend

in die Kavitäten (Fassungsvermögen < 500µl) von Mikrotiterplatten gegeben und

nach Erstarren des Agars mit dem Inokulum beimpft. Die Mikrotiterplatte wird für 18 ±

2 h bei 36 ± 1 °C im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubation lässt sich das

makroskopisch sichtbare Wachstum der Erreger gegen die Sterilitäts-(Negativ-) und

Wachstums-(Positiv)-Kontrolle ablesen. Dabei wird die MHK an der jeweiligen Kavität

festgelegt, bei der gerade kein Wachstum bzw. keine Trübung mehr zu erkennen

sind.

2.1.1.2 Material

Chemikalien:

1. Antiseptika:

Octenidindihydrochlorid – 100 %: Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt

Polihexanidlösung – 20 %: Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel

Chlorhexidindigluconatlösung – 20 % water: Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Schnelldorf

Nährmedien:

1. Müller-Hinton- Agar: Merck KGaA, Darmstadt

10

Zusammensetzung [g/l]: Fleischinfus 2,0 g/l, Caseinhydrolysat 17,5 g/l, Stärke 1,5

g/l, Agar-Agar 13,0 g/l, pH 7,4 ± 0,2 bei 25 °C

2. CSA-Agar: Roth GmbH + Co KG, Karslruhe

Zusammensetzung [g/l]: Pepton aus Casein (Pankreashydrolysat) 15,0 g/l,

Pepton aus Soja (Papainhydrolysat) 5,0 g/l, NaCl 5,0 g/l, Agar 15,0 g/l, pH: 7,3 ±

0,2 bei 25 °C

3. Isosensitest-Agar: Oxoid Deutschland GmbH, Wesel

Zusammensetzung [g/l]: Casein – Hydrolysat 11,0 g/l, Peptone 3,0 g/l, Glucose

2,0 g/l, NaCl 3,0 g/l, Stärke 1,0 g/l, Dinatriumhydrogenphosphat 2,0 g/l,

Natriumacetat 1,0 g/l, Magnesiumglycerophosphat 0,2 g/l, Calciumgluconat 0,1

g/l, Kobalt-(2)-Sulfat 0,001 g/l, Kupfer-(2)-Sulfat 0,001 g/l, Zinksulfat 0,001 g/l,

Eisen-(2)-Sulfat 0,001 g/l, Mangan-(2)-Chlorid 0,002 g/l, Menadion (Vit. K3) 0,001

g/l, Cyanocobalamin (Vit.B12) 0,001 g/l, L-Cystein 0,02 g/l, L-Tryptophan 0,02 g/l,

Pyridoxin(Vit. B6) 0,003g/l, Pantothenat 0,003 g/l, Nicotinamid 0,003g/l, Biotin

0,0003 g/l, Thiamin 0,00004 g/l, Adenin 0,01 g/l, Guanin 0,01 g/l, Xanthin 0,01g/l,

Uracil 0,01 g/l, Agar 8,0 g/l, pH: 7,4 ± 0,2 bei 25 °C

4. Blut-Agar: Schafsblut: Oxoid Deutschland GmbH, Wesel; MH-Agar: Merck KGaA,

Darmstadt

Zusammensetzung: Müller-Hinton-Agar + 5 % defibriniertes Schafsblut, pH: 7,4 ±

0,2 bei 25 °C

Testbakterien:

Grampositiv: S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 6538, norddeutscher

MRSA-Epidemiestamm, E. faecalis ATCC 29212, E. faecium ATCC 6057

Gramnegativ: P. aeruginosa ATCC 27853, P. aeruginosa ATCC 9027, P.

aeruginosa ATCC 15442, mukoidbildender P. aeruginosa (CF-Patientin,

Abnahmedatum 20.11.2007), E. coli NCTC 10538, E. coli ATCC 11229

Geräte:

Mikrotiterplatten: Multiple well plate 96-well, Flat bottom with lid, steril, Sarstedt

AG & Co, Nümbrecht

gelbe Schraubröhrchen mit Spitzboden: 15 ml, 120 x 17mm, Sarstedt AG & Co,

Nümbrecht

blaue Röhrchen: 50 ml, sterile Cellstars, Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen

Pipetten: 100 & 1000 µl, Eppendorf AG, Hamburg

Mehrkanalpipette: 8-er Pipette Research, 10-100 µl, Eppendorf AG, Hamburg

11

Pipettenspitzen: 100 & 200 µl Spitzen gelb; 1000 µl Spitzen blau, Sarstedt AG &

Co, Nümbrecht

Filterpipetten: 100 µl & 1000 µl Spitzen, „SafeSeal-Tips professional“, Biozym

Scientific GmbH, Hess, Oldenburg

Spritzen: Stepper 411, Socorex swiss, Ecublens, Schweiz

Spritzenaufsatz: Ecostep 37,5 ml, Socorex swiss, Ecublens, Schweiz

Schüttler-Gerät KS 125 basic: IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen

Vortexer: Typ Reax 2000, Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach

Glasflaschen für Dampfsterilisierung: Typ Boro 3.3, 100/250/500 ml, Schott AG,

Mainz

Bechergläser: 150/250 ml, Schott AG, Mainz

Messzylinder: 100 ml Vol., Vitlab GmbH, Großostheim

Röhrchenständer: Nalgene, Roskilde, Dänemark

Wasserbad: Typ 1004; GFL (Gesellschaft für Labortechnik mbH), Burgwedel

Brutschrank: Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach

Schüttelplatte: Typ Thys 2, mLw, Ilmenau

Waage: Typ BP 610-OCEV1, Sartorius AG, Göttingen

UV-Gerät: Typ Longlife FM Filter, highest ultraviolet Intensity; Spectroline,

Canada

Heiz-Rührgerät: Typ MR 3001K, max. 300°C & 1250 rpm, Heidolph Instruments

GmbH & Co. KG, Schwabach

Koloniezählgerät: Colony Counter, Stuart Scientific, Sigma-Aldrich, München

Heizplatte: Typ Thermoplate S, Desaga GmbH, Wiesbach

Defibriniertes Schafsblut: Oxoid Deutschland GmbH, Wesel

Autoklav: Typ Vakulab HP 669-2HR, MMM GmbH (Münchener Medizin

Mechanik), Planegg

Bunsenbrenner: Typ Flammy S, Fa. Schütt, Göttingen

Rührfische in verschiedenen Größen

Aqua dest: deionisiert und sterilisiert

NaCl 0,9 %: sterilisiert

12

2.1.1.3 Versuchsdurchführung

Herstellung der Bakteriensuspension:

Erste Subkultur (1. SK): Aus dem Tiefgefrierschrank wird jeweils eine mit den

oben genannten Erregern beladene Glasperle mit sterilem Glasspatel

entnommen und auf einer Columbia-Blutagarplatte gleichmäßig ausgestrichen.

Die mit Datum und Erregerstamm versehenen Blutplatten werden daraufhin für

18 ± 2 h bei 36 ± 1 °C im Brutschrank inkubiert. In dieser Zeit bilden sich 1.

Subkulturen, die unter Aufbewahrung im Kühlschrank ca. einen Monat lang

verwendet werden können.

Zweite Subkultur (2. SK): Nach der Bebrütung werden von jeder 1. SK 2-3

Kolonien mit sterilem Glasstab entnommen und auf einer neuen Columbia –

Blutplatte nach dem Verfahren des „fraktionierten Ausstreichens“ [22]

aufgetragen. Durch diese Methode gelingt es, aus dichten

Bakteriensuspensionen Einzelkolonien zu isolieren [22]. Die 2. Subkulturen

werden wiederum 18 ± 2 h bei 36 ± 1 °C bebrütet. Im Vergleich zu den 1.

Subkulturen sind sie nach 24 h nicht mehr verwertbar.

Inokulum: In einem gelben, verschließbaren Schraubröhrchen werden 2 ml 0,89%

NaCl-Lösung vorgelegt. 2 Einzelkolonien der 2. SK werden mit einem sterilen

Glasstab entnommen und anschließend in das mit 0,89% NaCl-Lösung

vorbereitete Röhrchen eingetaucht. Mehrfaches Vortexen lässt eine homogene

Bakteriensuspension (Inokulum) entstehen. Die in dieser Testsuspension

enthaltene Koloniezahl entspricht 1 x 106 KbE/ml [48].

Verdünnungsreihe des Inokulums: Das Inokulum, das als Testsuspension für die

Bestimmung der MHK’s in den Mikrotiterplatten verwendet wird, muss in seiner

Koloniezahl etwa mit der Koloniezahl der Hauptversuche übereinstimmen, da in

diesen Interaktionsversuchen AS-Konzentrationen verwendet werden, die sich

auf die spezifischen MHK-Werte aus den Vorversuchen beziehen.

Um in den Hauptversuchen einen Bakterienrasen zu erzielen, der weder zu dünn

noch zu dicht auf der Blutagarplatte wächst und ein exaktes Ablesen der

Hemmhofdurchmesser (HHD) gewährleistet, wurden im voraus Tests durchgeführt.

In diesen Vorversuchen wurden verschiedene Verdünnungsstufen des Inokulums

(10-1-10-3) hergestellt und je 0,1 ml auf Isosensitestplatten ausgestrichen.

Anschließend erfolgte ihre Beimpfung mit 3 ABplättchen. Nach der Kultivierung von

13

18 ± 2 h bei 36 ± 1 °C und Auswertung erwiesen sich folgende Verdünnungsstufen

als ideal:

für grampositive Kokkenbakterien:

10-2 = 10 ml Aqua dest. + 0,1ml der Testsuspension

für Enterokokken:

10-1 = 9 ml Aqua dest. + 1,0 ml der Testsuspension

für gramnegative Stäbchenbakterien:

10-2 = 10 ml Aqua dest. + 0,1 ml der Testsuspension

Herstellung des Nährmediums:

Zur Herstellung von 100 ml Agar wird je nach Nährmedium folgende Menge an

Trockenpulver abgewogen und in 100 bzw. 95 ml destilliertem Wasser aufgelöst:

Müller-Hinton (MH): 3,4 g Pulver + 100 ml Aqua dest. (34 g/1000 ml)

Isosensitest: 3,14 g Pulver + 100 ml Aqua dest. (31,4 g/1000ml)

CSA: 4,0 g Pulver + 100 ml Aqua dest. (40 g/1000ml )

Blut: 3,4 g MH-Pulver + 95 ml Aqua dest. + 5 ml defibr. Schafsblut

Die aufgeführten Mengen wurden mit Hilfe der Herstellerangaben berechnet, die sich

auf 1 l Flüssigagar beziehen. Im Unterschied dazu wird bei der Herstellung des

Blutagars das Volumen an destilliertem Wasser auf 95 ml reduziert, da es nach der

Sterilisation im Autoklaven mit 5 ml sterilem, defibriniertem Schafsblut auf 100 ml

aufgefüllt wird.

Die mit den Flüssignährmedien befüllten, hitzestabilen Glasflaschen werden bei 121

°C für 20 min autoklaviert und anschließend in einem auf 55 °C vor geheizten

Wasserbad langsam heruntergekühlt. Die Temperatur des flüssigen Agars darf nicht

unter 49 °C abfallen, da er sich sonst verfestigt. Abweichend davon wird der flüssige

Blutagar aus dem Wasserbad entnommen und um etwa weitere 5 °C abgekühlt, um

eine Hitzedenaturierung der Serumproteine zu verhindern. Das im Brutschrank auf

37 °C erwärmte Schafsblut (5 ml) wird behutsam in den flüssigen Agar pipettiert und

zur Homogenisierung nur kurz und langsam geschwenkt, um ein Platzen der

Erythrozyten zu vermeiden. Eventuell auftretende Anzeichen von Verfestigung

können durch erneutes Erhitzen auf einer Heiz-Rührplatte kompensiert werden.

Dennoch ist Vorsicht geboten, um die Temperaturschwankungen des Agars gering

zu halten.

14

Herstellung der AS-Stammlösung:

Menge: 100 ml pro AS;

Wirkstoffgehalt: Davon ausgehend, dass ein Wirkstoffgehalt von 100 % einer

Konzentration von 1000 mg/ml entspricht, kann die benötigte Menge bzw. das

benötigte Volumen der AS [x] über folgenden Dreisatz berechnet werden, um die

Endkonzentration von 1024 µg/ml zu erreichen:

Wirkstoffgehalt des AS in mg/ml = 1,024 mg/x ml

x = 1,024 mg / Wirkstoffgehalt AS [mg/ml]

Octenidin: Wirkstoffgehalt 100 % = 1000 mg/ml

100 ml Stamm-Lsg.: 102,4 mg Octenidin + 100 ml Aqua dest.

Polihexanid: Wirkstoffgehalt 20 % = 200 mg/ml

100 ml Stamm-Lsg.: 512µl Polihexanid-Lsg. + 99,488 ml Aqua dest.

Chlorhexidin: Wirkstoffgehalt 80 % = 800 mg/ml

100 ml Stamm-Lsg.: 0,128 ml Chlorhexidin-Lsg. + 99,872 ml Aqua dest.

Zuerst wird ein 100 ml Glaskolben mit der berechneten Menge an Festsubstanz oder

Flüssigkeit befüllt und anschließend bis zur 100 ml Marke mit Aqua dest. aufgefüllt.

Zur Homogenisierung wird jede der Stammlösungen für einige Minuten auf einem

Schüttler leicht gemischt. Im Vergleich zu den beiden anderen AS löst sich das

Octenidin nur langsam auf und benötigt mehrere Stunden auf dem Schüttler. Die

Lösungen sind unter Aufbewahrung im Kühlschrank mehrere Wochen haltbar, wobei

Chlorhexidin keiner Lichtquelle ausgesetzt werden sollte, um die chemische Stabilität

und die daraus resultierende Wirksamkeit sichern zu können. Alufolie zur

Verkleidung des Glaskolbens genügt als Schutz vor Lichteinwirkung.

Herstellung einer geometrischen Verdünnungsreihe des Antiseptikums:

Die AS Octenidin, Polihexanid und Chlorhexidin werden nach einem Verfahren

verdünnt, das in jedem Schritt zu einer Halbierung der AS-Konzentration führt

(geometrische Verdünnungsreihe) [73]. Im Folgenden ist die Testverdünnung in

ihrem Schema aufgeführt:

Schritt 1: 3 ml Stammlösung mit 3 ml Medium = 2 ml mit 512 µg/ml

Schritt 2: 1 ml von Schritt 1 mit 1 ml Medium = 2 ml mit 256 µg/ml


Schritt 4: 1ml von Schritt 1 mit 7 ml Medium = 8 ml mit 64 µg/ml

15







Schritt 11: 1 ml von Schritt 10 mit 1 ml Medium = 2 ml mit 0,5 µg/ml








Ausführung der Verdünnungsstufen: Chlorhexidin bis Schritt 13; Octenidin bis Schritt

12; Polihexanid bis Schritt 17.

Für die Durchführung werden gelbe, vorab beschriftete Röhrchen in den zugehörigen

Röhrchenständern vorbereitet. Mit dem Stepper werden die angegebenen Mengen

dest. Wasser (Medium) vorgelegt. Anschließend werden in das erste Röhrchen

zusätzlich 3 ml der AS-Stammlösung pipettiert und gut gevortext. Um die

gewünschten Konzentrationen in allen Röhrchen zu erzielen, wird die

Verdünnungsreihe vom 1. Schritt bis zum - je nach AS erforderlichen - letzten Schritt

der Reihenfolge nach abgearbeitet, wobei das vorgegebene Volumen stets mit einer

neuen Pipettenspitze in das darauf folgende Röhrchen weitergegeben wird. Nach

jedem Schritt wird das Röhrchen gevortext, damit sich das AS homogen verteilt.

Ungenauigkeiten in den Konzentrationen können dadurch vermieden werden.

Beschichtung der Mikrotiterplatten:

Für eine Doppelbestimmung der MHK-Werte werden pro Durchlauf mit einem

Nährmedium 9 Mikrotiterplatten à 96 Wells benötigt:

Octenidin: 2 Mikrotiterplatten (1 pro Einzelbestimmung)

Chlorhexidin: 4 Mikrotiterplatten (2 pro Einzelbestimmung)

16

Polihexanid: 2 Mikrotiterplatten (1 pro Einzelbestimmung)

Sterilitäts-(Negativ-) und Wachstums-(Positiv-)-Kontrolle: 1 Mikrotiterplatte

In der Summe ergeben sich daraus 36 zu beimpfende Platten, um für alle vier

Nährmedien Ergebnisse zu erzielen.

Die Wells einer Mikrotiterplatte werden pro Durchlauf nach folgendem Schema

befüllt:

Octenidin:

4 5 6 7 8 9 10 Verdünnungsschritt

S. aureus ATCC 29213

S. aureus ATCC 6538

MRSA norddt.

E. faecalis ATCC 29212

E. faecium ATCC 6057

P. aeruginosa ATCC 27853



P. aeruginosa mukoidbildend

E. coli NCTC 10538

E. coli ATCC 11229

/

17

Chlorhexidin:

0 1 2 3 4 5 6 7 Verdünnungsschritt


S. aureus ATCC 6538

MRSA norddt.







E. coli NCTC 10538

E. coli ATCC 11229

/

8 9 10 11 Verdünnungsschritt


S. aureus ATCC 6538

MRSA norddt.







E. coli NCTC 10538

E. coli ATCC 11229

/

Polihexanid:

1 2 3 4 5 6 7 8 Verdünnungsschritt


S. aureus ATCC 6538

MRSA norddt.







E. coli NCTC 10538

E. coli ATCC 11229

/

18

Positiv (PK) - und Negativkontrolle (NK):

4 5 6 7 8 9 10 Octenidin NK

1 2 3 4 5 6 7 8 Polihexanid NK

0 1 2 3 4 5 6 7 Chlorhexidin NK

8 9 10 11

E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 PK

E8 E9 E10 E11 PK

Anmerkung: Positivkontrollen: Erreger Nr. 1-11(E1-E11). Negativkontrollen: Die

Zahlen 0-11 entsprechen den jeweiligen AS-Verdünnungsschritten

19

Abb. 1: Beispielphoto der Mikrodilutionsmethode am Beispiel von Octenidin:

Eine Spalte (1-11) steht für je einen Erreger, die Konzentration des AS nimmt von

Well B nach Well H innerhalb einer Spalte zu. Beispiel Spalte 8: Erreger P.

aeruginosa ATCC 15442: sichtbare Trübung von Well B bis Well F MHK entspricht

der AS-Konzentration in Well G

Eine Tabelle entspricht einer Mikrotiterplatte mit 96 Wells, wobei die Zahlen 0 -11 für

die Schritte der geometrischen Verdünnungsstufe stehen und der jeweiligen

Konzentration des AS in diesem Schritt entsprechen.

In alle markierten Wells werden insgesamt 200 µl Volumen in der angegebenen

Reihenfolge pipettiert: 50 µl der jeweiligen AS-Konzentration, 100 µl des

Flüssigagars und 50 µl Inokulum.

Die verschiedenen AS-Konzentrationen werden der Reihenfolge nach in

Plastikgefäße umgegossen, die mehrere nebeneinander liegende Kammern

aufweisen. Mit einer Mehrkanalpipette können anschließend gleichzeitig acht

verschiedene AS-Konzentrationen aus den Kammern in die jeweiligen Wells

pipettiert werden. Diese Methode ermöglicht eine deutliche Zeitersparnis, da nicht

jede Kavität einzeln beschichtet werden muss. Nach Zugabe des flüssigen Agars

20

(ebenfalls mit der Mehrkanalpipette) werden die Mikrotiterplatten auf einer Heizplatte

mit integrierter Vibrationsfunktion für 5 min geschüttelt, um ein gleichmäßiges

Verteilen des AS im Agar zu gewährleisten. Die Zugabe des Inokulums erfolgt erst

nach Verfestigung des Agar-AS-Gemisches (Lagerung der Platten für 24 h im

Kühlschrank).

Bei den AS-Konzentrationen ist zu beachten, dass das Volumen des AS einem

Viertel des Gesamtvolumens pro Well (50µl/200µl) entspricht. Das bedeutet, es liegt

eine 1:3 Verdünnung des AS vor. Um die in der jeweiligen Kavität erforderliche

Konzentration zu erlangen, muss deshalb eine 4fach höhere AS-Konzentration

eingesetzt werden. Die Berücksichtigung dieses Aspekts und die Orientierung an

MHK-Werten aus anderen Untersuchungsmethoden bezüglich identischen Erregern,

Agar und AS (Tab. aus dem Mikrobiologischen Labor der Hygieneabteilung

Greifswald) führten zu den ausgewählten Verdünnungsschritten (s. Tab., Seite 20).

Ausnahmen bilden die Positiv- und Negativkontrollen. Die Wells der Positivkontrollen

werden mit je 100 µl Flüssigagar beschichtet und nach dessen Verfestigung mit je 50

µl Inokulum beimpft (E1-E11 stehen für die Inokula der Erreger 1-11). Die Wells der

Negativkontrollen werden mit je 50 µl der jeweiligen Antiseptikumkonzentration und

100 µl Nährmedium befüllt (die Zahlen 0-11 entsprechen den jeweiligen AS-

Verdünnungsstufen).

Bestimmung der Koloniezahl des Inokulums:

Bei der Bestimmung der Koloniezahl des verwendeten Inokulums werden je 0,1 ml

einer bestimmten Verdünnungsstufe auf Blutagar mit gewinkeltem Glasspatel

gleichmäßig ausgestrichen und für 18 ± 2 h bei 36 ± 1 °C im Brutschrank inkubiert.

Anschließend erfolgt die Auszählung an einem Koloniezählgerät. Dabei ist zu

beachten, dass die Koloniezahl der Verdünnungsstufe so niedrig ist, dass sie zu

einem Wachstum von einzelnen, gut voneinander differenzierbaren Einzelkolonien

führt. Nur so kann eine genaue KbE-Bestimmung gewährleistet werden. Aus

Vorversuchen ergaben sich folgende Verdünnungen als gut auszählbar:

grampositive Kokkenbakterien:

Verd.stufe 10-2 (= 1 x 104 KbE 10 ml NaCl + 0,1 ml Inokulum)

gramnegative Stäbchenbakterien:

Verd.stufe 10-2 (= 1 x 104 KbE 10 ml NaCl + 0,1 ml Inokulum)

grampositive Enterokokken:

Verd.stufe 10-1 (= 1 x 105 KbE 9 ml NaCl + 1 ml Inokulum)

21

Inokulum:

Verd.stufe 100 (= 1 x 106 KbE 2 ml NaCl + 2 Kolonien aus 2. Subkultur)

Aus den ausgezählten KbE wird rechnerisch die KbE der Ausgangssuspension

bestimmt.

2.1.1.4 Auswertung

Ermittlung der MHK-Werte:

Die mit Inokulum beimpften Mikrotiterplatten werden nach Bebrütung bei 18 ± 2 h bei

36 ± 1 °C ausgewertet. Die MHK lässt sich dem ersten Well einer

Konzentrationsreihe zuordnen, in dem makroskopisch kein Erregerwachstum und

keine Trübung zu erkennen sind. Um einen besseren Kontrast erzielen zu können,

bietet es sich an, die Auswertung der Platten auf schwarzem Untergrund

durchzuführen. Da das Blut den Agar dunkelrot verfärbt, sind Koloniewachstum und

Trübungen teilweise schlecht bis gar nicht zu erkennen. Durch Zuhilfenahme einer

Lichtquelle, die unter die Mikrotiterplatten gehalten wird, erhellt sich der Blutagar in

seiner Farbe und Kolonien und Trübungen lassen sich deutlicher ablesen.

Um den spezifischen MHK-Wert pro ml zu erhalten, muss die abgelesene

Verdünnungsstufe durch 4 dividiert werden. Das entspricht einer Erniedrigung der

Konzentration um 2 geometrische Verdünnungsstufen. Mit dieser Division wird die

4fach höhere Konzentrierung, die unter 2.1.1.3 „Beschichtung der Mikrotiterplatten“

beschrieben wurde, wieder aufgehoben.

Interpretation der Kontrollen:

Wachstums- bzw. Positivkontrolle: Bei positivem Ergebnis zeigen alle Kontrollen

Koloniewachstum in den jeweiligen Kavitäten an.

Sterilitäts- bzw. Negativkontrolle: Bei positivem Verlauf weisen die Wells nach der

Inkubation kein Koloniewachstum auf. Die Antiseptikalösungen können damit

Sterilität gewährleisten.

KbE-Bestimmung in den Mikrotiterplatten:

Um die genaue Koloniezahl des jeweiligen Erregers zu erhalten, ist zu beachten,

dass auch das Volumen des Inokulums nur ¼ des Gesamtvolumens (50µl/200µl) pro

Well beinhaltet. Eine 1:3 Verdünnung der Testsuspension findet statt. Daher muss

die KbE-Stufe, die aus den Kolonien der Blutplatte errechnet wurde, durch 4 geteilt

werden.

22

Differenzen hinsichtlich der verwendeten Verdünnungsstufe bei Blutplatten und

Mikrotiterplatten müssen ebenfalls in der Berechnung der KbE/ml berücksichtigt

werden. Das erfolgt durch Subtraktion von Logstufen [z.B. von 100 auf 10-2: Differenz

von 2 Logstufen: Subtraktion 1 x 106 1 x 104];

2.1.1.5 Probleme in der Durchführung

Die gewählte Methode wirft bei ihrer Durchführung einige Schwierigkeiten auf, die die

Auswertung der Ergebnisse erschweren können. Bei der Beschichtung der

Mikrotiterplatten mit flüssigem Agar kommt es Agar-abhängig zu geringer bis

mittlerer Blasenbildung in den Wells. Die Blasen entstehen dabei meist beim

Übertragen des Nährmediums aus den Pipettenspitzen der Mehrkanalpipette in die

Kavitäten. Begründen lässt sich diese Komplikation mit dem Wechsel des

Aggregatszustands von flüssig zu fest. Der flüssige Aggregatszustand geht - wie

oben erwähnt - bei Absinken der Temperatur unter 49 °C in den festen Zustand über.

Das Temperaturintervall, in dem die Stabilität des zugefügten AS und der flüssige

Agar-Zustand gewährleistet sind, liegt somit zwischen ca. 49 °C und 55 °C. Beim

Beschichten der Mikrotiterplatten ergibt sich daraus das Problem, dass die

Intervallgrenze von 49 °C durch das Abkühlen des Agars schnell unterschritten wird

und das Nährmedium in den Pipettenspitzen teilweise zu erstarren beginnt. Durch

das schwierige Abpipettieren des Agars werfen sich Luftblasen auf. Eine

Schüttelplatte kann zur Minimierung der Blasenbildung beitragen, bringt aber keine

100%ige Rückbildung. Daher bleiben kleine Luftblasen in dem sich verfestigenden

Agar zurück und erschweren im Anschluss die Auswertung der Ergebnisse. Dabei

wirken die kleinen Bläschen in ihrem Erscheinungsbild teilweise wie einzelne

Kolonien und können erst durch Kontrolle unter dem UV-Licht bzw. nach speziellen

chemischen Verfahren von wirklichem Bakterienwachstum unterschieden werden.

Der Wechsel vom flüssigen in den festen Aggregatszustand wirft ein weiteres

Problem auf: Die Verfestigung des Agars führt zur Verstopfung der Pippettenspitzen

bzw. zur Bildung von Agar-Rückständen in den Spitzen. Diese Schwierigkeit lässt die

Annahme zu, dass nicht jedes Well das exakte Volumen von 100 µl Agar aufweist.

Daher stellt sich die Frage, in wie weit eine geringere Menge an Agar den MHK-Wert

beeinflussen kann, denn ein geringeres Gesamtvolumen pro Well führt

möglicherweise zu einer relativen Erhöhung der AS-Konzentration, die abhängig von

der Volumenreduktion mehr oder weniger stark ausfallen kann.

23

Zu erwähnen sind zusätzliche Parameter, wie pH-Wert und Kationengehalt im Agar,

die bei der Herstellung des Nährmediums schwer kontrollierbar und somit

Schwankungen ausgesetzt sind [69]. Während auf Grund ihrer

Wirkungsunabhängigkeit in einem breiten pH-Intervall (siehe 1.4) kaum mit einer

Wirkungsänderung der AS zu rechnen ist, können die Erreger dagegen bereits durch

kleinste pH-Schwankungen des Agars in ihrer Empfindlichkeit gestört werden. Diese

Schwankungen können zu Wachstumssteigerung oder -verlangsamung führen, je

nachdem wie sich die pH-Wertveränderung bezüglich ihres pH-Optimums verhält.

Konzentrationsschwankungen bezüglich der Magnesium- und Calciumionen [70] im

Agar können ebenfalls zu einer Veränderung des bakteriellen Erregerwachstums

führen, die Stärke der Wachstumszu- oder Wachstumsabnahme hängt dabei stets

vom jeweiligen Bakterium ab.

In Einzelfällen haben die oben aufgelisteten Probleme bei der Doppelbestimmung zu

starken Abweichungen in den MHK-Werten eines Erregers geführt. Dabei

unterschieden sich die Wertepaare um mehr als zwei Verdünnungsstufen, so dass

der Versuch in diesen Fällen ein drittes Mal durchgeführt wurde. Bei Abweichungen

von einer Verdünnungsstufe innerhalb eines Wertepaares wurde der höhere Wert

verwendet, um sicher zu stellen, dass kein Erregerwachstum stattfindet.

2.1.2 Ergebnisse

Im Folgenden sind die MHK-Werte der Vorversuche tabellarisch dargestellt. Jede

Tabelle bezieht sich auf eine der vier Agarsorten. Die Mittelwerte aus der

Doppelbestimmung der MHK-Werte sind zu allen Kombinationsmöglichkeiten aus AS

und Erreger aufgelistet. Zu jedem Erreger sind die KbE/ml aus dem jeweils

verwendeten Inokulum aufgeführt.

Auf Isosensitest-Agar übertrifft Octenidin mit Ausnahme des E. coli ATCC-Stamms

Polihexanid und mit noch größerem Abstand Chlorhexidin an Wirksamkeit. Außer

gegenüber E. coli ist Polihexanid durchweg wirksamer als Chlorhexidin. Beim

mukoidbildenden P.aeruginosa sind die MHK-Werte von Polihexanid und

Chlorhexidin identisch (Tab. 1).

24

Tab. 1: MHK-Werte der Antiseptika auf Isosensitest-Agar

MHK

KbE [1/ml]

Octenidin [µg/ml]

Polihexanid [µg/ml]

Chlorhexidin [µg/ml]

S. aureus ATCC 29213 2 4 16 1,9x105

S. aureus ATCC 6538 2 4 32 1,7x105

MRSA norddt. 2 8 16 0,5x105

E. faecalis ATCC 29212 2 16 32 0,5x105

E. faecium ATCC 6057 2 8 16 0,4x105

P. aeruginosa ATCC 27853 8 32 64 1,1x105



P. aeruginosa mukoidbild. 8 32 32 0,4x105

E. coli NCTC 10538 4 16 8 2,2x105

E. coli ATCC 11229 16 16 8 5,0x106

Während auf CSA Octenidin bis auf eine Ausnahme am wirksamsten ist, ist der

Wirkungsunterschied zwischen Polihexanid und Chlorhexidin nicht so ausgeprägt

(3mal geringere Wirksamkeit von Polihexanid, 4mal kein Unterschied; Tab. 2).

Tab 2: MHK-Werte der Antiseptika auf CSA-Agar

MHK

KbE [1/ml]

Octenidin [µg/ml]



S. aureus ATCC 29213 4 8 8 2,5x105

S. aureus ATCC 6538 8 16 8 3,9x105

MRSA norddt. 2 16 16 2,2x104

E. faecalis ATCC 29212 8 16 16 4,2x105

E. faecium ATCC 6057 2 8 8 3,8x105





E. coli NCTC 10538 4 16 16 3,3x105

E. coli ATCC 11229 4 32 16 4,5x106

Auf MH-Agar ist Octenidin ausnahmslos am wirksamsten. Polihexanid ist mit einer

Ausnahme (mukoidbildender P. aeruginosa) wirksamer als Chlorhexidin (Tab. 3).

25

Tab. 3: MHK-Werte der Antiseptika auf MH-Agar

MHK

KbE [1/ml]

Octenidin [µg/ml]



S. aureus ATCC 29213 2 4 8 6,9x105

S. aureus ATCC 6538 1 4 8 4,4x105


E. faecalis ATCC 29212 1 8 16 1,0x105

E. faecium ATCC 6057 1 2 8 5,8x104





E. coli NCTC 10538 2 4 8 5,6x105

E. coli ATCC 11229 2 4 8 9,0x105

Auf Blut-Agar weist Octenidin 3mal keinen Unterschied in der Wirksamkeit

gegenüber Polihexanid auf. Hinsichtlich der verbleibenden 8 Erreger ist Octenidin am

wirksamsten. Polihexanid ist gegenüber Chlorhexidin ausnahmslos stärker in der

Wirkung (Tab. 4).

Tab. 4: MHK-Werte der Antiseptika auf Blut-Agar

MHK

KbE [1/ml]

Octenidin [µg/ml]



S. aureus ATCC 29213 4 4 16 7,1x105

S. aureus ATCC 6538 4 8 16 1,6x105


E. faecalis ATCC 29212 2 16 64 7,2x104

E. faecium ATCC 6057 2 8 32 8,0x104





E. coli NCTC 10538 4 8 16 6,2x105

E. coli ATCC 11229 4 4 16 6,8x105

26

2.1.3 Diskussion und Schlussfolgerungen

2.1.3.1 Wirksamkeit der Antiseptika im Vergleich

Die MHK-Werte stellen eine sinnvolle Kenngröße dar, um die Wirksamkeit der AS

auszudrücken. Begründen lässt sich das mit dem Zusammenhang zwischen der

Höhe der MHK eines AS bezüglich eines Erregers und dessen Vermehrung. Je

höher die zur Hemmung des Bakteriums benötigte AS-Konzentration ist, desto

unsensibler reagiert der Erreger auf das AS bzw. desto unwirksamer ist das AS.

Dieser Zusammenhang liegt ebenso in der umgekehrten Weise vor.

Wirksamkeit unter Verwendung des Nährmediums Isosensitest:

Vergleicht man die MHK-Werte der AS hinsichtlich jedes Erregers, übertrifft die

Wirksamkeit von Octenidin mit wenigen Ausnahmen die von Polihexanid und

Chlorhexidin. Die MHK-Werte von Polihexanid liegen mit einer Spannbreite von 1-3

Verdünnungsstufen oberhalb der MHK-Werte von Octenidin. Das bedeutet, dass die

Konzentration von Polihexanid vergleichsweise 2-8mal höher sein muss, um die

vollständige Wachstumshemmung eines Erregers zu erlangen. Die Wirksamkeit von

Chlorhexidin ist noch niedriger. Verglichen mit Octenidin liegen die MHK-Werte um

den Faktor 2-16 höher, gegenüber Polihexanid fallen die Abweichungen etwas

geringer aus. Dennoch werden auch im Vergleich zu Polihexanid etwa 2-4mal so

hohe Konzentrationen benötigt. Nur gegenüber E. coli war Chlorhexidin das

potenteste AS, wobei die stark erhöhte Koloniezahl von 5 x 106/ml im Vergleich zu

den verbleibenden Koloniezahlen der anderen Erreger (0,38-1,88 x 105/ml)

zusätzlich berücksichtigt werden sollte.

Wirksamkeit unter Verwendung des Nährmediums Müller-Hinton:

Müller-Hinton stellt wie Isosensitest eine der meist verwendeten Agarsorten in der

Mikrobiologie dar und weist im Vergleich nur wenige Unterschiede bei identischen

Versuchsabläufen auf. Bei der Betrachtung der AS-Wirksamkeit treten keine

wesentlichen Unterschiede zum Isosensitest-Agar auf. Auch hier ist Octenidin

gegenüber Polihexanid 2-8mal und gegenüber Chlorhexidin 4-16mal stärker

wirksam. Eine Ausnahme bildet der mukoidbildende P. aeruginosa. Hier ist die MHK

von Polihexanid mit 32 µg/ml doppelt so hoch wie die MHK von Chlorhexidin und

zeigt eine niedrigere Wirksamkeit an.

27

Wirksamkeit unter Verwendung des Nährmediums Müller-Hinton mit 5 %

Schafsblut:

Die Tendenz, dass die Wirksamkeit in der Reihenfolge Chlorhexidin, Polihexanid und

Octenidin zunimmt, setzt sich auch bei Verwendung von Blutagar fort. Wiederum

unterscheiden sich Octenidin und Polihexanid bei 10 Erregern um 1-3

Verdünnungsstufen. Mit Ausnahme von S. aureus ATCC 29213 ergibt sich eine 2-

8fach höhere Wirksamkeit von Octenidin gegenüber Polihexanid. Chlorhexidin weist

in diesem Fall eine 4-32fach niedrigere Wirkung als Octenidin auf.

Wirksamkeit unter Verwendung des Nährmediums CSA:

Auf CSA ergeben sich ähnliche Wirkungsabstufungen für Octenidin. Das Verhältnis

zu Chlorhexidin stellt sich jedoch anders dar als bei den übrigen Agarsorten.

Chlorhexidin ist um 1-4 Verdünnungsstufen, Polihexanid im Vergleich dazu nur um 1-

3 Verdünnungsstufen schwächer wirksam als Octenidin. Die Ausnahme zwischen

Octenidin und Chlorhexidin stellt S. aureus ATCC 6583 dar. Bezüglich dieses

Erregers sind keine Unterschiede zwischen den beiden AS gegeben. Während sich

somit Chlorhexidin und Octenidin in ihrer Wirkung auf Isosensitest und CSA

tendenziell identisch verhalten, treten zwischen Chlorhexidin und Polihexanid im

Vergleich zum Isosensitestagar deutliche Abweichungen auf. Bei CSA weisen die

beiden AS bei 7 von 11 Erregern die gleiche Wirksamkeit auf.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Octenidin unter Verwendung aller vier

Agarsorten die höchste Wirksamkeit aufweist. Die aus der Literatur entnommenen

Daten bezüglich der Wirkungsunterschiede zwischen Octenidin und Chlorhexidin, die

Octenidin eine 10fach höhere Wirksamkeit als Chlorhexidin zuschreiben (s. 1.3),

lassen sich mit den neuen Daten bestätigen bzw. in Bezug auf die hier verwendeten

Erreger und Agarsorten sind die Unterschiede zum Teil noch ausgeprägter

zugunsten von Octenidin. Im Vergleich zu Chlorhexidin ist auch Polihexanid das

wirksamere AS unter den hier gegebenen Bedingungen. Die einzige Abweichung

liegt unter Verwendung von CSA vor. In diesem Fall ist die Wirkung von Chlorhexidin

gleich oder sogar höher.

2.1.3.2 Einfluss des Agars

Die Wirkstärke eines AS wird von der Art des Agars beeinflusst. Wie bereits erwähnt,

können kleinste pH- oder Ionenschwankungen innerhalb eines Agars zu

28

Wachstumsveränderungen eines Erregers führen, die zu einer Koloniezahländerung

und dadurch bedingt zu einer Verschiebung des MHK - Wertes führen. Die hier

verwendeten Agarsorten weisen in ihrer Zusammensetzung deutliche Unterschiede

zueinander auf.

Im folgenden Abschnitt werden daher die verwendeten Agarsorten bezüglich ihrer

Einflussnahme auf die AS-Wirkung verglichen. Den Bezugsagar stellt hierbei Müller-

Hinton als häufig verwendetes Nährmedium zur Resistenztestung dar.

Jedes der 3 AS weist bei Isosensitest und MH identische oder innerhalb der

normalen Schwankungsbreite von 2 Verdünnungsstufen liegende MHK-Werte auf.

Die einzige Ausnahme stellt E. coli ATCC 11229 unter Verwendung von Octenidin

dar. Erklären lässt sich dieser Sachverhalt unter Einbeziehung der KbE. Die bei

Isosensitest um 4,1 x 106 Erreger höher liegende Koloniezahl erfordert eine höhere

AS-Konzentration zur vollständigen Wachstumshemmung als bei MH. Der MHK-Wert

liegt daher 3 Verdünnungsstufen niedriger, sodass die erforderliche AS-

Konzentration um den Faktor 8 höher ist. Der Unterschied ist demzufolge

offensichtlich nicht auf den Agar, sondern auf die zufällig verwendete höhere

Erregermenge zurückzuführen. Bei Polihexanid und Chlorhexidin lassen sich unter

Berücksichtigung der normalen Schwankungsbreiten ebenfalls nur geringfügige

Erhöhungen bzw. Erniedrigungen in den MHK-Werten feststellen. So zeigt sich, dass

Isosensitest und MH unter Betrachtung jeweils eines der 3 AS zu identischen MHK-

Werten führen. Geschlussfolgert werden kann hieraus die mögliche Austauschbarkeit

der beiden Agar untereinander bei Verwendung der genannten AS und Erreger.

Unabhängig von den verwendeten AS lassen sich in Kombination mit dem

Nährmedium CSA ebenfalls überwiegend im Toleranzbereich (Vergleich mit MH)

liegende MHK-Werte messen. Somit ruft CSA praktisch identische Wirkungsstärken

bei den AS hervor wie MH und Isosensitest. Um 3 Verdünnungsstufen abweichend

belaufen sich die MHK-Werte unter Verwendung der Erreger S. aureus ATCC 6538,

E. faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC 11229 und norddt. MRSA.

Wie unter 2.1.1.3 „Herstellung der Nährmedien“ beschrieben, handelt es sich beim

Blut-Agar um MH mit 5 % beigefügtem Schafsblut. Dieser Agar liefert den Bakterien

Umweltbedingungen, die zwar keinesfalls mit den Wachstumsbedingungen im

menschlichen Blut/Körper gleichgesetzt werden können, sie aber im Ansatz

versuchen, nachzuahmen. Trotz Belastung mit 5 % Schafsblut zeigen alle drei

getesteten Antiseptika im direkten Vergleich mit reinem MH-Nährmedium wieder nur

29

geringe Schwankungen bei ihren MHK-Werten. Die Abweichungen sind in der

Größenordnung von -1 bis +2 Verdünnungsstufen anzuordnen und unterliegen damit

den natürlichen Schwankungen. Schlussfolgernd zeigt sich, dass die Wirksamkeit

von Octenidin, Chlorhexidin und Polihexanid durch eine Belastung von 5 %

Schafsblut nicht abgeschwächt wird. Eventuelle Zeitverzögerungen bis zum

Wirkeintritt sind in diesem Fall jedoch nicht auszuschließen, da sie in den Versuchen

keiner Berücksichtigung unterlagen.

30

2.2 Hauptversuche zur Ermittlung von Interaktionen

2.2.1 Methode

2.2.1.1 Material

Chemikalien: s. auch unter 2.1.1.2

Antibiotika:

Amikacin: AK 30 µg; Artikel-Nr.: CT0107B; Oxoid GmbH, Wesel

Gentamicin: CN 200 µg; Artikel-Nr.: CT0695B; Oxoid GmbH, Wesel

Vancomycin: VA 30 µg; Artikel-Nr.: CT0058B; Oxoid GmbH, Wesel

Linezolid: LZD 30 µg; Artikel-Nr.: CT1650B; Oxoid GmbH, Wesel

Mupirocin: MUP 5 µg; Artikel-Nr.: CT0522B; Oxoid GmbH, Wesel

Ciprofloxacin: CIP 5 µg; Artikel-Nr.: CT0425B; Oxoid GmbH, Wesel

Geräte: s. auch unter 2.1.1.2

2.2.1.2 Testprinzip

Agardilutionsmethode:

Bei der Agardilutionsmethode [12] werden Behältnisse mit wirkstoffhaltigen

Kulturmedien gefertigt, wobei diese unterschiedliche Verdünnungsstufen des

Chemotherapeutikums aufweisen. Dabei werden der Flüssigagar und die AB-

Verdünnungsstufe unter sterilen Bedingungen im Verhältnis 9:1 gemischt und in

Petrischalen gegossen. Unter Verwendung von Petrischalen mit einem Durchmesser

von 9 cm ist ein Volumen von 25,5 ml Kulturmedium notwendig, um eine

Schichtdicke von 4 - 4,5 mm zu erlangen. Diese Dicke verhindert zum einen das zu

schnelle Austrocknen des agarhaltigen Mediums und zum anderen minimiert es die

Ausbildung eines Wirkstoffgradienten (s. o.). Nach Erstarren (dieser Zustand ist nach

etwa 48 h erreicht) wird die Oberfläche homogen mit 0,1 ml Inokulum (KbE 105 -

106/ml) beimpft. Die Auswertung der Platten erfolgt nach mindestens 18-stündiger

Inkubation bei 36 ± 1 °C. Die Petrischalen werden auf Wachstum überprüft. Die

Platte mit der niedrigsten Konzentration des Wirkstoffes, auf der visuell kein

sichtbares Koloniewachstum mehr auftritt, wird als minimale Hemmkonzentration

(MHK) des entsprechenden Bakteriums angegeben.

31

Agardiffusionsmethode:

Der Agardiffusionstest [10] ist eine bewährte Methode zur Testung der

Empfindlichkeit mikrobieller Krankheitserreger auf ein Chemotherapeutikum. Zwei

unterschiedliche Durchführungsverfahren sind möglich: der Streifentest/E-Test [16]

und der Plättchentest nach Kirby & Bauer [3]. Beim hier verwendeten Plättchentest

werden auf der Oberfläche einer Agarplatte 0,1 ml Inokulum homogen ausgestrichen

und anschließend mit ABplättchen (Wirkstoffträger) so beschichtet, dass annähernd

kreisrunde Hemmhöfe ohne Überschneidung entstehen. Die Wirkstoffträger

enthalten eine definierte Wirkstoffmenge, die durch die Feuchtigkeit des Agars

aktiviert wird. Das Chemotherapeutikum diffundiert sowohl in die Tiefe des Agars als

auch längs der Agaroberfläche und bildet einen vom Mittelpunkt nach außen

abfallenden Konzentrationsgradienten. Je nach Empfindlichkeit des

Krankheitserregers gegenüber dem AB entstehen wachstumsfreie Zonen

(Hemmhöfe) um die Plättchen. Nach DIN-Vorschrift gelten die Ränder des deutlich in

der Koloniegröße reduzierten Wachstums als Grenzen für den HHD [10]. Verglichen

mit Literaturwerten aus der DIN [11] oder der NCCLS werden die Ergebnisse in die

Kategorien a) resistent, b) intermediär und c) empfindlich eingestuft. Mit Hilfe von

Regressionsgeraden kann vom HHD indirekt auf die klinisch bedeutsame MHK

geschlossen werden [14].

Agardiffusions-Dilutions-Kombitest:

Zur Bestimmung der Interaktionen von AB und AS auf den Erreger werden beide

Methoden zum von uns benannten Agardiffusions-Dilutions-Kombitest kombiniert.

Das Prinzip des Versuches sieht vor, dass mit vorgegebenen Konzentrationen an AS

versehene Agar-Platten mit Erregern beimpft und zeitgleich mit ABplättchen

beschichtet werden. Die nach einer Inkubationszeit von 18 ± 2 h entstehenden HHD

werden mit den HHD aus Kontrollversuchen verglichen, bei denen dem Agar kein AS

zugefügt wurde. Differenzen in den Durchmessern lassen auf Interaktionen zwischen

AB und AS schließen. Drei verschiedene AB/AS-Interaktionsmöglichkeiten auf den

Erreger sind zu unterscheiden: additiver Effekt, Synergismus und Antagonismus.

32

2.2.1.3 Auswertung

2.2.1.3.1 Index der fraktionalen inhibitorischen Konzentration

Das Zusammenwirken zweier Chemotherapeutika auf einen Erreger lässt sich durch

ein Isobologramm beschreiben, wobei von der Definition der Additivität ausgegangen

wird, d. h. “das Ergebnis ist gleich der Summe der Wirkungen der einzelnen AB, oder

das AB verhält sich so, als wäre es mit sich selbst kombiniert (ein Teil AB A plus zwei

Teile AB B ist gleich drei Teile AB A)“ [17]. In Abb. 2 ist die hemmhofbildende AB-

Konzentration K(AB) unter der im Agar eingestellten AS-Konzentration K(AS)

schematisch aufgetragen.

Abb. 2: Isobologramm: Isobolen mit AB-Hemmhofkonzentrationen K(AB) als Funktion

der AS-Konzentrationen K(AS) im Agar (Nr. 1 und 2 = Antagonismus, Nr. 3 =

Synergismus, Nr. 4 = Additivität)

Die rechnerische Auswertung mittels IFIC (Index der fraktionalen inhibitorischen

Konzentration) entspricht dabei der graphischen Isobologrammauswertung. Sie

errechnet sich klassischerweise aus der Summe zweier Fraktionaler Inhibitorischer

Konzentrationen (FIC), die durch Division aus Minimaler Hemmkonzentration (MHK)

des AB in Kombination durch MHK des Antibiotikums allein bestimmt wird [23].

Die verschiedenen AB/AS-Interaktionsmöglichkeiten auf den Erreger sind anhand

der IFIC als Kennzahl definierbar und werden im Folgenden aufgeführt. Dabei ist

vorab anzumerken, dass davon ausgegangen wird, dass die AS-Konzentration

33

[K(AS)] ein vom AB unbeeinflussbarer Parameter ist. Dadurch kann die

normalerweise verwendete Bezeichnung K(AS/AB) zu K(AS) vereinfacht werden:

IFIC = ___K(AB/AS) ___ + ___K(AS)___ MHK(AB) MHK(AS)

IFIC = Kennzahl zur quantitativen Beschreibung einer Isobole mit folgenden

Werten:

o K(AB/AS) = hemmhofbildende Konz. des AB unter Anwesenheit einer

festen AS-Konz. im Agar

o K(AS) = im Agar gleichmäßig verteilte Konz. an AS

o MHK(AS) bzw. MHK(AB) = minimale Hemmkonz. des AS bzw. AB

Dabei gilt für:

IFIC = 1: additives AB/AS- Zusammenwirken mit Wertepaaren [K(AS)/ K(AB/AS)]

auf einer Geraden als Isobole (Abb. 2: Isobole Nr.4)

IFIC > 1: antagonistisches AB/AS- Zusammenwirken mit Wertepaaren

[K(AS)/K(AB/AS)] auf einer Isobolen oberhalb der Geraden (Abb. 2: Isobolen Nr.1

& Nr.2)

IFIC < 1: synergistisches AB/AS- Zusammenwirken mit Wertepaaren [K(AS)

/K(AB/AS)] auf einer Isobolen unterhalb der Geraden (Abb. 2: Isobole Nr.3)

Da die Konzentrationen K(AB/AS) und MHK(AB) nur indirekt über den HHD

gemessen werden, kann die IFIC hier jedoch nicht als Kennzahl zur

Gruppeneinteilung verwendet werden. Die Festlegung eines anderen Kriteriums wird

unter 2.2.1.3.2 erläutert.

2.2.1.3.2 Festlegung des Unterscheidungsmerkmals zur Gruppen-einteilung

Zur Festlegung eines Unterscheidungsmerkmals, das notwendig ist, um die

Aufstellung von fest definierten AB/AS-Interaktionsgruppen vornehmen zu können,

hilft das Isobologramm aus Abb. 2.

Bei additivem und synergistischem AB/AS-Zusammenwirken nimmt bei

wachsender AS-Konzentration [K(AS)] im Agar (Bezugspunkt ist die AS-

Konzentration K(AS) = 0) die hemmhofbildende AB-Konzentration K(AB/AS) ab

(Isobolen Nr. 3 und 4), d. h. die dazugehörigen HHD nehmen zu.

34

Bei antagonistischem AB/AS- Zusammenwirken nimmt bei wachsender K(AS) im

Agar die hemmhofbildende AB-Konzentration K(AB/AS) zu (Isobolen Nr. 1 und 2), d.

h. die dazugehörigen HHD nehmen ab.

Anstatt also eine einzige Kennzahl zur Aufstellung von Interaktionsgruppen zu

berechnen, wird hier das Änderungsverhalten (Monotonieverhalten) der HHD in

Abhängigkeit von der AS-Konzentration [K(AS)] im Agar als Kriterium verwendet.

Bezugspunkt hierfür ist der HHD der Kontrolle HHDK, der auf AS-freiem Agar

gemessen wird [K(AS) = 0].

2.2.1.3.3 Fehlerbetrachtung

Die Messung des HHD ist auf Grund des statistischen Fehlers mit einer

Messungenauigkeit behaftet. Diese wird als Standardabweichung des Mittelwerts

angegeben, wobei eine Normalverteilung der HHD-Messwerte angenommen wird.

Die Standardabweichung muss geschätzt werden, da in der hier verwendeten

Versuchsdurchführung nur zwei HHD-Messwerte für eine bestimmte AS - Konz.

(K(AS)-Wert) bestimmt wurden. Die zur Auswertung der wachstumsfreien Zonen

verwendete Schablone ist auf Millimeter-Einheiten geeicht. Auf Grund dieser Eichung

und in Anlehnung an die Messungen von G. Kronvall [48] wird die

Standardabweichung für den HHD auf ± 2 mm geschätzt.

Am Beispiel des Erregers S. aureus ATCC 29213 mit der CHX/LZD 30- Kombination

auf Isosensitest-Agar wird die Bedeutung der Standardabweichung verdeutlicht:

Die gemessenen HHD von 34 mm und 36 mm bei einer AS-Konzentration im Agar

von K(AS) = 1/8 MHK ergeben für den „wahren Mittelwert“ im arithmetischen Mittel

einen „Näherungswert“ von 35 mm, d.h. der „wahre Mittelwert“ liegt im Intervall [28,5;

32,5].

Zwei HHD-Mittelwerte werden hier nur dann als wesentlich verschieden angesehen,

wenn deren Fehlerintervalle sich nicht überlappen, ihre Abstände voneinander

mindestens 4 mm betragen. Als nicht wesentlich verschieden werden dagegen HHD-

Messwerte für 2 verschiedene K(AS) mit Abständen kleiner 4 mm bezeichnet.

Daraus ergeben sich konkrete Kriterien zur Einteilung in Interaktionsgruppen (siehe

2.2.1.3.4).

35

2.2.1.3.4 Festlegung der AB/AS-Interaktionsgruppen

Unter der Voraussetzung, dass Unterscheidungsmerkmal (2.2.1.3) und

Standardabweichung (2.2.1.4) festgelegt sind, kann eine Aufstellung von fest

definierten Interaktionsgruppen erfolgen.

Additivität/Synergismus: d1/8 MHK > dK + 4 mm, wobei der Wert d1/16 MHK nicht

wesentlich fallend sein darf gegenüber dK

d.h. die Randwerte sind wesentlich steigend und der HHD für K(AS) = 1/16

x MHK gliedert sich in das Verhalten der Messreihe ein, indem er nicht

wesentlich fallend ist.

Antagonismus: d1/8 MHK < dK - 4 mm, wobei der Wert d1/16 MHK nicht wesentlich

steigend sein darf gegenüber dK

d. h. die Randwerte sind wesentlich fallend und der HHD für K(AS) = 1/16 x

MHK gliedert sich in das Verhalten der Messreihe ein, indem er nicht

wesentlich steigend ist.

Indifferenz: in die Gruppe der Indifferenz fallen alle Wertepaare d1/8 MHK/dK, die

weder der Gruppe Additivität/Synergismus noch der Gruppe Antagonismus

zugeordnet werden können

d.h. die HHD-Werte sind weder als wesentlich steigend noch als wesentlich

fallend einzuordnen.

Erläuterung zu den Interaktionsgruppen: Der Messwert des HHD für K(AS) = 1x

MHK wird in die Monotoniebetrachtung nicht mit einbezogen, da er zu weit von den

HHD-Werten für K(AS) = 0 x MHK, K(AS) = 1/16 x MHK und K(AS) = 1/8 x MHK

entfernt ist, wohingegen diese einen konstanten Konzentrationsunterschied von je

∆K(AS) = 1/16 x MHK aufweisen. Dies ist aber Voraussetzung, um das

Steigungsverhalten der Funktion „HHD in Abhängigkeit von K(AS)“ von Intervall zu

Intervall vergleichbar machen zu können. Dennoch bleibt dieser Messwert nicht ohne

Bedeutung. Nach Festlegung der jeweiligen Interaktionstendenz einer Messreihe

kann dieser Wert mit einbezogen werden. Durch sinngemäßes Einfügen in die

Messreihe kann er deren Interaktionseffekt in seiner Aussagekraft verstärken.

36

2.2.1.4 Versuchsdurchführung

Herstellung der Erregersuspension: s. Abschn. 2.1.1.3

Herstellung des Agars:

Das gewünschte Volumen an Flüssigagar (Isosensitest, CSA, Blutagar, MH) wird in

hitzebeständigen, verschließbaren Glasflaschen hergestellt und sterilisiert. Die

Menge an Agarpulver wird für das jeweilige Volumen abgewogen (z. B. für 100 ml).

Die Mengenangaben werden dabei wie unter 2.1.1.3 „Herstellung des Nährmediums“

den Gebrauchsangaben der Firmen entnommen. Der Unterschied zur reinen Agar-

Herstellung liegt in der Zugabe des AS zum Flüssigagar.

Laut DIN 58940-6 (Agardilutionsmethode) werden Flüssigagar und AS-Lösung im

Verhältnis 9:1 gemischt [12]. Unter Einhaltung dieser Norm kann die jeweils

benötigte Menge an Agarpulver mit folgender Formel berechnet werden:

mlVolumenbenötigtes

gx

ml

gAgarpulver

1000

Dabei muss berücksichtigt werden, dass das Volumen an Aqua dest., welches zur

Auflösung des Agarpulvers verwendet wird, um 10 % des Gesamtvolumens reduziert

wird, damit nach Zugabe der 10 % AS-Lösung das benötigte Gesamtvolumen von

100 % im geforderten Verhältnis von 9:1 vorliegt. Bei einem gewünschten

Gesamtvolumen von 100 ml ergibt sich somit folgende Zusammensetzung der

verschiedenen Agarsorten:

Müller-Hinton (MH): 3,4 g Pulver + 90 ml Aqua dest. (34 g/1000 ml)

Isosensitest: 3,14 g Pulver + 90 ml Aqua dest. (31,4 g/1000 ml)

CSA: 4,0 g Pulver + 90 ml Aqua dest. ( 40 g/1000ml)

Blut: 3,4 g MH-Pulver + 85 ml Aqua dest. + 5 ml defibr. Schafsblut

Das Agarpulver wird auf einer Feinwaage abgewogen und in hitzestabile, sterile

Glasflaschen gefüllt. Nach Zugabe des Aqua dest. (90 % des gewünschten

Gesamtvolumens) wird das Nährmedium auf einem Heiz-Rührgerät zu einer

homogenen Flüssigkeit vermischt. Anschließend erfolgt die Sterilisation im

Autoklaven bei 121 °C für 20 min. Um eine Zerstörung der chemischen Struktur des

AS zu verhindern, wird es dem auf 55 °C abgekühltem, noch flüssigem Agar

(Temperierung in einem Heizbad), zugesetzt.

37

Herstellung der AS–Konzentrationen:

Bei der Betrachtung jedes einzelnen AS der hier verwendeten (Octenidin,

Polihexanid und Chlorhexidin) ist folgendes zu beachten: Jede mögliche Kombination

aus Agar und Erreger weist eine spezifische MHK auf, die bereits in den

Vorversuchen bestimmt wurde (s. Abschn. 2.1.2 Ergebnisse). Für jede Erreger/Agar-

Kombination müssen somit 3 verschiedene AS-Konzentrationen hergestellt werden:

1. AS-Konzentration = 1x MHK

2. AS- Konzentration = 1/8 x MHK

3. AS- Konzentration = 1/16 x MHK

Je nach gewünschter AS-Konzentration im Agar wird die jeweilige Verdünnungsstufe

aus der Stammlösung hergestellt. Dabei ist zu beachten, dass die Beimischung der

AS-Lösung zum Flüssigagar zu einer 1:10 Verdünnung des AS führt. Denn wie unter

2.2.1 „Herstellung des Agars“ bereits erwähnt, werden zu 90 % Aqua dest. 10 % AS

gegeben. Um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen, muss die Lösung

daher 10fach höher konzentriert werden. Für die Berechnung der jeweiligen AS-

Konzentration wird die folgende Gleichung verwendet:

Volumen X (Aqua dest) = Konzentration Stammlsg.(AS) - gewünschte Konzentration(AS)

gewünschte Konzentration(AS)

Gesamtvolumen (gewünschte AS-Konz.) = 1ml Stammlösung + X ml Aqua dest.

Unter Berücksichtigung der im Anschluss folgenden Aspekte konnten von jeder

benötigten AS-Konzentration direkt größere Volumina hergestellt werden, so dass

identische Arbeitsschritte und damit auch Zeit eingespart werden konnten:

Erreger/Agar-Kombinationen mit identischen MHK-Werten identische AS-

Konzentration erforderlich

Doppelbestimmung jedes Versuchs doppelte Volumina der AS-Konzentration

notwendig

Berechnung der benötigten Petrischalen pro Erreger/Agar-Kombination

Errechnung der Volumina an AS-Konzentration

Negativ- und Positivkontrollen:

Zusätzliche Platten für die Negativ- und Positivkontrollen sind nicht nötig. Die

Negativkontrollen entsprechen den hergestellten Platten mit verfestigtem Agar-

Antiseptikumgemisch. Liegt auf der Oberfläche der Nährböden vor dem Beimpfen mit

Inokulum kein sichtbares Erregerwachstum vor, ist die Sterilität der Medien

38

nachgewiesen. Die Platten für den reinen Agardiffusionsversuch können bei ihrer

Auswertung zeitgleich als Positivkontrollen gewertet werden. Diese Methode lässt ein

deutliches Erregerwachstum mit Ausnahme der Hemmhöfe auf dem Nährmedium

erwarten. Somit können beide Agardiffusions-Platten eines jeden

Versuchsdurchlaufs mit ihrem Bakterienwachstum den Erregernachweis im

verwendeten Inokulum liefern und eine positive Wachstumskontrolle nachweisen.

Herstellung der Nährmedienplatten:

Das geforderte Volumen an AS-Lsg. wird zu dem herunter gekühlten Flüssigagar

zugegeben, auf der Rühr-Heizplatte zu einem homogenen Medium gemischt und

anschließend in die vorbereiteten Petrischalen umgefüllt. Nach DIN 58940-6 werden

für eine Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm etwa 25,0 ml Volumen

benötigt, um eine Schichtdicke von 4,0 bis 4,5 mm zu erreichen. Um

Verwechslungen zu vermeiden, werden die Schalen vorab mit dem Namen des

Agars und der AS-Konzentration beschriftet. Die mit Flüssigagar beschichteten

Petrischalen werden für 2 Tage auf ebenem Untergrund bei Zimmertemperatur

gelagert, um eine vollständige Verfestigung des Agars zu gewährleisten.

Beimpfen der Platten:

0,1 ml des unter 2.1.1.3 „Herstellung der Testsuspension“ beschriebenen Inokulums

werden auf den Agar pipettiert und mit gewinkeltem Glasspatel gleichmäßig

ausgestrichen. Anschließend werden die ABplättchen auf den Agar aufgelegt. In der

Regel passen drei ABplättchen auf eine Agarplatte mit einem Durchmesser von 9

cm, so dass sich die entstehenden Hemmhöfe nicht gegenseitig überlappen und

Interaktionen zwischen den AB vermieden werden. Um die gewünschten Plättchen

immer an demselben Ort und zugleich in maximalem Abstand voneinander und vom

Petrischalenrand zu platzieren, wurde eine Schablone angefertigt und unter die

Petrischalen gelegt (Abb. 2). Die beimpften Platten werden bei 36 ± 1 °C für 18 ± 2 h

im Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgt die Auswertung.

39

Abb. 3: Schablone zur identischen Beschichtung der Petrischalen mit ABplättchen -

Platzierung der Schablone unter der Petrischale und Lage der jeweils 3 ABplättchen

auf den 3 vorgezeichneten schwarzen Punkten

Bestimmung der Erregerzahl:

Die KbE/ml werden nach dem gleichen Verfahren wie unter 2.1.1.3 „Bestimmung der

Koloniezahl des Inokulums“ beschrieben durchgeführt. Die berechneten

Koloniezahlen entsprechen direkt den Koloniezahlen der Inokula der

Interaktionstestungen.

Auswertung der Platten:

Die HHD werden an ihrer engsten Stelle mit Hilfe einer unter der Petrischale

platzierten Schablone mit mm-Einheiten abgelesen. Bei den Blutplatten wird die

Schablone direkt auf dem Agar platziert. Zur Zeitersparnis wird empfohlen, die

Schablone mit abwischbarer Folie zu umkleben, damit sie weiter verwendet werden

kann.

2.2.2 Ergebnisse

Ergebnistabellen aus den Rohdaten:

In den Tabellen 5-16 sind die Ergebnisse der Interaktionsmessung

zusammengefasst. Innerhalb der Spalten „1/16 MHK“, „1/8 MHK“ und „MHK“ sind die

gemessenen HHD mit den im Agar dilutierten AS-Konzentrationen K(AS) = 1/16 x-,

1/8 x- und 1 x- MHK aufgeführt. Die MHK-Werte wurden den Vorversuchen

entnommen und beziehen sich auf den jeweiligen Erreger und Agar. Die Spalte

40

„Kontrolle“ listet die HHD aus den Kontrollversuchen (Agardiffusionstest) auf. Alle

Werte innerhalb dieser vier Spalten sind in mm angegeben. Zu berücksichtigen ist,

dass es sich dabei bereits um die Durchschnittswerte aus der Doppelbestimmung

handelt. In der Spalte „Antibiotikum“ sind die an dem jeweiligen Erreger getesteten

AB in ihren gängigen Abkürzungen aufgeführt. Kein sichtbares Koloniewachstum ist

mit „KW“, Wachstum vereinzelter Kolonien mit „Kol.“ abgekürzt.

Auf Isosensitest-Agar lassen sich zwischen CHX und den geprüften AB als

Interaktion Indifferenz oder Additivität/Synergismus nachweisen. Erregerabhängig ist

die Interaktion jedoch unterschiedlich. Bei S. aureus ATCC 29213, dem norddt.

MRSA, E. faecalis, E. faecium, den P. aeruginosa-Stämmen ATCC 27853 und 9027

und E. coli ATCC 11229 liegt Indifferenz vor, während S. aureus ATCC 6538, P.

aeruginosa ATCC 15442 und der mukoidbildende P. aeruginosa bei allen AB und

E.coli NCTC 10538 bei CIP 5 Additivität/Synergismus aufweisen (Tab. 5).

41

Tab. 5: HHD-Ergebnisse der Chlorhexidin/AB-Kombinationen mit Isosensitest

AB MHK 1/8

MHK 1/16 MHK Kontrolle

KBE [1/ml]

S. aureus CIP 5 KW 32 31 33 9,0x105

ATCC 29213 LZD 30 KW 35 34 35

MUP 5 KW 33 30,5 33

VA 30 KW 22 21 20

S. aureus CIP 5 KW KW 40 34 2,8x105

ATCC 6538 LZD 30 KW KW 42,5 36

MUP 5 KW KW 41 36

VA 30 KW KW 29 22

MRSA norddt. CIP 5 KW 30 29 29 4,3x105

CN 200 KW 42 41 41,5

LZD 30 KW 40 37 36,5

MUP 5 KW 35 33 35

VA 30 KW 27,5 25,5 25

E. faecalis CIP 5 KW 26 26 26,5 5,88x105

ATCC 29212 LZD 30 KW 29 29,5 31

VA 30 KW 20 20 20

E. faecium CIP 5 KW 20 21 21,5 0,53x105

ATCC 6057 LZD30 KW 31 30 30

VA 30 KW 27 24 25

P. aeruginosa CIP 5 KW 37 39,5 36 1,76x106

ATCC 27853 AK 30 KW 30 29 28,5

P. aeruginosa CIP 5 KW 41 41 38 6,7x105

ATCC 9027 AK 30 KW 29 28,5 30

P. aeruginosa CIP 5 KW Kol. 41 40 2,7x105

ATCC 15442 AK 30 KW Kol. 31 30

P. aeruginosa CIP 5 KW KW 40 40 8,8x105

mukoidbildend AK 30 KW KW 29 26

E. coli CIP 5 KW 39 37 28 2,36x106

NCTC 10538 CN 200 KW 34 32 33,5

E. coli CIP 5 KW 36 35,5 34 2,28x106

ATCC 11229 CN 200 KW 33 32 31

Auf CSA ergibt sich dagegen fast ausschließlich Indifferenz. Ausnahmen sind der

mukoidbildende P. aeruginosa (bei allen AB Additivität/Synergismus) und P.

aeruginosa ATCC 9027 (bei AK 30 Additivität/Synergismus) (Tab.6).

42

Tab. 6: HHD-Ergebnisse der Chlorhexidin/AB-Kombinationen mit CSA

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW 30 30 29 1,05x106

LZD 30 KW 32,5 31 30,5

MUP 5 KW 31 31 30

VA 30 KW 20 19,5 20

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW 34,5 34 34,5 8,3x105

LZD 30 KW 36 35 38

MUP 5 KW 36 34 36

VA 30 KW 22 21 22


CN 200 KW 30 31 30,5

LZD 30 KW 37 37 40

MUP 5 KW 33 33 34

VA 30 KW 23 22 22


CIP 5 KW 28,5 27 27 6,0x104

LZD 30 KW 27 27 27

VA 30 KW 19,5 19 19


CIP 5 KW 21 21,5 21,5 1,4x104

LZD30 KW 29 29 30

VA 30 KW 23,5 22 24


CIP 5 KW 30 30 33,5 9,2x105

AK 30 KW 24 23 24


CIP 5 KW 36 34,5 36 2,25x106

AK 30 KW 27 25 21


CIP 5 KW 33,5 30 33 2,11x106

AK 30 Kol. 21 21,5 21


CIP 5 KW 42 38,5 35,5 1,3x105

AK 30 KW 22 21 11

E. coli NCTC 10538

CIP 5 KW 39,5 37,5 42,5 5,84x106

CN 200 KW 26 25 27,5

E. coli ATCC 11229

CIP 5 KW 36,5 34,5 39 1,9x106

CN 200 KW 26 26 25,5

Auf MH-Agar reagiert Chlorhexidin in Kombination mit den AB vorwiegend mit

Indifferenz. Bei S. aureus ATCC 6538 ergibt sich mit allen AB, bei P. aeruginosa

ATCC 9027 mit AK 30 und beim mukoidbildenden P. aeruginosa mit CIP 5

Additivität/Synergismus. Antagonistische Interaktion zeigt P. aeruginosa ATCC

27853 unter Verwendung von AK 30 (Tab. 7).

43

Tab. 7: HHD-Ergebnisse der Chlorhexidin/AB-Kombinationen mit MH

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW 36 32,5 33 9,0x105

LZD 30 KW 39,5 35 37

MUP 5 KW 34 34 34

VA 30 KW 22 20,5 21,5

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW Kol. 39 39 2,8x105

LZD 30 KW KW 40,5 41

MUP 5 KW KW 41 42

VA 30 KW 30 25 24

MRSA norddt. CIP 5 KW 31 30 29,5 4,3x105

CN 200 KW 34 34 34,5

LZD 30 KW 40 41 41

MUP 5 KW 40 36,5 38,5

VA 30 KW 28,5 26,5 26


CIP 5 KW 30 28 28 5,88x105

LZD 30 KW 31 30 31

VA 30 KW 20 20 20


CIP 5 KW 24 26 25 0,53x105

LZD30 KW 33 32,5 31

VA 30 KW 26 26 25,5


CIP 5 KW 38 38 40 9,2x105

AK 30 KW 25 25 29


CIP 5 KW 43 41,5 41 2,25x106

AK 30 KW 30 27 26


CIP 5 KW 37 36,5 37,5 2,11x106

AK 30 KW 30 27 27,5


CIP 5 KW Kol. 42,5 45 1,3x105

AK 30 KW 18 20 19

E. coli NCTC 10538

CIP 5 KW 42,5 42,5 44 5,84x106

CN 200 KW 34 34,5 33,5

E. coli ATCC 11229

CIP 5 KW 40 40 40 1,9x106

CN 200 KW 31 31 32

Auf Blutagar zeigt sich ein anderes Verhalten. Alle Staphylokokken-Stämme wie

auch E. faecalis und P. aeruginosa ATCC 15442 weisen Additivität/Synergismus

zwischen CIP 5 und CHX auf. S. aureus ATCC 29213 zeigt darüber hinaus auch bei

allen anderen AB/AS-Kombinationen additives/synergistisches Interaktionsverhalten.

Der norddt. MRSA und E. faecium weisen bei LZD 30 ebenfalls

Additivität/Synergismus auf. Gegenüber VA 30 zeigt sich nur der MRSA-Stamm

additiv/synergistisch (Tab.8).

44

Tab. 8: HHD-Ergebnisse der Chlorhexidin/AB-Kombinationen mit Blut

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW 36 34 32 6,5x105

LZD 30 KW 37 34 32

MUP 5 KW 35 30 30

VA 30 KW 24 22 20

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW 40 37 32 1,0x106

LZD 30 KW 37 37 34

MUP 5 KW 36 35 35

VA 30 KW 24 23 22


CN 200 KW 37 34 34

LZD 30 KW 43 40 36

MUP 5 KW 36 36 33

VA 30 KW 28 26 24


CIP 5 KW 28 27 24 7,4x105

LZD 30 KW 30 27 31

VA 30 KW 20 20 20


CIP 5 KW 20 22 22 4,13x105

LZD 30 KW 32 31 28

VA 30 KW 24 24 21


CIP 5 KW 32 32 32 1,94x106

AK 30 KW 28 29 30


CIP 5 KW 38 38 38 2,54x106

AK 30 KW 26 28 28


CIP 5 KW 40 38 35 3,37x106

AK 30 KW 30 28 30


CIP 5 Kol. 43 44 46 1,4x106

AK 30 KW 22 22 22

E. coli NCTC 10538

CIP 5 KW 39 36 36 2,15x106

CN 200 KW 36 36 38

E. coli ATCC 11229

CIP 5 KW 34 36 37 2,43x106

CN 200 KW 30 30 30

Auf Isosensitest-Agar zeigt sich unter Verwendung von Octenidin ein ähnliches

Verhalten wie unter Verwendung von Chlorhexidin (vgl. Tab.5). S. aureus weist mit

allen AB außer VA 30 Additivität/Synergismus auf. Der norddt. MRSA und E. coli

NCTC 10538 reagieren bei CIP 5 und CN 200, der mukoidbildende P. aeruginosa

nur bei CIP 5 additiv/synergistisch. Antagonistische Interaktion weisen P. aeruginosa

ATCC 15442 und E. coli ATCC 11229 beim AB CIP 5 auf (Tab. 9).

45

Tab. 9: HHD-Ergebnisse der Octenidin/AB-Kombinationen mit Isosensitest

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW 32 30 30 8,8x105

LZD 30 KW 34 33 32

MUP 5 KW 30 31 30

VA 30 KW 22 21 22

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW Kol. 33 34 1,26x106

LZD 30 KW 40 37 34

MUP 5 KW 38 35 32

VA 30 KW 23 22 22

MRSA norddt. CIP 5 KW Kol. 25 24 1,79x106

CN 200 KW Kol. 41 38

LZD 30 KW 35 34 34

MUP 5 KW 33 30 30

VA 30 KW 24 25 24


CIP 5 KW 24 25 26 5,9x105

LZD 30 KW 30 28 30

VA 30 KW 20 19 20


CIP 5 KW 21 23 24 1,8x105

LZD 30 KW 31 30 30

VA 30 KW 25 24 24


CIP 5 30 31 31 34 1,35x106

AK 30 32 29 28 28


CIP 5 25 27 29 37 2,59x106

AK 30 30 30 29 30


CIP 5 21 28 30 33 3,58x106

AK 30 30 30 28 30


CIP 5 KW Kol. 33 35 1,49x106

AK 30 KW 24 24 23

E. coli NCTC 10538

CIP 5 Kol. 40 39 34 2,24x106

CN 200 Kol. 34 34 30

E. coli ATCC 11229

CIP 5 KW 32 34 36 3,61x106

CN 200 KW 31 32 30

Im Vergleich zu Chlorhexidin (Tab. 6) zeigt Octenidin auf CS-Agar deutlich mehr

additiv/synergistische bzw. antagonistische Interaktionen. Alle Staphylokokken-

Stämme weisen mit dem Antibiotikum MUP 5 Additivität/Synergismus auf. S. aureus

ATCC 6538 zeigt zusätzlich mit allen weiteren an ihm getesteten AB

additives/synergistisches Verhalten, S. aureus ATCC 29213 dagegen nur mit CIP 5,

der norddt. MRSA nur mit MUP 5 und E. faecalis mit CIP 5. Die gramnegativen

Erreger weisen dagegen eher antagonistisches Verhalten auf. Alle Pseudomonaden-

Stämme zeigen bei CIP 5 Antagonismus, die E. coli-Stämme Indifferenz.

46

Additivität/Synergismus zeigt sich nur beim mukoidbildenden P. aeruginosa mit AK

30 (Tab.10).

Tab. 10: HHD-Ergebnisse der Octenidin/AB-Kombinationen mit CSA

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW Kol. 30 30 9,0x105

LZD 30 KW kW 37 34

MUP 5 KW 37 36 35,5

VA 30 KW 21,5 22 20,5

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW kW 30,5 37 2,8x105

LZD 30 KW Kol. Kol. 36

MUP 5 KW Kol. Kol. 37,5

VA 30 KW Kol. Kol. 22


CN 200 KW 33 32 33

LZD 30 KW Kol. 39 40

MUP 5 KW Kol. 35 34,5

VA 30 KW 26 25 23


CIP 5 KW 33 30 27 5,88x105

LZD 30 KW 32 31 30

VA 30 KW 20 20 20


CIP 5 KW 19 20 22 0,53x105

LZD 30 KW 31 30 29

VA 30 KW 23 22 21


CIP 5 25,5 25,5 27,5 33,5 9,2x105

AK 30 26 25 24 24


CIP 5 24 24,5 26 36 2,25x106

AK 30 20 21,5 22 21


CIP 5 22 21,5 23,5 33 2,11x106

AK 30 20 22 20 21


CIP 5 Kol. 29 28 35,5 1,3x105

AK 30 Kol. Kol. 12 11

E. coli NCTC 10538

CIP 5 42 39 37 42,5 5,84x106

CN 200 30 28 28 27,5

E. coli ATCC 11229

CIP 5 40,5 36,5 36 39 1,9x106

CN 200 30 28,5 25 25,5

Auf MH-Agar dominiert unter Verwendung von Octenidin Indifferenz. Damit ähnelt

das Verhalten dem von Chlorhexidin auf MH (vgl. Tab. 7). Additivität/Synergismus

ergibt sich bei S. aureus ATCC 29213 und 6538 mit LZD 30, zusätzlich weist S.

aureus ATCC 29213 auch bei CIP 5 und MUP 5 Additivität/Synergismus auf.

Antagonistisch wirken die AB/AS-Kombinationen CIP 5/Octenidin bei allen

47

Pseudomonaden-Stämmen mit Ausnahme von P. aeruginosa ATCC 27853

(Indifferenz) (Tab.11).

Tab. 11: HHD-Ergebnisse der Octenidin/AB-Kombinationen mit MH

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW 34 31 30 8,8x105

LZD 30 KW Kol. 32 32

MUP 5 KW Kol. 31 31,5

VA 30 KW 20 21 21

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW 39 35 38 1,26x106

LZD 30 KW 39 37 35

MUP 5 KW 38 38 36

VA 30 KW 24 23 23


CN 200 KW 32 31 30

LZD 30 KW 37 34 36

MUP 5 KW 35 32 33

VA 30 KW 26 25 25,5


CIP 5 KW 27 28 24 5,9x105

LZD 30 KW 29 30 28,5

VA 30 KW 20 20 20,5


CIP 5 KW 20 20 20 1,8x105

LZD 30 KW 30 30 29

VA 30 KW 24 24 24


CIP 5 32,5 33,5 34,5 36 2,16x106

AK 30 30 27,5 27,5 27


CIP 5 KW 28 30 36,5 2,41x106

AK 30 Kol. 28,5 26 29,5


CIP 5 Kol. 30 30 35,5 1,64x106

AK 30 Kol. 26 28 28


CIP 5 Kol. 35 40,5 45,5 2,33x106

AK 30 23,5 21,5 20,5 18,5

E. coli NCTC 10538

CIP 5 Kol. 41,5 41,5 39,5 2,38x106

CN 200 Kol. 30 29,5 28,5

E. coli ATCC 11229

CIP 5 Kol. 36,5 35,5 37 4,48x106

CN 200 Kol. 28 27,5 30

Auf Blut-Agar zeigt sich ein ähnliches Bild (vgl. Tab. 11). Bei S. aureus ATCC 29213

ergibt sich mit LZD 30 und MUP 5, bei S. aureus ATCC 6538 mit CIP 5 und LZD 30

Additivität/Synergismus. Der norddt. MRSA zeigt dieses Verhalten nur mit LZD 30.

Antagonismus lässt sich erneut mit CIP 5 bei den Pseudomonaden-Stämmen mit

Ausnahme von P. aeruginosa ATCC 27853 nachweisen (Tab. 12).

48

Tab. 12: HHD-Ergebnisse der Octenidin/AB-Kombinationen mit Blut

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW 35 32 32 6,5x105

LZD 30 KW 38 34 32

MUP 5 KW 34 30 30

VA 30 KW 22 20 22

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW 41 36 32 1,0x106

LZD 30 KW 47 36 34

MUP 5 KW 37 36 35

VA 30 KW 24 22 22


CN 200 KW 36 35 34

LZD 30 KW 40 38 36

MUP 5 KW 35 35 33

VA 30 KW 25 25 24


CIP 5 26 26 25 24 7,4x105

LZD 30 30 30 29 31

VA 30 20 20 19 20


CIP 5 17 22 22 22 4,13x105

LZD 30 30 29 28 28

VA 30 25 24 24 21


CIP 5 27 30 30 32 1,94x106

AK 30 32 28 29 30


CIP 5 28 34 34 38 2,54x106

AK 30 28 28 27 28


CIP 5 28 30 32 35 3,37x106

AK 30 29 28 28 30


CIP 5 30 40 42 46 1,4x106

AK 30 28 20 20 22

E. coli NCTC 10538

CIP 5 39 37 36 36 2,15x106

CN 200 30 30 30 30

E. coli ATCC 11229

CIP 5 34 34 36 37 2,43x106

CN 200 30 30 30 29

Unter Verwendung von Polihexanid zeigt sich auf Isosensitest-Agar fast

ausschließlich indifferentes Verhalten. Ausnahmen sind P. aeruginosa ATCC 9027

mit CIP 5 (Antagonismus) und E. coli NCTC 10538 mit CIP 5 und CN 200

(Additivität/Synergismus) (Tab13).

49

Tab. 13: HHD-Ergebnisse der Polihexanid/AB-Kombinationen mit Isosensitest

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 34 30,5 31 30 8,8x105

LZD 30 36,5 33,5 32,5 32,5

MUP 5 34,5 31 30,5 30,5

VA 30 24,5 22 22 22

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 Kol. 35 34 33,5 1,26x106

LZD 30 Kol. 37 35,5 34,5

MUP 5 Kol. 36 33,5 33

VA 30 31 24,5 22,5 22

MRSA norddt. CIP 5 KW 28 26,5 24,5 1,79x106

CN 200 KW 42 41,5 39

LZD 30 KW 36 36 34

MUP 5 KW 31,5 30 30

VA 30 KW 26 26 25,5


CIP 5 KW 25,5 25,5 25,5 5,9x105

LZD 30 KW 30,5 30 30

VA 30 KW 21 20 20


CIP 5 KW 22 24 24 1,8x105

LZD 30 KW 29,5 31 29,5

VA 30 KW 25,5 25 24,5


CIP 5 Kol. 31,5 30,5 34 1,35x106

AK 30 Kol. 26 26,5 28


CIP 5 Kol. 30,5 34 37 2,59x106

AK 30 Kol. 24,5 27 28


CIP 5 34 34 36 33 3,58x106

AK 30 Kol. 41 40 38


CIP 5 Kol. 35 38 35 1,49x106

AK 30 Kol. 24,5 24,5 23

E. coli NCTC 10538

CIP 5 KW 40 39,5 34 2,24x106

CN 200 KW 35,5 34 30

E. coli ATCC 11229

CIP 5 KW 36 34 36 3,61x106

CN 200 KW 30,5 30 30

Auch auf CSA zeigt Polihexanid kein besonders ausgeprägtes Interaktionsverhalten.

Mit Ausnahme von P. aeruginosa ATCC 27853 bei AK 30 (Antagonismus) und dem

mukoidbildenden P. aeruginosa bei CIP 5 und AK 30 (Additivität/Synergismus)

zeigen alle weiteren Erreger durchweg indifferentes Verhalten (Tab. 14).

50

Tab. 14: HHD-Ergebnisse der Polihexanid/AB-Kombinationen mit CSA

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 30 30 30 29 1,05x106

LZD 30 31 31 30 30,5

MUP 5 31 31 30 30

VA 30 20 20 20 20

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 35 34,5 33,5 34,5 8,3x105

LZD 30 39 38 34 38

MUP 5 39 36 34 36

VA 30 24 22 20 22

MRSA norddt. CIP 5 30 28,5 28 28 7,9x105

CN 200 31,5 30,5 30 30,5

LZD 30 40 37 36 40

MUP 5 36 34 34 34

VA 30 24 23 22 23


CIP 5 29 27,5 27,5 27 6,0x104

LZD 30 30 28,5 27,5 27

VA 30 20 20 20 19


CIP 5 22,5 21 21 21,5 1,4x104

LZD 30 28 29 28 30

VA 30 22 22 22 24


CIP 5 35 34 32,5 33,5 9,2x105

AK 30 16 20 20,5 24


CIP 5 34 35,5 35 36 2,25x106

AK 30 15,5 20 19,5 21


CIP 5 39,5 36 32 33 2,11x106

AK 30 13,5 18 20 21


CIP 5 Kol. 41 41 35,5 1,3x105

AK 30 16 16 15 11

E. coli NCTC 10538

CIP 5 40 39 39 42,5 5,84x106

CN 200 27,5 29 28,5 27,5

E. coli ATCC 11229

CIP 5 KW 35,5 37,5 39 1,9x106

CN 200 KW 27 27,5 25,5

Auf MH-Agar lassen sich zwischen Polihexanid und den AB alle drei Interaktionen

nachweisen. S. aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853 und E. coli ATCC

11229 zeigen mit allen AB Indifferenz. Mit CIP 5 zeigen die vier folgenden Erreger

Additivität/Synergismus: E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa mukoidbildend, E. coli

NCTC 10538. Der norddt. MRSA weist mit CN 200, S. aureus ATCC 6538 mit LZD

30 additives/synergistisches Verhalten auf. Antagonismus zeigt sich mit dem

Antibiotikum AK 30 bei den zwei Pseudomonaden-Stämmen ATCC 9027 und 15442

(Tab.15).

51

Tab. 15: HHD-Ergebnisse der Polihexanid/AB-Kombinationen auf MH

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW 31 30,5 30 8,8x105

LZD 30 KW 31 31 32

MUP 5 KW 32 31 31,5

VA 30 KW 22 21,5 21

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW 36,5 34,5 36 1,26x106

LZD 30 KW 40 38,5 35

MUP 5 KW 38 38,5 36

VA 30 KW 24 24 23

MRSA norddt. CIP 5 32 29,5 29,5 27 1,79x106

CN 200 36 34 33 30

LZD 30 38 35,5 35,5 36

MUP 5 36 34 34 33

VA 30 26 25,5 25 25,5


CIP 5 29,5 28 28 24 5,9x105

LZD 30 32,5 28,5 28,5 28,5

VA 30 25,5 21,5 21 20,5


CIP 5 24,5 24,5 23,5 19,5 1,8x105

LZD 30 33 30,5 29,5 29

VA 30 29 26,5 25 24


CIP 5 38 39,5 38,5 36 2,16x106

AK 30 20 25 25 27


CIP 5 Kol. 37,5 36 36,5 2,41x106

AK 30 Kol. 25 26 30


CIP 5 KW 35 34 34 1,64x106

AK 30 KW 23 24 38


CIP 5 KW Kol. 47 45,5 2,33x106

AK 30 Kol. 18 18 18

E. coli NCTC 10538

CIP 5 49 45 41,5 39,5 2,38x106

CN 200 40 33 33 32,5

E. coli ATCC 11229

CIP 5 50 39 39 37 4,48x106

CN 200 40 31 30 30

Unter Verwendung von Blut-Agar weist Polihexanid vorwiegend Indifferenz auf.

Ausnahmen bilden die zwei S. aureus-Stämme ATCC 29213 und 6538 sowie E.

faecium, die mit LZD 30 additiv/synergistisch wirken, sowie die antagonistisch

wirkenden Erreger E. coli NCTC 10538 mit CN 200, P. aeruginosa ATCC 15442 mit

AK 30 und der mukoidbildende P. aeruginosa mit CIP 5 (Tab.16).

52

Tab. 16: HHD-Ergebnisse der Polihexanid/AB-Kombinationen auf Blut

AB MHK 1/8


KBE [1/ml]


CIP 5 KW 33 30 32 6,5x105

LZD 30 KW 36 33 32

MUP 5 KW 30 30 31,5

VA 30 KW 20 20 21

S. aureus ATCC 6538

CIP 5 KW 32 32 32 1,0x106

LZD 30 KW 49 38 35

MUP 5 KW 33 32 36

VA 30 KW 22 22 23

MRSA norddt. CIP 5 32 30 30 30 1,61x106

CN 200 36 35 34 34

LZD 30 42 39 38 36

MUP 5 35 32 33 33

VA 30 28 26 24 24


CIP 5 29,5 26 26 24 7,4x105

LZD 30 34 29 30 31

VA 30 22 20 20 20


CIP 5 24,5 25 24 22 4,13x105

LZD 30 KW 35 30 28

VA 30 KW 23 22 21


CIP 5 KW 32 32 32 1,94x106

AK 30 KW 27 28 30


CIP 5 33 38 38 38 2,54x106

AK 30 24 25 26 28


CIP 5 34 32 34 35 3,37x106

AK 30 27 26 26 30


CIP 5 37 38 40 46 1,4x106

AK 30 20 22 22 22

E. coli NCTC 10538

CIP 5 KW 36 36 36 2,15x106

CN 200 KW 34 37 38

E. coli ATCC 11229

CIP 5 40 40 40 37 2,43x106

CN 200 30 30 30 30

Tabellarische Darstellung der ausgewerteten Ergebnisse

In den Tabellen 17-19 sind die additiv/synergistischen gegen die antagonistischen

AB/AS-Kombinationen aufgelistet. Dabei bezieht sich jede einzelne Tabelle auf eines

der drei getesteten Antiseptika:

Tabelle 17 auf Chlorhexidin,

Tabelle 18 auf Octenidin und

Tabelle 19 auf Polihexanid.

Innerhalb der Spalte Additivität/Synergismus sind 2 Gruppen zu unterscheiden:

Gruppe 1 mit der Bedingung d1/8 MHK > dK + 4 mm und Gruppe 2 mit der Bedingung

53

d1/8 MH > dK + 4 mm mit d1/8MHK = kein Wachstum (KW) oder einzelne Kolonien (Kol.).

Beide Gruppen erfüllen mit ihren HHD-Werten die Bedingungen für Signifikanz,

unterscheiden sich aber in ihrer Wirkstärke. Die AB/AS-Kombinationen aus Gruppe 2

sind als stärker additiv/synergistisch wirksam zu bewerten, da die Agarplatten unter

Einwirkung der AS-Konzentrationen K(AS) = 1/8 x MHK im Vergleich zu den AB/AS-

Kombinationen aus Gruppe 1 keinen eindeutigen Hemmhof mehr aufweisen,

sondern nur noch vereinzelte Kolonien oder überhaupt kein Erreger-Wachstum.

Unter Verwendung des AS Chlorhexidin ergeben sich 29 additiv/synergistische und

eine antagonistische AB/AS-Interaktionen. Von den 29 additiv/synergistischen

Interaktionen treten 12 in Kombination mit dem AB CIP 5 auf. Positiv zu bewerten ist

zusätzlich, dass davon 5 CHX/CIP 5-Interaktionen sogar so stark sind, dass bereits

bei Verwendung der AS-Konzentrationen K(AS) = 1/8 x MHK nur noch vereinzelte

Kolonien wachsen oder gar kein Wachstum mehr stattfindet. Additivität/Synergismus

in der Kombination mit LZD 30 tritt 5mal auf, jedoch nur unter Testung der gram-

positiven Erreger. Auch MUP 5 (3x) und VA 30 (4x) rufen mit CHX nur bei den gram-

positiven Erregern additiv/synergistisches Verhalten hervor. Die AB/AS-Kombination

AK 30/CHX wirkt bei den Pseudomonaden gehäuft positiv (5x). Antagonistische

Interaktion lässt sich nur einmal in der Kombination AK 30/CHX nachweisen (Tab.

17).

54

Tab. 17: Additiv/synergistische und antagonistische Effekte von CHX mit AB

ADDITIVITÄT/SYNERGISMUS ANTAGONISMUS

d1/8 MHK > dK + 4 mm d1/8 MHK < dK – 4 mm

CIP 5 CSA P. aeruginosa mukoidbildend

AK 30 MH P. aeruginosa ATCC 27853

CIP 5 Blut S. aureus ATCC 29213


CIP 5 Blut MRSA norddt.

CIP 5 Blut E. faecalis ATCC 29212

CIP 5 Blut


CIP 5 Isosensitest E. coli NCTC 10538

LZD 30 Blut S. aureus ATCC 29213

LZD 30 Blut MRSA norddt.

LZD 30 Blut E. faecium ATCC 6057

MUP 5 Blut S. aureus ATCC 29213


AK 30 CSA P. aeruginosa ATCC 9027

AK 30 CSA P. aeruginosa mukoidbildend

VA 30 MH S. aureus ATCC 6538

VA 30 Blut S. aureus ATCC 29213

VA 30 Blut MRSA norddt.

d1/8 MHK > dK + 4 mm mit d1/8 MHK = kein Wachstum (KW) oder

einzelne Kolonien (Kol.)

CIP 5 Isosensitest S. aureus ATCC 6538

CIP 5 Isosensitest P. aeruginosa ATCC 15442

CIP 5 Isosensitest P. aeruginosa mukoidbildend

CIP 5 MH S. aureus ATCC 6538

CIP 5 MH P. aeruginosa mukoidbildend

LZD 30 Isosensitest S. aureus ATCC 6538

LZD 30 MH S. aureus ATCC 6538

MUP 5 Isosensitest S. aureus ATCC 6538

MUP 5 MH S. aureus

55

ATCC 6538

VA 30 Isosensitest S. aureus ATCC 6538

AK 30 Isosensitest P. aeruginosa ATCC 15442

AK 30 Isosensitest P. aeruginosa mukoidbildend

Octenidin zeigt mit den verschiedenen AB in 23 Fällen Additivität/Synergismus und in

12 Fällen Antagonismus. Alle 12 antagonistisch wirkenden Kombinationen werden

unter Verwendung von Octenidin und CIP 5 hervorgerufen und zeigen sich nur bei

den gramnegativ getesteten Erregern der Pseudomonaden und E. coli.

Additiv/synergistisch wirkt Octenidin mit CIP 5 9mal, mit LZD 30 7mal, mit MUP 5

4mal, mit CN 200 zweimal und mit AK 30 einmal. Bis auf 2 Ausnahmen (P.

aeruginosa mukoidbildend; E.coli NCTC 10538) sind diese Interaktionen nur bei den

gram-positiven Erregern zu finden (Tab. 18).

56

Tab. 18: Additiv/synergistische und antagonistische Effekte von Octenidin mit AB


d1/8 MHK > dK + 4 mm d1/8 MHK < dK - 4 mm






CIP 5 Isosensitest E. coli ATCC 11229

CIP 5 CSA E. faecalis ATCC 28212

CIP 5 MH P. aeruginosa ATCC 9027



LZD 30 Isosensitest S. aureus ATCC 6538

CIP 5 CSA P. aeruginosa ATCC 27853





LZD 30 Blut MRSA norddt. CIP 5 CSA P. aeruginosa mukoidbildend

MUP 5 Isosensitest S. aureus ATCC 6538

CIP 5 Blut P. aeruginosa ATCC 9027

MUP 5 Blut S. aureus ATCC 29213

CIP 5 Blut P. aeruginosa ATCC 15442

CN 200 Isosensitest E. coli NCTC 10538

CIP 5 Blut P. aeruginosa mukoidbildend

d1/8 MHK > dK + 4 mm mit d1/8 MHK = kein Wachstum (KW) oder


CIP 5 Isosensitest MRSA norddt.

CIP 5 Isosensitest S. aureus ATCC 6538

CIP 5 Isosensitest P. aeruginosa mukoidbildend

CIP 5 CSA S. aureus ATCC 29213


LZD 30 CSA S. aureus ATCC 29213

LZD 30 CSA MRSA norddt.

MUP 5 MH S. aureus ATCC 29213

MUP 5 CSA MRSA norddt.


CN 200 Isosensitest MRSA norddt.

PHMB interagiert 20mal signifikant, davon 13mal additiv/synergistisch und 7mal

antagonistisch. Auch hier lassen sich bezüglich der Interaktion

57

Additivität/Synergismus Parallelen zu den Ergebnissen aus den Tabellen 17 und 18

ziehen: die AB/AS-Kombinationen CIP 5/PHMB (6x) und LZD 30/PHMB (4x)

interagieren am häufigsten. Mit CN 200 lässt sich zweimal und mit AK 30 einmal

Additivität/Synergismus nachweisen. Antagonismus tritt vorwiegend mit dem AB AK

30 (4x) auf, und zwar nur bei den Pseudomonaden (Tab. 19).

Tab. 19: Additiv/synergistische und antagonistische Effekte von PHMB mit AB


d1/8 MHK > dK + 4 mm d1/8 MHK < dK - 4 mm



CIP 5 MH E. faecalis ATCC 29212

CIP 5 Blut P. aeruginosa mukoidbildend

CIP 5 MH E. faecium ATCC 6057


CIP 5 MH E. coli NCTC 10538


CIP 5 CSA P. aeruginosa mukoidbildend

AK 30 CSA P. aeruginosa ATCC 27853


AK 30 Blut P. aeruginosa ATCC 15442


CN 200 Blut E. coli NCTC 10538


LZD 30 Blut E. faecium ATCC 6057


CN 200 Isosensitest E. coli NCTC 10538

CN 200 MH MRSA norddt.

d1/8 MHK > dK + 4 mm mit d1/8 MHK = kein Wachstum (kW) oder



58

3 Diskussion der Ergebnisse

Anhand des Agardiffussions-Dilutions-Kombitests wurden insgesamt 372

Kombinationen aus AB und AS auf verschiedenen Agarsorten und Erregern auf

Interaktionsverhalten geprüft. 85 Kombinationen können eindeutig den Interaktionen

Additivität/Synergismus oder Antagonismus zugeordnet werden. Sie zeigen unter

Berücksichtigung des Standardfehlers wesentlich steigendes oder fallendes

Verhalten im HHD bei wachsendem K(AS). Die verbleibenden 287 Kombinationen

zeigen dagegen kein eindeutiges Verhalten im HHD auf, d.h. sie können weder als

additiv/synergistisch noch als antagonistisch bewertet werden. Damit sind sie der

Gruppe Indifferenz zuzuordnen. Somit können in knapp 25 % der getesteten

Kombinationen AB/AS-Interaktionen nachgewiesen werden. Anzumerken ist hierbei,

dass der Anteil an eindeutigen Kombinationen von der Größe des Fehlerintervalls

abhängt. Um die als eindeutig additiv/synergistisch bzw. antagonistisch gewerteten

AB/AS-Kombinationen hinsichtlich des zum ersten Mal verwendeten Kombitests so

realistisch wie möglich einschätzen zu können, wurde das Fehlerintervall bewusst

nicht kleiner gewählt.

In den Tabellen 20-25 sind die 85 AB/AS-Kombinationen nach Erregergruppen

geordnet zusammengefasst. Die 11 eingesetzten Erreger entstammen folgenden

Bakterienspecies:

Staphylokokken: S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 6538 und MRSA

Enterokokken: E. faecalis ATCC 29212 und E. faecium ATCC 6057

Pseudomonaden: P. aeruginosa ATCC 15442, P. aeruginosa ATCC 9027,

P. aeruginosa ATCC 27853 und mukoidbildender P. aeruginosa

E. coli: E. coli ATCC 11229 und E. coli NCTC 10538.

In den Tabellen 20 und 21 wird antagonistisches, in den Tabellen 22 bis 25

additiv/synergistisches Wirkverhalten dargestellt. Unter allen gegen einen

Bakterienstamm getesteten Kombinationen (AB/AS/Agar) sind die Kombinationen,

die eine Interaktion hervorrufen, grau unterlegt. Zusätzlich vermerkte Zahlen in den

grauen Feldern geben an, auf wie viele Erreger einer Bakterienspecies die jeweilige

Kombination interaktiv wirkt.

Die Gruppe der Pseudomonaden zählt 4 Erreger und wurde auf die AB CIP 5 und AK

30 getestet (Tab. 20). Bei 4 verschiedenen Erregern kann durch eine AB/AS-

59

Kombination (unter Verwendung desselben Agars) maximal 4mal antagonistisches

Wirkverhalten hervorgerufen werden ( Zahl in den grauen Feldern: 1- 4).

Tab. 20: Häufigkeit antagonistischer Interaktionen zwischen CIP 5, AK 30 und den 3

AS gegenüber Pseudomonaden

CIP 5 AK 30

C1) O2) P3) C1) O2) P3)

Isosensitest 2 1

MH 2 1 2

CSA 4 1

Blut 3 1 1

1)Chlorhexidin, 2)Octenidin, 3)Polihexanid

Von 96 Kombinationen [AS: 3, AB: 2, Agar: 4, Erreger: 4 3 x 2 x 4 x 4 = 96]

ergaben 18 Antagonismus, d.h. in nur etwas mehr als einem Fünftel der Fälle

behindern sich AB und AS in ihrer Wirkung auf die Pseudomonaden. Es ist

vorteilhaft, dass CIP 5 und AK 30 in Kombination mit Chlorhexidin auf keiner der vier

Agarsorten antagonistisch interagieren (einzige Ausnahme: AK 30/ Chlorhexidin auf

MH). Mit Octenidin reagiert AK 30 in keinem Fall subadditiv. Dagegen behindern sich

CIP 5 und Octenidin in ihrer Wirkung auf Pseudomonaden in 11 von 16 möglichen

Fällen, darunter auch bei 3 von 4 Erregern auf Blut-Agar. In Hinblick auf die

Behandlung chronischer Wunden sollte deshalb von der Kombination CIP

5/Octenidin Abstand genommen werden. Auch die Kombination AK 30/Polihexanid

ist mit Skepsis zu betrachten (Tab. 20). In Tabelle 21 ist die Häufigkeit der

antagonistischen Interaktionen auf die Gruppe der E. coli-Erreger aufgelistet.

Getestet wurde an ihnen das Zusammenwirken der drei AS mit AB CIP 5 und CN

200.

60

Tab. 21: Häufigkeit antagonistischer Interaktionen zwischen CIP 5, CN 200 und den

3 AS gegenüber E. coli

CIP 5 CN 200

C1) O2) P3) C1) O2) P3)

Isosensitest 1

MH

CSA

Blut 1


Nur 2 der insgesamt 48 getesteten Kombinationen weisen antagonistisches

Verhalten auf. CIP 5 und Octenidin wirken unter Verwendung von Isosensitest-Agar

subadditiv, CN 200 und Polihexanid behindern sich auf Blut-Agar in ihrer

bakteriostatischen und mikrobioziden Wirkung. Es ist jedoch zu beachten, dass diese

Kombinationen nur gegen zwei Erreger getestet wurden (Tab. 21). In Tabelle 22

werden im Unterschied zu Tabelle 20 die additiven/synergistischen Interaktionen auf

Pseudomonaden beschrieben.

Tab. 22: Häufigkeit additiver/synergistischer Interaktionen zwischen CIP 5, AK 30

und den 3 AS gegenüber Pseudomonaden

CIP 5 AK 30

C1) O2) P3) C1) O2) P3)

Isosensitest 2 1 2

MH 1 1 1

CSA 1 1 2 1 1

Blut 1


Von den 96 AB/AS-Kombinationen zeigen 15 additives/synergistisches Verhalten.

CIP 5 wirkt vor allem mit Chlorhexidin (über-)additiv auf Pseudomonaden. Der Agar

scheint nur geringfügig als beeinflussender Faktor zu wirken. Auch in Kombination

mit AK 30 erzielt Chlorhexidin die meisten (über-)additiven Wirkungen. Außerdem

sind einzelne additive/synergistische Interaktionen zwischen CIP 5 bzw. AK 30 und

Octenidin bzw. Polihexanid zu verzeichnen. Eher negativ zu beurteilen ist die

61

Tatsache, dass die verschiedenen AB/AS-Kombinationen auf Blut-Agar getestet nur

einmalig (Über-)Additivität hervorrufen (CIP 5 mit CHX) (Tab. 22).

Vergleicht man die additiv/synergistisch wirkenden AB/AS- Kombinationen aus

Tabelle 22 mit den antagonistisch wirkenden aus Tabelle 20, lässt sich Folgendes

ableiten: Die AB/AS-Kombination CIP 5/Octenidin bewirkt nur antagonistisches

Interaktionsverhalten (in 11 von 16 Fällen), die AB/AS-Kombination CIP

5/Chlorhexidin führt dagegen ausschließlich zu additiver/synergistischer Interaktion.

Im klinischen Alltag könnten diese Erkenntnisse relevant werden: Bisher werden

Polihexanid und Octenidin als Mittel der Wahl in der Behandlung von akuten und

chronischen Wunden eingesetzt [52], während Chlorhexidin als Goldstandard der

Plaquehemmung bekannt ist [54]. Bei durch Pseudomonaden verursachten

chronischen Wunden könnte CIP 5 in Verbindung mit Chlorhexidin als vielleicht

bessere Therapieoption in Erwägung gezogen werden. AK 30 ruft in Kombination mit

Polihexanid eher antagonistisches Wirkverhalten hervor, in Kombination mit

Chlorhexidin dagegen eher additives/synergistisches. Aus diesem Vergleich lässt

sich somit die gleiche Schlussfolgerung hinsichtlich medizinischer

Therapiemöglichkeiten ziehen: auch AK 30/ Chlorhexidin könnte eine Option in der

Behandlung chronischer Wunden sein. In Tabelle 23 sind die

additiven/synergistischen Interaktionen hinsichtlich der Gruppe der E. coli

zusammengefasst.

Tab. 23: Häufigkeit additiver/synergistischer Interaktionen zwischen CIP 5, CN 200

und den 3 AS gegenüber E. coli

CIP 5 CN 200

C1) O2) P3) C1) O2) P3)

Isosensitest 1 1 1 1 1

MH 1

CSA

Blut


In 6 von 48 Kombinationen ließ sich eine unterstützende Wirkung nachweisen. CIP 5

wirkt mit jedem der 3 AS (über-)additiv auf Isosensitest-Agar und zwar in der Hälfte

der Fälle (3 von 6 möglichen Kombinationen). Auch CN 200 entwickelt in

62

Kombination mit Octenidin bzw. Polihexanid additives/synergistisches

Interaktionsverhalten. Auf Blut-Agar findet kein (über-) additiver Effekt statt (Tab. 23).

Vergleicht man auch hier die antagonistisch wirkenden AB/AS-Kombinationen aus

Tabelle 21 mit den additiv/synergistisch wirkenden aus Tabelle 23, wird deutlich,

dass 3mal so viele additive/synergistische Interaktionen stattfinden wie

antagonistische. Um eindeutigere Tendenzen über die AB/AS-Interaktionen gegen E.

coli feststellen zu können, sind Testungen mit weiteren E. coli-Stämmen

durchzuführen. In Tabelle 24 werden die additiven/synergistischen Interaktionen auf

Staphylokokken diskutiert. Die S. aureus-Stämme wurden gegen die AB CIP 5, LZD

30, VA 30 und MUP 5 getestet, der MRSA-Stamm zusätzlich auf CN 200.

Tab. 24 Häufigkeit additiver/synergistischer Interaktionen zwischen CIP 5, LZD 30,

VA 30, MUP 5, CN 200 und den 3 AS gegenüber Staphylokokken

CIP 5 LZD 30 MUP 5 VA 30 CN 200

C1) O2) P3) C1) O2) P3) C1) O2) P3) C1) O2) P3) C1) O2) P3)

Iso.4) 1 2 1 1 1 1 1 1

MH 1 2 1 1 1 1 1 1 1

CSA 1 2 1

Blut 3 1 2 3 2 1 1 2

1)Chlorhexidin, 2)Octenidin, 3)Polihexanid,4)Isosensitest

In 38 von insgesamt 156 Kombinationen zeigen AB und AS zusammen

unterstützendes Verhalten in ihrer Wirkung auf Staphylokokken, d.h. 25 % wirken

additiv/synergistisch. LZD 30 weist mit AS kombiniert 14mal (CIP 5 11x, MUP 5 7x

und VA 30 4x) Additivität/Synergismus auf. Dabei ist zu beobachten, dass die AB

CIP 5, LZD 30 und MUP 5 mit Octenidin zusammen bakteriostatischer/bakteriozider

wirken als allein angewendet. Darüber hinaus nimmt die Art des Agars bei diesen

AB/AS- Kombinationen keinen Einfluss darauf, ob (über-)additives Zusammenwirken

möglich ist oder nicht. Auch Chlorhexidin wirkt unterstützend auf die Wirkung von

CIP 5, LZD 30 oder MUP 5. Nur auf CSA-Agar wird diese Interaktion unterbunden.

Auffallend ist, dass Polihexanid im Vergleich zu den anderen AS nur zweimal mit

LZD 30 und einmalig mit CN 200 zusammen Additivität/Synergismus hervorruft. CN

200 wurde nur gegen MRSA getestet und weist daher auch weniger Kombinationen

auf. Positiv zu bewerten ist, dass die AB CIP 5, LZD 30, MUP 5 und VA 30 sowohl in

63

Kombination mit Chlorhexidin als auch in Kombination mit Octenidin (Ausnahme: VA

30 nur mit CHX) auf Blut-Agar zu additivem/synergistischem Verhalten führen. Von

insgesamt 38 Interaktionen entfallen 15 auf die Testung mit Blut-Agar. Damit könnten

die AB/AS-Kombinationen, die auf Blut-Agar zu (über-)additiven Interaktionen führen,

neue Optionen eröffnen (Tab. 24). In Tabelle 25 ist die Häufigkeit der

additiven/synergistischen Interaktionen gegenüber Enterokokken aufgelistet.

Tabelle 25 Häufigkeit additiver/synergistischer Interaktionen zwischen LZD 30, CIP

5, VA 30 und den 3 AS gegenüber Enterokokken

CIP 5 LZD 30 VA 30

C1) O2) P3) C1) O2) P3) C1) O2) P3)

Isosensitest

MH 2

CSA 1

Blut 1 1 1


Insgesamt wurden 72 AB/AS-Interaktionstestungen getestet. In nur 6 Fällen trat

additives/synergistisches Interaktionsverhalten zwischen AB und AS auf. VA 30 zeigt

keinerlei (über-)additives Verhalten in Verbindung mit AS (Tab. 25).

Vergleicht man die Enterokokken mit den Staphylokokken, ergibt sich folgendes: VA

30 erzielt in Kombination mit den AS bei Enterokokken keine und bei Staphylokokken

nur geringfügig additive/synergistische Interaktionen. Dagegen wirken LZD 30 und

CIP 5 in Kombination mit allen drei AS eindeutig besser bei den Staphylokokken. Vor

allem die auf Blut-Agar getesteten AB/AS-Kombinationen fallen dabei ins Gewicht.

Während bei den Staphylokokken 5 von 6 AB/AS-Kombinationen

Additivität/Synergismus aufweisen, sind es bei den Enterokokken nur 3.

Positiv ist zu bewerten, dass weder bei den Enterokokken noch bei den

Staphylokokken antagonistische Interaktionen zwischen AB und AS aufgetreten sind.

Unter medizinischen Gesichtspunkten gilt der Betrachtung der auf Blut-Agar erzielten

Interaktionen die größte Bedeutung, weil dieser Agar (durch Zugabe von

defibriniertem Schafsblut) in seinen Wachstumsbedingungen für Erreger am ehesten

der menschlichen Wunde gleich kommt. In chronischen Wunden können fast immer

Mischkulturen nachgewiesen werden, wobei es sich meist um die hier getesteten

Erreger handelt [7]. Die neuen AB-Resistenzentwicklungen und die mit AB schlecht

64

therapierbaren chronischen Wunden stellen Probleme in deren Therapie dar. Die

durch Bestimmung von Resistogrammen kalkulierte Antiinfektivatherapie ist eine

Option zur Minimierung dieser Problematik. Eine neue Option könnte der Einsatz

(über-) additiver AB/AS-Kombinationen sein. Die im Folgenden aufgeführten

Ergebnisse sollen abschließend noch einmal die Möglichkeiten hierfür aufzeigen. In

Tabelle 26 sind die Häufigkeiten der additiven/synergistischen und antagonistischen

AB/AS-Interaktionen bezüglich aller vier Erregergruppen auf Blut-Agar aufgelistet.

Die grau markierten Felder sind AB/AS-Kombinationen, die bei den jeweiligen

Erregern nicht getestet wurden. Die rot unterlegten Felder stehen für

antagonistisches, die grün unterlegten für additives/synergistisches

Interaktionsverhalten.

65

Tab. 26: Vergleich der Häufigkeiten additiver/synergistischer und antagonistischer

Interaktionen auf Blut-Agar

CIP 5

LZD 30

MUP 5 C1) O2) P3) C1) O2) P3) C1) O2) P3)

Staphylo- coccus

3 1 2 3 2 1 1

Entero- coccus

1 1 1

Pseudo-monas

1 3 1

E. coli

AK 30

VA 30

CN 200 C1) O2) P3) C1) O2) P3) C1) O2) P

3)

Staphylo- coccus

2

Entero- coccus

Pseudo-monas

1

E. coli

1


Von insgesamt 12 additiv/synergistisch wirkenden AB/AS-Kombinationen treten 8 bei

Staphylokokken und 3 bei Enterokokken auf. Bei den gramnegativen Erregern zeigt

sich nur einmal Additivität/Synergismus, und zwar bei den Pseudomonaden. Mit

Chlorhexidin kombiniert wirken vor allem VA 30, CIP 5 und LZD 30 gut, da sie bei

mindestens zwei der drei Staphylokokken-Referenzstämmen (Über-)Additivität

hervorrufen. Auch Octenidin und Polihexanid wirken in Kombination mit LZD 30 auf

zwei bis drei Erreger additiv/synergistisch. Die AB/AS-Kombinationen CIP

5/Chlorhexidin, LZD 30/Chlorhexidin und LZD 30/Polihexanid sind

additiv/synergistisch wirksam bei Enterokokken. Dass weder AK 30 noch CN 200 mit

AS zusammen (über-)additiv auf Staphylokokken wirken, ist ungünstig zu bewerten.

Bei Enterokokken, Pseudomonaden und E. coli zeigt sich ein ähnliches Bild, weder

VA 30 noch AK 30 oder CIP 5 zeigen unterstützendes Interaktionsverhalten. Positiv

fällt dagegen auf, dass auf Blut-Agar nur 4 AB/AS-Kombinationen antagonistisch

wirken. Am deutlichsten tritt dabei die AB/AS-Kombination CIP 5 /Octenidin hervor.

Bei 3 von 4 Pseudomonaden-Stämmen zeigt diese Kombination antagonistisches

66

Interaktionspotenzial (Tab. 26). Zusammenfassend lässt sich nun Folgendes

ableiten:

Positiv ist, dass AB/AS-Kombinationen auf Blut-Agar kaum antagonistisches

Interaktionspotenzial aufweisen. Diese Tendenz lässt vermuten, dass die

Behandlung chronischer Wunden mit AB und AS nicht zu verlangsamenden

Heilungsprozessen führt. Außerdem zeigt sich, dass bestimmte AB, wie CIP 5, LZD

30, MUP 5 und VA 30 in Kombination mit AS durchaus additiv und z. T. sogar

synergistisch gegen grampositive Erreger wirken (insbesondere gegen

Staphylokokken). Weitere Testungen könnten diese Tendenzen untermauern und

vielleicht dazu führen, dass bestimmte AB/AS-Kombinationen im klinischen Alltag

gezielt zum Einsatz kommen.

67

4 Zusammenfassung

Im Klinikalltag sind das Auftreten neuer Antibiotikaresistenzen und die steigende

Anzahl an chronisch infizierten Wunden ein Problem. Um dem zu begegnen, stehen

derzeit die Entwicklung neuer antimikrobieller Chemotherapeutika sowie die

kalkulierte, auf Antibiogrammen begründete Antibiotikatherapie im Fokus. Auch die

kombinierte Anwendung von systemisch wirksamen Antibiotika und lokal wirksamen

Antiseptika auf chronisch infizierten Wunden ist bereits gängige Praxis im

Klinikalltag. Untersuchungen, die Kombinationen aus Antibiotika und Antiseptika auf

Wechselwirkungen bzw. Interaktionspotenziale prüfen, sind trotz ihrer häufigen

Anwendung bisher aber kaum durchgeführt worden.

In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb das Interaktionsverhalten von AB/AS-

Kombinationen untersucht. Getestet wurden die Antibiotika Ciprofloxacin,

Gentamicin, Amikacin, Vancomycin, Mupirocin und Linezolid in Kombination mit den

Antiseptika Octenidindihydrochlorid, Chlorhexidindigluconat und Polihexanid. Die

Auswahl der Bakterien orientierte sich an den in chronisch infizierten Wunden häufig

nachzuweisenden Erregern Staphylokokken, Enterokokken, Pseudomonaden und E.

coli [17][15]. An Nährmedien kamen Isosensitest-, Müller-Hinton-, CSA- und Blut-

Agar zum Einsatz. Dem Blut-Agar wurde in Hinblick auf die Problematik im

Klinikalltag die größte Bedeutung bezüglich der Ergebnisinterpretation beigemessen.

In Vorversuchen wurden die für die in den Hauptversuchen notwendigen MHK’s der

Antiseptika mittels Mikroagardilutionsmethode bestimmt. In den Hauptversuchen

wurde mit Hilfe des Agardiffusions-Dilutions-Kombitests ermittelt, wie sich die

Hemmhofdurchmesser der AB/AS-Kombinationen im Vergleich zu denen der

Kontrollversuche (reiner Agardiffusionstest mit Antibiotika) verändern. Anhand des

Änderungsverhaltens im Hemmhofdurchmesser konnte entweder

„additives/synergistisches“, „antagonistisches“ oder „indifferentes“

Interaktionsverhalten nachgewiesen werden.

Aus insgesamt 372 getesteten Kombinationen (aus Antibiotika, Antiseptika, Erreger

und Agar) konnten 65 als (über-)additiv und 20 als antagonistisch bewertet werden.

Die hohe Anzahl sich indifferent verhaltender AB/AS- Kombinationen begründet sich

in der Größe des geschätzten Standardfehlers.

Additives/synergistisches Interaktionsverhalten zeigte sich am häufigsten bei der

Testung gegen Staphylokokken, gefolgt von Pseudomonaden.

68

Antagonistisches Interaktionsverhalten trat weder bei Staphylokokken noch bei

Enterokokken auf.

Gegen Pseudomonaden zeigten die Kombinationen CIP 5/Octenidin, CIP

5/Chlorhexidin und AK 30/Chlorhexidin ein hohes Interaktionspotenzial. Die

Kombination CIP 5/Octenidin wirkte maßgeblich antagonistisch, CIP 5/ Chlorhexidin

und AK 30/Chlorhexidin dagegen rein additiv/synergistisch.

Bei der Testung gegen Enterokokken und E. coli traten kaum Interaktionen auf.

Auf Blut-Agar fielen insbesondere die AB/AS-Kombinationen CIP 5/ Chlorhexidin,

LZD 30/Chlorhexidin, LZD 30/Octenidin, LZD 30/Polihexanid und VA 30/Chlorhexidin

auf. Alle fünf Kombinationen zeigten bei Staphylokokken ein

additives/synergistisches Interaktionsverhalten. Kann ihr Interaktionsverhalten in

größeren Studien bestätigt werden, könnten diese Kombinationen als neue

Therapieoptionen in der Behandlung chronisch infizierter Wunden an Bedeutung

erlangen.

Antagonismus wurde nur durch eine sehr geringe Anzahl an AB/AS-Kombinationen

auf Blut-Agar hervorgerufen. Das stärkste Potenzial wies CIP 5 in Verbindung mit

Octenidin bei Pseudomonaden auf. Der Einsatz dieser Kombination sollte daher im

Klinikalltag möglichst vermieden werden.

Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Interaktionen nicht allein von der AB/AS-

Kombination, sondern auch von der Art des Agars und Erregers abhängen. Dennoch

sind sie richtungsweisend und sollten Anlass dazu geben, weitere Untersuchungen in

der AB/AS-Kombinationstestung durchzuführen, um Fortschritte erzielen zu können.

69

5 Summary

The appearance of new antibiotic resistances and a rising number in chronically

infected wounds are a problem in the clinical practice. Therefore, the development of

new antimicrobial agents as well as the antibiotic therapy based on antibiogramms

now stands in the focus of attention. Also the combined use of systemically effective

antibiotics and locally effective antiseptics on chronically infected wounds is already a

current practice in everyday clinical life. However, the investigations which check

combinations of microbiocidal substances for interaction have hardly been carried out

despite their frequent use.

Therefore, in this present study the interaction behavior of AB/AS - combinations was

investigated. The antibiotics ciprofloxacin, gentamicin, amikacin, vancomycin,

mupirocin and linezolid were tested in combination with the antiseptics

octenidindihydrochlorid, chlorhexidindigluconat, and polihexanid. As pathogens were

chosen the bacteria which are frequently found in chronically infected wounds:

Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Pseudomonas spp and Escherichia coli /

[17] [15]. As culture media were used Isosensitest -, Mueller-Hinton -, CSA - and

blood - agar. In view of the problems in the clinical practice the greatest importance

was attached to the blood - agar with regard to the result interpretation. In preliminary

tests the MIC values of the antiseptics were measured by means of the microtitre-

agardilution method. In the main tests, it was determined with the help of the agar-

diffusion-dilution-combination method how the zone diameters of the AB/AS -

combinations change in comparison to those of the agar-disk-diffusion test with

antibiotics alone (control values). Either “additivism/synergy”, “antagonism” or

“indifference” could be proved with the help of the change behavior in the zone

diameter values.

From a total of 372 tested combinations (from antibiotics, antiseptics, pathogens and

culture media) 65 could be valued as (super-)additive and 20 as antagonistic effects.

The high number of AB/AS- combinations with indifference has its reason in the size

of the assumed standard error.

Additive/synergistic interaction appeared most frequently with the test against

staphylococci, followed by Pseudomonas spp. Antagonistic interaction appeared

neither with staphylococci nor with enterococci.

The combinations CIP 5/Octenidin, CIP 5/Chlorhexidin and AK 30/Chlorhexidin

showed a high interaction potential against Pseudomonas spp. While the

70

combination CIP 5/Octenidin looked decisively antagonistic, CIP 5/Chlorhexidin and

AK 30/Chlorhexidin showed against it purely additive/synergistic effects.

With the test against enterococci and Escherichia coli interactions hardly appeared.

The combinations CIP 5/Chlorhexidin, LZD 30/ Chlorhexidin, LZD 30/Octenidin, LZD

30/Polihexanid and VA 30/Chlorhexidin distinguished themselves in particular by

using blood-agar. All five combinations showed additive/synergistic interaction with

staphylococci. If this interaction can be confirmed in greater studies, these

combinations gain in importance as new therapy options in the treatment of

chronically infected wounds.

Antagonism was caused only by a very low number of AB/AS- combinations on

blood-agar. The strongest potential showed CIP 5 in connection with Octenidin with

Pseudomonas spp. Hence, the application of this combination should be avoided in

the clinical practice possibly.

The results make clear that the interactions do not only depend on the combination of

antibiotics and antiseptics, but also on the kind of the agar and pathogens. Still they

point the way ahead and should give enough reason to carry out more investigations

in the testing of AB/AS- combinations in order to be able to achieve progress.

71

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Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und

keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und

dass keine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades vorliegt.

Greifswald, den

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich sehr herzlich bei Herrn Prof. Dr. med Axel Kramer

für die Überlassung des Themas, für die stets gute Zusammenarbeit sowie für das

Korrekturlesen der Promotionsarbeit bedanken.

Herrn Dr. med Nils-Olaf Hübner danke ich für die Hilfe bei der Ausarbeitung des

Themas und für die gute Betreuung während der experimentellen Arbeiten im Labor.

Mein großer Dank gilt Frau Gudrun Lindstedt, Kerstin Sümnicht und dem Team des

wissenschaftlichen Labors mit Schwerpunkt krankenhaushygienische Überwachung

für die Erklärung der Methodik und die stetige Hilfe bei der Durchführung der

experimentellen Labortätigkeiten.

Bei Frau Brigitte Sümnicht möchte ich mich ganz herzlich für das Korrekturlesen und

die Beratung in stilistischen und formellen Fragestellungen bezüglich der Verfassung

der Promotionsarbeit bedanken.

Mein ganz besonderer Dank gilt Lisa Hübinger für die gute und freundschaftliche

Zusammenarbeit im Labor, die moralische Unterstützung und für die rückblickend

betrachtet ausgesprochen schöne Zeit mit Ihr zusammen als wissenschaftliche

Partnerin und gute Freundin.

Bei meinen Eltern möchte ich mich ganz herzlich für die moralische Unterstützung in

allen Lebenslagen, für das mir entgegengebrachte Interesse an der Promotionsarbeit

und das Korrekturlesen der Arbeit bedanken.

interaktionsmessung zwischen antibiotika und antiseptika ... · ii mic minimal inhibitory...

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